JP2008164520A - 抗原抗体反応を利用した検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便な手法で被検物質を抗原抗体反応を利用して検出できる検出装置の提供。
【解決手段】被検体から洗浄により被検液を採取する代わりに被検液に直接接触させることで被検液の採取の手数を減らすという着想から以下の発明を完成した。すなわち、本発明の検出装置は、被検体の表面に在る被検液が透過可能であって、被検液中の被検物質に特異的に結合する被検物質結合抗体が保持される抗体保持膜と、前記被検物質及び／又は前記被検物質結合抗体に特異的に結合する固定化抗体をもち、該抗体保持膜に積層された抗体固定化膜と、を有し、前記抗体保持膜側を前記被検体の表面に接触させて用いることを特徴とする。つまり、被検体の表面の被検液は、本発明の検出装置の抗体保持膜側から順次浸透していくことで抗原抗体反応が進行し、被検物質が被検液中に含有される場合に検出されることになる。
【選択図】なし

Description

本発明は、被検液中に含有する被検物質を抗原抗体反応を用いて検出する検出装置に関する。

従来から、被検体の表面に存在する細菌や生理活性物質などを検出する試みが為されている。被検体としては、飲食店の厨房機器の表面、魚介類などの食料品などの食中毒菌の存在が疑われるもの、傷口などの病原菌の存在が疑われるもの、汗が付着した皮膚や分泌液が付着した粘膜などの生理活性物質の存在が問題になるものなどが例示できる。

細菌などは肉眼で見ることができないので、被検体の表面に押し当てた寒天培地や、被検体の表面を生理食塩水などで洗浄して得られる液体をろ過したフィルタなどを培養することで細菌のコロニーを形成させて検出する手法などがあった。

しかしながら、これらの手法は煩雑なので、非水溶性高分子化合物を主成分としてなる粘着層を有する微生物試験用粘着シートの該粘着層を被検体の表面に圧着、剥離して微生物を集積した後、微生物を染色し得る１種以上の発色性物質を含有する水溶液を該粘着層の表面に接触させることにより該微生物を検出することを含む、該被検体中に存在する微生物の試験方法が提案されている（特許文献１）。

また、抗原抗体反応を利用して微生物などを検出する方法が開示されている（特許文献２、３など）。特許文献２に開示の方法はいわゆるフロースルーイムノアッセイ法であり、特許文献３に開示の方法はいわゆるラテラルフローイムノアッセイ法である。

そして、これらイムノアッセイ法に用いられるイムノメンブレンについて扱いやすく保存性を向上する目的で、試薬が固着された台紙の裏面に、表面に粘着層が設けられ、該粘着層に剥離ライナーが積層された透明な熱可塑性樹脂製保護シートが折り返されている試験紙が開示されている（特許文献４）。
特開２００２−１４２７９７号公報 特許２８１８１９１号公報 特開平６−１６７４９７号公報 特開２００１−５６３３９号公報

しかしながら、従来技術は、以下に述べるように、簡便に検出操作が行えるものではなかった。すなわち、特許文献１に開示の方法は短時間で検出可能であるが、粘着シートに発色性物質を接触させることを要し簡便に測定できるとは言い難かった。特許文献２及び３に記載の方法は被検体の表面を洗うなどして被検液を採取する必要があり、これも簡便な方法であるとは言い難かった。特許文献４に開示の方法は反応部分を素手などにて汚染することを防止する技術であり測定方法を簡略化するものではない。

本発明は上記実情に鑑み完成されたものであり、検査者の技量によらず、簡便な手法で被検物質を抗原抗体反応を利用して検出することができる検出装置及び方法を提供することを解決すべき課題とする。

上記課題を解決する目的で本発明者らは鋭意検討を行い、被検体の表面から洗浄などによって被検液を採取することに代えて、被検体の表面に存する被検液に対し、直接接触させることで被検液の採取の手数を減らすという着想に想到し、以下の発明を完成した。すなわち、上記課題を解決する本発明の抗原抗体反応を利用した検出装置は、被検体の表面に在る被検液が厚み方向に透過可能であって、該被検液中に含有される１以上の被検物質に特異的に結合する被検物質結合抗体が透過する該被検液に対して溶解可能に保持される抗体保持膜と、
前記被検物質及び／又は前記被検物質結合抗体に特異的に結合する固定化抗体を１種以上もち、該抗体保持膜の一面側に一面側が接するように積層された抗体固定化膜と、
を有し、
前記抗体保持膜側を前記被検体の表面に接触させて用いることを特徴とする。

また、上記課題を解決する本発明の検出方法は、前記被検体の表面が濡れていない場合に該被検体の表面を濡らす工程と、
本発明の抗原抗体反応を利用する検出装置の前記抗体保持膜側を該被検体の表面に接触させる工程と、
該検出装置の前記抗体固定化膜にまで該被検液が至るまで放置する工程と、
該抗体固定化膜の他面側に現れる前記被検物質の量にて該被検物質を検出する工程とを有することを特徴とする。

つまり、被検体の表面の被検液は、本発明の検出装置の抗体保持膜側から順次浸透していくことで抗原抗体反応が進行し、被検物質が被検液中に含有される場合に検出されることになる。具体的には、まず被検液は抗体保持膜に浸透していく過程で被検物質結合抗体を溶解する。溶解した被検物質結合抗体は、被検液中に被検物質を含む場合に、その被検物質と特異的に結合する。その後、被検液は抗体固定化膜に至ることになる。抗体固定化膜では被検液中の被検物質（及び／又は被検物質結合抗体）が固定化抗体に捕捉されることになる。被検液中の被検物質の量によって固定化抗体に捕捉される量が変化するので、固定化抗体に捕捉された量により被検物質の有無や量を検出することができる。

そして、前記抗体保持膜及び前記抗体固定化膜の間に積層され、前記被検液が厚み方向に透過可能な第１多孔質膜をもつことが望ましい。前記抗体保持膜及び前記抗体固定化膜の間に第１多孔質膜を介在させることで、両者の間での被検液の逆流が抑制できる。また、前記抗体保持膜側に積層され、前記被検液が厚み方向に透過可能な第２多孔質膜を有することが望ましい。第２多孔質膜を介して被検液に接触させることで、抗体保持膜に一旦浸透した被検物質結合抗体が被検体の表面に逆流することを防止できる。

また、前記抗体固定化膜は前記被検液が厚み方向に透過可能であり、該抗体固定化膜の他面側に該被検液を吸収する吸収膜を有することが望ましい。抗体固定化膜の他面側に被検液を吸収可能な吸収膜を有することで、抗体保持膜及び抗体固定化膜の双方に大量の被検液を透過させることが可能になって被検物質の検出感度が向上できる。吸収膜は被検物質の検出を妨げないように、前記吸収膜は前記被検液を吸収した後に透明乃至半透明になることが望ましい。

更に、前記被検液が透過できない材料からなり、前記抗体保持膜の前記他面側に積層され、所定の大きさの切り欠きが形成された被検液整流膜を有することで、被検液が浸透する部位を制御して均一に流れるようにすることができる。特に、前記被検液整流膜の前記切り欠きは２以上形成されており、前記抗体保持膜及び前記抗体固定化膜における前記被検物質結合抗体及び前記固定化抗体は、該孔が形成された位置に対応する位置毎に異なる種類又は組み合わせの前記被検物質に対応している構成を採用することで１つの検出装置にて複数の被検物質を独立して検出することが可能になる。

そして、前記抗体固定化膜の他面側の最表面に配置された前記被検液が透過できない保護膜を有することで、被検液に触れる虞が少なくなり、取り扱い性が良くなる。

更にまた、前記被検物質結合抗体は標識されており、前記抗体固定化膜は、前記固定化抗体にて捕捉された該被検物質結合抗体の該標識により前記被検物質を検出することで、光学的な手段によっても被検物質の検出を行うことが可能になる。

本発明の検出装置は上記構成を有することから被検体の表面からの被検液の採取の手間を省くことができ、簡便に被検物質を検出することができる。

以下、本発明の検出装置及び方法について実施形態に基づき詳細に説明する。本実施形態の検出装置は被検体の表面における被検物質を検出する方法である。被検物質としては抗原抗体反応における抗原として作用可能な物質であれば特に限定されない。例えば、細菌（病原性の菌など）、特定のタンパク質（食物中のアレルゲン、生体の皮膚から染み出した生理活性物質など）などである。

これら被検物質は液中に溶解された状態で本検出装置に適用される。被検物質が最初から水などに溶解して液状であればそのまま被検液として適用することも可能であり、液量が充分でなかったり、乾燥している場合には被検物質を含有しない水などを被検体の表面を霧吹きなどで湿潤させることで被検液とすることができる。

（構成）
本実施形態の検出装置は抗体保持膜と抗体固定化膜とがこの順に積層された積層体である。必要に応じてその他の部材を有することもできる。

抗体保持膜は膜状・多孔質の部材であり、被検液が厚み方向に透過可能になっており、毛細管現象などにより被検液が厚み方向に浸透可能になっている。例えば、不織布が例示される。抗体保持膜には被検物質に対応する抗体である被検物質結合抗体が保持されている。被検物質結合抗体は物理的な吸着により抗体保持膜上に保持されたり、抗体保持膜に固定化された被検物質などに対して抗原抗体反応を利用して結合させることで保持することもできる。透過する被検液に対して被検物質結合抗体が溶解・溶出する。抗原抗体反応を利用して保持する場合には被検液中の被検物質と競合的に結合することで被検物質結合抗体が溶出する。

被検物質結合抗体は後の検出を容易にする目的で何らかの標識がなされていることが望ましい。標識としては金コロイド、蛍光物質、酵素などが挙げられる。金コロイド、蛍光物質は発色や蛍光を検出することが可能であり、酵素は反応を促進する基質を加えてその基質の変化により検出することができる。

抗体固定化膜は毛細管現象などにより被検液が厚み方向に浸透可能になっている。被検液が厚み方向に透過可能にすることもできる。抗体固定化膜としては不織布が例示される。抗体固定化膜には被検物質及び／又は被検物質結合抗体に特異的に結合する固定化抗体を１種以上もつ。固定化抗体は抗体固定化膜上に結合されている。ここでいう固定化抗体の固定化（結合）は被検液に溶出しない程度で充分である。

固定化抗体に被検物質（及び／又は被検物質結合抗体）が結合された後、同時に結合している被検物質結合抗体（及び／又は被検物質）の存在を検出することで被検物質の存在を検出する。

固定化抗体は種々の形状（＋、−、○、×、陽、陰など）を示すように抗体固定化膜上に固定化することで被検物質を検出したときにその形状を表出させることができる。

その他必要に応じて有することができる部材としては、第２多孔質膜、吸収膜、被検液整流膜、保護膜などである。

第１多孔質膜は被検液が厚み方向に透過可能な膜状の部材である。毛細管現象などにより被検液が厚み方向に浸透する。第１多孔質膜により抗体保持膜から抗体固定化膜への被検液の流れが逆流することを防止できる。

第２多孔質膜は第１多孔質膜と概ね同じ構成をもつ部材である。第２多孔質膜は抗体保持膜の他面側に積層されている。抗体保持膜との間は接していても良いし、他の部材を介して積層されていても良い。第２多孔質膜は抗体保持膜が直接被検体の表面に接することを防いで被検液の流れの逆流を防止し、被検物質結合抗体による被検体の表面の汚染を防止することができる。

吸収膜は抗体固定化膜の他面側に積層される部材である。多孔質体などから形成される。吸収膜が被検液を吸収することで、抗体保持膜、第１多孔質膜、抗体固定化膜の順で被検液を大量に流すことが可能になり、被検液中の被検物質の検出感度が向上できる。

抗体固定化膜上での被検物質を光学的な検出を容易にする目的で、吸収膜は被検液が浸透した際に透明乃至は半透明になることが望ましい。例えば、透明な繊維（セルロース、化学処理したセルロース、ポリビニルアルコール、アクリル樹脂、ＰＥＴ、ポリアミドなど）などから形成した不織布を採用することができる。

被検液整流膜は被検液が透過しない素材から形成されている。被検液整流膜は本検出装置の抗体保持膜側に積層される。抗体保持膜との間は接していても良いし、他の部材を介して積層されていても良い。被検液整流膜は所定の大きさの切り欠きが形成されている。この切り欠きの部分のみ被検液が浸透する。切り欠きを２以上設け、それぞれ設けた切り欠きの位置毎に異なる種類の被検物質や異なる濃度の被検物質に対応する、被検物質結合抗体及び固定化抗体を保持・固定させることで一回の測定で２以上の被検物質や被検物質の濃度を検出することが可能になる。

保護膜は被検液を透過しない材料から形成されている。光学的な検出を妨げないように透明乃至は半透明な素材から形成されていることが望ましい。本実施形態の検出装置の操作者が被検液に触れる虞が少なくなる。

（作用効果）
以下に本実施形態の検出装置を用いて被検物質の検出を行う方法について説明する。本実施形態の検出装置は抗体保持膜側を被検体の表面に付着させて用いる。被検体の表面は湿潤していることが要求される。湿潤していない場合には被検物質を含有しない水（適正な緩衝液、純水など）を吹き付けるなどして湿潤させる。

被検体の表面に抗体保持膜側を付着させると、被検体の表面に在る被検液が抗体保持膜に染み込んでくる。ここで、被検液整流膜が在る場合には被検液整流膜の切り欠き部分のみから染み込んでくる。第２多孔質膜を有する場合には速やかに被検液が浸透される。

抗体保持膜に至った被検液は保持された被検物質結合抗体を溶解する。被検液中に含有する被検物質には被検物質結合抗体が特異的に結合する。被検液はそのまま第１多孔質膜を介して抗体固定化膜に浸透していく。吸収膜を採用した場合には、被検液を吸収して大量の被検液を抗体保持膜、第１多孔質膜、抗体固定化膜の順で透過させることができる。

抗体固定化膜では、被検物質と被検物質結合抗体とが結合した複合体に対して固定化抗体が結合する。その結果、固定化抗体が固定化された部位に被検物質及び被検物質結合抗体の複合体が濃縮される。

固定化抗体に被検物質などが結合することで被検物質が検出できる。被検物質結合抗体として標識された化合物を採用した場合には、その標識部分を検出することで被検物質が検出できる。

従って、本実施形態の検出装置は被検体の表面からの試験試料の採取の手間を省略することが可能になり誰でも簡単に被検物質の検出を行うことができる。

（試験１）
図１に示すように、被検液整流膜としてのポリエチレンシート１１と、抗体保持膜、第１多孔質膜、抗体固定化膜にそれぞれ対応する３枚のニトロセルロースメンブレン１２〜１４（Millipore#HABG04700）とを積層し、検出装置のモデルを形成した。ポリエチレンシート１１は、直径６ｍｍの穴（切り欠き）を２箇所ずつ３組開けて形成した。

１５０ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍＬを被検体としての卓９０上に垂らし、検出装置を上からポリエチレンシート１１側が接するように被せた。ポリエチレンシート１１に形成した穴から緩衝液が浸透し３枚のメンブレン１２〜１４に円形の切り欠きの形状を保ったまま染み込ませることができた。

被検液整流膜及びを採用することで、測定部位を厳密に選択することなく必要な部位に被検液を染み込ませることができた。

（試験２）
図２に示すように、下からグラスファイバーシート（Millipore#GFCP103000）からなる抗体保持膜２１、ニトロセルロースメンブレン（Millipore Durapore メンブレンフィルター、０．１ｍｍＶＶＰＰ）からなる抗体固定化膜２２、キムワイプ（商標）からなる吸収膜２３、ポリエチレンシートからなる保護膜２４の順に積層して検出装置を製造した。

抗体保持膜２１は、グラスファイバーシート上に被検物質結合抗体としてのRabbit polyclonal to Ovalbumin(abcam)を保持させた膜である。

まず、直径４０ｎｍの金コロイド（British-biocell International）に対しRabbit polyclonal to Ovalbumin(abcam)を混合した。緩衝液には１０％NaClを用いたものと、１０％Sucroseを用いたものとの２種類を用意した。

１０％Sucroseを用いた金コロイド溶液を２５μＬと、１０％NaClを用いた金コロイド溶液を２５μＬとをグラスファイバーシート上にそれぞれ２箇所ずつ滴下して風乾することで抗体保持膜２１を得た。

抗体固定化膜２２は、ニトロセルロースメンブレンに対し、Anti OVA（Rabbit Polyclonal to Ovaalbumin(abcam))とAnti Rabbit（GtxRabbitIgG#AP132(CHEMICON)）とを滴下し、風乾して４箇所２２２に固定した。固定化抗体を固定化した部位２２２は、Anti OVAが周りを囲む円形の部位２２２ａに、Anti Rabbitが中央の線状の部位２２２ｂにそれぞれ固定化されている。従って、被検液中に被検物質としてのOVAを含有する場合には中央の線状の部位２２２ｂが金コロイドにより発色し、その周りの円形の部位２２２ａは被検液中の被検物質の有無に係わらず被検液の透過によって発色することになる。

被検体としてのスライドグラス９０上に１００μｇ／ｍＬ ＯＶＡ(Wako, Albumin from Chicken Egg#010-17071)２５μＬを２箇所に滴下し、１５０ｍＭリン酸緩衝液２５μＬを更に２箇所滴下した。

前記スライドガラス９０上に製造した検出装置を載せたところ、被検液が浸透して吸収膜２３が透明になり、保護膜２４を通してシグナルを観察することができた。Sucrose緩衝液を用いて調製した金コロイド溶液とOVAとの組み合わせでは円状及び棒状のシグナルが観察された。NaCl緩衝液を用いて調製した金コロイド溶液とOVAとの組み合わせでは円状のシグナルが観察され、線状のシグナルはうっすらと観察できた。リン酸緩衝液では円状のシグナルのみが観察された。

つまり、被検液としてＯＶＡを含有する場合には調製に用いた緩衝液の種類によって反応性に差はあるものの被検物質（ＯＶＡ）の存在が検出され、OVAを含有しない場合には発色せずにＯＶＡが存在しないことを検知できることが判った。

試験１にて用いた検出装置を示す概略分解斜視図である。 試験２にて用いた検出装置を示す概略分解斜視図である。

符号の説明

１１…被検液整流膜
１２〜１４…ニトロセルロースメンブレン
２１…抗体保持膜
２２…抗体固定化膜 ２２２…固定化抗体が固定された部位
２３…吸収膜
２４…保護膜
９０…被検体

Claims (10)

1. 被検体の表面に在る被検液が厚み方向に透過可能であって、該被検液中に含有される１以上の被検物質に特異的に結合する被検物質結合抗体が透過する該被検液に対して溶解可能に保持される抗体保持膜と、
   前記被検物質及び／又は前記被検物質結合抗体に特異的に結合する固定化抗体を１種以上もち、該抗体保持膜の一面側に一面側が接するように積層された抗体固定化膜と、
   を有し、
   前記抗体保持膜側を前記被検体の表面に接触させて用いることを特徴とする抗原抗体反応を利用した検出装置。
2. 前記抗体保持膜及び前記抗体固定化膜の間に積層され、前記被検液が厚み方向に透過可能な第１多孔質膜を有する請求項１に記載の検出装置。
3. 前記抗体保持膜の他面側に積層され、前記被検液が厚み方向に透過可能な第２多孔質膜を有する請求項１又は２に記載の検出装置。
4. 前記抗体固定化膜は前記被検液が厚み方向に透過可能であり、
   該抗体固定化膜の他面側に該被検液を吸収する吸収膜を有する請求項１〜３のいずれかに記載の検出装置。
5. 前記吸収膜は前記被検液を吸収した後に透明乃至半透明になる請求項４に記載の検出装置。
6. 前記被検液が透過できない材料からなり、前記抗体保持膜側に積層され、所定の大きさの切り欠きが形成された被検液整流膜を有する請求項１〜５のいずれかに記載の検出装置。
7. 前記被検液整流膜の前記切り欠きは２以上形成されており、
   前記抗体保持膜及び前記抗体固定化膜における前記被検物質結合抗体及び前記固定化抗体は、該孔が形成された位置に対応する位置毎に異なる種類又は組み合わせの前記被検物質に対応している請求項６に記載の検出装置。
8. 前記抗体固定化膜の他面側の最表面に配置された前記被検液が透過できない保護膜を有する請求項１〜７のいずれかに記載の検出装置。
9. 前記被検物質結合抗体は標識されており、
   前記抗体固定化膜は、前記固定化抗体にて捕捉された該被検物質結合抗体の該標識により前記被検物質を検出する請求項１〜８のいずれかに記載の検出装置。
10. 前記被検体の表面が濡れていない場合に該被検体の表面を濡らす工程と、
    請求項１〜９のいずれかに記載の検出装置の前記抗体保持膜側を該被検体の表面に接触させる工程と、
    該検出装置の前記抗体固定化膜にまで該被検液が至るまで放置する工程と、
    該抗体固定化膜の他面側に現れる前記被検物質の量にて該被検物質を検出する工程とを有することを特徴とする抗原抗体反応を利用する検出方法。

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