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JP2008507252A - Ｃ−ｍｅｔ二量体化及び活性化を阻害するための方法と組成物 - Google Patents

Ｃ−ｍｅｔ二量体化及び活性化を阻害するための方法と組成物 Download PDF

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ダイネリ エム． ウィックラマシンゲ，
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Genentech Inc
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Abstract

本発明は、特にｃ-ｍｅｔ二量体化及び／又はｃ-ｍｅｔ多量体化を混乱させるｃ-ｍｅｔアンタゴニストを使用した、ｃ-ｍｅｔへのリガンドの結合を調節することによる、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を調節する方法及び組成物を提供する。

Description

(関連出願)
この出願は、２００３年１２月１１日に出願された仮出願第６０／５２８９０９号の優先権享受を主張し、米国特許法施行規則第１．５３条(ｂ)(１)に基づき出願された非仮出願であり、基礎出願の内容の全体を出典明示によりここに援用する。
(技術分野)
本発明は、一般的に、分子生物学及び成長因子調節の分野に関する。特に本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のモジュレーター及び該モジュレーターの使用に関する。
(背景)
ＨＧＦは、いくつかの種々な細胞型において、分裂促進、細胞遊走促進及び形態形成活性を有する、間充織誘導性多指向性因子である。ＨＧＦ効果は特定のチロシンキナーゼ、ｃ-ｍｅｔにより媒介され、異常なＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔが多様な腫瘍で頻繁に観察される。例えば、Maulikら、「サイトカインと成長因子の概説(Cytokine & Growth Factor Reviews)」(2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova及びZbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867を参照のこと。ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節は、腫瘍の進行と転移に関連している。例えば、Trusolino及びComoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照のこと。
ＨＧＦはＭｅｔレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞外ドメインに結合し、多様な生物学的プロセス、例えば細胞散乱、増殖及び生存を調節している。ＨＧＦ-Ｍｅｔシグナル伝達は、特に筋肉前駆細胞の遊走における正常な胚発生、及び肝臓及び神経系の発生に必須である(Bladtら, 1995; Hamanoueら, 1996; Mainaら, 1996; Schmidtら, 1995; Ueharaら, 1995)。Ｍｅｔ及びＨＧＦノックアウトマウスの発生表現型は、ＨＧＦがＭｅｔレセプターに対する同族リガンドであることを、かなり類似して示唆している(Schmidtら, 1995; Ueharaら, 1995)。また、ＨＧＦ-Ｍｅｔは肝臓再生、血管新生、及び創傷治癒における役割も担っている(Bussolinoら, 1992; Matsumoto及びNakamura, 1993; Nusratら, 1994)。Ｍｅｔレセプター前駆体は、ジスルフィド結合により結合している膜貫通βサブユニットと細胞外αサブユニットにおいて、タンパク質分解性開裂を被る(Tempestら, 1988)。βサブユニットは細胞質キナーゼドメインを含み、アダプタータンパク質が結合し、シグナル伝達が開始されるＣ末端にて、多基質ドッキング部位を包含する(Bardelliら, 1997; Nguyenら, 1997; Pelicciら, 1995; Ponzettoら, 1994; Weidnerら, 1996)。ＨＧＦの結合において、Ｍｅｔの活性化により、チロシンのリン酸化、及びそれぞれＧａｂ１及びＧｒｂ２／Ｓｏｓ媒介性ＰＩ３-キナーゼ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化を通した下流シグナル伝達に至り、細胞運動性及び増殖が促進される(Furgeら, 2000; Hartmannら, 1994; Ponzettoら, 1996; Royal及びPark, 1995)。
Ｍｅｔは、発癌物質処理された骨肉腫株化細胞において形質転換することが示されている(Cooperら, 1984; Parkら, 1986)。Ｍｅｔの過剰発現又は遺伝子-増幅が種々のヒトの癌で観察されている。例えば、Ｍｅｔタンパク質は直腸結腸癌では少なくとも５倍、過剰発現しており、肝転移においては遺伝子-増幅されることが報告されている(Di Renzoら, 1995; Liuら, 1992)。また、Ｍｅｔタンパク質は、口腔扁平上皮癌、肝細胞癌、腎細胞癌、乳癌、及び肺癌においても過剰発現していることが報告されている(Jinら, 1997; Morelloら, 2001; Nataliら, 1996; Oliveroら, 1996; Suzukiら, 1994)。さらに、ｍＲＮＡの過剰発現は、肝細胞癌、胃癌、及び直腸結腸癌において観察されている(Boixら, 1994; Kuniyasuら, 1993; Liuら, 1992)。
Ｍｅｔのキナーゼドメインにおけるいくつかの変異は、レセプターの構造的活性化に至る腎乳頭癌腫に見出されている(Oliveroら, 1999; Schmidtら, 1997; Schmidtら, 1999)。これらの活性化変異により、構造的なＭｅｔチロシンリン酸化が付与され、結果としてＭＡＰＫ活性化、病巣形成、及び腫瘍形成に帰する(Jeffersら, 1997)。さらに、これらの変異により、細胞の運動性及び浸潤が高められる(Giordanoら, 2000; Lorenzatoら, 2002)。形質転換した細胞におけるＨＧＦ-依存性Ｍｅｔ活性化は、増加した運動性、散乱性及び遊走を媒介し、最終的に浸潤癌の成長及び転移に至る(Jeffersら, 1996; Meinersら, 1998)。
Ｍｅｔは、レセプターの活性化、形質転換、及び浸潤を促進させる他のタンパク質と相互作用することが示されている。新生細胞において、Ｍｅｔは、α６β４インテグリン、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)成分に対するレセプター、例えばラミニンと相互作用し、ＨＧＦ-依存性浸潤性増殖を促進させることが報告されている(Trusolinoら, 2001)。さらに、Ｍｅｔの細胞外ドメインは、いくつかのセマフォリンファミリー、プレキシン(plexin)Ｂ１と相互作用し、浸潤性増殖を高めることが示されている(Giordanoら, 2002)。さらに、腫瘍形成及び転移に関連しているＣＤ４４ｖ６も、Ｍｅｔ及びＨＧＦと複合体を形成し、Ｍｅｔレセプターの活性化に帰することが報告されている(Orian-Rousseauら, 2002)。
Ｍｅｔは、Ｒｏｎ及びＳｅａに含まれるレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫｓ)のサブファミリーのメンバーである(Maulikら, 2002)。Ｍｅｔの細胞外ドメイン構造の予測では、セマフォリン及びプレキシンと、共通の相同性を有すると示唆されている。ＭｅｔのＮ末端には、全てのセマフォリン類及びプレキシン類に保存されている約５００のアミノ酸のＳｅｍａドメインが含まれる。セマフォリン類とプレキシン類は、神経発生における役割について記載されている、分泌及び膜結合性タンパク質の大きなファミリーに属している(Van Vactor及びLorenz, 1999)。しかしながら、さらに近年、セマフォリンの過剰発現は腫瘍の浸潤及び転移に相関している。プレキシン類、セマフォリン類及びインテグリン類に見出されているシステイン-リッチのＰＳＩドメイン(Ｍｅｔ関連配列ドメインとも称される)は、Ｓｅｍａドメインに隣接し、プレキシン類及び転写因子に見出されている免疫グロブリン様領域である４つのＩＰＴ繰り返しが続く。近年の研究では、Ｍｅｔ ＳｅｍａドメインがＨＧＦとヘパリンの結合に十分であることが示唆されている(Gherardiら, 2003)。
Ｍｅｔキナーゼドメインの役割は詳細に調査されているが、Ｍｅｔの細胞ドメインの特徴付けは不十分である。ＨＧＦがＭｅｔの細胞外ドメインに結合し、結果としてレセプターの活性化に帰することは知られているが、レセプターの二量体化に寄与していたとしても、サブドメイン(類)については明らかになっていない。それにもかかわらず、Ｍｅｔ細胞外ドメイン内のサブドメインが、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の活性化に対して寄与しているならば、その説明では、標的とする治療のための設計、例えば特に、Ｍｅｔレセプターそれ自身の機能における異常に関与した臨床的シナリオにおいて、かなり有利であるとことは明らかである。
特許出願及び刊行物を含む、ここで引用した全ての文献は、出典明示によりその全体がここに援用される。
(発明の開示)
本発明は、部分的には、肝細胞増殖因子のレセプター、ｃ-ｍｅｔの二量体化が、重要で有利な治療標的として提供される生物学的／細胞プロセスであるという実証に基づいている。ここでは、このプロセスの混乱により、癌等の多くの病状における細胞増殖調節不全に関連した細胞シグナル伝達経路の活性化が、効果的に阻害されることが実証された。さらに本発明は、ｃ-ｍｅｔタンパク質内の全てではないがある種のドメインが、効果的なｃ-ｍｅｔ二量体化、よってＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の活性化において主要な役割を担っているか、及び／又はこれに必要であるという発見に基づいている。また本発明は、ｃ-ｍｅｔの細胞外タンパク質における特定のドメインへのＨＧＦの結合に干渉することに基づく組成物と方法を提供する。ｃ-ｍｅｔに結合する同族リガンド又はｃ-ｍｅｔ二量体化に必要なｃ-ｍｅｔの特異的タンパク質を同定することにより、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路の異常な又は所望しないシグナル伝達に関連した病態に対する予防的及び／又は治療的アプローチの設計におけるさらなる微調整のための、独特で有利な標的が提供される。従って、本発明は、ｃ-ｍｅｔリガンド結合、ｃ-ｍｅｔ二量体化、活性化、及びＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達に関連した他の生物学的／生理学的活性の調節を含む、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路の調節に関連した方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
一態様では、本発明はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を混乱させる、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを提供する。例えば、本発明はｃ-ｍｅｔ二量体化を混乱させるｃ-ｍｅｔアンタゴニストを提供する。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストはｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの二量体化機能(すなわち、効果的なレセプター二量体化に機能させるＳｅｍａドメインの能力)を混乱させる。一例では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインのｃ-ｍｅｔ二量体化をもたらす能力に干渉する。直接的又は間接的に干渉することができる。例えば、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストはｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン内部の配列に結合し、よって該結合ドメインとその結合パートナー(例えば他のｃ-ｍｅｔ分子)との相互作用が阻害され得る。他の例では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニストはｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン内部ではない配列に結合してよいが、該結合の結果、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインのその結合パートナー(例えば他のｃ-ｍｅｔ分子)と相互作用する能力は混乱する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔ二量体化が混乱するようにｃ-ｍｅｔ(例えば細胞外ドメイン)に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔ二量体化をもたらすｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの能力が混乱するように、ｃ-ｍｅｔに結合する。例えば、一実施態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ分子への結合時に、該分子の二量体化を阻害するアンタゴニストを提供する。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの配列に特異的に結合する。
一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ホモ二量体化を含むｃ-ｍｅｔの二量体化を混乱させる。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ヘテロ二量体化(すなわち、非-ｃ-ｍｅｔ分子とのｃ-ｍｅｔ二量体化)を含むｃ-ｍｅｔ二量体化を混乱させる。
いくつかの例では、ｃ-ｍｅｔへのリガンド(例えばＨＧＦ)の結合に干渉しないｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有することが有利であり得る。従って、いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔにおけるリガンド(例えばＨＧＦ)結合部位に結合しない。他の実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔへのリガンド(例えばＨＧＦ)結合を実質的に阻害しない。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔへの結合において、リガンド(例えばＨＧＦ)と実質的に競合しない。一例では、本発明のアンタゴニストは、一又は複数の他のアンタゴニストとの結合に使用可能で、ここでアンタゴニストはＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ軸内における種々のプロセス及び／又は機能を標的にする。よって、一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、他のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産生されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片が結合するエピトープとは異なる、ｃ-ｍｅｔ上のエピトープに結合する。他の実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産生されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片とは異なる(すなわちそれではない)。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産生される抗体のｃ-ｍｅｔ結合配列を含まない。
いくつかの例においては、ｃ-ｍｅｔ二量体化及びリガンド結合の双方を混乱させるｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有することが有利であり得る。例えば、本発明のアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔへの結合に対して、ＨＧＦと競合する能力をさらに含み得る。
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの一実施態様では、ｃ-ｍｅｔへアンタゴニストが結合すると、ＨＧＦによるｃ-ｍｅｔの活性化が阻害される。本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの一実施態様では、細胞中でｃ-ｍｅｔにアンタゴニストが結合すると、細胞の増殖、散乱、形態形成及び／又は運動性が阻害される。
一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン又はその変異体の少なくとも一部を含有するペプチドを含む。一例では、本発明のアンタゴニストは、ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)(例えば、ｃ-ｍｅｔの２６９-２７３残基)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)(例えば、ｃ-ｍｅｔの３００-３０８残基)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)(例えば、ｃ-ｍｅｔの３５０-３５７残基)及びＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)(例えば、ｃ-ｍｅｔの３８１-３８８残基)からなる群から選択される、少なくとも一の配列を含有するペプチドを含む。他の例では、本発明のアンタゴニストは、ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)及びＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)からなる群から選択される少なくとも一の配列から本質的になるペプチドを含む。一実施態様では、前記ペプチドは、配列ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)を含む。一実施態様では、前記ペプチドは、本質的にＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)からなる。一実施態様では、前記ペプチドは、配列ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)を含む。一実施態様では、前記ペプチドは、本質的にＬＤＡＱＴ(配列番号：１)からなる。一実施態様では、前記ペプチドは、配列ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)を含む。一実施態様では、前記ペプチドは、本質的にＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)からなる。一実施態様では、前記ペプチドは、配列ＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)を含む。一実施態様では、前記ペプチドは、本質的にＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)からなる。いくつかの実施態様では、ペプチドは、配列ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)及び／又はＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似したアミノ酸配列を有する変異体であり、ここで変異体はｃ-ｍｅｔ分子と複合体を形成する能力を保持している。いくつかの実施態様では、これらのペプチドは、それらの阻害及び／又は治療効果を高める(例えば、親和性を向上、薬物動態特性(例えば、半減期、安定性、クリアランス等)を改善、被験者に対する毒性を低下させる)修飾を含む。このような修飾には、例えばグリコシル化、ペグ化、自然に生じたものではないが機能的に等価なアミノ酸での置換、結合基を含む修飾等が含まれる。適切な修飾は当該技術でよく知られており、さらに必要に応じて、経験的に決定することができる。
いくつかの実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、小分子(例えば有機分子)、ペプチド(例えばオリゴペプチド)、抗体、抗体断片、アプタマー、オリゴヌクレオチド(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)、又はそれらを組み合わせたものであるか、又はそれらを含む。
いくつかの実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、ここで記載された本発明のスクリーニング又は同定方法により得られる。
他の態様では、本発明はｃ-ｍｅｔアンタゴニストをスクリーニング又は同定するための方法を提供する。一例では、前記方法は、ｃ-ｍｅｔを発現する細胞と候補物質とを接触させることを含み、それにより、該候補物質の存在によって、該細胞内部におけるｃ-ｍｅｔの二量体化及び／又は活性化が阻害されれば(任意の多様な基準及び方法、そのいくつかはここで記載されたものにより評価される)、物質はｃ-ｍｅｔアンタゴニストであることが示される。他の例では、前記方法は、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの少なくとも一部を有する標的分子と候補物質とを接触させることを含み、それにより、該標的分子と特異的に結合する物質が、(ｃ-ｍｅｔアンタゴニストとして)選択される。いくつかの実施態様では、本発明のスクリーニング方法は、ｃ-ｍｅｔを発現する細胞と選択された物質とを接触させ、ここで、細胞におけるｃ-ｍｅｔ二量体化の阻害を評価(例えばここで、該細胞におけるｃ-ｍｅｔの二量体化度合いを検出又は定量化)することを含む。ｃ-ｍｅｔ二量体化の阻害は、当該技術で公知であり、また当該技術で公知の任意の多様な、さらにそのいくつかがここで詳細に記載されている基準に基づく種々の方法で評価することができる。例えば、ｃ-ｍｅｔ二量体化の阻害は、ｃ-ｍｅｔ活性化量の低下により表され、例えば細胞内におけるｃ-ｍｅｔ関連細胞シグナル伝達量でも示され得る。細胞シグナル伝達は、当該技術で公知であり、そのいくつかがここで記載されている多様な基準に基づく、種々の方法により評価することができる。例えば、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路における細胞シグナル伝達の発生は、シグナル伝達経路での標的分子のリン酸化における、生物学的な変化の形態で表される。よって、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路における、一又は複数の公知のリン酸化標的に関連したタンパク質リン酸化の量を測定することができる。このようなリン酸化標的の例には、ｃ-ｍｅｔそれ自身、及びミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(ＭＡＰＫ)が含まれる。
一態様では、本発明は、一又は複数の本発明のアンタゴニストと担体を含有する組成物を提供する。一実施態様では、担体は製薬的に許容可能なものである。
一態様では、本発明は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)である又はこれを含有するｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体又はその断片である又はこれらを含有するｃ-ｍｅｔアンタゴニストをコードする。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含有するベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含有する宿主細胞を提供する。ベクターは任意のタイプ、例えば組換えベクター、特に発現ベクターであってよい。多様な宿主細胞の任意のものを使用することができる。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞等の哺乳動物細胞である。
一態様では、本発明は、本発明のアンタゴニストの作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(又はその断片)である又はこれらを含有するｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法を提供するものであり、ここで該方法は、該抗体(又はその断片)をコードする本発明の組換えベクターを適切な宿主細胞で発現させ、該抗体を回収することを含む。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)である又はこれを含有するｃ-ｍｅｔアンタゴニストの作製方法を提供するものであり、該方法は、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)をコードする本発明の組換えベクターを適切な宿主細胞で発現させ、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を回収することを含む。
一態様では、本発明は、容器、及び容器に収容される組成物を含む製造品を提供するものであり、ここで該組成物は一又は複数の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様では、アンタゴニストを含有する組成物は、いくつかの実施態様では製薬的に許容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、本発明の製造品は、患者に組成物(例えばアンタゴニスト)を投与するための指示書をさらに含む。
一態様では、本発明は、一又は複数の本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを含有する組成物を収容する第１容器；及びバッファーを収容する第２容器を具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファーは製薬的に許容可能である。一実施態様では、アンタゴニストを含有する組成物は、いくつかの実施態様では製薬的に許容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、キットは、患者に組成物(例えばアンタゴニスト)を投与するための指示書をさらに含む。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストの使用を提供する。ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、抗体、抗体断片、小分子(例えば有機分子)、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)、核酸(例えばオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド)、アプタマー、又はそれらの組み合わせを含む、ここで記載された任意の形態にすることができる。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、病気、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫(例えば自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患の治療及び／又は予防的処置のための医薬の調製における、本発明のキットの使用を提供する。
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の調節不全に関連した病気を調節するのに有用な方法及び組成物を提供する。ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、例えば細胞増殖及び血管新生を含む、複数の生物学的及び生理学的機能に関与している。よって、一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔの細胞外部分のサブドメインの機能を調節する物質／分子を患者に投与し、よって、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達を調節する方法を提供する。一実施態様では、サブドメインはｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの全て又は少なくとも一部を含む。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法を提供するものであり、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト有効量と、細胞又は組織とを接触させることを含み、よってｃ-ｍｅｔ活性化に関連した細胞増殖が阻害される。
一態様では、本発明は、患者のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関連した病態を処置する方法を提供するものであり、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有効量、患者に投与することを含み、よって該病態は処置される。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供するもので、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストと該細胞とを接触させることを含み、よって該細胞の増殖が阻害される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的処置する方法を提供するもので、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有効量、該哺乳動物に投与することを含み、それにより、該哺乳動物が効果的に処置される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖又はその双方の増加した発現又は活性に関連した細胞増殖性疾患を処置又は防止するための方法を提供するもので、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有効量、患者に投与することを含み、それにより、該細胞増殖性疾患が効果的に治療又は防止される。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は細胞増殖を阻害する方法を提供するもので、ここで該細胞増殖は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有効量、該細胞と接触させることを含み、それにより、該細胞の増殖が阻害される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法において、該腫瘍の増殖は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニストを有効量、該細胞と接触させることを含み、それにより、該腫瘍が効果的に処置される。一実施態様では、細胞は種々の細胞により発現されるＨＧＦにより(例えばパラクリン作用を介して)接触させられる。
本発明の方法は、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全に関連した細胞及び／又は組織の、任意の適切な病理状態に影響を与えるように使用することができる。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭癌細胞(例えば甲状腺)、大腸癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉腫細胞、腎癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、aprostate癌細胞、胃癌細胞、頭部及び頸部の扁平上皮癌細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、及び白血病細胞からなる群から選択することができる。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は、過剰増殖性及び／又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法の標的細胞は形成異常細胞である。さらなる他の実施態様では、本発明の方法の標的細胞は転移細胞である。
本発明の方法は、付加的な処置工程をさらに含む。例えば一実施態様では、方法は、放射線処置及び／又は化学療法剤に、標的細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)を暴露させる工程をさらに含む。
ここで記載したように、ｃ-ｍｅｔ活性化は重要な生物学的プロセスであり、その調節不全により、多数の病態に至る。従って、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞(例えば癌細胞)とは、同じ組織起源の正常な細胞と比較して、ｃ-ｍｅｔの活性度が高められているものである。一実施態様では、本発明の方法は、標的細胞に死をもたらす。例えば、本発明のアゴニストと接触すると、結果としてｃ-ｍｅｔ経路を介したシグナル伝達に対して細胞不能になり、結果として細胞死又は細胞増殖の阻害がなされる。
ｃ-ｍｅｔ活性化(ひいてはシグナル伝達)の調節不全は、例えばＨＧＦ(ｃ-ｍｅｔの同族リガンド)及び／又はｃ-ｍｅｔそれ自身の過剰発現を含む、いくつかの細胞変化に起因する。従って、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、細胞をターゲティングすることを含み、ここで、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方は、同じ組織起源の正常な細胞と比較して、前記細胞(例えば癌細胞)によって、より豊富に発現している。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は、オートクリン又はパラクリン方式等において、種々の供給源からのＨＧＦにより調節することができる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞は、種々の細胞内部で及び／又は細胞により発現した肝細胞増殖因子に接触／結合している(例えばパラクリン作用を介する)。前記種々の細胞は、標的細胞に対して同一又は異なる組織起源のものであってよい。一実施態様では、標的細胞は、標的細胞それ自身により発現したＨＧＦに接触／結合している(例えばオートクリン作用／ループを介する)。さらにｃ-ｍｅｔ活性化及び／又はシグナル伝達は、リガンドと無関係に生じ得る。よって、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞におけるｃ-ｍｅｔ活性化は、リガンドと無関係に生じる。
(発明の実施形態)
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の調節不全に関連した病態を処置及び／又は防止するための、該軸に干渉する方法を提供する。本発明は、リガンド結合及び／又はｃ-ｍｅｔレセプター二量体化(ひいてはｃ-ｍｅｔ活性化)に必要であり、ここで示されたｃ-ｍｅｔ内部におけるサブドメイン／サブ配列の解明の少なくとも一部に基づく。さらに本発明は、本発明の方法に有用な組成物、キット及び製造品を提供する。
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細を、ここで提供する。
(一般的技術)
本発明の実施では、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲に入る分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学での一般的な技術が使用される。このような技術は、文献、例えば 「分子クローニング：研究室用マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、(Sambrookら, 1989); 「オリゴヌクレオチドの合成(Oligonucleotide Synthesis)」 (M. J. Gait編, 1984); 「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」 (R. I. Freshney編, 1987); 「酵素学における方法(Methods in Enzymology)」(Academic Press, Inc.); 「分子生物学における現代のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」 (F. M. Ausubelら編, 1987、定期的に更新);「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応(PCR: The Polymerase Chain Reaction)」(Mullisら編, 1994); 「分子クローニングの解説書(A Practical Guide to Molecular Cloning)」(Perbal Bernard V., 1988)において十分に説明されている。
(定義)
ペプチド(例えば、ＶＤＷＶＣＦＲＤＬＧＣＤＷＥＬ、ＬＤＡＱＴ、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ、ＫＰＤＳＡＥＰＭ、ＮＶＲＣＬＱＨＦ)又はポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが以下の表Ａに与えられている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表Ａに示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表Ａに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。
特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
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ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送可能な核酸分子を称することを意図している。ベクターの一タイプは、付加的なＤＮＡセグメントが結合していてもよい、環状の二重鎖ＤＮＡループと称される「プラスミド」である。他のタイプのベクターはファージベクターである。さらに他のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合していてもよいウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖可能である(例えば、複製の細菌起源を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されると、宿主細胞のゲノムに結合可能で、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作的に結合している遺伝子の発現に指向可能である。ここでは、このようなベクターは「組換え発現ベクター」(又は単に、「組換えベクター」)と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態をしている。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、最も一般的には、プラスミドがベクターの形態で使用される場合に、交換可能に使用され得る。
ここで交換可能に使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを称し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。もし存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識と結合することによりさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、類似体による自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性結合(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダーゼ、カルバマート等)及び荷電性結合(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、介入物を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されてもよく、もしくは固体状又は半固体状支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャッピング基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該技術で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオチド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基で置き換えてもよい。これらの代替の結合基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ.sub.２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ.sub.２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての架橋が同一である必要はない。先の記述において、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、ここで引用された全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの合成のポリヌクレオチドを称する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
ここで使用される場合、「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特に又は文脈的にさらなる指摘がないならば、このようなプロセスが生じる条件下、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を活性化可能な、任意の天然又は変異(天然／自然に生じた又は合成)ＨＧＦポリペプチドを称する。
「抗体」及び「免疫グロブリン」は、広義において相互交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)、及び抗体断片が含まれる。抗体は、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであってよい。
「抗体断片」は無傷抗体の一部のみを含み、該一部は、無傷抗体に存在する場合に、その一部に通常関連している機能の少なくとも一部、好ましくはほとんど又は全ての機能を保持している。一実施態様では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、特にＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等、無傷抗体に存在する場合に、Ｆｃ領域に通常関連している少なくとも一の生物学的機能を保持している。
ここで使用される場合、「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物活性を示す限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全ての高度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、次の総論及びここで引用された参考文献：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)も参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Marksら. Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、その標的(例えばｃ-ｍｅｔ)の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子を含む。例えば、「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減させるものである。
「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法で処置されることで恩恵を受ける任意の病状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させた慢性及び急性の疾患が含まれる。ここで処置される疾患の非限定的例には、良性及び悪性の腫瘍；非白血病及びリンパ性悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症、免疫学的及び他の血管新生に関連した疾患を含む。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、並びに様々なタイプの頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで「自己免疫疾病」とは、個々の所有する組織から生じる、またこれを指向する、非悪性の疾病又は疾患のことである。ここで自己免疫疾病では、悪性又は癌性の疾病又は状態、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く。自己免疫疾病又は疾患の例には、限定されるものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギーによる病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球付着欠損症；リウマチ様関節炎；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン(Sjorgen)症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるＴリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾病；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症疾病；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(限定するものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズポジティブ貧血を含む)；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾病；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；クレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；ベーチット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
ここで使用される場合、「処置」とは、処置される個人又は細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を称し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。処置に所望する効果には、発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは疾病又は疾患の発症を遅延化させるために使用される。
「有効量」とは、所望する治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を称する。本発明のアンタゴニストの「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個人の体重、及び個人に所望する反応を引き出すためのアンタゴニストの能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、アンタゴニストの任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を称する。必然ではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
(ベクター構築)
ここで記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望するポリヌクレオチド配列は、適切な源細胞から単離され、配列決定されてよい。抗体用の源細胞には、ハイブリドーマ細胞等の抗体生産細胞が含まれる。また、ポリヌクレオチドはヌクレオチドシンセサイザー又はＰＣＲ技術を使用して合成することができる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製し発現できる組換えベクターに挿入する。当該技術で入手可能な公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主としてベクター、特にベクターで形質転換される宿主細胞に挿入される核酸の大きさに依存する。それぞれのベクターは、それが存在する特定の宿主細胞との適合性及び機能(異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現、又は双方)に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分には、限定されるものではないが、一般的に複製起源(特に、ベクターが原核細胞に挿入される場合)、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種核酸挿入物及び転写終結配列が含まれる。
一般的に、宿主細胞と適合性のある種から誘導されたレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。通常、ベクターは、複製部位、並びに形質転換した細胞に表現型選択を付与可能なマーキング配列を担持している。例えば、大腸菌は、典型的にはｐＢＲ３２２、大腸菌種から誘導されたプラスミドを使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性をコードする遺伝子を含み、よって形質転換された細胞を同定するための、容易な手段が付与される。また、ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の細菌性プラスミド又はバクテリオファージも、内在性タンパク質の発現のため、微生物体により使用可能なプロモータを含有、又は含有するように修飾される。
さらに、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えばバクテリオファージ、特にλＧＥＭ.ＴＭ.-１１は、大腸菌ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換するために使用可能な組換えベクターを作製するのに利用され得る。
構成又は誘導プロモータのいずれかは、特定の状況での必要性に従い、本発明で使用可能であり、当業者により確認可能である。種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモータがよく知られている。選択されたプロモータは、制限酵素消化を介して、ソースＤＮＡからプロモータを除去し、選択されたベクターに単離されたプロモータ配列を挿入することにより、ここで記載されたポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに、作用可能に連結することができる。未変性のプロモータ配列及び多くの異種プロモータの双方とも、標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に使用され得る。しかしながら、一般的に、未変性の標的ポリペプチドプロモータと比較して、より多くの転写がなされ、発現した標的遺伝子の収率が高いために、異種プロモータが好ましいとされる。
原核宿主を用いた使用に適したプロモータには、ＰｈｏＡプロモータ、β-ガラクタマーゼ(galactamase)及びラクトースプロモータシステム、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモータシステム、及びハイブリッドプロモータ、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモータが含まれる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモータ(例えば他の公知の細菌又はファージプロモータ)も適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、よって当業者であれば、リンカー又はアダプターを使用し、標的となる軽及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能な連結させ(Siebenlistら (1980) Cell 20: 269)、任意の必要な制限部位を供給することができる。
一実施態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を通って発現したポリペプチドの転位を指示する、分泌シグナル配列成分を含有する。一般的に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、もしくはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシング(すなわち、シグナルペプチターゼにより切断)されたものであるべきである。異種ポリペプチド原産のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞にとって、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核細胞シグナル配列により置き換えられる。
ポリペプチドの発現に適した原核宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性菌が含まれる。有用な菌の例には、大腸菌類(例えば大腸菌)、桿菌(例えば枯草菌)、腸内細菌、シュードモナス属(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ、プロテウス、赤痢菌、根粒菌、Vitreoscilla、又は脱窒細菌が含まれる。好ましくは、グラム陰性菌が使用される。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌し、付加的なプロテアーゼインヒビターが細胞培養に導入されることが望ましい。
(ポリペプチド生成)
宿主細胞は、上述した発現ベクターを用いて形質転換又は形質移入され、プロモータの誘発、形質転換体の選択、又は所望する配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に変性された従来からの栄養培地で培養される。
形質移入とは、任意のコード化配列が実際に発現していてもいなくても、宿主細胞により発現ベクターが取り込まれることを意味する。多くの形質移入法、例えばＣａＰＯ４沈降及び電気穿孔等が、当業者に公知である。成功した形質移入とは、一般的に、このベクター操作による任意の徴候が宿主細胞内に生じた場合であると認識される。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして又は染色体組込体により複製可能なように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適した標準的な技術を用いてなされる。塩化カルシウムを使用したカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌性細胞に一般的に使用される。形質転換のための他の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯが使用される。さらに使用される他の技術は電気穿孔である。
原核宿主細胞は、選択された宿主細胞の培養に適した、当該技術で公知の任意の培地で成長させることができる。適切な培地の例は、必要な栄養素サプリメントがプラスされたルリアブロス(ＬＢ)を含む。また培地は、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にする、発現ベクターの構造に基づき選択される、選択剤を含む。例えば、アンピシリンはアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機ホスファート源の他の任意の必要なサプリメントも、単独で、又は他のサプリメント又は培地、例えば複合窒素源との混合物として導入され、適切な濃度で含まれる。通常、培養培地は、グルタチオン、システイン、システアミン、チオグリコラート、ジチオエリトリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される、一又は複数の還元剤を含んでいてよい。
原核宿主細胞は適温で培養される。大腸菌の成長においては、例えば好ましい温度は約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらに好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであってよい。大腸菌にとっては、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
誘導プロモータが発現ベクターに使用されるならば、タンパク質の発現はプロモータの活性化に適した条件下で誘導される。例えば、ＰｈｏＡプロモータが転写のコントロールに使用されるならば、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのホスファート制限培地で培養されてよい。多様な他の誘導因子は、当該技術で公知のようにして、使用されるベクター作成物に応じて使用されてよい。
微生物中で発現するポリペプチドが宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収され得る。タンパク質の回収は、一般的に浸透圧衝撃、超音波処理又は溶解等の手段による、微生物の破壊を典型的に含む。細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞が、遠心分離又は濾過により除去され得る。さらにタンパク質は、例えば親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製されてよい。また、タンパク質は培養培地に運ばれ、そこから単離することもできる。細胞を培養物から除去し、培養上清を濾過し、生成したタンパク質のさらなる精製のために濃縮してもよい。発現したポリペプチドはさらに単離され、一般的に公知の方法、例えば免疫親和性又はイオン交換カラムにおける分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥにおけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を使用するゲル濾過；疎水性親和樹脂、マトリックスに固定化された適切な抗原を使用するリガンド親和性、及びウエストブロットアッセイを使用して同定することができる。
原核宿主細胞の他に、真核宿主細胞システムも、当該技術で十分に確立されている。例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと。適切な宿主には、哺乳動物株化細胞、例えばＣＨＯ、昆虫細胞、例えば以下に記載するものが含まれる。
(ポリペプチドの精製)
生成されたポリペプチドは、さらなるアッセイ及び使用のために、実質的に均一な調製物を得るため、精製されてもよい。当該技術で公知の標準的なタンパク質精製法を使用することができる。次の手順が、適切な精製手順の例：免疫親和性又はイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥにおけるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を使用するゲル濾過である。
(本発明の方法)
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の活性化にとって重要な、ｃ-ｍｅｔ内部のドメインの同定に基づいた種々の方法を提供する。ここでは、このようなドメインを用いた干渉により、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性が調節されることを示している。
種々の物質又は分子(ペプチド／ポリペプチド、抗体等を含む)は、治療剤として使用され得る。これらの物質又は分子は、製薬的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従い調製することができ、よって、この文書での製品は、製薬的に許容可能な担体ビヒクルとの混合物に組み合わせられている。治療用調製物は、凍結乾燥された調製物又は水溶液の形態で、場合によっては生理学的に許容可能な担体、割形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. Ed. (1980))と、所望の純度を有する活性成分とを混合することにより、保管用として調製される。許容可能な担体、割形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、バッファー、例えばホスファート、シタラート及び他の有機酸、アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭化水素；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ又はＰＥＧを含む。
インビボ投与に使用される調製物は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内溶液バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬用組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、考慮される特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の医師の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
本発明のアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日で変化する。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、同5,206,344号、又は同5,225,212号参照。異なる調製物が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
物質又は分子の投与を必要とする任意の疾病又は疾患の治療に適した放出特性を持つ調製物で、物質又は分子の持続放出が望まれる場合、物質又は分子のマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン-(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; 国際公開第97/03692号, 国際公開第96/40072号, 国際公開第96/07399号; 及び米国特許第5,564,010号。
これらのタンパク質の持続放出調製物は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に応じて数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp.1-41。
この発明は、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン機能(例えば、ｃ-ｍｅｔ二量体化、リガンド結合)への干渉を介して、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達を阻害するものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。スクリーニングアッセイは、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａ配列と結合又は複合体形成する、そうでなければ他の細胞性タンパク質とｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインとの相互作用を干渉する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それらを特に候補薬(例えば、ペプチド／ポリペプチド、小分子、抗体等)の同定に適したものにする、化学的／化合物ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野でよく特徴付けられているものを含む種々の方式で実施することができる。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、ｃ-ｍｅｔ(Ｓｅｍａドメイン)とその結合パートナーとが相互作用するのに十分な条件及び時間で、候補薬とｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインとを接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出することができる。特定の実施態様では、候補物質又は分子が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面を物質／分子の溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化される物質／分子に特異的な固定化親和性分子、例えばモノクローナル抗体等の抗体を、固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物が相互作用するが、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインに結合しない場合、そのドメインとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等(Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４等の多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用に係るアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインとそのパートナーとの相互作用に干渉する化合物は、次のように試験できる：通常、２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間、反応混合物は、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａ配列又はその一部とその結合パートナー(例えばＳｅｍａを含有する他のポリペプチド、特にｃ-ｍｅｔの細胞外ドメイン)を含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加して正のコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物とｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａ配列との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物がｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインとその結合パートナーとの相互作用に干渉することを示す。
インヒビター(例えばアンタゴニスト)をアッセイするために、細胞発現ｃ-ｍｅｔを、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの機能に関連した特定の活性についてスクリーニングするため、化合物と接触させ、活性を阻害する化合物の能力により、該化合物がＳｅｍａドメイン(又はそのサブドメイン)に対するアンタゴニストであることを示すことができ、その特性は、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインと特異的に結合又は相互作用するが、関連のない分子とはそうはならない能力を測定することによりさらに確認される。
潜在的なアンタゴニストの他の特定の例には、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインに結合するオリゴヌクレオチド(アプタマーであってよい)、特に限定されるものではないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体が含まれる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、野生型ｃ-ｍｅｔの作用を競合的に阻害するｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの変異形態であってもよい。
潜在的アンタゴニストには、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン及び／又はその結合バートナーにおけるｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａの結合部位に結合し、それによりｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの正常な生物学的活性を阻止する小分子が含まれる。小分子の例には、これらに限定されないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。これらの小分子は、上述にて論議したスクリーニングアッセイの任意の一つ、及び／又は当業者によく知られている任意の他のスクリーニング技術により同定することができる。
ここで記載したように、本発明のアンタゴニストはペプチド又はポリペプチドとすることができる。このようなペプチド又はポリペプチドを得るための方法は、当該技術でよく知られており、適切な標的抗原に対するバインダーにて、ペプチド又はポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。一実施態様では、適切な標的抗原はｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの少なくとも一部を含む。ペプチド及びポリペプチドのライブラリーは当該技術でよく知られており、当該技術の方法に従い調製することができる。例えば、Clarkら, 米国特許第6,121,416号；Bassら, 米国特許第5,688,666号を参照のこと。ファージコートタンパク質等の、異種タンパク質成分に融合するペプチド又はポリペプチドのライブラリは、例えばClarkら, Bassら, 上掲に記載されているように、当該技術でよく知られている。一実施態様では、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン機能をブロックする能力を有するペプチドは、アミノ酸配列ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)及び／又はＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)、又はその変異体を含む。一実施態様では、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン機能をブロックする能力を有するポリペプチドは、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの全て又は実質的全てを含む。第１のペプチド又はポリペプチドのバインダーの変異体は、関心ある特徴(例えば、標的結合親和性の向上、薬物動態の向上、毒性の低減、治療指標の改善等)を得るために、ペプチド又はポリペプチドの変異体をスクリーニングすることにより生じせしめることができる。変異誘発技術は当該技術でよく知られている。さらに、スキャニング変異誘発技術(例えばアラニンスキャニングをベースにしたもの)は、ペプチド又はポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の構造的及び／又は機能的重要性を評価するのに、特に有用である。
本発明の候補物質／分子の、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達及び／又は該シグナル伝達に関連した生物活性を調節する能力の測定は、例えばOkigakiら, Biochemistry (1992), 31:9555-9561；Matsumotoら, J. Biol. Chem.(1998), 273:22913-22920；Dateら, FEBS Let.(1997),420:1-6; Lokkerら, EMBO J. (1992), 11:2503-2510；Hartmanら, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992),89:11574-11578に記載されているように、当該技術で十分に確立されている、インビトロ又はインビボアッセイにおける、物質／分子の調節能力をテストすることにより実施可能である。
(抗体)
本発明は、例えばｃ-ｍｅｔ二量体化及び／又はｃ-ｍｅｔへのリガンドの結合等、ｃ-ｍｅｔ活性化に必要な一又は複数のプロセスに干渉する抗体の使用を含む方法を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ結合抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン(又はその一部)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
２．モノクローナル抗体
あるいは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン(又はその一部)又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイできる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製され得る。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明の抗体を発現するハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；上掲のMorrison等］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
抗体は、適切な／所望する親和性を有して結合する抗体又は抗体断片のファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることにより生成することができる。このような技術は、例えば米国特許第5,750,373号；同5,780,279号；同5,821,047号；同6,040,136号；同5,427,908号；同5,580,717号、及びここでの参照に記載されているように、当該技術においてはよく知られている。
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同5,545,806号；同5,569,825号；同5,625,126号；同5,633,425号；同5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
抗体は、上述した公知の選択及び変異誘発法を使用して親和成熟させてよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製される出発抗体(一般的に、マウス、ヒト化又はヒト)の５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインに対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開第93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一の融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
国際公開第96/27011号に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインの少なくとも一対のＣＨ３領域を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの代償的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供する。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、単一のｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの２つの異なるエピトープ、又はｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインのエピトープと他のポリペプチドのエピトープに結合していてもよい。
５．ヘテロ結合抗体
ヘテロ結合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第91/00360号; 国際公開第 92/200373号; 欧州特許第03089号］に提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル-４-メルカプトブチリミダート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、改善された内部移行能力及び／又は増加した相補鎖媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより相補鎖溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
７．免疫結合体
本発明はまた、化学治療剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性結合)に結合された抗体を含む免疫結合体にも関する。
このような免疫結合体の生成に有用な化学治療剤は上記している。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体及び細胞障害剤の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミダートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベラート等)、アルデヒド類(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアナート(トリエン２,６-ジイソシアナート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に結合されてもよく、抗体-レセプター結合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害剤(例えば、放射性ヌクレオチド等)に結合した「リガンド」(アビジン等)を投与する。
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所定の孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学治療剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)：1484 (1989)参照。
９．抗体の製薬用組成物
ここで開示されるスクリーニングアッセイにより同定された抗体並びに他の分子は、種々の疾病の治療のために、製薬用組成物の形態で投与することができる。
全抗体がインヒビターとして用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも、所望される細胞に、本発明の物質／分子を送達するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、最小阻害断片を使用することが有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインに結合し、及び／又はｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインとその結合パートナーとの相互作用に干渉する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの調製物は、治療される特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を増強させる薬剤、例えば細胞障害剤、サイトカイン、化学治療剤又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに開示されている。
インビボ投与に使用される調製物は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
(製造品)
本発明の他の態様では、上述の疾病の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、組成物それ自体、又は症状を処置、予防及び／又は診断するのに有効な他の組成物と組み合わせて該組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の処置のために使用されることを示している。さらに、製造品は（ａ）そこに本発明のアンタゴニストを含有する組成物を含む第一の容器と；（ｂ）そこにさらなる細胞障害剤を含有する組成物含む第二の容器とを含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二組成物が、癌等の特定の病状を処置するのに使用可能であることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。あるいは、又は付加的に、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した一般的に記載を与えたので、種々の他の実施態様も実施することができるものと理解される。
材料及び方法
コンストラクト及び組換えタンパク質
ｃ-ｍｅｔの細胞外サブドメイン欠失を、常套的なＰＣＲ法を使用して構築した。ＫｐｎＩ部位に隣接したＳｅｍａ、ＰＳＩ、第１ＩＰＴ、又は第４ＩＰＴドメインでＫｐｎＩ部位に隣接されたものの出発点を有するＮ-末端プライマーを、ＳｔｕＩ部位に隣接されたＭｅｔ残基９５９まで、Ｃ-末端プライマーと対形成させた。テンプレートとしてｃ-Ｍｅｔを使用し、各クローンに対するＰＣＲ断片を、製造者の指示書に従い、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen)を使用して、ｐＣＲ-Ｂｌｕｎｔ ＩＩ-ＴＯＰＯベクターに挿入した。クローンをＤＮＡ配列決定により確認した。ついで、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶを介し、コンストラクトをｐｃＤＮＡ３．１ Ｖ５／Ｈｉｓベクター(Invitrogen)においてサブクローンし、Ｃ-末端にタグを添加した。各クローンのＮ-末端にて、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ部位を介して、Ｍｅｔのシグナルペプチドを添加した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶを用いて各クローンを消化させ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｍｅＩを介して、ｐＲＫ５ＴＫｎｅｏベクターにてサブクローンした。ＥＣ-ＷＴ Ｆｌａｇ及びＥＣ-ＷＴ Ｖ５／Ｈｉｓクローン用には、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＮ-末端プライマーを、ＳｔｕＩ部位に隣接されたＭｅｔ残基５９５まで、Ｃ-末端プライマーと対形成させた。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩを介し、ＥＣ-ＷＴ Ｖ５／ＨｉｓをｐｃＤＮＡ３．１ Ｖ５／ＨｉｓのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ部位においてサブクローンし、ついで、上述したようにして、ｐＲＫ５ＴＫｎｅｏにてサブクローンした。ＥＣ-ＷＴ Ｆｌａｇ用には、ＰＣＲ断片をｐＣＲ-Ｂｌｕｎｔ ＩＩ-ＴＯＰＯベクターに連結させた。Ｆｌａｇタグ配列を有するオリゴヌクレオチドをＳｔｕＩとＫｐｎＩの間に挿入した。ついで、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶ／ＳｃａＩを介し、ＥＣ-ＷＴ ＦｌａｇをｐＲＫ５ＴＫｎｅｏにおいてサブクローンした。組換えＨＧＦ及び抗-Ｍｅｔ ５Ｄ５-Ｆａｂは、R. Schwall (Genentech)により提供された。ｓｃＨＧＦを上述したようにして、哺乳動物細胞で産生させた(Peekら，2002)。
組換えＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを得るため、ＰＣＲをＭＥＴレセプターの残基２５-５６７をコードする領域に対して実施した。８ｘのＨｉｓタグ及びＮｏｔＩ部位をＣ-末端に添加し、Ｎ-末端をｐＡｃＧＰ６７Ａ(BD Biosciences)の昆虫細胞分泌シグナルのＣ-末端に直接融合させた。ＰＣＲ生成物をＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化させ、ｐＡｃＧＰ６７Ａでサブクローン化した。精製されたプラスミドＤＮＡ(ｐＡｃＧＰ６７ＡプラスＭＥＴ ｓｅｍａ及びＰＳＩドメイン)を、製造者のプロトコル(BD Biosciences)に従い、Ｓｆ９昆虫細胞に形質移入した。発現のために、５ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で、ＥＳＦ９２１培地(Protein Expression、LLC)にて成長させた１ＬのＨｉ５昆虫細胞を、２７℃で７２時間インキュベートさせた１０ｍＬのウイルス保存物に感染させた。ついで、３０００ｇ、１５分の遠心分離により、上清から細胞を除去した。１ｍＭのＮｉＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ８．０を上清に添加した。上清を濾過し、重力流により、２ｍＬのＮｉ-ＮＴＡカラム(Qiagen)に添加し、２０ｍＬの洗浄用バッファー(５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール)が続いた。５０ｍＭのＴｒｉｓ ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーを用い、タンパク質を溶出させた。組換えＳｅｍａドメイン単独を作成する試みでは、Ｓｅｍａ３Ａに対して事前に報告されているような(Antipenkoら，2003)タンパク質は産出しなかった。
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
株化細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から得た。２９３細胞を、１０％のＦＢＳ(Sigma)、ペニシリン／ストレプトマイシン(GIBCO)、及びグルタミンが補足されたＤＭＥＭに保持させた。Ａ５４９、Ｈ４４１、及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びグルタミンが補足された５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ１２(Cellgro)に保持させた。製造者の指示書に従い、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を使用して、細胞を１-１２μｇの指示されたコンストラクトに感染させた。２４時間後、完全プロテアーゼインヒビター混合錠剤とホスファターゼインヒビター混合物２(それぞれRoche及びSigma)を含有する１％のＮＰ４０溶解バッファーを用いて、細胞を収集した。Ｍｅｔチロシンのリン酸化及びＭＡＰＫのリン酸化の研究のために、０．５％のＢＳＡを用い、細胞を２時間、血清不足にさせた。１０μｇ／ｍｌの抗-Ｍｅｔ ５Ｄ５-Ｆａｂ又はｒＳｅｍａで処理した細胞を、溶解前にさらに１時間インキュベートした。細胞片を遠心分離し、上清をプロテインＡセファロース(Sigme)又はプロテインＧ-プラスアガロースビーズ(Santa Cruz)を用いて１時間、事前浄化しておいた。ついで、５００μｇの溶菌液を回転させながら、４℃で一晩、１０μｇの５Ｄ５抗体(Genetech)又は３５μｌのＭｅｔ(C-28)アガロース接合体(Santa Cruz)を用いて免疫沈降させた。ＨＧＦ結合研究のために、５００μｇの溶菌液を５μｇのｓｃＨＧＦ又はＨＧＦと共にインキュベートし、続いて１μｇのＶ５抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を１％のＮＰ４０溶解バッファーで３回洗浄するさらに２時間前、プロテインＡ又はＧビーズを添加した。１０ｍＭのＤＴＴと共に、２ｘのサンプルバッファーを添加した後、サンプルを４-１２％のトリス-グリシンゲル(Invitrogen)に流した。タンパク質をニトロセルロース膜に移動させ、５％の脱脂乳又はＢＳＡで１時間ブロックし、ついで振動させながら、４℃で一晩、１：５０００のＶ５(Invitrogen)、１：１００００のＣ-末端Ｍｅｔ(C-12)(Santa Cruz)、１：１０００のＭＡＰＫ(Cell Signaling)、１：５００のＨＧＦ-α(145)(Santa Cruz)、１：１０００のＰ-ＭＡＰＫ(Cell Signaling)、１：１０００のＨｉｓ(Cell Signaling)、又は１：１０００のホスホチロシン４Ｇ１０(Uptake)抗体を用いて探索した。マウス又はウサギＩｇＧに対する第２抗体を、１：５０００希釈度で使用した(Amersham)。強化された化学発光(ECL-Plus、Amersham)により、タンパク質が検出された。
共有親和性架橋分析
架橋研究を、修正を伴い過去に記載されたようにして実施した(Blechmanら, 1995)。０．５％のＢＳＡを用い、Ａ５４９、Ｈ４４１、ＭＤＡ-ＭＢ-４３５及び２９３細胞を、２時間血清不足にさせた。培地を除去し、ＰＢＳと置き換えた。ついで製造者の指示書に従い、細胞を増加濃度の架橋剤スルホ-ＥＧＳ(Pierce)で処理した。同様に、２９３細胞を６-ウェルプレートに置き、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を使用し、０．１-４μｇの指示されたコンストラクトを形質移入した。２４時間後、培地をＰＢＳと置き換え、細胞をスルホ-ＥＧＳで架橋させた。ついで、プロテアーゼとホスファターゼインヒビターを伴う１％のＮＰ４０溶解バッファーを用いて、細胞を溶解させた。還元サンプルバッファー中、１０μｇの溶菌液を８％又は４-１２％のトリス-グリシンゲルで即座に分析し、ニトロセルロース膜に移動させ、５％のミルクで１時間ブロックした。膜を振動させながら、４℃で一晩、１：１０００のＭｅｔＣ-１２(Santa Cruz)又は１：５０００のＶ５抗体を用いて探索した。１：５０００の第２抗体をインキュベートした後、タンパク質をＥＣＬ-プラスで検出した。ＥＣ-ＷＴ-Ｆｌａｇ及びＥＣ-ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓコンストラクトを同時形質移入し、従来通りに架橋した。５００μｇの架橋した溶菌液を、Ｖ５又はＦｌａｇ抗体を用いて免疫沈降させ、８％のトリス-グリシンゲルで分析し、ニトロセルロース膜に移動させ、１：５０００のＶ５又は１：１０００のＦｌａｇ(Sigma)抗体のいずれかで免疫ブロットした。タンパク質をＥＣＬ-プラスで検出した。
掻爬アッセイ
Ｈ４４１細胞を、５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０％のＦＢＳが入った９６-ウェルプレートに、４．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。次の日、過去に記載されているように各ウェルにおいて、集密的な単層にて掻爬を１回行った(Lorenzatoら, 2002)。ついで、細胞を、０．５％のＢＳＡを含有する培地と共にインキュベートし、モック(偽)、１０μｇ／ｍｌの５Ｄ５、１０μｇ／ｍｌのＳｅｍａ、又は１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した。掻爬体を監視し、毎日写真撮影した。代表的な結果が２日に示される。
遊走アッセイ
トランスウェル(transwell)遊走アッセイを修正を伴う上述のようにして実施した(Coltellaら，2003)。ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞を、１０μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン(Sigma)で予め被覆された各トランスウェル(Costar)の上部チャンバーに、０．５％のＢＳＡを含有する培地に１．２ｘ１０５細胞で播種した。モック、１０μｇ／ｍｌの抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂ、又は１０μｇ／ｍｌのＳｅｍａを上部チャンバーに添加した。さらに正のコントロールとして、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦをモック処理ウェルの下部チャンバーに添加した。次の日、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％のクリスタルバイオレットで染色した。下部チャンバーに遊走した細胞を１０％の酢酸で可溶化させ、マイクロプレートリーダーで、５６０ｎｍでの吸光度を測定した。
結果
ＳｅｍａドメインはＭｅｔレセプター架橋に必要
レセプターの二量体化及び活性化に対する、Ｍｅｔの細胞外ドメインによりなされる貢献度を測定するために、Ｍｅｔのサブドメイン欠失を図１に示すようにして作製した。各欠失変異体を、Ｖ５／Ｈｉｓタグを担持するＮ-末端及びＣ-末端膜貫通領域にて、シグナルペプチド(S.P.)に隣接させた。スルホ-ＥＧＳを使用し、Ｍｅｔ欠失変異体の架橋に対する能力を個々にテストした。増加濃度のスルホ-ＥＧＳで処理されたＶ５／Ｈｉｓタグ欠失変異体の形質移入体を溶解させ、４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。スルホ-ＥＧＳで処理されないサンプルにおいて、ＥＣ-ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓは、プロセスモノマー(ＥＣ-Ｍ、〜９０ｋＤ)及び非プロセス(＊、〜１２０ｋＤ)タンパク質として表れた。ＥＣ-ＷＴ架橋は、図２Ａに示すように、下級(ＥＣ-Ｍ、〜９０ｋＤ)から上級遊走性二量体(ＥＣ-Ｄ、〜１８０ｋＤ)へのシフトにより検出された。Ｓｅｍａドメインを欠失したＭｅｔ変異体は同様のシフトを示さなかった。予期された非プロセスＥＣ-ＷＴ(＊)Ｍｅｔは、スルホ-ＥＧＳが細胞膜不浸透性であるために、架橋を示さなかったと記される。Ｍｅｔの細胞内単鎖前駆体は、それが細胞表面に存在する場合に、タンパク質分解的に決断される(Giordanoら，1989)。架橋し膜挿入されたプロセスＭｅｔレセプターの限界浸透性及び効果が調査されているため、スルホ-ＥＧＳは架橋剤として選択された。
膜結合性細胞外Ｍｅｔがホモダイマーを形成する場合にアドレスするため、細胞をＥＣ-ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓ及びＥＣ-ＷＴ-Ｆｌａｇで同時形質移入させ、スルホ-ＥＧＳで架橋した。細胞を溶解させ、Ｖ５抗体を用いて免疫沈降させ、８％のＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、Ｆｌａｇ又はＶ５抗体で免疫ブロットした。免疫ブロットがＥＣ-ＷＴ-Ｆｌａｇ及びＥＣ-ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓ(図２Ｂ)を含有する上級遊走形態(ＥＣ-Ｄ、〜１８０ｋＤ)を表示し、これはＥＣ-ＷＴの双方の形態が架橋し同時免疫沈降していることを示す。Ｆｌａｇ抗体を使用した逆性免疫沈降も類似した結果を示した(図２Ｂ)。また残留した非架橋ＥＣ-ＷＴ Ｆｌａｇ(ＥＣ-Ｍ)もＶ５免疫沈降で検出されたが、増加したスルホ-ＥＧＳの添加により上級遊走形態にシフトした(図２Ｂ)。まとめて、架橋研究により、細胞外膜結合性Ｍｅｔホモダイマーは、Ｓｅｍａドメインが存在する場合に形成されることが明らかとなった。
ＨＧＦ及びｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)はＳｅｍａドメインに結合
ＨＧＦは不活性な単鎖前駆体として分泌され、細胞外プロテアーゼによりα及びβ鎖に切断される(Nakaら, 1992) ＨＧＦの切断されたジスルフィド結合α及びβ鎖は、高親和性でＭｅｔレセプターに結合している(Bottaroら，1991；Naldiniら，1991)。Ｍｅｔ欠失変異体のＨＧＦに結合する能力についてテストした。細胞をＥＣ-ＷＴ、△Ｓ、△Ｐ、△ＩＰＴ３、ＴＭで形質移入するか、又はモックの形質移入をし、細胞溶解液をＨＧＦと共にインキュベートした。Ｖ５抗体を用いた免疫沈降、続いて４-１２％でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びα鎖-ＨＧＦ抗体を用いた検出により、ＨＧＦがＥＣ-ＷＴ単独に結合したことが示された(図３Ｂ)。ＨＧＦが残存しているＭｅｔ欠失変異体に結合しなかったという観察によって、ＳｅｍａドメインはＨＧＦ結合に必要であることが示される。
Ｒ４９４Ｅ変異を含む単鎖ＨＧＦ[ｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)]は結合して、Ｍｅｔレセプターの活性化を阻害する(Lokkerら，1992)。また、ｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)もＭｅｔ細胞外ドメインに対する結合性について調査された。形質移入したＭｅｔ欠失変異体を溶解させ、ｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)と共にインキュベートし、上述したようにして分析した。ｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)のみがＥＣ-ＷＴに結合し、Ｓｅｍａ欠失変異体では結合しないことが、データに示された(図３Ｃ)。これらの観察から、同時免疫沈降実験で、ＨＧＦとｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)の双方が組換えＥＣ-Ｍｅｔ及びＳｅｍａドメインタンパク質に結合することが確認された(データを示さず)。よって、データは、ＭｅｔのＳｅｍａドメインはＨＧＦ相互作用部位であるという観察に一致する(Gherardiら，2003)。さらにデータには、ＭｅｔのＳｅｍａドメインが、さらに結合するｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)の相互作用部位であることも示されている。
５Ｄ５モノクローナル抗体はＭｅｔのＳｅｍａドメインに結合
抗-Ｍｅｔ５Ｄ５のＦａｂ断片(抗-Ｍｅｔ５Ｄ-Ｆａｂ)が、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達を阻害することが示されている。例えば、米国特許第5,686,292号;同 5,646,036号;同 6,207,152号及び同6,214,344号を参照のこと。Ｍｅｔ欠失コンストラクトを、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５を用いた同時免疫沈降実験でテストした。先のようにして、細胞をＭｅｔ欠失コンストラクトで形質移入するか、又はモックの形質移入をした。これらの細胞溶菌液を抗-Ｍｅｔ５Ｄ５で免疫沈降させ、Ｈｉｓ抗体で免疫ブロットした。図３Ｅに示すように、Ｓｅｍａ-含有ＥＣ-ＷＴのみが抗-Ｍｅｔ５Ｄ５に結合した。全ての形質移入タンパク質は溶菌液中に検出され(図３Ｄ)、内在性Ｍｅｔが抗-Ｍｅｔ５Ｄ５により免疫沈降された(図３Ｆ)。よって、データには、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５がＭｅｔのＳｅｍａドメインに結合することが示されている。抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂがアンタゴニストとして作用するため、次の機能研究におけるコントロールとして使用した。
腫瘍株化細胞における内在性Ｍｅｔの架橋
データには、Ｓｅｍａドメインが２つの機能、すなわちＨＧＦ結合性及びレセプター二量体化に関連していることが示されているため、ＨＧＦ結合への関与を排除し、二量体化におけるＭｅｔ Ｓｅｍａドメインの役割を調査した。特に示さない限りは、全ての以下の研究は、ＨＧＦの不在下で実施した。２９３(胚腎臓)、Ｈ４４１(肺癌腺)、Ａ５４９(肺癌)、及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５(乳癌)株化細胞で発現したＨＧＦレベルを、ＲＴ-ＰＣＲ及びウエスタンブロット分析により測定した。ＭＤＡ-ＭＢ-４３５及びＨ４４１細胞は、検出可能なＨＧＦ ＲＮＡ又はタンパク質を有していなかったが、Ａ５４９及び２９３細胞はＨＧＦ ＲＮＡを発現し、溶菌液及び馴化培地においては、検出可能なＨＧＦタンパク質はほとんどなかった(データを示さず)。種々の腫瘍株化細胞において発現したＭｅｔが、ＨＧＦの不在下で架橋可能かどうかを測定するために、実験の継続時間中、０．５％のＢＳＡを含有する血清フリーの培地に細胞を保持した。これらの株化細胞を、従来通りにスルホ-ＥＧＳで架橋させ、溶菌液を４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析し、続いてＭｅｔ抗体を用いて免疫ブロットした。架橋試薬がない場合、Ｍｅｔは、ＥＣ-ＷＴを用いた架橋研究で示されたように(図２Ａ)、プロセス(Ｍｅｔ-Ｍ)及び非プロセス(＊)タンパク質として表れた。各株化細胞においては、０．１ｍＭのスルホ-ＥＧＳでさえ、Ｍｅｔ-Ｍから上級遊走形態(Ｍｅｔ-Ｄ)へのシフトが観察された(図４)。架橋剤の濃度を増加させることにより、Ｍｅｔ-ＭからＭｅｔ Ｄ形態へのシフトが向上した。我々の以前の観察と一致して、細胞内の非プロセスＭｅｔは、スルホ-ＥＧＳ処理時には架橋しなかった。これに対し、Ａ５４９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦと共にインキュベートし、従来通りに架橋した。Ｍｅｔに対する免疫ブロットでは、ＨＧＦの不在下で見られるＭｅｔ-Ｄと比較した場合、ＨＧＦの存在下ではより高度な遊走形態が明らかになった(図４)。データには、架橋したＭｅｔ二量体がＨＧＦの不在下で形成され、ＨＧＦ結合のために、さらにシフトしたことが示されている。
ｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂを用いた腫瘍細胞におけるＭｅｔシグナル伝達の阻害
データには、ＳｅｍａドメインがＭｅｔ二量体化に必要であることが示されているため、ＭｅｔレセプターのＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを含む、組換えＳｅｍａ(ｒＳｅｍａ)タンパク質(材料と方法の項を参照)が生じ、Ｍｅｔシグナル伝達における機能的結果を調査した。ヒト腫瘍細胞を増加濃度のｒＳｅｍａで処理し、ＨＧＦ刺激における、ミトゲン活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)の下流活性化及びＭｅｔチロシンリン酸化について分析した。Ａ５４９細胞を血清不足にし、ＨＧＦの存在下、増加濃度のｒＳｅｍａと共にインキュベートした。細胞溶菌液を収集し、Ｃ-末端Ｍｅｔ抗体で免疫沈降させ、ホスホ-チロシン抗体で免疫ブロットした。Ｍｅｔリン酸化の低減は、ＨＧＦ刺激単独と比較して、ＨＧＦの存在下、増加量のｒＳｅｍａを用いて観察された(図５Ａ及び５Ｂ)。同様に、ＭＡＰＫのリン酸化は、リガンドの存在下、増加濃度のｒＳｅｍａを用いた処理において減少した。Ｈ４４１及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５株化細胞も、同様の方式において、ｒＳｅｍａ及びＨＧＦで処理したところ、ホスホ-ＭＡＰＫにおける用量依存性減少が観察された(図５Ａ及び５Ｂ)。
さらに、ＨＧＦの不在下におけるｒＳｅｍａによるＭｅｔ活性化の阻害も調査した。比較のため、Ｍｅｔレセプターアンタゴニストとして作用する抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂを、機能研究に使用した。Ａ５４９細胞を血清不足にし、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂ又はｒＳｅｍａで処理した。ｒＳｅｍａ又は抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂを用いた処理は、モック処理をされたコントロールと比較して、リガンド非依存性のＭｅｔリン酸化及びホスホ-ＭＡＰＫのレベルを阻害する原因となった(図５Ｃ及び５Ｄ)。同様に、Ｈ４４１及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５株化細胞も、ＨＧＦの不在下、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂ及びｒＳｅｍａで処理し(図５Ｃ及び５Ｄ)たところ；ＭＡＰＫリン酸化における減少は、Ａ５４９細胞で以前に観察されたのと類似した傾向であった。これらの結果から、ｒＳｅｍａはリガンド依存性及び非依存性のＭｅｔリン酸化を阻害するばかりでなく、下流ＭＡＰＫシグナル伝達にも影響を及ぼすことが示唆された。
また、Ｍｅｔ欠失変異体の、内在性Ｍｅｔシグナル形質導入を減弱させる能力についても調査した。細胞を、Ｍｅｔ欠失変異体で形質移入し(図５Ｅ)；溶菌液をＣ-末端Ｍｅｔ抗体で免疫沈降させ、ホスホ-チロシン抗体で免疫ブロットした。ＥＣ-ＷＴ形質移入体は、モック処理をされたコントロールと比較して、Ｍｅｔチロシンリン酸化及びホスホ-ＭＡＰＫの減弱が示された(図５Ｆ及び５Ｇ)。Ｓｅｍａ欠失形質移入体は、ホスホ-Ｍｅｔのある程度の減弱は示すが、下流ＭＡＰＫリン酸化における低減を示さなかった(図５Ｆ及び５Ｇ)。共に、これらの観察により、ＳｅｍａドメインがＭｅｔ活性化に必要であることが確認され、Ｍｅｔシグナル伝達をｒＳｅｍａが阻害する、先の結果が確証された(図５Ａ-Ｄ)。
ｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂによる細胞遊走の阻害
Ｍｅｔ媒介性細胞運動の測定として、Ｈ４４１細胞を掻爬アッセイに使用した(Lorenzatoら，2002)。高密度で増殖させたＨ４４１細胞を、０日目に各ウェルに掻爬し、実験の継続時間中、０．５％のＢＳＡを含有する血清フリーの培地に保持した(図６)。正のコントロール又はモック処理をしたものとして、細胞を、それぞれ１０μｇ／ｍｌのｒＳｅｍａ又は５Ｄ５又は１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した。２日目、モック処理がされたウェルの間隙は完全に閉じていたが、ｒＳｅｍａで処理した細胞においては、間隙は残っていた(図６)。また、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５ Ｆａｂ処理された細胞の間隙は、より小さい程度で、可視できる程に残っていた。ＨＧＦ処理された細胞は、１日目に間隙が閉じ、それ自体は２日目も残っていた。これらの観察は４つの別の実験で一致していた。データには、内在性Ｍｅｔの活性化により媒介される細胞運動が、ＨＧＦの不在下において、ｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ ５Ｄ５-Ｆａｂの双方により阻害されることが示唆されている。
リガンドの存在下、細胞運動におけるｒＳｅｍａの効果を調査するために、細胞を、０、０．１、０．５又は５μｇ／ｍｌのｒＳｅｍａに加えて、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した。ＨＧＦ単独で処理された細胞は、１日目に完全に間隙が閉じた。これに対し、ＨＧＦの存在下、ｒＳｅｍａで処理された細胞は、用量依存方式で間隙が保持されていた(データを示さず)。データには、ｒＳｅｍａがＨＧＦの存在下でＭｅｔ媒介性細胞運動を阻害することを示唆している。
ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞を用いたトランスウェルアッセイを、Ｍｅｔ駆動性細胞遊走(Coltellaら，2003)を測定するために使用した。ＨＧＦの不在下、モック処理がされた細胞は、図７に示すように遊走した。この遊走は、ｒＳｅｍａ、及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂの添加により、より小さな程度まで、一貫して減少した。これらの細胞にＨＧＦを添加すると、遊走が〜３倍に増加した。掻爬アッセイに相関したデータが、Ｈ４４１株化細胞に生じた。またＡｋｔの活性化も、細胞運動及び遊走アッセイに使用されるＨ４４１及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞で調査された。ＨＧＦの存在下、増加濃度のｒＳｅｍａを用いたＡｋｔリン酸化で、用量依存性減少が観察された(データを示さない)。データは、ｒＳｅｍａがリガンドの存在下で細胞運動を阻害可能である観察と相関していた。総合すれば、これらの観察は、Ｓｅｍａドメインアンタゴニスト、例えばＳｅｍａ配列を有する組換えポリペプチドはＭｅｔ活性化のみを阻害可能であるのではなく、リガンド依存性及び非依存の状況双方で、細胞運動及び遊走の下流効果をブロックすることができるといった結論を支持している。
議論
Ｓｅｍａドメインは、セマフォリン及びそのレセプター、プレキシンの細胞外領域に存在しており、レセプター／リガンド認識部位として供給されている(Tamagnoneら，1999)。Ｓｅｍａ３Ａ及びＳｅｍａ４Ｄの結晶構造についての最近の出版物では、これらのＳｅｍａドメインが、ホモ二量体化に重要な７つのbladedβ-プロペラ構造を形成していることが示唆されている(Antipenkoら，2003；Loveら，2003)。ここで記載されているインビトロ及びインビボ実験の証拠には、Ｍｅｔレセプター二量体化におけるＳｅｍａドメインの役割が強く支持されている。
データには、Ｍｅｔの架橋がＳｅｍａドメインの存在下でのみ生じ、レセプター二量体化におけるＳｅｍａドメインの必須の役割が示唆されている。さらに、Ｍｅｔの架橋はＨＧＦの不在下でも観察されており、これらの腫瘍株化細胞のＭｅｔレセプターが、リガンドの刺激なしに、二量体化され得ることを示している。
Ｓｅｍａ３Ａの結晶構造は、Ｓｅｍａドメインにおける４つの相互作用「ループ」が、Ｓｅｍａ３Ａ二量体の間の界面を確立するのに重要であることを示唆している(Antipenkoら，2003)。Ｍｅｔを伴うＳｅｍａ３Ａ配列のアラインメントでは、Ｍｅｔ ＳｅｍａドメインのＲ３０７とＳ３０８の間のタンパク質分解性切断部位に近接して、「ループ」が存在していることが明らかであり、Ｍｅｔ二量体化におけるその重要性が示唆されている。
ここで記載された細胞ベースアッセイにより、ＨＧＦの不在下、ＳｅｍａドメインがＭｅｔレセプターの同種親和性相互作用を媒介することが明らかとなった。特に、先の報告では、ＭｅｔがＣＤ４４ｖ６、α６β４インテグリン、及びプレキシンＢ１とも相互作用することが示唆されている(Giordanoら，2002；Orian-Rousseauら，2002；Trusolinoら，2001)。ここで記載された結果からは、プレキシンＢ１と関連したＭｅｔが、これら高度に保存されたＳｅｍａドメインを介して生じるといった意見が支持される。さらに、Ｍｅｔとセマフォリンの双方の過剰発現が、癌及び浸潤性転移において記載されており、任意の潜在的相互作用がＳｅｍａドメインを介して媒介されるという、さらなる推測に至る。しかしながら、これらの病理学的状況においてヘテロマー性相互作用を媒介するこれらの分子及びメカニズムの役割は、さらなる調査にとっては有益である。ＣＤ４４ｖ６及びα６β４は、Ｓｅｍａドメインに含まれることが知られていない。よって、Ｓｅｍａ及び／又はＰＳＩ又はＩＰＴドメインを介して媒介される他のタンパク質モチーフとの相互作用は、特定の生物反応の開始においては重要であり(Bertotti及びComoglio，2003)、可能性として排除できない。
ＲＴＫ、例えば線維芽細胞成長因子レセプター２(ＦＧＦＲ２)及びＲＥＴにおいて、各レセプターの細胞外ドメインにおけるシステイン間のジスルフィド結合は、レセプター二量体化に関連している(Robertsonら，2000)。Ｍｅｔレセプターにおいて、ここで記載されたデータには、システイン-リッチのＰＳＩドメイン又は４つのＩＰＴドメインのいずれも、Ｓｅｍａドメインの不在下で架橋しないことが示されており、これはこれらの領域がＭｅｔ二量体化に必要ではないことを示唆している。さらに、プレキシンＢ１とのＭｅｔ相互作用は、ＭｅｔのＰＳＩドメインの欠失にもかかわらず不変である(Giordanoら，2002)。ここで記載された機能研究に使用されるｒＳｅｍａは、Ｓｅｍａ及びＰＳＩドメインを含んでいるが(材料と方法を参照)、ここで記載された架橋研究及びプレキシンＢ１において報告されているＰＤＩドメイン欠失(Giordanoら，2002)では、Ｓｅｍａドメインが、ＰＳＩドメインの不在下でのこれらの相互作用において主要な役割を担っていることが、強く示されている。内部のＰＳＩ又はＩＰＴ欠失を生じさせる試みは、結果として本研究に使用されない非プロセスＭｅｔの発現を生じ、よってＭｅｔ二量体形成又はいくつかの他のメカニズム、例えばＥＧＦＲ用に報告されているような二量体化の自己抑制における、ＰＳＩ及びＩＰＴドメインのための役割であろうがなかろうが、断定的に示されたままである(Fergusonら，2003)。細胞外Ｍｅｔの結晶構造の分解はこれらの複合体の相互作用においてさらに軽く脱落する。
ＲＴＫのリガンド-レセプター複合体の結晶学的研究により、いくつかの構造的洞察が明らかとなった。Ｆｌｔ-１及びＴｒｋＡは双方とも、レセプターの二量体化及び活性化のためのリガンドの二量体化に利用される(Wiesmannら，1997；Wiesmannら，1999)。ＦＧＦＲにおいて、ヘパリン結合ＦＧＦリガンドは、レセプター二量体化を促進させる(Plotnikovら, 1999)。これに対し、ＥＧＦ：ＥＧＦＲ(表皮成長因子レセプター)複合体は、リガンド-リガンド相互作用に無関係に、レセプターを介してホモ二量体化する(Garrettら, 2002; Ogisoら, 2002)。ＭｅｔとＨＧＦの相互作用はあまり明らかになっていないが、最近の報告では、Ｍｅｔ、ＨＧＦ及びヘパリンは、１：１：１の複合体として存在していることが示唆されている(Gherardiら, 2003)。細胞成分、例えば細胞外マトリックス(ＥＣＭ)は我々の研究でも存在しており、インビボでのレセプター二量体化においてかなりの影響を有し得るために、我々の細胞ベースの研究はインビトロでの観察で報告されているこれらのものとは異なる。ＥＣＭがラミニン、及び細胞の相互作用の原因となる他の成分を含有しているため(Giancotti及びRuoslahti, 1999)、Ｍｅｔ二量体化を容易にする全てのタンパク質は未だに同定されていないと思われる。
ここで示したように、Ｓｅｍａドメインは、先の観察と一致して、ＨＧＦとの相互作用に十分であり(Gherardiら, 2003)、ｒＳｅｍａはリガンドにより促進されるＭｅｔ活性化を阻害可能である。よって、ｒＳｅｍａは、ＨＧＦの結合による、ＨＧＦ依存性Ｍｅｔ活性化を効果的に阻害すると思われる。さらに、ＨＧＦ依存性Ｍｅｔ過剰発現腫瘍は、リガンド依存性レセプター活性化のＲｏｎ Ｓｅｍａドメイン媒介性阻害に類似した方式にて、ｒＳｅｍａにより標的にされ得ることが示唆される(Angeloniら, 2003)。ここに記載されたデータには、架橋研究ではリガンド非依存性Ｍｅｔ二量体が、ＨＧＦに結合した場合にさらにシフトすることが示されているため(図４)、Ｓｅｍａ-ＨＧＦ相互作用部位がＭｅｔ二量体化界面とは異なることが示されている。これらのデータは、二量体化界面及びＨＧＦ相互作用部位が重複していないことを示唆している。
さらに、ここでは、Ｓｅｍａドメインが公知のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂの結合に必要であることが示されている。また、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂは、ここで記載した所見で観察されているように、リガンド非依存性レセプターの活性化を阻害するために、ＨＧＦ競合に加えて、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂが立体障害によりレセプター二量体化をブロックすることが可能である。同様に、ｒＳｅｍａはリガンド非依存性及び依存性のＭｅｔ活性化を阻害し、効果的なＭｅｔインヒビターとしての、ｒＳｅｍａの役割が示されている。同様の阻害活性がｃ-ｋｉｔレセプターについても記載されている(Levら, 1992)。この研究にて扱われているリガンド非依存性状況での二量体化におけるＭｅｔ Ｓｅｍａドメインの役割は、Ｒｏｎ Ｓｅｍａドメインの役割とは異なっている。Ｒｏｎ ＳｅｍａドメインがＭＳＰとの結合に競合して、Ｒｏｎの活性化を阻害する一方、Ｒｏｎレセプター二量体化は阻害されない(Angeloniら, 2003)。ここで記載された機能研究は、ＨＧＦの存在又は不在下で実施されており、Ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインがリガンド依存性及び非依存性のレセプター活性化の双方を阻害することが示されている。これらのデータには、Ｍｅｔ及びＲｏｎの構造モチーフ及び結合性相互作用は類似しているが、インビボでは異なる同種親和性相互作用であることが明白であると示唆されている。
ここでは、Ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインが、リガンド依存性ばかりでなく、リガンド非依存性のＭｅｔレセプター活性化の潜在的インヒビターであることが示されている。ここで記載されたデータには、ＭｅｔのＳｅｍａドメインが腫瘍細胞におけるレセプター活性化をブロックし、それによってＭＡＰＫリン酸化、細胞運動及び遊走が阻害されることが示されている。生物治療として、Ｓｅｍａドメインそれ自体を利用することに限定されるものではないが、ＭｅｔのＳｅｍａドメインの機能を標的にすることによって、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達軸の調節不全に関連した腫瘍を処置できる可能性を、これらの観察は提示している。
(部分的な参考文献リスト)
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Ｍｅｔ欠失変異体の模式的な表示Ｍｅｔ細胞外ドメインのサブドメイン欠失をＮ-末端から作製し、ＴＭ領域の後に、Ｖ５／Ｈｉｓでタグをつけた。Ｍｅｔシグナルペプチド(S.P.)配列を各変異体のＮ-末端に付加した。略語は次のとおりである：Ｓｅｍａ-セマフォリン；ＰＳＩ-プレキシン、セマフォリン、インテグリン；ＩＰＴ-プレキシン及び転写因子の免疫グロブリン様領域；及びＴＭ-膜貫通。Ｓｅｍａ領域上の矢印は、Ｍｅｔタンパク質分解性部位を指示している。 ＳｅｍａドメインはＭｅｔ架橋に必要Ａ：Ｍｅｔ欠失変異体を２９３細胞において形質移入し、増加濃度のスルホ-ＥＧＳに暴露した。１０μｇの溶菌液を４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、Ｖ５抗体を用いて免疫ブロットした。ＥＣ-Ｍは単量体ＥＣ-ＷＴを表し、ＥＣ-Ｄは二量体ＥＣ-ＷＴを称する。星印は非プロセスＥＣ-ＷＴの存在を示す。Ｂ：ＥＣ-ＷＴ-Ｆｌａｇ及びＥＣ-ＷＴ-Ｖ５／Ｈｉｓを２９３細胞において同時形質移入し、増加濃度のスルホ-ＥＧＳを受けさせ、溶解し、Ｖ５又はＦｌａｇ抗体で免疫沈降させ、８％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。免疫沈降サンプルをＦｌａｇ又はＶ５抗体でブロットした。 ＨＧＦ及び抗-Ｍｅｔ抗体(ここでは「５Ｄ５」とも称される)はＭｅｔのＳｅｍａドメインに結合Ａ：２９３細胞を指示したＭｅｔ Ｖ５／Ｈｉｓタグ構築体で形質移入し、Ｖ５抗体で免疫沈降させ、４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットした。Ｂ：Ａからの免疫沈降物を５μｇのＨＧＦと共にインキュベートした。サンプルを４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、α鎖であると認識されたＨＧＦ抗体を用いて免疫ブロットした。１０ｎｇの投与量のＨＧＦを正のコントロールとして提供した。Ｃ：免疫沈降及び免疫ブロットを、ｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)を使用し、Ｂのように実施した。正のコントロールとして、１５ｎｇのｓｃＨＧＦ(Ｒ４９４Ｅ)をサンプルと共に分析した。Ｄ：２９３細胞を指示したコンストラクトで形質移入し、４-１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、Ｖ５抗体を用いて免疫ブロットした。Ｅ：Ｄからの形質移入した溶菌液を抗-Ｍｅｔ５Ｄ５抗体で免疫沈降させ、Ｈｉｓ抗体を用いて免疫ブロットした。Ｆ：Ｂからのニトロセルロース膜をＭｅｔ Ｃ-１２抗体を用いて再検出した。 腫瘍株化細胞における内在性ｃ-Ｍｅｔの架橋増加濃度のスルホ-ＥＧＳを、血清不足にされた２９３、Ｈ４４１、ＭＤＡ-ＭＢ-４３５、及びＡ５４９細胞に添加した。さらにＡ５４９細胞を、架橋前に１００μｇ／ｍｌのＨＧＦと共にインキュベートした。溶菌液をＭｅｔ Ｃ-１２抗体を用いて免疫ブロットした。＊で示されるバンドは非プロセスＷＴ-Ｍｅｔを表す。 Ｍｅｔシグナル伝達はｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂにより阻害。Ｍｅｔの細胞外ドメインはＭｅｔシグナル伝達を減弱。Ａ：Ａ５４９細胞を血清不足のままにし、ホスホ-Ｍｅｔ及びホスホ-ＭＡＰＫ分析のために、１０分間、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦと共に、０、５、１０、５０又は１００μｇ／ｍｌのｒＳｅｍａで処理した。溶菌液をＭｅｔ Ｃ-１２抗体で免疫沈降させ、ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロットし、リン酸化Ｍｅｔを検出し、続いてＭｅｔ抗体を用いて免疫ブロットした。Ｈ４４１及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞をそれぞれ５分間、０、５、１０又は１００μｇ／ｍｌのｒＳｅｍａに加えて、５又は１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した。タンパク質をホスホ-ＭＡＰＫで検出し、ＭＡＰＫ抗体で再検出した。＊で示されるバンドは非プロセスＷＴ-Ｍｅｔを表す。Ｂ：Ａにおけるデータを、ＮＩＨイメージソフトウェアを使用して定量化し、各サンプルにおける非リン酸化タンパク質に対するリン酸化タンパク質の比率と比較して、左パネルに棒グラフとして表した。右パネルは他の実験のデータを表す。Ｃ：Ａ５４９、Ｈ４４１及びＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞を血清不足のままにし、１０μｇ／ｍｌのｒＳｅｍａ又は抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂで処理した。サンプルをホスホチロシン、Ｍｅｔ、ホスホ-ＭＡＰＫ、又はＭＡＰＫ抗体を用いて免疫ブロットした。＊で示されるバンドは非プロセスＷＴ-Ｍｅｔを表す。Ｄ：Ｃにおけるデータを定量化し、Ｂのようにして提供した。 Ｅ：Ａ５４９細胞を指示したコンストラクトで形質移入した。Ｍｅｔ変異体の発現をＶ５抗体を用いた免疫ブロットにより検出した。＊で示されるバンドは非プロセスＥＣ-ＷＴを表す。Ｆ：(左)Ｅからの溶菌液をＭｅｔ Ｃ-１２抗体で免疫沈降させ、ホスホ-チロシン抗体を用いて免疫ブロットした。Ｍｅｔ抗体で膜を再検出した。(右)溶菌液をホスホ-ＭＡＰＫを用いて免疫ブロットし、ＭＡＰＫで再検出した。Ｇ：Ｆにおけるデータを、ＮＩＨイメージソフトウェアを使用して定量化し、各サンプルにおける非リン酸化タンパク質に対するリン酸化タンパク質の比率と比較して、左パネルに棒グラフとして表した。右パネルは他の実験のデータを表す。各グラフにおいて左から右への棒は、それぞれＦで「モック」、「ＥＣ-ＷＴ」、「△Ｓ」、「△Ｐ」及び「ＴＭ」と命名されたレーンに相当する。 ｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂは細胞運動を阻害Ｈ４４１細胞を掻爬し、２日の間、血清不足にされた培地において、モック、ｒＳｅｍａ、抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂ又はＨＧＦで処理した。４つの独立した実験を実施し、代表的なデータセットを示す。 ｒＳｅｍａ及び抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂによる細胞遊走の阻害ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞を、血清不足にされた培地において、各トランスウェルの上部チャンバーに播種し、モック、ｒＳｅｍａ又は抗-Ｍｅｔ５Ｄ５-Ｆａｂで処理した。正のコントロールとしてＨＧＦを、モック処理がなされたウェルの下部チャンバーに添加した。遊走細胞をクリスタルバイオレットで染色し、溶出細胞の吸光度を５６０ｎｍで測定した。これらの非依存性遊走研究を重複して実施し、代表的なグラフを示した。

Claims (55)

  1. ｃ-ｍｅｔ二量体化を混乱させるｃ-ｍｅｔアンタゴニスト。
  2. ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの二量体化機能を混乱させる、請求項１に記載のアンタゴニスト。
  3. ｃ-ｍｅｔ二量体化が混乱するようにｃ-ｍｅｔに結合する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
  4. ｃ-ｍｅｔ二量体化を行わしめるｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの能力を混乱させるようにｃ-ｍｅｔに結合する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
  5. ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの配列に特異的に結合するｃ-ｍｅｔアンタゴニスト。
  6. ｃ-ｍｅｔ分子に結合することにより、該分子の二量体化を阻害する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  7. 前記二量体化がホモ二量体化を含む、請求項６に記載のアンタゴニスト。
  8. ｃ-ｍｅｔのＨＧＦ結合部位に結合しない、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  9. ｃ-ｍｅｔへの結合に対して肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)と実質的に競合しない、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  10. ｃ-ｍｅｔへの肝細胞成長因子の結合を実質的に阻害しない、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  11. ｃ-ｍｅｔへの結合に対してＨＧＦと競合する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  12. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープとは異なる、ｃ-ｍｅｔ上のエピトープに結合する、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  13. アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ １Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ ５Ｄ５.１１.６)で寄託されているハイブリドーマ株化細胞により産生されるモノクローナル抗体ではない、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  14. 抗体又はその断片、ペプチド、又はそれらの組み合わせである、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  15. ｃ-ｍｅｔにアンタゴニストが結合することで、ＨＧＦ依存性又は非依存性のｃ-ｍｅｔ活性化が阻害される、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  16. 細胞のｃ-ｍｅｔにアンタゴニストが結合することで、細胞の増殖、散乱、形態形成及び／又は運動性が阻害される、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  17. 前記アンタゴニストが、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメイン又はその変異体の少なくとも一部を含有するペプチドを含む、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のアンタゴニスト。
  18. 前記ペプチドが、ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)及びＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)からなる群から選択される少なくとも一の配列を含有する、請求項１７に記載のアンタゴニスト。
  19. 前記ペプチドが、ＬＤＡＱＴ(配列番号：１)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：３)及びＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：４)からなる群から選択される少なくとも一の配列から本質的になる、請求項１７に記載のアンタゴニスト。
  20. 前記ペプチドが配列ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)を含む、請求項１７に記載のアンタゴニスト。
  21. 前記ペプチドが本質的にＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：２)からなる、請求項１７に記載のアンタゴニスト。
  22. 請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストと担体を含有する組成物。
  23. 担体が製薬的に許容可能なものである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストをコードする核酸であって、該アンタゴニストがポリペプチドを含んでなる核酸。
  25. アンタゴニストが抗体又はその断片を含有する、請求項２４に記載の核酸。
  26. 請求項２４又は２５に記載の核酸を含んでなるベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
  28. 容器と；
    該容器に収容される組成物を含み、該組成物が請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストを含有している製造品。
  29. 患者にアンタゴニストを投与するための指示書をさらに含む、請求項２８に記載の製造品。
  30. 請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストを含有する組成物を収容する第１容器と；
    バッファーを収容する第２容器；
    を具備するキット。
  31. バッファーが製薬的に許容可能なものである、請求項３０に記載のキット。
  32. 患者にアンタゴニストを投与するための指示書をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
  33. ｃ-ｍｅｔアンタゴニストをスクリーニング又は同定する方法であって、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインの少なくとも一部を含む標的分子と候補物質を接触させ、該標的分子に特異的に結合する物質をｃ-ｍｅｔアンタゴニストとして選択することを含む方法。
  34. 選択された物質を、ｃ-ｍｅｔを発現する細胞と接触させ、細胞におけるｃ-ｍｅｔ二量体化の阻害を検出又は定量する、請求項３３に記載の方法。
  35. ｃ-ｍｅｔ二量体化の阻害が、ｃ-ｍｅｔ活性化量の低減により示される、請求項３４に記載の方法。
  36. ｃ-ｍｅｔ活性化量がｃ-ｍｅｔ関連細胞のシグナル伝達量で示される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記細胞シグナル伝達がタンパク質リン酸化により示される、請求項３６に記載の方法。
  38. 患者においてｃ-ｍｅｔ活性化を調節する方法であって、ｃ-ｍｅｔ Ｓｅｍａドメインモジュレーターを患者に投与することを含み、それによりｃ-ｍｅｔ活性が調節される方法。
  39. ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法であって、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストと細胞又は組織とを接触させることを含み、それによりｃ-ｍｅｔ活性化に関連した細胞増殖が阻害される方法。
  40. 患者におけるｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関連した病態を処置する方法であって、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストを患者に投与することを含み、それによりｃ-ｍｅｔ活性化が阻害される方法。
  41. ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストと該細胞とを接触させることを含み、それにより該細胞の増殖が阻害される方法。
  42. ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的処置する方法であって、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストを治療的有効量、該哺乳動物に投与することを含み、それにより該哺乳動物が効果的に処置される方法。
  43. ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖又はその双方の増加した発現又は活性に関連した細胞増殖性疾患を処置又は防止するための方法であって、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストを有効量、このような処置が必要な患者に投与することを含み、それにより該細胞増殖性疾患が効果的に治療又は防止される方法。
  44. 前記増殖性疾患が癌である、請求項４３に記載の方法。
  45. 細胞増殖を阻害する方法であって、細胞増殖が、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法が、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストと該細胞とを接触させることを含み、それにより該細胞の増殖が阻害される方法。
  46. 哺乳動物の腫瘍を治療的処置する方法であって、腫瘍の増殖が、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方の増殖効果に少なくとも部分的に依存しており、該方法が、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のアンタゴニストと該細胞とを接触させることを含み、それにより該腫瘍が効果的に処置される方法。
  47. 前記細胞が癌細胞である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記癌細胞が、放射線処置又は化学療法剤にさらに暴露される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記癌細胞が、乳癌細胞、直腸結腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭癌細胞、前立腺癌細胞、リンパ腫細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉腫細胞、腎癌細胞、肝臓癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭部及び頸部の扁平上皮癌細胞、黒色腫細胞及び白血病細胞からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  50. ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその双方が、同じ組織起源の正常な細胞と比較して、前記癌細胞により豊富に発現している、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記肝細胞増殖因子が種々の細胞で発現している、請求項４６に記載の方法。
  52. ｃ-ｍｅｔ活性化が、同じ組織起源の正常な細胞と比較して、前記癌細胞において高められている、請求項４７に記載の方法。
  53. 前記細胞の死を引き起こす、請求項４７に記載の方法。
  54. 前記アンタゴニストの不在下で、ｃ-ｍｅｔ活性化がリガンドに無関係に生じる、請求項４０ないし５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記アンタゴニストの不在下で、ｃ-ｍｅｔ活性化がリガンドに依存している、請求項４０ないし５３のいずれか１項に記載の方法。
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