CN115820882A - 一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物、鉴定方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物、鉴定方法与应用，属于基因型检测技术领域。本发明通过内切酶组合物对PCR产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果能够准确判定储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因/敏感基因，本发明通过明确储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因/敏感基因，为后续高效地采用储粮害虫的防治方法奠定了基础。本发明为明确储粮储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因、种群抗性发展预判等提供必要数据和方法，而且对于拓宽赤拟谷盗种群磷化氢敏感基因育种具有重要意义。本发明建立的鉴定储粮害虫磷化氢基因型的方法，该鉴定方法简便、精准、高效。
Description
技术领域
本发明属于基因型检测技术领域，尤其涉及一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物、鉴定方法与应用。
背景技术
储粮害虫是造成粮食数量和质量损失重要生物因素之一。粮食仓储稳定环境和食物充足为其生长繁殖提供理想温床。对储粮害虫的防治方法包含物理防治、化学防治、生物防治和生态防治，其中以磷化氢熏蒸的化学防治最为普遍。但是，由于长期以来对磷化氢熏蒸剂的不合理且单一的使用，使得储粮害虫对其产生了较为严重的抗药性。目前针对储粮害虫磷化氢抗性基因分析，精准的分析方法都是基于测序技术而建立的，其费用高、速度慢、普及性差等弊端明显，为了深入研究储粮害虫生长发育，明确储粮害虫抗药性水平，以开发高效防治手段，急需建立简便、快速、精准、易于推广使用的储粮害虫磷化氢抗性遗传基因分析方法。同时，鉴定储粮害虫种群中磷化氢基因型的发生情况有利于磷化氢的科学利用，对于新型药剂的开发也具有重要指导作用。因此，储粮害虫磷化氢基因型的鉴定意义重大，但快速准确的鉴定储粮害虫磷化氢基因型的方法目前尚未见报道。
赤拟谷盗，拉丁学名，Tribolium castaneum(Herbst)，属于鞘翅目(Coleoptera)，拟步甲科(Tenebrionidae)，拟谷盗属(Tribolium)。赤拟谷盗因其具有食性杂、多群居、危害周期长、分泌臭液、繁殖能力强等特点，对全球原粮和成品粮的储藏带来了极大的质量和数量损失。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物、鉴定方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种内切酶组合物在制备鉴定储粮害虫磷化氢基因型的产品中的应用，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。
优选的，所述基因型包括抗性基因型和敏感基因型中的一种或两种。
优选的，所述储粮害虫包括赤拟谷盗。
本发明提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。
本发明提供了一种储粮害虫磷化氢基因型的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取储粮害虫的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物1，纯化PCR扩增产物1得到gDNA；
(2)以步骤(1)得到的gDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
(3)依次用MboI和BsMAI限制性内切酶分别对PCR扩增产物2进行酶切，得到酶切产物；
(4)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)得到的酶切产物，若酶切后为一条带，则待测储粮害虫为磷化氢敏感基因型的储粮害虫；若酶切后为两条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性纯合基因型的储粮害虫；若酶切后为三条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性杂合基因型的储粮害虫。
优选的，步骤(1)中，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；步骤(2)中，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示。
优选的，步骤(3)中，所述酶切体系为：PCR扩增产物22μL，MboI/BsMAI，1μL，总体积3μL；用MboI限制性内切酶时，37℃酶切15min；用BsMAI限制性内切酶酶切时，60℃酶切15min。
优选的，步骤(2)中，所述PCR反应体系为：gDNA 2μL，RNase free water 8.5μL，Taq PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL。
优选的，步骤(2)中，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，54.2℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
本发明还提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的试剂盒，包括上述内切酶组合物。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物、鉴定方法与应用。本发明通过内切酶组合物对PCR产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果能够准确判定储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因/敏感基因，本发明通过明确储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因/敏感基因，为后续高效地采用储粮害虫的防治方法奠定了基础。本发明为明确储粮储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因、种群抗性发展预判等提供必要数据和方法，而且对于拓宽赤拟谷盗种群磷化氢敏感基因育种具有重要意义。本发明建立的鉴定储粮害虫磷化氢基因型的方法，该鉴定方法简便、精准、高效。
附图说明
图1为本发明的鉴定方法鉴定赤拟谷盗磷化氢基因型的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA Marker2000；1～4分别为编号为1、2、3和4的赤拟谷盗待测样本的酶切产物。
具体实施方式
本发明提供了一种内切酶组合物在制备鉴定储粮害虫磷化氢基因型的产品中的应用，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。
在本发明中，所述基因型优选的包括抗性基因型和敏感基因型中的一种或两种。所述储粮害虫优选的包括赤拟谷盗。本发明采用上述内切酶组合物酶切PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳的结果能够准确判定储粮害虫赤拟谷盗种群磷化氢抗性基因/敏感基因。
本发明提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。本发明的MboI限制性内切酶识别序列为5′-GATC-3′，BsMAI限制性内切酶识别序列为5′-GTCTC(N)1-3′。申请人通过12种限制性内切酶进行的随机两两组合试验中发现，由于储粮害虫磷化氢基因在扩增时会发生突变，导致并非任意限制性内切酶组合酶切时都会出现显著的规律性和指向性，而本发明惊奇地发现MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶组合获得的酶切结果具有显著的规律性和指向性，可用于判定储粮害虫赤拟谷盗磷化氢基因型。本发明对MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶来源没有特殊限定，采用本领域公知的市售产品即可。
本发明提供了一种储粮害虫磷化氢基因型的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取储粮害虫的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物1，纯化PCR扩增产物1得到gDNA；
(2)以步骤(1)得到的gDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
(3)依次用MboI和BsMAI限制性内切酶分别对PCR扩增产物2进行酶切，得到酶切产物；
(4)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)得到的酶切产物，若酶切后为一条带，则待测储粮害虫为磷化氢敏感基因型的储粮害虫；若酶切后为两条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性纯合基因型的储粮害虫；若酶切后为三条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性杂合基因型的储粮害虫。
在本发明中，提取储粮害虫的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA。本发明将提取的储粮害虫的总RNA为模板，采用南京Vazyme公司的
II 1st Strand cDNASynthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒进行cDNA的合成。
在本发明中，合成cDNA后，以cDNA为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物1，纯化PCR扩增产物1得到gDNA。所述PCR扩增引物的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1～2所示，具体引物优选为Tc-F：CGGAAAAAAATGGGCAGC，SEQ ID No.1；Tc-RCACCGGGAGGTCATCAT A，SEQ IDNo.2。所述PCR反应体系优选为cDNA 2μL，RNase free water 8.5μL，Taq PCR Master Mix12.5μL，Tc-F 1μL，Tc-R 1μL。所述PCR反应程序优选为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸5min。
在本发明中，以步骤(1)得到的gDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。所述PCR扩增引物的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3～4所示，具体引物为Tc-MM-F：AAATACGTGTCAGAGGTCAC，SEQ ID No.3；Tc-MM-R：CCAAATCAAGTCGGACATTG，SEQ ID No.4。所述PCR反应体系优选为：gDNA 2μL，RNase free water 8.5μL，Taq PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL。所述PCR反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性15s，54.2℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
在本发明中，依次用MboI和BsMAI限制性内切酶分别对PCR扩增产物2进行酶切，得到酶切产物。所述酶切体系优选为：PCR扩增产物22μL，MboI/BsMAI，1μL，总体积3μL；用MboI限制性内切酶时，37℃酶切15min；用BsMAI限制性内切酶酶切时，60℃酶切15min。
在本发明中，通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)得到的酶切产物。若酶切后在250bp～500bp处为一条带，则待测储粮害虫为磷化氢敏感基因型的储粮害虫；若酶切后在100bp～350bp为两条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性纯合基因型的储粮害虫；若酶切后100bp～500bp为三条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性杂合基因型的储粮害虫。
本发明还提供了一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的试剂盒，包括上述内切酶组合物。
在本发明中，所述试剂盒还优选的包括PCR反应体系和PCR扩增引物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下的实施例中，MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶均购自NEB，美国。
实施例1
一种储粮害虫赤拟谷盗磷化氢基因型的鉴定方法，步骤如下：
S1、赤拟谷盗总RNA提取
配制浓度为75％的乙醇溶液：在无菌容器中取若干浓度为99.99％的乙醇溶液与RNase-free water3：1混合均匀备用。
收集4只赤拟谷盗，分别编码为1、2、3和4，将收集的赤拟谷盗分别放入2mL无菌离心管中，然后在每一个离心管中先加入500μL的Trizol，用电动组织研磨仪将试虫充分磨碎，再加入500μL的Trizol，冰上静置10min；加入200μL氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡15s，冰上静置10min，然后将离心管放入高速冷冻离心机中，在12000g，4℃条件下离心15min；离心结束后，轻拿离心管避免上下层混合，取上层的澄清液于新的离心管中(尽量多取且不碰触下层)；加入500μL异丙醇，冰上静置10min，再放入高速冷冻离心机，在12000g，4℃条件下离心10min，轻拿离心管，去上清液留沉淀；在各离心管中均加入1mL配制好的75％乙醇溶液，轻勾，充分洗涤沉淀物，放入高速冷冻离心机，在7500g，4℃条件下离心5min，吸去液体，留RNA沉淀；打开离心管盖子，置于常温环境下，通风5min，使RNA沉淀干燥；分别加入30μL无核酸水(DEPC水)，用移液枪捶打，使RNA沉淀完全溶于水中，放入微量台式离心机中，离心下管壁上液体；将得到的RNA溶液放置到-80℃超低温冰箱保存备用，后续试验避免反复冻融。
S2、cDNA的合成
以步骤S1提取的赤拟谷盗总RNA为模板，采用南京Vazyme公司的H
II 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒进行cD NA的合成。按照试剂盒说明书进行操作，具体如下：
(1)RNA模板变性：在RNase-free离心管中配制如表1所示的混合液
表1
| 试剂 | 体积 |
| 4×gDNA wiper Mix | 4μL |
| Oligo(dT)<sub>23</sub>VN(50μM) | 1μL |
| Random hexamers(50ng/μL) | 1μL |
| 总RNA | 1μg |
| RNase-free ddH<sub>2</sub>O | 总体系16μL |
(2)用移液枪轻轻吹打混匀，金属浴42℃2min；
(3)配制cDNA合成反应液，加样如表2所示：
表2
| 试剂 | 体积 |
| 表1的混合液 | 16μL |
| 10×RT Mix | 2μL |
| HiScript ⅡEnzyme Mix | 2μL |
(4)用移液枪轻轻吹打混匀；
(5)按表3所示的条件进行cDNA合成反应：
表3
(6)将合成cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
S3、PCR扩增及产物纯化
以步骤S2得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应使用2×TaqMaster Mix DNA扩增酶系统(Vazyme，南京)，参照以下步骤在200μL的无酶PCR管中配制25μL的反应体系，使用的PCR引物为：Tc-F(CGGA AAAAAATGGGCAGC，SEQ ID No.1)和Tc-R(CACCGGGAGGTCATCATA，SEQ ID No.2)，PCR反应体系见表4，PCR扩增程序见表5：
表4
| 试剂 | 体积 |
| cDNA | 2μL |
| RNase free water | 8.5μL |
| Taq PCR Master Mix | 12.5μL |
| Tc-F(10μmol/L) | 1μL |
| Tc-R(10μmol/L) | 1μL |
表5
获得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA marker为参照。随后进行PCR产物的纯化，操作步骤按照
SV Gel and PCR Clea n-Up(Promega，美国)试剂盒的说明书进行，将gDNA回收产物放置于-20℃冰箱内保存备用。
S4、酶切及凝胶电泳分析
a、以步骤S3得到的gDNA为模板，进行PCR扩增。PCR克隆引物为：引物Tc-MM-F(AAATACGTGTCAGAGGTCAC，SEQ ID No.3)与Tc-MM-R(CCAAATCAAGTCGGACATTG，SEQ IDNo.4)，PCR反应体系见表6，PCR扩增程序见表7：
表6
表7
b、依次用MboI和BsMAI限制性内切酶分别对步骤a得到的PCR扩增产物进行酶切，得到酶切产物。其中，酶切体系为：PCR扩增产物2μL，MboI/BsMAI，1μL，总体积3μL；用MboI限制性内切酶时，37℃酶切15min；用BsMAI限制性内切酶酶切时，60℃酶切15min。
c、然后用1％的琼脂糖凝胶电泳分别观察编号为1、2、3、4的酶切产物是否酶切，电泳反应条件为：120V、20min。若酶切后为一条带，则待测储粮害虫赤拟谷盗为磷化氢敏感基因型的赤拟谷盗；若酶切后为两条带，则待测储粮害虫赤拟谷盗为磷化氢抗性纯合基因型的赤拟谷盗；若酶切后为三条带，则待测储粮害虫赤拟谷盗为磷化氢抗性杂合基因型的赤拟谷盗。
根据酶切琼脂糖凝胶电泳结果见图1结果表明，编号1的酶切产物在250bp～500bp处仅有一个条带，其基因型为敏感纯合SS，编号2的酶切产物在250bp～500bp处仅有一个条带，其基因型为敏感纯合SS，编号3的酶切产物在100bp～500bp处有三个条带，其基因型为抗性杂合SR；编号4的酶切产物在100bp～350bp处有两个条带，其基因型为抗性纯合RR。
实施例2本发明的鉴定方法和基因测序的比较
为了保证本发明的鉴定方法的准确性，分别对实施例1中的编号为1、2、3、4的PCR扩增得到的gDNA进行基因测序。
DNA测序由安徽通用生物采用ABI3700DNA测序仪(ABI，美国)完成，测序引物为：Tc-In-F(CTGACTTTAACAACTCCTCCCG，SEQ ID No.5)和Tc-In-R(CGGTGTAATCGGCCTTGAAT，SEQID No.6)。
其中，通过基因测序后编号为1、2、3、4的赤拟谷盗磷化氢基因型分别为赤拟谷盗磷化氢敏感纯合基因型SS、赤拟谷盗磷化氢敏感纯合基因型SS、赤拟谷盗磷化氢抗性杂合基因型SR和赤拟谷盗磷化氢抗性纯合基因型RR。
其中，测序得到的S基因如下：
TTTTACACACTTTTAAGCCAAGTTGGGCAGCTTTAATCGACGCAACGTAGCCCCCAGGTCCCGACCCAATCACGACCAAATCCGCATCGTGAGTTGTGGAGTATTGACCGTGGTGGAAGACAGTCAGGGCCCCCCGATTGCACCGTATCTGTGACAAAACTCACATTATCGAGTGACCTCTGACACGTATTTTACCCGAATTACGTAAACAGTTGTGTCACAATAATTGTAAATTAAAAGCGGTGTTAAAACCCCCAAATTTTGAGGTTATGTATTACGTAAACTACATTACGCCCAAATGACACATGAACTGTGGGTTAATTGAATGGAAATGTGCACACTCACCTTAAGTGACGAGGAGACAACGTTTCGAATGGCCGATTGCATCTTTTTAAATAAATTTTCTTAAATAATAATGACAGCTGAC，SEQ ID No.7。
测序得到的R基因如下：
TTTTACACACTTTTAAGCCAAGTTGGGCAGCTTTAATCGACGCAACGTAGCCCCCAGATCCCGACCCAATCACGACCAAATCCGCATCGTGAGTTGTGGAGTATTGACCGTGGTGGAAGACAGTCAGGGCCCCCCGATTGCACCGTATCTGTGACAAAACTCACATTATCGAGTGACCTCTGACACGTATTTTACCCGAATTACGTAAACAGTTGTGTCACAATAATTGTAAATTAAAAGCGGTGTTAAAACCCCCAAATTTTGAGGTTATGTATTACGTAAACTACATTACGCCCAAATGACACATGAACTGTGGGTTAATTGAATGGAAATGTGCACACTCACCTTAAGTGACGAGGAGACAACGTTTCGAATGGCCGATTGCATCTTTTTAAATAAATTTTCTTAAATAATAATGACAGCTGAC，SEQ ID No.8。
根据基因测序结果表明，本发明鉴定的结果：编号1的酶切产物在250bp～500bp处仅有一个条带，其基因型为敏感纯合SS，与基因测序结果一致；编号2的酶切产物在250bp～500bp处仅有一个条带，其基因型为敏感纯合SS，与基因测序结果一致；编号3的酶切产物在100bp～500bp处有三个条带，其基因型为抗性杂合SR，与基因测序结果一致；编号4的酶切产物在100bp～350bp处有两个条带，其基因型为抗性纯合RR，与基因测序结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种内切酶组合物在制备鉴定储粮害虫磷化氢基因型的产品中的应用，其特征在于，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因型包括抗性基因型和敏感基因型中的一种或两种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述储粮害虫包括赤拟谷盗。
4.一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的内切酶组合物，其特征在于，所述内切酶组合物包括MboI限制性内切酶和BsMAI限制性内切酶。
5.一种储粮害虫磷化氢基因型的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取储粮害虫的总RNA，以总RNA为模板合成cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增得到PCR扩增产物1，纯化PCR扩增产物1得到gDNA；
(2)以步骤(1)得到的gDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
(3)依次用MboI和BsMAI限制性内切酶分别对PCR扩增产物2进行酶切，得到酶切产物；
(4)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(3)得到的酶切产物，若酶切后为一条带，则待测储粮害虫为磷化氢敏感基因型的储粮害虫；若酶切后为两条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性纯合基因型的储粮害虫；若酶切后为三条带，则待测储粮害虫为磷化氢抗性杂合基因型的储粮害虫。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；步骤(2)中，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～4所示。
7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶切体系为：PCR扩增产物22μL，MboI/BsMAI，1μL，总体积3μL；用MboI限制性内切酶时，37℃酶切15min；用BsMAI限制性内切酶酶切时，60℃酶切15min。
8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应体系为：gDNA2μL，RNase free water 8.5μL，TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL。
9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，54.2℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
10.一种鉴定储粮害虫磷化氢基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的内切酶组合物。
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| 江亚杰;汪中明;张涛;贺培欢;李福君;曹阳;伍;: "基于DNA条形码技术的储粮害虫碎片鉴定研究", 中国粮油学报, no. 08, 25 August 2017 (2017-08-25) * |
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