JP2015181423A - バチルス属に属する菌株、微生物製剤、及び植物の栽培方法 - Google Patents

Abstract

【課題】人間、環境に対する負荷が少なく、また、大量にかつ安価に生産できる微生物農薬、生物農薬を提供すること。【解決手段】植物病害の防除及び植物の免疫機能の強化作用の効果を有する微生物を自然界から分離して提供することである。また、前記の微生物を有効菌として含有する微生物製剤及び前記の微生物製剤で植物を処理する栽培方法。【選択図】なし

Description

本発明は、抗生物質を体外へ産生・分泌することによる植物病害防除及び植物に病害抵抗性を誘導し免疫機能を強化することを特徴とする微生物に関する。更には、バチルス・アミロリクエファシエンスに属する微生物が生産する物質を有効成分として含有する菌株、植物病害の防除剤、及びそれを利用した植物病害の防除方法に関する。

我が国の農薬市場は低迷が続いている。対照的に、世界の農薬市場は人口爆発による食糧需要の拡大により、右肩上がりである。よって、国内の農薬メーカーにとって、海外でも拡販できる農薬開発が必須である。そのためには、「食の安全・安心」「環境への負荷軽減」といった付加価値の強い農薬原体の開発が必要になってきた。特に「食の安全・安心」は、質の高い国民生活を実現するために達成するべき喫緊の課題である。「安心・安全な食を守るため、ご自身で取り組んでいることはありますか」というアンケートに対し、一般消費者の79％が「農薬不使用や減農薬の野菜・果物を選んでいる」を選択していることからも、「食の安全・安心」に対する農薬が果たす役割は非常に大きい。
このような状況に置かれた農薬市場において、「微生物農薬」が脚光を浴び始めている。微生物農薬は、自然界に生存する微生物を利用して、農作物の病気を抑える戦略を取るため、農作物、人間、そして環境に対する負荷が少なく、食の安全・安心に大きく貢献し、「安全で高品質な食料・食品生産」という社会基盤を実現する農業技術になることが期待されている。
微生物農薬が分類される生物農薬の我が国の市場規模は、30億円程度と推察されており、現時点では農薬市場（約3,300億円）の１％に満たない（日経バイオ年鑑2010）。ただし、有機および減農薬栽培を試行する生産者の増加や、残留農薬に関する昨今の消費者意識の向上および残留農薬規制が強化された改正食品衛生法の施行などの影響により、「脱化学農薬」の流れに乗って、2015年には市場規模が100億円に達する予測もある。
加えて、2009年EU（欧州連合）が農薬の使用制限および認可ルールを厳しくする規則並びに農薬の持続的可能な使用のための目標および要件を定める枠組み指令（2009/128/EC）を採択したことによって、現在、EUでは脱化学農薬の動きが盛んとなり、微生物農薬を含む生物農薬の市場が活性化されている。
このように、国内外において微生物農薬の開発、使用が急速に熟成中である。

特開２０１３−４２６８０号公報 特許第２９５５６５５号公報 特開２００９−２４７３０２号公報

本発明は、植物病害の防除及び植物免疫機能の強化作用の効果を有する微生物を自然界から分離して提供することである。また、前記の微生物を有効菌として含有する微生物製剤として使用できる植物病害防除剤及びそれを利用した植物病害の防除方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明の請求項１による菌株または菌株の培養物は、植物病害防除作用及び植物免疫機能の強化作用の効果を示すバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株（NITE P-1121）であることを特徴とするものである。
また、請求項２による微生物製剤は、請求項１に記載の菌株または菌株の培養物を有効成分として含有することを特徴とするものである。
また、請求項３による栽培方法は、請求項２に記載の微生物製剤で植物を処理することを特徴とするものである。

本発明のバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の培養物は、抗生物質生産能（直接的に病原菌に作用し、病気を防ぐ）による植物病害防除作用と植物免疫誘導能（植物のもつ抵抗性を誘導し、間接的に病気を防ぐ）による植物免疫機能強化作用という多機能性を有している。
また、本発明のバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株を有効成分として含有する微生物製剤、または微生物製剤を使用して植物を処理する栽培方法として実用化することによって化学農薬の削減による食の安全・安心の実現に貢献することができる。

バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株が植物病原菌の生育を抑制することを示す写真。 ブドウ圃場散布試験におけるブドウ晩腐病に対するバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の防除効果を示すグラフ。 イチゴ散布試験におけるイチゴ炭疽病に対するバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の防除効果を示すグラフ。 青枯れ病菌とバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株のトマトポット苗試験を示す写真。 うどんこ病菌とバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株のトマトポット苗試験を示す写真。 バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株のトマトポット苗試験の土壌処理により植物免疫機能が強化されていることを示すグラフ。 バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株のトマトポット苗試験の葉面処理により植物免疫機能が強化されていることを示すグラフ。 バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の培養上清中にエリシターが含まれることを示すグラフ。 バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株を有効成分として含有する微生物製剤の防除効果を向上するための使用方法を示す図。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物病害防除剤は、バチルス・アミロリクエファシエンスに属し、植物病原菌の生育を抑制する物質を生産する微生物を培養し、その培養産物を採取し、必要に応じて製剤化することにより製造できる。バチルス・アミロリクエファシエンスに属する微生物としては、植物病原菌の生育を抑制する物質を生産し、且つ宿主植物へ病害抵抗性を誘導することによって植物免疫機能を強化するものであれば特に限定されないが、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株を使用するのが好ましい。

〔実施例１〕 in vitroでの植物病原菌とバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の対峙培養試験
バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株は、公益財団法人 新技術開発財団が所有する植物研究園から分離した細菌約20,000株の中から、寒天培地上の対峙培養によりブドウやイチゴに炭疽病を引き起こす病原菌（コレトトリカム・グロエスポリオイダス）に対して最も強い生育抑制を示した菌株であり（図１Ａ）、16S rDNA塩基配列からバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)として同定された分離株である。
病原菌との対峙培養を実施したところ、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株により生育抑制を示した病原菌の菌糸先端は、病原菌の種類に関わらず、膨潤し、破裂した（図１Ｂ）。この菌糸生育抑制はバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株が生産・分泌する抗生物質イツリンA(iturinA)によるものであると同定した。
バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株培養液中のイツリンA濃度は、培養6日後には0.064 mg/mLであり、病原菌の菌糸成長を抑制するのに必要なイツリンA最低濃度の0.01 mg/mL を超える生産量であった。また、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株はトマトなどに青枯れ病を引き起こす土壌病害細菌（ラルストニア・ソラナセラム）に対しても、生育抑制効果を示した（図１Ｃ）。

〔実施例２〕 ブドウ圃場散布試験
圃場散布試験において、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株は自然発生するブドウ晩腐病（コレトトリカム・グロエスポリオイダスによる）の発生を抑制した。2009年度に行ったブドウ房および葉面への散布試験では、ブドウ晩腐病発症率は、それぞれ、コントロール（無処理）40.9%、SCD（Soybean-Casein Digest）液体培地91.1%、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3 株培養液0%であった（図２Ａ）。コントロールとSCD液体培地を比較すると、SCD液体培地自体はブドウ晩腐病の発症率の抑制に繋がらないことが明らかであり、逆に栄養分となる培地を散布したことによりブドウ晩腐病菌の感染を増長した。1晩培養したバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の培養液を散布したブドウでは晩腐病の発症が確認されなかったことから、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3 株の培養液はブドウ晩腐病に対する高い防除効果があることが示された。2010年度に行った同散布試験のブドウ晩腐病発症率は、それぞれ、コントロール（無処理）70.2%、SCD液体培地95.4%、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株 培養液30.7%であった（図２Ｂ）。
一方、コレトトリカム・グロエスポリオイダスによるイチゴ炭疽病に対しても、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株は防除効果を示した（図３）。本散布試験では市販微生物農薬「タフパール」を対照区として使用したが、イチゴ炭疽病に対するタフパールとバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の防除効果は等しいことが示された（図３）。バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の適用範囲の拡大を目的にバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3 株の抗菌スペクトルを検討した結果、供試した植物病原菌25種の内、24種に対し拮抗作用を示した(表１)。

病原菌との拮抗試験（阻止帯の平均距離、及び拮抗度）

〔実施例３〕 青枯れ病菌とバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株のトマトポット苗試験
本病害は土壌病原細菌によるものであることから、本試験ではポット苗の土壌へバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の処理試験を実施した。
バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株をTSB(Tryptic soy broth)培地100mLに37℃で一晩培養した培養液5mL (1.8-5.6×10⁸cfu/mL)をラルストニア・ソラナセラムによるトマト青枯れ病菌5mL(1.0×10⁷ cfu/mL)とともに、本葉6-7葉展開のトマト苗(9cmポット苗)の土壌に接種した。その後、植物培養器にて明期16時間、25℃、暗期8時間、18℃にて培養を行い、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の防除効果を検討した結果、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株処理区では、無処理区で認められた「土際部の褐変」、「苗の萎凋」が全く認められなかった（図４）。従って、トマト青枯れ病に対してバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株は防除効果があると判断された。

〔実施例４〕 うどんこ病菌とバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の土壌接種処理によるトマトポット苗試験
本病害は、トマトの温室栽培において、深刻な病気の1つであり、生きたトマトにしか感染しない絶対寄生菌によるものである。バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株をトマト根に接種することによって、トマトが植物免疫を獲得し、うどんこ病を抑制するかどうかを確認するため、本試験ではポット苗の土壌へバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の処理試験を実施した。
上記実施例３と同様の条件にて培養したバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株培養液とトマト葉から採取したうどんこ病菌の胞子を滅菌水に懸濁して約10⁴ spores/mLに調整した胞子懸濁液を準備した。上記バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株培養液5mLを土壌接種処理し、うどんこ病菌胞子懸濁液5mLをトマト葉に散布処理して、直ちに植物培養器で明期16時間、25℃、暗期8時間、18℃にて培養を行った。その結果、地上部のトマト葉にはうどんこ病の病徴がほとんど認められなかった。従って、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の土壌処理はうどんこ病に対する植物免疫を誘導したと判断した（図５）。バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の土壌処理により、土壌とは離れた地上部の葉で、病原性関連タンパク質（PRプロテイン）であるキチナーゼおよびβ-1，3-グルカナーゼの遺伝子発現および酵素活性が顕著に増加した（図６）。これはバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株がトマトに植物免疫（全身獲得抵抗性）を誘導したことを強く示唆した。この植物免疫により、トマトうどんこ病を効率よく防除できると判断された（図5）。

〔実施例５〕 バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の葉面散布処理によるトマトポット苗試験
続いて、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株の葉面処理によっても、処理葉において、植物免疫が誘導されることを確認した（図７）。植物免疫誘導物質（植物免疫エリシター）はバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株により細胞外へ分泌される物質であった（図８）。

上記実施例より、バチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株は、農薬登録基準をクリアーできるレベルで、ブドウ、イチゴ、トマトの病害に適用できる。
加えて、抗生物質生産能並びに植物免疫誘導能という多機能性をバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株が有するため、植物病害防除効果および植物免疫機能強化の向上につながる使用法例として以下に示す。
土壌処理による直接的な土壌病害防除、すなはち、育苗時に1回、移植後2週間毎に1回処理を実施する。続いて、移植後、1週間毎に1回葉面散布処理による直接的な地上部病害防除および植物免疫誘導による間接的な地上部病害防除により、効果的に上記病害を抑制することができる（図９）。

Claims (3)

1. 菌株または菌株の培養物が植物病害防除作用及び植物免疫機能強化作用の効果を示すことを特徴とするバチルス・アミロリクエファシエンスS13-3株（NITE P-1121）。
2. 請求項１に記載の菌株または菌株の培養物を有効成分として含有することを特徴とする微生物製剤。
3. 請求項２に記載の微生物製剤で植物を処理する栽培方法。