JP2016020346A

JP2016020346A - モノクローナル抗体８ｈ９の使用

Info

Publication number: JP2016020346A
Application number: JP2015144323A
Authority: JP
Inventors: チャン，ナイ−コング，ヴィー．; Nai-Kong V Cheung
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2016-02-04
Also published as: US20100143245A1; EP2121008A4; EP2121008A2; KR20100014527A; CA2680111A1; CA2680111C; WO2008116219A3; JP2014088411A; CN101687021A; JP2010523478A; CN101687021B; WO2008116219A2

Abstract

【課題】腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長する方法の提供。【解決手段】ヒトＢ７−ホモログ３の４Ｉｇドメインアイソフォームである４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３に結合するモノクローナル抗体８Ｈ９又はその誘導体を使用し、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能な薬剤を効果的な量含む組成物を、対象者に投与する工程を備える使用方法。該薬剤が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１−６から選択される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を１以上含むポリペプチドであるモノクロナール抗体８Ｈ９又はその誘導体。【選択図】図１

Description

本発明は、癌患者の治療におけるモノクローナル抗体８Ｈ９又はその誘導体の使用に関する。
尚、本発明は、米国出願番号第６０／８９６,４１６号（出願日２００７年３月２２日）、及び米国出願番号第６０／９１５,６７２号（出願日２００７年５月２日）の優先権の利益を主張する。これら先行出願の全内容及び開示は、参照することにより本出願に組み込むものとする。

腫瘍限定的な表面抗原は、診断及び免疫ベースの治療のための標的となることができる。標的免疫療法に使用される理想的な腫瘍抗原は、正常細胞に存在せず、腫瘍細胞表面で多量に発現する必要がある。さらに、モノクローナル抗体によって認識される系譜を変化させる腫瘍細胞上に発現する「ジェネリック」腫瘍特異抗原は、抗体ベースの戦略において広範囲に有用性を有することができる。マウスのモノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される新規の５８ｋＤ表面腫瘍関連抗原が、既に報告されている（例えば、特許文献１参照）。８Ｈ９によって認識される抗原は、神経外胚葉、間葉、及び上皮由来の腫瘍の広範囲の細胞膜上に発現するとともに、正常組織への分布が制限されていた。この新規の抗体−抗原系は、腫瘍標的と免疫療法において非常に有望である。

モノクローナル抗体８Ｈ９は、腫瘍の標的化と撮像化、及び腫瘍細胞のパージング（除去）に使用することが可能である。また、８Ｈ９抗原は、神経芽細胞腫、脳腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、ＰＮＥＴ、黒色腫、非上皮性悪性腫瘍、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、及び様々な組織由来の上皮性悪性腫瘍を含む広範囲のヒトの癌に対する抗体ベースの免疫療法を目的とした潜在的な標的である。８Ｈ９の一本鎖抗体の構成又は抗体融合構成体もまた、開示されている（例えば、特許文献１参照）。

米国公開公報第２００５／０１６９９３２号

本開示は、モノクローナル抗体８Ｈ９を用いて、腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長するデータをさらに提供する。

本出願を通じて、様々な参考文献が引用されている。これら刊行物の開示は、それら全てを参照することにより本出願に組み込むこととし、これにより本発明に付随する分野の状況を完全に記載する。

本発明は、腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長する方法を提供する。本方法は、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能な薬剤を効果的な量含む組成物を、対象者に投与する工程を備える。

本方法は、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原を発現する腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長する方法を提供する。本方法は、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能な薬剤を効果的な量含む組成物を、対象者に投与する工程を備える。

本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ９と同じ又は類似の結合特異性を有する抗体をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、候補抗体をＳＥＱＩＤＮＯ．１５の配列を含むポリペプチド又はそのフラグメントと接触させる工程を備える。ポリペプチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体８Ｈ９と同じ又は類似の結合特異性を有する抗体である。本発明はまた、上記のスクリーニング方法によって認識される抗体を提供する。

本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原を提供する。抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５と、少なくとも約１０％、好ましくは１０％から９９％の間の相同性を有する。

８Ｈ９の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ：Single-Chain Variable Fragment）アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．７）及び遺伝子配列（センス及び相補性、ＳＥＱＩＤＮｏ．８−９）を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ：Complementary determining regions）は、次に示す順序で囲み枠として示される：ＣＤＲ−１（ＨＣ重鎖）、ＣＤＲ−２（ＨＣ）、ＣＤＲ−３（ＨＣ）、ＣＤＲ−１（ＬＣ軽鎖）、ＣＤＲ−２（軽鎖）、ＣＤＲ−３（軽鎖）。８Ｈ９のｓｃＦｖのヌクレオチドとアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．１０−１２）を示す。変異８Ｈ９ｓｃＦｖは、以下に示す部位特異的突然変異生成（ＶＨ：Ｋ１３ＥとＶＬ：Ｒ１８Ｑ、Ｒ４５Ｑ、Ｋ１０３Ｅ、Ｋ１０７Ｅ）を有することにより、ＰＩを６．４から４．８に、正味荷電を−１から−９に下げることになり、これは非特異的正常細胞の粘着性を下げる戦略である。８Ｈ９のウエスタンブロット法の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。８Ｈ９のアフィニティー精製（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット法）を示す。８Ｈ９のアフィニティー精製（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色）を示す。ＦＡＣＳによって分析された、Ｋ５６２細胞表面上のＨＬＡ−Ｉ（ＭＨＣクラスＩ）とＢ７Ｈ３タンパク質発現を示す。Ｋ５６２とＨＴＢ８２細胞に対するＮＫ９２細胞の細胞溶解活性を示す（細胞媒介性細胞崩壊のためのクロム遊離アッセイの結果）。ＨＴＢ８２細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解活性を示す（細胞媒介性細胞崩壊のためのクロム遊離アッセイの結果）。ＮＫ９２ＭＩ：親ＮＫ細胞、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＴＧＬＳ−８Ｈ：８Ｈ９のｓｃＦｖで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ。Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解活性を示す（細胞媒介性細胞崩壊のためのクロム遊離アッセイの結果）。ＮＫ９２ＭＩ：親ＮＫ細胞、ＮＫ９２ＭＩ／ＮＴＧＬＳ−８Ｈ：８Ｈ９のｓｃＦｖで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ。

本発明は、腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長する方法を提供する。本方法は、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能な薬剤を効果的な量含む組成物を、対象者に投与する工程を備える。本明細書で用いられる「予後を改善する」とは、疾患の将来的な方向性を可能な限り回復又は治癒に導くことが可能な癌の早期発見と治療の早期開始を意味する。この一方、「生存期間を延長する」とは、癌診断後の平均余命を長くすることを意味する。一実施形態では、癌はモノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原を発現する。

一実施形態では、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５の配列を含むポリペプチドである。その他の実施形態では、抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５のポリペプチドホモログである。一般的には、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５に対し、少なくとも約１０％の相同性、又は少なくとも約１５％の相同性、又は少なくとも約２５％の相同性、又は少なくとも約３５％の相同性、又は少なくとも約４５％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性、又は１００％までの相同性がある。当業者であれば、容易にＳＥＱＩＤＮｏ．１５のホモログ又はオーソログといえる（例えば、表１参照）。

ある実施形態では、上記組成物中の薬剤は、モノクローナル抗体８Ｈ９由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。このようなポリペプチドの例は、一本鎖抗体又は抗体融合構成体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「一本鎖抗体」は、免疫グロブリン分子（４つのペプチド鎖）を、通常、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を組み込んだ単一ペプチドの形態で、抗原又は腫瘍への免疫反応性と特異性を保有する単一ペプチドに還元することを示す。一方で、「抗体融合構成体」は、このような一本鎖抗体をその他のタンパク質又はペプチドに化学的に又は遺伝的に連結させることにより新規の抗体融合構成体を形成することを示す。

一実施形態では、このようなポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１−３、４−６、又は１−６のＣＤＲを含む。好ましくは、上記ポリペプチドにおけるＣＤＲ以外の配列は、ヒト由来である。その他の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．７又は１２のアミノ酸配列を有する。さらに、上記組成物中の薬剤は、直接的に又は間接的に標識薬剤又は細胞毒性薬に連結することができる。このような標識薬剤又は細胞毒性薬の代表例は、ラジオアイソトープ及び緑膿菌外毒素等の毒素を含むが、これらに限定されない。

一般的に、上記組成物は、腹腔内、静脈内、オマヤ貯留槽又は脊椎穿刺による髄腔内、腫瘍（原発性又は転移性のどちらか）又は腫瘍を取り囲む組織へと実質内に投与されることができる。

上記組成物の薬剤は、ラジオアイソトープで標識された時に、治療目的及び撮像目的のどちらにも用いることができる。一実施形態では、上記組成物中のこのような薬剤は、１注射当り０．０１ｍｇ乃至２０ｍｇで投与されるとともに、１ｍＣｉ乃至１００ｍＣｉの１３１−ヨードを運搬し、好適な実施形態では治療に用いられる。

他の実施形態では、上記組成物中の薬剤は、１注射当り０．０１ｍｇ乃至２０ｍｇで投与されるとともに、１ｍＣｉ乃至１００ｍＣｉの１２４−ヨードを運搬し、好適な実施形態では撮像及び線量測定の用途に用いられる。

他の実施形態では、上記組成物中の薬剤は、１注射当り０．０１ｍｇ乃至２０ｍｇで投与されるとともに、１ｍＣｉ乃至１００ｍＣｉの１３１−ヨードに生物学的に等価な放射能量のベータ放射体又はアルファ放射体を運搬する。このようなベータ放射体又はアルファ放射体は、２１３−ビスマス、２１２−ビスマス、１１１−インジウム、１１８−レニウム、９０−イットリウム、２２５−アクチニウム、及び１７７−ルテチウム、又は８５−アスタチンであることができる。

他の実施形態では、上記組成物中の薬剤は、１注射当り０．０１ｍｇ乃至２０ｍｇで投与されるとともに、１ｍＣｉ乃至１００ｍＣｉの１２４−ヨードに生物学的に等価な放射能量のポジトロン放射体を運搬する。このようなポジトロン放射体は、９４ｍ−テクネチウム、６４−銅、８９−ジルコニウム、６８−ガリウム、６６−ガリウム、７６−臭素、８６−イットリウム、８２−ルビジウム、１１０ｍ−インジウム、１３−窒素、１１−炭素、又は１８−フッ素であることができる。

好適な実施形態では、上記組成物は、対象者が１以上の他の癌治療の処置を受けた後に投与される。さらなる実施形態では、上記組成物は、対象者が１以上の他の癌治療の処置を受けている時に同時に又は連続して投与される。このような他の癌治療の例は、外科手術、化学療法、及び放射線療法を含むが、これらに限定されない。

また、本発明は、上述した特性（例えば、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能である等）を、腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長するための薬物として有する薬剤の使用方法を提供する。一実施形態では、腫瘍はモノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原を発現する。この薬剤を含む組成物を投与する経路と投与量は、当業者によって容易に決定可能である。例えば、組成物は、上述した投与経路と投与量に基づいて投与されることができる。

また、本発明は、モノクローナル抗体８Ｈ９と同じ又は類似の結合特異性を有する抗体をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、候補抗体を、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５の配列を含むポリペプチド又はそのフラグメントと接触させる工程を備える。ポリペプチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体８Ｈ９と同じ又は類似の結合特異性を有する抗体である。本発明はまた、本明細書に記載の方法によって同定される抗体を含む。

本発明はまた、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原を提供する。抗原は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５と少なくとも約１０％、好ましくは１０％と９９％の間の相同性を有する。

本発明はまた、ＮＫ／Ｔ細胞中の抗転移免疫応答を上方制御する方法を提供する。本方法は、ＮＫ／Ｔ細胞に存在するＢ７Ｈ３レセプターを適切な薬剤で阻害する工程を備える。

本発明はまた、モノクローナル抗体８Ｈ９がその標的物質に結合することを競合的に阻害する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、候補物質と標的物質が結合可能な条件下で、候補物質を標的物質に接触させる工程を備える。好適な実施形態では、上記方法は、複合体の形成、及び候補物質と標的物質を検出することをさらに備える。本実施形態では、標的物質はＢ７Ｈ３であり（ＣＤ２７６としても公知である）、薬剤は抗体、ペプチド、細胞表面タンパク質、又はリガンドであることができる。

本発明は、以下に続く実験の詳細事項を参照することによってより理解されることになるが、特定の詳細な実験は、実例にすぎず、本明細書に記載されるとともに後述する特許請求の範囲によって定義される本発明を制限することを意図したものではない。

実施例
（実施例１）
（脳脊髄液を通じて運ばれる１３１ヨード８Ｈ９放射免疫治療を含むモダリティを組み合わせることによる改善結果）
＜背景＞
ＣＮＳ（脳実質又は軟膜（ＬＭ：leptomeninges））に転移する原発性脳腫瘍及び癌は、制御が困難である。脳脊髄液（ＣＳＦ）コンパートメントを経由して投与された抗体ベースの標的治療は、治療潜在性を有する。モノクローナル抗体８Ｈ９は、ヒト固形腫瘍の広範囲に反応するマウスＩｇＧ１抗体である。オマヤ槽を介して投与される１３１−ヨード−８Ｈ９は、非ヒト霊長類における有益な薬物動態を有するとともに毒性は最小減である。

＜方法＞
第１相試験では、１５人の患者（患者（ｐｔ）、年齢２−３４歳）（１黒色腫、３再発上衣腫、８再発性ＣＮＳ神経芽細胞腫(ＮＢ)、３再発髄芽腫）が、線量測定用の２ｍＣｉのイントラ−オマヤ（Intra-Ommaya）１３１Ｉ−８Ｈ９を受け、続いて一週間後に、１０（ｎ＝３患者（ｐｔ））、２０（ｎ＝３）、３０（ｎ＝６）、又は４０（ｎ＝３）のイントラ−オマヤ治療投与量を受けた。一連の脳脊髄液（ＣＳＦ）と血液がサンプリングされ、線量測定の演算がなされた。核スキャンが２４時間の時点で実施され、１３１Ｉ−８Ｈ９の位置確認が試験された。１３１−ヨード−８Ｈ９線量測定と治療投与量は、患者（ｐｔ）がＰＤ（進行性疾患）を有していない場合には、１ヶ月後に再度実施された。

＜結果＞
グレード１又は２の熱、頭痛、又は嘔吐を含む副作用があり；１人は、第１回目の注射（３０ｍＣｉ）において一時的なグレード３のＡＬＴ上昇があった。ＣＳＦに対する計算平均放射線量は、３５．７（範囲１５−７９）ｃＧｙ／ｍＣｉであり、平均血液用量は、２．４ｃＧｙ／ｍＣｉであった。１５人の患者（ｐｔ）のうち、８人（＃１群）は神経芽細胞腫の一次診断を有していた。彼らは、（３．８年の平均年齢中央値で）ＣＮＳ転移が進行した時に、１３１−ヨード−８Ｈ９を含むサルベージ投薬管理によって治療された。８人全ての患者（ｐｔ）が無進行で生存し続け（１３１−ヨード−８Ｈ９投与後、３＋、１０＋、１６＋、１６＋、１８＋、１８＋、２０＋、３０＋ヶ月後、及びＣＮＳ／ＬＭ再発後、５−４３＋ヵ月後）、１人の患者（ｐｔ）において、１３１−ヨード−８Ｈ９は、ＬＭ疾患のＣＲ（完全寛解）を成し遂げた。対照的に、ＣＮＳ／ＬＭのＮＢの発現から死に至るまでの平均期間は、２７の歴史的対照では５．４ヶ月であった。急性副作用は自己限定性であり、４０ｍＣｉ投与量ではＤＬＴ（用量規制毒性）は見られなかった。

＜結論＞
ＣＮＳ転移と類似して殆どの他の固形腫瘍では、従来の治療法はＮＢ−ＣＮＳには効果がないものであった。イントラ−オマヤ１３１−ヨード−８Ｈ９は、（１）安全であり、（２）ＣＳＦと髄質に対して好ましい線量測定を有し、（３）８Ｈ９−陽性ＬＭ／ＣＮＳ癌の治療において従来のモダリティを用いてサルベージ治療を追加すると臨床的有用性を有することができる。

（実施例２）
（ＰＥＴ／ＣＴスキャンにおいて１２４−ヨード−８Ｈ９を用いたＣＮＳ腫瘍の解像度及びコントラスト撮像の改善）

＜背景＞
実施例１に記載する如く、脳脊髄液（ＣＳＦ）コンパートメントを経由して投与された抗体ベースの標的治療は治療潜在性を有し、放射性標識１３１−ヨード−８Ｈ９は転移性疾患を治療するのに用いることができる。患者の予後は、治療の改善によってのみではなく、転移性疾患の発見の改善及び線量測定の改善によって良くなることになる。以下に続く例は、神経芽細胞腫の発見の改善手段を記載する。

＜方法＞
５人の患者において１２４−ヨード−８Ｈ９が髄腔内に投与され、一連のＰＥＴ／ＣＴ撮像及びＣＳＦのサンプリングが実施された。患者はＣＮＳ腫瘍（脈絡叢癌、転移性横紋筋肉腫、及び転移性神経芽細胞腫）を有していた。１．７−２ｍＣｉの１２４−ヨード−８Ｈ９はオマヤ貯留槽を介して投与された。ＰＥＴ／ＣＴスキャンは、注射後、約４、２４、及び４８時間後の時点で得られた。４８時間経過後の一連の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルが得られた。画像は、３つ全ての時間点で脊柱上に関心領域を配することによって分析された。ＰＥＴ画像は、ＣＳＦコンパートメントの範囲内で直接的な活性測定値を提供した。

＜結果＞
１２４−ヨード−８Ｈ９ＰＥＴスキャンは、ＭＲＩ上の構造的病変を有する２人の患者における疾患を標的とする抗体分布の高解像度画像を提供した。２４時間時点では、殆どの抗体が室から除去され、硬膜管（thecal sac）を経由した脳弓隆部周りに分布していた。この分布は、前治療^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ脳槽造影法とよく一致していた。肝臓、脾臓、及び膀胱における全身作用は、２４時間と４８時間時点においてみられた。生物学的なＴ１／２クリアランスは、ＣＳＦに対して１４．１から９２．９ｃＧｙ／ｍＣｉの投与量に対応して８．９時間から６４．６時間の範囲であった。

＜結論＞
１２４−ヨード−８Ｈ９のＰＣＴ／ＣＴは、１３１−ヨード−８Ｈ９を備えるＳＰＥＣＴよりも高い解像度とコントラスト画像を提供し、これは分布、標的化、線量測定に用いられる。

（実施例３）
（８Ｈ９抗体は、ヒトＢ７−ホモログ３の４Ｉｇドメインアイソフォームである４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３を認識する）

以下の実施例は、８Ｈ９抗体によって認識される抗原の生物学的特性を記載する。抗原の同定は、ヒトＢ７−ホモログ３の４Ｉｇドメインアイソフォームである４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３である。

＜細胞培養＞
ヒト神経芽細胞腫細胞株ＬＡＮ−１は、Dr．Robert Seeger（Children's Hospital of Los Angeles、ロサンゼルス、カリフォルニア州）によって提供された。ヒト横紋筋肉腫細胞株ＨＴＢ８２、骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳ、及びバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ベテスダ）から購入した。全ての細胞株は、５％のＣＯ２インキュベーター内３７℃で、１０％子牛血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。

＜モノクローナル抗体＞
８Ｈ９と対照ＭｏＡｂ５Ｆ９は、どちらもマウスＩｇＧ１であり、ヒト神経芽細胞腫に対して作り出された。これらは、プロテインＡ（GE Healthcare社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）アフィニティークロマトグラフィーによって、使用前に精製された。

＜全細胞溶解液とウエスタンブロット法＞
８Ｈ９−陽性細胞株（ＬＡＮ−１、ＨＴＢ８２、及びＵ２ＯＳ）及び８Ｈ９−陰性細胞株（Ｄａｕｄｉ）は〜８０％コンフルエンスまで成長した。細胞は、２ｍＭのＥＤＴＡを用いて採取され、氷冷ＰＢＳで洗浄された。

Native PAGEは、NativePAGE Novex・ビス-トリス・ゲルシステム（Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて製造者の取扱説明書に基づき実施した。簡潔に言えば、細胞は、氷上で（２０分間）、NativePAGE１×サンプルバッファー＋１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）のいずれか）とプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Roche Applied Science社、ドイツ）中に溶解された。溶解液は４℃で２０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより澄んだ状態とした。５０μｇの全細胞溶解液は、NativePAGE Novex ４−１６％ビス−トリス・ゲルによって分析した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元又は還元条件下で、トリス−グリシン・レディゲル（Ready gel）システム（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて実施された。簡潔に言えば、細胞は、氷上で（２０分間）、Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファー（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．２、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠）中に溶解された。溶解液は上述と同様に、澄んだ状態とし、２５〜５０μｇの全細胞溶解液は、４−１５％トリス−塩酸ゲルによって分析した。

どちらかのＰＡＧＥにおける電気泳動の後、サンプルは、免疫ブロットＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド社）上に移動され、室温（ＲＴ）で１時間、ＴＢＳＴ中の１０％粉乳でブロックされ、一次抗体（８Ｈ９は１０−２０μｇ／ｍｌ、５Ｆ９は２０μｇ／ｍｌ）とともに３時間室温（ＲＴ）で培養された。その後、膜はＴＢＳＴで洗浄され、二次ペルオキシダーゼ結合AffiniPureヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research社、ウエストグローブ、ペンシルベニア州）とともに培養された。バンドは、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて検出された。

＜細胞下分画＞
粗膜調製のために、ＬＡＮ−１細胞は、組織培養皿からピペットで取り出され、氷冷ＰＢＳで洗浄され、氷上でスクロースバッファー（０．２５Ｍスクロース、５ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．２、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠）内に、Dounceホモジナイザー（Kontes社、バインランド、ニュージャージー州）を用いて溶解された。顕微鏡により判断したところ、１０００ｇで１０分間遠心分離することにより、全ての核がペレット状となった。１０００ｇにおける浮遊物は、Beckman L-70K（25,000rpm、SW41Tiローター）で３０分間、１００，０００ｇで超遠心分離機にかけられることにより、細胞膜微粒子（P100）と細胞質（S100）分画が得られた。細胞質分画は１％Ｔｒｉｔｏｎに調製され、その一方で粗核および細胞膜分画は、Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファーに再懸濁され、使用前に澄んだ状態とした。

＜８Ｈ９抗原アフィニティー精製＞
８Ｈ９抗原は、ＭｏＡｂ８Ｈ９を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、ＬＡＮ−１細胞抽出物から精製された。８Ｈ９アフィニティーカラムは、Pierce’s Protein G IgG Plus Orientation キット(ピアス社、ロックフォード、イリノイ州)を用いて、製造者の取扱説明書に基づき調製された。

４ｍｇのＬＡＮ−１全細胞溶解液又は等価的な細胞膜分画（上述の方法で調整したもの）は、２０μｌの８Ｈ９−プロテインＧセファロース（スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）と共有結合的に架橋、３ｍｇの結合８Ｈ９／ｍｌビーズ））とともに一晩４℃で培養された。Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファーで全面的に洗浄した後、コラムは、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．２、１Ｍ塩化ナトリウムを含む）、０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．８とｐＨ２．０）、ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノール・ブルー）、及びＳＤＳサンプルバッファーで順番に溶出させ、そして水中で５分間煮沸した。溶出物の小さいアリコート（分割量）を観察することにより、８Ｈ９抗体を用いて非還元下でウエスタンブロット分析を用いて８Ｈ９抗原の存在をみることができた。溶出物の１／４は、銀染色（SilberQuest Silver Staining Kit, Invitrogen社）によっても分析された。最後に、８Ｈ９抗原−陽性溶出物（０．１Ｍのグリシン−塩酸、ｐＨ２．０溶出分画）の半分が、コロイダル・クマシー・ブルー染色（GelCode Blue Stain Reagent ピアス社）によって分析され、８Ｈ９抗原−陽性バンドは、MSKCC Microchemistry and proteomics core facilityによる質量分光同定に送られた。

＜結果＞
＜８Ｈ９抗原のウエスタンブロット法による検出＞
８Ｈ９抗原は、天然状況下でNativePAGE Novex・ビス−トリス・ゲルシステムを用いて、８Ｈ９ＭｏＡｂによって初めて検出された。単独のバンドは、全ての８Ｈ９−陽性細胞株（ＬＡＮ−１、ＨＴＢ８２、及びＵ２ＯＳ）において検出されたが、８Ｈ９−陰性細胞株（Ｄａｕｄｉ）では検出されず、これは、１％非イオン界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００又はＤＤＭのいずれか）を用いたフローサイトメトリー分析によって規定されたものである（データ示さず）。本検出は、５Ｆ９（Ｋｕ７０タンパク質に対する対照ＭｏＡｂである）が異なる大きさのバンドを検出した（データ示さず）ことから、特異的であった。

その後、８Ｈ９抗原もまた、非還元条件下で、トリス−グリシン・レディゲル SDS-PAGEシステムを用いて８Ｈ９ＭｏＡｂによって検出された。天然の条件下と同じ様に、単独のバンド（〜８５ＫＤ、Invitrogen SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard をタンパク質分子量マーカーとして使用）が全ての８Ｈ９−陽性細胞株（ＬＡＮ−１、ＨＴＢ８２、及びＵ２ＯＳ）において検出されたが、８Ｈ９−陰性細胞株（Ｄａｕｄｉ）では検出されず、これは、１％Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファを用いたものである（図３参照、データ示さず）。本検出は、５Ｆ９（Ｋｕ７０に特異的なＩｇＧ１）が同じ大きさのバンドを検出しなかった（データ示さず）ことから、特異的であった。検出された８Ｈ９抗原の大きさは、８Ｈ９放射性免疫沈殿法を用いた過去のデータと一致している。我々は、還元条件下ではウエスタンブロット分析によって８Ｈ９抗原を検出することができず（データ示さず）、８Ｈ９が立体配座的に感受性の高いエピトープを認識していることを提示する。

細胞下分画後、８Ｈ９抗原は、細胞膜分画内で大部分が検出され（図３）、これは８Ｈ９抗原が細胞表面抗原であるという過去のデータに一致している。そして、細胞膜分画内で８Ｈ９抗原を濃縮することは、アフィニティー精製を用いて実施された。

＜８Ｈ９抗原のアフィニティー精製＞
ＬＡＮ−１細胞株が抗原精製のために選択され、これは、ＬＡＮ−１細胞株が、８Ｈ９抗原の比較的高レベルな発現及び組織培養内で急速に成長する能力を有しているからである。８Ｈ９アフィニティーカラムは、８Ｈ９のＦｃ部分が規定の方向性においてゲルマトリックスのプロテインＧと共有結合的に結合することによって調製された。これにより、抗原結合のための遊離抗体結合部位をより多く露出させることが可能となる。架橋に用いられる従来のイミドエステルＤＭＰの代わりにＮＨＳ−エステルＤＳＳを使用すると、担体からの抗体の溶出が有意に防がれることになる。

ＬＡＮ−１（及び陰性対照としてのＤａｕｄｉ）全細胞溶解液又はＬＡＮ−１細胞膜分画のいずれかを８Ｈ９−プロテインＧセファロースとともに一晩培養した後には、８Ｈ９抗原のかなりの部分（＞５０％）がセファロースに結合されていた（図４、データ示さず）。８Ｈ９抗原が０．１Ｍグリシン−塩酸、ｐＨ２．０において特異的且つ圧倒的に溶出したことが、ウエスタンブロット分析によって観察され（図４、データ示さず）、８Ｈ９抗体とその抗原との間の非常に強い相互作用が示された。同じ溶出液を銀染色した後、明らかなバンドが、ＬＡＮ−１細胞抽出物においてのみ検出され、Ｄａｕｄｉ細胞抽出物からは検出されなかった（図５）。溶出液は、８５ＫＤ付近で、質量スペクトル解析に用いられるのに十分澄んだ状態であった。最後に、バンド中における十分な量の８Ｈ９抗原（〜１０ｎｇ、コロイダル・クマシー・染色によって可視化、データ示さず）が採取され、質量分析同定に送られた。

＜質量分析同定＞
トリプシン消化物は、２μＬ総容積のＰｏｒｏｓ５０Ｒ２（PerSeptive社）逆相ビーズを用いたマイクロ・クリーン・アップ工程を受け、エッペンドルフ型ゲルローディングチップに詰められた。質量分析（MALDI-ReTOF）が、ＲＰ−マイクロチップカラムから回収されたペプチドプール（１６＆３０％ＭｅＣＮ）において、遅延引き出し（Delayed extraction）を備えるBruker Ultraflex TOF/TOF機器を用いて実施された。質量フィンガープリント法については、MALDI-ReTOF実験両方を組み合わせた実験的質量（ｍ/ｚ）が利用されることにより、PeptideSearch （Mathias Mann、Max-Planck Institute for Biochemistry、マーティンスリート、ドイツ）を用いて非冗長ヒトタンパク質データベース（ＮＲ；〜192,489エントリー；ＮＣＢＩ；ベテスダ、メリーランド州）が調査される。分子量の範囲は予測される量の２倍の範囲が網羅されており、質量精度制限は５０ｐｐｍよりもよく、切断部位を逃す最大分子量は、ペプチドごとに考慮した。部分的に分画されたプールから選択されたペプチドの質量分析配列（MALDI-TOF-MS/MS）が、「ＬＩＦＴ」モードのBruker Ultraflex TOF/TOF機器上、及び、MASCOT MS/MS Ion Search program（Matrix Science社）を用いたヒトデータベースを検索するために取得されたフラグメントイオンスペクトル上で実施された。ペプチド消化物から２つのペプチド配列が同定された；ＮＰＶＬＱＱＤＡＨＳＳＶＴＩＴＰＱＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１３）、及びＳＰＴＧＡＶＥＶＱＶＰＥＤＰＶＶＡＬＶＧＴＤＡＴＬＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４）。

これらにより、抗原が、４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３（ヒトＢ７−ホモログ３の４Ｉｇアイソフォームであり、ＣＤ２７６と呼ばれることもあり、受入番号ＮＭ＿００１０２４７３６．１であり、５７２３５ｋＤ分子量の５３４アミノ酸のペプチドをコードするものである）として明確に同定された。遺伝子は、染色体１５ｑ２４．１上に位置している。成熟ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りである（潜在的なＮ−糖鎖付加部位が下線で示されている）：

現在のところ、新規のＢ７は、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、及びＢ７Ｈ４を含む（表２参照）^４。これらのｍＲＮＡは極めて遍在的であるが、これらのタンパク質分子は転写後レベルにおいて別個に制御されることができる。Ｂ７Ｈ３は、タンパク質のＢ７共刺激ファミリーのメンバーとしてChapoval^５らによって最初にクローンされた。その後、Ｉｇ様ドメインを２つ有する代わりに４つ有するタイプＩ細胞膜タンパク質として存在することが決定され、４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３という新しい名前が与えられた（表２参照）^６。インビトロの４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３は、Ｔ細胞活性化^６のための共刺激よりも抑制的であった。Ｂ７Ｈ３タンパク質発現は、胃、ＮＳＣＬＣ、神経芽細胞腫、及び多数のヒト腫瘍細胞株で発見されてきた^{５、７、８}。４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３を発現するヒト神経芽細胞腫瘍及び細胞株は、ＮＫ−媒介性免疫応答^７を抑制することができる。Ｂ７Ｈ３は、胃癌の５９％及び胃腺腫サンプルの１００％で発現が確認されており^９、より良い生存率と相関性があるように見受けられる。マウスモデル^{１０、１１}及びヒト黒色腫^１２においては、Ｂ７Ｈ３は抗腫瘍応答を立証するように見受けられる。マウスＢ７Ｈ３は急性及び慢性の同種移植拒絶反応を促進させる^１３。Ｂ７Ｈ３は、腫瘍免疫学的監視を促進する役割を高い確実性で有している一方、４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３は抑制作用を発揮する^４。４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３が、脳と胎盤以外の殆どの部分において主要アイソフォームであることは、興味深いことである。胎盤において、Ｂ７Ｈ３は、ウエスタンブロット法によると１１０ｋｄの二重バンドと６０ｋｄの単一バンドである^１５。これは、妊娠中の絨毛外栄養膜において最も顕著である。Ｂ７Ｈ３は、骨形成においても役割を有すると考えられている^１６。

４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３を８Ｈ９の抗原として同定することにより、この糖タンパク質がヒトの固形腫瘍において高度に発現することが示される。８Ｈ９が認識するエピトープは、正常組織に対する腫瘍に制限されているように見受けられる。現在までに公開されたｍＲＮＡの作用に基づき、当業者は、この抗原が腫瘍標的となるには遍在的且つ不適当であると結論付けることになる。しかしながら、我々はそうではないことを発見した。我々は、４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３を対象とする抗体は主な副作用（最近、Ｔ細胞を対象とする抗−ＣＤ２８抗体又は抗−ＣＴＬＡ４を投与した時に観察されていたような副作用）なしに安全に投与可能であることを主張する。我々は、４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３が免疫共抑制分子であり、そして８Ｈ９のような抗体がその機能を調節可能であるとともにヒトの癌の範囲全域で宿主抗腫瘍免疫応答を促進可能であることを確信している。

（実施例４）
（８Ｈ９モノクローナル抗体を用いた、活性化ＮＫ/Ｔ細胞におけるＢ７Ｈ３レセプターの単離及び同定）
モノクローナル抗体８Ｈ９は、ヒトＢ７−ホモログ３の４Ｉｇドメインアイソフォームである４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３を認識する。ヒトＢ７−ホモログ３（Ｂ７Ｈ３）は、ＣＤ２７６としても知られており、免疫系に負の信号をもたらす、特にＮＫ／Ｔ細胞に負の信号をもたらし、腫瘍細胞が免疫応答を免れることが可能となるとして考えられている。モノクローナル抗体８Ｈ９が標的とする同定された抗原４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３は、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）の優性異型である。４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３は、Ｖ−様及びＣ−様Ｉｇドメインを複製するスプライス変異を含むヒトＢ７Ｈ３の優性表現型である^１４、６。

免疫モジュレータとしては、Ｂ７Ｈ３の陽性と陰性両方の免疫学的機能が報告されている。２Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３異型を記載した報告によると、Ｂ７Ｈ３の役割は、活性化Ｔ細胞上の推定レセプターに結合することによってＴ細胞活性化とＩＦＮ−γ生成を促進させることであることが示されている^５。抗腫瘍応答はマウス腫瘍モデルにおけるＢ７Ｈ３発現によって高められた^１１。患者において、胃癌のＢ７Ｈ３陽性は生存率の増加と相互関係がある^９。反対に、Ｂ７Ｈ３の共抑制の役割は、２Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３の両方がＴ細胞増殖とサイトカイン生成を抑制すること^６、Ｂ７Ｈ３がＢ７Ｈ３欠損マウスにおけるＴＨ１媒介免疫応答を選択的に下方制御すること^１７、及び４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３がＮＫ細胞の表面において推定抑制レセプターと相互作用することによって神経芽腫細胞のＮＫ媒介溶解を抑制すること^７という報告によって支持された。相反する発見は、拮抗Ｂ７Ｈ３レセプターによって、説明されることが可能であった。

以下の例は、活性化ＮＫ／Ｔ細胞上のＢ７Ｈ３レセプターがどのようにして同定及び単離可能であるかを示す。本実験は実施されなかった。

ＮＫ／Ｔ細胞上のＢ７Ｈ３レセプターは、２Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３−Ｆｃと４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３−Ｆｃの両方をベイトとして使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。Ｂ７Ｈ３−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の方法で作り出される：２Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３−Ｆｃは、R&D Systemsから購入する一方で、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３の細胞外ドメインをエンコードするｃＤＮＡ配列は、ｐＦＵＳＥ−ｍｌｇ−Ｇ２ａ−Ｆｃ２発現ベクターを用いてマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域に融合させる。融合タンパク質は、ＣＧ４４−ＣＨＯ細胞株において発現され、プロテインＡセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。融合タンパク質の純度と機能性は、クマシー・ブルー染色と抗−Ｂ７Ｈ３ウエスタンブロット法によって評価される。

Ｂ７Ｈ３レセプターに陽性であるＮＫ／Ｔ細胞が選択される。従来のＮＫ／Ｔ細胞株ＮＫ９２、ＮＫＬ、ＮＫ３．３、ＹＴ、ＴＡＬＬ−１０４に加えて、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から濃縮された活性化ＮＴ／Ｔ細胞は、Ｂ７Ｈ３−Ｆｃとともに培養され、その後、蛍光共役二次抗体を備える染色を用い、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析される。陽性細胞は、さらにＢ７Ｈ３−Ｆｃウエスタンブロット法によって確認される。

Ｂ７Ｈ３レセプターに陽性であるとして選択されたＮＫ／Ｔ細胞は、アフィニティー精製に用いられる。Ｂ７Ｈ３−Ｆｃアフィニティーカラムは、Ｂ７Ｈ３−ＦｃのＦｃ部分をゲルマトリックス上のプロテインＧに、Protein G IgG Plus Orientation キット(ピアスバイオテクノロジー社)を用いて共有結合的に結合させることにより調製される。Ｂ７Ｈ３レセプター陽性細胞からの細胞抽出物は、カラム上のセファロースビーズとともに培養される。カラムは、広範囲に洗浄され、溶出される。Ｂ７Ｈ３レセプターの存在と純度はＢ７Ｈ３−Ｆｃウエスタンブロット法と銀染色によって観察される。２０ｎｇを超えるＢ７Ｈ３レセプター陽性バンドは、質量分析の同定に送られる。

（実施例５）
（抑制性Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）の阻害、及びその後に生じる腫瘍細胞のＮＫ／Ｔ細胞媒介細胞溶解の改善のためのモノクローナル抗体の使用方法）

腫瘍への免疫応答は、Ｔ細胞上の抑制レセプターをその抑制レセプターに特異的なモノクローナル抗体を用いて阻害することによって促進されることが示されてきた。本現象の公知例は、抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を用いてＴ細胞上のＣＴＬＡ−４抑制レセプターを妨害することによって、免疫応答が向上することである。以下の例は、８Ｈ９抗体を用いてＮＫ／Ｔ細胞上のＢ７Ｈ３レセプターを妨害することが、どのようにＮＫ／Ｔ細胞媒介毒性に対して腫瘍細胞を感作させるかを示す。本実験は実施されなかった。

細胞媒介細胞溶解（クロム遊離）アッセイ：ＮＫ細胞媒介細胞溶解アッセイにおいて、ヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２が標的細胞に選択される。ＦＡＣＳ分析に示される如く、Ｋ５６２のＨＬＡ−１とＢ７Ｈ３タンパク質の発現は低い。横紋筋肉腫ＨＴＢ８２細胞は対照として用いる。標準的な４時間^５１クロム遊離アッセイでは、横紋筋肉腫ＨＴＢ８２細胞の１０％以下しかＮＫ９２細胞によって溶解されない一方で、Ｋ５６２細胞の６０％までがＮＫ９２エフェクター細胞によって効果的に殺傷される。Ｋ５６２の標的細胞集団の１グループは、スプライス型の４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３をエンコードする核酸でトランスフェクトされることにより、Ｂ７Ｈ３が本細胞集団において過剰発現となる。Ｋ５６２標的細胞は、１００μＣｉ^５１Ｃｒ／１０^６細胞を用いて１時間３７℃で放射性標識される。モノクローナル抗体８Ｈ９はトランスフェクトされた標的細胞とともに培養される一方で、対照はＨＬＡ−１ｍＡｂＨＢ９５とともに培養される。細胞溶解アッセイは、共抑制Ｂ７Ｈ３レセプターに陽性であるエフェクター細胞を用いて実施される。ＮＫ９２エフェクター細胞は、９６−ウェルプレートにおいて２５０μｌの標的細胞とともに４時間３７℃で培養される。Ｂ７Ｈ３トランスフェクトＫ５６２に対するＮＫ９２エフェクター細胞の細胞溶解活性は、非トランスフェクトＫ５６２に対して減少することになる。回復した細胞溶解活性が、共抑制Ｂ７Ｈ３阻害後に観察されることになる。

（参照）
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Claims

腫瘍を有する対象者の予後を改善する又は生存期間を延長するための薬物の製造における薬剤の使用であって、
前記薬剤が、モノクローナル抗体８Ｈ９によって認識される抗原に結合可能であることを特徴とする使用。
前記腫瘍が、転移性神経芽細胞腫及び神経芽細胞腫からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の使用。
前記薬剤が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１−６からなる群から選択される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を１以上含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載の使用。
前記薬剤が、モノクローナル抗体８Ｈ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体構成体であることを特徴とする請求項１記載の使用。
前記抗体構成体が、一本鎖抗体又は抗体融合構成体であることを特徴とする請求項４記載の使用。
前記薬剤が、直接的に又は間接的に標識薬剤又は細胞毒性薬に結合することを特徴とする請求項１記載の使用。
前記細胞毒性薬が、ラジオアイソトープであることを特徴とする請求項６記載の使用。
前記対象者が１以上の他の癌治療の処置を受けた後に、前記薬剤が投与されることを特徴とする請求項１記載の使用。
前記他の癌治療が、外科手術、化学療法、及び放射線療法からなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の使用。
前記薬剤が、静脈注射、髄膜注射、オマヤ貯留槽又は脊椎穿刺による注射、腫瘍又は腫瘍周りの組織への実質内注射、及び腹腔内注射からなる群から選択される方法によって投与されることを特徴とする請求項１記載の使用。
前記薬剤が、１注射当り０．０１ｍｇ乃至２０ｍｇで投与されるとともに、１ｍＣｉ乃至１００ｍＣｉの１３１−ヨード、１２４−ヨード、又は生物学的に等価な放射能量のベータ放射体、アルファ放射体、もしくはポジトロン放射体を運搬することを特徴とする請求項１記載の使用。
前記薬剤が、ＳＥＱＩＤＮＯ．１５の配列を含むポリペプチド、又はＳＥＱＩＤＮＯ．１５のポリペプチドホモログに結合することを特徴とする請求項１記載の使用。