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JP2015070854A - Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２又はＦｒｉｚｚｌｅｄ７細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物の製造方法 - Google Patents

Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２又はＦｒｉｚｚｌｅｄ７細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物の製造方法 Download PDF

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JP2015070854A
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mice
mouse
seq
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JP2015001114A
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誠 柿谷
Makoto Kakiya
誠 柿谷
一磨 冨塚
Kazuma Tomizuka
一磨 冨塚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Publication date
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Abstract

【課題】骨疾患の治療に用いるための医薬の製造方法を提供する。
【解決手段】哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ１、２及び７からなる群から選択されるＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞外システインリッチドメインを含む断片と哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質又はその変異体との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入する工程、得られた宿主細胞を培養して該核酸を発現させて該融合蛋白質を生産する工程、並びに、生産された該融合蛋白質を回収する工程を含む、骨疾患の治療に用いるための該融合蛋白質の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、Wntリガンド受容体蛋白質として知られるFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7の細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質を含有する骨疾患治療剤としての新規用途に関する。
この知見は、Frizzled細胞外システインリッチドメイン発現ノックインマウス及びFrizzled細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を投与したマウスの特性解析から見出された。
超高齢化社会を迎え骨粗鬆症人口は増加し、それに起因する骨折が社会的に大きな問題となっている。特に大腿骨頚部骨折及び椎体骨折は、寝たきり状態を招くことにより、クオリティーオブライフを大幅に低下させ、介護や入院治療等による社会的及び医療経済的負担の増加を招いている(非特許文献1、2)。また骨粗鬆症は、高齢期における死亡率に大きな関連性のあることが近年明らかにされてきた(非特許文献3、4)。このような背景から骨粗鬆症の予防及び治療は克服すべき重大な課題となっている。骨粗鬆症(骨基質量と石灰化量との比率が保たれたままで骨量が減少した状態)には原発性骨粗鬆症と続発性(二次性)骨粗鬆症があり、前者は従来、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症といわれた病態を指し、後者は他の疾患によって骨代謝に変化を来し骨粗鬆症の病態を呈したものを指し、原因別に内分泌性、栄養性/代謝性、炎症性、不動性、薬物性、血液疾患、先天性、その他の疾患によるものに分類される。上記分類において、内分泌性には、副甲状腺機能亢進症・甲状腺機能亢進症・性腺機能低下症・クッシング症候群・成長ホルモン欠乏症・糖尿病・アジソン病・カルシトニン欠損症等が、栄養性/代謝性には、慢性消耗性疾患・るいそう・重症肝疾患(特に原発性胆汁性肝硬変)・胃切除・壊血病・吸収不良症候群(セリアック病を含む)・低リン血症・慢性腎疾患・特発性高Ca尿症・ヘモクロマトーシス・アミロイドーシス・肥胖細胞腫・ナトリウム過剰摂取・カルシウム摂取不足・ビタミンD,A過剰症等が、炎症性には、関節リウマチ・傍関節性(炎症性サイトカインによる骨吸収亢進)・サルコイドーシス等が、不動性には、全身性・臥床安静・麻痺・局所性・骨折後等が、薬物性には、ステロイド(免疫抑制薬として炎症性疾患に広く用いられている。ステロイドで治療する疾患には、膠原病、喘息、炎症性腸疾患、臓器移植等がある。骨喪失はこの療法の重篤な副作用である。)・メトトレキセート・ヘパリン・ワーファリン・抗ケイレン薬・リチウム・タモキシフェン等が、血液疾患には、多発性骨髄腫・リンパ腫・白血病・血友病・慢性溶血性疾患等が、先天性には、骨形成不全症・マルファン症候群・クラインフェルター症候群・先天性骨髄性ポルフィリア・嚢胞性線維症等が、その他の疾患によるものには、慢性閉塞性肺疾患・肝疾患・腎疾患・関節リウマチ・妊娠・高酸素血症・HIV感染症等が続発性骨粗鬆症の原因疾患として挙げられている(非特許文献5)。
上記疾患の中でも原発性骨粗鬆症に加え社会的に大きな影響のある骨疾患として、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍、腎疾患に伴う骨疾患等が挙げられている。
変形性関節症は運動器領域で最も多い疾患であり、日本の罹患者は1,000万人ともいわれ、高齢化に伴い患者数は増加し続けることが予想されている。重度の関節障害は人工関節置換手術による治療が行われているが、疾病レベルが中等度以下の症状に対する根本的な治療方法は報告されていないのが現状である(非特許文献6)。
関節リウマチは多発性関節炎を主体とする慢性かつ進行性の炎症性疾患であり、関節滑膜の増殖から次第に周囲の軟骨や骨が侵され、関節の破壊と変形にいたることの多い疾患である。抗リウマチ薬(メトトレキサート)による治療では関節破壊の進行を十分に抑制できないことが報告されており、腫瘍壊死因子(TNF)αを標的とした生物学的製剤は関節破壊抑制効果が有意に表れることから画期的な薬剤と考えられている。しかしながらその使用にあたって日和見感染、結核(肺外結核)、ニューモシスチス肺炎等の発症率が増加することが副作用として懸念されている(非特許文献7)。
悪性腫瘍に伴う骨疾患として、主に悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症と骨転移が挙げられる。高カルシウム血症は食欲不振と利尿をきたし、脱水症状とそれによる腎機能不全を伴う。骨転移は特に乳がん、前立腺がん、肺がん患者に多く認められる。骨転移自体が致命的となることは少ないが、骨痛、病的骨折、神経麻痺等を引きおこす原因となるため患者のQOLを著しく低下させることが多く、骨転移のコントロールは臨床上の重要な課題となっている(非特許文献8)。これら悪性腫瘍に伴う骨疾患の治療にはビスフォスフォネート製剤が用いられているが副作用による問題点が指摘されている。
腎疾患に伴う骨疾患のうち、腎臓組織障害が原因となって骨が障害される病態を腎性骨異栄養症と呼ぶ。腎透析患者における骨疾患は、主に二次性副甲状腺機能亢進症に起因する。副甲状腺機能亢進を原因とするPTH濃度増加と例えばbone morphogenetic protein(BMP)7の不十分な産生により、腎性骨異栄養症が進行する。透析患者において骨の副甲状腺ホルモン(PTH)に対する反応性が低下する場合が多く、PTH濃度が慢性的かつ顕著に増加すると、線維性骨炎(高い骨回転)が発症するが、PTH濃度が基準範囲に維持されると無形成骨症(低い骨回転)となる。
線維性骨炎が重症化するとコラーゲン線維が不規則に形成され、非結晶性燐酸カルシウムとして石灰化し、粗線維骨(woven bone)が形成されることにより、骨形成は亢進するものの骨は折れやすくなる。線維性骨炎治療の基本は副甲状腺ホルモンの分泌抑制であり、カルシウム摂取と活性型ビタミンDの投与が中心となる。但し慢性腎臓病(CKD)、特に透析患者の場合には食物や水分の制限等様々なコントロールが必要であり、また二次性副甲状腺機能亢進症が進行すると逆に高カルシウム血症も問題となる。また活性型ビタミンDもその処方にあたっては、常に腎機能(血清クレアチニン値)と血清カルシウム値をモニターする等細心の注意が必要とされている。
活性型ビタミンD製剤の長期連用と過剰投与に伴うもの、あるいは副甲状腺摘出術(PTX)後の副甲状腺ホルモンの抑制によっても無形成骨症は発症する。
無形成骨症は線維性骨炎よりも骨折率が高く、高カルシウム血症、血管や他の軟部組織の石灰化を誘導することから適切な治療法が求められているが、無形成骨の病態として、骨吸収も骨形成も抑制された低回転骨の状態であり、確立された治療法がないのが現状である(非特許文献9)。
骨のリンやカルシウムの取り込み能の低下(低代謝回転骨)や貯蔵能力の低下(高代謝回転骨)によって引き起こされる高リン血症や高カルシウム血症は異所性(血管)石灰化の原因の一つとして考えられている。慢性腎不全患者、特に透析患者では、死因の40%以上が心血管系合併症によるものであり、血管石灰化を伴う動脈硬化が重要な病態として注目されている。慢性腎不全患者における高度の進展した石灰化病変に対する治療はいまだ困難で予後不良である(非特許文献10)。よって、原発性骨粗鬆症に加え変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍、腎疾患に伴う骨疾患、骨疾患に伴う血管石灰化に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
骨代謝は骨芽細胞と破骨細胞の働きのバランスによってコントロールされていると考えられており、骨を壊す作用が骨を作る作用を上回った時に、骨粗鬆症が生じる(非特許文献11)。特に閉経後の女性は、骨を保護する役割を担う女性ホルモンの分泌が低下し、その結果として、骨芽細胞の骨形成能の低下と破骨細胞の骨吸収活性の亢進が認められ、骨粗鬆症の症状を呈する可能性が高い(非特許文献12、13)。そのためエストロゲン製剤が用いられているが、その使用によって血栓症及び乳がんの危険性が増すことが明らかとなり適応は制限されつつある。また、選択的エストロゲン受容体モジュレーターの使用においては深部静脈血栓症の危険性増大が報告されている(非特許文献14)。
現在、破骨細胞の骨吸収活性を抑制する薬剤としてカルシトニンやビスフォスフォネート等が使用されている。カルシトニンは破骨細胞表面に発現するカルシトニン受容体と結合することによって破骨細胞の不活性化を誘導することが知られており、骨粗鬆症のみではなく高カルシウム血症、骨Paget病等にも臨床応用されている。しかしながら骨折抑制効果に対する有効性は明らかではなく、カルシトニン投与によってその受容体発現がダウンレギュレーションされることが報告されている(非特許文献14、15)。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を示し、日本においてもアンドロネート、リセドロネート等のアミノ基含有ビスフォスフォネートは骨粗鬆症治療薬の主流である。これらビスフォスファネート製剤はファルネシル二燐酸合成酵素を阻害することによって脂質蛋白質のプレニル化を阻害し、骨吸収機能の抑制と破骨細胞のアポトーシスを誘導する(非特許文献16)。しかしながらビスフォネート製剤の問題点として、2008年FDAから重度の骨格・関節・筋肉の疼痛発生の警告が発令された。また、歯科治療後に長期間(2〜3年以上)使用したとき顎骨壊死が発生する等の副作用が報告されている(非特許文献17)。上記以外の新しい骨吸収抑制剤として抗RANKL抗体が期待されている。抗RANKL抗体は更に関節リュウマチの関節破壊抑制剤や多発性骨髄腫治療剤としての適応も期待され臨床開発が進められている。しかしながら、RANKL/RANK経路は、樹状細胞の生存と維持に重要との報告(非特許文献18)やRANK及びRANKL欠損マウスではリンパ節の形成不全が引き起こされるとの報告(非特許文献19、20)から、抗RANKL抗体製剤の免疫系への影響が懸念される。2008年AMGEN社より抗RANKL抗体製剤(デノスマブ)の臨床試験において一部感染症発症率の増加が報告された。また2009年の抗RANKL抗体製剤の臨床試験結果から、ビスフォスフォネート製剤と同様、顎骨壊死の発生が副作用として報告された。骨芽細胞を活性化する骨形成促進剤として唯一PTHを用いた間歇投与治療が行われているが(Eli Lilly社、テリパラチド。日本では未承認。)、海綿骨骨量増加活性比べ皮質骨骨厚増加活性が余り高くない点ではビスフォスフォネート製剤等他の治療剤と変わらないため、骨折予防効果はあまり高くないと考えられる。更にPTHに関して、旭化成ファーマ社(日本)より、動悸、頻脈、血圧降下等の副作用やラット長期投与試験で骨肉種が認められた等の問題点が報告され、欧米においても1.5〜2年以上の継続的使用は認められておらず、癌患者への適応は禁止されているため癌骨転移抑制や癌によって引き起こされる高カルシウム血症(腫瘍細胞が産生する副甲状腺ホルモン関連ペプチドが原因となる腫瘍随伴体液性高カルシウム血症や局所性骨溶解性高カルシウム血症)の治療等にPTHを用いることは不可能である。
よって、閉経後の女性を含む骨芽細胞の骨形成能の低下や破骨細胞の骨吸収活性の亢進が原因によって生じる骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨Paget病、骨転移抑制、関節リュウマチの関節破壊抑制や多発性骨髄腫に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
この他、骨粗鬆症とは異なり石灰化のプロセスのみが阻害されることによって引き起こされる骨疾患として骨軟化症やクル病が知られている。骨は、コラーゲン等よりなる基質層が、ハイドロキシアパタイトの沈着により石灰化されることによって形成されるが、この石灰化が障害され、類骨が増加した状態が骨軟化症であり、小児期に発症した場合は、クル病と呼ばれる。症状としては、手足の痛み、関節痛、腰痛、背中の痛み等、骨や関節の痛みが起き、歩行障害に至り、骨折しやすい状態に陥る。小児の場合、発育障害、O脚等手足の変形や鳩胸等が認められる。一般的な治療方法として、食事療法に加え、ビタミンD、カルシウム剤、リン製剤が用いられるが変形による機能障害が強い場合、手術が唯一の対処療法である。よって、骨軟化症やクル病に対して更に有効な薬剤の開発が望まれている。
先に述べたように骨は常に骨芽細胞と破骨細胞の働きのバランスによってコントロールされリモデリングが行われている組織であるため、折れにくい丈夫な骨を作るには単に骨量が増加すればよいとは限らない。例えば大理石骨病(非特許文献21)、骨ページェット病(非特許文献22)、カムラチ・エンゲルマン病(CED)(非特許文献23、24)等の遺伝性疾患ではそれぞれ異なる原因から骨形成と骨吸収のバランスが異常となり、骨量の増加が観察されながらも骨強度は却って低下することが知られている。材料力学的に骨強度を決める因子には更に骨密度に代表される量的因子の他に、海綿骨の連結性や皮質骨の厚みや多孔率、断面モーメント等の形状因子、石灰化や骨疲労等の質的因子があげられる(非特許文献25)。それ故、骨量を増加させるばかりではなく、骨強度向上に役立つ有効な薬剤の開発が原発性骨粗鬆症や続発性(二次性)骨粗鬆症の治療において望まれている。
近年、骨形成促進薬の創薬標的として、Wnt/LRPシグナル制御機構に関与する因子が注目されている。Wntは分子量が約4万のパルミチン酸による脂質修飾を受けた分泌性糖タンパクであり、哺乳類では19種類が存在すると考えられている。Wntの受容体としては7回膜貫通型受容体であるFrizzledが10種類、1回膜貫通型受容体であるLRP5/6の2種類が報告されている(非特許文献26)。Wntが結合すると考えられているFrizzled受容体ファミリー分子の細胞外領域には保存された10個のシステインを含むシステインリッチドメイン[cysteine-rich domain(CRD)]と呼ばれる領域が存在する。これら10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをCRDとする場合(非特許文献27)やその前後の配列も含んでCRDとする場合(R&D systems)がある。マウスFrizzled8のCRDを用いた結晶構造解析においてCRDはホモダイマー構造を取ることが報告された(非特許文献28)。Wntシグナルは、canonical-Wntシグナル経路、non-canonical Wntシグナル経路としてSmall G結合タンパクを介するPCP(Planar Cell Polarity)経路、3量体Gタンパクを介するCa2＋経路の少なくとも3種類が存在すると考えられているが、骨代謝と関連した研究はcanonical-Wntシグナル経路が最も進んでおり、Wntは骨形成に対し促進的に作用すると考えられている(非特許文献29)。そのため近年本シグナル経路を阻害する内在性因子の働きをコントロールすることによって骨疾患治療に応用する試みがなされている。
Sclerostinは,当初BMPのアンタゴニストと考えられていたが、その後の研究でLRP5/6に直接結合することによってシグナル経路を阻害する因子であることが報告された(非特許文献30)。Sclerostinをノックアウトしたマウスにおいて顕著な骨密度増加が示され(非特許文献31)、現在欧米でSclerostin中和抗体のPhaseI試験が行われており(AMG785、Amgen＆UCB)、今後の展開が注目されている。別のcanonical-Wntシグナル阻害因子として知られているDKK1(Dickkopf-1)の中和抗体も作製され、多発性骨髄腫細胞(MM)移植SCIDマウスにおける骨密度低下阻害が見出され(非特許文献32)、中和抗体(BHQ880、Novartis)を用いた臨床試験が行われている。
また、WntのDecoy受容体と考えられFrizzledの細胞外ドメインとアミノ酸配列相同性の高いsFRP(soluble frizzled-related protein)は、Wntシグナルを負に制御していると考えられており(非特許文献33)、sFRP1のノックアウトマウス大腿骨においては海綿骨量の増加が報告されている(非特許文献34)。このような状況からsFRP1阻害剤の研究開発(Wyeth社)も進められている。
Frizzled7はWntリガンドと結合し、そのシグナルを伝達する受容体の一つとして同定されており(非特許文献35、36)、Frizzled7細胞外システインリッチドメイン(保存された10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをCRDとした場合)のアミノ酸配列はマウスとヒトで種差はなく100%一致している。本分子の作用として個体の発生分化への関与(非特許文献37)や肝臓細胞増殖への関与(非特許文献38)が報告されている。
また、本分子の発現様式として、マウス小腸や大腸におけるクリプト基底部に限局された発現パターン(非特許文献39)、各種がん細胞における発現向上(非特許文献40)、成体マウス由来組織における発現解析より脾臓を除く各組織(脳、眼球、心臓、腎臓、肝臓、肺、精巣)における発現が(非特許文献35)、胎児ヒト由来組織における発現解析より、脳と肝臓を除く組織(肺、腎臓)における発現が、成人ヒト由来組織における発現解析より、強い発現が骨格筋でやや強い発現が心臓で、弱い発現が脳、胎盤と腎臓で、発現が検出されなかった組織として肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸が報告されている(非特許文献41)。
Frizzled受容体の可溶化受容体である細胞外システインリッチドメインは、Wntと結合しその作用を阻害すると考えられており、インビトロ実験系においてFrizzled7細胞外システインリッチドメイン(保存された10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域及びその前後の配列を含む)とFcとの融合体(R&D Systems)がWnt3aによる細胞質β-catenin安定化を阻害することが報告されている(非特許文献42)。Frizzled7はがん細胞において発現向上が認められることから腫瘍治療のターゲット分子として注目されている(特許文献2、非特許文献43)。例えばFrizzled7の細胞外ドメインを発現するベクターが導入された大腸がん細胞はコントロールベクター導入大腸がん細胞に比べXenograft腫瘍細胞移植系において増殖阻害が観察され(非特許文献44)、腫瘍治療の創薬標的としての可能性が示唆された。
Frizzledは上記のように10種類のファミリー分子が報告されているがFrizzled7と細胞外システインリッチドメインの一次配列相同性がとりわけ高い分子としてFrizzled1とFrizzled2が報告されている(保存された10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをCRDとした場合、非特許文献22)。これら分子のシステインリッチドメイン(保存された10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをCRDとした場合)におけるFrizzled7とのアミノ酸相同性は、ヒト・マウスどちらにおいても、Frizzled1、Frizzled2に対してそれぞれ91%、93%と極めて相同性が高い。またFrizzled7と同様Frizzled1、Frizzled2共にシステインリッチドメイン(保存された10個のシステインのうち最もN末端側に位置するシステインと最もC末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをCRDとした場合)のマウスとヒト由来アミノ酸配列に種差はなく100%一致している。
Frizzled1とFrizzled2も共にFrizzled7と同様、Wntと相互作用することが報告されており、Frizzled1においてはWnt3aと相互作用することでアミロイドベーターペプチドによって引き起こされる海馬ニューロンの破壊を保護することが報告されている(非特許文献45)。またFrizzled1の発現様式として成人ヒト由来組織における発現解析より、強い発現が心臓、胎盤、肺、腎臓、すい臓、前立腺、卵巣で、胎児由来組織における発現解析より、強い発現が肺と腎臓で報告されている(非特許文献41)。Frizzled1とFrizzled2は共に大腸がんや乳がんで発現レベルが向上することから、癌化との関連が示唆されており、腫瘍治療のターゲット分子として注目されている(特許文献1、非特許文献46、47)。更に、Frizzled1においてはその遺伝子破壊マウスのフェノタイプに何ら変化が認められないことが報告された(非特許文献48)。以上から、受容体Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7由来の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を生体内において高発現させた場合、或いはFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7由来の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を生体内に投与した場合、該蛋白質が骨量増加及び骨強度増加に促進的かつ特異的に作用することを予測する事は極めて困難であった。
WO2008/061013 WO2008/031009
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超高齢化社会を迎え、骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍に伴う骨疾患及びそれらに関連する骨疾患の治療が社会的にも益々重要な課題となり、骨疾患治療剤の開発研究が広く精力的に行われている。現在最も一般的に使用される薬剤の一つはビスフォスフォネートであり、有効性の高い薬剤であるが、最近その副作用が問題となっている。その他の薬剤においてもそれぞれ克服すべき問題点が指摘されている。そのため、骨疾患治療に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤の開発が強く望まれている。
驚くべきことに、本発明者らは、従来の予測に反して、受容体Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7由来の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を生体内において高発現させた場合、或いはFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7由来の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を生体内に投与した場合、該蛋白質はいずれも骨量増加及び骨強度増加に促進的かつ特異的に作用することを初めて見出した。
本発明者らは、Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合体を過剰発現するマウスを作製し、Frizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合体の過剰発現より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化を、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の海綿骨増加及び胸骨の海綿骨増加を、X線写真撮影より脛骨の骨密度増加を、骨形態計測から脛骨の単位骨量の増加、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加を、骨強度測定から大腿骨の最大荷重増加を、骨構造解析から脛骨近位骨幹端部または大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下を、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の海綿骨の増加と骨幹壁厚の肥厚及び胸骨の海綿骨の増加を見出した。またFrizzled1細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合体の過剰発現により大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化を、X線写真撮影より脛骨の骨密度増加を、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨の増加及び胸骨の海綿骨の増加を、骨形態計測から脛骨の単位骨量の増加、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加を、骨強度測定から大腿骨の最大荷重増加を、骨構造解析から大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下をそれぞれ見出した。また、Frizzled2細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合体の過剰発現により大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化を、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の骨幹壁厚の肥厚を、骨形態計測から脛骨の単位骨量の増加、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加を、骨強度測定から大腿骨の最大荷重増加を、骨構造解析から大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下を見出した。
さらに本発明者らは、Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合体を遺伝子組換え蛋白質として取得した。取得したFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合組換え体のマウスへの投与により大腿骨の白色化、頭蓋骨の白色化、胸骨の白色化、節が太くなる傾向を、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の骨幹壁厚の肥厚を、骨形態計測から脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加を見出した。また、取得したFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合組換え体の卵巣摘出(OVX)マウスへの投与により大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化、椎骨の硬化、H&E染色された病理切片の観察から大腿骨の骨幹壁厚の肥厚を、2DマイクロCTから大腿骨の皮質骨断面積の増加を、骨強度測定から大腿骨の最大荷重増加を見出した。さらに取得したFrizzled7細胞外システインリッチドメインのN末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までのアミノ酸配列からなるCRD最小配列を含む蛋白質とFcとの融合組換え体のマウスへの投与により、骨強度測定から大腿骨の最大荷重増加を、骨構造解析から脛骨の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下を見出した。また、取得したFrizzled1細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合組換え体のマウスへの投与により大腿骨の白色化と骨端肥大、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化を見出した。
このような知見に基づいて、Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質を有効成分とする骨疾患治療剤が、新たな骨粗鬆症治療薬、関節炎治療薬や悪性腫瘍に伴う骨疾患治療薬として提供できることが示された。
すなわち、本発明は、以下の特徴を含む。
(1)哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体由来の骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ細胞外システインリッチドメイン、又は該ドメインのアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有しかつ骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ該ドメインの変異体、を含む蛋白質、或いは、該蛋白質をコードする核酸を含むベクター、を有効成分として含有する骨疾患治療用医薬組成物。
(2)上記蛋白質が、上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体と哺乳動物由来免疫グロブリンFc蛋白質又はその変異体との融合蛋白質であり、及び、上記蛋白質をコードする核酸が該融合蛋白質をコードする核酸である、(1)の組成物。
(3)上記蛋白質が化学修飾されている、(1)又は(2)の組成物。
(4)上記化学修飾が、1又は複数のポリエチレングリコール分子の結合である、(3)の組成物。
(5)上記化学修飾が、糖鎖の結合である、(3)の組成物。
(6)上記蛋白質が、前記Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質の断片であって、上記細胞外システインリッチドメインを含む断片である、(1)〜(5)のいずれかの組成物。
(7)上記蛋白質が、組換え蛋白質である、(1)〜(6)のいずれかの組成物。
(8)上記細胞外システインリッチドメインが、前記Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列において、そのN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含むアミノ酸配列を有する、(1)〜(7)のいずれかの組成物。
(9)上記細胞外領域蛋白質が、配列番号19、20、22、23又は25のアミノ酸配列を含む、(6)〜(8)のいずれかの組成物。
(10)上記細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質が、配列番号21、配列番号24、又は配列番号26の上記N末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を含む蛋白質である、(1)〜(9)のいずれかの組成物。
(11)上記細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質をコードする核酸が、配列番号44〜49のいずれかのヌクレオチド配列を含む、(1)〜(10)のいずれかの組成物。
(12)上記Fc蛋白質が、配列番号4のアミノ酸配列を含む、(2)〜(11)のいずれかの組成物。
(13)上記Fc蛋白質をコードする核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、(2)〜(11)のいずれかの組成物。
(14)上記融合蛋白質が、配列番号27〜31のいずれかのアミノ酸配列を含む、(2)〜(11)のいずれかの組成物。
(15)上記融合蛋白質をコードする核酸が、配列番号38〜43のいずれかのヌクレオチド配列を含む、(2)〜(11)のいずれかの組成物。
(16)上記哺乳動物がヒトである、(1)〜(15)のいずれかの組成物。
(17)上記骨疾患が、骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患である、(1)〜(16)のいずれかの組成物。
(18)(1)〜(17)のいずれかの組成物を哺乳動物に投与することを含む、骨疾患を治療する方法。
(19)上記哺乳動物がヒトである、(18)の方法。
(20)上記骨疾患が、骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患である、(18)の方法。
(21)上記組成物が、他の骨疾患治療剤と組み合わせて同時に又は連続的に投与される、(18)〜(20)のいずれかの方法。
本発明により、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加させることができる。従って、骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患、例えば骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍等に起因する骨疾患、及びそれらに関連する様々な骨疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、治療することが可能となる。
この図は、16週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の胸骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、16週齢の雌(♀)USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(下段)及び雌(♀)コントロールマウス(上段)の脛骨X線写真画像を示す。 この図は、16週齢の雄(♂)USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(下段)及び雄(♂)コントロールマウス(上段)の脛骨X線写真画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清を用いたウエスタン解析画像を示す。1266, 1268:コントロールキメラマウス由来血清サンプル、A3, A6, B8, B17:USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清サンプル、矢印:USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清サンプル特異的なメインバンドの位置。 この図は、16週齢の雌(♀)USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(下段)及び雌(♀)コントロールマウス(上段)の脛骨X線写真画像を示す。 この図は、16週齢の雄(♂)USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(下段)及び雄(♂)コントロールマウス(上段)の脛骨X線写真画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨病理切片骨幹部のH&E染色画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨(近位端より50%地点)病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨病理切片成長板近傍のH&E染色画像を示す。 この図は、16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の胸骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターを示す。 この図は、mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを示す。 この図は、12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨(近位端より30％地点)病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨(近位端より50％地点)病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の胸骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、Sham/non-treatment群(左上図)、OVX/non-treatment群(左下図)、Sham/mFZD7crd-hFcm群(右上図)及びOVX/mFZD7crd-hFcm群(右下図)の大腿骨皮質骨の2ＤマイクロCT撮影画像(近位端より50％地点)を示す。 この図は、12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨(近位端より30％地点)病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨(近位端より50％地点)病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の大腿骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の胸骨病理切片のH&E染色画像を示す。 この図は、mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを示す。 この図は、mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを示す。 この図は、mFZD7c10-hFcm組換え体投与マウス(右図)及びコントロールマウス(左図)の脛骨海綿骨の3次元マイクロCT撮影画像を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、上記のとおり、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体由来の骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ細胞外システインリッチドメイン、又は該ドメインのアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有しかつ骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつその変異体、を含む蛋白質、或いは、該蛋白質をコードする核酸を含むベクター、を有効成分として含有する骨疾患治療用医薬組成物を提供する。
本発明は、上記Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質中の細胞外システインリッチドメインを含む断片が哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する働きがあるという知見に基づいている。すなわち、本発明者らは、ノックイン法を利用してマウスES細胞からFrizzled細胞外システインリッチドメインを発現するマウスを作製、又はFrizzled細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質とFcとの融合組換え体をマウスに投与したところ、野生型と比べて視覚的、感覚的に判別できるほどに骨部位の骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加させ、しかも驚くべきことに、細胞外システインリッチドメインの骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用は骨に特異的であり他の組織や器官等には全く又はほとんど影響しない、即ち副作用が観察されないことを初めて見出した。従来の知見によれば、前述の背景技術に記載したように、Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメインは、該受容体のリガンドで骨形成と関わりのあるWntと結合し該ドメインの作用を阻害すると考えられていたことから、骨の増殖促進に関与するとは想像さえされていなかった。また、特にFrizzled7の細胞外システインリッチドメインは大腸癌等の腫瘍の増殖を抑制する作用があることが報告されており、むしろ癌治療の創薬標的として注目されてきた。
このように、本発明者らは、Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメインに、特異的かつ促進的骨量、骨密度及び/又は骨強度増加という新たな有用な機能が存することを見出した。本発明の医薬組成物は、骨部位の骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加させる骨疾患治療のために使用することができる。
以下において、本発明の医薬組成物について、さらに具体的に説明する。
＜Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメイン＞
本発明に関わるFrizzled受容体は、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7である。これらの受容体は、リガンドがWntである10種類のFrizzled受容体のうち特に細胞外システインリッチドメイン(以下、「CRD」とも称する)の同一性が高い。これらの受容体のCRDのN末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までのアミノ酸配列の同一性は、ヒト及びマウスの場合、Frizzled7のCRDとFrizzled2のCRDとの間で93%の同一性、Frizzled7のCRDとFrizzled1のCRDとの間で91%の同一性である。この領域のアミノ酸配列はヒトとマウスで同一であり、種間で保存性が高い。ちなみに、その他のFrizzled3〜6、8〜10のCRDとFrizzled7のCRDとの間の同一性は42〜56%と低い。
Frizzled1、Frizzled2及びFrizzled7のアミノ酸及びヌクレオチド配列の情報は、NCBI(米国)にアクセスすることによって入手可能である。
Frizzled7(FZD7とも称される)は、ヒト、マウス、アガゲザル、セキショクヤケイ、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Frizzled7蛋白質又はこれをコードする核酸は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類、マウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来Frizzled7の配列情報は、例えばヒトFrizzled7はアクセッション番号NM_003507.1、NP_003498.1等として、マウスFrizzled7はアクセッション番号NM_008057.1、NP_032083.1、NM_008057.2、NP_032083.2、NM_008057.3、NP_032083.3等として、GenBank(米国NCBI)に登録されている。
ヒト及びマウスFrizzled7の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ヒトFrizzled7の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号19):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYL
マウスFrizzled7の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号20):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYL
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号21)。
配列番号21:
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
Frizzled1(FZD1とも称される)は、ヒト、マウス、ラット、セキショクヤケイ、アフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Frizzled1蛋白質又はこれをコードする核酸は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類、マウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来Frizzled1の配列情報は、例えばヒトFrizzled1はアクセッション番号NM_003505.1、NP_003496.1等として、マウスFZD1はアクセッション番号NM_021457.1、NP_067432.1、NM_021457.2、NP_067432.2、NM_021457.3等として、GenBankに登録されている。
ヒト及びマウスFrizzled1の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ヒトFrizzled1の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号22):
QAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQH
マウスFrizzled1の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号23):
QAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQH
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号24)。この領域は、ヒトとマウスとで同一のアミノ酸配列を示す。
配列番号24:
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
Frizzled2(FZD2とも称される)は、ヒト、マウス、ラット、アフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Frizzled2蛋白質又はこれをコードする核酸は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類、マウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来Frizzled2の配列情報は、例えばヒトFrizzled2はアクセッション番号NM_001466.1、NM_001466.2、NP_001457.1等として、マウスFZD2はアクセッション番号NM_020510.1、NM_020510.2、NP_065256.1等として、GenBankに登録されている。
ヒト及びマウスFrizzled2の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列は、同一であり、以下のとおりである。
ヒト及びマウスFrizzled2の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号25):
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPAL
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号26)。
配列番号26:
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
本発明において、「細胞外システインリッチドメイン」は、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。ここで、「少なくとも含み」とは、細胞外システインリッチドメインが、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までの最小CRD配列からなっていてもよいし、又は、該最小CRD配列のN末端側及び/又はC末端側に、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するかぎり、任意の外来配列が付加していてもよいことを表わす。また、ここで、「外来配列」は、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質と無関係の任意の異種蛋白質由来の配列もしくは人工配列、異種Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質の最小CRD配列以外の部分に由来する配列、等を含むことができる。
或いは、本発明における細胞外システインリッチドメインは、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列において、そのN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含むアミノ酸配列を有し、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。ここで、「少なくとも含む」とは、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を最小配列とし、この最小配列のN末端側及び/又はC末端側に同種Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質由来の配列を適宜延長して含むことができることを表わす。従って、細胞外システインリッチドメインは、上記最小CRD配列から、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質の最大CRD配列までの任意のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明において、哺乳動物は、以下のものに限定されないが、霊長類、家畜動物、げっ歯類、有蹄類、ペット動物等を含む。好ましい哺乳動物は、ヒト及びマウスである。マウスは、細胞外システインリッチドメイン(CRD)のアミノ酸配列、特にN末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの最小CRD配列がヒト由来の配列と同一であるという点で重要である。
本発明において好ましいCRDは、ヒト又はマウス由来のFrizzled7、Frizzled1及びFrizzled2からなる群から選択されるFrizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列(配列番号21、24又は26)を少なくとも含むアミノ酸配列を有し、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。
本発明において好ましい別のCRDは、ヒト又はマウス由来のFrizzled7、Frizzled1及びFrizzled2からなる群から選択されるFrizzled受容体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号19、20、22、23又は25)において、そのN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列(それぞれ、配列番号21、24又は26)を少なくとも含むアミノ酸配列を有し、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。
本発明において、「骨量、骨密度及び/又は骨強度」の増加は、少なくとも海綿骨の増加、骨幹の肥厚と増殖、最大荷重の増加等を伴う。
＜細胞外システインリッチドメインの変異体＞
本発明の細胞外システインリッチドメインには、上記＜Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメイン＞の節で記載した細胞外システインリッチドメインの変異体も包含される。このような変異体は、天然の突然変異体及び人工変異体のいずれも含まれ、上記細胞外システインリッチドメインのアミノ酸配列において、1もしくは複数(好ましくは1もしくは数個)のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むか、或いは、該アミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、例えば93%以上、95%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するものである。
例示的に、上記変異体は、配列番号21、24又は26、或いは配列番号19、20、22、23、又は25、のアミノ酸配列において、1もしくは複数(好ましくは1もしくは数個)のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むか、或いは、該アミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、例えば93%以上、95%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するものである。
本明細書で使用される「数個」なる用語は、通常、2から10までの任意の整数を指す。好ましくは、それは2〜5の任意の整数である。
本明細書で使用される「同一性」なる用語は、2つのアミノ酸配列(又はヌクレオチド配列)のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数(又はヌクレオチド数)が最大となるように該2つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には、総アミノ酸残基数(又は総ヌクレオチド数)に対する同一アミノ酸残基数(又は同一ヌクレオチド数)のパーセンテージ(%)で表わされる。FASTAのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数(又は総ヌクレオチド数)に加算する。
80%以上、好ましくは85%以上の配列同一性を有する蛋白質は、例えばNCBI(米国)、EMBL(欧州)等の配列データベースにアクセスし、例えばBLAST、FASTA等の配列相同性検索プログラムを利用して検索することが可能である[Altschul, S. F.ら (1990) J. Mol. Biol. 15:403-410； Karlin, S.と Altschul S. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268等]。BLASTは、配列を固定長のワードに区切り、ワード単位で類似する断片を検索し、これらを類似度が最大になるまで両方向に伸ばして局所的なアラインメントを行い、 最後にこれらを結合して最終的なアラインメントを行う方法である。また、FASTAは、連続して一致する配列の断片を高速に検索し、それらの断片の中で類似度の高いものに着目して局所的なアラインメントを行い、最後にギャップを考慮した上でこれらを結合しアラインメントを行う方法である。
本発明の細胞外システインリッチドメインに変異を導入する場合、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列内の10個のシステイン残基以外のアミノ酸残基に対してのみ、置換、欠失又は付加からなる変異を行い、及び、天然のジスルフィド結合を破壊せず、かつ天然のコンホメーションを実質的に保持することが望ましい。これは、もし細胞外システインリッチドメイン内の天然のジスルフィド結合を破壊し本来のコンホメーションを変化させると、該ドメイン蛋白質が骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を喪失するか又は該能力を大きく低減するおそれがあるからである。
変異導入法としては、細胞外システインリッチドメインの配列が公知であれば、その配列に基づいて合成した(相補的変異配列を含む)プライマーを使用するPCR法を利用した部位特異的突然変異誘発法が好ましい(Kunkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82:488-492； F. M. Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons; J. Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press等)。変異導入用キット(例えば、宝酒造製)も市販されているので、指示書に従って変異を導入することもできる。
簡単に説明すると、Kunkelの方法は、細胞外システインリッチドメインをコードするDNAを含むプラスミドを鋳型にし、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼで予め5’末端をリン酸化したプライマー(相補的変異配列を含む)を該鋳型にアニーリングし、DNA合成を行ったのち、T4 DNAリガーゼで末端同士を連結して、目的の変異を含むDNAを精製することを含む。
本発明において、変異は、置換、欠失、付加、挿入、又はそれの組み合わせを含む。
置換は、保存的置換又は非保存的置換のいずれでもよいが、細胞外システインリッチドメイン蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないためには保存的置換が好ましい。保存的置換は、構造的(例えば、分岐状、芳香族性等)、電気的(例えば、酸性、塩基性等)、極性又は疎水性、等の化学的・物理的性質の類似したアミノ酸間での置換をいう。分岐状アミノ酸には、バリン、ロイシン、イソロイシンが含まれる。芳香族アミノ酸には、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンが含まれる。酸性アミノ酸には、グルタミン酸、アスパラギン酸が含まれる。塩基性アミノ酸には、リシン、アルギニン、ヒスチジンが含まれる。極性アミノ酸には、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、システイン、グリシン、プロリン等が含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン等が含まれる。
欠失は、1もしくは複数のアミノ酸残基を失うことである。付加は、1もしくは複数のアミノ酸残基を蛋白質のN末端又はC末端に結合することである。挿入は、蛋白質の内部に1もしくは複数のアミノ酸残基を結合することである。このうち、欠失と挿入は、細胞外システインリッチドメイン蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないことを前提として行うことができる。そのために、好ましくは約1〜5個程度のアミノ酸残基の欠失又は挿入に制限される。
＜細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質＞
上で説明したように、本発明の医薬組成物の有効成分のひとつは、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体由来の骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ細胞外システインリッチドメイン、又は該ドメインのアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有しかつ骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつその変異体、を含む蛋白質である。
ここで、「含む」なる表現は、上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体に、異種ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質を、該ドメイン又はその変異体のN末端又はC末端側に、必要であれば適当なペプチドリンカー(例えば、アミノ酸数1〜20)を介して、結合又は融合してもよいことを意味する。例えば、そのような異種蛋白質として好ましい例は、哺乳動物由来免疫グロブリンFc蛋白質又はその変異体等が挙げられる。しかし、このような異種蛋白質が生体内に投与されると、拒絶反応を引き起こす可能性があるため、それをできる限り回避するためにも、投与する哺乳動物が本来もつ蛋白質を該異種蛋白質として使用することが望ましいかもしれない。
好ましいFc蛋白質は、ヒトへの使用を考慮すると、ヒト免疫グロブリンのFc蛋白質である。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは、以下のものに制限されないが、例えばIgG、IgD、IgE、IgM、IgA、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等のいずれでもよいが、ヒトに使用するのであれば、ヒト免疫グロブリンのクラス及びサブクラスを使用することが望ましい。Fc蛋白質は、細胞外システインリッチドメイン又はその変異体の生体内(in vivo)での安定性を向上させることができる。ただし、この場合、Fc蛋白質は、その生物活性による生体内に及ぼす影響を避けるために、例えば抗体依存性細胞障害活性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞障害活性(CDC)活性等の生物活性を予め低下させることが望ましく、そのために、前記のような生物活性を抑制、低下又は喪失させるための変異を導入することが好ましい。そのような変異は、哺乳動物由来のFc蛋白質のアミノ酸配列において、例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸残基のアミノ酸置換であって、ADCC及び/又はCDC活性を低下させるような任意のアミノ酸置換であり、具体的には、後述の実施例1に例示されるような置換を含むことができる。Fc蛋白質の好適例は、配列番号4のアミノ酸配列を含むヒトIgG1 Fc変異体である。Fc蛋白質の結合位置は、細胞外システインリッチドメイン又はその変異体のN末端側、C末端側のいずれでもよいが、C末端側が好ましい。
上記Fc融合蛋白質の具体例は、例えば下記の配列番号27〜31のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質である。ここで、下線部分は、細胞外システインリッチドメイン蛋白質を、非下線部分は、ヒトIgG1 Fc変異体蛋白質をそれぞれ示す。
配列番号27(配列番号19＋配列番号4):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号28(配列番号20＋配列番号4):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号29(配列番号22＋配列番号4):
QAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号30(配列番号23＋配列番号4):
QAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号31(配列番号25＋配列番号4):
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
上記配列番号27〜31のアミノ酸配列中の細胞外システインリッチドメインは、Frizzled7、Frizzled1又はFrizzled2受容体の細胞外領域蛋白質に由来するが、このドメインのアミノ酸配列は、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するかぎり、上記＜細胞外システインリッチドメインの変異体＞の節に記載したような変異を含んでもよい。
本発明においては、上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質は、必ずしも異種ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質と結合又は融合する必要はない。すなわち、本発明における上記蛋白質は、上記Frizzled1、2又は7受容体の細胞外領域蛋白質の断片であって、前記細胞外システインリッチドメインを含む断片であってもよい。このような断片は、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するかぎり、上記＜細胞外システインリッチドメインの変異体＞の節に記載したような変異を含んでもよい。
本発明の上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質は、この業界で慣用の遺伝子組換え技術によって作製しうる。簡単に説明すると、該蛋白質の作製は、本発明の蛋白質をコードするDNAを用意し、このDNAを含む発現ベクターを構築し、該ベクターで原核又は真核細胞を形質転換又はトランスフェクションし、得られた細胞の培養から目的の組換え蛋白質を回収することを含む。蛋白質の精製は、蛋白質の慣用の精製法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒沈殿、透析、電気泳動、クロマトフォーカシング、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等を適宜組み合わせることによって実施可能である。
上記DNAやベクターに関しては、後述の＜核酸及びベクター＞の節、実施例等に記載しているので、それらを参照することができる。また、遺伝子組換え技術は、F. M. Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons、J. Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載されており、本発明のために利用できる。
本発明における上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質は、化学修飾されていてもよい。
化学修飾には、非限定的に、例えばグリコシル化、ペグ(PEG)化、アセチル化、アミド化、リン酸化等が含まれる。特に好ましく利用できる化学修飾は、グリコシル化及びペグ化である。
ペグ化は、例えば蛋白質のN末端アミノ基、リシン(Lys)のεアミノ基等のアミノ酸残基に1又は複数のポリエチレングリコール(PEG)分子を結合させることである。一般的には、アミノ酸の遊離アミノ基にPEG分子が結合される。PEGの平均分子量は、以下に限定されないが、約3,000〜約50,000の範囲で使用可能である。PEGを蛋白質に結合させるには、PEGの末端部分に、例えばカルボキシル基、ホルミル(アルデヒド)基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基、チオール基、マレイイミド基等の活性基を導入し、蛋白質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基等の基と反応させることができる。
グリコシル化は、蛋白質のアスパラギン、セリン又はトレオニン残基に炭水化物鎖(即ち、糖鎖)が結合することである。一般に、Asn-X-Thr/Ser(ここで、XはPro以外の任意のアミノ酸残基である。)の配列を認識して糖鎖の結合が起こる。このような配列をもつように該蛋白質のアミノ酸配列を改変するときは、天然型と異なる位置に糖鎖を導入することもできる。通常、遺伝子組換え技術によって、組換え蛋白質をコードする核酸を、真核細胞(酵母細胞、動物細胞、植物細胞等)中で発現することによって、組換え蛋白質のグリコシル化を起こすことができる。本発明では、糖鎖の構造は特に制限されないものとし、発現のために選択された細胞の種類によって糖鎖構造が異なると考えられる。ヒトにおける使用の場合、ヒト由来細胞、ヒト糖鎖を合成可能な酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等を利用しうる。
アセチル化やアミド化は、主に、蛋白質のN末端又はC末端で行うことが望ましい。これらの反応は、例えば脂肪族アルコールや脂肪酸等のアルコール類やカルボン酸類を用いて行うことができる。アルキル部分の炭素数は、例えば約1〜20程度であるが、水溶性を損なわない、無毒性である等の条件を満たす必要がある。
＜核酸及びベクター＞
本発明の組成物の有効成分として、上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターも含まれる。
本明細書で使用する「核酸」なる用語には、DNA及びRNAの両方を含むものとし、DNAにはゲノムDNAやcDNAを含み、RNAにはmRNAを含む。
細胞外システインリッチドメイン、その変異体及びそれらを含む蛋白質については、Fc蛋白質との融合蛋白質を含めて、上記＜Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメイン＞、＜細胞外システインリッチドメインの変異体＞及び＜細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質＞の各節で説明したとおりであり、それらの節で説明した全ての記載をここでも引用する。したがって、本発明における核酸は、上で説明し具体的に例示した、細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質をコードする核酸を包含する。
具体的には、該核酸は、マウスFrizzled7、Frizzled 1及びFrizzled2の細胞外領域蛋白質(配列番号20、23、25)、並びに、ヒトFrizzled7、Frizzled 1及びFrizzled2の細胞外領域蛋白質(配列番号19、22、25)のアミノ酸配列において、少なくとも、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までのアミノ酸配列からなるCRD最小配列(配列番号21、24、26)を含むアミノ酸配列をコードする核酸を包含する。
真核細胞での該核酸の発現及び発現産物の細胞外への分泌を考慮するならば、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むとよい。シグナル配列の例は、各Frizzled受容体蛋白質由来のシグナル配列、ヒトCD33由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列、ヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等である。
マウス及びヒト由来Frizzled7、Frizzled 1及びFrizzled2の細胞外領域蛋白質の前駆体をコードするヌクレオチド配列を例示する。下線部位はシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、非下線部位は、細胞外領域蛋白質の成熟配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
マウスFrizzled7細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号32):
ATGCGGGGCCCCGGCACGGCGGCGTCGCACTCGCCCCTGGGCCTCTGCGCCCTGGTGCTTGCTCTTCTGTGCGCGCTGCCCACGGACACCCGGGCTCAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTG
ヒトFrizzled7細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号33):
ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGCTCCGCTTTCGTCCCTGGGCCTCTGTGCCCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCGCAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGCCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTG
マウスFrizzled1細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号34):
ATGGCTGAGGAGGCGGCGCCTAGCGAGTCCCGGGCCGCCGGCCGGCTGAGCTTGGAACTTTGTGCCGAAGCACTCCCGGGCCGGCGGGAGGAGGTGGGGCACGAGGACACGGCCAGCCACCGCCGCCCCCGGGCTGATCCCCGGCGTTGGGCTAGCGGGCTGCTGCTGCTGCTTTGGTTGCTGGAGGCTCCTCTGCTTTTGGGGGTCCGAGCGCAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCAC
ヒトFrizzled1細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号35):
ATGGCTGAGGAGGAGGCGCCTAAGAAGTCCCGGGCCGCCGGCGGTGGCGCGAGCTGGGAACTTTGTGCCGGGGCGCTCTCGGCCCGGCTGGCGGAGGAGGGCAGCGGGGACGCCGGTGGCCGCCGCCGCCCGCCAGTTGACCCCCGGCGATTGGCGCGCCAGCTGCTGCTGCTGCTTTGGCTGCTGGAGGCTCCGCTGCTGCTGGGGGTCCGGGCCCAGGCGGCGGGCCAGGGGCCAGGCCAGGGGCCCGGGCCGGGGCAGCAACCGCCGCCGCCGCCTCAGCAGCAACAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAGCGGGGCATCTCCGTCCCGGACCACGGCTATTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAGGGCACCCCGACGCCCTCGCTGCTTCCAGAGTTCTGGACCAGCAACCCTCAGCAC
マウスFrizzled2細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号36):
ATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCACTGCTGCTGCTGCCGGCCGCCGGACCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTA
ヒトFrizzled2細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号37):
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTA
本発明における核酸は、Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質又はその変異体と、上記定義の異種蛋白質との融合蛋白質をコードする核酸も含まれる。異種蛋白質として好ましい例は、哺乳動物由来の免疫グロブリンFc蛋白質であり、特にヒトFc蛋白質が好ましいが、その生物活性(特にADCC及びCDC)を低下又は喪失させるように変異を導入することが望ましい。例えば、変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質をコードするヌクレオチド配列を配列番号3に示す。さらにまた、この変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質(下線部)と、マウス又はヒト由来Frizzled7、1又は2受容体の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質(非下線部)との融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、以下に例示する。
マウスFrizzled7細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号38):
CAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled7細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号39):
CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGCCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
マウスFrizzled1細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号40):
CAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled1細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号41):
CAGGCGGCGGGCCAGGGGCCAGGCCAGGGGCCCGGGCCGGGGCAGCAACCGCCGCCGCCGCCTCAGCAGCAACAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAGCGGGGCATCTCCGTCCCGGACCACGGCTATTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAGGGCACCCCGACGCCCTCGCTGCTTCCAGAGTTCTGGACCAGCAACCCTCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
マウスFrizzled2細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号42):
CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled2細胞外領域蛋白質＋変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号43):
CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
また、マウス及びヒト由来のFrizzled7、Frizzled1及びFrizzled2の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのシステインリッチドメイン(CRD)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を以下に例示する。
配列番号44:Frizzled7 マウス CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGC
配列番号45:Frizzled7 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC
配列番号46:Frizzled1 マウス CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGC
配列番号47:Frizzled1 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGC
配列番号48:Frizzled2 マウス CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGC
配列番号49:Frizzled2 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGC
上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。シグナル配列の例は、ヒト蛋白質由来のシグナル配列、例えばヒトFrizzled1、2及び7由来のシグナル配列、ヒトCD33由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列、ヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等である。
上記蛋白質類をコードする核酸ホモログは、ヒト又はマウス由来のFrizzled7、1及び2遺伝子をコードするmRNAから合成したcDNAに基づいて作製したプライマーやプローブを使用する周知の技術によって、ヒト及びマウス以外の他の哺乳動物由来の、該遺伝子を発現することが公知の細胞や組織から調製したcDNAライブラリーから取得することができる。そのような技術には、PCR法、ハイブリダイゼーション法(サザン法、ノーザン法等)等が含まれる。
PCR法は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、これは、二本鎖DNAを一本鎖に解離するための変性(denaturing)工程(約94〜96℃、約30秒〜1分)、プライマーを鋳型の一本鎖DNAに結合するためのアニーリング(annealing)工程(約55〜68℃、約30秒〜1分)、DNA鎖を伸長するための伸長(extension)工程(約72℃、約30秒〜1分)からなるサイクルを1サイクルとして約25〜40サイクルを実施する。また、変性工程の前に、約94〜95℃で約5〜12分の前加熱処理を行い、伸長工程の最終サイクル後に、さらに72℃で約7〜15分の伸長反応を実施することができる。PCRは、市販のサーマルサイクラーにて、耐熱性DNAポリメラーゼ[例えば、AmpliTaq Gold(登録商標)(Applied Biosystems)等]、MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)等を含有するPCRバッファー中で、センス及びアンチセンスプライマー(サイズ:約17〜30b、好ましくは20〜25b)と鋳型DNAの存在下で行う。増幅されたDNAは、アガロースゲル電気泳動で分離・精製(臭化エチジウム染色)することができる。
ハイブリダイゼーションは、約20〜100b又はそれ以上の長さの標識プローブと二本鎖を形成して目的核酸を検出する技法である。選択性を高めるために、一般にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うことができる。ストリンジェントな条件は、例えば約1〜5×SSC、室温〜約40℃でのハイブリダイゼーション、及びその後の、約0.1〜1×SSC、0.1% SDS、約45〜65℃での洗浄からなる。ここで、1×SSCは、150mM NaCl、15mM Na-クエン酸、pH7.0の溶液を指す。このような条件は、配列同一性が約80%以上、好ましくは85%以上の核酸を検出することを可能にするであろう。
上記核酸はベクターに挿入され、本発明の医薬組成物の有効成分である蛋白質の製造のために使用されるか、或いは、ベクター自体を製剤化して医薬組成物として使用される。
ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等を含む。プラスミドの例は、非限定的に、大腸菌由来プラスミド(例えばpRSET、pTZ19R、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草菌由来プラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来プラスミド(例えばYEp13、YEp24、YCp50等)、Tiプラスミド等が挙げられ、ファージの例はλファージ等が挙げられ、さらに、ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の動物ウイルスベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。
ベクターは、目的DNAを組み込むためのポリリンカーもしくはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、該DNAを発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。制御エレメントには、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列、ターミネーター等が含まれる。
選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子(例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等)、栄養要求性相補遺伝子[例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、HIS3遺伝子、LEU2遺伝子、URA3遺伝子等]等である。
プロモーターは、宿主細胞に応じて異なる場合がある。
宿主細胞の例としては、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属、シュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属、ピキア属等の酵母、CHO、COS、HEK293、NIH3T3、NS0等の動物細胞、Sf9、Sf21等の昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合、プロモーターとして、例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PL又はPRプロモーター等が例示される。
酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が例示される。
動物細胞を宿主とする場合、プロモーターとして、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、ヒトCMV初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、メタロチオネインプロモーター、多角体プロモーター等が例示される。
植物細胞を宿主とする場合、プロモーターとして、例えばCaMVプロモーター、TMVプロモーター等が例示される。
形質転換又はトランスフェクションとしては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、アグロバクテリウム法、ウイルス感染法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リポフェクション法等が挙げられる。
形質転換宿主は、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞の種類に応じた培養条件で培養され、細胞内又は培養液から目的蛋白質を回収する。
微生物の培養では、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地を使用する。炭素源として、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、窒素源として、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸や有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等、無機物として、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸 第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
動物細胞の培養では、例えばDMEM培地、RPMI1640培地等を基本培地とし、これに牛胎児血清(FCS)等を添加した培地が用いられる。
目的蛋白質の回収は、上で説明したとおり、蛋白質精製のための慣用手法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒沈殿、透析、電気泳動、クロマトフォーカシング、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等にて実施しうる。
ベクターを治療用に使用する場合には、被験体のゲノムに組み込まれないベクターであって、細胞に感染するが複製が不能にされたウイルスベクター、非ウイルスベクター等が望ましい。このようなベクターには、例えばアデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が含まれる。これらのベクターは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位、選択マーカー、レポーター遺伝子等を含みうる。ウイルスベクターの例は、J. Virol. 67:5911-5921 (1993), Human Gene Therapy 5:717-729 (1994), Gene Therapy 1:51-58 (1994), Human Gene Therapy 5:793-801 (1994), Gene Therapy 1:165-169 (1994)等に記載されているベクター、或いは、それらの改良ベクターである。更に、非ウイルスベクターの例は、ヒト人工染色体ベクターであり、これは、ヒト染色体由来のセントロメア及びテロメアを含む染色体断片から構成されるベクターである。ヒト染色体断片は特に制限されないが、例えばヒト14番染色体断片、ヒト21番染色体断片等が含まれる(再表2004/031385号、特開2007-295860等)。上記ベクターに、上記定義の核酸を挿入し、被験体の骨部に投与するか、或いは、被験体から採取した骨部組織若しくは細胞にベクターを導入したのち該被験体の骨部に戻す方法等により、ベクターを被験体に投与することができる。
＜医薬組成物＞
本発明は更に、上で説明したFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7受容体の細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質、或いは、該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とする骨疾患治療用組成物を提供する。
本発明はまた、該組成物を哺乳動物に投与することを含む、骨疾患を治療する方法を提供する。
本発明において、骨疾患は、骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患であり、例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍{破骨細胞腫、骨肉腫、多発性骨髄腫[多発性骨髄腫による骨の痛みは脊髄と肋骨にみられることが多く、運動することにより悪化することがある。同じ部分が持続的に痛む場合は、病的骨折を来している可能性がある。脊椎に病変がある場合は、脊髄圧迫を引き起こす場合がある。多発性骨髄腫では、増殖した腫瘍細胞によってIL-6が放出される。IL-6は破骨細胞を活性化する因子(OAF:osteoclast activating factor)としても知られ、IL-6によって活性化された破骨細胞が骨を吸収・破壊するため、多発性骨髄腫に侵された骨をレントゲン撮影すると、骨に穴が開いているように見える(打ち抜き像:"punched-out" resorptive lesions)。また、骨の破壊によって血中カルシウム濃度が高まり、高カルシウム血症や、それに起因する様々な症状が発生する。]}、高カルシウム血症、骨ページェット病、大理石骨病、カムラチ・エンゲルマン病、関節症、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、クル病、外傷性骨折、疲労骨折等に起因する骨疾患、及びそれらに関連する様々な骨疾患又は障害を含む。骨粗鬆症には原発性骨粗鬆症と続発性(二次性)骨粗鬆症が含まれ、原発性骨粗鬆症としては、例えば閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症が挙げられ、続発性(二次性)骨粗鬆症の原因疾患としては、例えば内分泌性(副甲状腺機能亢進症・甲状腺機能亢進症・性腺機能低下症・クッシング症候群・成長ホルモン欠乏症・糖尿病・アジソン病・カルシトニン欠損症等)、栄養性/代謝性[慢性消耗性疾患・るいそう・重症肝疾患(特に原発性胆汁性肝硬変)・胃切除・壊血病・吸収不良症候群(セリアック病を含む)・低リン血症・慢性腎疾患・特発性高Ca尿症・ヘモクロマトーシス・アミロイドーシス・肥胖細胞腫・ナトリウム過剰摂取・カルシウム摂取不足・ビタミンD,A過剰症等]、炎症性[関節リウマチ・傍関節性(炎症性サイトカインによる骨吸収亢進)・サルコイドーシス等]、不動性(全身性・臥床安静・麻痺・局所性・骨折後等)、薬物性[ステロイド(免疫抑制薬として炎症性疾患に広く用いられている。ステロイドで治療する疾患には、膠原病、喘息、炎症性腸疾患、臓器移植等がある。骨喪失はこの療法の重篤な副作用である)・メトトレキセート・ヘパリン・ワーファリン・抗ケイレン薬・リチウム・タモキシフェン等]、血液疾患[多発性骨髄腫・リンパ腫・白血病・血友病・慢性溶血性疾患等]、先天性(骨形成不全症・マルファン症候群・クラインフェルター症候群・先天性骨髄性ポルフィリア・嚢胞性線維症等)、その他の疾患によるもの[慢性閉塞性肺疾患・肝疾患・腎疾患・関節リウマチ・妊娠・高酸素血症・HIV感染症等]が挙げられる。
また、本発明において、骨疾患には石灰化のプロセスのみが阻害されることによって引き起こされる骨疾患も含まれ、例えばクル病等が挙げられる。
本発明の組成物は、骨疾患をもつ哺乳動物、好ましくは骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患をもつ哺乳動物、に投与するとき、骨部に特異的に作用して骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加させ、これによって、少なくと海綿骨の増加、骨幹の肥厚及び増殖等を可能にする。この組成物は、骨部に特異的であるゆえに、その他の組織に副作用をほとんど又はまったく引き起こさないという驚くべき利点を有している。
本発明の組成物の形態(即ち、製剤)は、制限されないものとし、経口製剤、非経口製剤のいずれも包含する。また、製剤には、本発明の有効成分の他に、骨疾患用の他の治療剤を含有させてもよい。そのような治療剤には、以下のものに限定されないが、例えばカルシウム製剤(L-アスパラギン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム等)、活性型ビタミンD3製剤(アルファカルシドール、カルシトリオール等)、女性ホルモン薬(エストリオール、結合型エストロゲン等)、カルシトニン製剤(サケカルシトニン、エルカトニン等)、ビタミンK製剤(メナテトレノン等)、ビスホスホネート製剤(エチドロン酸二ナトリウム、アレンドロン酸ナトリウム水和物、リセドロン酸ナトリウム水和物等)、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(塩酸ラロキシフェン等)、イプリフラボン、又は抗RANKL抗体等が含まれる。
上記の他の治療剤は、本発明の組成物と組み合わせて、担当医の治療計画に合わせて、同時に又は連続的に哺乳動物に投与することができる。ここで、「連続的に」とは、本発明の組成物が投与された後に、他の治療剤が投与されてもよいし、或いは、他の治療剤が投与された後に、本発明の組成物が投与されてもよいことを意味し、両薬剤の投与時期に時間的ずれがあることを表す。また、「同時に」とは、本発明の組成物と他の治療剤とが同時に投与される場合を意味し、この場合、本発明の組成物に他の治療剤が含有されて１つの製剤を構成してもよい。
好ましい形態は、非経口製剤であり、非限定的に、静脈内投与製剤、筋肉内投与製剤、腹腔内投与製剤、皮下投与製剤、局所投与製剤等が含まれる。局所投与は、損傷、骨折、障害を受けた骨部、例えば頭蓋骨、大腿骨、胸骨、椎骨、肋骨等の患部への直接的投与を含み、例えばハイドロキシアパタイト等の人工骨成分に有効成分を含有させた形態の移植用製剤として投与してもよい。非経口投与製剤には、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、リポソーム、ナノ粒子封入製剤等が含まれる。
経口製剤には、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、遅延放出製剤、腸溶性製剤等が含まれる。
本発明の蛋白質を有効成分とする場合、組成物は、製薬上許容される賦形剤、希釈剤等の担体、及び添加剤を含むことができる。
担体は、例えば生理食塩水、グリセロール、エタノール、アーモンド油、植物油、スクロース、デンプン、ラクトース等を含む。
添加剤は、例えば、結合剤(例えばα化トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ等)、分散剤(例えばポリビニルピロリドン、トウモロコシデンプン等)、懸濁剤(例えばタルク、アラビアゴム等)、乳化剤(例えばレシチン、アラビアゴム等)、崩壊剤(ジャガイモデンプン、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスポピドン等)、緩衝剤(例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス塩等)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、トコフェロール等)、保存剤(例えばソルビン酸、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等)、等張化剤(例えば塩化ナトリウム等)、安定化剤(例えばグリセロール等)等を含むことができる。
腸溶性製剤には、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸-メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸-アクリル酸エチルコポリマー、ヒドロキシプロピルアセテートサクシネート等のポリマーが使用される。
医薬製剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状及び投与経路等に応じて適宜決定されるべきであり、以下に限定されないが、例えば成人一日あたり約0.1μg/kg〜100mg/kgの範囲内であり、好ましくは約1μg/kg〜10mg/kgの範囲内である。製剤の投与は、治療中毎日投与してもよいし、数日間隔、2週間間隔又は1ヶ月間隔等時間間隔をとって投与してもよい。
本発明の別の有効成分は、Frizzled7、Frizzled1又はFrizzled2受容体の細胞外システインリッチドメイン蛋白質又はその変異体をコードする核酸を含むベクターである。
このベクターの投与は、遺伝子治療で行われる技術又は手法と同様に実施できる。ベクターは、被験体に直接投与(in vivo法)してもよいし、又は被験体から採取した細胞に導入し、目的のFrizzled細胞外システインリッチドメインを発現する形質転換細胞を選択してからその細胞を被験体に投与してもよい(ex vivo法)。目的の組織又は細胞にベクターを投与するために使用し得る遺伝子送達法には、コロイド分散系、リポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープ等が含まれる。例えば、送達系は巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を使用することができる。ベクターの直接投与は、例えば静脈内注射(点滴を含む)、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により行うことができる。また、ベクターの細胞導入(形質転換)は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、、リポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法を用いて行うことができる。ベクター又は形質転換体の使用量は、投与経路、投与回数、被験体の種類によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
＜Frizzled細胞外システインリッチドメインノックインマウスの作製＞
本発明は、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2受容体の細胞外システインリッチドメインの生体内機能を解析するためのB細胞特異的発現ノックインキメラマウス及びその作製法を通して見出されたものである。
本発明におけるFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス望ましくはFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインとFcとの融合体発現ノックインキメラマウスの作製は、例えば確立されている方法(国際公開第WO2006/78072号)に従って作製することができる。例えば、マウスB細胞におけるより効率的な分泌発現を可能にするため、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2の分泌シグナル配列をマウスIgκ遺伝子の分泌シグナル配列と置換する。ここでヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン又はヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメインとFcとの融合体をノックインする場合には、ヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン蛋白質(配列番号8)のN末端から32番目のアラニンまでの領域を、またマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメインをノックインする場合には、マウスFrizzled7細胞外システインリッチドメイン蛋白質(配列番号2)のN末端から32番目のアラニンまでの領域を置換することが好ましく、ヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメイン或いはヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメインとFcとの融合体をノックインする場合には、ヒトFrizzle1細胞外システインリッチドメイン蛋白質(配列番号16)のN末端から72番目のアラニンまでの領域を、またマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメインをノックインする場合には、マウスFrizzled1細胞外システインリッチドメイン蛋白質(配列番号12)のN末端から71番目のアラニンまでの領域を置換することが好ましく、ヒト或いはマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン又はヒト或いはマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメインとFcとの融合体をノックインする場合には、マウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン蛋白質(配列番号59)のN末端から28番目のアラニンまでの領域を置換することが好ましい。なお、Frizzled2の場合、ヒト及びマウス共にシステインリッチドメインのアミノ酸配列は同一であるため、ヒト又はマウスのどちらのアミノ酸配列が用いられてもよい。ここで述べるFcとの融合体を発現させる場合には、ヒトIgG1由来Fcの一部をADCC及びCDC活性低下型に変異させたFc変異体(hFcm)を用いることが好ましい。
ヒト又はマウスFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス又はヒト又はマウスFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインとhFcmとの融合体発現ノックインキメラマウス及び外来cDNA発現ユニットが挿入されていない、或いはhFcmのみの発現ユニットが挿入されたES細胞を用いて作製されたコントロールキメラマウスについて、各組織の病理解析、免疫組織化学解析、血清生化学検査、血球成分測定等を実施して、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインの発現に起因する変化を特定できる。後述の実施例2及び13においては、コントロールキメラマウスに比較しマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例2(2-1)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が、実施例2(2-2)よりHematoxylin-Eosin(H&E)染色された病理切片の観察から、大腿骨の海綿骨増加及び胸骨の海綿骨の増加が、実施例2(2-3)より脛骨のX線写真撮影から、脛骨の骨密度増加が、実施例13(13-2-2)より脛骨の単位骨量の増加が、実施例13(13-2-4)より脛骨の石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加が、実施例13(13-3)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例13(13-4)より脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が観察された。後述の実施例14においては、コントロールキメラマウスに比較しヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例14(14-2)及び(14-5)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が、実施例14(14-3)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例14(14-4)より大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が、実施例14(14-6)よりH&E染色された病理切片の観察から、大腿骨の海綿骨増加、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚及び胸骨の海綿骨の増加が観察された。また、後述の実施例5及び16においては、Frizzled1細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例5(5-1)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が、実施例5(5-2)より脛骨のX線写真撮影から、脛骨の骨密度増加が、実施例5(5-4)よりH&E染色された病理切片の観察から、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨増加及び胸骨の海綿骨の増加が、実施例16(16-2-2)より脛骨の単位骨量の増加が、実施例16(16-2-4)より脛骨の石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加が、実施例16(16-3)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例16(16-4)より大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が観察された。さらに、後述の実施例10及び19においては、Frizzled2細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例10(10-1)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が、実施例10(10-2)よりH&E染色された病理切片の観察から、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚が、実施例19(19-4-2)より脛骨の単位骨量の増加が、実施例19(19-4-4)より脛骨の石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加が、実施例19-4-5より破骨細胞数・破骨細胞面の低下が、実施例19(19-5)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例19(19-6)より大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が観察された。
Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインノックインマウス、或いは、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインとhFcmとの融合体ノックインキメラマウスは、例えば確立されている方法(国際公開第WO2006/78072号)に従って作製することができる。また、ノックインES細胞由来の細胞において挿入した核酸(Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメイン或いはFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメインとhFcmとの融合体)が発現するかどうかは、当該細胞由来のRNAを用いたRT-PCR法、ノーザンブロット法等、更にはFrizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2細胞外システインリッチドメイン或いはhFcmに対する抗体を用いた酵素免疫測定法(ELISA)及びウエスタンブロット法等を利用して検出できる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2をそれぞれFZD7、FZD1、又はFZD2と表記する。
［実施例１］
USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの作製
国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従い、マウスFZD7-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1719bp、配列番号1)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(FZD7の細胞外システインリッチドメインと結合させるため挿入したリンカー配列から終止コドンを含む702bp、配列番号3)より、pUSmFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、配列番号1におけるマウスFZD7シグナル配列、CRD(cystein-rich-domain)、7回膜貫通領域を含むCRDより下流領域をそれぞれGenBankアクセッション番号NM_008057.2、NP_032083.2の情報を基に、下線、囲み線、二重下線で示す。
配列番号1:
Figure 2015070854
以下に、配列番号1がコードするアミノ酸配列(572アミノ酸、配列番号2)を示す。
配列番号2:
Figure 2015070854
以下に、ヒトIgG1 由来Fc変異体(hFcm)のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号3及び4に示す。公知の情報(Tawara, T., et al., J. Immunology, 180, 2294-2298(2008)；Gross, J. A., et al., Immunity, 15, 289-302(2001)；国際公開第WO02/094852号パンフレット)を基に本来のヒトIgG1 由来Fc領域配列の中で、ADCC活性低下型に変えるため変異させたcDNA及びアミノ酸配列部分(N末端側より変異前と変異後のアミノ酸を記す。L→A、L→E、G→A)を二重下線で、CDC活性低下型に変えるため変異させたcDNA及びアミノ酸配列部分(変異前と変異後のアミノ酸配列を記す。K→A、P→S)を囲み線で、FZD7の細胞外システインリッチドメインのC末端アミノ酸と結合させるため本来のヒトIgG1由来Fc配列の5’末端に付加したリンカー配列(SfoI認識配列を含む)を下線で示す。公知の情報[Gross, J. A., et al., Immunity, 15, 289-302(2001)]から、上記方法以外にCDC活性低下型に変えるため、配列番号4記載のN末端より116番目のAをSに変異させることも可能である。
配列番号3:
Figure 2015070854
以下に、配列番号3がコードするアミノ酸配列(233アミノ酸、配列番号4)を示す。
配列番号4:
Figure 2015070854
以下に、pUSmFZD7crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号5:マウスFZD7シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD7crd-hFcm配列を含む1462bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号6:406アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号5:
Figure 2015070854
 配列番号6:
Figure 2015070854
pUSmFZD7crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスは作製された。
更に、下記実施例2、13、14、16、17、19で用いられたコントロールキメラマウス個体(コントロールキメラマウス)は国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従い作製された。
［実施例２］
USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの解析
2-1.剖検所見
上記実施例1で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。また、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの約半数の個体で脾臓の肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
2-1-1.大腿骨
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中全ての個体においてコントロール29個体に比べ白色化が観察された。
2-1-2.胸骨
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中全ての個体においてコントロール29個体に比べ白色化が観察された。
2-1-3.頭蓋骨
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ白色化は16個体、硬化は18個体認められた。
2-1-4.椎骨
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ白色化は1個体、硬化は10個体認められた。
2-1-5.肋骨
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ硬化は7個体認められた。
2-1-6.脾臓
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロールに比べ11個体で肥大傾向が認められた。但し同様の変化はコントロール個体においても29個体中、4個体で認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
2-2.病理所見
16週齢のコントロールキメラマウス7個体及びUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体から由来する肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、脳、副腎、精巣(雄性の場合)、卵巣(雌性の場合)、大腿骨、胸骨、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、脊髄、大動脈、骨格筋、皮膚のH&E染色病理切片を用いた観察から、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの全例において大腿骨の海綿骨増加及び胸骨の海綿骨の増加が観察された(図1、2)。コントロール個体においては1個体においてのみ上記同様の変化を示す個体が観察された。骨以外の臓器・組織においては、コントロールに比べ顕著な変化は観察されなかった。
以上の結果より、大腿骨の海綿骨増加及び胸骨の海綿骨増加はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
2-3.脛骨のX線写真画像解析
16週齢のコントロールキメラマウス(雌5個体、雄4個体)及びUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌7個体、雄6個体)由来脛骨を用いてX線写真(μFX-1000、FUJIFILM社製)を撮影した(図3、4)。
得られた脛骨のX線写真撮影画像は、雌雄ともにコントロールマウスに比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスでより白色化していた。
以上の結果より、脛骨の白色化はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
2-4.血球解析
8週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体から、8週齢のコントロール雌マウス15個体、コントロール雄マウス9個体から、15週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体から、15週齢のコントロール雌マウス14個体、コントロール雄マウス11個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
2-5.血清生化学解析
16週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス16個体、コントロール雄マウス14個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
2-6.USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおけるマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認
2-6-1.USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清を用いたマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体のELISA測定
16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌14個体、雄6個体)血清中に存在するマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体をELISA法によって検出した。
FZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の血清中濃度をELISA法によって測定を行うため、Anti-Human IgG(γ-Chain Specific, SIGMA社、商品番号:I3382)を固定化した96wellプレート(コーニング社、Maxi Soap)に評価サンプルないしはコントロールサンプル(Recombinant Mouse Frizzled-7/Fc Chimera, R&D systems社、商品番号:198-FZ)を加え、室温30分間インキュベートを行った後に、T-PBS(-)で3回洗浄操作を行い、ペルオキシダーゼ標識抗体Ant-Human IgG(Fc fragment)Peroxidase conjugate developed in Goat(SIGMA社、商品番号:A0170)を添加し室温で30分間インキュベートを行った。その後、T-PBS(-)で4回洗浄操作を行った後、スミロン ペルオキシダーゼ発色キット(住友ベークライト株式会社、商品番号:ML-1120T)を用いて発色させ、450nmの吸光度を測定することで血清中濃度の測定を行った。
その結果、雌14個体の平均濃度は201.7μg/mL、雄6個体の平均濃度は168.4μg/mLであり、コントロール個体由来の血清を用いて測定した結果では雌5個体、雄1個体すべて検出限界以下であった。
以上の結果より、マウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体が生体内で発現し血中を循環している事が示唆された。
2-6-2.USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清を用いたウエスタン解析
ヒトIgG認識ウサギポリクローナル抗体を用いた、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス及びコントロールキメラマウス由来血清のウエスタン解析を行った。ウエスタン解析に用いたサンプルとして、予め血清50μLをプロテインGカラム(GEヘルスケア、レジン体積約100μL)にアプライし、非特異的吸着物を除いた後、血清1.25μL及び2.5μL相当のレジンを解析用サンプルとして用いた。その結果、還元条件下で60kDa付近にUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス特有のメインバンドが検出された(図5)。本解析で得られた分子量は本来アミノ酸配列でのみ予測される分子量(還元条件下:42.8kDa)より大きな分子量を示したが、本融合体はN-link、O-link糖鎖付加予測サイトをそれぞれ3箇所含み、糖鎖付加による分子量の増加が示唆された。
以上の結果から、本実験で作製されたUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスはマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体を発現していることが示唆された。
［実施例３］
UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの作製
実施例1記載の方法に従い、ヒトFZD7-cDNA(配列番号7)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、配列番号7におけるヒトFZD7シグナル配列、CRD、7回膜貫通領域を含むCRDより下流領域をそれぞれGenBankアクセッション番号NM_003507.1、NP_003498.1の情報を基に、下線、囲み線、二重下線で示す。
配列番号7:
Figure 2015070854
以下に、配列番号7がコードするアミノ酸配列(574アミノ酸、配列番号8)を示す。
配列番号8:
Figure 2015070854
以下に、pUShFZD7crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号9:ヒトFZD7シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にヒトFZD7crd-hFcm配列を含む1462bpより構成される。囲み線の部分はヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号10:406アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号9:
Figure 2015070854
 配列番号10:
Figure 2015070854
pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
また、外来cDNA発現ユニットが挿入されていないコントロールキメラマウス個体(コントロールキメラマウス)の作製は国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従う。
［実施例４］
USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの作製
実施例1記載の方法に従い、マウスFZD1-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1929bp 配列番号11)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUSmFZD1crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、配列番号11におけるマウスFZD1シグナル配列、CRD(cystein-rich-domain)、7回膜貫通領域を含むCRDより下流領域をそれぞれGenBankアクセッション番号NM_021457.2、NP_067432.2の情報を基に、下線、囲み線、二重下線で示す。
配列番号11:
Figure 2015070854
以下に、配列番号11がコードするアミノ酸配列(642アミノ酸、配列番号12)を示す。
配列番号12:
Figure 2015070854
以下に、pUSmFZD1crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号13:マウスFZD1シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD1crd-hFcm配列を含む1534bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号14:430アミノ酸、下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号13:
Figure 2015070854
 配列番号14:
Figure 2015070854
pUSmFZD1crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
更に、下記実施例5で用いられたコントロールキメラマウス個体(コントロールキメラマウス)は国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従い作製された。
［実施例５］
USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの解析
5-1.剖検所見
上記実施例4で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
5-1-1.大腿骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中10個体においてコントロール10個体に比べ白色化が観察された。
5-1-2.胸骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中18個体においてコントロール10個体に比べ白色化が観察された。
5-1-3.頭蓋骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ白色化は19個体、硬化は13個体認められた。
5-1-4.椎骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ硬化は10個体認められた。
5-1-5.肋骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ硬化は7個体認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
5-2.脛骨のX線写真画像解析
16週齢のコントロールキメラマウス(雌9個体、雄7個体)及びUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌8個体、雄3個体)由来脛骨を用いてX線写真(μFX-1000、FUJIFILM社製)を撮影した(図6、7)。
得られた脛骨のX線写真撮影画像は、雌雄ともにコントロールマウスに比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスでより白色化していた。
以上の結果より、脛骨の白色化はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
5-3.血球解析
8週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス17個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス3個体から、8週齢のコントロール雌マウス21個体、コントロール雄マウス4個体から、15週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス17個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス3個体から、15週齢のコントロール雌マウス17個体、コントロール雄マウス4個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
5-4.病理所見
16週齢のコントロールキメラマウス9個体及びUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体から由来する肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、脳、副腎、精巣(雄性の場合)、卵巣(雌性の場合)、大腿骨、胸骨、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、脊髄、大動脈、骨格筋、皮膚のH&E染色病理切片を用い観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図8、9、表1)と海綿骨の増加(図10)及び胸骨の海綿骨の増加(図11)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
Figure 2015070854
5-4-1.大腿骨
剖検を実施したコントロール9個体に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中11個体において骨幹壁厚の肥厚が、またUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中15個体において海綿骨の増加が観察された。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%、50%及び80%)の横断切片について、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス7個体、コントロールマウス2個体由来のサンプルを用いて骨幹壁厚を計測した結果、近位端より50%地点の最大壁厚値でコントロールよりも高値を示した(図9、表1)。また、80%地点での海綿骨増加の所見が7個体中5個体で認められた(表1)。
5-4-2.胸骨
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中14個体においてコントロール9個体に比べ海綿骨の増加が観察された。
骨以外の臓器・組織においては、コントロールに比べ顕著な変化は観察されなかった。
以上の結果より、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨増加及び胸骨の海綿骨増加はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた
可能性が示された。
5-5.USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおけるマウスFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認を目的とした血清サンプルを用いたELISA測定
16週齢USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌17個体、雄3個体)血清中に存在するマウスFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体をELISA法によって検出した。
FZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の血清中濃度をELISA法によって測定を行うため、Anti-Human IgG(γ-Chain Specific, SIGMA社、商品番号:I3382)を固定化した96wellプレート(コーニング社、Maxi Soap)に評価サンプルないしはコントロールサンプル(Recombinant Mouse Frizzled-7/Fc Chimera, R&D systems社、商品番号:198-FZ、注；本測定系はFc部分を認識する抗体のサンドイッチELISA系であるため便宜上、コントロールサンプルとしてMouse Frizzled-7/Fc Chimeraを使用しても発現確認レベルであれば問題ないと判断した)を加え、室温30分間インキュベートを行った後に、T-PBS(-)で3回洗浄操作を行い、ペルオキシダーゼ標識抗体Ant-Human IgG(Fc fragment)Peroxidase conjugate developed in Goat(SIGMA社、商品番号:A0170)を添加し室温で30分間インキュベートを行った。その後、T-PBS(-)で4回洗浄操作を行った後、スミロン ペルオキシダーゼ発色キット(住友ベークライト株式会社、商品番号:ML-1120T)を用いて発色させ、450nmの吸光度を測定することで血清中濃度の測定を行った。
その結果、雌17個体の平均濃度は298.4μg/mL、雄3個体の平均濃度は308.8μg/mL(値は共に参考値)であり、コントロール個体由来の血清を用いて測定した結果雌5個体、雄1個体すべて検出限界以下であった。
以上の結果より、マウスFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体が生体内で発現し血中を循環している事が示唆された。
［実施例６］
UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの作製
実施例1記載の方法に従い、ヒトFZD1-cDNA(配列番号15)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、配列番号15におけるヒトFZD1シグナル配列、CRD(cystein-rich-domain)、7回膜貫通領域を含むCRDより下流領域をそれぞれGenBankアクセッション番号NM_003505.1、NP_003496.1の報を基に、下線、囲み線、二重下線で示す。
配列番号15:
Figure 2015070854
以下に、配列番号15がコードするアミノ酸配列(574アミノ酸、配列番号16)を示す。
配列番号16:
Figure 2015070854
以下に、pUShFZD1crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号17:ヒトFZD1シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にヒトFZD1crd-hFcm配列を含む1546bpより構成される。囲み線の部分はヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号18:434アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号17:
Figure 2015070854
 配列番号18:
Figure 2015070854
pUShFZD1crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
また、外来ｃＤＮＡ発現ユニットが挿入されていないコントロールキメラマウス個体(コントロールキメラマウス)の作製は国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従う。
［実施例７］
mFZD7crd-hFcm組換え体の発現・調製
7-1.mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
7-1-1.pLN1V5ベクターの構築
5’末端にBamHI・NheI・SalIサイトを3’末端にXhoIサイトを持つ(V5タグ+Stop codon)センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
V5S:GATCCGCTAGCGTCGACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGTGAC(配列番号50)
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
7-1-2.mFZD7crd-hFcm DNA断片の合成
088Fc_BHIkozakFw:TAAAGGATCCCGGCCACCATGCGGGGCCCCGGCACGGCGG
(配列番号52)
088Fc_mFZD7G1SA_3primer:GTCTGAAGACCTAGGCTCGGCCAGGTAGGGAGCAGTAGGG
(配列番号53)
G1SA_5primer:GCCGAGCCTAGGTCTTCAGAC
(配列番号54)
SalIG1SARev:TAAAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG
(配列番号55)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号52及び53のプライマー各10pmol、鋳型としマウスFZD7 cDNA(配列番号1)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、得られた594bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD7crd hFcm)を回収した。
同様に、Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号54及び55のプライマー各10pmol、鋳型としhFcm cDNA(配列番号3)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、得られた712bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(hFcm SalI)を回収した。
上記2回のPCRで得られたDNA増幅断片(BamHI mFZD7 hFcm)及び(hFcm SalI)をPrimeSTAR bufferに加え全量を100μlとし、100℃に10分間加熱した後、室温に戻し、hFcm領域をアニーリングさせた。その後、配列番号52及び55のプライマー各10pmol加え、伸長反応を72℃5分間行い、次に、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、最後に72℃2分間インキュベート後、得られた1285bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。
7-1-3.mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びSalI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。得られた酵素処理断片を実施例7-1-1で作製されたpLN1V5ベクターのBamHI・SalIサイトに導入し、mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクター(図12)を構築した。
以下にmFZD7crd-hFcm組換え体のcDNAの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列(1257 bp、配列番号56)及び該cDNAがコードするmFZD7-hFcmのシグナル配列を含んだアミノ酸配列(418アミノ酸、配列番号57)を示す。配列番号56及び57において、下線部はマウスFZD7のシグナル配列部分を示す。
配列番号56:
ATGCGGGGCCCCGGCACGGCGGCGTCGCACTCGCCCCTGGGCCTCTGCGCCCTGGTGCTTGCTCTTCTGTGCGCGCTGCCCACGGACACCCGGGCTCAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号57:
MRGPGTAASHSPLGLCALVLALLCALPTDTRAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7-2.mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD7crd-hFcmの一過的発現
7-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例7-1-3で取得されたmFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
7-2-2.培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに35mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加えた溶液、及び1.3mLの293 fectin Transfection Reagent(日本国インビトロジェン株式会社)に33.7mLのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumを加えた溶液をそれぞれ調製し、5分間室温でインキュベートした。インキュベート後この2液を混合し、更に約30分間室温でインキュベートした。その後、1x109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
7-3.mFZD7crd-hFcm組換え体の精製・調製
7-3-1.培養上清前処理
実施例7-2-2で得られた培養液の上清を回収し、0.22μmフィルター(0.22μm GP Express Membrane 500mL、日本国日本ミリポア株式会社)で濾過処理を行った後4℃で冷却した。
7-3-2.Antibody Affinityクロマトグラフィー
用いた酸性bufferの組成はクエン酸一水和物(日本国ナカライテスク株式会社)3.895g、クエン酸三ナトリウム(日本国和光純薬工業株式会社)0.38g、塩化ナトリウム(日本国純正化学株式会社)2.92gを水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(日本国関東化学株式会社)13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水和物(日本国和光純薬工業株式会社)41.5gを水に溶かし、1Lとしたものである。
前処理された1L培養上清をPBSで平衡化されたProteinGカラム(Hi Trap ProteinG HP 5mL、日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)にアプライした。その後、PBS25mL以上を用いカラムを洗浄し、その後PBSにNaClを添加しNaCl濃度を1.85M に調製した緩衝液で25mL以上洗浄し、再度30mLPBSでカラムを洗浄した。洗浄操作終了後、カラムに酸性buffer25mLを添加し目的蛋白質を回収した。目的蛋白質は回収後速やかに中和bufferを用いて中和を行った。上記分離精製操作にはAKTAexplorer10s(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
7-3-3.精製標品調製
実施例7-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MW COPES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。
蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光度(E1%1cm=10.3)より算出した。
［実施例８］
mFZD7crd-hFcm組換え体投与マウスの解析
8-1.マウスへの投与
mFZD7crd-hFcm組換え体による骨組織に対する生理作用を評価する目的で、マウスへの投与実験を行った。
mFZD7crd-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD7crd-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、完全ヒト抗体産生マウス(特許文献;特許3523245号)を使用した。マウスは3週齢で導入して馴化の後、4週齢で尾静脈より1μlの血液を採血し、抗ヒトIgG(γ-chain specific)ヤギ抗体(日本国シグマアルドリッチジャパン株式会社、商品番号:I3382)を固定化した96穴プレート(Nunc ImmunoplateII 96 Maxi Soap 442404、日本国サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)に分注して血中のヒトIgGを固層化した後、抗ヒトIgG(Fc fragment)ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体(日本国シグマアルドリッチジャパン株式会社、商品番号:A0170)を検出抗体として用い、スミロン ペルオキシダーゼ発色キットT(日本国住友ベークライト株式会社、商品番号:ML-1120T)によって発色させるELISA法により、マウス血中のヒト抗体産生について測定を行った。血中へのヒト抗体産生が確認されたマウスについて、6週齢時点の投与開始日前日(Day-1)の体重を基に群分けを実施した。
mFZD7crd-hFcm組換え体投与群には、mFZD7crd-hFcm組換え体を蛋白濃度5mg/mLとなるようにPBSで調製し、各個体に200μLずつ、10日に1回の頻度で計7回、尾静脈内に投与した。また、骨組織変化を比較するコントロール群として、投与を行わない無処置群を設定した。初回投与日をDay0とし、Day60まで10日おきに計7回の尾静脈投与を実施した後、Day68にマウスを剖検に供した。
8-2.病理所見
剖検において、右大腿骨及び胸骨等の組織を採取し、10%中性緩衝ホルマリン液(日本国和光純薬株式会社)に浸漬して固定の後、脱灰操作を行い、H&E標本を作製し、大腿骨における近位端より50%地点の最大骨幹壁厚を測定した。
剖検を実施したコントロール5個体、mFZD7crd-hFcm組換え体投与4個体由来のサンプルを用いて骨幹壁厚を計測した結果、近位端より50%地点の最大骨幹壁厚値でコントロールより高値を示した(表2)。
Figure 2015070854
8-3.剖検所見
上記実施例8-2にて剖検を実施した、mFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体の大腿骨、胸骨、頭蓋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウスにおいて大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化、胸骨の白色化、節が太くなる傾向が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
8-3-1.大腿骨
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中3個体において白色化が観察された。
8-3-2.頭蓋骨
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中2個体において白色化が観測された。
8-3-3.胸骨
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中1個体において白色化、2個体において節が太くなる傾向が観察された。
以上の結果より、大腿骨の白色化、頭蓋骨の白色化、胸骨の白色化、節が太くなる傾向はmFZD7crd-hFcm組換え体の投与によって引き起こされた可能性が示された。
8-4.骨形態計測
剖検において、脛骨の組織を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製しトルイジンブルー染色を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について構造パラメーターである単位骨量BV/TVを測定した。
剖検を実施したコントロール5個体、mFZD7crd-hFcm組換え体投与4個体由来のサンプルを用いて単位骨量BV/TVを測定した結果、コントロール個体群に比べmFZD7-hFc組換え体投与群のBV/TVが増加していることから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はmFZD7crd-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された(表3)。
Figure 2015070854
［実施例９］
USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスの作製
実施例1記載の方法に従い、マウスFZD2-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1713bp、配列番号58)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUSmFZD2crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、配列番号58におけるマウスFZD2シグナル配列、CRD(cystein-rich-domain)、7回膜貫通領域を含むCRDより下流領域をそれぞれGenBankアクセッション番号NM_020510.2、NP_065256.1の情報を基に、下線、囲み線、二重下線で示す。
配列番号58:
Figure 2015070854
以下に、配列番号58がコードするアミノ酸配列(570アミノ酸、配列番号59)を示す。
配列番号59:
Figure 2015070854
以下に、pUSmFZD2crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号60:マウスFZD2シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD2crd-hFcm配列を含む1423bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン、二重線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号61:393アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号60:
Figure 2015070854
 配列番号61:
Figure 2015070854
pUSmFZD2crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例に従いB細胞特異的にマウスFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
なお、FZD2細胞外システインリッチドメインのアミノ酸配列はマウス、ヒトで同一であるため、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスは、ヒトFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUShFZD2crd-hFcm KIキメラマウスと実質的に同一となる。
更に下記実施例10で用いられたマウスコントロール個体(コントロールキメラマウス)を、国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例11記載の方法に従い作製した。
［実施例１０］
USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスの解析
10-1.剖検所見
上記実施例9で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
10-1-1.大腿骨
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中7個体においてコントロール6個体に比べ白色化が観察された。
10-1-2.胸骨
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中9個体においてコントロール6個体に比べ白色化が観察された。
10-1-3.頭蓋骨
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ白色化は6個体、硬化は4個体認められた。
10-1-4.椎骨
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ硬化は2個体認められた。
10-1-5.肋骨
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ硬化は2個体認められた。
以上の結果より、骨量増加が原因と考えられる大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
10-2.病理所見
実施例8-2に記載の方法に従い、大腿骨における近位端より30%、50%及び80%の各地点の最大骨幹壁厚を測定した。
剖検を実施したコントロールマウス6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体のサンプルを用いて骨幹壁厚を計測した結果、近位端より50%地点の最大骨幹壁厚値及び30%地点の最小骨幹壁厚値でコントロールよりも高値を示した(表4)。
Figure 2015070854
以上の結果より、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
［実施例１１］
mFZD1crd-hFcm組換え体の発現・調製
11-1.mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号54、55、62、63のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFzd1 cDNA(配列番号11)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図13)。
103Fc_BHIkozakFw:TAAA GGATCCCGGCCACC ATGGCTGAGGAGGCGGCGCC
(配列番号62)
103Fc_mFZD1G1SA_3primer:GTCTGAAGACCTAGGCTCGGC GTGCTGCGGATTACTGGTCC
(配列番号63)
以下にmFZD1crd-hFcm組換え体 cDNAの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列(1446bp、配列番号64)、及び該cDNAがコードするmFZD1-hFcmのシグナル配列を含んだアミノ酸配列(481アミノ酸、配列番号65)を示す。配列番号64及び65において、下線部はマウスFZD1のシグナル配列部分を示す。
配列番号64:
ATGGCTGAGGAGGCGGCGCCTAGCGAGTCCCGGGCCGCCGGCCGGCTGAGCTTGGAACTTTGTGCCGAAGCACTCCCGGGCCGGCGGGAGGAGGTGGGGCACGAGGACACGGCCAGCCACCGCCGCCCCCGGGCTGATCCCCGGCGTTGGGCTAGCGGGCTGCTGCTGCTGCTTTGGTTGCTGGAGGCTCCTCTGCTTTTGGGGGTCCGAGCGCAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号65:
MAEEAAPSESRAAGRLSLELCAEALPGRREEVGHEDTASHRRPRADPRRWASGLLLLLWLLEAPLLLGVRAQAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11-2.mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD1crd-hFcm組換え体の一過的発現
11-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例11-1で取得されたmFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit; 日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
11-2-2.培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium (日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125 rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに20mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、2.5mLのPEI(Polyethylenimine) に17.5mLのOpti PRO SFMを加えた。その後すぐにこの2液を混合し、10分間室温でインキュベートした。その後、1×109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
11-3.mFZD1crd-hFcm組換え体の精製・調製
11-3-1.培養上清前処理
実施例11-2-2で得られた培養液の上清を回収し、0.22μmフィルター(0.22μm GP Express Membrane 500mL;日本国日本ミリポア株式会社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。
11-3-2.Antibody Affinityクロマトグラフィー
用いた酸性bufferの組成はクエン酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.895g、クエン酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.38g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)2.92gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
前処理された1L培養上清をPBS(Dulecco’s Phosphate Buffered Saline;SIGMA)で平衡化されたProteinGカラム(Hi Trap ProteinG HP 5mL; 日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)にアプライした。その後、PBS 25mL以上カラムを洗浄し、次にPBSにNaClを添加しNaCl濃度を1.85Mに調製した緩衝液で25mL以上洗浄し、再度30mL PBSでカラムを洗浄した。洗浄操作終了後、カラムに酸性buffer 25mLを添加し目的蛋白質を回収した。目的蛋白質は回収後速やかに中和bufferを用いて中和を行った。上記分離精製操作にはAKTAexplorer10s(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
11-3-3.精製標品調製
実施例11-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV; 日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。
蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光係数(E1%,1cm=10.6)より算出した。
［実施例１２］
mFZD1crd-hFcm組換え体投与マウスの解析
12-1.マウスへの投与
mFZD1crd-hFcm組換え体による骨組織に対する生理作用を評価する目的で、実施例8-1記載の方法に従い、実施例11-3で得られたmFZD1crd-hFcm組換え体のマウスへの投与実験を行った。
mFZD1crd-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD1crd-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、機能的なＢリンパ球が欠損し抗体が産生されない免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスをMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配により得られたホモ接合体(97KDマウス、日本国日本クレア株式会社、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000)を使用した。5週齢時点の投与開始日前日(Day-1)の体重を基に群分けを実施した。
mFZD1crd-hFcm組換え体投与群には、mFZD1crd-hFcm組換え体を蛋白濃度5mg/mLとなるようにPBSで調製し、各個体に200μLずつ、10日に1回の頻度で計7回、尾静脈内に投与した。また、骨組織変化を比較するコントロール群として、投与を行わない無処置群を設定した。初回投与日をDay0とし、Day60まで10日おきに計7回の尾静脈投与を実施した後、Day70にマウスを剖検に供した。
12-2.剖検所見
剖検を実施し、mFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体の大腿骨、胸骨、頭蓋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化と骨端肥大、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
12-2-1.大腿骨
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化、1個体でやや白色化が、更に1個体で骨端肥大が観察され、コントロール5個体中1個体でやや白色化が観察された。
12-2-2.胸骨
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化、1個体でやや白色化が、コントロール5個体中1個体でやや白色化が観察された。
12-2-3.頭蓋骨
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化と硬化、1個体でやや白色化とやや硬化が認められたが、コントロール5個体全てにおいてに変化は認められなかった。
12-2-4.肋骨
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中1個体で硬化が認められたが、コントロール5個体全てにおいて変化は認められなかった。
以上の結果より、大腿骨の白色化と骨端肥大、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はmFZD1crd-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された。
［実施例１３］
13-1.4、8、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおけるマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認
実施例1記載の方法に従い作製された4週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、4週齢コントロールマウス(雌6個体)、8週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体)、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)、16週齢コントロールマウス(雌6個体、雄5個体)それぞれの血清中に存在するマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の濃度を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。
その結果、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの4週齢雌個体の平均濃度は61.2μg/mL、8週齢雌個体の平均濃度は220.4μg/mL、16週齢雌個体の平均濃度は277.4μg/mL、16週齢雄個体の平均濃度は253.3μg/mLであり、コントロールマウス個体では全て検出限界以下であった。
以上の結果より、4週齢よりマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体がマウス生体内で発現し血中を循環している事及び週齢が進むと共に濃度も増加することが示唆された。
13-2.4、8、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスを用いた脛骨の骨形態計測
13-2-1.骨形態計測
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。4週齢剖検の場合、剖検3日前及び1日前にカルセインを投与し、8、16週齢剖検の場合、剖検6日前及び1日前にカルセインを投与した。4、8、16週齢個体の剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。
13-2-2.単位骨量
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が4、8、16週齢それぞれで増加していることから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加(有意差あり)したことから、頸骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加は雌個体ばかりでなく雄個体においてもマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表5)。
Figure 2015070854
13-2-3.骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨サンプルを用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の骨芽細胞数・類骨量が4、8週齢それぞれ減少傾向を示すことから、若週齢において脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の骨芽細胞数・類骨量はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けないか、やや抑制された可能性が示された。骨芽細胞面では4、8、16週齢全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロール個体群との差はほとんど観察されなかったことから雌個体と同様マウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けない可能性が示された(表6)。
Figure 2015070854
13-2-4.石灰化速度・石灰化面・骨形成速度
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度が16週齢のみで増加を示し、石灰化面は4、8週齢で増加を示し、骨形成速度は4、8、16週齢で増加を示したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、全てコントロール個体群に比べ増加が観察されたことから雌個体と同様頸骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化がマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された(表7)。
Figure 2015070854
13-2-5.破骨細胞数・破骨細胞面
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、コントロール個体群に比べ全ての週齢で変化を示さなかったことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けない可能性が示された。
更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、全てコントロール個体群と変化が観察されなかったことから雌個体と同様脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響を受けない可能性が示された(表8)。
Figure 2015070854
13-3.骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が8、16週齢それぞれで増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が増加したことから、雌個体と同様大腿骨の最大荷重増加はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表9)。
Figure 2015070854
13-4.骨構造解析 (3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、左脛骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下し、更に16週齢(雄個体)において剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより得られた結果も4、8、16週齢(雌個体)で得られた結果と同様であったことから、脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表10)。
Figure 2015070854
［実施例１４］
14-1.8、12週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおけるヒトFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認
実施例3記載の方法に従い作製された8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体)、8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、8週齢コントロールマウス(雄6個体)、12週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、12週齢コントロールマウス(雄6個体)それぞれの血清中に存在するヒトFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定（温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間）にした条件下で、飼料(日本国日本クレア社、CE-2)を自由摂取出来る環境で飼育した。
その結果、8週齢雌個体の平均濃度は244.0μg/ml、8週齢雄個体の平均濃度は190.2μg/ml、12週齢雄個体の平均濃度は208.1μg/mlであり、コントロール個体由来の血清を用いて測定した結果では全て検出限界以下であった。
以上の結果より、8週齢よりヒトFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体がマウス生体内で発現し血中を循環している事が示唆された。
14-2.8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの剖検所見
上記実施例3で作製されたキメラマウスを用い、8週齢において剖検(雌6個体、雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雌6個体、雄6個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化が認められた。また、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓の肥大傾向が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
14-2-1.大腿骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、10個体で白色化が、2個体でやや白色化がコントロール群(12個体)に比べ観察された。
14-2-2.胸骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、10個体で白色化が、2個体でやや白色化がコントロール群(12個体)に比べ観察された。
14-2-3.頭蓋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(12個体)に比べ白色化は10個体、やや白色化は2個体、硬化は1個体、やや硬化は9個体認められた。
14-2-4.肋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中5個体においてコントロール群(12個体)に比べやや硬化が認められた。
14-2-5.脾臓剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(12個体)に比べ6個体で肥大傾向が認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化はヒトFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
14-3.8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
コントロール12個体、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が雌雄共に増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はヒトFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表11)。
Figure 2015070854
14-4.8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの骨構造解析(3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
コントロール(雌雄それぞれ6個体)、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌雄それぞれ6個体)由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下したことから、大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はヒトFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表12)。
Figure 2015070854
14-5.12週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの剖検所見
上記実施例3で作製されたキメラマウスを用い、12週齢において剖検(雄６個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雄６個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨のやや硬化が認められた。また、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓のやや肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
14-5-1.大腿骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、1個体で白色化が、4個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
14-5-2.胸骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、1個体で白色化が、1個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
14-5-3.頭蓋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ白色化は2個体、やや白色化は3個体、硬化は1個体、やや硬化は1個体認められた。
14-5-4.椎骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中1個体においてコントロール群(6個体)に比べやや硬化が認められた。
14-5-5.脾臓剖検所見
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ1個体で肥大が認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨のやや硬化はヒトFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
14-6.12週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの病理所見
12週齢のコントロールキメラマウス6個体及びUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス６個体から由来する大腿骨、胸骨のH&E染色病理切片を用いた観察から、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図14、15、表13)と海綿骨の増加(図16)及び胸骨の海綿骨の増加(図17)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
14-6-1.大腿骨
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された(図16)。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%、50%及び80%)の横断切片について骨幹壁厚を計測した結果、近位端より30%地点の最小壁厚値と50%地点の最大壁厚値でそれぞれの平均値はコントロールよりも高値を示した(図14、15、表13)。
Figure 2015070854
14-6-2.胸骨
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中5個体において海綿骨の増加が観察された(図17)。
以上の結果より、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨増加及び胸骨の海綿骨増加はヒトFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
14-7.血清生化学解析
12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雄マウス6個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
［実施例１５］
15-1.卵巣摘出(OVX)モデルマウス作製
mFZD7crd-hFcm組換え体の骨粗鬆症治療薬としての薬効評価を行う目的で、卵巣摘出(OVX)モデルマウスを作製した。mFZD7crd-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD7crd-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、機能的なＢリンパ球が欠損し抗体が産生されない免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスをMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配により得られたホモ接合体(97KDマウス、日本国日本クレア株式会社、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000)をOVXモデルマウス作製に用いた。10週齢の97KDマウスに対し麻酔下で背部を切開し両卵巣を摘出あるいは、卵巣摘出を行わず切開のみ実施する偽手術を施した後に背部を縫合した。
15-2.mFZD7crd-hFcm組換え体投与OVXモデルマウスの解析
15-2-1.OVXモデルマウスへの投与
上記実施例15-1で作製されたOVXモデルマウスに対し、術後1週間経過した後にmFZD7crd-hFcm組換え体の骨粗鬆症への薬効を評価する目的で投与を行った。被験物質としてmFZD7crd-hFcm組換え体の他に、比較対象としてビスフォスファネート製剤であるリセドロネート(日本国和光純薬株式会社、商品番号:572-27451)を用い、さらにmFZD7crd-hFcm組換え体とリセドロネートの両者を投与する併用群を設定した。投与開始日をDay0とし、剖検はDay69とDay70に実施した。この間、mFZD7crd-hFcm組換え体を1mg/doseの用量で10日に1回の頻度で計7回、尾静脈内(IV)投与した。また、リセドロネートは5μg/kgの用量で1週間に3回の頻度で計30回、皮下(SC)投与した。群設定は、偽手術/非被験物質投与(Sham/non-treatment)群、OVX/リセドロネート投与(OVX/risedronate)群、偽手術/リセドロネート投与(Sham/risedronate)群、OVX/ mFZD7crd-hFcm組換え体投与(OVX/mFZD7crd-hFcm)群、偽手術/mFZD7crd-hFcm組換え体投与(Sham/mFZD7crd-hFcm)群、OVX/mFZD7crd-hFcm組換え体/リセドロネート投与(OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate)群、OVX/非被験物質投与(OVX/non-treatment)群の各群を設定し投与を行った。
15-2-2.mFZD7crd-hFcm組換え体投与OVXモデルマウスの剖検所見
上記実施例15-2で記載されたマウスを、Day69及びDay70に剖検し、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、肋骨、椎骨、脾臓、子宮について観察を行った。その結果、Sham/non-treatment群と比べSham/risedronate群、OVX/mFZD7crd-hFcm群、Sham/mFZD7crd-hFcm群、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群で大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化、椎骨の硬化(Sham/risedronate群は除く)が特徴的な変化として認められた。Sham/mFZD7crd-hFcm群で脾臓のやや黒色化を示す個体数が増加した。OVX/risedronate群、OVX/mFZD7crd-hFcm群、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群、OVX/non-treatment群で子宮の退縮が認められた。上記の臓器において、変化が観察された個体数を以下に示す。
15-2-2-1.大腿骨剖検所見
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、1個体で白色化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で白色化、4個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、5個体で白色化、4個体でやや白色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、8個体で白色化、2個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、7個体で白色化、3個体でやや白色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化が認められた。
15-2-2-2.胸骨剖検所見
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、2個体でやや白色化、Sham/risedronate群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、8個体で白色化、1個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、8個体で白色化、1個体でやや白色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化、1個体で濃色化が認められた。
15-2-2-3.頭蓋骨剖検所見
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、3個体でやや白色化、1個体でやや硬化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で白色化、6個体でやや白色化、2個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、2個体で硬化、3個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、7個体で白色化、1個体でやや白色化、5個体で硬化、4個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、5個体で白色化、2個体でやや白色化、2個体で硬化、4個体でやや硬化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化、2個体で部分的軟化が認められた。
15-2-2-4.肋骨剖検所見
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、1個体で硬化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で硬化、1個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、2個体で硬化、2個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、3個体で硬化、2個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、2個体で硬化、2個体でやや硬化、OVX/non-treatment群10個体中、2個体で部分的軟化が認められた。
15-2-2-5.椎骨剖検所見
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で硬化、1個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、2個体で硬化、1個体でやや硬化が認められた。
15-2-2-6.脾臓剖検所見
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、1個体で肥大、1個体で黒色化、Sham/risedronate群10個体中、1個体で肥大傾向、1個体でやや黒色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で肥大傾向、2個体でやや黒色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で肥大、6個体でやや黒色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群9個体中、1個体で肥大傾向、2個体でやや黒色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや黒色化が認められた。
15-2-2-7.子宮剖検所見
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、3個体で退縮、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で退縮、2個体で退縮傾向、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群9個体中、6個体で退縮、OVX/non-treatment群10個体中、3個体で退縮、2個体で退縮傾向が認められた。
以上の結果より、OVX/mFZD7crd-hFcm群、Sham/mFZD7crd-hFcm群の大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はmFZD7crd-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示唆された。また、OVX/risedronate群、Sham/risedronate群の大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はリセドロネート投与により引き起こされた可能性が示唆された。さらに、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群の大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はmFZD7crd-hFcm組換え体及びリセドロネートによって引き起こされた可能性が示唆された。なお、椎骨の硬化はOVX/mFZD7crd-hFcm群、Sham/mFZD7crd-hFcm群、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群の3群にのみ確認されていることから、椎骨の硬化はmFZD7crd-hFcm組換え体投与により引き起こされた可能性が示唆された。OVX処置群にのみ認められた子宮の退縮は、文献(J. Bone Miner. Res., 20:1085-92, 2005)に報告されている様なOVXによる変化であることが示唆された。
15-2-3.病理所見
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、10%中性緩衝ホルマリン液(日本国和光純薬株式会社)に浸漬して固定の後、近位端より30%地点及び50%地点の位置で輪切りし、末端部分は縦切りしたサンプルのH&E標本を作製した。末端部分の海綿骨の変化を観察し、更に近位端より30%地点の最大骨幹壁厚、50%地点の最大・最小骨幹壁厚を測定した。
大腿骨末端部分の海綿骨変化を所見レベルに応じて、-;変化なし、±;極めて軽度、＋;軽度、++;中等度、+++;重度の５段階で評価すると以下の様な結果が得られた。
OVX/non-treatment群で極めて軽度(±)な減少が２個体、軽度（＋)な減少が３個体観察されたのに対し、OVX/mFZD7crd-hFcm群では極めて軽度(±)な減少が２個体観察されたのみでありOVX処置による海綿骨減少を正常な状態に回復している可能性が示された。また、Sham/non-treatment群では極めて軽度(±)な増加が1個体と極めて軽度(±)な減少が２個体観察されたのに対し、Sham/mFZD7crd-hFcm群では軽度(＋)な増加が１個体観察された。
更に近位端より30%地点の最小骨幹壁厚、50%地点の最大・最小骨幹壁厚を測定した結果、Sham/non-treatment群に比べ、Sham/mFZD7crd-hFcm群の30%地点の最小骨幹壁厚、50%地点の最大・最小骨幹壁厚の平均値は増加した。また、OVX/non-treatment群に比べ、OVX/mFZD7crd-hFcm群の30%地点の最小骨幹壁厚、50%地点の最大・最小骨幹壁厚の平均値は増加した。OVX/mFZD7crd-hFcm群の値をSham/non-treatment群と比較した場合、50%地点の最大骨幹壁厚平均値は正常マウスコントロール群(Sham/non-treatment群)と等しく、30%地点の最小骨幹壁厚、50%地点の最小骨幹壁厚ではSham/non-treatment群よりも平均値は上回ることが示された(表14)。
Figure 2015070854
以上の結果より、mFZD7crd-hFcm組換え体は正常マウスコントロール個体(Sham/non-treatment個体)に加えて、OXV処置個体に対しても海綿骨量増加活性と骨幹壁厚増加活性を持つ事が示唆された。
15-2-4．大腿骨の皮質骨断面積測定
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、近位端より50%の地点の2DマイクロCT撮影(図18)を行い、近位端より50%地点の皮質骨断面積を測定した(測定個体数は各群10個体)。
Sham/non-treatment群に比べ、Sham/mFZD7crd-hFcm群の平均値は増加した。また、OVX/non-treatment群に比べ、OVX/mFZD7crd-hFcm群の平均値は増加した。OVX/mFZD7crd-hFcm群の値をSham/non-treatment群と比較した場合、平均値は正常マウスコントロール群(Sham/non-treatment群)よりも上回ることが示された。
以上の結果より、mFZD7crd-hFcm組換え体は正常マウスコントロール個体(Sham/non-treatment個体)に加えて、OXV処置個体に対しても皮質骨断面積を増加させる活性を持つ事が示唆された(表15)。
Figure 2015070854
15-2-5.大腿骨の骨強度測定
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った(測定個体数は各群10個体である)。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
Sham/non-treatment群に比べ、Sham/mFZD7crd-hFcm群の平均値は増加した。また、OVX/non-treatment群に比べ、OVX/mFZD7crd-hFcm群の平均値は増加した。OVX/mFZD7crd-hFcm群の値をSham/non-treatment群と比較した場合、平均値は正常マウスコントロール群(Sham/non-treatment群)よりも上回ることが示された。
以上の結果より、mFZD7crd-hFcm組換え体は正常マウスコントロール個体(Sham/non-treatment個体)に加えて、OXV処置個体に対しても大腿骨の骨強度を増加させる活性を持つ事が示唆された(表15)。
［実施例１６］
16.USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの解析
16-1.血清生化学解析
上記実施例4で作製された16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス16個体、コントロール雄マウス14個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
16-2.15週齢USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスを用いた脛骨の骨形態計測
16-2-1.骨形態計測方法
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。投与は剖検6日前及び1日前実施した。剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。実施例16のコントロールデーター取得には全て16週齢個体が用いられた。
16-2-2.単位骨量
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
更に雄個体において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加は雌個体ばかりでなく雄個体においてもマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表16)。
Figure 2015070854
16-2-3.骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
更に雄個体において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロール個体群との差は観察されなかったことから雌個体と同様マウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響を受けない可能性が示された(表17)。
Figure 2015070854
16-2-4.石灰化速度・石灰化面・骨形成速度
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度、石灰化面、骨形成速度が全て増加傾向を示したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
更に雄個体において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、全てコントロール個体群に比べ増加傾向が観察されたことから雌個体と同様脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化がマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された(表18)。
Figure 2015070854
16-2-5.破骨細胞数・破骨細胞面
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、コントロール個体群とほぼ等しい値が得られたことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けない可能性が示された。
更に雄個体において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、全てコントロール個体群とほぼ等しい値が得られたことから雌個体と同様脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響を受けない可能性が示された(表19)。
Figure 2015070854
16-3.骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
雄個体において剖検を実施したコントロール5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表20)。
Figure 2015070854
16-4.15週齢USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの骨構造解析(3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
コントロール(雌雄それぞれ6個体)、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌雄それぞれ6個体)由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下したことから、大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表21)。
Figure 2015070854
[実施例１７]
17-1.8、12週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおけるヒトFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認
実施例6記載の方法に従い作製された8週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体、雄6個体)、12週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、12週齢コントロールマウス(雄6個体)それぞれの血清中に存在するヒトFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(日本国日本クレア社、CE-2)を自由摂取出来る環境で飼育した。
その結果、8週齢雌個体の平均濃度は525.5μg/ml、8週齢雄個体の平均濃度は492.8μg/ml、12週齢雄個体の平均濃度は452.8μg/mlであり、コントロール個体由来の血清を用いて測定した結果では全て検出限界以下であった。
以上の結果より、8週齢よりヒトFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体がマウス生体内で発現し血中を循環している事が示唆された。
17-2.8週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの剖検所見
上記実施例6で作製されたキメラマウスを用い、8週齢において剖検(雌6個体、雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。また、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓のやや肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
17-2-1.大腿骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、5個体で白色化が、6個体でやや白色化がコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ観察された。
17-2-2.胸骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中11個体においてコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ白色化が観察された。
17-2-3.頭蓋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ白色化は9個体、やや白色化は3個体、硬化は2個体、やや硬化は5個体認められた。
17-2-4.肋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中5個体においてコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べやや硬化が認められた。
17-2-5.脾臓剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ7個体で肥大傾向が、8個体でやや黒色化が認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化はヒトZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
17-3.8週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
コントロール12個体、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が雌雄共に増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はヒトFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表22)。
Figure 2015070854
17-4.8週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの骨構造解析(3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量（BV/TV）、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
コントロール(雌雄それぞれ6個体)、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌雄それぞれ6個体)由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下したことから、大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はヒトFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表23)。
Figure 2015070854
17-5.12週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの剖検所見
上記実施例6で作製されたキメラマウスを用い、12週齢において剖検(雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雄6個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
17-5-1.大腿骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、5個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
17-5-2.胸骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、3個体で白色化が、3個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
17-5-3.頭蓋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ白色化は1個体、やや白色化は4個体、硬化は1個体、やや硬化は2個体認められた。
17-5-4.肋骨剖検所見
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中2個体においてコントロール群(6個体)に比べやや硬化が認められた。
以上の結果より、大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化はヒトFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
17-6.12週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスの病理所見
12週齢のコントロールキメラマウス6個体及びUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体から由来する大腿骨、胸骨のH&E染色病理切片を用いた観察から、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図19、20、表24)と海綿骨の増加(図21)及び、胸骨の海綿骨の増加(図22)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
17-6-1.大腿骨
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%地点、50%地点及び80%地点)の横断切片について骨幹壁厚を計測した結果、近位端より30%地点の最小壁厚値と50%地点の最大壁厚値でそれぞれの平均値コントロールよりも高値を示した(図19、20、表24)。
Figure 2015070854
17-6-2.胸骨
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された(図22)。
以上の結果より、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨増加及び胸骨の海綿骨増加はヒトFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
17-7.血清生化学解析
12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雄マウス6個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
[実施例１８]
実施例12で記載されたmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス由来頭蓋骨の頭蓋冠厚測定及び大腿骨を用いた骨強度測定を行った。
18-1.頭蓋骨の頭蓋冠厚測定
頭蓋骨のトルイジンブルー染色標本を作製し、矢状縫合線から左右に0.6mmを除外し、頭頂側頭縫合線(鱗縁)までの蓋骨外面における頭蓋冠厚(μm)を測定した。
コントロール雌５個体、mFZD1crd-hFcm組換え体投与雌５個体由来の頭蓋骨を用いて頭蓋冠厚を測定した結果、コントロール個体群の値(平均値:213.9μm)に比べmFZD1crd-hFcm組換え体投与個体群の値(平均値:219.4μm)が増加したことから、頭蓋骨の頭蓋冠厚増加はmFZD1crd-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された。
18-2.大腿骨の骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
コントロール雌5個体、mFZD1crd-hFcm組換え体投与雌5個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群の値(平均値:26.2N)に比べmFZD1crd-hFcm組換え体投与個体群の値(平均値:31.3N)が増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はmFZD1crd-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された。
[実施例１９]
実施例9記載の方法に従い作製されたUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスを用いた解析
19-1.血球解析
8週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、8週齢のコントロール雌マウス11個体、コントロール雄マウス11個体、15週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、15週齢のコントロール雌マウス11個体、コントロール雄マウス11個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(日本国バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
19-2.血清生化学解析
16週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス9個体、コントロール雄マウス9個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
19-3.USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスにおけるマウスFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の発現確認
実施例2記載の方法に従い、16週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)血清中に存在するマウスFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の濃度をELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。
その結果、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスの16週齢雌個体の平均濃度は31.5μg/mL、16週齢雄個体の平均濃度は26.2μg/mLであり、コントロール個体(雌6個体、雄6個体)では全て検出限界以下であった。
以上の結果より、FZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体がマウス生体内で発現し血中を循環している事が示唆された。
19-4.18週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスを用いた脛骨の骨形態計測
19-4-1.骨形態計測方法
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。投与は剖検6日前及び1日前実施した。剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。実施例19において実施例19-2以降のコントロールデーター取得には全て16週齢個体が用いられた。
19-4-2.単位骨量
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
更に剖検を実施したコントロール雄5個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雄4個体由来の脛骨を用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加は雌個体ばかりでなく雄個体においてもマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表25)。
Figure 2015070854
19-4-3.骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
更に剖検を実施したコントロール雄5個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雄4個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロール個体群との差は観察されなかったことから雌個体と同様マウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響を受けない可能性が示された(表26)。
Figure 2015070854
19-4-4.石灰化速度・石灰化面・骨形成速度
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度、石灰化面、骨形成速度が全て増加を示したことから、頸骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
更に剖検を実施したコントロール雄5個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雄4個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、石灰化面でコントロール個体群に比べ増加傾向が観察された(表27)。
Figure 2015070854
19-4-5.破骨細胞数・破骨細胞面
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、両パラメーターともにコントロール個体群に比べ低下傾向を示すことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって抑制された可能性が示された。
更に剖検を実施したコントロール雄5個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雄4個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、両パラメーター共にコントロール個体群に比べ低下傾向を示すことから、雌個体と同様頸骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって抑制された可能性が示された(表28)。
Figure 2015070854
19-5.骨強度測定
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検を実施した16週齢コントロール雌6個体、18週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
更に剖検を実施した16週齢コントロール雄5個体、18週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雄4個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の値が増加したことから、雌個体と同様大腿骨の最大荷重増加はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表29)。
Figure 2015070854
19-6.18週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスの骨構造解析(3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
16週齢コントロール(雌雄それぞれ6個体)、18週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス(雌3個体、雄4個体)由来の大腿骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下したことから、大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された(表30)。
Figure 2015070854
[実施例２０]
mFZD2crd-hFcm組換え体の発現・調製
20-1.mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号54、66、67、68のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFZD2 cDNA(配列番号58)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図23)。
20-1-1.pLN1V5ベクターの構築
5’末端にBamHI・NheI・SalI サイトを3’末端にXhoIサイトを持つ（V5タグ+Stop codon）センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
V5S:GATCCGCTAGCGTCGACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGTGAC
(配列番号50)
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG
(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
20-1-2.mFZD2crd-hFcm DNA断片の合成
155Fc_BHIkozakFw：TAAAGGATCCCGGCCACCATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGC
(配列番号66)
155Fc_mFZD2G1SA_3primer：GTCTGAAGACCTAGGCTCGGCTAGCGCAGGAGCTCCGTCC
(配列番号67)
G1SA_5primer：GCCGAGCCTAGGTCTTCAGAC
(配列番号54)
hFc-NotI-Rv：ATAGTTTAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG
(配列番号68)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号66及び67のプライマー各10pmol、鋳型としマウスFZD2 cDNA(配列番号58)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、62℃5秒、及び72℃40秒を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた543bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD2crd hFcm)を回収した。
同様に、Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号54及び68のプライマー各10pmol、鋳型としhFcm cDNA(配列番号3)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、62℃5秒、及び72℃40秒を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた718bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(hFcm NotI)を回収した。
上記2回のPCRで得られたDNA増幅断片(BamHI mFZD2 hFcm)及び(hFcm NotI)を10μlずつ添加し、100℃に3分間加熱した後、室温に戻し、hFcm領域をアニーリングさせた。その後、配列番号66及び68のプライマー各10pmol加え、伸長反応を72℃5分間行い、98℃1分加熱後、98℃10秒、62℃5秒、及び72℃1分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた1240bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。
20-1-3.mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例20-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びNotI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。実施例20-1-1で作製されたpLN1V5ベクターにNotI siteを付加したvectorを用意し、上で得られた酵素処理断片をBamHI・NotIサイトに導入し、mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクター(図23)を構築した。
以下にmFZD2crd-hFcm組換え体のcDNAの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列(1206bp、配列番号69)及び該cDNAがコードするmFZD2-hFcmのシグナル配列を含んだアミノ酸配列(401アミノ酸、配列番号70)を示す。配列番号69及び70において、下線部はマウスFZD2のシグナル配列部分を示す。
配列番号69:
ATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCACTGCTGCTGCTGCCGGCCGCCGGACCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号70:
MRARSALPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
20-2.mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD2crd-hFcm組換え体の一過的発現
20-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例20-1-3で取得されたmFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
20-2-2.培養細胞へのベクター導入と分泌発現
FreeStyle CHO-S Cells(日本国インビトロジェン株式会社)をFreeStyle CHO Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が1×105から4×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに20mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、7.5mLのポリエチレンイミン(PEI)に12.5mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加えた。その後すぐにこの2液を混合し、10分間室温でインキュベートした。その後、2×109 cells/LのFreeStyle CHO-S細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
20-3.mFZD2crd-hFcm組換え体の精製・調製
20-3-1.培養上清前処理
培養後、上清を回収し0.22μmフィルター(TCフィルターユニットPES、ナルゲン社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。凍結保存した場合には融解後、再度0.22μmフィルターで濾過した。
20-3-2.Antibody Affinityクロマトグラフィー
用いた酸性bufferの組成はくえん酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.43g、くえん酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.90g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はりん酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとりん酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
前処理された1L培養上清をPBS(Dulecco’s Phosphate Buffered Saline、SIGMA社)で平衡化されたProteinAカラム(Hi Trap ProteinA HP 5mL、日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)にアプライした。その後、25mL以上のPBSでカラムを洗浄し、再度30mLのPBSでカラムを洗浄した。洗浄操作終了後、カラムに酸性bufferを 25 mLを添加し目的蛋白質を回収した。上記分離精製操作にはAKTAexplorer10s(日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
20-3-3.精製標品調製
実施例20-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。濃縮操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。実施例20-3で行われた全ての工程はクリーンベンチでの作業以外、低温室(＋4℃)ないしは氷上で実施した。蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光係数(E1%,1cm=9.7)より算出した。
[実施例２１]
mFZD7c10-hFcm組換え体の発現・調製
21-1.mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号55、71のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFZD7 cDNA(配列番号1)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図24)。
21-1-1.pLN1V5ベクターの構築
5’末端にBamHI・NheI・SalI サイトを3’末端にXhoIサイトを持つ(V5タグ+Stop codon)センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
V5S:GATCCGCTAGCGTCGACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGTGAC
(配列番号50)
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG
(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
21-1-2.mFZD7c10-hFcm DNA断片の合成
pLN1V5-BHIkozakFw:TAAAGGATCCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTG
(配列番号71)
SalIG1SARv:TAAAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG
(配列番号55)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号71及び55のプライマー各10pmol、鋳型として、実施例1に記載の方法を基に作製した、マウスIgkシグナル配列、Frizzled7マウスCRD、及び変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNAを融合した配列を用い、98℃10秒保温した後、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、得られた1367bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD7c10hFcm SalI)を回収した。
21-1-3.mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例21-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びSalI（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。得られた酵素処理断片を実施例21-1-1で作製されたpLN1V5ベクターのBamHI・SalIサイトに導入し、mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクター(図24)を構築した。
以下にmFZD7c10-hFcm組換え体のcDNAの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列(1339bp、配列番号72)及び該cDNAがコードするマウスIgkシグナル配列を含んだアミノ酸配列(365アミノ酸、配列番号73)を示す。配列番号72及び73において、下線部はマウスIgkシグナル配列部分を、囲み線の部分はマウスFrizzled7の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのシステインリッチドメイン(CRDの最小領域)を、二重下線の部分はhFcmを示す。
配列番号72：
Figure 2015070854
 配列番号73：
Figure 2015070854
21-2.mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD7c10-hFcm組換え体の一過的発現
21-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例21-1-3.で取得されたmFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
21-2-2.培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに35mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、1.3mLの293 fectin Transfection Reagent(日本国インビトロジェン株式会社)に33.7mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、5分間室温でインキュベートした。インキュベート後この2液を混合し、更に20〜30分間室温でインキュベートした。その後、1×109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
21-3.mFZD7c10-hFcm組換え体の精製・調製
21-3-1.培養上清前処理
培養後、上清を回収し0.22μmフィルター(TCフィルターユニットPES、ナルゲン社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。凍結保存した場合には融解後、再度0.22μmフィルターで濾過した。
21-3-2.Antibody Affinityクロマトグラフィー
用いた酸性bufferの組成はくえん酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.895g、クエン酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.38g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
前処理された1L培養上清をPBS(Dulecco’s Phosphate Buffered Saline、SIGMA社)で平衡化されたProteinGカラム(Hi Trap ProteinG HP 5mL、日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)にアプライした。その後、25mL以上のPBSでカラムを洗浄し、次にPBSにNaClを添加しNaCl濃度を1.85mol/Lに調製した緩衝液で25mL以上洗浄し、再度30mLのPBSでカラムを洗浄した。洗浄操作終了後、カラムに酸性bufferを25 mLを添加し目的蛋白質を回収した。目的蛋白質は回収後速やかに中和bufferを用いて中和を行った。上記分離精製操作にはAKTAexplorer10s(日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
21-3-3.精製標品調製
実施例21-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてPBSに置換後、サンプルを濃縮した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。濃縮操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。実施例21-3で行われた全ての工程はクリーンベンチでの作業以外、低温室(＋4℃)ないしは氷上で実施した。最終精製品のSDS-PAGE(CBB染色)より、還元条件下では単量体が検出された。蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光係数(E1%,1cm=10.5)より算出した。
[実施例２２]
mFZD7c10-hFcm組換え体投与マウスの解析
22-1.mFZD7c10-hFcm組換え体の投与
mFZD7c10-hFcm組換え体の薬効評価を行う目的で、マウスへの投与実験を行った。mFZD7c10-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD7c10-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、機能的なＢリンパ球が欠損し抗体が産生されない免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスをMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配により得られたホモ接合体(97KDマウス、日本国日本クレア株式会社、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000)を用いた。投与期間中、97KDマウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。6週齢時点の投与開始日前日(Day-1)の体重を元に、1群5匹ずつ計4群に群分けを実施した。mFZD7c10-hFcm組換え体投与群には、mFZD7c10-hFcm組換え体を蛋白濃度5mg/mLとなるようにPBSで調製して凍結保存しておいた投与液を用時に融解し、各個体に200μLずつ1mg/doseの用量で10日に1回の頻度で計7回(q10d7)、尾静脈内に投与した。コントロール群として、無処置コントロール群を設定した。初回投与日をDay0とし、Day60まで10日おきに計7回の尾静脈投与を実施した後、Day70に全ての群の動物を剖検に供した。
22-2.骨強度測定
剖検において、右大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mmとし、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
コントロール5個体、mFZD7c10-hFcm組換え体投与5個体由来の大腿骨を用いて最大荷重を測定した結果、コントロール個体群(平均値:26)に比べmFZD7c10-hFcm組換え体投与群の値(平均値:28)が増加したことから、大腿骨の最大荷重増加はmFZD7c10-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された。
22-3.mFZD7c10-hFcm組換え体投与マウスの骨構造解析(3次元マイクロフォーカスX線CT)
剖検において、左脛骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて脛骨近位骨幹端部 海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した(図25)。
コントロール5個体、mFZD7c10-hFcm組換え体投与5個体由来の脛骨を用いてマイクロCTにより海綿骨内部構造を観察した結果、コントロール個体群に比べmFZD7c10-hFcm組換え体投与群の平均値が単位骨量は増加、骨梁幅は増加、骨梁数は増加、骨梁間隔は低下、骨梁中心間距離は低下したことから、脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下はmFZD7c10-hFcm組換え体投与によって引き起こされた可能性が示された（表31）。
Figure 2015070854
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
本発明により、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加させることができる。従って、骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍に伴う骨疾患及びそれに関連する様々な疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、治療することが可能となる。
配列番号3及び4:ヒトIgG1 Fc変異体
配列番号5:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号6:融合蛋白質
配列番号9:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号10:融合蛋白質
配列番号13:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号14:融合蛋白質
配列番号17:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号18:融合蛋白質
配列番号27〜31:融合蛋白質
配列番号38〜43:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号50及び51:センスオリゴDNA
配列番号52〜55:プライマー
配列番号56:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号57:融合蛋白質
配列番号62及び63:プライマー
配列番号64:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号65:融合蛋白質
配列番号66〜68:プライマー
配列番号69:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号70:融合蛋白質
配列番号71:プライマー
配列番号72:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号73:融合蛋白質

Claims (5)

  1. 哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ１、２及び７からなる群から選択されるＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞外システインリッチドメインを含む断片と哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質又はその変異体との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入する工程、得られた宿主細胞を培養して該核酸を発現させて該融合蛋白質を生産する工程、並びに、生産された該融合蛋白質を回収する工程を含む、骨疾患の治療に用いるための該融合蛋白質の製造方法。
  2. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞外システインリッチドメインを含む断片が、配列番号２１、２４及び２６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄの細胞外システインリッチドメインを含む断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４４〜４９のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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