JP2010501475A

JP2010501475A - 翻訳後修飾ニューロトロフィン

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Publication number: JP2010501475A
Application number: JP2009521157A
Authority: JP
Inventors: バルベイト、ルイス; ペハー、マリアナ; カッシナ、パトリシア; アルザリ、ペドロ・エム．
Original assignee: Instituto De Investigaciones Biologicas Clemente Estable; Facultad De Medicina Universidad de la Republica
Current assignee: Instituto De Investigaciones Biologicas Clemente Estable; Facultad De Medicina Universidad de la Republica
Priority date: 2006-07-24
Filing date: 2007-07-23
Publication date: 2010-01-21
Anticipated expiration: 2027-07-23
Also published as: WO2008012049A1; CA2657563A1; US20140178384A1; EP1882697B1; US20100055109A1; ATE465179T1; DE602006013809D1; BRPI0714545A2; US9328163B2; HK1116806A1; UY30501A1; EP2046823A1; JP5528803B2; EP2046823B1; AR062038A1; EP1882697A1

Abstract

本発明は、ニューロトロフィンは翻訳後修飾を受けること、および、これらの翻訳後修飾は、ニューロトロフィンのプロ−アポトーシスおよび／またはプロ-神経突起活性を仲介することを記述する。これらの翻訳後修飾は特に、ニトロ化、および、高次構造的に異なる二量体、ならびに四量体および八量体といった異常なオリゴマーの形成を含む。本発明は、更に、そのような修飾ニューロトロフィンと競合する化合物、ならびに前記修飾ニューロトロフィンに結合する化合物に関する。本発明は、したがって、慢性痛および／または神経細胞減少に関与する症状または疾病の治療のための有用な薬剤を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ニューロトロフィンの分野に関し、とりわけ翻訳後修飾ニューロトロフィン、ならびに、それらの生物学的、生物工学的、医学的、臨床的、治療的および診断的応用に関する。

ニューロトロフィン、特に神経成長因子（ＮＧＦ）は、発生の際における特異的な神経細胞集団の分化および生存に重要な役割を有し、成熟した神経系において神経の可塑性を修飾する［１、２］。逆説的に、ＮＧＦは、発生の際に神経細胞のアポトーシスを誘導し、病的状態にある損傷を受けた神経細胞およびグリア細胞を除去するとも記述されている［３、４］。ＮＧＦは、組織炎症および慢性痛の介在物質として記述され［５］、および、神経炎症を受けている幾つかの病理学に蓄積すると記述される［６−８］。

ＮＧＦは、２つの関連しない膜貫通レセプター、チロシンキナーゼレセプターＴｒｋＡおよびｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５^ＮＴＲ）を介して、その作用を及ぼす。ＴｒｋＡは、チロシンキナーゼレセプターであり、それは、十分に特徴づけられたシグナル伝達経路を活性化し、神経細胞の生存、分化および可塑性を促進する［２、９、１０］。一方、ｐ７５^ＮＴＲは、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーのメンバーであり、デスレセプターシグナル伝達アポトーシスとして作用できる［４、１１］。さらに、ｐ７５^ＮＴＲはまた、ＴｒｋＡ、ＢおよびＣに対する補助受容体として作用でき、または、その他のレセプター（ソーティリン（ｓｏｒｔｉｌｉｎ）、Ｎｏｇｏ−Ｒ）と相互に作用し、生存、細胞骨格再編成および軸索の伸長を含む様々な生物学的効果を調節する［４、１２］。

それゆえ、ＮＧＦといった天然のニューロトロフィンは、ｐ７５^ＮＴＲ依存性アポトーシスを誘導できると記述されている。

ｐ７５^ＮＴＲは、胚期において運動ニューロン中に高度に発現するが、その発現レベルは、出生後、段階的に終わる［１３］。ＴｒｋＡもｐ７５^ＮＴＲも、成体の運動ニューロンによって発現されないものの、ｐ７５^ＮＴＲは、軸索切断に続いて再度発現することができ［１４−１６］、および病的状態では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）といった運動ニューロン変性に関わる［１７、１８］。更に、ｐ７５^ＮＴＲは、軸索切断によって誘導される運動ニューロン死に結びつけられた［１４、１９、２０］。ｐ７５^ＮＴＲおよびＮＧＦの異常な発現は、変異型Ｃｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）を過剰発現するＡＬＳトランスジェニックマウスにて観察される、成体の運動ニューロン死に寄与する可能性がある［１８、２１−２５］。

最近では、プロニューロトロフィン（ｐｒｏ−ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）が、ｐ７５^ＮＴＲおよびソーティリンによって形成される複合体を通したシグナル伝達による、ｐ７５^ＮＴＲ依存性アポトーシスの強力な誘発剤であることが判明した［１４、１５］。

例えば、ＷＯ２００５／０１４０３９は、成熟ニューロトロフィンの何れかの翻訳後修飾の可能性を想定することなく、この「プロニューロトロフィン」仮説を開示し、追求している：公開されたＰＣＴ出願の４６頁２４−２８行目（「内因性成熟ＮＧＦが、組織抽出物中で非常に低い濃度でしか見つからず、および培地中では検出限界にほとんど達しないため、ＮＧＦ前駆体（１９−２１、２８および３２ｋＤａ）は、ｐ７５^ＮＴＲ発現運動ニューロンに対するアポトーシスの介在物質である可能性がある」）を参照されたい。

それゆえ、本発明以前において、主要な仮説は、プロ−ＮＧＦといったプロニューロトロフィンは、神経細胞の細胞死を引き起こす内因性因子である、ということであった。

本発明者らは、炎症、慢性痛および神経病理学を仲介する新種の成長因子を同定し、単離し、および精製した。本発明者らは、そのような症状または疾病の間、ＮＧＦといったニューロトロフィンは、パーオキシナイトライトといった内因性ニトロ化種（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒａｔｉｎｇｓｐｅｃｉｅｓ）と反応し、前記ニューロトロフィンのニトロ化がもたらされ、および、とりわけ前記ニューロトロフィンのニトロ化チロシンおよび／またはトリプトファン残基の形成がもたらされる、ならびに、ニューロトロフィン分子のそのようなニトロ化修飾は、天然の二量体に有意な構造変化を誘導し、これは次に、変性組織にて見られるそれらに匹敵する、高分子量の異常なオリゴマー（例えば四量体および／または八量体）の形成を促進することを発見した。

発明者は、このように、天然の非修飾ニューロトロフィンのそれらとは著しく異なる高次構造、構造および生物活性を有する修飾ニューロトロフィンを同定し、単離し、および精製した。

それゆえ、発明者らは、そのような修飾ニューロトロフィンは、炎症介在物質としてのキー薬剤であり、慢性痛の誘導および神経病理学の神経細胞死において、重要な役割を有し得ることを発見した。

本発明は、従って、そのような修飾ニューロトロフィン、より具体的にはニトロ化ニューロトロフィン（ｎｉｔｒａｔｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）に関する。

本発明は、更に、そのような修飾ニューロトロフィンに結合できる化合物または組成物である結合剤に関し、および、とりわけ非修飾型天然ニューロトロフィンには交差反応せず、少なくとも１つのそのような修飾ニューロトロフィンに結合できる、特異的結合剤に関する。

本発明は、そのような修飾ニューロトロフィンの、およびそのような結合剤の、生物学的、生物工学的、医学的、臨床的、治療的、診断的応用に関する。

ＮＧＦ構造のリボン図（ＰＤＢコード１ＢＥＴ）。２つのＮＧＦ単量体（緑および青）は、主として疎水性のインタフェースを介して互いに相互作用する［３９］。図は、マウスＮＧＦに存在する２つのチロシンのおよび３つのトリプトファン残基の位置を表す。１つの単量体（緑）からのＴｙｒおよびＴｒｐ側鎖は、棒状の表現で描かれており、（ピンク）にラベルされている。対向するＮＧＦ単量体からのＧｌｕ１１（赤）もまた示されている。パーオキシナイトライト処理は、ＮＧＦアポトーシス活性を増強する。ＧＤＮＦ（１ｎｇ／ｍＬ）で処理した純粋な運動ニューロン培養物を、パーオキシナイトライト（１ｍＭ；ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻）または分解したパーオキシナイトライト（ＮＧＦ−ＲＯＡ）で予め処理した増大するＮＧＦに、濃度を増大させて、さらした。点線は、ＮＯＮＥ（栄養性因子欠乏）のＳＤを表す。パーオキシナイトライト処理は、ＮＧＦアポトーシス活性を増強する。運動ニューロン培養物を、示した濃度のパーオキシナイトライトで予め処理したＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）にさらした。点線は、ＮＯＮＥ（栄養性因子欠乏）のＳＤを表す。パーオキシナイトライト処理は、ＮＧＦアポトーシス活性を増強する。運動ニューロン培養物を、一酸化窒素供与体ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ（１０μＭ、ＮＯ）の存在下、ＮＧＦ−ＲＯＡまたはＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻（１ｍＭ）で、濃度を増大させて、処理した。点線は、ＮＯＮＥ（栄養性因子欠乏）のＳＤを表す。パーオキシナイトライト処理は、ＮＧＦアポトーシス活性を増強する。運動ニューロン培養物を、パーオキシナイトライト（１ｍＭ；黒いバー（ＯＮＯＯ⁻））または分解したパーオキシナイトライト（１ｍＭ；白いバー（ＲＯＡ））で予め処理したＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）にさらした。点線は、ＧＤＮＦのＳＤを表す。運動ニューロンの生存は、処理から４８時間後に測定した。データは、ＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）で表される。^＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦに介在されるアポトーシスにはｐ７５^ＮＴＲが必要である。ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体（ａ−ｐ７５，１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ＃ＡＢ１５５４）および一般的なカスパーゼ阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（１０μＭ）は、予めパーオキシナイトライト（１ｍＭ；ＮＧＦ−ＯＮＯＯ−）で処理したＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）に誘導される運動ニューロン死を阻害した。ｐ７５^ＮＴＲに対する抗体は、運動ニューロンのプレーティングの直後に、１度添加し、一方、ＤＥＶＤ−ｆｍｋは２４時間ごとに添加した。データは、ＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）で表される。点線は、ＧＤＮＦのＳＤを表す。^＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦに介在されるアポトーシスにはｐ７５^ＮＴＲが必要である。アンチセンスおよびミスセンスのオリゴヌクレオチドを、プレーティングのときに、精製した運動ニューロン培養物に添加した。２４時間後、培養物を、ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻（１００ｎｇ／ｍＬ）またはＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ（１０μＭ）（ＮＧＦ＋ＮＯ）にさらした。アンチセンスオリゴヌクレオチド（黒いバー）は、両方の処理によって誘導される運動ニューロンの減少を完全に防ぎ、一方、ミスセンスオリゴヌクレオチド（白いバー）は、神経細胞の生存になんら効果を示さなかった。データは、それぞれＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）として表される。^＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦに介在されるアポトーシスにはｐ７５^ＮＴＲが必要である。ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻によって誘導される運動ニューロンアポトーシスは、パーオキシナイトライトの内因性の生産をもたらす。運動ニューロン培養物を、Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）またはＭｎＴＢＡＰ（１００μＭ）の存在下、パーオキシナイトライト（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理した１ｍＭのＮＧＦで処理した。点線は、ＧＤＮＦのＳＤを表す。データは、それぞれＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）として表される。＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。運動ニューロンの生存は、全ての場合において、処理から４８時間後に測定した。パーオキシナイトライトは、NGFオリゴマー化およびニトロ化を誘導する。増加する濃度のパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻；０．２５ｍＭから１ｍＭ）の処理後のＮＧＦにおける高分子量種の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。対照として、ＮＧＦを、分解したパーオキシナイトライト（１ｍＭ；ＲＯＡ）で処理した。ＮＧＦは、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度にて、パーオキシナイトライトで処理した。１０μｇのタンパク質を各々のレーンに適用し、電気泳動分離を変性および還元条件下１５％ポリアクリルアミドゲルで行った。図は、クマシーブルーで染色した代表的なゲルを表す。パーオキシナイトライトは、NGFオリゴマー化およびニトロ化を誘導する。１ｍＭパーオキシナイトライト（ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻）またはその分解生成物（ＮＧＦ−ＲＯＡ）で処理したＮＧＦを、リアルタイム多角度光散乱検出（ＭＡＬＳ）と組み合わせたサイズ−排除クロマトグラフィーで分析した。絶対的なモル質量対溶出の時間（または体積）を、９０°ＬＳ検出器からの信号に重ねた。ＮＧＦ−ＲＯＡ（青）は、二量体（３３．０±１．２ＫＤａ）に相当する質量を有した単一のピークとして溶出した。対照的に、ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻は、二量体（３３．２±０．６ＫＤａ、タンパク質の８５％）、四量体（６８．５±３．５ＫＤａ、１３％）および八量体（１２５．０±１０．０ＫＤａ、２％）に相当する３つのピークとして溶出した。パーオキシナイトライトは、NGFオリゴマー化およびニトロ化を誘導する。ニトロチロシンについての免疫反応性の増大を示すウエスタンブロット。（Ａ）の場合のように処理した１００ｎｇのＮＧＦを、抗ニトロチロシン（抗ニトロＴｙｒ）ポリクローナル抗体を使用した免疫ブロッティングにより分析した。剥離した後に、メンブレンを抗ＮＧＦポリクローナル抗体で発色させた。天然の（Ａ）およびパーオキシナイトライト処理した（Ｂ）ＮＧＦの逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。天然のＮＧＦは、３６．３分および３８．１分に２つのピークとして溶出した。パーオキシナイトライト処理（１ｍＭ）は、いくつかの生成物の不完全な分離をもたらした。非イオン化ニトロチロシンは３６０ｎｍで吸収する。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦでは、３６０ｎｍにおいて吸光度が増加したが（Ｂ）、天然のＮＧＦクロマトグラムでは、３６０ｎｍでの吸収は生じなかった。天然の（Ａ）およびパーオキシナイトライト処理した（Ｂ）ＮＧＦの逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。天然のＮＧＦは、３６．３分および３８．１分に２つのピークとして溶出した。パーオキシナイトライト処理（１ｍＭ）は、いくつかの生成物の不完全な分離をもたらした。非イオン化ニトロチロシンは３６０ｎｍで吸収する。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦでは、３６０ｎｍにおいて吸光度が増加したが（Ｂ）、天然のＮＧＦクロマトグラムでは、３６０ｎｍでの吸収は生じなかった。ＨＰＬＣ回収画分の質量分析。３６．３分の天然ＮＧＦからの溶出物のエレクトロスプレー飛行時間型質量分析により、質量が１３，２５２Ｄａであり、ＮＧＦの鎖Ａに相当することが判明した。１３，０７８Ｄａにおける質量シグナルは、Ｃ末端アルギニン残基の欠失に一致する。ＨＰＬＣ回収画分の質量分析。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦからの３８．６分の溶出の質量分析により、鎖Ａの質量が８９Ｄａ増加したこと（１３，２５２から１３，３４１Ｄａまで）が示された。３９．９分の溶出物は鎖Ｂに相当し、９０Ｄａの増大（１２，３５７から１２，４４９Ｄａまで）を示した。トリプシン消化したＨＰＬＣ回収画分のＱ−Ｔｏｆ質量分析。ＨＰＬＣ精製サンプルを、消化し、Ｑ−Ｔｏｆ質量分析で分析し、続いてＭＳ／ＭＳイオン検索をＭａｓｃｏｔによって行った。（Ａ）３６．３分の天然未処理ＮＧＦ溶出物、（Ｂ）３８．６分のパーオキシナイトライト処理ＮＧＦからの溶出物は、Ｔｙｒ５２およびＴｒｐ９９のニトロ化を示す修飾ペプチドを示す。同様の修飾が、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦ由来の３９．９分の溶出物で観察された。ピログルタミン酸（ピロＧｌｕ）は、ペプチドのＮ末端におけるグルタミン（Ｑ）の共通の修飾である。トリプシン消化したＨＰＬＣ回収画分のＱ−Ｔｏｆ質量分析。ＨＰＬＣ精製サンプルを、消化し、Ｑ−Ｔｏｆ質量分析で分析し、続いてＭＳ／ＭＳイオン検索をＭａｓｃｏｔによって行った。（Ａ）３６．３分の天然未処理ＮＧＦ溶出物、（Ｂ）３８．６分のパーオキシナイトライト処理ＮＧＦからの溶出物（Ｔｙｒ５２およびＴｒｐ９９のニトロ化を示す修飾ペプチドを示す）。同様の修飾が、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦ由来の３９．９分の溶出物で観察された。ピログルタミン酸（ピロＧｌｕ）は、ペプチドのＮ末端におけるグルタミン（Ｑ）の共通の修飾である。テトラニトロメタン処理がＮＧＦのニトロ化およびオリゴマー化を誘導した。テトラニトロメタン（ＴＮＭ）処理したＮＧＦのＨＰＬＣクロマトグラム。４０倍過剰のＴＮＭで処理したＮＧＦは、３７．９および３９．９分において２つのピークとして溶出した。３６０ｎｍの吸光度は、溶出されたピークにおけるニトロチロシンの存在を示す。テトラニトロメタン処理がＮＧＦのニトロ化およびオリゴマー化を誘導した。３７．９分の溶出物のデコンボリューションしたスペクトル（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄｓｐｅｃｔｒａ）は、天然のＮＧＦの場合（１３，２５２Ｄａ；図５Ａ）と比較して、４５Ｄａ（１３，２９７Ｄａへ）および９０Ｄａ（１３，３４２Ｄａへ）のＮＧＦ鎖Ａの質量増加を示した。１３，１６８Ｄａの質量のシグナルは、Ｃ末端アルギニン残基を欠失し、二重でニトロ化された鎖Ａに相当する。３９．９分の溶出物のデコンボリューションしたスペクトルは、鎖Ｂに対する同様な質量シフトを示した。テトラニトロメタン処理がＮＧＦのニトロ化およびオリゴマー化を誘導した。３７．９分のトリプシン消化された溶出物のＱ−Ｔｏｆ質量スペクトルは、Ｔｙｒ５２およびＴｙｒ７９のニトロ化を示した。３９．９分の溶出物の分析は、鎖Ｂにおける同様の修飾を示した。テトラニトロメタン処理がＮＧＦのニトロ化およびオリゴマー化を誘導した。ＴＮＭでの処理後のＮＧＦ（ＮＧＦ−ＴＮＭ）の高分子量種の形成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。１００ｎｇのタンパク質を各々のレーンで分析し、変性および還元条件の下、１５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動分離を行った。図は、代表的な銀染色したゲルを示す。テトラニトロメタン処理したＮＧＦは、ｐ７５^ＮＴＲ依存性運動ニューロン死を誘導した。ＧＤＮＦ（１ｎｇ／ｍＬ）で処理した純粋な運動ニューロン培養物を、予めベヒクルまたは４０倍過剰のＴＮＭ（ＮＧＦ−ＴＮＭ）で処理した増大する濃度のＮＧＦにさらした。点線は、ＮＯＮＥ（栄養性因子欠乏）のＳＤを表す。テトラニトロメタン処理したＮＧＦは、ｐ７５^ＮＴＲ依存性運動ニューロン死を誘導した。ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体（ａ−ｐ７５，１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ＃ＡＢ１５５４）は、ＮＧＦ−ＴＮＭ（１００ｎｇ／ｍＬ）に誘導される運動ニューロン死を防止した。ｐ７５^ＮＴＲに対する抗体を、運動ニューロンのプレーティングから３時間後にＮＧＦ−ＴＮＭとともに添加した。点線は、ＧＤＮＦのＳＤを表す。運動ニューロンの生存を処理後４８時間において測定した。データは、ＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）で表される。^＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。尿酸塩は、ＮＧＦアポトーシス活性に対するパーオキシナイトライトの効果を無効にした。尿酸塩は、用量依存的な様式で、チロシンニトロ化およびＮＧＦのオリゴマー化を阻害した。ＮＧＦを、ベヒクルまたは増大する濃度の尿酸塩（２０から１０００μＭ）の存在下で、分解したパーオキシナイトライト（１ｍＭ；ＲＯＡ）またはパーオキシナイトライト（１ｍＭ）にさらした。サンプル（１００ｎｇ）を、ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲルおよびニトロチロシンに対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。尿酸塩は、ＮＧＦアポトーシス活性に対するパーオキシナイトライトの効果を無効にした。尿酸塩の存在下においてパーオキシナイトライトで処理したＮＧＦはニューロンの生存に影響を与えなかった。運動ニューロン培養物を、予めベヒクル（ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻）または尿酸塩（２００μＭ；ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻−尿酸塩）の存在下でパーオキシナイトライト（１ｍＭ）で処理したＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）にさらした。運動ニューロンの生存に対する未反応の尿酸塩の直接的効果の可能性を除外するために、ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻−尿酸塩の添加後の培養物培地中に存在すると予想される尿酸塩の濃度を、ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻にさらされる培養物に添加した。尿酸塩（１００ｎＭ）は、ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻（１００ｎｇ／ｍＬ）に誘導される運動ニューロンの喪失を阻害しなかった。運動ニューロンの生存を処理後４８時間において測定した。点線は、ＧＤＮＦのＳＤを表す。データは、ＧＤＮＦのパーセンテージ（平均値±ＳＤ）で表される。^＊ＧＤＮＦからの有意差（ｐ≦０．０５）。ＮＧＦアミノ酸配列。マウスＮＧＦ（ＡＡＡ３９８１８；配列番号：３）。ＮＧＦアミノ酸配列。ヒトＮＧＦ（ＣＡＡ３７７０３；配列番号：４）。ＮＧＦアミノ酸配列。成熟マウスＮＧＦ（配列番号：１）。Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）残基は、図１２Ａおよび１２Ｂにおいて、太文字および下線を引いた文字で表される。図１２Ａ（成熟マウスＮＧＦ）では、成熟マウスＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｙｒ５２、Ｔｒｐ７６、Ｔｙｒ７９、Ｔｒｐ９９（成熟ニューロトロフィンタンパク質の配列の参照によって算出される残基番号）が示される。ＮＧＦアミノ酸配列。成熟ヒトＮＧＦ（配列番号：２）。Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）残基は、図１２Ａおよび１２Ｂにおいて、太文字および下線を引いた文字で表される。図１２Ｂ（成熟ヒトＮＧＦ）では、成熟ヒトＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｙｒ５２、Ｔｒｐ７６、Ｔｙｒ７９およびＴｒｐ９９残基（成熟ニューロトロフィンタンパク質の配列の参照によって算出されている残基番号）が示される。ニトロ化ＮＧＦに結合し、非ニトロ化ＮＧＦと交差反応しない特異的抗体を使用した、静止状態または刺激を受けた状態のアストロサイト（ＦＧＦ１，１０ｎｇ／ｍＬ；およびＬＰＳ，５マイクロｇ／ｍＬ）からの条件培地のウエスタンブロッティングによる分析（レーン１：非ニトロ化ＮＧＦ；レーン２：ニトロ化ＮＧＦ；レーン３：静止状態のアストロサイトからの条件培地；レーン４：刺激を受けた状態のアストロサイトからの条件培地）。パーオキシナイトライトは、ＮＧＦの神経突起成長促進活性を増大させる。Ｅ１５ラット胚由来の後根神経節外植片（ＴｒｋＡおよびｐ７５^ＮＴＲを発現する）を、栄養性因子非存在下（ＮＯＮＥ）、または、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ；ニトロＮＧＦ−Ｐ）もしくはテトラニトロメタンで処理したＮＧＦ（ニトロＮＧＦ−ＴＮＭ）の存在下で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地にて培養した。２４時間後、培養物を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＧＡＰ−４３に対する免疫蛍光に供した。ニトロＮＧＦで処理した神経節では、ＮＧＦで処理したものと比較して、神経突起成長が増加したことが留意される。

発明の詳細な説明

本発明は、ニューロトロフィンが翻訳後修飾を受けることを記述する。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、本発明は、ニューロトロフィン、とりわけＮＧＦの翻訳後修飾に関する最初の説明である。

発明者らは、これらの翻訳後修飾が、高次構造的に異なる二量体をもたらすこと、並びに四量体および八量体といった異常なオリゴマーをもたらすことを実証する。

そのような修飾ニューロトロフィンは、構造、高次構造および生物活性において、非修飾型天然（健康的な）ニューロトロフィンと異なる。

そのような修飾ニューロトロフィンは、運動ニューロンに対するプロアポトーシス効果および／または感覚神経節に対するプロ−神経突起成長効果を有する。更に、これらの修飾ニューロトロフィンは、非常に低い濃度でこれらの効果を及ぼすことができる：そのような効果を誘導および／または刺激する修飾されたニューロトロフィンの力価は、その由来となった非修飾型ニューロトロフィンの（仮に有するとして）有する力価であって、外因的な酸化窒素が添加された状態で、そのような非修飾ニューロトロフィンが使用された場合の力価と比較しても、非常に高い。

本発明者らは更に、インビボ条件の下で、これらの翻訳後修飾は、特に、内因性のニトロ化種（例えばパーオキシナイトライト）による、成熟ニューロトロフィンのニトロ化をもたらすことを実証した。

酸化窒素およびスーパーオキシドラジカルからの反応生成物であるパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）は、主として、酸化窒素の生産増大に関与する病的状態においてインビボで形成される。

本発明者らの知識の及ぶ限りでは、そのような修飾ニューロトロフィンを、同定し、単離しおよび精製したことも初めてである。

第１の側面において、本発明は、従って、これらの修飾ニューロトロフィン、とりわけこれらのニトロ化ニューロトロフィンに関する。

例えばＦｒａｚｉｅｒらの研究（１９７３年［５２］）といった以前の研究では、テトラニトロメタン（ＴＮＭ）によるＮＧＦのニトロ化は、少なくとも感覚神経節における神経突起成長の誘導による評価において、ＮＧＦ生物活性を修飾しなかった。本発明は、これに反して、ニトロ化剤（例えばＴＮＭおよび／またはパーオキシナイトライト）によるＮＧＦまたは別のニューロトロフィンのニトロ化は、その生物活性を高度に修飾することを、正確に実証する。

本発明以前において、運動ニューロンにおいてＮＧＦによるプロ−アポトーシス活性を仲介するものは、ニューロトロフィンの翻訳後修飾、例えばＮＧＦの翻訳後修飾（すなわち、ＮＧＦのニトロ化および／または異常なオリゴマー化）であることは全くわかっていなかった。先行技術が教示するものは、非修飾ＮＧＦおよび／またはその前駆体（例えばプロ−ＮＧＦ）のみを含むものであった；例えば、Ｐｅｈａｒらの報告（２００４年［２５］）が参照される。

本発明者らによって同定された翻訳後修飾ニューロトロフィンは、非常に低い濃度で、運動ニューロンアポトーシス活性および／または神経突起成長活性を有する。運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長（例えば、感覚神経節からの）を誘導および／または刺激するそのような修飾されたニューロトロフィンの力価は、その由来となった非修飾型ニューロトロフィンによる力価（仮にあるとして）であって、外因的な酸化窒素が添加された状態で、前記非修飾天然ニューロトロフィンが使用された場合の力価と比較しても、非常に高い。

修飾ニューロトロフィン（例えば修飾されたＮＧＦ）の効果は、非常に低い濃度で検出可能である。例えば、ニトロ化ＮＧＦは、１ｎｇ／ｍＬと同程度に低い濃度で運動ニューロンアポトーシスを有意に誘導する（図２Ａおよび関連コメント参照）。

酸化窒素または酸化窒素の供給源に関連して使用される場合、修飾されたニューロトロフィンのアポトーシス活性は更に増加しさえする。

例えば、酸化窒素と共に使用されるニトロ化ＮＧＦ（ＮＧＦ−ＯＮＯＯ⁻＋ＮＯ）は、わずか１ｐｇ／ｍＬで運動ニューロンの減少を有意に誘導する（図２Ｃおよび関連コメント参照）。インビトロでのパーオキシナイトライトによるＮＧＦのニトロ化は、酸化窒素の存在下、運動ニューロンのアポトーシスを誘導するＮＧＦの力価を１０，０００倍増大させる。

更に、ニトロ化ニューロトロフィン以外のニトロ化された成長因子、例えばニトロ化ＦＧＦは運動ニューロンに対して何らアポトーシス効果を有さないため（例えば、ニトロＦＧＦ−１、ニトロＦＧＦ−２；図２Ｄおよび関連コメント参照）、運動ニューロンアポトーシスおよび／または感覚神経節からの神経突起成長に対する、ニトロ化ニューロトロフィンによる活性はかなり特異的であると思われる。

本発明は、従って、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の非常に強力な誘導物質および／または刺激物質である修飾ニューロトロフィンに関する。これらの修飾ニューロトロフィンは、発明者らによって、単離され、同定されおよび特徴づけられた。

修飾ニューロトロフィンは、そのＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基が少なくとも１つのニトロ基を含むという事実によって特徴付けることができる。

修飾ニューロトロフィンは、それらは、天然ニューロトロフィンにおいて、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基における少なくとも１つのニトロ基の添加による、天然ニューロトロフィンの翻訳後のニトロ化修飾によって得ることができるという事実（ここにおいて、前記天然ニューロトロフィンは、天然プロニューロトロフィンまたは天然成熟ニューロトロフィン、好ましくは天然成熟ニューロトロフィンである）によって、代わりにまたは付加的に、特徴付けることができる。

本願において、天然ニューロトロフィンまたは天然プロニューロトロフィンとは、健康的な哺乳類において観察される、または、少なくとも、いずれの異常な運動ニューロンアポトーシスも患っていない哺乳類において観察される、天然に生じるニューロトロフィンまたはプロニューロトロフィンに相当するニューロトロフィンまたはプロニューロトロフィンであると意図される。天然ニューロトロフィンまたはプロニューロトロフィンは、従って、本願において、正常な「健康的な」ニューロトロフィンまたはプロニューロトロフィンに相当する。それゆえ、そのような天然ニューロトロフィンまたはプロニューロトロフィンはニトロ化されていない。

「ニューロトロフィン」という用語は、本願において、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４（ニューロトロフィン−４；ＮＴ−４／５、すなわちニューロトロフィン−４／５とも称される）およびＮＴ−６（ニューロトロフィン−６）からなる群を意味する。更なる指示がない限り、この用語は、成熟ニューロトロフィン並びにプロニューロトロフィンを包含する。本発明において、好ましいニューロトロフィンは成熟ニューロトロフィンである。

本発明はまた、保存的断片および保存的変種に関する。

保存的断片は、少なくとも１つの残基、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に、少なくとも１つのニトロ基を保持する断片である。それはまた、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を保持する。

保存的変種は、少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって、本発明の修飾されたニューロトロフィンまたは保存的断片から生じるものであるが、少なくとも１つの残基、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基を保持する。前記保存的変種はまた、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を保持する。

本出願において、特に明記しない限り、「修飾ニューロトロフィン」または「ニトロ化ニューロトロフィン」という用語は、本発明の修飾ニューロトロフィン、ならびにその保存的断片、ならびにそのような修飾ニューロトロフィンまたはそのような保存的断片のいずれかの保存的変種を包含する。

本発明のニトロ化ニューロトロフィンは、天然ニューロトロフィンまたは天然プロニューロトロフィンとニトロ化剤とを接触させて得てよい。

本発明の保存的断片は、以下のようにして得ることができる：
−本発明の修飾ニューロトロフィンの切断によって、または、天然ニューロトロフィンまたは天然プロニューロトロフィンの断片とニトロ化剤との接触によって、
それによって候補断片の集団を得る、および
−前記候補断片の集団の中から、少なくとも１つの残基、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に、少なくとも１つのニトロ基を保持し、且つ、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を有する断片を選択する。

本発明の保存的変種は、以下のようにして得ることができる：
−本発明の修飾ニューロトロフィンまたは本発明の保存的断片の少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって、または、天然ニューロトロフィンまたは天然プロニューロトロフィンの、または天然ニューロトロフィン断片の、または天然プロニューロトロフィン断片の変種とニトロ化剤との接触によって、
それによって、候補変種の集団を得る、および
−この候補変種の集団の中から、少なくとも１つの残基、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に、少なくとも１つのニトロ基を保持し、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を有する変種を選択する。

当業者が適切とわかるいずれのニトロ化剤でも使用することができる。１または複数のニトロ化剤を使用してもよい。使用されるニトロ化剤は、少なくとも１つのニトロ基を含み、および、ニューロトロフィンタンパク質またはその断片もしくは変種に、好ましくは前記ニューロトロフィンまたはその断片もしくは変種のＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に、前記少なくとも１つのニトロ基の付加を誘導することができる薬剤である。好ましくは、前記ニトロ化剤は、テトラニトロメタンおよび／またはパーオキシナイトライトである。

ニトロ化されるニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）は、当業者が適切とわかるいずれかの供給源を由来とするものであってよい。それは、天然のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または天然のポリペプチドもしくはタンパク質の断片、または組換えペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または合成ペプチドもしくはポリペプチドであってよい。当業者に既知の、ペプチドまたはポリペプチド合成のいずれかの方法を使用することができる。合成方法の例（例えばメリフィールド固相合成）は、例えば、“ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｄ＆Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，１９６９，Ｅｄ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＣｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）または“Ｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙら．１９７６，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ）にみることができる。

ニューロトロフィンの天然の供給源は、特に、アストロサイト細胞（例えばＩＩ型アストロサイトグリア細胞）を含む。

ニューロトロフィンはまた、商業的に入手可能であり、例えばＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ；ＵＳＡ）から入手可能なマウスＮＧが使用できる。

組換えニューロトロフィン、またはニューロトロフィン断片もしくは変種はまた、当業者によって、例えば、適切な宿主細胞（例えば線維芽細胞細胞）に、前記ニューロトロフィンまたは断片もしくは変種をコードするｃＤＮＡを、このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドの発現に適切な条件下で、感染および／または形質移入および／または形質転換させることによって製造してよい。例えば、組換えヒトＮＧＦの製造は、Ｊｏｈｎｓｏｎら．１９８６（Ｃｅｌｌ４７（４）：５４５−５５４；ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ａｌｌｅｎら．２００１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４７：２３９−２５５；ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｎｄｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌら．２００１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３２９６−３３０３；ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍａｂａｃｔｅｒｉａｌｓｙｓｔｅｍ）に記述されている。

前記ニューロトロフィン（またはその保存的断片もしくは変種）は、前記ニトロ化剤が前記ニューロトロフィンまたは断片もしくは変種の少なくとも１つのＴｒｐおよびＴｙｒ残基に少なくとも１つのニトロ基を付加するのに適切な条件の下（とりわけ、ｐＨおよび持続時間の条件の下）、前記ニトロ化剤に接触される。

運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力は、当業者にとって利用可能ないずれかの手段によって評価することができる。例えば、神経突起成長を誘導および／または刺激する能力は、感覚神経節を前記ニトロ化ニューロトロフィンまたはその断片もしくは変種にさらし、神経突起成長のレベルを測定し、それによって、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）への前記曝露が、前記感覚神経節からの神経突起の成長を誘導またはその数を増大させたかどうかを決定することで評価できる。前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）への曝露において、コントロール条件と比較して、神経突起の数が増加するかどうかを測定するために、神経突起の数の統計学的に有意な増加を観察してもよい。

例えば、運動ニューロンアポトーシスを誘導および／または刺激する能力は、運動ニューロンを前記ニトロ化ニューロトロフィンまたはその断片もしくは変種にさらし、非アポトーシス細胞、例えば細胞体直径の４倍より長い完全な神経突起を示す細胞、および／またはアポトーシス細胞を計測し、それによって、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）がアポトーシスを行った運動ニューロンの数を誘導または増大させたかどうかを決定することで評価することができる。前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）への曝露において、コントロール条件と比較して、非アポトーシス細胞の数が減少したかどうか、および／またはアポトーシス細胞の数が増加したかどうかを決定するために、非アポトーシス細胞数の統計学的に有意な減少および／またはポトーシス細胞数の統計学的に有意な増加をそれぞれ観察してよい。

そのような決定のために、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）への曝露を含まない適切な対照群が設定される。例えば、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）への曝露がない以外は、共通した実験条件において、共通した運動ニューロンまたは感覚神経節が設定され、または、分解されたニトロ化剤（例えば、分解したパーオキシナイトライト）に曝され及び逆の順序で添加された対照ニューロトロフィンに対する曝露が設定される。実例となる培養および実験的条件の詳細は、下記の例で記述されており、見ることができる（例えば、図２Aおよびそれに関するコメント、ならびに「運動ニューロン培養物の精製」と題された段落参照）。

「統計学的に有意」または「有意に」という用語は、本願において、統計学の分野における通常の意味で使用され（例えばｔ検定、ｚ試験、χ二乗値またはＦ比率、その他）、すなわち、値を別の値と比較することおよびこれらの値が互いに異なるかどうかの決定に使用される。それ故、「統計学的に有意」または、「有意に」という用語は、当業者が、度数分布においてデータの広がりの量を測定する標準偏差を（必要の場合に）考慮に入れてもよいという事実を包含する。所望のｐ値は、通常、５％のαレベル、またはより厳密には１％のαレベルで設定される。

各々のニューロトロフィンの単量体は、同様の分子サイズ（１３．２−１５．９ｋＤａ、例外的にＮＴ−６は２１ｋＤａ）、５０％に近いまたはそれを上回る一次配列の同一性、範囲９−１０の等電点、および同様に保存された位置における６つの保存されたハーフ−システイン（これらは、３つの鎖内ジスルフィド結合を生じさせる）を含む、多くの化学的特性を共有している。これらの３つのジスルフィド結合は、特徴的なシステイン節を形成する（図１参照）。

好ましくは、前記ニューロトロフィンはＮＧＦまたはＢＤＮＦである。最も好ましくは、前記ニューロトロフィンはＮＧＦである。

マウスＮＧＦおよびヒトＮＧＦのアミノ酸配列は、図１１Ａ、１２Ａ（マウスＮＧＦ）および図１１Ｂおよび１２Ｂ（ヒトＮＧＦ）に示される。

好ましくは、前記ニューロトロフィンは、ヒトニューロトロフィン、最も好ましくはヒトＮＧＦである。

ニトロ化反応の生成物は、未反応の化合物および／または副産物を含んでよい。望ましい場合または必要な場合、前記翻訳後ニトロ化修飾の後、未反応の化合物および／または副産物からのニトロ化ニューロトロフィンの分離および／または単離が行われる。

ニトロ化反応の生成物は、ニトロ化ニューロトロフィンの幾つかの単量体／オリゴマー種を含んでよい。望ましい場合または必要な場合には、前記翻訳後ニトロ化修飾の後に、これらの異なる単量体／オリゴマー種のそれぞれの分離および／または単離が行われ、これによって、これらの種が互いに分離および／または単離される。

前記分離および／または単離は、例えば、ＨＬＰＣクロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣ溶出画分の質量分析（エレクトロスプレー飛行時間型質量分析）によって行うことができ、これによって、それぞれの単量体またはオリゴマー種が純粋な形態で得られる。

純粋な形態で１つの単一な単量体／オリゴマー種を得るのに適した方法は、サイズ排除、イオン交換、免疫親和性または、逆相クロマトグラフィーを使用した液体分離を含んでよい。非変質条件における電気泳動および免疫沈降を適用してもよい。

前記ニューロトロフィンのニトロ化は、好ましくは少なくとも１つのＴｙｒまたはＴｒｐ残基への、少なくとも１つのニトロ基の付加を可能にする条件の下で、前記ニューロトロフィンとニトロ化剤（例えばパーオキシナイトライトおよび／またはテトラニトロメタン）とを接触させることで行うことができる。

例えば、前記ニトロ化は、２０ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む、５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて行うことができる。

前記ニューロトロフィンは、例えば、０．２から１ｍｇ／ｍＬの濃度とすることができる。

前記ニューロトロフィンは、例えば、パーオキシナイトライト溶液（０．０１ＭのＮａＯＨ溶液中、０．２５から２ｍｇ／ｍＬの濃度）の少なくとも１回の大量添加（１マイクロＬ）に供してよい。前記パーオキシナイトライト溶液の複数回の大量添加、例えば、１０回までの大量添加（それぞれ１マイクロＬ）を行ってもよい。

パーオキシナイトライトの連続した大量添加は、用量依存的様相のオリゴマーのマー数（ｍｅｒ−ｎｕｍｂｅｒｓ）の増加をもたらす。これは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける３つの高分子量種の用量依存的様相（ニトロ化ＮＧＦについての図４Ａ参照）、または、リアルタイム多角度光散乱検出（ＭＡＬＳ）と組み合わせたＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ニトロ化ＮＧＦ二量体について３３．２±０．６ｋＤａ；ニトロ化ＮＧＦ四量体について６８．５±３．５ｋＤａ；ニトロ化ＮＧＦ八量体について６８．５±３．５ｋＤａ；図４Ｂ参照）にて観察される。驚くべきことに、パーオキシナイトライト処理したＮＧＦ二量体は、天然ＮＧＦ二量体よりも先に溶出し（ＭＡＬＳ分析と組み合わせられたＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって評価）、構造変化の存在を反映している。この用量依存的様相のオリゴマーのマー数の増加は、天然ＮＧＦの染色強度における漸進性の減少を伴う。

パーオキシナイトライトの連続した大量添加はまた、接触されるニューロトロフィンの用量依存的なニトロ化を誘導する（ニトロ化ＮＧＦについての図４Ｃ参照）。

天然ＮＧＦは、逆相ＨＰＬＣにおいて、３６．３および３８．１分の２つのピークとして溶出し（図５Ａ参照）、これらはＮＧＦ鎖ＡおよびＮＧＦ鎖Ｂに相当する。

ニトロ化ＮＧＦは、分子量が増加したＮＧＦ種の存在に起因して、例えば、３８．６分またはそのわずか後に溶出する。

それゆえ、本発明者らは、ニューロトロフィンが翻訳後修飾を受けることを示すことに加えて、これらの翻訳後修飾が、特に、ニトロ化、とりわけチロシンのニトロ化に起因することを示す。ニトロ化は、そのような翻訳後修飾を説明する化学修飾の唯一の可能性ではなかった。

実際、チロシンのニトロ化は、タンパク質の生物活性を変化させることが知られている、チロシンの唯一の酸化的修飾ではない：３−クロロ、３−ブロモ−または３−ヒドロキシチロシンへの塩素化、ブロム化および水酸化（これらは、炎症性症状で促進される）といった、チロシンのその他の酸化的修飾が既知である。

チオール酸化といった反応性の窒素種によって引き起こされるその他の酸化的な工程、鉄−硫黄クラスターの破壊および遷移金属中心の酸化は、多くの場合、細胞／機能障害／死の促進において、ニトロ化よりも関連し得る。

更に、生物学的ニトロ化のパーオキシナイトライトの役割は近年疑われている（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら．２０００Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：６３４６−６３５２；Ｔｈｏｍａｓら．２００２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１２６９１−１２６９６）。

さらに、本発明は、チロシン残基のニトロ化だけでなく、トリプトファンといったその他の残基のニトロ化（ならびに、一部のニューロトロフィンについて、メチオニンの酸化）も記載する。本発明は、さらに、高次構造的に異なるニトロ化された二量体、並びに異常なオリゴマー化（例えば四量体および八量体種の形成）をもたらす、ニューロトロフィン分子における構造変化を記述する。

最も好ましくは、修飾されたニューロトロフィンの単離された形態は、そのプロ−アポトーシス活性および／またはそのプロ−神経突起成長活性を妨げない分子構造である。

ニューロトロフィン（またはニューロトロフィン断片または変種）のニトロ化の後に得られる生成物は、例えば、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、反応混合物のその他の構成成分から単離することができる（例えばニトロ化ＮＧＦについての図５Ｂ参照）。このように得られる溶出物は、１つの単一のニトロ化ニューロトロフィンオリゴマー種またはニトロ化ニューロトロフィンオリゴマーの混合物を含んでよいが、ニトロ化ニューロトロフィン以外のその他の何れかの化合物を取り除いてもよい。

必要に応じて、そのような溶出物は、例えばＨＰＬＣクロマトグラフィーによって更に精製し、互いに異なるオリゴマー種を単離し、または、少なくとも別の種または種混合物からの特定の種混合物を単離してもよい。

溶出物は、液体以外の形態、例えば固体で処方できる。生成物の構造および高次構造を崩すことなく、最初は液体状態で利用できる生成物の固体状態の製剤を得るのに適した技術は当業者に既知である。そのような技術は、例えば、膜分離および／または蒸発および／または結晶化および／または凍結濃縮を含んでよい。

好ましくは、修飾されたニューロトロフィンの単離された形状は、何れの非ニトロ化プロニューロトロフィンおよび／または何れの非ニトロ化成熟ニューロトロフィンも含まない。

それは、好ましくは、何れかの未反応ニューロトロフィン、例えば非ニトロ化ＮＧＦ二量体も、何れかの残留するニトロ化剤も含まない。好都合に、それは、少しもニトロ化および／または非ニトロ化プロニューロトロフィン（プロ−ＮＧＦ、プロ−ＢＤＮＦ、プロ−ＮＴ−３、プロ−ＮＴ−４）も含まない。それは、とりわけ、何れかのニトロ化および／または非ニトロ化プロ−ＮＧＦも含まない（商業的に入手可能なＮＧＦ生成物の全てが、実際に、成熟ＮＧＦおよびプロ−ＮＧＦの混合物であるとは考えられない場合、多数）。

最も好ましくは、それは、実質的に純粋な形状（下で定義されるように）であり、より好ましくは、ニトロ化ニューロトロフィン単量体および／またはオリゴマー以外の何れの化合物も含まない純粋な形状である。

「単離された」タンパク質とは、本来それが伴っているその他の構成成分（例えば、由来となる種からのタンパク質および隣接するゲノム配列）から実質的に分離され、および、タンパク質合成および／またはニトロ化反応において存在しまたはそれらの際に形成される可能性のあるその他の化学薬品または化合物から実質的に分離された、タンパク質である。「単離された」という用語は、自然発生のタンパク質またはポリペプチド、ならびに、化学的に合成したタンパク質またはポリペプチド、および、異種の系によって合成したタンパク質またはポリペプチドを包含する。

「実質的に純粋」とは、一般的に、本来の供給源と成る生物に由来する、または、タンパク質合成および／またはニトロ化反応において存在するもしくはそれらの際に形成される化学薬品または化合物に由来する、その他の化合物（例えば、混入したタンパク質、核酸、またはその他の生物学的化合物）から単離されたタンパク質を意味する。純度または「単離」は、標準的方法で、典型的に重量によって評価してよく、一般に、少なくとも約７０％純粋、より一般に少なくとも約８０％純粋、しばしば少なくとも約８５％純粋、よりしばしば少なくとも約９０％純粋、好ましくは少なくとも約９５％純粋、より好ましくは少なくとも約９８％純粋、および最も好ましい実施態様では少なくとも９９％純粋であろう。担体または賦形剤がしばしば添加され、または、製剤は、無菌でありおよび／または緩衝液の構成成分を含んでもよい。

実質的に純粋な分子は、分子の単離された形状を含む。単離されたタンパク質は、通常、分子の均一な組成であるが、一部の実施態様では、マイナーな不均一性を含むだろう。この不均一性は、典型的に、ポリマーの端または部分で見つかり、望ましい生物学的機能または活性に重要ではない。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、単量体またはオリゴマー、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体から成る。本発明の好ましい修飾ニューロトロフィンの１つは、単量体または二量体または四量体または六量体または八量体の形態である。

あるいは、本発明の修飾ニューロトロフィンは、少なくとも２つの異なるオリゴマー種、例えば少なくとも３つの異なるオリゴマー種から成ってもよい。本発明の修飾されたニューロトロフィンは、このように、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体からなる群から選択される、少なくとも２つの、例えば少なくとも３つの異なるオリゴマー種から成ってもよい。

本発明の好ましい修飾ニューロトロフィンの１つは、二量体、四量体および八量体から選択される少なくとも２つの異なるオリゴマー種から成る。本発明の好ましい修飾ニューロトロフィンの１つは、従って、２つのオリゴマー種、例えば二量体および四量体、または二量体および八量体、または四量体および八量体から成ってよい。本発明のその他の好ましいニューロトロフィンは、従って、３つのオリゴマー種、例えば二量体、四量体および八量体から成ってよい。本発明のさらに好ましいその他のニューロトロフィンは、従って、４つの異なるオリゴマー種、例えば二量体、四量体、六量体および八量体から成ってよい。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、固体の状態または液体の状態とすることができる。

ニューロトロフィン、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ−４は、２つの非共有結合的に繋がったモノマーから成る二量体構造を有している。そのような二量体構造がニトロ化に供された場合、少なくとも１つのモノマー、好ましくは２つのモノマーのニトロ化が、好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される、少なくとも１つの残基における、少なくとも１つのニトロ基の付加によって生じる。

それゆえ、翻訳後修飾生成物が溶液である場合、修飾ニューロトロフィンの二量体の凝集体が生じてもよく、前記凝集体は動的な混合物であり、ここにおいて、異なるオリゴマー種は、互いに平衡に達し、二量体、四量体、六量体、八量体から選択される少なくとも２つの異なるオリゴマー構造の混合物を形成してよい。

前記修飾ニューロトロフィンは、従って、二量体、四量体、六量体および八量体構築物から、好ましくは二量体、四量体および八量体構造から選択される少なくとも２つの異なるオリゴマー構造から成るオリゴマー混合物の形態であってよい。

にもかかわらず、使用される特定のニトロ化条件および／または特定のニトロ化剤に依存して、得られる生成物は、単一のオリゴマー種から構成されてよい。例えば、ニューロトロフィン出発物質の濃度が低い場合、得られる修飾ニューロトロフィン生成物は、ニトロ化ニューロトロフィンオリゴマーの単一の種、特にニトロ化ニューロトロフィン二量体の単一の種から構成されてよい。例えば、ＮＧＦが出発物質として０．２−０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される場合、（例えば、パーオキシナイトライトおよび／またはテトラニトロメタンによる）ニトロ化から得られる生成物は、ニトロ化ＮＧＦ二量体の単一の種から構成されてよい。そのような修飾ニューロトロフィン二量体は、少なくとも１つのニトロ基の存在によって天然（健康的）ＮＧＦ二量体と異なるだけでなく、分子構造によっても異なる。これは、例えば、特に修飾ＮＧＦ二量体についての、リアルタイム多角度光散乱検出（ＭＡＬＳ）分析と組み合わせたＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより証明される（図４Ｂ参照）。修飾ニューロトロフィン二量体は、更に、由来となった非修飾型天然ニューロトロフィン二量体の１つとは劇的に異なる生物活性を示す。修飾ニューロトロフィン二量体は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経炎の成長を誘導および／または刺激することができ、一方、非修飾型天然ニューロトロフィン二量体は、そのような活性を示さず、または非常に低いレベルでしか示さず、ニトロ化ニューロトロフィン二量体で認められる場合より有意に劣っている。例えば、本発明のニトロ化ＮＧＦ二量体は、その由来となった非修飾天然ＮＧＦ二量体より、約１０，０００倍高いアポトーシス活性を有する。

修飾ニューロトロフィンの由来となる前記ニューロトロフィンは、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５および／またはＮＴ−６でありえる。好ましくは、それは、成熟ＢＤＮＦ、成熟ＮＴ−３、成熟ＮＴ−４／５または成熟ＮＴ−６である。

あるいは、修飾ニューロトロフィンの由来である前記ニューロトロフィンはＮＧＦでありえる。好ましくは、これは成熟ＮＧＦである。

ＮＧＦは、約２７ｋＤａのホモ二量体である［３８、３９］。マウスＮＧＦモノマーは１１８のアミノ酸を有するが、ＮおよびＣ末端の両方で切断されたより短い鎖も確認された［３８、４０］。マウスＮＧＦは、位置５２および７９に、２つのチロシン残基を含む（図１参照）［４１］。ニューロトロフィンファミリーの全てのメンバーで保存されるため、Ｔｙｒ５２は、二量体インタフェースにおいて疎水性の接触に関与し、また、ｐ７５^ＮＴＲ結合に関与する［３９、４２］。部位特異的変異誘発の研究は、安定性のタンパク質高次構造の決定における、このチロシン残基の構造上の重要性を明らかにした［４３］。一方で、Ｔｙｒ７９は大部分のＮＧＦで保存されているが、ニューロトロフィンファミリーのその他のメンバーでは保存されていない［４１］。マウスＮＧＦでは、このチロシンは、同じプロトマーの残基と接触し、また、第２のプロトマーのＮ末端と相互作用できた［３９］。これらのチロシン残基は非常に保存されているため、これらの残基のパーオキシナイトライト修飾は、ＮＧＦ生物活性においてで重要な影響力を有する。

マウスＮＧＦおよびヒトＮＧＦのそれぞれの例証となる配列は１１Ａ図および１１Ｂに示される。

成熟マウスＮＧＦおよび成熟ヒトＮＧＦのそれぞれの配列は１２Ａ図および１２Ｂに示される。

以下のことにおいて、特異的なＮＧＦ残基、とりわけ特異的なＴｙｒおよびＴｒｐ残基が参照される。これらの残基は、それらのアミノ酸位置（例えば、Ｔｙｒ５２またはＴｒｐ９９）によって同定される。残基の位置は、このなかでは、成熟タンパク質の配列を参照することによって、例えば、マウスＮＧＦでは、図１２Ａに示される配列番号１の配列を参照することによって、または、ヒトＮＧＦでは、図１２Ｂに示される配列番号２の配列を参照することによって、算出される。

図１２Ａは、マウスＮＧＦに含まれる３つのＴｒｐ残基および２つのＴｙｒ残基（Ｔｒｐ２１、Ｔｙｒ５２、Ｔｒｐ７６、Ｔｙｒ７９、Ｔｒｐ９９）を示す。

図１２Ｂは、ヒトＮＧＦに含まれる３つのＴｒｐ残基および２つのＴｙｒ残基（Ｔｒｐ２１、Ｔｙｒ５２、Ｔｒｐ７６；Ｔｙｒ７９、Ｔｒｐ９９）を示す。

好都合に、本発明の修飾ニューロトロフィンはニトロ化ＮＧＦであり、ここにおいて、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基は、少なくとも１つのニトロ基を含む。

前記ニトロ化ＮＧＦは、純粋な形態のニトロ化ＮＧＦプロトマー、例えば、ニトロ化ＮＧＦ鎖Ａまたはニトロ化ＮＧＦ鎖Ｂ（鎖Ｂは、鎖Ａに存在する８つのＮ末端残基を欠く）でありえる。

前記ニトロ化ＮＧＦは、純粋な形態で、ニトロ化ＮＧＦ鎖Ａおよび／またはニトロ化ＮＧＦ鎖Ｂのニトロ化ＮＧＦオリゴマーでありえる。

そのようなニトロ化ＮＧＦオリゴマーは、（２つのニトロ化ＮＧＦ鎖Ａから成る、または１つのニトロ化鎖Ａと１つのニトロ化ＮＧＦ鎖Ｂとから成る、または２つのニトロ化鎖Ｂから成る）ニトロ化ＮＧＦ二量体でありえる。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦ二量体は、（ＭＡＬＳ分析との組み合わせによるＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって評価されるように）天然ＮＧＦ二量体より前に溶出し、これは構造変化の存在を反映していることが留意される（図４Ｂ参照）。

そのようなニトロ化ＮＧＦオリゴマーは、ニトロ化ＮＧＦ三量体、ニトロ化ＮＧＦ四量体、ニトロ化ＮＧＦ五量体、ニトロ化ＮＧＦ六量体、ニトロ化ＮＧＦ七量体、ニトロ化ＮＧＦ八量体でありえる。それは、好ましくは、ニトロ化ＮＧＦ二量体、ニトロ化ＮＧＦ四量体、ニトロ化ＮＧＦ六量体、ニトロ化ＮＧＦ八量体からなる群から選択される。より好ましくは、それは、ニトロ化ＮＧＦ二量体、ニトロ化ＮＧＦ四量体、ニトロ化ＮＧＦ八量体からなる群から選択される。

上述の通り、前記ニトロ化ＮＧＦオリゴマーは、オリゴマー混合物の形態、例えば、二量体、四量体、六量体および八量体種から選択される少なくとも２つの異なるオリゴマー種からなるオリゴマー混合物、最も好ましくは、二量体、四量体および八量体種から選択される少なくとも２つの異なるオリゴマー種からなるオリゴマー混合物、より好ましくは、二量体および四量体および八量体種からなるオリゴマー混合物でありえる。

少なくとも１つのニトロ基を含むＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基は、マウスＮＧＦのＴｙｒ５２またはＴｙｒ７９、またはヒトＮＧＦのＴｙｒ５２またはＴｙｒ７９、またはその他の種からの何れか等価の残基といったＴｙｒ残基でありえる。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦ（配列番号：１）である場合、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は、好ましくは、マウスＮＧＦのＴｙｒ５２およびＴｙｒ７９残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基はマウスＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦ（配列番号：２）である場合、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は、好ましくは、ヒトＮＧＦのＴｙｒ５２、Ｔｙｒ７９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は、ヒトＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

少なくとも１つのニトロ基を含むＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基は、例えば、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９もしくはＴｒｐ２１もしくはＴｒｐ７６、またはヒトＮＧＦのＴｒｐ９９もしくはＴｒｐ２１もしくはＴｒｐ７６、またはその他の種からの何れか等価の残基であってよい。

ニトロ基を有する前記ニューロトロフィンのＴｙｒおよびＴｒｐ残基（前記残基の各々に少なくとも１つのニトロ基を有する）の数は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたは少なくとも９つでありえる。

前記ニューロトロフィンの全てのＴｙｒおよびＴｒｐ残基は、少なくとも１つのニトロ基を有してもよい。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｙｒ残基は、好ましくはマウスＮＧＦのＴｙｒ５２およびＴｙｒ７９残基である（図１２Ａ参照）。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｙｒ残基は、好ましくはヒトＮＧＦのＴｙｒ５２およびＴｙｒ７９残基である（図１２Ｂ参照）。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、好ましくはマウスＮＧＦのＴｒｐ９９、Ｔｒｐ２１およびＴｒｐ７６残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９またはＴｒｐ２１残基である。最も好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、好ましくはヒトＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｒｐ７６、Ｔｒｐ９９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、ヒトＮＧＦのＴｒｐ２１またはＴｒｐ９９残基である。最も好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、ヒトＮＧＦのＴｒｐ９９残基である。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は、好ましくはマウスＮＧＦのＴｒｐ９９、Ｔｒｐ２１およびＴｒｐ７６残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９およびＴｒｐ２１残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は、好ましくはヒトＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｒｐ７６、Ｔｒｐ９９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は、ヒトＮＧＦのＴｒｐ２１およびＴｒｐ９９残基である。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも３つのＴｒｐ残基は、好ましくはマウスＮＧＦのＴｒｐ９９、Ｔｒｐ２１およびＴｒｐ７６残基である（図１２Ａ参照）。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも３つのＴｒｐ残基は、好ましくはＴｒｐ２１、Ｔｒｐ７６、ヒトＮＧＦのＴｒｐ９９残基である（図１２Ｂ参照）。

ニトロ基を有するＴｙｒおよびＴｒｐ残基の数が少なくとも２以上の場合、これらの残基は、少なくとも１つのＴｙｒ残基および少なくとも１つのＴｒｐ残基（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有す）でありえる。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は好ましくはマウスＮＧＦのＴｒｐ９９、Ｔｒｐ２１およびＴｒｐ７６残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９またはＴｒｐ２１残基である。最も好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９残基である。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は好ましくはマウスＮＧＦのＴｙｒ５２およびＴｙｒ７９残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は、マウスＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

これらのＴｙｒおよびＴｒｐ残基の全ての組合せは、本願に包含される。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９またはＴｒｐ２１残基であり、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基はマウスＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は好ましくはヒトＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｒｐ７６、Ｔｒｐ９９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、ヒトＮＧＦのＴｒｐ２１またはＴｒｐ９９残基である。最も好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は好ましくはヒトＮＧＦのＴｙｒ５２、Ｔｙｒ７９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基は、ヒトＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

これらのＴｙｒおよびＴｒｐ残基の全ての組合せは、本願に包含される。より好ましくは、前記少なくとも１つのＴｒｐ残基はヒトＮＧＦのＴｒｐ９９またはＴｒｐ２１残基であり、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基はヒトＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、ニトロ基を有する少なくとも１つのＴｙｒおよび少なくとも２つのＴｒｐ残基を含んでもよい（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有する）。

前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は好ましくはマウスＮＧＦのＴｒｐ９９、Ｔｒｐ２１およびＴｒｐ７６残基から選択される（図１２Ａ参照）。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９およびＴｒｐ２１残基である。

これらのＴｙｒおよびＴｒｐ残基の全ての組合せは、本願に包含される。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基はマウスＮＧＦのＴｒｐ９９およびＴｒｐ２１残基であり、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基はマウスＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

前記ニューロトロフィンがヒトＮＧＦである場合、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基は好ましくはヒトＮＧＦのＴｒｐ２１、Ｔｒｐ７６、Ｔｒｐ９９残基から選択される（図１２Ｂ参照）。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基はヒトＮＧＦのＴｒｐ２１およびＴｒｐ９９残基である。

これらのＴｙｒおよびＴｒｐ残基の全ての組合せは、本願に包含される。より好ましくは、前記少なくとも２つのＴｒｐ残基はヒトＮＧＦのＴｒｐ９９およびＴｒｐ２１残基であり、前記少なくとも１つのＴｙｒ残基はヒトＮＧＦのＴｙｒ５２残基である。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、ニトロ基を有する前記ニューロトロフィンの少なくとも１つのＴｙｒおよび少なくとも２つのＴｒｐ残基を含んでもよい（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有する）。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、ニトロ基を有する前記ニューロトロフィンの少なくとも１つのＴｙｒおよび少なくとも３つのＴｒｐ残基を含んでもよい（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有する）。

当然、Ｔｙｒ残基番号およびＴｒｐ残基番号のいずれかの組合せが、本発明に包含される。例えば、マウスＮＧＦは、３つのＴｒｐ残基および２つのＴｙｒ残基を有し（図１２Ａ参照）；ヒトＮＧＦは２つのＴｙｒ残基および３つのＴｒｐ残基を有する（図１２Ｂ参照）。

前記ニトロ化ニューロトロフィンは、酸化された少なくとも１つのＭｅｔ残基（例えばＭｅｔ＝Ｏ）を含んでもよい。前記ニューロトロフィンがマウスＮＧＦである場合、前記少なくとも１つのＭｅｔ残基は、好ましくは（成熟）マウスＮＧＦのＭｅｔ９残基である（図１２Ａ；配列番号１の位置９の残基Ｍ参照）。

本発明の修飾ニューロトロフィンは、非グリコシル化の形態、またはグリコシル化の形態とすることができる。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン、とりわけ本発明の少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィンに結合する化合物または組成物である結合剤に関する。ニトロ化ニューロトロフィンは、特に、ニトロ化ＮＧＦ、ニトロ化ＢＤＮＦ、ニトロ化ＮＴ−３、ニトロ化ＮＴ−４／５およびニトロ化ＮＴ−６を含む。実例となる結合剤は、抗体である。

本発明は、とりわけ、そのような修飾ニューロトロフィンに特異的に結合する特異的結合剤に関する。

本発明の特異的な結合剤は、特に、少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン、とりわけ少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィン（例えば、ニトロ化ＮＧＦ、ニトロ化ＢＤＮＦ、ニトロ化ＮＴ−３、ニトロ化ＮＴ−４／５、ニトロ化ＮＴ−６）に結合するこれらの化合物または組成物であって、前記少なくとも１つの修飾ニューロトロフィンの由来となる非修飾天然ニューロトロフィン（例えば、それぞれ、非ニトロ化天然ＮＧＦ、非ニトロ化天然ＢＤＮＦ、非ニトロ化天然ＮＴ−３、非ニトロ化天然ＮＴ−４／５、非ニトロ化天然ＮＴ−６）に結合しないものを含む。

そのような特異的な結合剤は、例えば、本発明の少なくとも２つのニトロ化ニューロトロフィン（例えばニトロ化ＮＧＦおよびニトロ化ＢＤＮＦ）に結合し、前記少なくとも２つのニトロ化形態の由来となる２つの非ニトロ化ニューロトロフィン二量体（例えば非ニトロ化ＮＧＦおよびＢＤＮＦ二量体）に結合しないものであってよい。

最も好ましくは、本発明の特異的な結合剤は、いずれかの非ニトロ化ニューロトロフィンに結合しない（それは、いずれかの非ニトロ化ＮＧＦに、いずれかの非ニトロ化ＢＤＮＧに、いずれかの非ニトロ化ＮＴ−３に、いずれかの非ニトロ化ＮＴ−４／５におよびいずれかの非ニトロ化ＮＴ−６に結合しない）。

好ましくは、本発明の特異的な結合剤は、本発明のニトロ化ＮＧＦに結合し、前記ニトロ化ＮＧＦの由来である非ニトロ化ＮＧＦ二量体に結合しない。最も好ましくは、そのような「ニトロＮＧＦ」特異的結合剤は、いずれかの非ニトロ化ＮＧＦ二量体に結合しない。最も好ましくは、そのような「ニトロＮＧＦ」特異的結合剤は、いずれかの非ニトロ化ニューロトロフィンに結合しない（それは、いずれかの非ニトロ化ＮＧＦに、いずれかの非ニトロ化ＢＤＮＦに、いずれかの非ニトロ化ＮＴ−３に、いずれかの非ニトロ化ＮＴ−４／５におよびいずれかの非ニトロ化ＮＴ−６に結合しない）。

そのような「ニトロＮＧＦ」特異的結合剤は、にもかかわらず、更に、本発明のニトロ化ＢＤＮＦ、ニトロ化ＮＴ−３、ニトロ化ＮＴ−４／５およびニトロ化ＮＴ−６から選択される少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィンに結合してよい。

好ましくは、本発明の結合剤または特異的結合剤はグルコースに結合しない。それは、したがって、好ましくはグルコースに対する何れかの機能的結合部位を含まない。

好ましくは、本発明の結合剤または特異的結合剤は、前記結合剤または特異的結合剤が結合する修飾ニューロトロフィンの少なくとも１つの活性を、調整し、最も好ましくは、抑制または遮断する。前記結合剤または特異的結合剤は、例えば、運動ニューロンにおいて前記少なくとも１つの修飾ニューロトロフィンによって及ぼされるプロアポトーシス効果を阻害または遮断してよく、および／または、感覚神経節において前記少なくとも１つの修飾ニューロトロフィンによって及ぼされる神経突起成長刺激および／または誘導効果を阻害または遮断してよい。

好ましくは、本発明の結合剤または特異的結合剤は、非修飾天然成熟ニューロトロフィンの由来となる非ニトロ化プロニューロトロフィン（すなわち天然プロニューロトロフィン）に結合しない。より好ましくは、本発明の結合剤または特異的結合剤は、何れかの非ニトロ化プロニューロトロフィン（すなわち、何れかの天然プロニューロトロフィン）に結合しない。

本発明の結合剤または特異的結合剤は、にもかかわらず、ニトロ化プロニューロトロフィン並びにニトロ化ニューロトロフィンに結合してよい。

本発明のその他の結合剤または特異的結合剤は、ニトロ化ニューロトロフィンに結合し、ニトロ化プロニューロトロフィンに結合しないでよい。

より好ましくは、本発明の結合剤または特異的結合剤は、ｐ７５^ＮＴＲおよび／またはＴｒｋＡに結合しない。

前記結合剤は、例えば、ＱＹＦＦＥＴＫ（配列番号７）から選択されるニトロ化エピトープに結合してよく、ここにおいて、これらのエピトープの位置２のＴｙｒ残基（Ｙ）は少なくとも１つのニトロ基を有する。このＴｙｒ残基は、マウスＮＧＦのＴｙｒ５２に、またはヒトＮＧＦのＴｙｒ５２に相当する。このＴｙｒ残基は非常に保存されている。

本発明の前記結合剤または特異的結合剤は、好都合に、抗体、または、そのような抗体の機能を模倣する化学物質であってよい。

[抗体および抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙｍｉｍｉｃｓ）］
抗体は、完全に組み立てられた抗体、一本鎖の抗体、Ｆａｂ断片、およびキメラ抗体、ヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、ポリクローナル（例えば多クローン性血清）またはモノクローナル抗体であってよい。

本発明の抗体は、また、タンパク質、抗体といったその他の治療薬との組み合わせで、および／または、特定の細胞型を特異的に標的とするターゲティング分子との組み合わせで、および／または、前記抗体を容易に検出するための検出ラベル（例えば放射性同位元素）との組み合わせで使用してよい。

抗体を製造するための実際的な手段は当業者に既知である。

既知の方法によって、ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）、または、その抗原的に機能的な誘導体によって、動物を免疫化することができる。

適切な動物は、特に、哺乳類、とりわけ非ヒト哺乳類、例えばウサギを含む。

例えば、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）またはその抗原的に機能的な誘導体が、哺乳類に腹腔内または皮下注射される。

前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）またはその抗原的に機能的な誘導体は、適切な量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、生理食塩水等で希釈され、またはこれらに懸濁してよい。

適切な量の標準的アジュバントは、必要または望ましい場合、生成物と混合される。例証となる標準的アジュバントは、特に、フロイント（完全または不完全）アジュバント、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および、潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ）を含む。

二官能性または誘導体化薬剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通しての共役）、Ｎヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通して）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物またはＳＯＣｌ_２）を用いて、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）を免疫化される種にとって免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）に共役させることが有用であってよい。

溶液は、数回（例えば、一日に４〜２１回）動物に投与される。加えて、適切な担体もまた、免疫原による免疫化に使用できる。

ポリクローナル抗体は、抗体分子の不均一な集団であり、前記少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）、またはその抗原的に機能的な誘導体で免疫化した動物の血清に由来する。

特定の抗原に対する均質な抗体の集合であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養物中の連続継代細胞系による抗体分子の生産のためのあらゆる技術によって得てよい。

これらは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７；ａｎｄＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４：７２；Ｃｏｌｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）を含むが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンクラスであってよい。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養してよい。

本発明のｍＡｂの生産は、特に、免疫化された動物由来の免疫細胞（例えば脾細胞）の回収、および、これらの免疫細胞と融合パートナーとの融合を含む。

上記の免疫細胞と融合されるパートナー細胞として、哺乳類のミエローマ細胞を使用することができる。好んでここに使用されるミエローマ細胞の細胞系の例は、ネズミミエローマ細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４といった様々な既知の細胞系、または、ＡＴＣＣＨＢ８４６４細胞系といった融合型マウスミエローマ／非悪性Ｂリンパ球株を含む。

上述の免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的に、既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法によって行うことができる（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）。

より具体的には、上記の細胞融合は、標準栄養培養液で、例えば、細胞融合促進物質の存在下で行なわれる。細胞融合促進物質として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）などが使用される。望ましい場合、ジメチルスルホキシドといったアジュバントも、さらなる融合効率の増強のために追加して使用できる。

ミエローマ細胞に対する免疫細胞のいずれかの比率が、ここでの使用のために設定されてよい。例えば、免疫細胞の数がミエローマ細胞のそれより１〜１０倍大きいことが望ましい。上述の細胞融合のために使用される培養液として、例えば、ＲＰＭ１１６４０培養液、または、上述のミエローマ細胞株の成長に適切なＭＥＭ培養液、または、この種の細胞培養のために使われるその他の標準的培養液を使用できる。さらに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）といった血清液体を、これらと併用して使用することができる。

細胞融合は、上記の培養液において、十分な量の上記免疫細胞およびミエローマ細胞を混合し、ほぼ３７℃に予め加熱したＰＥＧ（例えば、約１０００〜６０００の平均分子量を有する）溶液（一般に３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度）を添加し、次に溶液を混合し、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成することで行われる。続いて、適切な培養液を連続的に添加し、次に、遠心分離による上澄みの除去の工程を繰り返し、ハイブリドーマの成長に不利な細胞融合のための試薬等が除去される。

そのように得られたハイブリドーマは、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）といった標準選択培養溶液におけるハイブリドーマの培養によって選択される。上記のＨＡＴ培養液における培養は、目的のハイブリドーマ以外の細胞（融合していない細胞）が死ぬのに十分な期間（通常、数日から数週間）継続される。続いて、標準限界希釈法が行われ、目的の抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニング及びモノクローニグ（ｍｏｎｏｃｌｏｎｉｎｇ）が行なわれる。

抗原で非ヒト動物を免疫化することによって上述のハイブリドーマを得る方法に加えて、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）に対する結合活性を有する望ましいヒト抗体は、また、前記ニトロ化ニューロトロフィン（またはその断片もしくは変種）またはその機能的な抗原性誘導体で、インビトロでヒトリンパ球を感作すること、および、感作したリンパ球を永続的な分裂能を有するヒト由来ミエローマ細胞と融合させることによって得ることができる（日本特許出願（公告）Ｎｏ．１−５９８７８Ｂ（１９８９）参照）。

そのように作製したモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、標準培養液で継代培養でき、または、液体窒素に長期間に保存できる。

ハイブリドーマからモノクローナル抗体を得るために使用される方法の１例は、ハイブリドーマを培養し、標準的方法によって培養上清中のモノクローナル抗体を得ることを含む。その他の方法は、ハイブリドーマを増殖させることに適合性のある哺乳類にハイブリドーマを投与し、腹水中のモノクローナル抗体を得ることに関する。前者の方法は高純度の抗体を得るのに適切である。一方、後者の方法は抗体の大量生産に適す。

本発明に使用できるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングし、遺伝子を適切なベクターに組み込み、宿主にベクターを導入し、その後、遺伝子工学技術によって、組換えモノクローナル抗体を宿主に生産させることによって作られる組換えモノクローナル抗体であってよい（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ら．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。

上述の宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物または植物もまた、組換え抗体の生産に使用できる。

上述の抗体に加えて、キメラ抗体またはヒト化抗体といった人工的に改変した遺伝子組換え抗体を、例えば、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために使用することができる。これらの改変抗体は、既知の方法を使用して生産できる。

キメラ抗体は、例えば、抗体可変部をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとをつなぎ、発現ベクターに生成物を組み込み、その後、宿主にベクターを導入して抗体の生産を誘導することで得ることができる。この既知の方法を使用して、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

ヒト化抗体はまた、ヒト以外の哺乳類（例えばマウス）の抗体ＣＤＲ（相補性決定領域）をヒト抗体のＣＤＲに融合させて得られる、再構築ヒト抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）とも呼ばれる。その一般的遺伝子組み換え技術は既知である（欧州特許出願公開ＥＰ１２５０２３およびＷＯ９６／０２５７６、またはその対応米国出願の１つ、例えばＵＳ６０６８０４０を参照）。

本発明に使用される抗体は、分子全体に限定されず、それが少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）に結合し、且つ、前記少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）による、運動ニューロンに対するアポトーシス効果を抑制および／または遮断する能力、および／または、前記少なくとも１つのニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）による、感覚神経節に対する刺激および／または誘導の効果を抑制および／または遮断する能力を維持する限り、抗体の断片またはその修飾された生成物であってもよい。

多価の、好ましくは二価の抗体および一価の抗体が含まれる。抗体の断片の例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１つのＦａｂおよび完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃおよび一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み、ここにおいて、Ｈ鎖またはＬ鎖のＦｖは連結される。具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンといった酵素で抗体を処理することで合成され、または、これらの抗体断片をコードする遺伝子が構築され、この遺伝子が発現ベクターに導入され、および、その後、この遺伝子が適切な宿主細胞にて発現される（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。

ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とをつなぐことで得られる。ｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とは、リンカー、または好ましくはペプチドリンカーを介してつなげられる（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖのＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書にて記載される抗体の何れかを由来としてよい。Ｖ領域をつなぐペプチドリンカーとして、例えば、１２から１９のアミノ酸残基を含む何れかの一本鎖ペプチドが使用される。

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは以下の通りに得ることができる。増幅は、（上記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および、Ｌ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの）所望のアミノ酸配列をコードする全体またはＤＮＡ部分をテンプレートとして用いて、および、両端を特定するプライマーペアを用いて、ＰＣＲ方法によって実行される。増幅は、その後さらに、ペプチドリンカー部をコードするＤＮＡおよび両端がＨ鎖およびＬ鎖にそれぞれ連結するように特定するプライマーペアを組み合わせた使用により行われる。

更に、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを調製すれば、当該ＤＮＡを含む発現ベクター、および当該発現ベクターで形質転換された宿主は、標準的な方法によって得ることができる。加えて、宿主の使用によって、ｓｃＦｖは標準的方法に従って得ることができる。

これらの抗体断片は、宿主を用いて、上記方法と同様の様式でその遺伝子を得て、その後当該遺伝子の発現を行うことで得ることができる。本発明における「抗体」はまた、これらの抗体断片を含む。

培養にて増殖する遺伝子組換え哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞）は、全長ｍＡｂの製造において産業上の標準であるものの、哺乳動物細胞は、抗体断片（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）の生産に対する適正が低い可能性があり、原核生物の発現系（例えばＥ．コリ）またはその他の真核生物の発現系（例えば酵母または植物細胞）が、好んで使用されてもよい。

更に、本発明に使用される抗体は、遺伝子工学技術によって製造することもできる、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。

上記のように発現され製造される抗体は、細胞または宿主動物から単離でき、および均一な濃度で精製できる。本発明に使用される抗体の単離および精製は、アフィニティーカラムを用いて実行できる。プロテインＡカラムを使用するカラムの例は、ＨｙｐｅｒＤ，ＰＯＲＯＳ，ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。タンパク質に使用されるその他の標準的な単離および精製方法を使用してよく、これらの使用に関して制限はない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析法、透析等を、適切に選択し、および、組み合わせて使用してよく、それによって、抗体を単離しおよび精製できる（ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＥｄＨａｒｌｏｗ，ＤａｖｉｄＬａｎｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。

抗体の機能を模倣する化学物質を製造することができる。

本発明の抗体の機能を模倣する化学物質の構築および製造の幾つかの方法が存在する。

１つのアプローチでは、代替となるタンパク質フレームワーク（例えば、チトクロムｂ５６２またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む構造）を利用する（Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎら．１９９６，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１６４−１７０）。

ベンゾジアゼピン、ベータ−ターン模倣物（ｂｅｔａ−ｔｕｒｎｍｉｍｉｃｓ）、プロテアーゼ阻害剤およびプリン誘導体といった非天然オリゴマーもまた、抗体模倣物として機能する能力について試験された。

非天然生体高分子（例えば、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅｓ）、オリゴウレア(ｏｌｉｇｏｕｒｅａｓ)およびオリゴスルホン(ｏｌｉｇｏｓｕｌｆｏｎｅｓ)）が、抗体模倣物として提案されている。

抗体の認識特性の一部を有する分子が、骨格（例えばキサンテーゼ(ｘａｎｔｈｅｓｅ)またはクバン）またはカリックスアレーン単位に様々な置換基をつなぐことで構築された。これらの分子は、認識部位として複数のペプチドループを有すが、骨格によって形成される相対的に強固な有機フレームワーク周辺に造られる。

本発明は、とりわけ、ニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）による運動ニューロンに対するアポトーシスの効果を抑制および／または遮断する、および／または、ニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはその変種）による感覚神経節に対する刺激および／または誘導の効果を抑制および／または遮断する能力を有するこれらの抗体模倣物に関する。

［本発明の修飾ニューロトロフィンのコンペティター（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）をスクリーニングする生物学的システム］
本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）と競合する分子のスクリーニングに使用できる生物学的システムの構築および製造のいくつかのアプローチも存在する。

好ましいシステムのうちの１つは、リボソームディスプレイシステム（ｒｉｂｏｓｏｍａｌｄｉｓｐｌａｙｓｙｓｔｅｍ）である。リボソームディスプレイシステムは、少なくとも１つのリボソーム、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも１つのこのタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。有利なリボソームディスプレイシステムは、ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって記述された（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９４，ｐａｇｅｓ４９３７−４９４２）。そのようなリボソームディスプレイシステムは、本発明の抗体、とりわけ本発明の特異的な抗体、好都合に本発明のｓｃＦｖ、とりわけ本発明の特異的なｓｃＦｖに適用できる。

したがって、本発明は、また、本発明の少なくとも１つのｓｃＦｖ（とりわけ本発明の少なくとも１つの特異的なｓｃＦｖ）ならびにｓｃＦｖ等をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡが付着された、少なくとも１つのリボソームから成る、リボソームディスプレイシステムに関する。

そのような生物学的システム、および、とりわけそのようなリボソームディスプレイシステムは、そのような生物学的システムに結合する化合物、および好ましくは、本発明の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくは保存的変種）と、前記生物学的システムへの結合において競合する化合物のスクリーニングに好都合に使用できる。

そのような化合物は、それによって、同定および単離される。

好ましい化合物は、本発明のリボソームディスプレイシステム（好ましくは、少なくとも１つのリボソーム、本発明の少なくとも１つの特異的なｓｃＦｖおよびこのｓｃＦｖをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む）に結合し、別のリボソームディスプレイシステムと交差反応（すなわち結合）しないものであり、ここにおいて、前記その他のリボソームディスプレイシステムはまた、少なくとも１つのリボソーム、少なくとも１つの抗体（例えばｓｃＦｖ）およびこの抗体をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含むが、前記抗体（前記ｓｃＦｖ）は、少なくとも１つのニューロトロフィンに結合し、この少なくとも１つのニューロトロフィンから得られる何れの修飾ニューロトロフィンにも結合しない。

本発明は、とりわけ、運動ニューロンに対するニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはの変種）によるアポトーシスの効果を調節、好ましくは抑制および／または遮断する能力、および／または、感覚神経節に対するニトロ化ニューロトロフィン（または断片もしくはの変種）による刺激および／または誘導の効果を調節、好ましくは抑制および／または遮断する能力を有するこれらの化合物に関する。

そのような化合物は、その調節活性、好ましくはその阻害または遮断活性を、ＴｒｋＡ、ｐ７５^ＮＴＲ、またはその他の受容体もしくは補助受容体（例えばソーティリン）といった内因性の標的への結合について、内因性ニトロ化ニューロトロフィンと競合することにより、発揮してよい。

［治療的および診断的応用］
本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）は、運動ニューロンのアポトーシスおよびまたは感覚神経節からの神経突起成長の誘導および／または刺激の能力を有する。

修飾ニューロトロフィンの非保存的断片は、当業者によって、例えばペプチドまたはポリペプチド合成によって製造できる。

少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって、修飾ニューロトロフィンの非保存的変種、または前記修飾ニューロトロフィンもしくは修飾ニューロトロフィン断片に由来する修飾ニューロトロフィン断片の非保存的変種もまた、例えばペプチドまたはポリペプチド合成によって当業者が製造することができる。

そのような非保存的断片または変種は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を失っており、または、哺乳類に注入した場合、そのような誘導および／または刺激について検出可能な能力を非常に低い程度でしか示さない。

そのような非保存的断片または変種は、それ自身においておよびそれ自身の抗原性であってよく、または、少なくとも１つのその他の化合物（例えば、共に添加された、または抱合によって添加されたアジュバント）と関連して、抗原性になり、または、抗原性を増大させることができる。

そのような非保存的断片または変種は、したがって、能動免疫のための薬剤として使用してよい。それを必要とする哺乳類（例えばヒト）に投与される場合、それは、免疫応答、とりわけ抗体産生応答を誘導および／または促進でき、それによって、本発明の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）に結合する抗体が、前記哺乳類によって製造される。

好ましい非保存的断片または変種は、抗体産生応答を誘導および／または刺激し、それによって、本発明の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）に結合するが、非修飾天然の（健康的な）ニューロトロフィンに結合しない抗体が前記哺乳類から製造されるものである。

そのような非保存的断片または変種は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経突起成長の治療および／または寛解および／または予防のための免疫抗体産生応答を誘導する抗原として有用である。それゆえ、そのような本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）は、痛みの治療および／または寛解および／または予防のための薬剤として、および／または、神経変性の疾病または症状の治療および／または寛解および／または予防のための薬剤として、有用である。

化合物、例えば、本発明のリボソームディスプレイシステムによるスクリーニングによって同定および単離できる化合物は、本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）の活性と競合し、それによって、運動ニューロンのアポトーシス、および／または感覚神経節からの神経突起成長を遮断および／または阻害できる。

それ必要とする哺乳類（例えばヒト）に投与される場合、そのような化合物は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または感覚神経節からの神経突起成長の遮断および／または阻害に有用である。

本発明の結合剤、そのような本発明の抗体、および、とりわけ本発明の特異的な抗体は、本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）に結合する。

そのような結合剤は、受動免疫のための薬剤として有用である。それ必要とする哺乳類（例えばヒト）に投与される場合、そのような結合剤は、前記本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）に結合し、それによって、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または感覚神経節からの神経突起成長を遮断および／または阻害するだろう。

そのような結合剤は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または感覚神経節からの神経突起成長を遮断および／または阻害する薬剤として有用である。

そのような結合剤は、運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経突起の成長の受動免疫治療および／または寛解および／または予防のための薬剤として有用である。それゆえ、そのような結合剤は、痛みの治療および／または寛解および／または予防のための薬剤として、および／または、神経変性の疾病または症状の治療および／または寛解および／または予防のための薬剤として有用である。

本発明はまた、以下の組成物に関する：
−本発明の非保存的断片および非保存的変種から成る群から選択される少なくとも１つの要素を含む何れかの組成物、または、
−少なくとも１つの前記競合化合物を含む何れかの組成物、または
−本発明の結合剤（とりわけ本発明の特異的な結合剤、さらにとりわけ本発明の抗体、化学的模倣物、および生物学的模倣物）から成る群から選択される少なくとも１つの要素を含む何れかの組成物。

そのような組成物は、さらに、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、医薬的ベヒクル、生理的に許容可能なベヒクル、アジュバントから成る群から選択される少なくとも１つの要素を含んでよい。

本発明は、そのような医薬組成物、免疫原性組成物、免疫学的組成物、薬剤またはワクチンに関する。

能動免疫のための抗原として使用される場合、本発明の非保存的断片および非保存的変種、またはそれらの抗原的に機能的な等価物から成る群から選択される少なくとも１つの要素が、さまざまな経路を介して、哺乳類、好ましくはヒトに投与されてよい。

受動免疫のために使用される場合、本発明の結合剤（およびとりわけ特異的な結合剤、例えば特異的なｍＡｂ）、またはその抗原的に機能的な等価物は、さまざまな経路を介して、哺乳類、好ましくはヒトに投与されてよい。

これらの経路は、特に、経口的、非経口的、腹腔内、静脈内、動脈内、局所的、経皮的、舌下、筋肉内、直腸、経頬（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌｌｙ）、鼻腔内、リポソームによって（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｌｙ）、吸入によって、経膣的、眼球内（ｉｎｔｒａｏｃｃｕｌａｒｌｙ）、（例えばカテーテルまたはステントによる）局所送達によって、皮下、脂肪内（ｉｎｔｒａａｄｉｐｏｓａｌｌｙ）、関節内またはくも膜下腔内を含む。抗体は、局所的に（例えば、ステントまたはカテーテルによって）および／または定期的に放出される様式で、宿主に送達されてもよい。

本発明の結合剤（例えばＡｂ）、とりわけ本発明の特異的な結合剤（例えば特異的ｍＡｂ）もまた、動物における、例えば哺乳類（例えばヒト）における、とりわけそのような動物から採取したサンプル中における本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）の存在または過剰な存在の検出に有用である。

そのような本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）の過剰な存在は、神経変性の疾病もしくは症状または痛みの症状の存在またはそれらを発症するリスクを指し示す。

本発明の結合剤（例えばＡｂ）、とりわけ本発明の特異的な結合剤（例えば特異的なｍＡｂ）は、従って、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長に関する症状または疾病の存在またはそれらを発症するリスクの診断にも有用である。

運動ニューロンのアポトーシスを遮断および／または阻害することが有用である疾病または症状は、特に、神経変性の症状または疾病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、記憶欠損に関する何れかの疾病または症状、および／または、集中障害、ならびに、神経炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）症状または疾病を含む。

感覚神経節からの神経突起成長を遮断および／または阻害することが有用な疾病または症状は、特に、痛みの状態または症状または感覚を含み、とりわけ、以下のものを含む：
− 神経障害性の痛み（とりわけ、片頭痛、慢性的片頭痛、推定鎮痛薬乱用頭痛（ｐｒｏｂａｂｌｅａｎａｌｇｅｓｉｃ−ａｂｕｓｅｈｅａｄａｃｈｅＰＡＡＨ）、原発性線維筋痛症候群（ｐｒｉｍａｒｙｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａｓｙｎｄｒｏｍｅＰＦＭＳ）、神経損傷誘導性神経障害性疼痛（ｎｅｒｖｅ−ｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃｐａｉｎ）、坐骨神経傷害（ｓｃｉａｔｉｃｎｅｒｖｅｌｅｓｉｏｎｓ）、慢性的絞搾損傷（ｃｈｒｏｎｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ））、
− 関節の痛み（とりわけ、骨関節炎症状、骨関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、骨関節炎）、
− 炎症性疼痛、
− 癌疼痛。

本発明は、また、本発明の修飾ニューロトロフィン、その保存的断片、およびそのような修飾ニューロトロフィンの保存的変種またはそのような保存的断片の保存的変種を含む群から選択される少なくとも１つの要素を含む何れかの組成物に関する。そのような組成物は更に、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、医薬品的ベヒクル、生理的に許容可能なベヒクル、アジュバントから選択される少なくとも１つの要素を含んでよい。本発明は、そのような医薬組成物、免疫原性組成物、免疫学的組成物、薬剤またはワクチンに関する。

そのような組成物は、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の誘導および／または刺激に有用である。

これらは、したがって、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の刺激および／または誘導が望まれる疾病または症状の予防および／または治療および／または寛解に有用であり、好ましくは、神経突起成長の刺激および／または誘導が望まれる疾病または症状、例えば、神経障害および神経損傷をもたらす疾病、症状または外傷（脳卒中、脊椎損傷および神経変性の疾病を含む）の予防および／または治療および／または寛解に有用である。

本願は、また、それを必要とする哺乳類に有効量の抗体、抗体断片またはｓｃＦｖを投与することを含む、そのような疾病または症状の治療および／または寛解および／または予防のための方法に関し、ここにおいて、前記抗体、抗体断片またはｓｃＦｖは、少なくとも１つのニトロニューロトロフィンに結合し、前記少なくとも１つのニトロニューロトロフィンは、そのＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基の少なくとも１つのニトロ基を含み、非ニトロ化ニューロトロフィンと交差反応しない。

本願はまた、そのようなニューロトロフィン構造を含むと疑われるサンプル中において、ニューロトロフィン構造の異常な翻訳後修飾が存在するかどうかを決定する方法であって、本発明の結合剤、例えば本発明の抗体、とりわけ本発明の特異的な結合剤、例えば本発明の特異的な抗体が前記サンプルに含まれる標的に結合するかを決定し、これによって、そのような結合によって、異常な翻訳後修飾を受けたニューロトロフィン構造の前記サンプル中における存在が示されることを含む方法に関する。

前記異常な翻訳後修飾は、特に、上記のように説明され、下記のように例証される、前記ニューロトロフィン構造のニトロ化を含む。

本願はまた、上記の疾病または症状といった運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長に関する疾病または症状の診断のための方法およびキットに関する。

本発明のキットは、少なくとも１つの本発明の結合剤、例えば少なくとも１つの本発明の抗体、とりわけ少なくとも１つの本発明の特異的な結合剤、例えば少なくとも１つの本発明の特異的な抗体を含む。

本発明による診断方法は、本発明の結合剤、例えば本発明の抗体、とりわけ本発明の特異的な結合剤、例えば本発明の特異的な抗体が、前記診断を受ける哺乳類に含まれる、好のましくは、そのような哺乳類から採取した代表的サンプル（すなわち、ニューロトロフィン構造を含むこと疑われるサンプル）中に含まれる標的（すなわちリガンド）に結合するかどうかを決定し、それによって、そのような結合が、前記哺乳類が、前記疾病または症状を有し、またはそのような疾病または症状の高いリスクがあることを表すことを含む。

本願において、「診断」という用語は、従って、疾病または症状の存在の決定、ならびに、その発症の予測、または、少なくともそのような疾病または症状を発症する対象の傾向の評価を包含する。

［スクリーニングの方法］
本発明は、また、本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）が運動ニューロンに対して示す可能性のあるアポトーシス活性、および／または、本発明の修飾ニューロトロフィン（または保存的断片もしくはその変種）が感覚神経節に対して示す可能性のある神経突起成長効果を阻害および／または遮断する能力を有する化合物のスクリーニングの方法に関する。

候補化合物は、本発明の少なくとも１つの結合剤（例えば本発明の少なくとも１つの抗体）、とりわけ本発明の少なくとも１つの特異的な結合剤（例えば、本発明の少なくとも１つの特異的な抗体、例えば本発明の特異的なｍＡｂ）、または、本発明の少なくとも１つのリボソームディスプレイシステムに結合するそれらの能力についてスクリーニングされ、それによって、そのような結合能力によって、前記アポトーシス活性および／または前記神経突起成長効果を阻害および／または遮断する可能性が示される。

好ましい化合物は、非修飾天然ニューロトロフィンに特異的なｍＡｂ（すなわち、非修飾天然ニューロトロフィンに結合し、それを由来とする修飾ニューロトロフィンに結合しないｍＡｂ）に結合しないそれらの化合物である。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、制限がなく、および付加的で、列挙されない（ｕｎｒｅｃｉｔｅｄ）要素、成分または方法工程を除外せず、一方、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語は、特記しない何れの付加的要素、工程、または成分を除外する、閉じた用語である。

「から本質的に成る」という用語は、部分的に開いた用語であり、付加的な、列挙されない要素、工程または成分は、これらの付加的な要素、工程または成分が、本発明の基礎的なおよび新規の特性に具体的に影響しない限り、除外されない。

それ故、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」）という用語は、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」（「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｏｆ）」）という用語、ならびに、「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」（「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｏｆ）」）という用語を含む。従って、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」）という用語は、本願では、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」（「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｏｆ）」）という用語、および「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」（「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｏｆ）」）という用語をとりわけ包含した意味である。

本願に引用される全ての参考文献の関連ある開示のそれぞれは、特に援用される。以下の例は、例証として提供され、限定を意味しない。

概要
神経成長因子（ＮＧＦ）の過剰発現およびパーオキシナイトライトの生産の増大は、いくつかの神経変性の疾病において生じる。我々は、ＮＧＦが、その生物学的活性を調節する翻訳後の酸化的またはニトロ化的修飾を受け得るのかどうかを調べた。天然ＮＧＦと比較して、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦは、生理的に適切な濃度において、ｐ７５^ＮＴＲ依存性運動ニューロンアポトーシスを誘導する特殊な能力を示した。天然ＮＧＦが運動ニューロンの死を誘導するために、酸化窒素（ＮＯ）の外的供給源を必要とするのに対し、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦは、外因的なＮＯがない場合でも、運動ニューロンアポトーシスを誘導した。にもかかわらず、ＮＯはパーオキシナイトライト修飾ＮＧＦのアポトーシス活性を増強した。ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体またはアンチセンス処理によるｐ７５^ＮＴＲ発現のダウンレギュレーションは、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦによって誘導される運動ニューロンアポトーシスを阻害した。我々は、どんな酸化的修飾が、この中毒性機能獲得を誘導するかを調べ、パーオキシナイトライトが用量依存的な様式でチロシンニトロ化を誘導することを発見した。そのうえ、３，３’−ジチロシン架橋結合の証拠が認められないにもかかわらず、パーオキシナイトライトは、ＮＧＦの安定的な高分子量オリゴマーの形成を誘発した。尿酸塩によるチロシンニトロ化の阻止は、ＮＧＦアポトーシス活性に対するパーオキシナイトライトの効果を無効にした。これらの結果は、パーオキシナイトライトによるＮＧＦの酸化は、ｐ７５^ＮＴＲを通したＮＧＦアポトーシス活性を１０，０００倍に増強することを意味する。我々の知る限りでは、これは、ニューロトロフィンをアポトーシス薬剤へと変換する始めて発見された翻訳後修飾である。

導入
我々は、ＮＧＦが、翻訳後の酸化的またはニトロ化的修飾を受け、その機能的活性を変化させ得るかどうかを調べた。我々は、インビトロにおけるパーオキシナイトライトによるＮＧＦの酸化がニトロ化を引き起こし、高分子量のオリゴマーの形成を誘導することを報告する。そのうえ、これらの酸化的修飾は、生理的に適切な濃度において、ｐ７５^ＮＴＲ依存的運動ニューロンアポトーシスを誘導する特殊な能力を付与する。我々のデータは、パーオキシナイトライトによる酸化ストレスは、ニューロトロフィン活性を決定的に調整できることを示す。

材料および方法
パーオキシナイトライト処理：パーオキシナイトライトは、特にＵｐｓｔａｔｅから入手可能である（例えばＵｐｓｔａｔｅＵＳＡ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ２２９０３，ＵＳＡ）。パーオキシナイトライト濃度は、３０２ｎｍ（ε＝１，６７０Ｍ^−１ｃｍ^−１）にて分光光度的に測定した。希釈した原液を、０．０１ＭのＮａＯＨにて新鮮に調製した。ＮＧＦ（Ｈａｒｌａｎ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）と、種々の濃度のパーオキシナイトライト（２ｍＭから０．２５ｍＭ）との反応が、０．２ｍｇ／ｍＬから１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で行われ、同様の結果が得られた。反応は、２０ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。ＮＧＦは、パーオキシナイトライト（各々１μＬ）の１０ボーラス添加（１０ｂｏｌｕｓａｄｄｉｔｉｏｎ）に供し、所望の終濃度のパーオキシナイトライトに達成させた。パーオキシナイトライト原液の１ボーラスを試験管の上部に迅速に添加し、３秒間ボルテックスにより混合した。当該方法を１０回繰り返した。ｐＨ変化または混入に起因するパーオキシナイトライト処理の非特異的な効果の可能性を除外するため、コントロール実験を、希釈したＮａＯＨまたは分解するパーオキシナイトライト（逆順の添加（ＲＯＡ））を使用して行った。パーオキシナイトライトと、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ＦＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ）およびＦＧＦ−２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）との処理を、上述の通り、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で行った。

テトラニトロメタンによるＮＧＦニトロ化：ＮＧＦ（Ｈａｒｌａｎ）と４０モル倍過剰のテトラニトロメタン（Ｓｉｇｍａ）との反応を、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ８．０）にて４０分間行った。反応は、０．０５Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で平衡化および展開（ｄｅｖｅｌｏｐ）させたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムに反応混合物を通すことで終了させた。

電気泳動法およびウエスタンブロット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、還元条件の下、１５％ポリアクリルアミドミニゲルにて実行した。サンプルは、泳動前にＬａｅｍＬｉ緩衝液で５分間煮沸した。タンパク質は、クマシーブルーまたは銀染色によって可視化した。ウエスタンブロット分析のために、タンパク質は、ニトロセルロース膜に転写した（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）。膜を、ブロッキング溶液（５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４））にて２時間ブロッキングし、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体とともに一晩インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳによる洗浄の後、膜をペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギ抗体（１：４０００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１時間インキュベートし、その後、洗浄し、ＥＣＬ化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて現像した。使用した一次抗体は、抗ＮＧＦ−βポリクローナル抗体（１：３０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびニトロチロシンに対するポリクローナル抗体（１：３５００；Ｕｐｓｔａｔｅ）であった。

多角度光散乱検出と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー：パーオキシナイトライト（１ｍＭ）で処理したＮＧＦサンプルまたは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の分解パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦサンプルを、ＤＡＷＮ−ＥＯＳ多角度光散乱検出器およびＯｐｔｉｌａｂＲｅｘ屈折計（ＷｙａｔｔＴｅｃｈ．Ｃｏｒｐ．）に一列に接続したＢｉｏｓｕｉｔｅ１２５ＨＰＬＣサイズ排除カラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に載せた。ＨＰＬＣカラムは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭナトリウム硫酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化および展開した。光散乱ユニットは、製造者の説明書に従って調整した。０．１８５ｍＬ／ｇの値を、タンパク質のｄｎ／ｄｃと想定した。検出反応は、モノマーウシ血清アルブミンのためのシグナルを測定することで正常化した。光散乱ユニットおよび屈折計の温度は２５℃に維持した。カラムおよび全ての外部の接続は、周囲温度（約２５℃）とした。流速は、実験の全体を通じて、０．５ｍＬ／分に維持した。

質量分析研究：天然ＮＧＦまたはテトラニトロメタンもしくはパーオキシナイトライト（１ｍＭ）で処理したＮＧＦのサンプルを、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。定常相は、Ｃ_１８逆相Ｓｕｐｅｌｃｏカラム（１５ｃｍｘ４．６ｍｍ，５ μＭ）であった。移動相は、Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_３ＣＮおよび０．１％のトリフルオロ酢酸であった。５５分にわたって、有機を５％から６０％に増加させる線形勾配を使用して、分離を達成した。サンプルは、フラクションコレクターで回収し、減圧濃縮し、および、再懸濁し、全分子量変化のための質量分析またはトリプシン消化の分析のために分割した。分子量の全変化を発見するために、回収した画分を、０．１％ギ酸を含む３０％アセトニトリルに再懸濁し、その後、Ｗａｔｅｒｓ／ｍｉｃｒｏｍａｓｓＬＣＴＣｌａｓｓｉｃエレクトロスプレー飛行時間質量分析計に直接注入した。移動相は、３０％アセトニトリル、０．１％ギ酸とし、流速５μＬ／分とした。キャピラリー電圧は３．０１８ｋＶであり、ソース温度は８０℃であり、サンプルコーン電圧は４５Ｖであった。トリプシン消化は、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝剤に０．１％のＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）溶液を再懸濁し、ＲａｐｉＧｅｓｔＴＭＳＦＰｏｗｄｅｒプロトコールに従って行った。簡潔には、サンプルをＤＴＴで還元し、ＩＡＡでブロッキングし、その後、トリプシン（１：５０，μｇトリプシン：μｇタンパク質）とともに３７℃で一晩インキュベートした。ＴＦＡを、終濃度が０．５％となるように消化したタンパク質サンプルに添加し、サンプルを１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムを使用して、ＷａｔｅｒｓＱ−ｔｏｆＵｌｔｉｍａＧｌｏｂａｌＭａｓｓ分光計にサンプルを注入した。サンプルを、ＪｕｐｉｔｅｒＣ_１８トラップに２μＬ／分で充填し、その後、水および０．１％のギ酸で１μＬ／分で６分間洗浄した。４５分間にわたる勾配（０．２６μＬ／分）（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸から開始され、〜２％／分で有機物が増大する）を用いてサンプルを溶出した。サンプルは、ＮｅｗＯｂｊｅｃｔｉｖｅｐｉｃｏ−ｆｒｉｔ、１０ｃｍカラムにおいて、ＷａｔｅｒｓＢＥＨＣ_１８材料上に分離し、その後、エレクトロスプレーキャピラリー電圧３．５ｋＶおよびソース電圧７０ｋＶのＷａｔｅｒｓＮａｎｏＬｏｃｋｓｐｒａｙｓｏｕｒｃｅを使用して注入した。データ依存的タンデム型質量分析を、親イオンのｍ／ｚに依存的な衝突エネルギーにて実行した。ＭＳ^２スペクトルを、ＭａｓｃｏｔＭＳ／ＭＳイオン検索エンジンを使用して検索し、ペプチドは同一または上記のスコアと報告された。

精製された運動ニューロン培養物：培地および血清はＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。運動ニューロン培養物を、以前に記述されるとおり［４４］、メトリザマイド勾配遠心分離とラットｐ７５^ＮＴＲに対するモノクローナル抗体（マウスｍＡｂＩｇ１９２）によるイムノパニング(ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ)との組み合わせによって、１５日胚（Ｅ１５）のラット脊髄から作製した。運動ニューロンを、ポリオルニチン−ラミニンで予めコートした４ウェルマルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ）に、３５０細胞／ｃｍ^２の密度で播いた。培養は、２％ウマ血清、２５ｍＭＬ−グルタミン酸塩、２５μＭ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＬ−グルタミン、および２％Ｂ−２７サプリメントを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地で行った（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。運動ニューロンの生存は、培地にＧＤＮＦ（１ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を添加することで維持した。栄養因子の欠乏（ＮＯＮＥ、ＧＤＮＦなし）により誘導した運動ニューロン死は、全ての実験においてコントロールとして検出し、決して５０％を超えることはなかった。異なる試薬による処理は、運動ニューロンのプレーティングから３時間後に行った。運動ニューロンの生存は、ディッシュ中の固定した領域において、細胞体直径の４倍長い完全な神経突起を示す全ての細胞を直接数えることで、４８時間後に評価した。

アンチセンス処理：ｐ７５^ＮＴＲ発現をダウンレギュレーションするためのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は以前に記述されるとおりに行った［４５］。簡潔には、ＨＰＬＣ精製したホスホロチオネートアンチセンスおよびミスセンスオリゴヌクレオチド（５μＭ；ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、精製した運動ニューロンの細胞懸濁液に添加し、播種の前にピペッティングを繰り返した。オリゴヌクレオチドは、培養の全時間にわたって存在していた。取込みの効率を測定するために、細胞を、５’５６−ＦＡＭ蛍光ラベルを付したｐ７５^ＮＴＲアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。細胞を、定常的に５％ＣＯ_２としたＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡の加熱したステージ（３７℃）に移した。蛍光は、６３Ｘ油浸レンズにて画像をとった。取込み効率は、全ての実験で＞９６％であった。使用される配列は、以下の通りであった：ｐ７５^ＮＴＲアンチセンス、５’−ＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡ−３’（配列番号：５）およびｐ７５^ＮＴＲミスセンス、５’−ＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＧＡＣ−３’（配列番号：６）［４５］。使用されるアンチセンス配列は、インビボにおけるｐ７５^ＮＴＲ依存的運動ニューロン死の抑制に効果できてあることが示されている［２０］。

統計：各々の実験は、少なくとも３回繰り返し、データは平均ＳＤとして報告される。平均値の比較は、一元配置分散分析法によって行った。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を利用した平均値と差との間の対での対比は、ｐ＜０．０５ならば統計学的に有意であると明言した。全ての統計計算は、ＳｉｇｍａＳｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅ（ＪａｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。

刺激されたアストロサイトによるニトロＮＧＦの分泌：安静時のまたは刺激されたアストロサイト（ＦＧＦ１，１０ｎｇ／ｍＬ；およびＬＰＳ，５マイクロｇ／ｍＬ）からの条件培地（限外濾過によって４０倍に濃縮した）を、特異的な抗ニトロＮＧＦ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。標準的なＮＧＦ（５０ｎｇ，Ｈａｒｌａｎ）またはニトロＮＧＦ（５０ｎｇ）は、最初の２つのレーンに充填した。使われた特異的抗ニトロＮＧＦ抗体はポリクローナル抗体であり、パーオキシナイトライトによって商業的に入手可能なマウスＮＧＦをニトロ化し、そのように生産されたにニトロＮＧＦ種を単離して得たニトロ−ＮＧＦによるウサギの免疫化によって得たものである。特異的な抗ニトロＮＧＦ抗体として、ニトロＮＧＦに結合し、非ニトロ化標準ＮＧＦと交差反応しないものを選択した。

パーオキシナイトライトは、ＮＧＦの神経突起成長促進活性を増加させる：Ｅ１５ラット胚（ＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲの両方を発現する）からの後根神経節外植片を、栄養性因子がない状態（ＮＯＮＥ）、または、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、パーオキシナイトライトで処理したＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ；ｎｉｔｒｏＮＧＦ−Ｐ）もしくはテトラニトロメタンで処理したＮＧＦ（ニトロＮＧＦ−ＴＮＭ）が存在する状態で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で培養した。２４時間後、培養物を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＧＡＰ−４３に対する免疫蛍光に供した。ニトロＮＧＦで処理した神経節が、ＮＧＦで処理した場合と比較して、神経突起成長が増加したことに留意される。

結果
パーオキシナイトライトによる酸化はＮＧＦアポトーシス活性を増強する
ＧＤＮＦ（１ｎｇ／ｍＬ）で維持した培養物において、ｐ７５^ＮＴＲを発現している運動ニューロンは、ＮＧＦに感受性でない。しかしながら、パーオキシナイトライト処理したＮＧＦは、１ｎｇ／ｍＬと同程度に低い濃度で、運動ニューロン死を誘導した（図２Ａ）。分解したパーオキシナイトライト（ＲＯＡ）で処理したＮＧＦは、運動ニューロンの生存に影響を与えなかった（図２Ａ）。パーオキシナイトライト処理は、用量依存的にＮＧＦアポトーシス活性を増強し、パーオキシナイトライト濃度が０．５ｍＭを超える場合にはプラトーに達した（図２Ｂ）。以前に報告されたように［２５］、酸化窒素供与体ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ（１０μＭ）から作られる、定常状態濃度の酸化窒素（＜５０ｎＭ）の存在下、ＮＧＦ−ＲＯＡは、１０ｎｇ／ｍＬを超える濃度で、運動ニューロン減少を有意に誘導した（図２Ｃ）。さらに、酸化窒素の存在下、パーオキシナイトライトで修飾されたＮＧＦは、アポトーシス活性の増大を示し、わずか１ｐｇ／ｍＬで３３％の運動ニューロン減少を誘導した（図２Ｃ）。運動ニューロン培養物へのパーオキシナイトライト処理−ＢＳＡ、−ＦＧＦ−１または−ＦＧＦ−２の添加は、運動ニューロン死を誘導せず（図２Ｄ）、このことは、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦの特異的な効果を示している。

パーオキシナイトライト処理ＮＧＦによって誘導される運動ニューロン減少は、一般的なカスパーゼ阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋによって遮断され（図３Ａ）、アポトーシスの機構の活性化を示している。我々は、以前に、ＮＧＦがｐ７５^ＮＴＲを通したシグナル伝達によって運動ニューロンアポトーシスを誘導することをすでに示した［２５］。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦによって誘導されるアポトーシスもまた、ｐ７５^ＮＴＲ活性化に依存的だった。というのは、それが、ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体の添加によって（図３Ａ）、または、アンチセンス処理によるｐ７５^ＮＴＲ発現のダウンレギュレーションによって（図３Ｂ）完全に阻害されたためである。対照として、アンチセンス処理も、酸化窒素の存在下、天然ＮＧＦによって誘導される運動ニューロンアポトーシスを遮断した（図３Ｂ）。ＮＧＦを含む、異なるアポトーシス刺激によって誘導される運動ニューロンアポトーシスは、パーオキシナイトライトの内因性の生産を必要とする［２５、４６−４８］。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦによって誘導される運動ニューロン減少は、一般的な酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥ（１ｍＭ）またはＳＯＤ模倣物およびパーオキシナイトライト分解触媒、ＭｎＴＢＡＰ（１００μＭ）によって阻害され（図３Ｃ）、更に同様のアポトーシス機構の実行が確認される。

パーオキシナイトライトは、ＮＧＦオリゴマー化およびニトロ化を誘導する
我々は、その後、ＮＧＦに対するパーオキシナイトライト処理によって誘導される修飾を分析した。パーオキシナイトライトの連続した大量添加にＮＧＦをさらすと、３つの高分子量種の用量依存的な出現が生じることがＳＤＳ−ＰＡＧＥからわかる。天然ＮＧＦの染色強度は、次第に、パーオキシナイトライト濃度の増大とともに減少した（図４Ａ）。分解したパーオキシナイトライト（ＲＯＡ）によるＮＧＦの処理は、この移動シフトを誘導した。ＮＧＦオリゴマーの形成は、溶液中で、リアルタイム多角度光散乱検出（ＭＡＬＳ）分析と組み合わせたＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図４Ｂ）。分解したパーオキシナイトライトで処理したＮＧＦ（ＮＧＦ−ＲＯＡ）は、サイズ排除カラムから、二量体（３３．０±１．２ＫＤａ）に相当する質量を有した単一のピークとして溶出した。対照的に、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦは、二量体（３３．２±０．６ＫＤａ）、四量体（６８．５±３．５ＫＤａ）および八量体（１２５．０±１０．０ＫＤａ）に相当すると思われる３つのピークとして溶出した。驚くべきことに、パーオキシナイトライト処理したＮＧＦ二量体は、天然二量体（ＮＧＦ−ＲＯＡ）の前に溶出し、タンパク質のニトロ化に起因する構造変化の存在を反映している。

パーオキシナイトライト処理はまた、抗ニトロチロシン抗体による反応から明らかと成るように、ＮＧＦの用量依存的なニトロ化を誘導した（図４Ｃ）。酸化的修飾の特異的な部位は、精製された酸化生成物の質量分析によって決定した。天然ＮＧＦは、逆相ＨＰＬＣによって、３６．３および３８．１分に２つのピークとして溶出し（図５Ａ）、両方とも、質量分析によってＮＧＦポリペプチド鎖と同定された。鎖Ｂは、鎖Ａに存在する８つのＮ末端残基を欠き、ＮＧＦ精製の際に、限定的な加水分解に起因して形成されることが知られている［４０］。パーオキシナイトライトによるＮＧＦの酸化は、逆相ＨＰＬＣによって溶出されるように、いくつかの生成物の不完全な分離という結果となった（図５Ｂ）。３８．６分にて回収されたパーオキシナイトライト処理画分の質量分析は、非修飾ＮＧＦの質量スペクトルと比較して、分子量の増大したいくつかの種を明らかにした（図６）。以前に記述されたように［４０］、非修飾ＮＧＦ鎖の一部は、Ｃ末端のアルギニン残基がなかった（図６Ａ）。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦにおいて、最も小さい質量シフトは、鎖Ａの〜９０Ｄａの増大（１３，２５２Ｄａから１３，３４１Ｄａまで）であり、これは、２つのニトロ基の付加（各々４５Ｄａ）を意味する（図６Ｂ）。加えて、パーオキシナイトライト処理は、いくつかの付加的な修飾を誘導したようであり、これは、最高５つのニトロ基およびメチオニンの酸化を意味する。ＮＧＦは、３つのトリプトファンおよび２つのチロシンを含み、それは、５つの部位のニトロ化を説明する可能性がある（図６Ｂの挿入された表）。修飾の同様のパターンがＮＧＦの鎖Ｂにおいて認められた。

酸化的な修飾を受けている特異的な残基を同定するために、ＰＬＣ精製サンプルを消化し、質量分析によって分析した。未処理のおよびパーオキシナイトライト処理のＮＧＦ消化の比較は、２つのチロシン残基、Ｔｙｒ５２およびＴｒｐ９９のニトロ化を明らかにし（図７）、検出された９０Ｄａの全分子量変化を説明する可能性がある。パーオキシナイトライトによるＮＧＦの酸化は、また、トリプトファン蛍光の減少をもたらし、トリプトファンのニトロ化を支持する。酸化的修飾のその他の残基は、消化されたサンプルから検出されず、おそらく、ニトロ化Ｔｙｒ５２およびＴｒｐ９９を有するＮＧＦに相当するｍ／ｚ＝１３，３４１のイオンが、最も大量の種であることを示している。しかしながら、これは、また、その他のペプチドと比較して、イオン化の効率の増大に起因し得た。重要なことに、ＮＧＦ酸化における３，３’−ジチロシンの形成は、質量分析によって認められず、この付加物の欠如はさらに、励起／放出３２０／４１０ｎｍにおける蛍光の欠如によって確認された。

チロシンニトロ化は、ＮＧＦの生物活性を変化させるか？
チロシンニトロ化がＮＧＦ生物活性の修飾に重大な意味を持つかどうかを確認するために、我々は、テトラニトロメタンでＮＧＦを処理した（ＴＮＭ；４０倍過剰）。ＴＮＭは、タンパク質における３−ニトロチロシンを形成するために、アルカリｐＨにて一般に使われる。使用される条件において、ＴＮＭは、質量分析によって証明されるように、チロシンニトロ化だけを誘導した（下記参照）。ＴＮＭで処理したＮＧＦは、３７．９および３９．９分で溶出する２つの生成物を分離した（図８Ａ）。質量分析によって明らかにされるように、ＴＮＭ処理は、ＮＧＦ鎖Ａの分子量を９０Ｄａ増加させ（１３，２５２から１３，３４２Ｄａまで；図８Ｂ）、これは、主要な生成物は二重のニトロ化種であることを示す。しかしながら、単一ニトロ化種はまた、１３，２９７Ｄａで認められた（図８Ｂ）。同じパターンがＮＧＦの鎖Ｂについて認められた。消化された生成物のタンデム型質量分析は、ニトロ化残基としてＴｙｒ５２およびＴｙｒ７９を同定し（図８Ｃ）、全分子量変化を説明しうる（図８Ｂ）。トリプトファンニトロ化または３，３’−ジチロシン形成は、ＴＮＭ処理ＮＧＦにて認められなかった。４０倍過剰のＴＮＭで処理したＮＧＦの電気泳動パターンは、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦにて認められる場合に匹敵し、このことはＮＧＦオリゴマーの形成を示唆する（図８Ｄ）。

我々は、次に、運動ニューロンの生存に対するＴＮＭ処理ＮＧＦの効果を分析した。パーオキシナイトライト処理ＮＧＦと同様に、ＴＮＭ処理ＮＧＦは、酸化窒素がない場合、３２％の運動ニューロン減少を誘導した（図９Ａ）。ＴＮＭ処理ＮＧＦによって誘導される運動ニューロン死はまた、ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体の添加によって阻止され（図９Ｂ）、このことは、同じアポトーシスの機構を誘発することを示唆する。ニトロ化およびＮＧＦオリゴマー化は、ＴＮＭ処理とパーオキシナイトライト処理ＮＧＦとの間の共通の修飾であることがわかった。

ニトロ化がＮＧＦに運動ニューロン死を誘導する能力を与えたかをさらに決定するために、我々は、尿酸塩の存在下、パーオキシナイトライトでＮＧＦを処理した。パーオキシナイトライトによるニトロ化の抑制に特に有効な［４９］この化合物は、用量依存的にＮＧＦのチロシンニトロ化およびオリゴマー化を阻害した（図１０Ａ）。そのうえ、尿酸塩（２００μＭ）は、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦのアポトーシス効果を無効にした（図１０Ｂ）。対照として、１００ｎＭ尿酸塩（１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ−ＯＮＯＯ−⁻尿酸塩を添加した後に培地に存在すると予想される濃度）は、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）によって誘導される運動ニューロン減少を阻止せず（図１０Ｂ）、未反応の尿酸塩は、運動ニューロンの生存に影響しなかったことを意味する。

刺激されたアストロサイトによるニトロＮＧＦの分泌：ニトロ化ＮＧＦに結合し、非ニトロ化ＮＧＦで交差反応しない特異的な抗体の使用は、反応性のアストロサイトからの条件培地の免疫反応性のバンドを示す（図１３参照、図１３は、ＦＧＦ／ＬＰＳを刺激したアストロサイトの条件培地のウエスタンブロット分析における、モノマーおよび二量体ニトロ化ＮＧＦ種を示す）。この分析は、ニトロＮＧＦは炎症性の条件の下で分泌されることを示す。

神経突起成長促進活性：図１４は、ＮＧＦのニトロ化がＮＧＦの神経突起成長促進活性を増加させることを示す。

考察
ＡＬＳにおける運動ニューロン死およびアストロサイト反性は、活性酸素および窒素種の生産の増大に関与するため［２８、５０、５１］、我々は、分泌されたＮＧＦの酸化またはニトロ化が、運動ニューロンに対するアポトーシス活性を増強するかどうかを調べようと考えた。インビトロにおけるパーオキシナイトライトによるＮＧＦの酸化は、酸化窒素の存在下、運動ニューロンのアポトーシスを誘導する効力を１０，０００倍まで増大させた。我々の知識の及ぶ限りでは、これは、ｐｇ／ｍＬの範囲の生理的に適切な濃度の培養におけるニューロトロフィン誘導細胞死の最初の報告である。ＮＧＦレベルの増加は、ＡＬＳで生じる運動ニューロンの進行性の死に関係していた［２３−２５］。我々は、以前に、ＳＯＤ１Ｇ９３ＡＡＬＳマウスからの脊髄抽出物が、酸化窒素の外的供給源の存在下で、培養された運動ニューロンのｐ７５^ＮＴＲ依存的アポトーシスを刺激するのに十分なＮＧＦを含むことを報告した［２５］。しかしながら、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスからの変性している脊髄における、ＥＬＩＳＡによって測定されるＮＧＦレベルは、ｍＬあたりピコグラムの範囲であり［２５］、純粋なＮＧＦが純粋な運動ニューロン培養にてアポトーシスを誘導するために必要な濃度の１０，０００倍低い濃度であり、パーオキシナイトライト処理ＮＧＦの効力と同程度である。

ＴＮＭによるＮＧＦのニトロ化は、以前の研究において、感覚神経節における神経突起成長の誘導によって評価したところ、ＮＧＦ生物活性を修飾しなかった［５２］。ＮＧＦ受容体の発現の差は、明白に矛盾する結果を説明するかもしれない。感覚神経節はＴｒｋＡおよびｐ７５^ＮＴＲを発現し［５３、５４］、一方、純粋な運動ニューロン培養物は、ｐ７５^ＮＴＲを発現し、検出可能なＴｒｋＡの発現はない［５５］。ｐ７５^ＮＴＲに対する阻止抗体またはアンチセンス処理によるｐ７５^ＮＴＲ発現のダウンレギュレーションが完全に運動ニューロン死を阻害したため、ニトロ化ＮＧＦは、ｐ７５^ＮＴＲシグナル伝達に依存的な機構によって、運動ニューロンアポトーシスを誘導した。

ＮＧＦによるアポトーシス活性の獲得は、一貫してチロシンニトロ化および異常なオリゴマー化と関連していた。マウスＮＧＦは、位置５２および７９で２つのチロシン残基だけを含み、これらは両方とも溶媒に接触可能である［４１］。Ｔｙｒ７９のヒドロキシル基は、対向したＮＧＦモノマーからのＧｌｕ１１との水素結合相互作用に関与する（図１）。この相互作用は、チロシン水酸基のイオン化を還元し、このため残基がラジカルに仲介される酸化を受けにくくするが、このことはＴｙｒ７９がＴｙｒ５２よりもニトロ化に対して耐性があることの説明になる可能性がある。後者は、パーオキシナイトライトおよびＴＮＭによって容易にニトロ化された。Ｔｙｒ５２が非常に保存され、ＮＧＦの安定に重要であるので［４３］、そのニトロ化は、タンパク質における構造変化を誘導し、それが、オリゴマー化をもたらす異常なタンパク質相互作用を促進する可能性がある。

リアルタイム−ＭＡＬＳとの組み合わせによるサイズ排除クロマトグラフィーから示されるように、ＮＧＦオリゴマーは、二量体から八量体までの大きさにおいて変動した。精製された高分子量のオリゴマーを２度クロマトグラフィーに供した場合、モノマーおよび二量体ピークが再現され、これは非共有結合性のオリゴマーの形成を示している。しかしながら、パーオキシナイトライトおよびＴＮＭの両処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて安定なより高いオリゴマーの形成をもたらし、一部のサブユニットの非チオール依存的な共有結合性の架橋結合が示唆される。ＮＧＦのオリゴマー化は尿酸塩によって実際上阻止された。尿酸塩は、炭酸塩および二酸化窒素ラジカルと競合することによってパーオキシナイトライトに誘導されるチロシンニトロ化を妨げることが知られており、ラジカル形成はオリゴマーの形成に関与することが示唆される。３，３’−ジチロシン架橋結合は、パーオキシナイトライトがタンパク質二量体化を誘導する１つの機構であるものの［５６、５７］、より大きなオリゴマーは、架橋されるための少なくとも２つの異なるチロシン残基を必要とするだろう。架橋がチロシンラジカルの産生からのみ生じる場合、Ｔｙｒ５２のニトロ化はオリゴマー化を抑制するだろう。更に、３，３’−ジチロシンは、蛍光によってまたは質量分析によって検出できなかった。従って、ＮＧＦのオリゴマー化は、パーオキシナイトライトによって誘導される架橋結合のその他の形態に恐らく関与する。二酸化炭素の存在下、３０％のパーオキシナイトライトは、炭酸塩ラジカルさらに二酸化窒素を形成し、これらは両方とも、容易にチロシンおよびトリプトファンを酸化しラジカルを形成させる適度に強い酸化剤である［５８］。チロシルラジカルはまた、ほぼ拡散律速（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄｒａｔｅｓ）で二酸化窒素と結合して３−ニトロチロシンを形成する。トリプトファン酸化は、タンパク質を架橋することができるＮ−ホルミルキヌレニンおよびキヌレニンを含む複数の生成物を産生する［５９］。一方で、チロシルラジカルはまた、分子内の電子伝達反応によって、トリプトファンおよびシステインを含むその他のアミノ酸を酸化することができる［５９、６０］。ＮＧＦ内において、Ｔｙｒ５２は空間的にＴｒｐ２１の近くにある（図１）。従って、Ｔｙｒ５２の酸化は、Ｔｒｐ２１にラジカルを移動させ、それによって、ＮＧＦ分子間における共有結合の架橋を促進する可能性がある。

パーオキシナイトライト処理したＮＧＦは、運動ニューロンにおいて強力にｐ７５依存的アポトーシスを刺激した。ＮＧＦのＴｙｒ５２およびＴｒｐ２１は、ｐ７５^ＮＴＲのシステインに富むドメイン２（ＣＲＤ２）にドッキングする疎水性ポケットの形成で関与する［４２］。Ｔｒｐ２１がｐ７５^ＮＴＲとの境界面の大部分であるため、そのインビボの酸化生成物は、ｐ７５^ＮＴＲに対する共有結合性の付加を形成し、異常なアポトーシスの情報伝達を促進する可能性がある。しかしながら、その他の受容体もまた、パーオキシナイトライト処理されたＮＧＦによるアポトーシスの誘導に関与した。ＮＧＦの前駆体（ｐｒｏＮＧＦ）はｐ７５^ＮＴＲに対してＮＧＦより低い親和性で結合するが、それは、ｐ７５^ＮＴＲおよびソーティリンに同時に結合することによって、高親和性−シグナル伝達複合体を形成する［６１］。また、ｐ７５^ＮＴＲは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属し［６２］、このスーパーファミリーのその他のメンバーは、活性化のためにそれらの細胞内のデスドメインの三量体化を必要とすることが知られている［６３、６４］。同様に、ＮＧＦオリゴマーは、付加的なｐ７５受容体を集め、それによってそのデスドメインの三量体化を促進し、および、したがってアポトーシスのシグナル伝達をより強く活性化できた。

ＮＧＦのパーオキシナイトライト処理が機能獲得をもたらすため、ニトロ化タンパク質の小さい画分のみが、アポトーシスのシグナル伝達を引き出すのに必要とされる。パーオキシナイトライト処理されたＮＧＦは、ＮＧＦのアップレギュレーションがパーオキシナイトライトおよびその他のニトロ化種の生産増大と一致する、病理学的および炎症性の症状において形成される。酸化修飾されニトロ化されたＮＧＦのインビボでの発生は、ニューロトロフィンシグナル伝達が酸化ストレスの増大に関連する病的状態の下で破壊される、刺激的な新たな機構を提案する。

略語の一覧：ＡＬＳ、筋萎縮性側索硬化症；ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子；ＧＤＮＦ、グリア由来神経栄養因子；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＭＡＬＳ，多角度光散乱検出；ＮＧＦ，神経成長因子；ＮＯ，酸化窒素；ＮＯＳ、酸化窒素合成酵素；ＯＮＯＯ⁻，パーオキシナイトライト；ｐ７５^ＮＴＲ、ｐ７５ニューロトロフィン受容体；ＲＯＡ、逆順の添加；ＳＯＤ１、スーパーオキシドジスムターゼ１；ＴＮＭ，テトラニトロメタン。

文献一覧
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Claims

−単離された形態における修飾ニューロトロフィン（ここにおいて、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基は、少なくとも１つのニトロ基を含む）；または
−修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態の保存的断片（ここにおいて、前記保存的断片は、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基を維持し、且つ、前記保存的断片は、前記ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基を維持し、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を維持する）；または
−修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態のまたは前記保存的断片の保存的変種（ここにおいて、前記保存的変種は、少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって、前記修飾ニューロトロフィンまたは前記保存的断片に由来するが、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基を維持し、且つ、前記保存的変種は、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基を維持し、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を維持する）である、
運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の誘導物質および／または刺激物質。
−修飾ニューロトロフィン（前記修飾ニューロトロフィンは、天然成熟ニューロトロフィンにおいて、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基の付加することによる、前記天然成熟ニューロトロフィンの翻訳後ニトロ化修飾によって得ることができ、且つ、前記修飾ニューロトロフィンは、単離された形態である）；または
−修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態の保存的断片（ここにおいて、前記保存的断片は、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基を維持し、且つ、前記保存的断片は、前記ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基を維持し、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を維持する）；または
−修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態のまたは前記保存的断片の保存的変種（ここにおいて、前記保存的変種は、少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって、前記修飾ニューロトロフィンまたは前記保存的断片に由来するが、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される少なくとも１つの残基を維持し、且つ、前記保存的変種は、ＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基に少なくとも１つのニトロ基を維持し、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を維持する）である、
運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の誘導物質および／または刺激物質。
前記修飾ニューロトロフィンが修飾ニューロトロフィンモノマーである、請求項１または２に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記修飾ニューロトロフィンが修飾ニューロトロフィンオリゴマーである、請求項１または２に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記修飾ニューロトロフィンが修飾ニューロトロフィン二量体である、請求項４に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記修飾ニューロトロフィンが、修飾ニューロトロフィン四量体または修飾ニューロトロフィン六量体または修飾ニューロトロフィン八量体である、請求項４に記載の誘導物質および／または刺激物質。
−請求項４から６の何れか１項に記載の少なくとも２つの修飾ニューロトロフィンオリゴマー（ここにおいて、前記少なくとも２つのオリゴマーは、異なるオリゴマー種である）および／または
−請求項３に記載の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィンモノマー、および請求項４から６の何れか１項に記載の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィンオリゴマー
の混合物である、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長の誘導物質および／または刺激物質。
請求項４から６の何れか１項に記載の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン四量体、および／または請求項４から６の何れか１項に記載の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン六量体、および／または請求項４から６の何れか１項に記載の少なくとも１つの修飾ニューロトロフィン八量体を含む、請求項７に記載の誘導物質および／または刺激物質。
修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態は、何れかの非ニトロ化プロニューロトロフィンを含まない、請求項１から８の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
修飾ニューロトロフィンの前記単離された形態は、何れかの非ニトロ化成熟ニューロトロフィンを含まない、請求項１から９の何れかの１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
純粋な形態である、請求項１から１０の何れかの１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
そのプロ−アポトーシス活性および／またはそのプロ−神経突起成長活性を妨げない分子構造である、請求項１から１１の何れかの１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記ニューロトロフィンが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４である、請求項１から１２の何れかの１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記ニューロトロフィンが成熟ＮＧＦである、請求項１３に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記ニューロトロフィンが成熟ＢＤＮＦ、成熟ＮＴ−３または成熟ＮＴ−４である、請求項１３に記載の誘導物質および／または刺激物質。
少なくとも１つのニトロ基を含むＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基がＴｙｒ残基である、請求項１から１５の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記Ｔｙｒ残基が、マウスＮＧＦのＴｙｒ５２もしくはＴｙｒ７９またはヒトＮＧＦのＴｙｒ５２もしくはＴｙｒ７９である、請求項１６に記載の誘導物質および／または刺激物質。
少なくとも１つのニトロ基を含むＴｙｒおよびＴｒｐ残基から選択される前記少なくとも１つの残基がＴｒｐ残基である、請求項１から１５の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記Ｔｒｐ残基が、マウスＮＧＦのＴｒｐ９９もしくはＴｒｐ２１もしくはＴｒｐ７６またはヒトＮＧＦのＴｒｐ９９もしくはＴｒｐ２１もしくはＴｒｐ７６である、請求項１８に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記ニューロトロフィンの少なくとも２つのＴｙｒおよびＴｒｐ残基がニトロ基を有する（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有する）、請求項１から１９の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記少なくとも２つの残基が、２つのＴｙｒ残基またはＴｙｒ残基およびＴｒｐ残基である、請求項２０に記載の誘導物質および／または刺激物質。
ニトロ基を有する前記ニューロトロフィンのＴｙｒおよびＴｒｐ残基（前記残基の各々は少なくとも１つのニトロ基を有する）の数が、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９である、請求項２０または２１に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記ニューロトロフィンの全てのＴｙｒおよびＴｒｐ残基が少なくとも１つのニトロ基を有する、請求項１から２２の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
前記修飾ニューロトロフィンが非グリコシル化の形態でまたはグリコシル化された形態である、請求項１から２３の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質の非保存的断片、または、
少なくとも１つのアミノ酸の置換および／または欠失および／または付加によって前記誘導物質および／または刺激物質に由来する、請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質の非保存的変種
（ここにおいて、前記非保存的断片または変種は、運動ニューロンアポトーシスおよび／または神経突起成長を誘導および／または刺激する能力を失っている）。
運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経突起の成長の治療および／または寛解および／または予防のための、免疫抗体応答を誘導する抗原としての使用のための請求項２５に記載の非保存的断片または変種。
痛みおよび／または神経変性の疾病もしくは症状の治療および／または寛解および／または予防のための薬剤としての使用のための請求項２５に記載の非保存的断片または変種。
請求項１から２４の何れか１項に記載の少なくとも１つの誘導物質および／または刺激物質に結合し、前記誘導物質および／または刺激物質の由来となる非修飾天然ニューロトロフィンと交差反応しない、抗体。
モノクローナル抗体である請求項２８に記載の抗体。
ニトロ化ＮＧＦに結合する請求項２８または２９に記載の抗体。
ｓｃＦｖである請求項２８から３０の何れか１項に記載の抗体。
運動ニューロンのアポトーシスおよび／または神経突起の成長の受動的な免疫療法および／または寛解および／または予防のための薬剤としての使用のための請求項２８から３１の何れか１項に記載の抗体。
痛みの治療および／または寛解および／または予防のための薬剤としての使用のための請求項２８から３２の何れか１項に記載の抗体。
神経変性の疾病または症状の治療および／または寛解および／または予防のための薬剤としての使用のための請求項２８から３２の何れか１項に記載の抗体。
請求項３１の少なくとも１つのｓｃＦｖ並びにそのようなｓｃＦｖをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡが付着された少なくとも１つのリボソームから成る、リボソームディスプレイシステム。
請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質が運動ニューロンに対して示すアポトーシス活性、および／または、請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質が感覚神経節に対して示す神経突起成長効果を阻害および／または遮断する能力を有する化合物のスクリーニングの方法であって、ここにおいて、候補化合物は、請求項２８から３１の何れか１項に記載の少なくとも１つの抗体に、または、請求項３５に記載の少なくとも１つのリボソームディスプレイシステムに結合するそれらの能力についてスクリーニングされ、そのような結合能力によって、前記アポトーシス活性および／または前記神経突起成長効果を阻害および／または遮断する可能性が示される方法。
請求項２５から２７の何れか１項に記載の少なくとも１つの非保存的断片または変種および／または請求項２８から３４の何れか１項に記載の少なくとも１つの抗体を含む組成物。
ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、記憶欠損に関する何れかの疾病または症状、および／または、集中障害、ならびに、神経炎症症状または疾病といった神経変性の症状または疾病の治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項２５から２７の何れかの１項に記載の非保存的断片または変種。
痛みの状態または症状または感覚、とりわけ以下のものの治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項２５から２７の何れかの１項に記載の非保存的断片または変種：
− 神経障害性の痛み（とりわけ、片頭痛、慢性的片頭痛、推定鎮痛薬乱用頭痛ＰＡＡＨ、原発性線維筋痛症候群ＰＦＭＳ、神経損傷誘導性神経障害性疼痛、坐骨神経傷害、慢性的絞搾損傷）、
− 関節の痛み（とりわけ、骨関節炎症状、骨関節症、骨関節炎）、
− 炎症性疼痛、
− 癌疼痛。
ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、記憶欠損に関する何れかの疾病または症状、および／または、集中障害、ならびに、神経炎症症状または疾病といった神経変性の症状または疾病の治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項２８から３４の何れか１項に記載の抗体。
痛みの状態または症状または感覚、とりわけ以下のものの治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項２８から３４の何れか１項に記載の抗体：
− 神経障害性の痛み（とりわけ、片頭痛、慢性的片頭痛、推定鎮痛薬乱用頭痛ＰＡＡＨ、原発性線維筋痛症候群ＰＦＭＳ、神経損傷誘導性神経障害性疼痛、坐骨神経傷害、慢性的絞搾損傷）、
− 関節の痛み（とりわけ、骨関節炎症状、骨関節症、骨関節炎）、
− 炎症性疼痛、
− 癌疼痛。
ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、記憶欠損に関する何れかの疾病または症状、および／または、集中障害、ならびに、神経炎症症状または疾病といった神経変性の症状または疾病の治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項３７に記載の組成物。
痛みの状態または症状または感覚、とりわけ以下のものの治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項３７に記載の組成物：
− 神経障害性の痛み（とりわけ、片頭痛、慢性的片頭痛、推定鎮痛薬乱用頭痛ＰＡＡＨ、原発性線維筋痛症候群ＰＦＭＳ、神経損傷誘導性神経障害性疼痛、坐骨神経傷害、慢性的絞搾損傷）、
− 関節の痛み（とりわけ、骨関節炎症状、骨関節症、骨関節炎）、
− 炎症性疼痛、
− 癌疼痛。
運動ニューロンアポトーシスの誘導および／または刺激のために、および／または神経突起成長の誘導および／または刺激のために有用な薬剤としての使用のための、請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
神経障害、神経損傷、脳卒中、脊椎損傷および神経変性の疾病から成る群から選択される疾病、症状または外傷の治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項１から２４の何れか１項に記載の誘導物質および／または刺激物質。
請求項１から２４の何れか１項に記載の少なくとも１つの誘導物質および／または刺激物質を含む組成物。
神経障害、神経損傷、脳卒中、脊椎損傷および神経変性の疾病から成る群から選択される疾病、症状または外傷の治療および／または予防および／または寛解における使用のための、請求項４６に記載の組成物。
以下を含む、神経変性の症状または疾病、および／または、痛みの状態または症状または感覚の診断のためのインビトロ方法：
−生体試料を、請求項２８から３４の何れか１項に記載の１つの抗体に接触させること、
−前記少なくとも１つの抗体が前記生体試料中に含まれるリガンドに結合したかどうかを決定し、
そのような結合によって、前記疾病、状態、症状または感覚を示すことまたは予想すること。