JP2013532989A - 羊水由来多能性幹細胞の単離及び自己免疫疾患の処置又は予防におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、羊水由来多能性幹細胞の単離、及びＩ型糖尿病又は炎症性病態などの自己免疫疾患の処置又は予防におけるその使用に関する。

Description

本発明は、羊水由来多能性幹細胞の単離、新しい種類のそのように単離した多能性幹細胞、及びＩ型糖尿病又は炎症性病態などの自己免疫疾患の処置又は予防におけるその使用に関する。

免疫系は、自己抗原に対する寛容状態と病原性抗原に対する免疫状態との繊細な平衡によって特徴づけられている。免疫寛容の誘導は、外因性抗原及び自己抗原に対する免疫系の制御されない応答が誘発される自己免疫病態の処置及び予防において重要な現象である。実際、自己反応性Ｔリンパ球のあるサブセットは、抗原親和性の低下及び末梢レベルでの遊走によって胸腺欠損へと逸脱する場合があることが知られている。活性化後、これらのＴリンパ球が自己免疫をもたらす場合がある。したがって、Ｔリンパ球の機能調節及び活性化は、寛容と自己免疫との間の平衡を決定するものであり、Ｔ細胞の反応性のモジュレーションを目的とする治療戦略を研究する場合は考慮しなければならない（Ｐｕｃｃｅｔｔｉ Ｐ．ら、２００７、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：８１７〜８２３）。

Ｉ型糖尿病はヒト自己免疫疾患のプロトタイプであるとみなされている。この自己免疫病態は、インスリンを産生する膵島のβ細胞に影響を与える（Ｋａｔｚ Ｊ．Ｄ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７４：１０８９〜１１００）。最近の研究により、寛容の制御に関与する特定の経路の活性化による、島に指示される自己免疫応答のモジュレーションが、自己免疫応答のモジュレーションだけでなく膵島の再生ももたらし得ることが指摘されている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ Ｋ．Ｅら、２００８、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、３０：６１７〜６２０）。したがって、同じことが糖尿病患者における膵臓β細胞機能の修復に関連していることがありうるため、糖尿病患者における自己免疫応答のモジュレーションを目的とする新しい治療手法は興味深い目標である（Ｈａｒｄｉｋａｒ Ａ．Ａ．、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、１５：１９８〜２０３;Ｄｏｒ Ｙ．ら、２００７、Ｓｃｉ ＳＴＫＥ（４１４）：ｐｅ６６）。ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、この二重機能を活性化させるための有効な治療ツールでありうることが示唆されている。最近の研究により、自己免疫病態を予防するこれらの細胞の能力が実証されている（Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ．ら、２００８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ、４４８：７１〜７３;Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍ．Ａ．ら、２００９、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、６０：１００６〜１０１９）。これらのエフェクター免疫調節性応答の活性化が基づいている機構のうち、主要な役割は、ＭＳＣ、特にヒトＭＳＣにおけるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ｄｉｏｘｉｇｅｎａｓｅ）（ＩＤＯ）酵素の活性化によって実施される（Ｊｏｎｅｓ Ｂ．Ｊ．ら、２００７、Ｐｌａｃｅｎｔａ、２８：１１７４〜１１８１）。ＩＤＯは、開始反応を触媒し、「キヌレニン経路」を介してトリプトファン分解を制限するヘム基を含有する細胞内酵素である（Ｇｒｏｈｍａｎｎ Ｕ．ら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４２〜２４８）。ＩＤＯは、いくつかのヒト組織並びにマクロファージ及び樹状細胞中で高レベルで発現され、様々な炎症性状態においてＩＦＮ−γ及び他の炎症誘発性サイトカインによって誘導され、自然及び適応免疫応答の調節の重要なエフェクター系と考えることができる。これは寛容を誘導するための数々の方法のうちの１つしか表していないが、トリプトファン異化の免疫抑制経路は、妊娠及び着床の成功並びに自己免疫の有効な制御に寄与することが実証されている（Ｋａｔｚ Ｊ．Ｄ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７４：１０８９〜１１００）。

用語「幹細胞」とは、無制限に増殖することができ、１つ又は複数の細胞種へと分化することができる細胞をいう（Ｍｉｍｅａｕｌｔ Ｍ．ら、２００６、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２４：２３１９〜２３４５）。幹細胞は、一般的に、その可能な発生に基づいて全能性から単能性までに分類される。全能性の幹細胞は、哺乳動物中では接合体又は未熟な割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒ）によって代表され、胚性（体性系及び幹細胞系）並びに胚外の両方のすべての組織を含めた、完全な生物を生じる潜在能を有する。胚性のものを含めた多能性幹細胞は、３つの胚芽層に由来するすべての生物細胞型に分化することができるが、これは完全な生物をもたらすことができない。内肺葉、中胚葉及び外胚葉起源のいくつかの組織において同定されている複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞は、限定されたセットの細胞系を生じる能力を有し、単能性幹細胞は１つの成熟細胞型のみに発生することができる（Ｓｏｌｔｅｒ Ｄ．、２００６、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．、７：３１９〜３２７）。幹細胞は、その起源に応じて、２つの群、すなわち胚性（ＥＳＣ）又は成体幹細胞（ＡＳＣ）へと分類することができる。ＥＳＣは多能性であり、胚発生の初期段階における胚盤胞内細胞塊に由来する（Ｃｏｌｅ Ｒ．Ｊ．ら、１９６５、妊娠の着床前期（Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）（Ｗｏｌｓｔｅｎｈｏｌｍｅ，Ｇ．Ｅ．Ｗ．及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．編）８２〜１２２（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９６５）、Ｃｏｌｅ Ｒ．Ｊ．ら、１９６６、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１３：３８５〜４０７、Ｅｖａｎｓ Ｍ．Ｊ．ら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１５４〜１５６、Ｂｏｎｇｓｏ Ａ．ら、１９９４、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、９：２１１０〜２１１７、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜１１４７）。ＥＳＣは細胞表面抗原（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＢＥＴＷＥＥＮ２−５４）及び転写特異的因子（ＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ−２、ＦＧＦ４、ＲＥＸ１）を発現する。さらに、ＥＣＳは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対称的に、無制限に、分化せずに分裂するために適しており、免疫抑制したラットにおいて奇形癌の起源となるために適している。倫理的、道徳的、政治的な問題及び腫瘍原性が、現在これらの細胞を細胞治療に使用することを制限している。

ＡＳＣは、ほぼすべての成体組織中に存在する特定のニッチ中に存在し、その複能性を維持することができる（Ｊｏｎｅｓ Ｄ．Ｌ．ら、２００８、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９：１１〜２１）。その分化潜在能及び増殖能力は、胚性のものと比較した場合に制限されている。

過去数年間の間に、ＥＳＣ及びＡＳＣのどちらの使用にも関する制限を克服するために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）と命名された再プログラミングした成体細胞及び間葉系幹細胞によって代表される幹細胞の代替源が探索されている。ｉＰＳ細胞はＥＳＣから「分子的」及び機能的に識別不能であり、現在、そのような細胞の安全性を評価することを目的とした数々の研究が実施されている。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、胎盤及び羊水を含めたいくつかの組織から単離することができる複能性幹細胞である（Ｂｉａｎｃｏ Ｐ．ら、２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０５：１６６３〜１６６８；Ｉｍ Ｇ．Ｉ．ら、２００５、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１３：８４５〜５３、Ａｎｋｅｒ Ｐ．Ｓ．ら、２００４、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２２：１３３８〜１３４５）。ＭＳＣは、多数の細胞系の起源となる潜在能についてよく知られており、近年では、その特徴づけ（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ Ｍ．ら、２００６、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、８：３１５〜３１７）により臨床使用が可能となった。しかし、ＭＳＣの治療的応用は、様々な成体組織から入手可能な細胞数が少ないこと、増殖能力の低下、及び引き抜き採取の侵襲性、特に延髄穿刺の侵襲性が原因で制限されている（Ｒａｏ Ｍ．Ｓ．ら、２００１、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．、１２２：７１３〜７３４）。過去数年間の間に同定され、異論がでていない他の幹細胞源は、胎膜（胎盤）及び羊水である。出生前経路の遺伝子診断の残留材料の使用はいかなる倫理的、道徳的又は政治的な問題も含まないため、この最後の幹細胞源は特に興味深い。ｉＰＳ細胞などのように特定の操作を必要とせずに、胚性幹細胞に匹敵する複製時間を有する複能性及び／又は多能性幹細胞を、羊水から単離することが可能である。

現在までに２種類の幹細胞集団、すなわち間葉系幹細胞（ＡＦＭＳＣ）及び幹細胞（ＡＦＳ）が羊水から単離されている。どちらも、さらなる技術的操作なしに初代細胞（形質転換又は不死化されていない）として使用することができる。ＡＦＭＳＣは典型的なＭＳＣ特徴、すなわち、線維芽細胞に類似の形態、クローン原性能力、複能性、免疫抑制性特性、膜抗原及び典型的な間葉遺伝子の発現を示す。他方で、ＡＦＳは、ＥＳＣ及びＡＳＣの中間の特徴を有する多能性細胞である（Ｂａｊａｄａ Ｓ．ら、２００８、Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．、２：１６９〜８３；Ｓｉｅｇｅｌ Ｎ．ら、２００７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．、３：２５６〜２６４、Ｃａｎａｎｚｉ Ｍ．ら、２００９、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ、補遺１８、１：１７〜２７）。前記細胞は、ＥＳＣマーカー及びＭＳＣマーカーの両方並びに機能的特徴を発現する。これは、胚全体を表す細胞系に分化することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ着床後に腫瘍を形成しない（Ｃａｎａｎｚｉ Ｍ．ら、２００９、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ、補遺１８、１：１７〜２７）。

羊水から前記２種類の幹細胞を単離する様々な方法が存在する（Ｓｅｓｓａｒｅｇｏ Ｎ．ら、２００８、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９３：３３９〜３４６；Ｒｏｅｌｅｎ Ｄ．Ｌ．ら、２００９、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７０：１６〜２３；Ｏｒｃｉａｎｉ Ｍ．−Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏら、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．、２１：５９５〜６０２）。最も一般的に使用されているプロトコルはＤｅ Ｃｏｐｐｉ（Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ Ｐ．ら、２００７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１００〜１０６、Ａｔａｌａ Ａ．及びＤｅ Ｃｏｐｐｉ Ｐ．の特許、「絨毛膜絨毛、羊水、及び胎盤からの胎児幹細胞の単離、拡大及び分化方法並びにその治療的使用（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｕｓ，ａｍｎｉｏｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄ，ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」、ＥＰ１４４２１１５号）によるものであり、これは、２ステップ、すなわち、最初にｃ−ｋｉｔ陽性細胞（ＣＤ１１７）の免疫学的選択、続いてそのような細胞の培養拡大に基づく。

他の単離手順は最初の免疫学的選択を含まず、間葉系幹細胞の成長に特異的な培地中で培養するために細胞を３〜５ｍｌの新鮮な羊水中に配置することを含む（Ｏｒｃｉａｎｉ Ｍ．ら、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．、２１：５９５〜６０２）。

新鮮な羊水を使用しない単離手順がＴｓａｉによって報告されている（Ｔｓａｉ Ｍ．Ｓ．ら、２００４、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、１９：１４５０〜１４５６、題名「羊水から間葉系幹細胞を単離するための２段階の培養プロトコル（Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄ）」の特許、２００６年９月５日の米国特許第１０１，７１０，Ｂ２号）。Ｔｓａｉの手順は、細胞遺伝学的出生前診断プロトコルから生じる初代培養後の懸濁細胞の使用を含む。続いて前記細胞を遠心分離し、特別な培地中で培養する。

直前に記載した単離手順は一部の不利点を有する：
−出生前診断による生体材料の減少（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）。ルーチンな出生前診断により、引き抜き採取される羊水の量は約１５〜２０ｍｌである。Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ及びＯｒｃｉａｎｉ−Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏのプロトコルによる幹細胞の単離には、羊水部分を直接引き抜き採取するか、又は羊水穿刺の実施時に得る液体量を増大させなければならない。細胞成長の低下が起こる場合、材料の減少は診断目的にとって不利となる可能性がある。Ｔｓａｉによる手順では、出生前診断において、潜在的なさらなる一次遺伝子分析調査のために使用可能な細胞の別の不可欠な供給源を与えるために使用される細胞を使用する。
−Ｄｅ Ｃｏｐｐｉのプロトコルによるｃ−ｋｉｔを使用した幹細胞選択は、著者の提案と比較して単純ではあるが高価な技法を含む市販のキットを使用する（市販のキットは非常に高価である）。
−すべての既知の手順は、出生前診断の結果が知られる前に幹細胞（ＡＦＭＳＣ、ＡＦＳ）を選択する、すなわち、分析は、これらの細胞が染色体又は遺伝子の病態を示すか否かの知識なしに実施される。

したがって、上記に鑑みて、既知のものの不利点を克服する、幹細胞の新しい単離手順を提供する必要性が明らかである。

本発明の著者らは、今回、羊水の異種細胞混合物から幹細胞を単離する手順を開発した。本発明者らは、出発材料、すなわち新鮮な羊水であるか出生前診断の経路の終了時の培養残留物であるかに依存せずに羊水由来幹細胞（ＨＡ−ＳＣ）を入手することができる。他の手順とは異なり、出生前診断の終了時にＨＡ−ＳＣの入手が可能なことで、ＨＡ−ＳＣを入手する手順を開始する前に羊膜細胞の遺伝子構成を知ることが可能となり、したがって、細胞治療又は幹細胞バンクでの貯蔵に使用不可能な培養物の処理が回避される。さらに、本発明者らによって提案される方法は、既知の手順と比較して、時間及び金銭の両方に関して経済的である。より詳細には、本発明者らは、２つの多能性幹細胞の集団（ＨＡ−ＳＣ）を単離することができ、その主な表現型の差異は異なる増殖能力である。一方の集団は約１０〜１８時間の複製時間を示す一方で、他方は同じ培養条件下で約３０〜３６時間を示す。したがって、２つの細胞集団は羊水由来速（ｆａｓｔ）幹細胞（ｆＨＡ−ＳＣ）及び羊水由来遅（ｓｌｏｗ）幹細胞（ｓＨＡ−ＳＣ）と命名されている。どちらのＨＡ−ＳＣも、細胞治療に使用することを可能にする特徴を示す、すなわち、多能性があり、腫瘍細胞へ形質転換されず、とりわけ、末梢Ｔ細胞の増殖及び生存に対して恒常的、局在的且つＩＤＯ依存的な制御を発揮することができ、抗原及び臓器に特異的な寛容も促進する。さらに、これらはどちらも、免疫調節機能に重要なＴＧＦ−β１サイトカイン（ベータ１トランスフォーミング成長因子）を異なった量産生することができる。ｓＨＡ−ＳＣ細胞は、既に記載したＡＦＳＣと複製時間を含めて多くの類似性を示す一方で、ｆＨＡ−ＳＣは、著しい複製時間の差異（同じ実験条件下）のみが原因で、ＡＦＳとは異なる。ｆＨＡ−ＳＣは、高い複製潜在能が原因で、既知のものとは異なる幹細胞種を表す。高い増殖能力により、多数の細胞を短期間で得ることが可能であるため、ｆＨＡ−ＳＣが細胞治療で使用するために特に興味深く有用なものとなる。このｆＨＡ−ＳＣの独特な特性は、他方では、すべての他の非胚性幹細胞に固有の制限である。

本発明によれば、幹細胞は、自由意志で診断的理由のために羊水穿刺に供され、インフォームドコンセントに署名した妊娠第１６〜１７週目の女性からの羊水試料から単離する。幹細胞の単離手順は、特定の形態及びコロニー形状を有する細胞の選択からなる。これらのコロニーは、新鮮な羊水のアリコート、又は出生前診断の終了時に残る細胞培養物、すなわち、出生前診断のストックとして使用され、分析結果（又は報告書）の送達後に廃棄される羊水の細胞培養物を使用した培養によって得ることができる。

新鮮な羊水のアリコートを使用する場合は（３〜５ｍｌ）、試料を遠心分離し、細胞を収集し、適切な培地中で６〜７日間培養する。適切な培養培地の例は、（１）ＣＨＡＮＧ、２）ＭＳＣＧＭ（商標）（ＬＯＮＺＡ）、３）αＭＥＭ＋Ｃｈａｎｇ：１８％のＣｈａｎｇＢ、２％のＣｈａｎｇＣ、１５％の幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミンを添加したαＭＥＭ、４）ＤＭＥＭ：１０％の幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミンを添加したＤＭＥＭ、５）αＭＥＭ：幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミン）を添加した１０％のαＭＥＭである。

前記培養期間後、羊水中に存在する細胞の一部のみがａｍｎｉｏｄｉｓｈ（登録商標）（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）に接着し、形態的に異なるコロニーの起源となる（図１）。本発明の方法によれば、特定の形態を示しているコロニーのみを選択し、幹細胞特異的培地中で培養する。

目的のコロニーの起源となる細胞は、新鮮な羊水だけではなく、出生前診断の残留培養物中にも見つけることができる。出生前診断手順に従って、羊水（約１５〜２０ｍｌ）を遠心分離し、４ｍｌのＣｈａｎｇ培地中に再懸濁させ、ａｍｎｉｏｄｉｓｈ（登録商標）上で４つの初代培養物に分割する。６日間の培養後、ａｍｎｉｏｄｉｓｈ（登録商標）の表面に接着している細胞を出生前分析に使用する一方で、羊水由来の一部の懸濁細胞を含有する培養培地を収集し、２５ｃｍ^２の細胞培養用ファルコンフラスコ中に入れ、これに１ｍｌの新鮮なＣｈａｎｇ培地を加え、診断の完了時までＣＯ_２インキュベーター内に保つ。二次採収培養物と命名されたこの培養物は、診断の完了時までさらに６〜９日間ＣＯ_２インキュベーター内に残す。この診断完了期間中に、既に接着していない細胞は接着し、複製によって、形態的に異なるコロニーの起源となることができる（図１）。

上述のように、本発明による方法は、新鮮な羊水だけでなく、予備診断の終了時に廃棄される回収二次培養物も使用することができる。以下に、出生前診断方法の説明的なスキーム並びに本発明及び当分野の既知の方法に従って幹細胞の単離に使用した出発材料を報告する。

本発明による方法は、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に似た図２ａに報告したものに類似している必要がある、線維芽細胞様及びコロニー形状でなければならないという、倒立光学顕微鏡を用いた細胞形態の検査に基づく選択を含む。ｆＨＡ−ＳＣを得るためには、図２ａに報告された特定の形状を有する２つのコロニーの培養物のみを使用し、他方で、上記の前記コロニーを示さないすべての他の細胞培養物はｓＨＡ−ＳＣの起源となる。

必ずしも十分な数のコロニーが存在するわけではないため、すべての培養物をｆＨＡ−ＳＣの単離に使用することはできない。同種ｆＨＡ−ＳＣ細胞系を得ることができる培養物の数は非常に少なく、著者の観察によれば羊水の約１％である（１０００個を超える試料）。

出生前診断手順の終了時に二次採収培養物から選択された培養物において、Ｃｈａｎｇ培養培地を、αＭＥＭ＋Ｃｈａｎｇ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭＳＣＧＭ（商標）などの幹細胞特異的培地で交換する。

ｆＨＡ−ＳＣは非常に速く増殖し、上皮又はｓＨＡ−ＳＣ細胞などのすべての他の培養細胞種より高度にコンピテントであり、最大３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ継代培養後にｆＨＡ−ＳＣが培養細胞の９５％より多くを表し（図３）、事実上同種細胞系となる。ｓＨＡ−ＳＣは、幹細胞特異的培地中で増殖するが、均一性に達することはない。１つの羊水試料からは１種類の独立した細胞集団を単離することが可能であり、両方は可能でない。上記報告した単離手順は、新鮮な羊水又は出生前診断経路の残留培養物を使用して同じ結果を与えるが、選択の前に材料を培養する期間は異なる（前者及び後者の場合で６〜８及び１８〜２０日間）。このことは、ＨＡ−ＳＣを単離する可能性にも、同じ試料から様々な時点で様々なＨＡ−ＳＣ種を入手する機会にも影響を与えない。

本発明による細胞単離手順は、既知の技法と比較して複数の利点、特に以下を提供する：
１）ＨＡ−ＳＣは、新鮮な羊水から及び出生前診断の終了時の両方において選択することが可能である。出生前診断の終了時の二次採収培養物の使用が、以下の理由により好ましい：
ａ）選択材料は、それが廃棄されるにもかかわらず出生前診断の終了時に回収されるため、通常の診断手順を妨げない、
ｂ）さらなる量の羊水を羊水穿刺によって引き抜き採取することを必要としない、
ｃ）出生前診断の終了時の物質の使用により、染色体又は遺伝子の病態を有さない対象からの幹細胞のみを含めることが可能となる。したがって、病態を含まない出発材料を使用することが可能である。さらに、細胞治療に使用不可能な潜在能を有する培養物の単離が回避されるため、さらなるコスト削減がもたらされる。さらに、ルーチンな遺伝子調査中に検出された病態を研究実験モデルのベースにすることも可能である、
ｄ）出発試料中に存在する幹細胞のパーセンテージを増加させる。３〜５ｍｌの新鮮な羊水の代わりに１５〜２０ｍｌの羊水を起源とする回収培養物が使用可能であることにより、出発試料中に存在する幹細胞の数が増加する。
２）本発明の方法は、培養物の顕微鏡選択に基づいて一貫した結果が得られる可能性を提供する。
３）細胞形態及びコロニー形状の顕微鏡観察による前選択は、ｆＨＡ−ＳＣの起源となる確率がより高い培養物の経済的且つ素早い同定システムである。
４）羊水穿刺による出生前診断は幅広く使用されている手順であるため、羊水は容易に入手可能である。
５）本発明の方法は、治療的又は研究使用のための胚の破壊に関する倫理的懸念を克服する。

本発明の方法に従って単離されるどちらのＨＡ−ＳＣ細胞型（ｓＨＡ−ＳＣ、ｆＨＡ−ＳＣ）も、表現型：成長プロット、複製時間、膜マーカー、多能性マーカー、免疫学的特性が特徴づけられている。

ＨＡ−ＳＣの複製能力は、様々な培養培地及び様々な細胞量を使用して評価されている。図４は前記２つの細胞種の複製時間を示し、時間値は２つの細胞集団で非常に異なっており、ｓＨＡ−ＳＣでは３０〜３６時間であり（図４Ａ）、ｆＨＡ−ＳＣでは１０〜１８時間である（図４Ｂ）。前記図中から見ることができるように、ＭＳＣＧＭ及びαＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ培地を使用した細胞の成長プロットは、複製能力に対する培養培地の効果を指摘しているが、それでも集団の差異は依然として残る。逆に、異なる細胞量を使用した場合には、有意な差異は検出されなかった。

他の非胚性幹細胞と比較したｆＨＡ−ＳＣ種の細胞の高い増殖能力により、これが任意の実験手順及び細胞治療において特に適したものとなる。

ＨＡ−ＳＣ細胞は以下の特徴を有する：
ａ）以下のマーカーを発現する：ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４。逆に、これは、ＳＳＥＡ３、クラスＩＩ ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４９ｄ（図５Ａ〜Ｂ）について陰性である。
ｂ）ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）のメッセンジャーを発現するが、対応するタンパク質を決定することは必ずしも可能ではない。この最後のものは、一部のｓＨＡ−ＳＣ細胞系中でのみ検出されている。ＣＤ１１７を発現するｓＨＡ−ＳＣ細胞系は、細胞の２２％でそうであった（図５Ｃ）。
ｃ）主な多能性関連転写因子、すなわち、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＦＧＦ５、ＦＧＦ４、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ４、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、Ｎｏｄａｌを発現するため、多能性細胞である。多能性因子は、ＫＬＦ４がｆＨＡ−ＳＣによってより高いレベルで、すなわちｓＨＡ−ＳＣの約４００倍で発現される以外は、２つの集団によって有意な差異なしに発現される。
ｄ）胚性及び成体の幹細胞と比較して中間の特性を示す。
ｅ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の通常の手順の結果として細胞生存度の変化をまったく示さない。いずれにしても前記２つの細胞集団は互いに異なり、ｆＨＡ−ＳＣは１５０世代を超えて連続的に培養することができる一方で、ｓＨＡ−ＳＣは２０世代を超えない。
ｆ）長期間、すなわち２年を超える凍結解凍サイクルの後にも表現型の改変を受けない。
ｇ）通常のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養手順及び凍結解凍サイクル後に染色体安定性を示す。
ｈ）胚性幹細胞とは対照的に腫瘍原性を示さない。
ｉ）低レベルのクラスＩ ＭＨＣ複合抗原及びクラスＩＩ ＭＨＣ複合抗原の発現の非存在の結果として、低い免疫原性プロフィールを有する。
ｌ）樹状細胞及びマクロファージなどの造血細胞系と比較して、特に炎症誘発性刺激との接触後に、高レベルのＩＤＯ酵素を発現する。ｆＨＡ−ＳＣの独特な特徴は、ＩＤＯ酵素の２つの形態（ＩＤＯ１及びＩＤＯ２）の構成的発現である（図６）。ＩＤＯが存在するおかげで、ＨＡ−ＳＣは、糖尿病などの自己免疫病態の処置において、寛容原性応答の強力なエフェクターの役割を果たす。局在的トリプトファン欠乏とアポトーシス促進性代謝物（キヌレニン）の放出との組合せにより、ＨＡ−ＳＣは、末梢Ｔ細胞の増殖及び生存に対して更新された恒常的、局在的且つＩＤＯ依存的な制御を発揮することができ、抗原及び臓器に特異的な寛容も促進する。
ｍ）特に炎症誘発性刺激との接触後に、高レベルのＴＧＦβ１を発現する。著者らは、ＨＡ−ＳＣをスフィンゴシン−１−リン酸シグナル分子によって刺激して、ＩＤＯ及びＴＧＦβ１を産生させることができることを最初に実証した。
ｎ）ＩＮＦγ（アポトーシス促進性サイトカイン）を用いた刺激後、ＨＡ−ＳＣはアポトーシス細胞のパーセンテージの減少を示し（図７）、特に、ｆＨＡ−ＳＣに関して、複製細胞のパーセンテージの増加及びＫＬＦ４発現の増加が注目される。

本発明による幹細胞を一義的に同定及び分類することを可能にするために、文献中に記載のように、ＨＡ−ＳＣの複数の表現型的及び機能的特徴をＡＦＳ及びＡＦＭＳＣと比較した。特に、比較は、同じ実験条件下で、細胞形態、複製時間、表面又は細胞内（タンパク質）抗原、多能性分子マーカー（ｍＲＮＡ）、免疫調節における機能的役割に関して実施した。比較実験は例４に記載されており、表１に概要が示されている。得られた結果は、ｓＨＡ−ＳＣは既に文献に記載されている細胞とより類似している一方で、ｆＨＡ−ＳＣはユニークな特徴を示し、新しい種類の羊水由来幹細胞を表すことを示唆している。

文献に記載されているようにＨＡ−ＳＣと他の幹細胞種とを比較することで、１）表面マーカー、２）得られた細胞培養物の均一性、３）分子マーカー、４）複製時間、５）免疫学的特性に関する一部の差異が示される。

１）表面マーカー。
Ｏｒｃｉａｎｉ−Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏら（Ｏｒｃｉａｎｉら、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２１：５９５〜６０２）及びＴｓａｉら（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００４、１９：１４５０〜１４５６）による単離手順を使用してＣＤ１０５陰性ＡＦＭＳＣが得られ、ＣＤ１０５とは、ＭＳＣの細胞治療の国際学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ＭＳＣｓ）の指針によれば、対象細胞について９５％より高く陽性でなければならない膜抗原である（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ Ｍ．ら、２００６、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、８：３１５〜３１７）。さらに、Ｔｓａｉらによって得られた幹細胞は、２つの基礎的な抗原、すなわちＣＤ９０及びＣＤ１１７について弱く陽性である。また、Ｓｅｓｓａｒｅｇｏら（Ｈａｅｍａｔｏｌｇｉｃａ、２００８、９３：３３９〜３４６）によって記載されているように、低レベルのＣＤ４４及びＣＤ１０５が、ＡＦＭＳＣによっても発現される。Ｄｅ Ｃｏｐｐｉに従って得られたＡＦＳとは対照的に、一部のｓＨＡ−ＳＣ培養物を除いては、ＨＡ−ＳＣはＣＤ１１７タンパク質を発現しない。

２）細胞培養物の均一性。
Ｓａｓｓａｒｅｇｏら（Ｈａｅｍａｔｏｌｇｉｃａ、２００８、９３：３３９〜３４６）は、その手順による細胞系は、寸法及び形態に関して異なる様々な細胞部分集団を含有すると主張している。同様の結果が本発明者らによってｓＨＡ−ＳＣに関して得られている一方で、ｆＨＡ−ＳＣは９５％均一であることが証明されている（図５Ｄ）。

３）分子マーカー。
Ｔｓａｉら（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２００４、１９：１４５０〜１４５６）は、その手順に従って単離したＡＦＭＳＣはＯＣＴ４のｍＲＮＡを発現するが、部分集団中でのみタンパク質を検出することが可能である一方で、本発明によるすべての得られたＨＡ−ＳＣは常にＯＣＴ４タンパク質を９９％のパーセンテージで発現すると主張している（図５ｂ）。

４）複製時間。
ＨＡ−ＳＣ、ＡＦＳ及びＡＦＭＳＣの同じ実験条件下での複製時間が評価されている。その比較によれば、任意の実験条件下で、ｓＨＡ−ＳＣは、ＡＦＳ及びＡＦＭＳＣについて既に記載されているものに類似の３０〜３６時間の平均複製時間を有する一方で（Ｒｏｕｂｅｌａｋｉｓ Ｍ．Ｇ．ら、２００７、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．、１６：９３１〜９５２；Ｃａｎａｎｚｉ Ｍ．ら、２００９、Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ．、補遺１８、１：１７〜２７）、ｆＨＡ−ＳＣは、他の細胞よりも著しく短い１０〜１８時間の複製時間を有すると推論することが可能である。

５）免疫学的特性。
ＡＦＳＣは、ＭＳＣに匹敵し、したがってしばしば免疫抑制性である特徴を有するが（Ｒｏｅｌｅｎ Ｄ．Ｌ．ら、２００９、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７０：１６〜２３）、免疫調節性特性は記載されていない。本発明によるＨＡ−ＳＣの革新的態様は、Ｔリンパ球特異的集団の分化に関連する免疫調節能力からなる。Ｒｏｅｌｅｎら（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００９、７０：１６〜２３）は、ＩＤＯを産生するが、ｍＲＮＡのみが検出可能でタンパク質は検出されない非常に低いレベルで産生する、ＡＦＭＳＣの能力を記載している。逆に、ＨＡ−ＳＣは、注目に値する基底レベルのＩＤＯ酵素（ＩＤＯ１又はＩＤＯ２）を産生し、ＩＮＦγの誘導後、発現レベルは樹状細胞又は胎盤由来細胞などの造血細胞系よりも高い値に達する。

結論として、ｓＨＡ−ＳＣは既知の技術に記載されている細胞に類似の特徴を有する一方で、ｆＨＡ−ＳＣは新しい種類の細胞である。ｆＨＡ−ＳＣの新規性は、その高い複製能力並びに免疫抑制性及び免疫調節性の特性によるものである。

自己免疫起源の病態、すなわちＩ型糖尿病にもｆＨＡ−ＳＣが治療効果を発揮するかどうかを検証するために、これらのデータに基づいて、ＮＯＤマウス（肥満でない糖尿病性の実験モデル、Ｉ型糖尿病）に関する１セットの研究を実施した。実際、ｆＨＡ−ＳＣは拒絶に対する自己保護能力を有するが、それは免疫適格マウスでは異種移植を表し、したがって宿主の免疫抑制を必要としないことに注目するのは興味深い。他方では、ＮＯＤマウスでは、同系の間葉細胞（すなわちマウス由来）が保護活性を発揮するという証拠が存在する。

結果がこの仮説を裏付けており、実際、ＮＯＤマウスに接種したＨＡ−ＳＣは、５カ月後に、拒絶も新生物の成長も誘発していなかった。ＨＡ−ＳＣは膵臓中で検出されており（リンパ節又は脾臓中ではない）、これらはホーミングプロセス後に局在化される。自己免疫炎症の標的臓器である膵臓では、これらの細胞は炎症プロセスの低下を誘導する。

したがって、ＮＯＤマウスで得られた実験データは、標的部位でのみ免疫及び炎症反応を阻害し、炎症領域内のサイトカイン勾配に従った遊走（ホーミングプロセス）を介した損傷組織の修復を促進する能力からもたらされる、ｆＨＡ−ＳＣの治療潜在能を実証する。したがって、本発明によるｆＨＡ−ＳＣは局所的免疫抑制を誘導するために適している。局所的免疫抑制は、患者にとって全身性のものよりもはるかに有利であるとみなされ、これは、後者は感染症の危険性を増加させる可能性があるためである。さらに、ｆＨＡ−ＳＣによる免疫応答の局所的調節は組織再生を促進し、内在性幹細胞を損傷部位に動員し、成体細胞中の局所幹細胞の分化を誘導することができる。

通常の細胞治療では、細胞拒絶及び標的臓器中での局在化の問題が存在する。これらの問題は、本発明による幹細胞の独特な特徴のおかげで克服されている。実際、低い免疫学的プロフィールを有するそれは、外来であると認識されないため宿主によって拒絶されず（免疫障壁を克服）、ホーミングプロセスを実施する能力のおかげで、標的臓器中に独立して局在することができる。これらは、自己免疫疾患を治療するためのその使用を可能にする基礎的な特徴である。

現在、自己免疫病態の決定的な処置は利用可能でない一方で、異常な免疫患者の応答は、対象の組織及び重要臓器を慢性的且つ不可逆的に損傷させる。

ヒト羊水由来の幹細胞は、１セットの特異的細胞前駆体（多能性幹細胞）を供給することによって失われた組織財産を再構成すると同時に、患者において免疫学的欠損の根底にある自己免疫を補正するという、二重の意図を有する。本発明の著者らによって得られたデータは、特定の単離方法によって得られた細胞を単に投与するだけで、糖尿病性動物において免疫応答の生理的な再バランス化がもたらされることを示唆している。

したがって、本発明の特定の目的は、
ａ）出生前診断手順の終了時に羊水由来細胞の二次採収培養物を採取するか、又は新鮮な羊水からの細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、
ｂ）光学顕微鏡観察によって、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状を示す少なくとも２つの細胞コロニーを有する接着細胞培養物を選択するステップと、
ｃ）ステップｂ）で選択された細胞培養物を単離し、幹細胞用の培養培地中で培養するステップと、
ｄ）細胞コロニーを形成する幹細胞の少なくとも９０％が弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状をした細胞コロニーを得るために、十分な回数の継代培養をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施するステップを含む、又はそれからなる、羊水の異種細胞混合物から多能性幹細胞を単離する方法である。一般に、同種培養物を得るためには２回又は３回の継代培養が十分である。

上記に列挙した理由により、ヒト細胞の調製には、ステップａ）で、出生前診断手順の終了時の羊水由来細胞の二次採収培養物を使用することが好ましい。多能性幹細胞を動物から調製する場合は、新鮮な羊水を使用することができる。

羊水由来幹細胞に適した培養培地は、たとえば以下のとおりである：
−Ｃｈａｎｇ（Ｃｈａｎｇ培地組成Ｃｈａｎｇ培地：塩７９００ｍｇ／ｌ、デキストロース１４００ｍｇ／ｌ、アミノ酸７８１ｍｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン２１９ｍｇ／ｌ、ポリペプチド６６ｍｇ／ｌ、ビタミン２２ｍｇ／ｌ、デオキシリボヌクレオシド２１ｍｇ／ｌ、リボヌクレオシド２０ｍｇ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム１１０ｍｇ／ｌ、他の構成成分８ｍｇ／ｌ、ホルモン及び微量元素０．０００２５ｍｇ／ｌ、ステロイドホルモン０．００１３ｍｇ／ｌ、新生ウシ血清６％ｖ／ｖ、ウシ胎仔血清６％ｖ／ｖ。前記培地はキットとして市販されており、凍結乾燥した添加剤（Ｃ）及び基本培地（Ｂ）の２つの構成成分からなり、これらを合わせる、
−ＭＳＣＧＭ（商標）（ＬＯＮＺＡ）、
−αＭＥＭ＋Ｃｈａｎｇ（αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ培地組成：１８％のＣｈａｎｇＢ、２％のＣｈａｎｇＣ、１５％の幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミン）を添加したαＭＥＭ（アール塩、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミンなし））、
−ＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、ピルビン酸ナトリウムを含み、Ｌ−グルタミンなしのＤＭＥＭ：１０％の幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミンを添加したＤＭＥＭ）、
−αＭＥＭ（αＭＥＭ培地組成：１０％の幹細胞用ウシ胎仔血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタミンを添加したαＭＥＭ）。

幹細胞には、ＭＳＣＧＭ（商標）（ＬＯＮＺＡ）、αＭＥＭ＋Ｃｈａｎｇ、ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、αＭＥＭが好ましくは使用される。

上記定義した方法に従って入手可能な羊水由来多能性幹細胞は本発明のさらなる目的を表し、前記細胞は、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に似た形状を有する細胞コロニーを形成することを特徴とする。

本発明による多能性幹細胞は、アルファ−ＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ培地中で約１０±２時間の複製時間を有することを特徴とする。さらに、前記細胞は、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ｃＭｙｃ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、Ｎｏｄａｌ、ＡＬＰマーカーを発現し、クラスＩＩ ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ３マーカーを発現しないことを特徴とする。

本発明は、上記定義した多能性幹細胞を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと一緒に含む、又はそれからなる医薬組成物にさらに関する。医薬組成物は、インプラントの形態で、たとえばアルギネート錠として調製することができる。さらに、組成物は、上記定義した多能性幹細胞に由来するトリプトファン代謝物をさらに含むことができる。

本発明による多能性幹細胞又は医薬組成物は、医学及び獣医学の分野において、特に、糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症などの自己免疫炎症性疾患を処置又は予防するために使用することができる。さらに、本発明による多能性幹細胞又は医薬組成物は、臓器移植の拒絶に対する予防（移植片対宿主病ＧＶＨＤ）において使用することができる。

以下に、本発明を、その好ましい実施形態に従って、例示的であるが限定的でない方法によって記載し、同封した図面を詳細に参照する。

出生前診断の手順において羊膜細胞培養物から得ることができる様々な種類のコロニーを示す図である。 本発明による多能性幹細胞の単離方法に従って選択する細胞形態及びコロニーの形状を示す図である。 選択して皮膚紋理学と比較するコロニーの形態を示す図であり、上パネルは弓状、突起弓状の皮膚紋理（又はモノデルタ）を示し、下パネルは弓状紋の皮膚紋理学（又はデルタ）を示す。 ２回の継代培養後に本発明に従って単離した速多能性幹細胞（ｆＨＡ−ＳＣ）の細胞培養物を示す図である。 本発明による単離した多能性幹細胞の成長プロット及び複製時間を示す図である。図では、ＭＳＣＧＭ及びαＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ培地を使用して得られた結果を報告している。 本発明による多能性幹細胞の表現型の特徴づけを示す図である。 図５Ａは幹細胞マーカーを示す図である。 図５Ｂは胚性及び多能性マーカーを示す図である。 図５ＣはｓＨＡ−ＳＣ中でのＣＤ１１７タンパク質の発現を示す図である。 本発明による多能性幹細胞におけるＩＤＯの発現を示す図である。 図６ＡはＩＮＦγ誘導後のＩＤＯの発現を示す図である。 図６Ｂは胎盤幹細胞及び絨毛膜絨毛におけるＩＤＯの発現を示す図である。 図６ＣはｆＨＡ−ＳＣにおけるＩＤＯ１及びＩＤＯ２のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図６ＤはＳ１Ｐ誘導後のＨＡ−ＳＣにおけるＩＤＯの誘導を示す図である。 ヨウ化プロピジウム試験を示す図である。 本発明による多能性幹細胞（ｆＨＡ−ＳＣ）の存在及び様々なｆＨＡ−ＳＣ用量で処置したＮＯＤマウスの膵臓におけるリンパ球浸潤の、細胞蛍光測定アッセイを示す図である。 図８Ａは、それぞれＮＯＤ対照マウス又は２×１０^６若しくは５×１０^６個のｆＨＡ−ＳＣで処置したものの脾臓組織を、ヒト細胞に特異的なＣＤ１０５又はＨＬＡ抗体を使用して分析した図である。 図８Ｂは、同じ膵臓組織を、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋リンパ球細胞浸潤の存在について分析した図である。 ＮＯＤマウスの尾側領域中に接種した、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを用いて形質移入したｆＨＡ−ＳＣを示す図である。 図９Ａは、投与の２０分後の細胞の局在化を示す図である。 図９Ｂは、投与の３０時間後の細胞の局在化を示す図である。３０時間後の細胞はホーミング効果により膵臓内にのみ遊走した。 様々な細胞形態の比較を示す図である。形態の比較は、Ｏｒｃｉａｎｉ−Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏの手順に従って単離した細胞以外は（この場合は本発明者らが手順に従って細胞を単離し、その後に画像を獲得した）、それぞれの著者らによって公開された画像を使用して実施した。

（例１）羊水由来幹細胞の単離方法
幹細胞の単離方法は、新鮮な羊水の一部を使用した、又は出生前診断手順の終了時に残る細胞培養物を使用した培養物を起源とする、コロニーの特定の形態及び形状を有する細胞の選択に基づく。

出生前診断の手順
羊水（約１５〜２０ｍｌ）を遠心分離し、４ｍｌのＣｈａｎｇ培地中に再懸濁させ、ａｍｎｉｏｄｉｓｈ（登録商標）上で４つの初代培養物に分割する。６日間の培養後、ａｍｎｉｏｄｉｓｈ（登録商標）の表面に接着している細胞を出生前分析に使用する一方で、残りの羊水の一部の懸濁細胞を依然として含有する上清を回収し、２５ｃｍ^２の細胞培養フラスコ中に入れ、１ｍｌの新鮮なＣｈａｎｇＣ培地を加え、診断手順が完了するまでＣＯ_２インキュベーター内に保つ。回収培養物と命名されたこの培養物は、診断が完了する間、さらに６〜９日間ＣＯ_２インキュベーター内に静置する。この期間中に、依然として接着していない細胞は接着し、複製によって、異なる形態を有するコロニーの起源となることができる（図１）。

本発明による多能性幹細胞の単離方法
本発明による方法は、基礎的なステップとして、出生前診断手順の終了時の二次採収培養物からの、光学倒立顕微鏡を使用した観察による、図２ａに例示した形状を示すコロニーの選択を含む。図２ａに示すように、選択するコロニーは、似た形状のフィンガープリント（皮膚紋理学）を有するものである。特に、コロニーの形態は弓状（ａｒｃ）皮膚紋理（又はデルタ）及び突起弓状（ｔｅｎｔｅｄ ａｒｃ）（又はモノデルタ）皮膚紋理に類似している。弓状（ａｒｃ）又はデルタ線は互いに隣り合って波状となる一方で、突起弓状（ｔｅｎｔｅｄ ａｒｃ）（又はモノデルタ）線は弓状（ａｒｃ）に類似であるが、その間に突起（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｔｉｃｋ）が存在する（２ｂ）。さらに、前記コロニーの細胞形態はフィブロプラスト（ｆｉｂｒｏｐｌａｓｔ）に類似している。ｆＨＡ−ＳＣを得るためには、上記前記形状を示す２つのコロニーを含む培養物のみを選択して使用する。上記の前記コロニーのいずれも示さないすべての他の細胞培養物はｓＨＡ−ＳＣの起源となる。

選択した培養物中のＣｈａｎｇ培養培地を幹細胞特異的培地（ＭＳＣＧＭ、Ｌｏｎｚａ株式会社）で交換し、いずれの場合でも上述したαＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭなどの他の幹細胞特異的培地も使用することができる。

特異的培地中の上述したコロニーの細胞は、３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ継代培養のみの後で既に、培養物中に存在する細胞の９５％より多くに達する（図３）。選択した培養物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ_２中で、３日ごとに培地を交換して、さらに培養する。細胞凍結は、５０％の胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、幹細胞に特異的）、１０％のジメチルスルホキシドを添加した培養培地を含有する混合物を使用して実施する。最初に細胞を−８０℃で３日間保存し、その後、液体窒素容器中に移す。

（例２）例１の単離方法から得られた細胞の特徴づけ。
複製時間の決定（図４）
複製時間（ＴＤ）は方程式ＴＤ＝ｔ×ｌｏｇ２／ｌｏｇ（Ｎｔ／Ｎ０）を使用して計算し、式中、Ｎ０は播種した細胞数を表し、ＮＴは、時間ｔに回収された細胞数である（Ｙｏｕ Ｑ．ら、２００９．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、３７：１０５〜１１２）。複製時間は、以下の培養培地：Ｃｈａｎｇ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ、ＭＳＣＧＭ、αＭＥＭを使用して、２つの異なる細胞量：１０００、２０００、５０００及び１００００個を用いて評価した。

Ｃｈａｎｇ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇを使用して得られた複製時間は非常に類似している一方で、ＭＳＣＧＭ培地では異なる値が得られた。したがって、続いて例示したデータは、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ及びＭＳＣＧＭを使用して得られた複製時間を指す。ｓＨＡ−ＳＣは、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ中では３０±３時間、ＭＳＣＧＭ中では３６±４時間の複製時間を有しており、他方で、ｆＨＡ−ＳＣは、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ中では１０±２時間、ＭＳＣＧＭ中では１４±３時間の複製時間を有している。異なる細胞量を使用した場合に有意な差異はなかった。

ＦＡＣＳを使用した表現型の特徴づけ（図５）
ＦＡＣＳを使用した表現型の特徴づけでは、細胞をモノクローナル抗体で標識し、ＥＰＩＣＳ細胞蛍光測定計及びＥＸＰＯ３２ＡＤＣソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して蛍光の読み取りを実施した。３×１０^５個の細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）とコンジュゲートしたモノクローナル抗体で標識した（３０分間、４℃でインキュベーション）。以下の抗体を使用した：ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、クラスＩＩ ＤＲ、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４。ＯＣＴ４は核タンパク質であり、したがって、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を細胞透過処理に使用した。

ＦＡＣＳを使用して得られた結果（図５）により、単離した細胞は、間葉系幹細胞マーカー及び一部の胚性マーカーについて陽性である一方で、造血起源の幹細胞の主なマーカーについて陰性であることが示されている。特に、細胞は、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４について陽性である一方で、クラスＩＩ ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ３について陰性である。

未分化胚細胞中で多能性が発現されていることに特異的な一部の分子マーカーの決定は、逆転写酵素反応、続いてＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって実施する。約１×１０^６個の細胞から、細胞蛍光測定計分析に使用したものと同じ回数の継代培養で、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した全ＲＮＡを抽出し、続いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍのプロトコルに従って、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＦＧＦ５、ＦＧＦ４、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ４、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、Ｎｏｄａｌ及びβ−アクチン陽性対照のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施する。表１はＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの配列を示す。

本発明者らが単離するすべての細胞系は、以下の表２の結果によって示される多能性マーカーを発現する。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ分析はＭｘ３０００Ｐ装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して実施する。反応は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、提案されたプロトコルに従って行う。すべての試料は、そのハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）に基づいて標準化する。

ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４遺伝子からのｍＲＮＡの相対的定量をｓＨＡ−ＳＣ及びｆＨＡ−ＳＣについて実施する。主にｆＨＡ−ＳＣによってｓＨＡ−ＳＣよりも４００倍高いレベルで発現されるＫＬＦ４を例外として、多能性遺伝子は細胞系中で同等に発現される。

ＩＤＯの決定
ＨＡ−ＳＣ（１×１０^６個の細胞）を１０μＭのＩＮＦγ又は１μＭのＳ１Ｐで終夜前処理する。ＩＤＯの決定を、定量的ＰＣＲ（図６ｄ）及びヒトモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた免疫ブロッティングを使用して、ｍＲＮＡについて実施する。結果はβ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の発現の決定によって標準化する。ＩＮＦγ又はＳ１Ｐで誘導したＩＤＯの機能的能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、トリプトファン加水分解の結果として酵素によって産生されるｌ−キヌレニンの濃度を測定（ｄｏｓｉｎｇ）することによって評価した。ｌ−キヌレニン代謝物の濃度は、ＨＰＬＣによって、Ｆａｌｌａｒｉｎｏらによって記載されているプロトコルに従って決定する（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ，Ｆ．ら、２００３、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４：１２０６〜１２１２）。

ＩＤＯ１及びＩＤＯ２の決定は、以下のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって評価する。

図６Ａは、ＩＤＯ陽性対照及びβ−チューブリンと比較した、ＨＡ−ＳＣ中でのＩＤＯ発現の結果を示す。図６Ｂは胎盤及び絨毛幹細胞中のＩＤＯ発現の結果を示しており、図６ＣはＩＤＯ１及びＩＤＯ２を参照したＲＴ−ＰＣＲを示し、図６Ｄはβ−アクチンによる正規化後のＳ１Ｐ ＩＤＯ誘導を示す。

１×１０^６個の細胞から６時間の間に産生されたｌ−キヌレニンの平均量は０．２±０，００１６９μＭである。

ＴＧＦβ１の産生は、特異的ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して評価する。

２４時間かけてＩＮＦγで刺激したＨＡ−ＳＣは細胞増殖の増加を示す。ヨウ化プロピジウム試験を使用し、アポトーシス又は様々な段階の細胞サイクルに供された細胞のパーセンテージの評価を可能にして、以下が指摘されている：ｉ）ｓＨＡ−ＳＣでは、アポトーシス細胞のパーセンテージは３６％から１０％へと減少した、ｉｉ）ｆＨＡ−ＳＣでは、アポトーシス細胞の基底パーセンテージは非常に低い、すなわち３％であり、ＩＮＦγで刺激した後、対照と比較して細胞のさらに５％が分裂している。図７。２４時間かけてＳ１Ｐで刺激したｓＨＡ−ＳＣは、ＩＤＯ発現を非処理細胞よりも１５倍増加させる一方で、ｆＨＡ−ＳＣはより制限されたｍＲＮＡの増加を示す。

（例３）ＮＯＤマウスにおける幹細胞接種の効果に関する研究
ＮＯＤマウス
自己免疫性糖尿病は、ＮＯＤ／Ｍｒｋ雌マウスの８０％において２４週齢で起こる。血糖値＜２００ｍｇ／ｄｌ（糖尿なし）及び糖尿の存在下における３５０〜４００ｍｇ／ｄｌに等しい血糖値（少なくとも１週間安定して）により、前糖尿病性（５〜６）及び糖尿病性（＞１５週間）状態が定義される。１０日間を超えて血糖値を３５０〜４００ｍｇ／ｄｌに維持したＮＯＤマウスは、一度も外因性インスリンで処置しなかった様々な実験中に体重が有意な様式で変化する。ＮＯＤマウスを、経皮接種によってそれぞれ２×１０^６又は５×１０^６個のｆＨＡ−ＳＣを用いて処置する。血中グルコース濃度を、上記報告したように週に１回処置したマウスにおいて監視した。ＨＡ−ＳＣ及び膵臓リンパ球浸潤の両方による典型的なマーカーの発現を、例２に記載のように細胞蛍光測定を使用して分析する。

特に、膵臓試料を、膵臓レベルで特異的且つ十分に特徴づけられた白血球細胞浸潤を示す前糖尿病性の８〜９週齢のＮＯＤ雌マウスから引き抜き採取する。担体のみで処置した群で示されるように（図８）、興味深いことに、ＨＡ−ＳＣで処置したマウスは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の浸潤の有意な低下を示した。また、同様の興味深い様式で、マウスではなくヒト幹細胞に特異的な抗体で染色することによって、炎症の起源となっている臓器レベルでの細胞の存在を証明することも可能である。接種した細胞は、一方ではベータ細胞の再生に寄与することができ、他方では、ＩＤＯ及びＴＧＦ−β１などのサイトカインのように抗炎症経路の発現を介して、同じ部位で、やはり抗原特異的な様式で免疫応答を調節することができることを考慮すると、そのようなデータは非常に重要である。

ＨＡ−ＳＣのホーミングプロセスを実証するために、接種する細胞（電気穿孔）を、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを使用して形質移入する（ｐＧＬ４．５１（ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ）ベクター）。２４時間後に、そのように形質移入した細胞をマウスの尾側領域に接種し、ルシフェラーゼのみによって分解可能な適切な基質（ｖｉｖｏｇｌｏｗ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を動物に直接投与することによって監視する。続いて、蛍光シグナルを放射する陽性細胞をｘｅｎｏｇｅｎによって検出する。図９。

（例４）比較実験
ｓＨＡ−ＳＣ及びｆＨＡ−ＳＣを以下の論文中に報告されている実験条件下に供することによって、上述した著者らによって得られた表現型の特徴づけデータを、ＡＦＳ及びＡＦＭＳＣに関する文献データと比較する。
−Ｄｅ Ｃｏｐｐｉら、
−Ｋｉｍら（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ、２００７、４０：７５〜９０）。
−Ｓｅｓｓａｒｅｇｏら、
−Ｏｒｃｉａｎｉら
−Ｔｓａｉら

マーカーの発現に関する結果は表３及び４に報告されている。

表３は、細胞蛍光測定によって評価した一部のマーカーの発現結果を比較する。
Ｈ：高、Ｌ：低、ＮＤ：検出されず。パーセンテージの値は、集団中のマーカーを発現する細胞のパーセンテージを示す。

表４は多能性分子マーカーの発現結果を比較する。

１）表面マーカー。
Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏ及びＴｓａｉによる単離手順を使用して、ＣＤ１０５陰性ＡＦＭＳＣが得られる。さらに、そのような細胞はＣＤ９０及びＣＤ１１７に弱く陽性である。また、Ｓａｓｓａｒｅｇｏら（Ｈａｅｍａｔｏｌｇｉｃａ、９３：３３９〜３４６、２００８）によって記載されているように、低レベルのＣＤ４４及びＣＤ１０５がＡＦＭＳＣからも発現される。Ｄｅ Ｃｏｐｐｉによって単離されたＡＦＳとは対照的に、ｓＨＡ−ＳＣの一部の培養物を除いては、ＨＡ−ＳＣはＣＤ１１７タンパク質を発現しない。

２）細胞培養物の均一性。
Ｓａｓｓａｒｅｇｏら（Ｈａｅｍａｔｏｌｇｉｃａ、９３：３３９〜３４６、２００８）は、その研究において単離した細胞系は、大きさ及び形態に関して異なる細胞部分集団を含有すると主張している。同様の結果が本発明者らによってｓＨＡ−ＳＣに関して得られている一方で、ｆＨＡ−ＳＣは９５％均一であることが示されている。

３）分子マーカー。
Ｔｓａｉら（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、１９：１４５０〜１４５６、２００４）は、その研究において単離したＡＦＳＭＣはＯＣＴ４のｍＲＮＡを発現するが、彼らは１つの部分集団中でのみタンパク質を検出することができる一方で、本発明者らは、ＯＣＴ４タンパク質をすべてのＨＡ−ＳＣ中で９９％のパーセンテージで検出することができると主張している（図５ｂ）。

４）複製時間。
ＨＡ−ＳＣ及びＡＦＳ及びＡＦＭＳＣの同じ実験条件下での複製時間が評価されており、その比較によれば、すべての実験条件下で、ｓＨＡ−ＳＣはＡＦＳ及びＡＦＭＳＣについて既に記載されているものに類似の３０〜３６時間の平均複製時間を有する一方で、ｆＨＡ−ＳＣは、１０〜１８時間の、すなわち他のものよりも著しく短い複製時間を有することが論じられている。Ｃｈａｎｇ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ（Ｔｓａｉによって使用）、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ（Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ及び多くの他の著者らによって使用）培地を使用して得られた複製時間は非常に類似している一方で、ＭＳＣＧＭ培地（Ｏｒｃｉａｎｉ−Ｄｉ Ｐｒｉｍｉｏによって使用）では異なる結果が得られる。続いて例示したデータはαＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ及びＭＳＣＧＭを使用して得られた複製時間を指す。ｓＨＡ−ＳＣは、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ中では３０±３時間、ＭＳＣＧＭ中では３６±４時間の複製時間を有しており、他方で、ｆＨＡ−ＳＣは、αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ中では１０±２時間、ＭＳＣＧＭ中では１４±３時間の複製時間を有している。一部の著者は、複製時間は細胞濃度に応じて可変性であると主張している（Ｓａｓｓａｒｅｇｏ Ｎ．ら、２００９、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９３：３３９〜３４６）。著者らは、２つの異なる細胞濃度を使用して成長時間を評価し、有意な差異はなかった。

５）免疫学的特性。
ＨＡ−ＳＣの革新的態様は、リンパ球特異的集団の分化に関連する免疫調節能力からなる。Ｔ．Ｒｏｅｌｅｎら（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９、７０：１６〜２３）は、ＩＤＯを産生するが、ｍＲＮＡのみが検出可能でタンパク質は検出されないように非常に低いレベルで産生する、ＡＦＭＳＣの能力を記載している。逆に、ＨＡ−ＳＣは、注目に値する基底レベルのＩＤＯ酵素（ＩＤＯ１又はＩＤＯ２）を産生し、ＩＮＦγの誘導後、発現レベルは樹状細胞又は胎盤由来細胞などの造血細胞系よりも高い値に達する。

Claims (11)

1. ａ）出生前診断手順の終了時に羊水細胞の二次採収培養物を採取するか、又は新鮮な羊水からの細胞を適切な培養培地中で培養するステップと、
   ｂ）光学顕微鏡観察によって、弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状を示す少なくとも２つの細胞コロニーを有する接着細胞培養物を選択するステップと、
   ｃ）ステップｂ）で選択された細胞培養物を単離し、それらを幹細胞用の培養培地中で培養するステップと、
   ｄ）細胞コロニーを形成する幹細胞の少なくとも９０％が弓状又は突起弓状の皮膚紋理に類似の形状をした細胞コロニーを得るために、十分な回数の継代培養をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施するステップと
   を含む、又はそれからなる、羊水の異種細胞混合物から多能性幹細胞を単離する方法。
2. 弓状、突起弓状の皮膚紋理に似た形状を示す細胞コロニーを形成することを特徴とする、請求項１に記載の方法に従って入手可能な羊水の多能性幹細胞。
3. αＭＥＭ−Ｃｈａｎｇ培地中で約１０±２時間の複製時間を有することを特徴とする、請求項２に記載の多能性幹細胞。
4. ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ｃＭｙｃ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、Ｎｏｄａｌ、ＡＬＰマーカーを発現し、クラスＩＩ ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ３マーカーを発現しないことを特徴とする、請求項２から３までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
5. 請求項２から４までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと一緒に含む、又はそれからなる医薬組成物。
6. インプラントの形態の、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 請求項２から４までのいずれか一項に記載の多能性幹細胞に由来するトリプトファン代謝物をさらに含む、請求項５から６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 医学及び獣医学の分野において使用するための、それぞれ請求項２から４まで及び５から６までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。
9. 自己免疫疾患の処置又は予防において使用するための、それぞれ請求項２から４まで及び５から６までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。
10. 炎症性自己免疫疾患が糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症からなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための多能性幹細胞又は医薬組成物。
11. 臓器移植の拒絶の予防において使用するための、それぞれ請求項２から４まで及び５から６までに記載の多能性幹細胞又は医薬組成物。