JP2017521998A - 新規多重特異性分子及びかかる多重特異性分子に基づく新規治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、高い効力と組合わさった高い親和性を有する抗体の使用を含む、新規抗体に基づく治療方法、特に特定のエピトープに対する抗体の使用に関する。

Description

発明の分野
本発明は、新規の多重特異性分子、特に二重特異性分子、及びかかる多重特異性分子に基づく新規治療方法に関し、ここで多重特異性分子は、高い効力と組み合わさった高い親和性を有する抗体、又はその機能フラグメント、特に特定のエピトープに対する抗体、又はその機能フラグメントを含む。

発明の背景
本発明は、高い能力と高い親和性とを兼ね備え、特定のＣＤ３エピトープを特異的に認識する抗ＣＤ３抗体、又はその機能フラグメントを含む新規多重特異性分子、特に二重特異性分子に関する。

Ｔ細胞受容体又はＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される抗原の認識のために応答できるＴリンパ球（又はＴ細胞）の表面上に見出される分子である。ＴＣＲと抗原との間の結合は、比較的低い親和性のものである。ＴＣＲが抗原及びＭＨＣと係合する場合、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、特殊化されたアクセサリー分子、及び活性化されたか又は放出された転写因子により介在される一連の生化学的現象を通して活性化される。

ＴＣＲは、哺乳類における３種の異なった鎖（γ、δ及びε）、及びζ２ (ＣＤ２４７) 複合体又はζ/η 複合体の何れかを有する、ＣＤ３のような他の分子に関連している。それらのアクセサリー分子はトランスメンブラン領域を有し、そして細胞中へのＴＣＲからのシグナルを伝搬するために不可欠であり；ＴＣＲの細胞質端は非常に短く、シグナル伝達への参加を不可能にする。ＣＤ３−及びζ鎖は、ＴＣＲと一緒に、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。

ＣＤ３εは、特定のＴ細胞の表面上に発現されるタイプＩトランスメンブランタンパク質である。それは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関与し、そしてこの複合体の他のドメインと相互作用する。それらの相互作用パートナーの１つはＣＤ３γであり、これは１：１の化学量的にＣＤ３εに結合する（De la Hera et al, J. Exp. Med.1991 ; 173: 7-17）。図５は、ＣＤ３ε／ＣＤ３γを包含するＴＣＲ複合体の概略図を示す。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣ−ペプチド複合体へのＴＣＲの結合、及びＡＰＣに沿ってのＴ細胞の続く移動が、ＴＣＲ複合体の一定の回転を導き、お互いに関してＣＤ３ε及びＣＤ３γの変位をもたらし、これは、効果的ＴＣＲシグナル伝達及び従って、Ｔ−細胞の活性化のために必要とされると思われる。ＣＤ３εに対する特定の抗体は、他の抗体では示されていないが、ＴＣＲシグナル伝達を誘発することが実証されている。ＴＣＲ−活性化抗体は典型的には、ＣＤ３ε上の露出されたエピトープに結合し（図５、「アゴニストエピトープ」を参照のこと）、ところがいくつかの非刺激性抗体は、ＣＤ３εとＣＤ３γとの間のインターフェースに結合するか、又は同時に、ＣＤ３ε及びＣＤ３γに結合することが示されており（図５、「アンタゴニストエピトープ」を参照のこと）、従って、たぶん、ＣＤ３ε及びＣＤ３γの相対的変位を干渉する（Kim et al, JBC.2009; 284: 31028-31037）。

ペプチド−ＭＨＣ複合体が、低親和性及び早い解離速度でＴＣＲを結合することは十分に確立されている（Matsui et al, Science.1991 ; 254: 1788-1791 ; Weber et al, Nature.1992; 356: 793-796）。この低い親和性は、反復された結合及び解離により、多くのＴＣＲを連続的にトリガーする（Valitutti et al, Nature.1995; 375: 148-151）、少数のペプチド−ＭＨＣ複合体を可能にするための手段であることが示唆されている。この連続的トリガーは、時間と共にシグナル伝達を維持するために重要であり、結果的に、活性化閾値へのＴ細胞の到達を可能にする（Valitutti et al, Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia et al, Cell. 1999; 96: 1-4）。この概念は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に比較して、高親和性抗−ＣＤ３抗体は、それらが１：１の化学量的にＴＣＲをトリガーするので、Ｔ細胞を効果的に刺激せず（Viola et al, Science 1996; 273: 104-106）、このことは、低親和性抗体が、反復して、解離し、そしてＣＤ３εに再結合するそれらの能力のために、ＴＣＲシグナル伝達を介してのＴ細胞の刺激において、より効果的であり得ることを示唆する発見により支持される。実際、異なった親和性ですべて結合する、抗−ＣＤ３ε抗体ＴＲ６６の３種の誘導体の直接的比較によれば、中間の親和性を有する野生型ＴＲ６６は、より高いか又はより低い親和性を有する誘導体に比較して、Ｔ細胞活性化に最良の有効性を示した（Bortoletto et al, J. Immuno.2002;32:3 02-3107）。従って、ＴＲ６６のＫ_D近くのＫ_Dが、Ｔ細胞の刺激のためには理想的である。ＴＲ６６の親和性は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技法の使用により、及びそれぞれ２．６×１０^-7Ｍ（Moore et al, Blood.201 1 ; 117: 4542-4551）及び１．０×１０^-7Ｍ（Amann et al, Cancer Res. 2008; 68: 143-151）の平衡解離定数をもたらす、フローサイトメトリーにより決定された。これに伴い、１０^-8Ｍ未満の親和性を有する抗−ＣＤ３抗体（米国特許第７，１１２，３２４号）を使用することが推薦されており、そしてヒト治療用途のために公開されたＴ細胞−刺激抗体は、同じ範囲でヒトＣＤ３εへの親和性で結合する。従って、連続的ＴＣＲトリガーの理論によれば、及び抗−ＣＤ３ε抗体についての公開された結果と一致して、公開された親和性よりも有意に良好な親和性を有するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞のより有能な刺激因子であることは予想されないが、しかし対照的に、より弱い活性化因子であることが予想される。

ＣＤ３εに対する公開された抗体のいくつかは、Ｔ細胞調製物による動物の免疫化、及びいわゆるハイブリドーマ方法によるモノクローナル抗体の続く単離を介して生成されて来た。このアプローチの弱点は、一方では、動物における外来性（ヒト）Ｔ細胞の種々の抗原に対する非選択的免疫応答、及び他方では、ハイブリドーマ方法の不良な効率が、Ｔ細胞−刺激活性を有するモノクローナル抗体を同定する確立を低め、また、それらのアゴニスト抗体が抗−ＣＤ３ε抗体全体において少数派を表すためである。標的化されたエピトープに及ぶ線状ペプチドによる免疫化が免疫応答の選択性を高めるが、しかしながら、ネイティブ完全長ＣＤ３εを認識しないか、又は非最適ＴＣＲ刺激を発揮することができる抗体をもたらすことができる。

他のタイプＩトランスメンブランタンパク質による動物の免疫化のために、精製された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いることが特に有用であった。しかしながら、ＣＤ３εの精製されたＥＣＤは凝集する傾向があり、そして凝集物は、ネイティブタンパク質に比べて、変更された構造を有する。さらに、このアプローチは、ＣＤ３εとＣＤ３γとの間のインターフェースに結合する抗体を優先的に導くことができる。対照的に、柔軟なペプチドリンカーにより結合される、一本鎖タンパク質として精製されるＣＤ３ε及びＣＤ３γの複合体は、モノマー画分及びその天然のコンホメーション下で精製され得る（Kim et al, JMB.2000; 302: 899-916）。しかしながら、そのようなＣＤ３ε／γ一本鎖タンパク質による動物の免疫化は、アンタゴニスト効果をもたらすであろう、ＣＤ３ε及びＣＤ３γに同時に結合する抗体を導くことができる。

ヒトＣＤ３εに対して向けられたいくつかの抗体は、これまで開発されている。

モノクローナル抗体ＳＰ３４は、非ヒト霊長類ＣＤ３と交差反応し、そしてまた、ヒト及び非ヒト霊長類ＰＢＭＣ上で細胞増殖を誘発することもできるネズミ抗体である（Pessano et al., The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20-kD T3 (Τ3δ and Τ3ε) subunits. EMBO J 4 (1985) 337-344）。

国際公開第２００７／０４２２６１号及び国際公開第２００８／１１９５６７号（両者ともMicrometに譲渡されている）は、それぞれ、ＣＤ３εにおいて、エピトープＦＳＥＸＥ及びＱＤＧＮＥに対して向けられた交差反応性結合体を開示する。付与された欧州特許ＥＰ２１５５７８３号（国際公開第２００８／１１９５６７号の広域段階に基づかれる）に対するいくつかの異議申立入により提出された異議申立手続きにおいて、ＳＰ３４がエピトープＱＤＧＮＥにも結合することが提出されている。

しかしながら、多くの試みが、抗−ＣＤ３抗体を得るための、又は特に有用な性質を有する、一般的に結合分子への問題に対処するためになされてきた事実にもかかわらず、これまで、それらの試みは限られた成功を収めて来た。

従って、高い効力のために制限されない高親和性のための新規ＣＤ３結合分子、特に新規抗−ＣＤ３抗体を開発する大きな満たされていない必要性が依然として残っている。さらに、他の種、特に非ヒト霊長類、例えばカニクイザルと交差反応性である、高親和性のための新規ＣＤ３結合分子、特に新規抗−ＣＤ３抗体を開発する大きな満たされてない必要性が依然として存在する。

この問題の解決策は、CD3結合抗体、特に本出願、特に実施例に開示される抗-CD3抗体により提供される。これらの抗体は、ウサギの遺伝学的免疫化及び親和性成熟記憶Ｂ細胞のスクリーニングにより得られ、そしてこれまで先行技術によって達成もまた、示唆もされていない新規アゴニストエピトープに対する特異性を有することを示すことができた。

種々の悪性腫瘍の抗体に基づく治療、並びに感染性疾患及び自己免疫性疾患の潜在的な治療の将来有望なアプローチは、二重特異性抗体を用いて標的細胞を特異的に溶解するように免疫エフェクター細胞を再命令することである。二重特異性抗体は、標的細胞の表面で特定の抗原を認識し、そして同時にナチュラルキラー（NK)や細胞傷害性T（Tc）細胞などの免疫エフェクター細胞の表面分子を活性化して、それにより標的細胞を殺傷する。

二重特異性抗体のコンセプトは、例えば癌治療において使用されており、ここで癌細胞上の癌抗原に結合すると同時に、例えば細胞傷害性T細胞上に存在するCD３のε鎖に結合する二重特異性抗体が用いられる。そのような二重特異性抗体コンストラクトの周知の例は、BiTE（二重特異性T細胞のエンゲイジャー）フォーマットにおける抗体であり、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病の治療に用いられる「ブリナツモマブ（blinatumomab）」である。ブリナツモマブは、Mirometにより開発され、そして癌抗原CD19と細胞傷害性T細胞の表面上のCD3とに同時に結合し、それによって二つのタイプの細胞をまとめてつなぎ止め、そして細胞傷害性T細胞を活性化して、標的癌細胞を溶解させる。ブリナツモマブのCD3結合ドメインは、抗CD3ε抗体TR66に由来する。

ブリナツモマブによりにより活性化されるT細胞は、標的細胞の溶解に直接関与するグランザイムBやパーフォリンなどの細胞溶解性因子のみを産生するわけではなく、インターロイキン（IL)-２、IL-6、IL-10、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロンγ（IFNγ）やトランスフォーミング増殖因子（TNF）γなどのサイトカインも産生する。炎症誘導性サイトカイン（例えば、IL-2、Il-6、TNF及びIFNγ）が、局所的及び全身性の炎症を促進し、それにより副作用を引き起こす一方で、高濃度の免疫抑制因子（例えばIL-10及びTGFβ）は、CD８＋及び他のCD３＋エフェクター細胞の細胞溶解活性に対して負に影響しうる。

ブリナツモマブで治療された患者の大多数は、治療開始時にT細胞活性に関する弱い炎症症状を発達させる。CRS（サイトカイン放出シンドローム）は、「インフルエンザ様」の症状、例えば発熱、悪寒、及び頭痛などの症状や、血行力学的不安定性、出血、毛細血管漏出症候群、および呼吸障害の可能性により特徴付けられるより重篤な状態である。症状の重症度は異なるが、成人患者の少数の割合でグレード3以上のCRSが観察されている（32）。炎症性サイトカインIL-2、IL-6、IL-10、INFγおよびTNFαの放出は、成人および小児患者において示されている（Teachy et al., Blood.2013; 121：5154-5157; Klingerら、Blood.2012 ; 119：6226-6233）。小児研究のフェーズ１からのデータは、CRSの臨床症状を伴う炎症性サイトカイン、最も具体的にＩＬ−６及びＩＬ−１０の早期における上昇およびそれに続く減少を、より少ない程度のINFγと相関させた（Goreら、J Clin Oncol .2013; 31：10007; Zugmaierら、Blood.2013; 122（70））。最も最近の成人全L試験は、炎症性サイトカインの上昇度を、血液または骨髄における標的B細胞の頻度（Klinger et al.Blood.2012; 119：6226-6233）や、患者の転帰（Toppら、J Clin Oncol.2011; 29：2493-2498）に関連付けることができなかった。

ブリナツモマブ治療に付随する炎症促進性応答を弱めるために、現在の臨床試験では、治療開始時のデキサメタゾンの同時投与が義務づけられており、これは細胞培養実験において、T細胞の活性化や悪性B細胞に対するブリナツモマブの潜在的細胞傷害性に影響することなく、効果的にサイトカイン濃度を低下させることにより示されており（Brandlら、Cancer Immunol Immunother.2007; 56：1551-1553）、サイトカインレベルが因果的に効力に関連していないことを示唆している。 CRSのより重篤な症状を無効にする追加の治療オプションは、生命を脅かすCRSを有する小児患者において近年臨床的利益を示したIL-6受容体抗体、トシリズマブである（Teachyら、Blood.2013; 121：5154-5157） 。治療指針（therapeutic arsenal）へのこうした追加は、ステロイドで十分に管理されていない非常に重度なCRS患者において、症状をコントロールするための追加オプションを提供する。

ペプチド-MHC複合体が低い親和性および速いオフレートでTCRに結合することは十分に確立されている（Matsuiら、Science.1991; 254：1788-1791; Weberら、Nature.1992; 356：793-796） 。この低い親和性は、少数のペプチド-MHC複合体が、繰り返しの結合および解離によって多くのTCRを連続的に誘発することを可能にする手段であることが示唆されている（Valitutti et al、Nature.1995; 375：148-151）。この連続的誘発は、経時的なシグナル伝達を維持するために重要であり、T細胞が最終的に活性化閾値に達することを可能にする（Valututtiら、Immunol。Today 1997; 18：299-304; Lanzavecchiaら、Cell 1999; 96：1-4 ）。この概念は、ペプチド-MHC複合体と比較した場合、高親和性抗CD3抗体がT細胞を1：1の化学量論比で誘発するので、T細胞を効率的に刺激しないという知見によって支持され（Violaら、Science 1996; 273 ：104-106）、低親和性抗体は、CD3εに繰り返し解離して再結合する能力のため、TCRシグナル伝達を介してT細胞を刺激する上でより有効であり得ることが示唆される。実際、異なる親和性で結合する抗CD3抗体TR66の3つの誘導体の直接比較において、より高いか低い親和性を有する誘導体と比較した場合に、中間の親和性を有する野生型TR66は、T細胞の活性化において最良の効力を示した（Bortolettoら、J. Immuno.2002; 32：3102-3107）。したがって、TR66のKdあたりのKdが、T細胞の刺激に理想的である。TR66の親和性は、表面プラズモン共鳴（SPR）技術の使用ならびにフローサイトメトリーによって決定され、2.6×10^-7 M（Mooreら、Blood.2011; 117：4542- 4551）および1.0×10 ^-7 M（Amannら、Cancer Res。2008; 68：143-151）の平衡解離定数をもたらす。これに沿って、10 ^-8 M未満の親和性を有する抗CD3抗体（米国特許第7112324号）を使用することが推奨されており、ヒト治療用に公開されているT細胞刺激抗体は、同じ範囲内の親和性でヒトCD3εに結合する。したがって、連続的TCR誘発の理論に従い、かつ抗CD3抗体の公表された結果と一致して、公表されたものより有意に優れた親和性を有するモノクローナル抗体は、T細胞のより強力な刺激物質であるとは予想されず、対照的に弱いアクチベータであると予期される。

本発明、すなわちCD3結合分子、特にウサギの遺伝的免疫化及び親和性成熟された記憶B細胞のスクリーニングにより得られる抗CD3抗体、及び特にＣＤ３結合分子、特に抗ＣＤ３抗体であって、新規アゴニスト性エピトープに特異性を有する抗ＣＤ３抗体が、標的細胞の同程度又はさらに優れた効率で標的細胞を溶解を示す一方で、同時にサイトカインの低い産生をもたらす抗体を含む二重特異性分子、により提供されたこの課題に対する解決策は、従来技術により達成されていないし、示唆もされていない。

本発明は、結合領域、特に抗原−結合領域を個々に含む、ＣＤ３−結合分子、特に抗体又はその機能的フラグメントに基づく新規多重特異性分子に関し、ここで前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、ヒトＣＤ３のエピトープ、特にＣＤ３εの新規アゴニストエピトープに対して特異的であり、従来技術の抗体、特にＯＫＴ−３及び／又はＴＲ６６よりも高い親和性を有し、その一方で標的細胞の同等又はそれ以上の効率で溶解をもたらす効力を同時に示しつつ、さらにサイトカインの産生低下をもたらす。

こうして、第一態様では、本発明は少なくとも（i)標的結合部分（target-binding moiety）、及び(ii)ヒトCD３εのエピトープに特異的である結合領域を含む結合分子を含む多重特異性分子に関しており、ここで当該結合領域は、配列番号２１、２３、及び２４の群から選ばれるVLドメイン、及び配列番号２２のVHドメインを含む抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであり、但し当該VLドメインが配列番号２１である場合、当該標的結合部分はIL5Rに特異的ではない。

第二の態様では、本発明は、少なくとも（i)標的結合部分、及び(ii)以下の定義（a)〜（ｇ）の一又は複数にしたがった結合分子を含む多重特異性分子に関する：
（ａ）ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である結合領域を含む単離結合分子、特に抗原−結合領域を含む単離抗体又はその機能的フラグメントに関し、ここで前記エピトープは、結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む。
（ｂ）３．０×１０^−８Ｍ未満、特に１．５×１０^−８Ｍ未満、より特定には１．２×１０^−８Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である結合分子、特に３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメント
（ｃ）ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントである結合分子
（ｄ）ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントである結合分子
（ｅ）ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントである結合分子
（ｆ）ＩｇＧ形式で試験される場合、（ｉ）３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的であり；そして／又は（ｉｉｄ）結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、ヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である、抗原−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントである結合分子
（ｇ）当該多重特異性分子が、当該多重特異性分子と同じフォーマットでＣＤ３結合部分としてＴＲ６６を含む多重特異性コンストラクトと比較した場合に、同等又はさらにより効率的な標的細胞の溶解をもたらす効力を示す、ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原結合領域を含む抗体又は機能フラグメントである結合分子。

第３の態様によれば、本発明は、少なくとも（i)標的結合部分；及び（ii)段落[0097] − [0099]、[00102] − [00104]及び [00108]の抗体又はその機能的フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する、結合分子、特に単離抗体又は機能的フラグメントである結合分子を含む多重特異性分子に関する。

第４の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に多重特異性抗体又はその機能的多重特異性フラグメント、及び任意には、医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。

第５の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に多重特異性抗体又はその機能的多重特異性フラグメントをコードする核酸配列又はその集合物に関する。

第６の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物を含むベクター又はその集合物に関する。

第７の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物を含む宿主細胞、特に発現宿主に関する。

第８の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に多重特異性抗体又はその機能的多重特異性フラグメントの生成方法に関し、ここで前記方法は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物、又は本発明の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現する工程を含んで成る。

第９の態様によれば、本発明は、CD3ε結合抗体又はその機能フラグメントを含む、本発明の多重特異性分子の生成方法に関し、ここで前記方法は、下記工程：
ａ）ＣＤ３ε−発現プラスミドによりウサギを免疫化して、宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提示させ；
ｂ）蛍光活性化セルソーティングを用いて、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互反応する親和性成熟記憶Ｂ細胞をクローン単離し；
ｃ）選別されたクローンの不死化を必要としない、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞を培養し；
ｄ）細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいてＢ細胞培養上清液のスクリーニングを行い、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定し；
ｅ）工程ｄ）で同定された抗体、又はその機能フラグメントを、標的結合部分と組合せる
を含む。

第１０の態様では、本発明は、癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、及び神経変性疾患から選ばれる疾患の治療における使用のための、本発明の多重特異性分子に関する。

第１１の態様では、本発明は、癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、及び神経変性疾患から選ばれる疾患の治療方法であって、本発明の多重特異性分子を、必要とする患者に投与する工程を含む、治療方法に関する。

図１は、ウサギモノクローナル抗体からの連結されたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列の系統発生的クラスターリングを示す。

図２は、Jurkat Ｔ細胞への精製されたウサギモノクローナル抗体の結合を示す。

図３は、架橋された抗−ＣＤ３ε ｍＡｂによるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５．０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。 図３は、架橋された抗−ＣＤ３ε ｍＡｂによるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５．０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。

図４は、時間の経過とともに、架橋されたウサギｍＡｂによるＣＤ６９の刺激を示す。Ｔ細胞活性化を誘発する、精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体の可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。架橋された抗体は、Jurkat細胞を刺激するために５．０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、そしてＣＤ６９発現は、０、４、１５、２４、４８及び７２時間後、フローサイトメトリーにより評価された。ＣＤ６９発現の定性的検出に関しては、幾何学的平均でのシグナル強度を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、負の対照及び試験抗体の両者のために測定された。試験抗体と負の対照との間のＭＦＩの差異（ΔＭＦＩ）が、ＣＤ６９発現のために尺度として計算された。

図５は、ＣＤ３ε／ＣＤ３γを包含するＴＣＲ複合体の単純化された概略図を示す。

図６は、従来技術の抗体についての次のエピトープマッピング実験の結果を示す：（ａ）抗体ＳＰ３４のエピトープマッピング（欧州特許第２１５５７８８号のファイル履歴を参照のこと）；（ｂ）Micromet抗体のエピトープマッピング（欧州特許第２１５５７８８号／国際公開第２００８／１１９５６７号を参照のこと）；図６は、単一のアラニン変異体の結合実験の結果を示し、ここで所定の変異体についての結合の低下が、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、低いバー＝結合についての高い関連性）。

図７は、本発明の抗体についてのＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング実験の結果を示し（クローン−０２、クローン−０３、クローン−０６）；図７は、ペプチド走査分析における結合実験の結果を示す。ヒトＣＤ３εに由来する１５マー線状アレイ、すなわち各位置が１８個のアミノ酸（システインを除くすべての天然アミノ酸）により置換される残基１−１５が、エピトープに対する結合に影響を及ぼすアミノ酸特異性を研究するために、０．１μｇ／ｍｌの各抗体によりプローブされた。ＥＬＩＳＡにおける結合シグナルの低下が、（ａ）個々の各置換のために、与えられ、そして（ｂ）各位置について１８の異なった置換にわたって平均化される。図７ｂにおけるバーの高さは、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、大きなバー＝結合について高い関連性）。 図７は、本発明の抗体についてのＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング実験の結果を示し（クローン−０２、クローン−０３、クローン−０６）；図７は、ペプチド走査分析における結合実験の結果を示す。ヒトＣＤ３εに由来する１５マー線状アレイ、すなわち各位置が１８個のアミノ酸（システインを除くすべての天然アミノ酸）により置換される残基１−１５が、エピトープに対する結合に影響を及ぼすアミノ酸特異性を研究するために、０．１μｇ／ｍｌの各抗体によりプローブされた。ＥＬＩＳＡにおける結合シグナルの低下が、（ａ）個々の各置換のために、与えられ、そして（ｂ）各位置について１８の異なった置換にわたって平均化される。図７ｂにおけるバーの高さは、抗体結合についてのその対応する野生型アミノ酸残基の関連性を示唆する（すなわち、大きなバー＝結合について高い関連性）。

図８は、Jurkat Ｔ−細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合を示す。Jurkat Ｔ−細胞及びＣＤ３−陰性Jurkat細胞へのＡ）コンストラクト１、Ｂ）コンストラクト２及びＣ）コンストラクト３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞及び野生型ＣＨＯ細胞へのＤ）コンストラクト１、Ｅ）コンストラクト２及びＦ）コンストラクト３の結合が、フローサイトメトリーにより評価された。コンストラクト１、コンストラクト２及びコンストラクト３は、同じ抗−ＩＬ５Ｒ成分を有するが、しかし多様な親和性（コンストラクト１については１，１５×１０^-8Ｍ、コンストラクト２については２．９６×１０^-8Ｍ、及びコンストラクト３については２．２３×１０^-7Ｍ）でＣＤ３ニ結合する３種の異なった抗−ＣＤ３成分を有する；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。 図８は、Jurkat Ｔ−細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合を示す。Jurkat Ｔ−細胞及びＣＤ３−陰性Jurkat細胞へのＡ）コンストラクト１、Ｂ）コンストラクト２及びＣ）コンストラクト３の結合、及びＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞及び野生型ＣＨＯ細胞へのＤ）コンストラクト１、Ｅ）コンストラクト２及びＦ）コンストラクト３の結合が、フローサイトメトリーにより評価された。コンストラクト１、コンストラクト２及びコンストラクト３は、同じ抗−ＩＬ５Ｒ成分を有するが、しかし多様な親和性（コンストラクト１については１，１５×１０^-8Ｍ、コンストラクト２については２．９６×１０^-8Ｍ、及びコンストラクト３については２．２３×１０^-7Ｍ）でＣＤ３ニ結合する３種の異なった抗−ＣＤ３成分を有する；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

図９は、ｓｃＤｂによる細胞傷害性Ｔ−細胞と標的細胞との架橋によるインターロイキン−２分泌の特異的刺激を示す。ＣＤ８＋ Ｔ−細胞が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で、上昇する濃度のｓｃＤｂと共にインキュベートされた。培養上清液におけるインターロイキン−２濃度が、インキュベーションの１６時間後、ＥＬＩＳＡにより測定された；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

図１０は、抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂによるヒトＩＬ５Ｒ−発現ＣＨＯ細胞の特異的溶解を示す。ＣＨ８＋ Ｔ−細胞が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ細胞の存在下で上昇する濃度のｓｃＤｂと共にインキュベートされた。標的細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ又はＣＨＯ）が、緑色細胞毒性色素により標識され、そして細胞溶解が、インキュベーションの８８時間後、蛍光強度の測定により決定された；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含み；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む。

図１１は、二重特異性抗ＩＬ５Ｒ×ＣＤ３ｓｃＤｂｓにより再配向されたＣＤ８＋Ｔ細胞による標的細胞の用量依存的溶解を示す。ヒトＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞をナイーブヒトＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）とインキュベートし、そしてｓｃＤｂｓの濃度を増加させた。異なるドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて２つの独立実験（Ａ及びＢ）が示された。両方のｓｃＤｂｓは、同一の抗ＩＬ５Ｒドメインを含むが、異なる抗ＣＤ３ドメインを含んだ。Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３可変ドメイン（ヒト化クローン６）を含むｓｃＤｂは、全ての時点及び試験された濃度においてより高い最大溶解を示す。このｓｃＤｂを用いた最大溶解は、ＴＲ６６抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂと比較して低い濃度で達成される。さらに、高い濃度でほぼ完全な標的細胞溶解の（特に早い時点で）抑制を示すＴＲ６６を含むｓｃＤｂとは対照的に、クローン６由来の抗ＣＤ４ドメインを有するｓｃＤｂは、高いｓｃＤｂ濃度で維持された溶解活性を示す。

図１２は、再配向されたＣＤ８＋Ｔ細胞による用量依存的な標的細胞溶解とサイトカイン産生との相関を示す。ヒトＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞を、ナイーブなヒトＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）およびｓｃＤｂの濃度を６４時間にわたり増加させながらインキュベートした。Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３可変ドメイン（ヒト化クローン６）またはＴＲ６６の可変ドメインを含む抗ＩＬ５ＲｘＣＤ３ｓｃＤｂの両方の効力は非常に類似しているが（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）およびＩＦＮγ（Ｃ）によって示されるサイトカイン産生の用量依存性には著しい差がある。例えば、０．８ｎＭでは、Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂは、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂよりも大きな溶解を示すが、サイトカイン、ＴＮＦａおよびＩＦＮｙの両方は、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂで測定された濃度の約５０％にしか達しない。ＴＲ６６を含むｓｃＤｂの高濃度での標的細胞溶解の観察された落ち込みに沿って、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生も高濃度で減少した。 図１２は、再配向されたＣＤ８＋Ｔ細胞による用量依存的な標的細胞溶解とサイトカイン産生との相関を示す。ヒトＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞を、ナイーブなヒトＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）およびｓｃＤｂの濃度を６４時間にわたり増加させながらインキュベートした。Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３可変ドメイン（ヒト化クローン６）またはＴＲ６６の可変ドメインを含む抗ＩＬ５ＲｘＣＤ３ｓｃＤｂの両方の効力は非常に類似しているが（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）およびＩＦＮγ（Ｃ）によって示されるサイトカイン産生の用量依存性には著しい差がある。例えば、０．８ｎＭでは、Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂは、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂよりも大きな溶解を示すが、サイトカイン、ＴＮＦａおよびＩＦＮｙの両方は、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂで測定された濃度の約５０％にしか達しない。ＴＲ６６を含むｓｃＤｂの高濃度での標的細胞溶解の観察された落ち込みに沿って、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生も高濃度で減少した。 図１２は、再配向されたＣＤ８＋Ｔ細胞による用量依存的な標的細胞溶解とサイトカイン産生との相関を示す。ヒトＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞を、ナイーブなヒトＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）およびｓｃＤｂの濃度を６４時間にわたり増加させながらインキュベートした。Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３可変ドメイン（ヒト化クローン６）またはＴＲ６６の可変ドメインを含む抗ＩＬ５ＲｘＣＤ３ｓｃＤｂの両方の効力は非常に類似しているが（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）およびＩＦＮγ（Ｃ）によって示されるサイトカイン産生の用量依存性には著しい差がある。例えば、０．８ｎＭでは、Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂは、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂよりも大きな溶解を示すが、サイトカイン、ＴＮＦａおよびＩＦＮｙの両方は、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂで測定された濃度の約５０％にしか達しない。ＴＲ６６を含むｓｃＤｂの高濃度での標的細胞溶解の観察された落ち込みに沿って、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生も高濃度で減少した。

図１３は、ＩＬ−５Ｒ発現ＣＨＯ細胞の存在下または非存在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の早期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現を誘導する抗ＩＬ５Ｒ×ＣＤ３のｓｃＤｂの効力を示す。ヒトＩＬ５Ｒ＋およびｈＩＬ５Ｒ−ＣＨＯ細胞を、ナイーブなヒトＣＤ８＋細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）とインキュベートし、ｓｃＤｂの濃度を１８時間にわたり上昇させた。ＣＤ６９発現は、１８時間のインキュベート後にフローサイトメトリーによって評価した。Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３可変ドメイン（ヒト化クローン６）またはＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂは両方とも、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する非常に類似の効力を示し、Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３は低濃度でＣＤ６９発現のわずかに弱い誘導を示した。４ｎＭでのピーク後にＣＤ６９発現が落ち込むＴＲ６６とは対照的に、Ｎｕｍａｂ抗ＣＤ３の濃度が増加するとＣＤ６９発現は着実に増加した。

ＣＤ３結合分子を含む以前の二重特異性分子と比較した本発明の特異性は、新規の多重特異性分子が従来技術の抗体、特にＯＫＴ−３および／またはＴＲ６６よりも高い親和性を有するＣＤ３−結合分子を含むという事実であり、標的細胞の同等又はそれ以上の効率で溶解をもたらす効力を示すと同時に、サイトカインの低い産生をもたらす。

多重特異性分子に取り込まれた場合に、ａ）標的細胞の同様のまたはより効率的な溶解をもたらし、ｂ）サイトカインの産生を低下させる抗ＣＤ３ドメインは、より良好に同様に有効な用量を適用することを可能にするであろう最大許容用量をより有効なレベルにシフトさせることができる。これは、ＴＲ６６のような従来のＣＤ３結合ドメインによるＴ細胞活性化の際に産生されるサイトカインに特に感受性である患者の治療において有益であり、そしてさらに生命を脅かさない適応症においてＴ細胞再配向性治療を活用するために有益であろう。のような結果が実現可能であるとの示唆は、欧州特許第２２５７５３Ｂ１号の出願人によって、２０１４年１０月２日出願の提出物により提供されており、これは特許付与に対する異議手続の間に欧州特許庁に提出されたものである。

本出願は、二重特異性ｓｃＤｂ抗体フラグメントに組み込まれたＴＲ６６の可変ドメインと比較した場合に、（ｉ）標的細胞のより完全な溶解を誘導し、（ｉｉ）特異的標的細胞の同等の効力をを示し、（ｉｉｉ）最大有効濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生されるサイトカインの産生の低下をもたらし、そして（ｉｖ）維持されたＴ細胞活性を示し、かつより広い範囲の濃度にわたり標的細胞溶解を示す、新規のヒト化CD3結合抗体可変ドメインを記載する。

特に、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインとしてヒト化クローン６を含む標的細胞に、ＣＤ３＋Ｔ細胞を再標的化する二重特異性または多重特異性タンパク質は、TR66の可変ドメインを含む同様のタンパク質と比較した場合に、最大有効濃度において、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、IL-6、IL-10の酸性の低下をもたらす。

さらに、ＣＤ３＋Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を溶解し、本明細書に記載のＣＤ３結合ドメインとしてヒト化クローン６を含む二重特異性または多重特異性タンパク質は、T細胞活性の抑制に関与する因子ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＬＡＧ−３などの発現の低下をもたらす。

したがって、第1の態様において、本発明は、少なくとも（i）標的結合部分; 及び（ii）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的である結合領域を含む結合分子を含む多重特異性分子であって、前記結合領域が、配列番号２1、２３、及び２４の群から選ばれるVLドメイン、及び配列番号２２のVHドメインを含む、抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであり、但し当該VLドメインが配列番号２１である場合、当該標的結合部分はIL5Rに特異的ではない、多重特異性分子に関する。

特定の実施形態では、前記標的部分はＩＬ２３Ｒに特異的である。特定の実施形態では、前記標的部分は、配列番号２５、２６および２７の群から選択されるＶＬドメインと、配列番号２８のＶＨドメインとを含む抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである。

第2の態様において、本発明は、少なくとも（i）標的結合部分; （ii）以下の定義（a）〜（f）の1つ以上に従う結合分子である結合分子を含む多重特異性分子に関する：
（ａ）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的な結合領域を含む結合分子であって、当該エピトープが、アミノ酸残基Ｎ４を結合に重要である残基として含む、結合分子、特に抗原結合領域を含む抗体またはその機能的断片；
（ｂ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的な結合分子であって、前記結合分子が、ヒトＣＤ３に一価結合の解離定数が３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8未満、そして最も特に１．０×１０^-8未満で結合する、結合分子、特にヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであって、当該抗体又はその機能フラグメントが、ヒトＣＤ３に一価結合の解離定数が３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8未満、さらにより具体的に１．２×１０^-8Ｍ未満、そして最も特に１．０×１０^-8未満で結合する、抗体又はその機能フラグメント；
（ｃ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである結合分子であって、前記抗体またはその機能フラグメントが、ＩｇＧ形式で試験されたときに、架橋の際に、１．２５μg／ｍｌのＩｇＧ濃度で刺激の２４時間後に抗体ＯＫＴ−３またはＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強いＴ細胞活性化を誘発する、結合分子；
（ｄ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的な抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである結合分子であって、前記抗体またはその機能フラグメントが、架橋時にＩｇＧ形式で試験された場合に１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で７２時間の刺激後にＣＤ６９発現が少なくとも１．５倍増加することにより示されるように、抗体ＯＫＴ−３またはＴＲ６６よりも長く持続するＴ細胞活性化をもたらす、前記結合分子；
（ｅ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである結合分子であって、該抗体またはその機能フラグメントが、ＩｇＧ形式で試験された場合に、架橋の際に、Ｔ細胞の用量依存的な均一な活性化状態をもたらす、前記結合分子；
（ｆ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的な抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである結合分子であって、前記抗体またはその機能フラグメントが、ＩｇＧ形式で試験された場合、（ｉ）３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より具体的に１．２×１０^-8Ｍ未満、最も具体的に１．０×１０^-8未満の一価結合の解離定数でヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋時に、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で刺激の２４時間後に抗体ＯＫＴ−３またはＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強力なＴ細胞活性化を誘導し;（ｉｉｂ）ＩｇＧ濃度１．２５μｇ／ｍｌで７２時間の刺激後にＣＤ６９発現が少なくとも１．５倍増加することにより示されるように、抗体ＯＫＴ−３またはＴＲ６６よりも長く持続するＴ細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存的均一活性化状態をもたらし；および／または（ｉｉｄ）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的であり、当該エピトープが、結合に必須である残基としてアミノ酸残基N4を含む、結合分子；そして
（ｇ）ヒトＣＤ３のエピトープに特異的な抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントである結合分子であって、前記多重特異性分子が、当該多重特異性分子と同じフォーマットで、ＣＤ３結合部分としてＴＲ６６を含む多重特異性コンストラクトと比較した場合に、標的細胞の同等又はさらにより効率的な溶解をもたらす効力を示す一方で、同時に低下したサイトカイン産生をもたらす、結合分子。

本発明の文脈において、「多重特異性分子」という用語は、少なくとも2つの結合特異性、すなわち同種標的に特異的である少なくとも2つの結合部位を含む分子を指す。この用語の定義には、非限定的に、２つの結合部位からなる二重特異性分子、例えば一本鎖ダイアボディ（scDb）など、少なくとも１つの結合部位の２又はそれ以上のコピーを含む二重特異性分子、例えばタンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）；又は３つの結合部位からなる三重特異性分子、例えばトリボディまたはトリアボディが含まれる。特定の実施形態では、多重特異性分子は二重特異性分子である。他の特定の実施形態では、多重特異性分子は三重特異性分子である。

特定の実施形態では、標的結合部分は、細胞の表面上に存在する標的に対する結合特異性を有する結合部分である。特定の実施形態では、当該標的は以下の：
である。特定の実施形態では、標的は、以下の：インターロイキン-２３受容体（IL-23R)、IL12R-β１、IL12Rβ２、CCR6、CCR４、CXCR4、HER1、HER2、及びHER３の群から選ばれる。特定の実施形態では、標的は、IL5Rではない。

特定の実施形態では、結合分子は、ヒトCD3εのエピトープに特異的な結合領域を含む結合分子、特に抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントであり、当該エピトープは、結合に重要である残基として、N4アミノ酸残基を含む。

本発明に関しては、アミノ酸残基は、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合分子の結合親和性が、野生型ペプチド配列への結合親和性の少なくとも５０％、特に少なくとも２５％、より特定には少なくとも１０％、及び最も特定には少なくとも５％低められる場合、すなわち前記重要なアミノ酸残基がアラニンにより置換される場合、そして／又は実施例７のＥＬＩＳＡにより決定されるように、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合に起因する平均シグナル強度が、野生型ペプチド配列への結合シグナルの少なくとも５０％、特に少なくとも２５％、及び最も特定には少なくとも１０％低められる場合、すなわち前記重要なアミノ酸残基がシステインを除く他の天然の各アミノ酸残基により、別々に置換される場合、「結合のために重要である（critical for binding）」として見なされる。

特定の実施形態によれば、前記エピトープはさらに、結合に関与する残基として、アミノ酸残基Ｅ６を含む。特定の実施形態によれば、前記エピトープはさらに、結合のために重要である残基として、アミノ酸残基Ｅ６を含む。

本発明に関して、アミノ酸残基は、結合分子の結合親和性が少なくとも８０％まで低められる場合、すなわち前記アミノ酸残基がアラニンにより置換される場合、そして／又は実施例７のＥＬＩＳＡにより決定されるように、前記アミノ酸残基位置を含むペプチドへの結合に起因する平均シグナル強度が少なくとも８０％に低められる場合、すなわち、前記アミノ酸残基がシステインを除く他の天然の各アミノ酸残基により別々に置換される場合、「結合に関与する（involved in binding）」として見なされる。

特定の実施形態において、CD3eの残基Q1、D2、G3およびE5の少なくとも1つは、結合に重要ではない。特定の実施形態では、CD3eの残基Q1、D2、G3およびE5の少なくとも2つは結合に重要ではなく、特にCD3eの少なくとも3つ、特に残基Q1、D2、G3およびE5の4つすべては結合に重要ではない。

本発明の文脈において、重要でないアミノ酸残基がアラニンにより置換された場合であって、そのアミノ酸残基位置を含むペプチドに対する結合分子の結合親和性が、野生型ペプチド配列に対する結合親和性の８０％以上、より具体的には９０％以上、そして最も具体的には９５％以上に低下する場合に、及び/又は重要でないアミノ酸残基が、システインを除く他の天然アミノ酸残基の各々により別々に交換される場合であって、実施例７のELISAにより測定されるアミノ酸残基の位置を含むペプチドへの結合から生じる平均シグナル強度が、野生型ペプチド配列に対する結合シグナルの５０％以上に、特に７０％以上、より具体的にには８０％以上に、そして最も具体的には９０％以上に低下した場合に、アミノ酸残基が「結合にとって重要ではない」であると考えられるべきである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための平衡解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発する、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、ＯＫＴ−３又はＴＲ６６による活性化に比較して、低い不均一性である、Ｔ−細胞の用量依存性活性化状態をもたらす抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、結合分子は、３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的であるＣＤ３−結合分子、特に３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含んでなる抗体又はその機能的フラグメントである。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発する、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントに関する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る単離抗体又はその機能的フラグメントに関する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、架橋される際に、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗体−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントに関する。

特定の実施形態によれば、前記結合分子、特に前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

特定の実施形態によれば、結合分子は、ＩｇＧ形式で試験される場合、（ｉ）３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０−８Ｍ未満の一価結合のための解離定数を有するヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋に基づいて、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の２４時間後、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍、強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での刺激の７２時間後、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍高い増加により示されるように、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらし；そして／又は（ｉｉｄ）結合のために重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含むヒトＣＤ３εのエピトープに対して特異的である、抗原−結合領域を含んで成る抗体又はその機能的フラグメントに関する。

特定の実施形態では、結合分子は、ヒトCD3のエピトープに特異的な抗原結合領域を含む抗体またはその機能フラグメントであり、前記多重特異性分子は、前記多重特異的分子と同じフォーマットでCD3結合部分としてTR66を含む多重特異性コンストラクトと比較した場合に同等又はさらに優れた効率の標的細胞の溶解をもたらす効力を示し、その一方で同時にサイトカインの産生を低下させる。

本発明の文脈において、「効力」という用語は、ED50濃度と細胞溶解の程度との組み合わせを指す。さらに、本発明の文脈において、「サイトカイン産生の低下」という用語は、標的細胞の最大溶解をもたらす本発明の多重特異性分子の最低濃度で測定した、培地中のサイトカインのレベルが、当業者に周知の方法（例えば、ELISA）を使用して、CD3結合ドメインとしてのTR66を含む同じ多重特異性分子と比較して、10％、好ましくは20％、より好ましくは35％、最も好ましくは50％低いという事象を指す。

特定のそのような実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、さらに、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

本発明に関しては、用語「抗体」（antibody）とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＢ、ＩｇＡ又はＩｇＤ（又はそれらの何れかのサブクラス）に属するタンパク質として定義され、そしてすべての従来の公知抗体及びそれらの機能的フラグメントを包含する、「免疫グロブリン」（immunoglobulin）(Ｉｇ)の同義語として使用される。抗体／免疫グロブリンの「機能意的フラグメント」（functional fragment）は、抗原−結合領域を保持する、抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原−結合領域」（antigen-binding region）は典型的には、抗体の１又は２以上の超可変領域、すなわちＣＤＲ−１、−２及び／又は−３領域に見出されるが；しかしながら、その可変「骨格」（framework）領域はまた、例えばＣＤＲのための足場を提供することにより、抗原結合において重要な役割も演じることができる。好ましくは、「抗原−結合領域」（antigen-binding region）は、可変Ｌ鎖（ＶＬ）の少なくともアミノ酸残基４−１０３及び可変Ｈ鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基５−１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３−１０７及びＶＨのアミノ酸残基４−１１１を含み、そして完全ＶＬ及びＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１−１０９及びＶＨの１−１１３；国際公開第９７／０８３２０号に従っての番号付け）が特に好ましい。ウサギ抗体の場合、ＣＤＲ領域が表４に示されている（下記参考のこと）。本発明に使用のための好ましい種類の免疫グロブリンはＩｇＧである。本発明の「機能的フラグメント」（functional fragments）は、Ｆ（ａｂ‘）₂フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖのドメインを含む。（Ｆ（ａｂ’）₂又はＦａｂは、ＣＨ１とＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最少にするか、又は完全に除去するよう構築され得る。

本明細書において使用される場合、結合分子は、結合特異性は絶対的ではないが、しかし相対的性質であるので、そのような結合分子がそのような標的生体分子と、１又は２以上の参照分子との間を区別できるので、標的物、例えばヒトＣＤ３（又はヒトＣＤ３のエピトープ）、「に対して特異的であり」（specific to/for）、「特異的に認識し」（specifically recognizes）、又は「特異的に結合する」（specifically binds to）。その最も一般的な形で（及び定義される参照が言及されていない場合）、「特異的結合」（specific binding）とは、当業界において公知の特異性アッセイ方法に従って決定される場合、目的の生体分子と無関係な生体分子との間を区別する結合分子の能力を言及する。そのような方法は、ウェスターンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ試験及びペプチド走査を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイが実施され得る。スコアリングは、標準的発色（例えば、二次抗体とホースラディシュペルオキシダーゼ及びテトラメチルベンジジンと過酸化水素）により実施され得る。特定ウェル中の反応が、例えば４５０ｎｍでの光学密度によりスコアリングされる。典型的なバックグラウンド（＝負の反応）は、約０．１のＯＤであり得；典型的な陽性反応は、約１のＯＤであり得る。これは、正の評点と負の評点との間の比が１０倍又はそれ以上であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照生体分子ではなく、約３〜５種の無関係生体分子、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン又は同様のものを用いることにより実施される。具体的な実施形態では、結合特異性の決定は、ミルク粉末、BSA、及びトランスフェリンをレファレンスとして使用することにより行われる。

本発明においては、用語「約」（about）又は「およそ」（approximately）とは、所定の値又は範囲の９０％〜１１０％を意味する。

しかしながら、「特異的結合」（specific binding）とはまた、参照点として使用される、標的生体分子と１又は２以上の密接に関連する生体分子との間を区別する結合分子の能力を言及することができる。さらに、「特異的結合」（specific binding）は、その標的抗原の異なった部分、例えば標的生体分子の異なったドメイン、領域又はエピトープ間、又は標的生体分子の１又は２以上のキーアミノ酸残基又は一定長のアミノ酸残基間を区別する結合分子の能力に関連する。したがって、特定の実施形態では、ヒト標的上の特定のエピトープへの特異的な結合は、非ヒト標的が同一、又は少なくともかなり近いエピトープを含む状況において、非ヒト標的に結合することを排除しないし、要求すらする。

本発明においては、用語「エピトープ」（epitope）とは、標的生体分子と結合分子との間の特異的結合のために必要とされる所定の標的生体分子のその部分を言及する。エピトープは、連続的であり得、すなわち標的生体分子に存在する隣接する構造要素により形成されるか、又は不連続であり得、すなわち標的生体分子の一次配列において、例えば標的物としてのタンパク質のアミノ酸配列において異なった位置で存在する構造要素により形成される。

１つの実施形態によれば、エピトープは、ヒトＣＤ３のε鎖上に位置する。

特定の実施形態によれば、ヒトＣＤ３εへの前記結合は、表面プラスモン共鳴実験を用いて、ヒト起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞該ドメインへの、ＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントの親和性を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例１に示されるように、使用される：ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ計器（Sierra Sensors）；捕捉抗体：標準のアミンカップリング法を用いて、ＳＰＲ−２ Affinity Sensorチップ、Amine, Sierra Sensors上に固定された前記ＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体；９０−２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインの二倍連続希釈、流動細胞中への３分間の注入及びセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の５分間の解離、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入での各注入サイクル後の表面再生、one−to−one Langmuir結合モデルを用いて、Ｍａｓｓ−１分析ソフトウェア（Analyzer、Sierra Sensors）による見掛け解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_D）の計算。

特定の実施形態によれば、(ｉｉａ)及び／又は(ｌｉｃ)に従ってのＴ−細胞活性化の前記誘発は、ＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例３に示されるようにして使用される：３倍過剰の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗体−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋しているＯＫＴ３（BioLegend, カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novns Biolgicals、カタログ番号ＮＢＰ1−９９４４６））の添加による事前の架橋後において、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントにより、２４時間のJurkat細胞（１００，０００個の細胞／ウェル）を刺激する；刺激後にＣＤ６９発現を、ヒトＣＤ６９に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体（BioLegend，カタログ番号３１０９０６）を使用して細胞染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ aria III、Becton Dickinson）により分析する；陰性対照：前記架橋抗体とインキュベートされた未刺激刺のJurkat細胞を前記抗−ＣＤ６９抗体により染色する。

特定の実施形態によれば、(ｉｉｂ)に従っての前記長く持続するＴ−細胞活性化は、ＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激の経時を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例３に示されるようにして使用される：段落［００９０] のようにして架橋された、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメント、抗−ＣＤ３抗体による、０，４，１５，２４，４８及び７２時間の１００，０００個のJurkat細胞／ウェルの刺激、及び段落[００９０]に記載のフローサイトメーターによるＣＤ６９発現の分析。

特定の実施形態によれば、(ｉｉａ)及び／又は(ｌｉｃ)に従ってのＴ−細胞活性化の前記誘発は、ＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントによるＩＬ−２分泌の刺激を決定することにより決定される。

特定の実施形態によれば、次の条件が、実施例４に示されるようにして使用される：５μｇ／ｍｌの濃度でのＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞（２００，０００個の細胞／ウェル）の下記４種の異なったアッセイ設定を用いての刺激：（ａ）３倍高い濃度の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋する、ＯＫＴ３（BilLegend、カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novus Biologicals, カタログ番号ＮＢＰ−９７４４６））の添加により架橋された、ＩｇＧ形成での前記抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞の刺激；（ｂ）架橋抗体の不在下でのＴ−細胞活性化；（ｃ）一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上への前記架橋抗体の固定化；（ｄ）架橋抗体の不在下での一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上へのＩｇＧ形式での前記抗体又はその機能的フラグメント（又は対照抗体）の固定化；各設定においては、添加の１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡによる細胞の刺激及び２４、４８及び７２時間後での上清液の収集、ＩＬ−２放出の測定、市販のELISA（Biolegenｄ、カタログ番号４３１８０１）を用いての定量化を伴う。

特定の実施形態によれば、前記単離抗体又はその機能的フラグメントは、(ｉ)ウサギ抗体又はその機能的フラグメント、又は(ii)（i）の前記ウサギ抗体又はその機能的フラグメントをヒト化することに得られる抗体又はその機能的フラグメントである。

ウサギ抗体のヒト化のための方法は、当業者の誰にでも良く知られている（例えば、Borras et al., J Biol Chem. 2010 Mar 19;285(12):9054-66; Rader et al, The FASEB Journal, express article 10.1096/fj.02-0281 fje, published online October 18, 2002; Yu et al (2010) A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models. PLoS ONE 5(2): e9072. doi:10.1371/journal.pone.0009072を参照のこと）。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）を含む抗原−結合領域を含む。特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１、２３及び２４に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含み、そしてＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１、２３及び２４に存在するフレームワークドメインの変異体であるフレームワークドメインを含み、そして／又はＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインの変異体、特に配列番号２１、２３及び２４及び／又は２２に存在するその対応するヒト受容体アミノ酸残基の代わりに、１又は２以上の非ヒトドナーアミノ酸残基、特に配列番号１−２０から選択された配列の１つに存在するドナーアミノ酸残基を含む変異体であるフレームワークドメインを含む。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）を含む抗原−結合領域を含む。特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含み、そしてＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＬドメインは、配列番号２１に存在するフレームワークドメインの変異体であるフレームワークドメインを含み、そして／又はＶＨドメインは、配列番号２２に存在するフレームワークドメインの変異体、特に配列番号２１及び／又は２２に存在するその対応するヒト受容体アミノ酸残基の代わりに、１又は２以上の非ヒトドナーアミノ酸残基、特に配列番号１−２０から選択された配列の１つに存在するドナーアミノ酸残基を含む変異体であるフレームワークドメインを含む。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０から選択されたＶＨドメインの変異体であり、そして／又はＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９から選択されたＶＬドメインの変異体、特にフレームワークドメイン、及び／又は抗原結合に関与しないＣＤＲ残基に、１又は２以上のアミノ酸残基置換を含む変異体である。

高く保存された残基（特に、一定に維持される）及び多彩な配列位置（特に、その位置で天然において見出される残基の１つにより修飾され得る）の存在について相同配列群の分析を包含する、相同アミノ酸残基による、置換のために適切なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基の同定方法は、当業者に良く知られている。

抗体結合ドメインの構造、特に抗原−相互作用残基（特に、一定に維持される）及び抗原と接触して存在しない配列位置（修飾され得る）の存在について抗原との複合体中の抗体血結合ドメインの構造の分析を包含する、相同アミノ酸残基による、置換のために適切なＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基の同定方法は、当業者に良く知られている。

特に他の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、及び２４、特に配列番号３、５、９、２１、２３及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３及び２４から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む。他の特定の実施形態によれば、ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメインの変異体であり、そして／又はＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、及び２４、特に配列番号３、５、９、２１、２３及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３、及び２４から選択されたＶＬドメインの変異体、特にフレームワークドメイン、及び／又は抗原結合に関与しないＣＤＲ残基に、１又は２以上のアミノ酸残基置換を含む変異体である。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号 １/配列番号 ２; 配列番号 ３/配列番号 ４; 配列番号 ５/配列番号 ６; 配列番号 ７/配列番号 ８、配列番号 ９/配列番号 １０、配列番号 １１/配列番号 １２、配列番号 １３/配列番号 １４、配列番号 １５/配列番号 １６、配列番号 １７/配列番号 １８、及び配列番号 １９/配列番号 ２０、特に配列番号 ３/配列番号 ４; 配列番号 ５/配列番号 ６; 及び配列番号 ９/配列番号 １０、より特定には配列番号 ９/配列番号 １０から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む。特に他の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号 １/配列番号 ２; 配列番号 ３/配列番号 ４; 配列番号 ５/配列番号 ６; 配列番号 ７/配列番号 ８、配列番号 ９/配列番号 １０、配列番号 １１/配列番号 １２、配列番号 １３/配列番号 １４、配列番号 １５/配列番号 １６、配列番号 １７/配列番号 １８、及び配列番号 １９/配列番号 ２０、特に配列番号 ３/配列番号 ４; 配列番号 ５/配列番号 ６; 及び配列番号 ９/配列番号 １０、より特定には配列番号 ９/配列番号 １０から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せの変異体を含む抗原−結合領域を含み、ここでそのような変異体においては、少なくともＶＬ又はＶＨドメインは、列挙されるＶＬ／ＶＨドメインの変異体である。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的にフラグメントは、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２２、及び配列番号２４／配列番号２２のＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む。別の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２２、及び配列番号２４／配列番号２２のＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域の変異体を含み、ここでそのような変異体においては、少なくともＶＬ又はＶＨドメインは、列挙されるＶＬ／ＶＨドメインのうちの１の変異体である。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、本明細書に開示される配列の変異体である抗原−結合領域を含む。従って、本発明は、配列番号１−２０を含む、抗体又はその機能的フラグメントの性質、特に配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０、特に配列番号４、６及び１０、より特定に配列番号１０に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の配列同一性、より特定には少なくとも８０％の配列同一性、及び最も特定には、少なくとも９０％の配列同一性、及び／又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０、特に配列番号４、６、及び１０、より特定には配列番号１０に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも８０％の配列相同性、より特定には少なくとも９０％の配列相同性、及び最も特定には少なくとも９５％の配列相同性を有するＨ鎖アミノ酸配列、及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の配列同一性、より特定には少なくとも８０％の配列同一性、及び最も特定には、少なくとも９０％の配列同一性、及び／又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９、特に配列番号３、５、及び９、より特定には配列番号９に含まれるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域における少なくとも８０％の配列相同性、より特定には少なくとも９０％の配列相同性、最も特定には少なくとも９５％の配列相同性を有するＬ鎖アミノ酸配列を含む、セクション［００５７］、［００５９］、[００６１]、［００６４］―[００６９]、［００７７］及び［００７８］に定義される性質の１又は２以上の性質を有する単離抗体又はその機能的フラグメントを包含する。例えば、相同性検索マトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ（Henikoff, S. & Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919）を用いることによる配列相同性の決定方法、及び相同性に従っての配列の分類方法は、当業者に良く知られている。

特定の実施形態によれば、そのような変異体は、配列番号１９のＶＬ配列に従ってのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列の組を含むＶＬ配列、及び／又は配列番号２０のＶＨ配列に従ってのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列の組を含むＶＨ配列を含み、ここで各場合、配列番号１９及び／又は２０におけるすべての縮重位置「Ｘ」で示される、それらの示されるアミノ酸残基が選択される。例えば、配列番号１９のＣＤＲ１において「Ｘ（Ｓ／Ｎ）」として示される各位置の場合、任意のそのような変異体は、それらの対応する位置で、アミノ酸残基「Ｓ」又はアミノ酸残基「Ｎ」の何れかを含む。

特定の他の実施形態によれば、そのような変異体は、配列番号１９の配列に従ってのＶＬ配列、及び／又は配列番号２０の配列に従ってのＶＨ配列を含み、ここで各場合、配列番号１９及び／又は２０におけるすべての縮重位置「Ｘ」で示される、それらの示されるアミノ酸残基が選択される。例えば、配列番号１９のフレームワーク１における「Ｘ（Ｐ／Ａ）」として示される位置の場合、任意のそのような変異体は、その位置でアミノ酸残基「Ｐ」又はアミノ酸残基「Ａ」の何れかを含む。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、セクション[0097]-[0099]、及び[0102]-[104]の抗原−結合領域をヒト化することにより得られる抗原−結合領域を含む。

本発明の文脈において、前記多重特異性分子の前記標的結合部分及び前記結合分子は、前記標的および前記結合分子の結合相手に特異的に結合する限り、構造的に限定されない。しかし、前記標的結合部分;前記結合分子は、一般に、1つ以上のオリゴまたはポリペプチドまたはそれらの部分からなるか、またはそれらから構成される。特に、前記標的結合部分;前記結合分子は、典型的には少なくとも1つの抗体可変ドメインまたはその結合フラグメントを含む抗体ベースの結合部分である。

本発明の特定の実施形態では、前記標的結合部分は、および/または前記結合分子は、抗体に基づく結合部分（単数又は複数）、特に重鎖可変ドメイン（VH）又はその結合フラグメントを含む抗体ベースの結合部分、より具体的には重鎖可変ドメイン（VH）またはその結合フラグメントと、軽鎖可変ドメイン（VL）又はその結合フラグメントとを含む抗体ベースの結合部分である。本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、（単独で、または他のドメイン、領域またはその一部と組み合わせて）依然として機能的である所定のドメイン、領域、又は部分の一部であって、すなわち多重特異性コンストラクトにより認識される第1または第2の抗原に結合することができる一部を指す。

特定の実施形態では、多重特異性分子は、一本鎖ダイアボディ（scDb）、タンデムscDb（Tandab）、線状二量体scDb（LD-scDb）、環状二量体scDb（CD-scDb）、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE;タンデム di-scFv)、ジスルフィド安定化されたFvフラグメント（Brinkmannら、Proc Natl Acad Sci US A. 1993; 90：7538-7542）、タンデムトリ-scFv、トリボディ、二重特異性Fab、ジミニ抗体、テトラボディ、scFv-Fc-scFv融合物、ジ-ジアボディ、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体、例えばbsAb（軽鎖のC末端に結合されたscFv）、Bs1Ab（軽鎖のN末端に結合されたscFv）、Bs2Ab（重鎖のN末端に結合されたscFv）、Bs3Ab（重鎖のC末端に結合されたscFv）、Ts1Ab（重鎖及び軽差の両方のN末端に結合されたｓｃFv）、Ts2Ab（重鎖のC末端に結合されたdsscFv）、及びKnob-into-Holses (KiHs)（KiH技術により調製された二重特異性IgG)、及びDuoBodies（DuoBody技術により調製された二重特異性IgG）、１の機能Fvドメインが形成されるようにKiH又はDuoBodyの２つの異なる重鎖の１のC末端に融合されたVH及びVLドメイン、からなる群から選ばれる抗体フォーマットである。特に本明細書における使用に適しているものは一本鎖ダイアボディ（ｓｃDb）、特に二重特異性モノマーscDbである。様々な多重特異性コンストラクトを議論し、提示する概説については、例えば、Chan Carter、Nature Reviews Immunology 10（2010）301-316; Schubertら、Antibodies 1（2012）2-18; Byrneら、Trends in Biotechnology 31（2013）621; Metzら、Protein Engineering Design＆Selection.2012; 25：571-580）を参照のこと。

本発明の特定の実施形態では、多重特異性分子の第一及び第二抗体ベースの結合分子のVHドメインは、ヒト重鎖フレームワーク（FW）領域上に移植されたウサギ重鎖相補性決定領域（CDR）を含み、そして多重特異性分子の第1および第2の抗体に基づく結合部分のVLドメインは、ヒト軽鎖ＦＷ領域に移植されたウサギ軽鎖CDRを含む。

第1の抗体に基づく結合部分の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、特に、完全長のヒトＣＤ３の全長イプシロン鎖でウサギを免疫化することにより得られたウサギ抗体に由来する。ＣＤ３Ｅの全長鎖による免疫化は、ヒトＣＤ３Ｅの全長鎖をコードするプラスミド、またはＣＤ３のイプシロン鎖の精製された細胞外ドメインをコードするプラスミドによるウサギのＤＮＡ免疫化によって適切に行われる。さらに、第2の抗体に基づく結合部分の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、精製された標的タンパク質または前記標的を発現するプラスミドでウサギを免疫化することによって得られるウサギ抗体に特に由来する。

本発明の多重特異性構築物は、当技術分野で公知の任意の簡便な抗体製造方法（例えば、多重特異性構築物の産生については、Fischer、N.＆Leger、O.、Pathobiology 74：3-14（2007）;および二特異的ダイアボディーおよびタンデムscFvについてはHornig、N.＆Farber-Schwarz、A.、Methods Mol。Biol。907：713-727、2012）。本発明の多重特異性コンストラクトの調製のための適切な方法の具体的な例には、とりわけ、Genmab技術（Labrijnら、Proc Natl Acad Sci USA 2013 Mar 26; 110（13）：5145-50）およびMerus技術（de Kruifら、Biotechnol Bioeng。2010 Aug 1; 106（5）：741-50）が挙げられる。多特異性抗体の製造方法は、本技術分野に知られている（例えば、Zhuら、Cancer Lett. 86: 127-135(1994); Suresh et al., Methods Enzymol. 121: 210-228 (1986）を参照のこと）。

これらの方法は、例えばハイブリドーマ技術を用いて所望の抗原で免疫化されたマウス由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させることにより（例えば、Yokoyama et al．Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2、Unit 2.5,2006を参照のこと）、或いは組換え抗体工学を用いることにより（レパートリークローニングまたはファージディスプレイ/酵母ディプレイ（例えば、Chames＆Baty、FEMS Microbiol. Letters 189：1-8 (2000)を参照のこと）、並びに２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメインまたはその断片または部分の組み合わせを用いて、既知の分子クローニング技術を用いて多重特異性コンストラクトを得ることによる、典型的にはモノクローナル抗体の生成を含む。

本発明の多重特異性コンストラクトは、免疫原性を低下させ、および/または安定性を改善するために、特にヒト化される。抗体のヒト化の技術は、当技術分野で周知である。例えば、1つの技術は、異種抗体の相補性決定領域（CDR）を、ヒトアクセプターフレームワークの可変軽鎖VLおよび可変重鎖VHへ移植することに基づく（例えば、Jonesら、Nature 321： 522-525（1986）;およびVerhoeyenら、Science 239：1534-1536（1988））。別の技術では、異種抗体のフレームワークがヒトフレームワークへと突然変異される。両方の場合において、抗原結合部分の機能性の保持は必須である（Kabatら、J. Immunol。147：1709-1719（1991））。

特定の実施形態では、前記多重特異性分子は、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）またはそのフラグメントと２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）またはそのフラグメントを、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって、
Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_HＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_LＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_LＢ−Ｌ２−Ｖ_HＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_LＡ−Ｌ１−Ｖ_HＢ−Ｌ２−Ｖ_LＢ−Ｌ３−Ｖ_HＡ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_HＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_LＢ、Ｖ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_LＡ−Ｌ２−Ｖ_HＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢ又はＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢ、特にＶ_LＢ−Ｌ１−Ｖ_HＡ−Ｌ２−Ｖ_LＡ−Ｌ３−Ｖ_HＢの順番で含む二重特異性ｓｃＤｂであり、ここで当該Ｖ_LＡ及びＶ_HＡドメインは、一緒になって第一抗原に対する抗原結合部位を形成し、そしてＶ_LＢ及びＶ_HＢは、一緒になって第二抗原に対する抗原結合部位を形成し、特にここでリンカーL1が２〜１０個のアミノ酸、特に３〜７個のアミノ酸、特に５個のアミノ酸のペプチド、特にＧＧＧＧＳである場合、リンカーＬ３は１〜１０個のアミノ酸、特に２〜７アミノ酸、特に５このアミノ酸のペプチド、特にＧＧＧＧＳであり、リンカーＬ２は、１０〜４０個のアミノ酸、特に１５〜３０アミノ酸、特に２０〜２５アミノ酸、特に２０アミノ酸のペプチド、特に（ＧＧＧＧＳ）₄である。

本発明の多重特異性分子は、代替的に、非抗体ベースの結合ドメインに基づく１つ以上の結合部分を含んでいてもよい。本発明の多重特異性コンストラクトの適切な調製方法の具体例には、とりわけ、ＤＡＲＰｉｎ技術（Molecular Partners AG）、アドネキシン技術（Adnexus）、アンチカリン技術（Pieris）およびＦｙｎｏｍｅｒ技術（ Covagen AG）が挙げられる。

第3の態様において、本発明は、少なくとも（i）標的結合部分と；（ii）段落[0097]〜[0099]、[00102]〜[00104]および[00108]に記載の抗体又はその機能フラグメントと同じエピトープに実質的に結合する結合分子、特に抗体又はその機能フラグメントである結合分子とを含む多重特異性分子に関する。

特定の実施形態によれば、前記抗体又はその機能的フラグメントは、カニクイザルＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εと交差反応性であり、特にヒトＣＤ３εの親和性とは、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより特定には１５倍未満、及び最も特定には５倍未満、異なる、カニクイザルＣＤ３εに対する親和性を有する。

第４の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に多重特異性抗体又はその機能的多重特性フラグメント、及び任意には、医薬的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。

第５の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に二重特異性抗体又はその機能的二重特異性フラグメントをコードする核酸配列又はその集合物に関する。

第６の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物を含むベクター又は該ベクターの集合物に関する。

第７の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物を含む宿主細胞、特に発現宿主に関する。

第８の態様によれば、本発明は、本発明の多重特異性分子、特に二重特異性抗体又はその機能的二重特異性フラグメントの生成方法に関し、ここで前記方法は、本発明の核酸配列又はその集合物、又は本発明のベクター又はその集合物、又は本発明の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現する工程を含んで成る。

第９の態様によれば、本発明は、CD3ε-結合抗体又はその機能フラグメントを含む本発明の多重特異性分子の生成方法に関し、ここで前記方法は、下記工程：
ａ）宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提供するために、ＣＤ３ε−発現プラスミドによるウサギの免疫化；
ｂ）蛍光活性化細胞選別を用いての、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互反応する親和性成熟記憶Ｂ細胞のクローン単離；
ｃ）選別されたクローンの不死化を必要としない、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞の培養；
ｄ）Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定するために、特に細胞ベースのＥＬＩＳＡによる、Ｂ細胞培養上清液のスクリーニング；
ｅ）工程Dで同定された抗体、又はその機能フラグメントを、標的結合部分と組み合わせ
の工程を含んで成る。

第１０の態様では、本発明は、癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、自己免疫性疾患、感染性疾患、神経疾患、神経変性疾患から選ばれる疾患の治療に使用するための本発明の多重特異性分子に関する。

第１１の態様では、本発明は、癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経疾患、神経変性疾患から選択される疾患を治療する方法であって、本発明の多重特異性分子を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。

以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示する。

本明細書に記載される本発明のために使用されるアプローチは、Ｔ細胞刺激抗体を同定するために、成功の確率を高める段階的手順である。このアプローチは、次の手順を包含する：
ａ）ウサギ抗体は一般的に、齧歯類に比較して、より高いクローン多様性を示すので、免疫化のための宿主としてのウサギの使用。従って、ウサギの使用は、特定のエピトープに対する結合体を同定する確立を高め、そして新規エピトープの同定の確立を増強する。
ｂ）宿主細胞の表面上にネイティブ完全長ＣＤ３εを提供するために、ＣＤ３ε−発現プラスミドによるウサギの免疫化。このアプローチは、完全長ＣＤ３εに対する強い免疫応答を導き、そしてＣＤ３ε及びＣＤ３γに同時に結合する抗体の生成を回避する。
ｃ）蛍光活性化細胞選別を用いて、ＣＤ３ε／γ一本鎖と相互作用する親和性成熟記憶Ｂ−細胞のクローン単離。この方法は、ＣＤ３εをＣＤ３γとの間のインターフェースに結合する抗体の選択を回避し、それにより、選択の特異性を高める。
ｄ）選別されたクローンの免疫化を必要とせず、それにより、ハイブリドーマ手順の不良な効率を克服する、共培養システムにおける単一の選別されたＢ細胞の培養。
ｅ)Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εに結合する抗体を同定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡにおけるＢ細胞培養上清液のスクリーニング。

実施例１：ＣＤ３上のＴ細胞−刺激性エピトープに結合するモノクローナル抗体の同定及び選択
ＣＤ３εに結合するウサギ記憶Ｂ細胞を、蛍光活性化細胞選別を用いて、１つの免疫化されたウサギから単離した。ＣＤ３ε及びＣＤ３γのインターフェースに結合する抗体を排除するために、柔軟ペプチドリンカー（ｓｃＣＤ３γε）により連結される、ＣＤ３ε及びＣＤ３γの細胞外ドメインから成る、フィコエリトリン（ＰＥ）−標識された一本鎖タンパク質コンストラクトを使用した。ＰＥ−sｃＣＤ３γεに結合する４，２７０の記憶Ｂ細胞を、９６ウェル培養プレート中に個々に選別し、そして他の場所に公開された条件で培養した（Lightwood et al, JIM 2006; 316: 133-143）。まず最初に、すべての培養上清液を、ｓｃＣＤ３γεへの結合のためにＥＬＩＳＡによりスクリーンし、これにより、４４１のヒットをもたらした。第２のスクリーニングにおいて、最初のスクリーニングからの陽性上清液を、Jurkat細胞の表面上のＴＣＲ複合体に埋封されたネイティブＣＤ３εを結合するそれらの能力について試験した（下記方法を参照のこと）。合計２２のヒットが、ＣＤ３ε発現Jurkat細胞への結合を示したが、しかしｃｄ３−／−Jurkat細胞への結合は示さなかった。ヒト及びカニクイザル起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞外ドメインへの親和性を、２２のヒットに関して、ＳＰＲを用いて測定した。Ｋ_Dにより表されるように、ヒトＣＤ３εγへの親和性は、０．１６−９．２８ｎＭの範囲であった（データは示されていない）。スクリーニングヒットの１つは、ＳＰＲによる結合を示されず、そして従って、さらなる分析のためには見なされなかった。

残る２１のクローンの可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＲＴ−ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定により検索し、そして１８の独立したクローンをもたらした。それらのウサギＩｇＧを、哺乳類発現システム下で組換え的に生成し、そしてヒト及びカニクイザル起源のｓｃＣＤ３γεへの親和性及びJurkat細胞に結合するそれらの能力について特徴づけた。それらの１８の配列の系統発生学的配列分析は、２つの主要クラスターを示し、それらはお互い明確に異なるが、ところが２つのクラスター内に有意な相同性が存在した（図１）。１つのクラスターからのすべての代表物はたぶん、同じ抗原−結合親Ｂ細胞由来であるので、それらはたぶん、同じエピトープに結合する。従って、最大の多様性をカバーするために、最も多様なクローンを、Ｔ細胞を結合し、そして活性化するそれらの能力について、さらに試験された１２のクローンをもたらす各クラスターから選択した。Ｔ細胞を、細胞ベースのＥＬＩＳＡにより評価し、そしてＴ細胞刺激を、ＦＡＣＳによりＣＤ６９の発現を測定することにより定量化した。代表的抗体をさらに、実施例２−４に示されるようにして、特徴づけた。

実施例２：Jurkat Ｔ細胞及びカニクイザルＨＳＣ−Ｆ Ｔ細胞への精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３ε抗体の結合
JurkatヒトＴ細胞及びカニクイザルＨＳＣ−Ｆ Ｔ細胞を、方法セクションに記載のようにして、上昇する濃度の精製されたモノクローナルウサギ抗体と共にインキュベートした。試験されるすべての抗体に関して、ヒトＣＤ３εに対する特異的結合は、抗体濃度の上昇と共に上昇した（図２）。JurkatヒトＴ細胞への最大結合の半分を示すＥＣ₅₀値は、すべての抗体に関して非常に類似し、０．２８〜１．８７ｎＭの範囲であった（表１を参照のこと、これは、精製されたモノクローナルウサギ抗体の薬力学的特性を示す。ＣＤ６９発現の定性的検出のために、幾何学的平均でシグナル強度に影響を及ぼす平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、不の対照及び試験抗体の両者のために測定した。標準化されたＭＦＩを、負の対照抗体のＭＦＩを介して試験抗体のＭＦＩを割算することにより計算した。）カニクイザルＨＳＣ−Ｆ Ｔ細胞への結合についてのＥＣ₅₀値が、３種の抗体（クローン−０６、クローン−０２、クローン−０３）について示されている（表２Ｃを参照のこと）。

実施例３：Ｔ細胞上のＣＤ６９発現を刺激する、精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３ε抗体の可能性
ＣＤ６９発現の測定（方法を参照のこと）により評価されるように、Ｔ−細胞活性化を誘発する、精製されたモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の可能性を、公開されている抗体ＯＫＴ−３及びＴＲ６６と比較した。第１のアプローチによれば、３種の異なった濃度の架橋された抗体を用いて、Jurkat細胞を刺激し、そしてＣＤ６９発現を、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ６９発現の有意な上昇が、１．２５μｇ／ｍｌで、すべての試験された抗体により観察された（図３及び表Ｉ）。興味深いことには、すべての試験されたウサギ抗体は、公開されているＯＫＴ−３及びＴＲ６６よりも、ＣＤ６９発現のより強い刺激を示した。これは、ウサギ抗体が、従来技術によれば、連続的にトリガーし、そしてＴＣＲシグナル伝達を増強するそれらの能力に負の影響を及ぼすはずであるＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも、より高い親和性でヒトｓｃＣＤ３γεに結合するので、予測外である。上昇する濃度のウサギ抗体により、ＣＤ６９発現レベルはさらに上昇し、ところが、上昇する濃度のＯＫＴ−３又はＴＲ６６により、ＣＤ６９発現の単に中程度の上昇が存在した。さらに、ウサギ抗体により、ヒストグラムのピークが狭くなり、このことは、Ｔ細胞のより均質な集団を示し、すべては同様に高レベルでＣＤ６９を発現した。対照的に、試験された各濃度でＯＫＴ−３又はＴＲ６６により刺激されたＴ細胞集団においてＣＤ６９発現レベルの広範囲な分布が存在した。用量に依存して、明確で且つ均質なＴ細胞活性化レベルをもたらす抗体は、効能を最適化し、そして副作用を制限するために良好な用量調節を可能にする。

第２のアプローチによれば、抗−ＣＤ３抗体により異なった時点での刺激の後のＴ−細胞活性化を分析した。Jurkat細胞を、架橋された抗体により刺激し、そしてＣＤ６９発現を、０，４，１５，２４，４８及び７２時間後、上記のようにして評価した（図４）。

実施例４：Jurkat Ｔ細胞及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への抗−ＣＤ３×抗−ＩＬ５Ｒ抗体の結合
アゴニスト性抗−ＣＤ３抗体の効果を示すために、１組の二重特異性抗−ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ一本鎖ダイアボディ（diabodies）(scDb)を、標準方法により構成した（方法／データは示されたいない；コンストラクト１＝クローン−０６のヒト化された可変ドメインを含む；コンストラクト２＝クローン−０２のヒト化された可変ドメインを含む；コンストラクト３＝クローン−０３のヒト化された可変ドメインを含む）。

Jurkat Ｔ細胞及びＩＬ５Ｒ−発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）を、方法セクションに記載のようにして、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと共にインキュベートした。試験されるすべてのｓｃＤｂに関して、ＣＤ３ε及びＩＬ５Ｒ発現細胞系に対する特異的結合が検出されたが、しかし対照細胞系に対する非特異的結合は検出されない。抗−ＣＤ３成分とは異なるが、同一の抗−ＩＬ５Ｒ成分を含む３種の異なったｓｃＤｂ（コンストラクト１−３）を、ＩＬ５Ｒ又はＣＤ３εの何れかを発現する細胞に対する特異的結合について試験した。抗−ＣＤ３部分は、可変性親和性を有する重複エピトープに結合する（表１及び３、及び図７）。予想されるように、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合は、試験されたすべてのｓｃＤｂに関して、類似した（図８）。対照的に、Jurkat Ｔ−細胞への結合は、ＣＤ３ε結合ドメインの親和性の低下と共に、低下した。Jurkat Ｔ−細胞への結合が、試験される最高濃度で低親和性結合体コンストラクト３については検出されたなかった（図８）。

実施例５：Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を刺激する、二重特異的抗−ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの可能性
Ｔ−細胞活性化を誘発する、標的細胞に結合されるｓｃＤｂの可能性を、ヒト血液から精製された細胞毒性Ｔ−細胞によるＩＬ−２分泌の測定（方法を参照のこと）により評価することができる。異なったｓｃＤｂを、１０：１のエフェクター：標的細胞比で、標的発現ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共にインキュベートし、そしてＩＬ−２分泌を、１６時間のインキュベーションの後、分析する。ＩＬ−２分泌の用量依存性刺激が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で観察されるが、ところがＩＬ−２分泌は、野生型ＣＨＯ細胞の存在下では実質的に観察されない（表３及び図９における代表的データを参照のこと）。従って、Ｔ−細胞活性化は、標的発現細胞の不在下で特異的に誘発される。さらに、ＩＬ−２分泌を誘発する可能性は、組換え的に生成されたＣＤ３εγへの結合親和性及びＴ−細胞に結合する能力と相関する。親和性分析と一致して、最高の親和性を有する結合体であるコンストラクト１は、コンストラクト２よりも、ＩＬ−２分泌のより有能なインヂューサーであり、ところがＩＬ２分泌は、低親和性ｓｃＤｂコンストラクト３には観察されない（図９）。

実施例６：細胞毒性Ｔ−細胞による特異的ｓｃＤｂ介在性標的細胞溶解
抗−ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂにより介在される細胞毒性Ｔ−細胞による標的細胞の特異的溶解を、８８時間のインキュベーションの後、ＣｅｌｌＴｏｘ（登録商標）緑色細胞毒性アッセイ（方法を参照のこと）により分析する。Ｔ−細胞活性化について上記に論じられた結果に類似して、用量依存性標的細胞溶解が、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞の存在下で、コンストラクト１及びコンストラクト２に関して観察され、ところが溶解は、野生型ＣＨＯ細胞の存在下では観察されていない（表３及び図１０におけるコンストラクト１−３についての代表的データを参照のこと）。上記に言及された結果と一致して、ＣＤ３εに対する高い親和性を有するｓｃＤｂ結合は、低い親和性のｓｃＤｂに比較して、より有能な溶解性を示す。標的細胞溶解は、低親和性ｓｃＤｂコンストラクト３については観察されない。本発明者はさらに、カニクイザルＣＤ３εに対してもまた交差反応する抗体の異なったクラスター（クラスター１）に起因する追加のＣＤ３εクローン（クローン−０５）のヒト化変異体を含むｓｃＤｂの標的細胞を溶解する可能性を試験した。クローン−０５は、クローン−０６と比較して、さらに高い親和性で結合し（それぞれ、ウサギＩｇＧ及びヒト化されたその誘導体について、ＫＤ＝８．４５×１０^-10Ｍ及び４．２９×１０^-9Ｍ）、但し重要なことには、クラスター２（クローン−０６、クローン−２及びクローン−０２）からの結合体とは異なるエピトープに結合する。興味深いことには、本発明者は、それぞれの抗−ＩＬ５ＲｘＣｄ３ ｓｃＤｂが、ヒト化されたクローン−０６を含むｓｃＤｂよりも弱い、ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ標的細胞（ＥＣ₅₀＝９．９×１０^-9Ｍ）のＴ−細胞依存性溶解を誘発する可能性を示すことを見出し、このことは、クローン−０６のエピトープが特に標的細胞を溶解する細胞毒性Ｔ細胞の再方向付けのために適していることを示唆する。ＯＫＴ−３及びＴＲ６６に対するクラス２からの架橋された親ＩｇＧの卓越した効能（実施例３）は、ｓｃＤｂ形式で試験されたそれらの親和性よりも高い親和性でさえ、親和性の最適性は、見出されず、その後、効力は低下するであろうことを確証する。

実施例７：エピトープマッピング及びファイン−マッピング
エピトープマッピング及びファイン−マッピングを、記載のようにして実質的に実施した（Timmerman et al., Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TM technology.J.Mol.Recognit.20 (2007) 283-99; Slootstra et al., Structural aspects of antibody antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity 1 : 87 (1996) 96）。手短に言えば、ＣＬＩＰＳ技法は、ペプチドを、定義された立体構造に固定する。これは、最も複雑な結合部位の機能的模倣をもたらす。ＣＬＩＰＳ技法は現在、日常、単一、二重又は三重ループ構造、及びシート及びへリックス様折りたたみにペプチドライブラリーを成形するために使用される。

ＣＬＩＰＳライブラリースクリーニングは、組合せマトリックス企画を用いて、最大１０，０００の重複ペプチドコンストラクトのライブラリーへの標的タンパク質の変換で開始する。固体担体上で、線状ペプチドのマトリックスが合成され、続いて、空間的に規定されたＣＬＩＰＳコンストラクトに形状化される。正しいコンフォメーションで不連続エピトープの両部分を表すコンストラクトは、検出され、そして定量化される、高い親和性を有する抗体を結合する。不完全エピトープを提供するコンストラクトは、低い親和性を有する抗体を結合し、ところが、そのエピトープを含まないコンストラクトはまったく結合しない。親和性情報は、エピトープの配列及びコンホメーションを詳細に定義するために、反復スクリーンに使用される。

次のクローンを分析した：クローン−０２、クローン−０３、クローン−０４、クローン−０６及びクローン−１０。ＣＤ３の次の標的配列（Ｎ−末端配列）を使用した：
ヒトＣＤ３：

ペプチドの合成
標的分子の不連続エピトープを再構成するために、構成されたペプチドのライブラリーを合成した。これは、いわゆる「足場上での化学的に連結されたペプチド」（Chemically Linked Peptides on Scaffolds）(CLIPS)技法を用いて実施された。ＣＬＩＰＳ技法は、単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様折りたたみ、へリックス様折りたたみ及びそれらの組合せへのペプチドの構成を可能にする。ＣｌＩＰＳ鋳型は、システイン残基にカップリングされる。ペプチドにおける多重システインの側鎖を、１又は２つのＣＬＩＰＳ鋳型にカップリングする。例えば、Ｔ２ ＣＬＩＰＳ鋳型１，３ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭの溶液を、炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（v/v））に溶解する。この溶液を、ペプチドアレイ上に添加する。ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイの固相結合ペプチドに存在するような２つのシステインの側鎖に結合するであろう（３μｌのウェルを有する４５５のウェルプレート）。ペプチドアレイを、完全に溶液で覆いながら、３０〜６０分間、溶液中で軽く振盪する。最後に、ペプチドアレイを、過剰の水により十分に洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１％のＳＤＳ／０．１％のβ−メルカプトエタノールを含む破壊緩衝液下で７０℃で３０分間、音波処理し、続いて水中において、さらに４５分間、音波処理する。Ｔ３ ＣＬＩＰＳ担持ペプチドを、類似する手段で、但し３個のシステインを用いて製造した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング
各アレイへの抗体の結合を、一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄の後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼ接合体（SBA, cat.nr.2010 05）の１／１０００希釈溶液と共に、２５℃で１時間、インキュベートした。洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２μ／ｍｌの３％Ｈ₂Ｏ₂を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムにより定量化した。

ペプチドの設計
化学的に合成されたＣＬＩＰＳペプチドを、次の企画に従って、上記のようにして合成した。
第一セット
模倣タイプ：線状ペプチド：ヒト及びカニクイザル配列の両方についての線状ペプチドの２つのセット。長さは１４の重なりを有する１５の残基である。二つ目のセットは、２つのアラニン変異を有する（灰色で示される）。
第二セット
模倣タイプ：荷電を負荷された線状ペプチド
説明：ペプチドアレイ表面と強く相互作用する幾つかの抗体に必要とされる荷電を負荷された対照セット
第三セット
模倣タイプ：コンフォメーションペプチド
説明：ペプチド配列は、第一セットに類似するが、CLIPSコンフォメーションループに製薬される。
第四セット
模倣タイプ：CLIPSコンフォメーションペプチド
説明：重複する２０merのCLIPSコンフォメーションペプチドのセット
第五セット
模倣タイプ：CLIPS不連続マトリクスペプチド
説明：ペアで二重ループCLIPS構造に制約された、13merのペプチドの組合せセット。ヒト及びカニクイザルペプチドを、技術的変動を最小にするようなペアのアライメントに従い配列させる。

推定エピトープの同定
一般的に、すべての５種の抗体が、非常に類似する結果特性を示した。すべての結合は、ヒトＣＤ３εのＮ末端上で行われた（データは示されていない）。制限された及び制限されていないペプチドからの結合強度及び観察を考慮すれば、すべての抗体は、下記理由で、線状ペプチドに優先的に結合する可能性が高い：
・Ｎ末端配列に対してのみの結合が観察された、
・Ｄ２又はＧ３の損失は結合を強く低めない、
・２ＤＧＮ４の損失は結合を完全になくす。

結論
分析により、試験されたすべての５種の抗体についての結合領域を同定した。すべての抗体は、Ｎ末端上の一見直線状のエピトープに結合することが見出された。すべての抗体は、結合のために２ＤＧＮ４に強く依存する類似するエピトープに結合することが見出された。

実施例８：エピトープファイン−マッピング
方法
各位置が１８種のアミノ酸（システインを除くすべての天然のアミノ酸）により置換されている、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε残基２−１６及び５−２０由来の１５マーの線状アレイを、抗体によりプローブし、そしてその結合に影響を及ぼす特異性が見出された。

結果
すべての抗体は、Ｎ４のための絶対的条件及びＥ６の関与でＮ末端を結合し、そして有意な類似性を共有する。すべての抗体は、コアエピトープに近接する配列における小さな差異にもかかわらず、ヒト及びカニクイザルバージョンのＣＤ３εを結合する。

標的タンパク質
初期マッピングは、試験されるすべての抗体のためのコアエピトープとして、ＣＤ３εのＮ末端上に線状ストレッチを同定した。下記配列の残基２−２０を用いて、１５マーの線状ペプチドの十分な置換ライブラリーを企画した。

方法
ペプチドの合成
線状ペプチドを、Ｈｉ−Ｓｅｎｓｅ表面のヒドロゲル上で標準Ｆｍｏｃ合成により合成した。保護解除及び洗浄の後、カードを、独自の洗浄緩衝液により、音波処理浴中で広範に洗浄した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング
各合成されたペプチドへの抗体の結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄の後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼ接合体（SBA, cat.nr.2010 05）の１／１０００希釈溶液と共に、２５℃で１時間、インキュベートした。洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２μ／ｍｌの３％Ｈ₂Ｏ₂を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムにより定量化した。

ペプチドの設計
化学的に合成されたＣＬＩＰＳペプチドを、次の設計に従って、上記のようにして合成した。

第一セット
模倣タイプ：線状ペプチド
説明
ヒトCD３εの残基２〜１６に由来する１５merの線状ペプチド。各ペプチドにおいて、１の残基が、（システインを除く）全ての天然アミノ酸により置換され、飽和突然変異誘発ライブラリーが作成される。

第二セット
模倣タイプ：線状ペプチド
説明：カニクイザルCD３εの残基２〜１６に由来する１５merの線状ペプチド。各ペプチドにおいて、１の残基が、（システインを除く）全ての天然アミノ酸により置換され、飽和突然変異誘発ライブラリーが作成される。

第三セット
模倣タイプ：線状ペプチド
説明：ヒトCD３εの残基５〜２０に由来する１５merの線状ペプチド。各ペプチドにおいて、１の残基が、（システインを除く）全ての天然アミノ酸により置換され、飽和突然変異誘発ライブラリーが作成される。

第四セット
模倣タイプ：線状ペプチド

説明：カニクイザルCD３εの残基５〜２０に由来する１５merの線状ペプチド。各ペプチドにおいて、１の残基が、（システインを除く）全ての天然アミノ酸により置換され、飽和突然変異誘発ライブラリーが作成される。

サンプルの比較
すべての５種の抗体は、Ｎ４を絶対的に必要とすることにより（唯一ヒスチジンにより取って代わられる）、及びＥ６のための高い優先を伴って（このためには、制限された置換が許容されるが、しかしながら、グルタミン酸がその位置での最も好ましい残基である）、非常に類似する態様で、ＣＤ３εＮ末端のヒト及びカニクイザル変異体由来の線状ペプチドに結合する。何れの抗体も、残基５−２０に及びペプチドには結合しなかった。５種のこのグループ内で、３種の抗体（クローン２、クローン３及びクローン４）が他の２種（クローン６及びクローン１０）よりも、前者の３種のグループはまた、Ｇ３、Ｅ５、及び／又はＧ８の置換に対してより敏感であることから、カニクイザル配列における突然変異に対してより敏感である。この観察は、ＳＰＲにより決定されるように、タンパク質のヒト及びカニクイザル形についての親和性の差異と一致する（表１を参照のこと）。

結論
この分析は、Ｎ４及びＥ６の絶対的必要性を伴って、Ｎ末端を結合し、そして有意な類似性を共有する、５種の抗体のエピトープをファインマッピングした。すべての抗体は、コアエピトープに隣接する配列における小さな差異にかかわらず、ＣＤ３εのヒト及びカニクイザルバージョンに結合する。

実施例9：サイトカイン放出
バフィーコートから新たに単離したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ヒトインターロイキン５受容体（ｈＩＬ−５Ｒ）を発現するＣＨＯ細胞と、エフェクター細胞対標的細胞比１０：１で、二重特異性抗ＩＬ５Ｒ×ＣＤ３γ一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）の濃度を増加させてインキュベートした。試験した両方のｓｃＤｂは、同一のＩＬ５Ｒ結合ドメイン（ＶＬ：配列番号２９；ＶＨ：配列番号３０）を含むが、異なるＣＤ３ε結合ドメインを含んでいた。試験したＣＤ３ε結合ドメインは、Ｎｕｍａｂのヒト化クローン６（ＶＬ：配列番号２１；ＶＨ：配列番号２２）およびＴＲ６６（Mooreら、Blood.2011；117:4542-4551)の可変ドメインであった。標的細胞の特異的溶解を、方法の項に記載される様々な時点で評価した。図１１に示すように、両方のｓｃＤｂは、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインおよびＴＲ６６をそれぞれ含有するｓｃＤｂについて、０．３１ｎＭおよび０．１９ｎＭで、６４時間での用量反応曲線における類似のＥＣ５０を示した。しかし、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂは、標的細胞のより高い最大溶解をもたらし、低濃度で最大特異的溶解に達した。さらに、ＴＲ６６を含むｓｃＤｂを用いて高濃度で標的細胞溶解の明らかな低下が見られ、これはＮｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを有するものでは本質的に存見られなかった。ＴＲ６６の可変ドメインを含有するｓｃＤｂでみられる狭いベル形状の用量応答曲線は、活性濃度ウインドウに全身レベルを維持するために、治療適用において厳密に制御された投与スキームが必須であることを示唆している。対照的に、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインは潜在的により広い治療ウインドウにつながるであろう。

上記実験の培養上清からサイトカイン濃度を測定した。標的細胞の溶解を誘発する同様の効力を示すが、２つのｓｃＤｂは、サイトカイン産生に対するそれらの効果の点で大きく異なった。ＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂが、ＴＮＦαの急激な用量依存的な増加をもたらしたが、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂで観察されたＴＮＦα産生の顕著な低下が、全ての有効な濃度において存在した。Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂが達した最大標的細胞溶解の最も低い濃度である０．８ｎＭのｓｃＤｂでは、ＴＮＦα濃度は、ＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂで産生される濃度の約５０％にしか達しなかった（図１２Ｂ）。さらに、図１２Ａに示される高濃度での溶解活性の低下と相関して、ＴＲ６６の可変ドメインを含有するｓｃＤｂだけ、ＴＮＦα産生が最高濃度で低下した。これらの観察に沿って、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂで、ＩＦＮγ産生が有意に低く、０．８ｎＭの濃度でＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂで達したレベルの約５０％であった（図１２Ｃ）。

ＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂの最大濃度の存在下で、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の溶解能の明らかな消失（図１１及び１２Ａ）を説明するために、本発明者らは、Ｔ細胞活性化の初期マーカーであるＣＤ６９を発現するＴ細胞の割合を測定することによって、両ｓｃＤｂがＣＤ８＋を活性化する潜在能力を評価した。両方のｓｃＤｂは、４ｎＭまでの濃度で用量依存的にＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９発現を誘導し、ＮｕｍａＢの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂは低濃度で活性化ＣＤ８＋細胞の割合をわずかに低下させた。標的細胞溶解における観察された損失に沿って、ＴＲ６６の可変ドメインを含有するｓｃＤｂについて、高濃度で活性化Ｔ細胞の割合が減少した。対照的に、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂでは、ＣＤ６９を発現するＴ細胞の割合は、すべての試験濃度（最大１００ｎＭ）で増加し続けた（図１３）。これは、着実に増加するＴＮＦα濃度（図１２Ｂ）を伴っており、Ｎｕｍａｂの抗ＣＤ３ドメインを含むｓｃＤｂの試験濃度の全範囲にわたって用量依存的に、合計のＴ細胞活性が増加し、その一方でＴＲ６６の可変ドメインを含むｓｃＤｂでの最大Ｔ細胞活性が約４ｎＭの濃度で達成されることを示唆する。

一般的方法：
一次配列分析
その対応するＨ鎖及びＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）の得られる配列情報を、配列相同性に従って、整列し、そしてグループ分けした。ウサギ可変ドメインの組を、ユニーククローン及びユニーク組のＣＤＲを同定するために分析した。ＶＬ及びＶＨドメインの組合わされたアライメントを、ユニーククローンを同定するために、両ドメインの結合アミノ酸配列に基づいて実施した。可変ドメインのアライメントの他に、各ウサギＩｇＧクローンの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列組を、ユニーク組のＣＤＲを同定するために、異なったクローン間で比較した。それらのユニークＣＤＲ組を、複数のアライメントツールＣＯＢＡＩＴを用いて整列し、そして系統樹を、近隣結合アリゴリズムにより生成した。ＣＤＲ組を、各クローンの結合されるＣＤＲ配列の配列相同性に基づいてグループ分けし、そしてクラスター閾値を、配列相同性及び同一性に基づいて決定した。個々のウサギＩｇＧクローンのスクリーニングアッセイ結果及びクラスター所属に基づいて、候補体を、さらなる分析のために選択する。異なったクラスターからのクローンを、高い配列多様性を続行することを目的として選択した。

ウサギＩｇＧの製造
ウサギＩｇＧ可変ドメインを、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、及びリーダー配列及びそれぞれの不変ドメイン、例えばpFUSE-rlgG ベクター(Invivogen)を含む一過性異種発現のための適切な哺乳類発現ベクター中への連結によりクローン化した。機能的rIgGの一過性発現を、ＣＨＯ Ｓ細胞における、Ｈ及びＬ鎖をコードするベクターとFreeStyle^TM MAXシステムとの同時トランスフェクションにより実施した。７日間の培養の後、抗体分泌細胞の上清液を、精製のために回収した。続いて、分泌されたウサギＩｇＧを、磁気プロテインＡビーズ（ＧＨ Healthcare））により親和性精製した。ＩｇＧ負荷ビーズを洗浄し、そして精製された抗体を、ｐＨシフトにより溶出した。溶出画分を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳道（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、及びサイズ排除高速流体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により分析し、すべてのサンプルの同等の品質を確保した。

ヒト化された一本鎖Ｆｖフラグメント及びＩｇＧの構築及び特性化
ウサギ抗体クローンのヒト化は、Ｖκ１／ＶＨ３タイプのNumab独自のｓｃＦｃ受容体フレームワーク上へのウサギＣＤＲのトランスファーを包含した。この工程においては、所定のウサギクローンの６種のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を、他に記載されるように、ウサギ抗体ドナー配列上で同定し（Borras, L. et al. 2010. JBC;285:9054-9066）、そしてNumab受容体足場配列中に移植した。ウサギクローン、クローン−０６の場合、例えば得られるヒト化クローン−０６のＶＬ及びＶＨ配列が、それぞれ配列番号２１及び２２で示される。ヒト化軽鎖のバリアントを、配列番号２３及び２４に示す。

ヒト化ＩｇＧコンストラクトを、[００１６５]に記載される方法に類似して製造することができる。

モノクローナル抗−ＣＤ３抗体の結合動力学及び種交差性の決定のためのアッセイ
モノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の結合親和性を、ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）を用いて、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。親和性測定のために、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体（Bethyl Laboratories, カタログ番号A120-111A）を、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors）上に標準アミン−カップリング手順を用いて固定した。９０〜２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）の二倍連続希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を、５分間、進行せしめた。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（ＫＤ）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

種交差反応性の決定
カニクイザル一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインに対する種交差反応性を、同じアッセイ設定を用いて測定した。９０〜０．１２ｎＭの範囲のカニクイザルへテロダイマーＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）の連続三倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を、５分間、進行せしめた。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（ＫＤ）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

Ｔ−細胞の細胞表面上で発現されるＣＤ３εへのモノクローナル抗−ＣＤ３抗体の結合の決定のための細胞ベースのＥＬＩＳＡ
ヒトＴ細胞系のJurkat細胞（クローンＥ６−１）を、１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを含む丸底９６−ウェルプレートにおいて、３００，００細胞／ウェルで播種した。９０ｎＭ〜０．００５８ｎＭの範囲である抗−ＣＤ３ウサギモノクローナル抗体の連続５倍希釈溶液を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ１００μｌを含むプレートに添加した。Jurkat細胞の表面上に発現されたＣＥ３εへのウサギ抗体の結合を、ＩｇＧサブタイプのウサギ抗体のＦｃ部分（Jackson Immuno Research, カタログ番号1 1-035-046）を特異的に認識する二次抗体により検出した。この二次抗体を、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結した。ＨＲＰ活性を、比色反応において、ＨＲＰにより処理されるＴＭＢ基質（３、３′、５、５′−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−００）の添加により測定した。処理された基質の色の強度は、Jurkat細胞に結合される抗−ＣＤ３抗体の量に正比例する。色の強度を定量化するために、それぞれの波長での吸光度（光学密度）を、マイクロタイタープレートリーダー（Infinity reader M200 Pro, Tecan）を用いて測定した。

Jurkat細胞の細胞表面上に提供される未知の成分への抗体の非特異的結合を補正するために、Jurkat Ｔ細胞系（Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５）のＣＤ３ε欠損誘導体を使用した。この細胞系へのモノクローナル抗体の結合を、Jurkat細胞について上記に記載のようにして、測定した。Jurkat細胞への特異的結合の定量化のために、負の対照への結合のための光学密度を、Jukat細胞への結合のための光学密度から差し引いた。データを、Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)を用いて４−パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて分析し、そして５０％結合に達するために必要とされる抗体−ＣＤ３抗体のモル濃度（ＥＣ₅₀、標準曲線の中間−ＯＤ）を、用量応答曲線から得た。

種交差−反応性の決定
ＨＳＣ−Ｆ Ｔ細胞の表面上に提供されるカニクイザルＣＤ３への結合を、同じアッセイ設定を用いて測定した。カニクイザルＴ細胞系のＨＳＣ−Ｆ細胞を、１０％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを含む丸底９６−ウェルプレートにおいて、３００，００細胞／ウェルで播種した。１８ｎＭ〜０．００５８ｎＭの範囲である抗−ＣＤ３ウサギモノクローナル抗体の連続５倍希釈溶液を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ１００μｌを含むプレートに添加した。ＨＳＣ−Ｆ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＣＥ３εへのウサギ抗体の結合を、ＩｇＧサブタイプのウサギ抗体のＦｃ部分（Jackson Immuno Research, カタログ番号1 1-035-046）を特異的に認識する二次抗体により検出した。この二次抗体を、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結した。
ＨＲＰ活性を、上記のようにして測定した。

細胞表面上に提供される未知の成分への抗体の非特異的結合を補正するために、ＣＤ３ε負のヒトＢリンパ芽球細胞系（ＤＢ）を用いた。この細胞系へのモノクローナル抗体の結合を、上記のようにして測定した。ＨＳＣ−Ｆ細胞への特異的結合の定量化のために、負の対照への結合のための光学密度を、ＨＳＣ−Ｆ細胞への結合のための光学密度から差し引いた。データを、Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)を用いて４−パラメーターロジスティック曲線フィットを用いて分析し、そして５０％結合に達するために必要とされる抗体−ＣＤ３抗体のモル濃度（ＥＣ₅₀、標準曲線の中間−ＯＤ）を、用量応答曲線から得た。

モノクローナル抗体−ＣＤ３抗体によるＴ−細胞活性化：ＣＤ６９発現の誘発
Ｔ−細胞活性化を誘発するモノクローナルウサギ抗−ＣＤ３抗体の可能性を、他に記載されるようにして（Gil et al, Cell.2002; 109: 901-912）、Jurkat細胞におけるＣＤ６９発現の誘発の測定、すなわち初期Ｔ−細胞活性化マーカーにより評価した。用量−応答アッセイのために、Jarkat細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、２０μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３抗体により２４時間、刺激した。Jurkat細胞への抗−ＣＤ３モノクローナル抗体の添加の前、抗−ＣＤ３抗体を、ＯＫＴ３（BioLegend,カタログ番号317302）又はＴＲ６６Ｃ（Novus Biologicals, Cat. No. N BP 1-97446）が使用される場合、それぞれ、３倍過剰のヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（Bethyl Laboratories, カタログ番号A120-1 11 A）、及びウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research, カタログ番号315-005-008）の添加により架橋した。刺激の後、細胞を、ヒトＣＤ６９（BioLegend, カタログ番号310906）に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体を用いて、ＣＤ６９発現のために染色し、そして次に、フローサイトメーター（FACS aria III, Becton Dickinson）により分析した。負の対照として、架橋抗体と共にインキュベートされた、刺激されていないJurkat細胞を、上記抗−ＣＤ６９抗体により染色した。時間の経過にわたってのＴ−細胞活性化を、上記のようにして類似するアッセイ設定により評価した。１００，０００Jurkat細胞／ウェルを、上記のようにして架橋された抗−ＣＤ３抗体５μｇ／ｍｌにより、０，４，１５，２４，４８及び７２時間、刺激した。用量応答アッセイと同一のＣＤ６９発現を、フローサイトメトーにより分析した。

ｓｃＤｂコンストラクトの製造
種々の抗−ＩＬ５Ｒ ｘ ＣＤＥ３ε ｓｃＤｂコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を、新たに合成し、そしてpＥＴ２６ｂ（＋）主鎖（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づかれるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のための適合ベクター中にクローン化した。この発現コストラクトを用いて、Ｅ．コリ株ＢＬ１２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、そして細胞を、出発培養物として、２ＹＴ培地（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual）において培養した。発現培養物を接種し、そして振盪フラスコにおいて３７℃及び２００ｒｐｍでインキュベートした。１のＯＤ６００に達すると、タンパク質発現を、０．５ｍＭの最終濃度でのＩＰＴＧの添加により誘発した。一晩の発現の後、細胞を、４０００ｇの遠心分離により収穫した。封入体の調製のために、細胞ペレットを、ＩＢ再懸濁緩衝液（50 mM Tris-HCI pH 7.5、100 mM NaCI、5 mM EDTA、0.5% Triton X-100）に再懸濁した。細胞スラリーを、1 Mmの DTT、0.1 mg/mLのリゾチーム、10 mM のロイペプチン、100 μMの PMSF 及び1 μMのペプスタチンにより補充した。細胞を、氷上で冷却しながら、３サイクルの超音波均質化により溶解した。続いて、０．０１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼを添加し、そして均質物を室温で２０分間インキュベートした。封入体を、ｌ５０００ｇ及び４℃での遠心分離により沈降せしめた。ＩＢを、ＩＢ再懸濁緩衝液に再懸濁し、そして音波処理により均質化し、その後、別の遠心分離にゆだねた。ＩＢ再懸濁緩衝液により、合計で最少３回の洗浄工程を実施し、そして続いて、ＩＢ洗浄緩衝液（50 mM Tris-HCI pH 7.5、100 mM NaCl、5 mM EDTA）による２回の洗浄を実施し、最終ＩＢを得た。

タンパク質再折りたたみのために、単離されたＩＢを、可溶化緩衝液（100 mM Tris/HCI pH 8.0,6 M Gdn-HCl,2 mM EDTA）に、湿ったＩＢの１ｇ当たり５ｍｌの比率で再懸濁した。可溶化は、ＤＴＴが２０ｍＭの最終濃度で添加されるまで、室温で３０分間インキュベートされ、そしてインキュベーションはさらに３０分間、続けられた。可溶化が完結された後、溶液は、２１５００ｇ及び４℃での１０分間の遠心分離により透明化された。再折りたたみを、再折りたたみ緩衝液（典型的には：100 mM Tris-HCI pH 8.0, 、5.0 M のウレア、 5 mMのシステイン、1 mMのシスチン）中、０．３ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度の溶解されたタンパク質による急速希釈により実施した。再折りたたみ反応を、最少１４時間、通常通りインキュベートした。得られるタンパク質溶液を、８５００ｇ及び４℃での１０分間の遠心分離により透明化した。再折りたたまれたタンパク質を、Ｃａｐｔｏ Ｌ樹脂（GE Healthcare）上での親和性クロマトグラフィーにより精製した。単離されたモノマー画分を、サイズ排除ＨＰＬＣ、純度に関してはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びタンパク質含有量に関してはＵＶ／Ｖｉｓ分光計により分析した。緩衝液を、透析により、ネイティブ緩衝液（50 mM のクエン酸 - リン酸pH 6.4、200 mMの NaCl）に交換した。

二重特異性抗−ＣＤ３ × ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合動力学の決定のためのＳＰＲアッセイ
抗−ＣＤ３ × ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合親和性を、ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）を用いて、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。ＣＤ３への親和性測定のために、ヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメイン（内製）を、標準アミン−カップリング方法を用いて、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定した。９０〜０．１ｎＭの範囲のｓｃＤｂの連続的３倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そしてセンサーチップ上に固定されたＣＤ３εγからのタンパク質の解離を、１２分間、進行せしめた。各注入のサイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の２回の注入により再生する。ＩＬ５Ｒに対する親和性測定のために、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体を、アミン−カップリングにより、センサーチップ（SPR-2 Affinity Sensor High Capacity, Amine, Sierra Sensors）上に固定した。ＩＬ５Ｒ（９０ｎＭ−０．１ｎＭ）に対して特異的なｓｃＤｂの連続３倍希釈溶液を、流動細胞中に３分間、注入し、そして解離を１２分間、モニターした。各注入サイクルの後、表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）の３回の注入により再生した。見掛け解離（ｋｄ）及び会合（kａ）速度定数、及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_D）を、one−to−one Langmair結合モデルを用いて、ＭＡＳＳ−１分析ソフトフェア（Analyzer， Sierra Senors）により計算した。

Ｔ細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ３ε及びＤＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞）の表面上に発現されるＩＬ５Ｒへの二重特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの結合
ヒトＴ細胞系のJurkat細胞（クローンＥ６−１、ＡＴＣＣ）の細胞表面上に発現されるＣＤ３εへのｓｃＤｂの結合を、フローサイトメトリーにより分析した。Jurkat細胞の細胞表面上に提供される未知の成分へのｓｃＤｂの非特異的結合を評価するために、Jurkat Ｔ細胞系（J.RT3-T3.5, ATCC）のＣＤ３ε欠損誘導体を使用した。細胞表面上に発現されるＩＬ５ＲへのｓｃＤｂの結合を、トランスジェニックＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（ＺＨＡＷで生成された）を用いて分析し、そして野生型ＣＨＯ細胞（Invitrogen）を、非特異的結合のための対照として使用した。両細胞系を、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのｓｃＤｂと共に１時間インキュベートし、そして結合されたｓｃＤｂを、ＲＰＥ−標識されたプロテインＬ（BioVision）の添加により検出し、そして次に、フローサイトメーター（FACS aria III, Becton Dickinson）により分析した。負の対照として、無関係な標的物に対して特異的なｃｓＦｖを使用した。Jurkat及びＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞への結合の定性的評価のために、幾何学的平均でのシグナル強度に影響を及ぼす平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、非特異的ｓｃＦｖ及び試験ｓｃＤｂの両者について測定した。試験抗体と負の対照抗体との間のＭＦＩの差異（ΔＭＦＩ）を、結合のための尺度として計算した。さらに、標準化されたＭＦＩを、負の対照ｓｃＦｖのＭＦＩを介して試験ｓｃＤｂのＭＦＩを割算することにより計算した。

二重特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂによるＴ−細胞活性化：ＩＬ−２分泌の誘発
標的細胞の存在下でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞におけるＩＬ−２発現を誘発する、抗−ＣＤ３ × 抗−ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの可能性を、次の通りに評価した。細胞毒性Ｔ−細胞を、RosetteSep（登録商標） ヒトCD8+ T-細胞 富化カクテル(STEMCELL Technologies)を用いて、その製造業者の説明書に従って、ヒト血液から新たに単離した。ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０倍に連続的に希釈されたｓｃＤｂ（１００ｎＭ−０．００１ｎＭ）の存在下で、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共に、１０：１のエフェクター：標的物比でインキュベートした。Ｔ−細胞の非特異的刺激を評価するために、野生型ＣＨＯ細胞を、標的細胞として使用した。上清液を、１６時間の同時インキュベーションの後、収集し、ＩＬ−２放出を測定した。ＩＬ−２放出を、市販のＥＬＩＳＡキット（BilLegend）を用いて定量化した。データを、SoftMax（登録商標）Proデータ分析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて、４−パラメーターロジスティック曲線適合により分析し、そして最大の半分のＩＬ−２分泌（ＥＣ₅₀）を誘発するのに必要とされるｓｃＤｂのモル濃度を、用量応答曲線から誘導する。

細胞毒性Ｔ細胞によりＩL５Ｒ発現ＣＨＯ細胞のｓｃＤｂ介在性溶解
標的細胞溶液を誘発する二重特特異的抗−ＣＤ３ × ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂの可能性の評価のために、トランスジェニックＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞系を用いて（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）。上記のようにして単離された、刺激されていないヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞を、エフェクター細胞として使用した。標的細胞を、細胞ｔｏｘ緑色色素（Promega）により、その製造業者の説明書に従って、標識した。細胞溶液を、ＣｅｌｌＴｏｘ（登録商標）緑色細胞毒性アッセイ(Promega)緑色細胞毒性アッセイ（Promega）によりモニターした。アッセイは、細胞死の結果として生じる膜完全性の変化を測定する。アッセイは、生存細胞から排除されるが、しかし死亡細胞ＤＮＡを優先的に染色する非対称シアニン色素を用いる。色素が危険にさらされた細胞においてＤＮＡを結合する場合、蛍光特性は実質的に増強される。生存細胞は、蛍光の適切な上昇を生成しない。従って、死亡細胞ＤＮＡとの結合相互作用により生成される蛍光シグナルは、細胞毒性に比例する。同様に、上記のように、標識されたＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１０倍に連続的に希釈されたｓｃＤｂ（１００ｎＭ−０．００１ｎＭ）の存在下で、１０：１のエフェクター：標的物比でＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞と共にインキュベートした。標的物を発現しない細胞の非特異的溶解性を評価するために、Ｔ−細胞を、標識された野生型ＣＨＯ細胞と共に同時インキュベートした。蛍光強度を、マルチモードマイクロタイターリーダー（FlexStation 3, Molecular Devices）を用いて、８８時間のインキュベーションの後、分析した。データを、SoftMax（登録商標）Proデータ分析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて、４−パラメーターロジスティック曲線適合により分析し、そして最大の半分のＩＬ−２分泌（ＥＣ₅₀）を誘発するのに必要とされるｓｃＤｂのモル濃度を、用量応答曲線から誘導する。

実施例９のｓｃＤｂコンストラクトの作成
２つの異なる一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）コンストラクトを、周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成した。両方のｓｃＤｂは、同一のＩＬ５Ｒ結合可変ドメイン（ＶＬ：配列番号２９；ＶＨ：配列番号３０）を含むが、異なる抗ＣＤ３ドメインを含む。使用される２つの抗ＣＤ３結合ドメインは、一方ではクローン６のヒト化可変ドメイン（配列番号２１：ＶＬ；配列番号２２：ＶＨ）であり、他方では他の場所で記載されている抗ＣＤ３抗体ＴＲ６６の可変ドメインである（Mooreら、Blood.2011; 117:4542-4551)。

二重特異性ｓｃＤｂコンストラクトは、以下の設計：ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡであり、ここで、ＶＬＡおよびＶＨＡドメインは、共同してヒトＩＬ５Ｒに対する抗原結合部位を形成し、ＶＬＢおよびＶＨＢは、共同してヒトＣＤ３εに対する抗原結合部位を形成する。これらの可変ドメイン配列セグメントは、それぞれアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（Ｇ₄Ｓ）からなる柔軟なアミノ酸リンカーＬ１およびＬ３、並びにアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇ₄Ｓ）₄からなる中間リンカーＬ２によって連結されている。

実施例９のｓｃＤｂコンストラクトの製造
2つの抗IL5R x CDE3ε scDbコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を新たに合成し、大腸菌発現のための適合ベクターであって、ｐＥＴ２６ｂ（＋）骨格（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づくベクターにクローン化した。発現コンストラクトを大腸菌BL12（DE3）株（Novagen）に形質転換し、細胞を出発培養物として２ＹＴ培地（Sambrook、J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual）中で培養した。発現培養物を接種し、３７℃および２００ｒｐｍで振盪フラスコ中でインキュベートした。ＯＤ６００ｎｍが１に達したら、最終濃度０．５ｍＭでＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。一晩発現させた後、細胞を４０００ｇでの遠心分離によって回収した。封入体の調製のために、細胞ペレットをＩＢ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に再懸濁した。細胞スラリーに、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０ｍＭロイペプチン、１００μＭのＰＭＳＦおよび１μＭのペプスタチンを添加した。細胞を氷上で冷却しながら３回の超音波ホモジナイゼーションにより溶解する。続いて、０．０１ｍｇ／ｍＬのＤＮAｓｅを加え、ホモジネートを室温で２０分間インキュベートした。封入体を１５０００ｇ及び４℃の遠心により沈降させた。IBをIB再懸濁緩衝液で再懸濁し、そして更なる遠心前にソニケーションによりホモジェナイズした。合計で、ＩＢ再懸濁緩衝液での最低３回の洗浄工程を行い、続いてＩＢ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄して最終ＩＢを得た。

タンパク質リフォールディングのために、単離されたＩＢを、湿潤ＩＢ１ｇ当たり５ｍＬの比率で、可溶化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８．０，６ＭのＧｄｎ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。ＤＴＴが最終濃度２０ｍＭで添加されるまで、可溶化物を室温で３０分間インキュベートし、そしてインキュベートをさらに３０分間続けた。可溶化が完了した後、２１５００ｇ及び４℃で１０分間の遠心分離によって溶液を清澄化した。リフォールディングは、リフォールディング緩衝液（典型的には１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５．０Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、１ｍＭシスチン）中に、可溶化タンパク質０．３ｇ／Ｌの最終タンパク質濃度で急速希釈によって実施した。リフォールディング反応は、最低14時間、定常的にインキュベートした。得られたタンパク質溶液を、８５００ｇおよび４℃で１０分間の遠心分離によって清澄化した。リフォールディングされたタンパク質を、Capto L樹脂（GE Healthcare）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。単離した単量体画分をサイズ排除ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度について分析し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によりタンパク質含量について分析した。透析により、緩衝液を天然緩衝液（５０ｍＭクエン酸-リン酸塩ｐＨ６．４，２００ｍＭのＮａＣｌ）に交換した。

実施例９の二重特異性抗ＣＤ３×ＩＬ５Ｒ ｓｃＤｂｓによるＴ細胞活性化
標的細胞の存在下で抗ＩＬ５Ｒ×ＣＤ３ ｓｃＤｂがＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞においてサイトカイン発現を誘導する可能性を以下のように評価した。CD８＋T細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮カクテル（STEMCELL Technologies）を製造元の指示に従って使用することにより、ヒト血液から新たに単離するか、または
ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（STEMCELL Technologies）を用いてヒト軟膜から新たに単離した。ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１００００細胞／ウェル）を、連続希釈されたｓｃＤｂ（１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４ｎＭ）の存在下で、１０：１のエフェクター細胞：標的細胞比でＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と共に、９６ウェルマイクロタイタープレート中でインキュベートした。Ｔ細胞の非特異的刺激を評価するために、野生型ＣＨＯ細胞を標的細胞として使用した。サイトカイン濃度を測定するために、６４時間の共インキュベート後に上清を回収した。市販のＥＬＩＳＡキット（IFNγ:BioLegend; TNF:BioLegend; IL-10:BioLegend; TGFP:BioLegend; IL-6:BioLegend）を用いてサイトカイン放出を定量した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏデータ解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた４パラメータロジスティック曲線フィットを用いて解析した。

Ｔ細胞活性化を誘導する二重特異性抗ＩＬ−５Ｒ×ＣＤ３ ｓｃＤｂの潜在性を、他の文献（Gilら、Cell.2002; 109:901- 912）に記載されている初期Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９発現の誘導の測定によって評価した。１８時間後、ヒトＣＤ６９に特異的なフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体（BioLegend、カタログ番号310906）を用いてＣＤ６９発現について細胞を染色し、次いでフローサイトメーター（NovoCyte、Acea Biosciences)で分析した。陰性対照として、刺激されていないヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記と同じ条件でｈＩＬ５Ｒ陰性ＣＨＯ細胞とともにインキュベートした。

ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、またはＬＡＧ−３のなどの他の消耗マーカーについて、類似の手順を使用することによって同様の結果を得ることができる。

実施例９の細胞傷害性Ｔ細胞によるＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞のｓｃＤｂ媒介性溶解
標的細胞溶解を誘導する二重特異性抗ＩＬ５Ｒ×ＣＤ３ ｓｃＤｂの潜在性の評価のために、トランスジェニックＩＬ５Ｒ発現ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ）を用いた。上記のように単離した非刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。標的細胞は、製造業者の指示に従って細胞毒素緑色色素（Promega）で標識した。細胞溶解はCellToxグリーン細胞毒性アッセイ（Promega）によってモニターされた。当該アッセイは、細胞死の結果として起こる膜の完全性の変化を測定する。当該アッセイは、生存細胞からは排除されるが、優先的に死細胞ＤＮＡを染色する非対称シアニン色素を用いる。染色された細胞において色素がＤＮＡに結合すると、その蛍光特性は実質的に増強される。生存細胞は、蛍光の感知可能な増加をもたらさない。したがって、死細胞ＤＮＡとの結合相互作用によって生成される蛍光シグナルは、細胞傷害性に比例する。上述と同様に、標識されたＣＨＯ−ＩＬ５Ｒ細胞（１００００細胞／ウェル）を、９６穴マイクロタイタープレート中に５倍連続希釈ｓｃＤｂ（１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４ｎＭ）の存在下で、エフェクター細胞：標的細胞の１０：１の比率でのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞とインキュベートした。標的を発現しない細胞の非特異的溶解を評価するために、T細胞を標識された野生型ＣＨＯ細胞とともにインキュベートした。蛍光強度は、マルチモードマイクロペーパリーリーダー（FlexStation 3、Molecular Devices）を用いて１８，２４，４０，４８および６４時間のインキュベーション後に分析した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐroデータ解析ソフトウェア（Molecular Devices）を用いた4パラメータロジスティック曲線フィットを用いて分析し、半最大標的細胞溶解（EC50）を誘導するのに必要なｓｃＤｂのモル濃度を、用量反応曲線から得た。
［全ての配列の代表として、配列番号１及び２において、ＣＤＲ１〜３を太字及び下線で示す］
［配列番号１９及び２０において、位置「X」は、縮重位置であり、各「X」の後ろの括弧に示される縮重である］

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定するものではない。実際、本発明に記載される修飾の他に、本発明の種々の修飾が前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

それぞれの特許法の下で可能な限り、本明細書に引用される、すべての特許、出願、出版物、試験方法、文献及び他の材料は、引用により本明細書に組込まれる。

図３は、架橋された抗−ｈＣＤ３ε ｍＡｂ（図３Ａ：クラスター０２ａ； 図３Ｂ：クラスター０２ｂ）によるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。使用された抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５．０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。Ｊｕｒｋａｔ細胞数（Ｙ軸）対ＰＥ強度（ＣＤ６９発現）（Ｘ軸）。 図３は、架橋された抗−ｈＣＤ３ε ｍＡｂ（図３Ａ：クラスター０２ａ； 図３Ｂ：クラスター０２ｂ）によるＣＤ６９発現の刺激を示す。精製されたウサギモノクローナル抗−ＣＤ３抗体及び比較抗体ＴＲ６６及びＯＫＴ−３のＴ−細胞活性化を誘発する可能性が、ＣＤ６９発現の測定により評価された。３種の異なった濃度の架橋された抗体がJurkat細胞を刺激するために使用され、そしてＣＤ６９発現が、２４時間後、フローサイトメトリーにより評価された。使用された抗体濃度は、１．２５μｇ／ｍｌ（ａ）、５．０μｇ／ｍｌ（ｂ）及び２０μｇ／ｍｌ（ｃ）であった。Ｊｕｒｋａｔ細胞数（Ｙ軸）対ＰＥ強度（ＣＤ６９発現）（Ｘ軸）。

Claims (25)

1. 少なくとも（ｉ）標的結合部分；及び（ｉｉ）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的である結合領域を含む結合分子を含む、多重特異性分子であって、当該結合領域が、配列番号２１、２３、及び２４の群から選ばれるＶＬドメイン、及び配列番号２２のＶＨドメインを含む抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであり；但し当該ＶＬドメインが、配列番号２１である場合、当該標的結合部分はＩＬ５Ｒに特異的ではない、前記多重特異性分子。
2. 前記標的部分が、IL23Rに特異的であり、特に当該標的部分が配列番号２５、２６、及び２７の群から選ばれるＶＬドメイン、及び配列番号２８のＶＨドメインを含む抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントである、請求項１に記載の多重特異性分子。
3. 少なくとも（i)標的結合部分；及び（ii)以下の（a)〜（ｇ）の１又はそれ以上にしたがった結合分子である結合分子を含む、多重特異性分子：
   （a)ヒトCD３εのエピトープに特異的である結合領域を含む結合分子、特に抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであって、当該エピトープが、結合に決定的である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含み、特に前記エピトープが、さらに結合に関与する残基としてアミノ酸残基Ｅ６をさらに含み；及び／又はＣＤ３ｅのＱ１、Ｄ２、Ｇ３、及びＥ５の内の少なくとも１が結合に決定的ではない結合分子；
   （ｂ）ヒトCD3のエピトープに特異的である結合分子であって、当該結合分子が、ヒトＣＤ３に対して、３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数で結合し、当該抗体又はその機能フラグメントが、ヒトＣＤ３に対して、３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合のための解離定数で結合する、結合分子；
   （ｃ） ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原−結合領域を含む、抗体又はその機能フラグメントである結合分子であって、前記抗体又はその機能フラグメントが、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合に、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での２４時間の刺激後において、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強いＴ−細胞活性化を誘発する、前記結合分子；
   （ｄ） ヒトＣＤ３のエピトープに対して特異的である抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントである結合分子であって、当該抗体又はその機能フラグメントが、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での７２時間の刺激後において、ＣＤ６９発現の少なくとも１．５倍の増加により示される、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて、長く持続するＴ−細胞活性化をもたらす、前記結合分子；
   （ｅ） ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原−結合領域を含む抗体又はその機能的フラグメントである結合分子あって、当該抗体又はその機能的フラグメントが、架橋されてＩｇＧ形式で試験される場合、Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらす、前記結合分子；
   （ｆ） ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原−結合領域を含む抗体又はその機能的フラグメントである結合分子であって、前記抗体又はその機能的フラグメントが、ＩｇＧ形式で試験される場合、（ｉ）３．０×１０^-8Ｍ未満、特に１．５×１０^-8Ｍ未満、より特定には１．２×１０^-8Ｍ未満、及び最も特定には１．０×１０^-8Ｍ未満の一価結合についての解離定数でヒトＣＤ３に結合し；そして（ｉｉａ）架橋された状態で、１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での２４時間の刺激後に、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６よりも少なくとも１．５倍強いＴ−細胞活性化を誘発し；（ｉｉｂ）１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での７２時間の刺激後に、ＣＤ６９発現において少なくとも１．５倍の増加により示される、抗体ＯＫＴ−３又はＴＲ６６と比べて長く持続するＴ−細胞活性化をもたらし；（ｉｉｃ）Ｔ細胞の用量依存性均質活性化状態をもたらし、及び/又は（ｉｉｄ）ヒトＣＤ３εのエピトープに特異的であり、ここで当該エピトープが結合に重要である残基としてアミノ酸残基Ｎ４を含む、前記結合分子；
   （ｇ） ヒトＣＤ３のエピトープに特異的である抗原−結合領域を含む抗体又はその機能的フラグメントである結合分子であって、前記多重特異性分子が、当該多重特異性分子と同じフォーマットでＴＲ６６をＣＤ３結合部分として含む多重特異性コンストラクトと比較した場合に、標的細胞の同等又はさらにより効率的な溶解をもたらす効力を示す、結合分子。
4. 前記結合分子が、カニクイザルCD3、特にカニクイザルCD3εに対して交差反応性であり、特にヒトCD３εに対する親和性とは、カニクイザルCD3εに対して、１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより具体的に１５倍未満、そして最も具体的に５倍未満異なっている親和性を有する、請求項３に記載の多重特異性分子。
5. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、前記エピトープがヒトＣＤ３のε鎖に位置する、請求項３又は４に記載の多重特異性分子。
6. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、ヒトＣＤ３εへの前記結合が、ヒト起源のヘテロダイマーＣＤ３εγの精製された細胞外ドメインへの、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントの親和性を、表面プラズモン共鳴実験を用いて、特に次の条件：
   ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ装置（Sierra Sensors）; 捕捉抗体：標準アミン−カップリング方法を用いて、ＳＰＲ−２ Affinity Sensor chip, Amine, Sierra Sensors上に固定された前記ＩｇＧのＦｃ領域に対して特異的な抗体；９０−２．８１ｎＭの範囲のヒトへテロダイマー一本鎖ＣＤ３εγ細胞外ドメインの二倍連続希釈、フローセル中への３分間の注入、及びセンサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の５分間の解離、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの２回の注入による各注入サイクル後の表面再生、one−to−one Langmuir結合モデルを用いて、Ｍａｓｓ−１分析ソフトウェア（Analyzer、Sierra Sensors）による見掛け解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数及び見掛け解離平衡定数（Ｋ_D）の計算
   を用いて、決定することにより決定される、請求項３〜５のいずれか一項記載の多重特異性分子。
7. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、ｆ（ｉｉａ）及び／又はｆ（ｉｉｃ）に従ったＴ−細胞活性化の前記誘発が、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激を、特に次の条件：
   ３倍過剰の抗−ＩｇＧ抗体（対照：ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）と架橋されているＯＫＴ３（BioLegend, カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novns Biolgicals、カタログ番号ＮＢＰ1−９９４４６））の添加による事前の架橋の後において、２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントにより、２４時間Jurkat細胞（１００，０００個の細胞／ウェル）を刺激し；
   ヒトＣＤ６９に対して特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−標識された抗体（BioLegend，カタログ番号３１０９０６）を用いて、刺激後のＣＤ６９発現を細胞染色し；
   フローサイトメーター（ＦＡＣＳ aria III、Becton Dickinson）で分析し；ここで陰性対照が前記架橋抗体とインキュベートされ、前記抗−ＣＤ６９抗体により染色された未刺激のJurkat細胞である
   を用いて決定することにより、決定される、請求項３〜６のいずれか一項記載の多重特異性分子。
8. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、ｆ）（ｉｉｂ）に従った前記長く持続するＴ−細胞活性化が、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントによるＣＤ６９発現の刺激のタイムコースを、特に次の条件：
   ５μｇ／ｍｌのＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメント、すなわち請求項４に記載のようにして架橋された抗−ＣＤ３抗体により、０，４，１５，２４，４８及び７２時間の１００，０００個のJurkat細胞／ウェルを刺激し、そして請求項４に記載のようにフローサイトメーターによりＣＤ６９発現の分析する
   を用いて決定することにより、決定される、請求項３〜７のいずれか一項記載の多重特異性分子。
9. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、ｆ）（ｉｉａ）及び／又は（ｉｉｃ）に従ったＴ−細胞活性化の前記誘発が、ＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントによるＩＬ−２分泌の刺激を、
   特に次の条件：
   ５μｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメントによるJurkat細胞（２００，０００個の細胞／ウェル）を、次の４種の異なったアッセイ設定を用いて刺激し：
   （ａ）３倍高い濃度の抗ＩｇＧ抗体の添加により架橋されたＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメント（対照：ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jacksonlmmuno Research、カタログ番号３１５−００５−００８）で架橋されているＯＫＴ３（BilLegend、カタログ番号３１７３０２）又はＴＲ６６（Novus Biologicals, カタログ番号ＮＢＰ−９７４４６））によるJurkat細胞の刺激；
   （ｂ）架橋抗体の不在下でのＴ−細胞活性化；
   （ｃ）一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上への前記架橋抗体の固定化；
   （ｄ）架橋抗体の不在下での一晩のインキュベーションによる組織培養プレート上へのＩｇＧ形式の前記抗体又はその機能的フラグメント（又は対照抗体）の固定化
   各設定においては、添加の１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで細胞を刺激し、そして２４、４８及び７２時間後に上清を収集して、市販のELISA（Biolegenｄ、カタログ番号４３１８０１）を用いて定量されたＩＬ−２放出を測定する
   を用いて決定することにより決定される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の単離抗体又はその機能的フラグメント。
10. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、ここで前記抗体又はその機能フラグメントが、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である、請求項５〜９のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
11. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、抗体又はその機能的フラグメントが、(i)ウサギ抗体又はその機能的フラグメント、又は(ii)（i）の前記ウサギ抗体又はその機能的フラグメントをヒト化することに得られる抗体又はその機能的フラグメントである、請求項３〜１０のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
12. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、前記抗体又はその機能フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、及び２４特に配列番号３、５、９、２１、２３、及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３、及び２４に存在する、１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２及び１つのＣＤＲ３領域の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、及び２４、特に配列番号３、５、９、２１、２３、及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３及び２４に存在するフレームワークドメインから選択されたフレームワークドメインを含む）を含む抗原−結合領域を含む、請求項３〜１１のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
13. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、前記抗体又はその機能フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＨドメイン（特に、前記ＶＨドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３，及び２４特に配列番号３、５、９、２１、２３及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３、及び２４の１つに存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組合せを含むＶＬドメイン（特に、前記ＶＬドメインは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、及び２４特に配列番号３、５、９、２１、２３及び２４より特定には配列番号９、２１、２３及び２４の１つに存在するフレームワークドメインの組合せを含む）を含む抗原−結合領域を含む、請求項１２に記載の多重特異性抗体。
14. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、前記抗体又はその機能フラグメントが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２、特に配列番号４、６、１０及び２２、より特定には配列番号１０及び２２から選択されたＶＨドメイン、及び配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１、２３、及び２４特に配列番号３、５、９、２１、１３、及び２４、より特定には配列番号９、２１、２３及び２４から選択されたＶＬドメインを含む抗原−結合領域を含む、請求項３に記載の多重特異性抗体。
15. 前記結合分子が、抗体又はその機能フラグメントであり、前記抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号１／配列番号２；配列番号３／配列番号４；配列番号５／配列番号６；配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２２、及び配列番号２４／配列番号２２；特に配列番号３／配列番号４；配列番号５／配列番号６；配列番号９／配列番号１０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２２、及び配列番号２４／配列番号２２；より特定には配列番号９／配列番号１０及び配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４及び配列番号２４／配列番号２２から選択されたＶＨ／ＶＬドメイン組合せを含む抗原−結合領域を含む、請求項１４に記載の多重特異性抗体。
16. 少なくとも（i)標的結合部分；及び（ii)請求項１２〜１５のいずれか一項に記載される抗体又はその機能フラグメントと実質的に同じエピトープに結合する、結合分子、特に抗体又はその機能フラグメントである結合分子を含む、多重特異性抗体。
17. 前記結合分子が、抗原結合領域を含む抗体又はその機能フラグメントであり、請求項１４又は１５の抗原結合領域をヒト化することにより得られる、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性分子、特に二重特異性抗体又はその機能的二重特異性フラグメント、及び場合により医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
19. 請求項１〜１７のいずれか一項記載の多重特異性分子、特に二重特異性抗体又はその機能的二重特異性フラグメントをコードする核酸配列又はその集合物。
20. 請求項１９に記載の核酸配列又はその集合物を含む、ベクター又はその集合物。
21. 請求項１９に記載の核酸配列又はその集合物、又は請求項２０に記載のベクター又はその集合物を含む、宿主細胞、特に発現宿主細胞。
22. 請求項１〜１７のいずれか一項記載の本発明の多重特異性分子、特に重篤異性抗体又はその機能的二重特異性フラグメントの生成方法であって、請求項１９に記載の核酸配列又はその集合物、又は請求項２０に記載のベクター又はその集合物、又は請求項２１に記載の宿主細胞、特に発現宿主細胞を発現する工程を含む、前記方法。
23. CD3ε結合抗体又はその機能フラグメントを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性分子を生成する方法であって、以下の工程：
    a)ウサギをCD３ε発現プラスミドで免疫化して、宿主細胞の表面状で天然の全長CD3εを提示させ；
    b)蛍光活性化セルソーティングを用いて、CD３ε／γ一本鎖と相互作用するアフィニティ成熟された記憶B細胞をクローン単離し；
    c)単一のソートされたB細胞を、ソーとされたクローンの免疫化を必要としない共培養システム中で培養し；
    d)細胞ベースのELISA中でB細胞培養物上清をスクリーニングして、T細胞表面状のTCR複合体に埋め込まれた天然CD３εに結合する抗体を同定し；
    e)工程ｄ）で同定された抗体、又はその機能フラグメントを、標的結合部分と組み合わせる
    を含む、前記方法。
24. 癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、及び神経変性疾患から選ばれる疾患の治療における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
25. 癌、炎症性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、及び神経変性疾患から選ばれる疾患の治療方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性分子を、必要とする患者に投与する工程を含む、前記方法。