JP2012087202A - Method for producing cellulose particle, and cellulose particle - Google Patents
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Abstract
【課題】蛋白質等の吸着容量が高く、高流速で使用可能なセルロース粒子及びそれを得る製造方法の提供。
【解決手段】イオン液体にセルロースを溶解し得られたセルロース溶液、該セルロース溶液と相溶性の低い有機溶剤及び親油性高分子とを混合し、当該セルロース溶液の液滴を有機溶剤中に分散させた後、セルロースを凝固させることを特徴とするセルロース粒子の製造方法。
【選択図】なし[Problem] To provide cellulose particles having a high adsorption capacity for proteins and the like and usable at a high flow rate, and a production method for obtaining the same.
A cellulose solution obtained by dissolving cellulose in an ionic liquid, an organic solvent having low compatibility with the cellulose solution and a lipophilic polymer are mixed, and droplets of the cellulose solution are dispersed in the organic solvent. And then coagulating the cellulose.
[Selection figure] None
Description
本発明は、セルロース粒子の製造方法、及び、セルロース粒子に関する。 The present invention relates to a method for producing cellulose particles and cellulose particles.
セルロースは蛋白質や他の生体物質に対して不活性であること、アルカリ条件に対する耐性があること、多孔性構造をとることができること、自然界に豊富に存在し安価であること等の理由からゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィー用充填剤として広く利用されている（非特許文献１−３参照）。 Cellulose is gel-filtered because it is inert to proteins and other biological materials, is resistant to alkaline conditions, has a porous structure, is abundant in nature and is inexpensive. It is widely used as a packing material for various chromatographies such as chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and hydrophobic interaction chromatography (see Non-Patent Documents 1-3).
近年、抗体医薬等に代表されるバイオ医薬品は、発現技術の進展が著しく、それに伴いクロマトグラフィー等の精製工程での生産性の向上が求められている。従来バイオ医薬品の精製工程に使われる担体として、アガロース粒子や多孔質ガラスが用いられており、セルロース粒子は用いられることが少なかった。これは、セルロース粒子がアガロース粒子や多孔質ガラスに比べ、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ等を導入した場合の蛋白質等の吸着容量が低い等の問題を有していたことに基づく。 In recent years, biopharmaceuticals typified by antibody drugs and the like have made remarkable progress in expression techniques, and accordingly, improvement in productivity in purification steps such as chromatography is required. Conventionally, agarose particles and porous glass have been used as carriers used in biopharmaceutical purification processes, and cellulose particles have been rarely used. This is based on the fact that cellulose particles have problems such as low adsorption capacity of proteins and the like when protein A or the like is introduced as an affinity ligand, compared to agarose particles and porous glass.
従来、セルロース粒子を製造する方法としては、例えば、１）セルロース酪酸酢酸エステルを用いる方法（特許文献１参照）、２）セルロースをチオシアン酸カルシウム水溶液に溶解した後、造粒する方法（特許文献２参照）、３）ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミドと塩化リチウムを共存させた系にセルロースを溶解した後、造粒する方法（特許文献３参照）等が知られている。
しかしながら、１）の方法では粒子を形成するためにセルロースを溶解している溶媒の蒸発除去が必要であり、さらにケン化する必要がある等、操作が非常に繁雑であるという問題点があり、２）の方法ではセルロース溶液を１３０℃と高温に加温する設備が必要になり、また、セルロースの重合度が減少するという問題があり、３）の方法ではセルロースに対する溶解力が限られており、溶解に長時間を要するという問題点があった。
Conventionally, as a method for producing cellulose particles, for example, 1) a method using cellulose butyrate acetate (see Patent Document 1), 2) a method of granulating cellulose after dissolving it in an aqueous calcium thiocyanate solution (Patent Document 2) 3) A method of granulating cellulose after dissolving it in a system in which amide such as dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone and the like and lithium chloride coexist is known (see Patent Document 3).
However, in the method 1), it is necessary to evaporate and remove the solvent in which cellulose is dissolved in order to form particles, and there is a problem that the operation is very complicated, such as saponification. The method 2) requires a facility for heating the cellulose solution to a high temperature of 130 ° C., and there is a problem that the degree of polymerization of the cellulose is reduced, and the method 3) has a limited ability to dissolve cellulose. There is a problem that it takes a long time to dissolve.
また最近では、イオン液体にセルロースを溶解し、界面活性剤としてＳｐａｎ８５を用いてセルロース粒子を作成する方法が報告されている（非特許文献４参照）。しかし、この造粒法では粒径にかなりの幅があり、また粗大粒子や異形粒子、融着粒子、ひも状ゲル等が多数発生し、実際に使用する粒径に分級する必要があり、非常にロスが大きいという問題があった。また、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ等を導入した場合の蛋白質等の吸着容量も十分とはいえない。 Recently, a method has been reported in which cellulose is dissolved in an ionic liquid and cellulose particles are produced using Span 85 as a surfactant (see Non-Patent Document 4). However, this granulation method has a considerable range of particle sizes, and a large number of coarse particles, irregularly shaped particles, fused particles, string-like gels, etc. are generated, and it is necessary to classify them to the particle sizes actually used. There was a problem that the loss was large. In addition, when protein A or the like is introduced as an affinity ligand, the adsorption capacity of the protein or the like is not sufficient.
本発明が解決しようとする課題は、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ等を導入した場合に蛋白質等の吸着容量が高く、高流速で使用可能なセルロース粒子及びそれを得る製造方法を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide cellulose particles having a high adsorption capacity for proteins and the like that can be used at a high flow rate when protein A or the like is introduced as an affinity ligand, and a method for producing the same.
本発明者らは鋭意検討した結果、セルロースをイオン液体に溶解してセルロース溶液とし、これを、親油性高分子を用いて該溶液と相溶性の低い有機溶剤に液滴分散させた後、セルロースを凝固させるという方法を採用することにより、前記課題を解決できることを見いだした。 As a result of intensive studies, the inventors of the present invention dissolved cellulose in an ionic liquid to form a cellulose solution, which was dispersed in droplets in an organic solvent having low compatibility with the solution using a lipophilic polymer. It has been found that the above-mentioned problem can be solved by adopting a method of solidifying the material.
すなわち、本発明は以下の１）〜１０）に係るものである。
１）（１）イオン液体にセルロースを溶解するセルロース溶液の調製工程、
（２）前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤及び前記有機溶剤に可溶な親油性高分子とを混合し、前記セルロース溶液の液滴を有機溶剤中に分散させるセルロース溶液の液滴分散液の調製工程、並びに、
（３）セルロースを凝固させてセルロース粒子を得る凝固工程、
を含むことを特徴とするセルロース粒子の製造方法。
２）前記親油性高分子が、多糖類又はその誘導体である、上記１）の製造方法。
３）前記親油性高分子が、セルロース誘導体である、上記１）又は２）の製造方法。
４）前記イオン液体がアルキルイミダゾリウム塩である、上記１）〜３）の製造方法。
５）前記イオン液体が１−エチル−３−メチルイミダゾリウム塩である、上記１）〜４）の製造方法。
６）前記（２）において、前記有機溶剤及び親油性高分子を含む溶液を前記セルロース溶液と混合する、上記１）〜５）の製造方法。
７）上記１）〜６）の製造方法によって製造されたセルロース粒子。
８）上記７）のセルロース粒子を含むクロマトグラフィー用充填剤。
９）上記７）のセルロース粒子を用いた抗体精製用吸着体。
１０）アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された、上記９）の抗体精製用吸着体。
That is, the present invention relates to the following 1) to 10).
1) (1) Preparation process of cellulose solution for dissolving cellulose in ionic liquid,
(2) A droplet dispersion of a cellulose solution in which an organic solvent having low compatibility with the ionic liquid and an oleophilic polymer soluble in the organic solvent are mixed and the droplets of the cellulose solution are dispersed in the organic solvent. The preparation process, and
(3) a coagulation step for coagulating cellulose to obtain cellulose particles;
The manufacturing method of the cellulose particle characterized by including.
2) The production method of 1) above, wherein the lipophilic polymer is a polysaccharide or a derivative thereof.
3) The production method of 1) or 2) above, wherein the lipophilic polymer is a cellulose derivative.
4) The production method of 1) to 3) above, wherein the ionic liquid is an alkylimidazolium salt.
5) The production method of 1) to 4) above, wherein the ionic liquid is 1-ethyl-3-methylimidazolium salt.
6) The manufacturing method of said 1) -5) which mixes the said organic solvent and the solution containing a lipophilic polymer with the said cellulose solution in said (2).
7) Cellulose particles produced by the production methods of 1) to 6) above.
8) A packing material for chromatography containing the cellulose particles of 7) above.
9) An adsorbent for antibody purification using the cellulose particles of 7) above.
10) The adsorbent for purifying an antibody according to 9), wherein protein A is introduced as an affinity ligand.
本発明の製造方法によれば、一定の粒径を有するセルロース粒子を安定的に且つ高収率で製造することができる。また、得られたセルロース粒子は、クロマトグラフィー用担体として容器に充填し、流速を上げて通液した場合でも親和性物質等の動的結合容量が低下しにくい。従って、本発明によれば、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ等を導入した場合の蛋白質等の吸着容量が高く、高流速で使用可能なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができ、これにより、バイオ医薬品等の精製工程での生産性を格段に向上させることが可能となる。 According to the production method of the present invention, cellulose particles having a certain particle size can be produced stably and in high yield. In addition, the obtained cellulose particles are filled in a container as a chromatography carrier and the dynamic binding capacity of an affinity substance or the like is unlikely to decrease even when the flow rate is increased. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a chromatographic packing material that has a high adsorption capacity for proteins and the like when protein A or the like is introduced as an affinity ligand and can be used at a high flow rate. The productivity in the refining process such as can be significantly improved.
本発明のセルロース粒子の製造方法は、（１）イオン液体にセルロースを溶解するセルロース溶液の調製工程、（２）前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤及び前記有機溶剤に可溶な親油性高分子とを混合し、前記セルロース溶液の液滴を有機溶剤中に分散させるセルロース溶液の液滴分散液の調製工程、並びに、（３）セルロースを凝固させてセルロース粒子を得る凝固工程、を含むことを特徴とする。
以下、工程ごとに説明する。なお、本明細書中、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢを数値範囲内に含む。
The method for producing cellulose particles of the present invention comprises (1) a step of preparing a cellulose solution in which cellulose is dissolved in an ionic liquid, (2) an organic solvent having low compatibility with the ionic liquid, and a highly lipophilic substance that is soluble in the organic solvent. A step of preparing a droplet dispersion of a cellulose solution that mixes molecules and disperses the droplet of the cellulose solution in an organic solvent, and (3) a coagulation step of coagulating cellulose to obtain cellulose particles. It is characterized by.
Hereinafter, it demonstrates for every process. In the present specification, “A to B” representing a numerical range is synonymous with “A or more and B or less” and includes A and B within the numerical range.
（１）セルロース溶液の調製工程
本工程では、原料セルロース（原料として使用するセルロース。以下、単に「セルロース」ともいう。）をイオン液体に溶解してセルロース溶液が調製される。セルロースは、後述する有機溶剤に溶解しないか、有機溶剤に難溶性のものが好ましい。有機溶剤に難溶性のものとは、室温（２５℃）で、有機溶剤１００ｇに溶けるセルロースの質量（ｇ）が１ｇ以下であることを意味する。
本発明において用いられるセルロースとしては、その由来は特に制限はなく、例えば、綿リンター、木材パルプ等から得られる植物セルロース、微生物の産生するバクテリアセルロース、ホヤセルロース等の動物セルロース、再生セルロース等が使用できるが、これらを精製して得られる精製セルロースを用いるのが好ましい。なお、イオン液体に溶解し、有機溶剤に難溶である限りにおいて、一部に官能基が導入されたセルロース、例えば、セルロースの水酸基の一部がエステル化されたもの（エステル誘導体）、セルロースの水酸基がエーテル化されたもの（エーテル誘導体）等のセルロース誘導体を用いることもできる。斯かるセルロース誘導体としては、具体的には、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、ニトロセルロース、りん酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ベンジルセルロース、トリチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、アミノエチルセルロース、オキシエチルセルロース等が挙げられる。
本発明においては、セルロースは、後述する有機溶剤に溶解しないものが好ましい。
(1) Preparation Step of Cellulose Solution In this step, a cellulose solution is prepared by dissolving raw material cellulose (cellulose used as a raw material; hereinafter, also simply referred to as “cellulose”) in an ionic liquid. Cellulose is preferably insoluble in an organic solvent described later or hardly soluble in an organic solvent. What is hardly soluble in an organic solvent means that the mass (g) of cellulose dissolved in 100 g of the organic solvent at room temperature (25 ° C.) is 1 g or less.
The cellulose used in the present invention is not particularly limited in its origin. For example, plant cellulose obtained from cotton linter, wood pulp, etc., bacterial cellulose produced by microorganisms, animal cellulose such as squirt cellulose, regenerated cellulose, etc. are used. However, it is preferable to use purified cellulose obtained by purifying these. In addition, as long as it dissolves in an ionic liquid and is hardly soluble in an organic solvent, cellulose in which a functional group is partially introduced, for example, a cellulose in which a hydroxyl group is partially esterified (ester derivative), cellulose Cellulose derivatives such as those having a hydroxyl group etherified (ether derivative) can also be used. Specific examples of such cellulose derivatives include cellulose acetate, cellulose propionate, nitrocellulose, cellulose phosphate, cellulose acetate butyrate, cellulose nitrate, methylcellulose, ethylcellulose, benzylcellulose, tritylcellulose, cyanoethylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxy Examples include ethyl cellulose, aminoethyl cellulose, and oxyethyl cellulose.
In the present invention, the cellulose is preferably not dissolved in the organic solvent described later.
イオン液体としては、セルロースを均一に溶解できるイオン液体であれば特に制限はない。ここで、「セルロースを均一に溶解できる」とは、例えばイオン液体に、３質量％溶液となる分量でセルロースを混合し、目視で溶解を確認できることが挙げられる。なお、前記の通り溶解すればその温度は問わない。 The ionic liquid is not particularly limited as long as it can dissolve cellulose uniformly. Here, “being able to dissolve cellulose uniformly” means that cellulose can be mixed with an ionic liquid in an amount of a 3% by mass solution and dissolution can be confirmed visually. In addition, if it melt | dissolves as mentioned above, the temperature will not ask | require.
斯かるイオン液体としては、カチオン成分とアニオン成分とから構成され、融点が２００℃以下のものが好ましく、１００℃以下のものがより好ましく、５０℃以下のものがさらに好ましい。また、融点の下限としては、限定されるものではないが、−１００℃以上が好ましく、−３０℃以上がより好ましい。
カチオン成分としては、アルキルイミダゾリウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオン、アルキルアンモニウムカチオン、アルキルフォスフォニウムカチオン、アルキルスルフォニウムカチオン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルピロリジニウムカチオン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルピペリジニウムカチオン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウムカチオン等が挙げられる。このうち好適にはアルキルイミダゾリウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオン、アルキルアンモニウムカチオンが挙げられる。ここで、「アルキル」としては、炭素数１〜１２の直鎖又は分岐のアルキル基が挙げられ、このうち炭素数１〜８の直鎖アルキル基が好ましく、特に、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖アルキル基が好適である。上記アルキル基の代わりにアルケニル基であってもよく、前記アルケニル基としては、炭素数２〜８のアルケニル基が好ましく、アリル基がさらに好ましい。
カチオン成分としては、具体的には、Ｎ−メチルイミダゾリウムカチオン、Ｎ−エチルイミダゾリウムカチオン、１，３−ジメチルイミダゾリウムカチオン、１，３−ジエチルイミダゾリウムカチオン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−プロピル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１，２，３−トリメチルイミダゾリウムカチオン及び１，２，３，４−テトラメチルイミダゾリウムカチオン、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、Ｎ−プロピルピリジニウムカチオン、Ｎ−ブチルピリジニウムカチオン、１，４−ジメチルピリジニウムカチオン、１−ブチル−４−メチルピリジニウムカチオン及び１−ブチル−２，４−ジメチルピリジニウムカチオン、トリメチルアンモニウムカチオン、エチルジメチルアンモニウムカチオン、ジエチルメチルアンモニウムカチオン、トリエチルアンモニウムカチオン、テトラメチルアンモニウムカチオン、トリエチルメチルアンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウムカチオン等が挙げられるが、このうち、１，３−ジメチルイミダゾリウムカチオン、１，３−ジエチルイミダゾリウムカチオン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−プロピル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムカチオン等のジアルキルイミダゾリウムカチオンがより好ましく、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンがさらに好ましい。
Such an ionic liquid is composed of a cation component and an anion component, and preferably has a melting point of 200 ° C. or lower, more preferably 100 ° C. or lower, and even more preferably 50 ° C. or lower. Moreover, as a minimum of melting | fusing point, although not limited, -100 degreeC or more is preferable and -30 degreeC or more is more preferable.
As the cation component, alkyl imidazolium cation, alkyl pyridinium cation, alkyl ammonium cation, alkyl phosphonium cation, alkyl sulfonium cation, N, N-dialkylpyrrolidinium cation, N, N-dialkylpiperidinium cation, N, N-dialkylmorphonium cation and the like can be mentioned. Of these, alkyl imidazolium cations, alkyl pyridinium cations, and alkyl ammonium cations are preferable. Here, examples of the “alkyl” include a linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and among these, a linear alkyl group having 1 to 8 carbon atoms is preferable, and in particular, a methyl group, an ethyl group, n A linear alkyl group having 1 to 5 carbon atoms such as a -propyl group, n-butyl group, and n-pentyl group is preferred. An alkenyl group may be used instead of the alkyl group, and the alkenyl group is preferably an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, and more preferably an allyl group.
Specific examples of the cation component include N-methylimidazolium cation, N-ethylimidazolium cation, 1,3-dimethylimidazolium cation, 1,3-diethylimidazolium cation, and 1-ethyl-3-methylimidazole. 1-propyl-3-methylimidazolium cation, 1-butyl-3-methylimidazolium cation, 1-hexyl-3-methylimidazolium cation, 1,2,3-trimethylimidazolium cation and 1,2 , 3,4-tetramethylimidazolium cation, 1-allyl-3-methylimidazolium cation, N-propylpyridinium cation, N-butylpyridinium cation, 1,4-dimethylpyridinium cation, 1-butyl-4-methylpyridinium Cations and -Butyl-2,4-dimethylpyridinium cation, trimethylammonium cation, ethyldimethylammonium cation, diethylmethylammonium cation, triethylammonium cation, tetramethylammonium cation, triethylmethylammonium cation, tetraethylammonium cation, etc. 1,3-dimethylimidazolium cation, 1,3-diethylimidazolium cation, 1-ethyl-3-methylimidazolium cation, 1-propyl-3-methylimidazolium cation, 1-butyl-3-methylimidazolium Dialkyl imidazolium cations such as cation and 1-hexyl-3-methyl imidazolium cation are more preferable, and 1-ethyl-3-methyl imidazole is more preferable. Umukachion, more preferably 1-butyl-3-methylimidazolium cation.
アニオン成分としては、ハロゲン化物イオン（Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-等）、カルボン酸アニオン（例えば総炭素数１〜３ものが挙げられ、具体的にはＣ2Ｈ5ＣＯ2 -、ＣＨ3ＣＯ2 -、ＨＣＯ2 -等が挙げられる。）、擬ハロゲン化物イオン（例えば、一価でありハロゲン化物に類似した特性を有するＣＮ-、ＳＣＮ-、ＯＣＮ-、ＯＮＣ-、Ｎ3 -等）、スルホン酸アニオン、有機スルホン酸アニオン（メタンスルホン酸アニオン等）、リン酸アニオン（エチルリン酸アニオン、メチルリン酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン等）、ホウ酸アニオン（テトラフルオロホウ酸アニオン等）、過塩素酸アニオン等が挙げられ、ハロゲン化物イオン、カルボン酸アニオンが好ましい。 Examples of the anion component include halide ions (Cl − , Br − , I − and the like), carboxylate anions (for example, those having 1 to 3 carbon atoms in total, specifically C 2 H 5 CO 2 − , CH 3 CO 2 − , HCO 2 − and the like), pseudohalide ions (for example, CN − , SCN − , OCN − , ONC − , N 3 − etc. which are monovalent and have properties similar to halides) Sulfonate anion, organic sulfonate anion (methane sulfonate anion, etc.), phosphate anion (ethyl phosphate anion, methyl phosphate anion, hexafluorophosphate anion, etc.), borate anion (tetrafluoroborate anion, etc.), peroxy A chlorate anion etc. are mentioned, A halide ion and a carboxylate anion are preferable.
本発明において、イオン液体としては、セルロースの溶解性、融点、粘度等の観点から、好適には、アルキルイミダゾリウム塩、ジアルキルイミダゾリウム塩が挙げられ、より好適にはアルキルイミダゾリウムアセテート、アルキルイミダゾリウムクロリド、さらに好適にはジアルキルイミダゾリウムアセテート、ジアルキルイミダゾリウムクロリド、特に好適には、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドが挙げられる。 In the present invention, the ionic liquid is preferably an alkyl imidazolium salt or a dialkyl imidazolium salt, more preferably an alkyl imidazolium acetate or an alkyl imidazole, from the viewpoint of cellulose solubility, melting point, viscosity and the like. Among them, there can be mentioned lithium chloride, more preferably dialkylimidazolium acetate, dialkylimidazolium chloride, particularly preferably 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate, 1-butyl-3-methylimidazolium chloride.
セルロースの上記イオン液体への溶解は、用いるセルロース及びイオン液体の種類によっても異なるが、通常、１０〜２５０℃、好適には２５〜１２０℃で、１〜２４時間程度、撹拌下に行うのが好ましい。
ここで、イオン液体は、溶液の粘度上昇による液滴の形成の困難性、及びセルロース濃度低下による液滴形成時の微小粒子の多発を抑制する点から、溶液中のセルロース濃度が３〜５０質量％、好ましくは６〜３０質量％となるように用いるのが好ましい。
尚、セルロースのイオン液体への溶解濃度により、本発明の製造方法により得られるセルロース粒子の細孔径が変化する。すなわち、セルロースの溶解濃度が濃いほどセルロース粒子の細孔径が小さくなる傾向がある。従って、上記の範囲内において、セルロース濃度を調整することにより、任意の細孔径をもつセルロース粒子を得ることができる。尚、本発明のセルロース粒子において細孔径に特に制限はないが、一般にクロマトグラフィー用充填剤として用いられる場合には数ｎｍ〜数μｍ程度が好ましい。
The dissolution of cellulose in the ionic liquid varies depending on the type of cellulose and ionic liquid used, but is usually 10 to 250 ° C., preferably 25 to 120 ° C., for about 1 to 24 hours with stirring. preferable.
Here, the ionic liquid has a cellulose concentration in the solution of 3 to 50 mass from the viewpoint of difficulty in forming droplets due to an increase in the viscosity of the solution, and suppression of frequent occurrence of fine particles during the formation of droplets due to a decrease in the cellulose concentration. %, Preferably 6 to 30% by mass.
In addition, the pore diameter of the cellulose particle obtained by the manufacturing method of this invention changes with the melt | dissolution density | concentrations to the ionic liquid of a cellulose. That is, as the dissolution concentration of cellulose increases, the pore diameter of the cellulose particles tends to decrease. Therefore, by adjusting the cellulose concentration within the above range, cellulose particles having an arbitrary pore diameter can be obtained. In addition, although there is no restriction | limiting in particular in the pore diameter in the cellulose particle of this invention, when using as a filler for chromatography generally, several nm-about several micrometers are preferable.
（２）セルロース溶液の液滴分散液の調製工程
本工程では、上記の如く調製されたセルロース溶液、イオン液体と相溶性の低い有機溶剤（以下、単に「有機溶剤」とも称する）、及び親油性高分子とを混合・撹拌することにより、セルロース溶液の液滴が有機溶剤中に分散した分散液が調製される。ここで、「イオン液体と相溶性の低い有機溶剤」とは、イオン液体と有機溶剤とを体積比で１：１で混合した際に、イオン液体と有機溶剤との間に界面が形成される有機溶剤を意味する。
(2) Preparation Step of Droplet Dispersion of Cellulose Solution In this step, the cellulose solution prepared as described above, an organic solvent having low compatibility with the ionic liquid (hereinafter also simply referred to as “organic solvent”), and lipophilicity By mixing and stirring the polymer, a dispersion in which droplets of the cellulose solution are dispersed in the organic solvent is prepared. Here, “an organic solvent having low compatibility with the ionic liquid” means that an interface is formed between the ionic liquid and the organic solvent when the ionic liquid and the organic solvent are mixed at a volume ratio of 1: 1. Means organic solvent.
ここで用いられる有機溶剤は、分散媒となるものであるが、前記イオン液体と相溶性の低いものであればその種類は限定されず、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、流動パラフィン等の脂肪族炭化水素、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、シクロヘプタン、メチルシクロヘプタン等の脂環式炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロベンゼン等の芳香族炭化水素等を挙げることができ、これらは、それぞれ単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
好ましくは芳香族炭化水素が挙げられ、より好ましくはトルエンが挙げられる。
The organic solvent used here is a dispersion medium, but the type thereof is not limited as long as it has low compatibility with the ionic liquid. For example, n-hexane, n-heptane, liquid paraffin, etc. Alicyclic hydrocarbons such as aliphatic hydrocarbons, cyclohexane, methylcyclohexane, cycloheptane, methylcycloheptane, and aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, dichlorobenzene, etc. It may be used in a mixture of two or more.
Aromatic hydrocarbons are preferable, and toluene is more preferable.
有機溶剤の使用量は、セルロース粒子の粒子径等を考慮して適宜決定すればよいが、セルロースに対して、５０〜２０００倍質量が好ましく、５０〜５００倍質量がより好ましい。 Although the usage-amount of an organic solvent should just determine suitably the particle diameter of a cellulose particle etc., 50-2000 times mass is preferable with respect to a cellulose, and 50-500 times mass is more preferable.
親油性高分子としては、有機溶剤に溶解して粘度を上昇させ、前記セルロース溶液を液滴の状態を安定に保ったまま分散できるものあれば特に限定されないが、有機溶剤を増粘させる増粘剤として公知のものを好ましく用いることができる。
増粘剤としては、例えば、セルロース誘導体等の多糖類誘導体、親油性ビニル誘導体、親油性アクリル酸系ポリマー等が挙げられる。
The lipophilic polymer is not particularly limited as long as it dissolves in an organic solvent to increase the viscosity and can disperse the cellulose solution while maintaining the state of droplets stably. Known agents can be preferably used.
Examples of the thickener include polysaccharide derivatives such as cellulose derivatives, lipophilic vinyl derivatives, lipophilic acrylic acid polymers, and the like.
上記セルロース誘導体の具体例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等が挙げられ、親油性ビニル誘導体としては、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル等が挙げられ、親油性アクリル酸系ポリマーとしては、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体、メタクリル酸メチル・アクリル酸エチル共重合体等が挙げられる。
これらのうち、セルロース誘導体が好ましく、とりわけエチルセルロースが好ましい。
上記親油性高分子は、１種のみを使用することができるが、２種以上を併用することもできる。
Specific examples of the cellulose derivative include methyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetate, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose and the like. Examples of the lipophilic vinyl derivative include polyvinyl acetate and polyvinyl chloride. Examples of the polymer include ethyl acrylate / methyl methacrylate / methacrylated trimethylammonium ethyl copolymer, methyl methacrylate / ethyl acrylate copolymer, and the like.
Of these, cellulose derivatives are preferable, and ethyl cellulose is particularly preferable.
Only one kind of the lipophilic polymer can be used, but two or more kinds can be used in combination.
また、当該親油性高分子は、液滴の安定性及び分散媒の粘度を考慮すると、重量平均分子量が３，０００〜５，０００，０００であるのが好ましい。
尚、本発明において平均分子量とは、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）によるポリスチレン換算重量平均分子量を意味する。
The lipophilic polymer preferably has a weight average molecular weight of 3,000 to 5,000,000 in consideration of the stability of the droplets and the viscosity of the dispersion medium.
In addition, in this invention, an average molecular weight means the polystyrene conversion weight average molecular weight by gel permeation chromatography (GPC).
親油性高分子の使用量は、セルロースに対する分散性能やイオン液体の性質を考慮して適宜選択され得るが、例えば有機溶剤１００質量部に対して、好ましくは１質量部〜１００質量部、より好ましくは１質量部〜２５質量部である。 The amount of the lipophilic polymer used can be appropriately selected in consideration of the dispersibility with respect to cellulose and the properties of the ionic liquid. For example, the amount is preferably 1 part by weight to 100 parts by weight, more preferably 100 parts by weight of the organic solvent. Is 1 to 25 parts by mass.
セルロース溶液、有機溶剤、及び親油性高分子の混合順序は、特に制限はないが、有機溶剤と親油性高分子の混合液を、セルロース溶液に混合するのが好ましい。 The mixing order of the cellulose solution, the organic solvent, and the lipophilic polymer is not particularly limited, but it is preferable to mix the mixed solution of the organic solvent and the lipophilic polymer into the cellulose solution.
液滴の形成法としては撹拌機を使用する等の公知の方法を採用することできる。
例えば、スタティックミキサー等の混合器を用いて、セルロースが分解せず、析出しない温度、例えば、室温〜１００℃の範囲で混合撹拌する方法が挙げられる。
尚、撹拌時の回転速度を上げるほど形成される液滴は径が小さくなることから、目的とするセルロースの粒子径に応じて、適宜混合器の回転速度を調節すれば良い。
As a method for forming droplets, a known method such as using a stirrer can be employed.
For example, using a mixer such as a static mixer, a method of mixing and stirring at a temperature at which cellulose does not decompose and precipitate, for example, in the range of room temperature to 100 ° C.
In addition, since the diameter of the droplet formed becomes so small that the rotational speed at the time of stirring is raised, what is necessary is just to adjust the rotational speed of a mixer suitably according to the particle diameter of the target cellulose.
（３）セルロース粒子の凝固工程
本工程では、セルロース溶液の液滴分散液からセルロース粒子を凝固させるが、斯かる方法としては、例えば、当該セルロース溶液の液滴分散液に、イオン液体に相溶し且つ実質的にセルロースを溶解しない媒体を接触させる方法が挙げられる。
(3) Cellulose particle coagulation step In this step, the cellulose particles are coagulated from the droplet dispersion of the cellulose solution. As such a method, for example, the droplet dispersion of the cellulose solution is compatible with the ionic liquid. And a method of contacting a medium that does not substantially dissolve cellulose.
ここで、用いられる媒体としては、水、メタノール、エタノール等の極性溶剤の１種又は２種以上を挙げることができる。
媒体は直接セルロース溶液の液滴分散液に添加してもよいが、セルロース溶液の液滴の形状を保ったままセルロースを凝固せしめる点から、親油性高分子を溶解した有機溶剤と、水、メタノール、エタノール等の媒体とを混合・撹拌して調製された媒体の分散液として添加するのが好ましい。
また、この場合に用いられる有機溶剤としては、好ましくは、セルロース溶液の液滴分散の際に使用されたものと同種のものを使用することが好ましい。
Here, examples of the medium used include one or more polar solvents such as water, methanol, and ethanol.
The medium may be added directly to the droplet dispersion of the cellulose solution, but from the viewpoint of coagulating cellulose while maintaining the droplet shape of the cellulose solution, an organic solvent in which the lipophilic polymer is dissolved, water, methanol It is preferable to add as a dispersion of a medium prepared by mixing and stirring with a medium such as ethanol.
In addition, as the organic solvent used in this case, it is preferable to use the same type as that used in the dispersion of the droplets of the cellulose solution.
当該媒体の使用量は、イオン液体１００質量部に対して、好ましくは、２０〜２，０００質量部、より好ましくは５０〜２００質量部である。 The amount of the medium used is preferably 20 to 2,000 parts by mass, more preferably 50 to 200 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the ionic liquid.
セルロース溶液の液滴分散液と前記媒体との接触は、０〜１００℃、好適には２５〜８０℃で行うことが好ましい。 The contact between the liquid droplet dispersion of the cellulose solution and the medium is preferably performed at 0 to 100 ° C, preferably 25 to 80 ° C.
斯くして凝固したセルロース粒子は、遠心分離、濾過、デカンテーション等公知の方法により固液分離することにより回収することができる。また、回収したセルロース粒子はイオン液体及び上記有機溶剤に相溶性の溶媒、例えばエタノール、イソプロパノール、ブタノール等で洗浄され、次いで水洗浄を行うことにより精製される。 The cellulose particles thus coagulated can be recovered by solid-liquid separation by a known method such as centrifugation, filtration or decantation. The recovered cellulose particles are washed with a solvent compatible with the ionic liquid and the organic solvent, such as ethanol, isopropanol, butanol, etc., and then purified by washing with water.
斯くして、本発明の方法によれば、後記実施例に示すとおり、一定の粒径を有するセルロース粒子を安定的に収率よく製造することができる。尚、その粒子径は、既に述べたように、任意に調整することができるが、体積平均粒径は、クロマトグラフィー用担体として用いた場合の、高流速下での圧力の上昇及びリガンド結合容量の低下等を考慮すると、２０〜３００μｍであるのが好ましく、３０〜１５０μｍとするのがより好ましい。
また、本発明のセルロース粒子を、クロマトグラフィー用担体として容器に充填し、適切な線速度で通液した場合、担体内における溶質の移動が速く、また流速を上げても親和性物質等の動的結合容量が低下しにくいという性質を有する（実施例５）
Thus, according to the method of the present invention, cellulose particles having a certain particle diameter can be stably produced with high yield as shown in the Examples below. The particle diameter can be arbitrarily adjusted as described above, but the volume average particle diameter can be increased by increasing the pressure and the ligand binding capacity when used as a chromatographic support. In view of the decrease in the thickness, it is preferably 20 to 300 μm, more preferably 30 to 150 μm.
In addition, when the cellulose particles of the present invention are packed in a container as a chromatographic carrier and passed through at an appropriate linear velocity, the solute moves quickly in the carrier, and even if the flow rate is increased, the affinity substance and the like move. (Example 5)
本発明のセルロース粒子は、公知の方法（例えば、米国特許４９７３６８３号明細書、特開２００９−２４２７７０号公報参照）により化学架橋されてもよい。化学架橋することにより機械的強度が高くなり、より高流速での使用が可能となる。 The cellulose particles of the present invention may be chemically crosslinked by a known method (for example, see US Pat. No. 4,973,683 and JP-A-2009-242770). By chemical crosslinking, the mechanical strength is increased, and use at a higher flow rate is possible.
本発明のセルロース粒子は、以上のような性質を有することから、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィー用充填剤（担体）として、或いは、高分子担体、バイオリアクターの担体、検査薬の担体、体液浄化用担体、化粧品添加剤等として好適に用いることができる。 Since the cellulose particles of the present invention have the properties described above, various chromatographic fillers (carriers) such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, chelate chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, etc. Or as a polymer carrier, a bioreactor carrier, a test drug carrier, a body fluid purification carrier, a cosmetic additive, and the like.
斯かるクロマトグラフィー用充填剤として用いる場合には、その目的に応じて、公知の方法により、本発明のセルロース粒子に、適宜リガンド、荷電基、疎水性基等を導入することができる。
例えば、一態様として、本発明のセルロース粒子の水酸基の少なくとも一部を介してプロテインＡを公知の方法（米国特許６３９９７５０号等）により固定化することにより、抗体精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤、すなわち抗体精製用吸着体とすることが挙げられる。
When used as such a packing material for chromatography, a ligand, a charged group, a hydrophobic group and the like can be appropriately introduced into the cellulose particles of the present invention by a known method according to the purpose.
For example, as an embodiment, a chromatographic filler suitable for antibody purification is obtained by immobilizing protein A through a known method (US Pat. No. 6,399,750, etc.) via at least part of the hydroxyl groups of the cellulose particles of the present invention. That is, an adsorbent for antibody purification can be mentioned.
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由無く、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
＜評価方法＞
１）粒径分布の測定
レーザー散乱回折法粒度分布測定装置ＬＳ １３ ３２０ （（株）ベックマン・コールター）により粒径分布を測定した。光学モデルはFluid R.I. Real 1.333、Sample R.I. Real 1.54 Imaginary 0を使用した。
これより、セルロース粒子の体積平均径、及び体積粒度の変動係数（Ｃ．Ｖ．値：（標準偏差／体積平均径）×１００）を求めた。
２）粒子沈降体積
粒子を水分散し、目盛り付き容器に入れ、１２時間静置後の粒子沈降体積を目視により測定した。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. Moreover, the following description shows the aspect of this invention generally, This invention is not limited by this description without a particular reason.
<Evaluation method>
1) Measurement of particle size distribution The particle size distribution was measured with a laser scattering diffraction particle size distribution analyzer LS 13 320 (Beckman Coulter, Inc.). As the optical model, Fluid RI Real 1.333 and Sample RI Real 1.54 Imaginary 0 were used.
From this, the volume average diameter of the cellulose particles and the coefficient of variation of the volume particle size (CV value: (standard deviation / volume average diameter) × 100) were determined.
2) Particle sedimentation volume The particles were dispersed in water, placed in a graduated container, and the particle sedimentation volume after standing for 12 hours was measured visually.
実施例１（セルロース粒子Ａの製造）
５００ｍｌバッフル付きセパラブルフラスコ内で１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）６０ｇにセルロース粉末（フナコシ株式会社製）４．１７ｇを加え、温水バスにセットし９５℃に加熱し、２時間撹拌を行い溶解しセルロース溶液を得た。別の５００ｍｌセパラブルフラスコ内でトルエン（和光純薬工業社製）２００ｍｌにエチルセルロース４５（平均分子量１５００００）（和光純薬工業社製）１６ｇを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解した。さらに別のセパラブルフラスコ内でトルエン１５０ｍｌにエチルセルロース４５を１２ｇ加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解した後、０．２Ｍ硫酸ナトリウム水溶液６２．５ｍｌを加え４００ｒｐｍ、８０℃で３０分間撹拌をおこないＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。次にエチルセルロース４５含有トルエンをセルロース溶液に加え４００ｒｐｍ、９０℃で１０分間撹拌し、セルロース溶液の液滴分散液（ＩＬ／Ｏ型エマルジョン（ここで、ＩＬはイオン液体））を調製後、上記で得られたＷ／Ｏ型エマルジョンを加え４００ｒｐｍで撹拌しながら室温に冷却した。その後、１５００ｍｌエタノール中に注ぎ撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。さらにエタノール１５００ｍｌでデカンテーションを２回おこなった後、エタノールで濾過洗浄を行い、さらに水で濾過洗浄を行い目的のセルロース粒子を得た。また、生成物の目開き１ｍｍの網上に残る凝固物は０％（対原料セルロース投入重量）であり安定にセルロース粒子を作製することができた。
得られた粒子は体積平均粒径６２μｍ、Ｃ．Ｖ．値６５％であった。次に、セルロース粒子を１０６μｍと４０μｍのふるいにかけ４０μｍ〜１０６μｍの粒径をもつ粒子を得た。得られた粒子沈降体積は５０ｍｌであった。
Example 1 (Production of cellulose particles A)
In a separable flask with a 500 ml baffle, add 4.17 g of cellulose powder (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) to 60 g of 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate (manufactured by Aldrich), set in a hot water bath and heat to 95 ° C. It stirred for 2 hours and melt | dissolved and the cellulose solution was obtained. In another 500 ml separable flask, 16 g of ethylcellulose 45 (average molecular weight 150,000) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) is added to 200 ml of toluene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), set in a hot water bath, and stirred at 80 ° C. for 2 hours. And dissolved. In another separable flask, add 12 g of ethyl cellulose 45 to 150 ml of toluene, set in a warm water bath and stir at 80 ° C. for 2 hours to dissolve, then add 62.5 ml of 0.2 M aqueous sodium sulfate solution at 400 rpm at 80 ° C. Stirring was performed for 30 minutes to obtain a W / O type emulsion. Next, toluene containing ethyl cellulose 45 is added to the cellulose solution and stirred at 400 rpm and 90 ° C. for 10 minutes to prepare a droplet dispersion of the cellulose solution (IL / O type emulsion (where IL is an ionic liquid)). The obtained W / O emulsion was added and cooled to room temperature while stirring at 400 rpm. Thereafter, the mixture was poured into 1500 ml of ethanol, left to stand after stirring, and the supernatant was removed by decantation. Further, decantation was performed twice with 1500 ml of ethanol, followed by filtration and washing with ethanol, and further filtration and washing with water to obtain the intended cellulose particles. Further, the coagulated product remaining on the net having a mesh size of 1 mm of the product was 0% (vs. the raw material cellulose input weight), and the cellulose particles could be stably produced.
The obtained particles had a volume average particle size of 62 μm, C.I. V. The value was 65%. Next, cellulose particles were passed through 106 μm and 40 μm sieves to obtain particles having a particle size of 40 μm to 106 μm. The resulting particle sedimentation volume was 50 ml.
実施例２（セルロース粒子Ｂの製造）
実施例１で１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートの代わりに１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド(Ａｌｄｒｉｃｈ社製)を用いた以外は実施例１と同様にしてセルロース粒子を得た。目開き１ｍｍの網上に残る凝固物は５％（対原料セルロース投入重量）であり、ふるいにかける前は体積平均粒径６５μｍ、Ｃ．Ｖ．値８７％であった。ふるいにかけた後の４０〜１０６μｍの粒径をもつ粒子沈降体積は２５ｍｌであった。
Example 2 (Production of cellulose particles B)
Cellulose particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 1-butyl-3-methylimidazolium chloride (Aldrich) was used instead of 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate in Example 1. The amount of coagulum remaining on the mesh having a mesh opening of 1 mm is 5% (vs. the weight of raw material cellulose), and before passing through a sieve, the volume average particle size is 65 μm. V. The value was 87%. The particle sedimentation volume with a particle size of 40-106 μm after sieving was 25 ml.
比較例１（セルロース粒子Ｃの製造）
J.Chromatogr.A 1217(2010)1298-1304（前記非特許文献４）記載の方法に従って、セルロース粒子を製造した。
すなわち、５００ｍｌバッフル付きセパラブルフラスコ内で１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド(Ａｌｄｒｉｃｈ社製)６０ｇにセルロース粉末４．１７ｇを加え、温水バスにセットし９５℃に加熱し、２時間撹拌を行い溶解しセルロース溶液を得た。別の５００ｍｌセパラブルフラスコ内でｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ （ｈｅａｖｙ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２００ｍｌにＳｐａｎ８５（分子量９５７）（和光純薬工業株式会社製）９ｍｌを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解した。さらに別のセパラブルフラスコ内でｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ （ｈｅａｖｙ）１５０ｍｌにＳｐａｎ８５ ６．７５ｍｌを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解した後、０．２Ｍ硫酸ナトリウム水溶液６２．５ｍｌを加え４００ｒｐｍ、８０℃で３０分間撹拌をおこないＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。次にＳｐａｎ８５含有ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ （ｈｅａｖｙ）をセルロース溶液に加え８００ｒｐｍ、１００℃で１０分間撹拌しセルロース溶液の液滴分散液（ＩＬ／Ｏ型エマルジョン）を調製後、上記で得られたＷ／Ｏ型エマルジョンを加え８００ｒｐｍで撹拌しながら室温に冷却した。その後、１５００ｍｌエタノール中に注ぎ撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。さらにエタノール１５００ｍｌでデカンテーションを２回おこなった後、エタノールで濾過洗浄を行い、さらに水で濾過洗浄を行い目的のセルロース粒子を得た。また、生成物の目開き１ｍｍの網上に残る凝固物は３０％（対原料セルロース投入重量）であった。得られた粒子は体積平均粒径１０１μｍ、Ｃ．Ｖ．値１１６％であった。
次に、セルロース粒子を１０６μｍと４０μｍのふるいにかけ４０μｍ〜１０６μｍの粒径をもつ粒子を得た。得られた粒子沈降体積は１０ｍｌであった。この操作を複数回行い必要量の粒子を得た。
Comparative Example 1 (Production of cellulose particles C)
Cellulose particles were produced according to the method described in J. Chromatogr. A 1217 (2010) 1298-1304 (Non-patent Document 4).
That is, 4.17 g of cellulose powder was added to 60 g of 1-butyl-3-methylimidazolium chloride (manufactured by Aldrich) in a separable flask with a 500 ml baffle, set in a hot water bath, heated to 95 ° C., and stirred for 2 hours. This was dissolved to obtain a cellulose solution. In another 500 ml separable flask, add 9 ml of Span 85 (molecular weight 957) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 200 ml of mineral oil (heavy) (manufactured by Aldrich) And dissolved. In another separable flask, add 6.75 ml of Span85 to 150 ml of mineral oil (heavy), set in a warm water bath and stir at 80 ° C. for 2 hours to dissolve, then add 62.5 ml of 0.2M aqueous sodium sulfate solution. Stirring was performed at 400 rpm and 80 ° C. for 30 minutes to obtain a W / O type emulsion. Next, Span85-containing mineral oil (heavy) was added to the cellulose solution and stirred at 800 rpm and 100 ° C. for 10 minutes to prepare a droplet dispersion (IL / O type emulsion) of the cellulose solution, and then the W / O type obtained above. The emulsion was added and cooled to room temperature with stirring at 800 rpm. Thereafter, the mixture was poured into 1500 ml of ethanol, left to stand after stirring, and the supernatant was removed by decantation. Further, decantation was performed twice with 1500 ml of ethanol, followed by filtration and washing with ethanol, and further filtration and washing with water to obtain the intended cellulose particles. Further, the solidified product remaining on the net having a mesh size of 1 mm was 30% (vs. the raw material cellulose input weight). The obtained particles had a volume average particle size of 101 μm, C.I. V. The value was 116%.
Next, cellulose particles were passed through 106 μm and 40 μm sieves to obtain particles having a particle size of 40 μm to 106 μm. The resulting particle sedimentation volume was 10 ml. This operation was repeated several times to obtain the required amount of particles.
比較例２（セルロース粒子Ｄの製造）
実施例１でエチルセルロース４５の代わりにＳＰＡＮ８５を用いた以外は実施例１と同様にしてセルロース粒子を得た。目開き１ｍｍの網上に残る凝固物は８０％（対原料セルロース投入重量）でありふるいにかける前は体積平均粒径１０５μｍ、Ｃ．Ｖ．値１１８％であった。ふるいにかけた後の４０〜１０６μｍの粒径をもつ粒子沈降体積は３ｍｌであり、その後の評価に用いることができる量を得ることが出来なかった。
また、実施例１、２、比較例１、２におけるセルロース粒子のふるいにかける前のＣ．Ｖ．値とふるいにかけた後に得られた粒子沈降体積を表１にまとめた。
本発明の方法によりセルロースをイオン液体に溶解した溶液からでも、高収率でクロマトグラフィー用充填剤に適した粒径のセルロース粒子を得ることができる。
Comparative Example 2 (Production of cellulose particles D)
Cellulose particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that SPAN85 was used instead of ethylcellulose 45 in Example 1. The coagulated substance remaining on the mesh having a mesh size of 1 mm is 80% (vs. the raw material cellulose input weight), and before sieving, the volume average particle diameter is 105 μm. V. The value was 118%. The particle sediment volume with a particle size of 40 to 106 μm after sieving was 3 ml, and an amount that could be used for subsequent evaluation could not be obtained.
In addition, C. before sieving the cellulose particles in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2. V. Table 1 summarizes the values and particle sedimentation volumes obtained after sieving.
Even from a solution in which cellulose is dissolved in an ionic liquid by the method of the present invention, cellulose particles having a particle size suitable for a packing material for chromatography can be obtained in high yield.
実施例３（セルロース粒子Ａの化学架橋及びプロテインＡの固定化）
１００ｍｌ三ツ口フラスコを用い実施例１で製造したセルロース粒子２５ｍｌ（沈降体積）に水３５ｍｌを加えた。次にＮａＢＨ4１２０ｍｇ、３２重量％Ｎａ2ＳＯ4水溶液２５ｍｌ、４５重量％ＮａＯＨ水溶液０．６ｍｌを加え撹拌した。温度を５０℃にして３０分間撹拌を継続した。次に、４５重量％ＮａＯＨ０．９ｍｌとエピクロロヒドリン０．７２ｍｌを１時間おきに１２回加えた。添加終了後、温度５０℃で１２時間反応させた。その後、濾過により粒子を回収し、純水で洗浄し、化学架橋セルロース粒子Ａを得た。得られた粒子５ｍｌ（沈降体積）をサクションドライし、水を加えて計７ｍｌの懸濁液とした。上記の懸濁液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍｌ、ＮａＢＨ4２４ｍｇ、及びエピクロロヒドリン４ｍｌを加え、２５℃で８時間振とうし、化学架橋セルロース粒子Ａにエポキシ基を導入した。その後、上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行った。得られた粒子をプロテインＡ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ社、ｒＰＡ５０）１０２ｍｇを含む１．５Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）４５ｍｌで懸濁した。上記懸濁液を２５℃で２４時間振とうし、プロテインＡを粒子に結合させた。その後、粒子を遠心沈降して上澄み液を除いた。次に１Ｍチオグリセロール、０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４５ｍｌを加えて２５℃で4時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、ＰＢＳ（−）で順次洗浄し、プロテインＡ固定化セルロース粒子Ａを得た。
Example 3 (Chemical cross-linking of cellulose particles A and immobilization of protein A)
35 ml of water was added to 25 ml (sedimentation volume) of the cellulose particles produced in Example 1 using a 100 ml three-necked flask. Next, 120 mg of NaBH 4 , 25 ml of 32 wt% Na 2 SO 4 aqueous solution and 0.6 ml of 45 wt% NaOH aqueous solution were added and stirred. The temperature was raised to 50 ° C. and stirring was continued for 30 minutes. Next, 0.9 ml of 45 wt% NaOH and 0.72 ml of epichlorohydrin were added 12 times every 1 hour. After completion of the addition, the reaction was carried out at a temperature of 50 ° C. for 12 hours. Thereafter, the particles were collected by filtration and washed with pure water to obtain chemically crosslinked cellulose particles A. 5 ml (sedimentation volume) of the obtained particles were suction-dried, and water was added to make a total suspension of 7 ml. To the above suspension, 0.8 ml of 5N aqueous sodium hydroxide solution, 24 mg of NaBH 4 and 4 ml of epichlorohydrin were added and shaken at 25 ° C. for 8 hours to introduce epoxy groups into the chemically crosslinked cellulose particles A. Thereafter, the above reaction solution was filtered and washed in the order of pure water, ethanol, and pure water. The obtained particles were suspended in 45 ml of 1.5 M sodium sulfate and 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 102 mg of protein A (RepliGen, rPA50). The suspension was shaken at 25 ° C. for 24 hours to bind protein A to the particles. Thereafter, the particles were centrifuged and the supernatant was removed. Next, 45 ml of 1 M thioglycerol and 0.5 M sodium sulfate aqueous solution (pH 8.3) was added and reacted at 25 ° C. for 4 hours to block the remaining epoxy groups, and 0.1 M citrate buffer (pH 3.2), 0 .1M sodium hydroxide aqueous solution and PBS (-) were washed in order to obtain protein A-immobilized cellulose particles A.
実施例４（セルロース粒子Ｂの化学架橋及びプロテインＡの固定化）
実施例２で得られたセルロース粒子を実施例３と同様の方法により化学架橋した後、プロテインＡを固定化し、プロテインＡ固定化セルロース粒子Ｂを得た。
Example 4 (Chemical cross-linking of cellulose particles B and immobilization of protein A)
After the cellulose particles obtained in Example 2 were chemically cross-linked by the same method as in Example 3, protein A was immobilized to obtain protein A-immobilized cellulose particles B.
比較例３（セルロース粒子Ｃの化学架橋及びプロテインＡの固定化）
比較例１で得られたセルロース粒子を実施例３と同様の方法により化学架橋した後、プロテインＡを固定化し、プロテインＡ固定化セルロース粒子Ｃを得た。
Comparative Example 3 (Chemical Crosslinking of Cellulose Particle C and Immobilization of Protein A)
After the cellulose particles obtained in Comparative Example 1 were chemically cross-linked by the same method as in Example 3, Protein A was immobilized to obtain Protein A-immobilized cellulose particles C.
実施例５（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）動的結合容量と圧力の測定）
実施例３、４、比較例３で得られたプロテインＡ固定化セルロース粒子をそれぞれ内径０．５ｃｍのカラムにベッド高２０．０ｃｍまで詰めた。各カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｌ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を、線流速１５０ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧ濃度が１０％ブレークスルー（破過）の時のヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量と充填剤体積から動的結合容量を求めた。また、そのときのカラム圧を測定した。線流速３００ｃｍ／時間、６００ｃｍ／時間の時の動的結合容量とカラム圧も同様にして求めた。結果を表２に示す。
本発明品はカラム圧が低く体積当たりのＩｇＧ動的結合容量が高かった。特に高流速において体積当たりのＩｇＧ動的結合容量が高かった。
Example 5 (Measurement of dynamic binding capacity and pressure of immunoglobulin G (IgG))
The protein A-immobilized cellulose particles obtained in Examples 3 and 4 and Comparative Example 3 were packed in a column having an inner diameter of 0.5 cm to a bed height of 20.0 cm. After equilibrating each column with 20 mM phosphate buffer (pH 7.4), 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing human polyclonal IgG (5 mg / ml) was allowed to flow at a linear flow rate of 150 cm / hour, and the absorbance was monitored. The dynamic binding capacity was determined from the amount of human polyclonal IgG adsorbed and the filler volume when the human polyclonal IgG concentration in the eluate was 10% breakthrough (breakthrough). Further, the column pressure at that time was measured. The dynamic binding capacity and the column pressure at a linear flow rate of 300 cm / hour and 600 cm / hour were determined in the same manner. The results are shown in Table 2.
The product of the present invention had a low column pressure and a high IgG dynamic binding capacity per volume. In particular, IgG dynamic binding capacity per volume was high at high flow rates.
Claims (10)
（２）前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤及び前記有機溶剤に可溶な親油性高分子とを混合し、前記セルロース溶液の液滴を有機溶剤中に分散させるセルロース溶液の液滴分散液の調製工程、並びに、
（３）セルロースを凝固させてセルロース粒子を得る凝固工程、
を含むことを特徴とするセルロース粒子の製造方法。 (1) Preparation process of cellulose solution for dissolving cellulose in ionic liquid,
(2) A droplet dispersion of a cellulose solution in which an organic solvent having low compatibility with the ionic liquid and an oleophilic polymer soluble in the organic solvent are mixed and the droplets of the cellulose solution are dispersed in the organic solvent. The preparation process, and
(3) a coagulation step for coagulating cellulose to obtain cellulose particles;
The manufacturing method of the cellulose particle characterized by including.
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