JP2014529997A

JP2014529997A - 免疫グロブリン結合ドメインを使った血清中半減期延長

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Publication number: JP2014529997A
Application number: JP2014531267A
Authority: JP
Inventors: ローラント・コンテルマン; フェリックス・ウンフェルドルベン; マイケ・フット
Original assignee: ウニヴェルズィテートシュトゥットガルト
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2014-11-17
Also published as: WO2013041730A8; CA2846436A1; US20170145062A1; EP2758436B1; AU2012311451A1; EP2758436A1; WO2013041730A1; US20140220017A1; AU2012311451B2; US10428120B2

Abstract

本発明は（i）免疫グロブリン（Ig）結合部分と（ii）医薬活性部分とを含み、Ig結合部分がIg分子の重鎖の定常ドメイン1（CH1）に特異的に結合する複合体、ならびに治療および予防へのそれらの使用に関する。

Description

本発明は（i）免疫グロブリン（Ig）結合部分と（ii）医薬活性部分とを含み、Ig結合部分がIg分子の重鎖の定常ドメイン1（C_H1）に特異的に結合する複合体、ならびに治療および予防へのそれらの使用に関する。

医薬の治療的応用の大半にとって、長期間にわたって治療有効濃度を維持することは利益になるが、それには頻繁な投与もしくは注入が必要であったり、または有効濃度を長期間にわたって維持するために、血流への緩慢な吸収を利用する薬物の、局所的適用もしくは皮下投与が必要であったりする。薬物を血管系への急速静脈内注射によって投与した場合、血液からのその除去は、ほとんどの場合、二相性に起こる（Greenblatt（1985）Ann. Rev. Med. 36:421-427参照）。これは、身体を中心コンパートメントと末梢コンパートメントとに分割する2コンパートメントモデルによって、数学的に記述することができる（DhillonおよびGill「Basic Pharmacokinetics」参照）。これらのコンパートメントに明確な生理学的または解剖学的境界があるわけではないが、中心コンパートメントは灌流量の多い組織（例えば心臓、肺、腎臓、肝臓および脳）を含むと考えられ、一方、末梢コンパートメントはそれほど灌流量が多くない組織（例えば筋、脂肪および皮膚）を含む。2コンパートメントモデルでは、中心コンパートメントへの（例えば血流への）薬物投与後に、薬物は中心コンパートメントと末梢コンパートメントとに分布すると想定されている。しかし薬物は、2つのコンパートメントの間で即座に分布、すなわち平衡を達成するわけではない。薬物濃度-時間プロファイルは曲線を示し、log(薬物濃度)-時間プロットが二相性応答を示すので、これを使って、薬物が1コンパートメントモデルを示すか2コンパートメントモデルを示すかを区別することができる（DhillonおよびGill「Basic Pharmacokinetics」参照）。投薬直後は、血液から薬物が急速に消失する相があり、これは通常、数分〜1時間または2時間続いて、血液中の薬物濃度の極めて大きな減衰につながりうる。この初期の急速な薬物消失の相（初期または分布血漿中半減期t_1/2αによって記述される）は、主として、血管系を一構成要素とする「中心」コンパートメントから末梢組織中の貯蔵部位への薬物の可逆的分布によって決まり；この初期の急速な降下のうち排出またはクリアランスによって決まる部分はほとんどない。分布が完了した後、血中濃度曲線は、排出相（終末または排出血漿中半減期t_1/2βによって記述される）と呼ばれる、それほど急速ではない薬物消失の相に入り、この相における薬物消失は、主として、不可逆的なクリアランスによって決まる。この排出相における薬物降下のパターンは排出血漿中半減期を算出するために使用され、それは一般的には、薬物分布平衡に到達した後でないと決定されない（Greenblatt（1985）Ann. Rev. Med. 36:421-427）。ある物質、例えば医薬の初期血漿中半減期と終末血漿中半減期はどちらも、血液からのその急速なクリアランスを防止することによって体内での当該物質のバイオアベイラビリティを向上させる目的で、操作することができる。

小分子医薬、特に大半の小タンパク質治療薬には、代替組換え抗体フォーマット（Kontermann（2010）Curr. Opin. Mol. ther. 12:176-183）の多くや、新興の代替足場タンパク質クラス（NuttallおよびWalsh（2008）Curr. Opin. Pharmacol. 8:609-615；GebauerおよびSkerra（2009）Curr. Opin. Chem. Biol. 13:245-255）を含めて、主として循環からのそれらの急速なクリアランスゆえに、血清中半減期が短いという問題がある（Batraら（2002）Curr. Opin. Biotechnol. 13:603-608）。小サイズ薬物のこれらの制約が、血液におけるそれら組換え抗体の循環を延伸し、よって投与および薬物動態ならびに薬力学的性質を改良するための、半減期延長戦略の開発と実行につながった。

半減期の延長は、適用回数を減らし、用量を下げる助けになりうるので、治療上の理由からだけでなく、経済的理由からも有益である。それゆえに、医薬および治療用タンパク質の血漿中半減期を延長するための戦略は、ますます関心を集めつつある（Pisalら,（2010）J. Pharmaceut. Sci. 99:2557-2575；Kontermann（2009）BioDrugs 23:93-109；Kontermann（2011）Curr. Opin. Biotechnol. 印刷中）。

循環からの薬物のクリアランスには、タンパク質分解による末梢血を介した排出、腎および肝排出、受容体介在性エンドサイトーシスによる排出など、いくつかの機序が関与する（Tangら（2004）J. Pharmaceut. Sci. 93:2184-2204）。サイズが小さい分子、すなわち閾値が40〜50kDaの範囲である低分子量を有する分子は、腎濾過および分解によって、急速に浄化される。腎クリアランスを担っているのは、有窓内皮、糸球体基底膜および有足細胞足突起の間にあるスリット隔膜によって形成される糸球体濾過障壁（GBM）である（TryggvasonおよびWartiovaara（2005）Physiology 20:96-101）。糸球体内皮細胞間の窓はかなり大きく（50〜100nm）、分子の自由拡散が可能であるが、スリット隔膜は最終的な高分子障壁となり、数多くの小さな4〜5nm径の細孔と少数の8〜10nm径の細孔とを持つイソポーラス（isoporous）なジッパー様フィルタ構造を形成している（HaraldssonおよびSoerensson（2004）New Physiol. Sci. 19:7-10；Wartiovaaraら（2004）J. Clin. Invest. 114:1475-1483）。それゆえに、約4〜5nm未満の流体力学的半径を有する分子は、血液から急速に浄化される。加えて、タンパク質の電荷も腎濾過の一因になる。内皮細胞とGBMのプロテオグリカンは、負に荷電した血漿高分子の横断をある程度防止するアニオン性障壁を形成する（TryggvasonおよびWartiovaara（2005）Physiology 20:96-101）。その結果、半減期を改良するには、タンパク質治療薬のサイズ、すなわちその流体力学的半径だけでなく、その物理化学的性質も出発点になる。さらにまた、血清アルブミンやIgG分子など、一部の血漿タンパク質は、ヒトにおいて2〜4週間という並外れて長い半減期を有し、それが、これらの分子を、他のあらゆる血漿タンパク質とは明らかに異なるものにしている（Kontermann（2009）BioDrugs 23:93-109）。これを担っているのは、新生児型Fc受容体（FcRn、ブランベル（Brambell）受容体）によるリサイクリングである（RoopenianおよびAkilesh（2007）Nat. Rev. Immunol. 7:715-725）。マクロ飲作用によって細胞、例えば内皮細胞に取り込まれたアルブミンおよびIgGは、初期エンドソームの酸性環境下ではpH依存的にFcRnに結合する。この結合はアルブミンとIgGをリソソームコンパートメントにおける分解から逸脱させ、それらを形質膜へと転送し、そこでは、その中性pHにより、再び血漿中に放出される。これは、例えばアルブミンまたはIgGのFc領域への融合などによってタンパク質の半減期を延長または調整するためのさらなる機会を与える（Kontermann（2009）BioDrugs 23, 93-109）。最後に、細胞表面受容体に結合するタンパク質薬物は受容体介在性エンドサイトーシスによって内部に取り入れられ、タンパク質薬物が受容体に結合した状態のままであるなら、リソソーム分解に付されるであろう（Tangら（2004）J. Pharmaceut. Sci. 93:2184-2204；LaoおよびKamei（2008）Biotechnol. Prog. 24:2-7）。したがって、工学的に操作されたG-CSFおよび抗IL6受容体抗体について示されているように、酸性pHにおける治療用タンパク質とその受容体との相互作用の工学的操作も、結合を解かれた分子の血流へのリサイクリングを可能にすることによって、タンパク質の半減期を延伸することができる（Sarkarら（2002）Nat. Biotechnol. 20:908-913；Igawaら（2010）Nat. Biotechnol. 28:1203-1208）。

近年、タンパク質の流体力学的体積を増加させて腎クリアランスを低下させることを目的とするPEG化および高グリコシル化などの戦略、ならびに血清IgGや血清アルブミンの並外れて長い半減期の理由となっている新生児型Fc受容体（FcRn）によって達成されるリサイクリングプロセスを利用する戦略（Kimら（2006）Clin. Immunol. 122:146-155）を含めて、いくつかの半減期延長戦略が開発されている（Kontermann（2009）BioDrugs 23:93-109；Kontermann（2011）Curr. Opin. Biotechnol. 印刷中）。例えばアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の生成による半減期延長に使用されている。例えばアルブインターフェロンα-2bや凝固因子IX-HSA融合タンパク質など、いくつかのアルブミン融合タンパク質は、既に臨床治験に入っている（Nelsonら（2010）Gastroenterology 139:1267-1276；Metznerら（2009）Thromb. Haemost. 102:634-644）。加えて、アルブミン結合活性を呈するさまざまな分子も半減期延長に使用されている。このアプローチでは、投与後の血清アルブミンへの可逆的結合につながるように、アルブミン結合部分が治療用タンパク質にカップリングまたは融合される。そのようなアルブミン結合分子には、脂肪酸、有機分子、ペプチド、単鎖Fv、ドメイン抗体、ナノボディの他、アルブミン結合能を有する天然タンパク質のドメインなどが含まれる（概要についてはKontermann（2009）BioDrugs 23:93-109を参照されたい）。例えば、連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメイン（ABD）が、組換え抗体およびアフィボディ（Affibody）分子の血漿中半減期を延伸するために使用された（Storkら（2007）Protein Eng. Des. Sel. 20:569-576；Andersenら（2010）J. Biol. Chem. 286:5234-5241）。ABDの融合は、アルブミン融合タンパク質に見られるものと類似する半減期と、二重特異性単鎖ダイアボディについて示された腫瘍蓄積の改良とをもたらした（Storkら（2007）Protein Eng. Des. Sel. 20:569-576；Storkら（2009）J. Biol. Chem. 284:25612-25619）。しかしこれらの研究では、アルブミン融合タンパク質とABD融合タンパク質では、IgG分子の長い半減期には達しないことも明らかになった。アルブミンに対するアフィニティが増加しているABDを応用することによって半減期をさらに延伸する試みは、ごくわずかな改良しかもたらさなかった（Hoppら, 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23:827-834）。血清IgGとの非共有結合的相互作用も、血清アルブミンへの結合に代わる実行可能な選択肢である。このアプローチは既に、マウスFcγ1に対するアフィニティを有する二重特異性ダイアボディで試験されており、マウスにおいてダイアボディの終末血漿中半減期を1.7時間から10時間へと延伸した（Holligerら（1997）Nat. Biotechnol. 15:632-636）。

しかし、医薬の血漿中半減期を延長する上記の戦略には、多くの欠点が付随している。PEG、ポリシアル酸およびHESを使用するには、それらを医薬に化学的にコンジュゲートする必要があり、それが結果的に最終製品の生産と分析を複雑にする。PEGは生物分解性ではなく、患者の体内に蓄積しうるが、それは、さらなる合併症につながりうる。さらにまた、これらの修飾は医薬の血清中半減期を限られた範囲で延伸することができるに過ぎないことも示されている。同様に、血清アルブミンへの医薬のコンジュゲーション、融合または結合による血清中半減期延長、またはFc融合タンパク質による血清中半減期延長は、依然として、IgGの血清中半減期をかなり下回っている。したがって、これらの欠点を克服して、医薬（とりわけ治療用タンパク質）の血清中半減期の延長を可能にする新しい戦略の開発が、明らかに必要とされている。

本発明者らは、驚いたことに、免疫グロブリン結合ドメイン（IgBD）への医薬の融合が、この課題を解決することを見いだした。IgBDは、例えばブドウ球菌プロテインA（SpA）、連鎖球菌プロテインG（SpG）およびペプトストレプトコッカスのプロテインL（PpL）など、さまざまな細菌タンパク質のものが知られている（TashiroおよびMontelione（1995）Curr. Biol. 5:471-481；SidorinおよびSolov'eva（2011）Biochemistry (Mosc.) 76:363-378）。これらのIgBDは50〜60アミノ酸残基の長さを有し、3-α-ヘリックスバンドルまたは4本鎖βシートと1本のα-ヘリックスとから構成されるコンパクトな構造のいずれかを形成する（TashiroおよびMontelione（1995）Curr. Biol. 5:471-481）。したがって、IgBDは特に安定であり、そのことは、それらを含む融合タンパク質の生産と貯蔵性にとって有益である。

IgBDは血清免疫グロブリンに対して高いアフィニティを示し、それらの大半は、免疫グロブリンのFcドメイン上の、新生児型Fc受容体と同じ場所に結合する。例えば、IgGでは、主要結合部位は1本の重鎖のC_H2-C_H3界面にある（Deisenhofer（1981）Biochemistry 20:2361-2370）。したがってそれらはFcRn結合と競合しており、FcRnによる免疫グロブリン分子のリサイクリングに負の影響を及ぼしうる。これらの理由から、医薬の血清中半減期の延長に関して、今までにIgBDが考慮されたことはなかった。しかし、いくつかの細菌IgBDは、Fabフラグメントの異なる領域に結合する能力を有している（TashiroおよびMontelione（1995）Curr. Biol. 5:471-481）。本発明者らは、IgBDへの医薬の融合が、当該医薬の血清中半減期を有意に延伸し、それがおそらく、これらのIgBDがFc受容体結合と競合しないという事実によるものであることを示すことができた。

したがって、そのようなIgBDへの医薬の融合またはコンジュゲーションには、医薬の血清中半減期を延長する有利な可能性がある。というのも、免疫グロブリン分子への前記融合タンパク質の結合は、第1に、腎濾過および分解によるクリアランスが制限または防止され、第2に、FcRnによる融合タンパク質のリサイクリングが可能になるという、二重の効果を有するからである。

本発明の複合体は、なかんずく、次に挙げる有利な性質を与える。インビボでの各医薬活性部分の可溶性の増加、当該融合タンパク質の貯蔵寿命の延長をもたらす各医薬活性部分のインビトロ安定性の増加。医薬活性部分がタンパク質またはペプチドである場合、本発明のIgBDへの当該部分の融合のさらなる利点は、例えば哺乳動物発現系における、そのような融合タンパク質の発現の増加である。加えて、免疫グロブリン結合部分への医薬部分の複合体化は、特に医薬部分がタンパク質またはペプチドである場合には、当該医薬のより容易でかつ/または迅速な精製を可能にする。

第1の態様において、本発明は、（i）免疫グロブリン（Ig）結合部分と（ii）医薬活性部分とを含み、Ig結合部分がIg分子の重鎖の定常ドメイン1（C_H1）に特異的に結合する複合体に関する。

第2の態様において、本発明は、第1態様の複合体をコードする配列を含む核酸分子を提供する。

第3の態様において、本発明は、第2態様の核酸を含むベクターを提供する。

第4の態様において、本発明は、第1態様の複合体および/または第2態様の核酸分子および/または第3態様のベクターを含有する単離された細胞を提供する。

第5の態様において、本発明は、第1態様の複合体、第2態様の核酸、第3態様のベクターおよび/または第4態様の細胞と、医薬上許容される担体および/または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。

第6の態様において、本発明は、血清中半減期の延長に使用するための、第1態様の複合体、第2態様の核酸、第3態様のベクター、第4態様の細胞、第5態様の医薬組成物を提供する。

第7の態様において、本発明は、医薬品としての、第1態様の複合体、第2態様の核酸、第3態様のベクター、第4態様の細胞、第5態様の医薬組成物を提供する。

ヒトIgG1に結合したIgBDの概要．IgGとの複合体を形成したプロテインA（SpA_B、SpA_D）、プロテインG（SpG_C2、SpG_C3）およびプロテインL（PpL_C4*）のIgBDを、ヒトIgG1モデル上で視覚化した（Clark（1997）Chem. Immunol. 65:88-110）。加えて、Fc領域に結合したヒトFcRnの細胞外領域を含めた（Burmeisterら（1994）Nature 372:379-383）。各IgBDおよびFcRnについてPDBエントリーを示す。構造はPyMOL Molecular Graphics System（バージョン1.3、Schroedinger, LLC）で視覚化した。b）CH1への結合部位を1つとFc部分への結合部位を1つ有するSpG_C3の、IgGへの結合の模式図。c）CH1への結合部位を1つと、変異不活性Fc結合部位とを有するSpG_C3-Fabの、IgGのCH1ドメインだけへの結合の模式図。 scDb-IgBDおよびscFv-IgBDの構築．a）scDb-IgBD融合タンパク質とscFv-IgBD融合タンパク質の組成。IgBDが二重特異性scDbまたはscFvのC末端に融合されている。b）還元条件下での精製scDb-CEACD3（1）、scDb-SpA_B（2）、scDb-SpA_D（3）、scDb-SpA_EZ4（4）、scDb-SpG_C3（5）、およびscDb-PpL_C4*（6）のSDS-PAGE分析。c）還元条件下での精製抗CEA scFv（1）、scFv-SpA_B（2）、scFv-SpA_D（3）、scFv-SpA_EZ4（4）、scFv-SpG_C3（5）、およびscFv-PpL_C4*（6）のSDS-PAGE分析。1レーンにつき2マイクログラムのタンパク質を分析し、ゲルをクマシーブリリアントブルーG-250で染色した（M、分子量標準）。d〜g）精製scDb、scFv、ならびにscDb-SpG_C3およびscFv-SpG_C3融合タンパク質を、SECによって分析した。 ELISAにおけるCEAへのscDb-IgBD融合タンパク質およびscFv-IgBD融合タンパク質の結合． scDb-IgBD融合タンパク質（a）またはscFv-IgBD融合タンパク質（b）の濃度を増加させて、固定化CEAへの結合について分析した。 ELISAによって分析したIgG、FabおよびFcへのscDb-IgBDの結合．scDb、scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、scDb-SpA_E4、scDb-SpG_C3、およびscDb-PpL_C4*を、固定化マウス（a）およびヒト（b）血清IgG、ならびにそのFabおよびFcフラグメントへの結合について分析した。さらにまた、ヒトIgMおよびヒトIgAを、これらの融合タンパク質の結合について分析した。水晶微量天秤測定によって分析したIgG、FabおよびFcへのscDb-IgBDの結合．ヒトおよびマウスIgGならびにそのFabおよびFcフラグメントをQCMチップ上に固定化し、scDb-IgBD融合タンパク質の結合を、1.5μM（Fabフラグメント）、500nM（IgG）、40nM（ヒトIgG）またはx nM（IgG-Fcフラグメント）、および1.28nM（マウスIgG-Fcフラグメント）で決定した。アフィニティ．Attana A100と、免疫グロブリンが化学的にコンジュゲートされているセンサーチップとを使って、中性pH（7.4）および酸性pH（6.0）において水晶微量天秤測定によって決定された、ヒトおよびマウスIgGならびにそのFabおよびFcフラグメントに対するscDb-IgBD融合タンパク質のアフィニティ。無修飾タンパク質（scDb、scFv）およびIgGと比較したscDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質の血漿中半減期．ScDb-IgBD融合タンパク質（a）およびscFv-IgBD融合タンパク質（b）をCD1マウスにi.v.注射し（25μg/匹）、抗体分子の血清中濃度を、ELISAにより、異なる時点で決定した。最初の時点（3分）における最大濃度を考慮してデータを標準化した。マウスにおけるscDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質の生化学的性質および薬物動態的性質．ScDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質をCD1マウスにi.v.注射し（25μg/匹）、抗体分子の血清中濃度を、ELISAにより、異なる時点で決定した。最初の時点（3分）における最大濃度を考慮してデータを標準化した。t_1/2αは初期血漿中半減期を示し；t_1/2βは終末血漿中半減期を示し；AUCは試験したscDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質のバイオアベイラビリティを示す。分子量はアミノ酸配列から算出した。ストークス半径（Sr）はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。 scDb-IgBD融合タンパク質の免疫刺激活性．二重特異性抗CEA×抗CD3 scDb-IgBD融合タンパク質を、ヒトIgG（100μg/ml）の非存在下または存在下で、ターゲット細胞依存的なヒトPBMCからのIL-2放出の惹起について、インビトロで分析した。CEA陽性ターゲット細胞（LS1S74T）をマイクロタイタープレートで成長させてから、PBMCと融合タンパク質とを加え、24時間インキュベートした。次に、活性化T細胞から放出されたIL-2をELISAによって決定した。無修飾scDbを対照として含めた。 SpG _C3 ミュータント．a）scDb（1）、scDb-SpG_C3（2）、scDb-SpG_C3-Fab（3）、scDb-SpG_C3-Fc（4）のSDS-PAGE分析。ゲルはクマシーブリリアントブルーG-250で染色した。b）ELISAによって分析したヒトIgG、FabおよびFcへのscDb-SpG_C3、scDb-SpG_C3-Fab、scDb-SpG_C3-Fcの結合。scDb-SpG_C3、scDb-SpG_C3-Fab、scDb-SpG_C3-Fcを、固定化ヒト血清IgGならびにそのFabおよびFcフラグメントへの結合について分析した。c）ELISAによって分析したCEAへのscDb、scDb-SpG_C3、scDb-SpG_C3-Fab、scDb-SpG_C3-Fcの結合。d）scDb-SpG_C3-Fabの血漿中半減期：scDb-SpG_C3-FabをCD1マウスにi.v.注射し（25μg/匹）、抗体分子の血清中濃度を、ELISAにより、異なる時点で決定した。最初の時点（3分）における最大濃度を考慮してデータを標準化した。 SpG-C3-ダイアボディ-scTRAIL融合タンパク質の生産およびIgG結合．a）N末端SpG_C3ドメイン、抗EGFRダイアボディおよびTRAILの単鎖誘導体（scTRAIL）から構成される融合タンパク質の組成。b）抗TRAIL抗体または抗FLAGタグ抗体を用いたウェスタンブロットによる精製融合タンパク質の検出。約100kDaという予想サイズに対応するバンドが検出される。c）ELISAにおける固定化ヒト血清IgGへの融合タンパク質（10μg/ml）の結合。結合した融合タンパク質を抗FLAGタグ抗体およびHRPコンジュゲート抗マウス抗体で検出した。対照では融合タンパク質を省いた。 KabatによるEUインデックスでのヒト、マウス、およびラットIgGのCH1ドメイ上のSpG-C3結合エピトープのアミノ酸配列． scFv-SpG-C3融合タンパク質（抗CEA）の核酸およびアミノ酸配列．SpG_C3配列は灰色のボックスで示され、リーダー配列には下線が引かれている。 scDb-SpG-C3融合タンパク質（抗CEA×抗CD3）の核酸およびアミノ酸配列．SpG_C3配列は灰色のボックスで示され、リーダー配列には下線が引かれている。 SpG-C3-Db-scTRAIL（抗ヒトEGFR）融合タンパク質の核酸およびアミノ酸配列．SpG_C3配列は灰色のボックスで示され、リーダー配列には下線が引かれている。 scDb-SpG _C3 およびscDb-ABD _H の薬物動態的性質．a）ScDb、scDb-SpG_C3およびscDb-ABD_H融合タンパク質をCD1マウスにi.v.注射し（25μg/匹）、さまざまな時点における血清中濃度をELISAによって決定した。標準化のために3分値を100％に設定した。b）最初の1時間に示された血漿中濃度。c）最初の24時間にわたって決定されたAUC。d）最初の3時点（1時間まで）について決定された初期血漿中半減期。scDb、scDb-SpG_C3およびscDb-ABD_Hの血漿中半減期およびAUC_0-24hを、血清中濃度からExcelによって算出し、GraphPad Prismにより、T検定を使った統計を行った。 scDb-SpG _C3-Fab およびscDb-ABD _H 融合タンパク質を使ったIL-2放出の比較．LS174T細胞をさまざまな濃度のscDb（aおよびc）、scDb-ABD_H（b）またはscDb-SpG_C3-Fab（d）と共にインキュベートしてから、ヒトPBMCを加えた。scDb融合タンパク質を、正常血漿中濃度のおよそ1/50に相当する1mg/ml HSA（a、b）または100μg/mlヒトIgG（c、d）の非存在下（白い記号）または存在下（黒い記号）で、プレインキュベートした。24時間後に、上清へのIL-2放出をELISAによって決定した。

以下に本発明を詳述する前に、本発明は、本明細書に記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬類に限定されないことを理解すべきである。なぜなら、それらは変更しうるからである。また、本明細書において使用する術語には、特定の実施形態を説明する目的しかなく、本願のクレームによってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定しようとするものではないことも理解すべきである。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。

好ましくは、本明細書において使用する用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」Leuenberger, H.G.W.、Nagel, B.およびKoelbl, H.編、Helvetica Chimica Acta、スイスCH-4010バーゼル（1995）に記載されているとおりに定義される。

この明細書の本文ではいくつかの文書に言及する。本明細書において言及する文書のそれぞれは（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、説明書、GenBankアクセッション番号配列提出物などを含めて）、上述のものであれ後述のものであれ、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。先行発明を理由として本発明がそれらの開示に先行する資格がないことの自認であると解釈すべきものは、本明細書にはない。

定義
本明細書とそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の必要がある場合を除き、用語「を含む」（comprise）とその異形（例えば「comprises」および「comprising」）は、明示された整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群の包含を含意するが、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除を含意するわけではない。

本明細書において使用する用語「複合体」は、互いに極めて近接していて、共通のまたは相互に関係する機能を果たす個々の構成要素、パーツまたは部分をいくつか内包する全体を指す。そのような複合体の個々のパーツは、その複合体の共通の機能を達成するために、異なる機能を果たしうる。すなわち、共通の機能（例えば部位特異的活性という機能）を果たすために、複合体の1つのパーツは1つの機能（例えば複合体の結合）を媒介し、一方、複合体の他のパーツは異なる機能（例えば複合体の活性）を媒介しうる。複合体の個々の部分は、同じ性質または異なる性質を有しうる。すなわちそれらは、例えば限定するわけではないが、ヌクレオチド、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、および脂質などといった、同じ化学的実体、類似する化学的実体または異なる化学的実体から構成されうる。例えば、複合体は、いくつかの会合したタンパク質、または1つ以上のタンパク質と1つ以上の核酸との混合物、または1つ以上のタンパク質と1つ以上の脂質および/または糖質との混合物を含みうる。同一の化学的実体、類似する化学的実体または異なる化学的実体の他の任意の組み合わせも包含されると理解される。複合体の個々の部分は、相互につながれていても、相互につながれていなくてもよい。典型的には、複合体の個々のパーツは、共有結合または非共有結合によってつながれている。

用語「ポリヌクレオチド」と「核酸」は本明細書では可換的に使用され、ヌクレオチドモノマーから作られるポリマー状またはオリゴマー状の高分子であると理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（例えば限定するわけではないがリボースまたは2'-デオキシリボース）および1〜3個のリン酸基から構成される。典型的にはポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明との関連において、核酸分子と呼ばれるものには、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、およびそれらの混合物、例えばRNA-DNAハイブリッドなどが含まれるが、これらに限るわけではない。核酸は、例えば、ホスホトリエステル法などに従って化学的に合成することができる（例えばUhlmannおよびPeyman（1990）Chemical Reviews 90:543-584を参照されたい）。「アプタマー」は高いアフィニティでポリペプチドに結合する核酸である。アプタマーは、SELEmir146-a (例えばJayasena（1999）Clin. Chem. 45:1628-50；KlugおよびFamulok（1994）M. Mol. Biol. Rep. 20:97-107；US5,582,981を参照されたい）などの選択方法によって、さまざまな一本鎖RNA分子の大きなプールから単離することができる。アプタマーは、その鏡像型、例えばL-リボヌクレオチドとして、合成し、選択することもできる（Nolteら（1996）Nat. Biotechnol. 14:1116-1119；Klussmannら（1996）Nat. Biotechnol. 14:1112-1115）。こうして単離された形態は、天然リボヌクレアーゼによって分解されず、それゆえに、より高い安定性を有するという利点を享受する。

用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は本明細書では可換的に使用され、長さまたは翻訳後修飾とは無関係に、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の任意の鎖を指す。本発明において使用することができるタンパク質（タンパク質誘導体、タンパク質変異体、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメント、タンパク質エピトープ、およびタンパク質ドメインを含む）は、さらに化学修飾によって修飾することができる。これは、そのような化学修飾ポリペプチドが、20の天然アミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。そのような他の化学基の例には、グリコシル化アミノ酸およびホスホリル化アミノ酸が含まれるが、これらに限るわけではない。ポリペプチドの化学修飾は親ポリペプチドと比較して有利な性質、例えば強化された安定性、増加した生物学的半減期、または増加した水溶性の1つ以上を与えうる。

本明細書において使用する用語「変異体」は、それが由来するポリヌクレオチドまたはタンパク質と比較して、その長さまたは配列の1つ以上の変化を相違点とするポリヌクレオチドまたはタンパク質と理解すべきである。あるタンパク質変異体または核酸変異体が由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドとも呼ばれている。用語「変異体」は、親分子の「フラグメント」または「誘導体」を含む。典型的には「フラグメント」は、親分子と比較して長さまたはサイズが小さく、一方、「誘導体」は、親分子と比較してその配列に1つ以上の相違を呈する。また、修飾分子、例えば限定するわけではないが、翻訳後修飾されたタンパク質（例えばグリコシル化、ビオチン化、ホスホリル化、ユビキチン化、パルミトイル化、またはタンパク質分解によって切断されたタンパク質）およびメチル化DNAなどの修飾核酸も包含される。異なる分子の混合物、例えば限定するわけではないがRNA-DNAハイブリッドなども、用語「変異体」に包含される。典型的には、「変異体」は人工的に、好ましくは遺伝子工学的手段によって構築され、一方、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは野生型のタンパク質またはポリヌクレオチドである。しかし天然変異体も、本明細書において使用する用語「変異体」に包含されると理解すべきである。さらに、本発明において使用することができる変異体は、変異体が、親分子の少なくとも1つの生物学的活性を呈する、すなわち機能的に活性であるという条件の下で、親分子のホモログ、オルソログ、またはパラログに由来するか、人工的に構築された変異体に由来することもできる。

ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化は、1カ所または数カ所の部位で起こりうる、ヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、挿入、欠失、5'切断もしくは3'切断、N末端切断もしくはC末端切断、またはこれらの変化の任意の組み合わせであることができる。好ましい実施形態では、本発明において使用することができる変異体が、ヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中に、合計200まで（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200まで）の変化（すなわち、交換、挿入、欠失、および/または切断）を呈する。アミノ酸の交換は保存的および/または非保存的であることができる。これに代えて、またはこれに加えて、本明細書にいう「変異体」は、それが由来する親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドに対する一定程度の配列同一性によって特徴づけることもできる。より正確にいうと、本発明との関連において、タンパク質変異体は、その親ポリペプチドに対して少なくとも70％の配列同一性を呈する。本発明との関連において、ポリヌクレオチド変異体は、その親ポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の配列同一性を呈する。好ましくは、タンパク質変異体の配列同一性は、20、30、40、45、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上のアミノ酸の連続するストレッチにわたる。好ましくは、ポリヌクレオチド変異体の配列同一性は、60、90、120、135、150、180、210、240、270、300個またはそれ以上のヌクレオチドの連続するストレッチにわたる。

本明細書の全体を通して、ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列比較に関して、「少なくとも70％の配列同一性」という用語を使用する。この表現は、好ましくは、各参照ポリペプチドまたは各参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を指す。

2つの配列が比較され、どちらの配列に対して配列同一性百分率を算出するのかが明示されていない場合は、別段の具体的表示がある場合を除き、比較する2つの配列のうち長い方の配列に対する配列同一性が算出されるものとする。参照配列が示されている場合、配列同一性は、別段の具体的表示がある場合を除き、配列番号によって示される参照配列の全長に基づいて決定される。例えば、IgG分子のアミノ酸配列と比較される358アミノ酸からなるペプチド配列は、80.09％（358/447）の最大配列同一性百分率を呈し、一方、長さが224アミノ酸である配列は、50.11％（224/447）の最大配列同一性百分率を呈しうる。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性の百分率は、配列アラインメントによって決定することができる。そのようなアラインメントは、当技術分野において知られているいくつかのアルゴリズムを使って、好ましくはKarlinとAltschulの数学的アルゴリズム（KarlinおよびAltschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）、hmmalign（HMMERパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/）、または例えばhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlもしくはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlで利用することができるCLUSTALアルゴリズム（Thompsonら（1994）Nucleic Acid Res. 22:4673-4680）を使って行うことができる。使用されるパラメータで好ましいのは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/または http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlで設定されているとおり、デフォルトパラメータである。配列同一性（配列合致）の程度は、例えばBLAST、BLATまたはBlastZ（またはBlastX）を使って算出することができる。類似するアルゴリズムが、Altschulら（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラムに組み込まれている。BLASTポリヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、スコア（score）＝100、ワード長（word length）＝12で行われる。BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラム、スコア＝50、ワード長＝3で行われる。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るには、Altschulら（1997）Nucleic Acid Res. 25:3389-3402に記載されているように、Gapped BLASTが利用される。BLASTプログラムやGapped BLASTプログラムを利用する場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列合致解析は、Shuffle-LAGAN（Brudno M. (2003b）Bioinfomatics 19 Suppl 1:I54-I62）またはマルコフランダム場のような確立されたホモロジーマッピング技法で補うこともできる。本願において配列同一性の百分率に言及する場合、それらの百分率は、別段の具体的表示がある場合を除き、長い方の配列の全長に対して算出される。「ハイブリダイゼーション」も、2つの核酸配列間の配列同一性または相同性の尺度として使用することができる。F、N、またはM2-1をコードする核酸配列またはそれらのいずれかの一部分は、標準的ハイブリダイゼーション技法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション条件は当業者には知られており、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク、6.3.1-6.3.6、1991）に見いだすことができる。「中等度のハイブリダイゼーション条件」は、2×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）における30℃でのハイブリダイゼーションおよびそれに続く1×SSC、0.1％SDSにおける50℃での洗浄と等価な条件と定義される。「高ストリンジェント条件」は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）における45℃でのハイブリダイゼーションおよびそれに続く0.2×SSC、0.1％SDSにおける65℃での洗浄と等価な条件と定義される。

本明細書において使用する用語「免疫グロブリン（Ig）」は、免疫を付与する免疫グロブリンスーパーファミリーの糖タンパク質を指す。「表面免疫グロブリン」は、その膜貫通領域によってエフェクター細胞の膜に付着しており、これには、B細胞受容体、T細胞受容体、クラスIおよびII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質、β2-マイクログロブリン（β2M）、CD3、CD4およびCD8などの分子が包含される。典型的には、本明細書において使用する用語「抗体」は、膜貫通領域を欠き、したがって血流中および体腔中に放出されうる、分泌型免疫グロブリンを指す。ヒト抗体は、それらが保持する重鎖に基づいて、異なるアイソタイプにグループ分けされる。ヒトIg重鎖には、ギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμで表される5つのタイプがある。存在する重鎖のタイプが抗体のクラスを規定する。すなわちこれらのクラスは、それぞれIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM抗体中に見いだされ、これらのそれぞれが、異なる役割を果たし、異なるタイプの抗原に対する適正な免疫応答を指図する。相異なる重鎖はサイズおよび組成が異なる。αおよびγは約450個のアミノ酸を含み、一方、μおよびεは約550個のアミノ酸を有する（Janewayら（2001）「Immunobiology」 Garland Science）。IgAは、腸、気道および尿生殖路などの粘膜領域ならびに唾液、涙および乳汁中に見いだされ、病原体の定着を防止する（UnderdownおよびSchiff（1986）Annu. Rev. Immunol. 4:389-417）。IgDは、主に、抗原に曝露されたことのないB細胞上の抗原受容体として機能し、抗微生物因子を生産するための好塩基球および肥満細胞の活性化に関与する（Geisbergerら（2006）Immunology 118:429-437；Chenら（2009）Nat. Immunol. 10:889-898）。IgEは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンの放出を惹起するアレルゲンへのその結合によって、アレルギー反応に関与する。IgEは寄生生物への防御にも関与する（Pierら（2004）「Immunology, Infection, and Immunity」ASM Press）。IgGは、侵入する病原体に対する抗体に基づく免疫の大部分を提供し、胎盤を横切って胎児に受動免疫を与える能力を有する唯一の抗体アイソタイプである（Pierら（2004）「Immunology, Infection, and Immunity」ASM Press）。ヒトには4つの異なるIgGサブクラス（IgG1、2、3、および4）が存在する。これらは血清における存在量の順に名付けられており、IgG1が最も豊富で（約66％）、続いてIgG2（約23％）、IgG3（約7％）およびIgG（約4％）である。異なるIgGクラスの生物学的プロファイルは、それぞれのヒンジ領域の構造によって決まる。IgMはB細胞の表面に単量体型で発現すると共に、極めて高いアビディティを有する分泌五量体型で発現する。IgMは、十分なIgGが生産される前のB細胞媒介（体液性）免疫の初期段階において、病原体の排除に関与する（Geisbergerら（2006）Immunology 118:429-437）。

抗体は、単量体として見いだされるだけでなく、2つのIg単位の二量体（例えばIgA）、4つのIg単位の四量体（例えば硬骨魚のIgM）、5つのIg単位の五量体（例えば哺乳動物IgM）を形成することも知られている。抗体は典型的には、ジスルフィド結合を介してつながれた2本の同一重鎖と2本の同一軽鎖を含む4つのポリペプチド鎖でできていて、「Y」字状の高分子に似ている。各鎖はいくつかの免疫グロブリンドメインを含み、そのうちのいくつかは定常ドメイン、その他は可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、2つのβシートに配置された7〜9つの逆平行βストランドの2層サンドイッチからなる。典型的には、抗体の重鎖は4つのIgドメインを含み、そのうちの3つが定常ドメイン（C_Hドメイン：C_H1、C_H2、C_H3）、1つが可変ドメイン（V_H）である。軽鎖は、典型的には、1つの定常Igドメイン（C_L）と1つの可変Igドメイン（V_L）とを含む。例えば、ヒトIgG重鎖が、N末端からC末端に向かってV_H-C_H1-C_H2-C_H3（V_H-Cγ1-Cγ2-Cγ3ともいう）という順序で連結された4つのIgドメインから構成されるのに対し、ヒトIgG軽鎖は、N末端からC末端に向かってV_L-C_Lという順序で連結された2つの免疫グロブリンドメインから構成され、これは、κタイプまたはλタイプのいずれか（Vκ-CκまたはVλ-Cλ）である。

例えばヒトIgGの定常鎖は447個のアミノ酸を含む。本明細書および本願特許請求の範囲の全体を通して、免疫グロブリン中のアミノ酸位置のナンバリングは、Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S.およびFoeller, C.,（1991）「Sequences of proteins of immunological interest」第5版、米国国立衛生研究所、保健福祉省、メリーランド州ベセスダ）による「EUインデックス」のナンバリングである。「KabatによるEUインデックス」とは、ヒトIgG1EU抗体の残基ナンバリングを指す。したがって、IgGとの関連においてC_Hドメインは次のとおりである：「C_H1」は、KabatによるEUインデックスでアミノ酸位置118〜220を指し；「C_H2」は、KabatによるEUインデックスでアミノ酸位置237〜340を指し；「C_H3」は、KabatによるEUインデックスでアミノ酸位置341〜447を指す。

抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fabフラグメント」と呼ばれる（「Fab部分」または「Fab領域」ともいう）2つの同一な抗原結合性フラグメントと、残りの「Fc」フラグメント（この名称は容易に結晶化するその能力を反映している）（「Fc部分」または「Fc領域」ともいう）とを生成する。ヒトIgG Fc領域の結晶構造は決定されている（Deisenhofer（1981）Biochemistry 20:2361-2370）。IgG、IgAおよびIgDアイソタイプでは、Fc領域が、抗体の2本の重鎖のC_H2ドメインとC_H3ドメインに由来する2つの同一タンパク質フラグメントから構成され；IgMおよびIgEアイソタイプでは、Fc領域が、各ポリペプチド鎖中に3つの重鎖定常ドメイン（C_H2〜4）を含有する。加えて、それより小さい免疫グロブリン分子も自然界に存在し、あるいは人工的に構築されている。用語「Fab'フラグメント」は、Ig分子のヒンジ領域をさらに含むFabフラグメントを指し、一方、「F(ab')₂フラグメント」は、化学的に連結されるかジスルフィド結合によってつながれた、2つのFab'フラグメントを含むと理解される。「単一ドメイン抗体（sdAb）」（Desmyterら（1996）Nat. Structure Biol. 3:803-811）および「ナノボディ」は、V_Hドメインを一つ含むだけであり、一方、「単鎖Fv（scFv）」フラグメントは、短いリンカーペプチドを介して軽鎖可変ドメインに接合された重鎖可変ドメインを含む（Hustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883）。二価単鎖可変フラグメント（ジ-scFv）は2つのscFvを連結することによって工学的に作り出すことができる（scFvA-scFvB）。これは、2つのV_H領域と2つのV_L領域とを有する単一のペプチド鎖を生産して「タンデムscFv」（V_HA-V_LA-V_HB-V_LB）を得ることによって行うことができる。もう一つの可能性は、短すぎて2つの可変領域が折り重なることはできず、scFvに二量体化を強制するようなリンカーを使った、scFvの創製である。通常、5残基の長さを持つリンカーを使って、これらの二量体を生成させる。このタイプは「ダイアボディ」と呼ばれている。V_HドメインとV_Lドメインの間のさらに短いリンカー（1個または2個のアミノ酸）は、単一特異性三量体、いわゆる「トリアボディ」または「トリボディ」の形成につながる。二重特異性ダイアボディは、それぞれV_HA-V_LBおよびV_HB-V_LAまたはV_LA-V_HBおよびV_LB-V_HAという配置の鎖を発現させることによって形成される。単鎖ダイアボディ（scDb）は、12〜20アミノ酸、好ましくは14アミノ酸のリンカーペプチド（P）によって連結されたV_HA-V_LBフラグメントとV_HB-V_LAフラグメントとを含む（V_HA-V_LB-P-V_HB-V_LA）。「二重特異性T細胞エンゲイジャー（bi-specific T-cell engager）（BiTE)」は、異なる抗体の2つのscFvからなる融合タンパク質であって、一方のscFvはCD3受容体を介してT細胞に結合し、他方は腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合するものである（Kuferら（2004）Trends Biotechnol. 22:238-244）。二重アフィニティ・リターゲティング（dual affinity retargeting）分子（「DART」分子）は、C末端ジスルフィド橋によってさらに安定化されたダイアボディである。

本明細書において使用する用語「免疫グロブリン（Ig）結合部分」は、複合体のうち、免疫グロブリンと相互作用する部分またはパーツを指す。典型的にはIg結合部分は、Igの（好ましくは抗体の）重鎖および/または軽鎖に結合するポリペプチドまたはタンパク質を含む。Ig結合部分は、「Ig結合ドメイン（IgBD）」の他、例えば限定するわけではないがIg結合部分を安定化することまたはIgBDのIg結合能を増進することなどといった追加機能を実現するさらなるドメインを含みうる。

本明細書において使用する用語「Ig結合ドメイン（IgBD）」は、Ig分子へのIg結合部分の実際の結合を媒介するドメインを指す。IgBDは、Ig分子の任意のドメインに、すなわちIg分子の可変ドメインV_HもしくはV_Lおよび/または定常ドメインC_H1、C_H2、C_H3および/もしくはC_Lに結合しうる。典型的には、IgBDは、中性pH（すなわちpH7）においてIg分子に結合するアフィニティを有するが、それより低いpH値または高いpH値、例えばpH値5、6、または8での結合も起こりうる。Ig分子に結合するIgBDのアフィニティは、10^-6M未満、しばしば10^-7M未満、さらには10^-8M未満でありうる。典型的には、IgBDは、グラム陽性菌のIg結合タンパク質に由来する。これには、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインA、連鎖球菌プロテインG、およびペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）（現在はフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna））のプロテインLが含まれるが、これらに限るわけではない。

「プロテインA（SpA）」は、元々は黄色ブドウ球菌の細胞壁に見いだされた40〜60kDaの表面タンパク質である。これは、そのIgBD（A、B、C、D、E）の2つのαヘリックスとIg分子のFcフラグメント中のC_H2およびC_H3ドメインとの相互作用により、数多くの哺乳動物種に由来する免疫グロブリン、とりわけIgGに結合する。プロテインAは、ヒトIgG1およびIgG2ならびにマウスIgG2aおよびIgG2bには、高いアフィニティで結合するが、ヒトIgM、IgAおよびIgEならびにマウスIgG3およびIgG1には、あまり高くないアフィニティでしか結合しない。

「プロテインG（SpG）」は、プロテインAに似ているが、異なる特異性を呈する、C群およびG群連鎖球菌株において発現する免疫グロブリン結合タンパク質である。これは、IgG分子（特にIgG1、IgG2またはIgG4）のFc領域ならびに血清アルブミンに結合する約65kDaの細胞表面タンパク質である。連鎖球菌株G148、GX7805、およびGX7809の個々のIgBDのアミノ酸配列は同一である（Gussら（1986）EMBO J. 5:1567-1575）。プロテインGは、反復的に配置されたドメインからなり、C末端ドメイン（C1、C2、C3、ドメインB1〜B3ともいう）がIgG結合を担っていて、タンパク質のN末端側の半分にあるドメイン（ドメインA1、A2、A3）は血清アルブミンに結合する。プロテインGの単一のIgBDは、4本鎖逆平行-並行-逆平行βシートに対してパッキングされた中央αヘリックスからなる共通の二次構造を示す。ドメインC1およびC2のアミノ酸配列は、ドメインC3の配列に対して、それぞれ90％および93％同一である。連鎖球菌プロテインGのIg結合ドメインC1、C2、およびC3のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
SpG-C1：
TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE（配列番号16）
SpG-C2：
TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE（配列番号17）
SpG-C3：
TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE（配列番号1）

大半の連鎖球菌株では、プロテインGが3つ全てのIg結合ドメイン（C1〜C3）を含んでいるが、一部の株は、2つのIg結合ドメインしか含まないプロテインGを含有している。例えば、連鎖球菌株GX7809は、2つのIg結合ドメインしか有さないプロテインGを含有し、この場合、最初のドメインはG148およびGX7805のC1と同一であり、最後のドメインはG148およびGX7805のC3と同一である。

プロテインGのIgBD、特にSpGのC1およびC2ドメインと、免疫グロブリンのFcフラグメントとの間の相互作用は、IgBD内のαヘリックスと第3βストランドによって媒介される（GronenbornおよびClore（1993）J. Mol. Biol. 233:331-335）。C3ドメインは、Ig分子のC_H1ドメインの表面露出領域に結合することによって、Ig分子のFabフラグメントと相互作用する。C3ドメインとFabフラグメントとのこの相互作用は、ドメインC3の第2βストランドとIg分子のC_H1ドメインの第7βストランドとの逆平行アラインメント（これがC_H1ドメイン中へのドメインC3の4本鎖βシートの延長に影響を及ぼす）によって媒介される（DerrickおよびWigley（1994）J. Mol. Biol. 243:906-918）。より具体的には、C3ドメインは、KabatによるEUインデックスで、C_H1ドメインのアミノ酸位置122〜127および/または207〜214と相互作用する（図1参照）。

免疫グロブリンの重鎖に結合するプロテインAおよびプロテインGとは異なり、ペプトストレプトコッカス・マグヌスの「プロテインL（PpL）」は、κ軽鎖を含有するIg分子に軽鎖相互作用によって結合する。その過程において、PpLはIg分子の抗原結合部位と干渉しない。プロテインLは、IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDを含む全ての抗体クラスの代表例に結合し、scFvフラグメントやFabフラグメントにも結合する。

体内での物質（例えば代謝産物、薬物、シグナリング分子、放射性核種、または他の物質）の利用可能性は、例えば血漿におけるその濃度や、身体からのそのクリアランスの速度などといったいくつかの因子に依存する。体内での物質の総合的な持続性、すなわち物質が体内で費やす時間の長さは、「平均滞留時間（mean resistance time）（MRT）」として表される。MRTは、個体の身体サイズ、その物質が体内を移動し体内で反応する速度、また該当する場合は、投与された物質、例えば医薬の量などといった、さまざまな因子に依存する。MRTは、一定の物質、例えば薬物を血漿から排出する身体の総合的能力にも依存する。哺乳動物では、血漿クリアランスが、主要浄化器官、すなわち腎臓および肝臓によって達成される。本明細書において使用する用語「血漿クリアランス」は、所与の時間内に、ある一定の物質について浄化される血漿の体積を指し、容積流量率（容積/時間）の単位で測定される。

物質の血中濃度が半分まで降下するのに要する時間を、濃度の低下を引き起こす要因（例えば血漿クリアランス、組織による吸収）を問わず、物質の「血漿中半減期」または「血清中半減期」という。「血漿」という用語は血液の完全に可溶性な画分を指し、一方、「血清」という用語は凝固因子を欠く血漿、すなわち血液の凝固後に得られるものを指す。血漿中半減期と血清中半減期はどちらも、血液中の濃度として測定される。

物質の初期血漿中または血清中半減期と終末血漿中または血清中半減期とは区別することができる。用語「初期血漿中半減期」（または「初期血清中半減期」）と用語「分布血漿中半減期」（または「分布血清中半減期」）は、本明細書では可換的に使用され、t_1/2αと略記される。初期血漿中半減期は、血液から薬物が急速に消失する相を指し、これは投薬後直ちに起こり、血中薬物濃度の実質的な減衰つながりうる。この初期の急速な薬物消失の相は、主として、血管系を一構成要素とする「中心」コンパートメントから末梢組織中の貯蔵部位への薬物の可逆的分布によって決まり；この初期の急速な降下のうち排出またはクリアランスによって決まる部分はほとんどない。典型的には、初期相は数分（すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分）から数時間（すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10時間）持続する。

用語「終末血漿中半減期」（または「終末血清中半減期」）と用語「排出血漿中半減期」（または「排出血清中半減期」）は、本明細書では可換的に使用され、t_1/2βと略記される。排出血漿中半減期は一般に、薬物分布平衡に到達した後、すなわち、投与された物質のさまざまな体組織における分布が完了した後でないと決定されない。血中濃度曲線は、排出相と呼ばれる、それほど急速ではない薬物消失の相に入り、この相における薬物消失は、主として、不可逆的なクリアランスによって決まる。したがって終末血漿中半減期（t_1/2β）は、クリアランス（CL）および分布容積（V_D）によって決まり、その関係は次の等式によって記述される。

問題にしている物質によっては、組織におけるその蓄積や受容体相互作用を含む要因を考慮すると、当該物質の初期血漿中半減期と終末血漿中半減期との間の関係が複雑になりうる（ToutainおよびBousquet-Melou（2004）J. Vet. Pharmacol. Therap. 27:427-439）。体内での物質（例えば医薬）のバイオアベイラビリティを向上させるために、当該物質の初期血漿中半減期（または「初期血清中半減期」）および終末血漿中半減期（または「終末血清中半減期」）を操作することができる。物質のバイオアベイラビリティは、投与後に一定の時間感覚で、血液（血漿または血清）における該物質の濃度を測定し、濃度時間曲線下の面積を確定することによって決定することができる。「曲線下面積（AUC）」の値は、血流中の利用可能な物質の量に比例する。

例えば、腎クリアランスを低減するために当該物質の流体力学的体積を増加させること、またはFcRnによるリサイクリングプロセスを利用することなどによる血漿クリアランスの低減は、各物質の終末血漿中半減期を延伸し、それによって体内でのバイオアベイラビリティを増加させることにつながりうる。

本願との関連において、医薬活性部分の血清中半減期、好ましくは終末血清中半減期は、医薬活性部分をIgBD、好ましくは上に詳述した連鎖球菌プロテインGのC3 IgBDに複合体化することで、その血漿クリアランスを低減し、かつFcRnによるそのリサイクリングを可能にすることにより、延伸できることが好ましい。「延伸された」と「延長された」または「延伸」と「延長」は本明細書では可換的に使用され、時間の長さ、好ましくは血清中半減期の長さ、特に初期および/または終末血清中半減期の長さの増加を指す。

本明細書において使用する用語「医薬活性部分」は、複合体のうち、医薬効果、例えば限定するわけではないが、予防効果、治療効果、および/または診断効果などを媒介するパーツまたは部分を指すと理解される。

本明細書において、疾患または障害について、「防止する」、「防止すること」、「防止」、または「予防」とは、そのような疾患または障害が患者において起こるのを防止することを意味する。したがって予防効果を有する部分は、患者における疾患または障害の発生を防止する。

本明細書において、疾患または障害について、「処置する」、「処置すること」、「処置」または「治療」とは、以下の1つ以上を遂行することを意味する：（a）障害の重症度を低減すること；（b）処置される障害に特有の症状の発達を制限しまたは防止すること；（c）処置される症状に特有の症状の悪化を阻止すること；（d）過去に障害を持っていた個体におけるその障害の再発を制限しまたは防止すること；および（e）過去に障害の症状を示していた個体における症状の再発を制限しまたは防止すること。したがって、治療効果を有する部分は、上に挙げた効果（a）〜（e）の1つ以上を遂行することによって、疾患または障害の症状を処置する。

疾患または症状について、「同定する」、「同定すること」、「同定」または「診断」という用語は、本明細書では、疾患または障害の性質および原因の決定を指すために使用される。したがって、診断効果を有する部分は、疾患または障害の性質および原因の決定を可能にする。

疾患または障害の「症状」は、当該疾患または障害を有する組織、器官または生物によって感知されうる疾患または障害の暗示であり、これには組織、器官または個体の疼痛、脱力、圧痛、緊張、こわばり、および痙直、ならびにバイオマーカーまたは分子マーカーなどといった特異的指標の存在、不在、増加、減少が含まれるが、これらに限るわけではない。本明細書において使用する用語「疾患」および「障害」は、組織、器官または個体がその機能をもはや効率よく果たすことができない異常な状態、とりわけ異常な医学的状態、例えば疾病または傷害を指す。典型的には、疾患または障害は、当該疾患または障害の存在を示す特異的症状または徴候と関連する。

医薬活性部分は、典型的には、生物学的および/または化学的医薬を含む。「化学的医薬」は、典型的には、障害または疾患の防止、処置または診断に有効な人工的に合成された化学化合物を指すと理解される。「生物学的医薬」は、典型的には、生物工学的手段を使って生産された医学用薬物を指すと理解され、予防的、治療的、および/またはインビボ診断的目的に使用される。生物学的医薬には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および核酸（例えばDNA、RNA、またはそのハイブリッド）などがあるが、これらに限るわけではない。承認された治療用の生物学的医薬には、ホルモン（例えばインスリン、hGH、FSH、グルカゴン様ペプチド1、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン）、成長因子（例えばエリスロポエチン、G-CSF/GM-CSF、IGF-1）、インターフェロン（例えばIFN-α、IFN-β、IFN-γ）、インターロイキン（例えばIL-2、IL-11、IL-1Ra）、凝固因子（例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIa因子、トロンビン）、血栓溶解剤および抗凝固剤（例えばt-PA、ヒルジン、活性化プロテインC）、酵素（例えばα-グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸-2-スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、DNase）、抗原結合分子、例えば抗体および抗体フラグメント（例えばIgG、Fab）、ならびにそれらの融合タンパク質（例えばTNFR2-Fc、TMP-Fc、CTLA-4-Fc、IL-1R-Fc、LFA-3-Fc、IL-2-DT）などがあるが、これらに限るわけではない。

本発明との関連において「ペプチドリンカー」（または短く「リンカー」）とは、複合体の2つのパーツまたは部分、例えば2つのペプチドまたはタンパク質を立体的に分離するアミノ酸配列を指す。典型的には、そのようなリンカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸の最小長および少なくとも100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、または15アミノ酸以下の最大長を有する、1〜100個のアミノ酸からなる。本発明のペプチドリンカーの上記好ましい最小長および最大長は、それが数学的に意味がある組み合わせであれば、組み合わせることができ、例えばそのようなリンカーは、1〜15、または12〜40、または25〜75、または1〜100個のアミノ酸からなりうる。ペプチドリンカーは互いに連結される2つの部分間の自由度も与えうる。そのような自由度は、一般に、アミノ酸が小さければ増大する。したがって、フレキシブルなペプチドリンカーは、小さなアミノ酸、特にグリシンおよび/またはアラニン、および/またはセリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンなどの親水性アミノ酸の含量が多い。好ましくは、ペプチドリンカーのアミノ酸の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上が小さなアミノ酸である。

本明細書において使用する用語「切断部位」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列であって、例えばそれが切断酵素によって認識され、かつ/または分割されうるなどの理由で、この配列が、複合体または高分子（例えば核酸またはタンパク質）の分割を指図するものを指す。典型的には、ポリペプチド鎖は、アミノ酸を連結する1つ以上のペプチド結合の加水分解によって切断され、ポリヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の1つ以上の加水分解によって切断される。ペプチド結合またはホスホジエステル結合の切断は、化学的または酵素的切断に由来しうる。酵素的切断とは、タンパク質分解酵素、例えば限定するわけではないが、制限エンドヌクレアーゼ（例えばタイプI、タイプII、タイプII、タイプIV、または人工制限酵素）およびエンド-またはエキソ-ペプチダーゼまたはプロテアーゼ（例えばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ）などによって達成される切断を指す。典型的には、酵素的切断は、自己切断ゆえに起こるか、または独立したタンパク質分解酵素による影響を受ける。タンパク質またはポリペプチドの酵素的切断は、翻訳時または翻訳後に起こりうる。したがって、本明細書において使用する用語「エンドペプチダーゼ切断部位」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列内の切断部位であって、この配列が、エンドペプチダーゼ（例えばトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモライシン、エンドペプチダーゼV8、カテプシン）によって切断されるか、または切断されうる部位を指す。

本明細書において使用する用語「自己切断部位」は、アミノ酸配列内の切断部位であって、その切断に別の分子が関与することなく、この配列が切断されるか、または切断されうる部位を指す。切断部位は、典型的には、数個のアミノ酸を含むと理解される。したがって切断部位は、ペプチドリンカーの目的、すなわち2つのペプチドまたはタンパク質を立体的に分離する目的にも役立ちうる。

本明細書において使用する用語「ベクター」は、細胞中に導入されること、またはそこに含まれているタンパク質および/または核酸を細胞中に導入することが可能な、タンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはそれらの混合物を指す。本発明との関連においては、1つまたは複数のベクターを導入した時に、導入されたポリヌクレオチドによってコードされる目的の遺伝子が、細胞内で発現することが好ましい。適切なベクターの例には、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体などがあるが、これらに限るわけではない。

「医薬」、「医薬品」および「薬物」という用語は、本明細書では可換的に使用され、疾患または障害の同定、防止または処置に使用される物質および/または物質の組合せを指す。

「調製物」および「組成物」という用語は、活性化合物と担体としての封入材料との製剤であって、活性構成要素が、他の担体と共に、または他の担体を伴わずに、担体で囲まれていて、そうすることで担体が活性化合物と会合しているカプセル剤を与えるものを包含するものとする。

「医薬上許容される」とは、動物、特にヒトでの使用に関して、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の広く認識されている薬局方に掲載されていることを意味する。

「活性成分」という用語は、医薬組成物または製剤中の物質であって、生物学的に活性であるもの、すなわち医薬的価値を与えるものを指す。医薬組成物は、互いに協同して作用するか、互いに独立して作用しうる、1つ以上の活性成分を含みうる。活性成分は、中性型または塩型として調剤することができる。医薬上許容される塩には、遊離のアミノ基で形成されるもの、例えば限定するわけではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの、および遊離のカルボキシル基で形成されるもの、例えば限定するわけではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものが含まれる。

本明細書において使用する用語「担体」は、薬学的に不活性な物質、例えば限定するわけではないが、治療活性成分と一緒に投与される希釈剤、賦形剤、界面活性剤、安定剤、生理緩衝溶液、または媒体を指す。そのような医薬担体は液状または固形であることができる。液状担体には、例えば滅菌液、例えば食塩水溶液、および油、例えば限定するわけではないが、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などがあるが、これらに限るわけではない。食塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液状担体として、特に注射溶液用の液状担体として使用することができる。医薬組成物を静脈内投与する場合、食塩溶液は好ましい担体である。適切な医薬担体の例は、E.W.Martinにより、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。

適切な医薬「賦形剤」には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。

「界面活性剤」には、アニオン、カチオン、およびノニオン界面活性剤、例えば限定するわけではないが、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトンX-100、およびポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート65およびポリソルベート80などがある。

「安定剤」には、マンニトール、スクロース、トレハロース、アルブミン、ならびにプロテアーゼおよび/またはヌクレアーゼ拮抗剤などがあるが、これらに限るわけではない。

「生理緩衝溶液」には、塩化ナトリウム溶液、脱塩水、ならびに適切な有機または無機緩衝溶液、例えば限定するわけではないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）、HEPES緩衝液（[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸）またはMOPS緩衝液（3-モルホリノ-1-プロパンスルホン酸）などがあるが、これらに限るわけではない。各緩衝液の選択は、一般に、所望する緩衝液のモル濃度に依存する。例えば注射溶液および注入溶液には、リン酸緩衝液が適している。

「アジュバント」という用語は、組成物の活性成分に対する免疫応答を細胞レベルまたは体液レベルで増大させ、刺激し、活性化し、増強し、または調整する薬剤を指す。例えば免疫学的アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体は免疫学的効果を持たない。そのようなアジュバントの例には、無機アジュバント（例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの無機金属塩）、有機アジュバント（例えばサポニンまたはスクアレン）、油ベースのアジュバント（例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、およびINF-γ）、粒子状アジュバント（例えば免疫刺激性複合体（ISCOMS）、リポソーム、または生分解性マイクロスフェア）、ビロゾーム、細菌性アジュバント（例えばモノホスホリルリピドA、またはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えばノニオンブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ、または合成リピドA）、または合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニンまたはポリリジン）などがあるが、これらに限るわけではない。

「有効量」または「治療有効量」は、意図する目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤が投与される動物のサイズおよび種、投与の目的などといった因子と共に変動するであろう。当業者は当技術分野における確立された方法に従って、個々の例における有効量を、実験的に決定することができる。

実施形態
第1の態様において、本発明は、（i）免疫グロブリン（Ig）結合部分と（ii）医薬活性部分とを含み、Ig結合部分がIg分子の重鎖の定常ドメイン1（C_H1）に特異的に結合する複合体に関する。

好ましい実施形態では、Ig結合部分が医薬活性部分の血清中半減期を延伸する。すなわち、本発明の第1態様の複合体のパーツである場合、医薬活性部分は延伸された血清中半減期を呈する。したがって好ましい実施形態において、本発明の第1態様の複合体は、血清中半減期を、好ましくは医薬活性部分の血清中半減期を、延長するために使用される。初期および/または終末血清中半減期が延長されることは特に好ましい。バイオアベイラビリティ、より好ましくは医薬活性部分のバイオアベイラビリティが増加することは、さらに好ましい。

本発明との関連において、Ig結合部分は、哺乳類、鳥類、魚類または爬虫類のIg、特に実験動物、例えば限定するわけではないが、マウス、ラットおよびウサギ、および/または家畜、例えば限定するわけではないが、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ラクダ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、オウム、カナリヤ、ネコ、イヌ、金魚、マス、パンガシウス、コイ、ニシキゴイ、スズキ、ナマズ、サケ、ウミガメ、カメ、ヘビ、およびトカゲ、および/または霊長類、例えば限定するわけではないが、テナガザル、キツネザル、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、およびヒトのIgに結合することが好ましい。Ig結合部分がヒトのIgに結合することは特に好ましい。好ましくは、Ig分子へのIg結合部分の結合は、インビボで、すなわち哺乳動物、鳥、魚、または爬虫類の体内で、特に上に明示した哺乳動物、鳥、魚、または爬虫類の体内で起こる。したがって好ましくは、Ig結合部分はインビボでIg分子に結合する。

本発明のさらなる実施形態では、Ig結合部分が、IgA、IgD、IgE、IgG、および/またはIgM、好ましくはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、および/またはIgG4のIgG、より好ましくはIgG1、IgG2、および/またはIgG4に結合する。

Ig結合部分は、好ましくは、免疫グロブリン分子のFabフラグメントおよび/またはFc部に結合する。Ig結合部分がIg分子のFab部に結合すること、そして場合によってはFcフラグメントにも結合することは、特に好ましい。したがって、好ましい実施形態では、Ig結合部分が、（例えば図1bに図解するように）免疫グロブリン分子のFc部とFab部の両方に結合することを可能にする構造を有する。さらなる好ましい実施形態では、Ig結合部分が、（例えばFab結合性Ig結合部分について図1cに図解するように）免疫グロブリン分子のFc部またはFab部のどちらか一方に結合することを可能にする構造を有する。好ましくは、免疫グロブリン分子のFc部またはFab部の一方だけに結合する能力が、遺伝子工学によるIg結合部分の各結合部位の機能的不活化（例えばFab結合部位またはFc結合部位の全部または一部の構造的欠失、あるいはアミノ酸の欠失、置き換え、付加、変異、または交換による機能的不活化）によるものである。好ましい実施形態では、Ig結合部分が、中性pH（すなわちpH7）においてIg分子に、好ましくは10^-6M未満〜10^-9M未満のアフィニティで、すなわち10^-6M未満、10^-7M未満、10^-8M未満、または10^-9M未満のアフィニティで結合するアフィニティを有する。Ig結合部分は、Ig分子のFabフラグメントに、10^-7M〜10^-6Mのアフィニティで（すなわち1×10^-7M、1.1×10^-7M、1.2×10^-7M、1.3×10^-7M、1.4×10^-7M、1.5×10^-7M、1.6×10^-7M、1.7×10^-7M、1.8×10^-7M、1.9×10^-7M、2×10^-7M、2.1×10^-7M、2.2×10^-7M、2.3×10^-7M、2.4×10^-7M、2.5×10^-7M、2.6×10^-7M、2.7×10^-7M、2.8×10^-7M、2.9×10^-7M、3×10^-7M、3.1×10^-7M、3.2×10^-7M、3.3×10^-7M、3.4×10^-7M、3.5×10^-7M、3.6×10^-7M、3.7×10^-7M、3.8×10^-7M、3.9×10^-7M、4×10^-7M、4.1×10^-7M、4.2×10^-7M、4.3×10^-7M、4.4×10^-7M、4.5×10^-7M、4.6×10^-7M、4.7×10^-7M、4.8×10^-7M、4.9×10^-7M、5×10^-7M、5.1×10^-7M、5.2×10^-7M、5.3×10^-7M、5.4×10^-7M、5.5×10^-7M、5.6×10^-7M、5.7×10^-7M、5.8×10^-7M、5.9×10^-7M、6×10^-7M、6.1×10^-7M、6.2×10^-7M、6.3×10^-7M、6.4×10^-7M、6.5×10^-7M、6.6×10^-7M、6.7×10^-7M、6.8×10^-7M、6.9×10^-7M、7×10^-7M、7.1×10^-7M、7.2×10^-7M、7.3×10^-7M、7.4×10^-7M、7.5×10^-7M、7.6×10^-7M、7.7×10^-7M、7.8×10^-7M、7.9×10^-7M、8×10^-7M、8.1×10^-7M、8.2×10^-7M、8.3×10^-7M、8.4×10^-7M、8.5×10^-7M、8.6×10^-7M、8.7×10^-7M、8.8×10^-7M、8.9×10^-7M、9×10^-7M、9.1×10^-7M、9.2×10^-7M、9.3×10^-7M、9.4×10^-7M、9.5×10^-7M、9.6×10^-7M、9.7×10^-7M、9.8×10^-7M、9.9×10^-7M、または1×10^-6Mのアフィニティで）結合し、かつ/またはIg分子のFc部に、10^-8M〜10^-7Mのアフィニティで（すなわち1×10^-8M、1.1×10^-8M、1.2×10^-8M、1.3×10^-8M、1.4×10^-8M、1.5×10^-8M、1.6×10^-8M、1.7×10^-8M、1.8×10^-8M、1.9×10^-8M、2×10^-8M、2.1×10^-8M、2.2×10^-8M、2.3×10^-8M、2.4×10^-8M、2.5×10^-8M、2.6×10^-8M、2.7×10^-8M、2.8×10^-8M、2.9×10^-8M、3×10^-8M、3.1×10^-8M、3.2×10^-8M、3.3×10^-8M、3.4×10^-8M、3.5×10^-8M、3.6×10^-8M、3.7×10^-8M、3.8×10^-8M、3.9×10^-8M、4×10^-8M、4.1×10^-8M、4.2×10^-8M、4.3×10^-8M、4.4×10^-8M、4.5×10^-8M、4.6×10^-8M、4.7×10^-8M、4.8×10^-8M、4.9×10^-8M、5×10^-8M、5.1×10^-8M、5.2×10^-8M、5.3×10^-8M、5.4×10^-8M、5.5×10^-8M、5.6×10^-8M、5.7×10^-8M、5.8×10^-8M、5.9×10^-8M、6×10^-8M、6.1×10^-8M、6.2×10^-8M、6.3×10^-8M、6.4×10^-8M、6.5×10^-8M、6.6×10^-8M、6.7×10^-8M、6.8×10^-8M、6.9×10^-8M、7×10^-8M、7.1×10^-8M、7.2×10^-8M、7.3×10^-8M、7.4×10^-8M、7.5×10^-8M、7.6×10^-8M、7.7×10^-8M、7.8×10^-8M、7.9×10^-8M、8×10^-8M、8.1×10^-8M、8.2×10^-8M、8.3×10^-8M、8.4×10^-8M、8.5×10^-8M、8.6×10^-8M、8.7×10^-8M、8.8×10^-8M、8.9×10^-8M、9×10^-8M、9.1×10^-8M、9.2×10^-8M、9.3×10^-8M、9.4×10^-8M、9.5×10^-8M、9.6×10^-8M、9.7×10^-8M、9.8×10^-8M、9.9×10^-8M、または1×10^-7Mのアフィニティで）結合することが、特に好ましい。

好ましい実施形態では、Ig結合部分が、Ig分子のC_H1ドメインの表面露出領域に特異的に結合する。「Ig分子の表面露出領域」という用語は、好ましくは、結合部分とIg分子とが（好ましくは生理的溶液中に）溶解している場合に、結合部分と特異的に結合するのに制約がない、Ig分子のアミノ酸を指す。好ましくは、Ig分子の「表面露出領域」は、免疫応答、好ましくはB細胞特異的免疫応答を誘発することができるものである。好ましいのはIgG分子のC_H1ドメインの表面露出領域である。好ましくは、Ig結合部分が、Ig分子のC_H1ドメインの7番目のβストランドと相互作用する。Ig結合部分が、KabatによるEUインデックスでIg分子のアミノ酸位置122〜127および/または207〜214によって形成されるエピトープに特異的に結合することは特に好ましい（図12参照）。好ましくは、Ig結合部分が、配列番号4のヒトIgγ1、配列番号5のヒトIgγ2、配列番号6のヒトIgγ3、配列番号7のヒトIgγ4、配列番号8のマウスIgγ1、配列番号9のマウスIgγ2a、配列番号10のマウスIgγ2b、配列番号11のマウスIgγ3、および/または配列番号12のラットγ1、またはそれらの変異体の、KabatによるEUインデックスでアミノ酸位置122〜127および/または207〜214によって形成されるエピトープに、特異的に結合する。好ましくは、Ig結合部分は、Ig分子のC_H1ドメインに対して、より好ましくはIgG分子のC_H1ドメインの表面露出領域に対して、10^-6M未満〜10^-9M未満のアフィニティ、または上に詳述した好ましいアフィニティを有する。

本発明との関連において、Ig結合部分は、好ましくは、免疫グロブリン結合ドメイン（IgBD）を含む。好ましくは、IgBDは、グラム陽性菌のIg結合タンパク質に由来し、より好ましくは、IgBDが連鎖球菌由来のIgBDである。好ましい実施形態では、Ig結合部分がC_H1結合性IgBD、好ましくは連鎖球菌株のもの、より好ましくは連鎖球菌プロテインGのC_H1結合性IgBDである。Ig結合部分が、連鎖球菌プロテインGのC3 IgBD（本明細書では「SpG-C3」または「SpG_C3」という略号が可換的に使用される）、より好ましくは配列番号1のアミノ酸配列またはその変異体を含むもの、を含むことは、さらに好ましい。好ましい実施形態では、変異体が、SpG-C3（好ましくは配列番号1のもの）のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、または少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、変異体が、SpG-C3（好ましくは配列番号1のもの）のアミノ酸配列に対して、少なくとも94％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、または少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。したがって、SpG-C3（好ましくは配列番号1のもの）の変異体は、1〜14個のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14個の置換、欠失および/または挿入を有することが好ましい。

変異体の血漿中半減期、好ましくは初期および/もしくは終末血漿中半減期、または血清中半減期、好ましくは初期および/もしくは終末血清中半減期は、その変異体の基礎となる天然C_H1結合性IgBD、好ましくはグラム陽性菌のIg結合タンパク質と比較して、変化していないことが好ましい。さらなる好ましい実施形態では、変異体の血漿中半減期、好ましくは初期および/もしくは終末血漿中半減期、または血清中半減期、好ましくは初期および/もしくは終末血清中半減期が、その変異体の基礎となる天然C_H1結合性IgBDと比較して増加している。好ましくは、血漿中半減期、より好ましくは初期および/もしくは終末血漿中半減期、または血清中半減期、より好ましくは初期および/もしくは終末血清中半減期が、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、増加している。

変異体のバイオアベイラビリティが、天然C_H1結合性IgBDと比較して変化していないことも好ましい。変異体のバイオアベイラビリティが、天然C_H1結合性IgBDと比較して増加していることはさらに好ましい。好ましくは、変異体のバイオアベイラビリティが、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％増加している。

好ましい実施形態では、そのような変異体が、アミノ酸の交換、挿入、欠失、またはN末端もしくはC末端切断、またはこれらの変化の任意の組み合わせを含み、それらは1ヶ所または数カ所の部位に存在しうる。場合によっては、そのような変異体は、IgBDの結合特性を（好ましくはIg分子へのIgBDの結合アフィニティを増加させることによって）変化させうる。Ig分子への結合アフィニティの増加は、例えばアミノ酸アラニンを含有するように1つ以上のアミノ酸位置を交換することなどにより、FcフラグメントまたはFabフラグメントへのIgBDの結合を防止することによって達成しうる（それぞれ「C3-Fc」または「C3-Fab」）。好ましくは、連鎖球菌プロテインGのC3 IgBDのFab結合は、配列番号2に示すように、アミノ酸交換Thr10Ala、Lys12Ala、およびGlu14Alaによって禁止される（C3-Fc）。連鎖球菌プロテインGのC3 IgBDのFc結合は、配列番号3に示すように、アミノ酸交換Glu26Ala、Lys27Ala、およびLys30Alaによって禁止される（C3-Fab）。

本発明の第1態様の実施形態では、医薬活性部分が、生物学的および/または化学的医薬を含む。好ましくは、医薬活性部分は、生物学的医薬、例えば限定するわけではないが、生物工学的手段によって生産された医薬的に、好ましくは治療的に、活性なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む。適切な生物学的医薬には、ホルモン（例えばインスリン、hGH、FSH、グルカゴン様ペプチド1、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン）、血液因子（例えば第VIII因子、第IX因子、第XI因子）、成長因子（例えばエリスロポエチン、G-CSF/GM-CSF、IGF-1）、インターフェロン（例えばIFN-α、IFN-β、IFN-γ）、インターロイキン（例えばIL-2、IL-11、IL-1Ra）、凝固因子（例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIa因子、トロンビン）、血栓溶解剤および抗凝固剤（例えばt-PA、ヒルジン、活性化プロテインC）、酵素（例えばα-グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸-2-スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、DNase）、ワクチン（例えば寄生生物抗原、真菌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原、例えばB型肝炎表面抗原など）、抗原結合分子、例えば抗体および抗体フラグメント（例えばIgG、Fab）、ならびにその融合タンパク質（例えばTNFR2-Fc、TMP-Fc、CTLA-4-Fc、IL-1R-Fc、LFA-3-Fc、IL-2-DT）、などがあるが、これらに限るわけではない。

好ましい実施形態では、医薬活性部分が、ジフテリア毒素のN末端ドメイン、セルロース結合ドメイン（CBD）、診断用タンパク質、特にホタルルシフェラーゼおよび/またはオワンクラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質（GFP）を含まない。診断用タンパク質は、蛍光を発する能力を有するものである。

本発明との関連において、医薬活性部分が免疫グロブリン分子などの抗原結合分子を含むことは、特に好ましい。好ましくは、抗原結合分子は、抗体フラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖可変フラグメント（scFv）、ジ-scFv、二重特異性T細胞エンゲイジャー（BITE）、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、DART分子、トリプルボディ（triple body）、代替足場タンパク質、およびそれらの融合タンパク質からなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、抗原結合分子が、scFvもしくはダイアボディ、またはscFvもしくはダイアボディを含む融合タンパク質である。好ましくは、抗原結合分子は、セルロース結合ドメイン（CBD）を含まない。

上記に加えて、または上記に代えて、抗原結合分子はさらに、放射性部分、細胞毒性薬、キレート部分、光増感剤、またはイメージング試薬を含みうる。

好ましい実施形態では、抗原結合分子が放射性部分、すなわち放射性核種を含む。放射性部分は、F、Br、Mn、Co、Ga、As、Zr、P、C、S、H、I、In、Lu、Cu、Rh、Bi、At、Y、Re、Ac、Tc、またはHg原子の同位体でありうる。放射性部分は抗原結合分子を放射標識して、例えば人体におけるその検出を可能にすることで、それを、診断アプローチ（放射免疫検出：RAID）に役立つものにするばかりでなく、治療的応用（放射免疫療法：RAIT）に適したものにもする。

光増感剤は、特異的波長の光によって励起された後に発光するか、フリーラジカルおよび一重項酸素を形成させる能力を有する化学化合物である。光増感剤は、例えば光線力学的治療に使用される。好ましい実施形態において、光増感剤には、ポルフィリンファミリー、テキサフィリンファミリー、クロリンファミリーおよびフタロシアニンファミリーの化合物、特にHpD、ALA、M-ALA、ベルテポルフィン（Vertiporfin）、ルテキサフィリン（Lutexaphyrin）、テモポルフィン、タラポルフィン、HPPH、フタロシアニン、およびナフタロシアニン（Napthalocyanine）などが含まれるが、これらに限るわけではない。

イメージング試薬には、生物発光、化学発光および蛍光イメージング試薬、例えばウミシイタケ（Renilla reniformis）および/またはメトリディア・ロンガ（Metridia Longa）のルシフェラーゼ、パーオキサレート、ポリメチン（例えばCy3、Cy5、Cy5.5、Cy7などのシアニン色素）、スクアライン誘導体、フタロシアニン、ポルフィリン誘導体、およびBODIPYアナログ（BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TR、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665）、ならびに蛍光タンパク質、例えば限定するわけではないが、CFP、BFP、YFP、DsRED（Chudakovら（2010）Physiol. Rev. 90:1103-1163）が含まれる。好ましくは、蛍光タンパク質はGFPではない。

好ましい実施形態では、抗原結合分子が、細胞に対する毒性効果を持つ細胞毒性薬、例えば限定するわけではないが、抗有糸分裂薬、細胞成長を禁止する薬物および細胞死を引き起こす薬物などである。細胞毒性薬の非限定的な例は、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサロプラチン、メクロルエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル）、代謝拮抗物質（5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（ゼローダ（Xeloda（登録商標））、6-メルカプトプリン（6-MP）、メトトレキサート、ゲムシタビン）、植物アルカロイド（例えばアジュマリン、アトロピン、スコポラミン、ヒヨスチアミン、ビンカアルカロイド、コデイン、コカイン、コルヒチン、モルヒネ、レセルピン、ツボクラリン、フィソスチグミン、キニジン、キニーネ、エメチン、麦角アルカロイド）、抗腫瘍性抗生物質（例えばアクチノマイシン-D、ブレオマイシン、およびマイトマイシン-C、ミトキサントロン、およびアントラサイクリン、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばトポテカン、イリノテカンエトポシド（VP-16）およびテニポシド）、および有糸分裂阻害剤（エストラムスチン、タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルなど、エポチロン、例えばイクサベピロン、およびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）である。

抗原結合分子はさらに、少なくとも1つの金属イオン、例えば限定するわけではないが、カルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウム、亜鉛、銅、ヒ素、鉛、タリウム、および水銀イオンなどを、キレート形成によって結合する能力を有するキレート部分を含みうる。そのようなキレート部分は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン四酢酸（エデト酸カルシウム二ナトリウム（calcium disodium versante）（CaNa₂-EDTA））、ジメルカプロール（BAL）、ジメルカプトコハク酸（DMSA）、ジメルカプト-プロパンスルホネート（DMPS）、フェリチン、デフェロキサミンおよびデフェラシロクス、デフェリプロン（1,2-ジメチル-3-ヒドロキシル-4-ピリジノン）、DOTA、DTPA、DADT、DADS、DO3A、N2S2MAMA、トリアミドチオール、ホスホネート、有機ガドリニウム錯体、ペニシラミン、およびテトラサイクリンファミリーの抗生物薬を含みうる。キレート部分は、キレート治療において、例えばアテローム性動脈硬化、関節リウマチ、ならびに中毒、例えば水銀中毒、銅毒性、金毒性、ヒ素中毒、鉛中毒、急性鉄中毒、および鉄過剰症の処置において、特に興味深い。キレート部分は放射線療法にも重要である。

好ましくは、抗原結合分子は融合タンパク質であり、これは、上記に加えて、または上記に代えて、アポトーシス促進タンパク質、免疫（共）刺激タンパク質、免疫抑制タンパク質、サイトカイン（例えばインターロイキンおよび/またはインターフェロン）、ケモカイン（例えばα-、β-、またはγ-ケモカイン）、毒素、成長因子または酵素、好ましくはRNase、プロドラッグ変換酵素またはキナーゼ（例えばAGCキナーゼ、CaMキナーゼ、CK1キナーゼ、CMGCキナーゼ、STEキナーゼ、TKキナーゼ、およびTKLキナーゼ）をさらに含む。

好ましい実施形態において、アポトーシス促進タンパク質には、Bid、Bik、Puma、およびBim、ならびにアポトーシス促進サイトカイン（deathリガンド）、例えば限定するわけではないが、TNF、TRAIL、およびFasLなどがあるが、これらに限るわけではない。

好ましい実施形態において、免疫（共）刺激タンパク質には、B7.1、B7.2、4-1BBL、LIGHT、ICOSL、GITR、CD40、OX40L、およびCD70などがあるが、これらに限るわけではない。

免疫抑制タンパク質には、好ましくは、IL1-Raが含まれるが、これに限るわけではなく、毒素には、好ましくはシュードモナス外毒素Aおよびリシンが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましくは、毒素はジフテリア毒素ではない。

好ましい実施形態では、サイトカインがインターロイキンおよび/またはインターフェロンである。インターロイキン（IL）には、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン12、インターロイキン-13、インターロイキン-14、インターロイキン-15、インターロイキン-16、インターロイキン-17、インターロイキン-18、インターロイキン-19、インターロイキン-20、インターロイキン-21、インターロイキン-22、インターロイキン-23、インターロイキン-24、インターロイキン-25、インターロイキン-26、インターロイキン-27、インターロイキン-28、インターロイキン-29、インターロイキン-30、インターロイキン-31、インターロイキン-32、インターロイキン-33、インターロイキン-34およびインターロイキン-35などがあるが、これらに限るわけではない。インターフェロン（IFN）には、I型インターフェロン（例えばIFN-α、IFN-βおよびIFN-ω）、II型インターフェロン（例えばIFN-γ）、およびIII型インターフェロンなどがあるが、これらに限るわけではない。特に挙げられるのは、インターフェロンA1、インターフェロンA2、インターフェロンA4、インターフェロンA5、インターフェロンA6、インターフェロンA7、インターフェロンA8、インターフェロンA10、インターフェロンA13、インターフェロンA14、インターフェロンA16、インターフェロンA17、インターフェロンA21、インターフェロンB1、TNF、TRAIL、およびFasLである。

好ましい実施形態において、成長因子には、アドレノメデュリン（AM）、アンジオポエチン（Ang）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（BMP）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、上皮成長因子（EGF）、エリスロポエチン（EPO）、線維芽細胞成長因子（FGF）、膠細胞株由来神経栄養因子（GDNF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、成長分化因子-9（GDF9）、肝細胞成長因子（HGF）、ヘパトーマ由来成長因子（HDGF）、インスリン様成長因子（IGF）、遊走刺激因子（GDF-8）、神経成長因子（NGF）および他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子（PDGF）、トロンボポエチン（TPO）、トランスフォーミング成長因子アルファ（TGF-α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（TGF-β）、血管内皮成長因子（VEGF）、Wntシグナリング経路、および胎盤成長因子（PlGF）などがあるが、これらに限るわけではない。

RNAseには、エンドリボヌクレアーゼ、例えば限定するわけではないが、RNase A、RNase H、RNase I、RNase III、RNase L、RNase P、RNase PhyM、RNase T1、RNase T2、RNase U2、RNase V1、およびRNase V、ならびにエキソリボヌクレアーゼ、例えば限定するわけではないが、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、RNase PH、RNase II、RNase R、RNase D、RNase T、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼI、およびエキソリボヌクレアーゼIIが含まれる。

プロドラッグ変換酵素には、エステラーゼ、例えば限定するわけではないが、アセチルエステラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ（スルファターゼ）、二リン酸モノエステルヒドロラーゼ、およびリン酸トリエステルヒドロラーゼ；ホスファターゼ、例えば限定するわけではないが、チロシン特異的ホスファターゼ、セリン/スレオニン特異的ホスファターゼ、二重特異性ホスファターゼ、ヒスチジンホスファターゼ、および脂質ホスファターゼ；ならびにレダクターゼ、例えば限定するわけではないが、5-αレダクターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、HMG-CoA還元酵素、メトヘモグロビンレダクターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、大腸菌ニトロレダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、およびカルボキシペプチダーゼG2、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼなどがあるが、これらに限るわけではない。

キナーゼには、AGCキナーゼ、例えばPKA、PKCおよびPKG、CaMキナーゼ、例えばカルシウム/カルモジュリン依存的プロテインキナーゼ、ならびにセリン/スレオニンプロテインキナーゼ（例えばDAPK2）、CK1、例えばカゼインキナーゼ1グループ、CMGC、例えばCDK、MAPK、GSK3およびCLKキナーゼ、STE、例えば酵母Sterile 7、Sterile 11、およびSterile 20キナーゼのホモログ、チロシンキナーゼ（TK）、チロシンキナーゼ様キナーゼグループ（TKL）、受容体関連チロシンキナーゼ、MAPキナーゼ、およびヒスチジンキナーゼなどがあるが、これらに限るわけではない。

特に好ましい実施形態では、医薬活性部分が、ペプチド連結またはジスルフィド連結単鎖ダイアボディである。医薬活性部分が、ターゲット分子に向けられた第1特異性（A）と、エフェクター分子に向けられた第2特異性（B）とを有する単鎖ダイアボディであることは、特に好ましい。好ましくは、単鎖ダイアボディが、構造［VH(A)-VL(B)-P-VH(B)-VL(A)］または［VL(B)-VH(A)-P-VL(A)-VH(B)］を含む。好ましい実施形態では、第1特異性（A）が腫瘍関連抗原または病原体の抗原に向けられる。好ましくは、腫瘍関連抗原が、CEA、EGFR、HER2、HER3、HER4、VEGFR、インテグリン受容体ファミリー、線維芽細胞活性化タンパク質、ガレクチン、EpCAM、CEA、CD44、CD44v、CD2、CD5、CD7、CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD52、CD56、CD71、CD72、CD73、CD105、CD117、CD123、c-Met、PDGFR、IGF1-R、HMW-MAA、TAG-72、GD2、GD3、GM2、葉酸受容体、Le^y、MUC-1、MUC-2、PSMA、PSCAおよびuPARからなる群より選択される。さらなる好ましい実施形態では、第2特異性（B）が、細胞膜の分子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、補体系のタンパク質、凝固系のタンパク質、線維素溶解タンパク質、薬物の不活性前駆体をターゲット構造上で活性な薬物に変換することができる酵素、ペプチドホルモン、ステロイドホルモン、免疫グロブリンの定常パーツ、細胞毒性ペプチド、および医薬に向けられる。好ましくは、第2特異性（B）は、リンパ球、マクロファージ、単球または顆粒球の細胞膜上の分子に向けられ、より好ましくはT細胞の細胞膜上の分子に向けられる。第2特異性（B）がCD3に向けられること、より好ましくはCD3の細胞外領域に向けられることは、特に好ましい。

本発明のさらなる実施形態では、Ig結合部分と医薬活性部分とが、共有結合または非共有結合によってつながれる。Ig結合部分と医薬活性部分とが、直接的につながれるか、1つ以上のリンカーを介して間接的につながれることは、特に好ましい。好ましくは、1つ以上のリンカーが、ペプチドリンカー、より好ましくはフレキシブルなペプチドリンカーを含む。好ましい実施形態では、本発明のペプチドリンカーが、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸、好ましくは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15アミノ酸の最小長を有する。好ましくは、本発明のペプチドリンカーは、少なくとも100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、もしくは15アミノ酸またはそれ未満の最大長を有する。好ましくは、リンカーは1〜40、好ましくは5〜20、より好ましくは18〜12、最も好ましくは10アミノ酸の長さを有する。本発明の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、小さなアミノ酸、特にグリシンおよび/もしくはアラニン、ならびに/または親水性アミノ酸、例えばセリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンの含有量が多い。好ましくは、ペプチドリンカーのアミノ酸のうち、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上が、小さいかつ/または親水性のアミノ酸である。好ましくは、リンカーのアミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択される。さらなる好ましい実施形態では、本発明のペプチドリンカーが非免疫原性であり、特に好ましい実施形態では、ペプチドリンカーがヒトに対して非免疫原性である。配列GGSGGGGSGGを有するペプチドリンカーは特に好ましい。

好ましい実施形態では、Ig結合部分が、フレキシブルなリンカーを介して医薬活性部分、好ましくは抗体フラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖可変フラグメント（scFv）、ジ-scFv、二重特異性T細胞エンゲイジャー（BITE）、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、DART分子、トリプルボディ、代替足場タンパク質、およびそれらの融合タンパク質からなる群より選択される抗原結合分子につながれている、連鎖球菌IgBD、より好ましくは連鎖球菌プロテインGのC3 IgBD（SpG-C3）を含む。

本発明の第1態様の特に好ましい実施形態では、本発明の複合体が、配列番号13、配列番号14もしくは配列番号15のアミノ酸配列またはその変異体を含む。好ましくは、そのような変異体は、配列番号13、配列番号14または配列番号15のアミノ酸配列に対して、少なくとも94％の、すなわち少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有する。

さらなる実施形態では、1つ以上のペプチドリンカーが、1つ以上の切断部位、好ましくは1つ以上のエンドペプチダーゼ切断部位を含む。切断部位は、意図した行き先に到達した時の医薬活性部分の放出を可能にするものであることが好ましい。好ましくは、エンドペプチダーゼ切断部位は、アミノ酸配列内の切断部位に関し、この配列は、エンドペプチダーゼ、例えば限定するわけではないが、トリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモライシン、エンドペプチダーゼV8、メタロプロテイナーゼおよびカテプシンによって切断されるか、または切断されうる。

第2の態様において、本発明は、第1態様の複合体をコードする配列を含む核酸分子を提供する。好ましくは、そのような核酸分子は、DNAおよび/またはRNA分子を含む。

第3の態様において、本発明は、第2態様の核酸を含むベクターを提供する。適切なベクターには、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスおよび/または人工染色体などがあるが、これらに限るわけではないと理解される。

第4の態様において、本発明は、第1態様の複合体および/または第2態様の核酸分子および/または第3態様のベクターを含有する単離された細胞を提供する。そのような細胞には、原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば真菌、植物または動物細胞）が含まれるが、これらに限るわけではないと理解される。

第5の態様において、本発明は、第1態様の複合体、第2態様の核酸、第3態様のベクターおよび/または第4態様の細胞と医薬上許容される担体および/または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は医薬組成物である。好ましい実施形態において、医薬組成物はさらに、医薬上許容される担体および/または賦形剤ならびに場合によっては1つ以上の追加活性物質を含む。好ましくは、第5態様の組成物は、治療有効量の化合物（好ましくは精製された形態にあるもの）を、患者への適正な投与のための形態が得られるように、適切な量の担体および/または賦形剤と共に含有する。製剤は投与様式に適合すべきである。

医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。医薬組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドを使って、坐剤として調剤することができる。

本発明の医薬組成物を調製するために、医薬上許容される担体は固形または液状であることができる。固形の組成物には、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、口中錠、カシェ剤、坐剤、および分散顆粒などがある。固形賦形剤は、1つ以上の物質であることができ、それらは、希釈剤、矯味矯臭剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、または封入材料でありうる。粉末剤の場合、賦形剤は、好ましくは、微粉化された本発明の阻害剤と混合された、微粉化固形物である。錠剤の場合は、活性成分が、必要な結合特性を有する担体と、適切な比率で混合され、所望の形状とサイズに圧縮される。適切な賦形剤は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂などである。坐剤を調製するには、低融点ワックス、例えば脂肪酸グリセリドの混合物またはカカオ脂をまず溶融し、活性構成要素をその中に、撹拌することなどによって均一に分散させる。次に、溶融した均一混合物を都合のよいサイズの鋳型に注ぎ込み、冷ますことによって、固化させる。錠剤、粉末剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、および口中錠は、経口投与に適した固形剤形として使用することができる。

液状組成物には、溶液、懸濁液、およびエマルション、例えば水、食塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール溶液または水/プロピレングリコール溶液が含まれる。非経口注射（例えば静脈内、動脈内、骨内注入、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、および髄腔内注射）用には、例えばポリエチレングリコール水溶液に溶解した液状調製物を調剤することができる。医薬組成物を静脈内に投与する場合、食塩溶液は好ましい担体である。

好ましくは、医薬組成物は単位剤形（unit dosage form）である。そのような形態では、組成物を、適当な量の活性構成要素を含有する単位用量（unit dose）に分割することができる。単位剤形は、包装された組成物であることができ、例えば包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の粉末剤など、その包装は、不連続な量の組成物を含有する。また、単位剤形は、カプセル剤、注射剤バイアル、錠剤、カシェ剤、もしくは口中錠そのものであるか、または包装された形態にある適当な数のこれらのいずれかであることもできる。

組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝化剤を含有することができる。

さらにまた、そのような医薬組成物は、他の薬学的に活性な物質、例えば限定するわけではないが、アジュバントおよび/または追加活性成分も含みうる。本発明との関連において、アジュバントには、無機アジュバント、有機アジュバント、油ベースのアジュバント、サイトカイン、粒子状アジュバント、ビロゾーム、細菌性アジュバント、合成アジュバント、または合成ポリヌクレオチドアジュバントなどがあるが、これらに限るわけではない。

第6の態様において、本発明は、血清中半減期および/または血漿中半減期の延長に使用するための、上に詳述した本発明の第1態様の複合体を提供する。本発明の第1態様の複合体は、初期および/または終末血清中半減期の延長に使用するためのものであることが好ましい。好ましい実施形態では、医薬活性部分の血清中半減期、より好ましくは初期および/または終末血清中半減期が延伸される。好ましくは、医薬活性部分の血清中半減期、より好ましくは初期および/または終末血清中半減期が、免疫グロブリン結合部分への、好ましくはIgBDへの、より好ましくは連鎖球菌プロテインGのC3-IgBDへの、その複合体化により、延伸される。

本発明の第1態様の複合体が、初期および/または終末血漿中半減期の延長に使用するためのものであることは、さらに好ましい。好ましい実施形態では、医薬活性部分の血漿中半減期、より好ましくは初期および/または終末血漿中半減期が延伸される。好ましくは、医薬活性部分の血漿中半減期、より好ましくは初期および/または終末血漿中半減期が、免疫グロブリン結合部分への、好ましくはIgBDへの、より好ましくは連鎖球菌プロテインGのC3-IgBDへの、その複合体化により、延伸される。

第7の態様において、本発明は、医薬品としての、上に詳述した本発明の第1態様の複合体を提供する。好ましい実施形態では、複合体が、医学において使用するためのもの、すなわち、障害または疾患、例えば限定するわけではないが、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、がんタイプの疾患、皮膚の状態、内分泌疾患、眼の疾患および障害、遺伝性障害、感染性疾患、腸疾患、神経障害、および精神病の予防、処置または診断に使用するためのものである。例えば、自己免疫疾患には、真性糖尿病1型、関節リウマチ、乾癬、クローン病、自己免疫性心筋症、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、シェーグレン（Sjogern's）症候群などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、アレルギー性疾患には、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性湿疹、アナフィラキシー、昆虫毒アレルギー、薬物アレルギー、および食品アレルギーなどがあるが、これらに限るわけではない。例えば、がんタイプの疾患には、基底細胞癌、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、大腸がん、皮膚T細胞性リンパ腫、食道がん、網膜芽細胞腫、胃部（胃）がん、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭がん、卵巣がん、膵がん、胸膜肺芽腫、前立腺がん、咽喉がん、甲状腺がん、および尿道がんなどがあるが、これらに限るわけではない。例えば、皮膚の状態には、ざ瘡、皮膚炎、湿疹、皮膚付属器の状態、皮下脂肪の状態、色素沈着障害、表面母斑、表皮新生物、表皮嚢胞、紅斑、凍傷、遺伝性皮膚症、ムチン沈着症、神経皮膚状態（例えばウィスコット・アルドリッチ症候群）、および乾癬などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、内分泌疾患には、真性糖尿病1型および2型、骨粗鬆症、およびクッシング病などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、遺伝性障害には、色盲、嚢胞性線維症、ダウン症候群、鎌状赤血球症、およびターナー症候群などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、感染性疾患には、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンまたは他の病原体もしくは寄生生物によって引き起こされる疾患、例えばアフリカ睡眠病、AIDS、HIV感染、炭疽、ボレリア症、カリシウイルス感染症（ノロウイルスおよびサポウイルス）、水痘、クラミジア感染症、コレラ、クロストリジウム感染症、コロラドダニ熱（CTF）、感冒、クロイツフェルト・ヤコブ病、デング熱（DEN-1、DEN-2、DEN-3およびDEN-4）、エボラ、エンテロウイルス感染症、ヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）およびヒトヘルペスウイルス7（HHV-7）による感染、淋疾、連鎖球菌感染症（グループAおよびB）、手足口病（HFMD）、ヘリコバクター・ピロリ感染症、肝炎（A、B、C、およびD）、ヘルペス感染症、パピローマウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、インフルエンザ、ラッサ熱、マールブルク熱、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、パスツレラ症、ペスト、肺炎球菌感染症、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ロタウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、サルモネラ食中毒およびサルモネラ感染症、SARS、疥癬感染症、住血吸虫症、痘瘡、ブドウ球菌食中毒およびブドウ球菌感染症、梅毒、破傷風、白癬菌感染症、結核、チフス、ベネズエラウマ脳炎、および黄熱病などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、腸疾患には、胃腸炎、イレウス、回腸炎、結腸炎、虫垂炎、セリアック病、過敏性腸症候群、憩室性疾患、下痢、ポリープ、および潰瘍性大腸炎などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、神経障害には、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、脳損傷、クロイツフェルト・ヤコブ病、クッシング症候群、失読症、脳炎、てんかん、頭痛、ハンチントン病、片頭痛、多発性硬化症、パーキンソン病、ポリオ、狂犬病、統合失調症、および脳卒中などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、精神病には、急性ストレス障害、注意欠陥多動障害（ADHD）、自閉症性障害、境界性人格障害、神経性大食症、燃え尽き、統合失調症、うつ病、認知障害、コミュニケーション障害、摂食障害、窃盗癖、学習障害、勃起障害、メランコリー、強迫性障害（OCD）、パラノイア、病的賭博、外傷後ストレス障害（PTSD）、精神障害、過眠、不眠、およびトゥーレット症候群などがあるが、これらに限るわけではない。

以下の実施例は、本発明の例示に過ぎず、決して、本願のクレームによって示される本発明の範囲を限定していると解釈してはならない。

scDb-IgBD融合タンパク質の構築と生産
C末端にヘキサヒスチジンタグを含むIgBD（IgBD SpA_B、SpA_D、SpA_EZ4、SpG_C3、およびPpL_C4*）をコードするDNAが、5'端にNotI部位、3'端にEcoRI部位とXbaI部位を付加して、GeneArt（ドイツ・レーゲンスブルク）によって合成された。IgBD SpA_Bを、NotIおよびXbaIで切断された哺乳類発現ベクターpSecTagAHis scDb-CEACD3-ABD-L（Hoppら（2010）Protein Eng. Des. Sel. 23:827-834）中にクローニングした。次に、IgBD SpA_D、SpA_EZ4、SpG_C3、およびPpL_C4*をNotI-EcoRIフラグメントとしてscDb-CEACD3-SpA_B中にクローニングすることで、SpA_B IgBDを置換した。scDb-IgBD融合タンパク質の組成を図2aに掲載する。HEK293細胞を安定にトランスフェクトし、融合タンパク質scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、scDb-SpA_EZ4、scDb-SpG_C3、およびscDb-PpLC_4*を、本質的に既述のようにしてIMACによって、細胞培養上清から精製した（Muellerら（2007）J. Biol. Chem. 282:12650-12660）。2〜22mg/L上清の収量が得られた。精製融合タンパク質のSDS-PAGEを行った。各レーン2マイクログラムのタンパク質を分析し、ゲルをクマシーブリリアントブルーG-250で染色した(M、分子量標準）。SDS-PAGE分析により、還元条件下および非還元条件下で単一バンドが明らかになった（図2b）。無修飾scDbと比較して、分子量は還元条件下で約5kDa増加していた。

scFv-IgBD融合タンパク質の構築と生産
C末端にヘキサヒスチジンタグを含むIgBD（IgBD SpA_B、SpA_D、SpA_EZ4、SpG_C3、およびPpL_C4*）をコードするDNAが、5'端にNotI部位、3'端にEcoRI部位とXbaI部位を付加して、GeneArt（ドイツ・レーゲンスブルク）によって合成された。そのDNAをNotIおよびEcoRIで消化し、ベクターpSecTagA-scFvCEA-4-1BBL（Muellerら（2008）J. Immunol. 31:714-722）中にクローニングした。scFv-IgBD融合タンパク質の組成を図2aに掲載する。HEK293細胞を安定にトランスフェクトし、融合タンパク質scFv-SpA_B、scFv-SpA_D、scFv-SpA_EZ4、scFv-SpG_C3、およびscFv-PpL_C4*を、本質的に既述のようにしてIMACによって、細胞培養上清から精製した（Muellerら（2007）J. Biol. Chem. 282:12650-12660）。精製融合タンパク質のSDS-PAGEを行った。各レーン2マイクログラムのタンパク質を分析し、ゲルをクマシーブリリアントブルーG-250で染色した(M、分子量標準）。SDS-PAGE分析により、還元条件下および非還元条件下で単一バンドが明らかになった（図2c）。無修飾scFvと比較して、分子量は還元条件下で約5kDa増加していた。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
scDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質の純度およびストークス半径を、BioSuite 250（Waters Corporation、米国ミルフォード）と0.5ml/分の流速とを使って、HPLCサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した（図2d〜g）。以下の標準タンパク質を使用した：チログロブリン、β-アミラーゼ、ウシ血清アルブミン、炭酸脱水酵素、シトクロムc。融合タンパク質は全て、単量体分子に対応する単一ピークを示した。測定された融合タンパク質のストークス半径は、2.3〜2.7nmの範囲にあった。興味深いことに、scFv-IgBD融合タンパク質のストークス半径はscDb-IgBD融合タンパク質と類似していたが、無修飾scFvは1.2nmのストークス半径を持っていた（図8も参照されたい）。

ELISAにおけるCEAへのscDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質の結合
scDb-IgBD融合タンパク質（a）またはscFv-IgBD融合タンパク質（b）の濃度を増加させて、ELISAにより、固定化CEAへの結合について分析した。がん胎児性抗原（CEA）（300ng/ウェル）を4℃で終夜コーティングし、残存結合部位を2％（w/v）粉乳/PBSでブロックした。精製組換えscDb、scFV、ならびにscDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質を、二つ一組にしてタイトレートし、室温で1時間インキュベートした。検出は、マウスHRPコンジュゲート抗Hisタグ抗体により、TMB基質（0.1mg/ml TMB、100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0、0.006％H₂O₂）を使って行った。50μlの1M H₂SO₄で反応を停止した。ELISAリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。

ヒトおよびマウスIgG、ヒトFab-およびFc-フラグメントへのscDb-IgBD融合タンパク質の結合
融合タンパク質scDb-SpG_C3、scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、scDb-SpA_EZ4、およびscDb-PpL_C4*を、ELISAにより、固定化ヒト血清IgGならびにそのFabおよびFcフラグメントへの結合について分析した。ヒトまたはマウスIgG、ヒトFabまたはヒトFcフラグメント（100ng/ウェル）を4℃で終夜コーティングし、残存結合部位を2％（w/v）粉乳/PBSでブロックした。精製組換え抗体および血清試料を、二つ一組にしてタイトレートし、室温で1時間インキュベートした。検出は、マウスHRPコンジュゲート抗Hisタグ抗体により、TMB基質（0.1mg/ml TMB、100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0、0.006％H₂O₂）を使って行った。50μlの1M H₂SO₄で反応を停止した。ELISAリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。ヒト血清IgG（huIgG）ならびにヒトIg Fc（huIgFc）への最も強い結合はscDb-SpG_C3で観察された（図4b）。scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、scDb-SpA_EZ4もhuIgGおよびhuIgFcに結合することができたが、それらの結合はscDb-SpG_C3の結合より弱かった。scDb-PpL_C4*については結合をほとんど観察できなかった。scDb-SpG_C3についてはhuIgFabへの結合が観察されたが、他の融合タンパク質はいずれもhuIgFabへの結合をほとんど示さなかった。融合タンパク質scDb-SpG_C3、scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、およびscDb-SpA_EZ4はhuIgMに結合することもでき（図4b）、scDb-SpA_Bが最も強い結合を呈した（図4b）。加えて、融合タンパク質scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、およびscDb-SpA_EZ4は、huIgAへの結合も示した。

マウス血清IgG（moIgG）ならびにマウスIg Fc（moIgFc）でも全ての融合タンパク質（scDb-PpL_C4*を除く）の結合がみられたが、結合は、ヒトIgGでみられたものより一般に弱かった（図4a）。マウスIg Fab（moIgFab）フラグメントへの結合は、scDb-SpG_C3にのみ観察された。

アフィニティ測定
中性pHまたは酸性pHにおけるヒトおよびマウス血清IgGならびにFabおよびFcフラグメントに対するscDb-IgBD融合タンパク質のアフィニティを、水晶微量天秤測定（Attana A-100 C-Fastシステム）によって決定した。IgGならびにFabおよびFcフラグメントをLNB（低非特異的結合）カルボキシルセンサーチップに、製造者のプロトコールに従い、65〜95Hzのシグナル増加をもたらす密度で、化学的に固定化した。結合実験は、PBST（0.1％ツイーン20）pH7.4またはpH6.0中、25μl/分の流速で行った。25μlの10mMグリシン-HCl pH3.0でチップを再生した。各測定の前にベースラインを測定し、それを結合曲線から差し引いた。データをAttester 3.0（バージョン3.1.1.8、Attana、スウェーデン・ストックホルム）によって収集し、Attache Office Evaluationソフトウェア（バージョン3.3.4、Attana、スウェーデン・ストックホルム）により、質量輸送モデルをカーブフィッティングに使用して分析した（図、活性化合物5、図5参照）。ヒトおよびマウスIgGならびにIgG-Fcに対して、低ナノモル濃度域の強い結合が、異なるSpA-IgBDおよびSpG_C3融合タンパク質について観察された。ヒトおよびマウスFabフラグメントへの結合はscDb-SpG_C3についてのみ観察された。scDb-SpA-IgBD融合タンパク質の結合はpH依存的であることがわかり、pH6では強く低減する。例えばpHを7.4から6.0に低下させると、ヒト血清IgGに対するscDb-SpA_Bのアフィニティに約45倍の低減が起こり、マウス血清IgGに対するアフィニティには43倍の低減が起こる。pH依存的結合は、初期エンドソーム（pH約6.3〜6.8）および管状リサイクリングエンドソーム（pH約6.5）の酸性環境下ではSpA融合タンパク質がIgG-FcRn複合体に結合した状態に留まる必要があるFcRnを介したリサイクリングに、直接的な影響を及ぼしうる。対照的に、pH値を7.4から6へと低下させることで観察されるヒトIgFc、ヒトIgFab、マウスIgGおよびマウスIgFabに対するscDb-SpG_C3の結合アフィニティは、類似しているか、増加さえしていた（図5）。

薬物動態
CD1マウスをElevage Janvier（フランス、ル・ジュネスト＝サン＝ティスル）から購入した。動物の飼育と全ての実験は連邦ガイドラインに従い、大学および州当局の承認を受けた。CD1マウス（8〜16週齢、体重30〜40g）に、25μgのscDb-IGBDまたはscFv-IGBD融合タンパク質を、総体積150μlで、i.v.注射した。3分、30分、1時間、2時間、6時間、1日、および3日の時間間隔で、血液試料（50μl）を尾から採取し、氷上でインキュベートした。血餅を、4℃、13,000gで10分間遠心分離し、血清試料を−20℃で保存した。CEA結合組換え抗体の活性化合物血清中濃度をELISAによって決定した。がん胎児性抗原（CEA）（300ng/ウェル）またはIgG（500ng/ウェル）を4℃で終夜コーティングし、残存結合部位を2％（w/v）粉乳/PBSでブロックした。精製組換え抗体および血清試料を、二つ一組にしてタイトレートし、室温で1時間インキュベートした。結合のpH依存性を決定するために、全てのインキュベーションおよび洗浄ステップを、表示したpHに調節したPBSで行った。検出は、マウスHRPコンジュゲート抗Hisタグ抗体により、TMB基質（0.1mg/ml TMB、100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0、0.006％H₂O₂）を使って行った。50μlの1M H₂SO₄で反応を停止した。ELISAリーダーで450nmにおける吸光度を測定した。比較のために、最初の値（3分）を100％に設定した。CD1マウスへの単回i.v.注射後に、scDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質の半減期を分析した。初期血漿中半減期（t_1/2α）、終末血漿中半減期（t_1/2β）およびバイオアベイラビリティ（AUC）を、Excelを使って、scDb-IgBDおよびscFv-IgBD融合タンパク質について算出した（図8）。統計には、スチューデントのt検定を適用した。全ての融合タンパク質のバイオアベイラビリティが、それぞれ非融合scDbまたは非融合scFvと比較して増加した。非融合scDbまたは非融合scFvとそれぞれ比較して、バイオアベイラビリティの最も高い増加は、scDb-SpG_C3およびscFv-SpG_C3によって得られ、scDb-SpG_C3は36倍の増加、scFv-SpG_C3は65倍の増加を、それぞれのバイオアベイラビリティに呈した（図8）。1.3時間の終末半減期を呈するscDbと比較して、scDb-IgBD融合タンパク質は、強く延伸された血中での循環を示した（図7a）。scDb-PpL_C4*では2.4時間、scDb-SpA_EZ4では4.2時間、scDb-SpA_Dでは9時間、およびscDb-SpA_Bでは11.8時間という終末半減期と比較して、scDb-SpG_C3では23.3時間という終末半減期が決定された（図8）。scFv-IgBD融合タンパク質も、強く延伸された血中での循環を示した（図7b）。scDb-SpA_B、scDb-SpA_D、scDb-SpA_EZ4、およびscDb-Pp活性化合物L_C4*では1〜5時間である終末半減期と比較して、scFv-SpG_C3では20.8時間という終末半減期が決定された。

IL-2放出アッセイ
scDb融合タンパク質を、IL-2放出を誘発するその能力について、インビトロで分析した（図9）。健常ドナーの末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから前述のように単離した（Muellerら（2007）J. Biol. Chem. 282:12650-12660）。1×10⁵個のLS174T細胞/100μl/ウェルを96ウェルプレートに播種した。翌日、上清を取り除き、150μlの組換え抗体を加えた。37℃で1時間のプレインキュベーション後に、2×10⁵個のPBMC/50μl/ウェルを加えた。PBMCは前日に溶解して、培養皿に播種しておいた。懸濁状態で残っている細胞だけをアッセイに使用した。PBMCの添加後に、96ウェルプレートを37℃、5％CO₂で24時間インキュベートした。プレートを遠心分離し、無細胞上清を集めた。DuoSet IL-2 ELISAキット（R&D Systems）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、上清中のヒトIL-2の濃度を決定した。無修飾scDbと比較して、scDb-SpA_B、scDb-SpA_DおよびscDb-SpA_EZ4融合タンパク質は、ヒトIgGの非存在下で強く増加したIL-2放出を示した。これは、SpA_BドメインがPBMCの活性化を誘発することを示している（図9）。対照的に、scDb-SpG_C3は、scDbによって誘発されるIL-2放出を超えるIL-2放出を誘発しなかった。

SpG _C3 ミュータント
Ig Fcフラグメント（scDb-SpG_C3-Fab）またはIg Fabフラグメント（scDb-SpG_C3-Fc）に対する結合部位を欠くscDb-SpG_C3の変異体を、安定トランスフェクトHEK293細胞中で生産し、IMACによって精製し、ヒトIgG、IgG-FabフラグメントおよびIgG-Fcフラグメントへの結合について分析した（図10a）。scDb-SpG_C3およびscDb-SpG_C3-FcについてはヒトFcフラグメントへの結合を観察することができたが、scDb-SpG_C3-FabはhuIgFcに結合することができなかった。対照的に、scDb-SpG_C3およびscDb-SpG_C3-FabについてはヒトFabフラグメントへの結合を観察することができたが、scDb-SpG_C3-FcはhuIgFabに結合することができなかった（図10b）。scDb-SpG_C3-Fabを、実施例7で述べたように、CD1マウスにおける血漿中半減期について、さらに分析した。scDb-SpG_C3-Fabについて21.2±5.6時間（n＝3）という終末半減期が決定され（図10cおよびd）、野生型融合タンパク質の長い半減期（終末半減期23.3±5.9時間（n＝6））を保つには、免疫グロブリンのFabフラグメントへの結合があれば十分であることが実証された。

SpG _C3 -ダイアボディ-scTRAIL融合タンパク質
追加のリンカーによってヒトTRAILの単鎖誘導体に融合された抗EGFRダイアボディ（5残基GGGGSリンカーによってつながれたヒト化抗EGFR抗体huC225のVH-VLドメイン）に、SpG_C3を融合することによって、SpG_C3-ダイアボディ-scTRAIL融合タンパク質を生成させた（図11および図13）。精製と検出のために、このタンパク質はN末端にFLAGタグを含有する。融合タンパク質を安定トランスフェクトHEK293細胞に生産させ、抗FLAGアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。抗TRAIL抗体または抗FLAG抗体によるウェスタンブロットは、予想される分子量に相当する約100kDaの単一バンドを示した。精製融合タンパク質は、ELISAにおいて、ヒトIgGへの強い結合を示し、タンパク質のN末端に融合した場合も、SpG_C3ドメインは機能的であることが実証された。

scDb-SpG _C3 とscDb-ABD _H との薬物動態特性の比較
IgBDと同様に、連鎖球菌プロテインG由来のアルブミン結合ドメイン（ABD）は、アルブミンに結合した時のFcRnによるリサイクリングによって、小さな組換えタンパク質の半減期を強く改善することが示されている（Storkら, 2007, Protein Eng. Des. Sel., 20, 569-576；Andersenら, 2010, J. Biol. Chem. 286, 5234-5241）。マウスおよびヒトアルブミンに対するアフィニティが改変されているABDのミュータントはいくつか記載されており、その半減期延長特性について試験されている（Jonssonら, 2008, Protein Eng. Des. Sel. 21, 515-527；Hoppら, 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834）。それらのなかでは、ABD_H（高いアフィニティを有するアルブミン結合ドメイン）が、最も良い薬物動態特性を示すことが判明しており、それゆえにこれが、比較に適した融合タンパク質と思われる。さらにまた、アルブミンに対するABD_Hのアフィニティは、IgGに対するSpG_C3のアフィニティに似ている（Hoppら, 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834）。そこで、本発明者らは、上記実施例7で述べたように、CD1マウスにおける単回投与i.v.注射（25μg/匹）後のscDb-ABD_HとscDb-SpG_C3の血漿中半減期を比較した（図16aおよびb）。最初の24時間で、scDb-SpG_C3は、scDb-ABD_Hの836±81％時間および無修飾scDbの56±15％時間と比較して、997±79％時間というAUCによって示される、有意に（p＜0.01）増加した血漿中濃度を示した（図16c）。加えて、初期血漿中半減期を（最初の3つの値を使って）算出したところ、scDb-ABD_H（1.5±0.5時間）と比較してscDb-SpG_C3（2.4±0.7時間）ではt_1/2αに1.6倍の増加が明らかになり、これは有意な相違であった（p＜0.05）（図16d）。融合タンパク質薬物動態の二相性プロファイルをさらに調べたところ、6時間〜24時間から算出して、scDb-ABD_Hでは20.6±11.5時間、scDb-SpG_C3では21.0±4.8時間という、非常に似た終末血漿中半減期が得られた。この知見は、SpG_C3融合タンパク質が、ABD_H融合タンパク質と比較して、AUCによって測定されるバイオアベイラビリティの増加をもたらす改良された初期分布相を有することを示している。

アルブミンまたはIgGの非存在下または存在下でのscDb-SpG _C3-Fab およびscDb-ABD _H によるIL-2放出の比較
IL-2放出アッセイを使って、T細胞を刺激する二重特異性抗CEA×抗CD3 scDb融合タンパク質の潜在能力を分析した。上記実施例8で述べたプロトコールに従って、scDb-SpG_C3-FabおよびscDb-ABD_Hを、0.1nMから31.6nMまでの範囲の異なるタンパク質濃度で使用した（図17）。参照分子としての無修飾scDbは、IgGまたはヒト血清アルブミン（生理的濃度の1/50を使用）の存在下で、IL-2放出の低減を示さないか、わずかな低減しか示さなかったが、scDb-ABD_Hは、HSAと共にプレインキュベートすると、シグナルの強い低減を示した。対照的に、Ig Fcフラグメントに対する結合部位を欠くSpG_C3変異体SpG_C3-Fabは、IgGの存在下でさえ、無修飾scDbと同様に、強い活性化を示したことから、SpG_C3-Fabは、エフェクターT細胞をリターゲティングする二重特異性分子の半減期延長には、とりわけ適していること、およびこのドメインが確立されているABDドメインより優れていることが実証された。

配列番号1：SpGのC3ドメインのアミノ酸配列：
TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE
配列番号2：C3-Fcのアミノ酸配列：
TTYKLVINGKALAGATTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE
配列番号3：C3-Fabのアミノ酸配列：
TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAAAAFAQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE
配列番号4：KabatによるEUインデックスでヒトIgγ1分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Gly Pro Ser Val Phe Pro ... Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
配列番号5：KabatによるEUインデックスでヒトIgγ2分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Gly Pro Ser Val Phe Pro ... Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
配列番号6：KabatによるEUインデックスでヒトIgγ3分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Gly Pro Ser Val Phe Pro ... Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
配列番号7：KabatによるEUインデックスでヒトIgγ4分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Gly Pro Ser Val Phe Pro ... Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
配列番号8：KabatによるEUインデックスでマウスIgγ1分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Pro Pro Ser Val Tyr Pro ... Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
配列番号9：KabatによるEUインデックスでマウスIgγ2a分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Ala Pro Ser Val Tyr Pro ... Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
配列番号10：KabatによるEUインデックスでマウスIgγ2b分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Ala Pro Ser Val Tyr Pro ... Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
配列番号11：KabatによるEUインデックスでマウスIgγ3分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Ala Pro Ser Val Tyr Pro ... Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg
配列番号12：KabatによるEUインデックスでラットIg g1分子のアミノ酸位置122〜127および207〜214：
Ala Pro Ser Val Tyr Pro ... Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
配列番号13：scFv-SpG-C3（抗CEA）のアミノ酸配列
配列番号14：scDb-SpG-C3（抗CEA×抗CD3）のアミノ酸配列
配列番号15：SpG-C3-Db-scTRAIL（抗ヒトEGFR）のアミノ酸配列
配列番号16：SpGのC1ドメインのアミノ酸配列：
配列番号17：SpGのC2ドメインのアミノ酸配列。

Claims

（i）免疫グロブリン（Ig）結合部分と
（ii）医薬活性部分と
を含み、Ig結合部分がIg分子の重鎖の定常ドメイン1（C_H1）に特異的に結合する複合体。
Ig結合部分がIg分子のC_H1ドメインの表面露出領域に特異的に結合する、請求項1に記載の複合体。
Ig結合部分がIg分子のFc部に特異的に結合する、請求項1または2に記載の複合体。
Ig分子がIgG分子、好ましくはIgG1、IgG2、またはIgG4分子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の複合体。
Ig結合部分が、EUインデックスでIg分子のアミノ酸位置122〜127および/または207-214によって形成されるエピトープに特異的に結合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体。
Ig結合部分が、免疫グロブリン結合ドメイン（IgBD）、好ましくは連鎖球菌由来IgBDを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の複合体。
Ig結合部分が連鎖球菌プロテインGのC_H1結合性IgBDを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
Ig結合部分が配列番号1のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体。
医薬活性部分が生物学的および/または化学的医薬を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の複合体。
生物学的医薬が医薬活性ポリペプチド、好ましくは抗原結合分子である、請求項9に記載の複合体。
抗原結合分子が、抗体フラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖可変フラグメント（scFv）、ジ-scFv、二重特異性T細胞エンゲイジャー（BITE）、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、DART、トリプルボディ、代替足場タンパク質、およびその融合タンパク質からなる群より選択される、請求項10に記載の複合体。
該抗原結合分子が、放射性部分、細胞毒性薬、キレート部分、光増感剤、またはイメージング試薬をさらに含む、請求項10または11に記載の複合体。
該抗原結合分子が、アポトーシス促進タンパク質、免疫（共）刺激タンパク質、免疫抑制タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、毒素、成長因子または酵素、好ましくはRNase、プロドラッグ変換酵素またはキナーゼをさらに含む融合タンパク質である、請求項11または12に記載の複合体。
Ig結合部分と医薬活性部分とが共有結合または非共有結合によってつながれている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の複合体。
Ig結合部分と医薬活性部分とが直接的にまたは1つ以上のリンカーによって間接的につながれている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の複合体。
1つ以上のリンカーがペプチドリンカー、好ましくはフレキシブルなペプチドリンカーを含む、請求項14または15に記載の複合体。
1つ以上のペプチドリンカーが1つ以上の切断部位、好ましくは1つ以上のエンドペプチダーゼ切断部位を含む、請求項16に記載の複合体。
請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体をコードする配列を含む核酸分子。
請求項18に記載の核酸を含むベクター。
請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体、請求項18に記載の核酸、および/または請求項19に記載のベクターを含む細胞。
請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体、請求項18に記載の核酸、請求項19に記載のベクターおよび/または請求項20に記載の細胞を含む医薬組成物。
医薬上許容される担体および/または賦形剤ならびに場合によっては1つ以上の追加活性物質をさらに含む、請求項21に記載の医薬組成物。
血清中半減期、好ましくは終末血清中半減期の延長に使用するための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体、請求項18に記載の核酸、請求項19に記載のベクター、請求項20に記載の細胞、請求項21〜22のいずれか一項に記載の医薬組成物。
医薬品として使用するための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の複合体、請求項18に記載の核酸、請求項19に記載のベクター、請求項20に記載の細胞、請求項21〜22のいずれか一項に記載の医薬組成物。