JP2008542252A - 同種真皮繊維芽細胞を用いる組織修復 - Google Patents

Abstract

本発明は、1つの局面では、同種の真皮繊維芽細胞の懸濁液の対象への注射を含む、対象における皮下又は真皮の組織の修復のための方法を提供する。同種細胞の懸濁液を注射することによって、本発明は、例えば、現在入手できる材料、例えば自家繊維芽細胞又はコラーゲン、の調製及び/又は使用を伴う不利益がなく、隣接組織の長期間の増大を提供する。本発明の第1の局面によれば、対象における皮下又は真皮の組織の増大のための方法であって、以下：(i) 同種真皮繊維芽細胞の懸濁液を提供し；及び(ii) 組織が増大されるように、皮下又は真皮の組織に隣接した組織に当該懸濁液の有効量を注射すること、を含む、前記方法を提供する。本方法は好ましくは美容的である。

Description

本発明は、特に、ヒト対象における真皮又は皮下の組織の容積を増大させる材料を注射することによる、皺を含む皮膚及び柔組織欠陥の修復に関する。

注射可能な材料が、皮膚及び柔組織欠陥、特に、顔の柔組織欠陥を修復するために広く使用されている（Homicz & Watson, 2004, Facial Plastic Surgery 20: 21-29を参照）。注射可能な増大によく反応する欠陥は、額の静的な顔の皺（rhytid）、眉間、口の周囲、及び側方周囲（目尻の皺）を含む。典型的な外科的方法を超える注射可能な材料の利点は、投与の容易さ、処置される対象に対する最小の疼痛及び最小の不快感を含む。処置は、事務所設定で行いことができ、それによってコストを削減できる。しかしながら、注射可能な材料は、一般的に、長時間に渡って再吸収され、所望の結果を達成するには、繰り返し適用が必要とされる。注射後の最初の72時間内に、処置部位は、一次的な紅斑、水腫、斑状出血及び硬化を示すことがある。超過敏反応も起こることがあり、その重度は、注射される材料及び対象の免疫系に依拠する。

真皮増大としての注射に使用される材料は、合成材料及び生物材料を含み、後者は、異種移植（ドナーと対象とが異なる種である）、自己移植（ドナーと対象とが同一の個体である）又は同種異系移植（ドナーと対象とが異なる個体であるが、同一の種である。同種移植（homograft）としても知られている）として分類される。

皮膚及び柔組織欠陥の修復のための合成材料の開発は、顔の皺及び落ち込んだ輪郭の向上のために、1900年初期のパラフィンの使用に遡ることができる。1950年代の精製液体シリコンの開発は、合成材料による組織増大において更なる興味を与えた。医療グレードの液体シリコンの注射は、通常の組織の柔軟なテクスチャを模倣するような方法として、組織を固めるための手段を提供した。しかしながら、注射可能なシリコンにはいくつかの問題、例えば、予測不可能な炎症反応、移動、はみ出し、潰瘍形成、シリコン肉芽腫の形成、及び更には、肉芽腫性肝炎、肺塞栓症及びシリコン肺炎の場合には臓器障害及び死亡、が存在した。世界中の様々な国でまだに使用されているが、FDAは、1991年に、違法な注射可能なシリコンの使用を宣言した。

合成材料は、その潜在的な寿命のため、組織増大に望ましいと考えられており、他のより信頼でき、かる望ましい合成材料も入手でき、又は開発されている。しかしながら、対象が美容的効果に満足しない場合、移植された材料に対して逆の組織反応が存在する場合、又は対象が流行の変化のためにその外観を変更したい場合には、寿命は、問題であることがある。2004年の時点において、いずれの注射可能な合成材料も、真皮増大について米国食品医薬品局（FDA）によって承認されなかった（Homicz & Watson, 2004, 前掲）。

最も広く使用されている真皮充填剤は、異種移植性生物材料であるウシコラーゲン（5%未満のIII型コラーゲンを含む、主にI型コラーゲン）である。商業製品は、精製された酵素-消化コラーゲンを含み、ザイダーム(Zyderm）及びザイプラスト（Zyplast）としてInamed Aesthetics（Santa Barbara, CA, USA）から入手することができる。ザイダームは、ウシコラーゲンのC-及びN-末端ペプチドの酵素的分解により処理されて取り出され、これは、ヒト対象において免疫原性であり、それによって、予備選別された非-反応性対象において使用され得るアテロコラーゲンと称される原料を生じる（米国特許第3,949,073号明細書; 同第4,424,208号明細書; 及び同第4,488,911号明細書を参照）。ザイダーム製品は、宿主による吸収のため、長時間に渡って、容積を喪失する傾向があることが報告されている。この問題を解決するために、ザイプラスト）と称されるグルタルアルデヒド架橋アテロコラーゲンが開発された（米国特許第4,582,640号明細書; 及び同第4,642,117号明細書参照）。しかしながら、研究者の中には、ザイプラストは、ザイダームに比べて高い持続性がなく又はほとんどないと報告している者もいる（Matti & Nicolle, 1990, Aesthetic Plastic Surgery 14: 227-234; Ozgentas他, 1994, Ann Plastic Surgery 33: 171）。

20年間の臨床試験に従って、そして証明された安全性及び信頼性の利点により、ウシコラーゲンは、組織増大の最も基準になるスタンダートとしてみなされている。ウシコラーゲンの不利益は、制限された効果期間、よって、多数の処置の必要性、及びアレルギー反応の可能性を含む。

ヒアルロン酸は、結合組織の天然型細胞外マトリックスに見出されるグルコサミノグリカン高分子である。この高分子は、繰り返しの二糖単位の鎖からなり、その疎水性構造に起因して、細胞外マトリックスに水を引き入れて、結合組織を膨張させる。ヒアルロン酸は、構造的には、様々な種類について同一であり、それによって宿主において抗原的な交差反応性の可能性を減少させるが、移植後に局所的な分解を受ける。Genzyme Biosurgeryによって開発されたハイラフォーム（Hylaform）及びQ-Med社（Uppsala, スエーデン）によって開発されたレスチラン(Restylane）を含む商業的に入手可能な製品は、rooster comb（ハイラフォーム）又は連鎖球菌の発酵プロセス由来のヒアルロン酸誘導体の架橋ゲルである。これらのヒアルロン酸誘導体への過敏症の発生は低いように思うが、対象は、依然としてアレルギー反応の危険性の状況にある。更に、ウシコラーゲンと同様に、ヒアルロン酸誘導体は、限定された効果の期間を提供する。

皮膚及び柔組織欠陥の修復のための自己移植に用いられてきた材料は、自家脂肪、自家真皮細胞外マトリックス抽出物（オートローゲン（Autologen））及び自家真皮繊維芽細胞（アイソラーゲン（Isolagen））を含む。1970年代に開発された脂肪吸引法は、後で対象の標的部位に注射して戻すことができる、対象からの脂肪組織（脂肪）を採取する有効な手段を提供した。自家脂肪移植は、アレルギー反応と生物非適合性の最小限の危険性という利点を有するが、対象におけるドナー部位を必要とし、皮膚及び柔組織欠陥を正確に容易に修復することが困難である、ことを意味する予測不可能な再吸収率を有する。

オートローゲン（Collagenesis社, Beverly, MA, USAによって開発された）は、対象の皮膚から単離された真皮細胞外マトリックスを含む。対象の皮膚は、一旦切り取られると、コラーゲン（I、III及びVI型）、エラスチン、フィブロネクチン及びグルコサミノグリカンを含む真皮マトリックス成分を単離するように処理される。これらの成分の懸濁液は、次いで、柔組織増大のために対象に注射されるために使用される。オートローゲンによる処置は、注射可能な懸濁液をつくるために対象の皮膚のかなりの量を必要とし、繰り返された注射は、一般的に、処置の美的効果を維持することが求められる。

米国特許第5,591,444号明細書は、自家真皮繊維芽細胞の懸濁液（Isolagen Technologies, Houston, TX, USAによって開発された「アイソラーゲン」）の、欠陥に隣接した真皮及び皮下の組織への注射によって、対象における皮下又は真皮組織の修復のための方法を記載する。当該方法は、対象から得られた標本由来の自家の培養された真皮繊維芽細胞の調製、及び対象への当該繊維芽細胞調製物のその後の投与を含む。処置の効果の寿命に関する初期の結果は、勇気付けるものであり、更なる利点は、注射された材料の自家性に起因するアレルギー反応及び生物非適合性の最小限の危険性を含む。主な不利益は、対象におけるドナー部位についての要件、培養された真皮繊維芽細胞の調製物におけるその後の消費及び時間遅延、並びに製品の保存できないことを含む。自家細胞の使用の更なる不利益は、当該細胞が培養された後に、当該細胞が特に長い生存期間（「保存期間」）を有することが明らかになっていない、ことである。例えば、米国特許第5,591,444号明細書に従う自家細胞は、培養期間の末期後の約8時間内に、ドナーの患者に移植される必要がある、と考えられている。このことは、培養された自家細胞及びドナー/患者が同時に同一の場所で入手できるように、処置の管理手配を整えなければならない、ことを意味する。

皮膚切除術を受ける準備ができていない対象は、同種の材料デルマローゲン（Dermalogen）（Collagenesis社）を使用することがある。これは、オートローゲンと同一の製品であるが、公認の組織バンクからのプールされたヒト死体臓器から得られる。デルマローゲンの美容的効果の期間がザイプラストよりもよいことが報告されているが、アレルギー反応の危険性が存在する。代わりの同種の製品である、キメトラ（Cymetra）（Life Cell社, Branchburg, NJ, USA）は、公認の組織バンクからのプールされたヒト死体臓器から得られる無細胞の凍結乾燥真皮グラフトであるオートローゲンの微粉化形態である。キメトラ組織増大の寿命は、不明である。デルマローゲン及びキメトラの両方について、プールされたヒト死体臓器源からの疾患の感染の危険性が存在する。

纏めると、上記の入手できる注射可能な材料は、隣接の真皮及び柔組織を増大する目的を全く満足するものではなく、成功的で信頼性のあるコスト-効率の良い材料についての研究が継続している。

創傷治癒の分野では、Morimoto他（2005; J. Surg. Res 125: 56-67）は、試料ギニーピッグの背中につくられた損傷の処置のための、ギニーピッグの自家又は同種の繊維芽細胞をで播種されたコラーゲンスポンジの移植を記載する。自家の繊維芽細胞で播種されたコラーゲンスポンジは、同種繊維芽細胞で播種されたコラーゲンスポンジに比べて、創傷治癒には著しく好ましいことが判った。

本発明は、1つの局面では、同種真皮繊維芽細胞の懸濁液の対象への投与を含む、対象における皮下又は真皮組織の修復の代替的かつ簡易化した方法を提供する。同種細胞の懸濁液を注射することによって、本発明は、例えば、調製に伴う不利益がなく、及び/又は現在入手できる材料を使用して、隣接組織の長期間の増大を提供する。

本発明の第1の局面によれば、対象における皮下又は真皮の組織の増大の方法であって、以下のステップ：
(i) 同種真皮繊維芽細胞の懸濁液を提供し；及び
(ii) 組織が増大されるように、皮下又は真皮組織に隣接した組織に当該懸濁液の有効量を注射すること、
を含む、前記方法を提供する。

本方法は、好ましくは美容的方法である。本方法は、好ましくは、長期間、効果を有する（例えば、4〜6ケ月又は1年超）。

本発明の代わりの局面では、同種真皮繊維芽細胞は、注射以外の手段によって皮下又は真皮の組織に隣接した組織に適用される。例えば、同種真皮繊維芽細胞の懸濁液、ゲル又はクロットは、典型的には、例えば表面を薄く削った真皮組織に適用することができる。

本発明の更なる局面は、添付のクレームに記載されている。

本発明によって修復され得る典型的な欠陥は、皺（rhytid）、妊娠線、陥没瘢痕、非-外傷性の皮膚陥没、尋常性座瘡由来の瘢痕、及び唇の発育不全を含む。本発明に従って注射又は適用される細胞は、同種細胞、好ましくは細胞培養系における継代によって増殖される細胞である。

好ましい実施態様では、移植された細胞は、ヒト新生児包皮から得られる細胞培養から得られる真皮繊維芽細胞である。新生児-由来の真皮繊維芽細胞は、実質的に非-免疫原性である。真皮繊維芽細胞が本発明に従って調製され得る他の起源は、乳房系性-由来組織、腹部形成-由来組織及び多指症（polydactylism）-由来組織を含む。

同種真皮繊維芽細胞の懸濁液は、1つの実施態様では、実質的に免疫原性タンパク質がない。

本発明は、部分的には、皮膚及び柔組織の欠陥の修復のための米国特許第5,591,444号明細書に記載された対象由来の自家繊維芽細胞を使用することは必須ではないが、驚くべきことに、同種細胞は、このような欠陥の修復を刺激するために使用することができる、という理解に基づいている。本発明の発見は、例えば、対象に移植される時に、自家細胞の効果と同種細胞の効果との間の、先行技術において明からかにされかつ知られた相違点の観点からは予想できない（Morimoto他, 2005, 前掲も参照されたい）。

同種細胞の使用は、米国特許第5,591,444号明細書で特定されている、注射前の数週間に対象から採取された生検標本を入手し、培養する必要性を未然に防ぐ。本発明の利点は、十分量の同種細胞を調製し、保存する能力を含み、対象の迅速な処置のために利用できる細胞を有する。

本発明は、培養中に増殖し得る任意の未分化間葉細胞を注射することによって実行することができる。好ましい実施態様では、真皮繊維芽細胞は容易に得られ、増殖することができ、真皮及び皮下の組織中に通常存在する細胞種の1つであるため、真皮繊維芽細胞が注射される。

マスターセルバンク（MCB）の構築のために、ヒト真皮繊維芽細胞（HDF）は、単一のヒト新生児包皮から単離される1実施態様にある。包皮は、30 mlの殺菌IPA（イソプロピルアルコール）（又は70%エタノール）で2回洗浄され、次いで成長培地で2回洗浄されて、輸送培地の痕跡を取り除く。洗浄された包皮は、機械的に小片に切断される。HDFは、コラゲナーゼB（Roche）を用いて37℃で一連の酵素的消化サイクルにより組織から単離され、次いで約2 x 10⁴細胞/cm²で播種され、DMEM/10 [ウシ血清（10% v/v）及びL-グルタミン（2 mM）を補充したダルベッコ改変イーグル培地]、又はFSFM [1-グルタミン（2mM）、アデニン、亜セレン酸、インシュリン、ヒドロキシコルチゾン、エタノールアミン、Ｏ-ホスホリルエタノールアミン、トランスフェリン、トリヨード-L-チロシン及び上皮成長因子（10 ng/ml）を補充したDMEM/Hams F12（3:1 v/v）]のいずれかで培養する。

3±1日度に、細胞形態及びコンフルエンスのレベルを光学顕微鏡を用いて評価した。成長培地を全ての培養容器から吸引し、次いで新鮮培地と交換した。HDFは、好適なコンフルエントに到達するまで培地中で維持する。

HDFは、0.25%トリプシン-EDTA（又は、[APF]無しの動物製品、例えばノーザイム（No-zyme）[JRH Biosciences]、TrypLE [Invitrogen]、HyQTase [Pervio]、Accutase [Innovative Cell Technologies]）を用いて継代培養して、培養容器から細胞を引き離し、成長培地でその後に中和する。細胞は、約500 x gでペレット化し、新鮮な成長培地中に再懸濁し、次いで2500細胞/cm²の濃度で播種する。

2継代の後、HDFを、0.25%トリプシン-EDTA（又はその大体物）を用いて採取して、培養容器から細胞を引き離し、成長培地でその後に中和する。細胞は、約500 x gでペレット化し、新鮮な成長培地中に再懸濁し、トリパンブルー色素排泄試験を用いて生存細胞の総数を計算する。細胞を10% DMSO（v/v）及び10%ウシ血清（v/v）を補充したDMEM中で3 x 10⁶細胞/mlで再懸濁し、殺菌2 mlクライオバイアル（1 ml細胞懸濁液/バイアル）に移す。バイアルは、変化率が制御されたフリーザーを用いて、1℃/分の割合で低温保存し、その後直ちに、液体窒素冷蔵庫中での保存に移す。

得られた継代3 MCBは、必要な試験が完了するまで隔離し、その後、MCBは使用のために適格とされる。

ワーキングセルバンク（WCB）の構築のために、（十分に試験されたMCB由来の）継代3 HDFの1バイアルは、37℃（±1℃）で急速に解凍される。次いで、細胞は、60 mlのDMEM:10（上記）を含む1つの三頭（triple）フラスコに播種した。

3±1日度に、細胞形態及びコンフルエンスのレベルを光学顕微鏡を用いて評価した。成長培地を全ての培養容器から吸引し、次いで新鮮培地と交換した。HDFは、好適なコンフルエントに到達するまで培地中で維持する。

播種後、7±1日度に、細胞を0.25%トリプシン-EDTA（又は上記のようなその代替物）を用いて継代溶媒し、1:10のスプリット比を達成する。2継代後に、細胞を0.25%トリプシン-EDTA（又は上記のようなその代替物）を用いて採取する。トリパンブルー色素排泄試験を用いて生存細胞の総数を計算する。その後、細胞を10% DMSO（v/v）及び10%ウシ血清（v/v）を補充したDMEM中で0.5〜1 x 10⁷細胞/mlの濃度で再懸濁し、殺菌2 mlクライオバイアルに移す。バイアルは、Thermo Formaの変化率が制御されたフリーザーを用いて、1℃/分の割合で低温保存し、その後直ちに、液体窒素冷蔵庫中での保存に移す。

得られた継代6 WCBは、必要な試験が完了するまで隔離し、その後、WCBは製品の製造における使用のために放出される。

本発明に従って、上記の好ましい実施態様に記載されたものとは異なる継代数でヒト真皮繊維芽細胞を使用することも可能である。後の継代数（later passage numbers）は、より多量の細胞を有するが、細胞生存及び有効性は、継代数の増加と共に減少することがある。

ヒト新生児包皮-由来の繊維芽細胞懸濁液（「ICX-RHY」）の製造のために、p6ワーキングセルバンクの1以上のバイアルを37℃（±1℃）で解凍し、2500細胞/cm²の濃度で組織培養容器に播種する。10%ガンマ照射ウシ血清（v/v）及びグルタミン（2 mM）を補充したDMEMを用いて、細胞を好適な濃度が得られるまで継代する。次いで、0.25%トリプシン-EDTA（又は上記のその代替物）を用いて、細胞を組織培養フラスコから除き、（血清無しの）FSFM（又は代わりに、リン酸緩衝生理食塩水PBS又は生理食塩水）で何度も洗浄する。次いで、細胞を等張生理食塩水又はその代わりの輸送培地の好適な量で注射用に懸濁する。

適用（例えば、注射用）のための細胞（例えば、注射用）は、以下：
(i) 等張の生理食塩水溶液；
(ii) 血清無しの培地、例えばDMEM/F12（3:1 v/v）又はFSFM；
(iii) 血清-含有培養培地、例えばDMEM/10、又は血清（例えば、ウシ血清）を補充した(ii)の培地；
(iv) フィブリノゲン又はフィブリンを含む溶液（例えば、0.1〜20 mg/mlの最終濃度）；
(v) アスコルビン酸塩及び/又はトロンビンを含む溶液；
(vi) コラーゲン及び/又はヒアルロン酸を含む溶液；並びに
(vii) ハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）FRS、
の1以上の輸送培地で懸濁することができる。

ハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）（登録商標Mark BioLife Solutions社）は、Owega、NY13827のBioLife Solutions社により製造される保存培地である（www.BioLifeSolutions.com）。

ハイポサーモゾル（登録商標）FRSの成分を表1に示す。

自家真皮繊維芽細胞を用いて、米国特許第5,591,444号明細書の方法の不利益は、増大効果がゆっくり進行し、ある期間、例えば数週間の間、患者に気付かれないことがある、点であることを発見した。

本発明の利点は、ハイポサーモゾル（登録商標）に懸濁された同種真皮繊維芽細胞の注射が最初の投与の1又は2週間内に明白な増大効果を生じ得ることである。治療の数回の投与は、完全な効果を達成するためには必要であり、又は望ましいことがある。例えば、治療レジメは、各約1〜2週間毎に、約3回の注射を含むことがある。

細胞が懸濁されている生理食塩水又は輸送培地の量は、実施者が注射するのを除く繊維芽細胞数、治療される欠陥の大きさ及び数、並びに治療の結果を得る対象の希望の緊急性のような因子に依拠する。実施者は、従って、より大量の生理食塩水又は培地中に細胞を懸濁し、従って、必要ならば、各注射部位により少ない細胞を注射することができる。

例えば、本発明によれば、10⁴〜10⁸、又は10⁶〜10⁸、好ましくは約1〜5 x 10⁷、例えば1 x 10⁷又は4 x 10⁷、の繊維芽細胞が注射される。例えば、本発明によれば、約1 ml容の懸濁液が注射される、0.8 ml容を使用することもできる。

商業的に入手可能な製品ハイポサーモゾル（登録商標）、特にハイポサーモゾル（登録商標）FRSは、患者に投与する前に、生存条件で、培養された細胞を維持する点で有用である。

培養された繊維芽細胞は、高い代謝活性の状態にあり、高いエネルギー要求を有する。通常の条件下では、当該繊維芽細胞は、アポトーシス、特に、比較的高い細胞濃度で培地中に懸濁されたときに、を受ける傾向があるかもしれない。ハイポサーモゾル（登録商標）中の細胞の懸濁液は、細胞の生存を維持し、当該培地無しの場合よりも長期間生存させる、ようである。更に、培地中の細胞の生存集団の冷却は、生存を延ばすと期待されるのに対し；冷却しながらの、培養された繊維芽細胞と共にハイポサーモゾル（登録商標）の使用は、予想外の有利な保持効果を提供するようであり；このことは、製品の延ばされた「保存期間」のという重要な利益をもたらす。

本発明の更なる局面として、注射前の期間に、冷却されたハイポサーモゾル（登録商標）に注射用の細胞を懸濁することが有利であり得る。例えば、細胞は、約2℃〜約8℃で少なくとも1時間、冷却されたハイポサーモゾル（登録商標）での調整のために懸濁することができる。次に、調整された細胞は、使用まで冷却して維持することができるか、又は使用前の保存前に温めることができる。ハイポサーモゾル（登録商標）での冷却調整期間は、材料が実質的に温められる場合でさえ、継続できる保存の利益を提供するようである。調整のための冷却されていない（すなわち、室温）ハイポサーモゾル（登録商標）の使用は、望ましくない。例えば、本発明のこの局面に従って処置された細胞は、約10日間、約2℃〜約8℃で、保存し、生存し続けることができる。

本発明の細胞懸濁液は、当業者がザイダーム及びザイプラスト）を使用するために現在採用している同一の技術を用いて真皮欠陥を処置するために使用することができる。細胞懸濁液は、上記の利点を有するアテロコラーゲン溶液の代わりに使用することができる。隣接した真皮及び皮下の組織を増大するための注射可能な材料の使用に関する代表的な教示は、外科手術の文献に見出される（Gonzales, 1992, Aesthetic Plastic Surgery 16: 231-234; Nicolle, 1985, Aesthetic Plastic Surgery 9: 159-162; 及びPieyre, 1985, Aesthetic Plastic Surgery 9: 153-154を参照; これらはその全体が参考として本明細書に援用される）。

細かい表面的な顔の皺の処置は、本発明の1つの実施態様であるが、以下のように実行することができる。処置される部位は、アルコールで洗浄され、張った表面を与えるために延ばされる。シリンジを細胞懸濁液で満たし、注射用の30 ga.針を装着する。針は、できるだけ外科的に皮膚部位に挿入され；傾斜の方向は重要でない。皮内注射は、少し青ざめるまで軽い圧力によってなされる。複数の連続した注射がなされる。

他の実施態様では、唇の形成不全を処置するために輪筋組織に、又は深い皮下欠陥を処置するために皮下組織内に注射液（injectate）を置くことができる。

処置される標的部位及び/又は細胞懸濁液の粘性に依拠して、30 ga.より太い又は狭い針を使用することができる。

代わりの実施態様では、大きな面積のニキビの跡は、中度又は深い真皮のレベルまでの真皮削り術によって処置することができる。繊維芽細胞-含有懸濁液又は繊維芽細胞-含有ゲルもしくは繊維芽細胞-含有クロット（例えば、本明細書に参考としてその全体が援用される米国特許第5,591,444号明細書のセクション4.2に従って調製される）は、擦傷された真皮表面を覆うように形つくられ、懸濁液、ゲル又はクロットの繊維芽細胞播種面が擦傷された真皮表面に並べられるように適用される。次いで、適用された懸濁液、ゲル又はクロットは、包帯、ゼロホルム（Xeroform）、アダプティック（Adaptic）又は任意の非密封性の包帯で覆われる。

本発明は、本発明の個々の局面の単なる例証として意図された記載された特定の実施態様によって範囲を限定されるものではなく、機能的に等価な方法及び成分は、本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示された及び記載された態様に加えて、本発明の様々な修飾が、先の記載から当業者には明らかになるであろう。このような修飾は、添付のクレームの範囲内にある意図である。引用された全ての文献は、本明細書によって参考として援用される。

Claims (21)

1. 対象における皮下又は真皮の組織の増大方法であって、以下のステップ：
   (i) 同種真皮繊維芽細胞の懸濁液を提供し；及び
   (ii) 皮下又は真皮の組織が増大されるように、当該懸濁液の有効量を、皮下又は真皮の組織に隣接した（subadjacent）組織に注射すること、
   を含む、前記方法。
2. 美容的である、請求項１記載の方法。
3. 隣接した（subadjacent）皮下又は真皮の組織の増大によって改善を受ける欠陥を特定するステップを更に含む、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記繊維芽細胞が継代される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記欠陥が、皺（rhytid）、妊娠線、陥没瘢痕、非-外傷性の皮膚陥没、又は唇の発育不全である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記懸濁液が、注射剤を形成するための有効量でフィブリンを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記フィブリンが、0.1〜20 mg/mlの最終濃度にある、請求項５記載の方法。
8. 前記フィブリンがヒト性である、請求項６又は７記載の方法。
9. 前記懸濁液が、コラーゲン及び/又はヒアルロン酸を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 以下のステップ：
    a) 対象に対する同種源から真皮生検を得；
    b) 含脂肪細胞、ケラチン生成細胞及び細胞外マトリックスが実質的にない真皮繊維芽細胞を提供できるように、0.5%〜20%の非-ヒト懸濁血清を含む培養培地において、当該真皮生検から真皮繊維芽細胞を継代し；
    c) インキュベートされた繊維芽細胞の懸濁液を形成すること、
    を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記真皮生検がヒト新生児包皮由来から得られる、請求項１０記載の方法。
12. 前記懸濁液が、繊維芽細胞を抜き取り、及び/又はタンパク質分解酵素及び/又はノーザイム（No-zyme）のような動物産物のない代替物に繊維芽細胞を曝露することにより形成される、請求項１０又は１１記載の方法。
13. 前記対象がヒトである、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 10⁴〜10⁸、例えば10⁶〜10⁸、好ましくは約1〜5x10⁷、例えば1x 10⁷又は4x10⁷の繊維芽細胞が注射される、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. 約1 ml容の懸濁液が注射される、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. 前記細胞が、ハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）FRS（バイオソリューシャン社の登録された商標）である保存培地中に懸濁される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 前記繊維芽細胞が、少なくとも1時間、約2℃〜約8℃の温度で保存培地中に懸濁される、請求項１６記載の方法。
18. a) 前記繊維芽細胞がハイポサーモゾル（登録商標）保存培地中に懸濁され；及び
    b) 約1 x10⁷又は4 x10⁷の繊維芽細胞が、約1 mlの懸濁液で注射される、
    請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. 皮下又は真皮の組織欠陥の治療における、同種真皮繊維芽細胞、場合によりハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）FRS（バイオソリューシャン社の登録された商標）である保存培地を含む、の使用。
20. 皮下又は真皮の組織欠陥の美容的処置のための医薬の製造における、同種真皮繊維芽細胞、場合によりハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）FRS（バイオソリューシャン社の登録された商標）である保存培地を含む、の使用。
21. ハイポサーモゾル（登録商標）、好ましくはハイポサーモゾル（登録商標）FRS（バイオソリューシャン社の登録された商標）である保存培地中に同種真皮繊維芽細胞の懸濁液を含む、対象における皮下又は真皮の組織の増大ための組成物。