JP2012503978A

JP2012503978A - ヒトｆｇｆｒ４ａｒｇ３８８多形のための齧歯類癌モデル

Info

Publication number: JP2012503978A
Application number: JP2011528367A
Authority: JP
Inventors: ウルリッヒアクセル; マイアトーマス; シュトライトズィルヴィア; ザイツァーニナ
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2012-02-16
Also published as: WO2010034845A1; EP2169071A1; US20110179505A1; EP2344645A1

Abstract

本発明は、制御されていない細胞成長、例えば癌及び改変したＦＧＦＲ４に関連した分子機構及び生理学的プロセスを研究するための齧歯類動物を提供する。

Description

発明の詳細な説明
先行技術
繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）シグナリングシステムは、４つのレセプター（ＦＧＦＲ１−４）及び２０つより多くのリガンドから構成され、血管形成、有糸分裂誘発、分化及び発生を含む様々な生理学的プロセスの制御において関係している（１、２）。

ヒトの癌においては、このＦＧＦＲｓは過剰発現、例えば膵臓又は前立腺の癌腫（３−５）により、又は、異常な融合タンパク質又はヌクレオチド置換を生じる突然変異を活性化（６、７）することにより関係している。近年では、体性突然変異の他に、生殖細胞系突然変異、例えば、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）が、癌のような疾病にとって、しかしまた、治療薬剤に対する応答の決定においても（８、１０）、ますます重要性を認識されていることが明らかになった。

ヒトＦＧＦＲ４においては、コドン３８８における多形ヌクレオチド変化は、グリシン（Ｇｌｙ）をアルギニン（Ａｒｇ）へと、このレセプターの膜貫通領域、疾病関連配列変形のためのレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）におけるホットスポット、において置換する（１１）。このＦＧＦＲ４における単一置換は、様々な種類のヒト癌のプログレション及び不良な予後に関係することが示されている。ここで、Bange及び同僚らは、乳癌及び大腸癌の患者においてＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを腫瘍プログレッションと関連させることができた（１１）。同様に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを有する軟組織肉腫患者は、不良な臨床的結果を有した（１０）。メラノーマにおいては、このＡｒｇアレルは増加した腫瘍厚さ（tumour thickness）に関連し、一方で、頭部及び頸部の肉腫細胞癌腫においてはこのグリシン−アルギニン置換は減少した全体的な患者生存率及び進行した腫瘍段階を生じる。さらに、前立腺癌患者に対する最近の研究は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇアレルを腫瘍プログレッションとだけでなく、前立腺癌イニシエーションとも強力に関連させる。乳癌研究は、Ａｒｇアレルを、増進した疾病プログレッションとだけでなく、補助全身性又は化学療法（adjuvant systemic or chemotherapy）に対するより高い耐性とも初期の乳癌において相関させ、このことは、有意により短い疾病なしの及び全体的な生存を生じる（１１、１６）。

これら研究の主たる結論は、個人のゲノムにおける１又は２のＡｒｇ３８８アレルの存在は癌の発達（development）をイニシエーションさせないが、しかし、このキャリアーを、この疾病にかかった場合によりアグレッシブな形態にかかり易くさせることであった。残念なことに、この研究の、高度に複雑でかつ不均質な遺伝的バックグラウンドのために、時として限界（marginal）であり、患者の層別及び統計学的評価における差異のために、論争を生じた（１７、１８）。

ＦＧＦＲ４の遺伝的改変の結果は、様々な癌（上記参照のこと）を患うヒトにおいて説明されているが、しかし、この後ろにあるこの分子的及び生化学的機構及びこの生理学的プロセスは理解されていない。腫瘍プログレッションに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルの影響は、相関的な臨床的研究において示されているため、このようなＦＧＦＲ改変の根底にある分子的及び生化学的変化の理解は、疾病の予後、治療的戦略の開発、更に、癌研究にとって根本的なものである。

このようにして、新規の治療的戦略の開発のため、疾病治療に有用な診断マーカー及び剤を同定するため、そして、癌、しかしまた、ＦＧＦＲ４改変に関連する更なる疾病の発生及びプログレッションにおけるより多くの見解を得るために、アミノ酸置換を生じるＦＧＦＲ４改変、特にＳＮＰｓの分子的及び生化学的作用を研究するためのモデルとしての動物について必要性が存在する。

発明の概要
この必要性を満足させるために、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む齧歯類動物であって、その改変が、配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置での前記齧歯類の野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換である齧歯類動物を提供する。

一実施態様において、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含むマウス又はラットである齧歯類であって、その際、この改変が、前記マウス又はラットの野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換であり、その際、マウスの場合にはアミノ酸置換が配列番号１のアミノ酸位置３８５にあり、又は、その際、ラットの場合にはアミノ酸置換が配列番号４のアミノ酸位置３８６にある齧歯類を提供する。

一実施態様において、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含むマウスである齧歯類動物であって、その際、この改変が、前記マウスの野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換であり、その際、前記アミノ酸置換が配列番号１のアミノ酸位置３８５にある齧歯類動物を提供する。

更なる一観点において、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む齧歯類動物であって、その際、この改変が、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１によるＦＧＦＲ４タンパク質に比較して任意のアミノ酸位置での少なくとも１のアミノ酸置換であり、この改変が、ヘテロ接合又はホモ接合の方式で前記動物の少なくともいくつかの又は全ての又は実質的に全ての細胞において存在する場合には、腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成に関連するフェノタイプを生じる齧歯類動物に関連する。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

本発明は、さらに、改変したＦＧＦＲ４ポリペプチド及びこのような改変されたＦＧＦＲ４タンパク質をコードする核酸分子、また同様にプライマリー細胞及び細胞株にも関し、これは本願において説明されるとおりの非ヒト動物、例えば、齧歯類に由来する。

本発明は、さらに、
（ａ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセスを研究する、
（ｂ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の予防、改善又は治療において有用な剤を同定及び／又は試験する、
（ｃ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成についての、タンパク質及び／又は核酸診断マーカーを同定する、及び／又は
（ｄ）前記改変したＦＧＦＲ４の不所望な活性、発現、又は産生の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセス又は医学的状態を研究する
ためのモデルとしての本願において説明された動物、プライマリー細胞又は細胞株の使用に関する。

図面の簡単な説明
図１：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの作成
（Ａ）マウスのＦＧＦＲ４ゲノム配列のエキソン２〜１２にまたがるＦＧＦＲ４ｗｔ座；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩ遺伝子ターゲッティングコンストラクト、エキソン８は、特定の突然変異を介して確立したＳＮＰを含む、Ｃｒｅ欠失のためのｌｏｘＰ部位により隣接される選択−カセットは、エキソン１０及び１１の間に導入される；Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性；ＴＫ：チミジン−キナーゼ−カセット。
（Ｂ）１）遺伝子ターゲッティング後のＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析：ポジティブなクローンは、５′外部試料により検出された更なる１０ｋｂを示す。２）ＰＣＲ−制限断片長さ多形（ＲＦＬＰ）を介したＥＳ細胞クローンのゲノタイピング、ポジティブなクローンは９６ｂｐの更なる断片を含む。
（Ｃ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの分離分析；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩは、戻し（１：１）及び相互交雑（１：２：１）においてメンデル比を受け継ぐ。
（Ｄ）１）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスのゲノタイピング：増幅産物をＭｖａｌ制限酵素により切断し、ＦＧＦＲ４アレルを区別するための特定のバンドを獲得する。２）ＴＧＦα導入遺伝子の確認；３）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウス及びＴＧＦαについてトランスジェニックなオンコマウスの交雑スキーム；導入遺伝子は、この雌の通常の授乳を確保するために雄によってだけ受け継がれた。

図２：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの特性決定
（Ａ）LightCycler^(R)分析により定量化した成体ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの様々な組織におけるｍＲＮＡ発現レベル；発現レベルをＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子に対して標準化し、絶対値としてプロットした：ＦＧＦＲ４は、様々な組織において発現する；様々なＦＧＦＲ４アレル間で差異は検出可能でない。
（Ｂ）ＦＧＦＲ４の免疫沈降及びウェスタンブロットにより分析された成体ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの様々な組織におけるタンパク質発現レベル；アクチンは負荷コントロールとして働く；様々なＦＧＦＲアレル間で差異は検出可能でない。
（Ｃ）成体ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの様々な組織におけるＦＧＦＲ４発現パターンの表：ＦＧＦＲ、免疫組織化学的に分析されたもの、は様々な組織において発現する：様々なＦＧＦＲ４アレル間で差異は検出可能でない。
（Ｄ）ＦＧＦＲ４発現について、免疫組織化学的に分析された、成体ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ、Ｇｌｙ／Ａｒｇ又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの肺及び乳腺組織；様々な組織において発現する：様々なＦＧＦＲ４アレル間で差異は検出可能でない。

図３：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳癌腫瘍モデルにおいて生じる腫瘍の質量及びサイズ促進する
図３（Ａ−Ｄ）においては、全てのデータ点が１匹のマウスの値を示す。この値は体重に対して標準化され、様々な調査されたゲノタイプに対してプロットされている。この値の中央値を、非対称エラーバーとともにプロットした。
（Ａ／Ｂ）調査した腫瘍の質量及びサイズの合計。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に比較して有意に増加した腫瘍質量（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０３；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．００２）及び腫瘍サイズ（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０１；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０００６）を示す。すなわち、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は腫瘍成長を促進する。
（Ｃ／Ｄ）全体の乳腺に比較した生じる腫瘍の質量及びサイズのパーセンテージ。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に比較して有意に増加したパーセンテージの腫瘍質量（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０５；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．００５）及びサイズ（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝ｎｓ；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．００２）を示す。
（Ｅ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５及びＧｌｙ／Ｇｌｙ３８５マウスの比較。白い矢印は腫瘍を指し示す。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスは可視可能な、増加した腫瘍質量及び数を示す。
（Ｆ）免疫沈降したＦＧＦＲ４のウェスタンブロット分析；ＦＧＦＲ４は、非腫瘍原性乳腺に比較してＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来腫瘍において過剰発現している；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ａｒｇ又はＧｌｙ／Ｇｌｙマウスに比較してより高いリン酸化速度を示し、このことは、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来腫瘍におけるＦＧＦＲＡｒｇ／Ａｒｇ３８５の増進した活性を示唆する。
（Ｇ）ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の過形成乳腺及び腫瘍のＨＥ及びα−ＦＧＦＲ４染色；様々なＦＧＦＲ４アレルを有するＷＡＰ−ＴＧＲα／ＥＧＦＲマウス由来の腫瘍においては明白な病理組織学的変化は見出されなかった。１）ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の過形成乳腺ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／ＡｒｇのＨ及びα−ＦＧＦＲ４染色は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ発現に比較して過形成乳腺において過剰発現している。２）１）ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の腫瘍のＨ及びα−ＦＧＦＲ４染色；ＦＧＦＲ４は過剰発現し、様々なアレル間で差異を示さない。

図４：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、時間にわたりＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳房腫瘍モデルにおいて腫瘍プログレッションを促進する
図４（Ｂ−Ｆ）においては、全ての時間点が、少なくとも３匹の分析したマウスの値−中央値を指し示す。全てのゲノタイプについてこれらの中央値が時間に対してプロットされている。
Ａ）ＦＧＦＲ４ ^{Ｇｌｙ３８５}及びＦＧＦＲ４ ^{Ａｒｇ３８５}における可視可能な腫瘍発症の時間点；Ａｒｇ３８５を有するマウスは、有意により早期の腫瘍発症を示す（ｐ＝０．００１）；この値の中央値を非対称なエラーバーとともにプロットした。すなわち、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、可視可能な腫瘍発症を早発させる。
（Ｂ−Ｄ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスはより多くの数、質量及びサイズの腫瘍を確立し、時間にわたりより迅速なプログレッションを示す。
（Ｅ−Ｆ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスはより高いパーセンテージの腫瘍質量及びサイズを確立し、時間にわたりより迅速なプログレッションを示す。

図５：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＷＡＰＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳腺腫瘍モデルにおいて癌細胞転移を促進する
（Ａ）調査した肺の癌細胞転移発症の時間点；Ａｒｇ３８５を有するマウスはより早期の転移発生を示す（ｐ＝ｎｓ）。
（Ｂ）生じた転移の分析；各ゲノタイプについてサイズを転移の数に対してプロットする；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇは、全ての計算したサイズにおいて増進した数の転移を示す。
（Ｃ）生じた転移の分析；各ゲノタイプについてサイズを転移の数に対してプロットする；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇは、全ての計算したサイズにおいて増進した数の転移を示す。

図６：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）において細胞形質転換を促進し、細胞生存を容易にする
（Ａ）ＭＥＦｓにおける焦点形成アッセイ（Focus Formation Assay）；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５を有するＭＥＦｓは、全ての使用されたオンコジーンにおいてより多い数の焦点を実証する。
（Ｂ）ＭＥＦｓにおける焦点形成アッセイ；焦点の成長を様々な時間点で決定した：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、形質転換のより早期の時間点及び時間にわたりより高いプログレッションを示す。
（Ｃ）ＭＥＦｓにおけるアポトーシス；ＭＥＦｓを、０．５μＭのドキソルビシン（ｄｏｘ）で４８ｈ処理した：アポトーシスをＦＡＣＳ分析を介して測定した；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、ＦＧＦＲＧｌｙ／Ｇｌｙ３８５に比較して有意に（ｐ＝０．０３）減少した数のアポトーシス細胞を示す；類似して、Ａｒｇ３８５を有するＭＥＦｓは、ＦＧＦＲＧｌｙ／Ｇｌｙ３８５細胞に比較して、有意に（ｐ＝０．０３）減少した数のアポトーシス細胞をシスプラチン処理４８ｈｒｓ後に示す。対照的に、タキソール、微小管相互作用薬剤での処理は、Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓに比較してＦＧＦＲＧｌｙ／Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓにおいて４８ｈｒｓ後にアポトーシス性応答において差異を引き起こさない。すなわち、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５は、ＤＮＡ損傷薬剤に対する応答において、細胞生存を容易にするように見える。

図７：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５及びＧｌｙ３８５マウスは、同一の乳腺計量（Metric）を示す
図７（Ａ／Ｂ）において、全てのデータ点は、様々な調査したゲノタイプに対してプロットした１匹のマウスの値を示す。この値の中央値を非対称なエラーバーとともにプロットした。
（Ａ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスは、乳腺の同一の質量を示す。
（Ｂ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスは、乳腺の同一のサイズを示す。

図８：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＦＶＢバックグラウンドにおいて、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲモデルにおいて腫瘍発症の時間点を減少させる
図８Ａにおいて、全てのデータ点は、様々な調査したゲノタイプに対してプロットした１匹のマウスの値を示す。この値の中央値を非対称なエラーバーとともにプロットした。
（Ａ）ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲについてトランスジェニックなＦＧＦＲ４ ^Ｇｌｙ及びＦＧＦＲ４ ^Argマウスにおける腫瘍発生。ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲについてトランスジェニックな、Ａｒｇ３８５を有するマウスは、ＦＶＢバックグラウンドにおいて、減少した腫瘍発生時間点を示す。

図９：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓにおける通常の増殖、寿命及び移動
（Ａ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＭＥＦｓにおける変化した活性を示さない；ＦＧＦＲ４を免疫沈降し、かつ、この活性のあるレセプターの量をｐＴｙｒ抗体により分析した；異なるＦＧＦＲ４アレル間で検出可能な差異は存在しなかった；
（Ｂ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、変化した増殖又は延長した寿命を示さない；ＭＥＦｓを、老化が生じるまで継代培養し、集団二倍化速度を計算し、時間に対してプロットした；２）明らかに老化ＭＥＦｓを、β−ガラクトシダーゼ発現について染色し、老化細胞の量を顕微鏡により計算した；異なるＦＧＦＲ４アレル間の検出可能な差異は存在しなかった；
（Ｃ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、変化した移動を示さない；ＭＥＦｓを、１６ｈにわたり移動についてボイデンチャンバーにおいて分析した；異なるＦＧＦＲ４アレル間の検出可能な差異は存在しなかった。

図１０：発癌性バックグラウンドなしの乳腺計量に対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響
（Ａ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝１２）、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１７）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１２）における乳腺質量の分析。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５アレルについてホモ接合なマウスに比較して乳腺の質量における差異を示さない；
（Ｂ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝１２）、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１６）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１３）マウスにおける乳腺サイズの分析。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５アレルについてホモ接合なマウスに比較して乳腺のサイズにおける差異を示さない；
全てのデータを平均値±ＳＤＭとして示す。

図１１：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＭＭＴＶＰｙｍＴマウス乳癌腫瘍モデルにおける腫瘍プログレッションを促進しないが、ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックなマウスにおいてＦＶＢバックグラウンドにおける腫瘍発症の時間点を減少させる
（Ａ）ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴについてトランスジェニックな、３月齢のＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝８）、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１１）マウスにおける腫瘍サイズの分析：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを有するマウスは、Ｇｌｙ３８５アレルについてホモ接合なマウスに比較して腫瘍のサイズにおける差異を示さない；
（Ｂ）ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴについてトランスジェニックな、３月齢のＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝８）、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１１）マウスにおける腫瘍質量の分析：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５アレルについてホモ接合なマウスに比較して腫瘍の質量における差異を示さない；
全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示され、全てのｐ値はスチューデントＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的有意と考慮される。

図１２：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は過剰活性化され、ＷＡＰ−ＴＧＲα由来腫瘍の発現パターンにおいてより攻撃的なフェノタイプを促進する
腫瘍プログレッション６ヶ月後の、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝１０）又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝１０）（ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックである）マウス由来の腫瘍の発現分析：ターゲット遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲを介して分析した；ＧＡＤＰＨは発現通常値として機能した；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５腫瘍の発現値を、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５腫瘍の発現値に対して相対的にプロットし、その生理学的機能に関してグループ分けした；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの存在下で、腫瘍は有意に、移動、浸潤及び血管新生に関連する遺伝子を過剰発現した；ｐ２１は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの存在下で、有意に下方制御される（ＭＭＰ１４−ｐ＝０．０２、ＭＭＰ１３−ｐ＝０．０２１、ＭＭＰ−ｐ＝０．０１９、ｆｌｋ−１−ｐ＝０．０２、ＣＤ４４−ｐ＝０．０２、ＣＤＫ１−ｐ＝０．００９１、ｐ２１−ｐ＝０．０３）；
全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される；全てのｐ値はスチューデントＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的有意と考慮された。

図１３：ＥＧＦＲ又はｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓにおける発現分析及び細胞増殖
（Ａ）形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓのウェスタンブロット分析：ＥＧＦＲ及びｖ−ｓｒｃは空のｐＬＸＳＮで感染させたコントロールＭＥＦｓにおいて上方制御されていない；ｖ−ｓｒｃは、ｐＬＸＳＮ−ｖｓｒｃで感染させたＭＥＦｓにおいて過剰発現している；ＥＧＦＲは、ｐＬＸＳＮ−ＥＧＦＲで感染させたＭＥＦｓにおいて過剰発現している；アクチンは負荷コントロール及び定量化のための標準化値として機能した；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５発現及び活性化は、ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいて上方制御されている。
（Ｂ）形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓの増殖アッセイ：播種したＭＥＦｓの細胞数を時間にわたりモニタリングして、集団二倍化速度を計算した；ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの存在は、コントロールＭＥＦｓ（空のｐＬＸＳＮ）においてもｖ−ｓｒｃ又はＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいても増殖に影響を及ぼさない；
全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される。

図１４：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、細胞の形質転換、移動、足場非依存性成長及び分岐をＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいて容易にする
（Ａ）安定にＥＧＦＲ形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓの移動アッセイ：移動能力を、クリスタルバイオレット染色（２０×）後に顕微鏡により分析し、ＥＬＩＳＡ分析を介して定量化した。ＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、有意に（ｐ＝０．０００５）増加した移動能力を示す；
（Ｂ）安定にＥＧＦＲ形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓの軟寒天コロニー形成アッセイ：足場非依存性成長を分析し、示した時間点で顕微鏡により（２０×）定量化した。ＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓに比較して２４〜９６時間後に軟寒天中で足場非依存性成長の有意に増加した能力を示す（２４ｈ−ｐ＝０．００００４；９６ｈｐ＝０．００００３）；
（Ｃ）安定にＥＧＦＲ形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓのマトリゲルにおける浸潤アッセイ：マトリゲルにおける分岐を分析し、顕微鏡により（２０×）示した時間点で定量化した；ＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ３Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓに比較して９６時間後にマトリゲル中で有意に増加した浸潤を示す（ｐ＝０．００００９）；
全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される；全てのｐ値はスチューデントＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的有意と考慮された。

図１５：ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は移動、足場非依存性成長及び分岐を、ｖ−ｓｒｃで形質転換したか又は空のｐＬＸＳＮベクターを安定に発現するＭＥＦｓ中では促進しない
（Ａ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓ（ｖ−ｓｒｃで形質転換したか又は空のｐＬＸＳＮベクターを過剰発現する）の移動能力；ＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４アレルに関してその移動能力において差異を示さない。
（Ｂ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓ（ｖ−ｓｒｃで形質転換したか又は空のｐＬＸＳＮベクターを過剰発現する）の足場非依存性成長；ｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４アレルに関して足場非依存性成長における差異を示さない。空のｐＬＸＳＮベクターを安定に発現するＭＥＦｓは、足場非依存性成長できない。
（Ｃ）ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５（ｎ＝３）又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５（ｎ＝３）ＭＥＦｓ（ｖ−ｓｒｃで形質転換したか又は空のｐＬＸＳＮベクターを過剰発現する）のマトリゲル増生；ｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４アレルに関してマトリゲル増生における差異を示さない。空のｐＬＸＳＮベクターを安定に発現するＭＥＦｓは、マトリゲル中で分岐できない。

図１６：空のｐＬＸＳＮベクター、ｐＬＸＳＮ−ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８のいずれかを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＦＧＦＲ４相互作用パートナーを分析するための実験的構成の簡略化したスキーム；細胞株を、ＳＩＬＡＣラベル化について改変したアミノ酸を含有する培地中で継代培養した；ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８及びＡｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の間でこの結果を確認するためにラベルスイッチを行った。細胞溶解の後に、ライセートを１：１にプールし、ＦＧＦＲ４及びその相互作用物質を免疫沈降させ、トリプシン及びＬｙｓＣでインゲル（in-gel）消化させ、この後に定量的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析した。

図１７：ＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ４相互作用の評価：Ａ）空ｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８及び−Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でのＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ４の共免疫沈降：ＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８の相互作用は、ＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較してより強力であるように見える；Ｂ）ＥＧＦ刺激後のＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ４相互作用。ＥＧＦＲの増加したリン酸化及び増進したＦＧＦＲ４相互作用及び活性化、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中で；Ｃ）ＥＧＦ刺激されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のウェスタンブロット分析の定量化：ＦＧＦＲ４ＡＲｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、増進したＥＧＦＲ及びＡｋｔ活性化を示し、全ＥＧＦＲ及びチューブリンは定量化のための標準化値としてそれぞれ機能した；共免疫沈降したＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８は、ＥＧＦＲに対して増進した結合及び増加した活性化を、共免疫沈降したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較して示す。

図１８：ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激後のＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５又はＡｒｇ３８５ホモ接合マウス由来のＭＥＦｓのウェスタンブロット分析；Ａ）ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを発現する場合に、ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激すると増加しかつ延長したＡｋｔ活性化を示す；Ｂ）ＥＦＧＲで形質転換したＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを発現する場合に、ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激後に有意に増加したＥＧＦＲ活性化を示す（ＥＧＦ５′−ｐ＝０．００００７３、ＥＧＦ１０′−ｐ＝０．００２５、ＴＧＦα５′−ｐ＝０．０７、ＴＧＦα１０′−ｐ＝０．０１）；アクチンは、定量化のための標準化値として機能した。Ｃ）ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいては、ＦＧＦＲ４はＥＧＦ及びＴＧＦα刺激すると活性化し、その一方で、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に比較して増加したリン酸化を示す；全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される；全てのｐ値は、スチューデントのＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的に有意と考慮された。

図１９：空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１の生物学的特性；Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＦＧＦＲ４を過剰発現することによりその増殖能力を変更させない；Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＦＧＦＲ４を過剰発現することにより部分的に有意に増加した移動能力を示す（ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８−ｐ＝０．００１）；ＦＧＦＲ４Ａｒｇアレルを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８アレルを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に比較して有意に増進した移動を示す（ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８−ｐ＝０．００１）；全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される；全てのｐ値は、スチューデントのＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的有意であると考慮された。

図２０：空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、増殖、アポトーシス及び移動に対するゲフィニチブの影響；Ａ）ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ゲフィニチブに対して増加した感受性（ＩＣ₅₀＝９．５３）を、ＦＧＦＲＧｌｙ３８８又はコントロール細胞（ＩＣ₅₀＝１８．７２）に比較して示す；Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ゲフィニチブに対してＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較してＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルの存在下でアポトーシスにおける有意な増加を示す（２０μＭ−ｐ＝０．０１２；１０μＭ−ｐ＝０．００２２）；Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ゲフィニチブに対する応答において、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較してＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルの存在下で移動における減少を示す；全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される；全てのｐ値は、スチューデントのＴ検定を用いて計算され、値≦０．０３は統計学的有意であると考慮された。

図２１：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｉｎｖｉｖｏラベリング：マウスに天然の又は¹³Ｃ₆置換したタイプのリシンを含む食餌を供給した；ラベリングの効率は、特定組織の細胞増殖速度に依存する：Ｆ２発生は完全にラベル化される（Kruger et al., 2008）。

図２２：ｉｎｖｉｖｏＳＩＬＡＣを介したＦＧＦＲ４の肝性相互作用パートナーの調査：
Ａ）遮断ペプチドの合成；ＨＥＫ２９３を、ＧＳＴでタグ化したＦＧＦＲ４の細胞外ドメインを含むベクターで一過的にトランスフェクションするために使用した。特定のシグナルペプチドを介して、この組み換えタンパク質はこの細胞培地に配送されることができる；トリプシン又はリシンいずれかでの消化後に、この遮断ペプチドの効率をＦＧＦＲ４を用いた免疫沈降実験において試験した。
Ｂ）遮断ペプチドを介した肝性ＦＧＦＲ４の相互作用パートナーを分析するための実験的スキーム；定量可能な分析を可能にするために、このラベル化ＳＩＬＡＣマウスを内部標準として使用した；ラベル化及び非ラベル化マウスの肝臓を解剖し、溶解した；非ラベル化肝臓−ライセートを用いて、ＦＧＦＲ４を、遮断ペプチドの存在下で免疫沈降し、この場合に、非特異的結合パートナーの検出のためこの抗体とＦＧＦＲ４との結合を妨げた；ラベル化肝臓−ライセートにおいて、ＦＧＦＲ４を、ＦＧＦＲ４結合パートナーを分析するために、遮断ペプチドなしに免疫沈降した。
Ｃ）特異的遮断ペプチドの作成のための配列分析
Ｄ）ＦＧＦＲ４ＫＯマウスを介した肝性ＦＧＦＲ４の相互作用パートナーを分析するための実験的スキーム；定量可能な分析を可能にするために、このラベル化ＳＩＬＡＣマウスを内部標準として使用した；ラベル化及び非ラベル化マウスの肝臓を解剖し、溶解し、ＦＧＦＲ４免疫沈降のために一緒に混合した。
Ｅ）肝性ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の相互作用パートナーを分析するための実験的スキーム；定量可能な分析を可能にするために、このラベル化ＳＩＬＡＣマウスを内部標準として使用した；ラベル化及び非ラベル化マウスの肝臓を解剖し、溶解し、ＦＧＦＲ４免疫沈降のために一緒に混合した。

発明の詳細な説明
本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは齧歯類であって、その際、この改変が、配列番号１、すなわち、マウスＦＧＦＲのアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置での前記非ヒト齧歯類の野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換である非ヒト動物、好ましくは齧歯類を提供する。代替的に、この改変は、少なくとも、配列番号１又は任意の相応する配列の位置３８５でのアミノ酸の欠失、又は配列番号１又は任意の相応する配列の位置３８５での少なくとも１のアミノ酸の挿入であってよい。

一実施態様において、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含むマウス又はラットである齧歯類であって、その際、この改変が、前記マウス又はラットの野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換であり、その際、マウスの場合には前記アミノ酸置換が配列番号１のアミノ酸位置３８５にあるか、又は、ラットの場合には前記アミノ酸置換が配列番号４のアミノ酸位置３８６にある齧歯類を提供する。

一実施態様において、本発明は、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含むマウスである齧歯類であって、その際、この改変が、マウスの野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換であり、その際、前記アミノ酸置換が配列番号１のアミノ酸位置３８５にある齧歯類を提供する。

「相応する」との用語は、本願で定義される場合、ＦＧＦＲ４オルソログ、アイソフォーム、成熟形、又は、変異形（これは本願で定義される）のアミノ酸位置であって、これら配列における配列番号１の３８５位置を定義するものを示す。当業者にはこの文脈において、改変されたＦＧＦＲ４の遺伝子が、配列番号１又は本願で言及する任意の他の配列によるマウスＦＧＦＲ４タンパク質中の、アミノ酸レベルでの改変を反映することが明らかである。この改変に隣接するＦＧＦＲ４遺伝子の配列が、上で定義したマウスＦＧＦＲ４タンパク質のアミノ酸配列における相応する位置にあるものに同一なアミノ酸をコードしない場合に、当業者は容易に、この隣接配列によりコードされるアミノ酸をこのマウスＦＧＦＲ４タンパク質の相応するアミノ酸と、好ましくは以下に挙げるアミノ酸配列同一性を決定する方法を用いて容易にアラインメントさせることができ、かつ、上述した種類のこのマウスＦＧＦＲ４タンパク質における改変が前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列により反映されるかどうかを決定することができる。アミノ酸置換又は挿入の場合には、この改変は好ましくは、前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列により、同一のアミノ酸又はアミノ酸配列がこのアレルによりコードされるこのタンパク質の相応する位置に見出されるように反映される。アミノ酸欠失の場合には、この改変は好ましくは、前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列により、同一の又は対応するアミノ酸又はアミノ酸配列がこの遺伝子によりコードされるこのタンパク質の相応する位置で欠失されるように反映される。

例えば、上述のタンパク質は、例えば、マウスの野生型ＦＧＦＲ４タンパク質であってよく、例えば、配列番号１に開示される配列を有する。この改変、例えば、アミノ酸置換は次に、グリシンである、配列番号１のアミノ酸位置３８５に影響を及ぼす。代替的に、この改変されたＦＧＦＲ４タンパク質は、この動物に関して配列番号１によるマウスＦＧＦＲ４タンパク質の任意のオルソログであってよく、例えば、脊椎動物由来、好ましくは哺乳類由来、より好ましくは齧歯類由来、例えば、ハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス）又はクマネズミ属（Ratius）（例えば、ラット）由来、又はアナウサギ属（Oryctologus）（例えば、ウサギ）又はゴールデンハムスター属（Mesocricetus）（例えば、ハムスター）由来であってよい。この場合に、アミノ酸置換は、配列番号１におけるアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置に影響を及ぼしてよい。例えば、例えば配列番号４によるラット配列において、マウス配列のアミノ酸位置３８５はアミノ酸位置３８６に相応する。

一実施態様において、前記齧歯類、例えばマウス又はラット、請求項１又は４のいずれか１項記載の動物において、前記齧歯類動物において配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置はグリシンである。

別の実施態様において、前記齧歯類、例えばマウス又はラットにおいて、アミノ酸置換はグリシンとは異なるアミノ酸を伴う。

この非ヒト動物、例えば齧歯類の改変したＦＧＦＲ４タンパク質は、本願で定義されるとおり、配列番号１及び配列番号４に記載のマウス又はラットＦＧＦＲ４タンパク質の、又は前記オルソログの変形、アレル変形又は、その他であってもよく、この場合に特定のアミノ酸又は部分アミノ酸配列は、置き換えられ、付加されるか、又は欠失される。

好ましくは、非ヒト動物、例えば齧歯類における、配列番号１による野生型ＦＧＦＲ４配列のアミノ酸位置３８５又はこの相応するアミノ酸位置は、グリシンとは異なるアミノ酸、例えば、異なるサイズ及び／又は極性を有するアミノ酸により置き換えられ、すなわち、非保存的アミノ酸置換である。非保存的置換は、１のアミノ酸の、以下に示す５つの標準的なアミノ酸群の異なる群に列記された別のアミノ酸による交換として定義される：
１．低脂肪族性、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、（Ｐｒｏ）、（ＧＩｙ）：
２．負に荷電した残基及びそのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．高脂肪族性、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａＩ、（Ｃｙｓ）；
５．高芳香族性残基：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ。

保存的置換は、１のアミノ酸の、上で示された５つの標準的なアミノ酸群の同じ群内に列記された別のアミノ酸による交換として定義される：タンパク質構造におけるこの特殊な役割のために３つの残基がかっこ書きされる。Ｇｌｙは、側鎖を有しない唯一の残基であり、したがってこの鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは、この鎖を固く拘束する異常な幾何学を有する。Ｃｙｓは、ジルスフィド結合に関与する。

本発明の一実施態様において、非ヒト動物、例えば、齧歯類において、配列番号１のＦＧＦＲ４の位置３８５又は相応するアミノ酸位置でのグリシン残基は、グリシンとは異なる別の残基により、好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、（Ｐｒｏ）とは異なる残基により置き換えられ、好ましくは、荷電した側鎖を有する、すなわち、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸、例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン、特に好ましくはアルギニンにより置き換えられる。

好ましい一実施態様において、非ヒト動物、例えば齧歯類は、配列番号５又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を発現する。

本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類は、配列番号１又は配列番号４によるＦＧＦＲ４の位置３８５又は他のＦＧＦＲ４オルソログにおける相応する位置にグリシン残基の改変を含むものに限定されない。むしろ、非ヒト動物、例えば齧歯類のＦＧＦＲ４の「改変」との用語は、本願で説明される場合、これらが本願で説明されるフェノタイプを生じる限りはＦＧＦＲ４における任意の改変を包含するものであり、例えばアミノ酸置換、欠失又は挿入である。挿入型アミノ酸配列改変は、１又はそれより多いアミノ酸残基がタンパク質の予め定められた部位に導入される改変であり、ただし、この生成物の適したスクリーニングを用いてランダムな挿入も可能である。欠失型改変は、例えばフレームシフト又はストップコドンの挿入を生じる、この配列からの１又はそれより多いアミノ酸の除去により特徴付けられる。置換型アミノ酸改変は、この配列中の少なくとも１の残基が除去され、この場所中に異なる残基が挿入されているものである。

これに応じて、本発明の更なる一観点は、非ヒト動物、例えば齧歯類であって、改変されたＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含有し、その際、この改変が上述のとおりのアミノ酸改変、例えば、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１によるＦＧＦＲタンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸位置でのアミノ酸置換であり、この改変が、前記動物の細胞の少なくともいくつか又は全て又は実質的に全てにおいてヘテロ接合又はホモ接合の方式で存在する場合には、以下にさらに説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して腫瘍成長及び／又は転移形成の増加した速度、に関連したフェノタイプを生じる非ヒト動物、例えば齧歯類である。好ましい一実施態様において、前記動物は付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノムにおいてＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を、例えば哺乳類細胞において、適したプロモーター、例えば、ＷＡＰプロモーターの制御下の発現により、又は肝臓細胞、例えば肝細胞において、適したプロモーター、例えば、アルブミンプロモーター、α−１アンチトリプシンプロモーター又はＴＧＦ−αメタロチオネイン１プロモーターの制御下の発現により、発現する。

好ましくは、本発明の非ヒト動物、例えば齧歯類においてこの改変されたＦＧＦＲ４は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％この動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類、最も好ましくは齧歯類の野生型ＦＧＦＲ４配列、例えば配列番号１又は配列番号４によるマウス又はラットＦＧＦＲ４と同一である。一実施態様において、この改変されたＦＧＦＲ４タンパク質は、その野生型タンパク質と、配列番号１によるＦＧＦＲ４のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸置換を除いて、同一である。

以下の定義は、本願明細書を通じて核酸又はアミノ酸配列同一性に対する全ての言及に適用される。
「配列同一性」との用語は、特定の比較領域にわたり残基から残基ベース（residue-by-residue）で２つのポリヌクレオチド、タンパク質又はポリペプチド配列が同一である程度を指す。

「パーセントアミノ酸同一性」又は「％アミノ酸同一性」とのフレーズは、２つ又はそれより多いアミノ酸又は核酸配列の比較において見出される配列同一性のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、例えば、MEGALIGNプログラム（DNASTAR, Inc., Madison Wis.）を用いて、電子的に容易に決定されることができる。MEGALIGNプログラムは、異なる方法による２つ又はそれより多くの配列間のアラインメントを作成することができ、このうちの１つはクラスター法である。例えば、Higgins and Sharp (Higgins and Sharp1988)を参照のこと。このクラスターアルゴリズムは、全てのペアの間での距離を調べることによりクラスターへと配列を分類する。このクラスターはペア毎に、次に群へと、アラインメントされる。２つのアミノ酸配列、例えば、配列Ａと配列Ｂの間でのパーセンテージ類似性は、配列ＡとＢの間の残基一致（match）の合計を、配列Ａの長さ、マイナス配列Ａ中のギャップ残基の数、マイナス配列Ｂ中のギャップ残基の数、で割り、１００をかけることにより計算される。２つのアミノ酸配列の間の低ホモロジー又はホモロジーなしのギャップは、パーセンテージ類似性の決定には含まれない。

パーセンテージ同一性は、容易にMultAlinソフトウェアを使用して電子的に容易に決定されることもできる（Corpet 1988）。

本発明の目的のための２つのタンパク質配列の間のアミノ酸同一性の決定の別の方法は、「Blast 2 sequences」(bl2seq)アルゴリズムの使用であり、これはTatusova et al.により説明されている(Tatusova and Madden 1999）。この方法は、「BLAST」エンジンを使用する２つの所定の配列のアラインメントを作成する。「blasting two sequences」のオンラインアクセスは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.htmlでＮＣＢＩサーバーにより獲得されることができる。２つの配列のブラスト化（bl2seq）のために実行可能なスタンダロンは、ＮＣＢＩｆｔｐサイト（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables）から検索されることができる。好ましくは、２つのタンパク質の間の同一の又は類似のアミノ酸の数及びパーセンテージを決定するために使用されるプログラムblastpの設定は以下のとおりである：
プログラム： blastp
マトリックス： BLOSUM62
オープンギャップペナルティ： 11
エクステンションギャップペナルティ： 1
Gapxdropoff : 50
期待： 10.0
ワードサイズ： 3
低複雑性フィルター：オン。

配列同一性の決定のための２つ又はそれより多いアミノ酸又は核酸配列の比較は、オルソログ配列間、好ましくはマウス及びラット配列間で実施されることができる。

好ましくは、この改変されたＦＧＦＲ４タンパク質の野生型残基は、その際、この改変は、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１によるＦＧＦＲタンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸置換であり、この改変は、本願で説明されるとおりの動物、例えば齧歯類の細胞の少なくともいくつか又は全て又は実質的に全てにおいてヘテロ接合又はホモ接合の方式で存在する場合には、腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して腫瘍成長及び／又は転移形成の増加した速度、に関連したフェノタイプを生じるが、異なるサイズ及び／又は極性を有するアミノ酸により置換され、すなわち、これは非保存的アミノ酸置換であり、これは上で定義されるとおりである。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子又は乳癌を誘発する任意の他の遺伝子を発現する。代替的に、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノムにおいて、肝細胞癌を誘導する遺伝子、例えばｐ５３又はｃ−ｍｙｃを発現する。

「フェノタイプ」との用語は本願で使用される場合には、このゲノタイプ及び環境の相互作用から生じる、細胞又は生物により所有される、１又はそれより多い形態学的、生理学的挙動及び／又は生化学的形質を指す。このようにして、本発明の非ヒト動物、例えば齧歯類は、野生型動物に比較して１又はそれより多くの容易に観察可能な異常を示す。好ましい一実施態様において、本発明の動物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は少なくとも４の異常なフェノタイプ的特徴を示し、これは上述のカテゴリーの任意のものから選択される。

「腫瘍プログレッションにおける変化に関連したフェノタイプ」との用語は、本出願を通じて言及される場合、野生型動物と比較した、腫瘍成長及び／又は転移形成の増加した速度により特徴付けられてよい。このフェノタイプの定義に該当する更なる特徴付けは、以下において実施例において見出されてよい。この観点における好ましい腫瘍は、乳房の腫瘍（mammary tumor）又は肝臓（肝細胞）の腫瘍である。

上述したとおり、ＦＧＦＲ４遺伝子又は導入遺伝子の内因性プロモーターは、非ヒト動物、例えば齧歯類と関連して、非相同性プロモーター、例えば、遺伝子上に発現の異なる組織特異性を付与するプロモーター、例えば、ＷＡＰプロモーター（乳房細胞のため）、ビリンプロモーター（結腸直腸細胞のため）、又はアルブミンプロモーターα−１アンチトリプシンプロモーター、又はＴＧＦ−αメタロチオネイン１プロモーター（肝細胞のため）、又は一過的に制御可能なプロモーター、例えば、化学的又は物理学的手段、例えばｔｅｔ−ＣＲＥシステムにより誘導可能なプロモーターによって置き換えられてよい。

本願で使用される場合に「改変した」又は「改変」との用語は、この野生型に比較した変化を指す。本願で使用される場合に「突然変異」又は「改変した」との用語は、これに関連するＦＧＦＲ４タンパク質配列及び核酸配列との関連において、この相応する野生型ＦＧＦＲ４に比較した配列中の変化を指す。

本願で説明される場合に非ヒト動物とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類であってよい。更なる好ましい一実施態様において、非ヒト動物は齧歯類である。

特に、齧歯類は、ハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス）又はクマネズミ属（Ratius）（例えば、ラット）、又はアナウサギ属（Oryctologus）（例えば、ウサギ）又はゴールデンハムスター属（Mesocricetus）（例えば、ハムスター）から選択されてよい。特に好ましい非ヒト動物はマウス又はラットである。

本願で説明される場合に本発明の非ヒト動物モデル、例えば齧歯類は、本願で説明されるとおりの内因性の改変したＦＧＦＲ４タンパク質又は遺伝子又は本願で説明されるとおりの導入遺伝子を、少なくともいくつかのその細胞において、例えば、モザイク動物、例えばキメラ動物として発現し、又は、この改変されたＦＧＦＲ４タンパク質は上で定義したとおりの非相同性プロモーターを有する遺伝子により発現される場合がある。本発明の非ヒト動物モデル、例えば齧歯類は、本願で説明されるとおりの内因性の改変したＦＧＦＲ４タンパク質をその細胞の全てにおいて、例えば、このＦＧＦＲ４をコードする核酸から普遍的に発現されるプロモーターの制御下にこのＦＧＦＲ４タンパク質を発現することにより、発現してもよい。この改変したＦＧＦＲ４タンパク質は、内因性ＦＧＦＲ４プロモーターの制御下で前記ＦＧＦＲ４タンパク質をコードする核酸をコードする核酸から翻訳されてもよい。説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類の細胞は、本願で説明されるとおり、アミノ酸改変、例えば置換に関して少なくともヘテロ接合である。代替的に、この細胞はホモ接合であってもよい。

本発明は、さらに、成熟した改変したＦＧＦＲ４タンパク質を含む非ヒト動物、例えば齧歯類、又は、本願で説明されるとおりに改変されているその脊椎動物オルソログ、例えば、上述のとおりの特異的オルソログを含み、これは、本願で説明されるとおりのＦＧＦＲ４タンパク質に相応するアミノ酸又はアミノ酸配列を含む。本願で使用される場合に、ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形とは、後翻訳改変から生じてよい。このような付加的なプロセスは、限定する例ではないが、タンパク質加水分解開裂、例えば、リーダー配列の開裂、グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化を含む。一般に、本発明による成熟ポリペプチド又はタンパク質は、これらプロセスの１の操作又は、これらの任意の組み合わせから生じてよい。

本発明のアミノ酸置換をコードする核酸又は遺伝子は、非ヒト脊椎動物の生殖細胞又は体細胞又はこの両者において存在してよい。

本願で説明される場合にこの非ヒト動物、例えば齧歯類は、本願で説明されるとおりのＦＧＦＲ４の改変に加えて、制御されていない細胞成長、好ましくは癌及び／又は転移形成を示してよい。

本発明において使用される場合に「制御されていない細胞成長」とは、制御されていない成長により特徴付けられる任意の状態、例えば癌に関する。癌の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓の癌である。「制御されていない細胞成長」との用語は、制御されていない細胞分割、すなわち、制御されていない細胞成長状態における同じ細胞の成長及び／又は分割を超えた成長及び／又は分割をも包含する。制御されていない細胞成長を決定するための技術は、当業者に知られており、これは例えば細胞の視覚的検査（組織学）である。

制御されていない細胞成長は、細胞の制御されていない成長及び／又は分割を生じる当業者に知られた任意の方法又は処置によって引き起こされてよく、すなわち、照射、例えばＵＶ光を用いた照射、又は、癌誘導剤、例えばジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）、アゾキシメタン（ＡＯＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチル−ニトロソ−ウレア（ＥＮＵ）又は１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート（ＴＰＡ）を用いた処置によって引き起こされてよい。代替的に、これはオンコジーンを含む導入遺伝子、すなわち、脱制御され、この脱制御が癌の発生及び発達に参加する遺伝子の発現により引き起こされてよい。このような遺伝子の例は、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＰｙＶ−ｍｚ、ｅｒＢ−Ｂ２、ＲＥＴ、サイクリンＤ１、ＥＧＦＲ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｋｉｔ、ＨＥＲ２、Ｔｒｐ５３、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ、Ｅ２Ｆ−１、サイクリンＡ、ｍｙｃ、ｐ５３、ｒａｓ、Ｒｂ、特にＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦＲ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｋｉｔ、ＨＥＲ２、ｅｒＢ−Ｂ２、ｐ５３、ｍｙｃ又はｒａｓ、そしてとりわけＴＧＦ−α（配列番号７４）又は／及びＥＧＦＲ（配列番号７６）である。この導入遺伝子は、全生物又は個々の細胞又は組織において、例えば、乳房細胞、肺細胞、直腸結腸細胞、肝細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、又は膵臓細胞、特にβ−島細胞において発現されてよい。上述のとおり、全ての又は少なくともいくつかの細胞における導入遺伝子の発現は、適したプロモーターの使用により達成されてよい。

本発明の更なる一観点において、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む非ヒト動物、例えば齧歯類動物であって、その際、この改変が、例えば、本願で説明されるとおりの配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置での前記非ヒト動物の野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換である非ヒト動物、例えば齧歯類動物は、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化と関連したフェノタイプを発達させる。

別の観点において、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む非ヒト動物、例えば齧歯類動物は、その際、この改変が、本願で説明したとおりの改変、例えば、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１のＦＧＦＲ４タンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸位置でのアミノ酸置換であり、この改変が、ヘテロ接合又はホモ接合の方式で前記動物の少なくともいくつかの又は全ての又は実質的に全ての細胞において存在する場合には、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成に関連するフェノタイプを生じるが、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化に関連するフェノタイプを発達させる。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

本発明の更なる一観点において、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む非ヒト動物、例えば齧歯類は、その際、この改変が、本願で説明されるとおりの配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置での前記非ヒト動物、例えば齧歯類の野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換であるが、本願で説明するとおりのＦＧＦＲ４の改変の他に、本願で説明されるとおりの制御されていない細胞成長及び／又は転移形成を示し、かつ、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化と関連したフェノタイプを発達させる。

別の観点において、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む非ヒト動物、例えば齧歯類動物は、その際、この改変が、本願で説明したとおりの改変、例えば、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１のＦＧＦＲ４タンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸位置でのアミノ酸置換であり、この改変が、ヘテロ接合又はホモ接合の方式で前記動物の少なくともいくつかの又は全ての又は実質的に全ての細胞において存在する場合には、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッションにおける変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成に関連するフェノタイプを生じるが、本願で説明されるとおりのＦＧＦＲ４の改変に加えて、本願で上述されるとおりの制御されていない細胞成長及び／又は転移形成を示し、かつ、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化に関連したフェノタイプを発達させる。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

前述の説明から明白であるとおり、本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類は、当業者に知られている任意の技術、例えば、外因性遺伝子材料を組み込み／統合するゲノムを有する動物を生じる手順の適用により、例えば、この通常のＦＧＦＲ４遺伝子又はタンパク質の機能を改変又は破壊するための様式で、又は、上述の改変したＦＧＦＲ４を発現するための様式で、又は、遺伝子、例えば本願で説明されたオンコジーンを含む導入遺伝子の付加的なコピーを統合する様式で、産生されてよい。これら技術は、マイクロインジョクション、電気穿孔、細胞銃、細胞融合、無核細胞中への核輸送、奇形癌幹細胞の胚又は機能的等価な胚性幹細胞中へのマイクロインジョクションを含むが、これに限定されない。本発明の動物を作成するための手順の一実施態様は、更に以下に示される「材料及び方法」によるものである。

上述のとおりのオンコジーンを含む導入遺伝子を有するトランスジェニック動物の産生の場合には、この導入遺伝子をコードする遺伝的材料は、受精卵の前核中へマイクロインジョクションされてよく、このプロセスは当業者に知られている。しかし、ＤＮＡの挿入はランダムプロセスである。この操作された受精卵は、レシピエント雌又は養母の卵管中に移送され、これは精管切除された雄との交雑によりレシピエントとして働くように誘導されている。この雌の生じる子孫は、同様に、この導入遺伝子を有する動物を決定するために試験されている。

本発明は、さらに、事実上均質な遺伝的バックグラウンドを提供する利点を提供する、本発明の改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする核酸を有する動物の近交逐次系（inbred succesive line）を提供する。動物の遺伝的均質系列は、制御されていない細胞成長、腫瘍プログレッションにおける改変、及び／又は転移形成に関連する状態又は症状のための機能的に再現可能なモデルシステムを提供する。

本発明の動物は、種々の組織からのプライマリー細胞、例えばマウス胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ）の供給源としても、細胞培養実験のために、例えば、この分野で知られている任意の不死化細胞株の産生、例えば、レトロウィルス形質転換（これに限定されない）に使用されることができる。

本願で説明され、かつ請求された非ヒト脊椎動物のいずれか１つから由来する、このようなプライマリー細胞又は不死化細胞株は、同様に、本発明の範囲内にある。一実施態様において、このようなプライマリー細胞、例えばＭＥＦｓは、本願で説明されたような動物に由来し、これは、本願で説明されるような改変されたＦＧＦＲ４をコードする遺伝子をその細胞の全てにおいて含む。このような細胞は、前記の改変されたＦＧＦＲ４に関してヘテロ接合又はホモ接合であってよい。別の実施態様において、このようなプライマリー細胞、例えばＭＥＦｓは、付加的に、ＥＧＦＲをコードする核酸（配列番号７６又は配列番号７７）又はＥＧＦＲタンパク質を含む。このＥＧＦＲ核酸又はＥＧＦＲタンパク質は、一過的に、例えば感染により、又は安定に、例えば実施例に説明されるとおりに、存在してよい。これら動物からのこのような不死化細胞は、有利には、通常の及び形質転換した培養細胞の両方の所望の特性を示し、すなわち、これらは、形態学的及び生理学的に正常又はほぼ正常であるが、しかし、より長期間培養されることができ、そしてことによると、無期限の時間を有する。プライマリー細胞又はこれに由来する細胞株はさらに、本発明による動物モデルの構築のため使用されてよい。

他の実施態様において、本発明による細胞株は、本発明の動物モデルに上述のフェノタイプを付与するコドンを含む本発明の核酸配列又はその断片を含む核酸コンストラクトの挿入により準備されてよい。挿入のための適した細胞は、動物また同様に細胞から回収したプライマリー細胞を含み、これは、不死化細胞株のメンバーである。本発明の組み換え核酸コンストラクトは、以下説明するとおり、この分野において知られた任意の方法により細胞中に導入されてよく、これは、トランスフェクション、レトロウィルス感染、マイクロインジョクション、電気穿孔、形質導入又はＤＥＡＥ−デキストランを含むがこれらに限定されない。この組み換えコンストラクトを発現する細胞は、例えば、選択的発現を作成するために使用されるレポーター遺伝子を含む第２の組み換え核酸コンストラクトを使用することにより同定されてよい。本発明の核酸配列又はその断片を発現する細胞は、レポーター遺伝子発現の検出により非直接的に同定されてよい。

本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類が、腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化に関連するフェノタイプの、制御されていない細胞成長の、制御されていない細胞成長に関連する医学的状態、例えば癌、腫瘍形成及び／又はプログレッションの、転移形成の、制御されていない細胞成長及び／又は制御されていない細胞分割の関連において、様々な観点で有用であることが理解されるはずである。

したがって、本発明の一観点は、本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類、プライマリー細胞又は細胞株の、好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセスを研究するためのモデルとしての使用である。これは、制御されていない細胞成長、例えば癌を示す組織に対して、例えば、ディフェレンシャルプロテオーム分析を、例えば、２−Ｄゲル電気泳動、タンパク質チップマイクロアレイ又は、質量分光光度法を含む技術を用いて実施することにより、本願に説明されるように行われてよい。これはまた、核酸レベルで、例えばディフェレンシャルディスプレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイにより行われることもできる。

本発明の更なる一観点は、本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類、プライマリー細胞、又は細胞株の、好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の予防、改善又は治療において有用な剤を同定及び／又は試験を研究するためのモデルとしての使用である。試験すべき剤は、本発明による動物、例えば齧歯類に投与されることができ、当業者により知られている任意の技術が試験すべき剤の作用をモニターするために使用されることができる。この非ヒト動物、例えば齧歯類は、制御されていない細胞成長、例えば癌の様々な段階で試験すべき剤に曝露されてよく、そして、例えば、生じる腫瘍及び／又は転移形成のこの質量、領域及びパーセンテージ；この腫瘍又は転移が生じる全組織に比較したこの腫瘍又は転移の質量及び領域のパーセンテージ；腫瘍なしの同じ組織と比較される腫瘍内のＦＧＦＲ４の発現プロファイル；非腫瘍組織に比較した腫瘍組織中のＦＧＦＲ４のリン酸化状態、又は焦点形成アッセイが決定されてよい（例えば、以下の実施例も参照のこと）。

また本発明の範囲内にあるのは、本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類、プライマリー細胞、又は細胞株の、好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成についての、タンパク質及び／又は核酸診断マーカーの同定を研究するためのモデルとしての使用であり、このマーカーは、例えば、本願で説明されるとおりの制御されていない細胞成長、例えば癌に関連した医学的状態の早期相、中間相及び／又は後期相における役割を果たす遺伝子又は遺伝子産物に関連する診断マーカー、又は本願で説明されるとおりのＦＧＦＲ４改変に関連した疾病のための診断マーカーである。

このような診断マーカーは、このＦＧＦＲ４遺伝子又はそのタンパク質産物に関連してよいことが理解される。しかし、本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類は、ＦＧＦＲ４遺伝子又はタンパク質発現又は機能、又は、ＦＧＦＲ４タンパク質により影響を及ぼされる発現又は機能に影響を及ぼす他の遺伝子又は遺伝子産物に関連するマーカーの同定のために使用されることもできることが理解されるものである。さらに、本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類は、本願で説明されるとおりの、制御されていない細胞成長、例えば癌に関連する医学的状態の病原の研究のために高度に有用なモデルシステムであるので、これは、ＦＧＦＲ４遺伝子又はタンパク質発現又は活性、又は、ＦＧＦＲ４タンパク質により影響を及ぼされない発現又は活性に直接的に影響を及ぼす遺伝子又は遺伝子産物に関連する疾病関連マーカーを同定するために使用されてもよいことが理解されるものである。上述の使用が、本発明の更なる観点を提示することが理解されるものである。これは、例えば、制御されていない細胞成長、例えば癌を示す組織に対して、ディフェレンシャルプロテオーム分析を、例えば、２−Ｄゲル電気泳動、タンパク質チップマイクロアレイ、ＳＩＬＡＣ又は質量分光光度法を含む技術を用いて実施することにより、本願に説明されるように行われてよい。これはまた、核酸レベルで、例えばディフェレンシャルディスプレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイにより行われることもできる。

本発明の更なる観点は、本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類、プライマリー細胞又は細胞株の、前記改変したＦＧＦＲ４の不所望な活性、発現、又は産生の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセス又は医学的状態を研究するためのモデルとしての使用である。これは、制御されていない細胞成長、例えば癌を示す組織に対して、例えば、ディフェレンシャルプロテオーム分析を、例えば、２−Ｄゲル電気泳動、タンパク質チップマイクロアレイ、ＳＩＬＡＣ又は質量分光光度法を含む技術を用いて実施することにより、本願に説明されるように行われてよい。これはまた、核酸レベルで、例えばディフェレンシャルディスプレイ又はｃＤＮＡマイクロアレイにより行われることもできる。

本願で使用される場合に「前記改変したＦＧＦＲ４の不所望な活性、発現又は産生」との用語は、前記改変したＦＧＦＲ４をコードするタンパク質及び／又は遺伝子の、任意の不所望な活性、発現、又は産生を指す。この不所望な活性、発現、又は産生は、任意の異常な活性、発現又は産生に関連してよく、すなわち、ＦＧＦＲ４の通常の活性、発現又は産生を超えた活性、発現又は産生、また同様に、ＦＧＦＲ４の通常の活性、発現又は産生を下回る任意の活性、発現又は産生に関連してよい。

本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類、また同様にプライマリー細胞、宿主細胞又は細胞株が、本願で説明されるとおり、結合パートナー、特にＦＧＦＲ４タンパク質のリガンド、又は上流又は下流の遺伝子、又はＦＧＦＲ４タンパク質又はその遺伝子又はタンパク質活性により制御されかつ／又は改変したＦＧＦＲ４の発現により又は改変したＦＧＦＲ４タンパク質に関連した疾患において脱制御される遺伝子又はタンパク質のスクリーニング及び同定のためのモデルシステムとして高度に有用であることも理解されるものである。このような剤は、例えば、小分子薬剤、ペプチド又はポリペプチド、又は核酸、特に以下の第１表又は第２表に説明されるようなポリペプチドであってよい。特に好ましいポリペプチドは、タンパク質チロシンホスファターゼレセプタータイプＦ（ＰＴＰＲＦ、ＬＡＲ）、神経原性座ノッチホモログ２（ＮＯＴＣＨ２）、エフリンタイプ−Ａレセプター２（ＥＰＨＡ２）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（配列番号７７）、β−Ｋｌｏｔｈｏ、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１、プロパノイル−６ＡＣ−アシルトランスフェラーゼ、ホルミミデイルトランスフェラーゼ−シクロデアミナーゼ、及びヒドロキシメチルグルタリル−６Ａ合成酵素からなる群から選択される。最も特に好ましいポリペプチドは、ＥＧＦＲ（配列番号７７）である。

本願で説明されるとおりの非ヒト動物、例えば齧歯類また同様にプライマリー細胞又は細胞株は、本願で説明されるとおり、本願で説明されるとおりの乳癌腫瘍においてＦＧＦＲ４のアミノ酸改変が、他の癌の種類において、例えば肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、メラノーマにおいて、又は膵臓癌において、同じの又は類似の役割を果たすかどうかを研究するために高度に有用であるものであることも理解されるものである。

本発明は、さらに、特に前記動物に関連して、本願で説明されるとおりの、この改変したＦＧＦＲ４ポリペプチド及び核酸分子、例えば、このような改変したＦＧＦＲ４タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に関する。

したがって、本発明は、改変したＦＧＦＲ４のアミノ酸配列、例えば、マウス及びラットの改変したＦＧＦＲ４アミノ酸配列も提供する。この野生型マウス及び／又はラットＦＧＦＲ４アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号４に示されている。ＦＧＦＲ４、例えばマウス及び／又はラットＦＧＦＲ４の好ましい改変された一態様は、位置３８５又は３８６のグリシンが非グリシンアミノ酸に突然変異されているアミノ酸配列である。マウス及び／又はラットＦＧＦＲ４アミノ酸配列のより好ましい一態様は、位置３８５又は３８６のグリシンが、荷電したアミノ酸、例えば正に荷電したアミノ酸、すなわち、リシン、アルギニン又はヒスチジンに突然変異されているものである。マウス及び／又はラットＦＧＲＲ４アミノ酸配列の最も好ましい一態様は、位置３８５又は３８６のグリシンがアルギニンに突然変異されているものである（配列番号５又は配列番号６）。

ＦＧＦＲ４の別の好ましい一態様は、改変、例えばアミノ酸置換を、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１に応じたＦＧＦＲ４タンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸位置に伴うものであり、この改変は、本発明による非ヒト動物、例えば齧歯類の細胞の少なくともいくつか又は全て又は実質的に全てにヘテロ接合又はホモ接合の方式で存在する場合には、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成と関連するフェノタイプを生じる。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

一実施態様において、この改変したＦＧＦＲ４タンパク質及び核酸配列は、本願で説明されるとおり、単離されたタンパク質又は核酸配列である。本願で説明されるとおり、「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又はタンパク質、又は生物学的に活性のあるその断片は、このポリペプチド又はタンパク質が由来する細胞又は組織の供給源からの細胞材料又は他の汚染するタンパク質を実質的に含まず、又は、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学薬品を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」との用語は、タンパク質が、このタンパク質が単離されたか又はこのタンパク質が組み換えにより産生された細胞の細胞性成分から分離された細胞ＦＧＦＲ４タンパク質の調製を含む。

また本発明により包含されるのは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも４６０、少なくとも４７０、少なくとも４８０、少なくとも４９０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも７９０、少なくとも７９１、少なくとも７９２、少なくとも７９３、少なくとも７９４、少なくとも７９５、少なくとも７９６、少なくとも７９７、少なくとも７９８、少なくとも７９９又は少なくとも８００の連続アミノ酸を含むこのようなタンパク質の断片であり、これは、本願で説明されるとおりのアミノ酸改変、例えば、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、例えばマウスの又はラットのＦＧＦＲ４において、配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置でのアミノ酸置換又は野生型ＦＧＦＲ４タンパク質に比較した少なくとも１のアミノ酸位置でのアミノ酸置換、好ましくは配列番号１又は配列番号４の３８６によるＦＧＦＲ４タンパク質であって、この改変は、本願で説明されるとおりの本発明の非ヒト動物、例えば齧歯類の細胞の少なくともいくつか又は全て又は実質的に全てにおいてヘテロ接合又はホモ接合の方式で存在する場合には、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成、に関連したフェノタイプを生じるアミノ酸置換を有する。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

好ましい実施態様において、本発明のタンパク質は、配列番号５によるマウスＦＧＦＲ４タンパク質のオルソログ、好ましくは脊椎動物オルソログを示す。代替的に、これは、哺乳類オルソログ、特にハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス）、クマネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）、アナウサギ属（Oryctologus）（例えば、ウサギ）又はゴールデンハムスター属（Mesocricetus）（例えば、ハムスター）から選択された齧歯類、好ましくは配列番号６によるラットオルソログを示してよい。これは、配列番号５によるマウスＦＧＦＲ４タンパク質それぞれの、又は前記オルソログの変形であってもよく、好ましくは、配列番号６による前記ラットオルソログ、アレル変形又はその他のものであり、その際、特定のアミノ酸又は部分アミノ酸配列は、置換、付加又は欠失されている。

再度、好ましい一実施態様において、上述の改変は、配列番号１による前記マウスＦＧＦＲ４タンパク質又は相応するＦＧＦＲ４の、欠失又は少なくとも１のアミノ酸の別のアミノ酸による置換を生じる。代替的に、この改変は、マウスＦＧＦＲ４タンパク質又は上述の相応するＦＧＦＲ４のアミノ酸配列中に通常存在しない付加的なアミノ酸の挿入を生じてよい。

この置換はさらに、１のアミノ酸の別のアミノ酸の置換であってもよく、これは、上述のとおり、マウス及びラットのＦＧＦＲ４間の保存的アミノ酸置換である。このようなアミノ酸は、天然に生じないか又は天然に生じるアミノ酸であってよい。

好ましくは、この改変されたＦＧＦＲ４タンパク質の野生型残基は、上述のとおり異なるサイズ及び／又は極性を有するアミノ酸により置換されている。

本発明はさらに、成熟した改変したマウスＦＧＦＲ４又はラットＦＧＦＲ４タンパク質、又はその脊椎動物オルソログ、例えば、上で言及した特定のオルソログであって、本願で説明されるとおりの改変に相応するアミノ酸又はアミノ酸配列を含むものを包含する。

本発明はまた、改変したＦＧＦＲ４を基礎とするキメラ又は融合タンパク質をも提供する。本願で説明される場合に、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、ＦＧＦＲ４タンパク質であって、野生型又は本発明と一致して改変されたタンパク質、又は上述のとおりのこのようなタンパク質の断片であって、非ＦＧＦＲ４ポリペプチド（すなわち、ＦＧＦＲ４タンパク質又はその断片を含まないポリペプチド）、例えば、精製又はラベリングを容易にするために慣用されるアミノ酸配列、例えば、ポリヒスチジン尾部（tail）（例えばヘキサヒスチジンセグメント）、ＦＬＡＧタグ、ＨＳＶタグ、β−ガラクトシダーゼタグ及びストレプトアビジンに連結されているものを包含する。

本発明のアミノ酸配列は、この分野でよく知られているペプチド合成技術、例えば固相ペプチド合成（例えば、Fields et al. ."Principles and Practice of Solid Phase Synthesis" 、SYNTHETIC PEPTIDES, A USERS GUIDE, Grant, G. A. , Ed. , W. H. Freeman Co. NY. 1992, Chap. 3 pp. 77-183; Barlos, K. and Gatos, D. "Convergent Peptide Synthesis"、FMOC SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Chan, W. C. and White, P. D. Eds. , Oxford University Press, New York, 2000, Chap. 9: pp. 215-228を参照のこと）を使用して、又は、組み換えＤＮＡ操作及び組み換え発現（例えば宿主細胞中へ）により、なされてよい。既知配列を有するＤＮＡにおける予め定められた部位での置換突然変異を作成するための技術は良く知られており、かつ、例えば、Ｍ１３突然変異を含む。

置換型、挿入型又は欠失型変形として表現される変形タンパク質を作成するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Sambrook et al.中に適切に説明されている（以下参照）。

本発明は、以上及び以下により詳細に説明されるＦＧＦＲ４タンパク質をコードする核酸又は遺伝子配列を提供し、例えば、本発明（の動物、例えば齧歯類）に一致して改変されたＦＧＦＲ４である。好ましい一実施態様において、本発明は、本願で説明されるとおり改変されたマウス及び／又はラットＦＧＦＲ４タンパク質をコードする核酸配列を提供する。改変されたマウス及び／又はラットＦＧＦＲ４をコードする核酸又は遺伝子は、例えば、コドン３８５又は３８５それぞれがもはやグリシンをコードしないように、この野生型のマウスＦＧＦＲ４遺伝子のコドン３８５又はこの野生型のラットＦＧＦＲ４のコドン３８６を変更することにより為されることができる。グリシンをコードしない、３８５番目又は３８６番目のコドンそれぞれの構築は、この分野において良く知られている方法により達成されることができる。

グリシンは、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ又はＧＧＴによりコードされる。グリシンをコードしないコドンは、例えば、Ｐｈｅ（ＴＴＴ，ＴＴＣ）；Ｌｅｕ（ＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣ，ＣＴＡ，ＣＴＧ）；Ｉｌｅ（ＡＴＴ，ＡＴＣ，ＡＴＡ）；Ｍｅｔ（ＡＴＧ）；Ａｓｐ（ＧＡＣ，ＧＡＴ）；Ｓｅｒ（ＴＣＴ，ＴＣＣ，ＴＣＡ，ＴＣＧ），ＶａＩ（ＧＴＴ，ＧＴＣ，ＧＴＡ及びＧＴＧ）；Ｐｒｏ（ＣＣＴ，ＣＣＣ，ＣＣＡ，ＣＣＧ）；Ｔｈｒ（ＡＣＴ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧ），Ａｌａ（ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧ）；Ｈｉｓ（ＣＡＴ，ＣＡＣ），ＧＩｎ（ＣＡＡ，ＣＡＧ）；Ａｓｎ（ＡＡＴ，ＡＡＣ）；Ｌｙｓ（ＡＡＡ，ＡＡＧ）；ＧＩｕ（ＧＡＡ，ＧＡＧ）；Ｃｙｓ（ＴＧＴ，ＴＧＣ）；Ｔｒｐ（ＴＧＧ）；Ａｒｇ（ＣＧＴ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＧＡ，ＡＧＧ）；Ｓｅｒ（ＡＧＴ，ＡＧＣ）；Ｔｙｒ（ＴＡＣ，ＴＡＴ）、又はストップコドン（ＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡ）の１つをコードするコドンであってよい。やはり、部位特異的核酸突然変異の導入方法は良く知られている。

代替的に、この野生型ＦＧＦＲ４の少なくとも１のコドンは、この改変が、本発明の動物、例えば齧歯類の細胞の少なくともいくつか又は全て又は実質的に全てにおいてヘテロ接合又はホモ接合の方式で存在する場合に、本願で説明されるとおりの腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化、例えば、野生型動物に比較して増加した速度腫瘍成長及び／又は転移形成、に関連したフェノタイプを生じる限りは、野生型アミノ酸とは異なる別のアミノ酸をコードするように変更されていてよい。好ましい一実施態様において、前記動物は、付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する。

本発明の、この改変したＦＧＦＲ４タンパク質及びその断片をコードする核酸配列又は遺伝子は、単独で又は他の核酸配列、例えば、エピソーム要素、ゲノム、又はベクター分子、例えばプラスミド、例えば発現又はクローニングベクターと組み合わせて存在してよい。

本願で使用される場合に「核酸配列」との用語は、ヌクレオチド塩基の任意の連続配列系列、すなわち、ポリヌクレオチドを指し、かつ、好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。好ましくはこの核酸配列はｃＤＮＡである。しかし、これは、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。

「単離された」核酸分子又は遺伝子は、本願で言及される場合に、核酸の天然の供給源において普通に存在する他の核酸分子から分離されているものを指す。好ましくは、「単離」された核酸又は遺伝子は、このＤＮＡの天然（野生型）の供給源である生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５′−及び３′−末端に位置する配列）不含である。

ＦＧＦＲ４遺伝子分子は、標準のハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使用して単離されることができ、これは、例えば、 Sambrook et al. (eds. ), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ; 及びAusubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993中に説明されているとおりである。

本発明の核酸又は遺伝子は、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術に応じてテンプレート及び適したオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は代替的にゲノムＤＮＡを使用して増幅されることができる。このように増幅すべき核酸又は遺伝子は、適したベクター中にクローニング挿入され、かつ、ＤＮＡ配列分析により特性決定されることができる。さらに、本発明によるＦＧＦＲ４ヌクレオチド配列に相応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成装置を用いて調製されることができる。

本発明の別の観点は、ベクター、好ましくは発現ベクターであって、改変したＦＧＦＲ４タンパク質、又はその誘導体、断片、アナログ、ホモログ又は融合タンパク質をコードする核酸又は遺伝子を含有するものに関する。本願で使用される場合に、「ベクター」との用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。

適したベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーション導入される環式二重鎖環式ＤＮＡ分子を指す。ベクターの別の適した種類は、ウィルスベクターであり、その際、付加的なＤＮＡセグメントがウィルスゲノム又はこの部分にライゲーション導入されることができる。特定のベクターは、宿主細胞中で自律複製することができ、この中にこのベクターは導入される（例えば、複製の細菌性起点を有する細菌性ベクター及びエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞中へ導入すると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、これにより宿主ゲノムと一緒になって複製される。さらに、特定のベクターは、これらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指向させることができる。このようなベクターは、本願では「発現ベクター」と呼ばれる。

本発明の宿主細胞、例えば、培地中の原核性又は真核性の宿主細胞は、本願で説明されるとおり、改変したＦＧＦＲ４を産生（すなわち発現）するために使用されることができる。

したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して改変したＦＧＦＲ４タンパク質を産生するための方法を提供する。一実施態様において、この方法は、本発明の宿主細胞（この中に、改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする組み換え発現ベクターが導入されている）を、改変したＦＧＦＲ４タンパク質が産生されるのに適した培地中で培養することを含む。別の実施態様において、この方法はさらに、改変されたＦＧＦＲ４タンパク質、すなわち、組み換えにより産生されたタンパク質を、この培地又は宿主細胞から単離することを含む。

本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を産生するために使用されることもできる。例えば、一実施態様において、本発明の宿主細胞は、受精した卵母細胞又は胚性幹細胞であり、この中に改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする配列が導入されている。このような宿主細胞は次いで、外因性ＦＧＦＲ４配列がそのゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、又は相同性組み換えにより作成された動物を作成するのに使用されることができ、この中で内因性ＦＧＦＲ４配列は変更されている（実施例、材料及び方法、以下を参照のこと）。

この（宿主）細胞は、本願で説明されるとおりの改変したＦＧＦＲ４タンパク質と、改変したＦＧＦＲ４の結合パートナーとして作用する任意のタンパク質との間の相互作用を阻害する剤を同定するためにも使用されることができる。

一実施態様において、この改変したＦＧＦＲ４タンパク質は、配列番号１の位置３８５にあるグリシンが、グリシンとは異なるアミノ酸、特にアルギニンにより置換されているマウスＦＧＦＲ４タンパク質、例えば、配列番号５である。

一実施態様において、この改変したＦＧＦＲ４タンパク質は、配列番号４の位置３８６にあるグリシンが、グリシンとは異なるアミノ酸、特にアルギニンにより置換されているラットＦＧＦＲ４タンパク質、例えば、配列番号６である。

一実施態様において、この改変したＦＧＦＲ４タンパク質は、配列番号２又は配列番号８の位置３８８にあるグリシンが、グリシンとは異なるアミノ酸、特にアルギニンにより置換されているヒトＦＧＦＲ４タンパク質である。

本発明の別の観点において、本願で説明されるとおりの改変したＦＧＦＲ４タンパク質の結合パートナーとして作用するタンパク質は、タンパク質チロシンホスファターゼレセプタータイプＦ（ＰＴＰＲＦ、ＬＡＲ）、神経原性座ノッチホモログ２（ＮＯＴＣＨ２）、エフリンタイプ−Ａレセプター２（ＥＰＨＡ２）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（配列番号７７）、β−Ｋｌｏｔｈｏ、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１、プロパノイル−６ＡＣ−アシルトランスフェラーゼ、ホルミミデイルトランスフェラーゼ−シクロデアミナーゼ、及びヒドロキシメチルグルタリル−６Ａ合成酵素である。これに関して特に好ましいタンパク質はＥＧＦＲ、例えば配列番号７７のものである。

例えば、このような（宿主）細胞は、本発明の方法において使用されることができ、この方法は上述したとおりの改変したＦＧＦＲ４タンパク質と、上述したとおりの改変したＦＧＦＲ４タンパク質の結合パートナーとして作用する任意のタンパク質、特にＥＧＦＲタンパク質、例えば配列番号７７のもの、との間の相互作用を阻害する剤の同定方法であり、次の工程を含む；
（ａ）改変したＦＧＦＲ４タンパク質を過剰発現する細胞の培養；
（ｂ）試験すべき剤の培地への添加；及び
（ｃ）同じ剤の存在下で培養された野生型ＦＧＦＲ４タンパク質を過剰発現する細胞の、増殖速度の減少、アポトーシスの増加及び／又は細胞移動の減少の決定。

好ましい一実施態様において、この増殖速度は、ＭＴＴ増殖アッセイを介して決定され、このアポトーシスはＦＡＣＳ分析を介して決定され（Nicoletti et al., 1991, J. Immunol. Methods, 139: 271-279）、かつ／又はこの移動は、ボイデンチャンバーアッセイを用いて決定され、例えばこれは以下実施例において説明されるとおりである。

本発明の文脈において（宿主）細胞は、例えば、上述の方法において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であってよい。

本発明の更なる観点は、ＥＧＦＲ関連疾患、特にＥＧＦ及び／又はＴＧＦ−α媒介疾患、最も好ましくは乳癌又は肝細胞癌の治療のためのＦＧＦＲ４の阻害剤に関する。

ＦＧＦＲ４の阻害剤は、ＦＧＦＲ４に対して指向された抗体、例えば、以下に示される実施例において使用される抗体であってよい。一実施態様において、この阻害剤は、ＦＧＦＲ４に対して指向されたアプタマーである。好ましくはこのアプタマーは、２５〜７０、３５〜６０又は４０〜５０の長さの単鎖ＤＮＡ−又はＲＮＡオリゴヌクレオチドである。アプタマーの製造は、当業者に知られており、例えば、Tuerk et al.,1990, Sience 249: 505-510; Ellington et al., 1990, Nature 346: 818-822から知られている。代替的に、アプタマーはペプチドアプタマーである。このようなアプタマーは、例えば、１０〜２０のアミノ酸の可変ループからなってよく、これは、良好な溶解特性を有する足場タンパク質に対して両端で取り付けられており、例えばチオレドキシンＡである。代替的に、この阻害剤は、ＦＧＦＲ４に対して指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、ＦＧＦＲ４タンパク質をコードするｍＲＮＡのコード鎖に対して相補的である単鎖ＤＮＡ分子である。代替的に、この阻害剤は、ＦＧＦＲ４に対して指向されたＲＮＡｉ分子であってよい。代替的に、この阻害剤は、ＦＧＦＲ４タンパク質のドミナントネガティブな突然変異体、例えば、ＦＧＦＲ４タンパク質の細胞外ドメインであってよい。ＦＧＦＲ４は、ＦＧＦＲ４タンパク質又はＦＧＦＦ４核酸であってよい。これは、本願で説明されるとおりの、マウス、ラット又はヒトのＦＧＦＲ４タンパク質、特に、配列番号２又は配列番号３のヒトのタンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸配列であってよい。このＦＧＦＲ４タンパク質は、本願で説明されるとおりの、改変されたヒトのＦＧＦＲ４タンパク質又は核酸であってもよく、例えば、配列番号５のマウスタンパク質、配列番号６のラットタンパク質、又は、ヒトのＦＧＦＲ４タンパク質であり、その際、この改変は、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸位置３８８でのアミノ酸グリシンのアミノ酸置換又は前記タンパク質をコードする核酸配列である。好ましくは、このアミノ酸の置換は前記タンパク質においてアルギニンを伴うか、又は、このタンパク質をコードするそれぞれの核酸におけるコドンによる。

本発明はさらに、
（ａ）ＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の発現の決定；及び／又は
（ｂ）ＦＧＦＲ４タンパク質及びＥＧＦＲタンパク質の間での相互作用の決定；及び／又は
（ｃ）ＴＧＦ−アルファ及び／又はＥＧＦによるＥＧＦＲタンパク質の刺激の決定；及び／又は
（ｄ）ＦＧＦＲ４が、野生型タンパク質又は遺伝子、特に配列番号２又は配列番号３の野生型タンパク質又は遺伝子又は改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質であるかの決定、その際、前記改変が、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸位置３８８でのアミノ酸グリシンのアミノ酸置換であり、好ましくはアルギニンでの置換である
による深刻な癌プログレッションの診断方法であって、
その際、ＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の発現の上方調節；ＴＧＦ−アルファ及び／又はＥＧＦによるＥＧＦＲタンパク質の刺激の上方調節；及び／又は前記の改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質の存在が、深刻な癌プログレッションの指標である
深刻な癌プログレッションの診断方法に関する。ＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の発現；ＴＧＦ−アルファ及び／又はＥＧＦによるＥＧＦＲタンパク質の刺激；及び／又は前記の改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質の存在は、この分野において知られている方法により決定され、これは例えば実施例において使用される方法である。

図１は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの作成を示す図である。図２は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの特性決定を示す図である。図３は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳癌腫瘍モデルにおいて生じる腫瘍の質量及びサイズ促進することを示す図である。図４は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、時間にわたりＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳房腫瘍モデルにおいて腫瘍プログレッションを促進することを示す図である。図５は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＷＡＰＴＧＦα／ＥＧＦＲマウス乳腺腫瘍モデルにおいて癌細胞転移を促進することを示す図である。図６は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）において細胞形質転換を促進し、細胞生存を容易にすることを示す図である。図７は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５及びＧｌｙ３８５マウスは、同一の乳腺計量を示すことを示す図である。図８は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＦＶＢバックグラウンドにおいて、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲモデルにおいて腫瘍発症の時間点を減少させることを示す図である。図９は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓにおける通常の増殖、寿命及び移動を示す図である。図１０は、発癌性バックグラウンドなしの乳腺計量に対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響を示す図である。図１１は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＭＭＴＶＰｙｍＴマウス乳癌腫瘍モデルにおける腫瘍プログレッションを促進しないが、ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックなマウスにおいてＦＶＢバックグラウンドにおける腫瘍発症の時間点を減少させることを示す図である。図１２は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は過剰活性化され、ＷＡＰ−ＴＧＲα由来腫瘍の発現パターンにおいてより攻撃的なフェノタイプを促進することを示す図である。図１３は、ＥＧＦＲ又はｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓにおける発現分析及び細胞増殖を示す図である。図１４は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、細胞の形質転換、移動、足場非依存性成長及び分岐をＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいて容易にすることを示す図である。図１５は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は移動、足場非依存性成長及び分岐を、ｖ−ｓｒｃで形質転換したか又は空のｐＬＸＳＮベクターを安定に発現するＭＥＦｓ中では促進しないことを示す図である。図１６は、空のｐＬＸＳＮベクター、ｐＬＸＳＮ−ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８のいずれかを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＦＧＦＲ４相互作用パートナーを分析するための実験的構成の簡略化したスキームを示す図である。図１７は、ＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ４相互作用の評価を示す図である。図１８は、ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激後のＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５又はＡｒｇ３８５ホモ接合マウス由来のＭＥＦｓのウェスタンブロット分析を示す図である。図１９は、空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１の生物学的特性を示す図である。図２０は、空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８又はｐＬＸＳＮ−Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、増殖、アポトーシス及び移動に対するゲフィニチブの影響を示す図である。図２１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｉｎｖｉｖｏラベリングを示す図である。図２２は、ｉｎｖｉｖｏＳＩＬＡＣを介したＦＧＦＲ４の肝性相互作用パートナーの調査を示す図である。

実施例
ここで我々は、遺伝的に「クリーン」なシステムにおいて、レセプターの膜貫通ドメインにおけるグリシンをアルギニンへ変換する、マウスＦＧＦＲ４遺伝子のコドン３８５における単一ヌクレオチド差異の、ｉｎｖｉｖｏにおける乳癌プログレッションに対する影響を示す。我々は、乳癌プログレッションに対する２つの異なるＦＧＦＲ４アレルの作用を調査するために、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ノックイン（ＫＩ）マウスモデルを作成した。この目的のために、我々はＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスを、ＷＡＰＴＧＦα／ＥＧＦＲトランスジェニックマウスに交雑した（１９、２０）。このモデルにおいて、ＴＧＦα過剰発現を、妊娠中期にある乳房上皮細胞中の導入遺伝子を特異的に活性化する乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターにより制御した（１９）。このようにして、乳房発癌を、ＴＧＦα、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のリガンド、の構成的に高い過剰発現により促進した。乳房上皮細胞中のＴＧＦαの過剰発現は、増進した胞発達（alveolar development）及び損なわれた細胞分化を生じ、これは、雌の泌乳の失敗を導く。さらに、乳腺退縮（mammary involution）が遅れ、いくつかの胞状構造は完全に退行しそこねる。結果として、これらの過形成胞状結節（hyperplasic alveolar nodule）は、続く妊娠とともに数が増加し、いくつかの場合には可視可能な組織の腫瘍へと進行する（２０）。

ここで、我々は、コドン３８５でのグリシンからアルギニンへの置換が、ＷＡＰ−ＴＧＦαマウスの乳房癌腫モードにおいてこの生じる腫瘍の質量及びサイズにおいて乳癌のプログレッションを促進し、このプログレッションがｉｎｖｉｖｏで、マウス胚性繊維芽細胞において作成されるｉｎｖｉｔｒｏデータにより確認されることができたことを報告する。さらに、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、この生じる転移のサイズ及び数において肺転移を促進する。

これら結果は、ヒトの乳癌プログレッションにおけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの重要性にスポットライトをあて、したがって、この疾病を患う患者のための臨床的結果のための前診断的マーカーとして機能してよい。

材料及び方法
マウスターゲッティングコンストラクト
マウスＦＧＦＲ４のゲノム配列を、エキソン８〜１０を検出する特異的ｃＤＮＡプローブにより、ＳＶ／１２９遺伝的バックグラウンドのＲＰＣＩマウスＰＡＣライブラリー２１において検出した（Celera,USA）。マウスＦＧＦＲ４のエキソン２〜１２（１２．５ｋｂ）を次いで、ＳｐｅＩ／ＳａｃＩＩ制限（Biolabs, New England）を介してｐＢＳ−ベクター（Stratagene, California）中にクローニングした。ＧからＡへの単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）が特異的突然変異を介して３２０ｂｐのサブフラグメント中に導入された後に、これはｐｃＤＮＡ．３ベクター中にクローニングされた（Invitrogen, USA）（２１、２２）。このＳＮＰを含有する断片を次いで、ｐＢＳ−ベクター中に再クローニングした。この選択−カセットを最終的に、ＳｅａＩ（Biolabs, New England）制限により統合した。胚性幹細胞の電気穿孔前に、このターゲッティングコンストラクトを、ＳａｌＩ（Biolabs, New England）制限により線状化した。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のターゲッティング及びポジティブなクローンの選択
ＥＳ細胞系列Ｅ１４（２３）をフィーダー細胞（すなわち、照射されたマウス胚性繊維芽細胞）上に、２ｍＭグルタミン、１０００Ｕ／ｍｌＬＩＦ、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール及び２０％の熱不活性化したウシ胎児血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、高グルコース）中に維持した。

トランスフェクションのために、４×１０⁷細胞を、ＰＢＳ中で１００μｇの線状化したターゲッティングコンストラクトと混合し、８００μｌの最終容積にした。電気穿孔（２４０Ｖ、５００μＦ、６ｍｓｅｃ）をGenePulser（BioRad, Germany）を用いて実施し、この細胞を、２０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１０００Ｕ／ｍｌＬｉｆ及び０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ中で１０ｃｍの組織培養皿中に播種した。

翌日、この細胞を、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８で、このコンストラクトの統合について選択した。ネガティブ選択を２μＭのガンシクロビルで実施した。

耐性クローンを、サザンブロット（２４）により、相同性及び非正統的組み換えについて、５′−外側プローブ及びネオマイシン特異的プローブそれぞれを介して分析した。キメラマウスを作成するために、ポジティブなＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６芽細胞中にマイクロインジョクションし、偽妊娠レシピエント母の子宮に着床させた。

マウス及びゲノタイピング
キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交雑し、生殖細胞系移行を有する創始者世代（founder generation）を育てた。ｎｅｏＲ−選択カセットの除去のために、マウスをＤｅｌｅｔｅｒ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスで交雑した。Ｃｒｅ−ｄｅｌｔｅｒマウスを再度Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ戻し交雑し、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ノックイン（ＫＩ）マウスの第１世代を作成した。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスを、少なくとも１０回Ｃ５７／ＢＬ６マウスへと又は５回ＦＶＢマウスへ戻し交雑する。ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲトランスジェニックマウス（２０）は、L. Henninghausen, NIH, Bethesda, USAから、混合したC５７Ｂｌ／６及びＦＶＢ遺伝的バックグラウンドにおいて得られ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０回戻し交雑した。マウスを、通常状態下でMax-Planck-lnstitute of Biochemistryの動物施設において飼育した。

ＭＭＴＶ−ＰｙｍＴトランスジェニックマウスを、ミュンヘンにあるMaxPlanck-lnstitute of BiochemistryのChristian Baderから、ＳＶ／１２９バックグラウンドにおいて獲得した（Guy et al., 1992）。

ゲノタイプを、Qiagen Blood & Tissue DNeasy Kitを使用して製造者の推奨に応じて単離されたゲノム性末端ＤＮＡ（tail-DNA）のＰＣＲにより決定した。この選択カセットの除去を、ｎｅｏＲ特異的プライマー（5'-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTCCTCCTG-3'及び5'-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3'）を使用して検出した。Ｃｒｅ導入遺伝子の除去をＣｒｅ特異的プライマー（5'-AACATGCTTCATCGTCGG-3'及び5'-TTAGGATCATCAGCTACACC-3'）により決定した。ＦＧＦＲ４アレルのゲノタイプの検出のためのプライマーは、ＦＧＦＲ４−ＳＮＰに及び様々なＦＧＦＲアレルを区別するためのＭｖａＩ制限酵素を介したこの増幅産物の引き続く制限を有する１６８ｂｐバンドの増幅に特異的であった（forward: 5'-CGTGGACAACAGCAACCCCTG-3'; reverse: 5'-GCTGGCGAGAGTAGTGGCCACG-3'）。ＴＧＦα−導入遺伝子の存在を、ＴＧＦ−αforward 5'-TGTCAGGCTCTGGAGAACAGC-3'及びreverse 5'-CACAGCGAACACCCACGTACC-3'プライマー（L. Henninghausen, NIH, Berthesda, USAにより提供されたプライマー配列）を用いたＰＣＲ分析の実施により確認した。

ＰｙｍＴ−導入遺伝子の存在を、ＰｙｍＴ−forward 5'-TCG CCG CCT AAG ACT GC -3'及びreverse 5'-CCG CCC TGG GAA TGA TAG -3'を用いるＰＣＲ分析の実施により確認した。

腫瘍分析
発生する腫瘍の分析のために、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腹部から切開した。全ての乳腺を、腫瘍測定のために除去した。腫瘍サイズ及び質量を腫瘍組織及び乳腺組織の計量的測定及び秤量により独立して分析した。生データを体重に対して標準化した。全てのデータは平均値±ＳＤＭとして示される。全てのｐ値を、ペアードスチューデントのＴ検定を使用して計算し、値＜０．０５は統計学的有意であると考慮した。

マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）
ＭＥＦｓを１３．５ｄｐｃの胚から単離し、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に維持し、３Ｔ３プロトコルに従って維持した（２５）。

ＥＧＦＲ、ｖ−ｓｒｃ及び空のｐＬＸＳＮを安定に過剰発現するために、ＭＥＦｓを感染２４ｈｒｓ後にＧ４１８を用いたゲノム統合について選択した。ＭＥＦｓのトランス移動をボイデンチャンバー（Schubert & Weiss, Germany）中で分析した。１．５×１０⁴細胞を、０％ＦＣＳを含有する飢餓培地中に播種した。移動を４％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭに対して１６時間実施した。その後で細胞をクリスタルバイオレットで染色し、移動した細胞を巨視的に分析した。定量化のために、ボイデンチャンバー膜を５％酸性の酸において脱染し、ＥＬＩＳＡリーダー中で染色強度について分析した。軟寒天アッセイのために、細胞（１×１０⁵）を１０％ＦＢＳ及び０．３％寒天を補給したＤＭＥＭ３ｍｌに添加し、６０ｍｍ皿中の０．５％寒天床６ｍｌの上に積層させた。２４〜９６時間後に細胞の足場非依存性成長を計算し、顕微鏡により定量化した。マトリゲルアッセイを実施するために、５×１０³細胞をマトリゲル（BD bioscience）−コーティングした９６ウェル上に播種した。２４〜９６時間後に細胞の分岐を計算し、顕微鏡により定量化した。

増殖アッセイの実施のために１×１０⁵ＭＥＦｓを６ｃｍの皿中に播種し、８０％のコンフルエンスに維持し、カウントし、老化まで再播種した。集団二倍化速度を、ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）×３．３３（Ｎ＝成長期間の終了時の細胞；Ｎ０＝蒔いた細胞数）により決定した。

老化アッセイ（Cell Signalling, USA）を、６ｃｍの皿中に播種した１×１０⁵細胞に対して実施した。２４時間後に細胞を、製造者の推奨に応じてβ−ガラクトシダーゼ発現について染色し、光学顕微鏡下で分析した（Visitron Systems, Zeiss）。

焦点形成アッセイを、オンコジーンｖ−ｓｒｃ（ポジティブコントロール）、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｋｉｔを含むレトロウィルスを基礎としてｐＬＸＳＮ（Clontech, Palo Alto.USA）でのＭＥＦｓの感染（２６）により実施した。感染２４時間後に細胞を、４％ＦＣＳ含有培地中で飢餓させ、２１日間維持した。その後で細胞をクリスタルバイオレットで染色し、焦点を巨視的にカウントした。

ＭＥＦｓの寿命及び集団二倍速度を計算するために、１×１０⁵個のＭＥＦｓを６ｃｍの皿中に播種し、８０％のコンフルエントに維持し、カウントし、老化まで再播種した。集団二倍化速度を、ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）×３．３３（Ｎ＝成長期間の終了時の細胞；Ｎ０＝蒔いた細胞数）により決定した。

ＭＥＦｓのトランス移動をボイデンチャンバー（Schubert & Weiss, Germany）中で分析した。１．５×１０⁴細胞を、０％ＦＣＳを含有する飢餓培地中に播種した。移動を４％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭに対して１６時間実施した。その後で細胞をクリスタルバイオレットで染色し、移動した細胞を巨視的に分析した。アポトーシスアッセイを実施するために、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１．５×１０⁴細胞を１２ウェルプレート中に播種した。２４時間後に細胞を０．５μＭのドキソルビシンで４８時間処理した。その後で細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、アポトーシス細胞をＦＡＣＳ（FACScalibus, BD）分析において決定し、これは以前に説明されているとおりである（２７）。

ＲＮＡ及びLight Cycler^(R)分析
成体マウスのミンチにしたマウス組織の全ＲＮＡをthe RNeasy Kit（Qiagen, Germany）を用いて製造者の推奨に応じて単離した。この単離されたＲＮＡの品質を、１６Ｓ及び１８ＳＲＮＡを可視化するアガロース−ゲル電気泳動により確認した。ＲＮＡを、ｃＤＮＡへと、Boehringer Mannheimの the first strand cDNA kitを介して製造者のプロトコルに応じて逆転写した。この得られたｃＤＮＡをLight Cycler^(R) Technology (Roche Diagnostics, Mannheim)を介してＦＧＦＲ４発現レベルについて分析した。生データを、ハスキーピング遺伝子ＨＲＰＴの発現レベルについて標準化し、絶対値としてプロットした。データは平均値±ＳＤＭとして示される。

生データを、ハスキーピング遺伝子ＨＲＰＴの発現レベルについて標準化し、１又は１００％に設定したコントロールに対して相対的にプロットした。ＲＴ−ＰＣＲを介した生データ分析を、ImageJ Softwareを介して定量化し、ハスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルについて標準化し、１又は１００％に設定したコントロールに対して相対的にプロットした。

免疫沈降及びウェスタンブロット
タンパク質ライセートの調製のために、腫瘍試料を液体窒素中で急凍結させ（snap freeze）、Ultratorax（Janke & Kunkel, IKA Labortechnik）によりミンチにし、ホスファターゼ及びプロテイナーゼ−阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中で３０分間溶解させ、遠心分離により事前保証（preclear）した。培養した細胞をホスファターゼ及びプロテイナーゼ−阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。免疫沈降のために、ライセート（１０００ｍｇタンパク質）をタンパク質Ａセファロースビーズ（GE Healthcare, San Francisco）及びこの一致した一次抗体（the according primary antibody）（α-FGFR4 H121 , Santa Cruz）で４℃で一晩インキュベーションした。その後で試料をウェスタンブロットにかけ、これは以前説明されたとおりである（２８）。

生データ分析を、ImageJ Softwareを介して定量化し、アクチン／チューブリンの発現レベルについて標準化し、このコントロールに対して相対的にプロットした。

以下の一次抗体を使用した：ＦＧＦＲ４ｓｃ９００６（Santa Cruz）（α−ＦＧＦＲ４Ｈ１２１と同一である）、４Ｇ１０（upstate）、α−アクチン／α−チューブリン（Sigma）；二次抗体：α−ウサギ−ＨＲＰコンジュゲート（BioRAD）及びα−マウス−ＨＲＰコンジュゲート（Sigma）。

組織学及び免疫組織化学
腫瘍試料及び組織を４℃で一晩７０％エタノール中に固定した。翌日試料をパラフィン中に包理し、４〜８μＭの切片をマイクロトームで切り出した（HM355S, microm）。この切片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノールの段階的系列において再水和した。抗原賦活化（Antigen retrieval）を電子レンジ中でのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での調理により達成した。免疫組織化学的染色を、the Vectastain Staining Kit（Vector Laboratories, Burlingame）を用いて製造者のプロトコルに応じて実施した。１時間の、３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ緩衝液中の１０％ウマ血清でのブロッキング後に、この切片を一次抗体（α-FGFR4 Hs121 , Santa Cruz）で４０℃で一晩インキュベーションした。この二次抗体（α−ラビット,VectorLabs, USA）を１時間、３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ緩衝液中でインキュべーションし、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（Fluka, Switzerland）をカウンター染色として使用した。

病理学的分析及び転移の定量化のために、肺を切片化し、８００〜１０００μｍ間隔で分析した。切片をヘマトキシリン及びエオシン（H&E, Fluka, Switzerland）を用いて染色し、光学顕微鏡下で肺転移を同定した。転移性負荷は、転移性結節の数及びサイズを基礎として計算した。

使用したプライマー

結果：
ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩ及びＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＷＡＰ−ＴＧＦαトランスジェニックマウスの作成
腫瘍プログレッションに対するヒトＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの影響は、相関的かつ一部論争となる臨床的研究において最近示されたので、ｉｎｖｉｖｏにおいて、腫瘍プログレッションに対する単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の影響を絶対的に明らかにする緊急の必要性が存在した。ここで、作成されたマウスモデルの定義された遺伝的バックグラウンドは、患者コホートの不均一性ひいては生じる矛盾する結論の原因を克服する。したがって、我々は、ＳＶ／１２９マウスの遺伝的バックグラウンドにおいてＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ノックイン（ＫＩ）モデルを作成し、これは、癌のプログレッションに対する単一ヌクレオチド多形の影響を検査するために最初に直接的にターゲット化されたＫＩマウスモデルを示す。マウスのＦＧＦＲ４のゲノム性配列を達成するために、ＢＡＣライブラリーをＦＧＦＲ４遺伝子のエキソン８〜１０を検出する特定のｃＤＮＡプローブを使用してスクリーニングし、ポジティブなクローンをサザンブロットにより分析した（データ示さず）。この遺伝子ターゲッティングコンストラクト（図１Ａ）は、マウスのＦＧＦＲ４のゲノム配列のエキソン２〜１２（１２．５ｋｂ）を含む。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを作成するために、エキソン８中のグリシンを、部位指向した突然変異作成によりアルギニンへと変更させた。ｌｏｘＰ部位により隣接されるネオマイシン選択カセットを、エキソン１０及び１１の間にクローニングした。遺伝子ターゲッティング後来るべきネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンをサザンブロットにより分析した（図１Ｂ１）。ここで、５′−外側プローブを使用して、付加的な１０ｋｂバンドにより同定可能な正確な相同性組み換えを検出した。このポジティブなＥＳ細胞クローンのゲノタイプを次いで、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰにより分析した。ＳＮＰは新規制限部位を挿入するので、この得られた増幅産物はＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するクローン中で、Ｍｖａｌ制限酵素により切断されることができ、これは付加的な９３ｂｐの断片を生じる（図１Ｂ２）。

次に、ポジティブなクローンを、キメラを作成すべく、偽妊娠したマウスの胚盤胞中に注入した。これらマウスを次いで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交雑し、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの第１世代を育てた。ネオマイシン選択カセットを欠失するために、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５マウスを、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Deleter-Cre）についてトランスジェニックであるマウスに対して交雑させた。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５Ｃｒｅ欠失したマウスを、ＦＧＦＲ４アレルのメンデル遺伝について、マウスの統計学的有意な数の分離分析（segregation analysis）により分析した（図１Ｃ）。ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５マウスに対する戻し交雑において、この子孫は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５対ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５からの１：１の期待された分布を示した。ヘテロ接合相互交雑は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５対Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５対Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５からの１：２：１の期待された分布を示した。すなわち、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは正確なメンデル比において遺伝される。

乳癌プログレッションに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響を調査するために、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスを、ＷＡＰＴＧＦα／ＥＧＦＲについてトランスジェニックなマウスに対して交雑した（図１Ｄ３）。雌マウスの正常な泌乳を確保するために、この導入遺伝子は雄によってだけ受け継がれた。この子孫におけるＴＧＦα導入遺伝子の存在を確認するために、我々は、外因性ＴＧＦαのための特異的プライマーを用いたゲノタイピングを実施した（図１Ｄ２）。異なるＦＧＦＲ４アレルを区別するために、このゲノタイピングを、前述の付加的な制限部位によるＰＣＲ−ＲＦＬＰにより実施した（図１Ｄ１）。

ＦＧＦＲ４ＡＲｇ３８５ＫＩマウスは、ヒトの対応物（counterpart）を模倣する
ヒトにおいては、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較していかなる差異もなく様々な組織において発現されるが、この生物自体に対するまだ知られていない影響を有する（１１）。類似して、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスモデルは、Ａｒｇ３８５からＧｌｙ３８５を有するマウスを区別するまだ知られていない明白なフェノタイプを示す（データ示さず）。この作成されたＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスがそのヒトの対応物を、ＦＧＦＲ４発現、局在化及び分布においても模倣するかどうかを確認するために、我々はＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ−及びタンパク質−レベル及び局在化及び分布を成体マウスの様々な組織において分析した。

図２Ａ及びＢに示されるとおり、ＦＧＦＲ４は、乳腺、胚、脳又は腎臓を含めた様々な組織において発現される。ｍＲＮＡに対するまた同様にタンパク質発現レベルに対する異なるＦＧＦＲ４アレル間の差異は検出できなかった。次に、我々は、異なる組織のＦＧＦＲ４の発現及び局在化を免疫組織化学的に分析した（図２Ｃ）。ここで、ＦＧＦＲ４は、様々な組織において検出可能であり、かつ、ｍＲＮＡ又はタンパク質発現レベルと同じように、ＦＧＦＲ４アレル間の差異は存在しない。ＦＧＦＲ４染色した組織のための２つの例が図２Ｄに挙げられている。肺において、ＦＧＦＲ４は、平滑筋、血管及び気管支上皮細胞において発現される。乳腺においては、血管及び管の上皮細胞は明らかなＦＧＦＲ４染色を示す。これら結果は、ヒトの試料に対する以前に刊行されたデータと整合する（２９）。

このため、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスは、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベル、局在化及び分布において、そのヒトの対応物を模倣するようにみえる。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３９５は、腫瘍プログレッションを促進する
臨床的研究の以前の報告は、腫瘍イニシエーションにおけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを示唆せず、むしろ、これを癌がイニシエーションした後の促進された疾病プログレッションと関連付ける（１１、１２）。したがって、我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスを、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲについてトランスジェニックなマウスに対して交雑し、乳房腫瘍をイニシエーションさせ、かつ、初めて、マウスの乳房腫瘍プログレッションにおけるＳＮＰＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの影響をｉｎｖｉｖｏで調査する。

この目的のために、我々は、この生じる腫瘍の質量、領域及びパーセンテージを分析した（図３Ａ〜Ｄ）。ここでは、この腫瘍質量及び領域は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５マウス（Ｇｌｙ３８５）コントロールに比較した場合に、ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックな、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５（Ａｒｇ３８５）を有するマウスにおいて、有意に（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０３；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．００２）増加している（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０１；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０００６）（図３Ａ及びＢ）。これら結果は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルが、質量及び領域において、ＴＧＦα−誘発した乳癌腫瘍の有効なエンハンサーであることを示唆する。

さらに、腫瘍の領域中でのより高い有意性は、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５が、癌の細胞増殖のエンハンサーでないが、しかし、乳腺の増加した浸潤された領域を生じる移動を増進するようであることを示唆する。さらに、腫瘍領域におけるより有意な増加は、ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックな、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスにおいて、容易になった新生形質転換速度から生じてよい。これら結果は、ｉｎｖｉｔｒｏ結果と一致して、形質転換したＭＥＦｓを生じる。発癌性バックグラウンドのない、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスの分析されたコントロール乳腺は、その質量、サイズ又は病理学におけるいかなる変化をも示さない（図１０Ａ−Ｂ）。

さらに、我々は、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲモデルにおける乳房腫瘍のイニシエーションに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの影響を調査した。これをするために、我々は、全乳腺に比較した腫瘍の質量及び領域のパーセンテージである形質転換した乳腺上皮の量を分析した（図３Ｃ及び３Ｄ）。ここでは、腫瘍質量のパーセンテージが有意に増加しており（Ｇｌｙ／Ａｒｇ−ｐ＝０．０５；Ａｒｇ／Ａｒｇ−ｐ＝０．００５）、その一方で、腫瘍領域のパーセンテージは、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ及びＡｒｇ／Ａｒｇ（ｐ＝０．００２）が比較される場合にのみ有意な増加を示す。このようにして、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、図３Ａ及びＢに示されるとおり腫瘍成長を促進するだけでなく、しかし、ＴＧＦα／ＥＧＦＲ−誘発された乳房腫瘍のイニシエーションを容易にするようであり、というのも、この腫瘍性質量及び領域のパーセンテージは、ヘテロ接合からホモ接合のＡｒｇ３８５を有するマウスへと増加するからである。さらに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの有効な腫瘍促進性の影響は、Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５を有するマウスとＧｌｙ／Ｇｌｙコントロール（交配、これによる腫瘍プログレッション６ヶ月後に屠殺された）の比較により証拠付けられる（図３Ｅ）。対照的に、ＦＧＦＲ４が自体で癌イニシエーションに影響を及ぼすことができないことは図７Ａ／Ｂに示されている。

このＷＡＰ−ＴＧＦαマウスモデルに加えて、我々は、ＭＭＴＶ−ＰｙｍＴマウス乳房癌腫モデルにおけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の腫瘍促進性の影響も調査した。ｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓにおけるｉｎｖｉｔｒｏ結果のために、我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の腫瘍促進作用が、発癌性バックグラウンドに依存しているかどうかを最終的に決定するために、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの腫瘍促進作用がｉｎｖｉｔｒｏと同様にｉｎｖｉｖｏで明らかでないかどうかを調査することを目的とした。

したがって、３月齢の雌のＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスの腫瘍を分析した。腫瘍プログレッションのためのこの分析した尺度は、この分析した腫瘍の質量及び領域である。図１１Ａ及びＢに見出されるとおり、ＭＭＴＶ−Ｐｙｍｔについてトランスジェニックなマウスにおいて、ＦＧＦＲ４アイソタイプ間で、腫瘍サイズにも腫瘍質量にも有意な差異は存在しない。このように、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ｉｎｖｉｖｏアレルの腫瘍促進作用は、発癌を引き起こす遺伝的バックグラウンドに依存的である。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの腫瘍促進作用の根底をなす機構をさらに調査するために、我々は、ＦＧＦＲ４アレルの可能性のある分子的相違を研究した。多くのヒト癌において、ＦＧＦＲ４の過剰発現は、腫瘍の一般的に観察される特徴である（１、４、３０、３１）。ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の腫瘍におけるＦＧＦＲ４発現を検証するために、我々はまず、全てのゲノタイプの腫瘍ライセートからのＦＧＦＲ４の免疫沈降によりこの発現を分析した。ここで、ＦＧＦＲ４タンパク質は、非癌性乳腺に比較すると、腫瘍中で明らかに過剰発現しているが、しかし、この異なるアレル間での検出可能な差異は存在しない（図３Ｆ）。

さらに、我々は、このＡｒｇ３８５アレルがこのキナーゼ活性に対して任意の影響を有し、これにより腫瘍促進作用を生じるかどうかをチェックするために、このＦＧＦＲ４の構成的リン酸化状態を分析した。図３に示されるとおり、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５は、よりリン酸化され、これによりＧｌｙ／Ｇｌｙ−又はＧｌｙ／Ａｒｇ３８５よりもより活性化しているように見え、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの腫瘍促進性能力の可能性のあるヒントである。下流分子、例えばＥｒｋ又はＡｋｔの活性化は、この発現されたＦＧＦＲ４アレル間で有意な差異を示さなかった（データ示さず）。我々は、マウス試料中の全てのゲノタイプのＦＧＦＲ４の発現レベルを免疫組織化学的に確認もした（図３Ｃ）。特筆すべきことに、ＦＧＦＲ４アレルの発現は、アデノカルシノーマにおける差異を示さない（図３Ｇ２）、しかし、過形成乳腺においてＧｌｙ３８５に比較してＡｒｇ３８５アレルの明らかに増加した発現を示す（図３Ｇ１）。ことによると、発癌におけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の過剰発現は、グリシンアレルに相対的に増進され、これにより、より早期の発生とともに腫瘍プログレッションを促進する。さらに、ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の腫瘍の所定の例（図３Ｇ）は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレル発現のために病理学的差異を示さない。

プライマリー腫瘍におけるＦＧＦＲ４発現に加えて、我々は、アグレッシブな乳癌パラメーター、例えば運動性、浸潤性及び血管形成に関連する遺伝子の発現を調査したかった（図１２）。これらを、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウス（ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニック）からの６ヶ月の腫瘍においてこのｍＲＮＡレベルで分析した。ここで、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５を発現するＷＡＰ−ＴＧＦα−誘発された腫瘍におけるこの発現を１００％に設定し、かつ、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現するＷＡＰ−ＴＧＦα−誘発された腫瘍におけるこの発現はこれら発現レベルに対して相対的に設定した。最初に、我々は、ＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲの発現を分析し、これは、この腫瘍のプログレッシブな影響がＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５又はＥＧＦＲの過剰発現から生じることを除外し、そして、これら２種のタンパク質がこの調査されたマウスにおいて等しく発現されることを保証するためである。図１２において見受けられるとおり、ＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲの両者は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの存在において過剰発現を示さない。腫瘍サプッレサーのうち、発現における唯一の有意な変化はｐ２１について見出され、これは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現するＷＡＰ−ＴＧＦα誘発された腫瘍において有意に下方制御されている。この腫瘍サプッレサーは、高いＥＧＦＲ発現と一緒に下方制御される場合は、最も不良な予後のための決定因子として知られている。細胞サイクル及び増殖マーカーに関して、この細胞サイクルの発現に依存性のキナーゼ（ＣＤＫ）１、２及び４及びサイクリンＢを測定した。ＦＧＦＲ４は強いマイジェン性活性を有することが知られているので、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５又はＡｒｇ３８５を発現する腫瘍間で差異は期待されなかった。対照的に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現する腫瘍においてＣＤＫ１の有意により高い発現が存在した。ＣＤＫ１は移動に強力に関連しているので、この有意な過剰発現はこの腫瘍細胞の移動作用を促進又は増加させるようであり、このことは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５のよりアグレッシブなフェノタイプを有するマウスを生じる。浸潤マーカーの群のうち、転移及び血管形成に関連したタンパク質の発現を分析した。ここで、ＣＤ４４及びｆｌｋ−１遺伝子は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５腫瘍において有意に過剰発現している。浸潤に対するＣＤ４４の影響がいまだ論争を呼んでいるものの、しかし、その転移促進作用は広く許容されている。ｆｌｋ−１の有意な過剰発現が、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５腫瘍のよりアグレッシブな可能性を示唆し、というのも、ｆｌｋ−１は、この腫瘍及びその転移性能力のよりアグレッシブな挙動を生じる血管形成を促進するからである。ＭＭＰｓ１のクラスターにおいて、ＭＭＰ１３また同様にＭＭＰ１４はＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５腫瘍において過剰発現し、このことはより高い転移可能性に寄与する。

これらデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５を発現するＷＡＰ−ＴＧＦα誘発した腫瘍のよりアグレッシブな挙動を強力に示唆し、このことは、増進した腫瘍プログレッションを生じる。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、腫瘍発症（Tumor Incidence）の時間点を減少させ、時間にわたり腫瘍プログレッションを促進する
ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の腫瘍促進作用をさらに分析するために、我々は、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲモデルにおいて時間にわたりこれら３つの全てのゲノタイプの腫瘍プログレッションを追跡した。

最初に、我々は腫瘍発症の可視可能な時間点をチェックした。図４Ａに示されるとおり、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５（Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５をプールした）を有するマウスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５コントロールに比較してより早期の時間点で有意に（ｐ＝０．００１）腫瘍を発達させた。加えて、我々はさらに、ＦＶＢバックグラウンドにおけるＷＡＰ−ＴＧＦα導入遺伝子により誘発されるＧｌｙキャリアに比較したＦＧＦＲＡｒｇ３８５ＫＩマウスにおける腫瘍発生の時間点をチェックした。同様に、Ａｒｇアレルを有するマウスは、図８Ａに示されるとおり腫瘍のより早期の発生を示す（ｐ＝ｎｓ）。

さらに、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５−又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスは、より大量の腫瘍を同時に確立するだけでなく、しかし重要なことに、時間にわたり、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５マウスに比較してより迅速なその腫瘍の数を増加させる（図４Ｂ）。ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５−マウスの腫瘍質量及び領域もまた、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５マウスよりも顕著により迅速に進行する（図４Ｃ及びＤ）。

特筆すべきことに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスは、腫瘍プログレッションの早期の時間点で差異を示さないが、しかし、Ａｒｇ３８５についてホモ接合のマウスは、６〜８ヶ月後に腫瘍成長の莫大な増進を示す。すなわち、ヘテロ接合なＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５状態は、減少した腫瘍発症にとって十分であるように見えるが、ホモ接合なＡｒｇ３８５キャリアーは、腫瘍形成が一度生じると明らかにより迅速なプログレッションを示す。

次に、我々は時間にわたる乳腺中の腫瘍質量及び領域のシェアを分析した（図４Ｅ及びＦ）。ここで、腫瘍質量及びサイズの両方のパーセンテージは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５へとＧｌｙ／Ａｒｇ３８５へとＡｒｇ／Ａｒｇ３８５マウスへと明白な増加を示す。これらデータは、このＡｒｇ３８５アレルが、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ誘発された乳癌の腫瘍イニシエーションを容易にするようであるとの事実を確認する。

要約すると、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは時間にわたり、発生する腫瘍の数、質量及びサイズにおいて乳癌腫瘍プログレッションを促進し、かつ、発癌のイニシエーションを容易にし、これにより腫瘍発生の時間点を減少させるようである。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、癌細胞転移を促進する
癌の臨床的結果は、プライマリーな腫瘍の浸潤段階に依存的であるから、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲ由来の腫瘍の攻撃性及び浸潤性に対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの影響を調査することが重要である。したがって、我々は、遠位の転移の発生について切開したマウスの肺を調査した。衝撃的なことに、Ｇｌｙ３８５マウスに比較した場合にＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５マウスは肺転移のより早期の発症を示すが（図５Ａ）、病理組織学的には異ならない（図５Ｂ）。この他に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、肺転移を、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５に比較した場合に、ヘテロ接合からホモ接合なＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスに対して、サイズ及び数の両方において促進する（図５Ｃ）。この最も大きな差異は、８０μｍ未満のマイクロ転移の数において見ることができる。これら結果は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルが、腫瘍細胞浸潤を容易にするようであることを示唆する。第２に、３６０μｍよりも大きい転移において、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を有するマウスにおいてより早期の発症及びより迅速な転移成長の可能性についての証拠が観察される。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は細胞形質転換を促進する
ｉｎｖｉｔｒｏにおける腫瘍プログレッションに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの腫瘍のプログレッシブな作用の可能性のある機構を更に調査するために、我々は、単離されたＥ１３．５マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）に対する焦点形成アッセイを実施した。

この細胞を幾つかのオンコジーンで形質転換し、これは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスから得られた結果はｉｎｖｉｔｒｏを確認するものかどうか、そして、腫瘍プログッシブな作用の機構についての示唆があるかどうかを確認するためである。ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５、Ｇｌｙ／Ａｒｇ３８５又はＡｒｇ／Ａｒｇ３８５を発現するＭＥＦｓを、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ（配列番号７７）又はｃ−ｋｉｔで感染させ、その一方で、ｖ−ｓｒｃはポジティブコントロールとして機能した。図６Ａに示されるとおり、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓにおける焦点の数は３つ全てのオンコジーンにおいて著しく増加し、このことは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルが、典型的なオンコジーンと共同して細胞形質転換を促進することを示唆する。特筆すべきことに、ＥＧＦＲ又はｃ−ｋｉｔによる細胞形質転換は、弱いオンコジーンであると通常考えられるレセプターに、普通でないほど多くの数の焦点を生じる。この現象のための可能性のある説明は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５と他のレセプターチロシンキナーゼとの間での未だ知られていないクロストークが存在することかもしれない。

ｃ−ｋｉｔの次に、ＥＧＦＲでのＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓの形質転換は、焦点形成アッセイにおいて普通でないほど高い活性を示す。したがって、我々は、ＥＧＦＲ（配列番号７６）の安定な過剰発現によるＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓの形質転換後のいくつかの病理学的プロセスに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの関与を調査することを目的とした。ｖ−ｓｒｃの安定な過剰発現はポジティブコントロールとして機能し、空のｐＬＸＳＮベクターの安定な過剰発現はネガティブコントロールとして機能した。感染されたＭＥＦｓの間で等しい発現を保証するために、ＥＧＦＲ及びｖ−ｓｒｃの過剰発現を、イムノブロット分析及び定量化を介して分析した。図１３Ａに示されるとおり、ＥＧＦＲ及びｖ−ｓｒｃは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５及びＡｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓにおいて等しく発現している。興味深いことに、ＦＧＦＲ４は、ＥＧＦＲ形質転換された細胞においてｖ−ｓｒｃで形質転換したＭＥＦｓに比較して明らかに上方制御されており、そして、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓに相対的に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５において、より一層上方制御されかつ過剰活性化されている。この結果は、ＥＧＦＲウィルス発現ベクターで感染させたＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓの焦点形成アッセイにおける増加した形質転換速度についての可能性のある説明を生じる。さらに、ＦＧＦＲ４の上方制御は、これら２つのレセプターのこれまで知られていないクロストークについての更なる示唆である。我々はさらに、この、ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおけるＦＧＦＲ４Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５に比較したＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５の上方制御が特定の生物学的プロセスに影響を及ぼすかどうかを調査した。増殖に関して、ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４アイソタイプ間で差異を示さない。すなわち、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、形質転換されたＭＥＦの増殖に影響を及ぼさない（図１３Ｂ）。次に、我々は、ボイデンチャンバーアッセイにおいて細胞移動に対するＥＧＦＲにより形質転換されたＭＥＦｓにおけるＦＧＦＲ４アレルの影響を分析した。非形質転換ＭＥＦｓとは対照的に、ＥＧＦＲで形質転換されたＦＧＦＲＡｒｇ／Ａｒｇ３８５ＭＥＦは、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓに比較して有意に増加した移動能力を示す（図１４Ａ）。移動の次に、我々は、足場なしで形質転換されたＭＥＦｓが生存できる能力を分析した。この足場非依存性成長は、癌細胞が転移することを可能にし、これは次いで、プライマリー腫瘍のよりアグレッシブなフェノタイプを誘発する。したがって、我々は、ＥＧＦＲにより形質転換されたＭＥＦｓを用いた軟コロニー形成アッセイを実施した（図１４Ｂ）。ＥＧＦＲ過剰発現により形質転換されたＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５の発現により２４及び９６時間後に有意に増進された足場非依存性成長を示す。完全に悪性の癌細胞は、拡散し、この取り囲む組織に浸潤するために、これらを取り囲む細胞外マトリックスを分解する能力を獲得するので、我々は、マトリゲルアッセイにおいて浸潤に対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５の影響を分析したかった（図１４Ｃ）。ＥＧＦＲにより形質転換されたＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５の存在において２４及び９６時間後にマトリゲル中で有意に増進した分岐を示す。対照的に、マトリゲル中の移動、軟寒天コロニー形成及び分岐を含めた生物学的プロセスは、ｖ−ｓｒｃで形質転換されたＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８６ＭＥＦｓにより促進されなかった（図１５）。

これら結果は、ＭＥＦｓにおいて、腫瘍プログレッションに全て寄与する、移動、浸潤及び足場非依存性を含めた生理学的プロセスに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５が影響を及ぼすことを実証する。これらプロセスは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５により影響されるものとは別個のものであり、さらに、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響は、悪性形質転換を引き起こす遺伝的バックグラウンドに依存的である。

時間にわたる発癌を模倣するために、我々は、異なる時間点での焦点形成を停止することにより、付加的な焦点形成アッセイを実施した（図６Ｂ）。Ａｒｇ／Ａｒｇ−ＭＥＦｓが顕著により迅速に形質転換するだけでなく、増加した数の焦点を作成することも明らかに示された。すなわち、時間にわたるｉｎｖｉｖｏでのこの促進され、かつより強力なプログレッションはｉｎｖｉｔｒｏにより確認されることができた。

この観察を分子的分析方法により支持するために、我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８アレルがＭＥＦｓにおいて過剰活性化され、これにより細胞形質転換を促進するかどうかを決定した。異なるＦＧＦＲ４アイソフォームの発現はＭＥＦｓにおいてまた同様にリン酸化の基本状態において等しい（図９Ａ）。次に、我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５が、細胞生存を容易にするか又はＭＥＦｓの生理学的プロセスに影響を及ぼすかどうかをチェックしたかった。したがって、我々は、ｉｎｖｉｔｒｏでこの細胞が老化するまで集団二倍の数を分析し、付加的に、３０日間継代培養されたＭＥＦｓを、老化細胞を可視化するためにβ−ガラクトシダーゼについて染色した。しかし、我々は、異なるＦＧＦＲ４アレル間で明白な差異を見出さなかった（図９Ｂ）。すなわち、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、延長された細胞寿命を促進するようにみえない。さらに、我々は、生理学的プロセスに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの影響を調査したかった。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの運動促進性作用が既にBange及び同僚によりヒト乳房カルシノーマ細胞株を用いて示されているので、我々はＭＥＦｓにおけるこの観察を確認したかったが、しかし、図９Ｃに示されるように、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ−をＡｒｇ／Ａｒｇ−ＭＥＦｓに比較した場合に差異は観察されなかった。対照的に、Ａｒｇを有するＭＥＦｓは、ＤＮＡ損傷剤に対する応答において細胞生存を強力に支持するように見えた。ドキソルビシンでの処理４８時間後に、Ａｒｇ／Ａｒｇ−ＭＥＦｓは有意に（ｐ＝０．０３）減少したパーセンテージのアポトーシス細胞を、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ−ＭＥＦｓに比較して示した。付加的に、我々は、他の化学療法薬剤を用いた処理後のＦＧＦＲ４−Ａｒｇ３８５の抗アポトーシス性の影響を調査した。３μＭのシスプラチン（ドキソルビシンと同様に、ＤＮＡとインターカレーションする）の存在下において、Ａｒｇを有するＭＥＦｓは、処理４８時間後に減少したアポトーシスを示した。対照的に、タキソール（紡錘体の組織に干渉する）での４８時間の処理後に、Ｇｌｙ又はＡｒｇを有するＭＥＦｓの間で差異は観察されなかった（図６Ｃ）。

ことによると、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、化学療法薬剤に対するより高い寛容性により細胞がＤＮＡの損傷を生き残ることを可能にし、かつ、ＤＮＡ損傷又は−修復システムはＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを発現するＭＥＦｓにおいてより迅速かつより効率的に応答する。

新規のＦＧＦＲ４相互作用パートナーの調査
ＦＧＦＲ４及びそのＡｒｇ３８８変形の最も目立つ影響は、不良な臨床的結果と相関する癌におけるその関与である。さらに、ＦＧＦＲ４は、肝臓のホメオスタシスの維持に関与する。しかし、ＦＧＦＲ４が発癌又は肝臓代謝を支持する独特な機構はさらに明らかにされるべきである。この目的のために、我々は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでＳＩＬＡＣを基礎とする質量分析により、ＦＧＦＲ４相互作用パートナーのプロテオーム分析を実施した。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における新規のＦＧＦＲ４結合パートナーの調査
ＦＧＦＲ４は、例えばＨＥＲファミリーレセプターに比較してかなり低いレベルで発現し、この自然科学的ツール、例えば抗体は、このレセプターの調査における制限を示すので、我々は、Bange et al. (2002)により改変されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌腫瘍由来細胞をモデルシステムとして選択した。ここで、ＦＧＦＲ４はそのＧｌｙ３８８又はＡｒｇ３８８変形のいずれかで過剰発現され、その癌プログレッション増進作用を発揮する（Bange et al. 2002 (35)）。ＦＧＦＲ４過剰発現は、質量分析によるＦＧＦＲ４タンパク質の検出を広範囲に簡略化し、そして、ＦＧＦＲ４アレル間のこの差異がこの同じモデルシステムにおいて分析されることができる。

ＦＧＦＲ４相互作用パートナーの定量的質量分析の分析を実施するために、我々は、細胞のディフェレンシャル代謝ラベリングを達成するthe SILAC Technologyを使用した（Ong and Mann, 2006）。この獲得される相互作用パートナーを確認するために、我々は、いわゆる「ラベルスウィッチ」を実施した。定量的質量分析を、Ａｒｇ⁰／Ｌｙｓ⁰また同様にＡｒｇ¹⁰／Ｌｙｓ⁸ラベルにより、Ｇｌｙ３８８又はＡｒｇ３８８変形のいずれかを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で実施した。空のｐＬＸＳＮベクターを発現する親のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ネガティブコントロールとして機能し、かつ、Ａｒｇ⁴／Ｌｙｓ⁶ラベル化された（図１６）。細胞のラベル化及び試料調製は、以前に説明されているとおりに実施した（Andersen et al., 2005; Shevchenko et al.）。

第１表は、ＦＧＦＲ４の可能性のある相互作用パートナーである全てのタンパク質を示す。同定されたタンパク質は、空のｐＬＸＳＮを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてその検出値に対して標準化されていた。ここから、ネガティブコントロールに比較して５倍の上方制御を有する全てのタンパク質は、ＦＧＦＲ４の推定的相互作用パートナーである。第１表はさらに、ネガティブコントロールと比較した上方制御により示される相互作用の強度、及び、相互作用において差異がないことを意味する値１でのＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８及びＡｒｇ３８５変形の間の差異を示す。このＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８及びＡｒｇ３８５自体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における過剰発現の結果として高度に上方制御されることが見出された。これら結果は、実験的構成また同様にこの過剰発現システムが適当に働いたことを示す。さらに、タンパク質チロシンホスファターゼ、レセプタータイプＦ（ＰＴＰＲＦ、ＬＡＲ）、神経原性座ノッチホモログタンパク質２（ＮＯＴＣＨ２）、エフリンタイプ−Ａレセプター２（ＥＰＨＡ２）及び最も興味深いことに上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、配列番号７７）が、高度に上方制御されることが見出された。ＬＡＲは、膜貫通ホスファターゼであり、かつ、様々なレセプターチロシンキナーゼの機能を制御することが知られている。その活性は、ＥＧＦＲによりネガティブに制御されることが知られている（Ruhe et al., 2006）。ＬＡＲの欠損は、ｃＭＥＴによる増加した肝細胞の細胞増殖、インスリン耐性及び増加した腫瘍細胞転移に関連している（Machide et al., 2006; Mander et al., 2005; McArdle et al., 2005）。ＬＡＲの過剰発現は、哺乳類細胞においてアポトーシスを誘発する（Weng et al., 1998）。この上、ＬＡＲは、ＦＲＳ２と相互作用することによりＦＧＦ誘発されたシグナリングの制御に関与する（Wang et al., 2000）。ＥＰＨＡ２は、多くのヒトのアグレッシブな癌細胞上で上方制御される膜貫通レセプターチロシンキナーゼである。他のレセプターとは異なり、これは、腫瘍プログレッションを引き起こすリガンド結合なしのキナーゼ活性（EphrinA1）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含めた乳癌細胞において、ＥＰＨＡ２は細胞付着を誘発するリガンド又は抗体結合すると悪性癌細胞の挙動をネガティブに制御する（Carles-Kinch et al., 2002; Noblitt et al., 2004）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥＧＦＲ過剰発現は、癌発達及びプログレッションのいくつかの鍵となる特徴と関連し、かつ、様々な癌において有効なターゲットを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、複数の機構を介したＥＧＦＲの刺激は、その悪性挙動において増加を生じる（Wang et al., 2009; Zheng et al., 2009）。これらデータは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８又はＡｒｇ３８８変形を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、乳癌細胞においてＦＧＦＲ４の可能性のある相互作用パートナーを研究するために有用なモデルを提示することを示唆する。さらに、ＦＧＦＲ４は、様々なレセプターチロシンキナーゼと相互作用するようである。しかし、全ての可能性のある相互作用パートナーは、異なるＦＧＦＲ４アイソタイプ間で差異を示さなかった。

第１表：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＦＧＦＲ４の可能性のある新規の相互作用パートナーの要約：可能性のある相互作用パートナーは、「ラベルスウィッチ」により確認され、同定されたタンパク質の評価尺度は、上方制御≧５倍、レーザーペプチド（Razor Peptid）（＝ＲＰｓ）＞２、ＰＥＰ＜０．０３；この表はさらに、ＦＧＦＲ４アイソタイプ間で数倍の上方制御及び数倍の差異（fold of upregulation and fold difference）を示す；値１は、ＦＧＦＲ４アイソタイプ間の等しい相互作用を示す。

ＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ４相互作用の検証
興味深いことに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における質量分析の分析から得られたデータは、ＦＧＦＲ４の相互作用パートナーとして特にＥＧＦＲを示した。ＥＧＦＲは、癌において様々なプロセスの鍵となる制御因子であり、認容された治療的ターゲットであり、そして、我々の実験において使用されるＷＡＰ−ＴＧＦαマウスの乳房癌腫モデルにおける腫瘍プログレッションの主たる成分である。したがって、ＥＧＦＲとＦＧＦＲ４の間の可能性のある相互作用の検証は、この他の分析された相互作用パートナーの検証に先行した。

第１に、我々は、ＦＧＦＲ４が、空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８又は−Ａｒｇ３８８のいずれかを過剰発現するＭＤＡ−Ｍｂ−２３１の細胞においてＥＧＦＲと一緒に共免疫沈降されることを示すことをもくろんだ（図１７Ａ）。これらデータは、これら２のレセプターの相互作用のための第１のヒントを示唆する。質量分析の分析とは対照的に、ウェスタンブロット分析は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８に比較した、共免疫沈降したＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８の増加した含量を示した。期待されたように、このネガティブコントロールは共免疫沈降したＦＧＦＲ４を示さず、というのも、ＦＧＦＲ４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてほとんど発現していないからである。にもかかわらず、タンパク質は、この膜にクラスターにおいて大抵局在化しているので、共免疫沈降は、２のレセプター間の相互作用のための最終的な証拠ではない。したがって、我々は、ＥＧＦ刺激の際のＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ４相互作用を調査した。図１７Ｂに示されるとおり、ＥＧＦＲは、過剰発現したＦＧＦＲ４の存在下において増加したリン酸化を示した。さらに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥＧＦＲは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８の存在下におけるよりもより一層活性化されている。興味深いことに、この共免疫沈降されたＦＧＦＲ４−Ａｒｇ３８８は、ＦＧＦＲ４−Ｇｌｙ３８８に比較してより一層活性がある。この他に、ＦＧＦＲ４のリン酸化は、ＥＧＦ刺激の際に時間を超えて増加する。これらデータは、ウェスタンブロット分析の定量化により確認された（図１７Ｃ）。さらに、この下流のシグナリングタンパク質Ａｋｔの活性化は、ＥＧＦ刺激の際にＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において増加している。Ｅｒｋの活性化は、異なるＦＧＦＲ４アイソタイプ間で相違しなかった（データ示さず）。この結果は、ＥＧＦ刺激の際のＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲの生理学的相互作用を示唆する。同様に、このＥＧＦＲ−ＦＧＦＲ４相互作用は、刺激されていない細胞においてはほとんど見受けられない。要約すると、ＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲは直接的な相互作用パートナーである。ここで、ＦＧＦＲ４は、ＥＧＦ刺激の際にレセプターリン酸化によりＥＧＦＲ誘発されたシグナリングを支持するように見え、その一方で、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８はこのシグナルを促進する。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において得られたデータをさらに確認するために、我々は、ＥＧＦＲで形質転換したＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウス由来のＭＥＦｓにおいてＥＧＦ及びＴＧＦα刺激の際のシグナリングを調査した。ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓは、ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激の際にＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの存在下において増進されかつ延長された、Ａｋｔの活性を示した（図１８Ａ）。Ｅｒｋの活性化は、異なるＦＧＦＲ４アイソタイプ間での差異を示さない（データ示さず）。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に類似して、ＥＧＦＲで形質転換し、かつ、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現するＭＥＦｓは、ｐＥＧＦＲレベルにおいて、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５ＭＥＦｓに比較して有意な増加を示す（ＥＧＦ５′−ｐ＝０．００００７３、ＥＧＦ１０′−ｐ＝０．００２５、ＴＧＦα５′−ｐ＝０．０７、ＴＧＦα１０′−ｐ＝０．０１）（図１８Ｂ）。この他に、ＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓは、ＥＧＦ及びＴＧＦα刺激の際にＦＧＦＲ４の活性化を示す（図１８Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と類似して、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを発現するＭＥＦｓは、ＦＧＦＲ４の増加した活性を示す。これらデータは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において得られた結果を確認する。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＥＧＦＲの活性化及びこれに続く下流のシグナリングを明らかに支持する。

ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてこの移動性挙動及びゲフィニチブに対する感受性に影響を及ぼす
ＥＧＦＲとＦＧＦＲ４の間の相互作用を更に調査するために、我々は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生物学的特性に対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８の影響を分析した。我々は最初に、空のｐＬＸＳＮ、ｐＬＸＳＮ−Ｇｌｙ３８８及び−Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を分析した。図１９Ａにおいて示されるように、この過剰発現したＦＧＦＲ４は、通常の条件下でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対して影響を有しなかった。図１９Ｂにおいて示されるとおり、ＦＧＦＲ４の過剰発現は、移動において極めて大幅に増加し、このことは、細胞の移動挙動を促進するためのＦＧＦＲ４の莫大な能力を示唆する（Ｇｌｙ３８８−ｐ＝０．００１、Ａｒｇ３８８−ｐ＝０．００１）。その上、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１に比較して増進した移動挙動を示す。Bange et al.によるデータとは対照的に、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動を抑制しなかった。これは、細胞−細胞接触よりむしろ走化性移動における変化をモニターするボイデンチャンバーアッセイに比較して異なる応答を生じる可能性があるBange et al. (2002) (35)のスクラッチアッセイのためであるかも知れない。

ＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ４の間の生理学的関連をさらに分析するために、我々は、ゲフィニチブに対する曝露の際のＭＤＡ−ＭＢ−２３１過剰発現細胞における異なるＦＧＦＲ４アレルの間の差異を調査した。この小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＴＰとの競合によりＥＧＦＲリン酸化を遮断し、これにより、ＥＧＦＲ媒介された下流シグナリングを阻害する（Herbst et al., 2004）。したがって、ＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ４の二量体化を必要する生理学的プロセスは、ＥＧＦＲ阻害剤なしで得られたものと比較してゲフィニチブの存在において異なる結果を生じるはずである。我々は最初に、空のｐＬＸＳＮベクター又はＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８又はＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８のいずれかを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の応答を、ＭＴＴ増殖アッセイにおいてゲフィニチブ（０．０２５〜２０μＭ）の増加する濃度に対して決定した（図２０Ａ）。興味深いことに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を発現する細胞は典型的な用量応答曲線を示し、その一方で、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８及び空のｐＬＸＳＮベクタ−を発現する細胞は、ゲフィニチブ２０μＭまで応答を示さない。この分析されたＩＣ₅₀は、空のｐＬＸＳＮ又はＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の両者に対して１８．７２μＭであると見積もられた。対照的に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について計算されたＩＣ₅₀は、９．５３μＭであった。これら結果は、ゲフィニチブに対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８細胞のより高い感受性を示し、かつ、これら細胞のより高いＥＧＦＲ依存性を示唆する。さらに、我々は、この減少した増殖が、増殖の停止又はアポト−シス（ゲフィニチブにより誘発された）から生じるかどうかを決定したかった。したがって、我々は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるゲフィニチブ処理に対する応答におけるアポトーシスに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８過剰発現の影響を調査した。図２０Ｂに示されるとおり、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に比較して、ゲフィニチブに対して９６時間後に有意に増加したアポトーシス性応答を示す（２０μＭ−ｐ＝０．０１２；１０μＭ−ｐ＝０．００２２）。これらデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、細胞生存に関して、ゲフィニチブに対して増加した感受性を示すことを示唆する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを過剰発現することにより、有意に増進した移動能力を獲得するので、我々は、ゲフィニチブ（２．５μＭ）の存在下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動挙動を決定した（図２０ｃ）。ボイデンチャンバーアッセイにおける移動１５時間後に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＤＭＳＯ処理したコントロール細胞に比較して移動の２２．２８％の阻害を示す。対照的に、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８アレルを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６．２８％だけの阻害しか示さなかった。これら結果は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の移動能力がＥＧＦＲの分子作用に依存的であり、かつさらにゲフィニチブ処理に対して増加した応答を示すことを示唆する。

結論として、ゲフィニチブでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理は、細胞生存及び移動に関してＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲの間の強力な生理学的関連を示唆する。その上、ＦＧＦＲ４及びＥＧＦＲの間の分子的相互作用の依存性は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルの存在において増加している。

ｉｎｖｉｖｏでの肝性ＦＧＦＲ４の新規相互作用パートナーの調査
細胞培養中の安定なアイソタイプラベリング（ＳＩＬＡＣ）は、定量的な、質量分析（ＭＳ）ベースのプロテオミクスのための万能なツールである。全般的な相互作用及び関連を組織特異的にそして全生物の影響とともに調査するために、Kruger et al.は、マウスに天然の又は¹³Ｃ₆置換したタイプのいずれかのリシンを含む食餌を供給することによりｉｎｖｉｖｏＳＩＬＡＣを確立した（図２１）。

ＦＧＦＲ４は、肝臓において、脂質−、グルコース−及び胆汁酸代謝を含む様々な代謝プロセスにおいてまた同様に、肝臓発癌において関与している（Huang et al., 2008; Huang et al., 2007）。最近の刊行物もまた、ＦＧＦＲ４及びそのＡｒｇ３８８変形の分子作用についていくつかの証拠を提供し、相互作用パートナーを含むこの独特な機構は未だ知られていない（Stadler et al., 2006; Wang et al., 2006; Wang et al., 2008）。

肝性ＦＧＦＲ４結合パートナー及びＦＧＦＲ４アイソタイプに関するその差異の定量的分析
肝性ＦＧＦＲ４の新規相互作用パートナーを調査するために、質量分析の分析を、ＦＧＦＲ４と共免疫沈降する全てのタンパク質を同定するために実施した。相互作用パートナーの定量的分析を可能にするために、このラベル化ＳＩＬＡＣマウスを内部標準として使用した（Kruger et al., 2008）。非特異的結合パートナーを除外するために、第１の実験的段階は、全ての非選択的バインダーを同定するため抗体−ＦＧＦＲ４相互作用を選択的に遮断するためにＦＧＦＲ４遮断ペプチドを確立することであった。図２２Ａに見受けられるとおり、ホームメードα−ＦＧＦＲ４ｅｘ抗体（C. Stadler, 2005）を作成するために使用されるＦＧＦＲ４過剰発現コンストラクトは、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションされた。この組み換えＦＧＦＲ４タンパク質を精製し、トリプシン又はＬｙｓＣで消化した。この得られる遮断ペプチドを、その遮断効力についてＦＧＦＲ４免疫沈降において試験した。図２２Ａにおいて示されるとおり、特に、ＦＧＦＲ４遮断ペプチドのトリプシンによる消化が、この抗体−ＦＧＦＲ４相互作用を明らかに消滅させた。したがって、この合成された遮断ペプチドは、肝臓中の新規ＦＧＦＲ４相互作用パートナーの以下の質量分析の分析のために適用可能であった。

図２２Ｂは、ｉｎｖｉｖｏＳＩＬＡＣを介した新規ＦＧＦＲ４相互作用パートナーの調査に関する実験的構成を示す。ＳＩＬＡＣマウスは、定量可能な結果を達成するために内部標準として使用された。ラベル化されていないマウスの肝性ＦＧＦＲ４は、非特異的結合パートナーを検出するために遮断ペプチドの存在下で免疫沈降された。定量的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において、ＦＧＦＲ４及びその特異的相互作用パートナーは、ラベル化分画において高度に上方制御されるはずである。非特異的相互作用パートナーは、１：１の比を、遮断ペプチドでインキュベーションされたラベル化されていない分画に比較して示すはずである。遮断ペプチドがウェスタンブロット分析において高い効力を示したにもかかわらず、質量分析の分析は、ＦＧＦＲ４の特異的結合パートナーとして〜３００のタンパク質を検出した（データ示さず）。このような多数の結合パートナーは、生理学的に関連のある相互作用の結果であるはずはない。したがって、肝性ＦＧＦＲ４相互作用パートナーの定量的質量分析の分析は、これら実験において利用された遮断ペプチドを用いて実施されることはできない。この遮断反応の特異性を改善するために、我々は、特異的遮断ペプチドを合成するために、この得られた遮断ペプチド混合物を配列決定した（図２２Ｃ）。トリプシン消化から得られた遮断ペプチドミックスとは対照的に、この合成された遮断ペプチドの全ては、ウェスタンブロット分析において不活性であった（データ示さず）。この理由から、肝性ＦＧＦＲ４相互作用パートナーの調査を、ＦＧＦＲ４ＫＯマウスの肝臓で実施した（Yu et al., 2000）。図２２Ｄ及びＥは、肝性ＦＧＦＲ４の相互作用パートナー及びＦＧＦＲ４アイソタイプ間のその差異を同定するための実験的構成を示す。

第２表は、全ての同定されたＦＧＦＲ４アイソタイプ相互作用パートナーを示す。ここで、有意度（ＰＥＰ＜０．０３）、レーザーペプチド（razor peptide）の量（ＲＰｓ＞１）及びＦＧＦＲ４ＫＯ実験における少なくとも３倍の上方制御は、可能性のあるＦＧＦＲ４相互作用パートナーを同定した。ＦＧＦＲ４は、ＦＧＦＲ４ＫＯマウスに比較してＳＩＬＡＣマウスにおいて高度に上方制御されている。したがって、この実験的ワークフローは、ＦＧＦＲ４の肝性相互作用パートナーの調査のための適当な設定を示す。さらに、このＦＧＦＲ４は、ＦＧＦＲ４アイソタイプ間でディフェレンシャルに発現されず、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩマウスの特性決定により既に示される事実である。βＫｌｏｔｈｏは、ＦＧＦＲ４の既知の高親和性相互作用パートナーである。この単一膜貫通タンパク質は、ＦＧＦＲ４のＦＧＦ１９／１５刺激の際の下流のシグナリング事象の活性化のための本質的なコレセプターである。したがって、強力な相互作用パートナーとしてのβＫｌｏｔｈｏの同定は、ＭＳ分析において「ポジティブコントロール」であった。第２表において見受けられるとおり、βＫｌｏｔｈｏは、ＦＧＦＲ４ＫＯマウスに比較してＳＩＬＡＣマウスにおいて高度に上方制御されており、このことは、また再度、適当な実験的設定を示唆する。この他に、我々のマウスのｉｎｖｉｖｏＳＩＬＡＣ分析は、ＦＧＦＲ４及びそのＡｒｇ３８５／３８８変形の分子作用の推論に寄与することができるこれまでに知られていない相互作用パートナーを明らかにした。ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（Ｈａｏ１）は、引き続くＨ₂Ｏ₂産生とともにグリコラート及びグリオキシコラートを酸化し、かつ、肝臓及び膵臓において最初に発現される、主としてペルオキシソームタンパク質である。ラットにおけるＨａｏ１の下方制御は、酸化的ストレスと関連したタンパク質の上方制御を特に生じる（Recalcati et al., 2003）。プロパノイル−ＣｏＡＣ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｃｐ２）は、コレステロール及びことによると他の脂質の細胞内運動において重要な役割を果たす。その欠失は、ヒトにおいて複数のフェノタイプを生じる（Ferdinandusse et al., 2006）。マウスにおいては、Ｓｃｐ２の損失は、バイナリーな脂質分泌及び肝性コレステロール代謝における変更を誘発する（Fuchs et al., 2001）。ホルミジドイル−トランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（Ｆｔｃｄ）は、葉酸肝臓代謝をコントロールすることが示唆されている（Bashour and Bloom, 1998）。さらに、Ｆｔｃｄは、自己免疫肝炎を有する患者の血清において検出される肝臓特異的抗原として認識されている（Lapierre et al., 1999）。その上、Ｆｔｃｄは、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）において過剰発現し、したがって、早期段階ＨＣＣの診断に寄与することが示唆されている（Fuchs et al., 2001）。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ−合成酵素（Ｈｍｇｃｓ２）は、ケトンの体内産生の鍵となる調節因子であり、かつ、肝臓及び大腸において高度に発現している。Ｈｍｇｃｓ２が、ｃ−ｍｙｃ及びＦＫＨＲＬ１により転写的に制御されていることが知られており、これは、インスリン刺激の際にＨｅｐＧ２細胞においてＨｍｇｃｓ２の転写を示す横紋筋腫ファミリーにおけるフォークヘッド（forkhead）の一員である。さらに、Ｈｍｇｃｓ２は、その下方制御を介して大腸癌に関与している（Camarero et al., 2006; Nadal et al., 2002）。これらの可能性のある相互作用物質のうち、Ｈａｏ１及びＳｃｐ２は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５変形とのより強力な相互作用を示し、これはＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に比較したより高い比により示唆される。全ての前述の可能性のある相互作用パートナーは、まだチロシンキナーゼに関与していないか又はＲＴＫｓと相互作用することが知られていない。したがって、基本的な追跡実験が、レセプターチロシンキナーゼの分子作用の文脈にこれらタンパク質を最初に導入するために必要である。これらの可能性のある新規相互作用物質の次に、最も興味深いターゲットは、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）である。ＥＧＦＲは、ＦＧＦＲ４と有意に相互作用することが見出され、さらに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アイソタイプに対してより高い親和性を有する。この他に、ＥＧＦＲ−ＲＡＳ−ＭＡＰＫＫ枢軸は、肝臓中の細胞増殖のための最も重要な経路の１つである（Llovet and Bruix, 2008）。これらデータは、肝性ＦＧＦＲ４の様々な新規相互作用パートナーを示す。ＦＧＦＲ４との直接的な相互作用及びＦＧＦＲ４−媒介シグナリングにおけるその関与は、さらなる調査の主題となるべきである。

第２表：肝性ＦＧＦＲ４の同定された相互作用パートナー及びＦＧＦＲ４アイソタイプ間でのその差異の列記：列記は、同定されたタンパク質のレーザーペプチド（ＲＰｓ）、タンパク質及び遺伝子名、タンパク質ＩＤｓ及びその有意度（ＰＥＰ＜０．０３）；さらに、この列記は、相互作用パートナーの強度及びＦＧＦＲ４アレル間のその差異を示す。

考察
本研究においては、我々は初めて、ｉｎｖｉｖｏでの乳癌のイニシエーション及びプログレッションに対するコドン３８５でのレセプターチロシンキナーゼＦＧＦＲ４アレルの影響を調査した。このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ＫＩ自体は、そのヒトの対応物を、ＦＧＦＲ４の発現、局在化及び分布において模倣し、かつ、未だ明らかでないフェノタイプを示す。乳房癌腫のプログレッションにおけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５ノックインマウスの役割を調査するために、我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５マウスを、ＷＡＰ−ＴＧＦα／ＥＧＦＲについてトランスジェニックなマウスに交雑させた。我々は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、質量及びサイズにおいて、生じるＴＧＦα誘発された乳房腫瘍を直接的に促進することを示す。さらに、これら腫瘍はまた、異なるＦＧＦＲ４ゲノタイプに依存して時間にわたり増加もする。さらに、これは、腫瘍発症の可視可能な時間点を減少させ、したがって、時間にわたりプログレッションにおいて、腫瘍原性の質量及びサイズのより高いパーセンテージにより実証される腫瘍イニシエーションを容易にするように見える。

特筆すべきことに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、攻撃性を促進するだけでなく、しかし、肺転移の浸潤をも支持する。転移の時間点は実質的に減少し、かつ、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを有するマウス中の肺はコントロール動物におけるよりもより浸潤される。

これらデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５／３８８アレルを不良な予後とを強力に関連させ、これにより、乳癌プログレッションの可能性のあるマーカーとしてのこのレセプターを強調する。我々のｉｎｖｉｖｏの結果は、Bange 及び同僚によるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの発見後の既に刊行されたいくつかの臨床的報告と一致しており、これは、様々な癌、例えば頭部及び頸部、前立腺又は乳癌における腫瘍プログレッションとＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを関連させる（１２−１４）。

さらに、マウスにおける我々のデータは、ｉｎｖｉｔｒｏで確認されることができた。Ａｒｇ３８５アレルを有するマウス胚性繊維芽細胞は、焦点形成アッセイにおいて異なるオンコジーンで感染された場合に、コントロール繊維芽細胞に比較してより高い形質転換速度を示した。さらに、我々は、時間にわたり、Ａｒｇ３８５ＭＥＦｓにおいて形質転換された焦点の数及び成長速度における明らかな増加を示すことができた。

ｃ−ｋｉｔの次に、ＥＧＦＲの過剰発現を通じた焦点形成は、極めて多数の焦点を生じた。したがって、我々は、ＥＧＦＲにより駆動される形質転換にＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルが寄与するかどうか調査したかった。この終わりに、我々は、ＥＧＦＲ過剰発現によりＭＥＦＦＧＦＲ４ゲノタイプ変形を安定に形質転換した。興味深いことに、ＦＧＦＲ４は、ＥＧＦＲ形質転換したＭＥＦｓにおいて上方制御され、かつ、このＦＧＦＲ４ＡＲｇ３８５は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に比較してＥＧＦＲで形質転換したＭＥＦｓにおいて過剰活性化されることが見出された。これら結果は、ＨＥＲ２及びＦＧＦＲ４について示されているとおり、これら２つのレセプター間の可能性のあるクロストークを示唆する。ＥＧＦＲ形質添加したＭＥＦｓにおいて、ＦＧＦｒ４Ａｒｇ３８５アイソタイプは、増進した細胞運動性、軟寒天コロニー形成及びマトリゲル中の分岐と有意に関連していた。これらデータは、移動及び浸潤に連結されたプロセスを介してＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５が、細胞形質転換を促進することを示唆する。さらに、移動性作用は非形質転換ＭＥＦｓにおいて検出可能でないので、これらデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５が、オンコジーン自体ではなく、むしろ、関連する生理学的プロセスの促進によりオンコジーンを支持することを明らかに示唆する。さらに、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響は、ＭＥＦｓがｖ−ｓｒｃで形質転換された場合には検出可能でなかった。これら結果は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の影響が、過形成的形質転換を引き起こす発癌性バックグラウンドに明らかに依存することを示唆し、かつ、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アイソタイプの自律的というよりはむしろ支持的な作用を示唆する。

にもかかわらず、腫瘍プログレッシブ性の作用の分子的機構は未だ知られていない。我々の研究は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの腫瘍プログレッシブ性の機能についての説明となりうるいくつかの証拠を提供する。第１に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、他のアレルに比較した場合に分析された腫瘍においてより活性化され、このことはことによると、より強力なシグナリング及びさらにはより高い細胞増殖及び腫瘍プログレッションを生じる。第２に、ｃ−ｋｉｔ及びＥＧＦＲ誘発された焦点形成アッセイの普通でない数の焦点。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルは、他のレセプター及びその下流のシグナリング分子に対する付加的な未知のクロストークを可能にし、このことは腫瘍プログレッションを駆動できる。第３に、Ｇｌｙ３８５アレルは、抑制的機能を有することが説明されていた（３３）。この文脈において、Ａｒｇ３８５アレルは、その抑制を達成しそこね、そして、これにより、他のレセプターチロシンキナーゼのシグナリングを放出するか又はこのシグナリングを増強する可能性がある。質量分析の分析は、付加的な結合パートナー及びアダプタータンパク質又は付加的な下流分子を定義するために使用され、これは、異なるＦＧＦＲ４アレルの特異的刺激後に活性化される。

さらに、我々は、腫瘍におけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アイソタイプ発現の分子的結果を、増進された腫瘍プログレッションの根底となる機構を調査するために、分析した。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、一般的にはプライマリーな腫瘍において過剰発現していないが、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５に相対的にその活性は上方制御されている。ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換が、親水性アミノ酸への変換を生じるので、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の構造は、ことによると、キナーゼドメインに対する天然の調節因子の結合を損なうか、又は、より高い親和性でもってアクチベーターが結合することを可能にする。例えばWang 及び同僚（３６）は、前立腺癌細胞株におけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８の増加した安定性を実証した。この、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の遅延されたインターナリゼーションは、変更した構造の結果である可能性があり、これは比較的より高いリン酸化状態を生じる。さらに、２つの研究は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８の存在下における細胞遺伝子発現プロファイルにおける変化を同定した。

ここで、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８は、前立腺癌において転移関連遺伝子Ｅｈｍ２及び移動促進性遺伝子ＬＰＡレセプターＥＤＧ−２の上方制御をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において促進し、これは、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８により抑制され、興味深いことに、これはＥＧＦＲの良く知られているトランスアクチベーターである。ここで、ＷＡＰ−ＴＧＦα由来の腫瘍のマイクロアレイ分析は、癌細胞におけるＦＧＦＲ４アイソタイプ誘発した遺伝子発現プロファイルにおける差異を調査することに役立つことができる。この研究において、我々は、腫瘍プログレッションに関連するいくつかの遺伝子の発現を分析した。ここでは、ＦＧＲＲ４Ａｒｇ３８５を有するＷＡＰ−ＴＧＦα由来の腫瘍は、より「アグレッシブ」な遺伝子発現パターンを示す。腫瘍サプッレサーｐ２１の顕著な有意な下方制御は高いＥＧＦＲ発現と一緒になって極めて不良な予後を予想することが知られており、かつ、細胞サイクル依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１の上方制御は、ＦＧＦＲ４を癌細胞の促進された移動能力に関与させる。この他の細胞サイクルタンパク質の変更しない発現は、細胞増殖におけるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の関与の欠損を確認する。さらに、細胞浸潤性に関連する遺伝子は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現するＷＡＰ−ＴＧＦα由来腫瘍において上方制御されていた。例えば、ＣＤ４４は、転移形成を促進し、このことは、腫瘍血管形成を制御するＶＥＧＦレセプターｆｌｋ−１と同様である。したがって、ＭＭＰ１３また同様にＭＭＰ１４は、より高い転移可能性に寄与するＦＧＦＲ４Ａｒｇ／Ａｒｇ３８５を発現する腫瘍において有意に過剰発現している。

遺伝子発現における変化の他に、ＦＧＦＲ４アイソタイプは、他の機能的に関連するタンパク質に対するその親和性において相違することができる。この可能性に言及するために、我々は、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８８及びＡｒｇ３８８の免疫沈降物のＳＩＬＡＣを基礎とする質量分析の分析を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株モデルにおいて実施した。ここで、我々は、ＦＧＦＲ４の強力な相互作用パートナーであるとＥＧＦＲを同定した。引き続く実験は、興味深いことに、ＥＧＦＲのＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８変形に対する有意に高い親和性を示し、このことは、促進された下流シグナリングを生じる。この相互作用は、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５の腫瘍プログレッション促進作用の鍵となる機構かもしれず、これは、過剰活性なＥＧＦＲが乳房の癌腫を駆動するＫＩＷＡＰ−ＴＧＦαマウスモデルにおいて我々の結果により支持されている。この他に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５を発現するＭＥＦｓにおける形質転換アッセイは、ｃ−ｋｉｔでの形質転換による焦点の普通でない数を示した。これらデータは、可能性のある相互作用パートナーＥＧＦＲの次に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８／３８５に対してより強力な親和性でもって、ＦＧＦＲ４にクロストークできる可能性のある更なるレセプターチロシンキナーゼ及びオンコジーンを示唆する。これら知見は、ＦＧＦＲ４シグナリングの関与する相互作用パートナー及びＦＧＦＲ４アイソタイプに関連する差異を最終的に決定するための更なる調査の主題となるべきである。遺伝子発現の差異及び我々の予備的なＥＧＦＲ相互作用仮説に一致して、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルを発現するマウスの癌細胞は、ｉｎｖｉｖｏで遠位の転移を生じる肺の浸潤における促進した可能性を示す。我々は、転移形成が、より早期に、かつ有意に増加した数の肺転移を伴って生じることを、ＷＡＰ−ＴＧＦαについてトランスジェニックな、ＦＧＦＲ４Ｇｌｙ３８５を発現するマウスと比較した場合に、観察した。これらデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５／３８８アレルを不良な予後と強力に関連させ、これにより、乳癌プログレッションの可能性のあるマーカーとしてのこのレセプターを強調する。我々のｉｎｖｉｖｏの結果は、我々の研究室によるＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルの発見後の既に刊行されたいくつかの臨床的報告と一致しており、これは、様々な癌、例えば頭部及び頸部、前立腺、乳房の様々な癌、メラノーマその他における腫瘍プログレッションとＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８アレルを関連させる。

対照的に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、腫瘍の質量又は領域において、ＭＭＴＶ−ＰｙｍＴについてトランスジェニックなマウスにおいて乳癌プログレッションを促進することができなかった。しかし、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴモデルにおけるネガティブな結果は、ＦＧＦＲ４の癌細胞特異的な作用の非直接的な証拠を示し、というのもこれは、癌促進作用が非直接できるである場合にＭＭＴＶ−ＰｙＭＴにより誘発される哺乳類腫瘍プログレッションを促進するはずであるからである。これは、ｖ−ｓｒｃで安定に形質転換されたＭＥＦｓで得られた結果と良好に一致する。この場合に、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５は、分析された生物学的特性のいずれも促進できなかった。これら知見は、過形成性形質転換の特異的発癌性バックグラウンドに対するＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アイソタイプの影響の依存性を強調する。ＷＡＰ−ＴＧＦα誘発された腫瘍が、過剰活性ＥＧＦＲを含む一方で、このＰｙｍＴは、腫瘍形成を生じるｓｒｃを活性化する。質量分析により分析されるとおり、ＥＧＦＲは、Ａｒｇ３８８／３８５変形に対するより強い親和性を有するＦＧＦＲ４の直接的相互作用物質である。この相互作用は、ＭＭＴＶ−ＰｙｍＴモデルに比較してＷＡＰ−ＴＧＦαモデルにおける異なる結果についての説明となるように見える。

異例なことに、我々は、ＤＮＡ損傷剤、例えばドキソルビシンに対する応答において増加した生存をＡｒｇを有するＭＥＦｓが示すことを示すことができた。ことによると、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８８／３８５は、ＤＮＡ損傷及び発生するゲノム性不安定性を細胞が生き残ることを可能にし、これは、細胞形質転換において典型的事象である。ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５発現細胞が、容易にゲノム性不安定を取り扱うことができる場合には、これらは結果としてより容易に形質転換できる。さらに、このＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５／３８８は、結果的に、ＤＮＡ修復機構を支持し、これにより、より迅速かつより効率的なＤＮＡ修復を可能にする。すなわち、より低いパーセンテージの細胞はＤＮＡ損傷に対する応答においてアポトーシスに入る。

しかし、我々のデータは、ＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルが、ｉｎｖｉｖｏにおける乳癌発達及びプログレッションの有効なエンハンサーであることを示唆する。すなわち、我々の作成したノックインマウスについての更なる研究は、他の癌、例えば肝癌においてもＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの可能性のある影響を調査するはずである。ここでは、いくつかの最近の刊行物が、肝臓機能及びホメオスタシスにおいてＦＧＦＲ４を示唆する（３４）。さらに、ＦＧＦＲ４を遮断する治療的抗体の開発は、ことによると、付加的に、典型的な癌療法、例えば化学療法薬剤と一緒に使用されることができる。さらに、ＦＧＦＲ４は、付加的にターゲット化されることができるのみならず、このレセプターのゲノム性素因（disposition）は、一致した（according）患者での癌療法の決定において含められることも考えられる。この意見は、Thussbass及び同僚によっても強力に支持され、彼らは、異なる薬剤処理後の処理された乳房腫瘍の再発の異なる時間が異なるＦＧＦＲ４アレルと関連していることを示すことができた（１６）。

総括すると、ＦＧＦＲ４の関与、及び特にＡｒｇ３８５アレルの腫瘍プログレッシブ作用の影響与は不定されることができない。我々の報告は、乳癌プログレッション及び転移における不良な臨床的結果のためのマーカーとしてのＦＧＦＲ４Ａｒｇ３８５アレルの役割を示唆する。さらに、これら観察は、生殖細胞系変更、特にレセプターチロシンキナーゼ遺伝子における単一ヌクレオチド置換の、癌の臨床的プログレッションのための影響を強調し、これによりＦＧＦＲ４を、個別化された癌療法のためのプロトタイプ薬剤の開発のための可能性のあるターゲットとして有効にする。

Claims

改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む齧歯類動物であって、その改変が、配列番号１のアミノ酸位置３８５に相応するアミノ酸位置での前記齧歯類の野生型ＦＧＦＲ４におけるアミノ酸置換である齧歯類動物。
齧歯類がマウス、ハムスター又はラット、好ましくはマウスである請求項１記載の動物。
齧歯類がマウスであり、前記アミノ酸位置が配列番号１のアミノ酸位置３８５である請求項１又は２記載の動物。
齧歯類がラットであり、前記アミノ酸位置が配列番号４のアミノ酸位置３８６である請求項１又は２記載の動物。
前記齧歯類中で配列番号１のアミノ酸３８５位に相応するアミノ酸位置がグリシンである請求項１又は４記載の動物。
前記齧歯類においてアミノ酸置換が、グリシンとは異なるアミノ酸を伴う請求項１から５のいずれか１項記載の動物。
前記アミノ酸置換が、荷電した側鎖を有するアミノ酸、好ましくはリシン、アルギニン又はヒスチジン、より好ましくはアルギニンを伴う請求項１から６のいずれか１項記載の動物。
改変したＦＧＦＲ４が、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項１から７のいずれか１項記載の動物。
前記非ヒト動物の少なくともいくつかのその細胞又は全細胞が、前記の内因性の改変したＦＧＦＲ４コード遺伝子を含有する請求項１から８のいずれか１項記載の動物。
前記の少なくともいくつかの細胞又は全細胞が、前記の改変したＦＧＦＲ４に関してヘテロ接合又はホモ接合である請求項１から９のいずれか１項記載の動物。
付加的に、制御されていない細胞成長、好ましくは癌及び／又は転移形成を示す請求項１から１０のいずれか１項記載の動物。
さらに、照射され、癌誘発剤で処置され、かつ／又は導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子がオンコジーンを含む、請求項１から１１のいずれか１項記載の動物。
（ａ）オンコジーンが、ＴＧＦ−α（配列番号７４）、ＴＧＦ−β、ＥＧＦＲ（配列番号７６）、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｋｉｔ、ＨＥＲ２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｐ５３、ｍｙｃ、又は／及びｒａｓである；及び／又は
（ｂ）癌誘発剤が、ジメチルヒドロラジン（ＤＭＨ）、アゾキシメタン（ＡＯＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチル−ニトロソ−ウレア（ＥＮＵ）又は１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート（ＴＰＡ）である
請求項１２記載の動物。
前記導入遺伝子が、乳房の細胞及び／又は肝細胞中で発現される請求項１２又は１３記載の動物。
前記ＦＧＦＲ４の改変が、腫瘍プログレッション及び／又は形成における変化に関連するフェノタイプを生じる請求項１から１４のいずれか１項記載の動物。
腫瘍プログレッションにおける前記変化が、野生型動物に比較した、腫瘍成長及び／又は転移形成の増加した速度により特徴付けられる請求項１４記載の動物。
請求項１から１６のいずれか１項記載の動物に由来するプライマリー細胞又は細胞株であって、前記プライマリー細胞が好ましくはマウスの胚性フィーダー細胞（ＭＥＦｓ）であるプライマリー細胞又は細胞株。
前記細胞又は細胞株が、前記の改変したＦＧＦＲ４に関してホモ接合又はヘテロ接合である請求項１から８のいずれか１項記載の齧歯類の細胞に由来する、請求項１７記載の動物に由来するプライマリー細胞又は細胞株。
前記細胞又は細胞株が、ＥＧＦＲをコードする核酸（配列番号７６）又はＥＧＦＲタンパク質（配列番号７７）を含む請求項１７又は１８記載の動物に由来するプライマリー細胞又は細胞株。
（ａ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセスを研究する、
（ｂ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成の、予防、改善又は治療において有用な剤を同定及び／又は試験する、
（ｃ）好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、メラノーマ、及び／又は膵臓癌において、制御されていない細胞成長、例えば、癌及び／又は転移形成についての、タンパク質及び／又は核酸診断マーカーを同定する、及び／又は
（ｄ）前記の改変したＦＧＦＲ４の不所望な活性、発現、又は産生の、分子的機構、又はこれに関連する生理学的プロセス又は医学的状態を研究する
ためのモデルとしての請求項１から１９のいずれか１項記載の動物、プライマリー細胞又は細胞株の使用。
配列番号５又は配列番号６に応じた、改変したＦＧＦＲ４ポリペプチド。
請求項２１記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
請求項２２記載の核酸分子を含む発現ベクター。
請求項２１記載のポリペプチド、請求項２２記載の核酸又は請求項２３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
改変したＦＧＦＲ４タンパク質をコードする内因性遺伝子を含む齧歯類動物であって、その際前記改変が、野生型ＦＧＦＲ４タンパク質、好ましくは配列番号１のＦＧＦＲ４タンパク質に比較して少なくとも１のアミノ酸置換であり、この改変が、ヘテロ接合又はホモ接合の方式で前記動物の少なくともいくつかの又は全ての又は実質的に全ての細胞において存在する場合には、野生型動物に比較して増加した速度の腫瘍成長及び／又は転移形成と関連するフェノタイプを生じる齧歯類動物。
付加的に、少なくともいくつかのその細胞のゲノム中で、ＴＧＦ−αタンパク質をコードする導入遺伝子を発現する請求項２５記載の齧歯類動物。
前記導入遺伝子が、乳房の細胞において、好ましくはＷＡＰプロモーターの制御下の発現により発現される請求項２６記載の動物。
前記腫瘍が、乳房の腫瘍である請求項２５から２７のいずれか１項記載の動物。
（ａ）改変したＦＧＦＲ４タンパク質を過剰発現する細胞の培養；
（ｂ）試験すべき剤の培地への添加；及び
（ｃ）この剤の存在下で培養された細胞の、同じ剤の存在下で培養された野生型ＦＧＦＲ４タンパク質を過剰発現する細胞に比較した、増殖速度の減少、アポトーシスの増加及び／又は細胞移動の減少の決定
を含む改変したＦＧＦＲタンパク質及びＥＧＦＲタンパク質の間の相互作用を阻害する剤を同定する方法。
前記の改変したＦＧＦＲ４タンパク質が配列番号５のタンパク質であり、前記の野生型ＦＧＦＲタンパク質が配列番号１のタンパク質である請求項２９記載の方法。
細胞がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞である請求項２９又は３０記載の方法。
増殖速度がＭＴＴ増殖アッセイにより決定され、アポトーシスがＦＡＣＳ分析により決定され、かつ／又は移動がボイデンチャンバーアッセイを用いて決定される請求項２９から３１のいずれか１項記載の方法。
ＥＧＦＲ関連疾患の治療のためのＦＧＦＲ４の阻害剤。
ＥＧＦＲ関連疾患が、ＥＧＦ及び／又はＴＧＦ−アルファ媒介疾患である、請求項３３記載のＦＧＦＲ４の阻害剤。
ＥＧＦＲ関連疾患が、癌、好ましくは乳癌又は肝細胞癌である、請求項３３又は３４記載のＦＧＦＲ４の阻害剤。
阻害剤が、ＦＧＦＲ４に対して指向した抗体、ＦＧＦＲ４に対して指向したアプタマー、ＦＧＦＲ４に対して指向したアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、ＦＧＦＲ４に対して指向したＲＮＡｉ分子からなる群から選択される請求項３３から３５のいずれか１項記載のＦＧＦＲ４の阻害剤。
ＦＧＦＲ４タンパク質が、ヒトＦＧＦＲ４タンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のヒトＦＧＦＲ４タンパク質である、請求項３３から３６のいずれか１項記載のＦＧＦＲ４の阻害剤。
ＦＧＦＲ４タンパク質が、改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質であり、その際、この改変が、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸位置３８８でのアミノ酸グリシンのアミノ酸置換であり、好ましくはアルギニンでの置換である、請求項３３から３６のいずれか１項記載のＦＧＦＲ４の阻害剤。
（ａ）ＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の発現の決定；及び／又は
（ｂ）ＦＧＦＲ４タンパク質及びＥＧＦＲタンパク質の間での相互作用の決定；及び／又は
（ｃ）ＴＧＦ−アルファ及び／又はＥＧＦによるＥＧＦＲタンパク質の刺激の決定；及び／又は
（ｄ）ＦＧＦＲ４が、野生型タンパク質又は遺伝子、特に配列番号２又は配列番号３の野生型タンパク質又は遺伝子又は改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質であるかの決定、その際、前記改変が、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸位置３８８でのアミノ酸グリシンのアミノ酸置換であり、好ましくはアルギニンでの置換である
による深刻な癌プログレッションの診断方法であって、
その際、ＥＧＦＲ遺伝子又はタンパク質の発現の上方調節；ＴＧＦ−アルファ及び／又はＥＧＦによるＥＧＦＲタンパク質の刺激の上方調節；及び／又は前記の改変したヒトＦＧＦＲ４タンパク質の存在が、深刻な癌プログレッションの指標である
深刻な癌プログレッションの診断方法。