JP2010536857A - エリスロポエチン受容体ペプチドの製剤及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物の新規使用に関する。本発明はまた、化学療法起因の貧血を含む、不十分な又は欠陥のある赤血球産生に関連する障害を治療するためにそのようなペプチド化合物を使用する方法に関する。本発明のペプチド化合物を含有する医薬組成物も提供される。また、そのような化合物を含むキット及び製品も提供される。

Description

本発明は、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物に関する。本発明はまた、化学療法起因の貧血（chemotheraby induced anemia）を含む、不十分な又は欠陥のある赤血球産生に関連する障害を治療するためにそのようなペプチド化合物を使用する治療方法に関する。本発明のペプチド化合物を含有する医薬組成物も提供される。

貧血は癌化学療法の典型的な合併症である。そのような癌患者において内因性エリスロポエチンレベルが有意に低い場合があることは公知である。成人男性に関しては、典型的には１３．０ｇ／ｄＬ（グラム／デシリットル）未満のヘモグロビンレベルが貧血の診断指標であり、成人女性については、診断閾値は典型的には１２．０ｇ／ｄＬ未満である。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、約３４キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有する１６５アミノ酸の糖タンパク質ホルモンであり、アミノ酸２４位、３８位、８３位及び１２６位に好ましいグリコシル化部位を有する。エリスロポエチンは、最初に２３アミノ酸のシグナルペプチドを有する前駆体タンパク質として産生される。ＥＰＯは、α、β及びアシアロの３つの形態で存在し得る。α型とβ型はその炭水化物成分がわずかに異なるが、同じ効力、生物活性及び分子量を有する。アシアロ型は、末端の炭水化物（シアル酸）が除去されたα型又はβ型である。ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は報告されている［Linへの米国特許第４，７０３，００８号］。

ＥＰＯは赤血球前駆細胞の有糸分裂と分化を刺激し、したがって赤血球の産生を確実にする。ＥＰＯは、低酸素状態が優勢である場合に腎臓において産生される。ＥＰＯが誘導する赤血球前駆細胞の分化の間に、グロビン合成が誘導され、ヘム複合体の合成が刺激されて、フェリチン受容体の数が増加する。これらの変化により、細胞はより多くの鉄を獲得し、成熟赤血球において酸素と結合する機能性ヘモグロビンを合成する。このようにして、赤血球とそのヘモグロビンは、身体に酸素を供給するうえで鍵となる役割を果たす。これらの変化は、ＥＰＯと赤血球前駆細胞の表面上の適切な受容体との相互作用によって開始される[例えば、Graber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29.51-66参照]。

ＥＰＯは、身体が健康な状態にあり、組織が既存の数の赤血球から十分な酸素添加を受けている場合は、非常に低い濃度で血漿中に存在する。この正常な低濃度は、通常加齢によって失われる赤血球の補充を刺激するのに十分である。

循環中のＥＰＯの量は、循環中の血液細胞による酸素輸送が減少する低酸素の条件下で増加する。低酸素は、例えば、出血による実質的な血液損失、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高所若しくは長時間の意識消失に起因する酸素摂取量の減少、又は様々な形態の貧血によって引き起こされ得る。そのような低酸素ストレスに応答して、ＥＰＯレベルの上昇が赤血球系前駆細胞の増殖を刺激することによって赤血球の産生を増加させる。循環中の赤血球数が通常の組織酸素要求に必要とされる量を上回ると、循環中のＥＰＯレベルは低下する。

ＥＰＯは赤血球形成の過程において必須であるので、このホルモンは、低赤血球産生又は赤血球産生欠乏によって特徴づけられる血液障害の診断及び治療の両方において潜在的に有用な適用を有する。種々の試験により、様々な疾患状態、障害及び血液学的異常の状態に対するＥＰＯ治療の効果を予測するための基礎が提供されており、これにはβサラセミア[Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213参照]；嚢胞性線維症［Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21参照］；妊娠及び月経障害［Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311参照］；未熟児の初期貧血［Haga, et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72:827-831参照］；脊髄損傷［Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374参照］；宇宙飛行[Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182参照]；急性失血［Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590参照］；老化［Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580 and 581-588 and Lipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509参照］；赤血球生成異常に伴う様々な腫瘍性疾患状態［Dainiak, et al. (1983) Cancer 5: 1101-1106 and Schwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272参照］；並びに腎不全［Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78参照］が含まれる。

精製された均質なＥＰＯが特徴づけられている［Hewick への米国特許第４，６７７，１９５号］。天然ＥＰＯと同じ生化学的及び免疫学的性質を有する組換えポリペプチドを生産するため、ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列が精製され、クローニングされ、発現された。天然ＥＰＯと同一のオリゴ糖を有する組換えＥＰＯ分子も生産された［Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076参照］。

ＥＰＯの生物学的作用は、一部には、細胞膜結合受容体との相互作用を通して媒介されると考えられる。マウス脾臓から単離した未成熟赤血球系細胞を使用した初期試験は、ＥＰＯ結合細胞表面タンパク質が、それぞれ８５，０００ダルトン及び１００，０００ダルトンのおよその分子量を有する２つのポリペプチドを含むことを示唆した［Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694参照］。ＥＰＯ結合部位の数は、細胞表面当たり平均８００〜１０００と算定された。これらの結合部位のうちで、約３００が約９０ｐＭ（ピコモル）のＫ_ｄでＥＰＯに結合し、残りは約５７０ｐＭの低い親和性でＥＰＯに結合した［Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562参照］。独立した試験は、フレンド白血病ウイルスの貧血株（ＦＶＡ）を注射したマウスから調製したＥＰＯ応答性脾臓赤芽球が、それぞれ約１００ｐＭ及び８００ｐＭのＫ_d値を有する、合計約４００の高親和性及び低親和性ＥＰＯ結合部位を有することを示唆した［Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486参照］。

その後の研究は、２つの形態のＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）が１個の遺伝子によってコードされることを示した。この遺伝子はクローニングされている[例えば、Jones, et al. (1990) Blood 76, 31-35; Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556; Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563参照]。例えば、マウス及びヒトＥＰＯ−Ｒタンパク質についてのＤＮＡ配列及びコードされるペプチド配列は、D' Andrea, et al. への国際公開公報第９０／０８８２２号に記載されている。現在のモデルは、ＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合が２つのＥＰＯ−Ｒ分子の二量体化及び活性化をもたらし、それがシグナル伝達のその後の工程を生じさせることを示唆する［例えば、Watowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140-2144参照］。

ＥＰＯ−Ｒについてのクローン化遺伝子が入手可能であることは、この重要な受容体のアゴニスト及びアンタゴニストについての探索を容易にする。組換え受容体タンパク質が利用できることにより、種々のランダム及び半ランダムなペプチド多様性生成系における受容体−リガンド相互作用の試験が可能となる。これらの系は、「プラスミド上のペプチド」系［米国特許第６，２７０，１７０号に記載されている］;「ファージ上のペプチド」系［米国特許第５，４３２，０１８号及びCwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382に記載されている］；「コード化合成ライブラリー」（ＥＳＬ）系［１９９２年９月１６日出願の米国特許出願第９４６，２３９号に記載されている］；及び「非常に大規模な固定化ポリマー合成」系［米国特許第５，１４３，８５４号；国際公開公報第ＰＣＴ９０／１５０７０号；Fodor, et al. (1991) Science 251 :767-773; Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180；及び米国特許第５，４２４，１８６号に記載されている］を含む。

少なくともある程度ＥＰＯ−Ｒと相互作用するペプチドが同定されており、例えば、Wrighton, et al.への米国特許第５，７７３，５６９号、同第５，８３０，８５１号及び同第５，９８６，０４７号；Wrighton, et al.への国際公開公報第９６／４０７４９号；Johnson and Zivinへの米国特許第５，７６７，０７８号及び国際公開公報第９６／４０７７２号；Baluへの国際公開公報第０１／３８３４２号；並びにSmith-Swintosky, et al.への国際公開公報第０１／９１７８０号に記載されている。特に、ペプチドモチーフを含むペプチドの群が同定されており、その成員はＥＰＯ−Ｒに結合して、ＥＰＯ依存性細胞増殖を刺激する。さらに、モチーフを含むことがこれまでに同定されたペプチドは、インビトロで、約２０ナノモル（ｎＭ）〜約２５０ｎＭのＥＣ５０値でＥＰＯ依存性細胞増殖を刺激する。したがって、ＥＰＯによって刺激される最大細胞増殖の５０％を刺激するためには２０ｎＭ〜２５０ｎＭのペプチド濃度が必要である。ＥＰＯ受容体に結合するさらなる他のペプチド及びその構築物は、すべて２００３年５月１２日出願の米国特許出願第６０／４７０，２４４号、同第６０／４７０，２４５号及び同第６０／４６９，９９３号；いずれも２００４年１１月１１日出願の米国特許出願第６０／６２７，４３２号及び同第６０／６２７，４３３号；２００４年５月１２日出願の米国特許出願第１０／８４４，９６８号で、現在の米国特許第７，０８４，２４５号、米国特許出願公開第２００７／０１０４７０４号及び同第２００８／００８１７８３号；並びにいずれも２００４年５月１２日出願で、それぞれ国際公開公報第２００４／１０１６１１号及び同第２００４／１０１６０６号として公開されている、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１４８８６号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８９号に記載されている。これらの特許出願、特許公開及び特許の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

米国特許第４，７０３，００８号 米国特許第４，６７７，１９５号 国際公開公報第９０／０８８２２号 米国特許第６，２７０，１７０号 米国特許第５，４３２，０１８号 米国特許出願第９４６，２３９号 米国特許第５，１４３，８５４号 国際公開公報第ＰＣＴ９０／１５０７０号 米国特許第５，４２４，１８６号 米国特許第５，７７３，５６９号 米国特許第５，８３０，８５１号 米国特許第５，９８６，０４７号 国際公開公報第９６／４０７４９号 米国特許第５，７６７，０７８号 国際公開公報第９６／４０７７２号 国際公開公報第０１／３８３４２号 国際公開公報第０１／９１７８０号 米国特許出願第６０／４７０，２４４号 米国特許出願第６０／４７０，２４５号 米国特許出願第６０／４６９，９９３号 米国特許出願第６０／６２７，４３２号 米国特許出願第６０／６２７，４３３号 米国特許出願第１０／８４４，９６８号で、現在の米国特許第７，０８４，２４５号 米国特許出願公開第２００７／０１０４７０４号 米国特許出願第２００８／００８１７８３号 国際公開公報第２００４／１０１６１１号として公開されている、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１４８８６号 国際公開公報第２００４／１０１６０６号として公開されている、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８９号 Graber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29.51-66 Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213 Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21 Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311 Haga, et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72:827-831 Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374 Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182 Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590 Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580 and 581-588 Lipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509 Dainiak, et al. (1983) Cancer 5: 1101-1106 Schwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272 Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78 Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076 Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694 Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562 Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486 Jones, et al. (1990) Blood 76, 31-35 Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556 Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563 Watowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140-2144 Cwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 Fodor, et al. (1991) Science 251 :767-773 Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180

ＥＰＯ−Ｒアゴニストの非常に大きな潜在的可能性にもかかわらず、特定疾患、例えば化学療法起因の貧血の治療へのそれらの適用可能性を同定する必要が現在も存在する。貧血は癌化学療法の高頻度の合併症である。そのような広いカテゴリーの中で、特定のＥＰＯ−Ｒアゴニストが化学療法起因の貧血を治療するための有望な標的となる癌のサブタイプを同定する必要性も残されている。本発明はそのような方法を提供する。

この章の中で及び本明細書全体を通じて引用される参考文献の言及及び／又は考察は、単に本発明の説明を明確にするために提供されるものであり、そのような参考文献が本発明の「先行技術」であることの承認ではない。

本発明は、乳癌、前立腺癌又は肺癌の治療の間に起こり得るような、化学療法起因の貧血の治療のためのペプチド化合物を含む新規方法を提供する。本発明の方法によって使用されるペプチド化合物は、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、及びアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）を有するペプチドモノマーのホモダイマーを含み、前記配列において各々のアミノ酸は標準的な１文字略記によって示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」は、サルコシンとしても公知のＮ−メチルグリシンである。ペプチドダイマーの各々のペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基の間に分子内ジスルフィド結合を含む。

１つの態様では、本発明は、肺癌、乳癌又は前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である患者において、エリスロポエチンの欠乏又は低赤血球集団若しくは欠陥赤血球集団（low or defective red blood cell population）によって特徴づけられる障害を治療する方法であって、（ａ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第１ペプチドモノマー；（ｂ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第２ペプチドモノマー：（ｃ）第１ペプチドモノマーを第２ペプチドモノマーに共有結合するリンカー部分；及び（ｄ）リンカー部分とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を共有結合によって連結するスペーサー部分であって、前記ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧを含むスペーサー部分、を含有する化合物の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｃ末端に（ＭｅＧ）、Ｋ又は（ＭｅＧ）Ｋを付加的に含む。もう１つの実施形態では、アミノ酸配列は（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）である。さらにもう１つの実施形態では、アミノ酸配列は（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）である。さらなる実施形態では、アミノ酸配列は（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）である。

一部の実施形態では、第１ペプチドモノマーの２個のシステイン残基はジスルフィド架橋を介して共に結合しており、第２ペプチドモノマーの２個のシステイン残基はジスルフィド架橋を介して共に結合している。

一部の実施形態では、リンカー部分はリシン残基のアミド誘導体を含む。この実施形態の変形では、リシン残基はその側鎖の窒素原子を介して共有結合している。

一部の実施形態では、リンカー部分は式：

によって定義される。

一部の実施形態では、スペーサー部分は式：

によって定義される。

一部の実施形態では、化合物は式：

又はその医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、互変異性体、アセタール、ケタール、プロドラッグ若しくは光学異性体によってさらに定義される。

例えば、化合物は、

又はその医薬的に許容される塩としてさらに定義することができ、それについての他の光学異性体を実質的に含まない。

一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は約１０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。

一部の実施形態では、障害は貧血、例えば化学療法起因の貧血である。

一部の実施形態では、患者は、膀胱、血液、骨、脳、乳房、中枢神経系、結腸、子宮内膜、食道、尿生殖路、頭部、喉頭、肝臓、肺、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、脾臓、小腸、大腸、胃又は精巣の癌を有する。

一部の実施形態では、患者は肺癌、例えば非小細胞肺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である。

一部の実施形態では、患者は前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である。

一部の実施形態では、患者は乳癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である。

一部の実施形態では、患者は霊長動物、例えばヒトである。

一部の実施形態では、本発明の方法は、治療を必要とする患者を同定することをさらに含む。

一部の実施形態では、化合物は局所的に投与される。

一部の実施形態では、化合物は全身的に投与される。

一部の実施形態では、化合物は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内経路で、皮下的に又は経口的に投与される。

一部の実施形態では、治療有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇの用量である。一部の実施形態では、治療有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０２５ｍｇ〜約０．５ｍｇの用量である。一部の実施形態では、治療有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０２５ｍｇ〜約０．２ｍｇの用量である。一部の実施形態では、治療有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０５ｍｇ〜約０．１ｍｇの用量である。

一部の実施形態では、治療有効量は１日１回の単回用量で投与される。一部の実施形態では、治療有効量は１日２回又はそれ以上の分割用量で投与される。一部の実施形態では、治療有効量は３〜４週間ごとに１回投与される。

本発明はさらに、そのようなペプチド化合物を含む医薬組成物を提供する。例えば一態様において、本発明は、肺癌、乳癌又は前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である患者においてエリスロポエチンの欠乏又は低赤血球集団若しくは欠陥赤血球集団によって特徴づけられる障害を予防する又は治療するための医薬組成物であって、
（ａ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第１ペプチドモノマー；
（ｂ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第２ペプチドモノマー：
（ｃ）第１ペプチドモノマーを第２ペプチドモノマーに共有結合するリンカー部分；及び
（ｄ）リンカー部分とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を共有結合によって連結するスペーサー部分であって、前記ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧを含む、スペーサー部分
を含む化合物を含有する医薬組成物を提供する。

ある実施形態では、ＰＥＧは約２０，０００ダルトンの分子量を有する。他の実施形態では、医薬組成物は、前記化合物のいずれか１つと医薬的に許容される担体を含有する。

前記実施形態のすべてに関して、薬剤をイオン化形態又は溶媒和形態で投与することは当分野において周知であるので、本発明は、そのようなイオン化形態及び溶媒和物が指定されているか否かにかかわらず、化合物のすべての医薬的に許容されるイオン化形態（例えば塩）及び溶媒和物（例えば水和物）を包含することが意図されていることに留意されたい。また、特定の立体化学が指定されていない限り、化合物の記述は、化合物が個別の異性体として存在するか又は異性体の混合物として存在するかとは無関係に、すべての可能な立体異性体（例えば、キラル中心の数に依存して鏡像異性体又はジアステレオマー）を包含することが意図されていることにも留意されたい。さらに、特に指定されない限り、化合物の記述は、すべての可能な共鳴形態及び互変異性体を包含することが意図されている。特許請求の範囲に関して、「式を含む化合物」、「式を有する化合物」及び「式の化合物」という言語は、特定の請求項において明確に指定されない限り、化合物及びすべての医薬的に許容されるイオン化形態と溶媒和物、すべての可能な立体異性体、並びにすべての可能な共鳴形態及び互変異性体を包含することが意図されている。

癌患者群別のペプチドＩ治療による貧血の改善。ペプチドＩによる治療後の癌群別の応答患者のパーセンテージを示す。応答は、治療の第９週までの１ｇ／ｄＬ又はそれ以上のヘモグロビン（Ｈｇｂ）濃度の上昇によって定義した（図３参照）。ＮＳＣＬＣは非小細胞肺癌である。

癌患者群別のペプチドＩの平均有効用量。用量（Ｙ軸）は、体重１ｋｇ当たりのペプチドＩのｍｇで示している。バーは、指示されている群の患者に投与した最小用量と最大用量を示す。ＮＳＣＬＣは非小細胞肺癌である。その群の各々の患者に投与した最終用量から群平均用量を算定した。

癌患者群別のペプチドＩ治療の関数としてのヘモグロビン曲線。ｇ／ｄＬで表した血中ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを４回投与の多週間にわたる試験を通じて観測した。３つのシリーズの曲線は、各々異なる種類の癌についての治療を受けている、３つの群の患者に対応する。

乳癌患者群に対するペプチドＩ治療の関数としてのヘモグロビン曲線。ｇ／ｄＬで表した血中ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを４回投与の多週間にわたる試験を通じて観測した。各々の値に誤差バーを割り当てた。

ＮＳＣＬＣ癌患者群に対するペプチドＩ治療の関数としてのヘモグロビン曲線。ｇ／ｄＬでの血中ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを４回投与の多週間にわたる試験を通じて観測した。各々の値に誤差バーを割り当てた。

前立腺癌患者群に対するペプチドＩ治療の関数としてのヘモグロビン曲線。ｇ／ｄＬで表した血中ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを４回投与の多週間にわたる試験を通じて観測した。各々の値に誤差バーを割り当てた。

定義
ペプチド中のアミノ酸残基を以下のように略記する：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦである；ロイシンはＬｅｕ又はＬである；イソロイシンはＩｌｅ又はＩである；メチオニンはＭｅｔ又はＭである；バリンはＶａｌ又はＶである；セリンはＳｅｒ又はＳである；プロリンはＰｒｏ又はＰである；トレオニンはＴｈｒ又はＴである；アラニンはＡｌａ又はＡである；チロシンはＴｙｒ又はＹである；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨである；グルタミンはＧｌｎ又はＱである；アスパラギンはＡｓｎ又はＮである；リシンはＬｙｓ又はＫである；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤである；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥである；システインはＣｙｓ又はＣである；トリプトファンはＴｒｐ又はＷである；アルギニンはＡｒｇ又はＲである；そしてグリシンはＧｌｙ又はＧである。ペプチド中の従来型でないアミノ酸は以下のように略記する：１−ナフチルアラニンは１−ｎａｌ又はＮｐである；Ｎ−メチルグリシン（サルコシンとしても公知である）はＭｅＧ又はＳｃである；そしてアセチル化グリシン（Ｎ−アセチルグリシン）はＡｃＧである。

本明細書で使用される、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミド結合を介して共に連結されたαアミノ酸であるアミノ酸モノマーのポリマーを指す。ポリペプチドは、したがって、少なくとも２アミノ酸残基の長さであり、通常はより長い。一般に、「ペプチド」という用語は、数個のアミノ酸残基の長さしかないポリペプチドを指す。本発明の新規ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドは、好ましくは約５０アミノ酸残基の長さにすぎない。それらは、より好ましくは約１７〜約４０アミノ酸残基長である。ポリペプチドは、ペプチドと異なり、どのような数のアミノ酸残基も含み得る。したがって、ポリペプチドという用語は、ペプチド並びにより長い配列のアミノ酸を包含した。

本明細書で使用される、「医薬的に許容される」という語句は、「一般的に安全とみなされる」分子実体及び組成物、例えば、生理的に耐容され、典型的にはヒトに投与されたときアレルギー反応又は同様の有害作用、例えば胃の不調、めまい感等を生じさせない分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して米国薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方にリストされていることを意味する。「担体」という用語は、化合物がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば水及び油であり得、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含む。水又は水溶液食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液が、特に注射溶液のために、担体として好ましく使用される。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。

本明細書で使用される、「アゴニスト」という用語は、その相補的で生物学的に活性な受容体に結合し、受容体を活性化して、受容体における生物学的応答を生じさせる又は受容体の既に存在する生物活性を増強する、生物学的に活性なリガンドを指す。

ＥＰＯ−Ｒアゴニストであるペプチド
本発明は、著しく高い効力と活性を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストであるペプチド化合物の新規使用を提供する。これらのペプチド化合物は、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、又はアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのホモダイマーであり、前記配列において各々のアミノ酸は標準的な１文字略記によって示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」は、サルコシンとしても公知のＮ−メチルグリシンである。ペプチドダイマーの各々のペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基の間に分子内ジスルフィド結合を含む。そのようなモノマーは、以下のように図式的に表し得る：

（配列番号１）

（配列番号２）

これらの単量体ペプチドは、高いＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーを提供するために二量体化することができる。リンカー（Ｌ_Ｋ）部分は分枝鎖状の第三級アミドであり、各々のモノマーのＣ末端リシン残基に同時結合することにより、２つのペプチドモノマーのＣ末端を架橋する。第三級アミドリンカーは、
−Ｃ^１Ｏ−ＣＨ_２−Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ^２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ^１Ｈ−であり、リンカーのＣ^１は、第１ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基とアミド結合を形成し、リンカーのＣ^２は、第２ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基とアミド結合を形成し、そしてＸのＮ^１は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合しており、ＰＥＧは約２０，０００〜約４０，０００ダルトン（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する］
と表すことができる。

第三級アミドリンカーはまた、
−Ｃ^１Ｏ−ＣＨ_２−Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ^２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ^３Ｏ−であり、リンカーのＣ^１は、第１ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基とアミド結合を形成し、そしてリンカーのＣ^２は、第２ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基とアミド結合を形成する］
と表すこともできる。本発明のペプチドダイマーは、以下の構造：
−Ｎ^１Ｈ−（ＣＨ_２）_４−Ｃ^４Ｈ−Ｎ^２Ｈ−
［式中、スペーサーのＣ^４はＸのＣ^３に共有結合しており、スペーサーのＮ^１は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合しており、そしてスペーサーのＮ^２は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合しており、ＰＥＧは約１０，０００〜約６０，０００ダルトン（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する］
のスペーサー部分をさらに含む。

したがって、本発明において使用されるペプチドはまた、カルバメート結合又はアミド結合を介してペプチドダイマーの第三級アミドリンカーに共有結合している、ＰＥＧ部分も含むことができる。ＰＥＧは医薬的に許容される水溶性ポリマーである。本発明における使用のためのＰＥＧは、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約６０Ｋ（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧであり得る。最も好ましくは、ＰＥＧは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。当業者は、所望投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、もし存在する場合は、生物活性への作用、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は抗原性の欠如、及び治療用ペプチドへのＰＥＧの他の公知の作用などの考慮事項に基づいて、所望のポリマーサイズを選択することができる。

本発明のペプチド、ペプチドダイマー及び他のペプチドベースの分子は、分子の受容体結合部分（例えばペプチド＋スペーサー）に水溶性ポリマーを連結するための様々な化学のいずれかを使用して水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）に結合することができる。典型的な実施形態は、水溶性ポリマーを受容体結合部分に共有結合するために単一連結部を使用するが、選択的実施形態では、複数の連結部も使用でき、スペーサー及び／又は一方若しくは両方のペプチド鎖への共有結合連結部を含み得る、異なる連結部において異なる種の水溶性ポリマーを受容体結合部分に結合するさらなる変形例を包含する。一部の実施形態では、ダイマー又はより高次のマルチマーは、異なる種のペプチド鎖を含む（すなわちヘテロダイマー又は他のヘテロマルチマー）。限定するわけではないが一例として、ダイマーは、ＰＥＧ連結部を有する第１ペプチド鎖を含み得、第２ペプチド鎖は、ＰＥＧ連結部を欠くか又は第１ペプチド鎖とは異なる結合化学を利用してもよく、一部の変形例では、スペーサーはＰＥＧ連結部を含み得るか又は含まなくてもよく、前記スペーサーは、ＰＥＧ化されている場合、第１及び／又は第２ペプチド鎖とは異なる結合化学を利用し得る。選択的実施形態は、受容体結合部分のスペーサー部分に連結したＰＥＧと、分子のペプチド部分のアミノ酸の１つの側鎖に結合した異なる水溶性ポリマー（例えば炭水化物）を使用する。

多種多様なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を受容体結合部分（ペプチド＋スペーサー）のＰＥＧ化のために使用し得る。実質的にいかなる適切な反応性ＰＥＧ試薬も使用できる。好ましい実施形態では、反応性ＰＥＧ試薬は、受容体結合部分への結合時にカルバメート結合又はアミド結合の形成を生じさせる。適切な反応性ＰＥＧ種は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｙｅｂｉｓｕ Ｇａｒｄｅｎ Ｐｌａｃｅ Ｔｏｗｅｒ，２０−３ Ｅｂｉｓｕ ４−ｃｈｏｍｅ，Ｓｈｉｂｕｙａ−ｋｕ，Ｔｏｋｙｏ １５０−６０１９）のＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ（２００３）及びＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（４９０ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．３５８０６）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇカタログ（２００３）において販売されているものを含むが、これらに限定されない。例えば、限定するわけではないが、以下のＰＥＧ試薬が様々な実施形態においてしばしば好ましい：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ、マルチ−Ａｒｍ ＰＥＧ、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、ｍＰＥＧ−チオエステル、ｍＰＥＧ−ダブルエステル、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ＡＣＥＴ、ヘテロ官能性ＰＥＧ（ＮＨ_２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＰＥＧアクリレート（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、ＰＥＧ−リン脂質（例えばｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、当業者によって選択される化学によって活性化されるグリセリンベースのＰＥＧのＧＬシリーズを含む、ＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズのマルチアームＰＥＧ、ＳＵＮＢＲＩＴＥ活性化ＰＥＧ（カルボキシル−ＰＥＧ、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ、トレシル−ＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、アセタール−ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧ、チオール−ＰＥＧ、マレイミド−ＰＥＧ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボン酸無水物型ＰＥＧ、官能基化ＰＥＧ−リン脂質を含むが、これらに限定されない）のいずれか、並びに特定の適用及び用途のために当業者によって選択される他の類似の及び／又は適切な反応性ＰＥＧ。

本発明の新規ペプチドはまた、カルバメート結合又はアミド結合を介してスペーサー部分に共有結合している２つのＰＥＧ部分を含むことができ、スペーサー部分はペプチドダイマーの第三級アミドリンカーに共有結合している。本発明のそのような実施形態において使用される２つのＰＥＧ部分の各々は直鎖状であり得、１つの結合点で共に連結され得る。各々のＰＥＧ部分は、好ましくは約１０キロダルトン（１０Ｋ）〜約６０Ｋ（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する。直鎖状ＰＥＧ部分が特に好ましい。より好ましくは、２つのＰＥＧ部分の各々は、約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有し、さらに一層好ましくは約２０Ｋから約４０Ｋの間の分子量を有する。さらに一層好ましくは、２つのＰＥＧ部分の各々は約２０Ｋの分子量を有する。当業者は、所望投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、もし存在する場合は、生物活性への作用、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は抗原性の欠如、及び治療用ペプチドへのＰＥＧの他の公知の作用などの考慮事項に基づいて、所望のポリマーサイズを選択することができる。

本発明はまた、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）を有するペプチドモノマーのホモダイマーであるペプチドアゴニストの方法及び製剤を含み、前記配列において各々のアミノ酸は標準的な１文字略記によって示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」は、サルコシンとしても公知のＮ−メチルグリシンである。ペプチドダイマーの各々のペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基の間に分子内ジスルフィド結合を含む。そのようなモノマーは、以下のように図式的に表し得る：

（配列番号３）

これらの単量体ペプチドは、高いＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーを提供するために二量体化される。リンカー（Ｌ_Ｋ）部分はリシン残基であり、各々のモノマーのＣ末端アミノ酸に同時結合することにより、２つのペプチドモノマーのＣ末端を架橋する。１つのペプチドモノマーはそのＣ末端でリシンのεアミノ基に結合し、２番目のペプチドモノマーはそのＣ末端でリシンのαアミノ基に結合する。例えば、ダイマーは式Ｉに示すように構造的に例示され、式ＩＩに示すように要約される：

式Ｉ

式ＩＩ
式Ｉ及び式ＩＩにおいて、Ｎ^２はリシンのεアミノ基の窒素原子を表し、Ｎ^１はリシンのαアミノ基の窒素原子を表す。

本発明のペプチドダイマーは、以下の構造：
−Ｎ^１Ｈ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ^２Ｈ−
のスペーサー部分をさらに含む。一方の末端で、スペーサーのＮ^１は、アミド結合を介してリシンリンカーのカルボニル炭素に結合している。反対側の末端で、スペーサーのＮ^２は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合しており、ＰＥＧは約１０，０００〜約６０，０００ダルトン（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する。より好ましくは、ＰＥＧは約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する。

したがって、本発明の新規ペプチドはまた、ペプチドダイマーに共有結合しているＰＥＧ部分も含む。ＰＥＧは医薬的に許容される水溶性ポリマーである。本発明における使用のためのＰＥＧは、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約６０Ｋ（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧであり得る。最も好ましくは、ＰＥＧは約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有し、さらに一層好ましくは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。当業者は、所望投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、もし存在する場合は、生物活性への作用、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は抗原性の欠如、及び治療用ペプチドへのＰＥＧの他の公知の作用などの考慮事項に基づいて、所望のポリマーサイズを選択することができる。

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ^１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ^１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ^１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ^１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

本発明において使用し得るペプチドダイマーの例は、以下を含むが、これらに限定されない：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、スペーサーのＮ^１及びＮ^２の両方がカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、スペーサーのＮ^１及びＮ^２の両方がアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサーのＮ^１及びＮ^２の両方がカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

ホモダイマーの各々のモノマーがアミノ酸配列、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサーのＮ^１及びＮ^２の両方がアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物は以下のように表し得る：

本発明に関して使用し得るペプチドダイマーの例は、以下を含むが、これらに限定されない：

スペーサーがカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物（配列番号３）は以下のように表し得る：

スペーサーがアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合している場合、本発明において使用されるペプチド化合物（配列番号３）は以下のように表し得る：

この二量体構造は、［Ａｃ−ペプチド、ジスルフィド］_２Ｌｙｓ−スペーサー−ＰＥＧ_{２０〜４０Ｋ}と書き表すことができ、Ｎ末端アセチル化ペプチドがリシンのαアミノ基とεアミノ基の両方に結合しており、各々のペプチドが分子内ジスルフィドループを含み、スペーサー分子がリシンのＣ末端とＰＥＧ部分の間で共有結合を形成しており、ＰＥＧが約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有することを示す。

本発明に関する使用のためのペプチドダイマーの例は、以下を含むが、これらに限定されない：

２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸も、本発明の化合物のための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ノルロイシン、及び他の類似のアミノ酸及びイミノ酸を含むが、これらに限定されない。他の修飾も可能であり、アミノ末端の修飾、カルボキシ末端の修飾、天然に生じる遺伝的にコードされたアミノ酸の１又はそれ以上の、非従来型アミノ酸による置換、１又はそれ以上のアミノ酸残基の側鎖の修飾、ペプチドリン酸化等を含む。

本発明のペプチド配列は、単独で又はペプチド鎖のＮ末端及び／若しくはＣ末端伸長部と共に存在し得る。そのような伸長部は、非天然に生じる配列を場合により含むか又は非天然に生じる配列を実質的に含まない、天然にコードされるペプチド配列であり得る；伸長部は、当業者の所望に応じて任意の付加、欠失、点突然変異、又は他の配列修飾若しくは組合せを含み得る。例えば、限定するわけではないが、天然に生じる配列は完全長又は部分長であり得、側鎖結合を介して炭水化物、ＰＥＧ、他のポリマー等の結合のための部位を提供するアミノ酸置換を含み得る。１つの変形例では、アミノ酸置換は、ヒト免疫系と適合性にするための配列のヒト化を生じさせる。非免疫グロブリンスペーサー配列を有するか又は有さない、本発明のＥＰＯ−Ｒ活性化配列に隣接する又は近傍の免疫グロブリン配列を含む、すべてのタイプの融合タンパク質が提供される。１つのタイプの実施形態は、重鎖及び／又は軽鎖の可変（Ｖ）領域の代わりにＥＰＯ−Ｒ活性化配列を有する免疫グロブリン鎖である。

本発明において使用されるペプチド化合物の調製
ペプチドの合成
本発明において使用されるペプチドは、当分野で公知の古典的方法によって調製され得る。これらの標準的な方法は、排除固相合成、部分固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成、及び組換えＤＮＡ技術を含む［例えば、Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85:2149参照］。

１つの実施形態では、ペプチドダイマーのペプチドモノマーを個別に合成し、合成後に二量体化する。本出願中の特定ペプチドの合成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２００７／０１０４７０４号に存在する。

もう１つの実施形態では、ダイマーのペプチドモノマーは、ペプチド合成のための開始部位として働くことができる２つの官能基と、別の分子部分（例えば固体支持体の表面上に存在し得るような）への結合を可能にする３番目の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を有する分枝鎖状の第三級アミドリンカーＬ_Ｋ部分により、それらのＣ末端を介して連結される。この場合、２つのペプチドモノマーは、固相合成法の変形例においてリンカーＬ_Ｋ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成され得る。そのような合成は、連続的であるか又は同時であり得る。

もう１つの実施形態では、２つのペプチドモノマーは、固相合成法の変形例においてリンカーＬ_Ｋ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成され得る。そのような合成は、連続的であるか又は同時であり得る。この実施形態では、ペプチド合成のための開始部位として働くことができる２つのアミノ基と、別の分子部分（例えば固体支持体の表面上に存在し得るような）への結合を可能にする３番目の官能基（例えばリシンのカルボキシル基、又はカルボキシル基がアミド部分−ＣＯＮＨ_２に変換されたリシン残基であるリシンアミドのアミノ基）を有する、リシンリンカー（Ｌ_Ｋ）部分が使用される。

リンカー上でダイマーのペプチド鎖の連続的な合成を実施する場合は、リンカー分子上の２つのアミン官能基を２つの異なる除去可能な直交アミン保護基で保護する。保護されたリンカーを、リンカーの３番目の官能基を介して固体支持体に結合する。１番目のアミン保護基を除去し、ダイマーの第１ペプチドをその１番目の脱保護されたアミン部分上で合成する。次に２番目のアミン保護基を除去し、ダイマーの第２ペプチドをその２番目の脱保護されたアミン部分上で合成する。例えば、リンカーの１番目のアミノ部分はＡｌｌｏｃで保護することができ、２番目のアミノ部分はＦｍｏｃで保護し得る。この場合、Ｆｍｏｃ基は弱塩基［例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン］での処理によって除去することができ（Ａｌｌｏｃ基は除去できない）、第１ペプチド鎖が合成される。その後Ａｌｌｏｃ基を適切な試薬［例えばＰｄ（ＰＰｈ_３）／４−メチルモルホリン及びクロロホルム］で除去することができ、第２ペプチド鎖が合成される。ジスルフィド結合の形成を制御するためにシステインについて異なるチオール保護基を使用する場合（以下で論じるように）、ダイマーのペプチド鎖の最終的なアミノ酸配列が同一である場合でもこの手法を使用しなければならないことに留意されたい。

リンカー上でダイマーのペプチド鎖の同時合成を実施する場合は、リンカー分子の２つのアミン官能基を同じ除去可能なアミン保護基で保護する。保護されたリンカーを、リンカーの３番目の官能基を介して固体支持体に結合する。この場合、リンカー分子の２つの保護された官能基を同時に脱保護し、脱保護されたアミン上で２つのペプチド鎖を同時に合成する。この手法を用いると、ダイマーのペプチド鎖の配列は同一であり、システイン残基についてのチオール保護基はすべて同じであることに留意されたい。

ペプチド合成のための好ましい方法は固相合成である。固相ペプチド合成の手順は当分野において周知である［例えば、Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General Catalog from Novabiochem Corp, San Diego, USA; Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002参照］。固相合成では、合成は、典型的にはα−アミノ保護樹脂を使用してペプチドのＣ末端から開始される。適切な出発物質は、例えば、必要とされるα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂等に結合することによって調製できる。そのようなクロロメチル化樹脂の１つは、Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）によりＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ ＳＸ−１の商標名で販売されている。ヒドロキシメチル樹脂の調製は記述されている［Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind. London 38:1597］。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は記述されており［Pietta and Marshall (1970) Chem. Commun. 650］、その塩酸塩形態がＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。例えば、α−アミノ保護アミノ酸は、Gisin (1973) Helv. Chim. Acta 56:1467によって記述された方法に従って、炭酸水素セシウム触媒を用いてクロロメチル化樹脂に結合し得る。

最初のカップリング後、α−アミノ保護基を、例えば室温で有機溶媒中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は塩酸（ＨＣｌ）溶液を用いて除去する。その後、α−アミノ保護アミノ酸を伸長中の支持体結合ペプチド鎖に連続的に結合する。α−アミノ保護基は、ペプチドの段階的合成の分野において有用であることが公知のものであり、アシル型保護基（例えばホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基［例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換Ｃｂｚ］、脂肪族ウレタン保護基［例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］、及びアルキル型保護基（例えばベンジル、トリフェニルメチル）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、並びに１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）を含む。

側鎖保護基（典型的にはエーテル、エステル、トリチル、ＰＭＣ等）は、カップリングの間無傷のままであり、アミノ末端保護基の脱保護の間又はカップリングの間に分離されない。この側鎖保護基は、最終的なペプチドの合成の完了後に、標的ペプチドを変化させない反応条件下で除去可能でなければならない。Ｔｙｒについての側鎖保護基は、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、Ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚ及び２，５−ジクロロベンジルを含む。Ａｓｐについての側鎖保護基は、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル及びシクロヘキシルを含む。Ｔｈｒ及びＳｅｒについての側鎖保護基は、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル及びＣｂｚを含む。Ａｒｇについての側鎖保護基は、ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルメシトイルスルホニル（mesitoylsulfonyl）（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）又はＢｏｃを含む。Ｌｙｓについての側鎖保護基は、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｃｂｚ）、Ｔｏｓ又はＢｏｃを含む。

α−アミノ保護基の除去後、残りの保護アミノ酸を所望の順序で段階的に結合する。各々の保護アミノ酸は、一般に、適切なカルボキシル基活性化剤、例えば溶液中の、例えば塩化メチレン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はそれらの混合物中の、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して約３倍過剰で反応させる。

所望のアミノ酸配列が完成した後、所望のペプチドを試薬、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はフッ化水素（ＨＦ）で処理することによって樹脂支持体から脱結合するが、この処理は、樹脂からペプチドを切断するだけでなく、残りのすべての側鎖保護基も切断する。クロロメチル化樹脂を使用する場合、フッ化水素処理は遊離ペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用する場合、フッ化水素処理は直接遊離ペプチドアミドを生じさせる。あるいは、クロロメチル化樹脂を使用する場合、側鎖保護ペプチドは、ペプチド樹脂をアンモニアで処理することによって脱結合し、所望の側鎖保護アミドを生成することができるか、又はアルキルアミンで処理することによって脱結合し、側鎖保護アルキルアミド又はジアルキルアミドを生成することができる。その後、フッ化水素で処理することによって通常の方法で側鎖保護を除去し、遊離アミド、アルキルアミド又はジアルキルアミドを生成する。

本発明のエステルを調製する場合、ペプチド酸を調製するために用いられる樹脂を使用し、側鎖保護ペプチドを塩基と適切なアルコール（例えばメタノール）で切断する。その後、フッ化水素で処理することによって通常の方法で側鎖保護基を除去し、所望のエステルを得る。

これらの手順はまた、２０個の天然に生じる遺伝的にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸が、本発明の化合物のいずれかの１、２又はそれ以上の位置で置換されているペプチドを合成するために使用できる。本発明のペプチドに置換され得る合成アミノ酸は、Ｎ−メチル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、δアミノ酸、例えばＬ−δ−ヒドロキシリシル及びＤ−δ−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、及びイソキノリルを含むが、これらに限定されない。Ｄ−アミノ酸及び非天然に生じる合成アミノ酸も、本発明において使用されるペプチドに組み込むことができる。

本発明の他の化合物を生成するために本発明のペプチド化合物のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を修飾することもできる。例えば、アミノ末端を酢酸又はそのハロゲン化誘導体、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸又はα−ヨード酢酸でアセチル化し得る。

２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸（又は立体異性Ｄ−アミノ酸）の天然に生じる側鎖を他の側鎖で、例えばアルキル、低級アルキル、環状４員、５員、６員から７員のアルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ及びそれらの低級エステル誘導体などの基で、並びに４員、５員、６員から７員の複素環で置換することができる。特に、プロリン残基の環サイズが５員から４員、６員又は７員に変化しているプロリン類似体が使用できる。環式基は飽和であっても又は不飽和であってもよく、不飽和である場合は、芳香族であっても又は非芳香族であってもよい。複素環式基は、好ましくは１又はそれ以上の窒素、酸素及び／又は硫黄ヘテロ原子を含む。そのような基の例は、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（例えばモルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えばチオモルホリノ）及びトリアゾリルを含む。これらの複素環式基は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい。基が置換されている場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、又は置換若しくは非置換フェニルであり得る。

また、リン酸化及び他の方法［例えばHruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262に記載されているように］によってもペプチドを容易に修飾することができる。

本発明のペプチド化合物はまた、類似の生物活性を有する非ペプチド化合物についての構造モデルとして役立つ。当業者は、リードペプチド化合物と同じか又は類似の所望の生物活性を有するが、溶解度、安定性、並びに加水分解及びタンパク質分解に対する感受性に関してリードペプチド化合物よりも好ましい活性を有する化合物を構築するために、様々な手法が利用可能であることを認識する［Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252参照］。これらの手法は、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、第二級アミン及びＮ−メチルアミノ酸から構成される骨格でペプチド骨格を置換することを含む。

ジスルフィド結合の形成
本発明において使用される化合物は、２つの分子内ジスルフィド結合を含む。そのようなジスルフィド結合は、各々のペプチドモノマーのシステイン残基の酸化によって形成され得る。

１つの実施形態では、システイン結合形成の制御は、所望の異性体の形成を最適化するために有効な種類及び濃度の酸化剤を選択することによって行われる。例えば、２つの分子内ジスルフィド結合（各々のペプチド鎖上に１つ）を形成するためのペプチドダイマーの酸化は、酸化剤がＤＭＳＯ又はヨウ素（Ｉ_２）である場合優先的に（分子間ジスルフィド結合の形成に比べて）達成される。

他の実施形態では、システイン結合の形成は、ペプチド合成の間にチオール保護基を選択的に使用することによって制御される。例えば、２つの分子内ジスルフィド結合を有するダイマーを所望する場合、第１モノマーペプチド鎖を、１番目チオール保護基［例えばトリチル（Ｔｒｔ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）等］で保護されたコア配列の２個のシステイン残基を有するように合成し、次に、第２モノマーペプチドを、１番目のチオール保護基とは異なる２番目のチオール保護基［例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）等］で保護されたコア配列の２個のシステイン残基を有するように合成する。その後、１番目のチオール保護基を除去して第１モノマーのビスルフィド環化（bisulfide cyclization）を生じさせ、次に２番目のチオール保護基を除去して第２モノマーのビスルフィド環化を生じさせる。

本発明の他の実施形態は、硫黄の１個がＣＨ_２基又は硫黄の他の同配体によって置換された、これらのジスルフィド誘導体の類似体を提供する。これらの類似体は、各々のペプチドモノマーが２番目のＣ残基の代わりに少なくとも１つのＣ又はホモシステイン残基及びα−アミノ−γ−酪酸を含む本発明の化合物から、分子内置換又は分子間置換を介して、当分野で公知の方法［例えば、Barker, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:2040-2048 and Or, et al. (1991) J. Org. Chem. 56:3146-3149参照］を用いて調製することができる。当業者は、この置換がα−アミノ−γ−酪酸及びホモシステインの他のホモログを使用しても起こり得ることを容易に理解する。

前記環化方法に加えて、他の非ジスルフィドペプチド環化方法も使用できる。そのような選択的環化方法は、例えば、アミド環化法並びにチオエーテル結合の形成を含む方法を包含する。したがって、本発明の化合物は、分子内アミド結合又は分子内チオエーテル結合のいずれかを有する環化形態で存在し得る。例えば、コア配列の１個のシステインがリシンで置換され、２番目のシステインがグルタミン酸で置換されているペプチドを合成し得る。その後、これら２つの残基の側鎖の間のアミド結合を介して環状モノマーを形成し得る。あるいは、コア配列の１個のシステインがリシン（又はセリン）で置換されているペプチドを合成し得る。次に、リシン（又はセリン）残基の側鎖とコア配列の２番目のシステイン残基の間のチオエーテル結合を介して環状モノマーを形成し得る。従って、ジスルフィド環化法に加えて、アミド環化法及びチオエーテル環化方法は、どちらも本発明の化合物を環化するために容易に使用できる。あるいは、ペプチドのアミノ末端をα置換酢酸でキャップすることができ、この場合α置換基は脱離基、例えばα−ハロ酢酸、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸又はα−ヨード酢酸である。

分枝鎖状第三級アミドリンカーの付加
ペプチドモノマーは、分枝鎖状の第三級アミドリンカー部分によって二量体化され得る。１つの実施形態では、ペプチド合成の間にリンカーをペプチドに組み込む。例えば、リンカーＬ_Ｋ部分が、ペプチド合成のための開始部位として働くことができる２つの官能基と、１又はそれ以上の他の分子部分への結合を可能にする１又はそれ以上の他の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を含む場合、リンカーを固体支持体に結合し得る。その後、２つのペプチドモノマーを、固相合成法の変形例においてリンカーＬ_Ｋ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成し得る。

選択的実施形態では、ペプチド合成後にリンカーをペプチドダイマーの２つのペプチドモノマーに結合し得る。そのような結合は、当分野で広く確立されている方法によって達成され得る。１つの実施形態では、リンカーは、合成ペプチドモノマーの標的官能基への結合に適した２つの官能基を含む。例えば、あらかじめ活性化されているか又は適切なカップリング試薬の存在下にある、２個のカルボキシル基を含むリンカーを、２つのペプチドモノマーの各々の標的リシン側鎖のアミン基と反応させ得る。

例えば、ペプチドモノマーは、第三級アミドリンカー：
Ａ^＊−Ｃ^１Ｏ−ＣＨ_２−Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ^２Ｏ−Ｂ^＊
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｙであり、Ｙは適切な保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基であり、Ａ^＊は、リンカーのＣ^１を第１ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基に結合するために使用される、適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドであり、そしてＢ^＊は、リンカーのＣ^２を第２ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基に結合するために使用される、適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドである］
に化学的にカップリングし得る。

加えて、例えば、ペプチドモノマーは、第三級アミドリンカー：
Ａ^＊−Ｃ^１Ｏ−ＣＨ_２−Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ^２Ｏ−Ｂ^＊
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ^３Ｏ−であり、Ａ^＊は、リンカーのＣ^１を第１ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基に結合するために使用される、適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドであり、そしてＢ^＊は、リンカーのＣ^２を第２ペプチドモノマーのＣ末端リシン残基のεアミノ基に結合するために使用される、適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドである］に化学的にカップリングすることができ、そして第三級アミドリンカーは、スペーサー部分、Ｙ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｃ^４Ｈ−ＮＨ−Ｙ［式中、ＸのＣ^３はスペーサーのＣ^４に共有結合しており、Ｙは適切な保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基である］に化学的に結合される。

ペプチドモノマーは、リシンリンカーＬ_Ｋ部分によって二量体化され得る。１つの実施形態では、ペプチド合成の間にリシンリンカーをペプチドに組み込む。例えば、リシンリンカーＬ_Ｋ部分が、ペプチド合成のための開始部位として働くことができる２つの官能基と、別の分子部分への結合を可能にする３番目の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を含む場合、リンカーを固体支持体に結合し得る。その後、２つのペプチドモノマーを、固相合成法の変形例においてリシンリンカーＬ_Ｋ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成し得る。

ペプチドダイマーがリシンリンカーＬ_Ｋ部分によって二量体化される選択的実施形態では、ペプチド合成後に前記リンカーをペプチドダイマーの２つのペプチドモノマーに結合し得る。そのような結合は、当分野で広く確立されている方法によって達成され得る。１つの実施形態では、リンカーは、合成ペプチドモノマーの標的官能基への結合に適した少なくとも２つの官能基を含む。例えば、リシンの２個の遊離アミン基を、２つのペプチドモノマーの各々のＣ末端カルボキシル基と反応させ得る。

スペーサーの付加
本発明において使用されるペプチド化合物は、スペーサー部分をさらに含む。１つの実施形態では、ペプチド合成の間にスペーサーをペプチドに組み込み得る。例えば、スペーサーが、遊離アミノ基と、別の分子部分への結合を可能にする２番目の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を含む場合、スペーサーを固体支持体に結合し得る。

１つの実施形態では、２つの官能基を含むスペーサーを、最初に１番目の官能基を介して固体支持体に結合する。次に、ペプチド合成のための開始部位として働くことができる２つの官能基と、別の分子部分への結合を可能にする３番目の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を有するリシンリンカーＬ_Ｋ部分を、スペーサーの２番目の官能基とリンカーの３番目の官能基を介してスペーサーに結合する。その後、２つのペプチドモノマーを、固相合成法の変形例においてリンカーＬ_Ｋ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成し得る。例えば、遊離アミン基を有する、固体支持体に結合したスペーサーを、リンカーの遊離カルボキシル基を介してリシンリンカーと反応させ得る。

選択的実施形態では、ペプチド合成後にスペーサーをペプチドダイマーに結合し得る。そのような結合は、当分野で広く確立されている方法によって達成され得る。１つの実施形態では、リンカーは、合成ペプチドの標的官能基への結合に適した少なくとも１つの官能基を含む。例えば、遊離アミン基を有するスペーサーをペプチドのＣ末端カルボキシル基と反応させ得る。もう１つの例では、遊離カルボキシル基を有するリンカーをリシンアミドの遊離アミン基と反応させ得る。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の連結
近年、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、治療上及び診断上重要なペプチドの共有結合修飾のために使用されてきた。そのようなポリマーの連結は、生物活性を増強し、血液循環時間を延長し、免疫原性を低下させ、水溶解度を高め、プロテアーゼ消化に対する抵抗性を高めると考えられる。例えば、治療用ポリペプチド、例えばインターロイキン（Knauf, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263;15064; Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Release 33:447)、インターフェロン(Kita, et al. (1990) Drug Des. Delivery 6:157)、カタラーゼ(Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:582)、スーパーオキシドジスムターゼ(Beauchamp, et al. (1983) Anal. Biochem. 131:25)、及びアデノシンデアミナーゼ(Chen, et al. (1981) Biochim. Biophy. Acta 660:293)へのＰＥＧの共有結合連結は、インビボでそれらの半減期を延長させる及び／又は免疫原性と抗原性を低下させることが報告されている。

本発明のペプチド化合物は、カルバメート結合又はアミド結合を介してペプチドダイマーの分枝鎖状第三級アミドリンカー又はスペーサーに共有結合連結された、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。本発明において使用されるＰＥＧの一例は、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約４０Ｋ（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧである。好ましくは、ＰＥＧは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。

本発明において使用されるＰＥＧのもう１つの例は、約１０Ｋ〜約６０Ｋ（「約」という用語は、ＰＥＧの製剤中、一部の分子は言及されている分子量よりも重く、別の一部の分子はより軽いことを示す）の分子量を有する直鎖状ＰＥＧである。好ましくは、ＰＥＧは約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。より好ましくは、ＰＥＧは約２０Ｋの分子量を有する。

ＰＥＧの共有結合連結（ＰＥＧ化）のための方法の例を以下で述べる。これらの説明的記述は限定を意図しない。当業者は、広範囲のＰＥＧの共有結合連結のための様々な方法が当分野において広く確立されていることを理解する。従って、ＰＥＧが当分野で公知の多くの結合方法のいずれかによって連結されたペプチド化合物は本発明に包含される。

例えば、ＰＥＧは、活性化ＰＥＧ分子を結合し得る反応性基（例えば遊離アミノ基又はカルボキシル基）を介してリンカーに共有結合し得る。ＰＥＧ分子は、異なる反応性部分を有するメトキシル化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を使用してアミノ基に連結し得る。そのようなポリマーは、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデート、ｍＰＥＧ−４−ニトロフェニルカーボネート及びｍＰＥＧ−塩化シアヌルを含む。同様に、ＰＥＧ分子は、遊離アミン基を有するメトキシル化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＮＨ_２）を使用してカルボキシル基に連結し得る。

一部の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、末端アミノ基（すなわちスペーサーの末端に位置する）を含む。この末端アミノ基を、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えばｍＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）と反応させて、安定な共有結合カルバメート結合を作製し得る。あるいは、この末端アミノ基を適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えば反応性Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ＮＨＳ）基を含むｍＰＥＧ−スクシンイミジルブチレート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）又はｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）と反応させて、安定な共有結合カルバメート結合を作製し得る。他の実施形態では、リンカー反応性基は、適切な反応条件下で活性化されてアミン含有ＰＥＧ分子と共有結合を形成することができるカルボキシル基を含む。適切なＰＥＧ分子はｍＰＥＧ−ＮＨ_２を含み、適切な反応条件はカルボジイミド媒介性アミド形成等を含む。

ＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性アッセイ：
インビトロ機能アッセイ
インビトロでの競合結合アッセイは、ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯと競合する試験ペプチドの能力を定量する。例えば（例えば米国特許第５，７７３，５６９号に記載されているように）、ヒトＥＰＯ−Ｒの細胞外ドメイン（ＥＰＯ結合タンパク質、ＥＢＰ）を大腸菌において組換え生産し、組換えタンパク質を固体支持体、例えばマイクロタイターディッシュ又は合成ビーズ［例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのＳｕｌｆｏｌｉｎｋビーズ］に結合し得る。固定化ＥＢＰを、次に、標識組換えＥＰＯと共に、又は標識組換えＥＰＯ及び試験ペプチドと共にインキュベートする。試験ペプチドの段階希釈液をそのような実験のために使用する。試験ペプチドを添加していないアッセイポイントは、ＥＢＰへの総ＥＰＯ結合を規定する。試験ペプチドを含む反応については、結合ＥＰＯの量を定量し、対照（総計＝１００％）結合のパーセンテージとして表す。これらの値をペプチド濃度に対してプロットする。ＩＣ５０値は、ＥＢＰへのＥＰＯの結合を５０％低下させる試験ペプチドの濃度（すなわちＥＰＯ結合の５０％阻害）と定義される。

異なるインビトロ競合結合アッセイは、２つのビーズ：ＥＰＯ結合ビーズ及びＥＰＯ−Ｒ結合ビーズの近接性に応じて生成される光シグナルを測定する。ビーズの近接性は、ＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯと競合する試験ペプチドはこの結合を妨げ、光放出の減少を生じさせる。光放出を５０％減少させる試験ペプチドの濃度をＩＣ５０値として定義する。

本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯと非常に効率良く競合する。この高い機能は、ペプチドの実質的により低い濃度でＥＰＯの結合を阻害するそれらの能力によって示される（すなわちそれらは非常に低いＩＣ５０値を有する）。

ＥＰＯ受容体に特異的に結合する、本発明の単量体及び二量体ペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストの生物活性及び効力は、インビトロでの細胞ベースの機能アッセイを使用して測定し得る。

１つのアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現し、ｆｏｓプロモーターが駆動するルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物でさらにトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞株に基づく。ＥＰＯ又は別のＥＰＯ−Ｒアゴニストに曝露すると、そのような細胞はルシフェラーゼを合成することによって応答する。ルシフェラーゼは、その基質であるルシフェリンを添加すると光の放出を生じさせる。したがって、そのような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定を介して定量し得る。試験ペプチドの段階希釈液を細胞に添加し、次にそれを４時間インキュベートすることによって試験ペプチドの活性を測定する。インキュベーション後、ルシフェリン基質を細胞に添加し、光放出を測定する。光の半最大放出を生じさせる試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。

本発明のペプチドは、このアッセイにおいてＥＰＯ−Ｒのシグナル伝達依存性ルシフェラーゼ発現を促進する著しく高い能力を示す。この高い機能は、ペプチドの実質的により低い濃度で半最大ルシフェラーゼ活性を生じさせるそれらの能力によって示される（すなわちそれらは非常に低いＥＣ５０値を有する）。このアッセイは、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの効力と活性を評価するための好ましい方法である。

もう１つのアッセイは、ＥＰＯ−Ｒが安定にトランスフェクトされた、十分に特徴づけられた非形質転換マウス骨髄由来細胞系である、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞を使用して実施し得る[Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152: 1036-1047] 。これらの細胞はＥＰＯ依存性増殖を示す。

そのようなアッセイの１つでは、必要な増殖因子の存在下で細胞を半定常密度まで増殖させる（例えば米国特許第５，７７３，５６９号に記載されているように）。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、増殖因子を含まない完全培地中で１６〜２４時間飢餓状態にする。細胞の生存率を測定した後（例えばトリパンブルー染色によって）、約１０^５細胞／５０μＬになるように保存溶液（増殖因子を含まない完全培地中）を作製する。試験するペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニスト化合物（典型的には、ファージ結合若しくは他の結合ペプチド又は固定化ペプチドと異なり、遊離の液相ペプチド）の連続希釈液を、９６穴組織培養プレートにおいて５０μＬ／ウエルの最終容量で作製する。細胞（５０μＬ）を各ウエルに添加し、細胞を２４〜４８時間インキュベートして、その時点で陰性対照は死滅するか又は静止状態になるはずである。その後、当分野で公知の手法、例えば細胞増殖の指標としてＨ^３−チミジンの取込みを測定するＭＴＴアッセイ［Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55-63参照］によって細胞増殖を測定する。ペプチドを、ＥＰＯ−Ｒ発現細胞株と親非発現細胞株の両方に関して評価する。半最大細胞増殖を生じさせるのに必要な試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。

本発明のペプチドは、このアッセイにおいてＥＰＯ依存性細胞増殖を促進する著しく高い能力を示す。この高い機能は、ペプチドの実質的により低い濃度で半最大細胞増殖刺激活性を生じさせるそれらの能力によって示される（すなわちそれらは非常に低いＥＣ５０値を有する）。このアッセイは、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの効力と活性を評価するための好ましい方法である。

もう１つのアッセイでは、細胞をＥＰＯ添加培地において定常期まで増殖させ、収集して、その後ＥＰＯを含まない培地でさらに１８時間培養する。細胞を等しい細胞密度の３つの群：添加因子を含まない群（陰性対照）、ＥＰＯを含む群（陽性対照）及び試験ペプチドを含む実験群に分ける。次に、培養細胞を様々な時点で収集し、固定して、ＤＮＡ結合蛍光染料（例えば、いずれもＳｉｇｍａより入手可能なヨウ化プロピジウム又はＨｏｅｃｈｓｔ染料）で染色する。次に、例えばＦＡＣＳ Ｓｃａｎ Ｆｌｏｗサイトメーターを使用して蛍光を測定する。細胞周期の各々の期にある細胞の割合を、その後、例えばＣｅｌｌＦＩＴソフトウェアのＳＯＢＲモデル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定し得る。ＥＰＯ又は活性ペプチドで処理した細胞は、陰性対照群と比較してＳ期の細胞の割合がより大きいことを示す（ＤＮＡ含有量増加の指標としての蛍光上昇によって測定される）。

同様のアッセイを、ＦＤＣＰ−１細胞株［例えばDexter et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047参照］又はＴＦ−１細胞株［Kitamura, et al. (1989) Blood 73:375-380］を使用して実施し得る。ＦＤＣＰ−１は、ＷＥＨＩ−３ならし培地（ＩＬ−３を含有する培地、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を添加したとき、増殖することはできるが分化することはできない、増殖因子依存性マウス多能性始原造血前駆細胞株である。そのような実験のために、ＦＤＣＰ−１細胞株をヒト又はマウスＥＰＯ−Ｒでトランスフェクトし、それぞれ、ＥＰＯの存在下で増殖することはできるが分化することはできないＦＤＣＰ−１−ｈＥＰＯ−Ｒ細胞株又はＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ−Ｒ細胞株を生成する。ＥＰＯ依存性細胞株であるＴＦ−１は、細胞増殖へのペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストの作用を測定するためにも使用し得る。

さらにもう１つのアッセイでは、脾細胞へのＨ^３−チミジン取込みに基づくマイクロアッセイに関してKrystal (1983) Exp. Hematol 11:649-660に述べられている手順を使用して、ＥＰＯアゴニストとして働く本発明の化合物の能力を確認し得る。簡単に述べると、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１マウスにフェニルヒドラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）を２日間毎日注射する。３日目に脾細胞を取り出し、２４時間にわたって増殖するそれらの能力を、ＭＴＴアッセイを用いて確認する。

エリスロポエチン応答性細胞株におけるＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合は、受容体と、Ｓｈｃ、ｖａｖ及びＪＡＫ２キナーゼを含む多くの細胞内タンパク質の両方のチロシンリン酸化を誘導する。したがって、もう１つのインビトロアッセイは、本発明のペプチドがＥＰＯ−Ｒ及び下流の細胞内シグナルトランスデューサータンパク質のチロシンリン酸化を誘導する能力を測定する。前述した結合アッセイ及び増殖アッセイによって同定される活性ペプチドは、エリスロポエチン応答性細胞においてＥＰＯとほぼ同一のリン酸化パターンを惹起する。このアッセイのために、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞［Dexter, et al. (1980) J Exp Med 152:1036-47］をＥＰＯ添加培地で維持し、定常期まで増殖させる。次にこれらの細胞を、ＥＰＯを含まない培地で２４時間培養する。その後、規定された数のそのような細胞を試験ペプチドと共に３７℃で約１０分間インキュベートする。ＥＰＯを含む細胞の対照試料も各々のアッセイに供する。次に、処理した細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ溶解緩衝液に再懸濁して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。ゲル中の電気泳動したタンパク質をニトロセルロースに移し、ブロット上のホスホチロシン含有タンパク質を標準的な免疫学的手法によって視覚化する。例えば、ブロットを抗ホスホチロシン抗体（例えばＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．からのマウス抗ホスホチロシンＩｇＧ）でプローブし、洗浄して、次に二次抗体［例えばＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）からのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ］でプローブし得る。その後、ホスホチロシン含有タンパク質を、比色アッセイ、化学発光アッセイ又は蛍光アッセイを含む標準的な手法によって視覚化し得る。例えば、化学発光アッセイは、ＡｍｅｒｓｈａｍからのＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施し得る。

本発明のペプチドの活性を評価するために使用し得るもう１つの細胞ベースのインビトロアッセイは、マウス骨髄細胞又はヒト末梢血細胞を使用するコロニーアッセイである。マウス骨髄はマウスの大腿骨から入手でき、ヒト末梢血の試料は健常ドナーから入手し得る。末梢血の場合は、単核細胞を、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）］での遠心分離によって、最初に血液から単離する。このアッセイのために、有核細胞計数を実施してもとの試料中の有核細胞の数及び濃度を確認する。規定された数の細胞を製造者の指示に従って［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）］メチルセルロース上に塗布する。実験群は試験ペプチドで処理し、陽性対照群はＥＰＯで処理し、陰性対照群は処理を行わない。規定された期間、一般には１０日間と１８日間のインキュベーション後に、各々の群についての増殖コロニーの数を記録する。活性ペプチドはコロニー形成を促進する。

本発明の化合物の活性を明らかにするために使用できる他のインビトロ生物学的アッセイは、Greenberger, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935（ＥＰＯ依存性造血前駆細胞株）；Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614（Ｂ６ＳＵｔ．ＥＰ細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化）；Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678（ヒトＥＰＯ応答性細胞におけるＥＰＯ受容体のチロシンリン酸化）；Quelle, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060（ＦＤＣ−ＥＲ細胞におけるサイトゾルタンパク質、ｐｐ１００のチロシンリン酸化）；Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92（ヘモグロビンについての比色アッセイ）；Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120（２，７−ジアミノフルオレンによるヘモグロビンの検出）；Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302（ｃ−ｍｙｂの発現）；Witthuhn, et al. (1993) Cell 74:227-236（ＪＡＫ２の結合及びチロシンリン酸化）；Leonard, et al. (1993) Blood 82:1071-1079（ＧＡＴＡ転写因子の発現）；並びにAndo, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575（サイクリングＤ２及びＤ３によるＧ₁移行の調節）に開示されている。

マイクロフィジオメーターとして公知の、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．によって設計された装置は、様々な受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストの作用を測定するために成功裏に使用されることが報告されている。この装置についての原理は、受容体活性化に応答した細胞外培地の酸性化速度の変化の測定である。

インビボ機能アッセイ
試験ペプチドの効力を評価するために使用し得る１つのインビボ機能アッセイは、赤血球増加性過低酸素症（exhypoxic）マウスのバイオアッセイである。このアッセイのために、マウスを数日間交互の条件づけサイクルに供する。このサイクルでは、マウスを低圧状態の期間と雰囲気圧状態の期間に交互に供する。その後、マウスを２〜３日間雰囲気圧に維持した後、試験試料を投与する。試験ペプチド試料、又は陽性対照マウスの場合はＥＰＯ標準品を、条件づけしたマウスに皮下注射する。放射性標識鉄（例えば^５９Ｆｅ）を２日後に投与し、放射性標識鉄の投与の２日後に血液試料を採取する。次に、標準的手法によってヘマトクリット及び放射能の測定を各々の血液試料について実施する。活性試験ペプチドを注射したマウスからの血液試料は、試験ペプチド又はＥＰＯを摂取しなかったマウスよりも高い放射能を示す（赤血球ヘモグロビンによるＦｅ^５９の結合に起因する）。

試験ペプチドの効力を評価するために使用し得るもう１つのインビボ機能アッセイは、網状赤血球アッセイである。このアッセイのために、正常未処置マウスにＥＰＯ又は試験ペプチドのいずれかを３日間連続して皮下注射する。３日目に、前記マウスに鉄デキストランも腹腔内注射する。５日目に、マウスから血液試料を採集する。血液中の網状赤血球のパーセント（％）をチアゾールオレンジ染色及びフローサイトメーター分析（ｒｅｔｉｃ−ｃｏｕｎｔプログラム）によって決定する。加えて、ヘマトクリットを手操作で測定する。補正した網状赤血球のパーセントを、以下の式を用いて決定する：
％ＲＥＴＩＣ_補正＝％ ＲＥＴＩＣ_観測 ×（ヘマトクリット_個体／ヘマトクリット_正常）。
活性試験化合物は、試験ペプチド又はＥＰＯを摂取しなかったマウスと比較して％ＲＥＴＩＣ_補正レベルの上昇を示す。

医薬組成物
本発明のさらにもう１つの態様では、前記ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド化合物の医薬組成物が提供される。そのような組成物の投与によって緩和される又は調節される状態は、前記に示した状態を含む。そのような医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮（受動的に又はイオン導入法若しくは電気穿孔法を使用して）、経粘膜（鼻、膣、直腸又は舌下）投与経路による投与又は生体内分解性挿入物を使用した投与用であり得、各々の投与経路に適した投与形態に製剤することができる。一般に、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド又は誘導体生成物の有効量を、医薬的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に含有する医薬組成物は、本発明に包含される。そのような組成物は、様々な緩衝剤含有量（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ強度及びイオン強度の希釈剤；添加物、例えば界面活性剤及び可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えばラクトース、マンニトール）；ポリマー化合物の微粒子製剤、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸等又はリポソームへの物質の組込みを含む。ヒアルロン酸も使用し得る。そのような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出の速度、及びインビボでのクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712参照。組成物は、液体形態で調製され得るか、又は乾燥粉末（例えば凍結乾燥）形態であり得る。

注射剤、溶液及び乳剤
本発明はまた、一般に皮下、筋肉内又は静脈内注射によって特徴づけられる、非経口投与によって本発明の化合物を投与するために設計された組成物を対象とする。注射剤は、任意の従来の形態で、例えば液体溶液若しくは懸濁液として、注射の前に液体に溶解する若しくは懸濁するのに適した固体形態として、又は乳剤として調製され得る。

本発明において注射剤と共に使用し得る賦形剤の例は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール又はエタノールを含むが、これらに限定されない。注射剤組成物はまた、場合により少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、及び他のそのような作用物質、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン及びシクロデキストリンを含み得る。一定なレベルの用量が維持されるように、徐放システム又は持続放出システムの移植も（例えば米国特許第３，７１０，７９５号参照）、本明細書において考慮される。そのような非経口組成物に含有される活性化合物の割合は、その特定の性質、並びに化合物の活性及び被験者に必要性に大きく依存する。

製剤の非経口投与は、静脈内、皮下及び筋肉内投与を含む。非経口投与のための製剤は、注射用滅菌溶液、皮下用錠剤を含む、使用の直前に溶媒と組み合わせることができる滅菌乾燥可溶性製品、例えば本明細書で述べる凍結乾燥粉末、注射用滅菌懸濁液、使用の直前にビヒクルと組み合わせることができる滅菌乾燥不溶性製品、及び滅菌乳剤を含む。溶液は水性又は非水性のいずれでもよい。

静脈内投与する場合、適切な担体の例は、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、並びに増粘剤及び可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール及びそれらの混合物を含有する溶液を含むが、これらに限定されない。

非経口製剤において場合により使用し得る医薬的に許容される担体の例は、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁化剤及び分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤又はキレート化剤、並びに他の医薬的に許容される物質を含むが、これらに限定されない。

場合により使用し得る水性ビヒクルの例は、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及び乳酸加リンガー注射液を含む。

場合により使用し得る非水性非経口ビヒクルの例は、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油及び落花生油を含む。

特に製剤が多回投与用容器に包装されており、したがって保存されて、複数のアリコートを取り出すように設計されている場合は、静菌濃度又は静真菌濃度の抗菌剤を非経口製剤に添加し得る。使用し得る抗菌剤の例は、フェノール又はクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む。

使用し得る等張化剤の例は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。使用し得る緩衝液の例は、リン酸塩及びクエン酸塩を含む。使用し得る抗酸化剤の例は、重硫酸ナトリウムを含む。使用し得る局所麻酔薬の例は、プロカイン塩酸塩を含む。使用し得る懸濁化剤及び分散剤の例は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドンを含む。使用し得る乳化剤の例は、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（ＴＷＥＥＮ ８０）を含む。金属イオンの封鎖剤又はキレート化剤の例は、ＥＤＴＡを含む。

医薬担体はまた、場合により、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール、並びにｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸又は乳酸を包含し得る。

非経口製剤中の阻害剤の濃度は、注射が所望の薬理作用を生じさせるのに十分な医薬的有効量を投与するように調整され得る。阻害剤の正確な濃度及び／又は使用される用量は、当分野で公知のように最終的には患者又は動物の年齢、体重及び状態に依存する。

単位投与非経口製剤は、アンプル、バイアル又は針付き注射器に包装され得る。非経口投与のためのすべての製剤は、当分野において公知であり、実践されているように、無菌でなければならない。

注射剤は、局所及び全身投与用に設計され得る。典型的には、治療有効用量は、治療される組織に対して少なくとも約０．１重量％〜約９０重量％又はそれ以上、例えば１重量％を超える濃度のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド化合物を含むように製剤される。阻害剤は、一度に投与され得るか、又は時間間隔を置いて投与される複数のより小用量に分割され得る。正確な用量及び治療の期間は、組成物が非経口的に投与される場所、担体、及び公知の試験プロトコールを用いて又はインビボ若しくはインビトロ試験データからの推定によって経験的に決定され得る他の変数の関数であることが了解される。濃度及び用量の値はまた、治療される個体の年齢によっても異なることに留意すべきである。任意の特定被験者に関して、特定投与レジメンは、個体の必要性、及び製剤を投与する又は製剤の投与を監督する人物の専門的判断に従って経時的に調整される必要があり得ることがさらに了解されるべきである。したがって、本明細書で示す濃度範囲は例示であることが意図されており、特許請求される製剤の範囲又は実施を限定することは意図されない。

ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド化合物は、場合により、より可溶性の活性生成物を生じるように又はプロドラッグを生じるように、微粉化形態又は他の適切な形態で懸濁され得るか又は誘導体化され得る。生じる混合物の形態は、意図される投与形式及び選択担体又はビヒクルへの化合物の溶解度を含む多くの因子に依存する。有効濃度は、疾患状態の症状を改善するために十分であり、経験的に決定され得る。

経口送達
参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) at Chapter 89に一般的に述べられている経口固体投与形態は、本明細書における使用のために考慮される。固体投与形態は、錠剤、カプセル、丸剤、トローチ若しくはロゼンジ、カシェ剤、ペレット、散剤、又は顆粒剤を含む。また、本発明の組成物を製剤するためにリポソーム又はプロテイノイドのカプセル化を使用し得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソームカプセル化が使用でき、リポソームは様々なポリマーで誘導体化され得る（例えば米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬のための可能な固体投与形態の説明は、参照により本明細書に組み込まれる、Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10, 1979に記載されている。一般に、製剤は、ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又はその化学修飾形態）及び胃環境からの保護と腸における生物活性物質の放出を可能にする不活性成分を含む。

また、医薬的に許容される乳剤、溶液、懸濁液及びシロップを含む、経口投与のための液体投与形態も本明細書における使用のために考慮され、それらは、不活性希釈剤、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、並びに甘味料、香味料及び香料を含む、他の成分を含有し得る。

ペプチドは、誘導体の経口送達が有効であるように化学修飾され得る。一般に、考慮される化学修飾は、成分分子自体への少なくとも１つの部分の結合であり、前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸からの血流への取込みを可能にする。また、成分の全体的な安定性の上昇及び体内での循環時間の延長も望ましい。前記で論じたように、ＰＥＧ化は医薬用途のための好ましい化学修飾である。使用し得る他の部分は、以下を含む：プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカン［例えば、Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," in Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, N. Y.) pp. 367-383; and Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4: 185-189参照］。

経口製剤に関して、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸若しくは回腸）又は大腸であり得る。当業者は、胃では溶解しないが、十二指腸において又は腸内の別の場所で物質を放出する利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、ペプチド（又は誘導体）の保護によって又は胃環境を越えた、例えば腸内でのペプチド（又は誘導体）の放出によって、胃環境の有害作用を回避する。

完全な胃耐性を確実にするため、少なくともｐＨ５．０に対して不透過性のコーティングが必須である。腸溶剤皮として使用されるより一般的な不活性化成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ、及びＳｈｅｌｌａｃである。これらのコーティングは混合薄膜として使用され得る。

コーティング又はコーティングの混合物はまた、胃に対する保護を意図されない錠剤に関しても使用できる。これは、糖コーティング又は錠剤を飲み込みやすくするコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療薬（すなわち粉末）の送達のためのハードシェル（例えばゼラチン）で構成され得、液体形態についてはソフトゼラチンシェルを使用し得る。カシェ剤のシェル材料は、厚いデンプン又は他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成型錠剤又は粉薬錠剤については、モイストマッシング法（moist massing techniques）が使用できる。

ペプチド（又は誘導体）は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微細な多粒子として製剤に含めることができる。カプセル投与のための物質はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、又はさらには錠剤としても製剤することができる。これらの治療薬は圧縮によって調製できる。

着色剤及び／又は香味料も含まれ得る。例えば、ペプチド（又は誘導体）は、製剤されて（例えばリポソーム又はミクロスフェアカプセル化によって）、その後さらに食用製品中に、例えば着色剤と香味料を含む冷蔵飲料中に含有され得る。

ペプチド（又は誘導体）の体積を不活性材料で希釈又は増加させ得る。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンを含み得る。カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含む、ある種の無機塩も充填剤として使用し得る。市販の希釈剤の一部は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。

崩壊剤は、治療薬を固体投与形態に製剤する場合に含め得る。崩壊剤として使用される材料は、デンプンに基づく市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む、デンプンを含むが、これに限定されない。ナトリウムデンプングリコレート、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海綿及びベントナイトはすべて使用し得る。崩壊剤はまた、不溶性カチオン交換樹脂であり得る。粉末ゴムは、崩壊剤として及び結合剤として使用でき、粉末ゴム、例えば寒天、カラヤ又はトラガカントを含み得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

結合剤は、ペプチド（又は誘導体）物質を共に保持して硬錠剤を形成するために使用でき、天然生成物からの材料、例えばアカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンを含み得る。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、どちらもペプチド（又は誘導体）を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用できる。

製剤工程の間の接着を防ぐため、抗摩擦剤をペプチド（又は誘導体）の製剤に含めてもよい。潤滑剤は、ペプチド（又は誘導体）とダイ壁の間の層として使用でき、これらは、そのマグネシウム塩とカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチエレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスを含み得るが、これらに限定されない。可溶性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００及びＣａｒｂｏｗａｘ ６０００も使用し得る。

製剤の間の薬剤の流動特性を改善し、圧縮の間の再配置を助けるための流動促進剤も添加し得る。流動促進剤は、デンプン、滑石、発熱性シリカ及び水和シリコアルミネートを含み得る。

水性環境へのペプチド（又は誘導体）の溶解を助けるため、湿潤剤として界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は、アニオン界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムを含み得る。カチオン界面活性剤も使用でき、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを含み得る。界面活性剤として製剤中に含めることができる潜在的非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で又は種々の比率の混合物としてタンパク質又は誘導体の製剤中に存在し得る。

ペプチド（又は誘導体）の取込みを潜在的に増強する添加物は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。

制御放出経口製剤が望ましい場合がある。ペプチド（又は誘導体）を、拡散又は浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムに組み込むことができる。緩やかに変性するマトリックスも製剤に組み込み得る。一部の腸溶剤皮も遅延放出作用を有する。制御放出のもう１つの形態は、Ｏｒｏｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものであり、すなわち薬剤は、水を浸入させ、浸透圧作用によって１つの小さな開口部を通して薬剤を押し出すことを可能にする半透膜に封入される。

他のコーティングも製剤のために使用し得る。これらは、コーティングパンに適用できる様々な糖類を含む。ペプチド（又は誘導体）はまた、フィルムコーティング錠剤としても提供することができ、この場合に使用される材料は２つの群に分けられる。最初の群は非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールを含む。２番目の群は、一般にフタル酸のエステルである腸溶性物質から成る。

最適のフィルムコーティングを提供するために物質の混合物を使用し得る。フィルムコーティングは、パンコーター若しくは流動床において又は圧縮コーティングによって実施し得る。

非経口送達
非経口投与のための本発明による製剤は、滅菌水性溶液若しくは非水性溶液、懸濁液又は乳剤を含む。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油及びトウモロコシ油、ゼラチン、並びに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。そのような投与形態はまた、補助剤、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含み得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターでのろ過によって、滅菌剤を組成物に組み込むことによって、組成物を照射することによって、又は組成物を加熱することによって滅菌し得る。それらはまた、使用の直前に、滅菌水又は何らかの他の滅菌注射用媒体を使用することによって製造できる。

直腸又は膣送達
直腸又は膣投与のための組成物は、好ましくは、活性物質に加えて、賦形剤、例えばココアバター又は坐剤ワックスを含み得る坐剤である。経鼻投与又は舌下投与のための組成物も、当分野で周知の標準的な賦形剤と共に調製される。

肺送達
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又はその誘導体）の肺送達も本明細書において考慮される。ペプチド（又は誘導体）は、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を越えて血流に入る［例えば、Adjei, et al. (1990) Pharmaceutical Research 7:565-569; Adjei, et al. (1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135-144（酢酸ロイプロリド）; Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13(sup5):143-146（エンドセリン−１）; Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212（α１−アンチトリプシン）; Smith, et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146（α１−プロテイナーゼ）; Oswein, et al. (1990) "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado（組換えヒト成長ホルモン）; Debs, et al. (1988) J. Immunol. 140:3482-3488（インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子α）;並びにPlatz, et al.への米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）参照］。全身作用のための薬剤の肺送達についての方法及び組成物は、Wong, et al.への米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。

治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械装置が、本発明の実施における使用のために考慮され、それらは噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器を含むが、これらに限定されず、そのすべてが当業者によく知られている。本発明の実施に適した市販の装置の一部の特定例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ａｃｏｒｎ ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）である。

すべてのそのような装置は、ペプチド（又は誘導体）の投薬に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各々の製剤は使用される装置のタイプに特異的であり、治療において有用な通常の希釈剤、補助剤及び／又は担体に加えて、適切な推進剤の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはミクロススフェア、封入複合体、又は他のタイプの担体の使用も考慮される。化学修飾されたペプチドも、化学修飾のタイプ又は使用される装置のタイプに依存して種々の製剤に調製され得る。

ジェット式又は超音波式の噴霧器で使用するのに適した製剤は、典型的には溶液１ｍＬ当たり生物活性タンパク質約０．１〜２５ｍｇの濃度で水に溶解されたペプチド（又は誘導体）を含有する。製剤はまた、緩衝剤及び単純な糖（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節のため）も含み得る。噴霧製剤はまた、エアロゾルを形成するときに溶液の噴霧化によって引き起こされるペプチド（又は誘導体）の表面誘導凝集を低減する又は防止するために界面活性剤を含み得る。

定量吸入装置で使用するための製剤は、一般に、界面活性剤を用いて推進剤に懸濁されたペプチド（又は誘導体）を含む微細分割粉末を含有する。推進剤は、この目的に使用される任意の従来の材料、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、又はそれらの組合せであり得る。適切な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレシチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。

粉末吸入装置から投薬するための製剤は、ペプチド（又は誘導体）を含む微細分割乾燥粉末を含有し、また、バルキング剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース又はマンニトールを、装置からの粉末の散布を容易にする量、例えば製剤の５０重量％〜９０重量％の量で含み得る。ペプチド（又は誘導体）は、最も好都合には、遠位肺への最も有効な送達のために１０ｍｍ（又はミクロン）未満の平均粒径、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒径を有する微粒子形態に調製されるべきである。

経鼻送達
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又は誘導体）の経鼻送達も考慮される。経鼻送達は、肺における薬剤の沈着を必要とせずに、治療薬を鼻に投与した後ペプチドが直接血流に入ることを可能にする。経鼻送達のための製剤は、デキストラン又はシクロデキストランを含有する製剤を含む。

経鼻送達を促進するために使用される他の浸透促進剤も、本発明のペプチドと共に使用するために考慮される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００３年１２月１７日出願の国際公開公報第２００４０５６３１４号に記載されているもの）。

用量
すべてのペプチド化合物について、さらなる試験を実施したとき、様々な患者における様々な状態の治療のための適切な用量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、受容者の治療背景、年齢及び全般的健康状態を考慮して、適切な用量を確認することができる。選択される用量は、所望治療効果、投与経路及び所望の治療期間に依存する。一般に１日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルが哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注射又は注入に関しては、用量はより低いと考えられる。

ある実施形態では、本発明のペプチドのいずれか１つを、透析前又は透析中の腎不全を有する個体（透析前患者又は透析患者）を治療するために使用し得る。この実施形態における治療用量範囲は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）につき化合物０．０２５〜０．２ミリグラム（ｍｇ）（０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ）であり得る。より特定すると、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの用量範囲が好ましい。さらに、医師は、最初に０．０２５ｍｇ／ｋｇから出発して漸増用量を使用し、その後治療される各々の個体について、個々のヘモグロビン応答に基づき約０．０２５ｍｇ／ｋｇずつ用量を増加し得る。そのようにして、医師は、適切なヘモグロビン応答が達成されるまで各々の個体について用量を調節し得る。透析前又は透析患者である個体の場合は、適切なヘモグロビン応答は、正常なヘモグロビンレベル（１４〜１５ｇ／ｄＬ）又は医師によって決定される別のヘモグロビンレベルを概ね達成することでである。この実施形態では、各個別の透析前又は透析患者についての薬理学的活性用量（ＰＡＤ）は、０．０６７〜０．０７５ｍｇ／ｋｇであると予想される。この実施形態の利点は、他の現在の赤血球生成刺激薬（ＥＳＡ）の場合のように１週間に１回ではなく、各個別患者について３〜４週間ごとに１回という低い投与頻度であると予想される。多くの投与経路が使用できる（前述したように経口、ＩＶ等）。透析患者についての好ましい投与経路は、静脈内経路である。透析前患者についての好ましい投与経路は、皮下経路である。他の特定実施形態では、前述した化合物の１つを、悪性疾患に関連する貧血を有する個体（腫瘍患者）を治療するために使用し得る。この実施形態における治療用量範囲は、透析前又は透析患者についての範囲の３〜５倍（すなわち０．０７５〜０．５ｍｇ／ｋｇ）であると予想される。より詳細には、０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇの用量範囲が好ましい。前記のように、腫瘍患者を治療する医師は、０．０７５ｍｇ／ｋｇから出発して、適切なヘモグロビン応答が達成されるまで０．０７５ｍｇ／ｋｇずつ漸増して用量を調節し得る。各個別腫瘍患者についてのＰＡＤは約０．２５ｍｇ／ｋｇであると予想される。やはり、３〜４週間ごとに１回という低い投与頻度の利点が各個別患者について期待される。さらに、腫瘍患者に関する他の利点は、網状赤血球刺激とヘモグロビン上昇の間の遅滞期のヘモグロビン低下を防ぐために、所定用量を化学療法の前に（例えば３〜５日前に）投与し得るか又は化学療法と同時投与し得る。多くの投与経路が使用できる（前述したように経口、ＩＶ等）。皮下投与は腫瘍患者のための好ましい投与経路である。腫瘍患者を治療するときに使用するための化合物の例は、以下に示すものを含む。

カルバメート結合、サルコシンなし、及び一連のＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号１）：

カルバメート結合、サルコシンなし、及び好ましいＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号１）：

カルバメート結合、サルコシン含有、及び一連のＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号２）：

カルバメート結合、サルコシン含有、及び好ましいＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号２）：

アミド結合、サルコシンなし、及び一連のＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号１）：

アミド結合、サルコシンなし、及び好ましいＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号１）：

アミド結合、サルコシン含有、及び一連のＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号２）：

アミド結合、サルコシン含有、及び好ましいＰＥＧ分子量（本明細書で示す配列番号２）：

本発明のペプチド（又はその誘導体）は、１又はそれ以上の付加的な有効成分又は医薬組成物と共に投与し得る。

本発明の方法において使用される化合物は、米国特許出願公開第２００７／０１０４７０４号及び同第２００８／００８１７８３号に開示されている手順に従って合成し得る。これらの方法は、当業者によって適用される有機化学及び／又は生物工学の原理と技術を使用してさらに改変し、最適化することができる。

ペプチドダイマーの生物活性
本発明に関して使用し得るペプチドダイマーの生物活性を試験した。試験は、ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性と効力を評価するためのインビトロアッセイとインビボアッセイの両方を含んだ。インビボアッセイの例は、赤血球増加性過低酸素症マウスのバイオアッセイ、網状赤血球アッセイ及び血液学的アッセイを含む。ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドに関して実施したインビトロアッセイの例は、レポーターアッセイ、増殖アッセイ、競合結合アッセイ及びＣ／ＢＦＵ−ｅアッセイを含む。さらに、ラット、イヌ、サル及びヒトにおける薬物動態試験をペプチドＩに関して実施した。ペプチドＩは、０．０２５、０．０５又は０．１ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後、安全であり、良好に耐容されると思われ、プラセボと同様の安全性プロフィールを有していた。薬物動態試験の結果は、約１５〜３３時間の範囲の半減期を示し、平均値は０．１ｍｇ／ｋｇ用量で２３．５時間であった。中央値はすべての用量に関して同等であり、注入の開始から１５分後に生じた。Ｃ_最大値は用量と直線関係を有すると思われた；ＡＵＣ_{（０〜無限大）}は０．１ｍｇ／ｋｇ用量で非線形であると思われた。一次反応速度論はより低い薬剤濃度でのみ認められ、＞４００ｎｇ／ｍＬの血漿中濃度での代謝／排泄過程の飽和を示唆した。ペプチドＩは、評価したすべての用量で網状赤血球に対する薬理学的活性を示した；一般に応答は用量依存的であり、用量が高くなると共により大きく、より長い応答が生じた。０．１ｍｇ／ｋｇ用量群がＮＨＶにおけるＰＡＤと定義され、ヘモグロビンの基線からの臨床的及び統計的に有意の上昇に結びついており、１０名のペプチドＩ受容者の間で基線からの平均最大上昇は１．３６±０．３９ｇ／ｄＬであった。他の薬力学的パラメータの変化（赤血球数及びヘマトクリットの上昇、フェリチン及び網状赤血球ヘモグロビン含有量の一過性の減少、可溶性トランスフェリン受容体タンパク質の一過性の増加、及びＥＰＯの一過性の減少）は、赤血球生成の刺激と一致していた。

２００５年６月４日のストックホルムにおける第１０回欧州血液学会年次総会（European Hematology Association 10th Annual Congress）で提示されたポスター及び抄録Ｎｏ．０４７０は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

前述した試験からのさらなる詳細は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０１０４７０４号及び同第ＵＳ２００８／００８１７８３号に示されている。

本発明を、次に、以下の実施例によって説明する。しかし、この実施例及び本明細書の別の部分での他の実施例の使用は単なる説明であり、いかなる意味においても本発明又は何らかの例示される形態の範囲及び意味を限定しない。同様に、本発明は、本明細書で述べる何らかの特定実施形態に限定されない。実際に、本発明の多くの修正及び変形が、付属の図面を含む本明細書の読了後に当業者には明白であり得、その精神及び範囲から逸脱することなく実施され得る。そのような修正は付属の特許請求の範囲内に包含されるものである。本発明は、したがって、特許請求の範囲に対する全範囲の等価物と共に、付属の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。

本発明は、本明細書で述べる特定実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書で述べるものに加えて、本発明の様々な修正が前記説明及び付属の図面から当業者に明らかになる。

すべての数値は近似であり、説明のために提供されることがさらに了解されるべきである。

特許、特許出願及び様々な公表文献を含む数多くの参考文献が本発明の説明において引用され、考察される。そのような参考文献の引用及び／又は考察は、単に本発明の説明を明確にするために提供されるものであり、そのような参考文献が本発明の「先行技術」であることの承認ではない。本明細書で引用され、考察されるすべての参考文献は、各々の参考文献が個別に参照して本明細書に組み込まれるのと同じように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

癌患者におけるペプチドＩ治療のＨｇｂ及び用量分析
化学療法を受けている貧血性癌患者において皮下投与したペプチドＩの安全性、薬力学及び薬物動態のオープンラベル多施設用量漸増試験を実施した。この試験の目的は、化学療法を受けている貧血性癌患者の≧５０％において９週目に≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加に結びつく、皮下（ＳＣ）注射によって３週間ごとに投与されるペプチドＩの用量を決定することであった。試験の時間枠は約１３週間であった。試験の結果は表１に示すように要約でき、試験した３つの癌タイプ、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び前立腺癌によって結果を分類している。さらなる詳細を以下で論じ、表２から４及び図１から６に提示する。

試験の他の測定項目は以下を含んだ：（１）併用骨髄抑制化学療法を受けている癌患者において３週間ごとに皮下投与した４回までのペプチドＩ投与の安全性プロフィールの評価、（２）ペプチドＩの種々の用量レベルでの、化学療法を受けている貧血性癌患者におけるヘモグロビン（Ｈｇｂ）の基線からの変化の測定、（３）ペプチドＩに対するＨｇｂ応答を有する患者の割合の測定、（４）化学療法を受けている貧血性癌患者においてヘモグロビンを１１〜１３ｇ／ｄＬの標的範囲内に上昇させ、維持する、皮下投与したペプチドＩの測定、（５）化学療法を受けている貧血性癌患者において皮下投与した４回までのペプチドＩ投与の薬力学的プロフィールの評価（試験患者の小集団において）、（６）ペプチドＩの活性用量での投与頻度の影響の調査、及び（７）ペプチドＩの活性用量での非経口的鉄補充の影響の調査。

この試験についての患者の選択基準は以下のとおりであった：（１）患者は、この試験の試験的性質について通知され、施設、地域及び国のガイドラインに従って書面による署名済インフォームドコンセントを与えた；（２）１８歳以上、８０歳以下の年齢の男性又は女性；閉経前女性（手術により不妊である女性を除く）はスクリーニングにおいて妊娠試験陰性でなければならない；性的活動のある女性は、試験開始前少なくとも２週間は極めて有効な避妊方法を実施しなければならず、試験薬の最終投与後少なくとも４週間は避妊の実施を継続する意思がなければならない。極めて有効な避妊方法とは、一貫して正しく使用したとき低い失敗率（すなわち年間１％未満）を生じさせる方法、例えばインプラント、注射剤、混合経口避妊薬、一部のＩＵＤ、禁欲（ライフスタイルとして実施される場合のみ許容され、性的活動のあるものが試験期間中だけ禁欲を実施する場合は許容されない）又は精管切除術を受けたパートナーと定義される；（３）試験の間に少なくとも９週間の周期的骨髄抑制化学療法を受けることが予定されている、組織学的に確認された悪性固形腫瘍又はリンパ腫を有する患者；（４）試験薬の投与前１週間以内に≧８及び＜１１ｇ／ｄＬのヘモグロビン値；（５）０〜２のＥＣＯＧ一般状態；（６）試験薬の投与前４週間以内に１回の網状赤血球ヘモグロビン含有量（ＣＨｒ）＞２９ｐｇ；（７）試験薬の投与前４週間以内に１回のトランスフェリン飽和度≧１５％；（８）試験薬の投与前４週間以内に１回の正常値の下限を上回る血清又は赤血球葉酸レベル；（９）試験薬の投与前４週間以内に１回の正常値の下限を上回るビタミンＢ_１２レベル；（１０）試験薬の投与前１週間以内に１回の絶対好中球数≧１．０×１０^９／Ｌ；（１１）試験薬の投与前１週間以内に１回の血小板数≧７５×１０^９／Ｌ；並びに（１２）平均余命＞６カ月。

患者が試験者によって鉄欠乏とみなされ、ＩＶ鉄補充が必要である場合は、ヘモグロビンが前の週から０．５ｇ／ｄＬを超えて上昇しなくなるまで患者を週に１回（鉄投与後７日目から）再スクリーニングした。

患者の除外基準は以下を含んだ：（１）過去９０日の間の何らかの赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）による治療；（２）ＥＳＡ治療に対して応答しなかった経歴；（３）他のＥＳＡに対する公知の抗体又は赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）の既往歴；（４）急性若しくは慢性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、又は多発性骨髄腫；（５）骨盤又は脊柱のいずれかの５０％超への過去の又は今後予定されている放射線治療；（６）非経口鉄補充に対する公知の不耐性；（７）試験薬の投与前４週間以内の赤血球（ＲＢＣ）輸血；（８）公知の異常ヘモグロビン症（例えば同型接合性鎌状赤血球症、すべての型のサラセミア等）；（９）公知の溶血；（１０）過去２年間の肺塞栓症若しくはＤＶＴの既往歴又は現在の抗凝固薬の治療的投与；（１１）貧血の原因としての公知の失血；（１２）コントロールされない又は症候性の炎症性疾患（例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等）；（１３）正常値の上限の＞２．５倍のＡＳＴ又はＡＬＴ；肝転移が存在する場合は正常値の上限の＞５倍のＡＳＴ又はＡＬＴ；（１４）クレアチニン＞１７５μｍｏｌ／Ｌ；（１５）骨髄移植又は末梢血細胞移植の経歴；（１６）試験薬の投与前４８時間以内の発熱／≧３９℃の熱；（１７）試験薬の投与前４週間以内の、試験者の判断によるコントロール不良の高血圧（例えば反復読取りで収縮期血圧≧１７０ｍｍＨｇ又は拡張期血圧≧１００ｍｍＨｇ）；（１８）試験薬の投与前６カ月以内のてんかん発作；進行した慢性うっ血性心不全−ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association）クラスＩＶ；（１９）試験の早期脱落又は中止の高い可能性（例えば過去３カ月以内の心筋梗塞；重症若しくは不安定冠動脈疾患；脳卒中；呼吸異常、自己免疫異常、神経精神医学的異常若しくは神経学的異常；活性Ｂ型若しくはＣ型肝炎を含む肝疾患；活性ＨＩＶ疾患；又は試験者の見解で、患者の評価又はフォローアップを妨げ得る過去６カ月以内の他の何らかの臨床的に有意の医学的疾患若しくは状態）；（２０）試験期間中に予想される待機的手術；（２１）多剤アレルギーの既往歴；（２２）試験薬の投与前又は試験期間中に予定されている服薬前１ヶ月以内の何らかの試験薬への暴露。

表２から４は、癌群ごとの臨床結果を示す。データは、ペプチドＩについてのヘモグロビン濃度（各々の表の上の部分）及び投薬情報（各々の表の下の部分）を含む。これらの表において使用される略語は以下のとおりである；「Ｈｇｂ」はｇ／ｄＬでのＨｇｂ濃度を指す；「ｎ」は所見の数を示す；「ｓｔｄ」は標準偏差を指す。「タキサン」は、患者がタキサンベースの化学療法剤で治療されていたことを示す。「非タキサン」は、患者が非タキサンベースの化学療法剤で治療されていたことを示す。空欄のセルは、データが得られなかったこと又は投与が行われなかったことを示す。

星印（^＊）が付いた数値は、プロトコールにおいて予測されたように、これらのＨｇｂ値が輸血のために打ち切りされていることを示す。打ち切りは、検討している事項以外の何らかの事項によって交絡が引き起こされた可能性があるデータを無視する統計手法である。一部のデータの打ち切りは、典型的にはプロトコール又は統計解析計画のいずれかにおいて解析に先立って記載される。この場合は、試験患者が輸血を受けるとき、それらの患者のＨｇｂデータは輸血後の一定期間交絡される。プロトコールは、Ｈｇｂなどの薬力学データが輸血後４週間打ち切りされることを規定していた。星印を付けた数値は輸血後４週間以内に生じたものであり、したがって解析では「無視」された。

Claims (35)

1. 肺癌、乳癌又は前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である患者において、エリスロポエチンの欠乏又は低赤血球集団若しくは欠陥赤血球集団によって特徴づけられる障害を治療する方法であって、
   （ａ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第１ペプチドモノマー；
   （ｂ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第２ペプチドモノマー：
   （ｃ）第１ペプチドモノマーを第２ペプチドモノマーに共有結合するリンカー部分；及び
   （ｄ）リンカー部分とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を共有結合によって連結するスペーサー部分であって、前記ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧを含む、スペーサー部分
   を含有する化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、方法。
2. アミノ酸配列がＣ末端に（ＭｅＧ）、Ｋ又は（ＭｅＧ）Ｋを付加的に含む、請求項１に記載の方法。
3. アミノ酸配列が（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）である、請求項２に記載の方法。
4. アミノ酸配列が（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）である、請求項２に記載の方法。
5. アミノ酸配列が（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）である、請求項２に記載の方法。
6. 第１ペプチドモノマーの２個のシステイン残基がジスルフィド架橋を介して共に結合しており、第２ペプチドモノマーの２個のシステイン残基がジスルフィド架橋を介して共に結合している、請求項１に記載の方法。
7. リンカー部分がリシン残基のアミド誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
8. リシン残基のアミド誘導体がその側鎖の窒素原子を介して共有結合している、請求項７に記載の方法。
9. リンカー部分が式：
   

   

   によって定義される、請求項１に記載の方法。
10. スペーサー部分が式：
    

    

    によって定義される、請求項１に記載の方法。
11. 化合物が式：
    

    

    又はその医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、互変異性体、アセタール、ケタール、プロドラッグ若しくは光学異性体によってさらに定義される、請求項１に記載の方法。
12. 化合物が、
    

    

    又はその医薬的に許容される塩としてさらに定義され、それについての他の光学異性体を実質的に含まない、請求項１１に記載の方法。
13. ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
14. ＰＥＧ部分が約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の方法。
15. 障害が貧血である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 障害が化学療法起因の貧血である、請求項１５に記載の方法。
17. 患者が膀胱、血液、骨、脳、乳房、中枢神経系、結腸、子宮内膜、食道、尿生殖路、頭部、喉頭、肝臓、肺、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、脾臓、小腸、大腸、胃又は精巣の癌を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
18. 患者が肺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
19. 肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１８に記載の方法。
20. 患者が前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
21. 患者が乳癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
22. 患者が霊長動物である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 患者がヒトである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
24. 治療を必要とする患者を同定することをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
25. 化合物を局所的に投与する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
26. 化合物を全身的に投与する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
27. 化合物を静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内経路で、皮下的に又は経口的に投与する、請求項２６に記載の方法。
28. 治療有効量が患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇの用量である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
29. 治療有効量が患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０２５ｍｇ〜約０．５ｍｇの用量である、請求項２８に記載の方法。
30. 治療有効量が患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０２５ｍｇ〜約０．２ｍｇの用量である、請求項２８に記載の方法。
31. 治療有効量が患者の体重１ｋｇ当たり化合物約０．０５ｍｇ〜約０．１ｍｇの用量である、請求項２８に記載の方法。
32. 治療有効量を１日１回の単回用量で投与する、請求項２８に記載の方法。
33. 治療有効量を１日２回又はそれ以上の分割用量で投与する、請求項２８に記載の方法。
34. 治療有効量を３〜４週間ごとに１回投与する、請求項２８に記載の方法。
35. 肺癌、乳癌又は前立腺癌のための化学療法を現在受けている、過去に受けたことがある又は今後受ける予定である患者において、エリスロポエチンの欠乏又は低赤血球集団若しくは欠陥赤血球集団によって特徴づけられる障害を予防する又は治療するための医薬組成物であって、
    （ａ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第１ペプチドモノマー；
    （ｂ）アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（配列番号１４）を含む第２ペプチドモノマー：
    （ｃ）第１ペプチドモノマーを第２ペプチドモノマーに共有結合するリンカー部分；及び
    （ｄ）リンカー部分とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を共有結合によって連結するスペーサー部分であって、前記ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖状の非分枝ＰＥＧを含む、スペーサー部分
    を含む化合物を含有する、医薬組成物。

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