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CN108350467B - 基因构建体 - Google Patents

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CN108350467B
CN108350467B CN201680062516.6A CN201680062516A CN108350467B CN 108350467 B CN108350467 B CN 108350467B CN 201680062516 A CN201680062516 A CN 201680062516A CN 108350467 B CN108350467 B CN 108350467B
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Abstract

本发明提供了基因构建体和包含这类构建体的重组载体。构建体和载体可以在基因治疗方法中用于治疗一系列病症，包括青光眼和耳聋，或用于促进神经再生和/或存活。

Description

基因构建体
本发明涉及基因构建体和包含这类构建体的重组载体，并且涉及构建体和载体在基因治疗方法中用于治疗一系列病症(包括青光眼和耳聋)，或用于促进神经再生和/或存活的用途。
青光眼是用于定义一组眼睛病症的术语，所述眼睛病症的特征为进行性视神经变性、视网膜神经节细胞(RGC)死亡以及轴突损失，这导致视神经头部的凹陷外观和视力的损失。青光眼是全世界失明的主要原因[1]并且青光眼的发生率随年龄而急剧增加。年龄在40岁和以上的英国约50万人和北美超过220万人患有青光眼。此外，在美国每小时有人因这种威胁视力的疾病而失明[2]。随着老年人口的规模继续快速地增长，青光眼已经成为迫近的社会以及医学问题。升高的眼内压(IOP)是除年龄外青光眼最重要的风险因素[3]，并且所有当前许可的治疗通过降低IOP起作用[4-5]。
青光眼可以在视力损失之前通过视野测试并且通过视神经的眼底镜检查以检测“视杯”来诊断。青光眼的当前管理是基于使用局部应用的药物降低IOP至介于10与21mm Hg之间的正常水平，以防止进一步的视神经损害[6]。正常成人的平均IOP是15至16mm Hg。当前存在五大类用于降低IOP的药物：β-肾上腺素能拮抗剂、肾上腺素能激动剂、拟副交感神经药、前列腺素样类似物以及碳酸脱水酶抑制剂[7]。虽然在正确使用时相对有效地降低IOP，但这些药物在一些患者中可以导致严重的副作用并且从而不利地影响患者的生活质量。另外，对IOP降低滴眼剂治疗的坚持度常常很差，特别是在需要获取多种药物的老年患者中。已经估计出，少于50％的患者规定IOP降低治疗实际上按指导定期使用，并且明显暗示对于潜在病状的控制。如果指示IOP的额外降低，或如果药物未能充分降低IOP，那么可以使用激光小梁成形术，但这种治疗在许多患者中未能达成足够的IOP降低。如果IOP仍未得到足够控制，那么可以指示切口青光眼手术。然而，IOP降低治疗在许多患者中未能防止恶化并且青光眼仍然是全世界不可逆失明的主要原因。形成视神经的青光眼RGC和其轴突投射的神经保护将因此是用作常规IOP降低治疗的辅助的有价值的治疗模式并且在尽管有常规疗法仍恶化的患者中特别重要[8]。
青光眼视神经病变似乎由特定的病理生理变化以及RGC和其轴突的随后死亡引起。RGC死亡的过程被认为是两阶段的，即，对损害的起始负责的原发性损伤，继之以可归因于围绕变性细胞的敌对环境的更缓慢的继发性变性[9]。
在青光眼的实验动物模型和人类青光眼中的RGC死亡机制已经显示涉及凋亡[10]。尽管尚未鉴别触发凋亡的分子机制，但神经营养因子的剥夺、局部缺血、谷氨酸盐的慢性升高以及无组织的一氧化氮代谢疑为可能的机制[11]。
脑源性神经营养因子(BDNF)连同神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)以及神经营养素-4/5(NT-4/5)是营养因子的神经营养素家族的成员[12-13]。神经营养素在外周与中枢神经系统(包括RGC)中的大范围的神经元的发育、存活以及功能中起到必不可少的作用。神经营养素与以下两种细胞表面受体相互作用：低亲和力p75NTR受体和高亲和力酪氨酸受体激酶(Trk)家族[12-13]。神经生长因子(NGF)优先结合TrkA，脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养素-4/5(NT4/5)结合至原肌球蛋白受体激酶-B(TrkB)，并且神经营养素-3(NT-3)结合TrkC(并且在较小程度上结合TrkA)[12-13]。
在神经营养素当中，BDNF是用于受损RGC的最强效的存活因子[14-21]。BDNF是在脑中产生并且经由逆行轴突输送通过视神经而输送至视网膜的蛋白分子，在视网膜中其支持RGC并且维持其存活[15-21]。在某些病状中，诸如在谷氨酸盐受体激动剂(诸如N-甲基-D-天冬氨酸盐)所致的兴奋毒性损伤期间，BDNF也可以在RGC中产生，不过是在相对低的水平下[22-23]。BDNF通常作为含有短信号肽序列的前原多肽(即，前原BDNF)产生，其有助于整个多肽运输至囊泡以供释放至细胞外空隙中。信号肽的分裂和去除使前原BDNF转化成原BDNF。N端原BDNF序列然后在细胞内或细胞外分裂以产生成熟BDNF(mBDNF)[24]。原BDNF与mBDNF都具有生物活性，其中原BDNF优先活化p75NTR受体并且更短的mBDNF活化TrkB受体[25-27]。视网膜中p75NTR和TrkB受体的活化对RGC存活显示相反的作用，前者经过直接的RGC细胞体p75NTR活化[25-28]或间接地经由p75NTR活化对米勒细胞(Müller cell)的凋亡负责，从而刺激肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放，这进一步促进RGC损失[29]。
青光眼的动物模型已经证明在神经钳夹或提高的IOP之后，存在远离神经营养性mBDNF/TrkB信号传导朝着原BDNF/p75NTR路径的偏移。已经证明了视网膜中水平降低的mBDNF和TrkB受体[27、30-31]，连同原BDNF[28]和p75NTR受体[32]的相对水平的相反升高。经由重组蛋白眼部注射至具有实验性升高的IOP的大鼠来补充mBDNF与未处理的眼睛相比增加了RGC的存活，从而确认这种神经营养素的关键神经保护作用[19-21]。
为了维持患有青光眼的眼睛中mBDNF的水平，将需要mBDNF的定期注射，因为mBDNF在眼内快速降级。为了克服mBDNF的定期眼内注射的需要，对提供恒定升高的BDNF的尝试已经借助于使用编码BDNF的转基因的重组腺病毒或腺相关病毒(rAAV)载体递送至视网膜以延迟或防止青光眼的动物模型中的RGC死亡[18、33-34]。rAAV载体由单链DNA基因组组成。rAAV载体已经成功地用作多个临床试验中的基因疗法的病毒载体，同时展现有限的毒性。虽然单独的重组mBDNF的玻璃体内注射或经由基因疗法增加局部BDNF产生已经显示有效防止在IOP升高或其它视神经损害之后经过短的时段RGC损失，但BDNF的有益作用已经显示是短暂的[18]。然而，合并内源BDNF基因序列的基因疗法也能够产生并释放原BDNF以及预期的mBDNF。
旨在经由RGC中的受体的增加的表达或经由使用具有激动剂特性的抗体对剩余细胞外TrkB受体的恒定刺激而削弱或防止TrkB信号传导的损失的基因疗法也已经证明了在防止RGC损失方面的成功[35-36]。然而，经由mBDNF/TrkB路径的营养性信号传导的降低由于mBDNF活化的TrkB受体的内化和在细胞表面处的这些受体被不能细胞内信号传导的TrkB同种型置换而进一步复杂化[37-38]。此外，在mBDNF存在下TrkB受体二聚体的自体磷酸化之后对TrkB受体的灭活负责的生物化学系统在经受提高的IOP的视网膜中上调[39]。
此外，除了青光眼以外，BDNF/TrkB轴也已经牵涉到内耳的组分，特别是耳蜗结构的神经保护中，在耳蜗结构中损伤可以导致毛细胞的损失，引起耳聋[40-42]，并且导致神经再生的损失[43-44]。
因此，需要一种改进的基因疗法用于治疗青光眼和耳聋，以及用于促进神经再生或存活。
本发明者已经构建了一种新颖的基因构建体，其在单一启动子的控制下编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)和TrkB受体的激动剂。构建体的启动子可以用于确保激动剂和受体仅在视网膜神经节细胞(RGC)、耳蜗或神经细胞中表达，并且促进这些细胞的存活。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种基因构建体，其包含可操作地连接至编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)的第一编码序列和编码TrkB受体的激动剂的第二编码序列的启动子。
本发明者在实施例中已经证明了有可能在单一基因构建体中组合编码TrkB受体与其激动剂的基因。这考虑到受体和激动剂的大尺寸而尤其有挑战性，并且可能尚未预测将有可能以生理学上适用的浓度共同表达受体和激动剂。有利地，使用本发明的构建体，不需要如现有技术中所描述注射重组蛋白。此外，在现有技术中，仍然有必要进行蛋白的定期注射，而本发明的构建体仅需要单一基因疗法注射。
优选地，在使用中，TrkB受体由激动剂活化，从而促进视网膜神经节细胞(RGC)、神经细胞或耳蜗细胞的存活。有利地，本发明的构建体因此可以用于靶向RGC、神经细胞或耳蜗细胞以维持或增强这些细胞中的TrkB信号传导。因此，构建体可以用于使针对青光眼和耳聋的病理生理应激物的保护最大化，以及促进神经再生和/或存活。此外，构建体可以用于提供青光眼或耳聋的长期治疗，这归因于在一个或多个启动子的控制下TrkB受体和受体的激动剂的表达。因此，构建体已经克服了使用多个替代治疗的需要，这些治疗甚至在组合中只提供短暂的治疗作用。此外，本发明的构建体由于其可以用于显著增强RGC或耳蜗细胞对TrkB受体激动剂的敏感度而是有利的，这归因于TrkB受体与受体的激动剂的局部增加。
优选地，本发明的基因构建体包含表达盒，其一个实施方案示于图1中。如图1中可见，构建体包含启动子、编码TrkB受体的第一核苷酸序列以及编码成熟脑源性神经营养素(mBDNF)的第二核苷酸序列，这种神经营养素充当TrkB受体的优选激动剂。将了解，然而，如本文所论述可以使用其它激动剂。又如图1中所示，表达盒还包括2A间隔子序列、编码肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的序列、编码多聚A尾巴的序列以及左和右手反向末端重复序列(ITR)。
因此，优选地，基因构建体包含安置于第一与第二编码序列之间的间隔子序列，这个间隔子序列编码经过构造以被消化或切割，从而产生TrkB受体和激动剂作为独立的分子的肽间隔子。在图1中说明的实施方案中，TrkB受体的编码序列安置于受体激动剂(BDNF)的编码序列的5'处，间隔子序列介于其之间。然而，在另一个实施方案中，受体激动剂的编码序列可以安置于受体的编码序列的5＇处，间隔子序列介于其之间。
优选地，基因构建体包含编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的核苷酸序列，WHPE增强两个转基因，即，TrkB受体和其激动剂(优选的是BDNF)的表达。优选地，WHPE编码序列安置于转基因编码序列的3＇处。
土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的一个实施方案是592 bp长的，包括γ-α-β元件，并且在本文中称作SEQ ID No:57，如下：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[SEQ ID NO.57]
优选地，WHPE包含实质上如SEQ ID No:57所列出的核酸序列，或其片段或变体。
然而，在优选的实施方案中，使用截短的WHPE，其由于β元件的缺失是247bp长的，并且在本文中称作SEQ ID No:58，如下：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT
[SEQ ID NO.58]
有利地，构建体中所用的截短的WHPE序列总共节省约300bp，而不会负面地影响转基因表达。优选地，WHPE包含实质上如SEQ ID No:58所列出的核酸序列，或其片段或变体。
优选地，基因构建体包含编码多聚A尾巴的核苷酸序列。优选地，多聚A尾巴编码序列安置于转基因编码序列的3＇处，并且优选的是WHPE编码序列的3＇处。
优选地，多聚A尾巴包含猿猴病毒40多聚A 224bp序列。多聚A尾巴的一个实施方案在本文中称作SEQ ID No:59，如下：
AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA
[SEQ ID NO.59]
优选地，多聚A尾巴包含实质上如SEQ ID No:59所列出的核酸序列，或其片段或变体。
优选地，基因构建体包含左和/或右反向末端重复序列(ITR)。优选地，每个ITR安置于构建体的5＇和/或3＇末端处。
第一个方面的基因构建体中的启动子可以是能够诱导RNA聚合酶结合至并转录第一和第二编码序列的任何核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，启动子是人突触蛋白I(SYN I)启动子。编码人突触蛋白I(SYN I)启动子的469核苷酸序列的一个实施方案在本文中称作SEQ ID NO.1，如下：
CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
[SEQ ID NO.1]
优选地，因此，启动子可以包含实质上如SEQ ID No:1所列出的核苷酸序列，或其片段或变体。
在另一个优选的实施方案中，启动子是CAG启动子。CAG启动子优选地包含巨细胞病毒早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β-球蛋白基因的剪接接纳体，从而有助于仅在RGC和耳蜗细胞中的组织特异性表达。编码CAG启动子的1733核苷酸序列的一个实施方案在本文中称作SEQ ID NO.2，如下：
CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG
[SEQ ID NO.2]
在另一个优选的实施方案中，启动子是CAG启动子的截短形式，诸如启动子的664核苷酸形式，在本文中称作SEQ ID NO.3，如下：
CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID No:3]
在又另一个优选的实施方案中，启动子是CAG启动子的截短形式，诸如启动子的584核苷酸形式，在本文中称作SEQ ID NO.48，如下：
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[SEQ ID No:48]
因此，优选地，启动子包含实质上如SEQ ID No:2、3或48所列出的核苷酸序列，或其片段或变体。
科学文献中呈现的许多双顺反子基因构建体具有(i)合并的双启动子以独立地驱动两个基因的表达，或(ii)使用脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)以连接重组病毒载体内从单一启动子转录的两个基因[45-46]。然而，IRES依赖性翻译的效率在不同细胞和组织中可以有变化并且IRES依赖性第二基因表达可以显著低于双顺反子载体中的帽依赖性第一基因表达[47]。此外，rAAV载体的大小限制(一般<5kb)将阻止大基因构建体，诸如TrkB受体连同使用双启动子或IRES连接子的BDNF的合并。
因此，在优选的实施方案中，基因构建体包含安置于第一与第二编码序列之间的间隔子序列，所述间隔子序列编码经过构造以被消化，从而产生TrkB受体和激动剂作为独立的分子的肽间隔子。优选地，间隔子序列包含并编码病毒肽间隔子序列，更优选的是病毒2A肽间隔子序列[47]。优选地，2A肽序列将第一编码序列连接至第二编码序列。这使构建体能够克服在各种载体中表达伴随发生的大小限制并且使由第一个方面的构建体编码的所有肽的表达能够在单一启动子的控制下作为单一蛋白发生。
因此，在含有TrkB、2A肽以及激动剂(优选的是BDNF)的序列的单一蛋白翻译之后，分裂在病毒2A肽序列中在末端甘氨酸-脯氨酸连接处发生，从而释放两种蛋白，即，TrkB和激动剂(即，mBDNF)。基因构建体经过设计以使得病毒2A肽的剩余短N端氨基酸序列保持附接至TrkB受体的细胞内部分，从而去除免疫原性风险并且不干扰成熟受体的细胞内信号传导能力。来自C端病毒2A序列的残余脯氨酸氨基酸保持附接至N端BDNF信号肽并且在信号序列从成熟蛋白分裂之后最终从mBDNF蛋白去除。
本发明者已经产生了间隔子序列的两个实施方案。本文所描述的两个实施方案共有的肽间隔子序列的一个重要区段是C端。因此，优选地，肽间隔子序列包含在本文中称作SEQ ID NO.4的氨基酸序列，或其片段或变体，如下：
QAGDVEENPGP
[SEQ ID No:4]
优选地，肽间隔子序列的消化或切割位点安置于SEQ ID No:4中的末端甘氨酸与末端脯氨酸之间。
在第一个优选的实施方案中，间隔子序列包含在本文中称作SEQ ID NO.5的核苷酸序列，或其片段或变体，如下：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
[SEQ ID No:5]
在这第一个实施方案中，肽间隔子序列包含在本文中称作SEQ ID NO.6的氨基酸序列，或其片段或变体，如下：
GSGATNFSLLQAGDVEENPGP
[SEQ ID No:6]
在第二个优选的实施方案中，间隔子序列包含在本文中称作SEQ IDNO.7的核苷酸序列，或其片段或变体，如下：
AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
[SEQ ID No:7]
在这第二个实施方案中，肽间隔子序列包含在本文中称作SEQ ID NO.8的氨基酸序列，或其片段或变体，如下：
SGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[SEQ ID No:8]
本发明者已经仔细考虑TrkB受体的序列，并且已经产生由第一个方面的基因构建体中的第一编码序列编码的受体的若干优选的实施方案。
在一个优选的实施方案中，第一编码序列包含编码TrkB的人规范同种型的核苷酸序列。优选地，TrkB的规范同种型包含在本文中称作SEQ ID NO.9的氨基酸序列(822个残基)，或其片段或变体，如下列出：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No:9]
优选地，在这个实施方案中，第一编码序列包含在本文中称作SEQ IDNO.10的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:10]
在另一个优选的实施方案中，第一编码序列包含编码TrkB的同种型4的核苷酸序列。优选地，TrkB的同种型4包含在本文中称作SEQ ID NO.11的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[SEQ ID No:11]
优选地，第一编码序列的这个实施方案包含在本文中称作SEQ ID NO.12的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:12]
本发明者在研究TrkB受体的序列中已经耗费相当大的发明努力并且已经认识到TrkB包含五个酪氨酸残基(在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706以及816处)，其通常在二聚和在BDNF二聚体存在下自体磷酸化之后磷酸化。关于这五个酪氨酸残基的磷酸化的问题在于受体可以由磷酸酶，诸如Shp-2磷酸酶容易地灭活。因此，为了防止体内受体的磷酸化和所引起的灭活，优选地这些关键酪氨酸中的一者或多者突变(更优选地突变成谷氨酸)以模拟所产生的磷酸酪氨酸并且产生在BDNF存在下仍然有活性并且不可以由磷酸酶，诸如Shp-2磷酸酶灭活的受体。TrkB的这类突变形式旨在产生TrkB受体活性，其仍然有活性持续更长的时段或直至受体内化为止。
下文所提供的DNA和氨基酸序列说明了已经突变成五个谷氨酸(E)残基的这五个酪氨酸(Y)残基的位置。将了解，在本发明的实施方案中这些残基中的1个、2个、3个、4个或5个可以突变成谷氨酸。还设想了这些突变的各种组合，例如，仅位置516和701，或仅位置705、706和816，等等。
因此，在另一个优选的实施方案中，第一编码序列包含编码TrkB受体的突变形式的核苷酸序列，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的一个或多个酪氨酸残基经过修饰或突变。优选地，在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少两个、三个或四个酪氨酸残基经过修饰。最优选地，在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的所有五个酪氨酸残基经过修饰。
优选地，所述或每个酪氨酸残基被修饰成不同氨基酸残基，更优选的是谷氨酸。因此，优选地，TrkB受体的突变形式包含Y516E、Y701E、Y705E、Y706E和/或Y816E。
优选地，TrkB受体的修饰形式包含在本文中称作SEQ ID NO.13的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG
[SEQ ID No:13]
优选地，在这个实施方案中，第一编码序列包含在本文中称作SEQ IDNO.14的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGAACTGGACATTCTAGGC
[SEQ ID No:14]
将了解，第二编码序列编码TrkB受体的激动剂，其优选的是营养因子的神经营养素家族的成员。TrkB受体的优选激动剂因此可以选自由以下组成的激动剂的群组：脑源性神经营养因子(BDNF)；神经生长因子(NGF)；神经营养素-3(NT-3)；神经营养素-4(NT-4)；以及神经营养素-5(NT-5)；或其片段。
这些激动剂中的每一者的核苷酸和氨基酸序列将为技术人员所知。然而，举例来说，神经营养素-4(NT-4)的一个实施方案的氨基酸序列实质上如SEQ ID NO.49所列出，如下：
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[SEQ ID No:49]
神经营养素-4(NT-4)的这个实施方案的核酸编码序列实质上如SEQ IDNO.50所列出，如下：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No:50]
NT-4序列的信号肽的氨基酸序列实质上如SEQ ID NO.51所列出，如下：
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES
[SEQ ID No:51]
这个信号肽的核酸序列实质上如SEQ ID NO.52所列出，如下：
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCC
[SEQ ID No:52]
这个NT-4序列的原肽的氨基酸序列实质上如SEQ ID NO.53所列出，如下：
QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR
[SEQ ID No:53]
这个原肽的核酸序列实质上如SEQ ID NO.54所列出，如下：
CAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGT
[SEQ ID No:54]
这个NT-4序列的成熟蛋白序列的氨基酸序列实质上如SEQ ID NO.55所列出，如下：
GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[SEQ ID No:55]
这个成熟NT-4蛋白的核酸编码序列实质上如SEQ ID NO.56所列出，如下：
GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[SEQ ID No:56]
因此，在一个优选的实施方案中，第二编码序列编码神经营养素-4(NT-4)，其可以包含实质上如SEQ ID NO:49或55所列出的氨基酸序列，或其片段或变体。因此，第二编码序列可以包含实质上如SEQ ID No:50或56所列出的核苷酸序列，或其片段或变体。
然而，TrkB受体的最优选的激动剂包括前原脑源性神经营养因子(前原BDNF)、原BDNF或成熟BDNF(mBDNF)。BDNF最初作为前体蛋白，即前原BDNF，由内质网上发现的核糖体合成。存在至少17个由人前原BDNF基因(ENSG00000176697)编码的已知剪接变体。一旦前原BDNF已经进入粗面内质网中，前原BDNF就通过信号肽(即，“前”序列)的分裂转化成原BDNF。原BDNF通过存在于原BDNF上的额外N端肽序列的分裂转化成mBDNF。原BDNF与mBDNF然后都分泌至细胞外空隙中，在此其结合至并活化各种细胞，包括RGC和耳蜗细胞上的受体。
原BDNF优先结合至并活化受体p75NTR，其在活化时诱导RGC和耳蜗细胞的凋亡。因此，在一个优选的实施方案中，原BDNF是p75NTR受体的激动剂。在一个实施方案中，原BDNF是规范的原BDNF。优选地，规范的原BDNF包含在本文中称作SEQ ID NO.15的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:15]
优选地，在这个实施方案中，第二编码序列包含在本文中称作SEQ IDNO.16的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:16]
在另一个实施方案中，原BDNF是原BDNF的同种型2，其优选地包含缬氨酸至甲硫氨酸的突变(加下划线的氨基酸)。优选地，原BDNF的同种型2包含在本文中称作SEQ ID NO.17的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:17]
在一个实施方案中，然而，激动剂不是原BDNF，或其片段或变体，取而代之的是第二编码序列优选地包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。成熟BDNF(mBDNF)优先结合至并活化TrkB，其在活化时促进RGC和/或耳蜗细胞的存活。因此，成熟BDNF是TrkB的最优选的激动剂。根据第一个方面的构建体是有利的，这是因为不同于其它已知的基因构建体，这个构建体能够产生尚未错误折叠的成熟BDNF蛋白。
因此，在一个优选的实施方案中，第二编码序列包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。mBDNF是由基因编码的所有17个同种型所共有的。存在7个蛋白不同序列，其中五个具有扩展至规范形式的信号序列，并且一个具有规范信号序列，但具有缬氨酸至甲硫氨酸的突变(这个突变是同种型2、4、7、8、9、10、11、12、13、14以及16所共有的)。据信，缬氨酸至甲硫氨酸的突变减少BDNF从细胞释放。
优选地，成熟BDNF包含在本文中称作SEQ ID NO.18的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[SEQ ID No:18]
优选地，第二编码序列的这个实施方案包含在本文中称作SEQ ID NO.19的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:19]
在又另一个优选的实施方案中，激动剂是具有偶联至N端的信号肽的mBDNF。如下文所论述，信号肽可以是前原BDNF的规范信号肽，或IL-2的信号肽，或由本发明者创造的重新合成的新颖信号序列。
优选地，第二编码序列包含编码TrkB受体的激动剂的信号肽，最优选的是BDNF的信号肽的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，核苷酸序列编码BDNF的规范信号肽。优选地，第二编码序列的这个实施方案包含编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含在本文中称作SEQ ID NO.20的氨基酸序列，或其片段或变体，如下列出：
MTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:20]
优选地，第二编码序列的这个实施方案包含在本文中称作SEQ ID NO.21的核苷酸序列，或其片段或变体，如下列出：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:21]
本发明者已经创造了一系列扩展信号肽。在优选的实施方案中，编码BDNF的同种型信号肽的核苷酸序列选自由以下组成的群组：同种型2、3、6、5以及4。这些扩展信号肽中的每一者的核酸和氨基酸序列在下文列出：
同种型2
MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:22]ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:23]
同种型3和6
MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:24]ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:25]
同种型5
MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:26]
ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:27]
同种型4
MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPENGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:28]
ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGTTTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTGTGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAAAATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:29]
因此，在优选的实施方案中，第二编码序列包含编码在本文中称作SEQID NO.23、25、27或29中的任一者的信号序列肽的核苷酸序列。优选地，信号肽包含在本文中称作SEQID NO.22、24、26或28中的任一者的氨基酸序列。
本发明者还已经创造了激动剂，优选的是BDNF的新颖信号肽的各种实施方案。这些信号肽增加N端区段(添加有赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基)和后续疏水区(添加有亮氨酸(L)残基)的碱度水平，这与野生型规范信号序列所观测的水平相比增加BDNF的分泌。
a)QTA003P(IL-2信号)
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
[SEQ ID No:30]
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[SEQ ID No:31]
b)QTA004P
MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK
[SEQ ID No:32]
ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG
[SEQ ID No:33]
c)QTA009P(修饰的IL-2)
MRRMQLLLLIALSLALVTNS
[SEQ ID No:34]ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[SEQ ID No:35]
d)QTA010P
MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:36]ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:37]
e)QTA0012P
MRILLLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:38]
ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:39]
f)QTA0013P
MRRILFLTMVISYFGCMKA
[SEQ ID No:40]
ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:41]
g)QTA0014P
MRRFLFLLVISYFGCMKA
[SEQ ID No:42]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:43]
i)QTA0015P
MRRFLFLLYFGCMKA
[SEQ ID No:44]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[SEQ ID No:45]
图6示出了用于本发明的构建体中以增进激动剂，优选的是BDNF的分泌的信号肽的进一步优选的实施方案的核苷酸和氨基酸序列。信号肽中的第二个残基是苏氨酸(T)，其优选地被一个或多个碱性残基，诸如赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换。信号肽中包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)以及亮氨酸(L)的下一个残基段优选地被一个或多个疏水残基置换。
因此，在优选的实施方案中，第二编码序列包含编码在本文中称作SEQID NO.31、33、35、37、39、41、43、45、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101或103中的任一者的信号序列肽的核苷酸序列。优选地，信号肽包含在本文中称作SEQ ID NO.30、32、34、36、38、40、42、44、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100或102中的任一者的氨基酸序列。
因此，将了解，本发明者已经通过去除原序列来修饰BDNF基因序列，这在之前还从未达成，结果产生适当折叠的成熟BDNF，与引入完全新颖的信号肽相结合，这显著增进BDNF的产生和释放高于曾经用内源序列所达成的。
优选地，基因构建体包含左和/或右反向末端重复序列(ITR)。优选地，每个ITR安置于构建体的5＇和/或3＇末端处。ITR可以对病毒(例如，AAV或慢病毒)血清型具特异性，并且可以是任何序列，只要其在其二级结构中形成发夹环即可。
ITR的一个实施方案(来自可商购的AAV质粒的左ITR)的DNA序列在本文中以SEQID No:46表示，如下：
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[SEQ ID NO:46]
ITR的另一个实施方案(来自可商购的AAV质粒的右ITR)的DNA序列在本文中以SEQID No:47表示，如下：
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[SEQ ID NO:47]
综上所述，技术人员将了解第一个方面的构建体的实施方案的核苷酸序列以及编码的转基因的氨基酸序列。然而，为避免疑义，质粒QTA020P(和载体QTA020V)内所含的鼠类TrkB受体-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的2940bp序列的编码序列在此处称作SEQ ID No:107，如下：
ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGGGCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGAGCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAGATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGAGAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCTGAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTGTCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGGAGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGCCAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAGGGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCAACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTCCGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAATCTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCCCCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTCCAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAATCCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGATCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTATGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGATGTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCTTCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGCCTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCTTCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTCAGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACATCGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGCCCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACTTCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGTGGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCACACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGCACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGCAACCAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTGTACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCATCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTACCTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTGCTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCACACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCTGGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:107]
质粒QTA029P(和载体QTA029V)内所含的人类TrkB受体-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的2943bp序列的编码序列在此处称作SEQ ID No:108，如下：
ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAGGCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGACCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAGATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGAGAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCTGCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTGAGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAGAGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGCCAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAAGGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTAACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTCTGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAATCTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTCCGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAGCAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAATCCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAATATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTACGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACTGACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCGGATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGGCCAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACACGCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAACCCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACAACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTTGTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAGGATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTATGTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCGCGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATGTTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATCTTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGATGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAATCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTTTGGAGTCTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAATTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGGTCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGAGAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCGTCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:108]
因此，在最优选的实施方案中，构建体包含实质上如SEQ ID No:107或108所列出的核苷酸序列，或其片段或变体。
本发明者已经创造了包含本发明的构建体的一系列重组表达载体。
因此，根据第二个方面，提供了一种重组载体，其包含根据第一个方面的基因构建体。
重组载体可以是重组AAV(rAAV)载体。rAAV可以是天然存在的载体或具有杂交AAV血清型的载体。rAAV可以是AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10以及AAV-11。优选地，rAAV是rAAV血清型-2。
有利地，重组AAV2在宿主生物体中引发最小免疫反应并且介导长期转基因表达，这种表达在载体施用之后可以在视网膜中持续存在至少一年。
如本文所用的术语“重组AAV(rAAV)载体”意指含有至少一个末端重复序列的源自重组AAV的核酸。
载体的优选的实施方案示于图2-5中。
本文所描述的构建体和表达载体可以用于治疗视神经病症和耳蜗病症，并且更一般地用于促进神经再生和存活。
因此，根据第三个方面，提供了根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体，其用作药剂或用于疗法中。
根据第四个方面，提供了根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体，其用于治疗、预防或改善视神经病症或耳蜗病症，或用于促进神经再生和/或存活。
根据第五个方面，提供了一种治疗、预防或改善受试者的视神经病症或耳蜗病症，或用于促进受试者的神经再生和/或存活的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体。
优选地，根据本发明的基因构建体或重组载体用于基因治疗技术中。由构建体或载体编码的激动剂活化由构建体/载体也编码的TrkB，从而促进视网膜神经节细胞(RGC)或耳蜗细胞的存活。
在一个实施方案中，所治疗的视神经病症可以是青光眼，或可以导致RGC损失的任何其它病理生理性病状，诸如对头部或脸部的创伤或血管损伤，例如对接收来自视神经的输入的眼部结构或脑部区域的供血的部分或完全损失。另外，构建体也可以用于经由将未转化或转化的干细胞引入患者的眼睛或与视力相关联的区域中来支持RGC的置换。
在一个实施方案中，所治疗的耳蜗病症可以是听力损失或耳聋。本发明的构建体和载体显著增强耳蜗细胞对TrkB受体激动剂的敏感度，这归因于TrkB受体与受体的激动剂的局部增加。耳蜗细胞可以是毛细胞或神经元螺旋神经节细胞，所述细胞经由其轴突将听觉信号从耳朵传送至脑干。毛细胞可以是内耳毛细胞或外耳毛细胞[42、43、44]。
在另一个实施方案中，构建体和载体可以用于促进神经再生和/或存活。
将了解，根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体可以用于药剂中，所述药剂可以作为单一疗法使用(即，使用根据第一个方面的基因构建体或根据本发明的第二个方面的载体)，用于治疗、改善或预防视神经病症或耳蜗病症，或用于促进神经再生和/或存活。或者，根据本发明的基因构建体或重组载体可以作为已知疗法的助剂或与已知疗法组合使用，用于治疗、改善或预防视神经病症或耳蜗病症，或用于促进神经再生和/或存活。
根据本发明的基因构建体或重组载体可以在组合物中组合，所述组合物具有许多不同形式，这特别取决于使用组合物的方式。因此，举例来说，组合物可以呈粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾、胶束溶液、透皮贴片、脂质体悬浮液的形式或可以施用于需要治疗的人或动物的任何其它适合形式。将了解，根据本发明的药剂的媒剂应为由其所给与的受试者良好耐受的媒剂。
根据本发明的基因构建体或重组载体还可以在缓慢或延迟释放装置内合并。这类装置可以例如插在皮肤上或下，并且药剂可以经过数周或甚至数月释放。装置可以定位于至少邻近治疗部位。当需要基因构建体或重组载体的长期治疗并且将通常需要频繁施用(例如，至少每日注射)时，这类装置可能特别有利。
在优选的实施方案中，根据本发明的药剂可以通过注射至血流、神经中或直接注射至需要治疗的部位中而施用于受试者。举例来说，药剂可以至少邻近视网膜或耳朵注射。注射可以是静脉内(团注或输注)或皮下(团注或输注)或皮内(团注或输注)。
将了解，所需要的基因构建体或重组载体的量由其生物活性和生物利用度决定，这继而取决于施用模式、基因构建体或重组载体的生理化学特性以及其作为单一疗法还是在组合疗法中使用。施用频率还将受环状多肽在所治疗的受试者内的半衰期影响。有待施用的最佳剂量可以由本领域的技术人员确定，并且将随着使用中的特定基因构建体或重组载体、医药组合物的强度、施用模式以及视神经病症或耳蜗病症的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的额外因素将促使需要调整剂量，所述因素包括受试者年龄、体重、性别、饮食以及施用时间。
一般来说，根据本发明的环状多肽的介于0.001微克/公斤体重与10毫克/公斤体重之间或介于0.01微克/公斤体重与1毫克/公斤体重之间的日剂量可以用于治疗、改善或预防视神经病症或耳蜗病症，这取决于所使用的基因构建体或重组载体。
基因构建体或重组载体可以在视神经或耳蜗病症发作之前、期间或之后施用。日剂量可以作为单次施用而给与(例如，鼻喷雾的单次每日注射或吸入)。或者，基因构建体或重组载体可能需要在一天中施用两次或更多次。作为一个实例，基因构建体或重组载体可以作为两个(或更多个，这取决于所治疗的视神经或耳蜗病症的严重性)日剂量施用，所述日剂量介于0.07μg与700mg之间(即，假设体重70kg)。接受治疗的患者可以在睡醒后获取第一个剂量并且然后在晚间获取第二个剂量(如果在两个剂量方案下)或此后以3或4小时时间间隔获取。或者，缓慢释放装置可以用于将根据本发明的基因构建体或重组载体的最佳剂量提供给患者而不需要施用重复剂量。
已知的程序，诸如医药行业常规采用的那些(例如，体内实验、临床试验等等)可以用于形成根据本发明的基因构建体或重组载体的特定配方和精确的治疗方案(诸如药剂日剂量和施用频率)。本发明者相信首先在于提出编码可操作地连接至TrkB受体和TrkB受体激动剂的编码序列的启动子的基因构建体。
根据第六个方面，提供了一种医药组合物，其包含根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体和医药学上可接受的媒剂。
根据第七个方面，提供了一种制备根据第六个方面的医药组合物的方法，所述方法包括使根据第一个方面的基因构建体或根据第二个方面的重组载体与医药学上可接受的媒剂接触。
“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家养动物。因此，根据本发明的组合物和药剂可以用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如，马)、宠物，或可以用于其它兽医学应用中。然而，最优选地，受试者是人类。
基因构建体、重组载体或医药组合物的“治疗有效量”是如下任何量，所述量在施用于受试者时是治疗青光眼、耳聋或产生所需作用，诸如促进神经再生和/或存活所需要的前述量。
举例来说，所使用的基因构建体、重组载体或医药组合物的治疗有效量可以是约0.01mg至约800mg，并且优选地约0.01mg至约500mg。优选地，基因构建体、重组载体或医药组合物的量是约0.1mg至约250mg并且最优选地约0.1mg至约20mg的量。
如本文所提及的“医药学上可接受的媒剂”是本领域的技术人员已知适用于配制医药组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
在一个实施方案中，医药学上可接受的媒剂可以是固体，并且组合物可以呈粉末或片剂的形式。固体医药学上可接受的媒剂可以包括一种或多种物质，所述物质也可以充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、涂料或片剂崩解剂。媒剂也可以是囊封材料。在粉末中，媒剂是细粉状固体，其与根据本发明的细粉状活性剂混合。在片剂中，活性剂(例如，根据本发明的基因构建体或重组载体)可以与具有必要的压缩特性的媒剂按适合的比例混合并且压成所需的形状和大小。粉末和片剂优选地含有至多99％的活性剂。适合的固体媒剂包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡以及离子交换树脂。在另一个实施方案中，医药媒剂可以是凝胶并且组合物可以呈乳膏或类似形式。
然而，医药媒剂可以是液体，并且医药组合物呈溶液的形式。液体媒剂用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂以及加压组合物。根据本发明的基因构建体或重组载体可以溶解或悬浮于医药学上可接受的液体媒剂中，所述媒剂诸如水、有机溶剂、两者的混合物或医药学上可接受的油或脂肪。液体媒剂可以含有其它适合的医药添加剂，诸如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于经口和肠道外施用的液体媒剂的适合实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选的是羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)和其衍生物，以及油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠道外施用，媒剂也可以是油酯，诸如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒剂适用于供肠道外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体媒剂可以是卤化烃或其它医药学上可接受的推进剂。
呈无菌溶液或悬浮液的液体医药组合物可以通过例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内并且特别是皮下注射而利用。基因构建体或重组载体可以制备成无菌固体组合物，其可以在施用的时候使用无菌水、盐水或其它适当的无菌可注射介质来溶解或悬浮。
本发明的基因构建体、重组载体以及医药组合物可以呈无菌溶液或悬浮液的形式经口施用，所述溶液或悬浮液含有其它溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等张)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(与氧化乙烯共聚的山梨糖醇和其酸酐的油酸酯)，等等。根据本发明的基因构建体、重组载体或医药组合物还可以呈液体或固体组合物形式经口施用。适合于经口施用的组合物包括固体形式，诸如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉末；以及液体形式，诸如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。施用于肠道外施用的形式包括无菌溶液、乳液以及悬浮液。
将了解，本发明扩展至任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，这实质上包含本文所提及的序列中的任一者的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“实质上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”以及“片段”可以是与本文所提及的序列中的任一者的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列一致性的序列，例如与鉴别为SEQ ID No:1-108的序列具有40％一致性，等等。
还设想了与所提及的序列中的任一者具有大于65％、更优选地大于70％、甚至更优选地大于75％并且还更优选地大于80％序列一致性的序列一致性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的序列中的任一者具有至少85％一致性，更优选地与本文所提及的序列中的任一者具有至少90％一致性、甚至更优选地至少92％一致性、甚至更优选地至少95％一致性、甚至更优选地至少97％一致性、甚至更优选地至少98％一致性并且最优选地至少99％一致性。
技术人员将了解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性，必须首先制定两个序列的比对，继之以序列一致性值的计算。两个序列的百分比一致性可以取不同值，这取决于：(i)用于比对序列的方法，例如，ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同程序中实施)或来自3D比较的结构比对；和(ii)由比对方法使用的参数，例如，局部对比全局比对、所使用的配对得分矩阵(例如，BLOSUM62、PAM250、Gonnet等等)，以及空位罚分，例如函数形式和常数。
在已经进行比对下，存在许多不同的方式来计算两个序列之间的百分比一致性。举例来说，可以用一致性的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)不包括悬垂的对等位置的数目。此外，将了解，百分比一致性还强烈取决于长度。因此，一对序列越短，可以预期偶然发生的序列一致性越高。
因此，将了解，蛋白或DNA序列的准确比对是一个复杂的过程。普及的多重比对程序ClustalW(Thompson等,1994,《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》,22,4673-4680；Thompson等,1997,《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》,24,4876-4882)是用于生成根据本发明的蛋白或DNA的多重比对的优选方式。用于ClustalW的适合参数可以如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位扩展罚分＝6.66，并且矩阵＝一致性。对于蛋白比对：空位开放罚分＝10.0，空位扩展罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域的技术人员将意识到可能有必要改变这些和其它参数用于最佳序列比对。
优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性的计算然后可以从这样的比对以(N/T)×100计算，其中N是序列共享一致残基的位置的数目，并且T是包括空位但不包括悬垂的所比较的位置的总数。因此，用于计算两个序列之间的百分比一致性的最优选的方法包括(i)使用ClustalW程序使用适合的参数组(例如，如上文所列出)制定序列比对；和(ii)将N和T的值插入以下公式中：序列一致性＝(N/T)×100。
用于鉴别类似序列的替代性方法将为本领域的技术人员所知。举例来说，实质上类似的核苷酸序列将由在严格条件下与DNA序列或其补体杂交的序列编码。严格条件意味着核苷酸在约45℃下在3×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤器结合的DNA或RNA杂交，继之以在约20-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中的至少一次洗涤。或者，实质上类似的多肽可以与例如SEQ ID No:3和5所示的多肽有至少1个，但小于5个、10个、20个、50个或100个氨基酸不同。
归因于遗传密码的简并，显然本文所描述的任何核酸序列可以在不实质上影响由其编码的蛋白的序列的情况下改变或变化，以提供其功能变体变体。适合的核苷酸变体是具有通过编码序列内的相同氨基酸的不同密码子的取代，由此产生沉默变化而改变的序列的那些。其它适合的变体是具有同源核苷酸序列，但包含通过编码具有与所取代的氨基酸类似的生物物理特性的侧链的氨基酸的不同密码子的取代，以产生保守变化而改变的序列的全部或部分的那些。举例来说，小的非极性疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸以及甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，将了解哪些氨基酸可以被具有类似生物物理特性的氨基酸置换，并且技术人员将知晓编码这些氨基酸的核苷酸序列。
根据另一个方面，提供了一种基因构建体，其包含可操作地连接至编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)的第一编码序列和编码TrkB受体的激动剂的第二编码序列的启动子，所述激动剂用于活化TrkB，从而促进视网膜神经节细胞(RGC)、神经细胞或耳蜗细胞的存活。
本文(包括任何附随权利要求、摘要以及图式)所描述的所有特征和/或由此公开的任何方法或过程的所有步骤可以与上述方面中的任一者以任何组合形式组合，但这类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。
为了更好地理解本发明并且显示本发明的实施方案怎样可以付诸实施，现在将举例参考附图，其中：
图1是根据本发明的基因构建体的一个实施方案的示意图；
图2是称为“质粒QTA001PA”的根据本发明的重组载体的第一个实施方案的示意图，其含有规范信号序列(蓝色)加上原BDNF(红色)和mBDNF(黑色)。其还包括-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图3是称为“质粒QTA002P”的根据本发明的重组载体的第二个实施方案的示意图，其不具有原BDNF(但仅产生mBDNF)并且具有与QTA001PA相同的信号序列(蓝色)。其还包括-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图4是称为“质粒QTA003P”的根据本发明的重组载体的第三个实施方案的示意图，其不具有原BDNF(但仅产生mBDNF)并且具有IL-2信号序列(蓝色)。其还包括-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图5称为“质粒QTA004P”的根据本发明的重组载体的第四个实施方案的示意图，其不具有原BDNF(但仅产生mBDNF)并且具有新颖的信号序列(蓝色)。其还包括-IRES-GFP-序列(青色和紫色)；
图6示出了用于本发明的构建体中的信号肽的不同实施方案的核苷酸和氨基酸序列。第二个残基是苏氨酸(t)，其可以被一个或多个碱性残基，诸如赖氨酸(K)或精氨酸(R)置换。包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)以及亮氨酸(L)的下一个残基段可以被一个或多个疏水残基置换；
图7示出了在含有编码具有不同信号肽序列并且不具有扩展的原BDNF补体的编码序列的mBDNF的基因的质粒(4μg DNA/孔)转导之后24小时使用特异性ELISA的BDNF从HEK293细胞的释放(数据对于n＝4以平均值±SEM示出)；
图8示出了在质粒转导之后24小时HEK293细胞裂解物中BDNF免疫反应性物质的细胞浓度(任意单位)的西方墨点结果(数据对于n＝4以平均值±SEM示出)；
图9示出了当细胞用QTA001PA转导时显示两个分子量区带(32kDa和14kDa)的细胞裂解物的西方墨点中的BDNF免疫反应性，对比使用QTA002P、QTA003P以及QTA004P转导的仅单一14kDa区带；
图10示出了在使用选择性原BDNF ELISA的质粒转导之后24小时如使用特异性ELISA测量的HEK293孵育培养基中的原BDNF浓度(数据对于n＝4以平均值±SEM示出)；
图11示出了由质粒QTA002P(内源规范信号肽序列)和QTA009P至QTA013P对HEK293细胞裂解物中的BDNF的表达。数据以平均值+S.E.M示出。**P<0.01，与QTA002P相比；
图12示出了由质粒QTA002P(内源规范信号肽序列)和QTA009P至QTA013P对HEK293细胞孵育培养基中的BDNF的表达。数据以平均值+S.E.M示出。**P<0.01，与QTA002P相比；
图13示出了在HEK293细胞用质粒QTA015P(表达由IRES间隔子隔开的BDNF和eGFP)、QTA021P(表达由功能性病毒2A肽序列隔开的BDNF继之以eGFP)、QTA022P(表达由非功能性病毒2A肽序列隔开的BDNF继之以eGFP)以及QTA023P(表达由功能性病毒2A肽序列隔开的eGFP继之以BDNF的编码)转导之后24小时来自HEK293细胞的西方墨点。数据以BDNF免疫反应性(A)、eGFP免疫反应性(B)以及从HEK293细胞释放至孵育培养基中的BDNF的量(C)示出。数据以区带中密度的平均值+S.E.M示出；
图14A示出了在用QTA020V载体转染之后48小时HEK293细胞匀浆的西方墨点并且显示包括由病毒2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的大前体编码区的有效加工。图14B和14C显示，在病毒2A肽分裂之后产生的转基因蛋白已经输送至加工之后HEK293细胞中的正确细胞内区室(TrkB受体输送至细胞表面并且BDNF在释放前输送至储存囊泡)；
图15A示出了TrkB受体表达并且图15B示出了BDNF表达，这是在小鼠视网膜匀浆中对于rAAV2载体QTA020V。数据以小鼠视网膜匀浆的西方墨点中密度的平均值+S.E.M示出。**P<0.01，与未处理的(未注射的动物)相比；
图16示出了在注射含有由病毒2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的编码的rAAV2载体QTA020V之后如由免疫细胞化学显示的小鼠视网膜神经节细胞层中TrkB(A)和BDNF(B)转基因的表达；以及
图17示出了用rAAV2-CAG-eGFP载体处理的小鼠对比对照动物中在视神经钳夹(ONC)之后视网膜神经节细胞(RGC)存活。对于如由视网膜铺片中的Brn3A阳性细胞计数的在每只动物的整个视网膜中视网膜神经节细胞的平均数，数据以平均值+S.E.M.示出。***P<0.001，*P<0.05，与对照相比。
实施例
方法与材料
分子克隆和质粒构建体
使用在线工具(http://www.idtdna.com/CodonOpt)进行DNA序列的密码子优化并且由Integrated DNA technologies,Inc.(IDT；9180N.McCormickBoulevard,Skokie,IL60076-2920,USA)或GenScript(860Centennial Ave,Piscataway,NJ 08854,USA)合成DNA区块。使用标准分子生物学和克隆技术进行克隆以制造主质粒QTA001PA和后续质粒。
质粒规模放大和纯化
将DNA质粒在SURE感受态细胞(Agilent Technologies；目录号200238)中规模放大过夜以在大量制备(maxi-prep)纯化之后提供2.29μg/μl质粒。将剩余质粒规模放大至500μg规模和具有最小内毒素存在的转导质量。
HEK293培养和使用质粒DNA的细胞转导
在多聚-L-赖氨酸(10μg/mL，Sigma-Aldrich；目录号P1274)涂布的6孔板中在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和1％链霉素(1％Pen/Strep)的1.5mL杜氏最低必需培养基(Dulbecco＇s minimum essential medium，DMEM)中培养HEK293细胞(400,000个细胞)直至80％汇合。然后将培养基换成2mL DMEM(无添加剂)。二至三小时后，将含有4μg质粒DNA加上10μL脂染胺(lipofectamine)(4μL/mL；Thermo Fisher Scientific；目录号12566014)的额外0.5ml转染培养基添加至每个孔中，在整个转染时段中并且对于上清液收集得到2.5ml的总体积。
通过ELISA的BDNF测量
在转染之后24小时在细胞培养基中测量从HEK293细胞分泌的BDNF的量。将培养基离心以去除碎片，并且使用商业人类BDNF ELISA试剂盒(Sigma-Aldrich，产品号RAB0026)测量。通过将样品与新鲜制成的BDNF标准相比较来确定BDNF浓度。
BDNF和TrkB受体的西方墨点
通过去除DMEM孵育培养基，在冷磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞并且将350μL新鲜制备的裂解缓冲液添加至孔中(10ml裂解M试剂，+1片完全小型蛋白酶抑制剂混合物，Roche；目录号04719964001，+100μl停止磷酸酶抑制剂混合物(100×)，Thermo Scientific；目录号78428)来测量HEK293细胞内BDNF和TrkB免疫反应性的量。在细胞匀化之后，使用BCA检验(Pierce BCA蛋白检验试剂盒，Thermo Scientific；目录号23227)定量蛋白悬浮液。使介于6μg与15μg之间的HEK293细胞裂解物蛋白/泳道向下跑过Bis-Tris凝胶(12％NuPAGENovex；目录号NP0342BOX，ThermoScientific)并且通过西方墨点使用孵育过夜的初级兔多克隆抗BDNF抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；产品号sc-546；在1:500稀释度下)、兔多克隆抗TrkB抗体(Abcam；目录号ab33655，在1:2000稀释度下使用)或eGFP抗体(Abcam产品号ab-290，在1:500下使用)检查。用HRP偶联的抗兔抗体(Vector Laboratories；目录号PI-1000，在1:8000下)显现初级抗体并且使用ECL Prime(Amersham,GE Healthcare,UK)和Alliance西方墨点成像系统(UVItec Ltd,Cambridge,UK)进行信号检测。对于小鼠视网膜的西方墨点，在500μL新鲜制备的裂解缓冲液(10ml裂解M试剂，+1片完全小型蛋白酶抑制剂混合物，Roche产品号04719964001，+100μl停止磷酸酶抑制剂混合物(100×)，ThermoScientific产品号78428)中匀化来自载体处理的动物的眼睛。破坏组织1分钟(Qiagen，TissueRuptor产品号9001273)，然后在冰上再保持15分钟。然后如上文所描述通过西方墨点分析蛋白。
免疫细胞化学
将HEK293细胞(70,000)接种于4孔板内的13mm多聚-L-赖氨酸涂布的盖玻片上并且在0.5ml培养基中含有10％FBS和1％Pen/Strep的DMEM中孵育。一旦细胞已经生长至80％汇合，就将培养基换成0.4ml DMEM(无添加剂)持续2-3小时，然后再添加0.1mL转染培养基(0.8μg质粒DNA+2μl脂染胺)以使得最终体积达到0.5ml。在PBS中洗涤盖玻片两次并且在室温下在含4％多聚甲醛的1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定30分钟。在PBS中再洗涤三次后，阻断细胞并且通过在室温下在含5％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)以及0.3％Triton X-100的PBS中孵育60分钟来渗透。然后将细胞在4℃下与针对BDNF(Santa CruzBiotechnology Inc；产品号sc-546；在1:300稀释度下)或TrkB(Abcam产品号ab33655，以1:500稀释)的商业兔多克隆抗体一起孵育过夜，在阻断溶液中稀释。在室温下使用偶联至alexa fluor 647(Invitrogen，产品号A21248，在1:1000下)的二级抗兔抗体呈现染色2小时。用1μg/ml DAPI(Thermo Scientific，产品号D1306，在1:8000下)也对细胞核复染色。将细胞进一步洗涤三次，随后在成像前用fluorSaveTM试剂(Calbiochem/EMD ChemicalsInc.,Gibbstown,NJ,USA)封固。使用20×物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)或配备有63×油物镜的Leica SP5共焦显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)使用3×数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z步长间隔进行成像。
对于来自对照或载体处理的动物的视网膜结构的免疫细胞化学，将细心解剖的眼睛固定于4％多聚甲醛/0.1％PBS(pH 7.4)中过夜并且在4℃下在30％蔗糖/0.1％PBS中脱水(24小时)。然后将眼睛包埋于含有最佳切割温度化合物(OCT)(Sakura Finetek,Zoeterwoude,Netherlands)的硅模具中并且在干冰上冷冻。使用Bright OTF 5000低温恒温器(Bright Instruments,Huntingdon,UK)将穿过视网膜的背腹/上下轴的13μm切片收集至正电荷防脱载玻片(superfrost plus slide)(VWR产品号631-0108)上。在PBS中洗涤载玻片三次，并且在室温下渗透于含5％正常山羊血清(NGS)、3％牛血清白蛋白(BSA)以及0.3％Triton X-100的PBS中60分钟。然后将载玻片在4℃下与针对BDNF(Santa CruzBiotechnology Inc产品号sc-546 1:300)或TrkB(Abcam产品号ab33655 1:500)的商业兔多克隆抗体一起孵育过夜，在阻断溶液中稀释。在室温下使用偶联至alexa fluor 647(Invitrogen，产品号A21248，在1:1000下)的二级抗兔抗体呈现染色2小时。用1μg/mL DAPI(Thermo Scientific，产品号D1306，在1:8000下)也对视网膜细胞核复染色。将载玻片进一步洗涤三次，随后在成像前用fluorSaveTM试剂(Calbiochem/EMD Chemicals Inc.,Gibbstown,NJ,USA)封固。使用20×物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)或配备有63×油物镜的Leica SP5共焦显微镜(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)使用3×数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z步长间隔进行成像。
玻璃体内注射
在7-10天适应期之后，将小鼠随机分至各个研究组中。然后用腹膜内注射氯胺酮(ketamine)(50mg/kg)和赛拉嗪(xylazine)(5g/kg)使小鼠麻醉。在研究第1天局部施用1％丁卡因(tetracaine)滴眼剂。使用1％托品酰胺(tropicamide)滴眼剂达成瞳孔扩大。使用手术显微镜，用30号针制造部分厚度巩膜导孔以有助于具有30μm尖端直径和2.5mm尖端长度的精细金属微量吸液管穿透下层巩膜、脉络膜和视网膜。微量吸液管然后连接至10μl玻璃注射器(Hamilton Co.,Reno,NV)，随后吸取2μl载体悬浮液至吸液管中，这取决于各组。在玻璃体内注射期间小心避免穿透晶状体或对涡静脉造成损害。注射部位是在颞上异色边缘的后部约3mm处。经过1分钟缓慢地注射以允许载体悬浮液扩散。右眼保持未触及并且充当内部对侧对照。
视神经钳夹(ONC)
在载体施用之后三周(21天)，使小鼠经受ONC程序，保持未处理或假钳夹。在双目手术显微镜下，用弹簧剪在结膜中从眼球下部开始并且在眼睛周围短暂地制造小切口。这暴露出眼球的后下方，允许视神经显现。用反力式钳子(Dumont#N7目录号RS-5027；Roboz)从眼球的约1-3mm处抓紧所暴露的视神经持续10秒，来自自夹紧作用的唯一压力压在神经上。10秒后，释放视神经，去除钳子并且眼睛转回原位。在ONC之后7天，将动物扑杀。通过将器官置于4％多聚甲醛/0.1％PBS(pH 7.4)中过夜固定来自每个组的两只眼睛。在解剖来自角膜的后眼结构并且去除晶状体之后制备视网膜铺片。将视网膜铺片在4％多聚甲醛/0.1％PBS中后固定30分钟并且在含0.5％Triton X-100的PBS中洗涤。在-80℃下冷冻视网膜10分钟以渗透核膜并且提高抗体渗透，随后在室温下在含10％正常驴血清(NDS)、2％牛血清白蛋白(BSA)以及2％Triton X-100的PBS中阻断60分钟。用针对Brn3A(1:200SantaCruz，#sc-31984)的抗体对RGC复染色并且在荧光显微术下使用20×物镜和Leica DM6000落射荧光显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)显现。使用配备有40×油物镜的Leica SP5共焦显微镜(Leica Microsystems)使用1.5×数字变焦和0.5-0.8顺序扫描z步长间隔获得更高分辨率的图像。由ImageJ使用基于图像的工具用于对核插件(ITCN)计数来测量RGC细胞计数并且以密度RGC/mm2表示。
构建体和载体
本发明者已经产生了如图1中所示的基因构建体，其可以用于治疗罹患视神经病变(诸如青光眼)或耳蜗病变的受试者，或用于促进神经再生和/或存活。已经设计构建体以通过mBDNF的伴随产生和局部释放维持或增加RGC的细胞表面上TrkB受体的密度并且维持或增加穿过TrkB受体路径的信号传导。
构建体包含编码TrkB受体和其激动剂成熟脑源性神经营养因子的转基因。这些转基因可操作地连接至单一启动子，其为人突触蛋白I(SYN I)启动子或CAG启动子。有利地，图1的构建体可以置于rAAV2载体中而不受其编码的转基因的大小所阻碍。这是因为构建体经过定向以使得第一转基因TrkB连接至病毒2A肽序列继之以BDNF信号肽并且然后连接至成熟蛋白。这种定向也使免疫原性风险降至最低，因为病毒2A肽的短N端氨基酸序列保持附接至TrkB受体的细胞内部分并且来自C端病毒2A序列的残余脯氨酸氨基酸保持附接至N端BDNF信号肽并且在分裂之后最终从mBDNF蛋白去除。载体可以置于药理学上可接受的缓冲溶液中，其可以施用于受试者。
图2-5示出了表达载体的各种实施方案。图2示出了称为“质粒QTA001PA”的载体，其含有规范信号序列(蓝色)(即，MTILFLTMVISYFGCMKA[SEQ ID NO:20])加上原BDNF(红色)和mBDNF(黑色)。图3示出了称为“质粒QTA002P”的载体。其不编码原BDNF但仅产生mBDNF，并且编码与QTA001PA相同的信号序列(蓝色)。图4示出了称为“质粒QTA003P”的载体，其也不编码原BDNF但仅产生mBDNF。替代mBDNF的规范信号序列，其包含IL-2信号序列(蓝色)。最后，图5示出了称为“质粒QTA004P”的载体。其不编码原BDNF但替代地仅产生mBDNF。其还编码新颖的信号序列(蓝色)[SEQ ID NO:32]。
本发明者已经产生并研究了从成熟BDNF(mBDNF)元件开始涉及青光眼基因疗法概念的构建体和载体。本发明者已经清楚地展示了在用含有BDNF序列而不含原BDNF编码区的质粒(QTA002P，见图3)进行脂染胺转导之后mBDNF从HEK293细胞的产生和释放(见图7)。从细胞释放的mBDNF是预测的14kDa单体(使用西方墨点和针对BDNF的可商购的抗体测量)并且不存在蛋白聚集体的迹象，如由尝试使用酵母和其它基于细胞的制造方法1产生商业量的mBDNF的若干小组已经报道的。mBDNF因此以可以允许蛋白分子形成非共聚二聚体以活化TrkB受体的形式释放。
使用用于BDNF的ELISA(不区分mBDNF与更大的扩展原BDNF蛋白)，本发明者也已经展示了可能用新颖的肽序列(QTA004P-见图5)取代编码内源规范18-氨基酸信号肽序列(MTILFLTMVISYFGCMKA)的DNA序列并且在用含有BDNF基因的质粒对细胞进行脂染胺转导之后将等效水平的BDNF释放至HEK293孵育培养基中(见图7)。
用编码白介素-2信号肽的序列(QTA003P-见图4)取代内源信号肽在从培养基释放BDNF方面不太有效。释放至培养基中的BDNF的水平当前为约1-2nM并且这种激动剂的浓度足以最大地活化特异性TrkB受体(约0.9nM的IC50)。使用含有组合的原BDNF和mBDNF序列并且还包括18-氨基酸规范信号肽的质粒QTA001PA(见图2)与质粒QTA002P(见图3)和QTA004P(见图5)相比，BDNF释放的水平约高35倍(876±87ng/mLBDNF)。
使用QTA001PA相比使用QTA002P和QTA004P的那些，在脂染胺质粒转导之后24小时通过定量西方墨点对细胞中剩余的BDNF的测量揭示了更低的BDNF剩余浓度(见图8)。
此外，由QTA001PA转导的细胞裂解物中约一半的BDNF免疫反应性呈原BDNF的形式(分子量区带在32kDa处)，而原BDNF区带在用QTA002P、QTA003P以及QTA004P转导的细胞裂解物中不存在(见图9)，这可能是因为这些质粒不含有原BDNF扩展编码序列。
使用特定用于原BDNF的ELISA，本发明者能够展示约70ng/mL(2.2nM或3.5％)从QTA001PA转导的细胞释放的BDNF免疫反应性呈原BDNF的形式，但大多数(96.5％或876ng/mL/63nM)作为mBDNF释放(见图10)。不存在从不含有扩展原BDNF的编码序列的QTA002P、QTA003P或QTA004P转导的细胞检测的原BDNF免疫反应性。
因此，显然所有质粒都能够产生14kDa mBDNF蛋白，但从HEK293细胞释放的mBDNF的量在很大程度上取决于蛋白储存和封装至分泌囊泡中的效率。如用质粒QTA001PA(图2)产生的含有组合的原BDNF和mBDNF序列的蛋白的扩展形式因此比似乎在细胞内积聚的更小的mBDNF序列更加有效地封装至分泌囊泡中并且释放至孵育培养基中。
参考图11，其显示用质粒QTA009P至QTA013P中包括的新颖序列取代如在质粒QTA002P中表现的内源规范信号肽序列的编码增加了在用质粒转导之后24小时HEK293细胞中BDNF的浓度。图12展示，用新颖序列(质粒QTA009P至QTA013P)取代质粒QTA002P中包括的内源规范信号肽编码序列增加了如在用质粒转导之后24小时所测量的BDNF(如通过ELISA测量)从HEK293细胞的释放。
如图13中所示，病毒2A肽序列的添加使得大前体蛋白的编码序列有效加工成两个转基因eGFP和BDNF。西方墨点显示在用以下质粒转导之后24小时的HEK293细胞：(i)QTA015P(表达由IRES间隔子隔开的BDNF和eGFP)，(ii)QTA021P(表达由功能性病毒2A肽序列隔开的BDNF继之以eGFP)，(iii)QTA022P(表达由非功能性病毒2A肽序列隔开的BDNF继之以eGFP)，以及(iv)QTA023P(表达由功能性病毒2A肽序列隔开的eGFP继之以BDNF的编码)。
QTA021P(含有mBDNF-病毒2A肽-eGFP的密码子优化的序列的质粒)的编码序列在此处称作SEQ ID No:104，如下：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No:104]
QTA022P(含有mBDNF-非功能性病毒2A肽-eGFP的密码子优化的序列的质粒)的编码序列在此处称作SEQ ID No:105，如下：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTCAAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[SEQ ID No:105]
QTA023P(含有eGFP-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的序列的质粒)的编码序列在此处称作SEQ ID No:106，如下：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[SEQ ID No:106]
参考图14A，示出了在用QTA020V载体转染之后48小时HEK293细胞匀浆的西方墨点。其显示包括由病毒2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的大前体编码区的有效加工。两个TrkB和mBDNF免疫反应性转基因在预测的正确分子量大小内。应注意到在TrkB受体区带上方的大前体蛋白的染色的缺乏，指示在五个重复中的前体蛋白的几乎完全或完全加工。图14B和14C显示，在病毒2A肽分裂之后产生的转基因蛋白已经输送至加工之后HEK293细胞中的正确细胞内区室(TrkB受体输送至细胞表面并且BDNF在释放前输送至储存囊泡)。
图15显示，隔开TrkB受体和BDNF的两个编码区的病毒2A肽序列的添加使得在玻璃体内注射rAAV2载体QTA020V之后在小鼠视网膜中有效加工成两个转基因。
图16示出了在注射含有由病毒2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的编码的rAAV2载体QTA020V之后如由免疫细胞化学显示的小鼠视网膜神经节细胞层中转基因的表达。标靶视网膜神经节细胞体用抗Brn3A抗体染红色并且细胞核用DAPI复染蓝色以区分视网膜层。
参考图17，显示QTA020V(含有由病毒2A肽序列隔开的TrkB受体和BDNF的编码)经由玻璃体内注射(2μl 9×1012个载体粒子/毫升)的预处理在小鼠中对比用rAAV2-CAG-eGFP载体处理的对照动物在视神经钳夹之后对视网膜神经节细胞存活赋予显著的神经保护功效。由QTA020V载体提供的神经保护的水平也高于由仅表达BDNF的载体所提供的。使所有三组动物经受视神经钳夹程序并且在损伤之后7天测量视网膜神经节细胞的数目。视网膜神经节细胞在对照(黑条)中对比经受假钳夹的动物(数据未示出)减少71％。
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Figure BDA0001640521230000563
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序列表
<110> Quethera Limited
<120> 基因构建体
<130> 77097PCT1
<160> 108
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 469
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 启动子
<223> 人突触蛋白I (SYN I)启动子
<400> 1
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcag 469
<210> 2
<211> 1733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 启动子
<223> 其为包含以下的CAG启动子：
(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，
(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，
<400> 2
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttg 1733
<210> 3
<211> 664
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 启动子
<223> 截短的CAG核苷酸启动子序列
<400> 3
ctagatctga attcggtacc ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 60
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 120
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 180
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt 240
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 300
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 360
cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc 420
catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc 480
agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 540
gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 600
gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 660
ggcg 664
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子C端的肽序列
<400> 4
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子核苷酸序列的第一个实施方案
<400> 5
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aaggctggag acgtggagga gaaccctgga 60
cct 63
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子肽序列的第一个实施方案
<400> 6
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Gln Ala Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子核苷酸序列的第二个实施方案
<400> 7
agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 60
cct 63
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子肽序列的第二个实施方案
<400> 8
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 822
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Ser Ser Trp Ile Arg Trp His Gly Pro Ala Met Ala Arg Leu Trp
1 5 10 15
Gly Phe Cys Trp Leu Val Val Gly Phe Trp Arg Ala Ala Phe Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
100 105 110
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
145 150 155 160
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
165 170 175
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
195 200 205
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
225 230 235 240
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
245 250 255
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
260 265 270
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
290 295 300
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
305 310 315 320
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
325 330 335
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
340 345 350
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
355 360 365
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
370 375 380
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
405 410 415
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His Leu Ser
420 425 430
Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe Cys Leu Leu
435 440 445
Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met
450 455 460
Lys Gly Pro Ala Ser Val Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro
465 470 475 480
Leu His His Ile Ser Asn Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly
485 490 495
Gly Pro Asp Ala Val Ile Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu
500 505 510
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gcacgcaagg acttccaccg tgaggccgag ctcctgacca acctccagca tgagcacatc 1800
gtcaagttct atggcgtctg cgtggagggc gaccccctca tcatggtctt tgagtacatg 1860
aagcatgggg acctcaacaa gttcctcagg gcacacggcc ctgatgccgt gctgatggct 1920
gagggcaacc cgcccacgga actgacgcag tcgcagatgc tgcatatagc ccagcagatc 1980
gccgcgggca tggtctacct ggcgtcccag cacttcgtgc accgcgattt ggccaccagg 2040
aactgcctgg tcggggagaa cttgctggtg aaaatcgggg actttgggat gtcccgggac 2100
gtggaaagca ctgacgaaga aagggtcggt ggccacacaa tgctgcccat tcgctggatg 2160
cctccagaga gcatcatgta caggaaattc acgacggaaa gcgacgtctg gagcctgggg 2220
gtcgtgttgt gggagatttt cacctatggc aaacagccct ggtaccagct gtcaaacaat 2280
gaggtgatag agtgtatcac tcagggccga gtcctgcagc gaccccgcac gtgcccccag 2340
gaggtgtatg agctgatgct ggggtgctgg cagcgagagc cccacatgag gaagaacatc 2400
aagggcatcc ataccctcct tcagaacttg gccaaggcat ctccggtcga actggacatt 2460
ctaggc 2466
<210> 15
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 16
<211> 690
<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc aggtgtgcgg 60
acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg cttgacatca 120
ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca gaaagttcgg 180
cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat gctcagtagt 240
caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa ttacctagat 300
gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg aggggagctg 360
agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac tgcagtggac 420
atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag 480
caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg ctgcaggggc 540
atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt gcgggccctt 600
accatggata gcaaaaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac ttcttgtgta 660
tgtacattga ccattaaaag gggaagatag 690
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Met
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115
<210> 19
<211> 744
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatactttg gttgcatgaa ggctgccccc 60
atgaaagaag caaacatccg aggacaaggt ggcttggcct acccaggtgt gcggacccat 120
gggactctgg agagcgtgaa tgggcccaag gcaggttcaa gaggcttgac atcattggct 180
gacactttcg aacacgtgat agaagagctg ttggatgagg accagaaagt tcggcccaat 240
gaagaaaaca ataaggacgc agacttgtac acgtccaggg tgatgctcag tagtcaagtg 300
cctttggagc ctcctcttct ctttctgctg gaggaataca aaaattacct agatgctgca 360
aacatgtcca tgagggtccg gcgccactct gaccctgccc gccgagggga gctgagcgtg 420
tgtgacagta ttagtgagtg ggtaacggcg gcagacaaaa agactgcagt ggacatgtcg 480
ggcgggacgg tcacagtcct tgaaaaggtc cctgtatcaa aaggccaact gaagcaatac 540
ttctacgaga ccaagtgcaa tcccatgggt tacacaaaag aaggctgcag gggcatagac 600
aaaaggcatt ggaactccca gtgccgaact acccagtcgt acgtgcgggc ccttaccatg 660
gatagcaaaa agagaattgg ctggcgattc ataaggatag acacttcttg tgtatgtaca 720
ttgaccatta aaaggggaag atag 744
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 21
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys
1 5 10 15
Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys
20 25 30
Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Cys Gly
50
<210> 22
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型2的氨基酸序列
<400> 22
Met Phe His Gln Val Arg Arg Val Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met
1 5 10 15
Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
20 25
<210> 23
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型2的核酸序列
<400> 23
atgttccacc aggtgagaag agtgatgacc atccttttcc ttactatggt tatttcatac 60
ttcggttgca tgaaggcg 78
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型3和6的氨基酸序列
<400> 24
Met Gln Ser Arg Glu Glu Glu Trp Phe His Gln Val Arg Arg Val Met
1 5 10 15
Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys
20 25 30
Ala
<210> 25
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型3和6的核酸序列
<400> 25
atgcagagcc gggaagagga atggttccac caggtgagaa gagtgatgac catccttttc 60
cttactatgg ttatttcata cttcggttgc atgaaggcg 99
<210> 26
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型5的氨基酸序列
<400> 26
Met Leu Cys Ala Ile Ser Leu Cys Ala Arg Val Arg Lys Leu Arg Ser
1 5 10 15
Ala Gly Arg Cys Gly Lys Phe His Gln Val Arg Arg Val Met Thr Ile
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
35 40 45
<210> 27
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型5的核酸序列
<400> 27
atgctctgtg cgatttcatt gtgtgctcgc gttcgcaagc tccgtagtgc aggaaggtgc 60
gggaagttcc accaggtgag aagagtgatg accatccttt tccttactat ggttatttca 120
tacttcggtt gcatgaaggc g 141
<210> 28
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型4的氨基酸序列
<400> 28
Met Cys Gly Ala Thr Ser Phe Leu His Glu Cys Thr Arg Leu Ile Leu
1 5 10 15
Val Thr Thr Gln Asn Ala Glu Phe Leu Gln Lys Gly Leu Gln Val His
20 25 30
Thr Cys Phe Gly Val Tyr Pro His Ala Ser Val Trp His Asp Cys Ala
35 40 45
Ser Gln Lys Lys Gly Cys Ala Val Tyr Leu His Val Ser Val Glu Phe
50 55 60
Asn Lys Leu Ile Pro Glu Asn Gly Phe Ile Lys Phe His Gln Val Arg
65 70 75 80
Arg Val Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
85 90 95
Cys Met Lys Ala
100
<210> 29
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 扩展信号肽的同种型4的核酸序列
<400> 29
atgtgtggag ccaccagttt tctccatgag tgcacaaggt taatccttgt tactactcag 60
aatgctgagt ttctacagaa agggttgcag gtccacacat gttttggcgt ctacccacac 120
gcttctgtat ggcatgactg tgcatcccag aagaagggct gtgctgtgta cctccacgtt 180
tcagtggaat ttaacaaact gatccctgaa aatggtttca taaagttcca ccaggtgaga 240
agagtgatga ccatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 300
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA003P (IL-2信号)
<400> 30
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA003P (IL-2信号)
<400> 31
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA004P
<400> 32
Met Lys Arg Arg Val Met Ile Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Cys Met Lys
20
<210> 33
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA004P
<400> 33
atgaaaagaa gagtgatgat catccttttc cttactatgg ttatttcata cttcggttgc 60
atgaagagcg 70
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA009P (修饰的IL-2)
<400> 34
Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA009P (修饰的IL-2)
<400> 35
atgaggagga tgcaactcct gctcctgatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA010P
<400> 36
Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Cys Met Lys Ala
20
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA010P
<400> 37
atgaggagga tgcaactcct gctcctgact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 60
gcg 63
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA0012P
<400> 38
Met Arg Ile Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA0012P
<400> 39
atgagaatcc ttcttcttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA0013P
<400> 40
Met Arg Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys
1 5 10 15
Met Lys Ala
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA0013P
<400> 41
atgagaagaa tccttttcct tactatggtt atttcatact tcggttgcat gaaggcg 57
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA0014P
<400> 42
Met Arg Arg Phe Leu Phe Leu Leu Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA0014P
<400> 43
atgaggaggt tccttttcct tcttgttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的氨基酸序列：QTA0015P
<400> 44
Met Arg Arg Phe Leu Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 信号肽
<223> 激动剂的信号肽的核酸序列：QTA0015P
<400> 45
atgaggaggt tccttttcct tctttacttc ggttgcatga aggcg 45
<210> 46
<211> 130
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 左ITR的DNA序列
<400> 46
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 47
<211> 141
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 右ITR的DNA序列
<400> 47
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 48
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 启动子
<223> 截短的CAG核苷酸启动子序列
<400> 48
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120
aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 360
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 420
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 480
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 540
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 584
<210> 49
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu
35 40 45
Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala
50 55 60
Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg
65 70 75 80
Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val
85 90 95
Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
100 105 110
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
130 135 140
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
145 150 155 160
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
165 170 175
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
180 185 190
Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly
195 200 205
Arg Ala
210
<210> 50
<211> 630
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60
ccaattgagt cccaaccccc accctcaaca ttgccccctt ttctggcccc tgagtgggac 120
cttctctccc cccgagtagt cctgtctagg ggtgcccctg ctgggccccc tctgctcttc 180
ctgctggagg ctggggcctt tcgggagtca gcaggtgccc cggccaaccg cagccggcgt 240
ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 300
agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 360
ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 420
tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 480
gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 540
accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 600
tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc 630
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser
20
<210> 52
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
atgctccctc tcccctcatg ctccctcccc atcctcctcc ttttcctcct ccccagtgtg 60
ccaattgagt cc 72
<210> 53
<211> 56
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp
1 5 10 15
Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro
20 25 30
Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly
35 40 45
Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg
50 55
<210> 54
<211> 168
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
caacccccac cctcaacatt gccccctttt ctggcccctg agtgggacct tctctccccc 60
cgagtagtcc tgtctagggg tgcccctgct gggccccctc tgctcttcct gctggaggct 120
ggggcctttc gggagtcagc aggtgccccg gccaaccgca gccggcgt 168
<210> 55
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val
1 5 10 15
Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
50 55 60
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
65 70 75 80
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
85 90 95
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
100 105 110
Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly
115 120 125
Arg Ala
130
<210> 56
<211> 390
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
ggggtgagcg aaactgcacc agcgagtcgt cggggtgagc tggctgtgtg cgatgcagtc 60
agtggctggg tgacagaccg ccggaccgct gtggacttgc gtgggcgcga ggtggaggtg 120
ttgggcgagg tgcctgcagc tggcggcagt cccctccgcc agtacttctt tgaaacccgc 180
tgcaaggctg ataacgctga ggaaggtggc ccgggggcag gtggaggggg ctgccgggga 240
gtggacagga ggcactgggt atctgagtgc aaggccaagc agtcctatgt gcgggcattg 300
accgctgatg cccagggccg tgtgggctgg cgatggattc gaattgacac tgcctgcgtc 360
tgcacactcc tcagccggac tggccgggcc 390
<210> 57
<211> 592
<212> DNA
<213> 土拨鼠
<400> 57
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592
<210> 58
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 增强子
<223> 截短的WHPE核苷酸序列。β元件已经缺失。
<400> 58
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240
gtggtgt 247
<210> 59
<211> 224
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 59
agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 60
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 120
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 180
gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggta 224
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 61
<211> 54
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
atgaccatcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“R”置换。
<400> 62
Met Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 63
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aga”置换。
<400> 63
atgagaatcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“RR”置换。
<400> 64
Met Arg Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys
1 5 10 15
Met Lys Ala
<210> 65
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“agaaga”置换。
<400> 65
atgagaagaa tccttttcct tactatggtt atttcatact tcggttgcat gaaggcg 57
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“RRR”置换。
<400> 66
Met Arg Arg Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“agaagaaga”置换。
<400> 67
atgagaagaa gaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60第一个“T”已经被“K”置换。
<400> 68
Met Lys Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 69
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aaa”置换。
<400> 69
atgaaaatcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“KK”置换。
<400> 70
Met Lys Lys Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys
1 5 10 15
Met Lys Ala
<210> 71
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aaaaka”置换。
<400> 71
atgaaaakaa tccttttcct tactatggtt atttcatact tcggttgcat gaaggcg 57
<210> 72
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“KKK”置换。
<400> 72
Met Lys Lys Lys Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 73
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aaaaaaaaa”置换。
<400> 73
atgaaaaaaa aaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“KRR”置换。
<400> 74
Met Lys Arg Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 75
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aaaagaaga”置换。
<400> 75
atgaaaagaa gaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“RKR”置换。
<400> 76
Met Arg Lys Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61 的“acc”已经被“agaaaaaga”置换。
<400> 77
atgagaaaaa gaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“RRK”置换。
<400> 78
Met Arg Arg Lys Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 79
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“agaagaaaa”置换。
<400> 79
atgagaagaa aaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的第一个“T”已经被“KKR”置换。
<400> 80
Met Lys Lys Arg Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Cys Met Lys Ala
20
<210> 81
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“acc”已经被“aaaaaaaga”置换。
<400> 81
atgaaaaaaa gaatcctttt ccttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 60
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FLFL”置换。
<400> 82
Met Thr Phe Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 83
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttccttttcctt”置换。
<400> 83
atgaccttcc ttttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FFFL”置换。
<400> 84
Met Thr Phe Phe Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 85
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcttcttcctt”置换。
<400> 85
atgaccttct tcttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FIFL”置换。
<400> 86
Met Thr Phe Ile Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 87
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcatcttcctt”置换。
<400> 87
atgaccttca tcttccttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FIFI”置换。
<400> 88
Met Thr Phe Ile Phe Ile Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 89
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcatcttcatc”置换。
<400> 89
atgaccttca tcttcatcac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FVFI”置换。
<400> 90
Met Thr Phe Val Phe Ile Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 91
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcgttttcatc”置换。
<400> 91
atgaccttcg ttttcatcac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 92
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FVFV”置换。
<400> 92
Met Thr Phe Val Phe Val Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 93
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcgttttcgtt”置换。
<400> 93
atgaccttcg ttttcgttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FLFV”置换。
<400> 94
Met Thr Phe Leu Phe Val Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 95
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttccttttcgtt”置换。
<400> 95
atgaccttcc ttttcgttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 96
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FIFV”置换。
<400> 96
Met Thr Phe Ile Phe Val Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 97
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcatcttcgtt”置换。
<400> 97
atgaccttca tcttcgttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FFFI”置换。
<400> 98
Met Thr Phe Phe Phe Ile Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 99
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcttcttcatc”置换。
<400> 99
atgaccttct tcttcatcac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FFFV”置换。
<400> 100
Met Thr Phe Phe Phe Val Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala
<210> 101
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcatccttttcctt”置换。
<400> 101
atgaccttct tcttcgttac tatggttatt tcatacttcg gttgcatgaa ggcg 54
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 60相同的序列，但SEQ ID No. 60的“ILFL”序列已经被“FILFL”置换。
<400> 102
Met Thr Phe Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys
1 5 10 15
Met Lys Ala
<210> 103
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸序列：与SEQ ID No. 61相同的序列，但SEQ ID No. 61的“atccttttcctt”序列已经被“ttcttcttcgtt”置换。
<400> 103
atgaccttca tccttttcct tactatggtt atttcatact tcggttgcat gaaggcg 57
<210> 104
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QTA021P的核酸序列，其为含有mBDNF-病毒2A肽-eGFP的密码子优化的序列的质粒。
<400> 104
atgactatcc tgtttctgac aatggttatt agctatttcg gttgcatgaa ggctcacagt 60
gatcccgcac gccgcggaga acttagcgtg tgcgacagca tcagcgagtg ggtcaccgcc 120
gccgataaga agaccgctgt ggatatgtcc ggcgggaccg tcactgtact cgaaaaagtt 180
ccagtgagca aaggccaact gaaacaatat ttctatgaaa ctaagtgcaa ccccatgggg 240
tacaccaagg agggctgccg gggaatcgac aagagacact ggaattccca gtgccggacc 300
actcagagct acgtccgcgc cttgacgatg gattcaaaga agcgcatcgg atggcggttc 360
ataagaatcg acaccagttg tgtgtgcacg ctgacgataa aacgggggcg ggcccccgtg 420
aagcagaccc tgaactttga tttgctcaag ttggcggggg atgtggaaag caatcccggg 480
ccaatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggcgttg tgccaatact ggttgagttg 540
gatggcgatg tcaacggaca caaatttagc gtaagcgggg agggagaggg cgacgccaca 600
tatggcaagc tgaccctgaa gttcatttgc acgaccggca aattgcccgt cccttggccc 660
acacttgtga cgaccctgac ttatggcgta cagtgcttca gcaggtaccc tgatcatatg 720
aagcaacacg acttctttaa gagtgccatg ccagagggat acgtccagga aagaaccata 780
ttcttcaaag atgatggaaa ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840
ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900
cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960
aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020
gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080
cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140
gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200
taa 1203
<210> 105
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QTA022P的核酸序列，其为含有mBDNF-非功能性病毒2A肽-eGFP的密码子优化的序列的质粒。
<400> 105
atgactatcc tgtttctgac aatggttatt agctatttcg gttgcatgaa ggctcacagt 60
gatcccgcac gccgcggaga acttagcgtg tgcgacagca tcagcgagtg ggtcaccgcc 120
gccgataaga agaccgctgt ggatatgtcc ggcgggaccg tcactgtact cgaaaaagtt 180
ccagtgagca aaggccaact gaaacaatat ttctatgaaa ctaagtgcaa ccccatgggg 240
tacaccaagg agggctgccg gggaatcgac aagagacact ggaattccca gtgccggacc 300
actcagagct acgtccgcgc cttgacgatg gattcaaaga agcgcatcgg atggcggttc 360
ataagaatcg acaccagttg tgtgtgcacg ctgacgataa aacgggggcg ggcccctgtc 420
aaacaaaccc tcaattttga cttgctgaag cttgctgggg atgtcgagtc cgctgccgcg 480
gctatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggcgttg tgccaatact ggttgagttg 540
gatggcgatg tcaacggaca caaatttagc gtaagcgggg agggagaggg cgacgccaca 600
tatggcaagc tgaccctgaa gttcatttgc acgaccggca aattgcccgt cccttggccc 660
acacttgtga cgaccctgac ttatggcgta cagtgcttca gcaggtaccc tgatcatatg 720
aagcaacacg acttctttaa gagtgccatg ccagagggat acgtccagga aagaaccata 780
ttcttcaaag atgatggaaa ttacaaaacc cgggcagagg tcaagtttga aggcgacacc 840
ctggtgaaca ggatcgaact caaaggcatc gatttcaaag aggacggaaa catcctcgga 900
cacaaactgg aatacaatta caacagccac aacgtctaca tcatggcaga taaacaaaag 960
aacggtatta aagtgaactt caagatccgg cacaacatcg aagacggctc cgtccagctt 1020
gccgaccact accagcaaaa taccccgatc ggcgacggcc ccgttctcct ccccgataat 1080
cactacctga gtacacagtc agccttgagc aaagacccta atgaaaagcg ggaccacatg 1140
gttttgctgg agttcgttac cgcagcgggt attacgctgg gtatggacga gctttacaag 1200
taa 1203
<210> 106
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QTA023P的核酸序列，其为含有eGFP-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的序列的质粒。
<400> 106
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaag gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggct 720
cccgttaaac aaactctgaa cttcgacctg ctgaagctgg ctggagacgt ggagtccaac 780
cctggaccta tgaccatcct tttccttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 840
gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 900
gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 960
gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 1020
cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 1080
tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 1140
tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 1200
tag 1203
<210> 107
<211> 2940
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒QTA020P (和载体QTA020V)内所含的鼠类TrkB受体-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的2940 bp序列的核酸编码序列
<400> 107
atgagcccat ggctgaagtg gcacggacca gcaatggcaa gactgtgggg cctgtgcctg 60
ctggtgctgg gcttctggag agccagcctg gcctgtccaa cctcctgcaa gtgtagctcc 120
gccaggatct ggtgcacaga gccttctcca ggcatcgtgg cctttccccg cctggagcct 180
aacagcgtgg atcccgagaa tatcaccgag atcctgatcg ccaaccagaa gcggctggag 240
atcatcaatg aggacgatgt ggaggcctac gtgggcctga gaaacctgac aatcgtggac 300
tccggcctga agttcgtggc ctataaggcc tttctgaaga actctaatct gaggcacatc 360
aacttcaccc gcaataagct gacatctctg agccggagac actttcggca cctggatctg 420
tccgacctga tcctgaccgg caatccattc acatgctctt gtgacatcat gtggctgaag 480
accctgcagg agacaaagtc tagccccgat acccaggacc tgtactgtct gaacgagtcc 540
tctaagaata tgcctctggc caacctgcag atccctaatt gtggactgcc aagcgcccgg 600
ctggccgcac ctaacctgac agtggaggag ggcaagtccg tgacactgtc ctgttctgtg 660
ggcggcgatc ccctgcctac cctgtattgg gacgtgggca acctggtgtc taagcacatg 720
aatgagacct cccacacaca gggctctctg agaatcacaa atatcagctc cgacgatagc 780
ggcaagcaga tctcttgcgt ggcagagaac ctggtgggag aggatcagga cagcgtgaat 840
ctgaccgtgc acttcgcccc caccatcaca tttctggagt ctcctaccag cgatcaccac 900
tggtgcatcc ccttcacagt gcggggaaac ccaaagcccg ccctgcagtg gttttacaac 960
ggcgccatcc tgaatgagtc caagtatatc tgtaccaaga tccacgtgac caaccacaca 1020
gagtaccacg gctgcctgca gctggataat cccacccaca tgaacaatgg cgactacaca 1080
ctgatggcca agaacgagta tggcaaggac gagaggcaga tcagcgccca cttcatgggc 1140
cgccctggag tggattatga gaccaaccct aattacccag aggtgctgta tgaggactgg 1200
accacaccta ccgatatcgg cgacaccaca aacaagtcta atgagatccc aagcacagat 1260
gtggccgacc agtctaacag ggagcacctg agcgtgtacg cagtggtggt catcgcctcc 1320
gtggtgggct tctgcctgct ggtcatgctg ctgctgctga agctggcccg ccactctaag 1380
tttggcatga agggcccagc ctccgtgatc tctaatgacg atgacagcgc cagccccctg 1440
caccacatca gcaacggctc caatacccct tctagctccg agggcggccc agatgccgtg 1500
atcatcggca tgacaaagat ccccgtgatc gagaaccctc agtacttcgg catcaccaat 1560
tcccagctga agcctgacac atttgtgcag cacatcaagc ggcacaacat cgtgctgaag 1620
agggaactgg gagagggagc cttcggcaag gtgtttctgg ccgagtgcta taacctgtgc 1680
ccagagcagg ataagatcct ggtggccgtg aagaccctga aggatgccag cgacaacgcc 1740
cggaaggact tccacagaga ggccgagctg ctgacaaatc tgcagcacga gcacatcgtg 1800
aagttttacg gcgtgtgcgt ggagggcgac cctctgatca tggtgttcga gtatatgaag 1860
cacggcgatc tgaacaagtt tctgagagca cacggaccag atgccgtgct gatggcagag 1920
ggaaatcccc ctaccgagct gacacagtct cagatgctgc acattgcaca gcagattgca 1980
gcaggaatgg tgtacctggc cagccagcac ttcgtgcaca gggatctggc aaccagaaac 2040
tgcctggtgg gagagaatct gctggtgaag atcggcgact ttggcatgtc ccgggacgtg 2100
tactctaccg actactatag agtgggcggc cacacaatgc tgcccatcag gtggatgcca 2160
cccgagagca tcatgtatcg caagttcacc acagagtctg acgtgtggag cctgggcgtg 2220
gtgctgtggg agatctttac ctacggcaag cagccttggt atcagctgtc caacaatgaa 2280
gtgatcgagt gtattacaca gggacgcgtg ctgcagaggc cacgcacatg cccccaggag 2340
gtgtacgagc tgatgctggg ctgttggcag cgggagccac acaccagaaa gaacatcaag 2400
agcatccaca cactgctgca gaatctggcc aaggcctccc ccgtgtatct ggacatcctg 2460
ggcagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 2520
ggacctatga gaatccttct tcttactatg gttatttcat acttcggttg catgaaggcg 2580
cactccgacc ctgcccgccg tggggagctg agcgtgtgtg acagtattag cgagtgggtc 2640
acagcggcag ataaaaagac tgcagtggac atgtctggcg ggacggtcac agtcctagag 2700
aaagtcccgg tatccaaagg ccaactgaag cagtatttct acgagaccaa gtgtaatccc 2760
atgggttaca ccaaggaagg ctgcaggggc atagacaaaa ggcactggaa ctcgcaatgc 2820
cgaactaccc aatcgtatgt tcgggccctt actatggata gcaaaaagag aattggctgg 2880
cgattcataa ggatagacac ttcctgtgta tgtacactga ccattaaaag gggaagatag 2940
<210> 108
<211> 2943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒QTA029P (和载体QTA029V)内所含的人类TrkB受体-病毒2A肽-mBDNF的密码子优化的2943 bp序列的核酸编码序列
<400> 108
atgtcatctt ggatccgctg gcacgggcca gcgatggccc gattgtgggg cttctgctgg 60
cttgttgtag gcttctggcg cgcggcgttc gcgtgtccga cctcttgcaa atgctcagca 120
agccgaattt ggtgctcaga ccctagtcca ggaattgttg cattcccccg actggaacca 180
aactccgtcg acccggagaa tataactgag atatttattg caaatcaaaa acgccttgaa 240
atcattaacg aggatgacgt ggaggcctac gttggtttga gaaatcttac tattgtcgac 300
tccggactta aatttgtagc tcataaagcc ttcctgaaga actctaatct gcagcacatt 360
aatttcacga gaaataagct gaccagcttg tcccggaagc atttccgcca tctcgacctg 420
agcgagctca tactggtcgg aaacccattt acgtgctcct gtgacatcat gtggatcaaa 480
actctgcaag aggcgaaaag tagtccggat acccaagacc tttactgtct taatgaaagc 540
tcaaaaaata tcccgctggc caacctgcag ataccgaact gcggacttcc tagtgcgaat 600
ttggctgccc caaatcttac cgtcgaagaa ggcaaatcaa tcacgctttc ttgttctgta 660
gctggagatc cagtgcctaa tatgtattgg gacgtgggta acctcgtctc aaaacatatg 720
aacgaaacga gccacaccca gggctctttg cggataacaa acatctcctc tgatgattct 780
ggaaagcaaa tcagttgcgt agctgaaaat ctggttggcg aagatcaaga ttcagtcaat 840
ctgacagtcc atttcgcccc aacgatcacc tttctggaga gcccaactag cgatcaccac 900
tggtgtattc cgtttacggt aaaaggaaat ccaaaacctg cactccaatg gttttataat 960
ggagccatct tgaatgaaag caaatatatc tgtactaaaa tccatgtgac gaatcacacc 1020
gagtatcacg ggtgtcttca attggataat ccaacccata tgaataatgg tgattatact 1080
ttgatagcga agaacgaata cggcaaagac gaaaagcaaa tatccgcaca tttcatgggt 1140
tggcctggca tcgacgacgg tgcgaacccg aactacccag atgttattta cgaggattat 1200
gggactgcgg caaacgacat tggcgacacc acaaaccgaa gcaacgagat accaagtact 1260
gacgtcactg acaaaacggg tcgagagcat ttgtctgttt acgccgttgt tgttatcgcc 1320
tcagttgtcg gattttgcct gttggtcatg cttttcctcc tgaagctcgc gcgacattcc 1380
aagtttggca tgaaggggcc agcaagtgtt atatccaatg atgatgatag cgcttctcca 1440
ttgcaccaca taagtaacgg ctcaaacacg ccgtcatcta gtgaaggtgg accagacgcg 1500
gtcattatag ggatgactaa aattcccgta atcgaaaacc ctcagtactt cggcataacc 1560
aacagtcagc ttaaacccga tactttcgtg cagcacatca aaaggcacaa catagtcctc 1620
aagcgcgaac tcggggaggg agccttcgga aaggtctttc ttgctgagtg ctataatttg 1680
tgtcctgagc aggataaaat tcttgtggct gtaaaaactc tcaaagatgc ttccgacaac 1740
gcacggaagg attttcatcg ggaggccgaa ctgttgacga atttgcagca cgagcatata 1800
gtaaagttct acggggtatg tgttgagggg gacccgttga ttatggtctt cgagtatatg 1860
aagcacgggg acctgaacaa atttttgcgc gcccatgggc ctgatgccgt ccttatggca 1920
gaagggaacc ctccaacaga actcacccag agtcagatgt tgcacatagc gcaacagatc 1980
gcggccggca tggtttacct ggccagtcaa cacttcgtgc atagagatct tgccactcgc 2040
aactgtttgg tcggggagaa ccttctggtt aagattggtg actttggtat gtcacgagat 2100
gtgtattcca ctgactatta cagagttggg ggtcatacaa tgcttcctat tcggtggatg 2160
ccccccgaat ccatcatgta cagaaagttc acgacagaga gtgatgtttg gagtctcggc 2220
gtggtgctct gggaaatttt cacatacgga aagcagccgt ggtatcaact tagcaacaat 2280
gaggtgatag agtgtattac acagggtcgg gtgttgcagc gccctcgaac gtgcccacaa 2340
gaagtatatg aacttatgct cgggtgctgg caaagagaac cacatatgag aaaaaatatc 2400
aaggggatac atacattgct tcagaacttg gccaaggcat cacccgtcta cctcgatata 2460
ctgggcagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 2520
cctggaccta tgagaatcct tcttcttact atggttattt catacttcgg ttgcatgaag 2580
gcgcactccg accctgcccg ccgtggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagcgagtgg 2640
gtcacagcgg cagataaaaa gactgcagtg gacatgtctg gcgggacggt cacagtccta 2700
gagaaagtcc cggtatccaa aggccaactg aagcagtatt tctacgagac caagtgtaat 2760
cccatgggtt acaccaagga aggctgcagg ggcatagaca aaaggcactg gaactcgcaa 2820
tgccgaacta cccaatcgta tgttcgggcc cttactatgg atagcaaaaa gagaattggc 2880
tggcgattca taaggataga cacttcctgt gtatgtacac tgaccattaa aaggggaaga 2940
tag 2943

Claims (49)

1.一种包含基因构建体的重组载体，所述基因构建体包含可操作地连接至编码酪氨酸激酶受体B(TrkB)的第一编码序列和编码所述TrkB受体的激动剂的第二编码序列的启动子，其中所述激动剂是成熟BDNF或成熟NT-4，其中所述第二编码序列包含编码增进所述TrkB受体的所述激动剂的分泌的信号肽的核苷酸序列，并且其中所述基因构建体包含安置于所述第一与第二编码序列之间的间隔子序列，所述间隔子序列编码经过构造以被消化，从而产生所述TrkB受体和激动剂作为独立的分子的肽间隔子。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述基因构建体包含编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WHPE)的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其中所述WHPE包含如SEQ ID No:57或58所列出的核酸序列，或与SEQ ID No:57或58具有至少99％序列一致性的片段或变体。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述构建体包含编码多聚A尾巴的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其中所述多聚A尾巴包含如SEQ ID No:59所列出的核酸序列，或与SEQ ID No:59具有至少99％序列一致性的片段或变体。
6.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述启动子是人突触蛋白I(SYNI)启动子。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其中所述启动子包含如SEQ ID No:1所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:1具有至少99％序列一致性的片段或变体。
8.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述启动子是CAG启动子。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述启动子包含如SEQ ID No:2、3或48所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:2、3或48具有至少99％序列一致性的片段或变体。
10.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述间隔子序列包含并编码病毒肽间隔子序列。
11.根据权利要求4所述的重组载体，其中所述间隔子序列包含并编码病毒2A肽间隔子序列。
12.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述肽间隔子序列包含如SEQ ID NO.4所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少99％序列一致性的片段或变体。
13.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述间隔子序列包含如SEQ ID NO.5所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少99％序列一致性的片段或变体。
14.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述肽间隔子序列包含如SEQ ID NO.6所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少99％序列一致性的片段或变体。
15.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述间隔子序列包含如SEQ ID NO.7所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少99％序列一致性的片段或变体。
16.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述肽间隔子序列包含如SEQ ID NO.8所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8具有至少99％序列一致性的片段或变体。
17.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含编码TrkB的人规范同种型的核苷酸序列，其中TrkB的所述规范同种型包含如SEQ ID NO.9所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9具有至少99％序列一致性的片段或变体。
18.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含如SEQ ID NO.10所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:10具有至少99％序列一致性的片段或变体。
19.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含编码TrkB的同种型4的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的重组载体，其中TrkB的同种型4包含如SEQ ID NO.11所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少99％序列一致性的片段或变体。
21.根据权利要求19所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含如SEQ ID NO.12所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:12具有至少99％序列一致性的片段或变体。
22.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含根据SEQ ID No:9的核苷酸序列，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的一个或多个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
23.根据权利要求22所述的重组载体，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少两个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
24.根据权利要求22所述的重组载体，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少三个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
25.根据权利要求22所述的重组载体，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的至少四个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
26.根据权利要求23所述的重组载体，其中在SEQ ID No:9的位置516、701、705、706和/或816处的所有五个酪氨酸残基被修饰成谷氨酸。
27.根据权利要求22所述的重组载体，其中所述TrkB受体的所述修饰形式包含如SEQID NO.13所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少99％序列一致性的片段或变体。
28.根据权利要求27所述的重组载体，其中所述第一编码序列包含如SEQ ID NO.14所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:14具有至少99％序列一致性的片段或变体。
29.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列编码神经营养素-4(NT-4)，所述神经营养素-4包含如SEQ ID NO:49或55所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:49或55具有至少99％序列一致性的片段或变体；和/或所述第二编码序列包含如SEQ ID No:50或56所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:50或56具有至少99％序列一致性的片段或变体。
30.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含编码成熟BDNF的核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的重组载体，其中成熟BDNF包含如SEQ ID NO.18所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID No:18具有至少99％序列一致性的片段或变体。
32.根据权利要求31所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含如SEQ ID No.19所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:19具有至少99％序列一致性的片段或变体。
33.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含编码所述TrkB受体的所述激动剂的信号肽。
34.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含编码BDNF的信号肽的核苷酸序列。
35.根据权利要求33所述的重组载体，其中所述核苷酸序列编码BDNF的规范信号肽，其中所述第二编码序列包含编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含如SEQ ID NO.20所列出的氨基酸序列，或与SEQ ID No:20具有至少99％序列一致性的片段或变体。
36.根据权利要求33所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含如SEQ ID NO.21所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:21具有至少99％序列一致性的片段或变体。
37.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含编码如SEQ IDNO.23、25、27或29中的任一者所列出的信号序列肽的核苷酸序列，或其中所述信号肽包含如SEQ ID NO.22、24、26或28中的任一者所列出的氨基酸序列。
38.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述第二编码序列包含编码如SEQ IDNO.31、33、35、37、39、41、43、45、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101或103中的任一者所列出的信号序列肽的核苷酸序列；或其中所述信号肽包含如SEQ ID NO.30、32、34、36、38、40、42、44、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100或102中的任一者所列出的氨基酸序列。
39.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述构建体包含如SEQ ID No:107或108所列出的核苷酸序列，或与SEQ ID No:107或108具有至少99％序列一致性的片段或变体。
40.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
41.根据权利要求40所述的重组载体，其中所述rAAV是AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10或AAV-11。
42.根据权利要求41所述的重组载体，其中所述rAAV是rAAV血清型-2。
43.根据权利要求1所述的重组载体在制备药剂或疗法中的用途。
44.根据权利要求1所述的重组载体在制备用于治疗、预防或改善视神经病症或耳蜗病症，或用于促进神经再生和/或存活的药剂中的用途。
45.根据权利要求44所述的载体的用途，其中所治疗的所述视神经病症是导致RGC损失的任何病理生理性病状，或对头部或脸部的创伤或血管损伤，或对接收来自视神经的输入的眼部结构或脑部区域的供血的部分或完全损失，或用于经由将未转化或转化的干细胞引入患者的眼睛或与视力相关联的区域中来支持RGC的置换。
46.根据权利要求45所述的载体的用途，其中所治疗的所述视神经病症是青光眼。
47.根据权利要求44所述的载体的用途，其中所治疗的所述耳蜗病症是听力损失或耳聋。
48.一种医药组合物，其包含根据权利要求1所述的重组载体和医药学上可接受的媒剂。
49.一种制备根据权利要求48所述的医药组合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1所述的重组载体与医药学上可接受的媒剂接触。
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