JP2011041531A - フラボノイド化合物の製造方法 - Google Patents
フラボノイド化合物の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011041531A JP2011041531A JP2009192692A JP2009192692A JP2011041531A JP 2011041531 A JP2011041531 A JP 2011041531A JP 2009192692 A JP2009192692 A JP 2009192692A JP 2009192692 A JP2009192692 A JP 2009192692A JP 2011041531 A JP2011041531 A JP 2011041531A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- flavonoid compound
- flavonoid
- compound
- chemical formula
- glycosylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- -1 flavonoid compound Chemical class 0.000 title claims abstract description 162
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 title claims abstract description 158
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 title claims abstract description 158
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000235555 Cunninghamella Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 50
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 33
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 claims description 26
- 150000002207 flavanone derivatives Chemical class 0.000 claims description 26
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 claims description 26
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 23
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 22
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 20
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 20
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 19
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 19
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 19
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 18
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 claims description 17
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 14
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N UDP-alpha-D-glucuronic acid Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 15
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 59
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 35
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000011957 flavonols Nutrition 0.000 description 18
- 150000007946 flavonol Chemical class 0.000 description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N fisetin Chemical compound C=1C(O)=CC=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 XHEFDIBZLJXQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001290628 Cunninghamella echinulata Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N Morin Chemical compound OC1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000011990 fisetin Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007708 morin Nutrition 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXGIVZQGGGOFU-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-phenylchromen-4-one Chemical compound O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1.O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 AVXGIVZQGGGOFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000010215 Cunninghamella bainieri Species 0.000 description 1
- 241000010216 Cunninghamella blakesleeana Species 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001765 catechin Chemical class 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N flavone Chemical group O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】カニンガメラ属の微生物による微生物変換を用いてグリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで効率良く製造する製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法によれば、カニンガメラ属に属する微生物による微生物変換を用いることで、比較的多くの量のグリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで製造することが可能となる。また、本願発明に用いるカニンガメラ属に属する微生物は、フラボノイド化合物の３位の官能基を糖鎖で置換してグリコシル化するため、保護基等の脱着が必要なく容易にグリコシル化したフラボノイド化合物を製造することができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法によれば、カニンガメラ属に属する微生物による微生物変換を用いることで、比較的多くの量のグリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで製造することが可能となる。また、本願発明に用いるカニンガメラ属に属する微生物は、フラボノイド化合物の３位の官能基を糖鎖で置換してグリコシル化するため、保護基等の脱着が必要なく容易にグリコシル化したフラボノイド化合物を製造することができる。
【選択図】図１
Description
本発明は、微生物変換を用いてグリコシル化したフラボノイド化合物を製造するフラボノイド化合物の製造方法に関するものである。
フラボノイド化合物は植物界に多く存在し、代表的な天然化合物の一群である。フラボノイド化合物は現在３０００種以上が知られ、その多様性と多面的な生理活性から注目を集めている。これらの具体的な報告例としてはカテキン類の抗菌活性、ポリフェノール類の抗酸化作用などが挙げられる。また、植物の花色や青果物の色を決定する色素として重要なアントシアン類もこのフラボノイド化合物群に属し、水酸基の数や位置によって多様な色を呈する。このように、フラボノイド化合物は薬理作用、抗菌作用、食品への機能性の付与等、様々なものへの応用が期待されている。
これら応用が期待されているフラボノイド化合物群のひとつとして、糖鎖が結合しているグリコシル化したフラボノイド化合物がある。グリコシル化したフラボノイド化合物はこれ自体が抗菌活性および生活習慣病予防のための各種生理活性を有しているほか、他のフラボノイド化合物等の合成中間体としても期待されている。
ただし、ある特定のフラボノイド化合物を医薬品（医薬部外品）や食品に応用するためには、そのフラボノイド化合物に対する薬効や安全性評価等の生物評価を行わなければならない。この生物評価のためには目的のフラボノイド化合物がある程度の量必要である。しかしながら、目的のフラボノイド化合物が基本的なフラボノイド化合物の類縁体である場合、この類縁体のみを化学合成することは困難な場合が多い。上記のグリコシル化したフラボノイド化合物もこの化学合成が困難なものに属し、例えば、下記［化１０］のフラボノイド化合物を化学的方法で合成する場合、比較的容易に入手できる下記［化９］のフラボノイド化合物を出発原料として、［化９］のフラボノイド化合物の７位の水酸基以外の官能基に保護基を付けた上で７位の水酸基のみを糖鎖と置換してグリコシル化を行い、その後、保護基を除去するなどの操作が必要となる。このような複雑な反応工程が必要では、化学的方法によるグリコシル化したフラボノイド化合物の製造の実用化は、技術面及びコスト面から困難であると考えられる。
ところで、微生物変換は微生物菌体またはその培養物に基となる化合物を接触させることによって当該化合物を変換する方法であり、水酸化をはじめ還元、加水分解、スルホン酸化、グリコシル化など多くの反応が可能であることが知られている。また、この微生物変換は、常温常圧、中性付近で反応が進行することが多いため環境負荷が小さいこと、基質の部位特異性や立体特異的に優れ、反応に際して保護基が不要であることなどの点で優れている。
ここで、下記［非特許文献１］には、カニンガメラ属の微生物変換によるスルホン酸化の例が、また下記［非特許文献２］には、コムギの根毛を用いたフラボノールのグルコシル化の例がそれぞれ記載されている。
Chem.Pharm.Bull.56巻、1253〜1258頁（2008年）
Biosci.Biotechnol.Biochem.68巻、2032〜2039頁（2004年）
しかしながら、［非特許文献２］によるコムギの根毛を用いたフラボノールのグルコシル化では得られる量が極めて微量であり、生物評価等に使用できるほどの量を得ることができない。
本発明は上記事情に鑑みて成されたものであり、カニンガメラ属の微生物による微生物変換を用いてグリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで効率良く製造する製造方法を提供することを目的とする。
（１）化５の一般式に示す第１のフラボノイド化合物を化６の一般式に示す第２のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）に属する微生物を前記第１のフラボノイド化合物と糖類とを含有する培地で培養する、または、糖類を含有する培地で培養した前記微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液を前記第１のフラボノイド化合物と接触させることで、前記第１のフラボノイド化合物を第２のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第２のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
当該第２のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（２）化５の一般式に示す第１のフラボノイド化合物を化６の一般式に示す第２のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）に属する微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液を前記第１のフラボノイド化合物及びウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースまたはウリジン二リン酸グルクロン酸またはウリジンヌクレオチド二リン酸ガラクトースまたはウリジンヌクレオチド二リン酸マンノースと接触させることで、前記第１のフラボノイド化合物を第２のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第２のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（３）化７の一般式に示すフラバノンを化８の一般式に示す第３のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）の微生物をフラバノンと糖類とを含有する培地で培養する、または、糖類を含有する培地で培養した前記微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液をフラバノンと接触させることで、当該フラバノンを第３のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第３のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（４）化７の一般式に示すフラバノンを化８の一般式に示す第３のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）の微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液をフラバノン及びウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースまたはウリジン二リン酸グルクロン酸またはウリジンヌクレオチド二リン酸ガラクトースまたはウリジンヌクレオチド二リン酸マンノースと接触させることで、当該フラバノンを第３のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第３のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法は、カニンガメラ属の微生物による微生物変換を用いることにより、グリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで効率良く製造することができる。
本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法の実施の形態について詳細に説明する。
先ず、本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法の原理について簡単に説明する。本願発明者はある特定のカニンガメラ属（genus Cunninghamella）に属する微生物が、代謝等の生体反応により糖類をウリジンヌクレオチド二リン酸化（ＵＤＰ化）するとともに、ＵＤＰ化した糖類（の糖鎖）とフラボノイド化合物の特定位置の官能基（の水素）とを置換する酵素（以後、変換酵素とする。）を生成することを見出した。本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法は、この特定のカニンガメラ属に属する微生物を用いて原材料となるフラボノイド化合物をグリコシル化し、目的となるグリコシル化したフラボノイド化合物の製造を行うものである。
ここで、特定のカニンガメラ属に属する具体的な微生物としては、Cunninghamella
echinulata（カニンガメラ・エキヌラータ）、C. bainieri（カニンガメラ・バイニエリ）、C. blakesleeana（カニンガメラ・ブラケスリーアナ）、C.elegans（カニンガメラ・エレガンス）等が挙げられる。中でも特に、公的な菌株分譲機関に保存された菌株であるCunninghamella echinulata CBS 596. 68 の使用が最も好ましい。ただし、カニンガメラ属等の糸状菌の諸性質は一定したものでなく、自然的、人工的に容易に変化することは周知のとおりである。よって、本発明で使用しうるカニンガメラ属の微生物は上記のものに限定されるわけではなく、カニンガメラ属に属し［化９］の第１のフラボノイド化合物もしくは［化１１］のフラバノンを［化１０］の第２のフラボノイド化合物もしくは［化１２］の第３のフラボノイド化合物へ変換し得る菌株すべてを包含するものとする。
echinulata（カニンガメラ・エキヌラータ）、C. bainieri（カニンガメラ・バイニエリ）、C. blakesleeana（カニンガメラ・ブラケスリーアナ）、C.elegans（カニンガメラ・エレガンス）等が挙げられる。中でも特に、公的な菌株分譲機関に保存された菌株であるCunninghamella echinulata CBS 596. 68 の使用が最も好ましい。ただし、カニンガメラ属等の糸状菌の諸性質は一定したものでなく、自然的、人工的に容易に変化することは周知のとおりである。よって、本発明で使用しうるカニンガメラ属の微生物は上記のものに限定されるわけではなく、カニンガメラ属に属し［化９］の第１のフラボノイド化合物もしくは［化１１］のフラバノンを［化１０］の第２のフラボノイド化合物もしくは［化１２］の第３のフラボノイド化合物へ変換し得る菌株すべてを包含するものとする。
尚、以後の記載では本発明に用いるカニンガメラ属の微生物を変換菌と記述する。また、第１のフラボノイド化合物及びフラバノンを原料化合物と記述する。また、本願の製造方法により得られる生成物は、必ずしも全てが第２、第３のフラボノイド化合物となるわけではない。従って基本的に、本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法によって得られた生成物を生成化合物と記述し、生成化合物に含まれる上記の第２、第３のフラボノイド化合物をグリコシル化フラボノイド化合物と記述するものとする。
変換菌を培養する培地は、通常微生物が利用出来る栄養物を含有するものを使用することができる。例えば炭素源（糖類）としては、グルコース、グルクロン酸、ガラクトース、マンノース、シュクロース、マルトース、乳糖、デンプン、グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油等の一般の放線菌の培養に使用する炭素源が使用可能である。また、窒素源としては、大豆粉、小麦はい芽、肉粉、魚粉、肉エキス、ペプトン、コーンステイープリカー、乾燥酵母、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩等が使用可能である。その他、必要に応じて、食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸塩等の無機塩、変換菌の発育を助けるとともに変換酵素の生産を促進する添加物、例えば酵母エキスや麦芽エキス等を適宜組み合わせても良い。
尚、培地に使用する炭素源にグルコースのみを用いれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物（［化１０］、［化１２］）のＲはグルコースとなり、グルクロン酸、ガラクトース、マンノースのみを炭素源に用いれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物（［化１０］、［化１２］）のＲはそれぞれグルクロン酸、ガラクトース、マンノースとなる。また、その他の炭素源もしくは複数種の糖類が混合した炭素源を用いる場合には、その炭素源中に存在するもしくは培養中に生じたグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、マンノース等の量に応じて、［化１０］、［化１２］中のＲの異なるグリコシル化フラボノイド化合物が生成され、生成化合物はそれらの混合物となる。このことは、ＵＤＰ化した糖類を添加する後述の第三の形態のフラボノイド化合物の製造方法以外は基本的に同じである。尚、炭素源中のグルコース、グルクロン酸、ガラクトース、マンノースの混合比と、得られるグリコシル化フラボノイド化合物のそれぞれの混合比とは必ずしも一致しない。
また、天然のフラボノイド化合物は植物由来である場合が多く、このような植物由来のフラボノイド化合物は多種の類縁したフラボノイド化合物が種々の割合で混合している。そして、この混合したフラボノイド化合物のうち特定のフラボノイド化合物を単離して本願発明の原料化合物とすれば、この原料化合物に対しグリコシル化が行われる。また、フラボノイド化合物を混合物のまま原料化合物とすれば、それぞれのフラボノイド化合物に対しグリコシル化が行われ、得られる生成化合物もこれらのグリコシル化フラボノイド化合物の混合物となる。
次に、本発明に係る第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法を説明する。第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法は、変換菌を原料化合物と糖類とを含有する培地で培養することで、グリコシル化フラボノイド化合物を製造するものである。尚、原料化合物の添加は培養当初から行うのではなく、ある程度変換菌を培養した後に行うことが好ましい。
第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法は、先ず、所定の糖類（炭素源）を含有する培地に変換菌を植菌し、好気的条件の下、培養温度２０℃〜４０℃、好適には２３℃〜３０℃、最適には２８℃で所定の期間、変換菌の培養を行う。この培養期間は使用する変換菌の培養条件、特に培養装置、培地組成、培養温度等により異なるが、変換菌による変換酵素の生産能（これをグリコシル化能とする。）が高い時期がよく、通常は変換菌の培養開始後１日〜５日経過した時点が好ましい。この培養の期間中、変換菌は増殖しながら糖類をＵＤＰ化するとともに変換酵素を生成、蓄積する。
次に、この培地に原料化合物を添加する。原料化合物の添加量は、培地に対して０．０１％〜５．０％、好ましくは０．０２５％〜２．０％である。尚、本願中の％は基本的にｇ／１００ｍｌとする。原料化合物添加後の変換菌の培養は、好気的条件下で上記と同様の培養温度で行なう。培養期間は、原料化合物の添加後１〜８日程度である。この培養期間中にも変換菌は糖類をＵＤＰ化するとともに変換酵素を生成する。そして、生成された変換酵素はＵＤＰ化した糖類の糖鎖と原料化合物の特定位置の官能基とを変換してグリコシル化し、グリコシル化フラボノイド化合物を製造する。
グリコシル化の変換反応終了後、グリコシル化フラボノイド化合物を含む生成化合物は培地から既知の方法で採取、分離、精製される。例えば、培地を濾過し、得られた濾液を酢酸エチルのような水と混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒を留去した後、得られた粗生成化合物をシリカゲル、アルミナ、セパビーズ（三菱化学）等を用いたカラムクロマトグラフィーに付し、適切な溶離剤で溶出することによってグリコシル化フラボノイド化合物を分離、精製する。
５００ｍｌ容三角フラスコ２本に次の組成の培地８０ｍｌをそれぞれ入れ、変換菌としてカニンガメラ・エキヌラータ（C.echinulata CBS596. 68）を植菌した（培地組成：溶媒 蒸留水（ｐＨ無修正）、Ｄ−グルコース５．０％、ポリペプトン（日本製薬）０．５％、酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）０．３％）。これを、２日間、培養温度２８℃、２１０ｒｐｍの条件で振とう培養し、変換菌の培養を行った。次に、原料化合物としてのフラボノール（3-hydroxyflavone）４０ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．８ｍｌに溶解したものをそれぞれの培地に添加し、更に８日間、培養温度２８℃、２１０ｒｐｍの条件で振とう培養した。
培養終了後、培養液を酢酸エチル８０ｍｌで２回抽出し、この抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮した。この濃縮物をセパビーズＳＰ７０（三菱化学）カラムに吸着、洗浄後、１００％メタノールで溶出することにより精製した。これにより原料化合物８０ｍｇに対し生成化合物４０ｍｇを採取した。
この生成化合物を酢酸エチルを展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィー（分析条件 シリカゲル薄層：メルク社４０ｍｍ×１００ｍｍ、溶媒：１００％酢酸エチル、検出方法：ヨウ素またはアンスロン硫酸（１％／７５％硫酸）噴霧による検出）により確認した。その結果、フラボノールの３−Ｏ−グルコシル体が確認された。尚、原料化合物であるフラボノールはほとんど確認できなかった。またこの生成化合物の質量スペクトルをＥＳＩ−ＭＳ（日本電子（株）社製：ＨＸ−１１０）を用いて測定した。また、この生成化合物のＤＭＳＯ−ｄ６中における核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＭＮＲ）をＮＭＲ（日本電子（株）社製：ＪＮＭ−ＡＬ３００およびＪＮＭ−ＥＣＡ６００）を用いて測定した。そして、ＥＳＩ−ＭＳのイオンピークおよびＮＭＲの化学シフト値を文献値と比較した。この結果、特にＮＭＲでのグルコースの各プロトン、炭素に帰属されるシグナル、アノメリックプロトン（１’’位）のカップリング定数（８．３Ｈｚ）およびグルコースの１位からフラボン骨格の３位へのＨＭＢＣ（Hetero-Multiple-bond-Connectivity）が、３−Ｏ−グルコシルフラボン（flavone-3-β-O-glucopyranoside）の文献値とほぼ同等であった。よって、生成化合物は３−Ｏ−グルコシルフラボンであることが判明した。尚、参考のため、図１に生成化合物の13Ｃ−ＭＮＲスペクトル、測定値、及び３−Ｏ−グルコシルフラボンの文献値を示す。
ここで、実施例１での原料化合物はフラボノールであるから、［化９］中の３位には水酸基が、５位、７位（Ｒ５、Ｒ７）並びに２’位、３’位、４’位（Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’）には水素が結合している。また、得られたグリコシル化フラボノイド化合物は３−Ｏ−グルコシルフラボンであるから［化１０］中の３位がＯＲ（Ｒ＝グルコース）で、５位、７位（Ｒ５、Ｒ７）並びに２’位、３’位、４’位（Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’）は水素のままである。つまり、特定のカニンガメラ属による微生物変換を用いた本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法によれば、保護基等を用いなくとも特定の３位の官能基（［化９］中のＯＨの水素）のみを糖鎖（グルコース）に変換してグリコシル化し、その他の構造を変化させないことが分かる。
原料化合物を下記［表１］に示す、クエルセチン（quercetin）、フィセチン（fisetin）、モリン（morin）、ケムフェロール（kaempferol）、フラバノン（flavanone）とした以外は［実施例１］と同様の手順により、生成化合物をそれぞれ生成、採取した。
これら５種の生成化合物をそれぞれシリカゲル薄層クロマトグラフィーによりグリコシル体へと変換されているかを確認した。また、これら５種の生成化合物を水に溶解させた後、塩酸でｐＨ２に調整のうえ８０℃で約１６時間加水分解した。これを水酸化ナトリウム水溶液で中和後、グルコースオキシダーゼを用いた酵素法によるグルコース測定キット（Ｆ−キット、ＪＫインターナショナル社）で測定し、グルコースの結合の有無を確認した。
この結果、表１に示すように、本例で用いた変換菌としてのカニンガメラ・エキヌラータは、［実施例１］のフラボノールに加え、ケムフェロール、フラバノンの原料化合物に対してもグリコシル化（本例ではグルコシル化）を効率良く行うことが判明した。また、フィセチン、モリンに対しても一定のグリコシル化（グルコシル化）を示した。
また、培地組成の炭素源であるグルコースを、グルクロン酸、ガラクトース、マンノースとすれば、グリコシル化フラボノイド化合物としてグルクロン酸が結合したフラボノール、フラボノールのガラクトシル体、フラボノールのマンノシル体がそれぞれ生成される。さらに、原料化合物を仮にフラバノンやケムフェロール等の第１のフラボノイド化合物とすれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物はフラバノンや第１のフラボノイド化合物の３位にグルクロン酸、ガラクトース、マンノースが結合したものとなる。
以上のことから、本発明に係る第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法によれば、変換菌を所定の炭素源及び原料化合物を含有する培地で培養するだけで、グリコシル化フラボノイド化合物を製造可能であることがわかる。
次に、本発明に係る第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法を説明する。第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法は、変換菌を糖類を含有する培地で培養し、その培養した変換菌の培養菌体、もしくはこの培養菌体の菌体破砕物、もしくはこの培養菌体（の菌体破砕物）から抽出した酵素抽出液、を分離した上で原料化合物と接触させてグリコシル化フラボノイド化合物を製造するものである。
第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法は、先ず、第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法と同様にして、変換菌を糖類を含む培地でグリコシル化能が高くなるまで培養する。このとき、培地に少量の原料化合物を添加しても良い。次に、変換菌の集菌を行う。変換菌の集菌は培養物に対する遠心分離や濾過等の既知の方法によって行う。集菌された培養菌体は、生理食塩水、緩衝液等で洗浄して使用することが好ましい。
また、菌体破砕物の取得は、集菌した培養菌体を水性媒体、例えばｐＨ５〜９のリン酸緩衝液に懸濁させ、磨砕や超音波処理等の既知の手法により行う。さらに、酵素抽出液の取得は、上記の菌体破砕物に対し遠心分離等の物理的手法、有機溶媒、界面活性剤、酵素処理等による科学的手法等を施すことにより行う。
これらの培養菌体、菌体破砕物、酵素抽出液と原料化合物とを接触させてグリコシル化フラボノイド化合物を製造する場合、例えば培養菌体もしくは菌体破砕物もしくは酵素抽出液と原料化合物とを２０℃〜４５℃、好適には２５℃〜３０℃の水性媒体中、例えばｐＨ５〜９のリン酸緩衝液中で混合することにより行う。原料化合物の濃度は、培養時の培地に対して０．０１％〜５．０％が好ましい。また、変換反応時間は、原料化合物の濃度、反応温度等にもよるが、通常は１〜５日位である。
このようにして製造された生成化合物は、第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法で示したような既知の方法で採取、分離、精製される。
［実施例１］と同様にして変換菌の培養を行った。次に、培地を濾過して培養菌体を分離、取得した。取得した培養菌体４ｇを１／１５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、同リン酸緩衝液８ｍｌに懸濁させた。これを氷冷したのち乳鉢で磨砕し培養菌体の菌体破砕物を取得した。この菌体破砕物を２０００×ｇ（ｇ：重力加速度９．８ｍ／ｓ２）で１５分間遠心分離し、その上澄液を採取して酵素抽出液とした。この酵素抽出液に原料化合物としてのフラボノールを５％のジメチルスルホキシドに溶解した上で、酵素抽出液に対して約０．１％となるように添加し、酵素抽出液中の変換酵素と接触させた。これを、温度２８℃、２１０ｒｐｍの条件で２４時間振とうした。次に［実施例１］と同様にして、振とう後の縣濁液から生成化合物を採取した。この生成化合物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより確認した。その結果、フラボノールのグリコシル体が確認された。
上記の第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法では、先ず変換菌の培養時にＵＤＰ化した糖と変換酵素とを生成させる。次に、このＵＤＰ化した糖と変換酵素とを培地から分離した上で原料化合物と接触させてグリコシル化フラボノイド化合物を製造する。よって、第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法では、培地に関与する不純物を除去した環境でグリコシル化フラボノイド化合物の製造を行うことができる。さらに、酵素抽出液を用いれば培地に関与する不純物に加え変換菌の菌体に関与する不純物を除去した環境でグリコシル化フラボノイド化合物の製造を行うことができる。従って、変換反応時の不純物による悪影響を低減することができる。
尚、本例では酵素抽出液を原料化合物に接触させる例を示したが、培養菌体もしくは菌体破砕物を用いても同様にグリコシル化フラボノイド化合物を製造することができる。
また、本例では糖類としてグルコース、原料化合物としてフラボノールを用いた例を示したが、グリコシル化フラボノイド化合物の製造原理は第一の形態のフラボノイド化合物の製造方法と同等であるため、培養時に添加した糖類を仮にグルクロン酸、ガラクトース、マンノースとすれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物はグルクロン酸、ガラクトース、マンノースがそれぞれ結合したものとなる。また、原料化合物を仮にフラバノンやケムフェロール等の第１のフラボノイド化合物とすれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物はフラバノンや第１のフラボノイド化合物の３位に培養時に添加した糖類の糖鎖が結合したものとなる。
次に、本発明に係る第三の形態のフラボノイド化合物の製造方法を説明する。第三の形態のフラボノイド化合物の製造方法は、第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法と同様、先ず変換菌の培養菌体もしくは培養菌体の菌体破砕物もしくは培養菌体から抽出した酵素抽出液、を取得する。そして、培養菌体もしくは菌体破砕物もしくは酵素抽出液に別途製造されたＵＤＰ化した糖類を加えた上で原料化合物と接触させる。これにより、原料化合物をグリコシル化してグリコシル化フラボノイド化合物を製造する。
前述の第一の形態及び第二の形態のフラボノイド化合物の製造方法では、変換菌が生成したＵＤＰ化した糖を用いてグリコシル化フラボノイド化合物を製造する。このため、グリコシル化フラボノイド化合物の量は変換菌が生成したＵＤＰ化した糖の量に左右される。しかし、第三の形態のフラボノイド化合物の製造方法では、人工的に別途作製されたＵＤＰ化した糖を使用するため、より安定してグリコシル化フラボノイド化合物の製造を行うことができる。
［実施例３］と同様にして酵素抽出液を取得した。この酵素抽出液１ｍｌを１８ｍｍ径の試験管に入れ、ウリジンヌクレオチド二リン酸グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）を最終濃度１００ｍＭとなるよう添加した。また、フラボノールを５％のジメチルスルホキシド溶液を用いて最終濃度で０．１％になるように添加した。これを振とうしながら２８℃で２４時間保持した後、［実施例１］と同様にして生成化合物を採取した。これにより、生成化合物０．０５ｍｇが取得された。この生成化合物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより分析した結果、フラボノールのグルコシル体を確認した。さらに、この生成化合物の構造を質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）および核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＭＮＲ）により確認したところ、生成化合物は3’-β-O-グルコピラノシル-フラボンであることを確認した。尚、生成化合物中には原料化合物であるフラボノールが残存していた。
尚、［実施例４］では、酵素抽出液とウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースとを用いた例を示したが、培養菌体もしくは菌体破砕物を用いても同様にグリコシル化フラボノイド化合物を製造することができる。また、添加物質であるウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースを、ウリジン二リン酸グルクロン酸、ウリジンヌクレオチド二リン酸ガラクトース、ウリジンヌクレオチド二リン酸マンノースとすれば、グリコシル化フラボノイド化合物として、グルクロン酸が結合したフラボノール、フラボノールのガラクトシル体、フラボノールのマンノシル体がそれぞれ生成される。さらに、原料化合物を仮にフラバノンやケムフェロール等の第１のフラボノイド化合物とすれば、得られるグリコシル化フラボノイド化合物はフラバノンや第１のフラボノイド化合物がグリコシル化されたものとなる。
以上のように、本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法によれば、カニンガメラ属に属する微生物による微生物変換を用いることで、比較的多くの量のグリコシル化したフラボノイド化合物を低コストで製造することが可能となる。また、本願発明に用いるカニンガメラ属に属する微生物は、フラボノイド化合物の３位の官能基を糖鎖で置換してグリコシル化するため、保護基等の脱着が必要なく容易にグリコシル化したフラボノイド化合物を製造することができる。さらに、本発明に係るフラボノイド化合物の製造方法は微生物変換を用いており、常温常圧、中性付近でグリコシル化したフラボノイド化合物を製造することができるため、製造装置の構成を単純化することができる。
尚、上記の例は本願の好適な一例であるから、使用する添加物、添加方法、培養方法、培養条件、変換反応時の条件、生成物の分離、採取、精製方法、その他条件等は、上記の例に限定されるものではない。また、本例では実験レベルの比較的小規模の設備による製造方法の例を示したが、装置規模を大型化すればグリコシル化したフラボノイド化合物をある程度大量に製造することも可能である。さらに、本発明は本発明の要旨を逸脱しない範囲で変更して実施することが可能である。
Claims (4)
- 化１の一般式に示す第１のフラボノイド化合物を化２の一般式に示す第２のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）に属する微生物を前記第１のフラボノイド化合物と糖類とを含有する培地で培養する、または、糖類を含有する培地で培養した前記微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液を前記第１のフラボノイド化合物と接触させることで、前記第１のフラボノイド化合物を第２のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第２のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法。
- 化１の一般式に示す第１のフラボノイド化合物を化２の一般式に示す第２のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）に属する微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液を前記第１のフラボノイド化合物及びウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースまたはウリジン二リン酸グルクロン酸またはウリジンヌクレオチド二リン酸ガラクトースまたはウリジンヌクレオチド二リン酸マンノースと接触させることで、前記第１のフラボノイド化合物を第２のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第２のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法。 - 化３の一般式に示すフラバノンを化４の一般式に示す第３のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）の微生物をフラバノンと糖類とを含有する培地で培養する、または、糖類を含有する培地で培養した前記微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液をフラバノンと接触させることで、当該フラバノンを第３のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第３のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法。
- 化３の一般式に示すフラバノンを化４の一般式に示す第３のフラボノイド化合物にグリコシル化するカニンガメラ属（genus Cunninghamella）の微生物の培養菌体もしくは当該培養菌体の菌体破砕物もしくは当該培養菌体から抽出した酵素抽出液をフラバノン及びウリジンヌクレオチド二リン酸グルコースまたはウリジン二リン酸グルクロン酸またはウリジンヌクレオチド二リン酸ガラクトースまたはウリジンヌクレオチド二リン酸マンノースと接触させることで、当該フラバノンを第３のフラボノイド化合物にグリコシル化し、
当該第３のフラボノイド化合物を採取することを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009192692A JP2011041531A (ja) | 2009-08-24 | 2009-08-24 | フラボノイド化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009192692A JP2011041531A (ja) | 2009-08-24 | 2009-08-24 | フラボノイド化合物の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011041531A true JP2011041531A (ja) | 2011-03-03 |
Family
ID=43829451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009192692A Pending JP2011041531A (ja) | 2009-08-24 | 2009-08-24 | フラボノイド化合物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011041531A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130224239A1 (en) * | 2011-03-09 | 2013-08-29 | King Saud University | Alcoholic extract of fungi of genus cunninghamella and use thereof |
| CN107964556A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-04-27 | 皖西学院 | 一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法 |
-
2009
- 2009-08-24 JP JP2009192692A patent/JP2011041531A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130224239A1 (en) * | 2011-03-09 | 2013-08-29 | King Saud University | Alcoholic extract of fungi of genus cunninghamella and use thereof |
| CN107964556A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-04-27 | 皖西学院 | 一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法 |
| CN107964556B (zh) * | 2018-01-09 | 2021-05-07 | 皖西学院 | 一种利用微生物转化山奈酚生产紫云英苷的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nakajima et al. | Lipase-catalyzed direct and regioselective acylation of flavonoid glucoside for mechanistic investigation of stable plant pigments | |
| KR100683236B1 (ko) | 당 전이물의 제조방법 | |
| Yun et al. | Sterins A and B, new antioxidative compounds from Stereum hirsutum | |
| KR101703989B1 (ko) | 락토바실러스 아시도필러스를 이용한 이소플라본과 균체외 다당류가 증가된 장류 및 그 제조방법 | |
| Jia-Qi et al. | Biotransformation of quercetin by Gliocladium deliquescens NRRL 1086 | |
| EP1838862B1 (en) | Manufacturing method of kaempferol | |
| JP2011041531A (ja) | フラボノイド化合物の製造方法 | |
| Shimoda et al. | Glycosylation of artepillin C with cultured plant cells of Phytolacca americana | |
| Ren et al. | Creating diverse glycosides of 2′-hydroxyflavone through microbial glycosylation | |
| KR20010080330A (ko) | 루티노사이드의 효소적 분할 방법 | |
| Kazuma et al. | Identification of Delphinidin 3‐O‐(6 ″‐O‐Malonyl)‐β‐glucoside‐3′‐O‐β‐glucoside, a Postulated Intermediate in the Biosynthesis of Ternatin C5 in the Blue Petals of Clitoria ternatea (Butterfly Pea) | |
| Ren et al. | Microbial glycosylation of antitubercular agent chlorflavonin | |
| JP6156947B2 (ja) | 配糖体の製造方法 | |
| Lundt et al. | 1, 5-Anhydro-D-fructose: biocatalytic and chemical synthetic methods for the preparation, transformation and derivatization | |
| KR101529709B1 (ko) | 비배당체 대두 이소플라본의 제조방법 | |
| JP2009046414A (ja) | プレニルフラボノイド、その製造方法、抗癌剤及び抗菌剤 | |
| Wang et al. | Regioselective synthesis of β-D-glucopyranosides and their analogs by plant seed-derived β-glycosidases | |
| JP2011051933A (ja) | α−グリコシルアントシアニン | |
| KR20220107967A (ko) | 알파-티오글리콜리가제를 이용한 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 제조방법 | |
| JPS61139399A (ja) | 新規抗腫瘍性物質およびその製造方法 | |
| Malbert | Flavonoid glucodiversification with engineered sucrose-active enzymes | |
| KR0161149B1 (ko) | 새로운 N-아세틸-β-D-글루코사미니데이스 저해물질 및 그의 제조방법 | |
| TW200489B (ja) | ||
| KR20130136262A (ko) | 흑효모를 이용한 양파에 포함된 퀘세틴 이당체를 이소퀘시트린으로 생물전환하는 방법 | |
| WO2017078137A1 (ja) | 微生物変換によるアシルグルクロン酸抱合体の製造方法及びその変換活性を有する微生物 |