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JP2016514456A - 生物活性ペプチド担持抗体を生成する方法およびそれを含む組成物 - Google Patents

生物活性ペプチド担持抗体を生成する方法およびそれを含む組成物 Download PDF

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Abstract

一局面において、本発明は、生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該生物活性ペプチドアミノ酸配列が、補体系の阻害物質であり、かつ（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域のうちの少なくとも一方に融合されており、該抗体が補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/962,289号および2013年5月16日に出願された米国仮特許出願第61/823,964号の恩典を主張し、両出願は参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、生物活性ペプチド担持抗体およびその断片、例えば生物活性ペプチドを含む抗体（例えば阻害ペプチド担持MASP-2抗体）を生成するための方法、および補体活性化の阻害に使用するための、そのような生物活性ペプチド担持抗体を含む組成物に関する。
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、印刷物の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含んでいるテキストファイルの名称はMP_1_0207_PCT_Sequence_Listing_20140311_ST25である。このテキストファイルは297KBであり、2014年3月12日に作成されたもので、本明細書の出願と共にEFS-Webにより提出されている。
背景
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において、微生物感染および他の急性侵襲に対する免疫応答を開始、増幅、および編成するための初期作用機構を提供する（M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul編、Raven Press, Ltd., New York（非特許文献1））。補体活性化は潜在的病原体に対する有益で最も重要な防御となるが、保護免疫応答を促進する補体の活性化は宿主にとって潜在的脅威にもなりうる（K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994（非特許文献2）; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994（非特許文献3））。例えばC3およびC5のタンパク質分解産物は好中球を動員して活性化する。活性化好中球は宿主防御にとって不可欠であるが、活性化好中球による破壊酵素の放出は無差別的であり、臓器損傷の原因になりうる。加えて、補体活性化は、微生物標的だけでなく近傍の宿主細胞にも溶解性補体成分が沈着して宿主細胞溶解をもたらす原因になりうる。
補体系は、以下を含む数多くの急性病状および慢性病状の病理発生にも関係づけられている:心筋梗塞、卒中、急性呼吸窮迫症候群、再灌流傷害、敗血症性ショック、熱傷後の毛細管漏出、心肺バイパス術後炎症、移植片拒絶、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、加齢性黄斑変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、およびアルツハイマー病。これらの状態のほとんど全てにおいて、補体は原因ではないが、病理発生に関与するいくつかの因子のうちの一つである。それでもなお、補体活性化は主要な病理学的機構であるといえ、これらの病状の多くにおいて有効な臨床的制御ポイントである。
さまざまな病状における補体媒介性組織傷害の重要性の認識が高まることにより、効果的な補体阻害薬の必要性が明確になっている。今のところ、C5に対する抗体であるエクリズマブ（Soliris（登録商標））が、ヒト用として承認された唯一の補体標的指向化薬である。しかしC5は、補体系では「下流」に位置するいくつかのエフェクター分子の一つであり、C5を遮断しても補体系の活性化は阻害されない。それゆえに、補体活性化の開始段階の阻害物質には、「下流」補体阻害物質と比較して、多くの有意義な利点があるだろう。
補体活性化には3つの異なる経路が明らかにされている。古典的経路は特定の抗体アイソタイプが病原体または宿主抗原に結合すると活性化される。レクチン経路は、マンナン結合レクチン（MBL）、CL-11、またはフィコリンL、M、もしくはHなどのパターン認識レクチンが多糖などの複雑な微生物高分子または宿主高分子に結合すると活性化される。最後に、代替経路は、古典経路およびレクチン経路によって生成したシグナルを増幅するのに役立つ。セリンプロテアーゼのファミリーが3つの経路全ての初期活性化段階に不可欠である。C1rおよびC1sは、補体活性化抗体によって組み立てられるC1複合体の酵素構成要素を形成する。加えて、レクチン経路および代替経路のプロテアーゼカスケードを開始および/または伝播する3つのMBL関連セリンプロテアーゼ（MASP）がある（Yongqing et al., Biochim. Biophys. Acta 1824:253, 2012（非特許文献4））。
MASP-1、MASP-2、およびMASP-3は、C1複合体の酵素構成要素であるC1rおよびC1sと同じドメイン構成を持つ（Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000（非特許文献5））。これらのドメインには、N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形態形成タンパク質（CUB）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、第2のCUBドメイン、タンデム型の補体制御タンパク質ドメイン、およびセリンプロテアーゼドメインが含まれる。C1プロテアーゼの場合と同様に、MASPプロテアーゼの活性化は、セリンプロテアーゼドメインに近接するArg-Ile結合の切断によって起こる。これによって酵素はジスルフィド連結されたA鎖とB鎖とに分割され、後者はセリンプロテアーゼドメインからなる。
それぞれSGMI-1およびSGMI-2と呼ばれるMASP-1およびMASP-2の特異的ペプチド阻害物質の生成が、Heja et al, J Biol Chem 287:20290 (2012)（非特許文献6）およびHeja et al, PNAS 109:10498 (2012)（非特許文献7）に記載されており、これらの各文献は参照により本明細書に組み入れられる。SGMI-1およびSGMI-2は、プロテアーゼ結合ループの8つの位置のうちの6つを完全にランダム化したサバクトビバッタ（Schistocerca gregaria）プロテアーゼインヒビター2の変種のファージライブラリーより選択された、それぞれ36個のアミノ酸のペプチドである。機構的には、SGMI-1とSGMI-2はどちらも、古典経路には影響を及ぼさずに、補体活性化のレクチン経路を遮断する（Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498（非特許文献7））。しかし、血清におけるペプチドの半減期は短いので、SGMI-1およびSGMI-2などのペプチドは、治療的応用に使用するには、その潜在力に制約がある。
M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul編、Raven Press, Ltd., New York K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994 B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994 Yongqing et al., Biochim. Biophys. Acta 1824:253, 2012 Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000 Heja et al, J Biol Chem 287:20290 (2012) Heja et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498 (2012)
概要
本概要は、選ばれたいくつかの概念を簡略化した形で紹介するために掲載するものであり、それらの概念については下記の詳細な説明においてさらに説明する。この概要は、本願の主題の重要な特徴を特定することを意図するものではなく、本願の主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図していない。
一局面において、本発明は、生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、生物活性ペプチドアミノ酸配列は補体系の阻害物質であり、かつ（i）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域の少なくとも一方に融合されており、抗体が補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の局面において、本発明は、（i）MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域と、（ii）X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）によるアミノ酸配列を含み、X1がFまたはVであり、X2がRまたはKであり、X3がKまたはLであり、X4がLまたはWであり、かつX5がYまたはNであり、かつ、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列とを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、SGMIコアペプチド配列が、（a）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域；または（b）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域；または（c）軽鎖ヒト定常領域および/もしくは重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域のうちの少なくとも1つに融合されており、抗体またはその抗原結合性断片が、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の局面において、本発明は、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を含む可変領域と、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列とを含む抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸分子の発現が可能な条件下で、ペプチド担持抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む細胞を培養する工程、および該ペプチド担持抗体を単離する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）またはSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）のうちの少なくとも一方に対応するアミノ酸配列をさらに含み、マンナン被覆基材上でC4活性化を1％ヒト血清において10nMまたはそれ未満のIC50で阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、該抗体またはその抗原結合性断片が、（i）SEQ ID NO:111として示す重鎖可変領域とSEQ ID NO:115として示す軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって、または（ii）European Collection of Cell Cultures（ECACC）、英国ウィルトシャー州ソールズベリーに受託番号03050904として寄託されているハイブリドーマ細胞株が生産する参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を、特異的に認識する。
別の局面において、本発明は、生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、（a）（i）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、もしくはCDR-H3のうちの少なくとも1つに、および/または（ii）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、もしくはCDR-L3のうちの少なくとも1つに、少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を移植する工程、ならびに（b）ペプチド担持抗体が、単離された生物活性ペプチドと少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの生物活性ペプチドアミノ酸配列が、（i）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域、および/または（ii）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域、のうちの少なくとも1つに移植されている、単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供する。いくつかの態様では、1つまたは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3のうちの少なくとも1つに、生物活性ペプチドが移植されている。いくつかの態様では、1つまたは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3のうちの少なくとも1つに、生物活性ペプチドが移植されている。
別の局面において、本発明は、生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、（a）（i）1つもしくは複数のフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に、および/あるいは（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に、少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を融合する工程、ならびに（b）ペプチド担持抗体が、単離された生物活性ペプチドと比較して少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、（i）1つもしくは複数のフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域および/もしくは1つまたは複数のフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域の少なくとも一方に、生物活性ペプチドアミノ酸配列が融合されており、ペプチド担持抗体が、単離された生物活性ペプチドと少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の局面において、本発明は、（i）SGMIコア配列が、X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）によるアミノ酸配列を含み、X1がFまたはVであり、X2がRまたはKであり、X3がKまたはLであり、X4がLまたはWであり、かつX5がYまたはNである、SGMIコア配列を含む領域と、（ii）ヒトIgG1 Fcを含む領域とを含み、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、単離されたポリペプチドを提供する。
別の局面において、本発明は、本明細書において開示する生物活性ペプチド担持抗体およびその抗原結合性断片を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物対象においてレクチン経路補体活性化を阻害する方法であって、レクチン経路活性化を阻害するのに十分な量のSGMIペプチド担持抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、レクチン補体媒介性血管異常、虚血再灌流傷害、アテローム性動脈硬化、炎症性胃腸疾患、肺異常、体外再灌流術、筋骨格異常、腎臓異常、皮膚異常、臓器移植もしくは組織移植、神経系障害もしくは神経系損傷、血液障害、泌尿生殖器異常、糖尿病、化学療法もしくは放射線療法、悪性腫瘍、内分泌疾患、血液凝固異常、血栓性微小血管症、または眼科異常を処置するか、それらを防止するか、またはそれらの重症度を軽減するためにMASP-2依存性レクチン補体活性化および/またはMASP-1依存性レクチン補体活性化を阻害する際に使用するための医薬を製造する方法であって、MASP-2依存性レクチン経路活性化および/またはMASP-1依存性レクチン経路活性化を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-2-MASP-2抗体などのSGMI-2担持抗体および/もしくはSGMI-1 MASP-2抗体などのSGMI-1担持抗体、またはSGMI-1およびSGMI-2担持抗体）またはその抗原結合性断片の治療有効量を薬学的担体中で混和する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢性黄斑変性症、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内血液凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非定型的HUS（aHUS）および血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎およびベーチェット病からなる群より選択される疾患または障害を処置するか、該疾患または該障害を防止するか、または該疾患または該障害の重症度を軽減するためにレクチン経路活性化およびMASP-1依存性代替経路活性化を阻害する際に使用するための医薬を製造する方法であって、治療有効量の（i）MASP-1活性を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-1を含む抗体）、（ii）SGMI-1-MASP-2抗体、（iii）SGMI-1およびSGMI-2担持抗体、または（iv）第1のSGMI-1担持抗体および第2のSGMI-2担持抗体のうちの少なくとも1つを、薬学的担体中で混和する工程を含む、方法を提供する。
本明細書に記載するように、生物活性担持抗体およびその断片のさまざまな態様は、本発明の薬学的組成物において使用することができる。
本明細書に記載するように、本発明の薬学的組成物は、本発明の方法に従って使用することができる。
本明細書に記載する発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照すれば、明白になるであろう。本明細書において言及する米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は全て、あたかもそれぞれが個別に組み入れられているかのように、参照により本明細書にそのまま組み入れられる。
図面の説明
本発明の前記の局面および付随する利点の多くは、以下の詳細な説明を、添付の図面と併せて解釈すれば、よりよく理解されることになるので、それらを正しく理解することが、より容易になるであろう。
陽性血清、陰性血清、アイソタイプ対照、SGMI-1FcまたはSGMI-2Fcの存在下でのC5b-C9形成パーセントを示す棒グラフであり、実施例2で述べるように、SGMI-1FcとSGMI-2Fcがどちらもレクチン経路の活性化を阻害することを実証している。 1％正常血清＋0.15nM〜1000nMの濃度範囲にわたるアイソタイプ対照、SGMI-1FcまたはSGMI-2Fcに関して、C3b沈着のレベルをグラフで図解しており、実施例2で述べるように、SGMI-1FcとSGMI-2Fcがどちらもマンナン被覆ELISAウェルにおける正常血清からのC3b沈着を阻害したことを実証している。 相補性決定領域3（CDR-3）内に移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む可変重鎖ポリペプチド配列と比較した例示的親（DTLacO）可変重鎖ポリペプチド配列を図解している。 CDR-3内に移植された生物活性ペプチドSGMI-1およびその変種を含む例示的可変重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを、生物活性ペプチドのC末端および/またはN末端にある任意選択のリンカーを含めて表している。 CDR-1内に移植された生物活性ペプチドを含む可変軽鎖ポリペプチド配列と比較した例示的親（DTLacO）可変軽鎖ポリペプチド配列を図解している。 CDR-1内に移植された生物活性ペプチドSGMI-1またはSGMI-2およびそれらの変種を含む例示的可変軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを、生物活性ペプチドのC末端および/またはN末端にある任意選択のリンカーを含めて表している。 CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトmAbの、C5b-C9沈着に対する阻害活性をグラフで図解している。 CDR-3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまなさらなる代表的なキメラニワトリ/ヒトmAbの、C5b-C9沈着に対する阻害活性をグラフで図解している。 実施例3で述べる、CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトmAbの、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性をグラフで図解している。 実施例3で述べる、CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまなさらなる代表的なキメラニワトリ/ヒトmAbの、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性をグラフで図解している。 実施例3で述べる、CDR-L1に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトモノクローナル抗体（mAb）の、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性をグラフで図解している。 実施例3で述べる、CDR-L1に移植されたSGMI-1を含有するさまざまなさらなる代表的なキメラニワトリ/ヒトmAbの、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性をグラフで図解している。 CDR-L1内に移植されたSGMI-2を含むキメラニワトリ/ヒトmAb（Ab-SGMI-2L-Igλ）およびCDR-H3内に移植されたSGMI-1とCDR-L1内に移植されたSGMI-2との組合せを含むキメラニワトリ/ヒトmAb（Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-Igλ）の阻害活性をグラフで図解しており、実施例3で述べるように、キメラ組合せSGMI-1-SGMI-2 mAb（Ab-SBMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-Igλ）がC5b-C9沈着を阻害することを実証している。 CDR-H3内に移植されたSGMI-1とCDR-L1内に移植されたSGMI-2との組合せを含むキメラニワトリ/ヒトmAb（Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-Igλ）の阻害活性をグラフで図解しており、実施例3で述べるように、キメラ組合せSGMI-1-SGMI-2 mAb（Ab-SBMI-1-L1-IgG1/SGMI-2L-Igλ）がC5b-C9沈着を阻害することを実証している。 実施例4で述べる、重鎖可変領域のN末端（A）、および/または軽鎖可変領域のN末端（B）、および/または重鎖定常領域のC末端（C）、および/または軽鎖定常領域のC末端（D）に融合された生物活性ペプチドを含むキメラニワトリ/ヒト抗体を図解している。 重鎖または軽鎖のN末端またはC末端に融合された生物活性SGMI-1またはSGMI-2ペプチドを含むキメラニワトリ/ヒト抗体の阻害活性をグラフで図解しており、実施例4で述べるように、これらのペプチド-mAb融合物がいずれもC5b-C9沈着を阻害することを実証している。 Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002)の原図にYongqing et al, BBA 1824:253 (2012)が変更を加えた模式図であり、MASP-2とMAp19のタンパク質ドメインとそれをコードするエクソンを図解している。 Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002)の原図にYongqing et al, BBA 1824:253 (2012)が変更を加えた模式図であり、MASP-1、MASP-3、およびMAp44のタンパク質ドメインとそれをコードするエクソンを図解している。 最も活性なscFvクローンのアミノ酸配列アラインメントを示し、実施例5で述べるように、2つの異なるグループがそれぞれVH2遺伝子ファミリーとVH6遺伝子ファミリーに属することを明らかにしている。 最も活性なscFvクローンのアミノ酸配列アラインメントを示し、実施例5で述べるように、2つの異なるグループがそれぞれVH2遺伝子ファミリーとVH6遺伝子ファミリーに属することを明らかにしている。 実施例5で述べる、scFvクローン17D20、17N16、18L16および4D9のアミノ酸配列アラインメントを示す。 実施例5で述べる、scFvクローン17D20、17N16、18L16および4D9のアミノ酸配列アラインメントを示す。 実施例7で述べる、重鎖可変領域のN末端（A）、および/または軽鎖可変領域のN末端（B）、および/または重鎖定常領域のC末端（C）、および/または軽鎖定常領域のC末端（D）に融合された1つまたは複数のSGMIペプチドを含むMASP-2抗体スキャフォールドを図解している。 図17Aは、実施例7で述べる、MASP-2 scFv抗体スキャフォールドと重鎖可変領域のN末端および/または軽鎖可変領域のC末端に融合されたSGMIペプチドとを図解している。図17Bは、実施例7で述べる、軽鎖可変領域のN末端および/または重鎖可変領域のC末端に融合されたSGMIペプチドを含むMASP-2 scFv抗体スキャフォールドを図解している。 実施例7で述べる代表的なMASP-2抗体（M2）-SGMI融合物を図解している。 実施例7で述べるように、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）を用いて10％マウス血清中で行ったC3b沈着アッセイ法の結果を、SGMI-1またはSGMI-2を含むMASP-2抗体（M2）-SGMI融合物と比較して、グラフで図解している。 実施例7で述べるように、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）を用いて10％ヒト血漿中で行ったC4沈着アッセイ法の結果を、SGMI-1またはSGMI-2を含むMASP-2抗体（M2）-SGMI融合物と比較して、グラフで図解している。 実施例7で述べるように、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）を用いて10％ヒト血漿中で行ったC4沈着アッセイ法の結果を、SGMI-1またはSGMI-2を含むMASP-2抗体（M2）-SGMI融合物と比較して、グラフで図解している。 軽鎖定常領域のC末端に融合されたSGMI-1ペプチドを含む非特異的キメラニワトリ/ヒト抗体（L-SGMI-1-C）または重鎖可変領域のN末端に融合されたSGMI-1ペプチドを含む非特異的キメラ/ヒト抗体（H-SGMI-1-N）を用いて10％ヒト血清中で行ったC3b沈着アッセイ法の結果を、対応するMASP-2抗体（M2）-SGMI-1融合物と比較して、グラフで図解しており、実施例7で述べるように、MASP-2抗体とSGMI-1とを融合して同じ抗体とした時の相乗的なレクチン経路阻害を示している。 全ての条件について共通の「0nM抗体」データポイントを提供するために無処置マウスからの薬力学データを使用した、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）またはMASP-2抗体（M2）-SGMI-1融合物の濃度（薬物動態（PK）データセット）対レクチン経路活性（C3b沈着;薬力学（PD）データセット）のプロットを示す。 全ての条件について共通の「0nM抗体」データポイントを提供するために無処置マウスからの薬力学データを使用した、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）またはMASP-2抗体（M2）-SGMI-2融合物の濃度（薬物動態（PK）データセット）対レクチン経路活性（C3b沈着;薬力学（PD）データセット）のプロットを示す。実施例8で述べるように、各処置群について全ての時点からのデータを合わせた。
配列表の説明
SEQ ID NO:1 ヒトMASP-1 cDNA;
SEQ ID NO:2 ヒトMASP-1タンパク質（リーダー配列あり）;
SEQ ID NO:3 ヒトMASP-2 cDNA;
SEQ ID NO:4 ヒトMASP-2タンパク質（リーダー配列あり）;
SEQ ID NO:5: SGMIペプチドコア配列;
SEQ ID NO:6 SGMI-1Lペプチド（全長）;
SEQ ID NO:7 SGMI-1Mペプチド（中間長短縮形）;
SEQ ID NO:8 SGMI-1Sペプチド（短鎖短縮形）;
SEQ ID NO:9 SGMI-2Lペプチド（全長）;
SEQ ID NO:10 SGMI-2Mペプチド（中間長短縮形）;
SEQ ID NO:11 SGMI-2Sペプチド（短鎖短縮形）;
SEQ ID NO:12 ヒトIgG1-Fcポリペプチド;
SEQ ID NO:13 ペプチドリンカー＃1（12aa）;
SEQ ID NO:14: ペプチドリンカー＃2（10aa）;
SEQ ID NO:15: ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-1L、リンカー＃1、およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチドをコードする核酸;
SEQ ID NO:16: SGMI-1L、リンカー＃1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合物（SGMI-1Fc）;
SEQ ID NO:17: ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-2L、リンカー＃1およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチドをコードする核酸;
SEQ ID NO:18: SGMI-2L、リンカー＃1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合物（SGMI-2Fc）;
SEQ ID NO:19: SGMI-1フォワードプライマー;
SEQ ID NO:20: SGMI-1リバースプライマー;
SEQ ID NO:21: SGMI-2フォワードプライマー;
SEQ ID NO:22: SGMI-2リバースプライマー;
SEQ ID NO:23: 親DTLacO（クローン＃1）ニワトリ重鎖可変領域（DTLacO_VH）;
SEQ ID NO:24: ニワトリ重鎖可変領域由来の保存されたFR-1領域;
SEQ ID NO:25: ニワトリ重鎖可変領域由来の保存されたFR-2領域;
SEQ ID NO:26: ニワトリ重鎖可変領域由来の保存されたFR-3領域;
SEQ ID NO:27: ニワトリ重鎖可変領域由来のCDR-H3に近接する保存されたFR-3隣接領域;
SEQ ID NO:28: ニワトリ重鎖可変領域由来の保存されたFR-4領域;
SEQ ID NO:29: ニワトリ重鎖可変領域由来のCDR-H3に近接する保存されたFR-4隣接領域;
SEQ ID NO:30: 親DTLacO（クローン＃1）ニワトリ軽鎖可変領域（DTLacO_VL）;
SEQ ID NO:31: ニワトリ軽鎖可変領域由来の保存されたFR-1領域;
SEQ ID NO:32: ニワトリ軽鎖可変領域のCDR-L1に近接する保存されたFR-1隣接領域;
SEQ ID NO:33: ニワトリ軽鎖可変領域由来の保存されたFR-2領域;
SEQ ID NO:34: ニワトリ軽鎖可変領域のCDR-L1に近接する保存されたFR-2隣接領域;
SEQ ID NO:35: ニワトリ軽鎖可変領域由来の保存されたFR-3領域;
SEQ ID NO:36: ニワトリ軽鎖可変部分由来の保存されたFR-4領域;
SEQ ID NO:37〜46: ペプチドリンカー;
SEQ ID NO:47: ヒトIgG1定常領域（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）;
SEQ ID NO:48: ヒトラムダ軽鎖定常領域;
SEQ ID NO:49: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1L担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1L-IgG1）;
SEQ ID NO:50: SGMI-1L担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1L-IgG1）;
SEQ ID NO:51: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1M担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1M-IgG1）;
SEQ ID NO:52: SGMI-1M担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1M-IgG1）;
SEQ ID NO:53: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1S担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1S-IgG1）;
SEQ ID NO:54: SGMI-1S担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1S-IgG1）;
SEQ ID NO:55: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L1担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L1-IgG1）;
SEQ ID NO:56: SGMI-1-L1担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L1-IgG1）;
SEQ ID NO:57: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L2担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L2-IgG1）;
SEQ ID NO:58: SGMI-1-L2担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L2-IgG1）;
SEQ ID NO:59: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L3担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L3-IgG1）;
SEQ ID NO:60: SGMI-1-L3担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L3-IgG1）;
SEQ ID NO:61: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L4担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L4-IgG1）;
SEQ ID NO:62: SGMI-1-L4担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L4-IgG1）;
SEQ ID NO:63: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L5担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L5-IgG1）;
SEQ ID NO:64: SGMI-1-L5担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L5-IgG1）;
SEQ ID NO:65: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L6担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L6-IgG1）;
SEQ ID NO:66: SGMI-1-L6担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L6-IgG1）;
SEQ ID NO:67: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L7担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L7-IgG1）;
SEQ ID NO:68: SGMI-1-L7担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L7-IgG1）;
SEQ ID NO:69: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L8担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L8-IgG1）;
SEQ ID NO:70: SGMI-1-L8担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L8-IgG1）;
SEQ ID NO:71: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L9担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L9-IgG1）;
SEQ ID NO:72: SGMI-1-L9担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L9-IgG1）;
SEQ ID NO:73: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L10担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L10-IgG1）;
SEQ ID NO:74: SGMI-1-L10担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L10-IgG1）;
SEQ ID NO:75: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L11担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L11-IgG1）;
SEQ ID NO:76: SGMI-1-L11担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L11-IgG1）;
SEQ ID NO:77: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1-L12担持ニワトリVH配列およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1-L12-IgG1）;
SEQ ID NO:78: SGMI-1-L12担持ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1-L12-IgG1）;
SEQ ID NO:79: ヒトVLシグナル配列、SGMI-2L担持ニワトリVL配列およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-2L-Igλ）;
SEQ ID NO:80: SGMI-2L担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-2L-Igλ）;
SEQ ID NO:81: ヒトVLシグナル配列、SGMI-2M担持ニワトリVL配列およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-2M-Igλ）;
SEQ ID NO:82: SGMI-2M担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-2M-Igλ）;
SEQ ID NO:83: ヒトVLシグナル配列、SGMI-2S担持ニワトリVL配列およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-2S-Igλ）;
SEQ ID NO:84: SGMI-2S担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-2S-Igλ）;
SEQ ID NO:85: SGMI-1L担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1L-Igλ）;
SEQ ID NO:86: SGMI-1L担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1L-Igλ）;
SEQ ID NO:87: SGMI-1M担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1M-Igλ）;
SEQ ID NO:88: SGMI-1M担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1M-Igλ）;
SEQ ID NO:89: SGMI-1S担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-SGMI-1S-Igλ）;
SEQ ID NO:90: SGMI-1S担持ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-SGMI-1S-Igλ）;
SEQ ID NO:91: DTLacOニワトリ（クローン＃2）重鎖可変領域（DTLacO VH）;
SEQ ID NO:92: DTLacOニワトリ（クローン＃2）軽鎖可変領域（DTLacO VL）;
SEQ ID NO:93: ヒトVHシグナル配列、SGMI-1融合ニワトリVH配列、およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-IgG1-S10）;
SEQ ID NO:94: SGMI-1融合ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-IgG1-S10）;
SEQ ID NO:95: ヒトVHシグナル配列、SGMI-2融合ニワトリVH配列、およびヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-IgG1-S20）;
SEQ ID NO:96: SGMI-2融合ニワトリVH領域およびヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-IgG1-S20）;
SEQ ID NO:97: ヒトVHシグナル配列、ニワトリVH配列、およびSGMI-1融合ヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-IgG1-S01）;
SEQ ID NO:98: ニワトリVH領域およびSGMI-1融合ヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-IgG1-S01）;
SEQ ID NO:99: ヒトVHシグナル配列、ニワトリVH配列、およびSGMI-2融合ヒトIgG1定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-IgG1-S02）;
SEQ ID NO:100: ニワトリVH領域およびSGMI-2融合ヒトIgG1定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-IgG1-S02）;
SEQ ID NO:101: ヒトVLシグナル配列、SGMI-1融合VL配列およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-Igλ-S10）;
SEQ ID NO:102: SGMI-1融合ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-Igλ-S10）;
SEQ ID NO:103: ヒトVLシグナル配列、SGMI-2融合VL配列およびヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-Igλ-S20）;
SEQ ID NO:104: SGMI-2融合ニワトリVL領域およびヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-Igλ-S20）;
SEQ ID NO:105: ヒトVLシグナル配列、ニワトリVL配列、およびSGMI-1融合ヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-Igλ-S01）;
SEQ ID NO:106: ニワトリVL領域、およびSGMI-1融合ヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-Igλ-S01）;
SEQ ID NO:107: ヒトVLシグナル配列、ニワトリVL配列、およびSGMI-2融合ヒトIgλ定常領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（pcDNA3-Igλ-S02）;ならびに
SEQ ID NO:108: ニワトリVL領域およびSGMI-2融合ヒトIgλ定常領域を含む成熟ポリペプチド（Ab-Igλ-S02）。
MASP-2モノクローナル抗体:VH鎖
SEQ ID NO:109 17D20mc重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:110 17D20_dc35VH21N11VL重鎖可変領域（VH）（シグナルペプチドなし）をコードするDNA
SEQ ID NO:111 17D20_dc35VH21N11VL重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:112 17N16mc重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
MASP-2モノクローナル抗体:VL鎖
SEQ ID NO:113 17D20mc軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:114 17D20_dc21N11VL軽鎖可変領域（VL）（シグナルペプチドなし）をコードするDNA
SEQ ID NO:115 17D20_dc21N11VL軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:116 17N16mc軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:117 17N16_dc17N9軽鎖可変領域（VL）（シグナルペプチドなし）をコードするDNA
SEQ ID NO:118 17N16_dc17N9軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
MASP-2モノクローナル抗体重鎖CDR
SEQ ID NO:119〜122 CDR-H1
SEQ ID NO:123〜126 CDR-H2
SEQ ID NO:127〜131 CDR-H3
MASP-2モノクローナル抗体軽鎖CDR
SEQ ID NO:132〜136 CDR-L1
SEQ ID NO:137〜141 CDR-L2
SEQ ID NO:142〜145 CDR-L3
SEQ ID NO:146: 17D20mおよびd3521N11のコンセンサス重鎖CDR-H3
SEQ ID NO:147: 17D20mおよびd3521N11のコンセンサス軽鎖CDR-L1
SEQ ID NO:148: 17N16mおよびd17N9のコンセンサス軽鎖CDR-L1
SEQ ID NO:149: 17D20m、d3521N11、17N16mおよびd17N9のコンセンサス軽鎖CDR-L2
SEQ ID NO:150: 17N16mおよびd17N9のコンセンサス軽鎖CDR-L3
SEQ ID NO:151: scFvフォーマットの17D20クローン
SEQ ID NO:152: scFvフォーマットの18L16クローン
SEQ ID NO:153: scFvフォーマットの4D9クローン
SEQ ID NO:154: scFvフォーマットの17L20クローン
SEQ ID NO:155: scFvフォーマットの17N16クローン
SEQ ID NO:156: scFvフォーマットの3F22クローン
SEQ ID NO:157: scFvフォーマットの9P13クローン
SEQ ID NO:158: 野生型IgG4をコードするcDNA
SEQ ID NO:159: 野生型IgG4ポリペプチド
SEQ ID NO:160: IgG4ヒンジ変異体S228PをコードするcDNA
SEQ ID NO:161: IgG4変異体S228Pポリペプチド
SEQ ID NO:162: 野生型IgG2をコードするcDNA
SEQ ID NO:163: 野生型IgG2ポリペプチド
SEQ ID NO:164: NimoAb101:重鎖可変領域（ラット）
SEQ ID NO:165: NimoAb101:軽鎖可変領域（ラット）
SEQ ID NO:166: NimoAb101:CDR-H1
SEQ ID NO:167: NimoAb101:CDR-H2
SEQ ID NO:168: NimoAb101:CDR-H3
SEQ ID NO:169: NimoAb101:CDR-L1
SEQ ID NO:170: NimoAb101:CDR-L2
SEQ ID NO:171 NimoAb101:CDR-L3
SEQ ID NO:172〜173: ペプチドリンカー
SEQ ID NO:174: VH-M2ab6-SGMI-1-Nとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:175: VH-M2ab6-SGMI-1-Nとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:176: VH-M2ab6-SGMI-2-Nとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:177: VH-M2b6-SGMI-2-Nとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:178: VH-M2ab6-SGMI-1-Cとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:179: VH-M2ab6-SGMI-1-Cとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:180: VH-M2ab6-SGMI-2-Cとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:181: VH-M2ab6-SGMI-2-Cとヒンジ変異を持つヒトIgG4定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:182: VL-M2ab6-SGMI-1-NとヒトIgラムダ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:183: VL-M2ab6-SGMI-1-NとヒトIgラムダ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:184: VL-M2ab6-SGMI-2-NとヒトIgラムダ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:185: VL-M2ab6-SGMI-2-NとヒトIgラムダ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:186: VL-M2ab6-SGMI-1-CとヒトIgラムダ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:187: VL-M2ab6-SGMI-1-CとヒトIgラムダ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:188: VL-M2ab6-SGMI-2-CとヒトIgラムダ定常領域とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
SEQ ID NO:189: VL-M2ab6-SGMI-2-CとヒトIgラムダ定常領域とを含む成熟ポリペプチド
SEQ ID NO:190: H-DT40-Ab-SGMI-1-N
SEQ ID NO:191: L-DT40-Ab-SGMI-1-C
SEQ ID NO:192〜195: その他のペプチドリンカー
詳細な説明
I.定義
本明細書において特に定義がなされている場合を除き、本明細書において使用する用語は全て、本発明の技術分野において通常の知識を有する者が理解している意味と同じ意味を有する。本発明を説明するために本明細書および特許請求の範囲において使用する用語が明快になるように、以下の定義を掲載する。
本明細書において使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域（本明細書においては可変ドメインともいう）中にある少なくとも1つのエピトープ認識部位を介して、例えば糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子である。いくつかの態様では、本明細書において開示する抗体はニワトリ可変領域を含み、相補性決定領域（CDR）領域に移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、本明細書において開示する抗体は、ヒトまたは非ヒト（例えばマウス、ラット、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）可変領域を含み、軽鎖および/または重鎖のアミノ末端領域および/またはカルボキシ末端領域に融合された生物活性ペプチドをさらに含む。合成可変領域の例はHolliger and Hudson, Nature Biotechnology, vol 23 (9):1126-1136, 2005に掲載されている。「抗体」という用語を抗体の供給源に関して、またはその作製方法（例えばハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成などによる方法）に関して、限定するつもりはない。本明細書において使用する場合、抗体という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片、例えば一本鎖可変領域抗体（dAb）、または他の公知の抗体断片、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fvなど、一本鎖（ScFv）、その合成変種、天然変種、必要な特異性の抗原結合性断片を伴う抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性の抗原結合部位または抗原結合性断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾構成も包含する。遺伝子融合によって構築される多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」（WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993）も、本明細書において考えられる抗体の一特定形態である。CH3ドメインに接合されたscFvを含むミニボディも本明細書に包含される（S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996）。例えばWard, E. S. et al, Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988; PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996を参照されたい。ナノボディおよびマキシボディ（maxibody）も考えられる（例えばU.S. 6,765,087、U.S. 6,838,254、WO06/079372、WO/2010037402参照）。
本明細書において使用する場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に「相補性決定領域」または「CDR」の（すなわち、Kabat, et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングした場合に、軽鎖可変ドメイン中のおよそ残基24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3）前後、ならびに重鎖可変ドメイン中のおよそ31〜35（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）前後の）アミノ酸残基、および/または「超可変ループ」（すなわち、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載のChothiaナンバリングシステムに従ってナンバリングした場合に、軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3）、ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜32（H1）、52〜56（H2）および95〜102（H3））の残基、および/または「超可変ループ」/CDR（例えば、Lefranc, J.P., et al, Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., et al, Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)に記載のIMGTナンバリングシステムに従ってナンバリングした場合に、VL中の残基27〜38（L1）、56〜65（L2）および105〜117（L3）、およびVH中の27〜38（H1）、56〜65（H2）、および105〜117（H3））の残基を含む。
本明細書において使用する場合、「CDR領域に移植された」という用語は、親の一般的な重鎖または軽鎖のニワトリフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3、およびFR4）を含む重鎖または軽鎖の可変領域に関する少なくとも1つのCDR領域に生物活性ペプチド配列を導入することを指し、隣接フレームワーク領域はインタクトなままであり、ネイティブCDR配列全体が生物活性ペプチドで置き換えられているか、またはネイティブCDR配列に関する少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上の、最大で全てのアミノ酸残基が、生物活性ペプチドに隣接するリンカー配列として、移植された生物活性ペプチドを含む重鎖または軽鎖可変領域中に保たれている。
本明細書において使用する場合、「軽鎖または重鎖に融合された」という用語は、ヒトまたは非ヒト（例えばマウス、ラット、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）可変領域を含む抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端領域またはカルボキシ末端領域に生物活性ペプチド配列を融合することを指す。
本明細書において使用する場合、「抗原結合性断片」という用語は、関心対象の抗原に結合する免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖に関する少なくとも1つのCDRを含有するポリペプチド断片を指し、例えばCDRに移植された少なくとも1つの生物活性ペプチド、または軽鎖もしくは重鎖に融合された生物活性ペプチドを含有するポリペプチド断片を指し、このポリペプチド断片は、生物活性ペプチドの標的、例えばMASP-1またはMASP-2に結合する。これに関連して、本明細書に記載する抗体の抗原結合性断片は、本明細書に示すVH配列およびVL配列の、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てのCDRを含むことができ、抗体は、関心対象の生物活性ペプチドの標的、例えばMASP-1またはMASP-2に結合する。本明細書に記載するMASP-1またはMASP-2特異的抗体の抗原結合性断片は、MASP-1またはMASP-2に結合する能力を有する。ある特定の態様では、抗原結合性断片の結合が、関心対象の生物活性ペプチドの標的の結合（例えばGPCRリガンドのその受容体への結合）を防止または阻害して、受容体へのリガンド結合に起因する生物学的応答を中断させる。ある特定の態様では、抗原結合性断片が、関心対象の生物活性ペプチドの標的に特異的に結合し、かつ/またはその生物学的活性を阻害もしくは調整する。ある特定の態様では、抗原結合性断片が補体活性化を阻害する。ある特定の態様では、抗原結合性断片がレクチン経路補体活性化を阻害する。ある特定の態様では、抗原結合性断片がヒトMASP-1および/またはヒトMASP-2に特異的に結合し、かつ/またはその生物学的活性を阻害もしくは調整する。ある特定の態様では、抗原結合性断片が、MASP-2（例えばヒトMASP-2）に結合する免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖に関する少なくとも1つのCDRを含有するポリペプチド断片を指す。一態様において、本明細書に記載する抗体の抗原結合性断片は、MASP-2に結合する抗体の本明細書に示すVH配列およびVL配列の、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ全てのCDRを含みうる。本明細書に記載するMASP-2特異的抗体の抗原結合性断片はMASP-2に結合する能力を有する。ある特定の態様では、抗原結合性断片がヒトMASP-2および/またはヒトMASP-1に特異的に結合し、かつ/またはその生物学的活性を阻害もしくは調整する。ある特定の態様では、抗原結合性断片がMASP-2および/またはMASP-1依存性補体活性化を阻害する。
「抗原」という用語は、関心対象の抗体などといった選択的結合作用物質によって結合されうる分子または分子の一部分を指し、関心対象の生物活性ペプチドによって結合されることが可能であり、かつ/またはその抗原のエピトープに結合する能力を有する抗体を生産するために動物において使用することもできる、標的分子またはそのような分子の一部分を含む。抗原は1つまたは複数のエピトープを有しうる。
本明細書において使用する場合、「エピトープ」は、タンパク質（例えば抗体または生物活性ペプチド（例えばSGMIペプチド）の標的、例えばMASP-1またはMASP-2タンパク質）上にあって抗体に結合される部位を指す。「オーバーラップするエピトープ」は、少なくとも1つ（例えば2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）の共通するアミノ酸残基を含み、これには線状エピトープと非線状エピトープとが含まれる。ある特定の態様では、エピトープ決定基が、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどといった、分子の化学的に活性な表面基群を含み、またある特定の態様では、特別な三次元構造特徴および/または特別な電荷特徴を有しうる。ある特定の態様において、抗体がタンパク質および/または高分子の複雑な混合物中でその標的タンパク質を優先的に認識する場合、その抗体はタンパク質標的に特異的に結合するという。平衡解離定数が10-6M未満もしくは10-6M、または10-7M未満もしくは10-7M、または10-8M未満もしくは10-8Mである場合、その抗体は標的タンパク質（標的抗原ともいう）に特異的に結合するという。いくつかの態様において、平衡解離定数は10-9M未満もしくは10-9Mまたは10-10M未満もしくは10-10Mでありうる。
タンパク質分解酵素パパインはIgG分子を優先的に切断していくつかの断片を与え、そのうちの2つ（F（ab）断片）は、それぞれ、インタクトな抗原結合部位が含まれている共有結合によるヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、IgG分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むF(ab')2断片を含む、いくつかの断片を与えることができる。本発明のある特定の態様に従って使用するためのFv断片は、IgM免疫グロブリン分子の、また稀にはIgGまたはIgA免疫グロブリン分子の、優先的タンパク質分解切断によって生産することができる。しかしFv断片はより一般的には当技術分野において公知の組換え技法を用いて得られる。Fv断片は、ネイティブ抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合的VH::VLヘテロ二量体を含む。例えばInbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710;およびEhrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096を参照されたい。
ある特定の態様では、一本鎖Fv抗体、すなわちscFV抗体が考えられる。例えばカッパボディ（III et al, Prot. Eng. 10:949-57 (1997)）、ミニボディ（Martin et al, EMBO J. 13:5305-9 (1994)）、ダイアボディ(Holliger et al, PNAS 90:6444-8 (1993)）、またはヤヌシン（Janusin）（Traunecker et al, EMBO J. 10:3655-59 (1991) およびTraunecker et al. Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52 (1992)）は、所望の特異性を有する抗体の選択に関する本願の教示に従い、標準的な分子生物学技法を用いて、調製することができる。さらに別の態様では、移植された生物活性ペプチドを含む抗体および/または本開示の生物活性ペプチド（例えばSGMI）抗体融合物を包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体は異なる抗体からのCDRおよびフレームワーク領域を含むことができ、また、一つの結合ドメインによって第1の生物活性ペプチド（例えばSGMI-1などの第1のSGMIペプチド）の標的に特異的に結合し、第2の結合ドメインによって第2の生物活性ペプチド（例えばSGMI-2などの第2のSGMIペプチド）の標的に特異的に結合する二重特異性抗体を生成することができる。別の態様では、一つの結合ドメインによって親抗体の標的に結合し、生物活性ペプチドの存在によって導入される第2および/または第3の結合ドメインによって第1および/または第2の生物活性ペプチドの標的に結合する、二重特異性抗体および/または三重特異性抗体を生成することができる。これらの抗体は、組換え分子生物学技法によって生産するか、物理的に一つにコンジュゲートすることができる。
一本鎖Fv（scFv）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーで連結されたVHコード遺伝子とVLコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合で連結されたVH::VLヘテロ二量体である。Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883。抗体可変（V）領域の、自然に集合する-ただし化学的には分離している-軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に類似する三次元構造に折りたたまれることになるscFv分子へと変換するための化学構造を見分ける方法は、いくつか記載されている。例えばHustonらの米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号、ならびにLadnerらの米国特許第4,946,778号を参照されたい。抗体のdAb断片はVHドメインからなる（Ward, E. S. et al, Nature 341, 544-546 (1989)）。
ある特定の態様において、本明細書において開示する抗体（例えばMASP-1特異的抗体またはMASP-2特異的抗体）は、ダイアボディの形態にある。ダイアボディはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第1のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合ドメインを含む第2のドメインとを含み、2つのドメインは（例えばペプチドリンカーによって）連結されているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできず、抗原結合部位は、多量体内の1つのポリペプチドの第1のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第2のドメインとの会合によって形成される（WO94/13804）。
二重特異性抗体を使用しようとする場合、それらは、さまざまな方法（Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)）で製造すること、例えば化学的に調製するか、もしくはハイブリッドハイブリドーマから調製されることができる従来の二重特異性抗体であってもよいか、または上記の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。可変領域だけを用いてFc領域のないダイアボディおよびscFvを構築することで、抗イディオタイプ反応の効果を減少させることができる可能性がある。
二重特異性ダイアボディはまた、二重特異性の抗体全体とは対照的に、大腸菌（E. coli）中で容易に構築し発現させることができる点でも、とりわけ有用でありうる。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などの他の多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（WO94/13804）を用いて、ライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば抗原Xに対する特異性を持つように、一定に保っておきたい場合は、他方のアームがさまざまであるライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性の抗体全体は、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）工学（J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996）によって作製しうる。
ある特定の態様において、本明細書に記載する抗体は、UniBody（登録商標）の形態で提供しうる。UniBody（登録商標）はヒンジ領域が除去されたIgG4抗体である（オランダ国ユトレヒトのGenMab参照;例えばUS20090226421も参照されたい）。この特許抗体技術では、現行の小抗体フォーマットよりも大きな治療ウインドウを持つと予想される、安定で、より小さな抗体フォーマットが創製される。IgG4抗体は補体系を活性化しない。抗体のヒンジ領域を排除することにより、完全ヒトIgG4抗体を修飾して、対応するインタクトなIgG4と比較して異なる安定性を有する半分子断片を得ることができる（GenMab、ユトレヒト）。IgG4分子を二等分することにより、UniBody（登録商標）上にはコグネイト抗原（例えば疾患標的）に結合することのできる領域が1つだけ残るので、UniBody（登録商標）は、標的細胞上の1部位だけに一価に結合する。ある特定のがん細胞表面抗原については、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を用いた場合に見られるようにがん細胞を刺激して成長させることがなく、それゆえにUniBody（登録商標）技術は、従来の抗体による処置に抵抗性でありうるいくつかのタイプのがんにとっての処置選択肢になりうる。UniBody（登録商標）は通常のIgG4抗体のサイズの約半分である。この小さなサイズは、いくつかの形態のがんを処置する際に著しい利点となることができ、より大きな固形腫瘍への分子のより良い分布を可能にし、有効性を増加させる可能性がある。
ある特定の態様において、本開示の抗体はナノボディの形態をとりうる。ナノボディは、単一遺伝子によってコードされ、ほとんど全ての原核宿主および真核宿主、例えば大腸菌（米国特許第6,765,087号）、カビ（例えばアスペルギルス（Aspergillus）またはトリコデルマ（Trichoderma））および酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyvermyces）、ハンゼヌラ（Hansenula）またはピキア（Pichia）（例えば米国特許第6,838,254号参照））中で効率よく生産される。生産プロセスはスケーラブルであり、ナノボディはキログラム単位の量で生産されている。ナノボディは、貯蔵寿命の長い調製済み（ready-to-use）溶液剤として製剤化することができる。ナノクローン法（例えばWO 06/079372参照）は、B細胞の自動ハイスループット選択に基づく、所望の標的に対するナノボディを生成するための知的所有権下にある方法である。
ある特定の態様において、本明細書に記載する抗体およびその抗原結合性断片は、CDRの支えとなってCDR同士の空間的関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク領域（FR）セットの間にそれぞれ挿入された、重鎖および軽鎖CDRセットを含む。本明細書において使用する場合、「CDRセット」という用語は、重鎖または軽鎖V領域の3つの超可変領域を指す。これらの領域は、重鎖または軽鎖のN末端から順に、それぞれ「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と表される。それゆえに、抗原結合部位には、重鎖V領域と軽鎖V領域のそれぞれからのCDRセットを含む6つのCDRが含まれる。単一のCDR（例えば、CDR1、CDR2、またはCDR3）を含むポリペプチドを、本明細書では「分子認識単位」という。いくつかの抗原-抗体複合体の結晶学的解析により、CDRのアミノ酸残基は、結合した抗体と広範囲にわたる接触を形成し、最も広範囲にわたる抗原接触は重鎖CDR3との接触であることが、実証されている。このように分子認識単位は主として抗原結合部位の特異性を担っている。
本明細書において使用する場合、「FRセット」という用語は、重鎖V領域または軽鎖V領域のCDRセットのCDRに枠組みを与える4つの隣接アミノ酸配列を指す。いくつかのFR残基は結合した抗原と接触しうるが、FR、特にCDRに直接近接しているFR残基は、主としてV領域を抗原結合部位へと折りたたむことを担っている。FR内では、ある特定のアミノ酸残基およびある特定の構造特徴が極めて高度に保存されている。これに関連して、全てのV領域配列は、70〜90アミノ酸残基前後の内部ジスルフィドループを含有している。V領域が結合部位へと折りたたまれると、CDRは突き出したループモチーフとしてディスプレイされ、それが抗原結合表面を形成する。正確なCDRアミノ酸配列とは関係なく、折りたたまれたCDRループの形状に影響を及ぼしてある特定の「正準（canonical）」構造にするFRの保存された構造領域が存在することが、一般に認識されている。さらに、ある特定のFR残基は、抗体重鎖と抗体軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的ドメイン間接触に関与することが知られている。
本明細書において使用する場合、「ニワトリフレームワーク領域またはその（それら）の変種」という用語は、ニワトリ抗体のFR領域およびその保存された変種を指し、例えば本明細書において開示するもの、および参照により本明細書に組み入れられるWu et al, J. Immunol 188:322-333 (2012)にさらに記載されているものなどである。
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、現在はインターネット（immuno.bme.nwu.edu）で利用可能であるKabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services, 1987とその更新版を参照することによって決定することができる。
「モノクローナル抗体」とは均一な抗体集団を指し、モノクローナル抗体はエピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然および非天然）から構成される。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一のエピトープを指向する。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（ScFv）、その変種、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および必要な特異性の抗原結合性断片（エピトープ認識部位）を含み、かつエピトープに結合する能力を備えた、免疫グロブリン分子の他の任意の修飾構成も包含する。抗体の供給源またはその作製方法（例えばハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる方法）については限定されないものとする。この用語は、免疫グロブリン全体だけでなく、「抗体」の定義として上述した断片なども包含する。
「ヒト化」抗体とは、非ヒト種（例えばニワトリ）からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する、一般に組換え技法を用いて調製されるキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変領域を含んでもよいか、または可変領域中の適切なフレームワーク領域上に移植されたCDR（移植された生物活性ペプチド配列を含むCDRを含む）だけを含んでもよい。エピトープ結合部位は野生型であってもよいか、または1つもしくは複数のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい。これにより、ヒト個体における免疫原としての定常領域は排除されるが、外来可変領域に対する免疫応答の可能性は残っている（LoBuglio, A. F. et al, (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen et al, PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann et al, Nature (1988) 332:323-327）。
ある特定の態様において、本開示の抗体はキメラ抗体でありうる。これに関連して、一態様において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Fc部分に機能的に連結されるか他の形で融合された可変領域のCDRに移植された生物活性ペプチド配列を含む抗体の抗原結合性断片から構成されるか、または重鎖もしくは軽鎖のN末端もしくはC末端に融合された生物活性ペプチド配列を含む抗体の抗原結合性断片から構成される。ある特定の態様では、異種Fcドメインがヒト由来である。別の態様では、異種Fcドメインが、IgA（サブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG（サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4）、およびIgMなど、親抗体とは異なるIgクラスに由来する。さらなる態様では、異種Fcドメインが、1つまたは複数の異なるIgクラスからのCH2ドメインおよびCH3ドメインから構成されうる。ヒト化抗体について上述したように、キメラ抗体の抗原結合性断片は、本明細書に記載する抗体のCDRだけを1つまたは複数個（本明細書に記載する抗体のCDRを1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）含むか、可変領域全体（VL、VHまたは両方）を含みうる。
ある特定の態様では、生物活性ペプチド配列を含む抗体が、本明細書に記載する抗体のCDRを1つまたは複数個含む。ある特定の態様では、生物活性ペプチド配列を含む抗体が、本明細書に記載するMASP-2特異的抗体のCDRを1つまたは複数個含む。さらにこれに関連して、いくつかの例では、所望の特異的結合を保ったまま、抗体のVH-CDR3だけを移すことも可能であることが示されている（Barbas et al., PNAS (1995) 92:2529-2533）。McLane et al, PNAS (1995) 92:5214-5218、Barbas et al, J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2161-2162も参照されたい。
本明細書において使用する場合、「MASP-2依存性補体活性化」という用語はレクチン経路のMASP-2依存性活性化を含み、これは、生理的条件下（すなわちCa＋＋の存在下）で起こって、C3コンバターゼC4b2aの形成をもたらし、引き続いてC3切断産物C3bの蓄積後にC5コンバターゼC4b2a(C3b)nをもたらす。
本明細書において使用する場合、「MASP-1依存性補体活性化」という用語はレクチン経路のMASP-1依存性活性化を含み、これは、生理的条件下（すなわちCa＋＋の存在下）で起こって、C3コンバターゼC4b2aの形成をもたらし、引き続いてC3切断産物C3bの蓄積後にC5コンバターゼC4b2a(C3b)nをもたらす。
本明細書において使用する場合、「レクチン経路」という用語は、マンナン結合レクチン（MBL）、CL-11およびフィコリン（H-フィコリン、M-フィコリン、またはL-フィコリン）などといった血清糖質結合タンパク質および非血清糖質結合タンパク質の特異的結合によって起こる補体活性化を指す。
本明細書において使用する場合、「MASP-2阻害抗体」という用語は、MASP-2に結合するかまたはMASP-2と直接相互作用して、MASP-2依存性補体活性化を効果的に阻害する、任意のMASP-2抗体、またはそのMASP-2結合性断片を指す。本発明の方法において有用なMASP-2阻害抗体は、MASP-2依存性補体活性化を20％超、例えば30％超、または40％超、または50％超、または60％超、または70％超、または80％超、または90％超、または95％超、低減しうる。
本明細書において使用する場合、「MASP-1阻害抗体」という用語は、MASP-1に結合するかまたはMASP-1と直接相互作用して、MASP-1依存性補体活性化を効果的に阻害する、任意のMASP-1抗体、またはそのMASP-1結合性断片を指す。本発明の方法において有用なMASP-1阻害抗体は、MASP-1依存性補体活性化を20％超、例えば30％超、または40％超、または50％超、または60％超、または70％超、または80％超、または90％超、または95％超、低減しうる。
本明細書において使用する場合、「MASP-2遮断抗体」という用語は、MASP-2依存性補体活性化を90％超、例えば95％超、または98％超、低減する（すなわち、MASP-2補体活性化をわずか10％、例えばわずか9％、またはわずか8％、またはわずか7％、またはわずか6％、例えばわずか5％もしくはそれ未満、またはわずか4％またはわずか3％またはわずか2％またはわずか1％にする）MASP-2阻害抗体を指す。
本明細書において使用する場合、「MASP-1遮断抗体」という用語は、MASP-1依存性補体活性化を90％超、例えば95％超、または98％超、低減する（すなわち、MASP-1補体活性化をわずか10％、例えばわずか9％、またはわずか8％、またはわずか7％、またはわずか6％、例えばわずか5％もしくはそれ未満、またはわずか4％またはわずか3％またはわずか2％またはわずか1％にする）MASP-1阻害抗体を指す。
本明細書において使用する場合、「変種」抗体配列という用語は、親抗体配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、および/または置換によって、「親」抗体または参照抗体のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。一態様において、変種抗体配列とは、重鎖可変領域のフレームワーク内の総合計1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸置換、および/または軽鎖可変領域のフレームワーク領域内の総合計1、2、3、4、5、6、7、8 9、または10個までのアミノ酸置換を除けば、親フレームワークドメインと同一である1つまたは複数のフレームワーク領域を含有する分子を指す。いくつかの態様では、アミノ酸置換が保存的配列修飾である。いくつかの態様では、可変軽鎖および/または可変重鎖の変種フレームワーク領域が、SEQ ID NO:31、33、35、および36に示すそれぞれニワトリフレームワーク領域VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、およびVL-FR4アミノ酸配列の少なくとも1つまたは複数と、またはSEQ ID NO:24、25、26、および28に示すそれぞれニワトリフレームワーク領域VH-FR-1、VH-FR2、VH-FR3、およびVH-FR4アミノ酸配列の少なくとも1つまたは複数と、少なくとも85％の同一性、例えば、最小で86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％または少なくとも89％、または少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％または少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％または少なくとも99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそのようなアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様では、可変軽鎖および/または可変重鎖の変種フレームワーク領域が、表6、8、9、10、11、12、13、14、17、18および19に示すMASP-2特異的抗体可変領域配列の少なくとも1つまたは複数と、少なくとも85％の同一性、例えば、最小で86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％または少なくとも89％、または少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％または少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％または少なくとも99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそのようなアミノ酸配列からなる。
本明細書において使用する場合、「MASP-2スキャフォールド抗体」という用語は、補体活性化を阻害する生物活性ペプチドを含む抗体、例えば、SGMIペプチド配列を含むMASP-2抗体の調製に使用されるアミノ酸配列がコードする、MASP-2に結合する抗体を指す。
本明細書において使用する場合、「親ニワトリ抗体」という用語は、重鎖または軽鎖の可変領域のうちの少なくとも1つの中または上に移植された生物活性ペプチドを含む変種の調製に使用されるアミノ酸配列がコードする抗体を指す。親抗体は、ニワトリフレームワーク領域を有し、また定常領域が存在するのであれば、典型的にはヒト抗体定常領域を有する。
本明細書ではアミノ酸残基を以下のとおりに略記する:アラニン（Ala;A）、アスパラギン（Asn;N）、アスパラギン酸（Asp;D）、アルギニン（Arg;R）、システイン（Cys;C）、グルタミン酸（Glu;E）、グルタミン（Gln;Q）、グリシン（Gly;G）、ヒスチジン（His;H）、イソロイシン（Ile;I）、ロイシン（Leu;L）、リジン（Lys;K）、メチオニン（Met;M）、フェニルアラニン（Phe;F）、プロリン（Pro;P）、セリン（Ser;S）、スレオニン（Thr;T）、トリプトファン（Trp;W）、チロシン（Tyr;Y）、およびバリン（Val;V）。
最も広い意味で、天然アミノ酸は、各アミノ酸の側鎖の化学的特徴に基づいてグループ分けすることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysまたはProのいずれかを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、ArgまたはHisのいずれかを意味する。アミノ酸のこのグループはさらに以下のとおりのサブクラスに分類することができる。「非荷電親水性」アミノ酸とは、Ser、Thr、AsnまたはGlnのいずれかを意味する。「酸性」アミノ酸とは、GluまたはAspのいずれかを意味する。「塩基性」アミノ酸とは、Lys、ArgまたはHisのいずれかを意味する。
本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下の群のそれぞれの中のアミノ酸間の置換によって例示される:（1）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（3）セリンおよびスレオニン、（4）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（5）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（6）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。
本明細書において使用する場合、「単離された抗体」という用語は、その自然環境の構成要素から同定され、かつ分離されかつ/または回収された抗体を指す。その自然環境の夾雑構成要素は、抗体の診断的使用または治療的使用を妨害しうる物質であり、例えば酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好ましい態様では、抗体が、（1）Lowry法による決定で抗体の95重量％超まで、最も好ましくは99重量％超まで、または（2）スピニングカップシークエネーターを用いて少なくとも15残基のN末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（3）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元条件下または非還元条件下のSDS-PAGEで均一になるまで、精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチューの抗体が含まれる。というのも、抗体の自然環境の構成要素が少なくとも1つは存在しないからである。しかし通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
本明細書において使用する場合、「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分子（例えばポリヌクレオチド）である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子より小さい。
本明細書において使用する場合、「核酸分子コンストラクト」は、自然界には存在しない配置で組み合わされ並置された核酸のセグメントを含有するように人為的介入によって修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。発現ベクターは、典型的には、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、プロモーター「に機能的に連結されている」という。同様に、調節要素とコアプロモーターは、その調節要素がコアプロモーターの活性を調整するのであれば、機能的に連結されている。
本明細書において使用する場合、、数字に関する「およそ」または「約」という用語は、一般に、別段の明示がある場合または文脈からそうでないことが明白である場合を除き、両方向に（その数字より大きいまたは小さい）、その数字の5％の範囲内にある数字を含むと解釈される（そのような数字が考えうる値の100％を超える場合を除く）。範囲が明言されている場合、終点は、別段の明示がある場合または文脈からそうでないことが明白である場合を除き、その範囲内に包含される。
本明細書において使用する場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の局面を包含する。したがって例えば、「細胞（a cell）」への言及は、単一の細胞を包含すると共に、1つまたはそれ以上の細胞も包含し、「作用物質（an agent）」への言及は、1つの作用物質を包含すると共に、1つまたはそれ以上の作用物質も包含し、「抗体（an antibody）」への言及は、複数のそのような抗体を包含し、「フレームワーク領域（a framework region）」への言及は、1つまたは複数のフレームワーク領域および当業者に公知であるその等価物への言及を包含するなどである。
本明細書において使用する場合、「対象」は、全ての哺乳動物を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、および齧歯類動物を含むが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する場合、「生物活性ペプチド」という用語は、生物学的活性を有するペプチドを指す。
本明細書において使用する「ペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して一つに接合されて線状の鎖になっている複数のアミノ酸を指し、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む。オリゴペプチドという用語は、典型的には、少なくとも2個から約50個またはそれ以上までを有するペプチド（例えば2アミノ酸長から60アミノ酸長まで、例えば約5アミノ酸長から約50アミノ酸長まで、例えば約5アミノ酸長から約40アミノ酸長まで、例えば約5アミノ酸長から約30アミノ酸長まで）を記述するために使用される。60アミノ酸より大きいペプチドを、本明細書では、ポリペプチドまたはタンパク質という。
本明細書において使用する場合、「生物活性な」または「生物活性」という用語は、本明細書において使用する場合、相互作用が共有結合または非共有結合を伴うかどうかにかかわらず、タンパク質、糖タンパク質、糖質、例えばオリゴ糖または多糖、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、ホルモン、酵素、補因子などの別の生体分子との任意のタイプの相互作用を包含するが、それらに限定されるわけではない。生物活性はさらに、他の細胞構成要素または構成成分、例えば塩、イオン、金属、栄養素、細胞内に存在する外来作用物質または外因性作用物質、例えばウイルス、ファージなどとの任意のタイプの相互作用、例えば結合、隔離または輸送関連相互作用も包含する。ペプチドの生物活性は、例えばそれが発現する宿主細胞における表現型効果を観察することによって、または特定の生物活性、例えば標的分子へのアフィニティー結合、酵素活性の改変などについて、インビトロアッセイ法を行うことによって、検出することができる。生物活性ペプチドの例としては、抗微生物ペプチドおよびペプチド薬が挙げられる。抗微生物ペプチドは、細菌、ウイルス、原虫などの微生物に有害な影響を及ぼすペプチドである。抗微生物ペプチドとしては、例えば微生物の成長を遅くする阻害ペプチド、微生物を殺すのに有効な殺微生物ペプチド（例えば殺細菌ペプチド薬および殺ウイルスペプチド薬、滅菌薬、および消毒薬）、および微生物の繁殖、宿主毒性などを妨害するのに有効なペプチドが挙げられる。ヒトまたは他の動物における治療的使用のためのペプチド薬としては、例えば患者にとって使用できないほどには毒性でない抗微生物ペプチド、および宿主におけるさまざまな代謝プロセスを誘発するか、加速するか、減速するか、または防止するように設計されたペプチド、例えばインスリン、オキシトシン、カルシトニン、ガストリン、ソマトスタチン、抗がんペプチドなどが挙げられる。
本明細書において使用する場合、「単離された抗体は、無修飾生物活性ペプチドと少なくとも実質的に同じ生物学的活性を有する」という用語は、生物活性ペプチド配列を含む単離された抗体が、元の無修飾型である対応する生物活性ペプチドと比較して、少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％または少なくとも95％、または少なくとも98％、または少なくとも99％の生物学的活性を有することを指す。
本明細書における各態様は、別段の明白な陳述がある場合を除き、他のあらゆる態様に、必要な変更を加えて応用されるものとする。
組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的技法を使用することができる。酵素反応および精製技法は、製造者の説明書に従って、または当技術分野において一般に行われているように、または本明細書に記載するように、行うことができる。これらおよび関連する技法および手法は、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って行うか、または本明細書の全体を通して言及し論述するさまざまな一般文献およびより具体的な文献に記述されているように行うことができる。例えばSambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY）; Current Protocols in Immunology（John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober編, 2001 John Wiley & Sons, NY, NY）;または他の関連するCurrent Protocol刊行物および他の同様の参照文献を参照されたい。別段の具体的定義が掲載されている場合を除き、本明細書に記載する分子生物学、分析化学、有機合成化学、ならびに医化学および薬化学に関して用いる命名法ならびにその実験手法および技法は、当技術分野において周知であり、かつ一般に使用されているものである。組換え技術、分子生物学、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、および患者の処置には、標準的技法を使用することができる。
本明細書において論述する態様はいずれも、本発明の任意の方法、キット、試薬、または組成物に関して、遂行することができ、逆もまた同じであると考えられる。さらにまた、本発明の組成物は本発明の方法を達成するために使用することができる。
II.概略
生物活性ペプチドは、生物学的活性を誘発するペプチド（すなわち、2〜60アミノ酸残基長、例えば約5〜約50アミノ酸、例えば約5〜約40アミノ酸長、例えば約5〜約30アミノ酸長、または例えば長さが60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、または20アミノ酸残基以下であるペプチド）である。本開示のいくつかの態様によれば、生物活性ペプチドは補体活性化を阻害するアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、生物活性ペプチドが、MASP-1活性および/またはMASP-2活性を阻害するSGMIコア配列を含む（例えば、SGMIコア配列（SEQ ID NO:5として示す）を含み、長さが10〜60アミノ酸残基長、例えば約10〜約50アミノ酸、例えば約10〜約40アミノ酸長、例えば約10〜約30アミノ酸長である生物活性ペプチド、または例えば長さが60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11または10アミノ酸残基以下であるペプチド）。例えば生物活性ペプチドSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）およびSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）はそれぞれ36アミノ酸残基長であり、それぞれMASP-1およびMASP-2の高度に特異的な阻害物質である。しかしこれらは、ペプチドとして、生物学的研究および治療的応用に使用するには、その潜在力に制約がある。例えば、宿主細胞中のプロテアーゼおよび/またはペプチダーゼによる潜在的ペプチド薬の望ましくない分解によって証明されるように、関心対象の生物学的系内ではペプチドの不安定性が生じることが多い。
治療作用物質として使用するための、補体活性化を阻害する生物活性ペプチド、例えばSGMIコア配列を含む生物活性ペプチド（例えばSGMI-1および/またはSGMI-2）を、遺伝子操作するために、本発明者らは、生物活性ペプチド、例えばSGMIコア配列を含む生物活性ペプチド（例えばSGMI-1および/またはSGMI-2）をコードするアミノ酸配列を、以下のとおりに、さまざまな抗体スキャフォールドに移植するか、またはそれら抗体スキャフォールドに融合することにより、生物活性ペプチド担持抗体およびその断片を生成した:（1）実施例2で述べるように、ヒトIgG1 Fc領域のアミノ末端に融合してFc融合タンパク質を創製した;（2）実施例3で述べるように、非特異的キメラニワトリ（可変領域）-ヒト（IgG1およびIgλ定常領域）抗体のさまざまな相補性決定領域（CDR）に移植した;（3）実施例4で述べるように、非特異的キメラニワトリ（可変領域）-ヒト（IgG1およびIgλ定常領域）抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合した;（4）実施例7および8で述べるように、ヒト抗体、例えばヒトMASP-2抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合した。
本明細書に記載する方法を用いて、本発明者らは、驚くべきことにインビトロで測定した場合に生物活性ペプチドと少なくとも実質的に同じ生物学的活性を有し、生きている対象における治療作用物質としての使用に関して安定性が増加しているという利点を伴う、生物活性ペプチド担持抗体およびその断片を生産した。例えば、本明細書においてさらに説明するように、本開示のさまざまな態様により、本発明者らは、補体活性化を阻害する生物活性ペプチドを含む単離された抗体を生成した。例えば、実施例7で述べるように、SGMIコアペプチドアミノ酸配列（例えばSGMI-1および/またはSGMI-2）をヒトMASP-2抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合することによって、SGMIペプチド担持MASP-2抗体およびその断片などを生成した。本明細書に記載する方法を用いて、本発明者らは、実施例7で述べるように、ヒト血清を用いるC3bまたはC4b沈着アッセイ法で測定した場合に、驚くべきことに、SGMIペプチド配列を含有しない裸のMASP-2スキャフォールド抗体と比較して強化された阻害活性を有すると共に、マウスモデルにおいてインビボで測定した場合にも、裸のMASP-2スキャフォールド抗体と比較して強化された阻害活性を有する、SGMIペプチド担持MASP-2抗体およびその断片を生産した。
III.生物活性ペプチド担持抗体
前述に従って、一局面において、本発明は、生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、（a）（i）ニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、もしくはCDR-H3のうちの少なくとも1つに、および/または（ii）ニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、もしくはCDR-L3のうちの少なくとも1つに、少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を移植する工程、ならびに（b）ペプチド担持抗体が、単離された生物活性ペプチドと比較して少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程を含む、方法を提供する。
本発明のこの局面による方法は、任意の関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を含む生物活性ペプチド担持抗体を生成するために使用することができる。生物活性ペプチドはさまざまな系から単離されており、広範囲にわたる作用を呈し、かつ、医学の分野において治療作用物質として、および基礎研究と応用研究の両方において診断ツールとして用いられる。生物活性ペプチドの作用様式は、生物活性ペプチドと特異的タンパク質標的との相互作用によるものであることが見いだされている。生物活性ペプチドは、極めて高い特異性で、そのタンパク質標的に結合し、それを活性化または不活化することによって作用する。それぞれのタンパク質標的に対する生物活性ペプチドの結合定数は、典型的には、ナノモル濃度（nM）域にあると決定されており、ピコモル濃度域という強力な結合定数も報告されている。
本発明のこの局面の方法は、任意の生物活性ペプチドを伴うアミノ酸配列を含む抗体を生成するために使用することができる。本発明の方法において使用するための例示的生物活性ペプチドとしては、（i）補体活性化を阻害する生物活性ペプチド、（ii）医学的に重要なプロテアーゼを阻害する生物活性ペプチド、（iii）神経ペプチド、（iv）神経ペプチド活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（v）ペプチドホルモン、（vi）ペプチドホルモン活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（vii）クラスA GPCRのリガンドであるペプチド、（viii）クラスA GPCRを阻害または活性化する生物活性ペプチド、（ix）クラスB GPCRリガンド、および（x）クラスB GPCRを阻害または活性化する生物活性ペプチドが挙げられる。
例えば、生物活性ペプチドによって阻害される医学的に重要なプロテアーゼには、ガンマ-セクレターゼ、PAR-1、PAR-2、PAR-3、カテプシン、インクレチン、ジペプチジルペプチダーゼIV、アンジオテンシン変換酵素、カルパイン、カスパーゼ-3、カルボキシペプチダーゼ、トロンビン、ならびに凝固カスケードおよび補体経路のプロテアーゼなどがあるが、それらに限定されるわけではない。補体経路セリンプロテアーゼ阻害物質（例えばMASP-1、MASP-2の阻害物質）の例として、生物活性ペプチド阻害物質SGMI-1およびSGMI-2が挙げられる。
神経ペプチドの例としては、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸、アグーチ関連ペプチド、アルファ-エンドルフィン、ビッグダイノルフィン、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、カルベトシン、コカイン・アンフェタミン調節転写産物（CART）、コレシストキニン、コラゾニン、副腎皮質刺激ホルモン様中間体ペプチド、コルチスタチン、デモキシトシン、ダイノルフィンA、ダイノルフィンB、エレドイシン、エンケファリン、ガラニン、ガラニン様ペプチド、ガルミック（Galmic）、ガルノン、ガンマ-エンドルフィン、グレリン、ヘモプレッシン、キスペプチン、ニューロキニンB、ニューロメジンB、ニューロメジンN、ニューロメジンS、ニューロメジンU、ニューロメジンS、ニューロメジンY、神経ペプチドY、ニューロテンシン、ノシセプチン、オピオルフィン、オレキシン、オレキシン-A、オキシトシン、フィサレミン、プレプロタキキニン、プロクトリン、プロエンケファリン、プロオピオメラノコルチン、プロテインエピステーメー（Protein episteme）、リラキシン-3、RVD-Pα、ソマトスタチン、サブスタンスP、TAC1、タキキニンペプチド、TRH、バソプレシン、バソトシン、VIP、およびVGFが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
ペプチドホルモンの例としては、アクチビンおよびインヒビン、アディポネクチン、脂肪由来ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、アファメラノチド、アグーチ遺伝子、アグーチシグナリングペプチド、アラトスタチン、アミリン、アミリンファミリー、アンジオテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、大ガストリン、ウシソマトトロピン、ブラジキニン、脳由来神経栄養因子、カルシトニン、コレシストキニン、毛様体神経栄養因子、CJC-1293、CJC-1295、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、コシントロピン、甲殻類神経ホルモンファミリー、エンドセリアン（Endothelian）、エンテログルカゴン、FGF15、GFG15/19、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、胃抑制ペプチド、グレリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン調製物、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インクレチン、インスリン、インスリンアナログ、インスリンアスパルト、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子-1、インスリン様成長因子-2、レプチン、リラグルチド、小ガストリンI、黄体形成ホルモン、メラノコルチン、メラノサイト刺激ホルモン、アルファ-メラニン細胞刺激ホルモン、メラノタンII、ミニガストリン、脳性ナトリウム利尿ペプチドのN末端プロホルモン、神経成長因子、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、NPHインスリン、オベスタチン、オレキシン、オステオカルシン、膵ホルモン、副甲状腺ホルモン、ペプチドホルモン、ペプチドYY、血漿レニン活性、プラムリンチド、プレプロホルモン、プロラクチン、リラキシン、リラキシンファミリーペプチドホルモン、レニン、サルカトニン、セクレチン、セクレチンファミリーペプチドホルモン、シンカリド、硬骨魚類レプチン、テンポリン、テサモレリン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ウロコルチン、ウロコルチンII、ウロコルチンIII、血管作動性腸ペプチド、およびビテロゲニンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
クラスB GPCRリガンドの例としては、VIP（28aa）、PACAP（38aa）、およびCRF1（41aa）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
表1および表2に、本発明の方法における使用に適した代表的な生物活性ペプチドを列挙する。
（表１）薬剤に用いられる代表的な生物活性ペプチド
Figure 2016514456
（表２）応用研究に用いられる代表的な生物活性ペプチド
Figure 2016514456
本発明のこの局面の方法に従って、関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列が、実施例3で説明し、図3〜6に図解するように、例えば親ニワトリ一般的（すなわち非特異的）抗体の重鎖または軽鎖可変領域などの、重鎖（例えば1つまたは複数のニワトリフレームワーク領域（VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4)を含む重鎖）の可変領域に関する少なくとも1つのCDR領域に移植されているか、軽鎖（例えば1つまたは複数のニワトリフレームワーク領域（VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4）を含む軽鎖）の可変領域に関する少なくとも1つのCDR領域に移植されている。生物活性ペプチドは、可変重鎖または可変軽鎖中のCDRに近接する隣接フレームワーク領域が完全な状態で残るように、CDRに移植されている。いくつかの態様では、一般的な親抗体のネイティブCDR配列全体が除去され、生物活性ペプチド配列で置き換えられる。
図3〜6に示すように、いくつかの態様では、CDRに移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列と、生物活性ペプチド担持抗体に近接するフレームワーク領域の一方または両方との間に、少なくとも1つのペプチドリンカー配列（典型的には長さが1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基長）が含まれる。ペプチドリンカーは、表4に示す可動性リンカー配列など、任意の可動性リンカー配列であることができる。いくつかの態様では、図4および図6に図解するように、親抗体からのネイティブCDRアミノ酸残基を用いて、フレームワーク領域に近接する生物活性ペプチドの一方または両方の隣接領域にリンカーを形成させる。いくつかの態様では、ネイティブCDR配列に関する少なくとも1つのアミノ酸、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上、最大で全アミノ酸残基を、移植された生物活性ペプチドを含む重鎖または軽鎖可変領域中の生物活性ペプチドに隣接するリンカー配列として保っておく。
いくつかの態様では、生物活性ペプチド配列は抗体の重鎖可変領域に移植され、重鎖可変領域は一般式（I）:
N-X-B-Y-C （I）
を有する領域を含み、
Nは、重鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
Xは、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
Bは、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるか、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基からなり、
Yは、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
Cは、重鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
以下のうちの少なくとも1つが該当する:
Nは、SEQ ID NO:24として示すFR-1またはその変種を含み、かつCは、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含むこと;あるいは
Nは、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含み、かつCは、SEQ ID NO:26として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
Nは、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCは、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含むこと。
一態様では、生物活性ペプチド配列が抗体の重鎖可変領域に移植され、Nは、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCは、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含む。
一態様では、1つまたは複数のフレームワーク領域（例えばVH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4）とCDRに移植された少なくとも1つの生物活性ペプチドとを含む重鎖が、SEQ ID NO:47として示すヒトIgG1定常領域またはその変種をさらに含む。
いくつかの態様では、生物活性ペプチド配列が抗体の軽鎖可変領域に移植され、軽鎖可変領域は一般式（II）:
N-X-B-Y-C （II）
を有する領域を含み、
Nは、軽鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
Xは、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
Bは、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるか、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基からなり、
Yは、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
Cは、軽鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
以下のうちの少なくとも1つが該当する:
Nは、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCは、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含むこと;あるいは
Nは、SEQ ID NO:33として示すFR-2またはその変種を含み、かつCは、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
Nは、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含み、かつCは、SEQ ID NO:36として示すFR-4またはその変種を含むこと。
一態様では、生物活性ペプチドが抗体の軽鎖可変領域に移植され、Nは、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCは、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含む。
一態様では、1つまたは複数のフレームワーク領域（VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4）とCDRに移植された少なくとも1つの生物活性ペプチドとを含む軽鎖が、SEQ ID NO:48として示すヒトラムダ軽鎖またはその変種をさらに含む。
一態様において、本発明のこの局面による方法は、SGMIコアアミノ酸配列を含む生物活性ペプチドを、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域（例えばニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域）のうちの少なくとも1つに移植する工程を含み、SGMIコアアミノ酸配列は
X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
を含み、
X1はFまたはVであり、
X2はRまたはKであり、
X3はKまたはLであり、
X4はLまたはWであり、かつ
X5はYまたはNであり、かつ
生物活性ペプチドはMASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する。
一態様において、本方法は、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11からなる群より選択される生物活性ペプチドを移植する工程を含む。
一態様において、本方法は、MASP-1の活性を阻害する生物活性ペプチドを移植する工程を含み、生物活性ペプチドはSEQ ID NO:6〜8のうちの少なくとも1つである。
一態様において、本方法は、MASP-2の活性を阻害する生物活性ペプチドを移植する工程を含み、生物活性ペプチドはSEQ ID NO:9〜11のうちの少なくとも1つである。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含み、生物活性ペプチドアミノ酸配列のうちの少なくとも1つが、（i）ニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域、および/または（ii）ニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つに移植されている、単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供する。いくつかの態様では、生物活性ペプチドアミノ酸配列が、ニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3のうちの少なくとも1つに移植されている。いくつかの態様では、生物活性ペプチドアミノ酸配列が、ニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3のうちの少なくとも1つに移植されている。重鎖および/または軽鎖の1つまたは複数のCDR領域に移植された1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む単離された抗体またはその抗原結合性断片のさまざまな態様は、本明細書に記載する方法に従って生成される。
一態様では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、SEQ ID NO:5として示すSGMIコア配列を含む生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む。一態様では、単離された抗体またはその断片が、CDRに移植された生物活性ペプチド配列を含み、その生物活性ペプチド配列は、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含むか、またはSEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つからなる。
一態様では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくはSEQ ID NO:90、またはSEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくはSEQ ID NO:90に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む。別の態様では、単離された抗体またはその抗原断片をコードする核酸分子が提供され、核酸分子は、SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87もしくはSEQ ID NO:89、またはSEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87もしくはSEQ ID NO:89に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む。
別の局面において、本発明は、生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、（a）（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に、ならびに/または（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に、少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を融合する工程、ならびに（b）ペプチド担持抗体が、単離された生物活性ペプチドと比較して少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が、非ヒト領域を含む。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域がニワトリ領域を含む。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域がヒト領域を含むか、またはヒト領域からなる。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が、補体活性化を阻害する。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が、補体活性化のレクチン経路を阻害する。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が、MASP-1および/またはMASP-2のうちの少なくとも一方の活性を阻害する。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む。
本発明のこの局面の方法は、本明細書に記載する例示的生物活性ペプチドなど、任意の関心対象の生物活性ペプチドで行うことができる。図10、16、17、および18は、実施例4および実施例7でさらに説明するように、本発明のこの局面の方法を用いて生成させることができる生物活性ペプチド担持抗体のさまざまな態様を図解する模式図である。
いくつかの態様において、本発明のこの局面による方法は、軽鎖可変領域（例えば非ヒト（例えばラット、マウス、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）領域またはヒト領域含む軽鎖可変領域）および/または重鎖可変領域（例えば非ヒト（例えばラット、マウス、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）領域またはヒト領域を含む重鎖可変領域）のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に、関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を融合する工程を含む。
いくつかの態様において、本発明のこの局面による方法は、軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に、関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を融合する工程を含む。
図10および図16に示すように、いくつかの態様では、生物活性ペプチド配列と軽鎖領域または重鎖領域のアミノ末端との間、または生物活性ペプチド配列と軽鎖定常領域もしくは重鎖定常領域のカルボキシ末端との間に、少なくとも1つのペプチドリンカー配列（典型的には1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基）が含まれる。
いくつかの態様では、関心対象の生物活性ペプチドが、それぞれSEQ ID NO:24、25、26、および28として示すニワトリフレームワーク領域VH-FR1、VH-FR-2、VH-FR-3、およびVH-FR-4アミノ酸配列、またはそれらの変種を含む重鎖可変領域のアミノ末端に融合される。いくつかの態様では、重鎖がさらに、例えばSEQ ID NO:47として示すヒトIgG1定常領域またはその変種を含む。
いくつかの態様では、関心対象の生物活性ペプチドが重鎖定常領域のカルボキシ末端 に融合され、その重鎖はさらに、それぞれSEQ ID NO:24、25、26、および28として示すニワトリフレームワーク領域VH-FR1、VH-FR-2、VH-FR-3、およびVH-FR-4アミノ酸配列、またはそれらの変種を含む可変領域を含む。
いくつかの態様では、関心対象の生物活性ペプチドが、それぞれSEQ ID NO:31、33、35、および36として示すニワトリフレームワーク領域VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のアミノ末端に融合される。いくつかの態様では、軽鎖が、例えばSEQ ID NO:48として示すヒトラムダ軽鎖定常領域をさらに含む。
いくつかの態様において、本発明のこの局面による方法は、非ヒト（例えばラット、マウス、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）領域またはヒト領域を含む重鎖および/または軽鎖のうちの少なくとも1つに、SGMIコアアミノ酸配列を含む生物活性ペプチドを融合する工程を含み、SGMIコアアミノ酸配列は、
X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
を含み、
X1はFまたはVであり、
X2はRまたはKであり、
X3はKまたはLであり、
X4はLまたはWであり、かつ
X5はYまたはNであり、かつ
生物活性ペプチドはMASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する。
一態様において、本方法は、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11からなる群より選択される生物活性ペプチド融合する工程を含む。
一態様において、本方法は、MASP-1の活性を阻害する生物活性ペプチドを融合する工程を含み、生物活性ペプチドはSEQ ID NO:6〜8のうちの少なくとも1つである。
一態様において、本方法は、MASP-2の活性を阻害する生物活性ペプチドを融合する工程を含み、生物活性ペプチドは、SEQ ID NO:9〜11のうちの少なくとも1つである。
前述に従って、いくつかの態様において、本発明は、レクチン経路の阻害物質である生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域がMASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含み、かつ抗体がMASP-2活性を阻害する、方法を提供する。
前述に従って、いくつかの態様において、本発明は、SGMIペプチド担持MASP-2抗体（すなわちMASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む抗体スキャフォールド）を作製する方法であって、（a）（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または（iii）軽鎖ヒト定常領域および/もしくは重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、のうちの少なくとも1つに、SGMIコアペプチド配列のアミノ酸配列を融合する工程、ならびに（b）抗体融合物がMASP-2活性を阻害する能力を有するかどうかを判定する工程を含む、方法を提供する。
本発明のこの局面による方法は、MASP-2依存性補体活性化を阻害する能力を有するSGMIペプチド配列担持MASP-2抗体を生成するために使用することができる。
図16に示すように、いくつかの態様では、任意選択のペプチドリンカー配列（典型的には長さが1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなる可動性ペプチド配列）が、SGMIペプチドアミノ酸配列と近接MASP-2スキャフォールド抗体配列（例えば軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または軽鎖ヒト定常領域および/もしくは重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域）との間に含まれる。ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:13、172、または173として示す本明細書に掲載する例示的リンカー配列など、任意の可動性リンカー配列でありうる。図18は、実施例7においてさらに説明するように、本発明のこの局面の方法を用いて生成させることができるSGMIペプチド担持MASP-2抗体のさまざまな態様を図解する模式図である。
一態様において、本発明のこの局面による方法は、MASP-2に特異的に結合する抗体の以下の領域:（i）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または（iii）軽鎖ヒト定常領域および/または重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域のうちの少なくとも1つに、SGMIコアアミノ酸配列を融合する工程を含み、SGMIコアアミノ酸配列は、X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
を含み、
X1はFまたはVであり、
X2はRまたはKであり、
X3はKまたはLであり、
X4はLまたはWであり、かつ
X5はYまたはNである、かつ
SGMIペプチド配列はMASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する。
一態様において、本方法は、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11からなる群より選択されるSGMIペプチド配列を融合する工程を含む。
一態様において、本方法は、MASP-1の活性を阻害するSGMIペプチド配列を融合する工程を含み、SGMIペプチド配列はSEQ ID NO:6〜8のうちの少なくとも1つである。
一態様において、本方法は、MASP-2の活性を阻害するSGMIペプチド配列を融合する工程を含み、SGMIペプチド配列はSEQ ID NO:9〜11のうちの少なくとも1つである。
いくつかの態様において、SGMIペプチドを伴わないMASP-2スキャフォールド抗体は、MASP-2には特異的に結合するが、MASP-2阻害活性は弱いかまたはなくてもよく、MASP-2-SGMI融合物は、MASP-2阻害活性を提供するか、または増加させる（例えばレクチン経路活性化を阻害する）。いくつかの態様では、MASP-2スキャフォールド抗体がMASP-2に特異的に結合して初期レベルのMASP-2阻害活性を有し、MASP-2-SGMI融合物はスキャフォールド抗体と比較して強化された阻害活性（例えば、SGMIペプチドを伴わないスキャフォールド抗体と比較して、レクチン経路活性化の阻害などの阻害活性の統計的に有意な改良）を有する。適切なMASP-2阻害抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域の非限定的な例を、それぞれ表18および表19に掲載する。
一態様では、MASP-2に結合する1つまたは複数のCDRを含む軽鎖可変領域および/またはMASP-2に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に、SGMIコアペプチド配列が融合される。
一態様では、MASP-2に結合する1つまたは複数のCDRを含む軽鎖可変領域および/またはMASP-2に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域のカルボキシ末端領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に、SGMIコアペプチド配列が融合される。
一態様では、MASP-2に特異的に結合する抗体の軽鎖ヒト定常領域および/または重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に、SGMIコアペプチド配列が融合される。
一態様では、ヒトMASP-2（SEQ ID NO:4として示す）を特異的に認識する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のうちの少なくとも1つに、SGMIコアペプチド配列が融合される。
一態様では、ヒトMASP-2に特異的に結合してMASP-2依存性補体活性化を阻害または遮断するモノクローナルMASP-2抗体またはその抗原結合性断片に、SGMIコアペプチド配列が融合される。MASP-2阻害抗体は、MASP-2の生物学的機能を阻害または遮断することによってMASP-2依存性補体活性化系を効果的に阻害または効果的に遮断しうる。例えば阻害抗体は、MASP-2タンパク質間相互作用を効果的に阻害または遮断し、MASP-2の二量体化または集合を妨害し、Ca2＋結合を遮断しうるか、またはMASP-2セリンプロテアーゼ活性部位を妨害しうる。
図12および図13に示すように、MASP-2ポリペプチドは、MASP-1、MASP-3、ならびにC1補体系のプロテアーゼであるC1rおよびC1sと類似する分子構造を呈する。SEQ ID NO:3に示すcDNA分子は、（SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列からなる）MASP-2の代表例をコードしていて、リーダー配列（aa1〜15）を伴うヒトMASP-2ポリペプチドを与え、そのリーダー配列は分泌の過程で切断されて、成熟型のヒトMASP-2をもたらす。図12に示すように、ヒトMASP2遺伝子は12のエクソンを包含する。ヒトMASP-2 cDNAは、エクソンB、C、D、F、G、H、I、J、K、およびLによってコードされている。SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4に開示する配列がヒトMASP-2の単一アレルを表すこと、およびアレル変異および選択的スプライシングが起こると予想されることは、当業者にはわかるであろう。SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4に示すヌクレオチド配列のアレル変種は、サイレント変異を含有するもの、および変異がアミノ酸配列変化をもたらすものを含めて、本発明の範囲内にある。MASP-2配列のアレル変種は、異なる個体からのcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを標準的手法に従ってプローブすることによってクローニングすることができる。
ヒトMASP-2タンパク質（SEQ ID NO:4）のドメインを図12に示す。これらのドメインには、N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形態形成タンパク質（CUBI）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、第2のCUBドメイン（CUBII）、ならびにタンデム型の補体制御タンパク質ドメインCCP1およびCCP2、ならびにセリンプロテアーゼドメインが含まれる。MASP-2遺伝子の選択的スプライシングはMAp19をもたらす。MAp19は、MASP-2のN末端CUB1-EGF領域を4つの追加残基（EQSL）と共に含有する非酵素タンパク質である。
いくつかのタンパク質が、タンパク質間相互作用によってMASP-2に結合するか、またはMASP-2と相互作用することが示されている。例えばMASP-2は、レクチンタンパク質MBL、H-フィコリンおよびL-フィコリンに結合し、それらと共にCa2＋依存性複合体を形成することが知られている。各MASP-2/レクチン複合体は、タンパク質C4およびC2のMASP-2依存性切断によって、補体を活性化することが示されている（Ikeda, K., et al, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al, J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002）。MASP-2のCUB1-EGFドメインはMASP-2とMBLとの会合にとって不可欠であることが、研究によって示されている（Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001）。CUB1-EGF-CUBIIドメインが、活性なMBL複合体の形成に必要なMASP-2の二量体化を媒介することも示されている（Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000）。したがって、MASP-2依存性補体活性化にとって重要であることが知られているMASP-2標的領域に結合し、それを妨害するMASP-2阻害抗体を同定することができる。
本発明のSGMI-MASP-2抗体融合物の生成に使用されるMASP-2抗体は、以下のMASP-2ポリペプチドドメインの1つにあるエピトープに結合しうる。ヒトMASP-2のCUBIドメイン（SEQ ID NO:4のaa16〜136）、またはヒトMASP-2のCUBI/EGFドメイン（SEQ ID NO:4のaa16〜181）、またはヒトMASP-2のCUBI/EGF/CUBIIドメイン（SEQ ID NO:4のaa16〜292）、またはヒトMASP-2のEGFドメイン（SEQ ID NO:4のaa137〜181）、またはヒトMASP-2のCCPI/CCPII/SPドメイン（SEQ ID NO:4のaa290〜686aa）、またはヒトMASP-2のCCPI/CCPIIドメイン（SEQ ID NO:4のaa293〜444）、またはヒトMASP-2のCCPIドメイン（SEQ ID NO:4のaa293〜362）、またはヒトMASP-2のCCPIIドメイン（SEQ ID NO:4のaa363〜444）、またはヒトMASP-2のCCPII/SPドメイン（SEQ ID NO:4のaa363〜686）、またはヒトMASP-2のSPドメイン（SEQ ID NO:4のaa444〜6686）。
一態様では、本発明において使用されるMASP-2阻害性スキャフォールド抗体が、全長ヒトMASP-2タンパク質（SEQ ID NO:4）の一部分、例えばMASP-2のCUBI、EGF、CUBII、CCPI、CCPII、またはSPドメインに結合する。いくつかの態様では、本発明のMASP-2阻害抗体が、ヒトMASP-2のCCP1ドメイン（SEQ ID NO:4のaa293〜362）中のエピトープに結合する。例えば阻害性MASP-2抗体（例えばmAb＃6）は、実施例5で述べるように、CCP1ドメインを含有するMASP-2断片だけに結合し、MASP-2依存性補体活性化を阻害することが確認されている。
いくつかの態様では、本発明において使用されるMASP-2スキャフォールド抗体が、ヒトMASP-2（SEQ ID NO:3によってコードされるSEQ ID NO:4として示す）に、補体系の他の抗原への結合より少なくとも10倍は高いアフィニティーで、特異的に結合する。いくつかの態様では、MASP-2スキャフォールド抗体がヒトMASP-2に、補体系の他の抗原への結合より少なくとも100倍は高いアフィニティーで、特異的に結合する。
いくつかの態様では、本発明において使用されるMASP-2スキャフォールド抗体が、ヒトMASP-2に、約100nM未満、または約50nM未満、または約25nM未満、または約10nM未満、または約5nM未満、または約1nM未満もしくは約1nM、または0.1nM未満もしくは0.1nMのKD（解離定数）で、特異的に結合する。MASP-2抗体の結合アフィニティーは、ELISAアッセイ法などの、当技術分野において公知の適切な結合アッセイ法を用いて決定することができる。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、少なくとも1つの生物活性ペプチドアミノ酸配列が、（i）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（ii）軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域のうちの少なくとも一方に融合されており、抗体が、単離された生物活性ペプチドと比較して、少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域がヒト領域を含むか、またはヒト領域からなる。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が非ヒト（例えばラット、マウス、ニワトリ、ラクダ科動物、合成など）領域を含む。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が補体活性化を阻害する。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が、補体活性化のレクチン経路を阻害する。いくつかの態様では、生物活性ペプチド担持抗体が、MASP-1および/またはMASP-2のうちの少なくとも一方の活性を阻害する。いくつかの態様では、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む。
軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ末端領域に融合されているか、または軽鎖定常領域もしくは重鎖定常領域のカルボキシ末端領域に融合されている1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸を含む単離された抗体またはその断片のさまざまな態様は、本明細書に記載する方法に従って生成される。
一態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、SEQ ID NO:5として示すSGMIコア配列を含む生物活性ペプチドアミノ酸配列を含むSGMIペプチド担持抗体である。一態様において、単離された抗体またはその断片は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ末端領域に融合されているか、または軽鎖定常領域または重鎖定常領域のカルボキシ末端領域に融合されている生物活性ペプチドを含み、その生物活性ペプチド配列は、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含むか、またはSEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つからなる。
一態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、もしくはSEQ ID NO:108、またはSEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、もしくはSEQ ID NO:108に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む。別の態様では、単離された抗体またはその抗原断片をコードする核酸分子であって、SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105もしくはSEQ ID NO:107、またはSEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105もしくはSEQ ID NO:107に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む、核酸分子が提供される。
別の局面において、本発明は、（i）MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域と、（ii）X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）によるアミノ酸配列を含み、X1がFまたはVであり、X2がRまたはKであり、X3がKまたはLであり、X4がLまたはWであり、かつX5がYまたはNである、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列とを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、SGMIコアペプチド配列が、（a）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または（b）軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または（c）軽鎖ヒト定常領域および/または重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域の少なくとも1つに融合されており、かつ抗体融合タンパク質が、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本開示のこの局面による抗体を本明細書では「SGMIペプチド担持MASP-2抗体」ともいう。SGMIペプチド担持MASP-2抗体またはその抗原結合性断片のさまざまな態様は、本明細書に記載する方法に従って生成される。
SGMIペプチド担持MASP-2抗体の力価
一態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合物が、1％血清中で測定した場合に、IC50≦30nM、好ましくは約20nM未満もしくは約20nM、または約10nM未満、または約5nM未満、または約3nM未満もしくは約3nM、または約1nM未満もしくは約1nMでMASP-2依存性補体活性化を阻害するのに十分強力である。
一態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合物が、90％血清中で測定した場合に、IC50≦30nM、好ましくは約20nM未満もしくは約20nM、または約10nM未満、または約5nM未満、または約3nM未満もしくは約3nM、または約1nM未満もしくは約1nMでMASP-2依存性補体活性化を阻害するのに十分強力である。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合物の投与の結果として起こる補体系の構成要素の、以下の変化のうちの少なくとも1つを特徴とする: MASP-2依存性補体活性化系産物C4a、C3a、C5aおよび/またはC5b-9（MAC）（例えば米国特許第7,919,094号の実施例2に記載されているように測定される）ならびにそれらの異化分解産物（例えばC3DesArg）の生成または生産の阻害、C4切断およびC4b沈着（例えば実施例4で述べるように測定される）およびそれに続く異化分解産物（例えばC4bcまたはC4d）の減少、またはC3切断およびC3b沈着（例えば実施例4で述べるように測定される）またはそれに続く異化分解産物（例えばC3bc、C3dなど）の減少。
いくつかの態様において、本発明のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、完全血清（full serum）中で、C3沈着を、対照C3沈着の80％未満、例えば70％未満、例えば60％未満、例えば50％未満、例えば40％未満、例えば30％未満、例えば20％未満、例えば15％未満、例えば10％未満まで阻害する能力を有する。
いくつかの態様では、本発明のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、完全血清中で、C4沈着を、対照C4沈着の80％未満、例えば70％未満、例えば60％未満、例えば50％未満、例えば40％未満、例えば30％未満、例えば20％未満、例えば15％未満、例えば10％未満まで阻害する能力を有する。
いくつかの態様において、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、MASP-2補体活性化を選択的に阻害する（すなわちC1rまたはC1sへの結合より少なくとも100倍またはそれ以上高いアフィニティーでMASP-2に結合する）が、C1q依存性補体活性化系は機能的に完全な状態で残す（すなわち古典経路活性の少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも98％、または100％が保たれる）。
いくつかの態様において、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、以下の特徴を有する:（a）ヒトMASP-2に対する高いアフィニティー（例えば10nMまたはそれ未満のKD、好ましくは1nMまたはそれ未満のKD）、および（b）90％ヒト血清中でMASP-2依存性補体活性を、10nMまたはそれ未満のIC50、より好ましくは1nMまたはそれ未満のIC50で阻害する。
いくつかの態様では、MASP-2抗体スキャフォールドが完全ヒト抗体スキャフォールドである。いくつかの態様では、MASP-2抗体スキャフォールドがヒト化抗体スキャフォールドであり、非ヒト種（例えばマウスまたはラットなどの齧歯類動物、またはニワトリ）の免疫グロブリンに由来するMASP-2結合部位を含む。
実施例5で述べるように、MASP-2に高いアフィニティーで結合し、レクチン媒介性補体活性化を阻害するが、免疫系の古典（C1q依存性）経路の構成要素は完全な状態で残す、完全ヒト抗体が同定された。この抗体の可変軽鎖断片と可変重鎖断片を配列決定し、単離し、scFvフォーマットと全長IgGフォーマットの両方で解析した。図14Aおよび図14Bに、MASP-2に対する高い結合アフィニティーとMASP-2依存性活性を阻害する能力とを有すると同定された7種類のscFv抗MASP-2クローンのアミノ酸配列アラインメントを示す。図15Aおよび図15Bに、scFv母クローンのうちの4つ、17D20、17N16、18L16および4D9のアミノ酸配列アラインメントを示す。これは、フレームワーク領域とCDR領域とを示している。実施例5で述べるように、scFv母クローン17D20および17N16を親和性成熟に供することで、母クローンと比較して高いアフィニティーと増加した力価を有する娘クローンを生成させた。図14Aおよび図14Bならびに図15Aおよび図15Bに示すscFvクローンの重鎖可変領域（VH）（aa1〜120）および軽鎖可変領域（VL）（aa148〜250）ならびに結果として得られた娘クローンのアミノ酸配列を、下記の表6、8、9、10、11、12、18、および19に掲載する。例示的なSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質のアミノ酸配列を表14に掲載する。
MASP-2阻害抗体の置換可能な位置と、それらの位置に代入しうるアミノ酸の選択は、上で論じたMASP-2阻害抗体の重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を整列し、これらの抗体のどの位置にどのアミノ酸が存在するかを決定することによって明らかになる。例示的一態様では、図14Aおよび図14Bならびに図15Aおよび図15Bの重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を整列し、例示的抗体の各位置におけるアミノ酸の実体を決定する。（例示的MASP-2阻害抗体の重鎖および軽鎖の各位置に存在するアミノ酸を図解している）図14Aおよび図14Bならびに図15Aおよび図15Bに図解するように、いくつかの置換可能な位置ならびにその位置に代入することができるアミノ酸残基がすぐに同定される。別の例示的態様では、置換可能な位置ならびにそれらの位置に代入することができるアミノ酸残基を決定するために、母クローンおよび娘クローンの軽鎖アミノ酸配列を整列し、例示的抗体の各位置におけるアミノ酸の実体を決定する。
ある特定の態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、表18に示す重鎖可変ドメイン配列のいずれかと実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:109として示す17D20（VH）と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:109を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:111と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％同一であるか、少なくとも約97％同一であるか、少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:112と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、表19に示す軽鎖可変ドメイン配列のいずれかと実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:113と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:115と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:116と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:118と実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:110またはSEQ ID NO:114に示す重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる重鎖または軽鎖を含む。高ストリンジェンシー条件には、0.1×SSC（15mM食塩水/0.15mMクエン酸ナトリウム）中、50℃またはそれ以上でのインキュベーションが含まれる。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、図14Aおよび図14Bまたは図15Aおよび図15Bに示す、または下記の表9に記載する、重鎖可変配列のいずれかのCDRのアミノ酸配列と比較して、実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）か、または同一の配列を含むもしくは同一の配列からなる、1つまたは複数のCDR（CDR1、CDR2、および/またはCDR3）を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、図14Aおよび図14Bまたは図15Aおよび図15Bに示す、または下記の表11に記載する、軽鎖可変配列のいずれかのCDRのアミノ酸配列と比較して、実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）か、または同一の配列を含むもしくは同一の配列からなる、1つまたは複数のCDR（CDR1、CDR2、および/またはCDR3）を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:129またはSEQ ID NO:146として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む重鎖可変領域CDR-H3配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:142またはSEQ ID NO:150として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む軽鎖可変領域CDR-L3配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:123またはSEQ ID NO:124として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む重鎖可変領域CDR-H2配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:119またはSEQ ID NO:120として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む重鎖可変領域CDR-H1配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:149として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む軽鎖可変領域CDR-L2配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質は、SEQ ID NO:147またはSEQ ID NO:148として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む軽鎖可変領域CDR-L1配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、下記の表14に記載のアミノ酸配列と比較して実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）か、または同一の配列を含むもしくは同一の配列からなる、アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、またはSEQ ID NO:189として示すアミノ酸配列と比較して、実質的に同一である（例えば少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一であるか、または少なくとも約97％同一であるか、または少なくとも約98％同一であるか、または少なくとも99％同一である）か、または同一の配列を含む、アミノ酸配列を含む。
別の態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質をコードする核酸分子であって、SEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、もしくはSEQ ID NO:188、またはSEQ ID NO:174、176、178、180、182、184、186、もしくはSEQ ID NO:188に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む、核酸分子が提供される。
別の局面において、本発明は、ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）および/またはSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）のうちの少なくとも一方をさらに含み、マンナン被覆基材上でC4活性化を1％ヒト血清において10nMまたはそれ未満のIC50で阻害する、単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本発明のこの局面の一態様では、該抗体またはその抗原結合性断片が、（i）SEQ ID NO:111に示す重鎖可変領域とSEQ ID NO:115に示す軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって、または（ii）European Collection of Cell Cultures（ECACC）、英国ウィルトシャー州ソールズベリーに受託番号03050904として寄託されたハイブリドーマ細胞株が生産する参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を、特異的に認識する。
前述に従って、本願のある特定の好ましい実施形態に従ってSGMI-1および/またはSGMI-2のうちの少なくとも1つをさらに含む抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトMASP-2への結合に関して、（i）抗原に特異的に結合し、かつ（ii）本明細書において開示するVHおよび/またはVLドメインを含むかまたは本明細書において開示するCDR-H3を含む、本明細書に記載する任意の抗体と、またはそれらのいずれかの変種と競合するものでありうる。結合メンバー間の競合は、同じエピトープまたはオーバーラップするエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定が可能になるように、例えばELISAを用いて、かつ/または一方の結合メンバーに、他方のタグ付けされていない結合メンバーの存在下で検出することができる特異的リポーター分子をタグ付けすることによって、インビトロで容易にアッセイすることができる。したがって、ヒトMASP-2に結合する本明細書に記載の抗体、例えば実施例5、実施例6および実施例7に記載するMASP-2抗体のいずれか1つと、ヒトMASP-2への結合に関して競合するヒト抗体抗原結合部位を含む特異的抗体またはその抗原結合性断片が本明細書に提供される。
一態様において、本発明は、ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:182、およびSEQ ID NO:187、またはSEQ ID NO:175、SEQ ID NO:182、およびSEQ ID NO:187に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様において、本発明は、ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:189、またはSEQ ID NO:181、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:189に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
変種MASP-2阻害抗体
上述したモノクローナルMASP-2抗体を修飾して、MASP-2依存性補体活性化を阻害する変種抗体を得ることができる。変種抗体は、上述したモノクローナル抗体に関する少なくとも1つのアミノ酸を置換するか、付加するか、または欠失させることによって作製することができる。一般にこれらの変種抗体は上述したMASP-2抗体の一般特徴を有し、少なくとも、上述した抗体の1つのCDRを含有するか、またはある特定の態様では、上述した抗体のCDRに非常に似ているCDRを含有する。
好ましい態様では、変種が、親抗体の1つまたは複数の超可変領域に、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば変種は、少なくとも1個、例えば約1〜約10個の、例えば少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個または少なくとも10個の置換、好ましくは約2〜約6個の置換を、親抗体の1つまたは複数のCDR領域に含みうる。通常、変種は、親抗体の重鎖可変ドメイン配列または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも75％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、かつ最も好ましくは少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性またはホモロジーは、本明細書では、最大の配列同一性パーセントが得られるように配列を整列し、必要であればギャップを導入した後に、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。変種は、ヒトMASP-2に結合する能力を保っており、好ましくは、親抗体の性質より優れた性質を有する。例えば変種は、より強い結合アフィニティーおよび/または強化されたMASP-2依存性補体活性化阻害能力もしくは遮断能力を有しうる。
そのような性質を解析するには、例えばFab型の変種をFab型の親抗体と比較するか、全長型の変種を全長型の親抗体と比較すべきである。というのも、抗MASP-2抗体のフォーマットは、本明細書において開示する生物学的活性アッセイ法で、その活性に影響を与えることが見いだされているからである。本明細書において特に興味深い変種抗体は、親抗体と比較した場合に、生物学的活性に少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、最も好ましくは少なくとも約50倍の強化を示すものである。
本発明の抗体は望ましい性質が強化されるように修飾することができる。例えば抗体の血清中半減期を制御することが望ましいかもしれない。一般に、完全な抗体分子は非常に長い血清中持続性を有するのに対し、断片（＜60〜80kDa）は、腎臓によって非常に迅速にろ過される。それゆえ、MASP-2抗体の長期作用が望ましい場合、MASP-2抗体は好ましくは完全長IgG抗体（例えば、IgG2またはIgG4）であり、一方、短いMASP-2抗体作用が望ましい場合は、抗体断片が好ましいと考えられる。実施例7で述べるように、IgG4のヒンジ領域におけるS228P置換は血清中安定性を増加させることが決定されている。したがっていくつかの態様において、本願のSGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質はS228P置換を持つ全長IgG4抗体である。
一本鎖抗体
本発明の一態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質が一本鎖抗体であり、これは、図17Aおよび図17Bに図解するように、遺伝子的に融合された一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有し、さらにSGMIペプチドを含む、遺伝子操作された分子と定義される。そのような一本鎖抗体は「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片とも呼ばれる。一般に、Fvポリペプチドは、さらに、scFvが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、VHドメインとVLドメインの間に含む。MASP-2に結合するscFv抗体には、軽鎖可変領域が重鎖可変領域のアミノ末端側またはカルボキシル末端側にくるような向きを持たせることができる。本発明の例示的なscFv抗体を表6に示す。
別の局面において、本発明は、（i）SGMIコア配列が、X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）によるアミノ酸配列を含み、X1がFまたはVであり、X2がRまたはKであり、X3がKまたはLであり、X4がLまたはWであり、かつX5がYまたはNである、SGMIコア配列を含む領域と、（ii）ヒトIgG1 Fcを含む領域とを含み、かつMASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、単離されたポリペプチドを提供する。
一態様では、ヒトIgG1 Fc領域を含む領域が、SGMIコア配列を含む領域のアミノ末端に位置する。別の態様では、ヒトIgG1 Fc領域を含む領域が、SGMIコア配列を含む領域のカルボキシ末端に位置する。
一態様では、IgG1 Fcを含む領域が、SEQ ID NO:12もしくはその変種を含むか、またはSEQ ID NO:12もしくはその変種からなる。
一態様では、SGMIコア配列を含む領域が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含むか、またはSEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つからなる。一態様では、ヒトIgG1 Fcを含む領域が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つに直接融合されている。一態様では、ポリペプチドが、1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含み、このリンカー領域はSGMIコア配列を含む領域とヒトIgG1 Fcを含む領域との間に含まれる。一態様では、リンカー配列が、SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:14のうちの少なくとも一方を含む。一態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:16もしくはSEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:16もしくはSEQ ID NO:18に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む。
別の態様では、ポリペプチドをコードする核酸分子であって、SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17に対して少なくとも85％、または少なくとも88％、または少なくとも90％、または少なくとも92％、または少なくとも95％、または少なくとも98％の同一性を有するその変種のうちの少なくとも1つを含む、核酸分子が提供される。
バイオペプチド担持抗体を生産するための方法
本発明の抗体およびポリペプチドは、分子生物学分野および免疫学分野の当業者には周知の標準的な組換え遺伝子工学的方法によって生産することができる。
本発明のバイオペプチド担持抗体またはバイオペプチド担持融合ペプチドを組換え生産するために、バイオペプチド担持抗体またはバイオペプチド担持融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素（例えば関心対象の生物活性ペプチド配列と重鎖ポリペプチド配列または軽鎖ポリペプチド配列）をコードするDNA配列を、従来の方法を用いて組み立てることができる。一例として、構成要素を別々に組み立てて、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。例えば、あるポリペプチド構成要素をコードするDNA配列の3'端を、第2のポリペプチド構成要素をコードするDNA配列の5'端に、ペプチドリンカーを用いて、またはペプチドリンカーなしで、配列の読み枠が合うようにライゲーションする。
重鎖可変領域または軽鎖可変領域のCDR領域に移植された生物活性ペプチド配列を組換え生産するために、生物活性ペプチド配列をコードする核酸配列と、可変軽鎖または可変重鎖の近接フレームワーク領域をコードする核酸配列との読み枠が合うように、ペプチドリンカーを用いて、またはペプチドリンカーなしで、核酸構成要素を組み立てて、適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。
本明細書に記載するように、ペプチドリンカー配列は、生物活性ペプチド配列（例えばSGMIペプチド配列）を、ある所定の距離だけ、例えば本発明の利点が達成されること、例えばCDR領域に移植されているか重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのアミノ末端領域またはカルボキシ末端領域に融合された生物活性ペプチドの生物学的活性を、保証するのに十分な距離だけ、異種ポリペプチド配列から分離するために使用することができる。そのようなペプチドリンカー配列は、当技術分野において周知の標準的技法を用いて、生物活性ペプチド担持抗体に組み入れることができる。適切なペプチドリンカー配列は、例えば（1）可動性の伸展したコンフォメーションをとることができ、（2）生物活性ペプチド配列の能力を妨害しうる二次構造をとることができないなどの要因に基づいて、選ぶことができる。ペプチドリンカー配列の例は、例えばGly、AsnおよびSer残基を含有しうる。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばThrおよびAlaも、リンカー配列中に使用することができる。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列としては、本明細書において開示するものの他、Maratea et al, Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986;米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されているものが挙げられる。リンカー配列は、一般に、例えば1〜約20アミノ酸長でありうる。
本発明はさらに、本明細書に記載する本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。そのような核酸を含有するベクターも包含される。本方法が宿主細胞中で実施される場合は、まず宿主細胞を、安定化されたポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換またはトランスフェクションし、次にポリペプチドおよび抗体を発現させ、回収する。宿主細胞は、本明細書においてさらに説明するとおり、細菌などの原核生物、または真核生物であることができる。
多くの態様では、本願のモノクローナル抗体をコードする核酸が、宿主細胞中に直接導入され、コードされている抗体の発現を誘導するのに十分な条件下で、細胞がインキュベートされる。
いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドをコードする核酸分子を含む細胞を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現カセットを提供する。
いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドの生産方法であって、本発明の抗体をコードする核酸分子を含む細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。
ある特定の関連態様に従って、本明細書に記載する1つまたは複数のコンストラクトを含む組換え宿主細胞と、任意の抗体、そのCDR、VHドメインもしくはVLドメイン、または抗原結合性断片をコードする核酸と、コードされている産物の生産方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む、方法とが提供される。いくつかの態様では、SGMIペプチド担持MASP-2抗体融合タンパク質、そのCDR、VHドメインもしくはVLドメイン、または抗原結合性断片をコードする核酸を含む組換え宿主細胞と、コードされている産物の生産方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む、方法とが提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、都合よく達成することができる。発現による生産後は、抗体またはその抗原結合性断片を、任意の適切な技法を用いて単離および/または精製してから、所望どおりに使用することができる。
例えば、発現カセットの発現に適した任意の細胞、例えば酵母、昆虫、植物などの細胞を、宿主細胞として使用することができる。多くの態様では、通常は抗体を生産しない哺乳動物宿主細胞株が使用され、その例は以下のとおりである:サル腎臓細胞（COS細胞）、SV40で形質転換されたサル腎臓CVI細胞（COS-7、ATCC CRL 165 1）;ヒト胎児腎臓細胞（HEK-293、Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)）;ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）;チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)）;マウスセルトリ細胞（TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）;サル腎臓細胞（CVI ATCC CCL 70）;アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587）;ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）;イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）;バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）;ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）;ヒト肝臓細胞（hep G2、HB 8065）;マウス乳房腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）;TRI細胞（Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)）;NIH/3T3細胞（ATCC CRL-1658）;およびマウスL細胞（ATCC CCL-1）。他の細胞株も当業者には明らかになるであろう。多種多様な細胞株をAmerican Type Culture Collection、20110-2209バージニア州マナッサス,ユニバーシティブルバード10801から入手することができる。
細胞中に核酸を導入する方法は当技術分野において周知である。適切な方法として、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性脂質核酸送達、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が行われる状況（すなわちインビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法に関する一般的議論は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology 3d ed., Wiley & Sons, 1995に見いだすことができる。いくつかの態様では、リポフェクトアミンおよびカルシウムによる遺伝子導入技術が使用される。
本願の核酸を細胞中に導入した後、典型的には、その細胞を、通常は37℃で、時には選択下で、抗体の発現を可能にするのに適した時間、インキュベートする。大半の態様において、抗体は、典型的には、細胞を成長させている培地の上清に分泌される。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系発現系を用いて、本願の抗体を発現させることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列に、関心対象の抗体コード配列をライゲーションすることができる。このキメラ遺伝子は、次に、インビトロ組換えまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1またはE3）に挿入すれば、生存可能であり、かつ感染宿主において抗体分子を発現させる能力を有する組換えウイルスが得られうる（例えばLogan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)参照）。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって、高めることができる（Bittner et al, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)参照）。
組換え抗体の長期高収量生産には、安定発現を使用することができる。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子操作することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、免疫グロブリン発現カセットと選択可能マーカーとで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後に、工学的に操作された細胞を濃厚培地で1〜2日間成長させてから、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体中に安定に組み込むこと、および成長して増殖巣を形成することを可能にし、その増殖巣をクローニングして、細胞株へと拡大することができる。そのような工学的に操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングと評価にとりわけ有用であるだろう。
本発明の抗体分子または融合ポリペプチドが生産されたら、それを、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野において公知の任意の方法により、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティーによる、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解、または他の任意の標準的タンパク質精製技法によって精製することができる。多くの態様では、抗体が細胞から培養培地へと分泌され、培養培地から収穫される。例えば、シグナルペプチドをコードする核酸配列を、抗体または断片のコード領域の近隣に含めることができる。本願の抗体の生産を容易にするために、本願の抗体の本明細書に示すアミノ酸配列の5'端の近隣に、そのようなシグナルペプチドを組み入れることができる。
一態様において、本発明のある特定の態様に従ってニワトリフレームワーク領域を含む抗体は、DT40ニワトリB細胞リンパ腫株に基づくインビトロ系を用いて生成し、かつ/または必要なアフィニティーまたは特異性に関して最適化することができる。DT40ニワトリB細胞リンパ腫株はエクスビボでの抗体進化に使用されている（Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20:1129-1134 (2002);Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23:731-735 (2005)参照）。DT40細胞は、2つの異なる生理学的経路、すなわちそれぞれ鋳型変異（templated mutation）および非鋳型変異（nontemplated mutation）を生み出す遺伝子変換と体細胞超変異とを多様化に用いることができるので、非常に大きな潜在的V領域配列多様性を扱うことができる（Maizels, N., Immunoglobulin gene diversification. Ann. Rev. Genet. 39:23-46 (2005)）。しかし実際には、他の形質転換B細胞株と同様に、多様化は、1％未満の生理学的速度で起こるので、抗体進化におけるDT40細胞の有用性には限界があった。相同組換え経路を無効化することによって多様化を数倍加速することができるが（Cumbers et al., 前記）、そのように工学的に操作された細胞は、効率のよい遺伝子標的指向化を行うことができなくなる。ヒストンデアセチラーゼ阻害物質、トリコスタチンAで細胞を処理することによって多様化を加速することもできるが（Seo et al., 前記）、その結果生じる変異はもっぱら鋳型変異であり、これでは潜在的多様性が限定され、必要なアフィニティーまたは特異性の抗体は生産されない場合がある。
本明細書において抗体を生成するために使用されるDT40細胞は、さらなる遺伝子修飾の可能性または遺伝子変換と体細胞超変異の両方が変異導入に寄与する潜在的可能性を犠牲にすることなく免疫グロブリン（Ig）遺伝子多様化の速度が加速されるように、修飾される。これは、Ig遺伝子多様化を強力な大腸菌ラクトースオペレーター/リプレッサー調節ネットワークの制御下に置くことによって達成された。強力な大腸菌ラクトースオペレーターが100個程度重合した反復配列からなる多量体（PolyLacO）を、再配列して発現したIgλ遺伝子およびIgH遺伝子の上流に、相同遺伝子標的指向化によって挿入した。こうすれば、多様化を調節するために、ラクトースリプレッサータンパク質（LacI）に融合された調節因子を、オペレーターDNAに対するラクトースリプレッサーの高いアフィニティー（KD＝10-14M）を用いて、LacO調節要素に繋留することができる。PolyLacOがIgλだけに組み込まれているDT40 PolyLacO-λR細胞は、工学的操作を加える前の親DT40細胞との比較で、Ig遺伝子多様化速度に5倍の増加を呈した（Cummings, W.J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)）。Igλ遺伝子とIgH遺伝子の両方に標的指向化されたPolyLacOを保因するように工学的に操作された細胞（「DTLacO」）では、多様化がさらに上昇した。
薬学的組成物
別の局面において、本発明は、本明細書において開示する生物活性ペプチド担持抗体およびその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、補体活性化を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体およびその抗原結合性断片を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、レクチン補体経路の活性化を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体およびその断片を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、レクチン経路の活性化を阻害する能力を有するSGMIペプチド担持MASP-2抗体（例えばSGMI-1および/またはSGMI-2）およびその断片を含む組成物を提供する。
一態様では、組成物は、MASP-1活性またはMASP-2活性を特異的に阻害するように製剤化されている。一態様では、組成物は、MASP-1活性を特異的に阻害するように製剤化されている。一態様では、組成物は、MASP-2活性を特異的に阻害するように製剤化されている。一態様では、組成物は、MASP-1活性およびMASP-2活性を特異的に阻害するように製剤化されている。
一態様において、本発明は、MASP-2に特異的に結合してMASP-2依存性レクチン経路活性化を阻害する生物活性ペプチド担持抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様において、本発明は、MASP-1に特異的に結合してMASP-1活性を阻害する生物活性ペプチド担持抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様において、本発明は、MASP-1およびMASP-2に結合してMASP-1活性およびMASP-2活性を阻害する生物活性ペプチド担持二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様において、本発明は、MASP-1に結合してMASP-1活性を阻害する第1の生物活性ペプチド担持抗体とMASP-2に結合してMASP-2活性を阻害する第2の生物活性ペプチド担持抗体とを含む薬学的組成物を提供する。
担体は非毒性かつ生物適合性であり、生物活性ペプチド担持抗体（およびそれと組み合わされる他の任意の治療作用物質）の生物学的活性に有害な影響を及ぼさないように選択される。ポリペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体はYamadaの米国特許第5,211,657号に記載されている。生物活性ペプチド担持抗体および生物活性ペプチド担持ポリペプチドは、経口投与、非経口投与または外科的投与を可能にする錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液剤、デポジトリー（depository）、吸入剤および注射剤などの固形、半固形、ゲル状、液状またはガス状の調製物に製剤化することができる。本発明では、医療機器のコーティングなどによる組成物の局所投与も考えられる。
注射、注入、または灌注および外用送達による非経口送達用の適切な担体として、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、通常リンゲル液もしくは乳酸加リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、またはプロパンジオールが挙げられる。加えて、滅菌固定油を溶媒または懸濁媒として使用してもよい。この目的には、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含めて、任意の生体適合性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製に役立つ。担体および作用物質は、液状物、懸濁液、重合性ゲルもしくは非重合性ゲル、ペーストまたは膏薬として配合することができる。
担体は、作用物質の送達を持続させる（すなわち長引かせる、遅延させる、または調節する）ための送達媒体、または治療作用物質の送達、取り込み、安定性もしくは薬物動態を強化するための送達媒体も含みうる。そのような送達媒体としては、例えばタンパク質、リポソーム、糖質、合成有機化合物、無機化合物、ポリマーヒドロゲルまたはコポリマーヒドロゲルおよびポリマーミセルから構成される微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェアまたはナノ粒子を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。適切なヒドロゲルおよびミセル送達システムとしては、WO 2004/009664 A2に開示されているPEO:PHB:PEOコポリマーおよびコポリマー/シクロデキストリン複合体、ならびに米国特許出願公開第2002/0019369号に開示されているPEOおよびPEO/シクロデキストリン複合体が挙げられる。そのようなヒドロゲルは、意図した作用部位に局所的に注射するか、皮下注射もしくは筋肉内注射することで、徐放性デポーを形成させることができる。
関節内送達または静脈内送達のために、生物活性ペプチド担持抗体または生物活性ペプチド担持ポリペプチドを、注射可能な上述の液状担体もしくはゲル担体、注射可能な上述の徐放性送達媒体、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体に入れて運ぶことができる。
髄腔内（IT）送達または脳室内（ICV）送達には、適切な滅菌送達システム（例えば液状物、ゲル、懸濁液など）を用いて、本発明を施行することができる。
本発明の組成物は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝剤、浸透強化性、乳化剤、結合剤、増粘剤、香味剤（経口投与用）などの生体適合性賦形剤も含みうる。
局所投与用に対象の抗体の高濃度を達成するには、溶液中に粒状物または結晶の懸濁液として抗体を製剤化してから、注射、例えばデポーの筋肉内注射を行うことができる。
治療方法:
別の局面において、本発明は、ヒト対象などの哺乳動物対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害する方法であって、該ヒト対象に、本明細書において開示する生物活性ペプチド担持抗体または生物活性ペプチド担持ポリペプチド融合物を含む組成物を投与する工程を含み、生物活性ペプチドがレクチン補体経路の活性化を阻害する、方法を提供する。本明細書において述べるように、生物活性ペプチドSGMI-1およびSGMI-2は、古典経路に影響を及ぼすことなく補体活性化のレクチン経路を遮断する（Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498）。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,919,094号、米国特許第8,652,477号、ならびに同時係属中の米国特許出願第13/083,441号（US2011/0311549として公開）、米国特許出願第13/830,779号（US2013/0266559として公開）、米国特許出願第13/441,827号（US2012/0258095として公開）、米国特許出願第13/830,831号（US2013/0266560として公開）および米国特許出願第13/464,334号（US2012/0282263として公開）（これらはそれぞれ、本願の譲受人であるOmeros Corporationに譲渡されている）に記載されているように、MASP-2依存性レクチン補体活性化は、MASP-2依存性補体媒介性血管異常、虚血再灌流傷害、アテローム性動脈硬化、炎症性胃腸疾患、肺異常、体外再灌流術、筋骨格異常、腎臓異常、皮膚異常、臓器移植もしくは組織移植、神経系障害もしくは神経系損傷、血液障害、泌尿生殖器異常、糖尿病、化学療法もしくは放射線療法、悪性腫瘍、内分泌疾患、血液凝固異常、血栓性微小血管症、または眼科異常を含む、数多くの急性病状および慢性病状の病理発生の一因になると意味づけられている。それゆえに、本発明のレクチン経路阻害抗体は、上記の疾患および異常を処置するために使用しうる。
MASP-2依存性レクチン経路補体活性化および/またはMASP-1依存性レクチン経路補体活性化を阻害するための方法
一局面において、本発明は、レクチン補体媒介性血管異常、虚血再灌流傷害、アテローム性動脈硬化、炎症性胃腸疾患、肺異常、体外再灌流術、筋骨格異常、腎臓異常、皮膚異常、臓器移植もしくは組織移植、神経系障害もしくは神経系損傷、血液障害、泌尿生殖器異常、糖尿病、化学療法もしくは放射線療法、悪性腫瘍、内分泌疾患、血液凝固異常、血栓性微小血管症、または眼科異常を処置するか、それらを防止する、またはそれらの重症度を軽減するためにMASP-2依存性レクチン補体活性化および/またはMASP-1依存性レクチン補体活性化を阻害するための方法であって、MASP-2依存性レクチン経路活性化および/またはMASP-1依存性レクチン経路活性化を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-2-MASP-2抗体などのSGMI-2担持抗体、および/またはSGMI-1 MASP-2抗体などのSGMI-1担持抗体、またはSGMI-1およびSGMI-2担持抗体）またはその抗原結合性断片の治療有効量を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、血管異常、好ましくは心血管異常、脳血管異常、末梢（例えば筋骨格）血管異常、腎血管異常、腸間膜/腸血管異常、移植片および/または再移植片への血行再建、血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチに関連する血管炎、免疫複合体血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、川崎病（動脈炎）、静脈ガス塞栓（VGE）、ならびにステント留置、回転式粥腫切除術および経皮経管冠動脈形成術（PTCA）後の再狭窄からなる群より選択される血管異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、虚血再灌流傷害に関連する異常、好ましくは大動脈瘤修復、心肺バイパス、臓器移植および/または肢/指再移植に関係する血管再吻合、卒中、心筋梗塞、ならびにショックおよび/または外科手術後の血行力学的蘇生に関連する虚血再灌流傷害に関連する異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、それを必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化を処置および/または防止するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、炎症性胃腸疾患害に関連する異常、好ましくは膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群および憩室炎からなる群より選択される炎症性胃腸疾患に関連する異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、肺異常、好ましくは急性呼吸窮迫症候群、輸注関連急性肺傷害、虚血/再灌流急性肺傷害、慢性閉塞性肺疾患、喘息、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜抗体病（グッドパスチャー病）、胎便吸引症候群、閉塞性細気管支炎症候群、特発性肺線維症、熱傷に続発する急性肺傷害、非心原性肺水腫、輸注関連呼吸抑制および気腫からなる群より選択される肺異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、体外再灌流術、好ましくは血液透析、プラスマフェレーシス、白血球フェレーシス、体外膜型人工肺（ECMO）、ヘパリン誘発性体外膜型酸素供給LDL沈降法（heparin-induced extracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation）（HELP）および心肺バイパス（CPB）からなる群より選択される体外再灌流術を受けたか、または受けているか、または受けるであろう対象におけるレクチン補体活性化を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、痛風、神経障害性関節症、乾癬性関節炎、脊椎関節症、結晶性関節症および全身性エリテマトーデス（SLE）からなる群より選択される筋骨格異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（メサンギウム毛細管性糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎（連鎖球菌感染後糸球体腎炎）、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎およびIgAネフロパシーからなる群より選択される腎臓異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、乾癬、自己免疫性水疱性皮膚症、好酸球性海綿状態、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性疱疹、火傷傷害および化学熱傷傷害からなる群より選択される皮膚異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、臓器移植術もしくは組織移植術、好ましくは臓器同種移植、臓器異種移植、臓器および組織移植からなる群より選択される移植術を受けたか、または受けているか、または受けるであろう対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、多発性硬化症、重症筋無力症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ギラン・バレー症候群、卒中後の再灌流、変性椎間板、脳外傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ミラー・フィッシャー症候群、脳外傷および/または脳出血、脱髄、ならびに髄膜炎からなる群より選択される神経系障害または神経系損傷を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、敗血症に起因する急性呼吸窮迫症候群、全身炎症反応症候群、出血性ショック、溶血性貧血、自己免疫性血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症症候群からなる群より選択される血液障害を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、有痛性膀胱疾患、感覚性膀胱疾患、慢性無菌性膀胱炎、間質性膀胱炎、不妊、胎盤機能障害ならびに流産および子癇前症からなる群より選択される泌尿生殖器異常を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、非肥満糖尿病（1型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）に関連する異常および/または1型糖尿病もしくは2型（成人発症型）糖尿病に関連する合併症、好ましくは、血管症、ニューロパシー、および網膜症からなる群より選択される1型糖尿病もしくは2型糖尿病に関連する合併症を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、化学療法処置および/または放射線療法を受けたか、または受けているか、または受けるであろう対象におけるレクチン補体経路を阻害するために使用される。いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、悪性腫瘍を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、橋本甲状腺炎、ストレス、不安、ならびに下垂体からのプロラクチン、成長因子または他のインスリン様成長因子および副腎皮質刺激ホルモンの調節された放出が関与するホルモン障害からなる群より選択される内分泌疾患を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、レクチン補体媒介性眼科異常、好ましくは加齢性黄斑変性症を患っている対象を処置するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、それを必要とする対象、例えば敗血症、外傷、悪性腫瘍、移植片拒絶、輸注反応、分娩合併症、血管動脈瘤、肝不全、熱中症、熱傷、放射線被曝および重症中毒反応からなる群より選択される疾患または異常を患っている対象における播種性血管内血液凝固を処置するか、該播種性血管内血液凝固を防止するか、または該播種性血管内血液凝固の重症度を軽減するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、発作性夜間ヘモグロビン尿症を患っている対象におけるレクチン補体経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、血栓性微小血管症（TMA）を患っている対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、非定型的溶血性尿毒症症候群（aHUS）を患っている対象または非定型的溶血性尿毒症症候群（aHUS）を発症するリスクがある対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、溶血性尿毒症症候群（HUS）を患っている対象または溶血性尿毒症症候群（HUS）を発症するリスクがある対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を患っている対象またはTTPの診断と矛盾しない症状を呈している対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、クリオグロブリン血症を患っている対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、寒冷凝集素病を患っている対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、緑内障を患っている対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、急性放射線症候群を発症するリスクがある対象または急性放射線症候群を患っている対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎およびベーチェット病からなる群より選択される疾患または障害を患っている対象または該疾患もしくは該障害を発症するリスクがある対象におけるレクチン経路を阻害するために使用される。
レクチン経路補体活性化を阻害しかつMASP-1依存性代替経路補体活性化を阻害するための方法
別の局面において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢性黄斑変性症、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内血液凝固、血栓性微小血管症（HUS、aHUSおよび、TTPを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病を処置するか、それらを防止するか、またはそれらの重症度を軽減するために、レクチン経路補体活性化を阻害し、MASP-1依存性代替経路補体活性化も阻害するための方法であって、治療有効量の、本明細書において開示する生物活性ペプチド担持抗体または生物活性ペプチド担持ポリペプチド融合物を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、組成物が、レクチン補体経路の活性化を阻害し、かつ、代替経路のMASP-1依存性活性化（例えば、SGMI-1担持抗体もしくはSGMI-1-MASP-2抗体もしくはSGMI-1およびSGMI-2担持抗体）またはレクチン経路活性化およびMASP-1依存性代替経路活性化を阻害する能力を有する、その抗原結合性断片を阻害する、方法を提供する。
最近の発見により、MASP-1は代替経路活性化と関連づけられている。MASP-1は代替経路活性化酵素であるD因子をそのチモーゲン型からその酵素活性型へと変換することができる（Takahashi et al., J Exp Med 207:29-37 (2010)、Iwaki et al, J. Immunol 187:3751-58 (2011)参照）。さらにまた、MASP-1はチモーゲン型のMASP-3も活性化し（Megyeri et al, J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013); Degn et al. J. Immunol. 189(8):3957-69 (2012)）、それ自体はチモーゲンD因子を活性化すると共に、代替経路の別の必須構成要素である因子Bをその活性型へと切断することができる（Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751-58 (2011)）。
参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の米国特許出願第13/857,391号（US2013/0273053として公開）および米国特許出願第13/921,139号（US2013/0344073として公開）（これらはそれぞれ本願の譲受人であるOmeros Corporationに譲渡されている）に記載されているように、MASP-2依存性レクチン経路活性化およびMASP-1依存性代替経路補体活性化は、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢性黄斑変性症、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内血液凝固、血栓性微小血管症（HUS、aHUS、およびTTPを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病を含む数多くの急性病状および慢性病状の病理発生の一因になると意味づけられている。
したがって、一態様において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢性黄斑変性症、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内血液凝固、血栓性微小血管症（HUS、aHUS、およびTTPを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患または障害を患っている対象または該疾患または該障害を発症するリスクがある対象を処置するために、（i）MASP-1活性を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-1を含む抗体）、（ii）SGMI-1-MASP-2抗体、（iii）SGMI-1およびSGMI-2担持抗体、または（iv）第1のSGMI-1担持抗体および第2のSGMI-2担持抗体のうちの少なくとも1つを含む治療有効量の組成物を投与することによって、レクチン経路活性化およびMASP-1依存性代替経路活性化を阻害する方法を提供する。
送達方法
本発明のさまざまな態様によれば、組成物は、例えば動脈内投与、静脈内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、吸入投与、経鼻投与または皮下投与などによる全身送達用に製剤化されている。
本明細書において使用する場合、「全身送達」および「全身投与」という用語は、経口経路および非経口経路、例えば筋肉内（IM）、皮下、静脈内（IV）、動脈内、吸入、舌下、頬側、外用、経皮、経鼻、直腸内、膣内、および送達される抗体が単一または複数の意図した治療作用部位に効果的に分散されることになる他の投与経路を包含するものとするが、それらに限定されるわけではない。本組成物にとって好ましい全身送達経路として、静脈内、筋肉内、皮下、および吸入経路が挙げられる。本発明の特定組成物に用いられる選択された作用物質のための正確な全身投与経路が、1つには、所与の投与経路に関連する代謝的変換経路に対する作用物質の感受性を考慮して決定されることは理解されると考えられる。
生物活性ペプチド担持抗体および生物活性ペプチド担持ポリペプチドは、任意の適切な手段によって、それを必要とする対象に送達することができる。送達の方法としては、経口、肺、非経口（例えば筋肉内、腹腔内、静脈内（IV）、または皮下注射）、吸入（例えば微粉末製剤による）、経皮、経鼻、膣内、直腸内、または舌下投与経路が挙げられ、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。
本発明の組成物は、所望するレベルの治療効果が維持されるように決定された間隔で、定期的に全身性に投与することができる。例えば組成物は、皮下注射などによって、2週間ごと〜4週間ごとに、またはそれより低頻度の間隔で投与することができる。投与レジメンは、作用物質の組合せの作用に影響を及ぼしうるさまざまな要因を考慮して、医師が決定しうる。これらの要因には、処置される異常の進行の程度、患者の年齢、性別および体重、ならびに他の臨床的要因が含まれうる。個々の作用物質の投与量は、組成物に含まれる特定抗体ならびに任意の薬物送達媒体（例えば徐放性送達媒体）の存在および性質に依存してさまざまであるだろう。加えて、投与量は、投与頻度の変動および送達される作用物質の薬物動態挙動を考慮して調節することができる。
所与の対象における本発明のMASP-2阻害組成物およびMASP-1阻害組成物ならびにMASP-2阻害方法およびMASP-1阻害方法の治療有効性、ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイ法で決定することができる。補体は数多くの特異的産物を生成する。この十年間に、小活性化断片C3a、C4a、およびC5aならびに大活性化断片iC3b、C4d、Bb、およびsC5b-9を含むこれらの活性化産物の大半に関して、感度の高い特異的アッセイ法が開発され、商業的に入手することができるようになっている。これらのアッセイ法の大半は、断片上に露出するが、それらが形成される元となるネイティブタンパク質上には露出していない新しい抗原（ネオ抗原）と反応する抗体を用いており、そのことが、これらのアッセイ法を非常に簡単で特異性の高いものにしている。大半がELISA技術によるが、C3aおよびC5aにはラジオイムノアッセイ法が使用されることもまだある。これら後者のアッセイ法では、加工されていない断片と、循環中に見いだされる主要形態であるそれぞれの「desArg」断片とが、どちらも測定される。加工されていない断片とC5adesArgは、細胞表面受容体への結合によって迅速に取り除かれるので、極めて低濃度で存在するのに対し、C3adesArgは細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。C3aの測定は高感度で経路非依存的な補体活性化の指標になる。代替経路活性化は、Bb断片を測定することによって評価することができる。膜侵襲経路活性化の液相産物sC5b-9の検出は、補体が最後まで活性化されていることの証拠になる。レクチン経路と古典経路はどちらも同じ活性化産物C4aおよびC4dを生成するので、これら2つの断片の測定は、これら2つの経路のうちのどちらが活性化産物を生成したかについては、何の情報も与えない。
レクチン依存性補体活性化の阻害は、本発明による抗MASP-2抗体の投与の結果として起こる補体系の構成要素の以下の変化のうちの少なくとも1つを特徴とする: MASP-2依存性補体活性化系産物C4b、C3a、C5aおよび/またはC5b-9（MAC）の生成または生産の阻害、C4切断およびC4b沈着の減少、またはC3切断およびC3b沈着の減少。
製造物
別の局面において、本発明は、本明細書に記載する生物活性ペプチド担持抗体もしくはその抗原結合性断片または生物活性ペプチド担持ポリペプチド（例えばSGMI担持MASP-2抗体）を、ヒト対象への治療的投与に適した単位剤形で、例えば1mg〜5000mg、例えば1mg〜2000mg、例えば1mg〜1000mgの範囲の単位投与量で、例えば5mg、10mg、50mg、100mg、200mg、500mg、または1000mgの単位投与量で含有する製造物を提供する。いくつかの態様において、製造物は、容器と、その容器上の、またはその容器に添付された、ラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成させることができる。容器は、異常を処置するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は、本発明の生物活性ペプチド担持抗体もしくはその抗原結合性断片または生物活性ペプチド担持ポリペプチド（例えばSGMIペプチド担持MASP-2抗体またはその抗原結合性断片）である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の異常を処置するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書はさらに、患者への抗体組成物の投与に関する指示も含みうる。本明細書に記載する組み合わせ療法を含む製造物およびキットも考えられる。
前記に従って、本発明は以下の態様を特徴とする。
1.（i）SGMIコア配列が、X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
によるアミノ酸配列を含み、
X1がFまたはVであり、
X2がRまたはKであり、
X3がKまたはLであり、
X4がLまたはWであり、かつ
X5がYまたはNである、
該SGMIコア配列を含む領域と、
（ii）ヒトIgG1 Fcを含む領域と
を含み、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、単離されたポリペプチド。
2.前記SGMIコア配列を含むアミノ酸配列が、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、項目1に記載のポリペプチド。
3.MASP-1の活性を阻害する、項目1記載のポリペプチド。
4.前記SGMIコア配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:8のうちの少なくとも1つを含む、項目3記載のポリペプチド。
5.MASP-2の活性を阻害する、項目1に記載のポリペプチド。
6.前記SGMIコア配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:9〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、項目5に記載のポリペプチド。
7.前記ヒトIgG1 Fc領域がSEQ ID NO:12またはその変種を含む、項目1〜6のいずれかに記載のポリペプチド。
8.前記ヒトIgG1 Fc領域を含む領域が、前記SGMIコア配列を含む領域のアミノ末端に位置する、項目1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
9.前記ヒトIgG1 Fc領域を含む領域が、前記SGMIコア配列を含む領域のカルボキシ末端に位置する、項目1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
10.ヒトIgG1 Fcを含む領域が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つに直接融合されている、項目8に記載のポリペプチド。
11.ヒトIgG1 Fcを含む領域が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つに直接融合されている、項目9に記載のポリペプチド。
12.1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含み、該リンカー領域が、前記SGMIコア配列を含む領域とヒトIgG1 Fcを含む領域との間に含まれる、項目1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
13.前記リンカー配列が、SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:14のうちの少なくとも一方を含む、項目12に記載のポリペプチド。
14.前記SGMIコア配列を含む領域がSEQ ID NO:6を含む、項目1に記載のポリペプチド。
15.前記SGMIコア配列を含む領域がSEQ ID NO:9を含む、項目1に記載のポリペプチド。
16.SEQ ID NO:16、またはSEQ ID NO:16に対して少なくとも85％の同一性を有するその変種を含む、項目1に記載のポリペプチド。
17.SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:18に対して少なくとも85％の同一性を有するその変種を含む、項目1に記載のポリペプチド。
18.項目1〜17のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
19.項目18の核酸分子を含む、細胞。
20.項目1〜17のいずれかに記載のポリペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
21.請求項3または4に記載のMASP-1阻害ポリペプチドを含む、項目20に記載の薬学的組成物。
22.項目5または6に記載のMASP-2阻害ポリペプチドを含む、項目20に記載の薬学的組成物。
23.全身送達用に製剤化されている、項目20〜22のいずれかに記載の組成物。
24.動脈内投与用、静脈内投与用、頭蓋内投与用、筋肉内投与用、吸入投与用、経鼻投与用、または皮下投与用に製剤化されている、項目23に記載の組成物。
25.ヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害する方法であって、項目1〜17のいずれかに記載のポリペプチドを、該ヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、方法。
26.前記ポリペプチドが、MASP-1活性、MASP-2活性、または、MASP-1活性およびMASP-2活性を特異的に阻害するように選択される、項目25に記載の方法。
27.生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、
（a）少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を、
（i）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、もしくはCDR-H3のうちの少なくとも1つに、および/または
（ii）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、もしくはCDR-L3のうちの少なくとも1つに
移植する工程、ならびに
（b）該抗体が、単離された該生物活性ペプチドと比較して少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程
を含む、方法。
28.工程（a）が、ニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のCDR-H3に関心対象の前記生物活性ペプチドのアミノ酸配列を移植することを含む、項目27に記載の方法。
29.工程（a）が、ニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域のCDR-L1に関心対象の前記生物活性ペプチドのアミノ酸配列を移植することを含む、項目27に記載の方法。
30.工程（a）が、2つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を移植することを含み、1つの生物活性ペプチド配列が前記軽鎖可変領域に移植され、かつもう1つの生物活性ペプチド配列が前記重鎖可変領域に移植される、項目27に記載の方法。
31.前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と少なくとも1つのフレームワーク領域との間に少なくとも1つのリンカー配列を含める工程をさらに含む、項目27〜30のいずれかに記載の方法。
32.生物活性ペプチド担持抗体を作製する方法であって、
（a）少なくとも1つの関心対象の生物活性ペプチドのアミノ酸配列を、
（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に、および/または
（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に
融合する工程、ならびに
（b）該ペプチド担持抗体が、単離された該生物活性ペプチドと比較して少なくとも実質的に同じかまたは増加した生物学的活性を有するかどうかを判定する工程
を含む、方法。
33.生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該生物活性ペプチドアミノ酸配列が、
（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または
（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域
のうちの少なくとも1つに融合されており、ペプチド担持抗体が、単離された該生物活性ペプチドと実質的に同じ生物学的活性を有する、抗体またはその抗原結合性断片。
34.前記生物活性ペプチドが、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に融合されている、項目33に記載の単離された抗体。
35.前記生物活性ペプチドが、前記軽鎖定常領域および/または前記重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、項目33に記載の単離された抗体。
36.前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のアミノ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、項目34に記載の単離された抗体。
37.前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖定常領域または前記重鎖定常領域のカルボキシ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、項目33〜36のいずれかに記載の単離された抗体。
38.1つまたは複数のニワトリフレームワーク領域を含む、項目33〜37のいずれかに記載の単離された抗体。
39.完全にヒトであるかまたはヒト化されている、項目33〜37のいずれかに記載の単離された抗体。
40.前記軽鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:31、33、35、および36に示すVL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、およびVL-FR4アミノ酸配列、またはそれらの保存的配列変種を含む、項目38に記載の単離された抗体。
41.前記重鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:24、25、26、および28に示すVH-FR-1、VH-FR2、VH-FR3、およびVH-FR4アミノ酸配列、またはそれらの保存的配列変種を含む、項目38に記載の単離された抗体。
42.前記重鎖がヒトIgG1定常領域をさらに含む、項目33に記載の単離された抗体。
43.前記軽鎖がヒトλ軽鎖定常領域をさらに含む、項目33に記載の単離された抗体。
44.レクチン補体媒介性血管異常、虚血再灌流傷害、アテローム性動脈硬化、炎症性胃腸疾患、肺異常、体外再灌流術、筋骨格異常、腎臓異常、皮膚異常、臓器移植もしくは組織移植、神経系障害もしくは神経系損傷、血液障害、泌尿生殖器異常、糖尿病、化学療法もしくは放射線療法、悪性腫瘍、内分泌疾患、血液凝固異常、血栓性微小血管症、または眼科異常を処置するか、それらを防止するか、またはそれらの重症度を軽減するためにMASP-2依存性レクチン補体活性化および/またはMASP-1依存性レクチン補体活性化を阻害する際に使用するための医薬を製造する方法であって、MASP-2依存性レクチン経路活性化および/またはMASP-1依存性レクチン経路活性化を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-2-MASP-2抗体などのSGMI-2担持抗体および/またはSGMI-1 MASP-2抗体などのSGMI-1担持抗体、またはSGMI-1およびSGMI-2担持抗体）またはその抗原結合性断片の治療有効量を薬学的担体中で混和する工程を含む、方法。
45.発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢性黄斑変性症、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内血液凝固、血栓性微小血管症（HUS、aHUS、およびTTPを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤飲性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患または障害を処置するか、該疾患または該障害を防止するか、該疾患または該障害の重症度を軽減するためにレクチン経路活性化およびMASP-1依存性代替経路活性化を阻害する際に使用するための医薬を製造する方法であって、（i）MASP-1活性を阻害する能力を有する生物活性ペプチド担持抗体（例えばSGMI-1を含む抗体）、（ii）SGMI-1-MASP-2抗体、（iii）SGMI-1およびSGMI-2担持抗体、または（iv）第1のSGMI-1担持抗体および第2のSGMI-2担持抗体のうちの少なくとも1つの治療有効量を、薬学的担体中で混和する工程を含む、方法。
以下の実施例は、本発明を実施するための現在考えられる最善の方法を例示しているに過ぎず、本発明を限定していると解釈すべきでない。
実施例1
生物活性ペプチドを抗体またはその断片に移植または融合することによって阻害性MASPポリペプチドを生成するための戦略の概略
理論的根拠:それぞれSGMI-1およびSGMI-2と呼ばれるMASP-1およびMASP-2の特異的阻害物質の生成は、Heja et al, J Biol Chem 287:20290 (2012)およびHeja et al, PNAS 109:10498 (2012)に記載されており、これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。SGMI-1およびSGMI-2は、それぞれ36アミノ酸のペプチドであり、該ペプチドは、プロテアーゼ結合ループの8つの位置のうち6つが完全にランダム化された、サバクトビバッタプロテアーゼインヒビター2の変種のファージライブラリーより選択された。その後のインビトロ進化により、一桁nMのKI値を有する単一特異性阻害物質が得られた（Heja et al, J. Biol. Chem. 287:20290, 2012）。構造研究により、最適化されたプロテアーゼ結合ループは2つの阻害物質の特異性を画定する一次結合部位を形成することが明らかになった。拡張された二次および内部結合領域のアミノ酸配列は、2つの阻害物質に共通していて、接触表面の一因になっている（Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290）。機構的には、SGMI-1とSGMI-2はどちらも、古典経路には影響を及ぼさずに、補体活性化のレクチン経路を遮断する（Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498）。SGMI-1阻害物質とSGMI-2阻害物質のアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2016514456
上記SGMI配列では、以下にSEQ ID NO:5:
X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
として示すコアSGMI配列（下線部）が共通しており、
X1はFまたはVであり、
X2はRまたはKであり、
X3はKまたはLであり、
X4はLまたはWであり、かつ
X5はYまたはNである。
生物活性ペプチド（例えばSGMI-1（SEQ ID NO:6〜8として示す）およびSGMI-2（SEQ ID NO:9〜11として示す）から誘導されるSGMIペプチド）は、それぞれMASP-1およびMASP-2の高度に特異的な阻害物質である。しかし、これらは、ペプチドとして、生物学的研究および治療的応用に使用するには、その潜在力に制約がある。これらの制約に対処するために、本発明者らは、本明細書において述べるとおり、これらの生物活性ペプチドアミノ酸配列（すなわち生物活性ペプチドをコードするアミノ酸配列）をさまざまなスキャフォールドに移植するか、またはそれらをさまざまなスキャフォールドに融合した。すなわち、（1）実施例2で述べるように、ヒトIgG1 Fc領域のアミノ末端に融合してFc融合タンパク質を創製し、（2）実施例3で述べるように、非特異的キメラニワトリ（可変領域）-ヒト（IgG1定常領域およびIgλ定常領域）抗体のさまざまな相補性決定領域（CDR）に移植し、（3）実施例4で述べるように、非特異的キメラニワトリ（可変領域）-ヒト(IgG1定常領域およびIgλ定常領域）抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合し、（4）実施例7および実施例8で述べるように、ヒトMASP-2抗体などのヒト抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合した。
本明細書において述べるように、抗体スキャフォールドへの生物活性ペプチド配列の導入は、単離された生物活性ペプチドと比較して、少なくとも同じ生物活性またはより強い生物活性を有し、かつ例えばより長い半減期および抗体エフェクター機能などといった改良された治療特性を有する産物をもたらす。
実施例2
この実施例では組換えSGMI-Fc融合タンパク質の生成について述べ、これらの融合タンパク質がレクチン経路を阻害できることを実証する。
方法:SGMI-IgG1 Fc融合タンパク質を発現させるために、SGMI-1（SEQ ID NO:6）ペプチドおよびSGMI-2（SEQ ID NO:9）ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し（DNA 2.0）、発現ベクターpFUSE-hIgG1-Fc2（InvivoGen）のIL-2シグナル配列をコードするヌクレオチド配列とヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:12）をコードするヌクレオチド配列の間に挿入した。いくつかの態様では、SGMIペプチドとIgG1 Fc領域との間に任意選択の可動性ポリペプチドリンカー（例えばSEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:14）を含めた。
例示的な可動性ルポリペプチドリンカー配列:
Figure 2016514456
別の態様において、本発明はSGMIペプチドのアミノ末端に融合されたIgG1 Fc領域を含有する別形のSGMI-IgG1 Fc融合タンパク質も包含することに留意されたい。さらなる態様において、本発明は、コアSGMI配列（SEQ ID NO:5）を含みかつ少なくとも9アミノ酸残基から36アミノ酸残基までの長さを有する生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む別形のSGMI-IgG1 Fc融合タンパク質、例えばSGMI-1生物活性ペプチドまたはSGMI-2生物活性ペプチドのさまざまな短縮形（例えば、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のいずれかなどといった、SEQ ID NO:5のコア配列を含むSGMIペプチド）などを包含することにさらに留意されたい。
結果として得られるコンストラクトを以下に説明する。
ヒトIL-2シグナル配列、SGMI-1、リンカー、およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチド（pFUSE-SGMI-1Fc）をSEQ ID NO:15として示す。これは、SEQ ID NO:16として示す、SGMI-1（下線部）、リンカー領域（斜体部）およびヒトIgG1-Fc（合わせて「SGMI-1Fc」という）を含む成熟ポリペプチド融合物をコードしている。
SEQ ID NO:16
Figure 2016514456
ヒトIL-2シグナル配列、SGMI-2、リンカー、およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチド（pFUSE-SGMI-2Fc）をSEQ ID NO:17として示す。これは、SEQ ID NO:18として示す、SGMI-2（下線部）、リンカー領域（斜体部）およびヒトIgG1-Fc（合わせて「SGMI-2Fc」という）を含む成熟ポリペプチド融合物をコードしている。
SEQ ID NO:18
Figure 2016514456
組換えタンパク質の生産
2つの発現プラスミド（pFUSE-SGMI-1Fc（SEQ ID NO:15）およびpFUSE-SGMI-2Fc（SEQ ID NO:17）のうちの一方を、Freestyle 293-F細胞またはExpi293F細胞（Invitrogen）に、供給者のプロトコールに従って一過性にトランスフェクトした。37℃で4日間のインキュベーション後に、培養培地を収穫した。Fc融合タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
レクチン経路の活性化を測定するアッセイ法
Wieslab（登録商標）Complement System Screen（Euro Diagnostic、スウェーデン国マルメー）MBLアッセイ法は、レクチン経路を単離した条件下で、C5b-C9沈着を測定する。このアッセイ法を製造者の説明書に従って行い、Fc融合タンパク質を400nMの最終濃度で試験した。
図1は、SGMI-1Fc（SEQ ID NO:16）融合タンパク質またはSGMI-2Fc（SEQ ID NO:18）融合タンパク質の阻害活性を、アッセイキットと共に提供された陽性血清および陰性血清ならびにアイソタイプ対照抗体と比較して表す棒グラフである。図1に示すように、SGMI-1FcとSGMI-2Fcがどちらもレクチン経路の活性化を阻害するのに対し、アイソタイプ対照は阻害しない。
SGMI-1Fc融合タンパク質およびSGMI-2Fc融合タンパク質を、レクチン経路活性の別の尺度であるマンナン被覆96ウェルプレートでの1％血清からのC3bの沈着を阻害する能力についても試験した。SGMI-1FcおよびSGMI-2Fcを1％正常ヒト血清と共に氷上で1時間プレインキュベートしてから、マンナンで被覆されたウェルに加えた（2μg/ウェル）。C3b沈着を、Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011に記述されているように、ELISAで測定した。
図2は、0.15〜1000nMの濃度範囲にわたるアイソタイプ対照、SGMI-1FcまたはSGMI-2Fcを加えた1％正常ヒト血清について、C3b沈着のレベルをグラフで図解れており、SGMI-1FcとSGMI-2Fcがどちらも、マンナン被覆ELISAウェルにおける正常血清からのC3b沈着を、それぞれおよそ27nMおよび300nMのIC50値で阻害したことを実証している。
これらの結果は、SGMIペプチドのMASP-1阻害機能およびMASP-2阻害機能が、SGMI-1Fc融合タンパク質およびSGMI-2Fc融合タンパク質中で保たれていることを実証している。
実施例3
この実施例では、重鎖可変領域に関する少なくとも1つのCDR領域および/または軽鎖可変領域に関する少なくとも1つのCDR領域（例えばCDR-H3および/またはCDR-L1）に移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列（例えばSGMI-1またはSGMI-2）を含む、キメラニワトリ（V領域）/ヒト定常領域）抗体の生成について述べる。
背景/理論的根拠:
特定のポリペプチドの多様化の可逆的誘導を可能にする改変DT40細胞株DTLacOは、WO2009029315およびUS2010093033に記載されており、これらの特許文書はそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。DT40は、培養時にその重鎖および軽鎖免疫グロブリン（Ig）遺伝子を構成的に変異させることが知られているニワトリB細胞株である。他のB細胞と同様に、この構成的変異導入では、変異の標的がIg遺伝子のV領域、したがって発現された抗体分子のCDRである。DT40細胞における構成的変異導入は、各機能的V領域の上流にある多数の非機能的V遺伝子セグメント（偽V遺伝子;ΨV）をドナー配列として使用する遺伝子変換によって起こる。ΨV領域の欠失は、多様化の機序が遺伝子変換から、ヒトB細胞においてよく観察される機序である体細胞超変異へと切り替わる原因になることが、以前に示された。DT40ニワトリB細胞リンパ腫株は、エクスビボでの抗体進化にとって有望な出発点であることが示されている（Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)）。DT40細胞は培養時に（ヒトB細胞の20〜24時間と比べて）8〜10時間の倍加時間でロバストに増殖し、非常に効率のよい相同遺伝子標的指向化を支持する（Buerstedde, J.M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990)）。DT40細胞は、2つの異なる生理学的経路、すなわちそれぞれ鋳型変異および非鋳型変異を作り出す遺伝子変換と体細胞超変異とを、多様化に用いることができるので、非常に大きな潜在的V領域配列多様性を扱うことができる（Maizels, N. Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005)）。多様化された重鎖および軽鎖免疫グロブリン（Ig）は、細胞表面にディスプレイされたIgMの形態で発現される。表面IgMは構造がIgG分子に似た二価の形態を有する。特定の抗原に対する特異性を有するIgMをディスプレイする細胞は、固定化された可溶形の抗原または膜ディスプレイ形の抗原のいずれかに結合することによって単離することができる。しかし実際には、他の形質転換B細胞株と同様に、多様化は1％未満の生理学的速度で起こるので、抗体進化におけるDT40細胞の有用性には限界があった。
この実施例において使用した系では、WO2009029315およびUS2010093033に記述されているように、さらなる遺伝子修飾の可能性または遺伝子変換と体細胞超変異の両方が変異導入に寄与する潜在的可能性を犠牲にすることなくIg遺伝子多様化の速度が加速されるように、DT40細胞を工学的に操作した。多様化の速度が増加し、その結果として、細胞のライブラリーにおける結合特異性の複雑度が増加するように、2つの重要な改変がDT40に加えられた（Yabuki et al, PLoS One 7:e36032, 2012）。まず、Ig遺伝子多様化を、強力な大腸菌ラクトースオペレーター/リプレッサー調節ネットワークの制御下に置いた。強力な大腸菌ラクトースオペレーターが100個程度重合した反復配列からなる多量体（PolyLacO）を、再配列して発現したIgλ遺伝子およびIgH遺伝子の上流に、相同遺伝子標的指向化によって挿入した。こうすれば、多様化を調節するために、ラクトースリプレッサータンパク質（LacI）に融合された調節因子を、オペレーターDNAに対するラクトースリプレッサーの高いアフィニティー（kD＝10-14M）を用いて、LacO調節要素に繋留することができる。PolyLacOがIgλだけに組み込まれているDT40 PolyLacO-λR細胞は、工学的操作を加える前の親DT40細胞との比較で、Ig遺伝子多様化速度に5倍の増加を呈した（Cummings, W.J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)）。Igλ遺伝子とIgH遺伝子の両方に標的指向化されたPolyLacOを保因するように工学的に操作された細胞（「DTLacO」）では、多様化がさらに上昇した。DTLacO細胞は、親DT40 PolyLacO-λR LacI-HP1株に特有の2.8％との比較で、多様化速度が2.5倍〜9.2倍上昇していることが実証された。こうして、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の両方にPolyLacO要素を標的指向化することにより、多様化は、DT40親細胞株との比較で21.7倍加速された。Ig遺伝子座に調節因子を繋留することによって変異導入の頻度が変化するだけでなく、変異導入の経路を変化させて、より大きなユニーク配列変化のコレクションを創製することもできる（Cummings et al. 2007; Cummings et al. 2008）。次に、繋留された因子が加速するIg遺伝子多様化のための配列出発点の多様なコレクションを生成した。2ヶ月齢のニワトリから単離された再配列Ig重鎖可変領域を重鎖遺伝子座に標的指向化することによって、これらの多様な配列出発点を、DTLacOに付加した。これらの重鎖可変領域の付加により、抗体多様化のための107個の新しい出発点のレパートリーが創製された。これらの新しい出発点をDTLacO細胞株中に作ることによって、特定標的に結合するクローンの同定が可能になり、次に繋留された因子による迅速な親和性成熟が可能になる。親和性成熟後に、ヒトIgG1およびラムダ定常領域を含有する発現ベクター中に、成熟再配列重鎖および軽鎖可変配列（ニワトリフレームワーク領域とCDRとからなるVHおよびVλ）をクローニングすることにより、全長組換えキメラIgGを作製する。これらの組換えmAbはインビトロ応用およびインビボ応用に適しており、ヒト化のための出発点として役立つ。
DTLacO系を使用することにより、本発明者らは、ニワトリ重鎖可変領域（VH）のCDR-H3およびニワトリ軽鎖可変領域（VL）のCDR-L1に、25アミノ酸を越える大きなインサートを認めた。対照的に、マウスおよびヒトの場合、CDR-H3の平均サイズははるかに小さい（それぞれ9アミノ酸および12アミノ酸の平均サイズ）。これらニワトリCDRが潜在的に大きな配列のブロックを収容できることから、本発明者らは、生物活性ペプチドSGMI-1およびSGMI-2を活性なコンフォメーションで提示するCDRの能力を試験した。この戦略の価値にはいくつかの面がある:（1）SGMI阻害物質に抗体のインビボ安定性が付与される、これは治療的応用には重要な利点である;（2）生物活性ペプチド（SGMI-1配列またはSGMI-2配列など）を保持するVH遺伝子およびVL遺伝子のDTLacO細胞株への組み込みは、エクスビボ変異導入と、より大きなアフィニティーおよび有効性を持つV領域を選択するための手段になる;（3）第1の生物活性ペプチド（例えばSGMI-1）を抗体の長いCDRの1つに移植し、第2の生物活性ペプチド（例えばSGMI-2）を抗体の別の長いCDRに移植することにより、2つの機能的活性を有する（例えばMASP-1とMASP-2を阻害する）二重特異性抗体が創製される。この実施例では、ニワトリ可変領域のCDR-H3および/またはCDR-L1へのSGMI配列の移植と、阻害活性の保持とに関連して、本発明を説明するが、これらの結果により、本明細書で、ニワトリ可変領域を含む抗体の可変軽鎖および/または可変重鎖のCDR内での他の生物活性ペプチドのディスプレイおよび送達に関するパラダイムが確立されることは、当業者には理解されるであろう。
方法:
生物活性ペプチド（SGMI-1またはSGMI-2）をCDR-H3および/またはCDR-L1内に担持するキメラニワトリ-ヒト抗体を生成するために、参照により本明細書に組み入れられるWO2009029315およびUS2010093033に記載のニワトリ-ヒトキメラ重鎖および軽鎖抗体のpcDNA3（Invitrogen）系発現ベクターに、SGMI-1ペプチドおよびSGMI-2ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、In-Fusionクローニング（Clontech、表3に示すプライマー）によって挿入した。
（表３）SGMI-1およびSGMI-2ポリヌクレオチドをニワトリV領域にクローニングしてSGMI-1L-IgG1およびSGMI-2L-Igλキメラ抗体を得るために使用したPCRプライマー
Figure 2016514456
1.親ニワトリ重鎖可変領域のCDR-H3に移植されたSGMI-1およびSGMI-2
スキャフォールドとして使用するための出発親クローンとしてDT40ニワトリ重鎖可変領域を選び、図3および図4に示すように、そのCDR-H3領域に、SGMI-1ペプチド配列またはSGMI-2ペプチド配列を移植した。
図3は、CDR-H3内に移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む修飾形の可変重鎖ポリペプチド配列と比較した例示的親（DTLacO）可変重鎖ポリペプチド配列を図解している。図3に示すように、ニワトリ重鎖可変領域は、4つのフレームワーク領域（FR-1、FR-2、FR-3、およびFR-4）が隣接する3つのCDR（CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3）を含有している。驚いたことに本発明者らは、DT40親ニワトリ抗体（抗体スキャフォールドになる）の重鎖可変領域のCDRに生物活性ペプチド（例えばSGMI-1またはSGMI-2）を移植することにより、生物活性ペプチドの生物学的活性が、移植された生物活性ペプチド配列を含む親抗体に付与されることを見いだした。
親ニワトリ抗体は、さまざまなクローン間で保存されている重鎖および軽鎖のフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3、およびFR4）を提供する。どの親ニワトリ抗体クローンでもスキャフォールドとして使用するために選択することができる。いくつかの態様では、安定性などの望ましい性質に基づいて親ニワトリ抗体クローンを選択することができる。
例示的な親ニワトリ重鎖可変領域を以下に掲載する。図4に示すように、ネイティブCDR領域は親クローン間でさまざまであるが、CDR間のフレームワーク領域はニワトリにおいて保存されており、したがって、数種類の異なる親ニワトリ重鎖領域のアラインメントから導き出されたコンセンサスFR-1、FR-2、FR-3、およびFR-4配列も以下に掲載する。図4にさらに示すように、FR-3には、親クローン中のCDR-H3からN末端側に3番目の位置に、保存されたシステイン（C）残基があり（SEQ ID NO:26における31位のシステインに対応する）、これは、移植された生物活性ペプチドをCDR-H3に含有するコンストラクトのFR-3に保たれている。図4にさらに示すように、FR-4には、親クローン中のCDR-H3のすぐ隣の位置に保存されたトリプトファン（W）があり（SEQ ID NO:28における1位のトリプトファンに対応する）、これは、移植された生物活性ペプチドをCDR-H3に含有するコンストラクトのFR-4に保たれている。
DTLacO親ニワトリ（クローン＃1）重鎖可変領域:（DTLacO VH）（SEQ ID NO:23）
Figure 2016514456
VH CDR（31〜35（H1）、50〜66（H2）、および99-114（H3））に下線を付し、フレームワーク領域（1〜30（FR-1）、36〜49（FR-2）、67〜98（FR-3）および115〜125（FR-4））を斜体で記す。
DTLacO親ニワトリ(クローン＃2）重鎖可変領域（DTLacO VH）（SEQ ID NO:91）
Figure 2016514456
DTLacO VH由来の保存されたFR-1領域をSEQ ID NO:24として示す:
Figure 2016514456
。ここで、X＝RまたはGである。
DTLacO VH由来の保存されたFR-2領域をSEQ ID NO:25として示す:
Figure 2016514456
。ここで、X＝FまたはWである。
DTLacO VH由来の保存されたFR-3領域をSEQ ID NO:26として示す:
Figure 2016514456
。ここで、
X1＝VまたはLであり、かつ
X2＝AまたはTである。
CDR-H3に近接する保存されたFR-3隣接領域をSEQ ID NO:27として示す:
Figure 2016514456
。ここで、X＝AまたはTである。
DTLacO VH由来の保存されたFR-4領域をSEQ ID NO:28として示す:
Figure 2016514456
。
CDR-H3に近接する保存されたFR-4隣接領域をSEQ ID NO:29として示す:
WGHGT。
図4に示すように、いくつかの態様では、生物活性ペプチドのアミノ末端もしくは生物活性ペプチドのカルボキシ末端または両方の位置に、ペプチドリンカーを含めた。ペプチドリンカーは、例えば表4に示す配列など、任意の可動性リンカー配列であってよい。いくつかの態様では、リンカー配列を親クローン中のネイティブCDR-H3配列から得た。図4にさらに示すように、いくつかの態様では、ネイティブCDR-H3の元の16個のアミノ酸残基のうちの1残基を除く全てを生物活性ペプチド配列で置き換えた（例えばSGMI-1L参照）が、残り1個のアミノ酸配列はリンカーとして含まれている。いくつかの態様では、ネイティブCDR-H3の元の16個のアミノ酸残基のうちの8残基をC末端リンカーに残し（SGMI-1L5参照）、ネイティブCDR-H3の元の16個のアミノ酸残基のうちの14個までをC末端リンカー領域およびN末端リンカー領域に残した（SGMI-L7参照）。
2.親ニワトリ軽鎖可変領域のCDR-L1に移植されたSGMI-1およびSGMI-2
スキャフォールドとして使用するための出発親クローンとしてDT40ニワトリ軽鎖可変領域を選び、図5および図6に示すように、そのCDR-L1領域に、SGMI-1ペプチド配列またはSGMI-2ペプチド配列を移植した。
図5は、CDR-L1内に移植された生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む可変軽鎖ポリペプチド配列と比較した例示的親（DTLacO）可変軽鎖ポリペプチド配列を図解している。図5に示すように、ニワトリ軽鎖可変領域は、4つのフレームワーク領域（FR-1、FR-2、FR-3、およびFR-4）が隣接する3つのCDR（CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3）を含有している。可変重鎖ポリペプチド中のCDR-H3で得られた結果と同様に、本発明者らは、親ニワトリ抗体（抗体スキャフォールドになる）の可変軽鎖ポリペプチドのCDR-L1に生物活性ペプチド配列（例えばSGMI-1）を移植することにより、移植された生物活性ペプチド配列を含む親抗体が、生物活性ペプチドの生物学的活性を含む抗体に変換されることを見いだした（すなわち、コンストラクトSGMI-ILによってレクチン経路の阻害が観察された、非掲載データ）。
例示的な親ニワトリ軽鎖可変領域を以下に掲載する。図6に示すように、ネイティブCDR領域は親クローン間でさまざまであるが、CDR間のフレームワーク領域はニワトリにおいて保存されており、したがって、数種類の異なる親ニワトリ軽鎖領域のアラインメントから導き出されたコンセンサスFR-1、FR-2、FR-3、およびFR-4配列も以下に掲載する。図6にさらに示すように、FR-1には、親クローン中のCDR-L1のすぐ隣の位置に保存されたシステイン（C）残基があり（SEQ ID NO:31における23位のシステインに対応する）、これは、移植された生物活性ペプチドをCDR-L1に含有するコンストラクトのFR-1に保たれている。図6にさらに示すように、FR-2には、親クローン中のCDR-L1のすぐ隣の位置に保存されたトリプトファン（W）残基があり（SEQ ID NO:33における1位のトリプトファンに対応する）、これは、移植された生物活性ペプチドをCDR-L1に含有するコンストラクトのFR-2に保たれている。
DTLacOニワトリ（クローン＃1）軽鎖可変領域（DTLacO VL）（SEQ ID NO:30）
Figure 2016514456
VL CDR（21〜28（L1）、45〜51（L2）、および84〜92）に下線を付し、フレームワーク領域（1〜20（FR-1）、29〜44（FR-2）、52〜83（FR-3）および93〜102（FR-4））を斜体で記す。
DTLacOニワトリ（クローン＃2）軽鎖可変領域（DTLacO VL）（SEQ ID NO:92）
Figure 2016514456
DTLacO VL由来の保存されたFR-1領域をSEQ ID NO:31として示す:
Figure 2016514456
。ここで、
X1＝AまたはSであり、
X2＝LまたはPであり、
X3＝GまたはEである。
CDR-L1に近接する保存されたFR-1隣接領域をSEQ ID NO:32として示す:
Figure 2016514456
。
DTLacO VL由来の保存されたFR-2領域をSEQ ID NO:33として示す:
Figure 2016514456
。ここで、
X1＝AまたはSであり、
X2＝VまたはLである。
CDR-L1に近接する保存されたFR-2隣接領域をSEQ ID NO:34として示す:
Figure 2016514456
。ここで、X＝Y、F、またはHである。
DTLacO VL由来の保存されたFR-3領域をSEQ ID NO:35として示す:
Figure 2016514456
。ここで、
X1＝NまたはDであり、
X2＝KまたはLであり、
X3＝AまたはNであり、
X4＝NまたはEであり、
X5＝YまたはFである。
DTLacO VL由来の保存されたFR-4領域をSEQ ID NO:36として示す:
FGAGTTLTVL。
図6に示すように、いくつかの態様では、生物活性ペプチドのアミノ末端もしくは生物活性ペプチドのカルボキシ末端または両方の位置に、ペプチドリンカーを含めた。ペプチドリンカーは、例えば表4に示す配列など、任意の可動性リンカー配列であってよい。いくつかの態様では、リンカー配列を親クローン中のネイティブCDR-L1配列から得た。図6にさらに示すように、いくつかの態様では、ネイティブCDR-L1の元の13個のアミノ酸残基のうちの5個を生物活性ペプチドで置き換え（例えばSGMI-2L参照）、元のCDR-L1配列の一部分を生物活性ペプチド配列に隣接するペプチドリンカーとして残した。
（表４）CDRに生物活性ペプチドを移植するための例示的ペプチドリンカー
Figure 2016514456
いくつかの態様では、ニワトリ可変重鎖領域をヒトIgG1定常領域に融合して、ニワトリ/ヒトキメラ抗体を得る。例示的ヒトIgG1定常領域をSEQ ID NO:47として以下に掲載する。
ヒトIgG1定常領域（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）:SEQ ID NO:47
Figure 2016514456
いくつかの態様では、ニワトリ可変軽鎖領域をヒトラムダ軽鎖定常領域に融合して、ニワトリ/ヒトキメラ抗体を得る。例示的ヒトラムダ軽鎖定常領域をSEQ ID NO:48として以下に掲載する。
ヒトラムダ軽鎖定常領域（SEQ ID NO:48）
Figure 2016514456
結果として得られたポリヌクレオチドコンストラクトをpcDNA3-SGMI-1L-IgG1、-1M-IgG1、-1S-IgG1、および-1-L1-IgG1〜-1-L12-IgG1（SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77）ならびにpcDNA3-SGMI-2L-Igλ、-2M-Igλ、および-2S-Igλ（SEQ ID NO:79、81および83）と名付け、ポリペプチドを、図4に示すようにAb-SGMI-1L-IgG1、-1M-IgG1、-1S-IgG1、および-1-L1-IgG1〜-1-L12-IgG1（SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78）ならびに図6に示すようにAb-SGMI-2L-Igλ-、-2M-Igλ、および-2S-Igλ（SEQ ID NO:80、82、および84）と命名した。図6にさらに示すように、さまざまなリンカーの組合せおよびVernierゾーン残基（すなわちCDR-L1外）の1つの修飾を用いて、さらなるポリペプチドを生成した: Ab-SGMI-1-F1-Igλ、Ab-SGMI-1-F2-Igλ、Ab-SGMI-1-F3-Igλ、Ab-SGMI-1-F4-Igλ、Ab-SGMI-1-F5-Igλ、Ab-SGMI-1-F3.1-Igλ、Ab-SGMI-1-F3.2-Igλ、およびAb-SGMI-1-F3.3-Igλ。
Freestyle 293-F細胞またはExpi293F細胞（Invitrogen）に、以下のとおりの発現プラスミドの組合せを、一過性にトランスフェクトした:（a）pcDNA3-SGMI-1-IgG1-1L（et al.）＋DTLacO VLをコードする軽鎖プラスミド;（b）pcDNA3-SGMI-2-Igλ-L1（et. al.）＋DTLacO VHをコードする重鎖プラスミド;（c）pcDNA3-SGMI-1-IgG1-1L＋pcDNA3-SGMI-2-Igλ-L1、および（d）pcDNA3-SGMI-1-F1-Igλ〜pcDNA3-SGMI-1-F3.3-Igλ＋DTLacO VHをコードする重鎖プラスミド。37℃で4日間のインキュベーション後に、培養培地を収穫し、SGMI担持キメラ抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
結果:
CDR-H3に移植されたSGMI-1を含むキメラニワトリ/ヒト抗体
実施例2で述べたように、キメラ抗体の機能性を測定するためにWieslab（登録商標）Complement System Screen MBL経路を使用した。アッセイ法は、SGMI-1Fc（実施例2で述べたように生成）を陽性（阻害）対象として、2つ一組にして行った。対応アイソタイプ抗体を陰性対照として含めた。
図7Aおよび図7Bは、CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトmAbのMBL補体活性に対する阻害活性をグラフで図解している。アッセイ法は異なる時点で行ったので、データは2つの図に分けられている。図7Aおよび図7Bに示すように、CDR-H3内に移植されたSGMI-1を含有するキメラmAbのいくつかは、陽性SGMI1-Fc融合タンパク質（例えばAb-SGMI-1-L2、-L3、-L4、-L5、-L7、-L9、-L1、-L10、-L11および-L12）と類似する程度にC5b-C9沈着を阻害する。図4に示すように、これらのコンストラクトは、阻害ペプチドを抗体フレームワーク領域から分離する可動性リンカーの性質だけが異なっている。興味深いことに、CDR-H3に移植されたSGMI-1を有し、「Ab-SGMI-1L」と呼ばれる別のキメラmAbには阻害活性がない。図4に示すように、Ab-SGMI-1Lは、生物活性ペプチドとフレームワークセグメントとの間に1アミノ酸残基リンカーしか持っていない。
Ab-SGMI-1抗体を、レクチン経路阻害について、マンナン被覆ビーズでのC3b沈着のアッセイ法でも評価した。フローサイトメトリーによって活性の程度を決定するこのアッセイ法では、Wieslab（登録商標）アッセイ法より高い分解能が得られる。レクチン経路ビーズアッセイ法は以下のとおりに行った。直径7μMのポリスチレンビーズ(Bangs Laboratories;米国インディアナ州フィッシャーズ）に、炭酸-重炭酸緩衝液（pH9.6）中、4℃で一晩、マンナンを吸着させた。ビーズをPBSで洗浄し、10％血清に曝露するか、抗体または阻害物質と共にプレインキュベートした10％血清に曝露した。血清-ビーズ混合物を撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。血清インキュベーション後に、ビーズを洗浄し、抗C3cウサギポリクローナル抗体（Dako North America;米国カリフォルニア州カーピンテリア）およびPE-Cy5コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Southern Biotech;米国アラバマ州バーミングハム）による検出で、ビーズ上のC3沈着を測定した。染色手順後に、FACS Caliburサイトメーターを用いて、ビーズを解析した。前方散乱と側方散乱を使用し、均一な集団としてビーズにゲートをかけた。C3沈着はFL3陽性粒子として明白であった（FL-3または「FL-3チャネル」はサイトメーター上の第3のチャネルまたは赤色チャネルを示す）。各実験条件についてこの集団の幾何平均蛍光強度（MFI）を抗体/阻害物質濃度に対してプロットすることで、レクチン経路阻害を評価した。
図8Aおよび図8Bは、CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトmAbの、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性を、グラフで図解している。図8Aおよび図8Bに示すように、CDR-H3に移植されたSGMI-1を含有する抗体は全て、ビーズアッセイ法においてレクチン経路活性を阻害したが、その力価の程度はさまざまであった。
図8Cおよび図8Dは、CDR-L1に移植されたSGMI-1を含有するさまざまな代表的キメラニワトリ/ヒトmAbの、補体C3b沈着活性に対する用量依存的な阻害活性を、グラフで図解している。図8Cに示すように、CDR-L1に移植されたSGMI-1を含有する抗体は全て、ビーズアッセイ法においてレクチン経路活性を阻害し、「F1」、「F2」、および「F3」は、さまざまなリンカーの組合せを有し、場合によっては、（図6に示すように）CDR-L1に近接するFR-2中のVernierゾーン残基「Y」から「F」または「H」への修飾を有し、「F4」および「F5」より阻害活性が大きかった。図6に示すように、これらのコンストラクトは、阻害ペプチドを抗体フレームワーク領域から分離する可動性リンカーの性質とFR-2領域の第2位にあるアミノ酸とが異なっている。図6にさらに示すように、3アミノ酸の可動性リンカーをSGMIペプチドのアミノ末端に含有する最も強力な抗体Ab-SGMI-F3-Igλは、SGMI-1ペプチドのアミノ末端にある可動性リンカーのサイズをそれぞれ5アミノ酸、7アミノ酸および9アミノ酸に増加させたコンストラクト「F3.1」、「F3.2」および「F3.3」を創製することによって、さらに最適化された。図8Dに示すように、SGMI-1ペプチドのアミノ末端にある5アミノ酸の可動性リンカー（コンストラクト「F3.1」）が、最も強力なレクチン経路の阻害をもたらした。
Wieslab（登録商標）アッセイ法と比較して、このビーズアッセイ法では、抗体間の相違がより容易に識別されることに注目されたい。
要約すると、これらの結果は、ニワトリ抗体スキャフォールドのCDR-H3またはCDR-L1に生物活性ペプチドを移植することによって阻害性治療ポリペプチドを生成しうることを実証している。
CDR-L1に移植されたSGMI-2を含むキメラニワトリ/ヒト抗体
図9Aは、CDR-L1内に移植されたSGMI-2を含むキメラニワトリ/ヒトmAb（Ab-SGMI-2L-Igλ）が、Wieslab補体系MBL経路アッセイ法では阻害活性をほとんどまたは全くはっきしないことを、グラフで図解している。これらの結果から、（図7A、図7Bおよび図8A〜8Dに示すように）SGMI-1含有mAbの有効性に著しい影響を及ぼした生物活性ペプチドに隣接するリンカー要素には、最適化の余地が残る。
SGMI-1およびSGMI-2を含むキメラニワトリ/ヒト抗体
図9Aは、それぞれCDR-H3およびCDR-L1に移植されたSGMI-1およびSGMI-2を含むキメラニワトリ/ヒト抗体の活性も示している。Ab-SGMI-1-L1-IgG1/SGMI-2-L-Igλは、SGMI-1ペプチドだけを含有するmAb（Ab-SGMI-1-L1-IgG1）とほぼ同じ程度に強力である。この結果は、図9Bに示すように、フローサイトメトリーによるマンナン被覆ビーズアッセイ法を用いて確認された。総合すると、これらのデータは、CDR-H3に移植されたSGMI-1ペプチドが、CDR-L1に移植されたSGMI-2ペプチドが存在するかどうかにかかわらず、レクチン経路を阻害することを実証している。本明細書に記載する結果から、SGMI-2隣接リンカーをさらに最適化すれば、SGMI-1が媒介するMASP-1阻害活性を既に保持している抗体に、MASP-2阻害活性が付加されると予想される。
実施例4
この実施例では、キメラニワトリ/ヒト抗体の重鎖および軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された1つまたは複数の生物活性ペプチド（例えばSGMI-1またはSGMI-2）を含むキメラ抗体の生成について述べる。
理論的根拠:
実施例2および実施例3で実証したように、SGMI-1ペプチドとSGMI-2ペプチド（およびそれらの短縮型変種）の阻害機能はSGMI-Fcタンパク質において保存され、またSGMI-1については、完全抗体のCDR領域内にディスプレイした時にも保存された。この実施例では、キメラニワトリ/ヒト抗体の抗体重鎖または抗体軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された時に、SGMIペプチドが活性を保つかどうかを判定するために実験を行った。
（表５）生物活性ペプチドSGMI-1およびSGMI-2が重鎖または軽鎖のN末端またはC末端に融合されているキメラニワトリ/ヒト抗体
Figure 2016514456
表5中の略号:
「HC-N」＝重鎖のアミノ末端
「HC-C」＝重鎖のカルボキシル末端
「LC-N」＝軽鎖のアミノ末端
「LC-C」＝軽鎖のカルボキシル末端
表5に示すN末端融合物については、生物活性ペプチドとニワトリ可変領域との間に、ペプチドリンカー（SEQ ID NO:14）を付加した。
表5に示すC末端融合物については、定常領域と生物活性ペプチドとの間にペプチドリンカー（SEQ ID NO:37）を付加し、C末端SGMIペプチドを分解から保護するために融合ポリペプチドのC末端に第2のペプチド「GSGA」を付加した。これらの融合物コンストラクトを図10に模式的に図解する。
図11は、Wieslabアッセイ法におけるN末端ペプチドおよびC末端ペプチドの阻害活性を図解している。陽性対照および陰性対照と比較すると、全ての融合mAbがC5b-9沈着を阻害した。1つの融合mAbを除く、つまり軽鎖のC末端に融合されたSGMI-1を除く全てが、対照SGMI-1Fc-融合タンパク質および対照SGMI-2Fc-融合タンパク質の阻害レベルに匹敵する阻害レベルを呈した。これらのN末端およびC末端ペプチドmAb融合物のいくつかを、実施例3で述べたフローサイトメトリーによるマンナン被覆ビーズアッセイ法でも試験し、類似する結果を得た（非掲載データ）。これらの抗体は、SGMI-1とSGMI-2の組合せを担持する二重特異性抗体の開発に使用しうる。
実施例5
この実施例では、MASP-2に結合し、免疫系の古典（C1q依存性）経路構成要素を完全な状態で残したままレクチン媒介性補体活性化を阻害する完全ヒトscFv抗体の、ファージディスプレイを用いた同定について述べる。
概略:
MASP-2は、MBLおよびフィコリンに対する結合部位、セリンプロテアーゼ触媒部位、タンパク質分解基質C2に対する結合部位、タンパク質分解基質C4に対する結合部位、MASP-2チモーゲンの自己活性化のためのMASP-2切断部位、および2つのCa＋＋結合部位を含む、多くの個別の機能ドメインを持つ複雑なタンパク質である。参照により本明細書に組み入れられるWO 2012/151481に記載されているように、MASP-2に高いアフィニティーで結合するscFv抗体断片が同定され、同定されたscFv断片は、それらがMASP-2の機能的活性を遮断することができるかどうかを判定するために、機能アッセイ法において試験された。同定された抗MASP-2 scFv抗体断片の「遮断活性」の評価には、レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法が使用された。レクチン経路におけるMASP-2の主たる生理学的役割が、レクチン媒介性補体経路の次の機能的構成要素、すなわちレクチン経路C3コンバターゼを生成することであることは、公知である。レクチン経路C3コンバターゼは、C3をC3aとC3bとにタンパク質分解的に切断する重要な酵素複合体（C4b2a）である。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ（C4b2a）の構造的構成要素ではないが、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質構成要素（C4b、C2a）を生成するには、MASP-2の機能的活性が必要である。さらにまた、MASP-2がレクチン経路C3コンバターゼを生成するには、上に挙げたMASP-2の個別の機能的活性の全てが必要であると思われる。これらの理由から、抗MASP-2 Fab2およびscFv抗体断片の「遮断活性」を評価する際に使用するための好ましいアッセイ法は、レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法であると考えられる。
本明細書において述べるように、例えばファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定される完全ヒトMASP-2抗体などのMASP-2抗体は、阻害活性が強化されたMASP-2抗体-SGMI融合物を生成するためのスキャフォールドとして使用することができる。
MASP-2阻害性スキャフォールド抗体の生成
WO2012/151481に記述されているように、MASP-2阻害抗体の可変軽鎖断片と可変重鎖断片を、scFvフォーマットと全長IgGフォーマットの両方で単離した。ヒトMASP-2抗体は、免疫系の古典（C1q依存性）経路構成要素を完全な状態で残したまま、レクチン経路が媒介する代替補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害するのに有用である。いくつかの態様において、MASP-2阻害性スキャフォールド抗体は以下の特徴を有する:（a）ヒトMASP-2に対する高いアフィニティー（例えば10nMまたはそれ未満のKD）、および（b）90％ヒト血清中でMASP-2依存性補体活性を30nMまたはそれ未満のIC50で阻害する。
方法:
触媒的に不活性な全長MASP-2の発現:
リーダー配列を持つヒトMASP-2ポリペプチド（SEQ ID NO:4）をコードするヒトMASP-2の全長cDNA配列（SEQ ID NO:3）を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下での真核発現を駆動する哺乳類発現ベクターpCI-Neo（Promega）（Kaufman R.J. et al, Nucleic Acids Research 7:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)に記載されている）にサブクローニングした。
触媒的に不活性なヒトMASP-2Aタンパク質を生成するために、参照により本明細書に組み入れられるUS2007/0172483に記載されているように、部位指定変異導入を行った。アガロースゲル電気泳動およびバンド調製によってPCR産物を精製し、標準的テーリング手法を用いて単一アデノシンオーバーラップを生成した。次に、アデノシンテールを持つMASP-2AをpGEM（登録商標）-T Easyベクター（Promega）にクローニングし、大腸菌に形質転換した。ヒトMASP-2Aをさらに、哺乳類発現ベクターpED（SinoBio）またはpCI-Neo（Promega）のいずれかにサブクローニングした。
標準的リン酸カルシウムトランスフェクション法（Maniatis et al., 1989）を用いて、上述のMASP-2A発現コンストラクトをDXB1細胞にトランスフェクトした。調製物が他の血清タンパク質によって汚染されていないことを保証するために、MASP-2Aを無血清培地で生産した。コンフルエント細胞から2日目ごとに培養培地を収穫した（合計4回）。組換えMASP-2Aのレベルは平均でおよそ1.5mg/リットル-培養培地であった。MASP-2A（上述のSer-Ala変異体）をMBP-A-アガロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
パンニング/scFv変換およびフィルタースクリーニングによって同定されたScFv候補クローンに対するMASP-2A ELISA
scFvフォーマットのヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを、抗原パンニングに続いて自動抗体スクリーニングおよび選択に供することで、ヒトMASP-2タンパク質に対する高アフィニティーscFv抗体を同定した。HISタグ付きまたはビオチンタグ付きMASP-2Aに対するscFvファージライブラリーのパンニングを3ラウンド行った。第3ラウンドのパンニングは、まずMBLで溶出し、次にTEA（アルカリ性）で溶出した。標的MASP-2Aに対するscFv断片をディスプレイしているファージの特異的濃縮をモニタリングするために、固定化MASP-2Aに対するポリクローナルファージELISAを行った。第3パンニングラウンドからのscFv遺伝子をpHOG発現ベクターにクローニングし、MASP-2Aに対する特異的クローンを探すために、小スケールフィルタースクリーニングに供した。
第3ラウンドのパンニングからのscFv断片をコードするプラスミドを含有する細菌コロニーをつついて、ニトロセルロースメンブレン上に格子状に置き、非誘導培地上で一晩成長させることで、マスタープレートを製作した。第3パンニングラウンドから合計18,000個のコロニーを、半分は競合的溶出物からまた半分はその後のTEA溶出物からつついて解析した。MASP-2Aに対するscFvファージミドライブラリーのパンニングとそれに続くscFv変換ならびにフィルタースクリーニングにより、137個の陽性クローンを得た。MASP-2結合に関するELISAアッセイ法では137クローン中108クローンが陽性であり、そのうちの45クローンを、正常ヒト血清中でMASP-2活性を遮断する能力について、さらに解析した。
レクチン経路C3コンバターゼの形成の阻害を測定するためのアッセイ法
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を用いて、MASP-2 scFv候補クローンの「遮断活性」を評価した。レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質構成要素（C4b、C2a）を生成するには、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要である。したがって、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 scFv（すなわち、遮断性MASP-2 scFv）は、レクチン経路C3コンバターゼのデノボ形成を阻害すると考えられる。C3は、その構造の一部として、珍しい高反応性チオエステル基を含有している。このアッセイ法ではC3コンバターゼによってC3が切断されると、C3b上のそのチオエステル基は、プラスチックウェルの底に固定化された高分子上のヒドロキシル基またはアミノ基とエステル結合またはアミド結合による共有結合を形成することができ、よってELISAアッセイ法におけるC3bの検出を容易にする。
酵母マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子である。C3コンバターゼの形成を測定するための下記の方法では、マンナンで被覆されたプラスチックウェルを、希釈したヒト血清と共にインキュベートすることで、レクチン経路を活性化した。次に、ウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたC3bを標準的なELISA法を用いてアッセイした。このアッセイ法において生成したC3bの量は、レクチン経路C3コンバターゼのデノボ形成を直接反映している。このアッセイ法では、選択した濃度のMASP-2 scFvクローンを、C3コンバターゼ形成とそれに続くC3b生成を阻害するそれらの能力について試験した。
方法:
上述のように同定された45個の候補クローンを発現させ、精製し、同じ原液濃度に希釈し、それを、Ca＋＋およびMg＋＋含有GVB緩衝液（CaMgGVB:4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4）で再び希釈することで、全てのクローンが同じ量の緩衝液を含むことを保証した。scFvクローンを2μg/mLの濃度でそれぞれ3つ一組にして試験した。陽性対照はOMS100 Fab2とし、0.4μg/mLで試験した。scFv/IgGクローンの存在下および非存在下でC3b形成をモニタリングした。
マンナンを50mM炭酸緩衝液（15mM Na2CO3＋35mM NaHCO3＋1.5mM NaN3）pH9.5で20μg/mL（1μg/ウェル）の濃度に希釈し、ELISAプレート上に4℃で一晩コーティングした。翌日、マンナン被覆プレートを200μlのPBSで3回洗浄した。次に、100μlの1％HSAブロッキング溶液をウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを200μlのPBSで3回洗浄し、試料を添加するまで200μlのPBSと共に氷上に保存した。
正常ヒト血清をCaMgGVB緩衝液で0.5％に希釈し、この緩衝液にscFvクローンまたはOMS100 Fab2陽性対照を3つ一組にして0.01μg/mL、1μg/mL（OMS100対照のみ）および10μg/mLの濃度で加え、氷上で45分間プレインキュベートしてから、ブロッキングしたELISAプレートに加えた。37℃で1時間のインキュベーションによって反応を開始し、プレートを氷浴に移すことによって反応を停止した。ウサギα-マウスC3c抗体と、それに続くヤギα-ウサギHRPとによって、C3b沈着を検出した。陰性対照は抗体を含まない緩衝液とし（OMS100なし＝最大C3b沈着）、陽性対照はEDTAを含む緩衝液とした（C3b沈着なし）。ウェルがマンナンを含まない点以外は同じアッセイ法を行うことによって、バックグラウンドを決定した。マンナンなしのウェルから得られたバックグラウンドシグナルを、マンナン含有ウェルにおけるシグナルから差し引いた。カットオフ基準を、無関係なscFvクローン（VZV）および緩衝液のみの活性の半分に設定した。
結果:カットオフ基準に基づいて、13個のクローンが、MASP-2の活性を遮断することを見いだした。＞50％経路抑制をもたらす13個のクローンを全て選択し、配列決定したところ、10個のユニークなクローンが得られた。10個のクローンは全て同じ軽鎖サブクラスλ3を有するが、重鎖サブクラスは3種類、すなわちVH2、VH3、およびVH6であることがわかった。機能アッセイ法では、10個の候補scFvクローンのうちの5個が、0.5％ヒト血清において25nMという目標基準を下回るIC50 nM値を与えた。
（表６）図14Aおよび図14Bならびに図15Aおよび図15Bに示すScFvクローンの配列
Figure 2016514456
図14Aおよび図14Bは、全長scFvクローン17D20、18L16、4D9、17L20、17N16、3F22、および9P13のアミノ酸配列アラインメントを示す。これらのscFvクローンは、重鎖可変領域（aa1〜120）、リンカー領域（aa121〜145）および軽鎖可変領域（aa146〜250）を含む。図14Aに示すように、最も活性なクローンの重鎖領域（残基1〜120）のアラインメントにより、それぞれVH2遺伝子ファミリーおよびVH6遺伝子ファミリーに属する2つの異なるグループが明らかになった。図14Aにさらに示すように、VH2クラスのクローン（17D20、18L16、および4D9）については、VH領域が全120アミノ酸領域中20aaの位置に可変性を有した（すなわち83％の同一性）。
図14Aにさらに示すように、VH6クラスのクローン、17L20、17N16、3F22、および9P13については、VH領域が全120アミノ酸領域中18アミノ酸の位置に可変性を有した（すなわち85％の同一性）。図15Aおよび図15Bは、scFvクローン17D20、17N16、18L16および4D9の配列アラインメントを示す。これらのscFvクローンは、重鎖可変領域（aa1〜120）、リンカー領域（aa121-145）および軽鎖可変領域（aa146〜250）を含む。
これらのscFvクローンを、1％ヒト血清中、1000nM scFv精製タンパク質を使用し、C3b沈着を阻害する能力について、機能的力価を試験した。機能的力価および異なるVH遺伝子ファミリーに基づいて、17N16、17D20および18L16を親和性成熟用に選んだ。
母クローン17N16、17D20、および18L16の鎖シャフリングおよび親和性成熟
改良された力価を有する抗体を同定するために、上述のように同定された3つの母scFvクローン17N16、17D20、および18L16を、軽鎖シャフリングに供した。このプロセスでは、6人の健常ドナーに由来するナイーブヒトラムダ軽鎖（VL）のライブラリーとペアにした、母クローンのそれぞれのVHからなるコンビナトリアルライブラリーを生成し、次にこのコンビナトリアルライブラリーを、改良された結合アフィニティーおよび/または機能性を有するscFvクローンについて、スクリーニングした。表7に示すように母クローンより高い機能的活性とアフィニティーとを有する娘クローンが同定された。
（表７）代表的なscFv娘クローンの機能的力価のIC50（nM）での比較
Figure 2016514456
重鎖可変領域
（表８Ａ）重鎖（aa1〜20）
Figure 2016514456
（表８Ｂ）重鎖（aa21〜40）
Figure 2016514456
（表８Ｃ）重鎖（aa41〜60）
Figure 2016514456
（表８Ｄ）重鎖（aa61〜80）
Figure 2016514456
（表８Ｅ）重鎖（aa81〜100）
Figure 2016514456
（表８Ｆ）重鎖（aa101〜118）
Figure 2016514456
上記の表7および表8A〜Fに列挙した母クローンと娘クローンについて重鎖可変領域（VH）配列を以下に掲載する。
Kabat CDR（31〜35（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3））を太字で記し、Chothia CDR（26〜32（H1）、52〜56（H2）および95〜101（H3））に下線を付す。
17D20重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:109）:
Figure 2016514456
17D20_35VH-21N11VL重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:111）
Figure 2016514456
17N16重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:112）
Figure 2016514456
（表９）重鎖CDR
Figure 2016514456
Figure 2016514456
軽鎖可変領域
（表１０Ａ）軽鎖（aa1〜20）
Figure 2016514456
（表１０Ｂ）軽鎖（aa21〜40）
Figure 2016514456
（表１０Ｃ）軽鎖（aa41〜60）
Figure 2016514456
（表１０Ｄ）軽鎖（aa61〜80）
Figure 2016514456
（表１０Ｅ）軽鎖（aa81〜100）
Figure 2016514456
（表１０Ｆ）軽鎖（aa101〜120）
Figure 2016514456
上記の表7および表10A〜Fに列挙した母クローンと娘クローンについて軽鎖可変領域（VL）配列を以下に掲載する。
Kabat CDR（24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3））を太字で記し、Chothia CDR（24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3））に下線を付す。これらの領域はKabatシステムでナンバリングしてもChothiaシステムでナンバリングしても同じである。
17D20m軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:113）
Figure 2016514456
17D20m_d3521N11軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:115）
Figure 2016514456
17N16m軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:116）
Figure 2016514456
17N16m_d17N9軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:118）
Figure 2016514456
（表１１）軽鎖CDR（Kabat/chothia）
Figure 2016514456
Figure 2016514456
候補クローンのIgG4、IgG4/S228P、およびIgG2フォーマットへの変換
母クローンおよび娘クローンをIgG4、IgG4/S228Pヒンジ変異体、およびIgG2フォーマットに変換し、これらの抗体の機能性をC3アッセイ法で評価した。血清中安定性を増加させるためにS228Pヒンジ領域変異体を含めた（Labrijn A.F. et al, Nature Biotechnology 27:767 (2009)参照）。IgG4、IgG4/S228PおよびIgG2フォーマットに変換した候補クローンの配列を以下のとおり掲載する。
SEQ ID NO:158:野生型IgG4をコードするcDNA
SEQ ID NO:159:野生型IgG4ポリペプチド
SEQ ID NO:160:IgG4変異体S228PをコードするcDNA
SEQ ID NO:161:IgG4変異体S228Pポリペプチド
SEQ ID NO:162:野生型IgG2をコードするcDNA
SEQ ID NO:163:野生型IgG2ポリペプチド
（表１２）代表的なMASP-2抗体（ヒト）
Figure 2016514456
エピトープマッピング
どちらもヒトMASP-2に高いアフィニティーで結合し、機能的補体活性を遮断する能力を有することが実証されている、MASP-2抗体OMS100およびmAb＃6を、WO2012/151481に記載されているドットブロット解析によって、エピトープ結合について解析した。その結果、mAb＃6抗体とOMS100抗体はMASP-2に対して高度に特異的であり、MASP-1およびMASP-3には結合しないことが明らかになった。これらの抗体は共に、MAp19にも、MASP-2のCCP1ドメインを含有しないMASP-2断片にも結合しなかったことから、結合部位はCCP1を包含するとの結論が導かれる。
実施例6
この実施例では、MASP-2に結合してレクチン媒介性補体活性化を阻害するラットモノクローナル抗体の同定について述べる。
方法:
参照により本明細書に組み入れられるWO2004/106384に記載されているように、3μgの組換えヒトMASP-2 CCP1-CCP2-SPドメインを雌Wistarラットに注射し、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ上清を抗MASP-2抗体に関してスクリーニングすることによって、モノクローナルMASP-2抗体を生じさせた。MASP-2が触媒するC4沈着の阻害についてスクリーニングすることによって阻害抗体を同定した。完全ヒト血清中でC4沈着を阻害する能力を有する代表的なMASP-2阻害性モノクローナル抗体（IC50＝0.0318ng/μl対Eu/Eumax）が同定された。これは、European Collection of Cell Cultures（ECACC）（英国ウィルトシャー州ソールズベリー）に受託番号03050904として2003年5月9日に寄託された、抗体NimoAb101（「4A8」ともいう」）を生産するハイブリドーマ細胞株によって生産された。ウェスタンブロットによるエピトープマッピングで、NimoAb101はMASP-2のB鎖上の線状エピトープを認識することが示された。抗体NimoAb101のVH領域およびVL領域の配列を以下に掲載する。
NimoAb101:重鎖可変領域（ラット）（SEQ ID NO:164）
Figure 2016514456
NimoAb101:軽鎖可変領域（ラット）（SEQ ID NO:165）
Figure 2016514456
（表１３）NimoAb101のCDR
Figure 2016514456
実施例7
この実施では、ヒトMASP-2抗体の重鎖および/または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端あるいは重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された1つまたは複数のSGMI阻害ペプチド（例えばSGMI-1またはSGMI-2）を含むMASP-2抗体の生成について述べる。
理論的根拠:
実施例2で実証したように、SGMI-1ペプチドおよびSGMI-2ペプチドの阻害機能は、SGMI-Fcタンパク質中で保存されることが決定された。この実施例で述べるように、完全ヒトMASP-2阻害抗体などのMASP-2抗体スキャフォールドの重鎖または軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された場合に、SGMIペプチドが活性を保つかどうかを判定するために、およびその結果得られるMASP-2抗体/SGMIペプチド融合物が裸の（SGMIを含有しない）MASP-2スキャフォールド抗体と比較して強化された阻害活性を有するかどうかをさらに判定するために、実験を行った。
図16に、重鎖可変領域のN末端（A）、および/または軽鎖可変領域のN末端（B）、および/または重鎖定常領域のC末端（C）、および/または軽鎖定常領域のC末端（D）に融合された1つまたは複数のSGMIペプチドを含む例示的MASP-2抗体スキャフォールドを図解する。
図17Aに、重鎖可変領域のN末端および/または軽鎖可変領域のC末端に融合されたSGMIペプチドを含むMASP-2 scFv抗体スキャフォールドを図解する。図17Bに、軽鎖可変領域のN末端および/または重鎖可変領域のC末端に融合されたSGMIペプチドを含むMASP-2 scFV抗体スキャフォールドを図解する。
方法:
MASP-2抗体スキャフォールドに融合された時のSGMIペプチドの阻害活性を調べるために、図18に図解するとおり、実施例5で述べたように生成した代表的なMASP-2阻害抗体mAb＃6の重鎖または軽鎖のN末端またはC末端のいずれかに融合されたSGMI-1またはSGMI-2をコードする8つの発現コンストラクトを生成した。
（表１４）MASP-2抗体/SGMI融合物
Figure 2016514456
Figure 2016514456
Figure 2016514456
表14中の略号:
「H-N」＝重鎖のアミノ末端
「H-C」＝重鎖のカルボキシル末端
「L-N」＝軽鎖のアミノ末端
「L-C」＝軽鎖のカルボキシル末端
「M2」＝MASP-2抗体スキャフォールド（代表的なmAb＃6）
表14に示すN末端融合物については、SGMIペプチドと可変領域との間にペプチドリンカー（「GTGGGSGSSS」SEQ ID NO:172）を付加した。
表14に示すC末端融合物については、定常領域とSGMIペプチドとの間にペプチドリンカー（「AAGGSG」SEQ ID NO:173）を付加し、C末端SGMIペプチドを分解から保護するために融合ポリペプチドのC末端に第2のペプチド「GSGA」を付加した。これらの融合物コンストラクトを図16および図18に模式的に図解する。
以下の代表的なMASP-2抗体/SGMI融合物について、アミノ酸配列を下記に掲載する。
H-M2ab6-SGMI-1-N:（SEQ ID NO:174によってコードされているSEQ ID NO:175）:
Figure 2016514456
［491aaタンパク質、aa1〜36＝SGMI-1、aa37〜46＝リンカー、aa47〜164＝MASP-2 ab＃6の重鎖可変領域、aa165〜491＝ヒンジ変異を伴うIgG4定常領域］
H-M2ab6-SGMI-2-N（SEQ ID NO:176によってコードされているSEQ ID NO:177）:
Figure 2016514456
［491aaタンパク質、aa1〜36＝SGMI-2（下線部）、aa37〜46＝リンカー（斜体部）、aa47〜164＝MASP-2 ab＃6の重鎖可変領域（下線部）、aa165〜491＝ヒンジ変異を伴うIgG4定常領域］
H-M2ab6-SGMI-1-C（SEQ ID NO:178によってコードされているSEQ ID NO:179）:
Figure 2016514456
［491aaタンパク質、aa1〜118＝MASP-2 ab＃6の重鎖可変領域（下線部）、aa119〜445＝ヒンジ変異を伴うIgG4定常領域、aa446〜451＝第1のリンカー（斜体部）、aa452〜487＝SGMI-1、aa488〜491＝第2のリンカー（斜体部）］
H-M2ab6-SGMI-2-C（SEQ ID NO:180によってコードされているSEQ ID NO:181）:
Figure 2016514456
［491aaタンパク質、aa1〜118＝MASP-2 ab＃6の重鎖可変領域（下線部）、aa119〜445＝ヒンジ変異を伴うIgG4定常領域、aa446〜451＝第1のリンカー（斜体部）、aa452〜487＝SGMI-2、aa488〜491＝第2のリンカー（斜体部）］
L-M2ab6-SGMI-1-N（SEQ ID NO:182によってコードされているSEQ ID NO:183）:
Figure 2016514456
［258aaタンパク質、aa1〜36＝SGMI-1（下線部）、aa37〜46＝リンカー（斜体部）、aa47〜152＝MASP-2 ab＃6の軽鎖可変領域（下線部）、aa153〜258＝ヒトIgラムダ定常領域］
L-M2ab6-SGMI-2-N（SEQ ID NO:184によってコードされているSEQ ID NO:185）:
Figure 2016514456
［258aaタンパク質、aa1〜36＝SGMI-2（下線部）、aa37〜46＝リンカー（斜体部）、aa47〜152＝MASP-2 ab＃6の軽鎖可変領域（下線部）、aa153〜258＝ヒトIgラムダ定常領域］
L-M2ab6-SGMI-1-C（SEQ ID NO:186によってコードされているSEQ ID NO:187）:
Figure 2016514456
［258aaタンパク質、aa1〜106＝MASP-2 ab＃6の軽鎖可変領域（下線部）、aa107〜212＝ヒトIgラムダ定常領域、aa213〜218＝第1のリンカー、aa219〜254＝SGMI-1、aa255〜258＝第2のリンカー］
L-M2ab6-SGMI-2-C（SEQ ID NO:188によってコードされているSEQ ID NO:189）:
Figure 2016514456
［258aaタンパク質、aa1〜106＝MASP-2 ab＃6の軽鎖可変領域（下線部）、aa107〜212＝ヒトIgラムダ定常領域、aa213〜218＝第1のリンカー、aa219〜254＝SGMI-2、aa255〜258＝第2のリンカー］
機能アッセイ法:
8つのMASP-2-SGMI融合抗体コンストラクトをExpi293F細胞（Invitrogen）中で一過性に発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、10％正常ヒト血清中で、後述のマンナン被覆ビーズアッセイ法におけるC3b沈着の阻害について試験した。（注:H-M2-SGMI-1-Cコンストラクトは十分に発現しなかったので、このアッセイ法では試験することができなかった。）
実験番号1: マンナン被覆ビーズアッセイ法におけるC3b沈着に関するMASP-2-SGMI融合物の試験
MASP-2-SGMI融合抗体を、マンナン被覆ビーズでのC3b沈着のアッセイ法において、レクチン経路阻害について評価した。フローサイトメトリーによって活性の程度を決定するこのアッセイ法では、Wieslab（登録商標）アッセイ法より高い分解能が得られる。レクチン経路ビーズアッセイ法は以下のとおりに行った。直径7μMのポリスチレンビーズ(Bangs Laboratories;米国インディアナ州フィッシャーズ）に、炭酸-重炭酸緩衝液（pH9.6）中、4℃で一晩、マンナンを吸着させた。ビーズをPBSで洗浄し、10％血清に曝露するか、抗体または阻害物質と共にプレインキュベートした10％血清に曝露した。血清-ビーズ混合物を撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。血清インキュベーション後に、ビーズを洗浄し、抗C3cウサギポリクローナル抗体（Dako North America;米国カリフォルニア州カーピンテリア）およびPE-Cy5コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Southern Biotech;米国アラバマ州バーミングハム）による検出で、ビーズ上のC3b沈着を測定した。染色手順後に、FACSCaliburフローサイトメーターを用いて、ビーズを解析した。前方散乱と側方散乱を使用し、均一な集団としてビーズにゲートをかけた。C3b沈着はFL3陽性粒子として明白であった（FL-3または「FL-3チャネル」はサイトメーター上の第3のチャネルまたは赤色チャネルを示す）。各実験条件についてこの集団の幾何平均蛍光強度（MFI）を抗体/阻害物質濃度に対してプロットすることで、レクチン経路阻害を評価した。
GraphPad PRISMソフトウェアを用いてIC50値を算出した。具体的に述べると、可変スロープ（4パラメータ）非線形フィッティングをサイトメトリーアッセイ法から得たlog（抗体）対平均蛍光強度曲線に適用することによって、IC50値を得た。
結果を表15に示す。
（表１５）10％ヒト血清におけるC3b沈着（マンナン被覆ビーズアッセイ法）（実験番号1）
Figure 2016514456
結果:
対照非SGMI含有MASP-2「裸」スキャフォールド抗体（mAb＃6）は、このアッセイ法において≧3.63nMのIC50値で阻害性であったが、これは実施例5で観察された阻害結果と合致する。注目すべきことに、表15に示すとおり、試験した7つのSGMI-MASP-2抗体融合物は全て、このアッセイ法におけるMASP-2スキャフォールド抗体の力価を向上させた。最も強力な2つの融合物L-M2-SGMI-1CおよびH-M2-SGMI-1-NはどちらもMASP-1特異的SGMI-1ペプチド（SEQ ID NO:6）を含有することから、二重MASP-1/MASP-2特異性はC3b沈着の阻害に有利でありうることが示唆される。MASP-2特異的SGMI-2ペプチド（SEQ ID NO:9）を担持するMASP-2-SGMI融合抗体のうちの2つ、H-M2-SGMI-2-NとH-M2-SGMI-2-Cがほぼ同じ程度に活性であることから、C3b沈着の阻害には結合価の増加も有益でありうることにも注目されたい。
実験番号2:C3b沈着に関するマンナン被覆ビーズアッセイ法
MASP-2-SGMI融合物の2つの構成要素、すなわちMASP-2抗体スキャフォールドとSGMIペプチドの、改良された阻害活性への相対的寄与を評価するために、10％ヒト血清を用いてC3b沈着に関するマンナン被覆ビーズアッセイ法を行った。この解析には最も強力な2つの融合物を使用した。それぞれについて、MASP-2抗体スキャフォールド（mAb＃6）を、非特異的DT40ニワトリ抗体（MASP-2に結合しない）から生成した対応するキメラDT40抗体-SGMI融合物、重鎖のN末端領域にSGMI-1ペプチドが融合されている非特異的ニワトリ抗体（SEQ ID NO:190として示すH-DT40-Ab-SGMI-1-N）および軽鎖のC末端領域にSGMI-1ペプチドが融合されている非特異的ニワトリ抗体（SEQ ID NO:100として示すL-DT40-Ab-SGMI-1-C）と対比して、MASP-2-SGMI融合物と比較した。アッセイ法は上述のように行い、結果を下記の表16に示す。
（表１６）10％ヒト血清を用いて実施したC3b沈着（実験番号2）
Figure 2016514456
表16に示すように、どちらの場合も、SGMI-1ペプチドはMASP-2スキャフォールド抗体の活性を改良した。2つの融合物のうち、最も顕著な活性の改良は、MASP-2抗体軽鎖のC末端に融合されたSGMI-1（L-M2-SGMI-1-C、IC50は0.33nM）に見られた。対照的に、SGMI-1ペプチドを非特異的ニワトリキメラmAbの同じ位置に融合した場合（L-DT40-AB-SGMI-1-C）、その阻害活性はほとんど検出できなかった。SGMI-1を非特異的ニワトリmAb重鎖のN末端に融合すると（H-DT40-Ab-SGMI-1-N）、その活性はL-DT40-AB-SGMI-1-Cよりはかなり高くなったが、MASP-2抗体スキャフォールド上の同じ位置にそれを移すと（H-M2-SGMI-1-N）、その阻害活性はさらに2桁近く増加する（IC50は32nMと0.38nM）。総合すると、これらのデータは、融合して単一の抗体分子とした場合に、MASP-2抗体スキャフォールドとSGMIは協同してレクチン経路の活性化を遮断することを示している。
実験番号3:10％マウス血清におけるC3b沈着アッセイ法
C3b沈着に関するマンナン被覆ビーズアッセイ法を、10％マウス血清を用いて、上述のように行った。図19は、ある抗体濃度範囲にわたって、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）を用いて10％マウス血清において行ったC3b沈着アッセイ法の結果を、SGMI-1またはSGMI-2を含むMASP-2抗体（M2）-SGMI融合物と比較して、グラフで図解している。図19に示すように、MASP-2スキャフォールド抗体にSGMI-1またはSGMI-2のいずれかを融合することにより、これらの条件下でMASP-2抗体の阻害力価が増加した。
実験番号4:10％ヒト血清を用いたC4b沈着アッセイ法
C3b沈着アッセイ法について上述したものと同じアッセイ条件を使用し、以下の変更を加えて、10％ヒト血清を用いてC4b沈着アッセイ法を行った。C4bの検出およびフローサイトメトリー解析は、フローサイトメトリー解析に左記だって、抗C4bマウスモノクローナル抗体（1:500、Quidel）で沈着反応を染色し、PE Cy5にコンジュゲートされた二次ヤギ抗マウスF(ab')2（1:200、Southern Biotech）で染色することによって行った。
図20Aに示すように、単一SGMI-2担持MASP-2抗体融合物（H-M2-SGMI-2-N、L-M2-SGMI-2-N）と二重SGMI-2担持MASP-2抗体融合物（HL-M2-SGMI-2-2-NNおよびHL-M2-SGMI-2-2-NC）は全て、MASP-2スキャフォールド抗体（HL-M2）と比較して増加した力価を持っていた。
同様に、図20Bに示すように、単一SGMI-2担持MASP-2抗体融合物（H-M2-SGMI-2-CおよびL-M2-SGMI-2C）と二重SGMI-2担持MASP-2抗体融合物（HL-M2-SGMI-2-2-CNおよびHL-M2-SGMI-2-2-CC）は全て、MASP-2スキャフォールド抗体（HL-M2）と比較して増加した力価を持っていた。
実験番号5:10％ヒト血清を用いたC3b沈着アッセイ法
融合抗体の2つの構成要素、すなわちMASP-2抗体スキャフォールド（mAb＃6）とSGMIペプチドの、改良された阻害活性への相対的寄与を評価吸うために、10％ヒト血清においてC3b沈着アッセイ法を行った。この解析には、前もって高い力価を有すると決定された2つの代表的な融合物、すなわちH-M2-SGMI-1-NおよびL-M2-SGMI-1-Cを使用した。各融合物コンストラクトを、対応するキメラDT40抗体-SGMI融合物（実施例4で述べたように生成したもの）と比較した。
図21は、軽鎖定常領域のC末端に融合されたSGMI-1ペプチドを含む非特異的キメラニワトリ/ヒト抗体（L-SGMI-1-C）または重鎖可変領域のN末端に融合されたSGMI-1ペプチドを含む非特異的キメラ/ヒト抗体（H-SGMI-1-N）を使用し、10％ヒト血清において行ったC3b沈着アッセイ法の結果を、対応するMASP-2抗体（M2）-SGMI-1融合物と比較して、グラフで図解している。図21に示すように、最も顕著な活性の改良は、MASP-2スキャフォールド抗体の軽鎖のC末端に融合されたSGMI-1（L-M2-SGMI-1-C、IC50は0.33nM）で達成され、一方、SGMI-1ペプチドを非特異的キメラDT40抗体のC末端に融合した場合（L-SGMI-1-C）、その阻害活性はほとんど検出することができない。図21にさらに示すように、非特異的キメラDT40抗体のN末端にSGMI-1を融合した場合（H-SGMI-1-N）、ある程度の阻害活性はあったが（IC50は30nM）、SGMI-1をMASP-2スキャフォールド抗体上の同じN末端位置に融合すると（H-M2-SGMI-1-N、IC50は0.38nM）、阻害活性の2桁近い顕著な改良が達成された。結論として、どちらの場合も、SGMI-1は、MASP-2スキャフォールド抗体の阻害活性を劇的に改良した。総合すると、これらのデータは、融合して単一の抗体分子とした場合に、MASP-2抗体スキャフォールドと生物活性ペプチドSGMI-1は協同してレクチン経路の活性化を遮断することを示している。
代替的態様:
本明細書の開示を考慮すれば、この実施例に記載したMASP-2抗体mAb＃6の使用は代表的なMASP-2スキャフォールド抗体であり、例えば表17に記載のMASP-2抗体など、任意のMASP-2抗体に、当技術分野において公知の日常的な方法を用いてSGMIペプチドを融合して、本発明のMASP-2抗体/SGMI融合物を生成しうることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの態様では、SGMIペプチドを持たないMASP-2スキャフォールド抗体が、弱い阻害活性を持つか、または阻害活性を持たず、SGMI担持MASP-2抗体融合物が、そのMASP-2スキャフォールド抗体の阻害活性を与えるか増加させる。いくつかの態様では、MASP-2スキャフォールド抗体が、初期レベルの阻害活性を有し、SGMI担持MASP-2抗体融合物が強化された阻害活性を有する。適切なMASP-2阻害抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域の非限定的な例をそれぞれ表18および表19に掲載する。
（表１７）文献からのMASP-2特異的抗体
Figure 2016514456
（表１８）MASP-2阻害抗体重鎖可変領域
Figure 2016514456
（表１９）MASP-2阻害抗体軽鎖可変領域
Figure 2016514456
実施例8
この実施例では、SGMI-1担持MASP-2抗体融合物およびSGMI-2担持MASP-2抗体融合物の阻害活性をインビボで評価するために行ったマウス薬動力学研究について述べる。
背景/理論的根拠:
実施例7で述べたように、それぞれMASP-1およびMASP-2の生物活性ペプチド阻害物質であるSGMI-1およびSGMI-2は、ヒト血清およびマウス血清におけるレクチン経路の活性化を遮断するMASP-2スキャフォールド抗体の能力を著しく強化することが決定された。SGMI-1担持MASP-2抗体融合物およびSGMI-2担持MASP-2抗体融合物の阻害活性を7日間マウス薬力学研究で評価するために以下の実験を行った。
方法:
マウス（n＝3/群）に、MASP-2スキャフォールド抗体（mAb＃6）、SGMI-1ペプチド担持MASP-2抗体（L-M2-SGMI-1-C、L-M2-SGMI-1-NまたはH-M2-SGMI-1-N）、SGMI-2ペプチド担持MASP-2抗体（L-M2-SGMI-2-N、H-M2-SGMI-2-C、H-M2-SGMI-2-NまたはL-M2-SGMI-2-C）、またはアイソタイプIgG4対照抗体（ET904）のいずれかを、5mg/kgの量で腹腔内注射した。
抗体注射の24時間後、72時間後、および168時間後にマウスから血清試料を得て、90％血清を用いるC3b沈着アッセイ法で、レクチン経路活性を測定した。融合抗体のうちの2つ、すなわちH-M2-SGMI-2-CおよびH-M2-SGMI-1-Nが最も高い力価を有し、注射の24時間後までにレクチン経路活性をほぼ検出不可能なレベルまで阻害し、高レベルの阻害を1週間は維持することが、観察された。
薬物動態に関してアッセイするために、薬力学アッセイ法に使用した時点と同じ時点で、血清試料中の抗体レベルを測定するためのELISAも行った。次に、ELISA（薬物動態データセット）によって決定された抗体の濃度を、C3b沈着アッセイ法によって決定されたレクチン経路活性（薬力学データセット）に対してプロットした。無処置マウスからの薬力学データを用いて、全ての条件に共通の「0nM抗体」データポイントとした。各処置群について全ての時点からのデータを合わせた。
結果:
図22Aに、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）またはMASP-2抗体（M2）-SGMI-1融合物の濃度（薬物動態（PK）データセット）対レクチン経路活性（C3b沈着;薬力学（PD）データセット）のプロットを示す。図22Bに、代表的な裸のMASP-2（HL-M2）スキャフォールド抗体（mAb＃6）またはMASP-2抗体（M2）-SGMI-2融合物の濃度（薬物動態（PK）データセット）対レクチン経路活性（C3b沈着;薬力学（PD）データセット）のプロットを示す。
図22Aに示すように、SGMI-1ペプチドは、マウスにおいてインビボでレクチン経路の活性化を遮断するMASP-2スキャフォールド抗体の能力を著しく強化する。さらに図22Bに示すように、SGMI-2ペプチドも、マウスにおいてインビボでレクチン経路の活性化を遮断するMASP-2スキャフォールド抗体の能力を強化するが、その程度はSGMI-1ペプチドよりは低い。これらの結果は、抗体-ペプチド融合物によって与えられる二重MASP-1/MASP-2特異性は、インビボでのレクチン経路の阻害に有利でありうることを示唆している。MASP-2特異的SGMI-2ペプチドを担持するMASP-2-SGMI融合抗体による改良された結果から、結合価の増加もインビボでのレクチン経路の阻害に有益でありうることが示唆される点に注目されたい。
本発明の好ましい態様を例示し、説明したが、本発明の本旨および範囲から逸脱することなくさまざまな変化をそこに加えうることは、理解されるであろう。
排他的所有権または特権を主張する本発明の態様は、特許請求の範囲に記載するとおりに定義される。
[本発明1001]
生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該生物活性ペプチドアミノ酸配列が、補体系の阻害物質であり、かつ
（i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または
（ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域
のうちの少なくとも一方に融合されており、
該抗体が補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片。
[本発明1002]
前記生物活性ペプチドが、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に融合されている、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1003]
前記生物活性ペプチドが、軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1004]
前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のアミノ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1005]
前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖定常領域または前記重鎖定常領域のカルボキシ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、本発明1003の単離された抗体。
[本発明1006]
前記生物活性ペプチドが、
X 1 CTX 2 X 3 X 4 CX 5 Q（SEQ ID NO:5）
によるSGMIコアアミノ酸配列を含み、
X 1 がFまたはVであり、
X 2 がRまたはKであり、
X 3 がKまたはLであり、
X 4 がLまたはWであり、かつ
X 5 がYまたはNであり、かつ
該生物活性ペプチドが、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、本発明1001〜1005のいずれかの単離された抗体。
[本発明1007]
前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1006の単離された抗体。
[本発明1008]
前記生物活性ペプチドが、MASP-1の活性を阻害する、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1009]
前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:8のうちの少なくとも1つを含む、本発明1008の単離された抗体。
[本発明1010]
前記生物活性ペプチドが、MASP-2の活性を阻害する、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1011]
前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:9〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1010の単離された抗体。
[本発明1012]
前記重鎖可変領域および/または前記軽鎖可変領域が、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含み、かつ前記抗体がMASP-2活性を阻害する、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1013]
完全にヒトである、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1014]
ヒト化されている、本発明1001の単離された抗体。
[本発明1015]
前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1012の単離された抗体。
[本発明1016]
（i）MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域と、
（ii）X 1 CTX 2 X 3 X 4 CX 5 Q（SEQ ID NO:5）
によるアミノ酸配列を含み、
X 1 がFまたはVであり、
X 2 がRまたはKであり、
X 3 がKまたはLであり、
X 4 がLまたはWであり、かつ
X 5 がYまたはNである、
少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列と
を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、
該SGMIコアペプチド配列が、
（iii）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または
（iv）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または
（v）軽鎖ヒト定常領域および/もしくは重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域
のうちの少なくとも1つに融合されており、
該抗体またはその抗原結合性断片が、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片。
[本発明1017]
前記SGMIコアペプチド配列が、MASP-2に結合する1つもしくは複数のCDRを含む軽鎖可変領域および/またはMASP-2に結合する1つもしくは複数のCDRを含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に融合されている、本発明1016の抗体。
[本発明1018]
前記SGMIコアペプチド配列が、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、本発明1016の抗体。
[本発明1019]
前記SGMIコアペプチド配列が、軽鎖ヒト定常領域および/または重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、本発明1016の抗体。
[本発明1020]
前記重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が、1つまたは複数のCDRを含み、該CDRが、ヒトMASP-2に特異的に結合し、かつMASP-2活性を阻害する、本発明1016の抗体。
[本発明1021]
前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1022]
前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:6〜8のうちの少なくとも1つを含み、かつ前記抗体がMASP-1活性およびMASP-2活性を阻害する、本発明1016の抗体。
[本発明1023]
前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:9〜11のうちの少なくとも1つを含み、かつ前記抗体がMASP-2活性を阻害する、本発明1016の抗体。
[本発明1024]
前記SGMIコアアミノ酸配列と前記抗体の前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のアミノ末端との間に、1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含む、本発明1016〜1023のいずれかの抗体。
[本発明1025]
前記SGMIコアペプチドアミノ酸配列と前記抗体の前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のカルボキシ末端との間に、1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含む、本発明1016〜1023のいずれかの抗体。
[本発明1026]
SEQ ID NO:4として示すヒトMASP-2に特異的に結合する、本発明1016〜1025のいずれかの抗体。
[本発明1027]
前記MASP-2抗体が完全にヒトである、本発明1026の抗体。
[本発明1028]
前記MASP-2抗体がヒト化されている、本発明1026の抗体。
[本発明1029]
1％ヒト血清でのインビトロアッセイ法においてC3b沈着を10nMまたはそれ未満のIC 50 で阻害する、本発明1016の抗体。
[本発明1030]
1％ヒト血清でのインビトロアッセイ法においてC4沈着を10nMまたはそれ未満のIC 50 で阻害する、本発明1016の抗体。
[本発明1031]
前記重鎖可変領域が、表9に示すCDR-H1配列、CDR-H2配列、および/またはCDR-H3配列の1つまたは複数を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1032]
前記軽鎖可変領域が、表11に示すCDR-L1配列、CDR-L2配列、および/またはCDR-L3配列の1つまたは複数を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1033]
前記重鎖可変領域CDR-H3配列が、SEQ ID NO:129またはSEQ ID NO:146として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1034]
前記軽鎖可変領域CDR-L3配列が、SEQ ID NO:142またはSEQ ID NO:150として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1035]
前記重鎖可変領域CDR-H2配列が、SEQ ID NO:123またはSEQ ID NO:124として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1036]
前記重鎖可変領域CDR-H1配列が、SEQ ID NO:119またはSEQ ID NO:120として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1037]
前記軽鎖可変領域CDR-L2配列が、SEQ ID NO:149として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1038]
前記軽鎖可変領域CDR-L1配列が、SEQ ID NO:147またはSEQ ID NO:148として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、本発明1016の抗体。
[本発明1039]
前記抗体またはその抗原結合性断片が、Fab、Fab'断片、F(ab')2断片、および抗体全体からなる群より選択される、本発明1016の抗体。
[本発明1040]
前記抗体またはその抗原結合性断片が、一本鎖抗体、scFv、および、ヒンジ領域を欠如している一価抗体からなる群より選択される、本発明1016の抗体。
[本発明1041]
ヒトMASP-2に10nMまたはそれ未満のKdで結合する、本発明1026の抗体。
[本発明1042]
MASP-2のCCP1-CCP2-SP領域中のエピトープに結合する、本発明1016の抗体。
[本発明1043]
表18に示す重鎖可変領域配列に対して少なくとも85％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1044]
表19に示す軽鎖可変領域配列に対して少なくとも85％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、本発明1016の抗体。
[本発明1045]
本発明1016〜1044のいずれかの抗体のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
[本発明1046]
本発明1045の抗体をコードする核酸分子を含む、発現カセット。
[本発明1047]
本発明1045の抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
[本発明1048]
MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む可変領域と、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列とを含む抗体を生成する方法であって、該抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下で本発明1047の細胞を培養する工程、および該抗体を単離する工程を含む、方法。
[本発明1049]
ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）またはSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）のうちの少なくとも一方に対応するアミノ酸配列をさらに含み、マンナン被覆基材上でC4活性化を1％ヒト血清において10nMまたはそれ未満のIC 50 で阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[本発明1050]
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（i）SEQ ID NO:111に示す重鎖可変領域とSEQ ID NO:115に示す軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって、または（ii）ハイブリドーマ細胞株03050904が生産する参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、本発明1049の単離された抗体。
[本発明1051]
本発明1001〜1044ならびに本発明1049および1050のいずれかの抗体またはその抗原結合性断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
[本発明1052]
全身送達用に製剤化されている、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
動脈内投与用、静脈内投与用、頭蓋内投与用、筋肉内投与用、吸入投与用、経鼻投与用、または皮下投与用に製剤化されている、本発明1051の組成物。
[本発明1054]
それを必要とするヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害する方法であって、本発明1051の組成物を、該ヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、方法。
[本発明1055]
前記組成物が、MASP-2活性を特異的に阻害するように製剤化されている、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記組成物が、MASP-2およびMASP-1を阻害するように製剤化されている、本発明1054の方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの生物活性ペプチドアミノ酸配列が、（i）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域、および/または（ii）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つに移植されている、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
[本発明1058]
前記生物活性ペプチドアミノ酸配列が、前記重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3のうちの少なくとも1つに移植されている、本発明1057の単離された抗体。
[本発明1059]
前記生物活性ペプチドアミノ酸配列が、前記軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3のうちの少なくとも1つに移植されている、本発明1057の単離された抗体。
[本発明1060]
前記重鎖がヒトIgG1定常領域をさらに含む、本発明1058の単離された抗体。
[本発明1061]
前記軽鎖がヒトλ軽鎖定常領域をさらに含む、本発明1059の単離された抗体。
[本発明1062]
前記生物活性ペプチドアミノ酸配列とニワトリフレームワーク領域との間に、少なくとも1つの可動性アミノ酸リンカー配列をさらに含む、本発明1057〜1061のいずれかの単離された抗体。
[本発明1063]
一般式（I）:
N-X-B-Y-C （I）
の重鎖可変領域を含み、
Nが、該重鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
Xが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
Bが、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ、60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、
Yが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
Cが、該重鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
以下のうちの少なくとも1つが該当する、本発明1057の単離された抗体:
Nが、SEQ ID NO:24として示すFR-1またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含むこと;あるいは
Nが、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:26として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
Nが、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCが、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含むこと。
[本発明1064]
Cが、SEQ ID NO:47として示すヒトIgG1定常領域またはその変種をさらに含む、本発明1063の単離された抗体。
[本発明1065]
Nが、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCが、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含む、本発明1063の単離された抗体。
[本発明1066]
Xおよび/またはYが、一般的な親ニワトリクローンのCDRに由来するリンカー配列である、本発明1062または本発明1063の単離された抗体。
[本発明1067]
Xおよび/またはYが、表4より選択されるリンカー配列である、本発明1062または本発明1063の単離された抗体。
[本発明1068]
一般式（II）:
N-X-B-Y-C （II）
の軽鎖可変領域を含み、
Nが、該軽鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
Xが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
Bが、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ、60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、
Yが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
Cが、該軽鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
以下のうちの少なくとも1つが該当する、本発明1057の単離された抗体:
Nが、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCが、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含むこと;あるいは
Nが、SEQ ID NO:33として示すFR-2またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
Nが、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:36として示すFR-4またはその変種を含むこと。
[本発明1069]
Cが、SEQ ID NO:48として示すヒトλ軽鎖またはその変種をさらに含む、本発明1068の単離された抗体。
[本発明1070]
Nが、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCが、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含む、本発明1068の単離された抗体。
[本発明1071]
Xおよび/またはYが、表4より選択されるリンカー配列である、本発明1062または本発明1068の単離された抗体。
[本発明1072]
前記軽鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:31、33、35、および36に示すニワトリフレームワーク領域VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、およびVL-FR4アミノ酸配列、ならびにそれらの変種を含む、本発明1057〜1071のいずれかの単離された抗体。
[本発明1073]
前記重鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:24、25、26、および28に示すニワトリフレームワーク領域VH-FR-1、VH-FR2、VH-FR3、およびVH-FR4アミノ酸配列、ならびにそれらの変種を含む、本発明1057〜1072のいずれかの単離された抗体。
[本発明1074]
前記生物活性ペプチドが、（i）医学的に重要なプロテアーゼを阻害する生物活性ペプチド、（ii）神経ペプチド、（iii）神経ペプチド活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（iii）ペプチドホルモン、（iv）ペプチドホルモン活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（v）クラスA GPCRのリガンドであるペプチド、（vi）クラスA GPCRを阻害または活性化する生物活性ペプチド、（vii）クラスB GPCRリガンド、および（viii）クラスB GPCRリガンドを阻害または活性化する生物活性ペプチドからなる群より選択される、本発明1057〜1073のいずれかの単離された抗体。
[本発明1075]
2つの生物活性ペプチド配列を含み、1つの生物活性ペプチド配列が前記軽鎖可変領域に移植されており、かつもう1つの生物活性ペプチド配列が前記重鎖可変領域に移植されている、本発明1057〜1074のいずれかの単離された抗体。
[本発明1076]
前記生物活性ペプチドが、補体系の阻害物質である、本発明1057の単離された抗体。
[本発明1077]
前記生物活性ペプチドが、
X 1 CTX 2 X 3 X 4 CX 5 Q（SEQ ID NO:5）
によるSGMIコアアミノ酸配列を含み、
X 1 がFまたはVであり、
X 2 がRまたはKであり、
X 3 がKまたはLであり、
X 4 がLまたはWであり、かつ
X 5 がYまたはNであり、かつ
該生物活性ペプチドが、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、本発明1076の単離された抗体。
[本発明1078]
前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1077の抗体。
[本発明1079]
ポリペプチドが、MASP-1の活性を阻害する、本発明1077の抗体。
[本発明1080]
前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:8のうちの少なくとも1つを含む、本発明1079の抗体。
[本発明1081]
ポリペプチドが、MASP-2の活性を阻害する、本発明1077の抗体。
[本発明1082]
前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:9〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、本発明1081の抗体。
[本発明1083]
一方の生物活性ペプチドがMASP-1を阻害し、かつ他方の生物活性ペプチドがMASP-2を阻害する、本発明1075の抗体。
[本発明1084]
前記生物活性ペプチドと実質的に同じ生物学的活性を有する、本発明1057〜1083のいずれかの単離された抗体。
[本発明1085]
本発明1057〜1084のいずれかの単離された抗体のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
[本発明1086]
本発明1085の核酸分子を含む、細胞。

本明細書に記載する発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照すれば、明白になるであろう。本明細書において言及する米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は全て、あたかもそれぞれが個別に組み入れられているかのように、参照により本明細書にそのまま組み入れられる。

Claims (86)

  1. 生物活性ペプチドアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該生物活性ペプチドアミノ酸配列が、補体系の阻害物質であり、かつ
    （i）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または
    （ii）軽鎖定常領域および/もしくは重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域
    のうちの少なくとも一方に融合されており、
    該抗体が補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 前記生物活性ペプチドが、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に融合されている、請求項1に記載の単離された抗体。
  3. 前記生物活性ペプチドが、軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、請求項1に記載の単離された抗体。
  4. 前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のアミノ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、請求項2に記載の単離された抗体。
  5. 前記生物活性ペプチドアミノ酸配列と前記軽鎖定常領域または前記重鎖定常領域のカルボキシ末端との間に少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、請求項3に記載の単離された抗体。
  6. 前記生物活性ペプチドが、
    X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
    によるSGMIコアアミノ酸配列を含み、
    X1がFまたはVであり、
    X2がRまたはKであり、
    X3がKまたはLであり、
    X4がLまたはWであり、かつ
    X5がYまたはNであり、かつ
    該生物活性ペプチドが、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  7. 前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項6に記載の単離された抗体。
  8. 前記生物活性ペプチドが、MASP-1の活性を阻害する、請求項1に記載の単離された抗体。
  9. 前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:8のうちの少なくとも1つを含む、請求項8に記載の単離された抗体。
  10. 前記生物活性ペプチドが、MASP-2の活性を阻害する、請求項1に記載の単離された抗体。
  11. 前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:9〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項10に記載の単離された抗体。
  12. 前記重鎖可変領域および/または前記軽鎖可変領域が、MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含み、かつ前記抗体がMASP-2活性を阻害する、請求項1に記載の単離された抗体。
  13. 完全にヒトである、請求項1に記載の単離された抗体。
  14. ヒト化されている、請求項1に記載の単離された抗体。
  15. 前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項12に記載の単離された抗体。
  16. （i）MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域と、
    （ii）X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
    によるアミノ酸配列を含み、
    X1がFまたはVであり、
    X2がRまたはKであり、
    X3がKまたはLであり、
    X4がLまたはWであり、かつ
    X5がYまたはNである、
    少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列と
    を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、
    該SGMIコアペプチド配列が、
    （iii）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域、または
    （iv）軽鎖可変領域および/もしくは重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域、または
    （v）軽鎖ヒト定常領域および/もしくは重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域
    のうちの少なくとも1つに融合されており、
    該抗体またはその抗原結合性断片が、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化を阻害する、抗体またはその抗原結合性断片。
  17. 前記SGMIコアペプチド配列が、MASP-2に結合する1つもしくは複数のCDRを含む軽鎖可変領域および/またはMASP-2に結合する1つもしくは複数のCDRを含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのアミノ末端領域に融合されている、請求項16に記載の抗体。
  18. 前記SGMIコアペプチド配列が、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、請求項16に記載の抗体。
  19. 前記SGMIコアペプチド配列が、軽鎖ヒト定常領域および/または重鎖ヒト定常領域のうちの少なくとも1つのカルボキシ末端領域に融合されている、請求項16に記載の抗体。
  20. 前記重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域が、1つまたは複数のCDRを含み、該CDRが、ヒトMASP-2に特異的に結合し、かつMASP-2活性を阻害する、請求項16に記載の抗体。
  21. 前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項16に記載の抗体。
  22. 前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:6〜8のうちの少なくとも1つを含み、かつ前記抗体がMASP-1活性およびMASP-2活性を阻害する、請求項16に記載の抗体。
  23. 前記SGMIコアペプチド配列を含むアミノ酸配列が、SEQ ID NO:9〜11のうちの少なくとも1つを含み、かつ前記抗体がMASP-2活性を阻害する、請求項16に記載の抗体。
  24. 前記SGMIコアアミノ酸配列と前記抗体の前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のアミノ末端との間に、1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含む、請求項16〜23のいずれか一項に記載の抗体。
  25. 前記SGMIコアペプチドアミノ酸配列と前記抗体の前記軽鎖可変領域または前記重鎖可変領域のカルボキシ末端との間に、1個のアミノ酸残基〜20個のアミノ酸残基のリンカー領域をさらに含む、請求項16〜23のいずれか一項に記載の抗体。
  26. SEQ ID NO:4として示すヒトMASP-2に特異的に結合する、請求項16〜25のいずれか一項に記載の抗体。
  27. 前記MASP-2抗体が完全にヒトである、請求項26に記載の抗体。
  28. 前記MASP-2抗体がヒト化されている、請求項26に記載の抗体。
  29. 1％ヒト血清でのインビトロアッセイ法においてC3b沈着を10nMまたはそれ未満のIC50で阻害する、請求項16に記載の抗体。
  30. 1％ヒト血清でのインビトロアッセイ法においてC4沈着を10nMまたはそれ未満のIC50で阻害する、請求項16に記載の抗体。
  31. 前記重鎖可変領域が、表9に示すCDR-H1配列、CDR-H2配列、および/またはCDR-H3配列の1つまたは複数を含む、請求項16に記載の抗体。
  32. 前記軽鎖可変領域が、表11に示すCDR-L1配列、CDR-L2配列、および/またはCDR-L3配列の1つまたは複数を含む、請求項16に記載の抗体。
  33. 前記重鎖可変領域CDR-H3配列が、SEQ ID NO:129またはSEQ ID NO:146として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  34. 前記軽鎖可変領域CDR-L3配列が、SEQ ID NO:142またはSEQ ID NO:150として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  35. 前記重鎖可変領域CDR-H2配列が、SEQ ID NO:123またはSEQ ID NO:124として示すアミノ酸配列と、その保存的配列修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  36. 前記重鎖可変領域CDR-H1配列が、SEQ ID NO:119またはSEQ ID NO:120として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  37. 前記軽鎖可変領域CDR-L2配列が、SEQ ID NO:149として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  38. 前記軽鎖可変領域CDR-L1配列が、SEQ ID NO:147またはSEQ ID NO:148として示すアミノ酸配列と、その保存的修飾とを含む、請求項16に記載の抗体。
  39. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、Fab、Fab'断片、F(ab')2断片、および抗体全体からなる群より選択される、請求項16に記載の抗体。
  40. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、一本鎖抗体、scFv、および、ヒンジ領域を欠如している一価抗体からなる群より選択される、請求項16に記載の抗体。
  41. ヒトMASP-2に10nMまたはそれ未満のKdで結合する、請求項26に記載の抗体。
  42. MASP-2のCCP1-CCP2-SP領域中のエピトープに結合する、請求項16に記載の抗体。
  43. 表18に示す重鎖可変領域配列に対して少なくとも85％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項16に記載の抗体。
  44. 表19に示す軽鎖可変領域配列に対して少なくとも85％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項16に記載の抗体。
  45. 請求項16〜44のいずれか一項に記載の抗体のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
  46. 請求項45に記載の抗体をコードする核酸分子を含む、発現カセット。
  47. 請求項45に記載の抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
  48. MASP-2に特異的に結合する1つまたは複数のCDRを含む可変領域と、少なくとも1つのSGMIコアペプチド配列とを含む抗体を生成する方法であって、該抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下で請求項47に記載の細胞を培養する工程、および該抗体を単離する工程を含む、方法。
  49. ヒトMASP-2に結合し、かつSGMI-1（SEQ ID NO:6として示す）またはSGMI-2（SEQ ID NO:9として示す）のうちの少なくとも一方に対応するアミノ酸配列をさらに含み、マンナン被覆基材上でC4活性化を1％ヒト血清において10nMまたはそれ未満のIC50で阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
  50. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、（i）SEQ ID NO:111に示す重鎖可変領域とSEQ ID NO:115に示す軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって、または（ii）ハイブリドーマ細胞株03050904が生産する参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、請求項49に記載の単離された抗体。
  51. 請求項1〜44ならびに請求項49および50のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
  52. 全身送達用に製剤化されている、請求項51に記載の組成物。
  53. 動脈内投与用、静脈内投与用、頭蓋内投与用、筋肉内投与用、吸入投与用、経鼻投与用、または皮下投与用に製剤化されている、請求項51に記載の組成物。
  54. それを必要とするヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害する方法であって、請求項51に記載の組成物を、該ヒト対象におけるレクチン経路補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、方法。
  55. 前記組成物が、MASP-2活性を特異的に阻害するように製剤化されている、請求項54に記載の方法。
  56. 前記組成物が、MASP-2およびMASP-1を阻害するように製剤化されている、請求項54に記載の方法。
  57. 1つまたは複数の生物活性ペプチドアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの生物活性ペプチドアミノ酸配列が、（i）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域、および/または（ii）1つもしくは複数のニワトリフレームワーク領域を含む重鎖可変領域のうちの少なくとも1つに移植されている、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  58. 前記生物活性ペプチドアミノ酸配列が、前記重鎖可変領域のCDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3のうちの少なくとも1つに移植されている、請求項57に記載の単離された抗体。
  59. 前記生物活性ペプチドアミノ酸配列が、前記軽鎖可変領域のCDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3のうちの少なくとも1つに移植されている、請求項57に記載の単離された抗体。
  60. 前記重鎖がヒトIgG1定常領域をさらに含む、請求項58に記載の単離された抗体。
  61. 前記軽鎖がヒトλ軽鎖定常領域をさらに含む、請求項59に記載の単離された抗体。
  62. 前記生物活性ペプチドアミノ酸配列とニワトリフレームワーク領域との間に、少なくとも1つの可動性アミノ酸リンカー配列をさらに含む、請求項57〜61のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  63. 一般式（I）:
    N-X-B-Y-C （I）
    の重鎖可変領域を含み、
    Nが、該重鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
    Xが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
    Bが、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ、60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、
    Yが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
    Cが、該重鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
    以下のうちの少なくとも1つが該当する、請求項57に記載の単離された抗体:
    Nが、SEQ ID NO:24として示すFR-1またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含むこと;あるいは
    Nが、SEQ ID NO:25として示すFR-2またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:26として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
    Nが、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCが、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含むこと。
  64. Cが、SEQ ID NO:47として示すヒトIgG1定常領域またはその変種をさらに含む、請求項63に記載の単離された抗体。
  65. Nが、SEQ ID NO:26として示すFR-3もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:27を含み、かつCが、SEQ ID NO:28として示すFR-4もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:29を含む、請求項63に記載の単離された抗体。
  66. Xおよび/またはYが、一般的な親ニワトリクローンのCDRに由来するリンカー配列である、請求項62または請求項63に記載の単離された抗体。
  67. Xおよび/またはYが、表4より選択されるリンカー配列である、請求項62または請求項63に記載の単離された抗体。
  68. 一般式（II）:
    N-X-B-Y-C （II）
    の軽鎖可変領域を含み、
    Nが、該軽鎖可変領域のアミノ末端領域であり、
    Xが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、
    Bが、生物活性ペプチドアミノ酸配列であり、かつ、60個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列、または最小で少なくとも3個のアミノ酸残基までの50個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、
    Yが、可動性アミノ酸リンカー領域であり、かつ0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸からなり、かつ
    Cが、該軽鎖可変領域のカルボキシ末端領域であり、かつ
    以下のうちの少なくとも1つが該当する、請求項57に記載の単離された抗体:
    Nが、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCが、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含むこと;あるいは
    Nが、SEQ ID NO:33として示すFR-2またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含むこと;あるいは
    Nが、SEQ ID NO:35として示すFR-3またはその変種を含み、かつCが、SEQ ID NO:36として示すFR-4またはその変種を含むこと。
  69. Cが、SEQ ID NO:48として示すヒトλ軽鎖またはその変種をさらに含む、請求項68に記載の単離された抗体。
  70. Nが、SEQ ID NO:31として示すFR-1もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:32を含み、かつCが、SEQ ID NO:33として示すFR-2もしくはその変種、または隣接するSEQ ID NO:34を含む、請求項68に記載の単離された抗体。
  71. Xおよび/またはYが、表4より選択されるリンカー配列である、請求項62または請求項68に記載の単離された抗体。
  72. 前記軽鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:31、33、35、および36に示すニワトリフレームワーク領域VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、およびVL-FR4アミノ酸配列、ならびにそれらの変種を含む、請求項57〜71のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  73. 前記重鎖可変領域が、それぞれSEQ ID NO:24、25、26、および28に示すニワトリフレームワーク領域VH-FR-1、VH-FR2、VH-FR3、およびVH-FR4アミノ酸配列、ならびにそれらの変種を含む、請求項57〜72のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  74. 前記生物活性ペプチドが、（i）医学的に重要なプロテアーゼを阻害する生物活性ペプチド、（ii）神経ペプチド、（iii）神経ペプチド活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（iii）ペプチドホルモン、（iv）ペプチドホルモン活性を阻害または活性化する生物活性ペプチド、（v）クラスA GPCRのリガンドであるペプチド、（vi）クラスA GPCRを阻害または活性化する生物活性ペプチド、（vii）クラスB GPCRリガンド、および（viii）クラスB GPCRリガンドを阻害または活性化する生物活性ペプチドからなる群より選択される、請求項57〜73のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  75. 2つの生物活性ペプチド配列を含み、1つの生物活性ペプチド配列が前記軽鎖可変領域に移植されており、かつもう1つの生物活性ペプチド配列が前記重鎖可変領域に移植されている、請求項57〜74のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  76. 前記生物活性ペプチドが、補体系の阻害物質である、請求項57に記載の単離された抗体。
  77. 前記生物活性ペプチドが、
    X1CTX2X3X4CX5Q（SEQ ID NO:5）
    によるSGMIコアアミノ酸配列を含み、
    X1がFまたはVであり、
    X2がRまたはKであり、
    X3がKまたはLであり、
    X4がLまたはWであり、かつ
    X5がYまたはNであり、かつ
    該生物活性ペプチドが、MASP-1またはMASP-2の少なくとも一方の活性を阻害する、請求項76に記載の単離された抗体。
  78. 前記生物活性ペプチドが、以下の配列:SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項77に記載の抗体。
  79. ポリペプチドが、MASP-1の活性を阻害する、請求項77に記載の抗体。
  80. 前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:6〜SEQ ID NO:8のうちの少なくとも1つを含む、請求項79に記載の抗体。
  81. ポリペプチドが、MASP-2の活性を阻害する、請求項77に記載の抗体。
  82. 前記生物活性ペプチドが、SEQ ID NO:9〜SEQ ID NO:11のうちの少なくとも1つを含む、請求項81に記載の抗体。
  83. 一方の生物活性ペプチドがMASP-1を阻害し、かつ他方の生物活性ペプチドがMASP-2を阻害する、請求項75に記載の抗体。
  84. 前記生物活性ペプチドと実質的に同じ生物学的活性を有する、請求項57〜83のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  85. 請求項57〜84のいずれか一項に記載の単離された抗体のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
  86. 請求項85に記載の核酸分子を含む、細胞。
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