JP2018070565A

JP2018070565A - 双翅目昆虫用殺虫剤

Info

Publication number: JP2018070565A
Application number: JP2016216238A
Authority: JP
Inventors: 武部　聡; Satoshi Takebe; 聡武部
Original assignee: Kindai University
Current assignee: Kindai University
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2018-05-10

Abstract

【課題】優れた双翅目昆虫殺虫性を備える双翅目昆虫用殺虫剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の双翅目昆虫用殺虫剤は、下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質を有効成分とする。（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、双翅目昆虫殺虫作用を有するタンパク質【選択図】なし

Description

本発明は、双翅目昆虫用殺虫剤に関する。

衛生害虫である蚊の駆除には、安価で、即効性のある化学合成殺虫剤が用いられている。しかし、人体や有害生物以外の生物への影響、残留性の高さ、生物濃縮といった問題から、環境に対しての悪影響が懸念される。
蚊の繁殖場所を減らすため、小鉢や空き缶、古タイヤなどに溜まった水を捨てたり、蚊帳などを利用して蚊の吸血を防いだりといったことも行われているが、これらの対策で家のまわりから蚊を遠ざけ、蚊との接触の機会を減らすことはできても、蚊の個体数を減らす効果は期待できない。

人体や有害生物以外の生物への影響等が懸念される化学合成殺虫剤に対し、細菌を用いた害虫の駆除は、残留性が低いなど、化学合成殺虫剤にはない利点を有することから、微生物農薬としての積極的な利用が検討されている。
例えば、バチルス・チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ。以下、「Ｂｔｉ」と略記することがある）が産生する殺虫性タンパク質顆粒（本明細書において「顆粒」とは「微小粒状物」を指す。以下、同様。）と胞子からつくられたボウフラ駆除剤が米国内で市販されている。
しかし、同じ成分の殺虫剤の長期に渡る使用は、耐性虫の出現を促す懸念がある。例えば、Ｃｒｙ１において、既に交差耐性虫の出現が報告されている（非特許文献１参照。）。

そこで、本発明者は、Ｂｔｉに代わる双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有する細菌として、双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ。以下、「Ｂｔ」と略記することがある）ＴＫ−Ｅ６（ＦＥＲＭＰ−１７９８１菌株）を提案した（特許文献１参照。）。

ここで、Ｂｔについて説明すると、Ｂｔは、自然界では土壌や植物葉上などに広く生息しているグラム陽性の好気性桿菌である。近縁種には、一般的なモデル生物として扱われるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ。以下、「Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ」と略記することがある）、食中毒菌として知られているバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、ボウフラに殺虫性を示すバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）などがいる。

Ｂｔは胞子形成期に、菌体内に胞子とともにクリスタルと呼ばれるタンパク質の結晶顆粒を形成する。クリスタルの構成タンパク質は、Ｃｒｙと呼ばれる。Ｃｒｙタンパク質には、Ｃｒｙ毒素とＣｙｔ毒素、及びパラスポリン（ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ）の３つがある。

Ｃｙｔ毒素は、約３０ｋＤａのタンパク質で脊椎動物、無脊椎動物を問わず、非特異的な活性をもっている。
Ｃｒｙ毒素は、１３０ｋＤａタイプのものと７０ｋＤａタイプのものがあり、高い選択毒性をもち殺虫性を示すものが見つかっている。Ｃｒｙ毒素の種類によって対象とする昆虫目が異なっている。殺虫活性の仕組みの詳しい作用機構は解明されていないが、Ｂｔ内で産出されたＣｒｙ毒素が、感受性昆虫に摂取された後、腸内のアルカリ性消化液によりクリスタルが部分分解され活性型毒素となり、毒素は中腸上皮細胞上にある受容体と結合、オリゴマー化され細胞膜に孔が形成され、消化管細胞に浸透圧の錯乱がおこり、細胞を破壊する。その結果、腸における栄養の吸収が困難となり、昆虫は衰弱して餓死するとされている。

パラスポリンは、Ｂｔ及び近縁の細菌が産生するＣｒｙタンパク質のうち、溶血活性を持たないが、ガン細胞に選択的な細胞損傷活性を示すものと定義され、もともとは殺虫性を示さないＢｔから発見された（非特許文献２、非特許文献３など参照。）。
パラスポリンは、アミノ酸配列の相同性により１〜６のグループがあり、それぞれ、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ１（＝Ｃｒｙ３１Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２（＝Ｃｒｙ４６Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ３（＝Ｃｒｙ４１Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ４（＝Ｃｒｙ４５Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ５（＝Ｃｒｙ６４Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ６（＝Ｃｒｙ６３Ａ）と命名されている。

そして、上述したＢｔ．ＴＫ−Ｅ６が、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａｂ１（＝Ｃｒｙ４６Ａｂ１）をコードする遺伝子（ｃｒｙ４６Ａｂ１）を有すること、そして、Ｃｒｙ４６Ａｂ１は、プロテイナーゼＫにより約３０ｋＤａの活性型となり、ＭＯＬＴ−４細胞に対して強い細胞損傷能を示すことが報告されている（非特許文献４参照。）。

しかし、現在まで、パラスポリンの殺虫活性に関する報告はなく、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａｂ１とアミノ酸配列の相同性が高いＰａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａａ１に関する報告においても、殺虫性に関する記述は見当たらない（非特許文献５など参照。）。

特許第４７５３１０８号公報

Bernardi D, Salmeron E, Horikoshi RJ, Bernardi O, Dourado PM, Carvalho RA, et al. (2015) "Cross-Resistance between Cry1 Proteins in Fall Armyworm (Spodoptera frugiperda) May Affect the Durability of Current Pyramided Bt Maize Hybrids in Brazil", PLoS ONE 10(10): e0140130. doi:10.1371/journal.pone.0140130 Mizuki, E. et al. "Parasporin, a Human Leukemic Cell-Recognizing Parasporal Protein of Bacillus thuringiensis", Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7, 625-634 (2000) Ito, A. et al. " A Bacillus thuringiensis Crystal Protein with Selective Cytocidal Action to Human Cells", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2004) 279, 21282-21286 Hayakawa, T. et al. "Parasporin-2Ab, a Newly Isolated Cytotoxic Crystal Protein from Bacillus thuringiensis", CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 55 (2007), pp. 278-283 Kitada, S. et al. " Cytocidal Actions of Parasporin-2, an Anti-tumor Crystal Toxin from Bacillus thuringiensis ", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2006) 281, 26350-26360

本発明は、優れた双翅目昆虫殺虫性を備える双翅目昆虫用殺虫剤を提供することを目的とする。

上述のとおり、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６はＣｒｙ４６Ａｂ１をコードする遺伝子（ｃｒｙ４６Ａｂ１）を有する。しかし、本発明者の検討によれば、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６が生産するクリスタルに含まれるタンパク質にはＣｒｙ４６Ａｂ１は含まれていないことが明らかとなった。
また、ｃｒｙ４６Ａｂ１を単離し、他のＣｒｙタンパク質非生産Ｂｔ株に導入してＣｒｙ４６Ａｂ１タンパク質を調製し、殺ボウフラ活性を調べたところ、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６が生産するクリスタルと比べて、強い毒性を示すことが分かった。
本発明は、このような鋭意検討の結果、完成されたものである。

すなわち、本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤は、下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質を有効成分とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、双翅目昆虫殺虫作用を有するタンパク質

本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤は、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６が生産するクリスタルよりも強い双翅目昆虫殺虫性を発揮する。

また、本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤の有効成分であるタンパク質は、Ｂｔ菌体内で不溶性のタンパク質顆粒として生産させることができる。そのため、水田等に散布しても溶解せずに、拡散し難い顆粒として留まるので、溶解や流出による希釈や損失がないという利点もある。また、顆粒であるためにボウフラが餌として摂取しやすい。

さらに、従来、３ドメイン型のＣｒｙタンパク質でハエ目に殺虫活性を示すものは多数あるが、これらの殺虫機構（Mode of Action）は似通っていると考えられ、交差耐性を獲得した虫の出現も危惧されるものであった。これに対し、本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤の有効成分であるタンパク質は、従来のＢｔ菌における３ドメイン型のＣｒｙ毒素とは構造が異なり、Ｃｒｙファミリー間の保存配列が見られるｂｌｏｃｋ領域をもたず、アミノ酸配列の類似性も低い。
従って、構造の相違により、殺虫機構も従来と異なると推測されることから、交差耐性虫を出現させないという観点において望ましいのみならず、新たな生物農薬の開発へとつながる可能性もある。

なお、本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤の有効成分であるタンパク質は、Ｃｒｙ４６Ａｂ１（＝Ｐａｒａｐｏｒｉｎ２Ａｂ１）であり、ガン細胞に特異的な細胞損傷作用を示すが、殺虫性はないと思われていたものであり、また、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６が生産するクリスタル中のタンパク質には含まれていないため、その強い双翅目昆虫殺虫性を発見することは極めて困難であったといえる。

実施例１で使用したプラスミド（ｐＨＹ３００ＰＬＫ）の構造を示す図である。実施例１で使用したプラスミド（ｐＰｃｙｔ１Ａ）の構造を示す図である。実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、本培養前と本培養２４時間後の培養液中の菌体の様子を位相差顕微鏡で観察した結果を示す写真である。実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

以下、本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。

本発明に係る双翅目昆虫用殺虫剤は、下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明に係る殺虫性タンパク質」ということがある）を有効成分とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｃｒｙ４６Ａｂ１）
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、双翅目昆虫殺虫作用を有するタンパク質

本発明に係る殺虫性タンパク質は、当該タンパク質をコードする遺伝子を用い、周知の遺伝子組換え技術により製造することができる。

具体的には、例えば、以下の工程により製造することができる。
（１）本発明に係る殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を調製する。
（２）発現ベクターに上記遺伝子を導入したプラスミドを構築する。
（３）宿主細胞を上記プラスミドで形質転換して組換え宿主細胞を形成する。
（４）上記組換え宿主細胞を培養して本発明に係る殺虫性タンパク質を産生させる。
（５）上記殺虫性タンパク質を回収・確認する。

まず、遺伝子の調製（上記（１））について説明する。
上述のとおり、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６は、ｃｒｙ４６Ａｂ１遺伝子を有している。なお、ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列は、近畿大学生物理工学部分子生化学研究室内で決定された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１３６９１４）（配列番号２）。
そこで、プライマーを用いて、ｃｒｙ４６Ａｂ１又はその変異遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、標的ＤＮＡ断片（本発明に係る殺虫性タンパク質をコードする遺伝子）を増幅させることができる。
プライマーは、標的ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて適宜設計すればよい。

なお、ｃｒｙ４６Ａｂ１の変異遺伝子は、従来公知の手法によりｃｒｙ４６Ａｂ１に変異を導入することで得ることができる。
例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ^TM−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製））などを用いて変異導入を行うことができる。

次に、発現ベクターへの遺伝子の導入（上記（２））について説明する。
本発明に係る殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を導入する発現ベクターは、少なくとも、プロモーター領域と、その下流に配置されるターミネーター領域を備える。

プロモーター領域は、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯプロモーター、ａｐｒＥプロモーター等が挙げられる。

ターミネーター領域は、例えば、大腸菌の場合、ρ因子非依存的転写終結ではＧ−Ｃ塩基対に富んだ逆位反復配列と、それに続くＴの連続配列から成り、逆位反復配列におけるステム−ループ構造の形成によりＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖から外れて転写を終わらせる。ρ因子依存的転写終結ではステム−ループ構造があまり大きくないので、ρ因子がＲＮＡポリメラーゼを外す手助けをして転写を終わらせる。

プロモーター領域とターミネーター領域とは、制限酵素認識部位を介して連結されている。この連結箇所を制限酵素で切断し、その間に、本発明に係る殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を導入することで、目的のプラスミドを構築することができる。

プロモーター領域には、プロモーターの近傍にリボソーム結合部位（ＳＤ配列）が含まれる。
発現ベクターには、プロモーター領域とターミネーター領域の他、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。

本発明者は、ｃｙｔ１Ａのプロモーター領域とｃｒｙ４Ａのターミネーター領域をＳｐｈＩ部位を介して連結したＢｔ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａについて報告しているが（武部聡ら、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａの構築、近畿大学先端技術総合研究所紀要（１０），ｐｐ．２９−３６，２００５年）、この発現ベクターは、本発明において好適に用いることができる。

次に、宿主細胞の形質転換（上記（３））について説明する。
宿主細胞としては、上記プラスミドにより形質転換され、目的のタンパク質を発現させることができるものであれば、特に限定されない。
例えば、本発明の技術分野において通常使用される細菌（大腸菌、枯草菌、バチルス・チューリンゲンシス等）又はその変異株（例えば、殺虫性タンパク質を生産しないバチルス・チューリンゲンシス株）などが挙げられる。

上記プラスミドの宿主細胞への導入は、例えば、大腸菌の場合、塩化カルシウム法や電気穿孔法等、枯草菌の場合、電気穿孔法やプロファージ等により行うことができる。

特に、上記Ｂｔ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａに殺虫性タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クリスタルを生産しないＢｔ細胞に導入することで、効率良く目的の殺虫性タンパク質を発現させることができる。

上記組換え宿主細胞を培養することで、本発明に係る殺虫性タンパク質を産生させることができる（上記（４））。
例えば、抗生物質テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含む胞子形成培地（例えば、ＳＳＭ培地）に上記組換え宿主細胞を植菌し、３０℃において振盪培養すると２４時間後以降に菌体内に胞子とともに殺虫性タンパク質顆粒が形成される。

次いで、細胞培養により産生したタンパク質を回収し、検出・確認する（上記（５））。
タンパク質の回収は、従来公知の方法、例えば、細胞培養後、破砕し、公知の分離方法により分離することによって行うことができる。
分離方法としては、例えば、遠心分離、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。分離操作上必要であれば、タンパク質を可溶化しても良い。本発明に係る殺虫性タンパク質は水に不溶であるが、アルカリ条件下では可溶化し、水溶液になる。

また、タンパク質の検出・確認の方法としては、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングなどが挙げられる。

以下、実施例を用いて、本発明について詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実験材料〕
＜菌株＞
以下の菌株を用いた。
（１）Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６
近畿大学生物理工学部分子生化学研究室にて単離された菌株である（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７９８１）。
（２）バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスターキー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＣＲＹ（−）Ｂ
クリスタル非生産株であり、ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ）より入手した菌株である（ＢＧＳＣＮｏ．４Ｄ１１）。
以下、「ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂ」と略記することがある。

＜プラスミド＞
以下のプラスミドを用いた。
（１）ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ。以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ」と略記することがある）とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方へＤＮＡ形質導入できるタカラバイオ社のシャトルベクターである（図１参照。）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓと同様にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓへのＤＮＡ形質導入も可能である。
Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドｐＡＣＹＣ１７７とストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミドｐＡＭα１由来のＤＮＡより構築されている。薬剤耐性マーカーはアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉ中では両者が発現するが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中ではテトラサイクリン耐性遺伝子のみが発現する。
ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＰＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、ＸｂａＩの制限酵素切断部位を１ヵ所ずつ持っている。

（２）ｐＰｃｙｔ１Ａベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位にＢｔｉ由来のｃｙｔ１Ａプロモーター領域とｃｒｙ４Ａターミネーター領域を制限酵素ＳｐｈＩ認識部位でつないだ断片を挿入した、Ｂｔ細胞用発現ベクターである（図２参照。）。
ｃｙｔ１Ａプロモーター領域は配列番号３の塩基配列からなり、ｃｒｙ４Ａターミネーター領域は配列番号４の塩基配列からなる。
上記プロモーターはσ³⁵、σ²⁸の２つの認識配列を持っており、転写活性が高くなる時期の異なる２つのプロモーターの働きにより、長い間ｍＲＮＡの細胞内濃度を高く維持できると考えられる。
また、上記ターミネーターは、どの読み枠においても終始コドンが入ることを確認し、本来のｃｒｙ４Ａの終始コドンより上流から、ステムループ構造の下流までを用いた。
上記プロモーター、ターミネーター部位は、公知の手法に従い、ＰＣＲにより調製し、制限酵素消化後にｐＨＹ３００ＰＬＫにクローニングした。
ＳｐｈＩ部位に外来遺伝子のＯＲＦを挿入することで転写できる。ｃｙｔ１ＡのＳＤ配列により、ＳｐｈＩ部位内にあるＡＴＧから翻訳される。
これにより、Ｂｔ細胞内で胞子形成期にタンパク質を大量に発現させることができる。

＜試薬＞
用いた試薬を下表１に示す。

＜培地＞
以下に示す培地を用いた。
（１）ＬＢ培地（Luria bertani medium）
Ｂａｃｔｏ（商標）トリプトン１０．０ｇ
Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス５．０ｇ
ＮａＣｌ１０．０ｇ
寒天１５．０ｇ
にｓＨ₂Ｏ（滅菌水。以下、同様。）を１０００ｍＬとなるまで加え、オートクレーブした。
ただし、ＬＢ液体培地作製の場合は寒天を加えない。

＜アガロースゲル電気泳動＞
（１）１％アガロースゲル
アガロース０．２５ｇ
０．５×ＴＢＥ緩衝液２５ｍＬ
からなる。
（２）０．５×ＴＢＥ緩衝液（泳動用緩衝液）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５．４ｇ
ホウ酸２．７５ｇ
エチレンジアミン４酢酸・２Ｎａ０．３７５ｇ
にｓＨ₂Ｏを加えて１０００ｍＬにした。

（２）ＳＳＭ培地（Schaeffer's sporulation medium）
ニュートリエントブロス（Nutrient Broth）８．０ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２５ｇ
ＫＣｌ１．０ｇ
にＨ₂Ｏを１０００ｍＬとなるまで加え、オートクレーブした。
その後、
１ｍＭＦｅＳＯ₄ １．０ｍＬ
１０ｍＭＭｎＣｌ₂ １．０ｍＬ
１ｍＭＣａＣｌ₂ １．０ｍＬ
を加えた（これらの試薬はいずれもフィルター滅菌済み）。

＜抗生物質＞
テトラサイクリンストック２０ｍｇ／ｍＬを用いた。溶媒はエタノールであり、−３０℃で保存した。

＜可溶化緩衝液＞
（１）５０ｍＭ炭酸バッファー
３０ｍＭのＮａ₂ＣＯ₃及び２０ｍＭのＮａＨＣＯ₃からなる（ｐＨ１０．５）。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
（１）１２％分離ゲル
３０％アクリルアミド／ビス混合液４．０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ３．４ｍＬ
ＷＩＤＥＲＡＮＧＥゲル調製用緩衝液２．５ｍＬ
１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム０．１ｍＬ
テトラメチルエチレンジアミン０．００６ｍＬ
からなる。

（２）３％濃縮ゲル
３０％アクリルアミド／ビス混合液０．２ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ１．２８ｍＬ
ＷＩＤＥＲＡＮＧＥゲル調製用緩衝液０．５ｍＬ
１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム０．０２ｍＬ
テトラメチルエチレンジアミン０．００２ｍＬ
からなる。

（３）グリシンバッファー
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン３．０ｇ
グリシン１４．４ｇ
ＳＤＳ１．０ｇ
にｓＨ₂Ｏを１０００ｍＬとなるまで加えて調製した。

（４）２×サンプルバッファー
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．９１ｍＬ
ＳＤＳ０．４ｇ
グリセロール２．０ｍＬ
２−メルカプトエタノール１．２ｍＬ
ブロモフェノールブルー１ｍｇ
にｓＨ₂Ｏを１０００ｍＬとなるまで加えて調製した。

＜ウエスタンブロット＞
（１）一次抗体
Ｃｒｙ４６Ａｂ１のアミノ酸配列から１９アミノ酸残基（配列番号１の第１９５〜２１３番目）を化学合成したペプチドをウサギに免役して作製したポリクローナル抗体（シグマアルドリッチジャパン合同会社）

（２）二次抗体
抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギポリクローナル抗体（ＨＲＰ標識）（フナコシ）を用いた。

（３）５×転写バッファー
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｇ
グリシン５７０ｇ
ＳＤＳ２０ｇ
にｓＨ₂Ｏを４０００ｍＬとなるまで加えて調製した。

（４）０．５×転写バッファー
５×転写バッファー９０ｍＬ
メタノール１８０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ６３０ｍＬ
からなる。

（５）ブロッキングバッファー
１０×ブロッキングバッファー４．０ｍＬ
１０×マレイン酸４．０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ３２ｍＬ
からなる。

（６）洗浄バッファー
１０×洗浄バッファー２０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ１８０ｍＬ
からなる。

（７）検出バッファー
１０×検出バッファー４．０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ３６ｍＬ
からなる。

（８）染色液
クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ２５０を用いた。

（９）脱色液
酢酸１０ｍＬ
メタノール５０ｍＬ
ｓＨ₂Ｏ４００ｍＬ
からなる。

＜生物検定の使用生物＞
（１）アカイエカ（Ｃｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓ）
大日本除蟲菊株式会社からの分与、又は住化テクノサービス株式会社から購入した。
（２）ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）
大日本除蟲菊株式会社から分与された。

〔実施例１〕
＜遺伝子の調製＞
（１）ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列の決定
ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列は近畿大学生物理工学部研究室で決定された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１３６９１４）。ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦ（９１５ｂｐ、終止コドンを含む）（配列番号２）から推測されるタンパク質は、３０４アミノ酸残基、３３ｋＤａの大きさである。

（２）プライマー設計
ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列に基づき、次の通り、プライマーを設計した。
センス鎖プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５）
アンチセンス鎖プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴ−３’（配列番号６）
センス鎖プライマーは、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの開始コドン（ＡＴＧ）を含む２６ｎｔの５’側にＳｐｈＩ部位（ＧＣＡＴＧＣ）を付加し、間に２塩基（ＡＡ）挿入してフレームを合わせたものである。
また、アンチセンス鎖プライマーは、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの終止コドン（ＴＡＡ）より上流２５ｎｔの相補鎖の５’にＳｐｈＩ部位を付加したものである。

（３）ＰＣＲ
Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６のゲノム画分（巨大プラスミドを含む）を鋳型とし、上記プライマーを用いてＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）で３０サイクル行った。
反応液は、
１０×ＥｘＴａｑバッファー５μＬ
ｄＮＴＰ（２５０μＭｅａｃｈ）４μＬ
２．０μＭセンス鎖プライマー５μＬ
２．０μＭアンチセンス鎖プライマー５μＬ
５０μｇ／ｍＬ鋳型ＤＮＡ２μＬ
ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ
にＨ₂Ｏを５０μＬとなるまで加えて調製した。

＜上記遺伝子の発現ベクターへの導入＞
ＰＣＲ産物を大腸菌用ＴＡクローニングベクター「ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ」（プロメガ株式会社製）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。この菌を培養して調製したプラスミドｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ−ｃｒｙ４６Ａｂ１におけるｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの塩基配列を調べ、変異等がないことを確認した。このプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動（１％ゲル濃度、０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０））により、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦ断片を分離、回収して挿入断片とした。ベクターｐＰｃｙｔ１ＡはＳｐｈＩで消化した後、脱リン酸酵素ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｈｒｉｍｐ）（ＳＡＰ）（タカラ社製）により、５’末端の脱リン酸処理を行った。このベクターにｃｒｙ４６Ａｂ１ＯＲＦの挿入断片をＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（タカラ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。
組換え体の中からｃｒｙ４６Ａｂ１ＯＲＦが正方向（ベクターのプロモーターの向きとＯＲＦの転写方向が一致）に挿入されたクローンを選抜し、その組換えプラスミドをｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１とした。

＜組換え宿主細胞の形成＞
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１をもつ大腸菌ＤＨ５αをＬＢ培地（７５μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）３ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液からｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１を抽出し、電気穿孔法によりクリスタル非生産株のＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂ（ＢＧＳＣＮｏ．４Ｄ１１）に導入した。テトラサイクリン耐性を獲得した菌をＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）で一晩培養し、培養液にグリセロールを１５％になるように添加したものをグリセロールストックとして−８０℃に保存した。

＜菌体の培養によるタンパク質の産生＞
上記ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂのグリセロールストック（−８０℃）をＬＢ寒天培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）に画線し、３０℃で２４時間培養した。

次いで、以下の通り、前培養を行った。
すなわち、形成されたシングルコロニーを、ＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）５ｍＬ（Ｌ字管）に植菌し、３０℃で５０ｒｐｍ，１６時間モノード振盪培養した。

次いで、以下の通り、本培養を行った。
すなわち、１Ｌ容スクリューフラスコ（ひだ付きフラスコ）にＳＳＭ培地１００ｍＬ（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）を作製し、前培養液全量（５ｍＬ）を加えて４００ｒｐｍで３０℃、２４時間振盪培養した。菌体が胞子を形成しているのを検鏡で確認した後、ファルコンチューブ（５０ｍＬ）２本に分注し、集菌（３，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）した。

＜タンパク質の回収及び試料液の作製＞
上記集菌後、菌体を１ｍＭペファブロックＳＣ／ｓＨ₂Ｏ１０ｍＬに懸濁し、ソニケーターＳＯＮＩＦＥＲ４５０Ｄ（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。菌体が破砕されていることを検鏡で確認した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）を行い、沈殿（不溶タンパク質と胞子を含む）を得た。これを１ｍＭペファブロックＳＣを含むＷａｓｈＩ（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ＭＮａＣｌ）１０ｍＬに完全に懸濁した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）で回収する洗浄を３回繰り返し、さらに、１ｍＭペファブロックＳＣを含むＷａｓｈＩＩ（０．５ＭＮａＣｌ）１０ｍＬに完全に懸濁した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）で回収する洗浄を３回繰り返した。
その後、沈殿を１ｍＭペファブロックＳＣ／ｓＨ₂Ｏ１ｍＬに懸濁したものを試料液として、−３０℃で冷凍保存した。

＜試料液の可溶化及び濃度測定＞
目的のＣｒｙ４６Ａｂ１は水には不溶であるが、アルカリ条件下では可溶化し、水溶液になる。
そこで、上記試料液５０μＬに５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ１０．５）１５０μＬを加え、３７℃で１時間保温した。その後、遠心分離（室温，１５，０００ｒｐｍ，１０分）し、上清（可溶化したタンパク質を含む）を新しいチューブに移した。

２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ標準溶液を、５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ１０．５）を用いて希釈し、０，５０，１００，２００，３００，４００，５００μｇ／ｍＬのＢＳＡ標準溶液を作製した。それぞれ２０μＬをエッベンチューブに取り、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔを１ｍＬ加えてよく混合し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定して検量線を作製した。
可溶化したタンパク質を４μＬ取り、５０ｍＭ炭酸バッファーを１６μＬ加え、さらに、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔを１ｍＬ加えてよく混合した。波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＢＳＡの検量線から試料液の可溶化タンパク質濃度を求めた。

＜タンパク質の検出及び確認＞
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂが胞子形成期に菌体内につくる不溶性タンパク質画分にＣｒｙ４６Ａｂ１が含まれることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｃｒｙ４６Ａｂ１抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、以下の通り検出・確認した。

（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ａ）電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの作成
ＡＴＴＯ社製ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置（ＡＥ−６５００）を用い１２％分離ゲル、３％濃縮ゲルのポリアクリルアミドゲルを作製した。

（ｂ）サンプル調製
Ｃｒｙ４６Ａｂ１試料液を炭酸バッファーによるアルカリ可溶化処理後、処理液全体（遠心分離前液）、遠心分離（室温，１５，０００ｒｐｍ，１０分）後の上清、沈殿の各サンプルに分けた。
各サンプルに含まれるタンパク質量が５μｇになるように計算し、５０ｍＭ炭酸バッファーを加えて液全量を１０μＬにした。各サンプルに２×サンプルバッファーを１０μＬ加え、５分間煮沸した後、全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。

（２）ウエスタンブロットによるＣｒｙ４６Ａｂ１の検出
（ａ）一次抗体の作製
（シグマアルドリッチジャパン合同会社の「シンプル抗体作製サービス」）
Ｃｒｙ４６Ａｂ１のアミノ酸配列のうちＮ−末端から１９５番目のアルギニンから２１３番目のアラニンまで（配列番号１の第１９５〜２１３番目）の１９アミノ酸残基を化学合成し、ウサギに免疫した。１週間ごとに３回抗原を投与し、最終投与から２週間後に採血した。

（ｂ）メンブレン前処理
ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブレンをメタノールに１０分間浸し、親水化した。

（ｃ）メンブレンへのタンパク質転写
Ｃｒｙ４６Ａｂ１試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質のＰＶＤＦメンブレンへの転写をミニトランスブロット（登録商標）セル装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてウェット式転写で行った。ゲルと同サイズにカットしたメンブレン、ろ紙をゲルとスポンジとともに０．５×転写バッファーに浸し平衡化した。転写装置の陽極側からスポンジ、ろ紙、メンブレン、ゲル、ろ紙、スポンジの順にセットした。４５Ｖ，１００ｍＡ，４℃，１６時間通電し、転写を行った。転写後のＰＶＤＦメンブレンをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ２５０に浸し、揺らしながら２分以上染色した。その後、染色液を脱色液３０ｍＬに交換し、ＰＶＤＦメンブレンのバックグラウンド部分が十分に脱色されるまで、３回脱色液を交換して脱色を行った。最後に純水でメンブレンを十分にすすぎ、脱色反応を止めた。このメンブレンを写真に撮り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動像とした。

（ｄ）ブロッキング
脱色したＰＶＤＦメンブレンをハイブリ・バッグ（コスモ・バイオ社製）に入れ、さらにブロッキングバッファー２０ｍＬを入れて３０分間揺らしながらメンブレンのブロッキングを行った。

（ｅ）一次抗体反応
ブロッキング後、一次抗体２０μＬをバッグ内のバッファーに加え、３０分揺らしながら反応させた。バッグ内の液を除いた後、余剰の一次抗体を除くため洗浄バッファー３０ｍＬをバッグ内に加え、１０分間揺らして液を捨てる洗浄作業を３回繰り返した。

（ｆ）二次抗体反応
一次抗体反応の洗浄作業終了後、バッグ内にブロッキングバッファー２０ｍＬを入れ、二次抗体２μＬを加えて３０分間揺らしながら反応させた。バッグ内の液を除いた後、余剰の二次抗体を除くため洗浄バッファー３０ｍＬをバッグ内に加え、１０分間揺らして液を捨てる洗浄作業を３回繰り返した。メンブレンをバッグから取り出して検出バッファー４０ｍＬに浸し、１０分揺らしながら反応させた。

（ｇ）Ｃｒｙ４６Ａｂ１の検出
検出バッファーから取り出したＰＶＤＦメンブレン全体にＣＤＰ−ＳＴＡＲ２００μＬをかけ、ハイブリ・バッグに入れて空気を抜いて密閉した。暗所でＸ線フィルム用カセッテにハイブリ・バッグに密封したＰＶＤＦメンブレンとの化学発光用フィルムＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を重ねて入れ、１０分感光させた。フィルムを取り出して現像液に８分間浸け揺らし現像した。水道水で現像液を洗い流し、定着液に５分間浸けた。フィルムの余白部分の色が抜けたことを確認し、水道水で洗浄した。

＜生物検定＞
試料液を用いてボウフラに対する生物検定を行った。試料液には胞子も含まれる。また、供試したボウフラはネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）とアカイエカ（Ｃｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓ）である。
２４穴プレートの１ウェルあたり瞬化後５日目２齢虫、体長約３ｍｍのボウフラ６匹と６００μＬのイオン交換水を入れ、６時間絶食状態に置いた。
試料液を滅菌水で希釈した２倍希釈系列を作製し、各ウェルに６００μＬ加え、計１．２ｍＬになるようにした。２４時間後に死虫数を測定し半数致死濃度（ＬＣ₅₀）を求めた。同終濃度につき２ウェルずつアッセイを行った。また、ネガティヴコントロールとして調製サンプルをいれないウェルを２つ用意した。

〔比較例１〕
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂの代わりに、ｃｒｙ４６Ａｂ１遺伝子の供与菌であるＢｔ．ＴＫ−Ｅ６を用いたこと以外は実施例１と同様にして、菌体の培養によるタンパク質の産生、タンパク質の回収及び試料液の作製、試料液の可溶化及び濃度測定、タンパク質の検出及び確認並びに生物検定の各実験を行った。

〔比較例２〕
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂの代わりに、ｃｒｙ４６Ａｂ１を持たないｐＰｃｙｔ１Ａ／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂを用いたこと以外は実施例１と同様にして、菌体の培養によるタンパク質の産生、タンパク質の回収及び試料液の作製、試料液の可溶化及び濃度測定、タンパク質の検出及び確認並びに生物検定の各実験を行った。

〔結果及び考察〕
＜顕微鏡観察の結果及び考察＞
実施例１、比較例１，２における本培養前と、本培養２４時間後の培養液中の菌体の様子を位相差顕微鏡で観察した結果は、図３に示す通りであった。

比較例１，２における顕微鏡観察では、いずれの菌も、本培養前には胞子は無く、本培養２４時間後に菌体内に胞子の形成を確認できた。また、本培養における菌体数の増加はほとんど見られなかった。

実施例１において、ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂの本培養２４時間後の菌体内には胞子の他に黒い固まり（インクルージョンボディ）が認められた。このインクルージョンボディは、比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）において、本培養２４時間後の菌体内で形成されたクリスタルより小さかった。この大きさの違いは形成するＣｒｙタンパク質の種類によるものと考えられる。すなわち、ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂが産生するＣｒｙはＣｒｙ４６Ａｂ１のみであるのに対し、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６ではＣｒｙ３２グループが多数発現する。この違いが大きさに現れたとみている。

一方、比較例２（ｐＰｃｙｔ１Ａ／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂ）において、本培養２４時間後の菌体内には、胞子は形成されていたが、インクルージョンボディは観察されなかった。
従って、実施例１において見られたインクルージョンは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１由来のものと考えられる。

＜タンパク質の検出及び確認の結果及び考察＞
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例１、比較例１，２について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分画を行った結果は、図４に示すとおりである。

図４下部に示す通り、レーン１〜５は実施例１に関し、レーン１は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン２は可溶化処理後の上清、レーン３は可溶化処理後の上清を１００倍に希釈したもの、レーン４は可溶化処理後の上清を１０００倍に希釈したもの、レーン５は可溶化処理後の沈殿を示す。
レーン６−８は比較例１に関し、レーン６は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン７は可溶化処理後の上清、レーン８は可溶化処理後の沈殿を示す。
レーン９−１１は比較例２に関し、レーン９は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン１０は可溶化処理後の上清、レーン１１は可溶化処理後の沈殿を示す。

実施例１（ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂ）における不溶画分の可溶化処理後上清サンプルでは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１の分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られた（レーン２）。このサンプルの１００倍希釈液でも薄いバンドが確認できたが、１０００倍希釈液では確認できなかった（レーン３，４）。

比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）における不溶画分可溶化処理後沈殿サンプル（レーン８）でも分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られるが、このバンドについては、後述の通り、ウエスタンブロットにおいてＣｒｙ４６Ａｂ１抗体が認識しなかったためＣｒｙ４６Ａｂ１ではないと推測される。
また、比較例２（ｐＰｃｙｔ１Ａ／ＢｔｋＣＲＹ（−）Ｂ）では、可溶化後上清及び、沈殿のいずれにも３３ｋＤａのタンパク質は見られなかった。

実施例１で、不溶化画分の可溶化処理後上清サンプル及び１００倍希釈液（レーン２、３）の９０ｋＤａ付近に見られるバンドは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１がオリゴマー化したものと考えられる。
比較例１で、２５ｋＤａ、３３ｋＤａ、４５ｋＤａ、９０ｋＤａの位置に見られるバンドは（レーン６−８）、胞子由来のタンパク質であると考えられる。また、レーン６，７の１５０ｋＤａ付近に見られるバンドはクリスタル由来の分子量１４４ｋＤａのＣｒｙ３２である。

（２）ウエスタンブロットによるＣｒｙ４６Ａｂ１の検出
ウエスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した３３ｋＤａのタンパク質がＣｒｙ４６Ａｂ１であるのかを確かめるために行った。
結果は図５に示すとおりである。なお、各レーンについては、図５下部に示しているとおりであり、図４と同様である。

目的とするＣｒｙ４６Ａｂ１タンパク質は分子量３３ｋＤａで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様にウエスタンブロットでもバンドが確認できた。不溶タンパク質可溶化後上清・沈殿のサンプルでも同様にバンドを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に、全体液、可溶タンパク質可溶化後上清・沈殿で９０ｋＤａ付近のバンドが確認でき、また懸濁液と可溶化処理後沈殿では１００ｋＤａ以上の分子量で、バンドが確認された。これらのタンパク質はＣｒｙ４６Ａｂ１抗体が認識したため、Ｃｒｙ４６Ａｂ１がオリゴマー化したものではないかと考えられる。
比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）においては、上述の通り、不溶画分可溶化処理後沈殿サンプル（レーン８）において分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られたが、ウエスタンブロットでは同様のバンドが確認できなかったことから、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６の不溶タンパク質にはＣｒｙ４６Ａｂ１が含まれていないと判断される。

＜生物検定の結果＞
実施例１について、半数致死濃度（ＬＣ₅₀）の結果を下表２，３に示す。

表２，３より、Ｃｒｙ４６Ａｂ１のアカイエカ（Ｃｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓ）幼生に対するＬＣ₅₀は４．５７ｎｇ／ｍＬ（３．９３−５．３３）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）幼生に対するＬＣ₅₀は４．２４ｎｇ／ｍＬ（３．０５−５．３７）であった（カッコ内数値は９５％信頼限界）。
一方、比較例１、すなわち、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６クリスタルを試料とした生物検定では、１０７２μｇ／ｍＬでもアカイエカ幼生に対して殺活性はみられなかった。この結果も、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６不溶タンパク質にはＣｒｙ４６Ａｂ１が含まれていないとの事実を示唆している。

Claims

下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質を有効成分とする、双翅目昆虫用殺虫剤。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、双翅目昆虫殺虫作用を有するタンパク質