JP2008099602A - 抗体遺伝子の可変領域における変異部位の分布状況の調節法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入する方法の提供を目的とする。
【解決手段】 本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（以下、ＨＤＡＣとする）２遺伝子の機能を選択的に低下又は喪失させ、或いは、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子領域に多様な変異を導入する方法を提供するものである。
【選択図】図４

Description

本発明は、抗体遺伝子領域に変異を導入する方法に関する。より詳細には、抗体遺伝子領域に種々の変異を導入し、多様な抗体分子を取得する方法に関する。

体細胞相同組換えは、遺伝子の多様性を産み出す要因の一つとして、生体内において重要な役割を果たしている。特に、抗体遺伝子は、ＶＤＪ組換により生じた可変領域が更に再編成され、非常に多くの異なる特異性を持つ抗体分子をコードすることになる。このような細胞内における一連の現象を、特に、可変領域の再編成を自在に誘導することが可能になれば、所望の特性を持つ抗体を取得することが可能となる。

また、体細胞突然変異も抗体に多様性をもたらす現象の一つであり、ＸＲＣＣ２及びＸＲＣＣ３を欠失させたＤＴ４０細胞株においては、体細胞突然変異の頻度が増加するとの報告があり（非特許文献１）、ＸＲＣＣ２若しくはＸＲＣＣ３をノックアウトしたＤＴ４０細胞を用いた種々の特性を持つ抗体の取得が試みられている（特許文献１、非特許文献２）。さらに、体細胞遺伝子変換と体細胞突然変異の双方に関与するＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子の発現をＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより一時停止させ、抗体産生クローンを単離する技術も報告されている（特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、これらの技術により取得した抗体は、抗原認識上の特異性、親和性などの点において不十分な点が残されていた。

一方、発明者らは、可変領域の再編成が相同組換え機構（特に、体細胞遺伝子変換）によって誘導される可能性に着目し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、多様な抗体を取得する技術を開発した（特許文献３、非特許文献４）。この技術は、ニワトリＢ細胞由来の培養細胞株ＤＴ４０の抗体遺伝子座において、ヒストンアセチル化酵素阻害剤等（例えば、トリコスタチンＡなど）による処理で体細胞遺伝子変換を著しく促進させ、その結果として抗体の多様性を獲得する方法を提供する。本技術は、それまで報告されていた技術に比較して、多様な抗体分子の取得を可能にするもので、非常に有用性の高い技術であるが、本技術によると、抗体可変領域の一部（超可変領域１）に選択的に遺伝子変換が誘導される傾向があった。そのため、取得される抗体の多様性を少なからず狭めてしまう可能性があった。

Ｓａｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ ４１２：９２１−９２６，２００１ Ｃｕｍｂｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１１２９−１１３４， ２００２ Ｋａｎａｙａｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：ｅ１０．，２００６ Ｓｅｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：７３１−７３５，２００５ 特開２００３−５０３７５０号公報 特開２００４−２９８０７２号公報 国際公開公報ＷＯ２００４／０１１６４４

本発明者らは、上記事情に鑑み、抗体遺伝子可変領域に導入される変異の分布範囲を調節する方法について鋭意研究を行った結果、ヒストン脱アセチル化酵素２（ＨＤＡＣ２）遺伝子の機能を選択的に抑制することにより達成できることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入する方法の提供を目的とする。
また、本発明は、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入することにより、多様な特性を有する抗体分子の作製方法を提供する。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「コード領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列からなる遺伝子の機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５
（ｂ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードするタンパク質がヒストン脱アセチル化活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記機能低下又は機能喪失が、前記（ａ）又は（ｂ）で示される塩基配列からなる遺伝子に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記機能低下又は機能喪失が、前記（ａ）又は（ｂ）で示される塩基配列からなる遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるタンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ヒストン脱アセチル化活性を有するタンパク質」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記免疫細胞を、付加的にＨＤＡＣ阻害剤にも接触させて処理することを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記ＨＤＡＣ阻害剤がトリコスタチンＡであることを特徴とする上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記免疫細胞がＤＴ４０細胞であることを特徴とする上記（６）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記抗体遺伝子が抗体軽鎖遺伝子であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずかに記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法により抗体遺伝子可変領域に変異を導入した免疫細胞」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法により変異が導入された抗体遺伝子がコードするポリペプチドを少なくとも１つを含む抗体分子」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「前記抗体分子がＩｇＭである上記（１１）に記載の抗体分子」である。

本発明の方法によれば、抗体遺伝子可変領域の全領域において変異を導入することができる。

本発明の方法によれば、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入することにより、多様な特性を有する抗体分子を作製することができる。

本発明の一実施形態は、ヒストン脱アセチル化酵素（以下、ＨＤＡＣとする）２遺伝子の機能を選択的に低下又は喪失させ、或いは、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子領域に多様な変異を導入する方法である。
「ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）」は、活性中心に亜鉛を含有する金属酵素でありアセチル化されたヒストンからアセチル基を脱離させる反応を触媒する。ＨＤＡＣの細胞内における主な機能としては、クロマチン構造を制御し、転写等の活性化又は抑制のコントロールなどが知られている。ＨＤＡＣはいくつかのクラス、例えば、ヒトの場合、クラスＩ（ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７）に大別されている。これらのアイソフォームは、他の多くのタンパク質と相互作用することにより巨大複合体を構成している。例えば、ＨＤＡＣ１とＨＤＡＣ２はＳＩＮ３複合体やＮＵＲＤ／Ｍｉ２複合体中に存在している。

本発明における「ＨＤＡＣ２遺伝子」とは、そのコード領域が、配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡのみならず、コード領域が、配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒストン脱アセチル化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものも含まれる。また、「遺伝子」には、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが含まれ、ゲノムＤＮＡの場合には、エキソン、イントロンのみならず、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節領域も含まれる。
本発明における「抗体遺伝子」には、免疫グロブリン遺伝子と同義で、重鎖（Ｈ鎖）抗体遺伝子と軽鎖（Ｌ鎖）抗体遺伝子の両方が含まれる。

配列番号１、３又は５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３又は５で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点に近いか、又はそれ以下の環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。

また、本発明における「ＨＤＡＣ２タンパク質」とは、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２、４又は６で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒストン脱アセチル化活性を有するタンパク質である。
あるいは、配列番号２、４又は６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号２、４又は６で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒストン脱アセチル化活性を有するタンパク質である。
なお、本明細書中において、特に断らない限り、「タンパク質」と「ポリペプチド」は同じ意味で用いるものとする。

本発明における「免疫細胞」としては、抗体産生能を有するＢ細胞を指し、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ニワトリなどに由来する細胞を使用することができる。好ましくは、株化された細胞が使用され、特に好ましくは免疫細胞としてはＤＴ４０細胞が使用される。
「ＤＴ４０細胞」とは、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であり、当該細胞の保有する染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）を加えられた、誘導体株、サブラインも含む。
本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される免疫細胞に適した培地、培養条件（培養温度、ＣＯ_２濃度）下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される免疫細胞がＤＴ４０細胞である場合、例えば、培地はＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、培養温度は例えば３９．５℃、５％のＣＯ_２濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの有無を確認する。

ＨＤＡＣ２遺伝子の機能を低下又は機能喪失させるために、ＨＤＡＣ２遺伝子機能を改変することができる。遺伝子の機能を改変する方法としては、限定はしないが、例えば、細胞内に存在するＨＤＡＣ２遺伝子に突然変異を導入する方法、ＨＤＡＣ２遺伝子全体を破壊する方法、ＨＤＡＣ２遺伝子の転写プロモーターを改変して発現量を制御する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、ＨＤＡＣ２遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、ＨＤＡＣ２遺伝子に突然変異を導入する方法、ＨＤＡＣ２遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、ＨＤＡＣ２遺伝子全体を破壊する方法である。

遺伝子全体を破壊する方法にはクローン化した標的遺伝子（ＨＤＡＣ２遺伝子）の必須領域ＤＮＡ配列（破壊すべき領域）にマーカー遺伝子を挿入したＤＮＡを細胞に形質転換する方法がある。細胞内に導入された該ＤＮＡは、ＨＤＡＣ２遺伝子の両隣接配列を介した相同組換えを誘発するため、染色体上のＨＤＡＣ２遺伝子をマーカー遺伝子で置換することができ、その結果、ＨＤＡＣ２遺伝子を破壊することができる。
また、遺伝子機能を喪失させるために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。この場合、ＨＤＡＣ２遺伝子によってコードされるタンパク質の機能ドメインに関する塩基配列をもとに、短いＲＮＡ二本鎖もしくは該ＲＮＡを産生するベクターを細胞内に導入することで、ＨＤＡＣ２遺伝子の機能低下または機能喪失をもたらすことができる。
加えて、ＨＤＡＣ２遺伝子上流域に誘導可能な転写プロモーターを配置して条件的にＨＤＡＣ２遺伝子の発現を制御したり、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰなどの部位特異的組換え酵素系を用いてＨＤＡＣ２遺伝子と転写プロモーターの相対位置を転換させて発現を制御したりする方法が存在する。
さらに、インビトロにおいて突然変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。ＨＤＡＣ２遺伝子に突然変異を導入することで機能改変を行う場合、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性を欠失させるように変異を導入すること、該タンパク質と他のタンパク質が相互作用を行うのに必要な部位に変異を導入し該相互作用を消失させるような変異を導入することなどが望ましい。

ＨＤＡＣ２タンパク質の活性若しくは機能を低下又は喪失させるためには、上述のＨＤＡＣ２遺伝子の機能を低下又は喪失させるために使用可能な方法の他に、当業者において周知の方法を使用することができる。限定はしないが、例えば、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性若しくは機能を低下又は喪失させる抗体を目的の細胞内へ導入する方法、ＨＤＡＣ２タンパク質の不活性型（ドミナントネガティブ）を目的の細胞内へ導入するか又は目的の細胞内で発現させる方法、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性を阻害する低分子のインヒビターを目的の細胞内へ導入する方法などを挙げることができる。
抗体やＨＤＡＣ２タンパク質の不活性型を細胞内へ導入するためには、例えば、細胞膜透過性ペプチドを抗体、ＨＤＡＣ２タンパク質の不活性型に連結して細胞内へ導入してもよく、又は市販のキットを使用することもできる。
ＨＤＡＣ２タンパク質の不活性型を細胞内で発現させるためには、当業者の通常の技術常識に従って容易に行うことができる。目的の細胞に応じて、発現ベクター（目的の細胞に応じたプロモーターなど、発現誘導に必要な構成要素を備えているもの）を選択して、適切な培養条件下にてＨＤＡＣ２タンパク質の不活性型を発現させることができる。

本発明の他の実施形態は、ＨＤＡＣ２遺伝子の機能を低下又は喪失させ、或いは、ＨＤＡＣ２タンパク質の活性若しくは機能を、低下又は喪失させ、該ＨＤＡＣ２遺伝子、ＨＤＡＣ２タンパク質が存在する免疫細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤と接触させて処理し、該免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子領域に多様な変異を導入する方法である。
「ＨＤＡＣ阻害剤」には、ＨＤＡＣの活性を抑制する活性を持つ抗体などのタンパク質因子、トリコスタチンＡ、ブチル酸及びバルプロ酸など小分子化合物など、当業者に知られているものであれば如何なるものも使用可能であると思われるが、最も好適にはトリコスタチンＡ が使用される。ＨＤＡＣ阻害剤で免疫細胞を接触する場合、ＨＤＡＣ阻害剤での処理濃度及び処理時間は、接触させる細胞が死に至らない範囲内であれば、使用可能である。具体的には、トリコスタチンＡの場合には、処理濃度は、１〜２０ｎＭが好ましく、処理時間としては、２週間〜４ヶ月が好ましい。

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１：ｃｈＨＤＡＣ２−／−株の作製と、継続培養による抗体遺伝子（重鎖・軽鎖）可変領域の多様化
＜方法＞
１．ｃｈＨＤＡＣ２−／−株（ホモ接合遺伝子破壊株）の作製
下記プライマーセットを用いて、ＤＴ４０ゲノミックＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりｃｈＨＤＡＣ２遺伝子のＢａｍＨＩ（６９４９）−ＳａｃＩ（１３１４０）、６．２ｋｂｐ断片を増幅し、制限酵素で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ部位に挿入してクローニングを行った。このプラスミドからＳｔｕＩ（７５４３）−ＳｔｕＩ（１０１２９）、２．６ｋｂｐ断片（第３エキソンの一部と、第４エキソン及び第５エキソンを含む）を切り出し、そこにβ−アクチンプロモーターで発現するｌｏｘＰ ｆｌａｎｋｅｄ ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｒ（若しくはｐｕｒｏｍｙｃｉｎ Ｒ）選択マーカー配列を挿入した（図１）。この後、３０μｇの組換え体ＤＮＡをＳａｃＩで切断したのち、電気穿孔法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ，５５０Ｖ，２５ｕＦＤ）によりＤＴ４０細胞のＣＬ１８株に形質転換を行った。ブラストサイジン耐性コロニーから、まずヘテロ接合遺伝子破壊株（ｃｈＨＤＡＣ２＋／−）を選別し、これらにさらにピューロマイシン耐性マーカーを含む遺伝子破壊マーカーを形質転換し、最終的に二系統のホモ接合形質転換体（ｃｈＨＤＡＣ２−／−）を分離した。

これら２系統のｃｈＨＤＡＣ２遺伝子破壊株をＷＬ３．１と名付け、原株を凍結保存した。これらの株の確認は、ｃｈＨＤＡＣ２プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにて実施した（図２）。ＲＴ−ＰＣＲ反応は“ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、２００ｎｇの鋳型ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、１０ｐｍｏｌのｃｈＨＤＡＣ２用、およびβ−アクチン（対照）用のＰＣＲプライマー・セットを加えて５０μｌ反応液中で実施した。反応条件は、５５℃３０分、９４℃２分の前処理後、９４℃１５秒／６０℃３０秒／６８℃１分を２５サイクル実施し， 最後に６８℃で５分反応させた。念のためゲノミック・サザンハイブリダイゼーションによる遺伝子破壊の確認を行った。
ｃｈＨＤＡＣ２ ＰＣＲプライマーセット：
上流：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＧＧ−３’ （配列番号７）
下流：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＣＣ−３’ （配列番号８）
ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット：
（ｃｈＨＤＡＣ２用）
上流：５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧ−３’ （配列番号９）
下流：５’−ＣＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＧ−３’（配列番号１０）
（β−アクチン用）
上流：５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧ−３’
（配列番号１１）
下流：５’−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＧＴＣＣＧＴＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＡ−３’
（配列番号１２）

２．ｃｈＨＤＡＣ２−／−株の継代培養による抗体遺伝子（重鎖・軽鎖）可変領域の多様化
上記のＷＬ３．１を、ＣＯ_２恒温槽にて５％のＣＯ_２存在下で３９．５℃で標記の期間（３週間〜２ヶ月）培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ，２−メルカプトエタノール ５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯ ２ｍｇ／ｍｌに溶解したものをストックとし、最終濃度が２．５，５，１０ｎＭとなるように、適宜培地で希釈して用いた。細胞濃度は１０５〜２×１０^６個／ｍｌに保ちながら培養を続けた。

３．表面ＩｇＭ陽性クローンの蛍光セルソーター（ＦＡＣＳ）解析による遺伝子変換頻度の推定
細胞密度〜１０^６の細胞培養液を１．５ｍｌチューブ中で１０００ｘｇ、５分遠心して細胞を回収したのち、染色バッファー（リン酸バッファーＰＢＳ：１０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４に０．３％ＢＳＡを添加したもの）２００μｌに懸濁した。細胞を再び遠心により回収し、次にＦＩＴＣラベルした抗ニワトリＩｇＭ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を染色バッファーで１／２５０倍希釈したものを２００μｌで懸濁し、氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により回収し再び染色バッファー２００μｌに懸濁・遠心し、細胞を洗浄した。この洗いのステップをもう一度繰りかえしたのち、細胞を５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ナカライ社）を含む染色バッファー１００μｌに懸濁した。ＩｇＭを発現している細胞の割合は、ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により、約１０，０００個程度の細胞を測定して算出した。その際、ヨウ化プロピジウムにより染色される細胞は死細胞としてゲートアウトした。

４．ゲノムＤＮＡ／ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出
細胞約１０万個（ゲノムＤＮＡ用）若しくは２００万個（ＴｏｔａｌＲＮＡ用）を１．５ｍｌチューブに遠心（１０００ｇ、５分）により回収し、−８０℃で細胞ペレットのサンプルを保存した。その後解凍して、Ｍａｇ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ ＭＦＸ−２０００ （Ｔｏｙｏｂｏ社）とＧｅｎｏｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、若しくは、ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ゲノムＤＮＡとＴｏｔａｌＲＮＡを精製し、１００μｌの滅菌水に溶解した。

５．抗体軽鎖遺伝子可変領域の配列の解析
抗体軽鎖および重鎖遺伝子の可変領域の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００）を利用した。ゲノムＤＮＡ溶液１μｌ（細胞５０００個相当）を鋳型とし、下記のプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ使用した。
軽鎖可変領域：
上流：５’−ＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＧ−３’ （配列番号１３）
下流：５’−ＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧ−３’ （配列番号１４）
重鎖可変領域：
上流：５’−ＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣ−３’
（配列番号１５）
下流：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＧＧ−３’
（配列番号１６）
ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いて、５０μｌ反応液中で実施した。反応条件は、９８℃２分の後、９８℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１分を２７サイクル行い、最後に７２℃５分反応させた。その後、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１μｌ加え、７２℃１５分反応させた後、全反応液の２０μｌ分をアガロースゲル電気泳動で分離した。軽鎖遺伝子可変領域に相当するバンドを切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）によりＤＮＡを回収後、ＴＯＰＯ−ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションした。その後プラスミドを抽出し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）若しくはＡＢＩ３７３０ｘｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により配列を解析した。

６．ウサギＩｇＧ磁気ビーズの作製：
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｄｙｎａｌ社）を、また磁気スタンドはＤｙｎａｌ ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ社）を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌのバッファーＡ（０．１Ｍ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．４）で３回洗った後、バッファーＡ、２００μｌ中で１２０μｇのウサギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）と３７℃で一晩、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズをバッファーＣ（ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡ）２００μｌで２回洗浄した。その後バッファーＤ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５，０．１％ ＢＳＡ）２００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌのバッファーＣで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファーＣ、２００μｌに懸濁した。

７．ウサギＩｇＧ磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択
トリコスタチンＡ、２．５ｎｇ／ｍｌで週間処理した野生型ＤＴ４０細胞約５×１０^７個を、洗浄バッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）１０ｍｌで１回、さらに１ｍｌで一回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄バッファー中でストレプトアビジン磁気ビーズ（ウサギＩｇＧ磁気ビーズによるセレクションの場合はウサギＩｇＧ磁気ビーズ）５×１０^６個と混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後１ｍｌの洗浄バッファーで５回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を５００μｌに懸濁し、これを３０ｍｌの培地に加えたのち、９６穴プレートに３００μｌずつ分注し、３９．５℃で培養した。

＜結果＞
１．ｃｈＨＤＡＣ２−／−株における抗体遺伝子軽鎖可変領域の多様化
ｃｈＨＤＡＣ２−／−株（ＣＬ１８系統、表面ＩｇＭ陰性クローン）を、５ｎＭトリコスタチンＡ存在下（１４日目以降）／非存在下で０、１４、２１、２８、３５、４２日間培養し、ＦＡＣＳでＩｇＭ陽性細胞数を測定した。
その結果、ｃｈＨＤＡＣ２−／−株はトリコスタチンＡ非存在下では、２８日後に２８％の細胞が表面ＩｇＭ陽性を示したが、その後表面ＩｇＭ陽性細胞の比率は定常状態からやや下降気味に推移することが明らかになった。
これに対し、５ｎＭトリコスタチンＡ存在下では、野生型細胞と同様に表面ＩｇＭ陽性細胞の比率が著しく上昇し、３５日後には７０％近くの細胞が陽性を示した。ただ、野生型ではその後も陽性率が上昇するのに対し、ｃｈＨＤＡＣ２−／−株では７０％程度で定常状態に移行することが明らかになった（図３）。

次に、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３を含む約４００ｂｐの領域のゲノムＤＮＡ配列を解析した。その結果、野生型をトリコスタチンＡ処理した場合に比べ、遺伝子変換が起きる箇所が可変領域全体に分散し、ＣＤＲ２やＣＤＲ３部分にも相当数の変異が導入されることが示された（図４）。
また、多様化のパターンも野生型＋トリコスタチンＡ（３１クローンで１６種類、図５）に比べ複雑化しており、計４３クローンで３８種類、もしくは３０クローンで２２種類が、それぞれ全く異なる配列を有していた。

図６に示す通り、ｃｈＨＤＡＣ２−／−株では、ＣＤＲ１部位に変異が認められるものが全クローンの３０−４５％、ＣＤＲ２および３領域を含むＣＤＲ１以外の領域に変異が認められるものが３０−４５％程度となっている。
ｃｈＨＤＡＣ２−／−株にトリコスタチンＡを添加して培養した場合は、ＣＤＲ１領域での遺伝子変換がより顕著に認められるのに加え、ＣＤＲ２やＣＤＲ３部分を含むＣＤＲ１以外の領域にも相当数の変異が導入され、ｃｈＨＤＡＣ２−／−株の効果とトリコスタチンＡ処理の効果が相加的なものであることが判明した（図７）。

２．上記多様化処理細胞群からウサギＩｇＧを固定した磁気ビーズを用いての抗体産生クローンの分離
ｃｈＨＤＡＣ２−／−株にトリコスタチンＡを添加して６０日間以上培養して得られた細胞集団に、ウサギＩｇＧを結合させた磁気ビーズを添加した。強固に結合する細胞を磁石で回収し、９６穴プレートで培養したところ、多数のクローンが増殖した。図８にウサギＩｇＧに対する抗体作製例（クローンＨ１１が特異抗体）のエライザ（ＥＬＩＳＡ）データを示す。

３．ｃｈＨＤＡＣ２−／−株における抗体遺伝子重鎖可変領域の多様化
上記、抗体軽鎖遺伝子領域で確認された結果は、抗体重鎖遺伝子領域においても、同様に確認された（図９）。

本発明は、抗体遺伝子の可変領域に変異を導入する方法を提供する。さらに、本方法を用いると種々の特性（抗原への特異性、抗原への親和性など）を備えた所望の抗体を作製することができる。従って、これまで、作製が困難であった所望の抗体を本発明の方法により取得することが可能となり、医療分野における治療、創薬などの有効な手段として活用することができる。

ＨＤＡＣ２遺伝子ノックアウトコンストラクトの模式図を示す。 ｃＨＤＡＣ２遺伝子が破壊されたことを確認したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＷＴは野生型株を、（＋／−）はヘテロ接合遺伝子破壊株を、（−／−）はホモ接合遺伝子破壊株の結果である。 野生型とｃｈＨＤＡＣ２−／−細胞の遺伝子変換頻度の結果を示す。横軸は、培養の時間（日）を、縦軸はＩｇＭ＋細胞の割合（％）を表す。３回の培養結果の平均を示す。 ｃｈＨＤＡＣ２−／−２月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。 野生型＋トリコスタチンＡ（５ｎＭ）２月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。 ｃｈＨＤＡＣ２（−／−）、ｃｈＨＤＡＣ２（−／−）＋ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）、ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）細胞集団における配列多様化部位の各超可変領域での比率を示す。 ｃｈＨＤＡＣ２（−／−）＋トリコスタチンＡ（５ｎＭ）１月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。 ウサギＩｇＧに対して作成した抗体クローンのエライザの結果を示す。 ｃｈＨＤＡＣ２（−／−）２月齢細胞集団の抗体重鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。

Claims (12)

1. コード領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列からなる遺伝子の機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。
   （ａ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５
   （ｂ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードするタンパク質がヒストン脱アセチル化活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列
2. 前記機能低下又は機能喪失が、前記（ａ）又は（ｂ）で示される塩基配列からなる遺伝子に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記機能低下又は機能喪失が、前記（ａ）又は（ｂ）で示される塩基配列からなる遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるタンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。
   （ａ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ヒストン脱アセチル化活性を有するタンパク質
5. 前記免疫細胞を、付加的にＨＤＡＣ阻害剤にも接触させて処理することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法
6. 前記ＨＤＡＣ阻害剤がトリコスタチンＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記免疫細胞がＤＴ４０細胞であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
8. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
9. 前記抗体遺伝子が抗体軽鎖遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至７のいずかに記載の方法。
10. 請求項１乃至９のいずれかに記載の方法により抗体遺伝子可変領域に変異を導入した免疫細胞。
11. 請求項１乃至９のいずれかに記載の方法により変異が導入された抗体遺伝子がコードするポリペプチドを少なくとも１つを含む抗体分子。
12. 前記抗体分子がＩｇＭである請求項１１に記載の抗体分子。