JP2009005709A

JP2009005709A - ダーマトファゴイデス（家ほこりダニ）からの主要なアレルゲンのｔ細胞エピトープの製造方法

Info

Publication number: JP2009005709A
Application number: JP2008202456A
Authority: JP
Inventors: Richard D Garman; リチヤード・デイ・ガーマン; Julia L Greenstein; ジユリア・エル・グリーンステイン; Mei-Chang Kuo; メイ−チヤング・クオ; Bruce L Rogers; ブルース・エル・ロジヤーズ
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2009-01-15
Also published as: KR940702936A; EP0623168A1; KR100260342B1; HUT71211A; FI941757A0; HU220462B1; IL103452A0; AU676668B2; ES2334179T3; MX9205985A; FI941757L; HU9401108D0; EP0623168B1; NO314586B1; NO941371D0; PT100979A; NZ244772A; ATE444360T1; PT100979B; NO941371L

Abstract

【課題】ダニアレルギーの診断または治療において役立つダニアレルゲンのＴ細胞エピト−プの提供
【解決手段】特定のＴ細胞刺激指数を有するダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）からのペプチドまたは改変ペプチドの製造方法
【選択図】なし

Description

本発明は、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）（家ほこりダニ）からの主要なアレルゲンのＴ細胞エピトープの製造方に関する。

最近の報告は、家ほこりダニ（ｈｏｕｓｅｄｕｓｔｍｉｔｅ）のアレルギーにおいてグループＩ（例えば、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩ）およびグループＩＩ（例えば、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩ）のタンパク質アレルゲンに対する応答の重要性を実証づけた。例えば、患者の６０％を越えるものは、これらのタンパク質に対して向けられた抗ダニ抗体の少なくとも５０％を有することが実証づけられた（例えば、非特許文献１参照）。子供は、グループＩおよびグループＩＩのアレルゲンに対してより大きい程度の反応性を示す可能性がある（非特許文献２参照）。ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属（Ｄ．）のダニに対するアレルギーは、例えば、ぜん息、鼻炎および異所性皮膚炎に随伴する。２つの種、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）は優勢でありそして、その結果、これらの２種により生産されるアレルゲンを同定する試みにおいてかなりの努力が払われてきた。

遺伝子のクローニングにより、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）の両者からの主要なアレルゲンを特性決定するために、共同による努力がなされた。結局、何件かの刊行物は下記のものを包含するいくつかのアレルゲンの完全なヌクレオチド配列を報告した：ＤｅｒｐＩ（非特許文献３および非特許文献４参照）、ＤｅｒｐＩＩ（非特許文献５）、ＤｅｒｆＩ（非特許文献６）、ＤｅｒｆＩＩ（非特許文献７および非特許文献８）および低分子量のアレルゲン（非特許文献９）。

ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩをコードするｃＤＮＡの発表されたヌクレオチド配列は、これらの２つのタンパク質がアミノ酸レベル（８１％の同一性）において高度に相同性であり、そして成熟タンパク質の生産物は、それぞれ、２２２および２２３残基から構成されていることを実証する（非特許文献１０および非特許文献６参照）。ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩの両者は１２９残基から構成されており、そして、また、アミノ酸配列において高度に相同性（８８％の同一性）である（（非特許文献８および非特許文献７参照）；非特許文献１１参照）。

ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩをコードするｃＤＮＡクローンの単離は、組換え抗原についての研究を可能とした（非特許文献１２および非特許文献１３参照）。ＤｅｒｐＩの相補的ＤＮＡ断片は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発現され、そしてプールしたヒトのダニのアレルギー性ＩｇＥ血清を使用するＩｇＥの結合の研究はこの分子を通じて結合および非結合の領域を実証した（非特許文献１４）。ＤｅｒｐＩのＴ細胞エピトープが報告された（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７および非特許文献１８）。

ｖａｎｄｅｒＺｅｅ，Ｊ．Ｓ．ら，ＪｏｕｒｎａｌＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：８８４−８９６（１９８８）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６４：３０１−３１４（１９８８）Ｔｈｏｍａｓ，Ｗ．Ｒ．ら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５：１２７−１２９（１９８８）Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｙ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１６７：１７５−１８２（１９８８）Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｙ．ら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９１：１１８−１２３（１９９０）Ｄｉｌｗｏｒｔｈ，Ｒ．Ｊ．ら、ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｌｌｅｒｇｙ，２１：２５−３２（１８９１）Ｙｕｕｋｉ，Ｔ．ら、ＪａｐａｎＪｏｕｒｎａｌＡｌｌｅｒｇｙ，３９：５５７−４６１（１９９０）Ｔｒｕｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．ら、ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｌｌｅｒｇｙ，２１：３３−３７（１９９１）Ｏｖｅｙ，Ｅ．Ｒ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７０：１４５７−１４６２（１９８９）Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｙ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１６７：１７５−１８２（１９８８）Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｙ．ら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９１：１１８−１２３（１９９０）Ｇｒｅｅｎ，Ｗ．Ｋ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９２：３０−３８（１９９０）Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｙ．ら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９１：１２４−１２９（１９９０）Ｔｈｏｍａｓ，Ｗ．Ｒ．ら、アトピー性アレルゲンのエピトープ、ユーロピアン・アカデミー・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジーのＸＩＶ会議からのワークショップの会報（ＥｐｉｔｏｐｅｓｏｆＡｔｏｐｉｃＡｌｌｅｒｇｅｎｓ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＷｏｒｋｓｈｏｐｆｒｏｍＸＩＶＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ベルリン、１９８９年９月、ｐｐ７７−８２）Ｏ’Ｈｅｈｉｒ，Ｒ．Ｅ．ら、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：６７−９５（１９９１）Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ａ．ら、アトピー性アレルゲンのエピトープ、ユーロピアン・アカデミー・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジーのＸＩＶ会議からのワークショップの会報（ＥｐｉｔｏｐｅｓｏｆＡｔｏｐｉｃＡｌｌｅｒｇｅｎｓ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＷｏｒｋｓｈｏｐｆｒｏｍＸＩＶＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ベルリン、１９８９年９月、ｐｐ４１−４７Ｙｅｓｓｅｌ，Ｈ．ら、健康および疾患におけるＴ細胞の活性化：免疫性および寛容性の間の区別、会議（ＴｃｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＨｅａｌｔｈａｎｄＴｏｌｅｒａｎｃｅ，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）１９９０年９月２２〜２６日、トリニティ大学、オックスフォード、英国および非特許文献１８：Ｈｅｓｓｅｌ，Ｈ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（３）：７３８−７４５（１９９２年２月１日）

本発明は、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属の主要なタンパク質アレルゲンの単離されたペプチドを提供する。本発明の範囲内のペプチドは、アレルゲンＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、ＤｅｒｆＩ、またはＤｅｒｆＩＩから選択されるタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んでなる。本発明は、さらに、少なくとも２つの領域を含んでなり、各領域がダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドを提供する。この領域はダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属の同一であるか、あるいは異なるタンパク質アレルゲンから誘導される。

本発明は、また、対応する天然に見いだされるアレルゲンまたはその一部分と同様であるか、あるいは増強された治療的性質を有するが、副作用が減少した修飾されたペプチド、ならびに改良された性質、例えば、増加した可溶性および安定性を有する修飾されたペプチドを提供する。本発明のペプチドは、それらを投与した家ほこりダニに対して感受性の個体において、家ほこりダニのアレルゲンまたは家ほこりダニのアレルゲンと免疫学的に交差反応性のアレルゲンに対する個体のアレルギーの応答を変更することができる。個体における家ほこりダニに対する感受性の処置または診断する方法および１または２以上の本発明のペプチドを含んでなる治療用組成物も提供される。

＜発明の詳細な記述＞
本発明は、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属の主要なタンパク質アレルゲンから誘導された単離されたペプチドを提供する。本明細書で使用するとき、ペプチドまたはタンパク質の断片は、タンパク質の全体のアミノ酸配列より少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を意味する。本発明のペプチドは、アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるＤｅｒｐＩ（配列識別番号：１および２）、ＤｅｒｐＩＩ（配列識別番号：３および４）、ＤｅｒｆＩ（配列識別番号：５および６）およびＤｅｒｆＩＩ（配列識別番号：７および８）を包含する。

少なくとも２つの領域を含んでなり、各領域がダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドも本発明の範囲内である。このようなペプチドの各領域は、同一であるか、あるいは異なるダニのアレルゲンのから誘導される。各々がダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んでなる単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの領域は、治療的効果の増加のためにとくに望ましい。本発明のペプチドに免疫学的に関係する（例えば、抗体またはＴ細胞の交差反応性により）ペプチドは、また、本発明の範囲内である。抗体の交差反応性により免疫学的に関係づけられるペプチドは、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンのペプチドに対して特異的である抗体により結合される。Ｔ細胞の交差反応性により免疫学的に関係づけられるペプチドは、本発明のペプチドと同一のＴ細胞と反応することができる。

本発明の単離されたペプチドは、このようなペプチドをコードする配列を有する核酸で形質転換された宿主細胞における組み換えＤＮＡ技術により生産することができる。本発明の単離されたペプチドは、また、化学的合成により生産することができる。ある種の制限された場合において、単離されたペプチドはタンパク質アレルゲンの化学的切断により生産することができる。ペプチドを組換え技術により生産するとき、ペプチドをコードする配列を有する核酸または前記核酸配列の機能的同等体で形質転換された宿主細胞を細胞に適当な培地の中で培養し、そしてペプチドを細胞培地、宿主細胞または両者から、ペプ
チドおよびタンパク質の精製のためにこの分野において知られている技術により、精製することができ、このような技術はイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、あるいはペプチド、ペプチドを誘導したダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲン、またはその一部分に対して特異的な抗体を使用する免疫精製を包含する。本発明の単離されたペプチドは、組み換えＤＮＡ技術により生産するとき、細胞物質または培地を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成したとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。

本発明は、発現ベクターおよび本発明の核酸配列を発現するように形質転換された宿主細胞を提供する。ダニのアレルゲンをコードする核酸配列、またはその少なくとも１つの断片は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母菌、または哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の中で発現することができる。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー、および他の発現コントロール要素は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）の中に見いだすことができる。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサー、および他の発現コントロール要素は当業者に知られている。哺乳動物、酵母菌または昆虫の細胞の中の発現は、組換え物質の部分的または完全なグリコシル化および鎖相互または鎖内のジサルファイド結合の形成に導く。酵母菌の中の発現に適当なベクターは、ＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら（１９７８）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）；ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）；ＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（インビトロゲン・コーポレーション［ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。これらのベクターは自由に入手可能である。バキュロウイルスおよび哺乳動物の発現系は、また、入手可能である。例えば、昆虫細胞の中の発現のためにバキュロウイルス系は商業的に入手可能である（ファーミンゲン［ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ］、カリフォルニア州サンディエゴ）が、哺乳動物細胞の中の発現のためにｐＭＳＧは商業的に入手可能である（ファーマシア［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］、ニュージャージイ州ピスカタェイ）。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中の発現のために適当な発現ベクターは、なかでも、ｐＴＲＣ（Ａｍａｎｎら（１９８８）、Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）；ｐＧＥＸ（ＡｍｒａｄＣｏｒｐ．、オーストラリア国メルボルン）；ｐＭＡＬ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチュセッツ州ベベリイ）；ｐＲＩＴ５（Ｐｈｒｍａｃｉａ、ニュージャージイ州ピスカタェイ）；ｐＥＴ−１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウイスコンシン州メディソン）Ｊａｍｅｅｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３９６３−３９６６；およびｐＳＥＭ（Ｋｎａｐｐら（１９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８：２８０−２８１）を包含する。例えば、ｐＴＲＣおよびｐＥＴ−１１ｄの使用は、未融合のタンパク質の発現に導くであろう。ｐＭＡＬ、ｐＲＩＴ５、ｐＳＥＭおよびｐＧＥＸの使用は、マルトースＥ結合性タンパク質（ｐＭＡＬ）、プロテインＡ（ｐＲＩＴ５）、切頭β−ガラクトシダーゼ（ＰＳＥＭ）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＥＸ）に融合したアレルゲンの発現に導くであろう。ダニのタンパク質アレルゲンまたはそれらの１または２以上の断片を融合タンパク質として発現させるとき、酵素切断部位を担体タンパク質とタンパク質アレルゲンまたはその断片との間の融合接合部に導入することはとくに有利である。次いで、ダニのタンパク質アレルゲンまたはその断片を、酵素的部位における酵素的切断およびタンパク質およびペプチドの精製の普通の技術を使用する生化学的精製により、融合タンパク質から回収することができる。適当な酵素の切断部位は、血液凝固因子Ｘａまたはトロンビンについてのものを包含し、それらについての切断の適当な酵素およびプロトコールは、例えば、シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏｍｐａｎｙ）ミゾリー州セントルイスおよびＮ．Ｅ．バイオラブス（Ｂｉｏｌａｂｓ）マサチュセッツ州ベベリイ、商業的に入手可能である。異なるベクターは、また、異なるプロモーター領域を有し、これらの領域は、例えば、ＩＰＴＧ誘発（ＰＲＴＣ、Ａｍａｎｎら、（１９８８）、前掲；ｐＥＴ−１１ｄ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ウイスコンシン州マディソン）または温度誘発（ｐＲＩＴ５、Ｐｈｒｍａｃｉａ、ニュージャージイ州ピスカタェイ）を使用して構成的または誘発可能な発現を可能とする。

本発明の単離されたペプチドを得るために、実施例ＩＩＩに記載するように、ダニのアレルゲンを所望の長さの非オーバーラッピングペプチドまたは所望の長さのオーバーラッピングペプチドに分割し、これらは組換え的に、合成的に、あるいはある種の制限された場合において、アレルゲンの化学的切断により生産することができる。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドは、Ｔ細胞の応答、例えば、刺激（すなわち、増殖またはリンホカインの分泌）を引き出すことができ、および／またはＴ細胞のアネルギー（すなわち、寛容性）を誘発することができる。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドを決定するために、単離されたペプチドを、例えば、Ｔ細胞の生物学的技術により、試験して、ペプチドがＴ細胞の応答を引き出すか、あるいはＴ細胞のアネルギーを誘発すかどうかを測定する。Ｔ細胞の応答を引き出すか、あるいはＴ細胞のアネルギーを誘発することがわかったペプチドは、Ｔ細胞の刺激活性を有すると定義する。

実施例に記載するように、ダニのアレルゲンに対して感受性の個体（すなわち、ダニのアレルゲンに対するＩｇＥ仲介免疫応答を有する個体）から得られたＴ細胞をアレルゲンから誘導されたペプチドとともに培養し、そして、例えば、トリチウム化チミジンの細胞の吸収により測定して、ペプチドに応答してＴ細胞の増殖が起こるかどうかを決定することによって、ヒトＴ細胞の刺激活性を試験することができる。ペプチドに対するＴ細胞により応答についての刺激指数は、ペプチドに応答する最大ＣＰＭ／対照のＣＰＭとして計算することができる。２に等しいか、あるいはそれより大きいＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）×バックグラウンドのレベルを「陽性」と考える。陽性の結果を使用して、試験したペプチドのグループについての各ペプチドの平均刺激指数を計算する。本発明の好ましいペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなり、そして２．０より大きいか、あるいはそれに等しい平均Ｔ細胞刺激指数を有する。２．０より大きいか、あるいはそれに等しいＴ細胞刺激指数を有するペプチドは治療剤として有用であると考えられる。好ましいペプチドは少なくとも２．５、より好ましくは少なくとも３．５、なおより好ましくは少なくとも４．０、そして最も好ましくは少なくとも５．０の平均Ｔ細胞刺激指数を有する。

さらに、好ましいペプチドは少なくとも約１００、より好ましくは少なくとも１５０、なおより好ましくは少なくとも約２００、そして最も好ましくは少なくとも約２５０の陽性指数（Ｐ．Ｉ．）を有する。ペプチドについての陽性指数は、家ほこりダニに対して感受性の個体の集団（例えば、好ましくは少なくとも９個体、より好ましくは少なくとも１６またはそれ以上、より好ましくは少なくとも２９またはそれ以上の個体、あるいはなおより好ましくは少なくとも３０またはそれ以上の個体）において、平均Ｔ細胞刺激指数×ペプチドに対して応答するＴ細胞を有する個体の百分率により決定される。こうして、陽性指数は家ほこりダニに対して感受性の個体のある集団における、ペプチドに対するＴ細胞の応答の強さ（Ｓ．Ｉ．）およびペプチドに対するＴ細胞の応答の頻度の両者を表す。例えば、第５図に示すように、ペプチドＤＰＩ−１は試験した個体のグループにおいて４．７の平均Ｓ．Ｉ．および７３％の陽性の応答を有して、３４３．１の陽性指数を生ずる。少なくとも約１５０の陽性指数および少なくとも約４の平均Ｔ細胞刺激指数を有するＤｅｒｐＩペプチドは、ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）；ＤＰＩ−２１．２（（配列識別番号：２８）；ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩ−２３．２（配列識別番号：３４）；ＤＰＩ−２
５．２（配列識別番号：３６）；およびＤＰＩ−２６．１（配列識別番号：３７）を包含する。

例えば、優秀なマッピング技術により、正確なＴ細胞エピトープを決定するために、Ｔ細胞の生物学的技術により決定してＴ細胞刺激活性を有し、こうして少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドを、そのペプチドのアミノまたはカルボキシ末端におけるアミノ酸残基の付加または欠失により修飾し、そして試験して修飾されたペプチドに対するＴ細胞の反応性の変化を測定する。天然タンパク質の配列におけるオーバーラップの区域を共有する２またはそれ以上のペプチドを、Ｔ細胞の生物学的技術により測定して、ヒトＴ細胞刺激活性を有することが発見された場合、このようなペプチドのすべてまたは一部分を含んでなる追加のペプチドを生産し、そしてこれらの追加のペプチドを同様な手順により試験することができる。この技術に従い、ペプチドを選抜し、そして組換え的にまたは合成的に生産することができる。ペプチドは種々の因子、例えば、ペプチドに対するＴ細胞の応答の強さ（例えば、刺激指数）、家ほこりダニに対して感受性の個体の集団におけるペプチドに対するＴ細胞の応答の頻度、およびダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属の他のアレルゲンとのペプチドの潜在的交差反応性に基づいて選抜される。これらの選抜したペプチドの物理的または化学的性質（例えば、溶解度、安定性）を検査して、ペプチドが治療用組成物における使用に適当であるかどうか、あるいはペプチドがここに記載する修飾を必要とするかどうかを決定する。選抜したペプチドまたは選抜した修飾されたペプチドがヒトＴ細胞を刺激する（例えば、増殖、リンホカインの分泌を誘発する）能力を測定する。

さらに、本発明の好ましいペプチドは免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に結合しないか、あるいはペプチドを誘導したタンパク質アレルゲンがＩｇＥに結合するより実質的に少ない程度にＩｇＥに結合する。標準の免疫治療の主要な合併症はＩｇＥ仲介応答、例えば、アナフィラキシーである。免疫グロブリンＥは、マスト細胞または好塩基性細胞上のＩｇＥへの抗原の結合または交差連鎖およびメディエイター（例えば、ヒスタミン、セロトニン、好酸球の化学走性因子）の解放から生ずるアナフィラキシーの反応のメディエイターである。こうして、家ほこりダニに対して感受性の個体の集団の実質的な百分率におけるアナフィラキシーは、家ほこりダニのアレルゲンに対して感受性の個体の集団の実質的な百分率（例えば、少なくとも約７５％）においてＩｇＥに結合しない１または２以上のペプチドの免疫治療における使用により回避することができるか、あるいはペプチドがＩｇＥに結合する場合、このような結合はマスト細胞または好塩基性細胞からのメディエイターの解放を生じない。アナフィラキシーの危険は、ＩｇＥへの結合が減少した１または２以上のペプチドの免疫治療における使用により減少することができる。そのうえ、最小のＩｇＥ刺激活性を有するペプチドは治療効果のために望ましい。最小のＩｇＥ刺激活性は、天然タンパク質アレルゲン（例えば、ＤｅｒｐＩ）により刺激されるＩｇＥの生産および／またはＩＬ−４の生産の量より少ないＩｇＥの生産を意味する。

本発明のペプチドは、家ほこりダニに対して感受性の個体に投与したとき、アレルゲンに対する個体のアレルギーの応答を変更することができる。とくに、ダニのアレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたはダニのアレルゲンから誘導された少なくとも２つの領域からなり、各々が少なくとも１つのＴ細胞エピトープからなる、本発明のペプチドは、家ほこりダニに対して感受性の個体に投与したとき、アレルゲンに対する個体のＴ細胞の応答を変更することができる。ここにおいて使用するとき、家ほこりダニのアレルゲンに対して感受性の個体のアレルギーの応答の変更は、非応答性、あるいは標準の臨床的手順（参照、例えば、Ｖａｒｎｅｙら、ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、３０２：２６５−２６９（１９９０））により決定して、ダニのタンパク質アレルゲン誘発ぜん息症候群の減少を包含する、ダニのアレルゲンに対して暴露したときの症状の減少として定義される。ここにおいて使用するとき、症状の減少は、個体が本発明の１
または２以上のペプチドを使用する処置の養生法を完結した後、アレルゲンに対して個体のアレルギーの応答の減少を包含する。この減少は主観的（すなわち、患者はアレルゲンの存在下により快適に感ずる）であることがある。症状の減少は、この分野において知られているように標準の皮膚試験を使用して、臨床的に同様によく決定することができる。

ここに記載する研究の結果として、少なくとも１つのＴ細胞エピトープからなるダニのアレルゲンから誘導されたペプチドが生産された。Ｔ細胞エピトープは、ダニのアレルゲンの臨床的症状の原因となる１または２以上のダニのアレルゲンに対する免疫応答の開始および永続させることに関係すると信じられる。これらのＴ細胞エピトープは、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて、抗原提示細胞の表面上の適当なＨＬＡ分子に結合し、そして関係するＴ細胞の下位集団を刺激することによって、前期の事象をトリガーすると考えられる。これらの事象はＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所的炎症反応、追加の免疫細胞のその部位への漸増、および抗体の生産に導くＢ細胞のカスケードの活性化に導く。これらの抗体の１つのアイソタイプであるＩｇＥはアレルギーの症状の発生において基本的に重要であり、そしてその生産は、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて、分泌されたリンホカインの性質により事象のカスケードにおいて前期に影響を受ける。Ｔ細胞エピトープは、そのエピトープがタンパク質のアミノ酸配列において隣接および／または非隣接であることができるレセプターの認識に対して必須のアミノ酸残基からなる場合、Ｔ細胞のレセプターによる認識の基本的要素または最小の単位である。Ｔ細胞エピトープをまね、そしてダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンに対してアレルギーの応答を変更するアミノ酸配列は、本発明の範囲内である。

本発明のペプチドへのダニのアレルギーの患者の暴露は、Ｔ細胞の下位集団を寛容化またはアネルギー化し、こうしてそれらは１または２以上のダニのアレルゲンに対して非応答性となり、そしてこのような暴露のときの免疫応答のマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）に参加しない。さらに、本発明のペプチドの投与は、天然に見いだされるダニのタンパク質アレルゲンまたはその一部分への暴露と比較して、リンホカインの分泌のプロフィルを変更することができる（例えば、ＩＬ−４の減少および／またはＩＬ−２の増加を生ずる）。さらに、本発明のペプチドへの暴露は、通常１または２以上のダニのアレルゲンに対する応答に参加するＴ細胞の下位集団に影響を及ぼすことがあり、こうしてＴ細胞はアレルゲンへの通常の暴露の１または２以上の部位（例えば、鼻粘膜、皮膚および肺）から離れてペプチドの治療的投与の１または２以上の部位に向かって引かれる。Ｔ細胞の下位集団のこの再分布は、１または２以上のダニのアレルゲンへの通常の暴露の部位における免疫応答をマウントする個体の免疫系の能力を軽減または減少し、アレルギーの症状を減少させることができる。

本発明の単離されたペプチドは、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなり、したがって、タンパク質アレルゲンの少なくともほぼ７つのアミノ酸残基を含んでなる。処置の効果の目的で、本発明の治療用組成物は好ましくはダニのアレルゲンの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んでなる。したがって、本発明の単離されたペプチドは好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んでなり、したがって、少なくともほぼ８つのアミノ酸残基、好ましくは１５のアミノ酸残基を含んでなる。さらに、本発明の治療用組成物は、好ましくは、家ほこりダニに対して感受性の個体へのこの組成物の投与の治療的養生法がタンパク質アレルゲンに対して寛容化されている個体のＴ細胞を生ずるように、十分な百分率の全体のタンパク質アレルゲンのＴ細胞エピトープを含んでなる。長さがほぼ４５までのアミノ酸残基、最も好ましくはほぼ３０までのアミノ酸残基を含んでなる本発明の合成的に生産されたペプチドが、とくに望ましい。なぜなら、長さが増加すると、ペプチドの合成が困難となることがあり、ならびにペプチドとそれが誘導されるタンパク質アレルゲンとの間のコンフォメーションの類似性が維持するために、望ましくない
性質（例えば、免疫グロブリンの結合または酵素活性）が保持されるからである。第３図および第４図に示すペプチドのすべては、ヒトＴ細胞刺激活性を有することが発見された。好ましいペプチドは、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのタンパク質アレルゲンの範囲内の主要なＴ細胞反応性の区域、すなわち、領域１、領域２、領域３、領域４、領域５、領域６ａ、領域６ｂ、領域７、領域８、領域９および領域１０のすべてまたは一部分を含んでなる。各区域は次のように定義される：領域１はＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１〜２８を含んでなる；領域２はＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基３６〜６８を含んでなる；領域３はＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基７４〜１０９を含んでなる；領域４はＤｅｒｐＩおよびＤｅｒ
ｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１１８〜１３９を含んでなる；領域５はＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１４１〜１６６を含んでなる；領域６ａはＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１６１〜１８５を含んでなる；領域６ｂはＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１７３〜２０１を含んでなる；領域７はＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１〜２６を含んでなる；領域８はＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基３３〜６７を含んでなる；領域９はＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基７９〜１０４を含んでなる；領域１０はＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのタンパク質アレルゲンのアミノ酸残基１０７〜１２９を含んでなる。

ＤｅｒｐＩタンパク質から誘導された好ましいペプチドは、下記のペプチドのすべてまたは一部分を含んでなる：ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）；ＤＰＩ−２（配列識別番号：１０）；ＤＰＩ−３（配列識別番号：１１）；ＤＰＩ−４（配列識別番号：１２）；ＤＰＩ−１１．１（配列識別番号：１３）；ＤＰＩ−１２．１（配列識別番号：１４）；ＤＰＩ−５（配列識別番号：１５）；ＤＰＩ−１３（配列識別番号：１７）；ＤＰＩ−１４（配列識別番号：１８）；ＤＰＩ−１５（配列識別番号：１９）；ＤＰＩ−６．１（配列識別番号：２０）；ＤＰＩ−７．１（配列識別番号：２１）；ＤＰＩ−８（配列識別番号：２２）；ＤＰＩ−９（配列識別番号：２３）；ＤＰＩ−１６（配列識別番号：２４）；ＤＰＩ−１０（配列識別番号：２５）；ＤＰＩ−１７（配列識別番号：２６）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）；ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）；ＤＰＩ−２２．２（配列識別番号：３０）；ＤＰＩ−２２．３（配列識別番号：３１）；ＤＰＩ−２２．４（配列識別番号：３２）；ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩ−２３．２（配列識別番号：３４）；ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２６．１（配列識別番号：３７）；ＤＰＩ−２７．１（配列識別番号：３８）；ＤＰＩ−２８．１（配列識別番号：３９）；ＤＰＩ−２８．２（配列識別番号：４０）、ここでペプチドの一部分は、第５図および第１３図に示すように、それを誘導したペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数に等しいか、あるいはそれより大きい平均Ｔ細胞刺激指数を有する。さらに好ましいのは、ＤｅｒｐＩタンパク質から誘導されたペプチドが下記のペプチドのすべてまたは一部分を含んでなる：ＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２２．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２５．２、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩ−２７．１およびＤＰＩ−２８．１のペプチドを含んでなり、そして最も好ましくは、ＤｅｒｐＩタンパク質から誘導されたペプチドがＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２３．１およびＤＰＩ−２６．１のすべてまたは一部分を含んでなり、ここでペプチドの一部分は、第５図および第１３図に示すように、それが誘導されたペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数に等しいか、あるいはそれより大きい平均Ｔ細胞刺激指数を有する。

ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質から誘導された好まし
いペプチドは、次のものを包含する：ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）；ＤＦＩ−２．１（配列識別番号：７３）；ＤＦＩ−３（配列識別番号：７４）；ＤＦＩ−４（配列識別番号：７５）ＤＦＩ−１１（配列識別番号：７６）；ＤＦＩ−１２（配列識別番号：７７）；ＤＦＩ−５（配列識別番号：７８）；ＤＦＩ−１３（配列識別番号：７９）；ＤＦＩ−１４（配列識別番号：８０）；ＤＦＩ−１５（配列識別番号：８１）；ＤＦＩ−６（配列識別番号：８２）；ＤＦＩ−７（配列識別番号：８３）；ＤＦＩ−８．１（配列識別番号：８４）；ＤＦＩ−８（配列識別番号：８５）ＤＦＩ−９（配列識別番号：８６）；ＤＦＩ−１６（配列識別番号：８７）；ＤＦＩ−１０（配列識別番号：８８）；ＤＦＩ−１７（配列識別番号：８９）；ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）；ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−２２．２（配列識別番号：９３）；ＤＦＩ−２２．４（配列識別番号：９４）；ＤＦＩ−２３．１（配列識別番号：９５）；ＤＦＩ−２３．２（配列識別番号：９６）；ＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；’ＤＦＩ−２５．２（配列識別番号：９８）；ＤＦＩ−２６．１（配列識別番号：９９）；ＤＦＩ−２７．１（配列識別番号：１００）；ＤＦＩ−２８．１（配列識別番号：１０１）；ＤＦＩ−２８．２（配列識別番号：１０２）；ＤＰＩＩ−２０（配列識別番号：５０）；ＤＰＩＩ−２０．１（配列識別番号：５１）；ＤＰＩＩ−２０．２（配列識別番号：５２）；ＤＰＩＩ−２０．３（配列識別番号：５３）；ＤＰＩＩ−２０．４（配列識別番号：５４）；ＤＰＩＩ−２０．５（配列識別番号：５５）；ＤＰ
ＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）；ＤＰＩＩ−１（配列識別番号：４１）；ＤＰＩＩ−２（配列識別番号：４２）；ＤＰＩＩ−３．１（配列識別番号：４３）；ＤＰＩＩ−４（配列識別番号：４４）；ＤＰＩＩ−５（配列識別番号：４５）；ＤＰＩＩ−６（配列識別番号：４６）；ＤＰＩＩ−７（配列識別番号：４７）；ＤＰＩＩ−８（配列識別番号：４８）；ＤＰＩＩ−９（配列識別番号：４９）；ＤＰＩＩ−１．１（配列識別番号：５７）；ＤＰＩＩ−１．２（配列識別番号：５８）；ＤＰＩＩ−２．１（配列識別番号：５９）；ＤＰＩＩ−２．２（配列識別番号：６０）；ＤＰＩＩ−２．３（配列識別番号：６１）；ＤＰＩＩ−２１（配列識別番号：６２）；ＤＰ
ＩＩ−２２（配列識別番号：６３）；ＤＰＩＩ−２６（配列識別番号：６４）；ＤＰ
ＩＩ−２６．１（配列識別番号：６５）；ＤＰＩＩ−２３（配列識別番号：６６）；ＤＰＩＩ−２３．１（配列識別番号：６７）；ＤＰＩＩ−２４（配列識別番号：６８）；ＤＰＩＩ−２５（配列識別番号：６９）；ＤＰＩＩ−２５．１（配列識別番号：７０）；ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；ＤＦＩＩ−１（配列識別番号：１０３）；ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）；ＤＦＩＩ−１３．１（配列識別番号：１０５）；ＤＦＩＩ−３．１（配列識別番号：１０６）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）；ＤＦＩＩ−４．３（配列識別番号：１０８）；ＤＦＩＩ−１５（配列識別番号：１０９）；ＤＦＩＩ−１６（配列識別番号：１１０）；ＤＦＩＩ−１７（配列識別番号：１１１）；ＤＦＩＩ−１８（配列識別番号：１１２）；ＤＦＩＩ−１９（配列識別番号：１１３）；ＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−２１（配列識別番号：１１５）；およびＤＦＩＩ−２２（配列識別番号：１１６）、または少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドの一部分。好ましくは、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドの一部分は、第１０図、第１５ａ図、第１５ｂ図および第１６図に示すように、それが誘導されたペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数に等しいか、あるいはそれより大きい平均Ｔ細胞刺激指数を有する。より好ましくは、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質から誘導されたペプチドは下記のペプチドのすべてまたは一部分を含んでなる：ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩＩ−２０．６、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩＩ−２４およびＤＰ
ＩＩ−２５．２。

本発明の１つの態様は、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンのペプチドを特徴とする。このペプチドまたはその一部分は、
タンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなり、そして式Ｘ_ｎ−Ｙ−Ｚ_ｍを有し、ここでＹは、ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）；ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦ
Ｉ−２２．２（配列識別番号：９３）；ＤＦＩ−２２．４（配列識別番号：９４）；ＤＦＩ−２３．１（配列識別番号：９５）；ＤＦＩ−２３．２（配列識別番号：９６）；ＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２５．２（配列識別番号：９８）；ＤＦＩ−２６．１（配列識別番号：９９）；ＤＦＩ−２７．１（配列識別番号：１００）；ＤＦＩ−２８．１（配列識別番号：１０１）；ＤＦＩ−２８．２（配列識別番号：１０２）；ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）；ＤＰＩＩ−２０（配列識別番号：５０）；ＤＰＩＩ−２０．１（配列識別番号：５１）；ＤＰＩＩ−２０．２（配列識別番号：５２）；ＤＰＩＩ−２０．３（配列識別番号：５３）；ＤＰＩＩ−２０．４（配列識別番号：５４）；ＤＰＩＩ−２０．５（配列識別番号：５５）；ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）；ＤＰＩＩ−１（配列識別番号：４１）；ＤＰＩＩ−１．１（配列識別番号：５７）；ＤＰＩＩ−１．２（配列識別番号：５８）；ＤＰＩＩ−２．１（配列識別番号：５９）；ＤＰＩＩ−２．２（配列識別番号：６０）；ＤＰＩＩ−２．３（配列識別番号：６１）；ＤＰＩＩ−２１（配列識別番号：６２）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）；ＤＰＩＩ−２６（配列識別番号：６４）；ＤＰＩＩ−２６．１（配列識別番号：６５）；ＤＰＩＩ−２３（配列識別番号：６６）；ＤＰＩＩ−２３．１（配列識別番号：６７）；ＤＰＩＩ−２４（配列識別番号：６８）；ＤＰＩＩ−２５（配列識別番号：６９）；ＤＰＩＩ−２５．１（配列識別番号：７０）；ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；ＤＦＩＩ−１（配列識別番号：１０３）；ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）；ＤＦＩＩ−１３．１（配列識別番号：１０５）；ＤＦＩＩ−３．１（配列識別番号：１０６）；ＤＦ
ＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）；ＤＦＩＩ−４．３（配列識別番号：１０８）；ＤＦＩＩ−１５（配列識別番号：１０９）；ＤＦＩＩ−１６（配列識別番号：１１０）；ＤＦＩＩ−１７（配列識別番号：１１１）；ＤＦＩＩ−１８（配列識別番号：１１２）；ＤＦＩＩ−１９（配列識別番号：１１３）；ＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−２１（配列識別番号：１１５）；およびＤＦＩＩ−２２（配列識別番号：１１６）から成る群より選択されるアミノ酸配列である。さらに、Ｘ_ｎはタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の中のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸残基であり、そしてＺ_ｍはタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸残基である。この式において、ｎは０〜３０であり、そしてｍは０〜３０である。

本発明の他の態様は、少なくとも２つの領域を含んでなり、各領域がダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる（したがって、各領域が少なくともほぼ７つのアミノ酸残基を含んでなる）ペプチドを提供する。少なくとも２つの領域を含んでなるこれらのペプチドは、所望の数のアミノ酸残基を含んでなることができ、そしてダニのアレルゲンの好ましくは少なくとも約１４、なおより好ましくは約３０、最も好ましくは少なくとも４０のアミノ酸残基を含んでなることができる。このようなペプチドの各領域は、長さが好ましくは４５までのアミノ酸残基、より好ましくは４０までの残基、最も好ましくは３０までのアミノ酸残基を含んでなる。なぜなら、領域の長さが増加すると、ペプチドの合成が困難となることがあり、ならびにペプチドとそれが誘導されたタンパク質アレルゲンとの間のコンフォメーションの類似性が維持されるために、望ましくない性質（例えば、免疫グロブリンの結合または酵素活性）が保持されるからである。このようなリンカーは任意の非エピトープのアミノ酸配列または他の適当な連鎖または接合因子であることができる。少なくとも２つの領域を含んでなり、各々が少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる好ましいペプチドを得るために、アレルゲンまたは異なるダニのタンパク質アレルゲンの組み合わせの中の領域の天然に見いだされるコンフィグレーションと異なるコン
フィグレーションで領域を配置する。例えば、１または２以上のＴ細胞エピトープを含有する領域を非隣接のコンフィグレーションで配置することができそして、好ましくは、同一のタンパク質アレルゲンまたはタンパク質アレルゲンの組み合わせから誘導することができる。非隣接は、領域を誘導したタンパク質アレルゲンの中に存在するアミノ酸配列の配置と異なる１または２以上のＴ細胞エピトープを含有する領域の配置として定義される。さらに、Ｔ細胞エピトープを含有する非隣接の領域は順次でない順序で配置することができる（例えば、アミノ酸がアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている、１または２以上のＴ細胞エピトープを含有する領域を誘導した天然タンパク質アレルゲンのアミノ酸の順序を異なる順序で）。ペプチドはダニのアレルゲンのＴ細胞エピトープの少なくとも１５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％または１００％までを含んでなることができる。

個々のペプチド領域を生産しそして試験して、どの領域がダニのアレルゲンに対して特異的な免疫グロブリンＥに結合するか、そしてこのような領域のどれがマスト細胞または好塩基性細胞からメディエイター（例えば、ヒスタミン）を解放させるかを測定することができる。試験したアレルギー性血清のほぼ１０〜１５％より大において免疫グロブリンＥに結合しそしてマスト細胞または好塩基性細胞からメディエイターを解放させることが発見されたペプチド領域は、好ましくは、本発明のペプチドを形成するために配置されたペプチド領域の中に含まれない。

本発明の好ましいペプチドは、同一であるか、あるいは異なるダニのアレルゲン（例えば、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩ）から誘導された２またはそれ以上の領域からなる。例えば、１つの領域はＤｅｒｐＩから誘導されることができ、そして１つの領域はＤｅｒｐＩ１から誘導されることができる；１つの領域はＤｅｒｆＩから誘導されることができる；１つの領域はＤｅｒｐＩＩから誘導されることができ、そして１つの領域はＤｅｒｆＩから誘導されることができる；１つの領域はＤｅｒｐＩＩから誘導されることができ、そして１つの領域はＤｅｒｆＩＩから誘導されることができる；そして１つの領域はＤｅｒｆＩから誘導されることができ、そして１つの領域はＤｅｒｐＩ１から誘導されることができる。さらに、領域は同一のタンパク質アレルゲン、例えば、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩなどから誘導することができる。

本発明のペプチドの領域は、好ましくは、各ダニのアレルゲンの範囲内の主要なＴ細胞反応性の前述の好ましい区域（すなわち、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩの領域１〜６ａ〜６ｂおよびＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩの領域７〜１０）のすべてまたは一部分からなる。例えば、１つの領域は領域１のすべてまたは一部分（ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｆＩのアミノ酸残基１〜２８）からなり、そして１つの領域は領域２（ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｆＩのアミノ酸残基３６〜６８）のすべてまたは一部分からなる。本発明のペプチドはこれらの領域（すなわち、領域１〜１０）の２またはそれ以上のすべてまたは一部分からなり、そして好ましいペプチドはＩｇＥに結合せず、そしてマスト細胞または好塩基性細胞からのメディエイターの解放を引き起こさない。ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩから誘導された好ましいペプチドは、領域１、領域２、領域３および必要に応じて領域４のすべてまたは一部分からなる。ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導された好ましいペプチドは、領域７および領域８および領域１０のすべてまたは一部分からなる。さらに、これらの領域の１つはＩｇＥに結合しそしてマスト細胞または好塩基性細胞からのメディエイターの解放を引き起こすことが発見され、こうしてペプチドはこのような領域からならず、むしろＩｇＥに結合せず、そしてマスト細胞または好塩基性細胞からのメディエイターの解放を引き起こさないこのような領域から誘導された種々の領域を含んでなることが好ましい。

好ましい領域の例は、下記のアミノ酸配列のすべてまたは一部分を包含する：ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）；ＤＰ
Ｉ−２２．１（配列識別番号：２９）；ＤＰＩ−２２．２（配列識別番号：３０）；ＤＰＩ−２２．３（配列識別番号：３１）；ＤＰＩ−２２．４（配列識別番号：３２）；ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩ−２３．２（配列識別番号：３４）；ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２６．１（配列識別番号：３７）；ＤＰＩ−２７．１（配列識別番号：３８）；ＤＰＩ−２８．１（配列識別番号：３９）；ＤＰＩ−２８．２（配列識別番号：４０）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：７２）；ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）；ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−２２．２（配列識別番号：９３）；ＤＦＩ−２２．４（配列識別番号：９４）；ＤＦＩ−２３．１（配列識別番号：９５）；ＤＦＩ−２３．２（配列識別番号：９６）；ＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２５．２（配列識別番号：９８）；ＤＦＩ−２６．１（配列識別番号：９９）；ＤＦＩ−２７．１（配列識別番号：１００）；ＤＦＩ−２８．１（配列識別番号：１０１）；ＤＦＩ−２８．２（配列識別番号：１０２）；ＤＰＩＩ−２０（配列識別番号：５０）；ＤＰＩＩ−２０．１（配列識別番号：５１）；ＤＰＩＩ−２０．２（配列識別番号：５２）；ＤＰＩＩ−２０．３（配列識別番号：５３）；ＤＰＩＩ−２０．４（配列識別番号：５４）；ＤＰＩＩ−２０．５（配列識別番号：５５）；ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）；ＤＰＩＩ−１（配列識別番号：４１）；ＤＰＩＩ−１．１（配列識別番号：５７）；ＤＰＩＩ−１．２（配列識別番号：５８）；ＤＰＩＩ−２．１（配列識別番号：５９）；ＤＰＩＩ−２．２（配列識別番号：６０）；ＤＰＩＩ−２．３（配列識別番号：６１）；ＤＰＩＩ−２１（配列識別番号：６２）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）；ＤＰＩＩ−２６（配列識別番号：６４）；ＤＰＩＩ−２６．１（配列識別番号：６５）；ＤＰＩＩ−２３（配列識別番号：６６）；ＤＰＩＩ−２３．１（配列識別番号：６７）；ＤＰＩＩ−２４（配列識別番号：６８）；ＤＰＩＩ−２５（配列識別番号：６９）；ＤＰＩＩ−２５．１（配列識別番号：７０）；ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；ＤＦＩＩ−１（配列識別番号：１０３）；ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）；ＤＦＩＩ−１３．１（配列識別番号：１０５）；ＤＦＩＩ−３．１（配列識別番号：１０６）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）；ＤＦＩＩ−４．３（配列識別番号：１０８）；ＤＦＩＩ−１５（配列識別番号：１０９）；ＤＦＩＩ−１６（配列識別番号：１１０）；ＤＦＩＩ−１７（配列識別番号：１１１）；ＤＦＩＩ−１８（配列識別番号：１１２）；ＤＦＩＩ−１９（配列識別番号：１１３）；ＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−２１（配列識別番号：１１５）；およびＤＦＩＩ−２２（配列識別番号：１１６）、このような領域のアミノ酸配列は第３図および第４図に示されているか、あるいは前記領域の一部分は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる。

好ましいペプチドは２またはそれ以上の領域の種々の組み合わせを含んでなり、各領域は主要なＴ細胞反応性の前述の好ましい区域のすべてまたは一部分を含んでなる。好ましいペプチドは２またはそれ以上の領域の組み合わせを含んでなり（各領域は第３図および第４図に示されているアミノ酸配列を有する）前記領域は次のものを包含する：ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２９）およびＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）およびＤＰＩ−１（配列識別番号：９）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３９）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２２
．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰ
Ｉ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）、およびＤＰＩ−２６．１（配列識別番号：３７）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）およびＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）およびＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＦＩ−１２．１（配列識別番号：９０）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２３．１（配列識別番号：９５）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、およびＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、およびＤＦ
Ｉ−１（配列識別番号：７２）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＦ
Ｉ−２１．２（配列識別番号：９１）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、およびＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、およびＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）およびＤＰＩ−（配列識別番号：２９）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、およびＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）およびＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）およびＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＦＩＩ−９（配列識別番号：８６）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、およびＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７
）、ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、およびＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；およびｉ’）ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）。

好ましいペプチドは、２またはそれ以上の領域の組み合わせを含んでなりそして下記の組み合わせを包含する：ＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２０．６、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩＩ−２５．２およびＤＦＩＩ−２２．２；ＤＰＩ−２１．１、ＤＦＩＩ−２２．２；ＤＰＩ−２１．２、ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２５．２、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩ−２７．１、ＤＰＩＩ−２０．６、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩＩ−２４、およびＤＰ
ＩＩ−２５．２；ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２２、ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩＩ−２０．６、およびＤＰＩＩ−２５．２；ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２１．２、ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩＩ−２０．６およびＤＰＩＩ−２５．２；ＤＰＩ−２３．１、ＤＦＩ−２２およびＤＰＩＩ−２０．６；ＤＰＩ−２６．１、ＤＦＩ−２２．２およびＤＰＩＩ−２５．２；ＤＰＩ−２１．２、ＤＦＩ−２２．２およびＤＰＩＩ−２２；およびＤＰＩ−２１．２およびＤＰＩＩ−２２。

最も好ましいペプチドは、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、およびＤｅｒｆＩから誘導された２またはそれ以上の領域の組み合わせ（各領域は第３図および第４図に示されているアミノ酸配列を有する）を含んでなり、前記好ましいペプチドの各々は第２５図〜第２７図に示すようなアミノ酸配列の下記の特定の順次の配置を有する：それぞれ、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２５．２、ＤＦＩ−２２、ＤＰＩＩ−２０．６およびＤＰＩ−２１．１；それぞれ、ＤＰＩＩ−２５．２、ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩ−２１．２およびＤＰＩＩ−２０．６；および、それぞれ、ＤＰＩＩ−２５．２、ＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩＩ−２０．６およびＤＦＩ−２２．２。前述のペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、第２５図、第２６図および第２７図に示されている。

本発明の範囲内のダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンのペプチドは、ダニのアレルゲンに対するアレルギー反応を処置および防止する方法において使用することができる。こうして、本発明の１つの面は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、あるいは好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含むＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、ＤｅｒｆＩ、またはＤｅｒｆＩＩのペプチド、および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を含んでなる治療用組成物を提供する。他の面において、治療用組成物は製剤学的に許容されうる担体または希釈剤、および少なくとも２つの領域を含んでなり、各領域が同一であるか、あるいは異なるダニのタンパク質アレルゲンから誘導されたダニのアレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドを含む。

好ましい治療用組成物は、ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属の少なくとも１種のタンパク質アレルゲンの少なくとも１種のペプチドを含んでなる。この組成物は、家ほこりダニに対して感受性の個体へのその組成物の投与の治療的養生法がそのタンパク質アレルゲンに対して寛容化されている個体のＴ細胞を生ずるように、十分な百分率の少なくとも１種のタンパク質アレルゲンのＴ細胞エピトープを含んでなる。好ましくは、この組成物は、各タンパク質のＴ細胞反応性の少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％がこの組成物の中に含有されるように、十分な百分率の１または２以上のタンパク質アレルゲンのＴ細胞エピトープを含んでなる。このような組成物は、家ほこりダニまたは家ほこりダニと免疫学的に交差反応性であるアレルゲンに対す
る感受性を処置または防止するために、個体に投与することができる。

個体を除感作するための本発明の治療用組成物の投与は、既知の技術を使用して実施することができる。例えば、少なくとも１つのＴ細胞エピトープからなるダニのアレルゲンから誘導されたペプチドを、適当な希釈剤、例えば、担体、および／またはアジュバントと組み合わせて投与することができる。個体においてＴ細胞のアネルギーを誘発するために、治療用組成物は、好ましくは、非免疫原性の形態で投与され、例えば、それはアジュバントを含有しない。製剤学的に許容されうる希釈剤は、生理的食塩水および水性緩衝液を包含する。製剤学的に許容されうる担体は、ポリエチレングリコール（Ｗｉｅら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６４：８４−９９（１９８１））およびリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｉｍｍｎｏｌｏｇｙ、７：２７（１９８４））を包含する。このような組成物は、一般に、注射（皮下的、静脈内など）、経口的投与（例えば、カプセル剤の形態で）、吸入、経皮的適用または経直腸的投与により投与されるであろう。本発明の治療用組成物は、家ほこりダニに対して感受性の個体に、家ほこりダニのアレルゲンに対する個体の感受性を減少する（すなわち、アレルギーの応答を減少する）ために有効な投与量および時間の間投与される。治療的に有効量の１または２以上の同一であるか、あるいは異なる治療用組成物を、家ほこりダニに対して感受性の個体に同時にまたは順次に投与することができる。有効量の治療用組成物は、家ほこりダニに対する個体の感受性の程度、年令、性別、および個体の体重、および個体においてＴ細胞の応答を刺激するペプチドの能力のような因子に従い変化するであろう。

本発明のなお他の面において、少なくとも２つのペプチド（例えば、少なくとも２つのペプチドの物理的混合物）を含んでなり、各々がダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる組成物が提供される。ペプチドは同一であるか、あるいは異なるダニのアレルゲンから誘導される。このような組成物は、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤を有する治療用組成物の形態で投与することができる。このような組成物の１または２以上の治療的に有効量を、家ほこりダニに対して感受性の個体に同時にまたは順次に投与することができる。

同時にまたは順次に投与することができるペプチドの好ましい組成物およびペプチドの好ましい組み合わせ（第３図および第４図に示されているアミノ酸配列を有するペプチドを含んでなる）は、下記の組み合わせを包含する：ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２９）およびＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）およびＤＰＩ−１（配列識別番号：９）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）、ＤＰ
Ｉ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３９）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２８）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩ−２１．２（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）、およびＤＰＩ−２６．１（配列識別番号：３７）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）およびＤＦＩ−２２．１（
配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）およびＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：９７）；ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＦＩ−２５．１（配列識別番号：３５）；ＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）、ＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）、およびＤＦＩ−２３．１（配列識別番号：９５）；ＤＰ
Ｉ−２１．１（配列識別番号：２７）、およびＤＦＩ−２２．１（配列識別番号：９２）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、およびＤＦＩ−１（配列識別番号：７２）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＦＩ−２１．２（配列識別番号：９１）；ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、ＤＰＩ−２５．１（配列識別番号：３５）、ＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）、およびＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、およびＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、およびＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）およびＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、およびＤＰＩ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩＩ−２０．６（配列識別番号：５６）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰ
Ｉ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰＩ−２５．２（配列識別番号：３６）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−２１．１（配列識別番号：２７）、ＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）、およびＤＰ
Ｉ−２３．１（配列識別番号：３３）；ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、ＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）、ＤＰＩ−１（配列識別番号：９）、およびＤＰＩ−２２．１（配列識別番号：２９）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）およびＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）およびＤＦＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＦ
ＩＩ−１９．１（配列識別番号：１１４）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＦＩＩ−９（配列識別番号：８６）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、およびＤＦＩ−２１．１（配列識別番号：９０）；ＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）、およびＤＰＩＩ−２５．２（配列識別番号：７１）；およびＤＦＩＩ−４．５（配列識別番号：１０７）、ＤＦＩＩ−２（配列識別番号：１０４）、およびＤＰＩＩ−２２（配列識別番号：６３）；およびＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２５．２、ＤＰＩ−２２、ＤＰＩＩ−２０．６およびＤＰＩ−２１．２。

本発明は、また、個体から得られた血液試料を本発明のペプチドと、血液成分とこのペプチドとの結合のために適当な条件下に、一緒にし、そしてこのような結合が起こる程度を測定することからなる、個体における家ほこりダニに対する感受性を検出する方法を提
供する。結合が起こる程度は、Ｔ細胞の機能、Ｔ細胞の増殖またはそれらの組み合わせを評価することによって決定される。

また、このような目的について本発明のペプチドの構造を、溶解度の増加、治療的または予防的効能、または安定性（例えば、ｅｘｖｉｖｏの貯蔵寿命、およびｉｎｖｉｖｏのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強するように、修飾することができる。アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加により、修飾されて、免疫原性を変更したおよび／またはアレルゲン性が減少した修飾されたペプチド、あるいは相補体が同一の目的で付加された修飾されたペプチドを生産することができる。

例えば、免疫原性の形態で投与したとき、強い増殖的応答または可能ならば増殖的応答を誘発する能力をもたない、ペプチドがＴ細胞のアネルギーを誘発しそしてＭＨＣタンパク質に結合する能力を維持するように、ペプチドを修飾することができる。この場合において、Ｔ細胞のレセプターのための重要な結合性残基を、既知の技術（例えば、各残基の置換およびＴ細胞反応性の存在または不存在の測定）により決定することができる。Ｔ細胞のレセプターとの相互作用に対して必須であることが示された残基は、必須のアミノ酸を、他の、好ましくは同様なアミノ酸残基（保存的置換）（その存在はＴ細胞反応性を増強、減少するが、排除しないか、あるいはそれを生じない）で置換することによって、修飾することができる。さらに、Ｔ細胞のレセプターの相互作用のために必須ではないアミノ酸残基は、その組み込みがＴ細胞反応性を増強、減少するか、あるいはそれを生ずることができないが、関係するＭＨＣに対する結合性を排除しない他のアミノ酸による置換により、修飾することができる。

さらに、本発明のペプチドは、ＭＨＣタンパク質複合体との相互作用のために必須であることが示されたアミノ酸を、他の、好ましくは同様なアミノ酸残基（保存的置換）（その存在はＴ細胞活性を増強、減少するが、排除しないか、あるいはそれを生じない）で置換することによって、修飾することができる。さらに、ＭＨＣタンパク質複合体との相互作用のために必須ではないが、なおＭＨＣタンパク質複合体と結合するアミノ酸残基は、その組み込みがＴ細胞反応性を増強し、生じないが、それを排除しない他のアミノ酸配列で置換することによって、修飾することができる。非必須アミノ酸との好ましいアミノ酸置換は、アラニン、グルタミン酸、またはメチルアミノ酸との置換を包含するが、これらに限定されない。

ペプチドの修飾の他の例は、システイン残基を好ましくはセリン、スレオニン、ロイシンまたはグルタミン酸で置換してジサルファイド結合を介する２量化を減少することである。例えば、いずれかのアレルゲンの最初の１０アミノ酸残基を含むＤｅｒｐＩＩまたはＤｅｒｆＩＩのペプチドの安定性は、第８アミノ酸残基に位置するシステインを好ましくはアラニン、またはグルタミン酸で置換するか、あるいはセリンまたはスレオニンで置換することによって増強することができる。

安定性および／または反応性を増強するために、ペプチドは、また、第２５図〜第２７図に示すように天然のアレルの変異型から生ずるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の中に１または２以上の多形性を組み込むことによって、修飾することができる。さらに、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸または非アミノ酸類似体を置換または付加して、本発明の範囲内の修飾されたペプチドを生産することができる。さらに、本発明のペプチドは、Ａ．Ｓｅｈｏｎおよび共同研究者ら（Ｗｉｅら、前掲）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を使用して修飾して、ＰＥＧと接合したペプチドを生産することができる。さらに、ＰＥＧを本発明のペプチドの化学的合成の間に付加することができる。ペプチドまたはその一部分の修飾は、また、次のものを包含することができる：還元／アルキル化（Ｔａｒｒ：タンパク質の微小特性決定の方法（ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＭｉｃ
ｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｊ．Ｅ．Ｓｉｌｖｅｒ編、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ．ニュージャージイ州クリフトン、ｐｐ１５５−１９４（１９８６））；アシル化（Ｔａｒｒ、前掲）；エステル化（Ｔａｒｒ、前掲）；適当な担体への化学的カップリング（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、細胞の免疫学における選択された方法（ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ＷＨＦｒｅｅｍａｎ、カリフォルニア州サンフランシスコ（１９８０））；米国特許第４，９３９，２３９号）；または温和なホルマリン処理（Ｍａｒｓｈ、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４１：１９９−２１５（１９７１））。

他の態様において、アレルゲンのグループ（例えば、ＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｐＩＩ）の範囲内のペプチドを修飾してＴ細胞反応性を増強することができる。グループＩおよびグループＩＩのアレルゲンの範囲内の交差反応性が与えられると、アミノ酸位置において対応する他のグループのアレルゲンのペプチドより反応性が低い１つのグループのアレルゲンのペプチドを、対応するペプチドからの１または２以上のアミノ酸と置換された１または２以上のアミノ酸を有することができる（例えば、ＤＰＩＩ−１、ＤｅｒｆＩＩのアミノ酸配列における残基１７［メチオニン］をＤｅｒｐＩＩにおける残基１７［ロイシン］に位置するアミノ酸と置換して、ＤｅｒｆＩＩペプチドの反応性を増強することができる）。さらに、ペプチドを修飾して、天然アレル変異型から生ずるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の中にある多形性を組み込むことができる。１または２以上のこれらの多形性を含めるペプチドの修飾は、安定性および／または反応性を増強することができる。本発明のペプチドの精製を促進しかつ溶解度を潜在的に増加するために、ペプチドの主鎖に１または２以上のリポーター基を付加することができる。例えば、ポリ−ヒスチジンをペプチドに付加して、固定化された金属イオンのアフィニティクロマトグラフィーでペプチドを精製することができる（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１３２１−１３２５（１９８８））。さらに、特定のエンドプロテアーゼ切断部位を、必要に応じて、ペプチドのリポーター基とアミノ酸配列との間に導入して、無関係の配列を含まないペプチドの単離を促進することができる。タンパク質の抗原に対して個体を首尾よく除感作するために、ペプチドに官能基を付加するか、あるいはペプチドの中に疎水性Ｔ細胞エピトープまたは疎水性エピトープを含有する領域を含めないようにすることによって、ペプチドの溶解度を増加することが必要であることがある。

ペプチド内のＴ細胞エピトープの適切な抗原の処理を潜在的に促進するために、各々が少なくとも１つのＴ細胞エピトープからなる領域の間で、規定のプロテアーゼ感受性部位を組換え的または合成的に操作することができる。例えば、荷電したアミノ酸対、例えば、ＫＫまたはＲＲをペプチドの組換え構築の間にペプチド内の領域の間に導入することができる。生ずるペプチドをカテプシンおよび／または他のトリプシン様酵素の切断に対して感受性として、１または２以上のＴ細胞エピトープを含有するペプチドの部分を発生させることができる。さらに、このような荷電したアミノ酸残基はペプチドの溶解度を増加させることができる。

本発明のペプチドをエンコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を使用して、ペプチドの構造を修飾することができる。このような方法は、ＰＣＲ（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ、７７：５１−５９（１９８９））または突然変異した遺伝子の全体の合成（Ｈｏｓｔｍｓｋｙ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１６１：１０５６−１０６３（１９８９））を伴うことができる。細菌の発現を増強するために、前述の方法を他の手順と組み合わせて使用して、本発明のペプチドをエンコードするＤＮＡ構成体の中の真核生物のコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で優先的に使用されるコドンに変化させることができる。

前述の修飾手順の１または２以上に従い修飾された本発明のペプチドの特定の例は、第２８図に示すようなペプチドＤＰＩ−２３．１および第２８図に示すようなペプチドＤＰＩＩ−２２への修飾を包含するが、これらに限定されない。さらに詳しくは、ペプチド２３．１への修飾は、荷電したアミノ酸（２３．１．２）荷電したアミノ酸対（２３．１．１）を付加して溶解度を増加すること、およびシステイン残基をセリン２３．１．３またはグルタミン酸（２３．１．４）で置換して溶解度を増加することを包含する。ペプチドへの変化は、荷電したアミノ酸対（２２．１および２２．２）を付加して溶解度を増加することを包含する。

本発明は、また、本発明のペプチドをエンコードする配列を有する核酸を提供する。本発明の任意の態様において使用する核酸配列は、ここに記載するｃＤＮＡであるか、あるいは本明細書において表す配列のすべてまたは一部分を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等体であることができる。このようなオリゴデオキシヌクレオチド配列は、既知の技術を使用して、化学的または機械的に生産することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的同等体は、１）配列識別番号：１、配列識別番号：３、配列識別番号：５および配列識別番号：７、またはそれらの断片の配列（または対応する配列の部分）がそれに対してハイブリダイゼーションする相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることができる配列、または２）配列識別番号：１、配列識別番号：３、配列識別番号：５および配列識別番号：７に対して相補的な配列（または対応する配列の部分）および／または３配列識別番号：１、配列識別番号：３、配列識別番号：５および配列識別番号：７の配列（または対応する配列の部分）によりコードされる生産物の同一の機能的特性を有する生産物（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）をエンコードする配列であるものである。機能的同等体が１または２以上の基準を満足しなくてはならないかどうかは、その使用に依存するであろう（例えば、それをオリゴプローブとしてのみ使用する場合、それは第１または第２の基準のみを満足することが必要であり、そしてそれを本発明のペプチドの生産に使用すべき場合、それは第３の基準のみを満足することが必要である）。

下記の非限定的実施例によって、本発明をさらに説明する。

＜実施例Ｉ＞天然ダニのアレルゲンの精製
ヒトＴ細胞エピトープのマッピングのために主要な抗原として、天然の形態の家ほこりダニのダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）のグループＩおよびグループＩＩのアレルゲンを精製するために実施した仕事を、下に記載する。

すべての４つのタンパク質アレルゲン、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩＩおよびＤｅｒｐＩＩを、コモンウェルス・セラ・ラボラトリーズ（ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＳｅｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、オーストラリア国メルボルンまたはライト・ステート大学（ＷｒｉｇｈｔＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、オハイオ州ダイトンの（ラリイＧ．アーリアン（ＬａｒｒｙＧ．Ａｒｌｉａｎ）博士から入手した、使用済みのダニ培地から免疫親和的に精製した。乾燥した使用済みのダニ培地の１０％（重量／体積）水性抽出液を、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）中で４℃において一夜撹拌しながら調製した。１０，０００×ｇで４℃において１時間遠心することによって、不溶性物質を除去した。次いで、上澄み液を真空マニホールド上でワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃１紙を通して濾過し、そして１５，０００×ｇで４℃において１時間再遠心した。最終の濾過を０．４５ｍの酢酸セルロースのフィルターを通して実施した。

モノクローナル抗体４Ｃｌおよび６Ｄ６（バージニア大学、ノースカロライナ州）を、
それぞれ、グループＩまたはグループＩＩのダニのアレルゲンの免疫親和精製のために使用した（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８０：１４７９−１４８４（１９８７）；Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８３：１０５５−１０６７（１９８９））。４Ｃｌモノクローナル抗体はＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐＩの両者のタンパク質が共有するエピトープを反応する；同様に、６Ｄ６モノクローナル抗体はＤｅｒｆＩＩおよびＤｅｒｐＩＩの両者のタンパク質と反応する。

各モノクローナル抗体について、腹水を５０％の硫酸アンモニウム中でカットし、そして抗体を１００ｍＭＮａＨＣＯ_３、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３中でＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４（ファーマシア）に４℃において一夜カップリングした。

モノクローナル抗体のカラムをＰＢＳ中で平衡化し、そして濾過した抽出液を１５ｍｌ／時で負荷した。次いでこのカラムを２０体積のＰＢＳで洗浄し、その後５００ｍＭＮａＣｌを補充したＰＢＳで２０カラム体積のよりストリンジェントの洗浄を実施した。タンパク質は５００ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭグリシンｐＨ１１．０の中に溶離され、そして画分を２８０ｎｍにおける分光光度測定の吸収によりタンパク質含量について評価した。ピークの画分をプールし、そしてＰＢＳに対して広範に透析し、負圧の透析装置（アミコンから入手した、マサチュセッツ州ベベリイ）で濃縮し、そしてダニのグループＩおよびグループＩＩのアレルゲンのＴ細胞エピトープの研究において使用した。回収されたタンパク質は８０％（グループＩＩ）以外の９０％（グループＩ）の範囲の純度で得られた。

逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを適用して、Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８３：１０５５−１０６７（１９８９））における条件に従い、免疫親和精製したグループＩＩのダニのタンパク質アレルゲンをさらに精製した。簡単に述べると、免疫親和精製したタンパク質を、５μｍ５００ÅのＣ−８カラム（アプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド）に０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ中で適用した。このカラムについての流速は１ｍｌ／分であり、勾配は６０分かけて０〜６０％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡであった。グループＩＩのタンパク質はほぼ４５％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡにおいて溶離された。画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動および引き続いてデンシトメトリーの走査により純度について分析した。９０％より大きい純度のグループＩＩのタンパク質を有する画分を、引き続いてアレルゲンのヒトＴ細胞のマッピングのために利用した。

＜実施例ＩＩ＞組換えダニのアレルゲンの発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中の組換えタンパク質として、家ほこりダニのダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）のグループＩおよびグループＩＩのアレルゲンを生産するために実施した実験を、下に記載する。

すべての４つのタンパク質アレルゲン、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩＩおよびＤｅｒｐＩＩを、リーダー配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦ（ここでアミノ酸ＥＦはＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡＴＴＣによりコードされる）をもつ、それらの成熟アミノ末端において融合した。アミノ酸のＨ_６ストレッチはＮＴＡアガロースカラム（ＤｉａｇｅｎｇｍｂＨ）上のＮｉ^＋＋イオンと協調するので、この活性は組換えタンパク質の精製において利用された（Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８６：１３２１−１３２５（１９８８））。究極的には、すべての４つのアレルゲンを発現ベクターｐＥＴ−１１
ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８８（１９９０））の中にファージＴ７ｇｎ１０プロモーターの転写のコントロール下にサブクローニングした。

ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）からのグループＩのアレルゲンをエンコードするｃＤＮＡを、λｇｔ１１からのサブクローンとしてプラスミドの形態でワイネ・トマス（ＷａｙｎｅＴｈｏｍａｓ）博士から入手した（Ｃｈｕａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７：１７５−１８２（１９８８）；Ｄｉｌｗｏｒｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、２１：２５−３２（１９９１））。ＤｅｒｐＩｃＤＮＡは、イムロジック（ＩｍｍｕＬｏｇｉｃ）（ＰｌａｏＡｌｔｏ）のローランド・ブエロウ（ＲｏｌａｎｄＢｕｅｌｏｗ）博士により、Ｍ１３ＲＦプラスミドからＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ１８の中にサブクローニングされたが、ＤｅｒｆＩｃＤＮＡはＭ１３ｍｐ１９ＲＦプラスミドＤｆＩ（１）から直接操作された。

最初に、ｃＤＮＡをｐＴｒｃ９９Ａの修飾されたバージョンである発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６インサートＲＲＲＳの中にサブクローニングした（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、６９：３０１−３１５（１９８８））。ポリリンカーの５’末端におけるそのＮｒｕＩ（ＭＧ）とＥｃｏＲＩ（ＥＦ）との間のリーダー配列ＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦをエンコードする合成アダプター（２つの相補的オリゴヌクレオチドから成る）、およびＲＲＳ（レトロ調節配列）をポリリンカーの３’末端におけるそのＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に付加することによって、もとのベクターを修飾した。リーダー配列を前述したように精製助剤として使用したが、ＲＲＳを付加して組換えメッセージの安定性を増強し、これにより組換えタンパク質の収量を増加した（Ｓｋｏｇｌｕｎｄら、Ｇｅｎｅ、８８：１−５（１９９０））。最後に、インサート、この場合においてショート・ラグィード（ｓｈｏｒｔｒａｇｗｅｅｄ）の主要なアレルゲンをエンコードするＡｍｂａＩ．ＩｃＤＮＡ（Ｒａｆｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２６：１２２９−１２３６（１９９１））を、ＥｃｏＲＩとしてＨ_６リーダーとインフレームでＰｓｔＩ断片にサブクローニングした。

ダニのグループＩのアレルゲンを発現するために、ＡｍｂａＩ．ＩｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により切除し、そしてφＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩオーバーハング（１対の相補的オリゴヌクレオチドから構成された）をもつアダプターと置換した。これらのアダプター（第２ａ図）は、成熟ＤｅｒｐＩのＮＨ_２末端の最初の５アミノ酸、ＰｓｔＩ部位まで、および成熟ＤｅｒｆＩのＮＨ_２末端の最初の１０アミノ酸、ＨｐａＩ部位までをエンコードした。ベクターのＥｃｏＲＩ部位およびアレルゲンの中のφＥｃｏＲＩ部位を結合すると、ベクターの中のＥｃｏＲＩ部位は破壊され、中間の構成体ｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳおよびｐＴｒｃ９９ＡＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳとしてアダプターに対して内部でコードされたＥｃｏＲＩ部位が残った。Ｄｅｒ
ｐＩｃＤＮＡをＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳの中に挿入したが、ＤｅｒｆＩｃＤＮＡはＨｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてＨｐａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴｒｃ９９ＡＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳの中に挿入した。各構成体、ｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳおよびｐＴｒｃ９９ＡＡＨｉｓ_６５’ｐｌＲＲＳの５’末端の配列を、ジデオキシ連鎖停止法のＤＮＡ配列決定により、セクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ商標）ＩＩキット（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルス）を使用して評価した。Ｈ_６ｐｌおよびＨ_６ｆｌコーディングカセットをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化により切除し（ＮｈｅＩ部位はＲＲＳアダプターの３’末端に存在した）そしてＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化したｐＥＴ１１ｄの中に挿入した。これらの２つの構築体、ｐＥＴ１１ｄＨｉｓ_６ｐｌＲＲＳおよびｐＥＴ１１ｄＨｉｓ_６ｆｌＲＲＳを、組換えタンパク質の発現のためにコンピーテントＢＬ２１［ＤＥ３］細菌の中に
形質転換した。ＢＬ２１［ＤＥ３］は、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつ組換えファージλリソゲン、ＤＥ３、をｌａｃＵＶ５プロモーターの転写のコントロール下に含有する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘発され、次いでこれはｐＥＴベクターのＴ７ｇｎ１０プロモーターの３’でサブクローニングされた組換え遺伝子の高いレベルの発現に導く。

ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）からのグループＩＩのアレルゲンをエンコードするｃＤＮＡは、また、λｇｔ１１からのサブクローンとしてプラスミドの形態でワイネ・トマス（ＷａｙｎｅＴｈｏｍａｓ）博士から入手した（Ｃｈｕａら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．、９１：１１８−１２３（１９９０）；Ｔｒｕｄｉｎｇｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、２１：３３−３７（１９９１））。もとのＤｅｒｐＩＩｃＤＮＡは、イムロジック（ＩｍｍｕＬｏｇｉｃ）（Ｐｌａｏ
Ａｌｔｏ）のローランド・ブエロウ（ＲｏｌａｎｄＢｕｅｌｏｗ）博士により、Ｍ１３ＲＦプラスミドからｐＣＡおよびｐＧＥＸベクターの中にサブクローニングされた。トマス博士のグループは、ｐＧＥＸの中のサブクローンとしてＤｅｒｆＩＩｃＤＮＡを供給した。グループＩＩのｃＤＮＡを収容する両者のｐＧＥＸプラスミドを、同一の５’センス／３’アンチセンスのプライマーの対を使用するＰＣＲ増幅のために鋳型として使用した（第２ｂ図）。プライマーをデザインしてＥｃｏＲＩ部位（アミノ酸ＥＦをエンコードするＧＡＡＴＴＣ）を成熟グループＩＩタンパク質のＮＨ_２末端とインフレームで融合し、そしてグループＩＩコーディング領域の３’にＰｓｔＩ部位を配置した。３０Ｘのプログラム（９４℃１分／５５°１分３０秒／７２℃２分）をもつＭＪリサーチ・サーマル・コントローラー（ＲｅｓｅａｒｃｈＴｈｅｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）を、ＰＣＲ増幅のためのパーキン−エルマー・シータス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）の遺伝子増幅キットと組み合わせて使用した。ＰＣＲ生産物をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化し、そしてＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化したＭ１３ｍｐ１９ＲＦの中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列の分析を実施して、ＰＣＲ生産物の配列を評価した。正しいＭ１３ＲＦをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化し、それらのグループＩＩのｃＤＮＡインサートを単離し、そしてＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６ＡｍｂａＩ．１ＲＲＳ（これはグループＩＩのｃＤＮＡをラグウィードｃＤＮＡと交換する働きをする（第１図））の中にサブクローニングした。

ＤｅｒｆＩＩｃＤＮＡは、位置５４に配列の多形性を有した（すなわち、イソロイシンの代わりにスレオニンを有した）。この多形性を変更するために、ＤｅｒｆＩＩｃＤＮＡの中のＴ_５４残基の部位特異的突然変異誘発を、バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのムタ−遺伝子（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ）キットを使用して、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８−４９２（１９８５）の方法に基づいて実施した。Ｔ_５４ＤｅｒｆＩＩ
ｃＤＮＡをもつもとのＭ１３ｍｐ１９ＲＦをＣＪ２３６細菌（これはＤＮＡの複製の間にチミジンの代わりにウラシルの組み込みに耐える）の中に形質転換し、そして一本鎖ファージＤＮＡを鋳型として調製した。突然変異原性１７塩基対のプライマー（第２ｂ図）をファージ鋳型ＤＮＡにアニーリングした。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して、突然変異原性オリゴヌクレオチドによりプライムされた鋳型ＤＮＡをコピーし、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼはＤＮＡ鎖の中のギャップをシールする働きをする。反応をＭＶ１１９０細菌（これはＤＮＡからのウラシル残基の修正のための野生型であり、したがって突然変異誘発された（ウラシル以外を含有する）鎖を選択的に複製する）の中に移し、そして一本鎖ＤＮＡを組換え（白色）プラークから調製した。いくつかの組換え体をＤＮＡ配列の分析にかけ、そして正しいＩ_５４配列をもつＤｅｒｆＩＩｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６ＡｍｂａＩ．ＩＲ
ＲＳの中にサブクローニングした。

１つの従来の研究はｐＥＴ１１ｄベクターが、ほとんどの場合において、ｐＴｒｃ９９Ａベクターより高いレベルで組換えタンパク質を発現することができることを示したので、２つのダニのグループＩＩのｃＤＮＡをＨ_６融合タンパク質としてＴ７ベクターの中にサブクローニングした。ｐＴｒｃＡＨｉｓ_６ｆＩＩＲＲＳおよびｐＴｒｃ９９ＡＨｉｓ_６ｐＩＩＲＲＳをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、そしてｃＤＮＡインサートを単離し、そしてＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化したｐＥＴ１１ｄＨｉｓ_６ｐｌの中にサブクローニングした（第１図）。組換えプラスミドをＢＬ２１［ＤＥ３］細菌の中に発現のために形質転換した。ｐＥＴ１１ｄダニのアレルゲンの発現構築体を収容するＢＬ２１ＤＥ３宿主細菌を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＢＨＩ寒天プレート（３．７％ｗ／ｖ、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）脳心臓浸出液；１．５％ｗ／ｖのディフコ寒天）上に新しくストリーキングし、そして３７℃において一夜インキュベーションした。単一のコロニーを２ｍｌの２００μｇ／ｍｌのアンピシリン／ＢＨ１培地（３．７％ｗ／ｖ、ディフコ脳心臓浸出液）の中に接種し、そして濁るが、飽和しなくなるまで、３７℃において３００ｒｐｍで震盪した。次いで２ｍｌの培養物を１００ｍｌの２００μｇ／ｍｌのアンピシリン／ＢＨ１培地に添加し、濁るが、飽和しなくなるまで、３７℃において３００ｒｐｍで震盪し、その時点において培養物を１８×５００ｍｌ（９リットル）の２００μｇ／ｍｌのアンピシリン／ＢＨ１培地の中に分割し、そして３７℃において３００ｒｐｍで震盪した。培養物をＯＤ_５９５が１．０に到達したとき、組換え分子をＩＰＴＧを４００μＭに添加することによって誘発し、そして２時間の間続けた。

細菌を１０，０００×ｇで１５分間遠心することによって収獲し、そして１／２０の溶解緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１００ｍＭＮａＰＯ_４ｐＨ８、５０ｍＭＮａＣｌ）の中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベーションし、そして−７０℃において凍結させた。凍結した細菌を３７℃における急速融解により破壊し、次いで３０秒の間隔で２０秒間５回超音波処理した。超音波処理した試料を１５，０００×ｇで遠心して、可溶性の粒状細菌タンパク質を単離した。可溶性タンパク質を注ぎ出し、そして沈澱したタンパク質を６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭＮａＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０の中に再懸濁させた。この懸濁液を１５，０００×ｇで遠心し、そして上澄み液を除去し、１０ＮＮＨ_４ＯＨでｐＨ８．０に調節し、そして６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０の中で平衡化させたＮＴＡアガロースカラムに適用した。このカラムを、流出液のＯＤ_２８０がバックグラウンドに到達するまで、６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭＮａＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０の中で洗浄した。次いでカラムの緩衝液を８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０に切り替えた。平衡化後、８Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０ラムの中で、流出液のＯＤ_２８０がバックグラウンドに到達するまで、よりストリンジェント洗浄を実施した。次いで組換えダニタンパク質（Ｈ_６融合体として）を８Ｍ
尿素、１００ｍＭＮａＯＡｃ、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ４．５ラムの中で溶離し、そしてアリコートで集め、そのＯＤ_２８０のプロフィルをモニターした。タンパク質のピークをヒトＴ細胞の分析のために５００体積のＰＢＳの中に３回透析した。収量は１０〜７０ｍｇの組換えタンパク質／リットルの範囲であり、純度（デンシトメトリーの走査により決定して）は８０（ＤｅｒｆＩＩ）〜９５％の範囲であった。

組換えＤｅｒｆＩＩタンパク質アレルゲンをさらに精製するために、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを適用した。ほぼ１００ｍｇのＨｉｓ_６−ＤｅｒｆＩＩタンパク質を２０ｍＭＤＴＴ中で３６℃において３０分間還元し、次いでファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＰＲＯＲＰＣＨＲ１０／１０カラムに０．１％ｖ／ｖＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ中で適用した。このカラムの流速は１．５ｍｌ／分であり、勾配は４０分かけて０．１％Ｔ
ＦＡ中の０〜７０％のアセトニトリルであり、次いで０．１％ＴＦＡ中の７０〜１００％のアセトニトリルであった。Ｈｉｓ_６−ＤｅｒｆＩＩタンパク質は５４〜９６％のアセトニトリルの間で溶離された。２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて検出された画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動／デンシトメトリーの走査により純度について分析した。引き続いて、９５％より大きい純度のＨｉｓ_６−ＤｅｒｆＩＩタンパク質を有する画分をアレルゲンのヒトＴ細胞のマッピングのために利用した。調製用逆相ＨＰＬＣからの収率はほぼ６９％であった。

ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩアレルゲンにおけるヌクレオチド配列の多形性の決定
個々のダニの中の天然のアレルの変動のために、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩをコードする核酸配列の中に配列の多形性が存在することが期待された。異なるＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩクローンの配列決定の間に、いくつかのヌクレオチドおよび生ずるアミノ酸配列の多形性が発見された。アミノ酸配列の多形性は、第２２図、第２３図および第２４図に示されている。

＜実施例ＩＩＩ＞オーバーラップするペプチドの合成
第３図および第４図に示すＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒ
ｆＩＩのオーバーラップするペプチドを、標準のＦｍｏｃ／ｔＢｏｃ合成化学を使用して合成し、そして透析または逆相ＨＰＬＣにより精製した。合成されたペプチドのアミノ酸残基をペプチドの名称により括弧内示し、そしてアミノ酸配列（単一文字のコード）をペプチドの名称の次に示す。ペプチドの名称は図面を通じて一致する。ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩのオーバーラップするペプチドならびにＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩについて対応するアミノ酸残基数を有する、例えば、ＤＰＩおよびＤＦＩの両者のアレルゲンが、それぞれ、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのアレルゲンのアミノ酸残基１−２０を含有するような方法において、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質をオーバーラップするペプチドに分割した。ＤｅｒｐＩペプチドとＤｅｒｆＩペプチドとの間のアミノ酸位置における対応を決定する目的をもって実施してＤｅｒｐおよびＤｅｒｆのＴ細胞エピトープの交差反応性を最良性について試験し、こうして、ほこりダニに対して感受性の個体に投与したとき、ＤｅｒｐおよびＤｅｒｆの両者のアレルゲンに対する感受性を処置するであろうペプチドを決定した。オーバーラップするペプチドの設計において、Ｔ細胞の交差反応性のレベルにおいてグループＩおよびグループＩＩのアレルゲンの関係を考慮した。さらに、セリンプロテアーゼとしてのグループＩアレルゲンの機能を考慮し、そして他の既知のセリンプロテアーゼ、例えば、パパイン、アクチジンのアミノ酸配列を検査して、グループＩアレルゲン内の同様な保存されたおよび変動する領域を同定した。グループＩアレルゲン内に保存された領域は「共有された」Ｔ細胞エピトープを含有することが期待された。

＜実施例ＩＶ＞ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩタンパク質およびペプチドに対するダニアレルギー性患者の一次的Ｔ細胞の応答
末梢血液の単球（ＰＢＭＣ）をダニ−アレルギー性患者Ｒ．Ｂ．からの末梢血液の検体のフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）遠心により精製し、そして種々の抗原、すなわち、親和精製したＤｅｒｐＩ、親和精製したＤｅｒｐＩＩ、種々のＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩペプチドに対する応答における増殖についてアッセイした。アッセイのために、５×１０^４のＰＢＭＣを三重のマイルロウェル中の７日間３７℃において種々の濃度の抗原の存在下に、２００μｌの５％のヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。次いで、各ウェルに１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６時間の間供給した。組み込まれたカウントをガラス繊維のフィルター上に集め、そして液体シンチレーションの計数のために処理した。このアッセイの結果を表１に示す。ＣＰＭ±標準偏差を示す。各応答の刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、抗原に対する応答において
細胞により組み込まれた^３Ｈ−チミジンＣＰＭ／培地中のみの細胞により組み込まれた^３Ｈ−チミジンＣＰＭの比である。結果が示すように、患者はペプチドＤＰＩ−１、ＤＰ
Ｉ−３、ＤＰＩ−８、ＤＰＩ−１０、ＤＰＩ−５．２、ＤＰＩＩ−４およびＤＰＩＩ−９に対して少なくとも２．０のＳ．Ｉ．で応答する。こうして、これらのペプチドはこの特定のアレルギー性患者からのＴ細胞により認識されたＤｅｒｐＩまたはＤｅｒｐＩＩのＴ細胞エピトープを含有する。

＜実施例Ｖ＞ＤｅｒｐＩを使用するＴ細胞エピトープの研究
ダニのアレルギーの臨床的症状を示しそして家ほこりダニについて皮膚試験が陽性である、家ほこりダニ−アレルギー性患者からのヘパリン処理した末梢血液の６０ｍｌをフィコール−ヒパクー（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）遠心することによって、末梢血液の単球（ＰＢＭＣ）を精製した。

個体５４３からの１０^７のＰＢＭＣを、５％のプールしたヒトＡＢ血清を含有しそしてグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨＥＰＥＳ緩衝剤を補充した１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で、２０μｇ／ｍｌの精製した天然ＤｅｒｐＩ／ｍｌの存在下に３７℃において７日間培養した。次いで、生存能力のある細胞をフィコール−ヒパクー（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）遠心により精製し、そして５単位の組換えヒトＩＬ−２／ｍｌおよび５単位の組換えヒトＩＬ−４／ｍｌを含有するＲＰＭＩ−１６４０／５％ＡＢ血清中でさらに２週間培養した。次いで、休止Ｔ細胞を二次増殖アッセイにおいて試験して、種々の家ほこりダニのタンパク質およびペプチドに対するＴ細胞の応答を評価した。アッセイのために、２×１０^４の休止Ｔ細胞を２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０／５％ＡＢ血清中で３日間３７℃において、抗原提示細胞として２×１０^４のオートロガスエプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞（２０，０００ラド）の存在下に、種々の濃度の精製した天然ＤｅｒｐＩまたは合成ＤｅｒｐＩペプチドとともに試験した。次いで、各ウェルに１μＣｉのトリチウム化チミジンを１６時間の間供給した。組み込まれたカウントをガラス繊維のフィルター上に集め、そして液体シンチレーションのカウンターにかけた。培地単独は、陰性の対照として作用し、アレルゲンまたはペプチドを含有した。この実験の結果は、ＤＰＩ−１、ＤＰＩ−２、ＤＰＩ−４、ＤＰＩ−１１、ＤＰＩ−５、ＤＰＩ−１３、ＤＰＩ−１５、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−８、ＤＰ
Ｉ−９、ＤＰＩ−１６、ＤＰＩ−１０およびＤＰＩ−１７を包含する、ＤｅｒｐＩタンパク質から誘導されたいずれかのペプチドに対して、２．０のＳ．Ｉ．で、この患者は応答することを示す（データは示されていない）。

ある数の他の家ほこりダニのアレルギー性個体を使用して、前述の手順に従ったが、ただしａ）個々の場合において、ＩＬ−２およびＩＬ−４との培養時間を変化させた；ｂ）個々の場合において、Ｔ細胞を精製した天然（Ｎ）または組換え（Ｒ）のＤｅｒｐＩタンパク質を使用して２０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌにおいてプライムした；そしてｃ）個々の場合において、ｘ線照射した（３５００ラド）オートロガスＰＢＭＣを抗原提示細胞として二次増殖アッセイにおいて使用した。さらに、３つのペプチド（ＤＰＩ−１１（配列識別番号：１１７）、ＤＰＩ−１２（配列識別番号：１１８）、およびＤＰ
ＩＩ−３（配列識別番号：１１９））は、それらのアミノ酸配列の中の天然配列からのある数の保存的変化を含有した。３つの追加のペプチド（ＤＰＩ−１１．１（配列識別番号：１３）、ＤＰＩ−１２．１（配列識別番号：１４）およびＤＰＩＩ−３．１（配列識別番号：４３）は、天然配列との変化なしに合成された。もとのペプチド（すなわち、ＤＰＩ−１１、ＤＰＩ−１２およびＤＰＩＩ−３）を使用して、いくつかのＴ細胞の分析を実施した。追加のペプチド（すなわち、ＤＰＩ−１１．１、ＤＰＩ−１２．１およびＤＰＩＩ−３．１）を使用して下記のＴ細胞の分析を実施し、もとのペプチドと追加のペプチドとの間の陽性の応答の平均Ｓ．Ｉ．または百分率において有意の差は検出されなかった。こうして、両者のグループのペプチドからのデータをプールした。

個体がＤｅｒｐＩタンパク質およびＤｅｒｐＩから誘導された少なくとも１つのペプチドに対して２．０またはそれより大きいＳ．Ｉ．で応答した場合、個体の結果を陽性と考慮しそして使用した。３３の陽性の実験の要約を第５図に示す。組換えまたは天然のＤｅｒｐＩ刺激したＰＢＭＣでプライムした休止のＴ細胞系を、合成ＤｅｒｐＩペプチドに対する反応性について試験した。抗原の滴定における各ペプチドについての最大の応答を、Ｔ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）として表す。このＳ．Ｉ．は、ペプチドに対する応答において細胞により組み込まれた計数／分（ＣＰＭ）／培地中のみの細胞により組み込まれたＣＰＭである。バックグラウンドのレベルより大きいＳ．Ｉ．値は、ペプチドがＴ細胞エピトープを含有することを示す。しかしながら、２．０より大きいか、あるいはそれに等しい個体のＳ．Ｉ．値（バックグラウンドを越えた２倍またはそれより大きい応答）（ここにおいて「陽性」の結果と呼ぶ）のみを使用して、試験した患者または患者のグループについて各ペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数を計算した。ヒストグラム上の各バーの
上の括弧の中は、極限の孤立値の効果を最小とするために各ペプチドについての最大および最低の陽性の応答を捨てた後、計算した平均Ｔ細胞刺激指数である。Ｔ細胞刺激指数は、次の式により計算する：

（Ｔ細胞のＣＰＭ＋ＡＰＣ＋抗原）／（Ｔ細胞のＣＰＭ＋ＡＰＣ＋対照）

バーは患者のグループにおけるペプチドの応答の累積順位を表す。累積順位を決定するために、各個体において最高のＳ．Ｉ．をもつ５患者を決定し、そして下降する順序で数の順位に割り当て、５は最強の応答を表す。次いで、各ペプチドについての順位を患者のグループにおいて合計して、そのペプチドについての累積順位を決定する。各バーの上は、試験した患者のグループにおけるペプチドに対して少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ陽性の応答である。陽性の百分率および平均Ｔ細胞刺激指数が与えられると、各ペプチドについての陽性指数（Ｐ．Ｉ．）を計算することができる。各個体についてのＰ．Ｉ．は、そのペプチドに対して少なくとも２．０のＳ．Ｉ．で応答した家ほこりダニに対して感受性の個体の集団（例えば、好ましくは１５個体、より好ましくは少なくとも３０個体またはそれ以上）において、平均Ｓ．Ｉ．×個体の百分率により決定する（例えば、第５図においてＤＰＩ−１について、Ｐ．Ｉ．は約３４３（７３％×４．７）である）。したがって、Ｐ．Ｉ．はペプチドに対するＴ細胞の応答の強さおよび家ほこりダニに対して感受性の個体の集団においてあるペプチドに対するＴ細胞の応答の頻度の両者を表す。第５図が実証するように、ペプチドＤＰＩ−１、ＤＰＩ−２、ＤＰＩ−３、ＤＰＩ−４、ＤＰＩ−５、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−７．１、ＤＰＩ−８、ＤＰＩ−９、ＤＰＩ−１６、およびＤＰＩ−１０はこの患者のパネルにおいてＴ細胞の反応性の有意な領域を含有する。

＜実施例ＶＩ＞ＤｅｒｆＩを使用するＴ細胞エピトープの研究
実施例Ｖの実験に類似する実験を実施して、ＤｅｒｆＩタンパク質のＴ細胞−反応性の区域を決定した。例えば、家ほこりダニ−アレルギー性患者７８３からのＰＢＭＣを実施例Ｖに記載するように単離し、そして組換え精製ＤｅｒｆＩで２０μｇ／ｍｌにおいてｉｎｖｉｔｒｏで刺激した。抗原提示細胞としてｘ線照射した（３５００ラド）オートロガスＰＢＭＣを使用してＤｅｒｆＩを用いる増殖の結果は、この患者からのＴ細胞がペプチドＤＦＩ−８．１、ＤＦＩ−９、ＤＦＩ−６、ＤＦＩ−１０、ＤＦＩ−２．１、ＤＦＩ−３、ＤＦＩ−１１、ＤＦＩ−５、ＤＦＩ−１およびＤＦＩ−１７に対して応答することを示す（データは示されていない）。

前述の手順をある数の患者において実施したが、ただし個々の場合において、Ｔ細胞系を親和精製ＤｅｒｆＩで２０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌにおいてプライムし、そしてｘ線照射した（３５００ラド）オートロガスエプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を抗原提示細胞として使用した。１６の陽性実験の結果の要約を第６図に示す。データは実施例Ｖに記載するように分析した。データが示すように、ＤｅｒｆＩタンパク質の中のＴ細胞反応性の有意な区域はペプチドＤＦＩ−１、ＤＦＩ−２、ＤＦＩ−３、ＤＦＩ−４、ＤＦＩ−１１、ＤＦＩ−５、ＤＦＩ−６、ＤＦＩ−７、ＤＦＩ−１４、ＤＦＩ−１５、ＤＦＩ−８．１およびＤＦＩ−９の中に発見された。

＜実施例ＶＩＩ＞ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩのＴ細胞エピトープの交差反応性を示す研究
ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質は非常に相同性である（８１％の同一性）。したがって、実施例Ｖの実験に類似する実験を実施して、種々のＤｅｒｐＩペプチドおよび実質的に合致するＤｅｒｆＩＩペプチドでチャレンジしたときの、ＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞系のＴ細胞の応答を測定した。Ｔ細胞系は実施例に記載するようにプライムし、そして１組の実質的に合致するＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩペプチド（例え
ば、ＤＰＩ−１（ＤｅｒｐＩのアミノ酸残基１−２０）またはＤＦＩ−（ＤｅｒｆＩのアミノ酸残基１−２０））に対する応答について試験した。データは実施例Ｖに記載するように分析したが、ただし各ペプチドに対する最高および最低のＳ．Ｉ．値を平均Ｓ．Ｉ．の計算から省略した。ある数のこのような実験の要約を第７図に示す。１４の陽性の実験の結果は、ＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞が種々のグループのアレルゲン内で交差反応性を示すＤｅｒｆＩペプチドに応答することを示す。ＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞は、ペプチドＤＦＩ−１、ＤＦＩ−２、ＤＦＩ−３、。ＤＦＩ−４、ＤＦＩ−１１、ＤＦＩ−１２、ＤＦＩ−１５、ＤＦＩ−８、ＤＦＩ−９、ＤＦＩ−１５およびＤＦＩ−６に対して有意に応答する。ある患者において、ＤｅｒｆＩペプチドは対応するＤｅｒｐＩペプチドよりＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞のいっそう効力のある刺激因子であった。第８図は逆の実験の結果を示し、ここである数の患者からのＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＤｅｒｆＩタンパク質に対してプライムし、そして種々のＤｅｒｐＩペプチドおよび１組の実質的に合致するＤｅｒｆＩペプチドに対する応答について分析した。８つの陽性の実験の結果は、ＤｅｒｆＩプライムドＴ細胞がペプチドＤＰＩ−１、ＤＰＩ−３、ＤＰＩ−４、ＤＰＩ−１１／１１．１、ＤＰＩ−１４、ＤＰＩ−５、ＤＰＩ−１５、およびＤＰＩ−８に対して有意に応答することを示す。

＜実施例ＶＩＩＩ＞ＤｅｒｐＩＩを使用するＴ細胞エピトープの研究
実施例Ｖの実験に類似する実験を実施して、ＤｅｒｐＩＩタンパク質のＴ細胞−反応性の区域を決定した。例えば、家ほこりダニ−アレルギー性患者３４８からのＰＢＭＣを実施例Ｖに記載するように単離し、そして２０μｇ／ｍｌの組換え精製ＤｅｒｐＩＩでｉｎｖｉｔｒｏで刺激した。抗原提示細胞としてｘ線照射した（３５００ラド）エプスタイン−バーウイルス形質転換オートロガスＢ細胞を使用してＤｅｒｐＩＩを用いる増殖アッセイの結果は、この特定の患者がペプチドＤＰＩＩ−１、ＤＰＩＩ−７、ＤＰ
ＩＩ−８、ＤＰＩＩ−２、およびＤＰＩＩ−９に対してよく応答することを示す（データは示されていない）。

前述の手順をある数の患者において実施したが、ただし個々の場合において、Ｔ細胞系を組換えＤｅｒｐＩＩで２０μｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌにおいてプライミングし、そしてｘ線照射した（３５００ラド）オートロガスＰＢＭＣを抗原提示細胞として使用した。２６の陽性実験の結果の要約を第９図に示す。データは実施例Ｖに記載するように分析し、ただしペプチドの応答の順位付けした合計を分析して、３．２または１の値を３つの最高のＳ．Ｉ．の応答に対して割り当てた。この患者のパネルについてのＤｅｒｐＩＩタンパク質内の有意なＴ細胞の反応性の区域は、ＤＰＩＩ−１、ＤＰＩＩ−２、ＤＰＩＩ−３、ＤＰＩＩ−４、ＤＰＩＩ−７、ＤＰＩＩ−８およびＤＰＩＩ−９の中に発見された。

＜実施例ＩＸ＞ＤｅｒｆＩＩを使用するＴ細胞エピトープの研究
実施例Ｖの実験に類似する実験を実施して、ＤｅｒｆＩＩタンパク質のＴ細胞−反応性の区域を決定した。例えば、家ほこりダニ−アレルギー性患者３８４からのＰＢＭＣを実施例Ｖに記載するように単離し、そして精製した組換えＤｅｒｆＩＩでｉｎｖｉｔｒｏで刺激し、次いでＴ細胞系を抗原提示細胞としてｘ線照射した（２５，０００ラド）オートロガスエプスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞の存在下に種々のオーバーラッピングＤｅｒｆＩＩペプチドでチャレンジした。この増殖アッセイの結果は、この特定の患者からのＴ細胞がペプチドＤＦＩＩ−１、ＤＦＩＩ−２、ＤＦＩＩ−３．１、ＤＦＩＩ−４．５、ＤＦＩＩ−１５、ＤＦＩＩ−１６、およびＤＦＩＩ−１９．１に対してよく応答することを示す（データは示されていない）。

前述の手順を１０人の患者において実施したが、ただし個々の場合において、Ｔ細胞系
は患者のＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌの精製した天然ＤｅｒｆＩＩで刺激することによってプライムし、そして抗原提示細胞としてｘ線照射した（３５００ラド）オートロガスＰＢＭＣの存在下にアッセイした。１０の陽性実験の結果の要約を第１０図に示す。データは実施例ＩＸに記載するように分析したが、ただし各ペプチドに対する陽性の応答の最高および最低のＳ．Ｉ．値を計算から省略しなかった。データが示すように、ＤｅｒｆＩＩタンパク質の中のＴ細胞反応性の有意な区域は、ペプチドＤＦＩＩ−１、ＤＦＩＩ−２、ＤＦＩＩ−１３．１、ＤＦＩＩ−４．５、ＤＦＩＩ−１５、ＤＦＩＩ−１７、およびＤＦＩＩ−１９．１の中に発見された。

＜実施例Ｘ＞ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩのＴ細胞エピトープの交差反応性を示す研究
実施例ＶＩＩに記載する研究に類似する研究を実施して、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒ
ｆＩＩタンパク質のＴ細胞の交差反応性を決定した。ＤｅｒｆＩＩでプライミングしたＴ細胞を、種々のＤｅｒｆＩＩペプチドおよび１組の実質的に合致するＤｅｒｐＩＩペプチドで対抗した。１０人の患者の要約を第１１図に示す。結果が示すように、ＤｅｒｆＩＩプライムドＴ細胞は、ペプチドＤＰＩＩ−１、ＤＰＩＩ−３／３．１、ＤＰＩＩ−４、およびＤＰＩＩ−７に対して有意に応答する。第１２図は逆の実験の結果を示し、ここである数の患者からのＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＤｅｒｐＩＩタンパク質に対してプライムし、そして種々のＤｅｒｆＩＩペプチドに対する応答について分析した。２６の陽性の実験の結果は、ＤｅｒｐＩＩプライムドＴ細胞が、ペプチドＤＦ
ＩＩ−１、ＤＦＩＩ−４．５、ＤＦＩＩ−１５、ＤＦＩＩ−１７、ＤＦＩＩ−１８およびＤＦＩＩ−１９．１に対して有意に応答することを示す。

＜実施例ＸＩ＞優性のペプチドの合成
実施例Ｖ〜Ｘに記載する分析に基づいて、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩ、ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩ内のＴ細胞反応性の主要な区域を同定した。このような研究において、試験した患者のすべてはタンパク質アレルゲン（例えば、ＤｅｒｐＩ）およびタンパク質内のＴ細胞反応性の主要な区域から誘導された少なくとも１つのペプチドに対して応答した。主要なＴ細胞反応性の７つの領域（領域１、領域２、領域３、領域４、領域５、領域６ａおよび領域６ｂ）がＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質において同定された。これらの領域を次のように定義した：領域１、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基１−２８；領域２、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基３６−３８；領域３、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基７４−１０９；領域４、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基１１８−１３９；領域５、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基１４１−１６６；領域６ａ、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基１６１−１８５および領域６ｂ、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質のアミノ酸残基１７３−２０１。

同様に、主要なＴ細胞反応性の４つの領域（領域７、領域８、領域９、および領域１０）が同定された。これらの領域を次のように定義した：領域７、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質のアミノ酸残基１−２６；領域８、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒ
ｆＩＩタンパク質のアミノ酸残基３３−６７；領域９、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質のアミノ酸残基７９−１０４；および領域１０、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質のアミノ酸残基１０７−１２９。実施例Ｖ〜Ｘに記載するＴ細胞反応性に一部分に基づいて、ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドを選択し、そしてペプチドの５’または３’におけるアミノ酸残基の付加または欠失により修飾した。これらの選択したペプチドの設計において、オーバーラップするペプチドの順位付けた合計、ペプチドに対して少なくとも２．０のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドの潜在的に交差反応性、ペプチドの製造の困難
などを包含する種々の因子を考慮した。実施例Ｖ〜Ｘに記載するものに類似するＴ細胞の研究をこれらの選択したペプチドを使用して実施して、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質の領域１〜６ａおよびＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質の領域７〜１０内のＴ細胞反応性の主要な区域をより正確に定めた。

ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩ調製から誘導された選択したペプチドを使用するＴ細胞の研究の結果を、第１３図〜第１８ａ〜ｄ図に示す。実施例Ｖに記載する手順をＤｅｒｐＩに対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムしたある数の患者からのＴ細胞系を使用して実施し、次いでＤｅｒｐＩ配列から誘導された選択したペプチドに対する応答について分析した。第１３図に示す３３の陽性の実験の結果は、ＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞がペプチドＤＰＩ−２１．１、ＤＰＩ−２１．２、ＤＰＩ−２２．２、ＤＰＩ−２５．２、ＤＰＩ−２２．１、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩ−２３．２、ＤＰＩ−２６．１、およびＤＰＩ−２８．１の中に見いだされるペプチドに対して有意に応答することを示す。

同様に、実施例ＶＩに記載する手順をＤｅｒｆＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムした９人の患者からのＴ細胞系を使用して実施し、次いでそのタンパク質から誘導された選択したペプチドに対する応答について分析した。データを実施例ＶＩに記載するように分析した。第１４図に示す９人の患者の結果は、ＤｅｒｆＩからの選択したペプチドに対するＴ細胞の反応性を証明する。

他の実験において、ある数の患者からのＴ細胞系をＤｅｒｐＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライミングし、そしてＤｅｒｐＩタンパク質から誘導された選択したペプチドおよびＤｅｒｐＩタンパク質から誘導された１組の実質的に合致するペプチドに対する応答について分析した。３０の陽性の実験からのデータを実施例Ｖに記載するように分析した。第１５ａ図に示すように、ＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞は、ペプチドＤＦＩ−２１．１、ＤＦＩ−２１．２、ＤＦＩ−２３．１、ＤＦＩ−２２．２、ＤＦＩ−２２．３、ＤＦＩ−２２．４、ＤＦＩ−２３．２、ＤＦＩ−２５．１、ＤＦＩ−２６．１およびＤＦＩ−２７．１に対して有意に応答する。第１５ｂ図は第１５ａ図に示すデータのサブセットであり、そして順位付けした合計により分析したペプチドに対するＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞の応答を示す。第１５ｂ図が示すように、ＤＰＩ−２３．１はこの研究においてペプチドのこのグループの最高の順位付けした合計を有する。第１６ａ図は逆の実験の結果を示し、ここで９人の患者からのＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＤｅｒｆＩに対してプライムし、そして選択したＤｅｒｆＩおよび１組の実質的に合致するＤｅｒｐＩペプチドでチャレンジした。結果が示すように、９人の患者からのＤｅｒｆＩプライムドＴ細胞はＤｅｒｐＩからの選択したペプチドに対して応答する。第１６ａ図が示すように、ＤＦＩ−２２．１およびＤＦＩ−２５．１はペプチドのこのグループの最高の刺激指数を有する。第１６ｂ図は第１６ａ図に示すのと同一のデータのサブセットであり、そして好ましいＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐＩペプチドの応答を示す。第１６ｂ図が示すように、ＤＦＩ−２２．２はこの実験において好ましいペプチドのこのグループの最高の刺激指数を有する。

実施例ＶＩＩＩに記載する手順に従う他の実験において、ＤｅｒｐＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムしそしてＤｅｒｐＩＩ配列から誘導された選択したペプチドで対抗した２９人の患者の応答を分析した。第１７ａ図は、１人の患者からのＤｅｒｐＩＩプライムドＴ細胞がＤｅｒｐＩＩからの選択したペプチドに対して応答することを示す。第１７ｂ図は、第１７ａ図に示す実験に類似する実験からの結果を示し、ここで３０人の患者の組を使用しそして高いおよび低い値を平均から省略した。第１７ｂ図が示すように、ＤＰＩＩ−２０．６はこの研究において好ましいペプチドのこのグループの最高の順位付けした合計を有する。第１８ａ図は逆の実験を示し、ここで１人の患
者からのＴ細胞をＤｅｒｆＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そしてＤｅｒｐＩＩ配列から誘導された選択したペプチドで対抗した。第１８ａ図が示すように、１０人の患者からのＤｅｒｆＩＩプライムドＴ細胞はＤｅｒｐＩＩからの選択したペプチドに対して応答する。第１８ａ図に示すように、ＤＰＩＩ−２５は最高の刺激指数を有する。第１８ｂ図は第１８ａ図に示すのと同一のデータのサブセットであり、そして順位付けした合計により分析した好ましいＤｅｒｐＩＩペプチドに対する天然ＤｅｒｆＩＩプライムドＴ細胞系の応答を示す。第１８ｂ図に示すように、ＤＰＩＩ−２５．２はこの研究において好ましいペプチドの最高の刺激指数を有する。

＜実施例ＸＩＩ＞選択したグループＩおよびグループＩＩのエピトープの交差反応性を示す研究
ＤｅｒｆおよびＤｅｒｐからのグループＩのタンパク質を使用して事象でプライムした４人の合致する患者からのＴ細胞を使用して、実施例ＶＩＩに記載する研究に類似する研究を実施し、次いでＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩからの選択した好ましいペプチドに対する応答について分析した。第１８ｃ図の結果が示すように、ある数の選択した好ましいＤｅｒｐＩペプチドに対するＴ細胞の反応性は、それらのＤｅｒｆＩの片方およびその逆について本質的に同等であった。

第１８ｄ図は同様な研究の結果を示し、ここでＤｅｒｐおよびＤｅｒｆからのグループＩＩのタンパク質でｉｎｖｉｔｒｏでプライムした６人の合致する患者からのＴ細胞を使用し、次いで選択した好ましいＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩペプチドに対する応答について分析した。第１８ｃ図における結果と同様に、ＤｅｒｐＩＩのある数の選択した好ましいペプチドに対するＴ細胞の反応性は、それらのＤｅｒｆＩＩの片方およびその逆について本質的に同等であった。

＜実施例ＸＩＩＩ＞アレルゲンのタンパク質およびペプチドへのＩｇＥの直接結合のアッセイ
コーニングのアッセイプレート（＃２５８８２−９６）を第１９図、第２０図および第２１図に記載する５μｇ／ｍｌの各被覆の抗原で５０μｌ／１００ｍｌ／ウェルで被覆し、そして４℃において一夜インキュベーションした。被覆の抗原を除去し、そしてウェルを可能、３００μｌ／ウェル中の０．５％ゼラチンで室温において２時間ブロッキングした。プールしたヒト血漿（商用ダニ抽出物について皮膚陽性であった２０人の患者からの血漿試料の混合物）をＰＢＳ−ツイーン２０（ＰＢＳ＋０．０５％非イオン性洗浄剤ツイーン２０、Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）で系統的に希釈し。そして１００μｌ／ウェルで添加し、そして４℃において一夜インキュベーションした（血漿の希釈物を二重反復実験において試験した）。第２の抗体（ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＥ、１：１０００、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マリイランド州ガイサースバーグ）を１００μｌ／ウェルで室温において１時間かけて添加した。この溶液を取り出し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰＯ、１：１００００（ＳｏｕｔｈｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミントン）を１００μｌ／ウェルで室温において１時間かけて添加した（すべてのウェルをＰＢＳ−ツイーンで各インキュベーション工程の間に３回洗浄した）。ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質系（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を新しくマイスし（ｍｉｃｅｄ）、そして１００ｍｌ／ウェルで添加した。２〜５分間色を発生させた。１００ｍｌ／ウェルの１Ｍリン酸の添加により、反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍのフィルターを使用してマイクロプレートＩＬ３１０オートリーダー（ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、バーモント州ウィンオスキ）で読んだ。二重反復実験のウェルの吸収レベルを平均した。ＥＬＩＳＡアッセイのグラフにした結果（希釈の対数／吸収）を第１９ａ図〜第１９ｂ図、第２０ａ図〜第２０ｂ図および第２１ａ図〜第２１ｂ図に示す。これらの図面の凡例中の垂直に記載する被覆の抗原の
順序は、左から右の順序で、各ヒストグラムについて記載した被覆の抗原に相当する。

第１９ｂ図に示すＥＬＩＳＡアッセイの結果は、生化学的に精製したＤｅｒｐＩＩおよび組換えＤｅｒｐＩＩ（ｒＤｅｒｐＩＩ）の両者とヒトＩｇＥとのすぐれた結合を実証し、そしてＤｅｒｐＩＩペプチドへの検出可能な結合は存在しなかった。ペプチドおよびタンパク質のＤｅｒｐの組へのＩｇＥの結合（第２０ａ図および第２０ｂ図）は、Ｄｅｒｆの組と同一の反応性のパターンを示す。すなわち、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＩＩペプチドまたは組換えＤｅｒｆＩへの検出可能な結合は存在せず、生化学的に精製したＤｅｒｆＩおよび組換えおよび生化学的に精製したＤｅｒｆ１Ｉのみへの結合が存在した。両者の場合において、生化学的に精製した形態に対するより組換えＤｅｒｐＩＩまたはＤｅｒｆＩＩに対する結合はよりすぐれるように思われる。前述のＥＬＩＳＡアッセイのデータから誘導されるすべての結論は、他のアッセイの方法、ニトロセルロース紙上のドットブロットにより、同一の組の抗体および抗原の試薬を使用して共同研究された。

陽性の対照として使用した抗原調製物は、４つの主要な生化学的に精製したダニのアレルゲン（精製したダニのアレルゲンについての用語ＰＭＡ）の混合物であった；ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｆＩＩ、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩ。１００μｇの各タンパク質／ｍｍまたは４００μｇの合計のタンパク質／ｍｌの濃度で、ストックを発生させた。各被覆したＥＬＩＳＡプレート上に、この調製物を使用した。これらのＥＬＩＳＡアッセイからの結果を、第２１ａ図〜第２１ｈ図に示す。各プレート上の精製したまたは組換えのタンパク質またはＰＭＡ抗原調製物への明瞭な結合存在し、すぐれたＩｇＥの反応性を示す。しかしながら、ＰＭＡ抗原調製物は、最初の抗体溶液を添加しなかったバックグラウンドの希釈において示される高度の非特異的反応性を事実示す。この非特異的反応性は、ＰＭＡ抗原とビオチニル化第２抗体との間で起こり、そして抗原への特異的ＩｇＥ反応性を危うくしない。陽性の読みとして最高の血漿濃度でバックグラウンドの２倍の定量的値を使用すると、このアッセイ法によりスクリーニングした５６ペプチドのいずれの１つに対する検出可能なＩｇＥ反応性も存在しない。

本発明をその好ましい態様を参照して説明したが、他の態様は同一の結果を達成することができる。本発明に対する変化および変更は当業者にとって明らかである、そして本発明の真の精神および範囲に入るすべてのこのような変更および同等のものは添付する請求の範囲に包含されることを意図する。

ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）からのグループＩおよびグループＩＩのアレルゲンのサブクローニングおよび発現を示す。ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩの発現において使用するアダプターを示す。ＤｅｒｆＩＩおよびＤｅｒｐＩＩの増幅のためのプライマーおよびＤｅｒｆＩＩの突然変異誘発プライマーを示す。ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの種々のペプチドを示す。ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの種々のペプチドを示す。精製した天然（Ｎ）または組換え（Ｒ）のＤｅｒｐＩタンパク質に対して試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）でプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｐＩペプチドに対する応答について分析した、３３人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２の（Ｓ．Ｉ．）をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｆＩペプチドに対する応答について分析した、１６人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｐＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｐＩペプチドおよび実質的に合致するＤｅｒｆＩペプチドに対する応答について分析した、１４人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｆＩペプチドおよび実質的に合致するＤｅｒｆＩペプチドに対する応答について分析した、１４人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｐＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｐＩＩペプチドに対する応答について分析した、２９人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｆＩＩペプチドに対する応答について分析した、１０人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｐＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｐＩＩペプチドおよび実質的に合致するＤｅｒｆＩＩペプチドに対する応答について分析した、１０人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、種々のオーバーラップするＤｅｒｆＩＩペプチドおよび実質的に合致するＤｅｒｆＩＩペプチドに対する応答について分析した、２６人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｐＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、ＤｅｒｐＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、３３人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数および等級をつけたペプチドの応答の合計により、ＤｅｒｆＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、９人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｐＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率およびペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数により、ＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、３０人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率（各バーの上）、ペプチドについての陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数（各バーの上の括弧内）および等級をつけたペプチドの応答の合計により分析した、好ましいＤｅｒｐＩペプチドに対するＤｅｒｐＩプライムドＴ細胞の応答を示す、第１５ａ図に示す同一のデータから誘導されたグラフの表示である。ＤｅｒｆＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率およびペプチドについて少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ平均Ｔ細胞刺激指数により、ＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐＩタンパク質アレルゲンから誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、９人の患者からのＴ細胞系統の応答を描写するグラフの表示である。試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率およびペプチドについて少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ平均Ｔ細胞刺激指数により、好ましいＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｐＩペプチドに対するＤｅｒｆＩプライムドＴ細胞系統の応答を示す、第１６ａ図に示す同一のデータから誘導されたグラフの表示である。ＤｅｒｐＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答のＴ細胞刺激指数により、ＤｅｒｐＩＩタンパク質から誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、２９人の患者からのＴ細胞の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率（各バーの上）、平均Ｔ細胞刺激指数（各バーの上の括弧内）および等級をつけたペプチドの応答の合計（Ｘ軸）により、ＤｅｒｐＩＩタンパク質から誘導された選択したペプチドに対する応答について分析した、３０人の患者の応答を描写するグラフの表示である。ＤｅｒｆＩＩタンパク質に対してｉｎｖｉｔｒｏでプライムし、そして少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答のＴ細胞刺激指数により、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質から誘導された所望の長さの選択したペプチドに対する応答について分析した、１０人の患者からのＴ細胞の応答を描写するグラフの表示である。試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率（各バーの上）、平均Ｔ細胞刺激指数（各バーの上の括弧内）および等級をつけたペプチドの応答の合計（Ｘ軸）により分析した、好ましいＤｅｒｐＩＩタンパク質に対するＤｅｒｆＩＩプライムドＴ細胞系の応答を示す第１８ａ図に示す同一のデータから誘導されたグラフの表示である。ダニのグループＩのアレルゲンでｉｎｖｉｔｒｏプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率およびペプチドについて陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数により、好ましいＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｆＩペプチドに対する応答について分析した４人の合致した患者の応答を描写するグラフの表示である。ダニのグループＩＩのアレルゲンでｉｎｖｉｔｒｏプライムし、そして試験した個体内の少なくとも２のＳ．Ｉ．をもつ応答の百分率およびペプチドについて陽性の応答の平均Ｔ細胞刺激指数により、好ましいＤｅｒｐＩＩペプチドに対する応答について分析した６人の合致した患者の応答を描写するグラフの表示である。親和精製したおよび組換えのＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩタンパク質およびある種のＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩのオーバーラッピングペプチド質に対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。親和精製したおよび組換えのＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩタンパク質およびある種のＤｅｒｐＩおよびＤｅｒｐＩＩのオーバーラッピングペプチド質に対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。親和精製したおよび組換えのＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質およびある種のＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩのオーバーラッピングペプチド質に対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。親和精製したおよび組換えのＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩタンパク質およびある種のＤｅｒｆＩおよびＤｅｒｆＩＩのオーバーラッピングペプチド質に対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。生化学的に精製したダニのアレルゲン（ＰＭＡ）の混合物およびＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｆＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩＩから誘導されたペプチドに対するＩｇＥの直接結合アッセイの結果のグラフの表示である。ＤｅｒｐＩタンパク質における多形性を図解する５つのＤｅｒｐＩのクローン（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列の複合体の整列である。記号（−）を使用して、ＤｅｒｐＩのクローンのアミノ酸残基がその位置においてＤｅｒｐＩ（ａ）の対応するアミノ酸配列と同一であることを示す。これらのクローンのアミノ酸配列は、ＤｅｒｐＩにおいて有意の変動が存在しうることを示し、５つの多形性アミノ酸残基が５つの配列の中に見いだされる。ＤｅｒｐＩＩタンパク質における多形性を図解する３つのＤｅｒｐＩＩのクローン（ｃ）、（１）および（２）のアミノ酸配列の複合体の整列である。番号はＤｅｒｐＩＩ（ｃ）クローンの配列を意味する。記号（．）を使用して、ＤｅｒｐＩＩのクローンのアミノ酸残基がその位置においてＤｅｒｐＩＩ（ｃ）の対応するアミノ酸配列と同一であることを示す。ＤｅｒｆＩＩタンパク質における多形性を図解する６つのＤｅｒｆＩＩのクローン（すなわち、ｐＦＬ１、ｐＦＬ２、ＭＴ３、ＭＴ５、ＭＴ１８およびＭＴ１６）のアミノ酸配列の複合体の整列である。番号はＤｅｒｆＩＩｐＦＬ１クローンの配列を意味する。記号（．）を使用して、ＤｅｒｆＩＩのクローンのアミノ酸残基がその位置においてＤｅｒｆＩＩｐＦＬ１の対応するアミノ酸配列と同一であることを示す。ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンから誘導された種々の領域からなる、選択したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンから誘導された種々の領域からなる、選択したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ＤｅｒｐＩ、ＤｅｒｐＩＩおよびＤｅｒｆＩのタンパク質アレルゲンから誘導された種々の領域からなる、選択したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。本発明による修飾されたペプチドのアミノ酸配列を示す。

Claims

ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属のタンパク質アレルゲンのペプチド、ペプチドの部分、改変されたペプチドもしくは改変されたペプチドの部分の製造方法であって、製造すべきペプチドをコードするペプチド配列を有する核酸で形質転換された宿主細胞における組換えＤＮＡ技術により生産するか、または化学的に合成し、そして目的のペプチドを精製する工程を含んでなり、かつ、製造すべきペプチドが、（ａ）ＤＰＩ−１（ＳＥＱＩＤ ΝΟ：９）；ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）；ＤＰＩ−２１．２（ＳＥＱＩＤ ΝΟ：２８）；ＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤ ΝΟ：３３）；ＤΡ−Ι−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）；ＤＰ
Ｉ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）およびＤＰＩ−２６．１（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３７）；または
（ｂ）図３および４に示されるＤＰＩ−２１．２（ＳＥＱＩＤ ΝΟ：２８），ＤＰ
Ｉ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３），ＤＦＩ−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）およびＤＰＩ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７），ＤＰ ΙΙ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６），ＤＰＩＩ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰＩＩ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）
のいずれかから選ばれることを特徴とする、上記方法。
製造すべきペプチドが、ａ）ＤＰＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）；
ｂ）ＤＰＩ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）；
ｃ）ＤＰＩ−３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）；
ｄ）ＤＰＩ−４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）；
ｅ）ＤＰＩ−１１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）；
ｆ）ＤＰＩ−１２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）；
ｇ）ＤＰＩ−１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）；
ｈ）ＤＰＩ−１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）；
ｉ）ＤＰＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）；
Ｊ）ＤＰＩ−６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）；
ｋ）ＤＰＩ−７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）；
１）ＤＰＩ−８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）；
ｍ）ＤＰＩ−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）；
ｎ）ＤＰＩ−１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）；
ｏ）ＤＰＩ−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）；
ｐ）ＤＰＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）；
ｑ）ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）；
ｒ）ＤＰＩ−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）；
ｓ）ＤＰＩ−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）；
ｔ）ＤＰＩ−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）；
ｕ）ＤＰＩ−２２．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）；
ｖ）ＤＰＩ−２２．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）；
ｗ）ＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｘ）ＤＰＩ−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）；
ｙ）ＤＰＩ−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；
ａ’）ＤＰＩ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｂ’）ＤＰＩ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；
ｃ’）ＤＰＩ−２７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）；
ｄ’）ＤＰＩ−２８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）；
ｅ’）ＤＰＩ−２８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）；および
ｆ’）ＤＰＩ−５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んで成る、請求項１記載の方法。
製造すべきペプチドが、少なくとも２つの領域を含んで成り、各領域はダーマトファゴイデス属のタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、前記領域はダーマトファゴイデス属の同一もしくは異なるタンパク質アレルゲンから導き出され、前記領域はそれぞれ、
ａ）ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）；
ｂ）ＤＰ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）；
ｃ）ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）；
ｄ）ＤＰ Ι−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）；
ｅ）ＤＰ Ι−２２．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）；
ｆ）ＤＰ Ι−２２．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）；
ｇ）ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｈ）ＤＰ Ι−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）；
ｉ）ＤＰ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；
ｊ）ＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｋ）ＤＰ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；
１）ＤＰ Ι−２７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）；
ｍ）ＤＰ Ι−２８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）；
ｎ）ＤＰ Ι−２８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）；
ｏ）ＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）；
ｐ）ＤＦ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）；
ｑ）ＤＦＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｒ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）；
ｓ）ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
ｔ）ＤＦ Ι−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）；
ｕ）ＤＦ Ι−２２．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：９４）；
ｖ）ＤＦ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）；
ｗ）ＤＦ Ι−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９６）；
ｘ）ＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ｙ）ＤＦ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）；
ｚ）ＤＦ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）；
ａ’）ＤＦ Ι−２７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００）；
ｂ’）ＤＦ Ι−２８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）；
ｃ’）ＤＦ Ι−２８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）；
ｄ’）ＤＰＩＩ−２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）；
ｅ’）ＤＰ ΙΙ−２０．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）；
ｆ’）ＤＰ ΙΙ−２０．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）；
ｇ’）ＤＰ ΙΙ−２０．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）；
ｈ’）ＤＰ ΙΙ−２０．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）；
ｉ’）ＤＰ ΙΙ−２０．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）；
ｊ’）ＤＰ ΙΙ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；
ｋ’）ＤＰＩＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）；
１’）ＤＰＩＩ−１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）；
ｍ’）ＤＰＩＩ−１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）；
ｎ’）ＤＰＩＩ−２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）；
ｏ’）ＤＰＩＩ−２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）；
ｐ’）ＤＰＩＩ−２．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）；
ｑ’）ＤＰＩＩ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）；
ｒ’）ＤＰＩＩ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），
ｓ’）ＤＰＩＩ−２６（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）；
ｔ’）ＤＰ ΙΙ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）；
ｕ’）ＤＰＩＩ−２３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）；
ｖ’）ＤＰ ΙΙ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）；
ｗ’）ＤＰＩＩ−２４（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）；
ｘ’）ＤＰＩＩ−２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）；
ｙ’）ＤＰ ΙΙ−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）；
ｚ’）ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；
ａ”）ＤＦＩＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３）；
ｂ”）ＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）；
ｃ”）ＤＦＩＩ−１３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５）；
ｄ”）ＤＦ ΙΙ−３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６）；
ｅ”）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）；
ｆ”）ＤＦ ΙΙ−４．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８），
ｇ”）ＤＦＩＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）；
ｈ”）ＤＦＩＩ−１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０）；
ｉ”）ＤＦＩＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）；
ｊ”）ＤＦＩＩ−１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）；
ｋ”）ＤＦＩＩ−１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３）；
１”）ＤＦＩＩ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）；
ｍ”）ＤＦ ΙΙ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５）；および
ｎ”）ＤＦ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６）
から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んで成る、請求項１または２記載の方法。
請求項３に記載の方法であって、（ｉ）前記領域が図３および４に示される
ａ）ＤＰ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）；
ｂ）ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｃ）ＤＰ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；
ｄ）ＤＰ ΙΙ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；
ｅ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；
ｆ）ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；および
ｇ）ＤＦ Ι−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）；
から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んで成るか、あるいは
（ｉｉ）前記ペプチドが、
ａ）ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；
ｂ）ＤＰ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｃ）ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）；
ｄ）ＤＰ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｅ）ＤＰ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８），ＤＰＩ−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｆ）ＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｇ）ＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｈ）ＤＰ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９），ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｉ）ＤＰ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｊ）ＤＰ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９），ＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）とＤＰ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；
ｋ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）とＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
１）ＤＦ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０），ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）とＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ｍ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１），ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）とＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ｎ）ＤＦ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）とＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
ｏ）ＤＦ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２），ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）とＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ｐ）ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；
ｑ）ＤＦ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０），ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）とＤＦ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）；
ｒ）ＤＰ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）とＤＦＩ−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
ｓ）ＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９），ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３），ＤＰ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）とＤＦ Ι−１（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７２）；
ｔ）ＤＰ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９），ＤＰ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５），ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）とＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）；
ｕ）ＤＰＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９），ＤＰ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５），ＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）とＤＦＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｖ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）とＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；
ｗ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）とＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）とＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）；
ｘ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１），ＤＰＩＩ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９），ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）とＤＰ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｙ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１），ＤＰＩＩ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６），ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ｚ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１），ＤＰＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；
ａ’）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７１），ＤＰ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７），ＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）とＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）；
ｂ’）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３），ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱ
ＩＤＮｏ：７１），ＤＰＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）とＤＰ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）；
ｃ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）とＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）；
ｄ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）とＤＦ ΙΙ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）；
ｅ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７），ＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）とＤＦ ΙΙ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４），
ｆ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７），ＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）とＤＦ ΙΙ−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）；
ｇ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）とＤＦ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｈ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７），ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：６３）とＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；および
ｉ’）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７），ＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）とＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；
から選択される領域の組み合わせを含んで成るか、あるいは
（ｉｉｉ）前記ペプチドが
ＤＰＩ−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）；ＤＰＩ−２３．１（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３３）；ＤＰＩ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；ＤＰＩＩ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；ＤＰＩＩ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）とＤＦＩ−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）；
の領域の組み合わせを含んで成るか、あるいは
（ｉｖ）前記ペプチドがアミノ酸配列の特定の配列配置を持ち、前記アミノ酸配列の配置が、
ａ）図２５に示されるＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２５．２、ＤＦＩ−２２、ＤＰＩＩ−２０．６およびＤＰＩ−２１．２の配置；
ｂ）図２６に示されるＤＰＩＩ−２５．２、ＤＦＩ−２２．２、ＤＰＩ−２３．１、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩ−２１．２およびＤＰＩΙ−２０．６の配置；ならびに
ｃ）図２７に示されるＤＰＩＩ−２５．２、ＤＰＩ−２１．１、ＤＰＩ−２６．１、ＤＰＩＩ−２２、ＤＰＩＩ−２０．２およびＤＦＩ−２２．２の配置、
から選択される、上記方法。
製造すべきペプチドが、ａ）ＤＦＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）；
ｂ）ＤＦＩ−２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）；
ｃ）ＤＦ Ι−３（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）；
ｄ）ＤＦ Ι−４（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）；
ｅ）ＤＦ Ι−１１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）；
ｆ）ＤＦ Ι−１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）；
ｇ）ＤＦ Ι−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）；
ｈ）ＤＦＩ−１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）；
ｉ）ＤＦ Ι−１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）；
ｊ）ＤＦＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）；
ｋ）ＤＦ Ι−６（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）；
１）ＤＦ Ι−７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８３）；
ｍ）ＤＦＩ−８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：８４）；
ｎ）ＤＦ Ι−８（ＳＥＱＩＤＮＯ：８５）；
ｏ）ＤＦ Ι−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）；
ｐ）ＤＦＩ−１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：８７）；
ｑ）ＤＦ Ι−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：８８）；
ｒ）ＤＦＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８９）；
ｓ）ＤＦ Ι−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｔ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）；
ｕ）ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
ｖ）ＤＦ Ι−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）；
ｗ）ＤＦ Ι−２２．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：９４）；
ｘ）ＤＦ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）；
ｙ）ＤＦ Ι−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９６）；
ｚ）ＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ａ’）ＤＦ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）；
ｂ’）ＤＦ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）；
ｃ’）ＤＦ Ι−２７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００）；
ｄ’）ＤＦ Ι−２８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）；
ｅ’）ＤＦ Ι−２８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）；
ｆ’）ＤＰ ΙΙ−２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）；
ｇ’）ＤＰ ΙΙ−２０．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）；
ｈ’）ＤＰ ΙΙ−２０．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）；
ｉ’）ＤＰ ΙΙ−２０．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）；
ｊ’）ＤＰ ΙΙ−２０．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）；
ｋ’）ＤＰ ΙΙ−２０．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）；
１’）ＤＰ ΙΙ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；
ｍ’）ＤＰＩＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）；
ｏ’）ＤＰ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）；
ｐ’）ＤＰ ΙΙ−３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）；
ｑ’）ＤＰ ΙΙ−４（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４），
ｒ’）ＤＰ ΙΙ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）；
ｓ’）ＤＰ ΙΙ−６（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）；
ｔ’）ＤＰ ΙΙ−７（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）；
ｕ’）ＤＰ ΙΙ−８（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）；
ｖ’）ＤＰ ΙΙ−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）；
ｗ’）ＤＰ ΙΙ−１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）；
ｘ’）ＤＰ ΙΙ−１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）；
ｙ’）ＤＰ ΙΙ−２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）；
ｚ’）ＤＰ ΙΙ−２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）；
ａ”）ＤＰ ΙΙ−２．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）；
ｂ”）ＤＰ ΙΙ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）；
ｃ”）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；
ｄ”）ＤＰ ΙΙ−２６（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４），
ｅ”）ＤＰ ΙΙ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）；
ｆ”）ＤＰＩＩ−２３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６），
ｇ”）ＤＰ ΙΙ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）；
ｈ”）ＤＰＩＩ−２４（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）；
ｉ”）ＤＰＩＩ−２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）；
ｊ”）ＤＰ ΙΙ−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）；
ｋ”）ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；
ｌ”）ＤＦＩＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３）；
ｍ”）ＤＦＩＩ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）；
ｎ”）ＤＦＩＩ−１３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５）；
ｏ”）ＤＦ ΙΙ−３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６）；
ｐ”）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）；
ｑ”）ＤＦ ΙΙ−４．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８）；
ｒ”）ＤＦＩＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）；
ｓ”）ＤＦＩＩ−１６（ＳＥＱ１ＤＮＯ：１１０）；
ｔ”）ＤＦＩＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）；
ｕ”）ＤＦＩＩ−１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）；
ｖ”）ＤＦＩＩ−１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１ｌ３）；
ｗ”）ＤＦＩＩ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１ｌ４）；
ｘ”）ＤＦＩＩ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５）；および
ｙ”）ＤＦＩＩ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６）
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んで成る、請求項１記載の方法。
製造すべきペプチドが、ａ）ＤＦ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）；
ｂ）ＤＦＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｃ）ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＤＮＯ：９２）；
ｄ）ＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＤＮＯ：９７）；
ｅ）ＤＦ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）；
ｆ）ＤＦ Ι−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）；
ｇ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）；
ｈ）ＤＰＩＩ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）；
ｉ）ＤＰＩＩ−１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）；
ｊ）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；
ｋ）ＤＰ ΙΙ−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）；
１）ＤＰ ΙΙ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）；
ｍ）ＤＰ ΙΙ−２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）；
ｎ）ＤＰ ΙΙ−２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；
ο）ＤＰ ΙΙ−２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）；
ｐ）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）；
ｑ）ＤＦ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）；
ｒ）ＤＦＩＩ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）；
ｓ）ＤＦＩＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）；
ｔ）ＤＦＩＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）；
ｕ）ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；
ｖ）ＤＦＩ−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）
または
ａ）ＤＦ Ι−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）；
ｂ）ＤＦＩ−２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）；
ｃ）ＤＦ Ι−３（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）；
ｄ）ＤＦ Ι−４（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）；
ｅ）ＤＦ Ι−１１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）；
ｆ）ＤＦ Ι−１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）；
ｇ）ＤＦ Ι−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）；
ｈ）ＤＦＩ−１３（ＳＥＱＩＤＮＯ７９）；
ｉ）ＤＦ Ι−１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）；
ｊ）ＤＦＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ８１）；
ｋ）ＤＦ Ι−６（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）；
ｌ）ＤＦ Ι−７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８３）；
ｍ）ＤＦ Ι−８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：８４）：
ｎ）ＤＦ Ι−８（ＳＥＱＩＤＮＯ：８５）；
ｏ）ＤＦ Ι−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）；
ｐ）ＤＦ Ι−１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：８７）；
ｑ）ＤＦ Ι−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：８８）；
ｒ）ＤＦＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８９）；
ｓ）ＤＦＩ−２１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）；
ｔ）ＤＦ Ι−２１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）；
ｕ）ＤＦ Ι−２２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）；
ｖ）ＤＦ Ι−２２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９３）；
ｗ）ＤＦ Ι−２２．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：９４）；
ｘ）ＤＦ Ι−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９５）；
ｙ）ＤＦ Ι−２３．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９６）；
ｚ）ＤＦ Ι−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９７）；
ａ’）ＤＦ Ι−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：９８）；
ｂ’）ＤＦ Ι−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９９）；
ｃ’）ＤＦ Ι−２７．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１００）；
ｄ’）ＤＦ Ι−２８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１）；
ｅ’）ＤＦ Ι−２８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２）；
ｆ’）ＤＰ ΙΙ−２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）；
ｇ’）ＤＰＩＩ−２０．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）；
ｈ’）ＤＰ ΙΙ−２０．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）；
ｉ’）ＤＰ ΙΙ−２０．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）；
ｊ’）ＤＰ ΙΙ−２０．４（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）；
ｋ’）ＤＰ ΙΙ−２０．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）；
ｌ’）ＤＰＩＩ２０．６（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）；
ｍ’）ＤＰ ΙΙ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）；
ｏ’）ＤＰ ΙΙ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）；
ｐ’）ＤＰ ΙΙ−３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）；
ｑ’）ＤＰ ΙΙ−４（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）；
ｒ’）ＤＰ ΙΙ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）；
ｓ’）ＤＰ ΙΙ−６（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）；
ｔ’）ＤＰ ΙΙ−７（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）；
ｕ’）ＤＰ ΙΙ−８（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）；
ｖ’）ＤＰ ΙΙ−９（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）；
ｗ’）ＤＰＩＩ−１．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）；
ｘ’）ＤＰ ΙΙ−１．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）；
ｙ’）ＤＰ ΙΙ−２．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）：
ｚ’）ＤＰ ΙΙ−２．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０），
ａ”）ＤＰ ΙΙ−２．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）；
ｂ”）ＤＰ ΙΙ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）；
ｅ”）ＤＰ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）；
ｄ”）ＤＰ ΙΙ−２６（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）；
ｅ”）ＤＰ ΙΙ−２６．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）；
ｆ”）ＤＰ ΙΙ−２３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）；
ｇ”）ＤＰ ΙΙ−２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）；
ｈ”）ＤＰ ΙΙ−２４（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）；
ｉ”）ＤＰ ΙΙ−２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）；
ｊ”）ＤＰ ΙΙ−２５．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）；
ｋ”）ＤＰ ΙΙ−２５．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）；
ｌ”）ＤＦ ΙΙ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３）；
ｍ”）ＤＦＩＩ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４）；
ｎ”）ＤＦＩＩ−１３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５）；
ｏ”）ＤＦ ΙΙ−３．１（ＳＥＱＤＮＯ：１０６）；
ｐ”）ＤＦ ΙΙ−４．５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７）；
ｑ”）ＤＦ ΙΙ−４．３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８）；
ｒ”）ＤＦＩＩ−１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９）；
ｓ”）ＤＦＩＩ−１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０）；
ｔ”）ＤＦＩＩ−１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１）；
ｕ”）ＤＦＩＩ−１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２）；
ｖ”）ＤＦＩＩ−１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３）；
ｗ”）ＤＦＩＩ−１９．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４）；
ｘ”）ＤＦ ΙΙ−２１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５）；
ｙ”）ＤＦ ΙΙ−２２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６）．
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んで成る、請求項１記載の方法。