CN106459908B - 来源于纯滋养层的干细胞及包含其的细胞治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层(除了绒毛膜绒毛以外的滋养层，chorionic trophoblast layer without villi，CT‑V)的干细胞及包含其的细胞治疗剂。与现有的来源于整个胎盘的干细胞相比，本发明的来源于纯滋养层的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，尤其，分化成软骨细胞的特性优秀，从而可有效用作用于治疗软骨损伤或软骨缺损等的细胞治疗剂及组织再生用组合物。

Description

来源于纯滋养层的干细胞及包含其的细胞治疗剂

技术领域

本发明涉及来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层(除了绒毛膜绒毛以外的滋养层，chorionic trophoblast layer without villi，CT-V)的干细胞及包含其的细胞治疗剂。

背景技术

最近生命工程将人类福利作为最终目标来提供可解决粮食、环境、健康问题的新解决办法，其中利用干细胞的技术正成为治疗顽固性疾病的新篇章。以前为了治疗人类的顽固性疾病而提出了脏器移植、基因治疗等，但由于免疫排斥反应和脏器供应不足、载体研发或者缺少针对疾病基因的知识而无法有效地应用。由此，提高了对干细胞的关注，从而认识到具有通过增殖和分化可形成所有器官的能力的全能干细胞既能治疗大部分的疾病又能从根本上解决脏器损害。并且，许多科学家们提出了通过使用干细胞既能实现人体的几乎所有脏器再生又能治疗帕金森病、各种癌、糖尿病和脊椎损伤等的多种可能性。

干细胞(stem cell)是指作为未分化的细胞具有自我复制能力及分化成两个以上的互不相同种类的细胞的能力的细胞。干细胞根据分化能力可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多潜能干细胞(pluripotent stem cells)、多能(多功能)干细胞(multipotent stem cells)，根据细胞学起源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来源于着床前受精卵或者生成中的胎儿生殖器组织等，相反，成体干细胞来源于成体中的各器官，例如，骨髓、脑、肝、胰脏等。

由于胚胎干细胞存在道德上的限制，因此在使用为细胞治疗剂的方面存在限制。与此相反，由于成体干细胞可主要从脂肪、脐带血、骨髓及胎盘等提取，从而不存在道德上的问题，尤其，存在于脂肪组织的脂肪干细胞和存在于分娩时胎盘的胎盘干细胞安全且分化能力优秀，因此可适用于改善现代医学难以治疗的作为不治之症的糖尿病、痴呆、退行性关节炎、心肌梗塞、脑梗塞、肾功能障碍等的多种细胞损伤疾病的症状。

其中，在上述干细胞为来源于胎盘的干细胞的情况下，利用分娩后废弃的胎盘，从而具有容易提取且可便于确保大量的干细胞的优点。在上述干细胞为来源于脂肪或骨髓的干细胞的情况下，受到所要分离、提取的捐献者的年纪或健康状态等影响而在增殖力或分化能力等上有限制，而且变动性多，但在来源于胎盘的干细胞的情况下，作为成体干细胞中可最早获取的干细胞，几乎不受到根据捐献者的年纪等的变数的干细胞干性影响，而且具有优秀的增殖力及分化能力。并且，来源于胎盘的干细胞可分离能够适用于神经系统疾病、肝病、肌肉骨骼疾病等多种疾病的干细胞组。

由于上述的优点，正积极进行与来源于胎盘的干细胞相关的研究。例如，在韩国专利授权第818214号中公开了利用含N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC，N-acrtyl-L-cysteine)培养基从羊膜或蜕膜分离干细胞的方法，在韩国专利授权第871984号中公开了利用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Basic Fibroblast Growth Factor)培养基培养来源于羊膜、浆膜、底蜕膜及胎盘组织的干细胞的方法，在韩国公开专利第10-2007-0052204号中公开了从胎盘滋养膜的胎盘绒毛(chorionic villi)分离干细胞的方法。但是，目前为止未执行针对来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的研究。

发明内容

发明要解决的课题

对此，本发明人为了在来源于胎盘的干细胞中也找到干细胞干性更优秀的干细胞而持续研究的结果，发现与现有的来源于整个胎盘的干细胞相比，来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层(除了绒毛膜绒毛以外的滋养层)的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，尤其，分化成软骨细胞的特性优秀，从而可有效用作细胞治疗剂，由此完成了本发明。

并且，本发明的目的在于，提供来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞。

本发明的另一目的在于，提供将来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂及组织再生用组合物。

用于解决课题的方法

为了实现上述目的，本发明提供来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞。

并且，本发明提供将来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂。

并且，本发明提供将来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的组织再生用组合物。

发明的效果

与现有的来源于整个胎盘的干细胞相比，本发明的来源于纯滋养层(除了绒毛膜绒毛以外的滋养层)的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，尤其，分化成软骨细胞的特性优秀，从而可有效用作用于治疗软骨损伤或软骨缺损等的细胞治疗剂及组织再生用组合物。

附图说明

图1作为示出胎盘的剖面的显微镜照片，示出了自上而下依次层叠有胎盘的羊膜上皮(amniotic epithelium，AE)、羊膜(amniotic membrane，AM)、绒毛膜(chorionicmembrane，CM)、纯滋养层(chorionic trophoblast layer without villi，CT-V)、绒毛膜绒毛(chorionic villi，CV)及蜕膜(decidua，DC)的形态。

图2为示出通过显微镜观察本发明的来源于纯滋养层(CT-V)的干细胞的继代培养之前(P0)的细胞形态与长时间继代培养之后(P28)的细胞形态的照片(X100)的图。

图3为示出通过显微镜观察来源于整个胎盘的干细胞的继代培养之间(P0)的细胞形态与长时间继代培养之后(P29)的细胞形态的照片(X100)的图。

图4为示出来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的集落形成单位的图。

图5为示出来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的群体倍增时间的图。

图6为示出本发明的用于确认来源于纯滋养层的干细胞的表面因子表达特性的流式细胞分析结果的图。

图7为示出用于观察来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的分化成脂肪细胞(Adipogenesis)、软骨细胞(Chondrogenesis)或骨细胞(Osteogenesis)的程度的各染色结果的图。

图8为示出为了观察来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的分化成软骨细胞的程度而利用番红O(Saparin-O)进行染色后进行定量化的结果的图。

图9为示出为了观察来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的分化成软骨细胞的程度而进行利用Ⅱ型胶原蛋白(Type II collagen)的免疫组织化学染色后进行定量化的结果的图。

图10为示出对来源于整个胎盘的干细胞及来源于纯滋养层的干细胞的分化成脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞的程度进行比较分析的结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明提供来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞。

在本发明中，“干细胞”是指具有自我复制能力及分化成两个以上的互不相同种类细胞的能力的细胞。干细胞根据分化能力可分为全能干细胞、多潜能干细胞、多能(多功能)干细胞。

在本发明中，“全能干细胞”是指如下的细胞，即，作为具有可发育为一个完整的个体的全能的性质的细胞，在完成卵子与精子的受精之后，使细胞直到8细胞期为止具有上述性质，而且若分离上述细胞并移植于子宫，则可使上述细胞增殖为一个完整的个体。在本发明中，“多潜能干细胞”是指如下的细胞，即，作为可增殖为来源于外胚层、中胚层、内胚层的多种细胞和组织的细胞，来源于位于在受精4～5日之后出现的胚泡(blastocyst)的内侧的内细胞团(inner cell mass)，将其称之为胚胎干细胞，而可分化成多种不同的组织细胞，但无法形成新生命体。在本发明中，“多能干细胞”是指只能分化成形成包含干细胞的组织及器官的特异性细胞的细胞。作为本发明的目的，优选地，上述“干细胞”为多能干细胞。

在本发明中，“胎盘(placenta)”是指怀孕期间为了胎儿而形成的生物体内组织，其呈重量为500～600g、直径为15～20cm、厚度为2～3cm左右的圆盘形态。胎盘的一侧与母体相接触，另一侧与胎儿相接触，在上述胎盘中，在母体的血液与胎儿的血管之间实现营养及氧的传递。胎盘可大致分为羊膜、绒毛膜、蜕膜的3层，更详细地，可分为羊膜上皮、羊膜、绒毛膜、滋养层、蜕膜。蜕膜为为了使受精卵着床于子宫而使子宫的上皮细胞变形来形成的膜。图1简要示出胎盘的剖面图。

在本发明中，“纯滋养层”是指在位于绒毛膜与蜕膜之间的滋养层中除了绒毛膜绒毛以外的组织。

可通过如下的方法获取本发明的来源于纯滋养层的干细胞，即，向从胎盘分离的纯滋养层组织添加酶溶液来进行酶反应，从而获取细胞，并在添加有胎牛血清及抗生剂的培养基中培养上述细胞，而不使用生长因子，然后进行回收来获取。

更具体地，可通过如下的步骤获取本发明的来源于纯滋养层的干细胞。

步骤(a)：从胎盘分离作为细微组织的纯滋养层。

步骤(b)：利用选自由胰蛋白酶(Trypsin)、胶原酶(collagenase)、分散酶(dispase)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、透明质酸酶(hyaluronidase)及弹性蛋白酶(elastase)组成的组中的一种以上的酶对被分离的上述纯滋养层组织进行处理来获取来源于纯滋养层的细胞。

步骤(c)：从所获取的上述来源于纯滋养层的细胞筛选干细胞。

以下，按各步骤对本发明的来源于纯滋养层的干细胞的制备方法进行具体的说明。

上述步骤(a)作为从胎盘分离作为细微组织的纯滋养层的步骤，虽然未特别限定分离方法，但上述分离方法可通过利用手术镊W、手术刀等的机械分离方法、利用酶处理的化学分离方法等来进行。并且，优选地，在步骤(a)之后，通过清洗被分离的上述组织来去除来源于胎盘的血液，此时，作为洗涤液可利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)，而且并不限定于此。

上述步骤(b)为利用选自由胰蛋白酶、胶原酶、分散酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶及弹性蛋白酶组成的组中的一种以上的酶对纯滋养层组织进行处理来获取来源于纯滋养层的细胞的步骤。上述胶原酶包括胶原酶A、胶原酶I、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅲ或胶原酶Ⅳ等。虽然未特别限定终止上述酶的反应的方法，但优选地，使用添加包含胎牛血清的培养基的方法。

上述步骤(c)作为从来源于纯滋养层的细胞筛选干细胞的步骤，虽然未特别限定筛选干细胞的方法，但优选地，可使用如下的方法，即，在培养容器中培养通过上述步骤(b)获取的来源于纯滋养层的细胞，并筛选以附着于上述培养容器的下部的方式附着培养的细胞。此时，作为培养时使用的培养基，可使用适用于干细胞的培养的所有培养基，虽然未对其进行特别限定，但优选地，使用未包含生长因子而包含血清及抗生剂的培养基。

根据本发明的一实施例，利用网过滤在上述步骤(b)中获取的细胞来去除未分解的组织，并利用添加有胎牛血清及抗生剂的培养基来进行清洗。在未包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的培养基中培养经清洗的上述细胞，并筛选附着于培养容器的底面的间充质干细胞。由于所筛选的上述间充质干细胞在外形上呈凸起及狭长的形态，因此具有与成纤维细胞(fibroblastic cells)类似的形态学特性。

本发明的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞具有如下的特征。

(a)成纤维细胞形状的形态学特征。

(b)以实现25至30以上的继代次数的方式可长时间增殖的能力。

(c)可分化成脂肪细胞、软骨细胞或骨细胞的能力。

(d)集落形成能力。

(e)对CD44、CD73、CD90及CD105的阳性免疫学特性。

(f)对CD31、CD34、CD45及HLA-DR的阴性免疫学特性。

本发明的来源于纯滋养层的干细胞可根据以下的方法分化成互不相同种类的细胞，例如，可分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞或肌腱细胞(tenocyte)等多种种类的细胞，但并不限定于此。

在本发明中，“分化(differentiation)”是指通常比较单一的系被分离成实质上不同的两种以上的部分系的现象，具体地是指细胞在通过分裂增殖来进行生长的过程中使不同的结构或功能特殊化的现象，即，生物的细胞、组织等为了执行各自担当的任务而改变形态或功能的现象。相对地，“未分化”是指未发生上述的分化现象且还保持作为干细胞的特征的状态。

可根据目前公知的方法来分化干细胞，对其不进行特别限制。例如，优选地可使用如下的方法，即，通过在包含地塞米松(dexametha sone)、吲哚美辛(indomethacin)、胰岛素及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，3-isobutyl-1-methylxanthine)的培养基培养上述干细胞来分化成脂肪细胞的方法；通过在包含地塞米松、骨形态生成蛋白-6(BM P-6，bonemorphogenetic protein 6)、转化生长因子-β(TGF-β，Tra nsforming growth factorbeta)、抗坏血酸(ascorbic acid)及L-脯氨酸(L-proline)的培养基培养上述干细胞来分化成软骨细胞的方法；在包含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸盐(β-glycrophosphate)及抗坏血酸-2-磷酸盐(ascorbic acid-2-phosphate)的培养基上述干细胞来分化成骨细胞的方法等。

虽然不特别限定测定通过上述方法被分化的来源于纯滋养层的干细胞的分化程度的方法，但可使用作为本领域公知的技术的流式细胞分析方法、免疫细胞化学方法、使用聚合酶链反应(PCR)或基因表达图谱来测定细胞表面标记或形态的变化的方法、使用光学显微镜或共聚焦显微镜来观察细胞的形态变化的方法、测定基因表达图谱的变化的方法等，优选地，可使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、油红O(Oil-red O)染色法、番红O(Safranin O)染色法、Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色法，碱性磷酸盐(ALP，alkalinephosphate)染色法或茜素红S(Alizarin red S)染色法等。

与现有的来源于整个胎盘的干细胞相比，本发明的来源于纯滋养层(除了绒毛膜绒毛以外的滋养层)的干细胞具有匀质的生长特性、优秀的增殖特性及分化特性，尤其，分化成软骨细胞的特性优秀。

因此，本发明提供将来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的细胞治疗剂。

被分化的上述细胞包括软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞、肌腱细胞等，可根据治疗目的选择适当的细胞。

本发明的术语“细胞治疗剂(cellular therapeutic agent)”是指如下的医药品，即，作为从人类分离或者通过培养及特殊操作制备的细胞及组织而以治疗、诊断及预防为目的使用的医药品(美国FDA规定)，为了复原细胞或组织的功能而在体外增殖筛选存活的自身细胞、同种细胞或异种细胞或者通过其他方法使细胞的生物学特性发生变化等的一系列操作，来使这些细胞适用于治疗、诊断及预防疾病的目的。

优选地，本发明的细胞治疗剂可用于治疗针对软骨损伤、软骨缺陷、骨缺损、肌腱-韧带缺损或脂肪组织缺损等。

在本发明中，“软骨缺陷”是指身体内的软骨产生损伤、缺陷(defect)或不足的情况，例如，包括软骨外伤、软骨断裂、软骨软化、软骨坏死、骨软骨炎、软骨缺损或骨关节炎等，但并不限定于此。

本发明的来源于纯滋养层的干细胞可用于使身体的组织或器官通过目的细胞群落例如干细胞或分化细胞群落的植入、移植或注入而被调整、强化、治疗或替代的多种种类的治疗方案。本发明的来源于纯滋养层的干细胞可通过替代或强化存在的组织使其成为新的组织或发生变化的组织或者使其与生物学组织或结构相结合。

并且，向关节内投入本发明的来源于纯滋养层的干细胞，从而治疗关节软骨的病变，或者，向肌腱或韧带部位投入上述干细胞，从而可适用于治疗或预防等的目的。例如，向关节、肌腱或韧带部位投入本发明的来源于纯滋养层的干细胞，从而实现针对上述组织的损伤部位的恢复或调整，而且可利用来源于本发明的纯滋养层的干细胞的软骨组织结构物等来源于干细胞的物质，以使关节(例如，膝盖关节等)的组织重组或再生等的方法进行治疗。

本发明的细胞治疗剂的优选剂量随个体的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间而异，但可通过本领域普通技术人员选择适当的剂量。给药次数可以为一天一次，也可分次进行给药，上述剂量不管在任何方面都不限制本发明的范围。

并且，本发明提供将来源于纯滋养层的干细胞或从上述干细胞分化的细胞作为有效成分包含的组织再生用组合物。

虽然未特别限定上述组织，但可包括软骨、脂肪、骨、神经、韧带、肌腱等的组织，优选地为软骨。

上述软骨包括透明软骨(hyaline cartilage)、纤维软骨(fibro cartilage)或弹性软骨(elastic cartilage)等，例如，可以为关节软骨(articular Cartilage)、耳软骨、鼻软骨、胳膊肘软骨、半月板软骨(meniscus)、膝盖软骨、肋软骨、踝关节软骨、气管软骨、喉软骨或脊椎软骨，但并不限定于此。

以下，通过下述实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于详细说明本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例。

实施例1：获取来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞

胎盘是根据韩国三星首尔医院临床试验伦理委员会指南从在韩国三星首尔医院同意捐赠的剖腹产正常分娩的产妇收集的。将胎盘组织放入经灭菌的容器并移动。从移动的胎盘组织去除羊膜后，分离位于绒毛膜(CM)与蜕膜(DC)之间的滋养层，利用经过灭菌的手术镊W和手术刀小心地分离上述滋养层中除了绒毛膜绒毛之外的纯滋养层。图1示出胎盘的剖面图。

利用磷酸缓冲盐溶液多次清洗所分离的纯滋养层组织，从而去除血液及血球细胞后，将组织尽可能切成小块，然后投入添加0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基，在37℃温度下，利用搅拌器反应2～3小时，从而获取来源于纯滋养层的细胞。

利用70μm的网过滤所获取的上述来源于纯滋养层组织的细胞，从而去除未分解的组织，在投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基后，在25℃的温度下，以1000rpm离心分离4分钟。在去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基，在37℃的温度下，在5％的CO₂条件下进行培养。在上述培养物中筛选附着于培养容器的底面的细胞，从而获取来源于纯滋养层的干细胞。

比较例1：获取来源于整个胎盘的干细胞

切碎整个胎盘组织，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，从而从胎盘组织去除血液及血球细胞。向所清洗的上述胎盘组织投入添加有0.2％的胶原酶的达尔伯克改良伊格尔培养基，在37℃的温度下，利用搅拌器进行反应，从而获取胎盘细胞。利用70μm的网过滤所获取的上述胎盘细胞，从而去除未分解的组织，在投入添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基后，在25℃的温度下，以1000rpm离心分离4分钟。在去除上清液后的所沉淀的细胞中投入不包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基，在37℃的温度下，在5％的CO₂条件下进行培养。在上述培养物中筛选附着于培养容器的底面的细胞，从而获取来源于整个胎盘(Whole placenta，Pla)的干细胞。

实施例2：继代培养来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞

利用磷酸缓冲盐溶液清洗在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞后，每2～3日更换未包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基并进行培养。在上述干细胞生长80％以上的时点上实施TryPLE处理，并从培养容器分离干细胞，在以1/4的比率稀释所分离的干细胞之后，以在其他培养容器进行培养的方法进行继代培养。重复进行如上所述的继代培养，并测定不再进行继代培养的继代次数(passage number)，用显微镜观察继代培养之前(P0)与长时间继代培养之后的细胞形态。并且，利用在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘的干细胞，以相同的方法进行继代培养后，用显微镜观察继代培养之前(P0)与长时间继代培养之后的细胞形态。图2及图3分别示出上述细胞形态。

如图2所示，本发明的来源于纯滋养层的干细胞呈现成纤维细胞形状的形态学特征，且具有继代次数达到28的优秀的增殖能力，从而确认到可进行长时间培养。

并且，如图3所示，可确认到来源于整个胎盘的干细胞从继代培养初期呈现成纤维细胞形状的形态特性且混合有多个互不相同的形态的细胞，而不是一个形态。即，与本发明的的来源于纯滋养层的干细胞(图2)相比，在继代培养前后，来源于纯滋养层的干细胞仅特异性维持单一的细胞，但来源于整个胎盘的干细胞混合有互不相同形态的细胞。

实施例3：来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的集落形成能力分析

确认了在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的集落形成能力。更具体地，以上述实施例2的方法对在上述实施例1中获取的来源于纯滋养层的干细胞进行第一次继代培养，在完成上述继代培养的时点上，在100mm的盘分别接种(seeding)5×10³个后，在未包含生长因子且添加有胎牛血清及抗生剂的达尔伯克改良伊格尔培养基培养10日。将所培养的上述干细胞为对象进行吉姆沙染色法(Giemsa stain)，从而对形成在干细胞的群落进行计数并计算它们的平均值。并且，利用在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘的干细胞，以相同的方法测定集落形成能力，并将它的结果值换算成100％。图4示出了其结果。

如图4所示，确认了本发明的来源于纯滋养层的干细胞相比于来源于整个胎盘的干细胞具有更优秀的集落形成能力。

实施例4：来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的群体倍增时间分析

测定了在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的群体倍增时间。更具体地，对在上述实施例1中获取的来源于纯滋养层的干细胞以上述实施例2的方法进行第一次继代培养，以2～3日为间距反复进行获取细胞以及继代培养。在获取细胞的过程中确认了所增加的细胞的数量，在继代时，在100mm的盘中培养3×10⁵个细胞。在继代过程中，将细胞数量不再增加的时点定为细胞数量最终不增加的时点。以从P2到P6的继代培养的细胞数量测定了倍增时间，并以如下式进行了计算。并且，利用在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘的干细胞，以相同的方法计算了群体倍增时间。图5示出其结果。

倍增时间＝培养的时间/倍增

倍增＝log(N_{初始细胞数量}/N_{增加的细胞数量})/log2

如图5所示，本发明的来源于纯滋养层的干细胞的群体倍增时间(populationdoubling time)短于来源于整个胎盘的干细胞的群体倍增时间，从而确认了本发明的干细胞的细胞增殖较快。

实施例5：来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的表面标志分析

为了确认在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的免疫学特性，而进行了如下的实验。首先，利用磷酸缓冲盐溶液清洗来源于纯滋养层的干细胞，实施TryPLE处理后，收集干细胞，并以1000rpm离心分离4分钟。去除上清液后，为了抑制非特异性结合而添加2％的胎牛血清(FBS)及磷酸缓冲盐溶液的混合液，清洗干细胞后，以1000rpm离心分离5分钟。去除上清液后，将干细胞悬浮于磷酸缓冲盐溶液，并以1×10⁵cell分株于流式细胞仪专用圆底烧瓶。向其分别添加抗体(PE标记的小鼠抗人单克隆抗体，PE-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)，在冰块中孵化30分钟后，以1000rpm离心分离5分钟。重新去除上清液后，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，并以1000rpm离心分离5分钟。反复进行2次上述步骤。最后，去除上清液后，使干细胞单一化，并利用流式细胞仪(FACS)来分析免疫学特性。并且，利用相同的方法分析在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘的干细胞的免疫学特性。如表1及图6示出其结果。

表1

CD31

CD34

CD45

CD73

CD90

CD105

HLA-DR

CD44

胎盘

0.0％

0.0％

0.0％

97.5％

98.0％

100.0％

0.0％

92.9％

纯滋养层

0.0％

0.0％

0.0％

99.1％

98.0％

100.0％

0.0％

97.0％

如表1及图6所示，确认到本发明的来源于纯滋养层的干细胞对CD44、CD73、CD90及CD105呈现阳性的标记因子表达特性，对CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈现阴性的标记因子表达特性。

实施例6：确认来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的分化成软骨细胞的能力

为了确认在上述实施例1中获取的来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞的分化成软骨细胞的能力，而在公知的软骨细胞分化诱导培养基(包含有0.1μM的地塞米松、50μg/ml的抗坏血酸、40μg/ml的L-脯氨酸、10ng/ml的转化生长因子-β3、500ng/ml的骨形态生成蛋白-6、50mg/ml的ITS通用型培养混合剂(ITS premix)的达尔伯克改良伊格尔培养基)中培养干细胞3周，从而诱导分化成软骨细胞。为了测定上述干细胞的分化成软骨细胞的程度，根据现有的公知的方法进行利用番红O染色及Ⅱ型胶原蛋白的免疫化学染色法。并且，以相同的方法测定在上述比较例1中获取的来源于整个胎盘的干细胞的分化成软骨细胞的能力。图7至图9示出其结果。

如图7至图9所示，确认到与来源于整个胎盘的干细胞相比，本发明的来源于纯滋养层的干细胞具有可更均匀地分化成软骨细胞的优秀的软骨细胞分化能力。

尤其，根据现有的公知的方法对来源于纯滋养层的干细胞和来源于整个胎盘的干细胞的分化成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的能力进行比较分析的结果，在分化成脂肪细胞或骨细胞的程度方面，来源于纯滋养层的干细胞与来源于整个胎盘的干细胞相似，但在分化成软骨细胞的能力方面，来源于纯滋养层的干细胞尤其优秀(图10)。

由此，在来源于整个胎盘的干细胞混合有来源于多种组织的具有互不相同的分化模式的干细胞，从而在提供所需要的细胞治疗效果方面有所欠缺，但在利用本发明的来源于纯滋养层的干细胞的情况下，可以仅利用具有匀质的特性的细胞，分化成软骨细胞的能力优秀，而且在适用于软骨损伤或需要软骨再生的疾病的细胞治疗剂的情况下，实现优秀的效果。

Claims (10)

1.一种干细胞，其特征在于，来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层，其中所述纯滋养层是从位于绒毛膜与蜕膜之间的绒毛膜滋养层去除绒毛膜绒毛的组织，所述干细胞对表面标记CD44、CD73、CD90及CD105呈阳性；且所述干细胞对表面标记CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈阴性。

2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，通过如下的步骤(a)、步骤(b)以及步骤(c)制备上述干细胞：

步骤(a)，从胎盘分离作为细微组织的纯滋养层；

步骤(b)，利用选自由胰蛋白酶、胶原酶、分散酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶以及弹性蛋白酶组成的组中的一种以上的酶对被分离的上述纯滋养层组织进行处理来获取来源于纯滋养层的细胞；

步骤(c)，从所获取的上述来源于纯滋养层的细胞筛选干细胞。

3.一种细胞治疗剂，其特征在于，包含来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞作为有效成分，其中所述纯滋养层是从位于绒毛膜与蜕膜之间的绒毛膜滋养层去除绒毛膜绒毛的组织，所述干细胞对表面标记CD44、CD73、CD90及CD105呈阳性；且所述干细胞对表面标记CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈阴性。

4.根据权利要求3所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述干细胞具有分化成软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、韧带细胞或肌腱细胞的能力。

5.根据权利要求3或4所述的细胞治疗剂，其特征在于，上述细胞治疗剂用于治疗软骨损伤、软骨缺陷、骨缺损、肌腱-韧带缺损或脂肪组织缺损。

6.根据权利要求5所述的细胞治疗剂，其特征在于，上述软骨缺陷为选自由软骨外伤、软骨断裂、软骨软化、软骨坏死、骨软骨炎、软骨缺损及骨关节炎组成的组中的一种以上。

7.一种组织再生用组合物，其特征在于，包含来源于作为胎盘的细微组织的纯滋养层的干细胞作为有效成分，其中所述纯滋养层是从位于绒毛膜与蜕膜之间的绒毛膜滋养层去除绒毛膜绒毛的组织，所述干细胞对表面标记CD44、CD73、CD90及CD105呈阳性；且所述干细胞对表面标记CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈阴性。

8.根据权利要求7所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述组织为选自由软骨、脂肪、骨、神经、韧带以及肌腱组成的组中的一种以上。

9.根据权利要求8所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述软骨为透明软骨、纤维软骨或弹性软骨。

10.根据权利要求8所述的组织再生用组合物，其特征在于，上述软骨为选自由关节软骨、耳软骨、鼻软骨、胳膊肘软骨、半月板软骨、膝盖软骨、肋软骨，踝关节软骨、气管软骨、喉软骨及脊椎软骨组成的组中的一种以上。