JP2012068254A

JP2012068254A - 腫瘍治療のための組成物と方法

Info

Publication number: JP2012068254A
Application number: JP2011231764A
Authority: JP
Inventors: Sarah C Bodary; ボーダリー，サラ，シー．; L Fisher Karen; フィッシャー，カレン，エル．
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2012-04-05
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: US20080175842A1; AU776600B2; EP1204682B1; WO2001009189A3; CA2378182C; US20030113764A1; JP5897300B2; US7226596B2; ES2355055T3; DE60045247D1; JP2014144959A; AU6391300A; EP1204682A2; WO2001009189A2; ATE488529T1; CA2378182A1; JP2003508028A

Abstract

【課題】腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅するＡＤＡＭ８遺伝子の同定に基づき、遺伝子増幅は、同型組織の正常細胞と比較して遺伝子産物の過剰発現に関連し、腫瘍形成に貢献しているので、増幅遺伝子によってコードされているＡＤＡＭ８タンパク質の発現を検出する。
【解決手段】(a)試験試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現をインビトロで検出すること、及び(b)該試験試料中の発現レベルをコントロールと比較することを含み、このときコントロール試料と比較して該試験試料中の該ポリペプチドレベルの発現が高い場合に、試験試料を採取した該哺乳動物に腫瘍があることを示す、新生物性疾患のインビトロ検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、腫瘍の診断及び治療のための組成物及び方法に関する。

悪性腫瘍（癌）は、米国特許において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boringら, CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993]）。
癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍実体を形成する異常な、又は腫瘍形成性の細胞数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節及び離間部位に拡散（転移）する悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
遺伝子発現の交互変化は制御不能な細胞成長及び脱分化に強く関連しており、全ての癌に共通する特徴である。或る種の良く研究されたゲノムが、通常は腫瘍抑制遺伝子と呼ばれ、正常には悪性細胞成長又は或る種の優性遺伝子、例えば悪性成長を促進するように作用するオンコジーンの過剰発現を防止するように作用する劣性遺伝子発現の現象を示すことが見出された。これらの遺伝子変化は、凝集して十分な腫瘍形成性フェノタイプを示す形質の幾つかが移入される原因であることが明らかとなった（Hunter, Cell 64: 1129 [1991]; Bishop, Cell 64: 235-248 [1991]）。

癌細胞における良く知られた遺伝子(例えばオンコジーン）の過剰発現のメカニズムは遺伝子増幅である。これは、祖先細胞の染色体において特定遺伝子の多重コピーが生成されるプロセスである。このプロセスは、遺伝子を含む染色体の領域の計画性のない複製、次いで複製されたセグメントが染色体へ戻る再組換えを含む（Alitaloら, Adv. Cancer Res. 47: 235-281 [1986]）。遺伝子増幅に平行する遺伝子の過剰発現は、即ち作成されるコピーの数に比例すると考えられている。
増殖因子及び増殖因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳癌を含む様々なヒトの悪性腫瘍の原因に重要な役割を担っていることが確認されている。例えば、表皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した１８５-ｋｄの膜貫通糖タンパク質レセプター(ｐ１８５^ＨＥＲ２、ＨＥＲ２）をコードするヒトＥｒｂＢ２遺伝子(ｅｒｂＢ２、ｈｅｒ２としても知られている、又はｃ-ｅｒｂＢ-２)は、ヒトの乳癌の約２５％〜３０％で過剰発現されていることが見出されている(Slamonら, Science 235:177-182[1987]；Slamonら, Science 244:707-712[1989])。

プロトオンコジーンの遺伝子増幅は、典型的には癌のより悪性の形態に含まれる事象であり、臨床的結果の予言者として作用しうることが報告されている（Schwabら, Genes Chromosomes Cancer 1, 181-193 [1990]; Alitaloら, 上掲）。即ち、ｅｒｂＢ２の過剰発現は、特に腋窩のリンパ節を含む一次疾患を持つ患者において、不完全な予後の前兆と共通して見なされており（Slamonら, [1987]及び[1989], 上掲; Ravdin及びChamness, Gene 159: 19-27 [1995]; 及びHynes及びStern, Biochem Biophys Acta 1198: 165-184 [1994]）、ホルモン療法及びＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセート、及びフルオロウラシル）を含む化学治療薬に対する感受性又は耐性と関連付けられていた（Baselgaら, Oncology 11 (3 Suppl 1): 43-48 [1997]）。しかしながら、ｅｒｂＢ２過剰発現と不完全な予後との関連にも関わらず、ＨＥＲ２-ポジティブな患者のタキサンでの処理に臨床的に反応する可能性は、ＨＥＲ２-ネガティブ患者の３倍も大きかった（上掲）。組換えヒト化抗-ＥｒｂＢ２(抗-ＨＥＲ２）モノクローナル抗体(マウス抗-ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化型、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２又はHerceptin(商品名)と呼ばれる）は、広範な従来の抗癌治療を受けたＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を持つ患者で臨床的に活性である(Baselgaら, J. Clin. Oncol. 14: 737-744[1996]）。

マウスＡＤＡＭ８（ＭＳ２及びｍＣＤ１５６としても知られている）は、マクロファージ及びマクロファージ株化細胞から最初にクローン化され、細胞表層抗原として記述された（Yoshidaら, (1990)Intl Immunology 2:585-591）。当初は認識されなかったが、ｍＡＤＡＭ８は、出血性蛇毒タンパク質のメタロプロテイナーゼドメインに類似する構造をアミノ末端のシステインリッチ領域に有し、骨髄単球性細胞の組織浸潤を一役を担うことができる（Higuchi, Y.ら, (1996) Tissue Antigens 48:423；Kataoka, M.ら(1997) J. Biol. Chem 29: 18209-18215）。ヒトＡＤＡＭ８（hADAM8、hCD156としても知られている）はクローン化され、染色体１０ｑ２６．３．ｈＡＤＡＭ８へマップされた対応する遺伝子はｍＡＤＡＭ８と６１．７％の相同性を示し、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを表す（Yoshiyama, K.ら(1997) Genomics 41:56-62）。さらに、ＡＤＡＭ８ペプチドは神経系の全身性自己免疫ラットモデルに寛容誘導を増した（Schluesener, H. (1998) J. Neuroimmunology 87: 197-202）。
ＷＯ９７４００７２には、ＡＤＡＭ１２タンパク質及びその利用について記載されている。
上記に照らして、遺伝子増幅に関連する腫瘍の診断及び治療に有用な新規な方法及び組成物を同定することに明らかな興味がある。

１．実施態様
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における腫瘍細胞成長及び増殖の診断及び治療のための組成物及び方法に関する。本発明は、腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅される遺伝子の同定に基づく。このような遺伝子増幅は、遺伝子産物の過剰発現を伴い、腫瘍形成に寄与すると予測される。従って、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質は、或る種の癌の診断及び治療（予防を含む）に有用であると考えられ、腫瘍治療の予後の予言者として作用する。
マウスのＡＤＡＭ８分子をクローン化したものには当初は認識されなかったが、ＡＤＡＭ８はメタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインを含有する。単球（白血球の）上に存在する抗原としても単離された。従って、ＡＤＡＭ８は、細胞外マトリックスの単球の移動、或いは恐らくはサイトカイン又はその他の走化性分子のプロセッシングにおいての一役を担うと考えられている。例えば、腫瘍細胞上、腫瘍細胞に近接する間質又は上皮細胞でのＡＤＡＭ８発現の増大は、腫瘍細胞が細胞外マトリックスの中を移動する、或いはサイトカイン又はその他の走行性分子を加工する手段を提供する。それ故に、腫瘍又はその付近でのＡＤＡＭ８発現の増大は、腫瘍細胞が組織へ侵入する又は転移を形成する手段を提供する。抗体又は組織の中或いは外へ移動する腫瘍細胞の能力をブロック、不活性化さもなくば無能力化する他の分子でこのような分子を標的化することは、臨床的に関連性のある抗腫瘍治療となる。

一実施態様では、本発明は、ここでＡＤＡＭ８と命名されるポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。一側面では、単離された抗体は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドに特異的に結合する。他の側面では、抗体はＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する細胞の死を誘導する。多くの場合、ＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する細胞は、当該ポリペプチドを同じ組織型の正常細胞に比較して過剰に発現する腫瘍細胞である。さらに他の側面では、抗体はモノクローナル抗体であり、それは好ましくは非ヒトの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体はラベル化されてもよいし、固体支持体へ固定されてもよい。さらに他の側面では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体であって、好ましくはＡＤＡＭ８ポリペプチドに特異的に結合する。

他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容される担体と混合された、好ましくはＡＤＡＭ８ポリペプチドに特異的に結合する抗体とを含む物質の組成物に関する。一側面では、この物質の組成物は抗体の治療的有効量を含有する。他の側面では、この組成物は、例えば更なる抗体又は細胞毒性又は化学治療薬であってよい更なる活性成分を含む。好ましくは、この組成物は無菌である。
さらなる実施態様では、本発明は、抗-ＡＤＡＭ８抗体をコードする単離された核酸分子、及びそのような核酸分子を含むベクター及び組換え宿主細胞に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は抗-ＡＤＡＭ８抗体の製造方法に関し、当該方法は、その抗体をコードする核酸分子で形質転換した宿主細胞を当該抗体を発現させるのに十分な条件下で培養し、細胞培地から抗体を回収することを含んでなる。
さらに本発明は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能又は活性の１つ又は複数を阻害するＡＤＡＭ８ポリペプチドのアンタゴニストに関する。ＡＤＡＭ８ポリペプチドのアゴニストもここにおいて考慮されている。

さらなる実施態様では、本発明は、ＡＤＡＭ８ポリペプチド、又はその補体をコードする核酸配列にハイブリッド形成する単離された核酸分子に関する。単離された核酸分子は、好ましくはＤＮＡであり、ハイブリッド形成は好ましくは厳密なハイブリッド形成法及び洗浄条件下で起こる。このような核酸分子は、ここで同定される増幅された遺伝子のアンチセンス分子として作用でき、また翻って各増幅遺伝子の転写及び／又は翻訳の調節において、又は増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出される。さらに、このような配列は、リボザイム(ribozyme)及び／又は三重螺旋配列の一部として使用することができ、それは翻って増幅遺伝子の調節に置いて使用してもよい。
他の実施態様では、本発明は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドを含有すると推測される試料中でＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、当該方法は、当該試料を抗-ＡＤＡＭ８抗体に暴露し、当該抗体の試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドへの結合を測定することを含んでなる。他の実施態様では、本発明は、細胞中でのＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、当該方法は、当該細胞を抗-ＡＤＡＭ８抗体に曝露し、抗体の細胞への結合を測定することを含む。

さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物において腫瘍を診断する方法に関し、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中、及び（ｂ）同じ細胞型の知られた正常組織細胞の対照試料中におけるＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、対照試料に比較した試験試料における高いレベルが、当該試験組織細胞を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す。
他の実施態様では、本発明は、哺乳動物において腫瘍を診断する方法に関し、（ａ）抗-ＡＤＡＭ８抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料と接触させ、そして（ｂ）抗-ＡＤＡＭ８抗体と試験試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含んでなり、複合体の形成が前記哺乳動物における腫瘍の存在を示す。測定は定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の知られた正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監視と比較して実施してもよい。試験試料中の複合体形成量の増加が、試験試料を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で公知の他の技術によって監視できる。
試験試料は通常、腫瘍性細胞成長又は増殖（例えば癌性細胞）を有すると推測される個体から得る。

他の実施態様では、本発明は、抗-ＡＤＡＭ８抗体及び担体（例えば緩衝液）を適切な包装内に含んでなる癌診断用キットに関する。このキットは、好ましくは当該抗体が、ＡＤＡＭ８ポリペプチドを含有することが推測される試料中のそれらの存在をを検出するために用いられるという説明書を具備する。
さらに他の実施態様では、本発明は腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関し、ＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する腫瘍細胞を、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性及び／又は発現を阻害する薬剤の有効量に暴露することを含んでなり、それにより当該腫瘍細胞の成長が阻害される。この薬剤は、好ましくは抗-ＡＤＡＭ８抗体、小さな有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、又は三重螺旋分子である。特別な態様では、薬剤、例えば抗-ＡＤＡＭ８抗体は細胞死を誘発する。さらなる態様では、腫瘍細胞には、放射線処理、細胞毒性薬又は化学治療薬がさらに施される。
さらなる実施態様では、本発明は、
容器；
当該容器上のラベル；及び
当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備し、当該組成物が腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効であり、容器上のラベルが当該組成物は前記腫瘍細胞中で同じ組織型の正常細胞に比較してＡＤＡＭ８ポリペプチドの過剰発現を特徴とする状態の治療に有効であることを表示する製造品に関する。特別な側面では、組成物中の活性剤は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する薬剤である。好ましい側面では、活性剤は抗-ＡＤＡＭ８抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

また本発明は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する方法を提供し、候補化合物をＡＤＡＭ８ポリペプチドと、２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させ、前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性が阻害されるか否かを測定することを含んでなる。他の態様では、非固定化成分が検出可能な標識を担持している。好ましい態様では、この方法は、（ａ）細胞とスクリーニングすべき候補化合物とを、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在下で、ＡＤＡＭ８ポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ、そして（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して試験化合物が有効なアンタゴニストか否かを決定することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明はＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する細胞で前記ポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定する方法を提供し、当該細胞を化合物と接触させ、前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含んでなる。好ましい側面では、この方法は、（ａ）細胞とスクリーニングすべき候補化合物とを、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現に適した条件下で接触させ、（ｂ）前記ポリペプチド発現の阻害を測定する工程を具備する。

ＡＤＡＭ８配列
天然ＡＤＡＭ８タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す：
MRGLGLWLLGAMMLPAIAPSRPWALMEQYEVVLPRRLPGPRVRRALPSHLGLHPERVSYVLGATGHNFTLHLRKNRDLLGSGYTETYTAANGSEVTEQPRGQDHCLYQGHVEGYPDSAASLSTCAGLRGFFQVGSDLHLIEPLDEGGEGGRHAVYQAEHLLQTAGTCGVSDDSLGSLLGP RTAAVFRPRPGDSLPSRETRYVELYVVVDNAEPQMLGSEAAVRHRVLEVVNHVDKLYQKL NFRVVLVGLEIWNSQDRFHVSPDPSVTLENLLTWQARQRTRRHLHDNVQLITGVDFTGTTVGFARVSAMCSHSSGAVNQDHSKNPVGVACTMAHEMGHNLGMDHDENVQGCRCQERFEAGRCIMAGSIGSSFPRMFSDCSQAYLESFLERPQSVCLANAPDLSHLVGGPVCGNLFVERGEQCDCGPPEDCRNRCCNSTTCQLAEGAECAHGTCCQECKVKPAGELCRPKKDMCDLEEFCDGRHPECPEDAFQENGTPCSGGYCYNGACPTLAQQCQAFWGPGGQAAEESCFSYDILPGCKASRYRADMCGVLQCKGGQQPLGRAIlCIVDVCHALTTEDGTAYEPVPEGTRCGPEKVCWKGRCQDLHVYRSSNCSAQCHNHGVCNHKQECHCHAGWAPPHCAKLLTEVHAASGSLPVLVVV VLVLLAVVLVTLAGIIVYRKARSRILSRNVAPKTTMGRSNPLFHQAASRVPAKGGAPAPS RGPQELVPTTHPGQP ARHPASSVALKRPPPAPPVTVSSPPFPVPVYTRQAPKQVIKPTFA PPVPPVKPGAGAANPGPAEGAVGPKVALKPPIQRKQGAGAPTAP（配列番号：１）

ＡＤＡＭ８アミノ酸ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を下記に示す：
ATGCGCGGCCTCGGGCTCTGGCTGCTGGGCGCGATGATGCTGCCTGCGATTGCCCCCAGCCGGCCCTGGGCCCTCATGGAGCAGTATGAGGTCGTGTTGCCGCGGCGTCT GCCAGGCCCCCGAGTCCGCCGAGCTCTGCCCTCCCACTTGGGCCTGCACC CAGAGAGGGTGAGCTACGTCCTTGGGGCCACAGGGCACAACTTCACCCTC CACCTGCGGAAGAACAGGGACCTGCTGGGTTCCGGCTACACAGAGACCTA TACGGCTGCCAATGGCTCCGAGGTGACGGAGCAGCCTCGCGGGCAGGACC ACTGCTTATACCAGGGCCACGTAGAGGGGTACCCGGACTCAGCCGCCAGC CTCAGCACCTGTGCCGGCCTCAGGGGTTTCTTCCAGGTGGGGTCAGACCT GCACCTGATCGAGCCCCTGGATGAAGGTGGCGAGGGCGGACGGCACGCCG TGTACCAGGCTGAGCACCTGCTGCAGACGGCCGGGACCTGCGGGGTCAGC GACGACAGCCTGGGCAGCCTCCTGGGACCCCGGACGGCAGCCGTCTTCAG GCCTCGGCCCGGGGACTCTCTGCCATCCCGAGAGACCCGCTACGTGGAGC TGTATGTGGTCGTGGACAATGCAGAGTTCCAGATGCTGGGGAGCGAAGCA GCCGTGCGTCATCGGGTGCTGGAGGTGGTGAATCACGTGGACAAGCTATA TCAGAAACTCAACTTCCGTGTGGTCCTGGTGGGCCTGGAGATTTGGAATA GTCAGGACAGGTTCCACGTCAGCCCCGACCCCAGTGTCACACTGGAGAAC CTCCTGACCTGGCAGGCACGGCAACGGACACGGCGGCACCTGCATGACAA CGTACAGCTCATCACGGGTGTCGACTTCACCGGGACTACTGTGGGGTTTG CCAGGGTGTCCGCCATGTGCTCCCACAGCTCAGGGGCTGTGAACCAGGAC CACAGCAAGAACCCCGTGGGCGTGGCCTGCACCATGGCCCATGAGATGGG CCACAACCTGGGCATGGACCATGATGAGAACGTCCAGGGCTGCCGCTGCC AGGAACGCTTCGAGGCCGGCCGCTGCATCATGGCAGGCAGCATTGGCTCC AGTTTCCCCAGGATGTTCAGTGACTGCAGCCAGGCCTACCTGGAGAGCTT TTTGGAGCGGCCGCAGTCGGTGTGCCTCGCCAACGCCCCTGACCTCAGCC ACCTGGTGGGCGGCCCCGTGTGTGGGAACCTGTTTGTGGAGCGTGGGGAG CAGTGCGACTGCGGCCCCCCCGAGGACTGCCGGAACCGCTGCTGCAACTC TACCACCTGCCAGCTGGCTGAGGGGGCCCAGTGTGCGCACGGTACCTGCT GCCAGGAGTGCAAGGTGAAGCCGGCTGGTGAGCTGTGCCGTCCCAAGAAG GACATGTGTGACCTCGAGGAGTTCTGTGACGGCCGGCACCCTGAGTGCCC GGAAGACGCCTTCCAGGAGAACGGCACGCCCTGCTCCGGGGGCTACTGCT ACAACGGGGCCTGTCCCACACTGGCCCAGCAGTGCCAGGCCTTCTGGGGG CCAGGTGGGCAGGCTGCCGAGGAGTCCTGCTTCTCCTATGACATCCTACC AGGCTGCAAGGCCAGCCGGTACAGGGCTGACATGTGTGGCGTTCTGCAGT GCAAGGGTGGGCAGCAGCCCCTGGGGCGTGCCATCTGCATCGTGGATGTG TGCCACGCGCTCACCACAGAGGATGGCACTGCGTATGAACCAGTGCCCGA GGGCACCCGGTGTGGACCAGAGAAGGTTTGCTGGAAAGGACGTTGCCAGG ACTTACACGTTTACAGATCCAGCAACTGCTCTGCCCAGTGCCACAACCAT GGGGTGTGCAACCACAAGCAGGAGTGCCACTGCCACGCGGGCTGGGCCCC GCCCCACTGCGCGAAGCTGCTGACTGAGGTGCACGCAGCGTCCGGGAGCC TCCCCGTCCTCGTGGTGGTGGTTCTGGTGCTCCTGGCAGTTGTGCTGGTC ACCCTGGCAGGCATCATCGTCTACCGCAAAGCCCGGAGCCGCATCCTGAG CAGGAACGTGGCTCCCAAGACCACAATGGGGCGCTCCAACCCCCTGTTCC ACCAGGCTGCCAGCCGCGTGCCGGCCAAGGGCGGGGCTCCAGCCCCATCC AGGGGCCCCCAAGAGCTGGTCCCCACCACCCACCCGGGCCAGCCCGCCCG ACACCCGGCCTCCTCGGTGGCTCTGAAGAGGCCGCCCCCTGCTCCTCCGG TCACTGTGTCCAGCCCACCCTTCCCAGTTCCTGTCTACACCCGGCAGGCA CCAAAGCAGGTCATCAAGCCAACGTTCGCACCCCCAGTGCCCCCAGTCAA ACCCGGGGCTGGTGCGGCCAACCCTGGTCCAGCTGAGGGTGCTGTTGGCC CAAAGGTTGCCCTGAAGCCCCCCATCCAGAGGAAGCAAGGAGCCGGAGCT CCCACAGCACCCTAGGGGGGCACCTGCGCCTGTGTGGAAATTTGGAGAAG TTGCGGCAGAGAAGCCATGCGTTCCAGCCTTCCACGGTCCAGCTAGTGCC GCTCAGCCCTAGACCCTGACTTTGCAGGCTCAGCTGCTGTTCTAACCTCA GTAATGCATCTACCTGAGAGGCTCCTGCTGTCCACGCCCTCAGCCAATTC CTTCTCCCCGCCTTGGCCACGTGTAGCCCCAGCTGTCTGCAGGCACCAGG CTGGGATGAGCTGTGTGCTTGCGGGTGCGTGTGTGTGTACGTGTCTCCAG GTGGCCGCTGGTCTCCCGCTGTGTTCAGGAGGCCACATATACAGCCCCTC CCAGCCACACCTGCCCCTGCTCTGGGGCCTGCTGAGCCGGCTGCCCTGGG CACCCGGTTCCAGGCAGCACAGACGTGGGGCATCCCCAGAAAGACTCCAT CCCAGGACCAGGTTCCCCTCCGTGCTCTTCGAGAGGGTGTCAGTGAGCAG ACTGCACCCCAAGCTCCCGACTCCAGGTCCCCTGATCTTGGGCCTGTTTC CCATGGGATTCAAGAGGGACAGCCCCAGCTTTGTGTGTGTTTAAGCTTAG GAATGCCCTTTATGGAAAGGGCTATGTGGGAGAGTCAGCTATCTTGTCTG GTTTTCTTGAGACCTCAGATGTGTGTTCAGCAGGGCTGAAAGCTTTTATT CTTTAATAAT GAGAAATGTATATTTTACTAATAAATTATTGACCGAGTTCTGTAGATTCTTGTTAGA（配列番号：２）
Yoshida S.ら(1990) Intl Immunology 2(6): 585-91及びYoshiyama K.ら(1997) Genomics 41:56-62を参照のこと。

表１及び表２の概要
表１Ａ−Ｄは、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムを用いて％アミノ酸配列同一性（表１Ａ−Ｂ）及び％核酸配列同一性（表１Ｃ−Ｄ）を決定するための下記に記載の方法を用いることに関する仮説的例示を示し、「ＰＲＯ」は対象とする仮説的ＡＤＡＭ８ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。「比較タンパク質」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象とする仮説的ＡＤＡＭ８コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
表２Ａ−Ｑは、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムの完全なソースコードを提供する。このソースコードはＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するために日常的にコンパイルでき、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを提供する。

（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は株化細胞で生成されるプロセスを意味する。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸展）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。

「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接的に腫瘍細胞の病理を低下させてもよいし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び／又は化学治療に対してより敏感にしてもよい。
癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝化水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の自己形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。

１つ又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０及びＲｅ^１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロランブシル、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。

ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、増殖阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１期停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１期停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。

「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓増殖因子；線維芽増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。

本出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)及びStellaら,「Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borchardtら,(編), pp.247-267, Humana Press(1985)を参照。限定するものではないが、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、前掲の化学療法剤が含まれる。

ここで用いられる場合の「ＡＤＡＭ８」又は「ＡＤＡＭ８ポリペプチド」という用語は、天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチド及びＡＤＡＭ８ポリペプチド変異体（さらにここで定義される）を含み、好ましくはヒトポリペプチドである。ＡＤＡＭ８ポリペプチドは、例えばヒト組織型又はその他のソースなどの種々のソースから単離することができ、或いは組み換え体及び／又は合成法によって調製することができる。

「天然配列」ＡＤＡＭ８ポリペプチドは、天然由来のＡＤＡＭ８ポリペプチドポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ＡＤＡＭ８ポリペプチドという用語には、特に、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形体(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＡＤＡＭ８ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の或る実施態様では、天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドは、上記に示したアミノ酸配列（配列番号：１）を含む成熟又は全長の天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドである。ここで各天然ポリペプチドの断片は、これらに限られないが、そのような切断（分泌）形態が自然に生ずるか否かに関わらず、そこから天然Ｎ-末端シグナル配列が全部又は一部欠失され、又は他の配列に置換されたポリペプチド変異体及び各天然配列の細胞外ドメインを含む。断片は、好ましくは対応する天然「ＡＤＡＭ８」ポリペプチドに特異的に結合する抗体の生産のために十分な長さである。

「ＡＤＡＭ８ポリペプチド変異体」とは、上記に示されたアミノ酸配列（配列番号：１）と約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、或いはそれの特に誘導された断片を有する下記に定義されるような活性ＡＤＡＭ８ポリペプチドを意味する。このようなＡＤＡＭ８ポリペプチド変異体には、例えば、配列番号：１の配列において、各々、内部ドメインと共にＮ-及び／又はＣ-末端で１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失したＡＤＡＭ８ポリペプチドが含まれる。通常、ＡＤＡＭ８ポリペプチド変異体は、配列番号：１のアミノ酸配列又はその誘導ポリペプチド断片の各々と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。変異体は、天然ＡＤＡＭ８ポリペプチド配列を含まない。

ここで定義されるＡＤＡＭ８ポリペプチドに関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＡＤＡＭ８ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここで使用される％同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いることで発生する。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの（すなわち調節可能なパラメータ）は、次の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。％アミノ酸配列同一性の値は、（ａ）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定される対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドのアミノ酸配列と対象の比較アミノ酸配列（すなわち、対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドが比較されている配列）の間の一致するアミノ酸残基の数を（ｂ）対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドのアミノ酸残基の全数でそれぞれ除することにより決定される。
上記にもかかわらず、％アミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ユーザー資料と共に米国著作権庁、Washington D.C., 20559へ提出されて米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている、コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることでも決定することができる。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。表２Ａ−Ｑを参照のこと。

「ＡＤＡＭ８変異体ポリヌクレオチド」又は「ＡＤＡＭ８変異体核酸配列」とは、上記に示したヌクレオチド配列（配列番号：２）と少なくとも８０％の配列同一性を有する、或いは特にそれの誘導化された断片を有する、下記に定義されるような活性ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸分子である。通常は、ＡＤＡＭ８変異体ポリペプチドヌクレオチドは、配列番号：２の核酸配列又はその誘導化断片と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくより好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。この点については、遺伝子コードの縮重のために、配列番号：２の核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する多くのＡＤＡＭ８変異体ポリヌクレオチドが、配列番号：１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることは、普通の当業者は直ぐに認識できる。

ここで同定されるＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここで使用される％同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschulら, 上掲）を用いることで発生する。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの（すなわち調節可能なパラメータ）は、次の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。％核酸配列同一性の値は、（ａ）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定される対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸配列と対象の比較核酸配列（すなわち、対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸配列が比較されている配列）の間の一致する核酸残基の数を（ｂ）対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドの核酸残基の全数でそれぞれ除することにより決定される。
上記にもかかわらず、％核酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ユーザー資料と共に米国著作権庁、Washington D.C., 20559へ提出されて米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている、コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることでも決定することができる。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。表２Ａ−Ｑを参照のこと。

他の実施態様では、ＡＤＡＭ８変異体ポリペプチドは、好ましくは厳密なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、全長ＡＤＡＭ８ポリペプチド（配列番号：１）をコードするヌクレオチド配列へハイブリッド形成することが可能であり、活性ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸分子である。ＡＤＡＭ８変異体ポリペプチドは、ＡＤＡＭ８変異体ポリヌクレオチドによってコードされうるものである。
上記のように実施された配列比較において、「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として；表３を参照のこと）を含む。ポジティブの％値は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス内でポジティブな値が付けられた残基のフラクションによって決まる。この値は、（ａ）WU-BLAST-2により決定される対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドアミノ酸配列と比較アミノ酸配列（すなわち、ＡＤＡＭ８ポリペプチド配列が比較されているアミノ酸配列）の間のＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおけるポジティブな値をつけるアミノ酸残基の数を（ｂ）対象のＡＤＡＭ８ポリペプチドのアミノ酸残基の全数で除することにより決定される。表１Ａ−Ｄを参照のこと。

ここで開示される種々のポリペプチドを記述するために用いられる「単離された」とは、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、天然に付随しているすべての成分をまったくともなっていない。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。ＡＤＡＭ８の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。

「単離された」ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される型あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡＤＡＭ８をそれぞれコードする核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡＤＡＭ８ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡＤＡＭ８ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＡＤＡＭ８ポリペプチドをそれぞれコードする核酸分子を含む。

「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に連結したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に連結」している。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に連結している。一般的に、「作用可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。連結は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。

バイブリダイゼーション反応の「厳密性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。バイブリダイゼーションは、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合に変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより厳密性にするが、低い温度は厳密性を低下させる。バイブリダイゼーション反応の厳密性の更なる詳細と説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。

ここで定義される「厳密性条件」又は「高厳密性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）バイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％のホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高厳密性洗浄を用いるものによって特定される。

「中程度の厳密性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように特定され、上記の厳密性より低い洗浄溶液及びバイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の厳密性条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーションに、１ｘＳＳＣ中約３５−５０℃でのフィルターの洗浄が続くといったものである。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。

ここで用いられる場合の「エピトープタグ」という用語は、「タグポリペプチド」に融合したＡＤＡＭ８ポリペプチド、又はそのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは抗体がそれに対して生成されるか、ある他の薬剤によって同定することができるエピトープを提供するのに十分であるが、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い残基を有する。タグポリペプチドはまた好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは一般に少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは、約１０〜約２０残基）を有する。

ＡＤＡＭ８ポリペプチド(又はそれらのコード化配列）に基づいて同定された分子という状況での「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＡＤＡＭ８ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するポリペプチド(例えば抗体)又は有機或いは無機小分子、ペプチドなどに相当する。
ここに開示されるスクリーニングアッセイによって同定できる抗体又は他のアンタゴニスト分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）の文脈における「生物学的活性」は、それらの分子がここに同定される増幅された遺伝子にコードされるペプチドと結合又は複合体形成する能力、又はコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を妨害する能力、又はＡＤＡＭ８ポリペプチドの転写又は翻訳を妨害する能力を指す。好ましい生物学的活性は、標的細胞の増殖阻害である。他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍細胞の死をもたらす細胞毒性活性である。

「免疫学的特性」なる語句は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性を意味する。
ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活性を持つＡＤＡＭ８ポリペプチドの定性的生物学的活性を、周知の活性ＡＤＡＭ８ポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを意味する。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジュバント中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜内又は皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反応性は好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子（例えば抗体）のＡＤＡＭ８ポリペプチドに対する結合親和性が、その分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対する結合親和性より有意に高い（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約４倍、さらにより好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約８倍高い）ことを意味する。

「アンタゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然ＡＤＡＭ８ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様の方法で、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然ＡＤＡＭ８ポリペプチドの生物学的活性に類似する任意の分子を含む。適したアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、小有機分子などを含む。
ここで、「小分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。

「抗体」（Ａｂｓ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇｓ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に、限定がなく、少なくとも二つの無傷の抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの無傷の抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体）、及び所望する生物活性を示す限りの抗体断片を対象とする。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。

「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、配列に関して抗体の中でかなり異なっており、特定の抗原に対する個々の抗体の結合性及び特異性として使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインの全体に渡って一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は、相補性決定領域(ＣＤＲｓ)と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。

ここで使用される場合の「高頻度可変領域」は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変領域の残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変領域の３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）からのアミノ酸残基、及び／又は「高頻度可変ループ」（例えば、軽鎖可変領域の残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変領域の残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｌ２)及び９６−１０１(Ｌ３)；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）からの残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異的抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を持つ２つの同一な抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映した名称の残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')_２断片が生成される。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の二量体からなる。この配置では、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面における抗原結合部位を決定するために各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合する能力を持つが、結合部位全体よりは親和性が低い。
また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')_２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

任意の種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる１つ又は２つの明らかに異なる型に分類できる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。

ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在する自然に起こりうる突然変異以外は同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されない点において有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られ、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256: 495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）により作成してもよい。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリから、例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marksら, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いて単離してもよい。

ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望のお生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ枠残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるＣＤＲ又は枠配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jonesら, Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmannら, Nature 332: 323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. struct. Biol. 2: 593 -596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたPRIMATIZED(商品名)抗体を含む。

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ)内で軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。

「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。

「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。検出可能な標識を提供しうる放射性ヌクレオチドは、例えば、Ｉ-１３１、Ｉ-１２３、Ｉ-１２５、Ｙ-９０、Ｒｅ-１８８、Ｒｅ-１８６、Ａｔ-２１１、Ｃｕ-６７、Ｂｉ-２１２、及びＰｄ-１０９を含む。
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の粒子の不連続な固体相も含む。

「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ＡＤＡＭ８ポリペプチド又はそれらに対する抗体、場合によっては化学治療薬）の送達に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。
ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。

ＩＩ. 本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＡＤＡＭ８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＡＤＡＭ８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本明細書では、ここに開示される核酸配列によりコードされるタンパク質並びに前述のＡＤＡＭ８の定義に含まれる更なる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製方法に関わらず、「ＡＤＡＭ８」と呼ばれる。

Ｂ．ＡＤＡＭ８変異体
ここに記載した全長天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドに加えて、ＡＤＡＭ８変異体も調製できると考えられる。ＡＤＡＭ８変異体は、ＡＤＡＭ８ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＡＤＡＭ８ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＡＤＡＭ８の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。

天然全長配列ＡＤＡＭ８又はここに記載したＡＤＡＭ８の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＡＤＡＭ８と比較してＡＤＡＭ８のアミノ酸配列が変化するＡＤＡＭ８をコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＡＤＡＭ８の１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。

ＡＤＡＭ８ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＡＤＡＭ８断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＡＤＡＭ８断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＡＤＡＭ８ポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＡＤＡＭ８ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。

表３
元の残基例示的置換好ましい置換
Ala(A) val; Leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys(C) ser ser
Gln(Q) asn asn
Gln(E) asp asp
Gly(G) pro; ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン leu
Leu(L) ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン leu

ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＥＡＣＨ変異体ＤＮＡを作成することもできる。

また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &amp; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。

Ｃ．ＡＤＡＭ８の修飾
ＡＤＡＭ８の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＡＤＡＭ８の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＡＤＡＭ８を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＡＤＡＭ８抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &amp;amp; Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。

本発明の範囲内に含まれるＡＤＡＭ８ポリペプチドの共有結合的修飾のその他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＡＤＡＭ８に見られる一つ又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＡＤＡＭ８に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＡＤＡＭ８ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＡＤＡＭ８（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＡＤＡＭ８アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。

ＡＤＡＭ８ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＡＤＡＭ８ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＡＤＡＭ８の共有結合的修飾のその他の型は、ＡＤＡＭ８ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＡＤＡＭ８は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＡＤＡＭ８を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。

一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＡＤＡＭ８ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＡＤＡＭ８のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＡＤＡＭ８のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＡＤＡＭ８を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。

それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＡＤＡＭ８ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。

Ｄ．ＡＤＡＭ８の調製
以下の説明は、主として、ＡＤＡＭ８核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＡＤＡＭ８を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＡＤＡＭ８を調製することができると考えられる。例えば、ＡＤＡＭ８配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)を参照のこと］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＡＤＡＭ８の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＡＤＡＭ８を生産してもよい。

ａ．ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡは、ＡＤＡＭ８ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＡＤＡＭ８ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＡＤＡＭ８-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＡＤＡＭ８ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。

下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。

ｂ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＡＤＡＭ８生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。

原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＰＯ_４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。

ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｒｔ３ｐｈｏＡＥ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＡＤＡＭ８コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。

グリコシル化ＡＤＡＭ８の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。

ｃ．複製可能なベクターの選択及び使用
ＡＤＡＭ８をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。

ＡＤＡＭ８は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＡＤＡＭ８-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。

発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えば桿菌（バシリ）に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＡＤＡＭ８-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub らにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahngら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。

酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。

哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＡＤＡＭ８転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＡＤＡＭ８コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。

また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＡＤＡＭ８をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＡＤＡＭ８の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。

ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡＤＡＭ８ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。

ｅ．ポリペプチドの精製
ＡＤＡＭ８の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＡＤＡＭ８の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＡＤＡＭ８を組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＡＤＡＭ８のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。例えば、選ばれる精製過程は、用いられる生産方法及び生産される特定のＡＤＡＭ８の性質によって決まる。

Ｅ．ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする遺伝子の腫瘍組織及び細胞系での増幅
この発明は或る種の癌細胞で増幅される遺伝子の同定及び特徴付けに基づいている。
原核生物及び真核生物ゲノムに２つの見掛け上は矛盾する要件を課した。一方は、遺伝情報としてのＤＮＡのその最初の形態での保存及び繁殖であり、複数の世代を通して安定な遺伝を確保する。他方では、細胞又は生物が最近の環境変化を採用しなければならない。適応メカニズムは遺伝子物質の質的又は量的改変を含みうる。質的改変は、コード化配列が変化して構造的又は機能的に異なるタンパク質を生ずるＤＮＡ変異を含む。遺伝子増幅は量的改変であり、それにより実際の完全なコード化配列、即ち遺伝子の数が増加し、転写に利用できるテンプレート数の増加、翻訳可能な転写物の数の増加、及び最終的には増幅された遺伝子にコードされるタンパク質の量の増加をもたらす。

遺伝子増幅の現象及びそこにあるメカニズムは、幾つかの原核及び真核生物細胞培養系でインビトロ実験されている。遺伝子増幅の最も特徴づけられた例は、種々の濃度の細胞毒性薬メトトレキセート（ＭＴＸ）を含有する培地での真核生物細胞の培養を含む。ＭＴＸは葉酸類似物であり酵素デヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）のブロックによりＤＮＡ合成を妨害する。低濃度のＭＴＸに最初に暴露すると殆どの細胞（＞９９．９％）が死亡する。少量の細胞は生き残り、多量のＤＨＦＲ-ＲＮＡ及びタンパク質を生産することによりＭＴＸ濃度を増加させても成長できる。この過剰生産の基礎は単一のＤＨＦＲ遺伝子の増幅である。遺伝子のさらなるコピーは、小さく過剰な染色体（二重微小）の形態で染色体外コピーとして、又は一体化染色体コピーとして見られる。

遺伝子増幅は、細胞毒性薬（最近に対する抗生物質及び真核生物に対する化学治療薬）への耐性の進行及び腫瘍形成性形質転換において最も普通に起こる。自発的事象としての又はウイルス又は化学／環境侵襲による真核生物の形質転換は典型的にその細胞の遺伝物質における変化を伴う。ヒト悪性腫瘍で観察される最も通常の遺伝的変化はｐ５３タンパク質の突然変異である。ｐ５３は、定常（Ｇ１）から複製（Ｓ）期への細胞の転移を制御し、ＤＮＡ損傷の存在下でこの転移を防止する。言い換えれば、ｐ５３変異不全の主な結果の一つは、ＤＮＡ損傷の蓄積及び成長、即ち遺伝的変化である。腫瘍形成細胞における遺伝的変化の通常の型は、点変異に加えて、増幅及び全体、構造的改変、例えば転位置である。

ＤＮＡ配列の増幅は、ＤＨＦＲ実験系で例示したように特定の機能的要件を示す。従って、悪性におけるある種のオンコジーンの増幅は悪性形質転換及び形質転換フェノタイプの維持のプロセスにおけるこれらの遺伝子の原因となる役割を示す。この仮説が最近の研究で支持されている。例えば、ｂｃｌ-２タンパク質はある型の非ホジキンリンパ腫において増幅されることが見いだされた。このタンパク質はアポトーシスを阻害して腫瘍形成細胞の蓄積を進行させる。増殖因子レセプターの遺伝子ファミリのメンバーが種々の型の癌で増幅されることが見いだされ、これらのレセプターの過剰発現が、腫瘍細胞の制限された量の利用可能な増殖因子に対する感受性を低下させる。例としては、アンドロゲン欠乏治療の間の再発前立腺癌におけるアンドロゲンレセプターの増幅、及び乳癌における増殖因子レセプター相同体ＥＲＢ２の増幅を含む。最近、細胞間シグナル伝達及び細胞周期進行に含まれる遺伝子が悪性形質転換の間に増幅を受けうる。これは、種々の上皮及びリンパ腫瘍形成におけるｂｃｌ-Ｉ及びｒａｓ遺伝子の増幅によって例示される。
これらの初期の研究は、これらの方法が悪性形質転換に重要な遺伝子の同定が可能であるため、腫瘍形成において増幅されたＤＮＡ配列の同定の可能性を例示する。ＥＲＢ２の場合も、形質転換タンパク質が腫瘍治療のための新規で特異的な標的を示すので、治療的立場からの可能性を示す。

増幅されたゲノム配列を示すのに幾つかの異なる技術を使用できる。癌細胞から調製した染色体展開の古典的な細胞発生分析は、転位置、欠失及び変換といった全体構造変化を同定するには十分である。増幅ゲノム領域は、それらが高いコピー数を含むか染色体外物質として存在する場合にのみ可視化される。細胞発生は特定の腫瘍形成を持つ特定の染色体変化の一貫した関係を示すための第１の技術だが、管理可能なＤＮＡ配列の同定及び単離には不十分である。より最近に開発された技術の競合ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）は腫瘍形成におけるゲノム増幅の広範な現象を例示する。腫瘍及び正常ＤＮＡは正常細胞の分裂中期に同時にハイブリッド形成し、腫瘍に高頻度で存在するＤＮＡ配列についての画像分析で全ゲノムをスクリーニングする（WO 93/18,186; Grayら, Radiation Res. 137: 275-289 [1994]）。スクリーニング法として、このタイプの分析は、種々のヒト腫瘍における再発アンプリコン（増幅ＤＮＡの伸展）の多数を明らかにした。ＣＧＨは古典的細胞発生分析よりＤＮＡの増幅伸展の同定において感度が高いが、それは標準的な遺伝子技術によりアンプリコン内のコード化配列の迅速な同定及び単離ができない。

遺伝子増幅の検出に最も感度の良い方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイである。これらのアッセイは極めて少量の腫瘍ＤＮＡを出発材料として用い、精巧で感度が良く、配列決定などの更なる分析に利用できるＤＮＡを提供し、高容量スループット分析に適している。
上記のアッセイは相互に排他的ではなく、腫瘍形成における増幅の同定にしばしば組み合わせて使用される。細胞発生分析及びＣＧＨは増幅領域の全ゲノムの概観のためのスクリーニング法を代表し、ＰＣＲベースのアッセイはコード化配列、即ち増幅領域の遺伝子を最終的に同定するのに最も適している。
本発明により、このような遺伝子は定量的ＰＣＲ（S. Gelminiら, Clin, Chem. 43: 752 [1997]）により、乳、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、精巣、卵巣、子宮など、腫瘍、又は腫瘍株化細胞を含む種々の原発腫瘍からのＤＮＡを健常ドナーからのプールしたＤＮＡと比較することにより同定される。定量的ＰＣＲは、TaqMan（商品名）装置（ABI）を用いて実施された。遺伝子特異的プライマー及び蛍光発生プローブは、ＤＮＡのコード化配列に基づいて設計される。

ヒト肺癌株化細胞は、Ａ５４９(ＳＲＣＣ７６８)、Ｃａｌｕ-１(ＳＲＣＣ７６９)、Ｃａｌｕ-６(ＳＲＣＣ７７０)、Ｈ１５７(ＳＲＣＣ７７１)、Ｈ４４１(ＳＲＣＣ７７２)、Ｈ４６０(ＳＲＣＣ７７３)、Ｈ５２２（ＳＲＣ８３２）、Ｈ８１０（ＳＲＣ８３３）、ＳＫＭＥＳ-１(ＳＲＣＣ７７４)及びＳＷ９００(ＳＲＣＣ７７５)を含み、全てＡＴＣＣから入手可能である。原発ヒト肺腫瘍細胞は通常は腺癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌、非-小細胞癌、小細胞癌、及び気管支肺胞癌から誘導され、例えば、ＳＲＣ７２４（「ＳｑＣＣａ」と略記される扁平上皮癌）（ＬＴ１）、ＳＲＣ７２５(「ＮＳＣＣａ」と略記される非-小細胞癌)(ＬＴ１ａ)、ＳＲＣ７２６(「ＡｄｅｎｏＣａ」と略記される腺癌)(ＬＴ２)、
ＳＲＣ７２７(腺癌)(ＬＴ３)、ＳＲＣ７２８(扁平上皮癌)(ＬＴ４)、ＳＲＣ７２９（腺癌）(ＬＴ６)、ＳＲＣ７３０(腺／扁平上皮細胞癌)(ＬＴ７)、ＳＲＣＣ７３１(腺癌)(ＬＴ９)、ＳＲＣ７３２（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１０)、ＳＲＣ７３３（腺癌)(ＬＴ１１）、ＳＲＣ７３４（腺癌)(ＬＴ１２）、ＳＲＣ７３５（「ＢＡＣ」と略記される気管支肺胞癌）、ＳＲＣ７３６（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１５）、ＳＲＣ７３７（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１６）、ＳＲＣ７３８（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１７）、ＳＲＣ７３９（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１８）、ＳＲＣ７４０（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１９）、ＳＲＣ７４１（「ＬＣＣａ」と略記される肺細胞癌）、ＳＲＣ８１１（腺癌）（ＬＴ２２）を含む。

結腸癌株化細胞は、例えば、ＡＴＣＣ株化細胞ＳＷ４８０(腺癌、ＳＲＣＣ７７６)、ＳＷ６２０(結腸腺癌のリンパ節転移、ＳＲＣ７７７)、Ｃｏｌｏ３２０(癌、ＳＲＣＣ７７８)、Ｃｏｌｏ２０５（癌、ＳＲＣ８２８）、ＨＣＣ２９９８（癌、ＳＲＣ８３０）、ＨＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ７７９）、ＨＭ７(癌、ＳＲＣＣ７８０）、ＫＭ１２（癌、ＳＲＣ８３１）、ＣａＷｉＤｒ(腺癌、ＳＲＣＣ７８１)、ＨＣＴ１５(癌、ＳＲＣＣ８２９)、ＨＣＴ１１６(癌、ＳＲＣＣ７８２)、ＳＫＣＯ１(腺癌、ＳＲＣＣ７８３)、ＳＷ４０３(腺癌、ＳＲＣＣ７８４)、ＬＳ１７４Ｔ(癌、ＳＲＣＣ７８５)、及びＨＭ７（ＡＴＣＣ大腸腺癌株化細胞ＬＳ１７４Ｔの高ムチン産生変異体、、Robert Warren博士, UCSFから得た）を含む。原発大腸腫瘍は、ＣＴ１（ＳＲＣ７５１）、ＣＴ２(ＳＲＣ７４２)、ＣＴ３(ＳＲＣ７４３)、ＣＴ４(ＳＲＣＣ７５２)、ＣＴ６(ＳＲＣ７５４)、ＣＴ７(ＳＲＣ７５５)、ＣＴ８（ＳＲＣ７４４）、ＣＴ９(ＳＲＣ７５６)、ＣＴ１０(ＳＲＣ７４５)、ＣＴ１１(ＳＲＣ７５７)、ＣＴ１２(ＳＲＣ７４６)、ＣＴ１４(ＳＲＣ７４７)、ＣＴ１５(ＳＲＣ７４８)、ＣＴ１６(ＳＲＣ７４９)、ＣＴ１７(ＳＲＣ７５０)、ＣＴ１８(ＳＲＣＣ７５８)と称される大腸腺癌を含む。
ヒト乳癌株化細胞は、例えば、ＨＢＬ１００(ＳＲＣＣ７５９)、ＭＢ４３５ｓ(ＳＲＣＣ７６０)、Ｔ４７Ｄ(ＳＲＣＣ７６１)、ＭＢ４６８(ＳＲＣＣ７６２)、ＭＢ１７５(ＳＲＣＣ７６３)、ＭＢ３６１(ＳＲＣＣ７６４)、ＢＴ２０(ＳＲＣＣ７６５)、ＭＣＦ７(ＳＲＣＣ７６６)、ＳＫＢＲ３（ＳＲＣＣ７６７）を含む。

Ｆ．組織分布
ここでの遺伝子増幅アッセイの結果は、種々のヒト組織でのｍＲＮＡ発現の測定などのさらなる実験により確認できる。
上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、ｍＲＮＡの転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。

あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色及び／又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列ＡＤＡＭ８ポリペプチドに対して、又はここに提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又はＡＤＡＭ８ＤＮＡ配列に融合し特異的抗体エピトープをコードする細胞外配列に対して調製される。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成のプロトコールは以下に提供する。

Ｇ．染色体マッピング
与えられた遺伝子の増幅が機能的に関連する場合は、その遺伝子は、腫瘍生存に重要でない隣接ゲノム領域より多く増幅すべきである。これを試験するために、例えば放射性ハイブリッド分析により、遺伝子を特定染色体にマッピングできる。次いで、増幅レベルを特定した位置及び隣接ゲノム領域において測定する。遺伝子がマッピングされたゲノム領域での選択的又は優先的増幅は、観察された遺伝子増幅が腫瘍成長又は生存を促進する可能性と一致する。染色体マッピングはフレームワーク及びエピセンターマッピングの両方を含む。さらなる詳細は、例えば、Stewartら, Genome Research 7, 422-433 (1997)を参照のこと。

Ｈ．抗体結合実験
遺伝子増幅実験の結果は、腫瘍（癌）細胞上でのＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現を阻害する抗-ＡＤＡＭ８抗体の能力が試験される抗体結合実験によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合実験は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の（腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。

サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。

Ｉ．細胞ベースの腫瘍アッセイ
細胞ベースアッセイ及び腫瘍（例えば、癌）の動物モデルを用いて、遺伝子増幅アッセイに発見を確認し、ここでの遺伝子増幅と腫瘍形成細胞成長の進行及び病理との関係をさらに理解することができる。ここで同定する遺伝子産物の腫瘍又は癌の進行及び病理における役割は、ここで遺伝子を増幅すると同定された原発腫瘍細胞又は株化細胞を用いて試験することができる。このような細胞は、例えば、上記した乳、大腸及び肺癌細胞及び株化細胞を含む。

異なる方法では、特定の腫瘍に含まれることが知られた細胞型の細胞をここのｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの過剰成長誘発能力を分析する。適当な細胞は、例えば、Ｂ１０４-1-１（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定なＮＩＨ-３Ｔ３細胞液）及びｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞等の安定な腫瘍株化細胞を含み、これらは所望の遺伝子で形質移入し、そして腫瘍形成的成長を監視できる。このような形質移入株化細胞は、次いで、形質転換細胞の成長に対する細胞分裂停止又は細胞毒性活性の発揮により、又は抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の媒介により、ポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の腫瘍形成細胞成長を阻害する能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、癌治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、（下記のような）トランスジェニック動物の腫瘍から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている（Smallら, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照）。

Ｊ．動物モデル
腫瘍の進行及び原因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例えば大腸組織に移植された結腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより作成される。（1997年9月18日に発行されたＰＣＴ公報WO 97/33551参照。）

癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。ハイポ／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異種移植の宿主として行動するという観察は、この目的のための広い用途を導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、I／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲIII及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子系統に導入された。さらに、遺伝的な免疫不全を持つヌードマウス以外の広範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さらなる詳細については、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 及び B. Winograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照のこと。
これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌株化細胞、例えば上記列挙した腫瘍株化細胞、及び、例えばＢ１０４-１-１株化細胞（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３株化細胞）；ｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞：Ｃａｃｏ-２（ＡＴＣＣＨＴＢ−３７）、中程度に良く分化したグレードIIヒト大腸腺癌株化細胞、ＨＴ-２９（ＡＴＣＣＨＴＢ−３８）から、あるいは腫瘍及び癌から誘導することができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Karmaliら, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983]）。

腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動物に、種々の手法によって導入できる。マウスの皮下（s.c.）空間は、腫瘍移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー(trochar)を用いてニードル生検として、細胞懸濁物としてs.c.移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植のために、適切な大きさの腫瘍組織断片がs.c.空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は安定な腫瘍株化細胞から新たに調製され、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下植え込みとして注射することもできる。この位置において、種菌が皮膚結合組織の下層とs.c.組織との間に析出される。Boven及びWinograd (1991), 上掲。
乳癌の動物モデルは、例えば、神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子が最初に単離される）、又はｎｅｕ形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより、基本的にはDrebinら, PNAS USA 83, 9129-9133 (1986)に記載されているように生成される。

同様に、結腸癌の動物モデルは、結腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wangら, Cancer Research 54, 4726-4728 (1994)及びTooら, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に記載されている。このモデルは、いわゆるAntiCancer, Inc. (SanDiego, California)から市販の「METAMOUSE」に基づく。
動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビトロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。このような継代技術は、周知の腫瘍又は癌株化細胞で実施することができる。

例えば、ＭｅｔｈＡ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ-１６４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に導入され（DeLeoら, J. Exp. Med. 146, 720 [1977]）、それは、種々の抗原の抗-腫瘍活性の研究のための高度に制御可能なモデル系を提供する（Palladinoら, J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987]）。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に注射する前に、株化細胞は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０^６から１０ｘ１０^７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。
さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療における有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断片又は培地に残った細胞の注射に際して正常マウスに導入でき（Zupiら, Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980]）、証拠は、腫瘍がたった一つの細胞の注射から開始され、感染した腫瘍細胞の極めて高い集団が生存することを示している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986]を参照のこと。

移植された腫瘍の動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確である。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延としてより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利用可能である。しかし、腫瘍に続く壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期に腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、形態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。

組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Thompsonら, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitranoら, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Laskoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される。

あるいは、動物の胚性細胞に導入されたＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、そのポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここに同定するＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特にＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas 及び Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Liら, Cell,69:915 (1992)を参照のこと］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。

自発的な動物腫瘍の治療におけるここに同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の有効性も試験できる。このような研究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは高度に侵襲的な悪性腫瘍で、ネコに最も通常の口腔悪性腫瘍であり、この種に報告される口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、この転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているにすぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコの口腔の解剖学的形状による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない。研究に入る前に、各々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療がこの腫瘍を殺した後でも、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを長期に渡って繰り返し治療する。腫瘍の写真を治療期間中の毎日及び引き続く再チェックの時点で撮影した。治療の後、各ねこに再度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン及びラジオグラフは、その後８週間ごとに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上又は生存期間の延長を必要とする。
さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらのイヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの型の腫瘍の発生比率によって制限される。

Ｋ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチドと結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。小分子とは、抗体合成有機又は無機化合物を含むと考え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定される核酸にコードされるポリペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な時間接触させることで共通している。

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。

候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のＡＤＡＭ８ポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、その相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者ら［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。

ここで同定されるＰＲＯのコード化配列と他の細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる：通常は、増幅された遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で２つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視する。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。

Ｌ．腫瘍治療のための組成物及び方法
ここで同定した遺伝子の増幅を伴う腫瘍の治療に有用な組成物は、限定されないが、抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、標的遺伝子産物の発現又は活性を阻害するものである。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。

Ｍ．抗体
本発明で最も有望な候補薬剤の幾つかは、ここで同定される増幅遺伝子の生成又は遺伝子産物を阻害する及び／又は遺伝子産物の活性を低下させる抗体及び抗体断片である。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。

２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＡＤＡＭ８抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には断片を含むＡＤＡＭ８ポリペプチド、又はそのタンパク質又はその断片の融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。

好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所（Salk Institute）Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＡＤＡＭ８に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。

所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。

また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。

抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。

３．ヒト及びヒト化抗体
抗-ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。

非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。

また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。

４．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照のこと)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えばWO88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。

限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒトリソザイム、ヒトグルコロニダーゼ、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２及びカルボキシペプチダーゼＡ）及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照のこと)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。

この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗-ＡＤＡＭ８抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えば、Neubergerら, Nature 312:604-608[1984]を参照のこと)。

５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＡＤＡＭ８に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。

所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。

二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')_２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。

組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成する別のメカニズムを提供した。フラグメントは、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してなる。従って、一つのフラグメントのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他のフラグメントの相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。

二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら，J. Immunol. 147:60(1991)。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるタンパク質上の２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ポリペプチドアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のタンパク質発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、特定のポリペプチドを発現する細胞に対する局所的細胞毒性薬として使用してもよい。これらの抗体は、ポリペプチド結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、ポリペプチドに結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。

６．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。

７．エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caronら, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。

８．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。小分子毒素は、例えばカリケアマイシン（calicheamicins）（US 5,053,394）、マイタンシノイド(maytansinoids)（US 5,208,020）、パリトキシン（palytoxin）及びＣＣ１０６５を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅを含む。

抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026を参照のこと。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。

９．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)を参照のこと。

１０．製薬組成物
ここで同定される増幅遺伝子の産物に特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、癌を含む腫瘍の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
増幅された遺伝子にコードされるタンパク質が細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が通常は好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる（例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]を参照のこと）。

抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。

本発明のスクリーニングアッセイで同定された非-抗体化合物は、同様の方式で、この分野で知られた標準技術を用いて製剤される。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的仮性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は増殖阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系&lt;BR（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。

徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。

１１．治療方法
本発明の抗体及び他の抗腫瘍化合物は、ここで同定される増幅遺伝子の過剰発現及び／又は活性化を特徴とするものを含む種々の状態の治療に用いてもよいと考えられる。このような抗体及び、これらに限られないが有機及び無機小分子、ペプチド、アンチセンス分子等を含む他の化合物で治療される状態又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓(renal)、肝臓、腎臓(kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、大腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、甲状、肝臓の癌；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部の腫瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症、脈管形成及び免疫学的な疾患が含まれる。
本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。

他の治療的養生法を抗癌剤、例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。本発明の抗体は、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。

また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。ときどきは、患者にサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗癌剤は、増殖阻害剤と同時投与される。例えば、まず増殖阻害剤を投与し、続いて本発明の抗癌剤を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。増殖阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、増殖阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
疾患の防止又は治療のための、ここでの抗腫瘍剤の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。薬剤は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。

例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
さらに、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する薬剤は、種々の炎症疾患を診断又は治療することに用いることができる。急性及び慢性炎症の双方の惹起、悪化、又は進行中の症状には、多様な個体群の白血球、例えば単球の組織傷害を引き起こす組織内外への輸送及び遊走が含まれる。ＡＤＡＭ８を阻害して白血球による遊走、輸送及び組織破壊の阻害は、炎症プロセスを和らげる。乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患、関節炎、多発性硬化症及び慢性閉塞性肺疾患等の疾患が、ＡＤＡＭ８の阻害剤で治療できる疾患の例である。

このような疾患の更なる例としては、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）と関連した反応包含する炎症性皮膚疾患；成人呼吸窮迫症候群；髄膜炎、脳炎；ブドウ膜炎；湿疹及び喘息のようなアレルギー症状；Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症反応を包含する症状；皮膚超過敏反応（ツタウルシ及び有毒オークを包含する）；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全；リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、糖尿病、レーノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、sjorgen's 症候群、若年型糖尿病、並びに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に典型的に見出されるＴ−リンパ球及びサイトカインによって媒介される遅延型過敏症と関連している免疫応答などの自己免疫疾患；悪性貧血；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気管支炎；膵島炎；鼻炎；じんま疹；糸球体腎炎；白血球血管外遊出を含有する疾患；ＣＮＳ炎症疾患；敗血症又は外傷の次の多臓器傷害症候群；自己免疫(病名)溶血性貧血；mythemia gravis；疾患によって媒介される抗原抗体複合体；ネフローゼ症候群；悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病又はヘアリー細胞白血病のようなＢ細胞悪性腫瘍）；移植片対宿主又は宿主対移植片病を包含するすべての種類の移植；ＨＩＶ及びライノウイルス伝染；肺線維症；腫瘍細胞の二次器官などへの浸潤などのようなＴ細胞炎症反応を含む。
これらの疾患は、抗癌条件の利用のために上記にて議論した製剤、投与経路、服用量及び投薬形式を利用して治療することができる。

１２．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は通常、ここで同定される遺伝子産物の活性を妨害することのできる抗腫瘍剤、例えば抗体である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

１３．腫瘍の診断及び予知
或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れた標的であるが、同じタンパク質は腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに腫瘍の診断及び予知に用途が見出される。例えば、腫瘍細胞で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は腫瘍診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、増幅された遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば増殖因子をコードする場合に特に好ましい。このような結合アッセイは、上記５節に実質的に記載されたように実施される。

マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。

（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ユニヴァーシティー・ビルディング、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９である。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 1990; Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coliganら, Current Protocols in Immunology, 1991。

実施例１：遺伝子増幅
この実施例は、ＡＤＡＭ８ｍＲＮＡが或る種の乳、肺、結腸癌の細胞において高レベルで存在していることを示す。ｍＲＮＡのレベルの増加は、細胞表層で発現されるＡＤＡＭ８タンパク質の量を示す。大腸、乳、肺及び他の癌等の或る種の癌において過剰発現されているタンパク質は、治療的処置の有用な標的である。治療薬はＡＤＡＭ８ポリペプチドのアンタゴニストの形態をとることができ、例えばＡＤＡＭ８−ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体がある。
スクリーニングの出発物質は、種々の癌の薄切りの凍結切片から単離した全ＲＮＡである。全ＲＮＡは蛍光的に定量される。比較手段として、ＲＮＡは、また、各腫瘍の近くから取り出された正常な健全組織から単離された。腫瘍細胞に対して正常細胞のｍＲＮＡレベルの違いを見出すために、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ABI Prizm 7700 Seqence Detection System TM, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA）を使用した。その結果は、ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡが、スクリーニングされた任意の原発肺、大腸又は乳癌において過剰反応しているか否かを決定するために用いられる。
ＴａｑｍａｎＴＭ分析の結果は、デルタ（Δ）Ｃｔ単位で報告される。１単位は正常に対して約２倍増加の１ＰＣＲサイクルに相当し、２単位は４倍、３単位は８倍増幅等々に相当する。定量化は、プライマー及びＡＤＡＭ８コード化遺伝子から誘導したＴａｑｍａｎＴＭ蛍光プローブを用いて得た。最もスプライシングされたイントロンを持たないと思われており、独特の核酸配列を含むと思われ領域は、プライマー及びプローブ誘導に好ましく、例えば３-非翻訳領域がある。二組のプライマー／プローブ組み合わせをＴａｑｍａｎＴＭ分析に用いた。ＡＤＡＭ８ｍＲＮＡ分析に用られたプライマー及びプローブの配列は次の通りであった：

セット１−３’−非翻訳領域の一部分を増幅するプライマー／プローブの一組
前方向プライマー
８−２５７０Ｆ（２２ｍｅｒ）GCTCAGCCCTAGACCCTGACTT（配列番号：３）
プローブ
８−２５９４Ｔ（３２ｍｅｒ）CAGGCTCAGCTGCTGTTCTAACCTCAGTAATG
（配列番号：４）
逆方向プライマー
８−２６５５Ｒ（１８ｍｅｒ）CGTGGACAGCAGGAGCCT（配列番号：５）
セット２−コード化配列の一部分を増幅するプライマー／プローブの一組
前方向プライマー
ＡＤＡＭ８．３−１７９７Ｆ（１９ｍｅｒ）TTGCTGGAAAGGACGTTGC（配列番号：６）
プローブ
ＡＤＡＭ８．３−１８１７Ｔ（３２ｍｅｒ）
AGGACTTACACGTTTACAGATCCAGCAACTGC（配列番号：７）
逆方向プライマー
ＡＤＡＭ８．３−１８８１Ｒ（１９ｍｅｒ）GTTGCACACCCCATGGTTG
（配列番号：８）

５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲベースの技術であり、リアルタイムでの増幅監視のためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応に典型的な単位複製配列の生成に２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置する核酸配列を検出するために設計された。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。２つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によりテンプレート依存的方式で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第２のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子について標識され、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96-ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは光ファイバーケーブルで９６ウェルに集められ、ＣＣＤで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ又は境界サイクルで表現される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。癌ＤＮＡの結果と正常ヒトＤＮＡの結果を比較する際に、Ｃｔ値を核酸試料における特定の標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として使用した。

ＲＮＡの調製及び定量化
ＲＮＡを、凍結した一対のヒト腫瘍及び正常組織の薄切り切片から調製した。その単離は、製造者の指示書及び下記に示す説明に従って、バッファー、カラム、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙｍｉｎｉキットの他の試薬を包含する精製キットを用いておこなわれた。
ＲＮＡの単離を始める前に、１０μｌのベーターメルカプトエタノールを各１ｍｌＲＬＴバッファーへ添加した。クリオスタットを用いて、組織単位より１から４の各腫瘍及び正常組織の１０又は２０μ−切片を切り出した。これらの切片を、直ちに、ベーターメルカプトエタノールが添加されている３５０又は６００μｌバッファーＲＬＴを含有する１．５ｍｌマイクロ遠心管チューブへ置いた。ＶｅｒＴｉｓ携帯型ホモジナイザーを１．５ｍｌマイクロ遠心管チューブに適合するのに十分に小さなジェネレイターとともに用いて、この組織切片をおよそ３０分に渡ってホモジュナイズした。ジェネレイターを、無菌Ｈ_２Ｏで約１０秒、０．１％ＳＤＳで約１０秒、そして再び無菌Ｈ_２Ｏで約１０秒間作動させることで洗浄した。これは、最初の組織試料を処理する前に行われ、そして各組織試料の処理の間に再実行された。ホモジュナイズされた試料を含有する１．５ｍｌマイクロ遠心管チューブを、微量遠心管によって最高スピードで３分間に渡って回転した。その上澄みを、新鮮なマイクロ遠心管へ移した。次に、各試料は、２２ｇａ針の付いた３ｃｃ注射器で２０回汲み出され、そして排出された。この付加的段階の目的は、ホモジナイゼーション及びマイクロ遠心管による回転の後に試料に存在するであろうすべてのゲノムＤＮＡを剪断することである。次に、１容量（通常は３５０又は６００μｌの何れか）の７０％エタノールを各試料へ添加し、ピペット操作で混合した。７００μｌの試料を、２ｍｌ収集管に置いたＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｓｐｉｎカラムへ負荷した。このカラムを、１５秒間に渡って少なくとも８０００ｘｇで遠心分離した。試料の容量が７００μｌを越えた場合は、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉカラムへ連続的にその一定分量を負荷し、上記のように再び遠心分離した。各遠心回転の後、フロースルーを廃棄した。これと同じカラムを７００μｌのバッファーＲＷ１で負荷し、１５秒間に渡って少なくとも８０００ｘｇで遠心分離してカラムを洗浄した。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉカラムを新しい２−ｍｌ収集管へ移し、５００μｌのバッファーＲＰＥを負荷して１５秒間に渡って少なくとも８０００ｘｇで遠心分離してカラムを洗浄した。そのフロースルーを廃棄し、収集管は再使用された。カラムを５００μｌのバッファーＲＰＥで負荷し、２分間に渡って最高速度で遠心分離してＲＮｅａｓｙ膜を乾燥させた。ＲＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍｌ収集管へ移し、カラム膜へ直接に展開した３０−５０μｌのＲＮａｓｅを除いた水で負荷した。カラムを１分間に渡って少なくとも８０００ｘｇで遠心分離し、ＲＮＡを溶出した。
ＲＮＡは、溶出試料をＨ_２Ｏで１：２０又は１：２５で希釈して標準Ａ２６０、Ａ２８０分光光度法によって定量化した。希釈試料を０．１ｍｌ石英キュベットへ置き、Beckman DU640分光光度計で計測した。

遺伝子増幅アッセイ
ヒト乳、肺及び大腸腫瘍から調製され、腫瘍近辺から採取された正常組織切片と比較された全ＲＮＡ試料中のＡＤＡＭ８ｍＲＮＡを増幅するために、ＡＤＡＭ８プライマー／プローブセットをTaqman分析に使用した。全ＲＮＡをＨ_２Ｏで２．５ｎｇ／μｌへ希釈した。試料は二重又は三重に試験され、プレートに包含されたのはＧＡＰＤＨ及び／又はｂ−アクチン Taqmqn TM プライマー及びプローブで、テンプレートコントロールは無く、逆転写酵素コントロールは無い。反応は、以下の通りであった：
１０μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ_２（Perkin Elmer reagent）
５μｌ１０ＸバッファーＡ（Perkin Elmer reagent）
６μｌ１０ｍＭｄＮＴＰｓ（Perkin Elmer reagent）
０．５μｌ前方向プライマー（１ＯＤ／１００μｌ）
０．５μｌ逆方向プライマー（１ＯＤ／１００μｌ）
２．５μｌプローブ（２μＭ）
１μｌＲＮａｓｅインヒビター２０単位／μｌ（Perkin Elmer reagent）
０．２５μｌＭｕＬＶ逆転写酵素５０単位／μｌ（Perkin Elmer reagent）
０．５μｌ TaqGold Taq Polymerase ５単位／μｌ（Perkin Elmer reagent）
１３．７５μｌＨ_２Ｏ
１０μｌ全ＲＮＡ２．５ｎｇ／μｌ

反応は、９６ウェルプレート（MicroAmp Optical reaction plates, N801-0560, Perkin Elmer）で調製された。プレートを Perkin Elmer Sequence Detection System 7700に置き、以下の温度と時間で装置をプログラムした：
４８℃ ３０分（ｍＲＮＡの逆転写）
９５℃ １０分（TaqGoldの活性化）
以下（特定のｍＲＮＡの増幅）の４０サイクル：
９５℃ １５秒
６０℃ １分
データ分析をSequence Detection System ソフトウェアでおこない、計算をExcelでおこない、そして腫瘍と正常の間の相違をデルタ（Δ）Ｃｔで報告した。
結果
正常組織に対してＡＤＡＭ８ｍＲＮＡの増加
乳腫瘍：５Ｘ
乳腫瘍：１６００Ｘ
肺腫瘍：４．６Ｘ
大腸腫瘍：３．４Ｘ
大腸腫瘍辺緑：２．２Ｘ

実験の他に、定量化を最初に分光光度法によっておこなった。ＲＮＡ試料をTaqman（商品名）実験で展開し、次に希釈ＲＮＡ試料を、製造者の指示に従ってRiboGreen RNA 定量化キット（Molecular Probes R-11490）を用いることで再び定量化した。蛍光プレートリーダー（SepctroMax Gemini, Molecular Devices）で読み取った。分光光学的示度を用いて、試料を２．５ｎｇ／μｌへ希釈した。Taqman（商品名）実験を展開した後、蛍光定量化法によって測定されたＲＮＡ濃度のどのような相違に対してもＣｔ値を調整した。
さらに、より正確なデータは、その他の遺伝子へ規準化することなしに得られた。これら更なる方法を用いて、上記にて報告された大腸腫瘍試料を再び展開し、幾つかの他の試料を下記に示す。

正常組織に対して増加したＡＤＡＭ８ｍＲＮＡ：

大腸腫瘍：１０Ｘ（再展開）
大腸腫瘍辺縁：６．８Ｘ（再展開）
大腸腫瘍７．４Ｘ
大腸腫瘍：３．５Ｘ
乳腫瘍：４．８Ｘ

実施例２：遺伝子増幅
この実施例は、ＡＤＡＭ８コード化遺伝子が、或る種のヒト肺、大腸及び／又は乳癌及び／又は株化細胞のゲノムにおいて増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ポリペプチドが大腸、肺、乳、及び他の癌等のある種の癌における治療的処置のための有用な標的であることを示している。このような治療薬は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドのアンタゴニスト、例えば、ＡＤＡＭ８ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
スクリーニングの出発材料は、種々の癌より単離したゲノムＤＮＡであった。ＤＮＡは、例えば蛍光的に，正確に定量された。負のコントロールとして、１０人の正常で健康な個体からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ用コントロールとして用いた（示されていない）。或る種の癌で潜在的に増幅されている遺伝子を見出すために、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば，TaqMan（商品名））及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（商品名）（ Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA））を用いた。この結果は、スクリーニングされた任意の原発肺又は大腸癌或いは癌株化細胞又は乳癌株化細胞において、ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡが過剰表示されているか否かを決定するために用いられた。原発肺癌は、表２に示されている型及び段階の腫瘍を有する個人より得られた。原発腫瘍の命名に用いられる略記の説明は、表２に収掲され、この実施例を通して言及されている原発腫瘍及び株化細胞は、上文に提供されている。

Taqman（商品名）の結果は、デルタ（Δ）ＣＴ単位で報告されている。１単位は、１ＰＣＲサイクル又は平常に対して約２倍増幅に相当し、２単位は４倍に相当し、３単位は８倍増幅に相当する等々である。定量化は、ＡＤＡＭ８コード化遺伝子から誘導したプライマー及びTaqman（商品名）蛍光プローブを用いて得た。独特な核酸配列を含む可能性が最も高く、イントロンのスプライスアウトを持つ可能性が最も低いＡＤＡＭ８の領域、例えば、３’−非翻訳領域がプライマー及びプローブ誘導に好ましい。ＡＤＡＭ８遺伝子増幅に用いたプライマー及びプローブの配列（前方向、逆方向及びプローブ）は次の通りである：
前方向プライマー
８−２５７０Ｆ（２２ｍｅｒ）GCTCAGCCCTAGACCCTGACTT （配列番号：３）
プローブ
８−２５９４Ｔ（３２ｍｅｒ）CAGGCTCAGCTGCTGTTCTAACCTCAGTAATG
（配列番号：４）
逆方向プライマー
８−２６５５Ｒ（１８ｍｅｒ）CGTGGACAGCAGGAGCCT（配列番号：５）

５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、蛍光ＰＣＲ−ベース技術であり、リアルタイムにおける増幅の監視にＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応の典型的な単位複製配列を作製するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に局在化したヌクレオチド配列の検出に用いた。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素で延長不可能であり、リポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。リポーター染料からの任意のレーザー励起放出は、それらがプローブ上にあるように２つの染料が接近している場合には消光染料で消光される。増幅反応の間、プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素でテンプレート依存的に切断される。得られたプローブ断片は、溶液中で分解し、リポーター染料放出からのシグナルは第２のフルオロフォアの消光効果を受けない。リポーター染料の１分子が、合成された新たな分子のために遊離され、消光されないリポーター染料がデータの定量的解釈の基礎とされる。

５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prizm 7700TM Sequence Detection のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で行われる。系は、温度サイクル器、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、及びコンピュータからなる。系は、温度サイクル器において９６ウェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザー励起された蛍光シグナルが、９６ウェル全てについての光ファイバーケーブルを通して実時間で回収され、ＣＣＤカメラで検出される。系は、器具を作動させデータを分析するソフトウェアを備えている。
５’ヌクレオチドアッセイデータは、最初にＣｔ又は閾値サイクルとして表現される。これは、リポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルより上まで蓄積されるサイクルとして定義される。Ｃｔ値は、癌ＤＮＡの結果を正常ヒトＤＮＡの結果と比較する場合に、核酸試料における特定標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として用いられる。
表４は、本発明のＡＤＡＭ８化合物をスクリーニングするために利用した種々の原発腫瘍の段階、Ｔ段階及びＮ段階を記載している。
原発肺癌は、表４に示された腫瘍の型及び段階にある個人より得られた。原発腫瘍の命名に用いられる略記の説明は、表４に収掲され、この実施例を通して言及されている原発腫瘍及び株化細胞は、上文に提供されている。

ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは培養した細胞系、原発腫瘍、正常ヒト血液から調製した。その単離は、全てQuiagenの精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。

細胞培養溶解：
細胞を洗浄し、チップ当たり７．５ｘ１０^８の濃度でトリプシン化し、４℃で５分間１０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化し、次いで１／２容量のＰＢＳ再遠心で洗浄した。ペレットを３回洗浄し、懸濁細胞を回収して２ｘＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を10mLのＰＢＳに懸濁させた。バッファーＣ１を４℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ＃１９１５５を６．２５mlの冷ｄｄＨ_２Ｏで最終濃度20mg/mlまで希釈して４℃で平衡化させた。１０ｍＬのＧ２バッファーを、QuiagenＲＮＡｓｅＡストック（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーＣ１（１０ｍＬ、４℃）及びｄｄＨ_２Ｏ（４０mL、４℃）を、次いで１０ｍｌの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで４℃において２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら２ｍｌのバッファーＣ１（４℃）及び６ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに懸濁し、４℃において２５００ｒｐｍで１５分間２回目の遠心分離をした。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり２００μlを用いて再懸濁した。Ｇ２バッファー（１０ml）を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ（２００μl、上記のように調製）を添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘｇでペレット化する）。

固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解：
腫瘍試料を秤量し５０mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり２５０mgの組織未満に制限した（１チップ／調製）。プロテアーゼ溶液を６．２５mlの冷ｄｄＨ_２Ｏ中に最終濃度２０ｍｇ／ｍlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを最終濃度２００ｍｇ／ｍｌまで希釈することによりＧ２バッファー（２０ｍｌ）を調製した（１００ｍｇ／ｍｌのストックから）。エアロゾルの吸入を避けるために層流ＴＣフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を１９mlのＧ２バッファー中で６０秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々２LのｄｄＨ_２Ｏで２ｘ３０秒間、次いでＧ２バッファー（５０ml）でスピンさせることによりポリトロンを清浄化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ（上記のように調製、１．０ml）を添加し、次いでボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘgでペレット化する）。

ヒト血液調製及び溶解：
健常なボランティアから標準的な感染薬プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり１０ｍｌの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを６．２５mlの冷ｄｄＨ_２Ｏ中に最終濃度２０ｍｇ／ｍｌまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを１００ｍｇ／ｍｌのストックから最終濃度２００ｍｇ／ｍｌまで希釈することによりＧ２バッファー（２０ｍｌ）を調製した。血液（１０ｍｌ）を５０ｍｌのコニカル管に配し、１０ｍｌのＣ１バッファー及び３０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ（ともに４℃で平衡化したもの）を添加し、反転させて混合して氷上に１０分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、４℃において２５００ｒｐｍで１５分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を２ｍｌのＣ１バッファー（４℃）及び６ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ（４℃）中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に２００μlチップを用いて懸濁させた。Ｇ２バッファー（１０ml）を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで３０秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加（２００μl）し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘgでペレット化する）。

透明化溶解物の精製：
（１）ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを１０ｍｌのＱＢＴバッファーで平衡化した（最大チップ調製当たり１試料）。ＱＦ溶離バッファーを５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを２ｘ１５ｍｌのＱＣバッファーで洗浄した。ＤＮＡを、３０ｍｌのシラン化したオートクレーブ３０ｍｌCortex管に１５ｍｌのＱＦバッファー（５０℃）で溶離した。イソプロパノール（１０．５ｍｌ）を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、ＳＳ-３４ロータで４℃において１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、１０ｍｌの７０％エタノール（４℃）を添加した。試料を、ＳＳ-３４ロータで４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚の各面に置き、３７℃で１０分間乾燥させたが、使用の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを１．０ｍｌのＴＥ（ｐＨ８．５）に溶解し、５０℃に１−２時間置いた。試料を４℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでＤＮＡ溶液を、ツベルクリンシリンジ上に２６ゲージの針を具備する１．５ｍｌ管に移した。ＤＮＡを剪断するために移行を５ｘ繰り返した。次いで試料を５０℃に１−２時間置いた。

（２）ゲノムＤＮＡの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製：
各管のＤＮＡレベルを１：２０希釈（５μlＤＮＡ＋９５μlｄｄＨ_２Ｏ）での標準的なＡ２６０、Ａ２８０分光光学により、Beckman ＤＵ６４０分光光度計の０．１ｍｌ石英キュベットを用いて定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は１．８−１．９の範囲であった。次いで各ＤＮＡ試料をＴＥ（pH８．５）中に約２００ｎｇ／ｍｌまで希釈した。最初の材料が高濃度（約７００ｎｇ／μｌ）である場合、材料を５０℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料（２０−６００ｎｇ／ｍｌ）に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光ＤＮＡ定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant ２００蛍光計を約１５分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液（＃Ｈ３３２５８、１０μl、使用の１２時間以内に調製）を１００ｍｌの1xＴＮＥバッファーに希釈した。２ｍｌキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)（２μl、ロット＃３６０８５１０２６）を２ｍｌの蛍光計溶液に添加して２００単位で校正した。次いで、さらに２μlのｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)ＤＮＡを試験し、４００＋／−１０単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも３回読んだ。３試料が互いに１０％以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。

次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をｄｄＨ_２Ｏ中に１０ｎｇ／μｌまで希釈するのに用いた。これは、１回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、５００−１０００アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、Taqman(商品名)プライマー及びプローブで３回試験し、Ｂ-アクチン及びＧＡＰＤＨともに正常なヒトＤＮＡを持ちテンプレート対照を持たない単一のプレート上にある。希釈した試料を用いたが、試験ＤＮＡから減算した正常ヒトＤＮＡのＣＴ値は+/-１ＣＴであった。希釈した、ロット定性化したゲノムＤＮＡを、１．０ｍｌアリコートで−８０℃において保存した。続いて遺伝し増幅アッセイに使用するアリコートは、４℃で保存した。各１ｍｌのアリコートは、８−９プレート又は６４試験に十分である。

遺伝子増幅アッセイ：
下記の原発腫瘍においてＡＤＡＭ８遺伝子をスクリーニングし、その結果であるＣｔ値を表５において報告する。

ＡＤＡＭ８：
種々のヒト腫瘍のＣｔ値を表５に報告する。Ｃｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍ＬＴ１１、ＬＴ１３、ＬＴ１５、ＬＴ１７、及びＬＴ１８で生じたＡＤＡＭ８の有意な増幅を示す。これら原発肺腫瘍の平均Ｃｔ値は、１．１２、１．４３、１．６８、１．５９及び１．０７であり、遺伝子コピーにおいて正常組織に対しては、各々約２．１７、２．６９、３．２、３．０１及び２．１倍の増加を表す。また、ＡＤＡＭ８の有意な増幅が、原発大腸腫瘍ＣＴ１、ＣＴ２、ＣＴ４、ＣＴ５、ＣＴ６、ＣＴ１０、ＣＴ１１、及びＣＴ１２で生じたことを表５は示す。これら原発腫瘍の平均Ｃｔ値は、１．５、１．３８、１．７５、２．３２、１．１４、１．３２、２．７６及び１．２であり、遺伝子コピーにおいて正常組織に対しては、各々約２．８３、２．６、３．３６、４．９９、２．２、２．５、６．７７及び２．３倍の増加を表す。種々の腫瘍においてＡＤＡＭ８の増幅が起こるために、ＡＤＡＭ８は腫瘍の形成及び／又は成長に関連しているものと思われる。結果としては、ＡＤＡＭ８に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療において有用である。

実施例３：ＡＤＡＭ８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
全脾臓ＲＮＡをClonetech（#64034-1）より購入した。ｃＤＮＡ合成のための試薬をGibcoBRL（Superscript TM Preamplification System # 18089-011）より購入した。製造者の指示書に従い、ＲＮＡをオリゴｄＴプライムｃＤＮＡの合成に使用した。ＡＤＡＭ８ｍＲＮＡの５’末端からの約８８０ｂｐＤＮＡ断片を作製するために、このｃＤＮＡ（５μｇ）をＡＤＡＭ８特異的プライマーとともにＰＣＲ反応で使用した。使用される特異的プライマーは、以下の通りである：
ｈ８−９ＦＢＡＭ前方向プライマー（２９ｍｅｒ）
ATGTGGATCCATGCGCGGCCTCGGGCTCT（配列番号：９）
ｈ８−９１３Ｒ逆方向プライマー（２１ｍｅｒ）
CCACAGTAGTCCCGGTGAAGT（配列番号：１０）

下記のＰＣＲ反応を組み立てた：
６６．４３μｌＨ_２Ｏ
１０μｌ１０ＸＰＣＲバッファー（Perkin Elmer）
６μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ_２（Perkin Elmer）
８μｌｄＮＴＰＭｉｘ（Perkin Elmer）
４μｌＤＭＳＯ
０．５μｌＴａｑＧｏｌｄ（Perkin Elmer）
１．７３μｌｈ８−９ＦＢＡＭ前方向プライマー１ＯＤ／１００ｍｌ
１．３４μｌｈ８−９１３Ｒ逆方向プライマー１ＯＤ／１００ｍｌ
２μｌｃＤＮＡ（上記を参照のこと）
１００μｌ総量

以下のプロトコールに従ってＡＤＡＭ８断片を増幅するために、Ericomp TM TwinBlock サーモサイクラーを使用した：
初期ｔａｑポリメラーゼ活性化：
９５℃１０分間

３５サイクル：
９５℃１５秒
５３℃３０秒
７０℃２分

最終伸張
７２℃ ２０分

このＰＣＲ増幅断片をConcert TM PCR精製キット（Gibco BRL）で洗浄し、製造者指示書に従って制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ（New England Biolabs）で消化して、１％アガロースゲル（ＦＭＣコーポレーション）上で８８０ｂｐ断片を単離した。ＢａｍＨＩ部位を前方向ＰＣＲプライマーにおいて作製したが、ＳａｌＩ部位はＡＤＡＭ８ｃＤＮＡ配列において生じた。生じた断片は、Concert TM Gel精製キット（Gibco BRLコーポレーション）を使用して洗浄した。この断片を、ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏと呼ばれる発現ベクターへライゲーション（New England Biolabsリガーゼ）し、さらにマルチプルクローニング部位のＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位を消化して上記と同じ方法によって精製した。形質転換は、製造者指示書に従い、Stratagene Supercompetent XL1 Blueを用いておこなった。生じたコロニーは、終夜に渡る５ｍｌ培養で生育させ、Qiagen miniprepキットでＤＮＡの少量調製物を作製した。クローンを確かなものにするために、公開されている配列に基づく種々の制限消化をおこなった。１つのクローンを、大規模なＤＮＡ調製のために、Concert TM DNA preparation system（Gibco BRL）を使用して選択した。

全長ＡＤＡＭ８ｃＤＮＡのクローニング
全長ＡＤＡＭ８クローンを全ＵＣＬＡＰ３株化細胞ＲＮＡから得た。ＲＮＡを培養で生育させたＵＣＬＡＰ３細胞株から得、ペレット化し、ＰＢＳで洗浄して再び市販のキットを使用してペレット化してＤＮａｓｅ（Qiagen RNeasyキット）で処理した。特に、ＲＴ−ＰＣＲキット（GibcoBRL Thermoscript RT-PCR System 11146-016）及びＡＤＡＭ８ｍＲＮＡに対して特異的なオリゴヌクレオチドを使用してプライムｃＤＮＡを作製した。
ｈ８−３１０９Ｒと呼ばれる，使用されたプライマーの配列：
５’AGCTGACTCTCCCACATAGCCC３’（配列番号：１１）
ｃＤＮＡは、製造者指示書に従い、約５μｇの全ＲＮＡ及び逆転写酵素のインキュベーション温度である６０℃によって作製した。ＰＣＲ反応を、最終濃度が２ｍＭのＭｇＳＯ_４を使用し、Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 酵素（Gibco BRL）でおこなった。逆方向プライマーは、ｃＤＮＡ反応及び前方向プライマーに関して上記に収掲されているものと同じであり、ｈ８−９Ｆｂａｍと呼ばれ，次の配列を有する：
５’ATGTGGACCCATGCGCGGCCTCGGGCTCT３’（配列番号：９）
ＰＣＲ増幅サイクルパラメーターは、次の通りであった：初期変性段階として９５℃を２分間；９５℃を３０秒；５５℃を３０秒；６８℃、３分間を４０サイクル；回収するまで反応を保持するために４℃に浸す。期待されるＰＣＲバンドの大きさは、約３１００ｂｐで、これはゲル電気泳動によって確かめられた。

ＰＣＲ反応物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII制限酵素で消化し，その結果生じた混合物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。約３１００ｂｐのバンドをゲルから抽出し、同じようにＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化したプラスミドベクターへライゲーションした。この結果生じたクローンの配列が決定され、公開されているＡＤＡＭ８の配列に対して幾つかの配列の違いが含まれていることが見出された。これらのクローンは、ＡＤＡＭ８変異体を表している可能性がある。これらのうちの二つが、アミノ酸第１７１のＡｒｇからＧｌｙ、及びアミノ酸第２２３のＬｙｓからＡｒｇのアミノ酸変化を生じていた。これら配列は、標準的な分子生物学的手法を用いて、３４６ｂｐのＳａｎＤＩ／ＳａｌＩ断片を消化して除き、これをＡＤＡＭ８クローンの５’末端の８８０ｂｐからの類似の断片で置き換えることで、これらの位置が公開されていた配列を含むものに戻った。全長クローン及び８８０ｂｐの５’末端クローンの双方に他の二つの相違が見出された：１）公開されている配列のように、ヌクレオチド番号２４９（GenBank 配列ではＤ２６５７９として測定された）は、ＴよりもむしろＣであってアミノ酸６４でＧｌｙをコードすることが見出された、そして２）ヌクレオチド番号３２７は、ＡよりもむしろＣで、アミノ酸位置９０でＬｅｕよりもＰｈｅをコードすることが見出された。さらには、全長クローンのみでは、ヌクレオチド番号１２６３はＴよりもむしろＣであって、公開されている配列のようにアミノ酸位置４０２でＡｒｇをコードすることが見出された。また、全長クローンにおいて、配列ＡＧＡに代わって開始コドンＡＴＧが見出された。配列の決定は、市販で入手可能な蛍光標識ヌクレオチド（Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, PE Applied Biosystems）を利用するキットによっておこなわれた。

実施例４：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定ｍＲＮＡ合成の追跡変化及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成^３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。［^３３-Ｐ］ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。

^３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の^３３Ｐ−ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥^３３Ｐ−ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ；１０ｍＭのＧＴＰ，ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌのＨ_２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲｎａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ_２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，Ｔ７＝Ｓ，通常）

管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ IIで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡＭｒｋIIIを３μｌの負荷バッファーに添加した。３７℃の加熱ブロック上で３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。

^３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、ＳＱＨ_２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回すすいだ。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）で脱タンパクした。スライブを続く０．５ｘＳＳＣでリンスし、段階的なエタノール及び空気乾燥によって脱水した。
プレハイブリダイゼーション
スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μlのハイブリダイゼーションバッファー（１０％デキストラン硫酸、５０％ホルムアルデヒド、１ｘＳＳＣ）で被覆し、４２℃で１−４時間インキュベートした。
ハイブリッダイゼーション
スライド当たり１．０ｘ１０^６ｃｐｍのプローブ及び１．０μlのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μlの^３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μlに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
洗浄
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５ＭＥＤＴＡ、Ｖ_ｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖ_ｆ＝４Ｌ）。

下記は、インサイツハイブリダイゼーションのプローブとして利用するｐＲＫ５ｔｋｎｅｏベクター内に含有されている、ＡＤＡＭ８配列の一部を増幅するために使用されるプライマーである。
上段（Ｔ７プロモーター＋ＡＤＡＭ８）：
GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGACTCAGCCGCCAGCCTCAGC
（配列番号：１２）
下段（Ｔ３プロモーター＋ＡＤＡＭ８）：
CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCCGCCGTGTCCGTTGC （配列番号：１３）

製造者指示書に従い、Clonetech（8417-1）のAdvantage cDNA polymerase mix を使用してプローブを増幅した。サイクルの条件は、以下の通りである：
１０サイクルの：
９４℃で３０秒
６８℃で３０秒
７２℃で１分

１５サイクルの：
９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で１分

続いて：
７２℃で７分
４℃を維持

組織のＡＤＡＭ８
ＡＤＡＭ８は、肺扁平上皮癌の悪性上皮、肺腺癌、大腸癌腫、前立腺癌腫、乳癌腫及び炎症組織等に見出された。悪性細胞で発現があり、ある腫瘍は、腫瘍の極めて近くの間質に存在していた。種々の正常組織で、ある程度の弱いむらのある発現があった。
正常組織：
１．正常大腸（ｎ＝２）：固有層及び粘膜リンパ系濾胞でのむらがあって弱い発現から低レベル発現。
２．胎児ヒト皮膚、表皮：弱いポジティブの発現。
３．胎児ヒト胸腺：胸腺(解剖)髄質での低レベルの拡散性発現。

正常ヒト組織マイクロアレイ（Ｈ２０００−２（１４−１））：
副腎皮質（Ｈ９７−６２１及びＨ９９−３４６）：副腎上皮質上皮細胞でのポジティブ発現（Clinomic arrayでは、正常副腎皮質は負から弱いネガティブ）
肺（Ｈ９７−６２１）：ネガティブ
胎盤（Ｈ９７−６２１）：絨毛膜でポジティブ発現。
小脳（Ｈ９７−６１９）：ネガティブ
大脳皮質（Ｈ９７−６１９）：ネガティブ
脳幹（Ｈ９７−６２１）：ネガティブ
眼（ＨＰ０００９７１及び９７２）：ネガティブ
大腸粘膜（Ｐ９６００３１３Ａ及びＨ９７−６２１及びＨ９７−２５４）：ネガティブ
肝臓、肝細胞（Ｈ９７−６２１）：ネガティブ
腎皮質（Ｈ９７−６２１）：ネガティブ
卵巣（ＨＰ００１２１６）：間質での低レベルから弱いポジティブ発現。
前立腺（Ｈ９７−６２１）：ネガティブ
リンパ節（Ｈ９７−６２１及びＨＰ００１３７３）：弱いポジティブ発現：
脾臓（Ｈ９７−６２１及びＨＰ−００１２４９）：赤脾髄でのポジティブ発現；拡散（評価のために、白脾髄は切片には存在しない。
扁桃腺（Ｈ９９−３４６及びＨＰ００１３６６）：弱い発現
皮膚、真皮（Ｈ９７−５２８）：ネガティブ
乳、管（Ｈ９７−５２８）：ネガティブ

成人多組織区分（ＫＨ９７−０６６）、ＫＨ９７−０４、ｍｉｓｃ０２）
１．脾臓の赤脾髄における低レベル拡散発現
２．準急性化膿性気管支炎の肺：大気道の患部における化膿性浸潤の好中球での低レベルな特異的発現
３．膵臓：銀目の凝集体のランダムパターン。
４．ネガティブであった組織は、前立腺、肝臓、膵臓、正常肺（２切片）、胎盤、胆管及び腎臓を包含する。

新生物：
肺扁平上皮細胞ＣＡ（ｎ＝１７）腫瘍
１．ネガティブ。
２．ネガティブ。
３．悪性腫瘍の数領域に近接する反応性の線維性結合組織のむらのある領域での弱いポジティブ発現
４．悪性腫瘍の数領域に近接する反応性の線維性結合組織のむらのある領域での弱いポジティブ発現、及び悪性腫瘍のある領域での弱いポジティブ発現。
５．悪性腫瘍細胞（９４／１５５２４Ｅ１）でのむらのある弱い発現。
６．高いバックグラウンド及び明確で一貫したシグナルが存在しない；低いバックグラウンドの領域ではシグナルが無く、バックグラウンドのある領域では、拡散する低シグナル（５５５２／９６）。
７．新生物細胞及び近傍の間質に発現がある；すべての領域に発現発現があるのではない；この腫瘍には、ＳＣＣ及びアデノ成物の両方を有すると思われる（５１５６Ａ１）。
８．ネガティブ（２２７２Ａ２）。
９．ＳＣＣ又はこの試料の成分では、有意な発現がない。
１０．ＳＣＣは、大気道に存在する。扁平上皮癌に焦点を合わせた弱から＋１の発現；反応性増殖及び二次卵胞形成をともなう皮質の領域性（臍）リンパ節での＋２拡散発現（２６４１Ａ４）。
大気道患部の粘膜下組織での混合リンパ節顆粒球炎症浸潤物での＋１。
１１．ＳＣＣ又はこの試料の成分では、有意な発現がない（４７２７Ａ４／９８）
１２．扁平上皮癌には、壊死及び繊維増殖、そし近接する非腫瘍肺の領域を有する；結うな発現はない（９８／１４９６４）。
１３．この扁平上皮細胞／アデノ扁平上皮癌及び近傍の非腫瘍肺は、有意な発現を有しない（９８／８９４６）。
１４．腫瘍には、ポジティブでむらのある低レベル発現がある。化膿性炎症である１つの気管支では、非腫瘍の正常／過形成性粘膜上皮でむらのある発現がる（１１０４６）。
１５．有意な発現がない（７９１５／９８）。
１６．有意な発現がない（９８／１５７１５）。
１７．有意な発現がない（９８／９２１０）。

肺腺癌（ＡｄＣＡ；ｎ＝１７）
１．悪性上皮での低レベル拡散発現（２４８４Ａ／９８）
２．悪性上皮での弱から低レベル拡散発現（９６／７４６８１）
３．悪性上皮及び近傍の線維性間質での弱から低レベルのむらのある発現（１９１Ｄ２）
４．悪性上皮での中程度の拡散発現（９４／１５８５１Ｂ）
５．ネガティブ（９５／５５９０）
６．悪性上皮での低レベルのむらのある発現（２９４３Ａ３／９８）
７．ネガティブ（５２６Ａ４）
８．悪性上皮でのポジティブ低レベル発現（９５／１０３０２１Ｂ）
９．この腺癌の腫瘍上皮では、ポジティブで有意な発現がある。正常な気管支での発現のレベルを評価するために十分な正常な肺が切片にはない。センスプローブはネガティブである（Ｈ９７−６１８．１Ｂ）。
１０．有意な発現はない（３２８４Ａ４／９８）。
１１．幾つかの腫瘍上皮細胞集団には、むらがあり中程度の発現があるが、腫瘍細胞は大部分がネガティブである。また、腫瘍の近傍の繊維増殖の幾つかの領域では、むらがある中程度の発現がある。腫瘍及び領域性リンパ濾胞（ＭＡＬＴ）に近接して存在する炎症の領域（好中球減少、リンパ組織球性）は、ネガティブである（８０１４／９８）。
１２．有意なポジティブだが、この腺癌の腫瘍性上皮ではむらのある発現。発現は、正常肺上皮には存在せず、腫瘍の線維性間質では最小である；発現は、殆ど腫瘍性上皮に限られている。ＩＳＨで検出されるような発現をすべての腫瘍が有してはいない（１４３６６）。
１３．リンパ節、腺癌は転移する。これは、領域性リンパ節で存在する転移である；腫瘍又はリンパ節のどちらも有意な発現を有しない（１０５０９）。
１４．この腺癌の腫瘍性上皮では、有意（中程度から強いレベル）な発現がある。発現は正常上皮には存在せず、腫瘍の線維性間質では最小である；発現は殆ど腫瘍性上皮に限られている（９５／２５２７）。
１５．腫瘍性細胞には、一貫した発現はない；壊死及び分解を有する少数の病巣において、むらのある低レベルの発現が存在する。線維芽細胞のfobroplasiaの幾つかの領域において中程度の発現があり、大気道を支える軟骨に存在する軟骨細胞において中程度の発現がある。軟骨のＩＳＨシグナルは、時折、人為的（硝子質マトリックスへのプローブの非特異的固着）である可能性がある。；しかしながら、ここでは、発現は細胞体及び個々の軟骨細胞の核へ負担をかけ過ぎる（９８／１０７２０）。
１６．有意なポジティブ（中程度）だが、この腺癌の腫瘍性上皮ではむらのある発現。発現は、正常肺上皮には存在せず、腫瘍の線維性間質では最小である；発現は、殆ど腫瘍性上皮に限られている（１０７２）。
１７．有意な発現はない（９８／１５０２９）。

肺腫瘍多区分：Ｈ１９９９−６３７１：９パンチ切片
１．ＨＰ００１２１７：癌腫：腫瘍細胞において強いポジティブ発現。
２．ＨＰ００１２６１：癌腫：腫瘍細胞において中程度のポジティブ発現；幾つかの線維性間質組織において低レベル発現。
３．ＨＰ００１２６３：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞において中程度のポジティブ発現。
４．ＨＰ００１２１８：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞において中程度のポジティブ発現：気管支上皮において発現なし。
５．ＨＰ００１２３３：拡散低レベル発現；正常気管支上皮において発現（低い）。
６．Ｈ９７−６１８．２Ｄ：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞において中程度のポジティブ発現。
７．Ｈ９７−６１８．１Ｄ：拡散低レベル発現。
８．Ｈ９７−６１８．１Ｃ：癌腫：腫瘍細胞において中程度の発現。
９．ＨＰ００１２９７：正常：肺胞及び気管支粘膜において拡散で弱い発現。

非小細胞肺癌腫．ＳＣＣ：８試料のうち２つがポジティブ発現を有していた；腺癌及び大細胞癌腫：１７試料のうち１１が発現していた。
１．不十分に分化した腺癌：ネガティブ
２．混合腺扁平上皮癌の弱い発現
３．腺癌：弱い発現
４．不十分に分化した扁平上皮癌：ネガティブ
５．大細胞未分化：ポジティブ低発現
６．腺癌：ポジティブ低発現
７．腺癌：ポジティブ低発現
８．類表皮癌：ポジティブ低発現
９．腺癌：弱い発現
１０．扁平上皮癌：弱い発現
１１．腺癌：弱い発現
１２．扁平上皮癌：ネガティブ
１３．腺癌：ポジティブ低発現
１４．扁平上皮癌：ポジティブ低発現
１５．腺癌：ポジティブ発現
１６．腺癌：ポジティブ発現
１７．気管支肺胞癌腫：ポジティブ発現
１８．腺癌：ポジティブ発現
１９．腺癌：ポジティブ発現
２０．腺癌：弱い発現
２１．腺癌：ポジティブ発現
２２．扁平上皮癌：ネガティブ
２３．扁平上皮癌：ネガティブ
２４．扁平上皮癌：ネガティブ
２５．腺癌：ポジティブ
２６．扁平上皮癌：ポジティブ低発現
２７．腺癌：ポジティブ

小細胞肺癌腫（８試料のうち４つが発現を有していた）
１．扁平上皮癌：ネガティブ
２．小細胞癌腫：ネガティブ
３．小細胞癌腫（炎症）：ポジティブ低発現
４．小細胞癌腫：ネガティブ
５．扁平上皮癌（炎症）：ポジティブ低発現
６．小細胞癌腫：弱い発現
７．扁平上皮癌：ポジティブ低発現
８．扁平上皮癌：ポジティブ低発現

インサイツの肺癌腫
１．弱い発現
２．弱い発現
３．弱い発現
４．弱い発現
５．弱い発現

転移性肺腫瘍
１．大細胞癌腫：弱い発現
２．扁平上皮癌：弱い発現
３．扁平上皮癌：弱い発現
４．腺癌：弱い発現
５．腺癌：ポジティブ低発現
６．扁平上皮癌：ネガティブ
７．扁平上皮癌：弱い発現
８．腺癌：ポジティブ低発現
９．腺癌：弱い発現
１０．腺癌：ポジティブ低発現
１１．腺癌：ポジティブ低発現
１２．腺癌：ポジティブ低発現

好酸球気管支炎の肺（喘息）（ｎ＝２）
１．ＨＰ００１１９１１ＡＩＦ９８４：慢性好酸球炎症（喘息）をともなう気管支炎：この切片は、ＢＡＬＴ及び２門部リンパ節と関連している大気道を含む。；気道には、粘膜下組織に重い好酸球炎症がある。好酸球においては＋１から＋２の発現、リンパ節の皮質及び粘膜下組織のＢＡＬＴ内では＋１から＋２の発現がある。
２．ＨＰ００１１９２１ＣＩＦ９８４：喘息、好酸球気管支炎の肺。浸潤している好酸球及びＢＡＬＴのリンパ様凝集体、そして動脈周囲のリンパ球性炎症の部分には、特定の発現がある。

大腸癌腫（ｎ＝１０）
１．ネガティブ（９７２９／９８Ｆ）
２．ネガティブ（７５６０／９８Ｆ）
３．ネガティブ（７３８０／９１）
４．ネガティブ（９４９０／９８Ｈ）
５．ネガティブ（７４７０／９８Ｃ）
６．ネガティブ（７６９８／９８９）
７．ネガティブ（７１５１／９８）
８．ネガティブ（７３０６／９８Ｃ３）
９．悪性腫瘍に近接する炎症している間質での、むらのある弱いポジティブ；腫瘍性細胞には発現がない（９１５３／９８Ｃ）。
１０．悪性上皮細胞での低レベルポジティブな発現（６５６１／９１）

大腸腫瘍の多区分Ｎ９９９−６３６１（３パンチ切片）
１．ＨＰ００１２７７：ＡｄＣＡ：腫瘍性大腸粘膜細胞には、特定の中程度の発現がある；正常大腸粘膜のかなり弱い発現と同程度かそれ以下。しかしながら、白血球の固有層、特に球形の白血球／好酸球及び幾つかのリンパ球及び繊維芽細胞において中程度の明白な発現がある。
２．ＨＰ００１２３２：ＡｄＣＡ：発現は、殆ど固有層内の白血球；少数の腫瘍性粘膜細胞が発現する。
３．ＨＰ００１２２３：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞には、発現がない；白血球の固有層及び繊維芽細胞にむらのある発現が存在する．
４．ＨＰ００１２０９：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞及び固有層での低発現。
５．ＨＰ００１２１０：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞での，むらのある低レベルから中程度の発現。
６．ＨＰ００１２４３：ＡｄＣＡ：腫瘍細胞での低発現。

乳癌腫（ｎ＝１１）
１．悪性上皮でのポジティブな低レベル拡散発現（ＩＦ９７−０１５３７１Ｅ；Ｈ９７−５２８）
２．悪性腫瘍の侵入端に即近傍の間質におけるポジティブな低レベル発現；固体小結節／索状組織の腫瘍性細胞には発現がない（ＩＦ９６−２８３０３１Ｂ、Ｈ９７−５２８）。
３．ネガティブ（ＩＦ９７−１２８５５１Ｃ、Ｈ９７−５２８）。
４．乳腺では、低レベルの特異的発現がる；腺は、多重層上皮対して単一；周辺組織は、密度の高いコラーゲン（２３４０／９８）。
５．この腺癌の固体小結節／索状組織では，特異的発現がある（４２０２Ａ２）。
６．覆い被さっている皮膚上皮性被覆組織には、発現がある（拡散）。炎症性腫瘍間質及び或る腫瘍病巣の或る腫瘍性細胞には、発現があった。後者は、低レベルで、腫瘍を通して一貫性はなかった（５１５６Ａ１）。
７．この腺癌の腫瘍細胞には、特異的発現がる。また、悪性病巣の近傍の炎症性間質の或る領域には、発現がある。比較上、存在する正常な腺は、全くないか、まれに発現がある（１３３２７／９７）。
８．乳小葉癌。発現がない（５１５９Ｂ１Ｈ）。
９．乳腺管癌。腫瘍性細胞での低レベルの拡散発現；少数の部分において、腫瘍の即近傍の間質成分（線維芽細胞）は、低レベルの発現を有した（８８Ａ）。
１０．乳腺癌。発現がない（銀目の多巣性小凝集体がランダムパターンで存在；人為産物と解釈された）（９１８３／９７）。
１１．乳腺癌。発現がない（３８８５Ｂ１）。

炎症性組織マイクロアレイＨ２０００−２９（４）Clinomics Microarrat）
リウマチ様関節炎滑膜：
放射状茎状突起：滑膜でのポジティブ発現
膝：副滑膜血管（subsynovial vessel）でのポジティブな発現；試料には、評価する滑膜がない。
膝：滑膜でのポジティブな発現
全身性エリテマトーデスでの腎生検
１．炎症部分の間質での弱いポジティブな発現
正常な腎臓
１．尿細管上皮での弱いポジティブな発現
２．ネガティブ
３．尿細管上皮での弱いポジティブな発現
甲状腺炎
橋本甲状腺炎：ネガティブ
慢性リンパ性甲状腺炎：ネガティブ
慢性リンパ性甲状腺炎：炎症部分で弱いポジティブな発現
慢性リンパ性甲状腺炎：ポジティブ
橋本甲状腺炎：炎症部分で弱いポジティブな発現
橋本甲状腺炎：ネガティブ
病巣自己免疫甲状腺炎：ネガティブ
橋本甲状腺炎：ネガティブ
甲状腺好酸性細胞化生を伴う慢性甲状腺炎

正常な甲状腺
１．上皮で弱いポジティブな発現
２．ネガティブ（ｎ＝３）
正常膵臓
１．ネガティブ（ｎ＝４）
乾癬
１．乾癬表皮でのポジティブな発現（ｎ＝４）
慢性皮膚炎
１．皮膚糸状菌症をともなう苔癬状慢性皮膚炎：真皮でのポジティブで低レベル発現
２．非定型リンパ性皮膚炎、菌状息肉腫：感染真皮でのポジティブで中程度の発現
正常皮膚
１．表皮でのポジティブで低レベルの発現（ｎ＝２）
喘息：肺
喘息をともなう線維性肺胞炎：感染肺胞間質での弱い発現（ｎ＝３）
喘息をともなう無気肺：ネガティブ（ｎ＝３）
喘息：ネガティブ（ｎ＝２）

慢性閉塞性肺疾患
外因性アレルギー性肺胞炎、ＣＯＰＤ：感染肺胞間質での弱い発現
ＣＯＰＤ及びうっ血：感染肺胞間質での弱い発現
急性及び慢性うっ血及びＣＯＰＤ：ネガティブ
ＣＯＰＤ：炎症性間質での弱い発現
急性及び慢性胸膜炎、ＣＯＰＤ：感染肺胞間質での弱い発現
ＣＯＰＤ：炎症性線維性組織でのポジティブで中程度の発現
ＣＯＰＤ、胸膜炎及び膿胸：炎症性線維性組織でのポジティブで中程度の発現
細菌肺炎
１．病巣リポイド肺炎：恐らく肺胞の炎症性間質でのポジティブで低発現
２．閉塞性肺炎及びＣＯＰＤ：恐らく肺胞の炎症性間質でのポジティブで中程度の発現
３．肺炎、形成：ネガティブ
４．リンパ系凝集体をともなう気管支肺炎：恐らく肺胞の炎症性間質でのポジティブで低発現
５．急性気管支肺炎：炎症性間質でのポジティブで低発現
６．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）での嚥下性肺炎：炎症性間質でのポジティブで中程度の発現
正常肺
ネガティブ（ｎ＝８）

結核
慢性間質性炎症：炎症性間質でポジティブで中程度の発現（ｎ＝２）
扁桃腺
１．９５−８９５０：発現はなし。
２．Ｈ１９９９−６６３８−３１３７２：扁桃腺陰窩上皮細胞での＋１から＋２の発現（上皮細胞及び又は浸潤単核細胞）；扁桃腺の副皮質領域及び周辺帯の単核細胞で拡散的に、ほぼ樹状突起細胞のような胚中心の分散した細胞での＋１の発現。覆っている口腔粘膜上皮において，低レベル（０から＋１）発現がある。
３．Ｈ１９９９−６６３６−３１３７０：扁桃腺陰窩上皮細胞での＋２の発現（上皮細胞及び又は浸潤単核細胞）；ほぼ樹状突起細胞のような胚中心の分散した細胞での＋１の発現、扁桃腺の副皮質領域及び周辺帯の単核細胞で拡散的に＋１の発現。覆っている口腔粘膜上皮において，低レベル（０から＋１）発現がある。
４．Ｈ１９９９−６６３７−３１３７１：扁桃腺陰窩上皮細胞での＋２の発現（上皮細胞及びある浸潤単核細胞）；ほぼ樹状突起細胞のような胚中心の分散した細胞での＋１の発現、扁桃腺の副皮質領域及び周辺帯の単核細胞で拡散的に＋１の発現。覆っている口腔粘膜上皮において，低レベル（０から＋１）発現がある。
５．Ｈ１９９９−６６３５−３１３６９：扁桃腺陰窩上皮細胞での＋２の発現（上皮細胞及びある浸潤単核細胞）；ほぼ樹状突起細胞のような胚中心の分散した細胞での＋１の発現、扁桃腺の副皮質領域及び周辺帯の単核細胞で拡散的に＋１の発現。

脾臓
１．Ｈ１９９９−６６３１２−３１３７６：高いバックグラウンドは、発現の評価を妨げる；このバックグラウンドを越える特定の発現はない。
２．Ｈ１９９９−６６３１４−４１３７８：赤脾髄での＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１の発現。
３．Ｈ１９９９−６６３１０−３１３７４：有意なシグナルはない。
４．Ｈ１９９９−６６３１３−４１３７７：有意なシグナルはない。
５．Ｈ１９９９−６６３１８−３１３８２：赤脾髄での＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１から＋２の発現；二次濾胞の濾胞胚中心の＋１の発現。
６．Ｈ１９９９−６６３１１−３１３７５：赤脾髄での＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１の発現；二次濾胞の濾胞胚中心の発現。
７．Ｈ１９９９−６６３１７−３１３８１：赤脾髄での＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１の発現；二次濾胞の濾胞胚中心の＋１の発現。
８．Ｈ１９９９−６６３１９−３１３８３：赤脾髄での弱から＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１の発現；二次濾胞の濾胞胚中心の＋１の発現。
９．Ｈ１９９９−６６３１５−４１３７９：赤脾髄での弱から＋１の拡散発現；動脈周囲のリンパ系鞘（ＰＡＬＳ）の単核細胞及び一次又は二次濾胞の周辺帯での＋１の発現；二次濾胞の濾胞胚中心の＋１の発現。

前立腺腫瘍群（Ｈ２０００−２６（４）；Clinomics）：
正常前立腺
ＣＬ１９９９−１：粘膜が存在しない：ネガティブ
ＣＬ１９９９−２：粘膜が存在しない：ネガティブ
ＣＬ１９９９−３：前立腺粘膜上皮で低いポジティブ発現
ＣＬ１９９９−４：前立腺粘膜上皮で低いポジティブ発現
良性過形成
ＣＬ１９９９−６：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現；基礎を成す線維状間質での弱いポジティブなシグナル。
ＣＬ１９９９−７：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現；基礎を成す線維状間質での弱いポジティブなシグナル。
ＣＬ１９９９−１０：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＰＩＮ：低度
ＣＬ１９９９−１１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−１２：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−１３：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−１４：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−１５：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＰＩＮ：高度
ＣＬ１９９９−１６：ネガティブ
ＣＬ１９９９−１８：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−１９：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２０：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現；基礎を成す線維状間質での弱い発現。

前立腺癌
ＣＬ１９９９−２１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２２：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２３：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２４：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２５：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２６：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２７：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２８：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−２９：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３０：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３２：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３３：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３４：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３５：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３６：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−３７：ネガティブ
ＣＬ１９９９−３８：ネガティブ
ＣＬ１９９９−３９：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−４０：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−４１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−４２：ネガティブ
ＣＬ１９９９−４３：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−４４：ネガティブ
ＣＬ１９９９−４５：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−４６：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−４８：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−４９：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５０：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−５２：ネガティブ
ＣＬ１９９９−５３：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−５４：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５５：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５６：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５７：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５８：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−５９：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−６０：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６２：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６３：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６４：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６５：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６６：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６７：前立腺粘膜上皮で弱い発現
ＣＬ１９９９−６８：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−６９：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７０：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７１：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現

前立腺癌：
ＣＬ１９９９−７３：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７４：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７５：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７６：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７７：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７８：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−７９：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８０：前立腺上皮でポジティブ発現
転移性前立腺癌：
ＣＬ１９９９−８１：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８２：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８３：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８４：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８５：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８６：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８７：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８８：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−８９：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９０：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９１：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９２：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９３：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９４：前立腺上皮でポジティブ発現
ＣＬ１９９９−９５：前立腺上皮でポジティブ発現
前立腺萎縮症：
ＣＬ１９９９−９９：前立腺粘膜上皮でポジティブ発現

胸腺
１．Ｈ９７−０８４０１：胎児胸腺（年齢は特定されていない）の切片；胸腺皮質に限定される特定のシグナルがある。ここのシグナルは細胞のサブセットの範囲内にあり、この領域の胸腺のリンパ球成分に対抗する延髄性胸腺上皮細胞に特異的と思われる。皮質での発現は存在しない（皮質に存在する網状上皮細胞の異なる型に注意する）。
ヒト胎児組織（１４．５週）
１．Ｈ９７−１０６３１：ＥＭＨをともなう肝臓、腸、腹壁、膵臓、肋骨、骨格筋、腎臓を含有する腹部横切片：有意な発現はない。

実施例５：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＡＤＡＭ８の利用
以下の方法は、ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
ここにおいて開示されている全長又は成熟ＡＤＡＭ８ポリペプチドのコード化配列を含有するＤＮＡ及び／又はその断片は、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種ＤＮＡ（ＡＤＡＭ８の天然発生変異体など）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射標識ＡＤＡＭ８誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。

実施例６：大腸菌での「ＡＤＡＭ８」ポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による、ＡＤＡＭ８の非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、最初に選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で設計され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＡＤＡＭ８コード領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。

ライゲーション混合物は、次いで、選択した大腸菌のSambrookら, 上掲に記載された方法を用いた形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択されるプラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離した。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＡＤＡＭ８タンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。

以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態でＡＤＡＭ８を大腸菌で発現させてもよい。ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６gのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００mL水中の５．３６gのShefield hycase SF、並びに１１０mMのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５%（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ_４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及びタンパク質のリフォールディング（再折りたたみま）で凍結させた。

０．５から１Ｌの発酵（６−１０gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Mのグアニジン、２０mMのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００rpmで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５mlのQiagen Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を２５０mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０nmにおけるその吸収により見積もった。

試料を、２０mMのトリス、pH８．６、０．３MのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０mMのグリシン及び１mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２ンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。

所望の再生したＡＤＡＭ８タンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製した。
例えば、ＰＣＲ反応は全長ＡＤＡＭ８を用いて設定され、ＡＤＡＭ８の５’末端クローン由来の３４６ｂｐのＳａｎＤＩからＳａｌＩ断片をテンプレートとして含んだ．この作成物は、実施例３に記載されている。この反応のための前方向プライマー、ＳＴ２３９Ａ８ＴＣＲ（５４ｍｅｒ）は次の通りである：
５’CCGAGCTCGAGCGGCCGCAGTCGATTAGCTCCCGGACGCTGCGTGCACCT３’
（配列番号：１５）

前方向配列は、ＡＤＡＭ８の成熟配列の開始配列が後に続く５’末端へ向かって、ＮｓｉＩ制限部位によって設計され、アミノ酸配列：DSLPSRETR（配列番号：２１）で構成された。逆方向プライマー配列は、ＮｏｔＩ制限部位、終止コドン、及び膜貫通タンパク質の最初にあるＡＤＡＭ８末端の配列が後に続く５’末端の近傍のＳｓｔＩ制限部位によって設計された：TEVHAASGS（配列番号：２２）。それ故に、発現ベクターへ挿入されたＡＤＡＭ８配列は、成熟した細胞外ドメインを構成する。ＰＣＲ反応は、最終的に、Platinum Taq、ＨＦＰＣＲバッファー、及び２ｍＭＭｇＳＯ_４（GibcoBRL）を用いて設定された。反応物は、次のようにインキュベートされた：９５℃を２分間、次に９５℃、３０秒を４０サイクル、５５℃を３０秒、そして３分間の６８℃に続き、反応が回収されるまで４℃で浸す。反応物をConcert rapid PCR 精製カラム（GibcoBRL）を用いて精製し、ＮｓｉＩ及びＳａｃＩで消化した。また、ｐＳＴ２３９と呼ばれるベクターをＮｓｉＩ及びＳａｃＩで消化した。二つの断片をゲル精製及びライゲーションし、配列が確かめられている最終構築物、ｐＳＴ２３９．ＡＤＡＭ８ｍａｔを形成させた。

ベクターｐＳＴ２３９はｐＢＲ３２２から誘導され、ＮｓｉＩ制限部位が存在する３’末端にＮ末端ｐｏｌｙｈｉｓリーダーを含む。このリーダーは、最適翻訳開始、Ｎｉキレート化カラム上での精製、及び所望するならばＴＡＧＺｙｍｅシステム（Unizyme Laboratories, Horsholn Denmark）で効率的な除去を提供する。リーダーのアミノ酸配列は次の通りである：MKHQHQHQHQHQHQMHQ(配列番号：１６）。転写は大腸菌のアルカリホスファターゼプロモーターでコントロールされ（Kikuchi Y. ら, Nucleic Acids Research 9:5671-5678, 1981）、ｔｒｐオペロンリボゾーム結合部位（Yanofsky C.ら, Nucleic Acids Research 9:6647-6668, 1981）は翻訳を提供する。翻訳終結コドンの下流には、珍しいコドンｔＲＮＡ遺伝子ｐｒｏ２、ａｒｇＵ、及びｇｌｙＴ（Komine Y., ら, J.Mol.Biol. 212:579-598, 1990及びFournier M. J.ら, Microbiol. Rev. 49:379-397, 1985）が続くλ_ｔｏ転写ターミネーター（Scholtissek S.ら, Nucleic Acids Research 15:3185, 1987）がある。

プラスミドｐＳＴ２３９．ＡＤＡＭ８ｍａｔを大腸菌株５８Ｆ３（fhuAΔ（tonAΔ)lonΔ galE rpoHts(htpRts) ΔclpP lacIq ΔompTΔ(nmpc-fepE)ΔslyD）へ形質転換した。１つの形質転換体のルリア培地を最初に３０℃で終夜生育させ、次にリン酸制限培地で１００倍に希釈してアルカリホスファターゼプロモーターを誘導した。２４時間後に１０℃で振盪後、培地を遠心分離し、次に精製を開始するまでに細胞ペレットを凍結した。
大腸菌ペースト（６−１０ｇｍペレット）を７ＭグアニジンＨＣｌ、２ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８、バッファーの１０容量（Ｗ／Ｖ）に懸濁した。これに固体硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを添加し、各々の最終濃度を０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、この溶液を４℃で終夜に渡って攪拌した。この溶液を遠心分離によって浄化し、６Ｍグアニジン、ＨＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で平衡化したQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷した。このカラムを５０ｍＭイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含むさらなるバッファーで洗浄した。タンパク質は、２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーで溶出した。この溶出液を、さらに６Ｍグアニジン，２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０を含むバッファー中のPharmacia Ｓ−２００ゲル濾過カラムで精製した。所望するタンパク質を含む分画をプールし、これを２Ｍ尿素、２０ｍＭグリシン、１０ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４に対して透析して、４℃で貯蔵した。

実施例７：哺乳類細胞でのＡＤＡＭ８の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的に非グリコシル化形態のＡＤＡＭ８の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７参照）を用いた。場合によっては、ＡＤＡＭ８ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrookらに記載されたようなライゲーション方法を用いてＡＤＡＭ８ＤＮＡを挿入する。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＡＤＡＭ８と呼ばれる。一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＡＤＡＭ８ＤＮＡを約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ_４を添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養媒質を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで血清無し媒質で洗浄し、新鮮な媒質を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。

トランスフェクションの約２４時間後、培養媒質を除去し、培養媒質（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌの^３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの^３５Ｓ−メチオニンを含む培養媒質で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件媒質を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、Ａｐｏ-３リガンドポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（血清無し媒質）、媒質を選択されたバイオアッセイで試験した。
それに換わる技術において、ＡＤＡＭ８ＤＮＡは、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に過渡的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＡＤＡＭ８ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮してＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養媒質で洗浄し、組織培養媒質、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件媒質を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで、発現されたＡＤＡＭ８を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。

他の実施態様では、ＡＤＡＭ８をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＡＤＡＭ８ベクターを、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ−デキストランといった周知の試薬を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトできる。上述したように、細胞培地をインキュベートし、次いで媒質を培養媒質（のみ）又は^３５Ｓ−メチオニンなどの放射性標識を含む媒質と置換することができる。ＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在を測定した後、培養媒質を血清無し媒質に置換してもよい。好ましくは、培地を約６時間インキュベートし、次いで条件媒質を収集する。次に、発現されたＡＤＡＭ８を含む媒質を、選択された任意の方法によって濃縮し精製することができる。
また、エピトープタグＡＤＡＭ８を宿主ＣＨＯ細胞で発現させてもよい。ＡＤＡＭ８は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングすることができる。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−hisタグのような選択したエピトープタグを持つ枠に融合させることができる。ポリ−hisタグＡＤＡＭ８挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導細胞で（上記のように）トランスフェクトすることができる。標識化は、上記のように、発現を検証するために施される。発現されたポリ−hisタグＡＤＡＭ８を含む培養媒質は、次いで、Ｎｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィ等の選択された方法により濃縮して精製することができる。

ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、各ＤＮＡを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucasらに記載されているように成長させた。約３ｘ１０^−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。

プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを１．２ｘ１０^６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０ｍＬとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。

ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ, ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのNi-NTAカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール，ｐＨ６．８，を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５ Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。

イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー, ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に汲み上げた。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸, ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー, ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列決定した。

例えば、ＰＣＲ反応を全長ＡＤＡＭ８クローンを用いて設定し、ＡＤＡＭ８の５’末端クローン由来の３４６ｂｐのＳａｎＤＩからＳａｌＩ断片をテンプレートとして含んだ。この作成物は、実施例３に記載されている。前方向プライマーであるＰＲＫＡ８Ｒは、次の通りである：
５’GCTGCATGAATTCATGCGCGGCCTCGGGCTCTGGCTGCTGGGC３’ （４３ｍｅｒ）（配列番号：１７）
逆方向プライマーの配列であるＰＲＫＡ８Ｒは、次の通りである：
５’GAGTTTTGTCGGTGACCGACCCGGACGCTGCGTGCACCTCAGTCAG３’
（４６ｍｅｒ）（配列番号：１８）

前方向配列は、ＡＤＡＭ８のシグナル配列の開始配列が後に続く５’末端へ向かって、ＥｃｏＲＩ制限部位によって設計され、アミノ酸配列：MRGLGLWLLG（配列番号：１９）で構成された。逆方向プライマー配列は、膜貫通タンパク質の最初にあるＡＤＡＭ８の末端配列が後に続く５’末端の近傍のＢｓｔＥII制限部位によって設計された：LTEV HAASGS（配列番号：２０）。それ故に、発現ベクターへ挿入されたＡＤＡＭ８配列は、シグナル配列、プロドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン及びＥＧＦドメインを包含する細胞外ドメインを構成する。ＰＣＲ反応は、最終的に、Platinum Taq、ＨＦＰＣＲバッファー、及び２ｍＭＭｇＳＯ_４（GibcoBRL）を用いて設定された。反応物は、次のようにインキュベートされた：９５℃を２分間、次に４０サイクルの９５℃、３０秒、５５℃を３０秒、そして３分間の６８℃に続いて、反応が回収されるまで４℃で浸す。反応物をConcert rapid PCR 精製カラム（GibcoBRL）を用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｔＥIIで消化した。また、細胞外ドメインのライゲーションがヒトＩｇＧ１Ｆｃとの融合となるようにＢｓｔＥII制限部位で設計されたヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含有するｐＲＫ５ベクターを、ＢｓｔＥII及びＥｃｏＲＩで消化した。この二つの断片をゲル精製及びライゲーションし、配列が確かめられている最終構築物、ｐＲＫ．ＡＤＡＭ８Ｉｇを形成させた。

ヒトＩｇＧ１Ｆｃへ融合したヒトＡＤＡＭ８の細胞外ドメインを含有するこのプラスミドを、リン酸カルシウム法（Gorman, C.ら, Science 221, 551-553(1983)）及びネオマイシン耐性を付与する遺伝子を含有する１μｇのプラスミドとともに１０μｇのプラスミドを用いて２９３細胞（Graham, F.L.ら, J. Gen. Virol. 36, 59-74, 1977）へトランスフェクションした。これらの細胞を８００μｇ／ｍｌのジェネテシン（GibcoBRL）で選択し、１ＸＬ−グルタミン酸（GibcoBRL）及び１０％ＦＢＳを補充した５０：５０Ｆ１１２：ＤＭＥＭで生育させた。これらの細胞を，実施例１０に記載したアッセイに用いた。
組み換えタンパク質の生産を、ＤＰ１２−ＤＨＦＲ＋（１９８９年３月１５日に公開のEP 307,247）と命名されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株化細胞を用いておこなった。これらの細胞は、懸濁培養にて早く生育することを可能にするために、安定的にＤＨＦＲ＋プラスミドでトランスフェクションしたジヒドロ葉酸マイナス（dhfr-）DUKX CHO宿主（Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216[1980]）から誘導された。

次の大規模な一過性のトランスフェクション法を用いて、プラスミドｐＡＤＡＭ８．ＩｇＧをこの株化細胞へ導入した：密度が１．５ｘ１０６細胞／ｍｌの１．９５リッターのＤＰ１２−ＤＨＦＲ＋細胞を、選択生育培地（米国特許5,122,469に記載の微量成分を含む改良ＨＡＭＦ１２／ＤＭＥＭ）へ播種した。ＤＭＥＭ及びＨＡＭ１２培地の組成物としては、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 第６版、１９８８、３４６−３４９ページの培養公式を参照のこと。この培地は、２ｍｇ／Ｌインシュリン、１％ウシ胎仔血清（Gibco）、及び０．１５ｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシンで補充した。トランスフェクションをおこなう前に、細胞をこの培地で１から２時間に渡ってインキュベートした。
添加物含まない１．０５リッターの天然培地（改良ＨＡＭＳＦ１２／ＤＭＥＭ、上に同じ）中で、６ｍｇのプラスミドＤＮＡ（Qiagen Gigaprep法で精製）を１２ｍｌのカチオン性脂質薬剤（DMRIE-Cと同等、Life Technologies, Inc.）で混合することによってトランスフェクション複合物を作製した。トランスフェクション複合物を３０−６０分に渡ってインキュベートし、次に細胞と混ぜた。トランスフェクト細胞培養を三つの１Ｌ培養へ分割し、３Ｌの攪拌容器で３７℃にてインキュベートした。

２４時間目に、トランスフェクト細胞培養は、血清を除くために培地を交換し、８分間の１０００ｒｐｍによる遠心分離でトランスフェクション薬剤を除いた。２ｍｇ／Ｌインシュリン、０．１５ｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、３０ｇ／Ｌグルコース及び１２５ｍｌ／Ｌの２０％プリマトーンＰ３（Quest）を補充した生産培地（米国特許5,122,469に記載の微量成分及び「スーパー」アミノ酸を含む改良ＨＡＭＦ１２／ＤＭＥＭ）に、トランスフェクト細胞を懸濁した。残りの生産期間の間、この細胞培養を３３℃に置いた。ｐＨは、Ｎａ_２ＣＯ_３の添加によってコントロールした。７日目に培養を収集し、組み換えタンパク質をプロテインＡ（ProSep）クロマトグラフィーによって精製した。
３．５リッターの培養上清へ添加したのは、１ｍＭアジ化ナトリウム、並びに後に終夜、４℃で６ｍｌＰｒｏｓｅｐ（プロテインＡ）カラムに負荷した１ｍＭＰＭＳＦであった。このカラムは、ベースラインＯ．Ｄ．となるまでＰＢＳで洗浄し、０．５ＭＴＭＡＣを含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで洗浄して５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０で溶出させ、直ちに１／５容量の１ＭＨｅｐｅｓｐＨ７．２で中和した。次に、溶出物を終夜、ＰＢＳで透析し、無菌濾過し、４℃で貯蔵した。産出高は、３２ｍｌｘ０．４７ｍｇ／ｍｌ＝１５ｍｇ。
精製の後、ＳＤＳゲルによってジスルフィド凝集が明らかになった。ジスルフィド凝集は、あるＦｃ作成物で生じることが知られている。凝集のより少ないものを提供するものとして、一般的に上記に記載の方法を利用してバキュロウイルス又はＣＨＯＨｉｓ（Ｃ末端）タッグ又はＣＨＯＦｌａｇ（Ｎ末端）タッグ種を調製することが可能である。

実施例８：酵母菌でのＡＤＡＭ８の発現
以下の方法は、酵母菌中での所望のＡＤＡＭ８の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＡＤＡＭ８の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。所望のＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＡＤＡＭ８の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＡＤＡＭ８をコードするＤＮＡを、選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＡＤＡＭ８の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。

酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＡＤＡＭ８は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＡＤＡＭ８を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。

実施例９：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＡＤＡＭ８の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中での所望する組換え発現を記載する。
ＡＤＡＭ８をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＡＤＡＭ８又はＡＤＡＭ８のコード化配列の所望の部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、或いはタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。

組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。

次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＡＤＡＭ８は、例えばＮｉ^２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過した。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ_２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ_２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ^２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ_１０−タグＡＤＡＭ８を含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＡＤＡＭ８の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。

ＰＣＲ増幅に続いて、各コード化配列をバキュロウィルス発現ベクター（ＩｇＧ融合のためのpb.PH.IgG及びポリ−Ｈｉｓタグタンパク質のためのpb.PH.His.c）中にサブクローニングし、ベクターとBaculogold（商品名）バキュロウィルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５のSpodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（Gibco-BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びpb.PH.Hisは商業的に利用できるバキュロウィルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の改変物で、Ｈｉｓ又はＦｃタグ配列を含む修飾ポリリンカー領域を持つ。１０％ＦＢＳを補填したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地（Hyclone）で細胞を増殖させた。細胞を３８℃で５日間インキュベートした。上清を収集し、続いて１０％ＦＢＳを補填したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地中のＳｆ９細胞を１０のおよその感染効率（ＭＯＩ）で感染させることにより最初のウィルス増幅に使用した。細胞を３８℃で３日間インキュベートした。上清を収集し、バキュロウィルス発現ベクター中における作成物の発現を、ヒスチジンタグタンパク質に対して２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡビード（QIAGEN）へ、又はＩｇＧタグタンパク質に対してプロテイン-ＡセファロースＣＬ−４Ｂビード（Pharmacia）へ１ｍｌの上清をバッチ結合させ、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行って、クーマシーブルー染色により既知の濃度のタンパク質標準と比較することにより決定した。

最初のウィルス増幅上清は、０．１のおよそのＭＯＩでＥＳＦ−９２１培地（Expression Systems LLC）中で増殖したＳｆ９細胞の撹拌培養（５００ｍｌ）を感染させるために使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を収集し、濾過した。撹拌培養の発現が確認されるまでバッチ結合とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５から３Ｌ）を遠心分離により収集して細胞を除去し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物に対しては、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を使用してタンパク質作成物を精製した。精製前に、５ｍＭの濃度まで条件培地にイミダゾールを添加した。条件培地を、４℃で４−５ｍｌ／ｍｉｎの流量で２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．３ＭのＮａＣｌと５ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに汲み上げた。充填後、カラムを更なる平衡化バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化バッファーで溶出させた。高度に精製されたタンパク質は続いて２５ｍｌのＧ２５ Superfine（Pharmacia）カラムで１０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で脱塩し、−８０℃で貯蔵した。

タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を次のようにして条件培地から精製した。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化された５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に条件培地を汲み上げた。充填後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５での溶出前にカラムを平衡化バッファーで十分に平衡化した。溶出したタンパク質を、２７５ｍＬの１ＭＴｒｉｓバッファー, ｐＨ９を含むチューブ中に１ｍｌのフラクションを収集することにより即座に中和させた。高度に精製したタンパク質を上述のようにポリ−Ｈｉｓタグタンパク質の貯蔵バッファー中に脱塩した。タンパク質の一様性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動法とエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定により証明した。

あるいは、ｈｉｇｈ５細胞を取り込んだ変更を加えたバキュロウィルスの手段を使用してもよい。この手段では所望の配列をコード化しているＤＮＡは、適切な系、例えばＰｆｕ（Stratagene）で増幅され、又はバキュロウィルス発現ベクターに含まれていたエピトープタグの上流（５’側）に融合される。そのようなエピトープタグはポリＨｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＩＥ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に入手可能なプラスミドから得られるプラスミドを含む様々なプラスミドが利用されてもよい。ｐＩＥＩ−１及びｐＩＥＩ−２ベクターは安定に形質転換された昆虫細胞（１）におけるバキュロウィルスｉｅ１プロモーターからの組み替えタンパク質の構成的な発現のために設計される。プラスミドは複数のクローン化部位の配向でのみ異なり、ｈｒ５エンハンサーエレメント並びに感染していない昆虫細胞でのｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られているすべてのプロモーター配列を含む。ｐＩＥＩ−１及びｐＩＥＩ−２は翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の生産に使用される。簡単に言えば、所望の配列または配列の所望部分（例えば膜貫通タンパクの細胞外ドメインをコード化する配列）はＰＣＲによって５’と３’領域に相補的なプライマーを使って増幅される。５’プライマーはフランキング（選択された）制限酵素部位を組み込む。次いで生成物はこれらの選択された制限酵素で消化された発現ベクター中にサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥ１−１の誘導体はヒトＩｇＧ（ｐｂ.ＰＨ.ＩｇＧ）のＦｃ領域又は所望の配列の下流（３’側）の８ヒスチジン（ｐｂ.ＰＨ.Ｈｉｓ）を含む。好ましくは、ベクター作成物は確認のために配列決定される。

Ｈｉ−５細胞は２７℃、ＣＯ_２無しの、ＮＯｐｅｎ／ｓｔｒｅｐの条件下で５０％の集密度まで生育する。それぞれの１５０ｍｍプレートに対し塩基配列を含む条件３０μｇのｐＩＥベースベクターを１mlのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地（培地：Ex-Cell401+1/100L-Glu JRH Bioscience #14401-78P(注：この培地は光感受性である)）と混合され、分離したチューブで１００μｌのＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（CellFECTIN（GibcoBRL#10362-010）（ボルテックスで混合））を１mlのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地でと混合する。２つの溶液を混ぜ合わせ、室温で１５分間インキュベートする。８mlのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を２mlのＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物に加え、先にＥｘ−Ｃｅｌｌ培地で洗浄しておいたｈｉｇｈ−５細胞上に重ねる。ついでプレートを室温で１時間暗所でインキュベートする。ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物は時に吸引され、細胞は一度Ｅｘ−Ｃｅｌｌで洗浄して過剰のＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物を除去し、３０mlの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を加え、２８℃で３日間インキュベートする。上清を収集し、バキュロウィルス発現ベクターでの配列の発現をヒスチジンタグタンパク質に対してはＮｉ^２＋−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）の、ＩｇＧタグタンパク質に対してはプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Pharmacia）の２５mlに対する１mlの上清をバッチ結合させ、次いでクーマーシブルー染色によりタンパク質標準の既知の濃度と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定する。

形質移入細胞からの条件培地（０.５〜３L）を、遠心分離により細胞を除去し０.２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収する。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ^２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に５mMの濃度まで添加する。条件培地を、０.３MのＮａＣｌ及び５mMイミダゾールを含む２０mMのＨｅｐｅｓ, ｐＨ７.４バッファーで平衡化した６mlのＮｉ−ＮＴＡカラムに４-５ｍｌ／分の流速で４８℃でポンプ供給する。負荷後、カラムを更なる平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０.２５Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０mMのＨｅｐｅｓ、０.１４MのＮａＣｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, ｐＨ６.８中で２５mlのG２５ Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。

タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、２０mMのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６.８で平衡化した５mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷する。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００mMのクエン酸、ｐＨ３.５で溶離する。溶離したタンパク質は、１mlの画分を２７５mlの１Mトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手段により評価される。

実施例１０：ＡＤＡＭ８に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ８を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＡＤＡＭ８を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。例えば、ヒトＡＤＡＭ８は、大腸菌内のエピトープタグ（ポリＨＱ）のＮ末端で生産され、標準的方法によって２０ｍＭグリシン、２Ｍ尿素及び１０ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭＴｒｉｓで製剤化された。また、同一のエピトープタグで生産された組み換え体とは関連性のないヒトタンパク質（アルテミン(artemin)）を、タッグを認識する抗体に対するスクリーニングのために生産した。例えば、ポリＨｉｓ_６、ポリＨｉｓ_８等のどの適切なエピトープ、及びどの適切なタッグタンパク質、又はエピトープタッグのみを、タッグを認識する抗体を除くためのスクリーニングに用いることができる。

Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＡＤＡＭ８免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＡＤＡＭ８抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＡＤＡＭ８の静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。

ハイブリドーマ細胞は、ＡＤＡＭ８に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＡＤＡＭ８に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＡＤＡＭ８モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。

抗ＡＤＡＭ８モノクローナル抗体の開発
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, DE）をＲｉＢｉアジュバント（Ribi Immunochem Research, Inc, Inc., Hamilton, MT）中の精製ヒトＡＤＡＭ８で過免疫した。最も高い抗ＡＤＡＭ８抗体力価を示した５匹のマウス由来のＢリンパ球を膝窩及び鼠径部のリンパ節より収集し、前出に示したように（Kohlerら, 1975）、マウスメラノーマ細胞（X63.Ag8.653；Ameerican Type Culture Collection, Rockville, MD）と融合させた。８−１４日後、上澄みを収集し、直接酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体生産についてスクリーニングした。最も高いＡＤＡＭ８特異性免疫結合を示した６７のポジティブクローンについて、さらに免疫細胞化学的分析をおこなった。限界希釈法によって、２３のポジティブクローンをサブクローニングした。２回目のサブクローニングの後、ＭＡｂのインビボ生産のために、選択した系統をプリスタンで初回抗原刺激を受けたマウス（Pristane-primed mice）（Freund及びBlair, 1982）へ注入した。生じた腹水をプールし、前出に記載したように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Pharmacia fast protein liquid chromatography[FPLC]；Pharmacia, Uppsala, Sweden）によって精製した（Hongoら, 1995）。精製抗体調製物を無菌濾過（０．２μｍ孔径；Nalgene, Rochester NY）し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて４℃で貯蔵した。

抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマの選択のための直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を、１００μｌ／ウェルの０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６中の関連性のないポリＨＱタッグタンパク質（１μｇ／ｍｌ）又はヒトＡＤＡＭ８のどちらかで終夜、４℃でコーティングした。アッセイの残りの部分は、前出に記載したようにおこなった（Hongoら, 1995）。
アイソタイピング
抗体のアイソタイプを、市販で入手可能なアイソタイピングキット（Mouse Antibody Isotyping Kit; dipstick format；GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて決定した。

固定細胞へ結合する、抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマのスクリーニング
免疫組織化学的実験において固定化された細胞へ結合する抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマを選択するために、ＡＤＡＭ８Ｉｇ融合物をコードする発現ベクターでトランスフェクトした固定化細胞に対するハイブリドーマをスクリーニングするようにアッセイを開発した。ヒト腎臓細胞（２９３細胞）をＡＤＡＭ８Ｉｇ発現ベクター、並びにネオマイシン耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を発現するプラスミドであるｐＲＳＶ_ｎｅｏでトランスフェクションした。トランスフェクト細胞を、特にＡＤＡＭ８を発現する細胞を選択するために、８００μｇ／ｍｌのジェネテシン（GibcoBRL）で選択した。１０％ＦＢＳ及び１ＸＬ−グルタミン酸（GiboBRL）で補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２の５０：５０の混合培地で、細胞を生育させた。これらの細胞を、約５０％の集密で、２．５μｇ／ｃｍ^２のポリ−Ｄ−リジンでコーティングした６ウェル組織培養プレート（Costar）へプレートした。翌日、培地を吸引して取り除き、細胞をＰＢＳ（２ｍｌ）で２回洗浄した。この細胞を、２分間に渡って、氷冷メタノールで固定化した（他の固定液を用いてもよい、例えば５０：５０のメタノール：アセトン、エタノール、又は１０％中性ホルマリン）。この細胞を、洗浄バッファー（１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。一次抗体を１０％ＦＢＳを加えたＰＢＳへ添加し、ウェルへ塗布した。この場合、試験された一次抗体は、１ｍｌにおいて１：１０に希釈された分泌ハイブリドーマであった。インキュベーションは、室温で約２．５時間に渡って、極めて温和な回転でおこなった。この細胞を洗浄バッファーで５回洗浄し、二次抗体を適用した。この場合、抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧで、Ｆｃ特異性、ＨＲＰで共役（Sigma A0168）されており、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：５０００に希釈されていた。インキュベーションは、再び、室温で約２．５時間に渡って、極めて温和な回転でおこなった。２ｍｌのＰＢＳで希釈したｏ−ジアニシジン飽和エタノール（５０ｍｌＰＢＳ、０．５ｍｌｏ−ジアニシジン飽和エタノール、５μｌＨ_２Ｏ_２）を適用する前に、細胞を洗浄バッファーで５回洗浄した。色の展開は、約１時間に渡って室温でおこなった。細胞をＨ_２Ｏで２回洗浄し、プレートを４℃で貯蔵した。細胞を染色の程度によって記録した（なし、弱い、中程度、強い）。

ＡＤＡＭ８Ｉｇへ結合する、抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマのスクリーニング
更に、抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマを評価するために、哺乳動物細胞でＩｇ融合タンパク質として作製したＡＤＡＭ８を用いて、上澄み液をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc Maxisorb）を４℃で終夜に渡って２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃ（Caltag H10700）でコーティングした。このプレートは、洗浄バッファー（０．０５％Tween20を加えたＰＢＳ）で３回洗浄した。プレートを室温で１時間に渡って１％ＢＳＡのＰＢＳ（１５０μｌ）でブロックした。このプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ＡＤＡＭ８Ｉｇ（ｐＲＫ．ＡＤＡＭ８Ｉｇ）を発現するＣＨＯ細胞作成物での大規模な過度トランスフェクションによる上澄み液を、０．３％ＢＳＡのＰＢＳで１：９に希釈して約５００ｎｇ／ｍｌとした。希釈上澄み液（５０μｌ）をプレートへ塗り付け、室温で２時間に渡ってインキュベートした。このプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。抗ＡＤＡＭ８分泌ハイブリドーマの上澄み液をプレート（５０μｌ）へしっかりと塗り付け、室温で２時間に渡ってインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的、ＨＲＰ共役抗体（SigmaA0168）を１：５０００に希釈した０．３％ＢＳＡを添加したＰＢＳを室温で１時間渡って塗り付けた。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、着色を１００μｌＴＭＢパーオキシダーゼ基質／Ｈ_２Ｏ_２（Kirkegaard及びPerry Laboratories）で１０分間に渡っておこなった。反応は、１００μｌの１Ｍリン酸で止めた。プレートの読みとりは、４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダー上でおこなった。

融合により、１０の９６ウェルプレートをクローンでプレートした。元の免疫原によるＥＬＩＳＡではポジティブであって、関連性のないタッグタンパク質によるＥＬＩＳＡではネガティブであった６７のクローンを得た。これら６７のクローンのうち、３３のクローンはｐＲＫ．ＡＤＡＭ８Ｉｇ一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞の上澄みによるＥＬＩＳＡでポジティブであった。メタノール固定細胞に対するスクリーニングにおいて、２３のクローンがＡＤＡＭ８への結合に関してはポジティブであった。これら２３のクローンはサブクローンニングされた。また、１０％ホルマリンで固定された細胞に対するスクリーニングにおいて、これら２３のクローンのうちの１つがＡＤＡＭ８との結合に関してポジティブであった。
メタノール又はホルマリンで固定された細胞へ結合する抗体は、試料組織におけるＡＤＡＭ８の発現及びその程度を分析するための標準的な免疫組織化学実験において特に有用である。生存細胞の表面のＡＤＡＭ８及び固定された細胞のＡＤＡＭ８を認識して結合する抗体は、例えばホルマリンで細胞を固定化することが抗原構造を改変するので、特に興味あるものである。これら抗体は、細胞／組織が固定された場合に保持されるＡＤＡＭ８上のエピトープを認識するの可能性がある。このような抗体は、診断試薬及び治療用抗体として臨床的に用いられることが可能である。

上文の明細書は、当業者によって本発明を実施するためには十分であると考えられる。実際に、ここにおいて記載の内容に加えて本発明の種々の改良は、上文の説明からは当業者にとって明かなものであり、捕捉請求項の範囲内におさまるものである。

実施態様
１．ＡＤＡＭ８ポリペプチドへ結合する単離された抗体。
２．前記ポリペプチドへ特異的に結合する、請求項１の抗体。
３．前記ポリペプチドを発現する細胞の死を誘導する、請求項１の抗体。
４．前記細胞が正常細胞の同型組織と比較して前記ポリペプチドを過剰発現する、請求項３の抗体。
５．モノクローナル抗体である、請求項１の抗体。
６．非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）又はヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項５の抗体。
７．標識化された請求項１の抗体。
８．固体支持体に固定化された、請求項１の抗体。
９．抗体断片又は一本鎖抗体である、請求項１の抗体。
１０．製薬的に許容可能な担体と混合した請求項１の抗体を含んでなる製造品。
１１．前記抗体の治療的有効量を含む、請求項１０の製造品。
１２．細胞傷害又は化学療法剤をさらに含んでなる、請求項１０の製造品。
１３．無菌である、請求項１０の製造品。
１４．請求項１の抗体をコードする、単離された核酸。
１５．請求項１４の核酸分子を含んでなるベクター。
１６．請求項１５のベクターを含んでなる宿主細胞。
１７．細胞培養からＡＤＡＭ８ポリペプチドへ結合する抗体の発現及びその抗体を回収するを可能にする十分な条件下で請求項１６の宿主細胞を培養することを含んでなる方法である、前記ポリペプチドへ結合する抗体を生産する方法。
１８．ＡＤＡＭ８ポリペプチドのアンタゴニスト。
１９．ＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする核酸配列の補体とハイブリッド形成する単離された核酸分子。
２０．ＡＤＡＭ８ポリペプチドを含有すると思われる試料を抗ＡＤＡＭ８抗体へ曝露し、その試料中でのＡＤＡＭ８ポリペプチドへの抗ＡＤＡＭ８抗体の結合を確かめる、前記ポリペプチドを含有すると思われる試料での前記ポリペプチドの存在を確かめる方法。
２１．前記試料がＡＤＡＭ８ポリペプチドを含んでなると思われる細胞を含む、請求項２０の方法。
２２．（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞のコントロール試料からＡＤＡＭ８ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、試験試料中でのより高い発現レベルが試験組織細胞が得られた哺乳類での腫瘍の存在を示す、哺乳類の腫瘍を診断する前記方法。
２３．（ａ）哺乳類から得られた組織細胞の試験試料と抗ＡＤＡＮＭ８抗体を接触させること、及び（ｂ）試験試料中の抗ＡＤＡＭ８抗体及びＡＤＡＭ８ポリペプチド間の複合体の形成を検出することを含んでなり、複合体の形成が組織細胞の試験試料を得た前記哺乳類での腫瘍の存在を示す、哺乳類の腫瘍を診断する方法。
２４．前記抗体が検出可能に標識化されている、請求項２３の方法。
２５．組織細胞の前記試験試料が新生物の成長又は増殖を有すると思われる個人から得られる、請求項２３の方法。
２６．抗ＡＤＡＭ８抗体及び適切な包装の担体を含んでなる、癌診断キット。
２７．ＡＤＡＭ８ポリペプチドを含有すると思われる試料にＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在を検出するための前記抗体を使用するための指示書をさらに含む請求項２６のキット。
２８．ＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する腫瘍細胞へＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性を阻害する薬剤の有効量を曝露することを含んでなり、前記腫瘍細胞の成長が阻害される、腫瘍細胞の成長を阻害する方法。
２９．同じ組織型の正常細胞と比較し、前記腫瘍細胞が前記ポリペプチドを過剰発現する、請求項２８の方法。
３０．前記薬剤が抗ＡＤＡＭ８抗体である、請求項２８の方法。
３１．前記抗ＡＤＡＭ８抗体が細胞死を誘発する、請求項３０の方法。
３２．前記腫瘍細胞をさらに放射線処理、細胞傷害性剤又は化学療法剤へ曝露する、請求項２８の方法。
３３．ＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する腫瘍細胞へＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現を阻害する薬剤の有効量を曝露することを含んでなり、これにより前記腫瘍細胞の増殖が阻害される、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
３４．同じ組織型の正常細胞と比較し、前記腫瘍細胞が前記ポリペプチドを過剰発現する、請求項３３の方法。
３５．前記薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３３の方法。
３６．前記腫瘍細胞をさらに放射線処理、細胞傷害性剤又は化学療法剤へ曝露する、請求項３５の方法。
３７．組成物が腫瘍細胞の増殖の阻害に効果的であり、正常細胞の同じ組織型と比較し、前記腫瘍細胞のＡＤＡＭ８ポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる症状を治療するために組成物が効果的であることを容器上の標識が示す、容器、容器上の標識、及び容器に含有される活性剤を含んでなる組成物を含んでなる製造品。
３８．前記活性剤が前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する、請求項３７の製造品。
３９．前記活性剤が抗ＡＤＡＭ８抗体である、請求項３８の製造品。
４０．前記活性剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３８の製造品。
４１．候補化合物をＡＤＡＭ８ポリペプチドと相互作用することができる十分な条件下及び時間に渡って接触させること、並びに前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性が阻害されているか否かを確定することを含んでなる、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物を同定する方法。
４２．前記候補化合物が抗ＡＤＡＭ８抗体である、請求項４１の方法。
４３．前記化合物又は前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドが固体支持体へ固定化されている、請求項４１の方法。
４４．非固定化成分が検出可能に標識化されている、請求項４３の方法。
４５．（ａ）通常はＡＤＡＭ８ポリペプチドによって誘導される細胞応答の誘発に適した条件下のＡＤＡＭ８の存在において、スクリーングされる候補化合物と細胞を接触させること、及び（ｂ）試験化合物が効果的なアンタゴニストであるか否かを確定するために前記細胞応答の誘導を確定することの段階を含んでなる、ＡＤＡＭ８ポリペプチドの活性を阻害する化合物を同定する方法。
４６．ＡＤＡＭ８ポリペプチドを発現する細胞と候補化合物を接触させること、並びに前記ＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現が阻害されているか否かを確定することを含む方法である、前記ポリペプチドを発現する細胞において前記ポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定する方法。
４７．前記候補化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４６の方法。

Claims

(a) 試験試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドの発現をインビトロで検出すること、及び(b) 該試験試料中の発現レベルをコントロールと比較することを含み、このときコントロール試料と比較して該試験試料中の該ポリペプチドレベルの発現が高い場合に、試験試料を採取した該哺乳動物に腫瘍があることを示す、新生物性疾患のインビトロ検出方法。
(a) 抗ＡＤＡＭ８抗体に結合させることによって試験試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドをインビトロで検出すること、及び(b) 該試験試料中の抗体とポリペプチドの複合体レベルをコントロールのものと比較することを含み、このときコントロールと比較して該試験試料中の複合体レベルが高い場合に、試験試料を採取した該哺乳動物に腫瘍があることを示す、新生物性疾患のインビトロ検出方法。
前記抗体が検出可能に標識されている、請求項２に記載の方法。
前記の組織細胞の試験試料が、腫瘍を有すると思われる個体から得たものである、請求項２に記載の方法。
請求項２に記載の方法に従って用いる場合に、抗ＡＤＡＭ８抗体と担体を適切にパッケージ化して具備する診断用キット。
さらに、腫瘍細胞を含有すると思われる試料中のＡＤＡＭ８ポリペプチドの存在を検出するための前記抗体の使用についての指示書を具備する、請求項５に記載のキット。
(a) 全ＲＮＡ試料中のＡＤＡＭ８ｍＲＮＡをインビトロで検出すること、及び
(b) 該試験試料中のｍＲＮＡレベルをコントロールのものと比較することを含み、このときコントロールと比較して該試験試料中のｍＲＮＡレベルが高い場合に、試験試料を採取した該哺乳動物に腫瘍があることを示す、新生物性疾患のインビトロ検出方法。
腫瘍が乳、大腸又は肺の腫瘍である、請求項１から４及び７の何れか一に記載の方法。