JP7609795B2 - 新規選択マーカーを含む細胞株及びタンパク質製造のためのそれらの使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、タンパク質製造のための細胞株及び選択マーカーに関する。

発明の背景
工業規模での組み換えタンパク質の製造は、大量の組み換えタンパク質を産生するクローンの単離を必要とする。異種遺伝子を動物宿主細胞に導入し、そして加えられた遺伝子の発現についてスクリーニングすることは、非常に長く複雑なプロセスである。このプロセスは、トランスフェクション及び安定な長期発現するクローンの選択、並びに対応する組み換えタンパク質について高い発現率を有するクローンのスクリーニングを含む。

発現ベクターから組み換えタンパク質を発現するクローンを生成する場合、宿主細胞は通常は、目的のタンパク質及び選択マーカーの両方を同じベクター上にコードするＤＮＡベクターを用いてトランスフェクトされる。従ってこのような発現ベクターは、発現ベクターが存在するクローンの選択を可能にする選択可能なマーカーを含む。このような選択可能なマーカーはまた、トランスフェクトされたＤＮＡの同時増幅ももたらし得、それにより高産生クローンの単離を可能にし得る。

大部分の選択可能なマーカーは、抗生物質もしくは他の毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質又は細胞生存に必須のタンパク質のいずれかである。いくつかのこのような選択可能なマーカーは当該分野で公知であり、これらとしては、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオマイシン（ｚｅｏｍｙｃｉｎ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）及びヒポキサンチン－グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。特に、ＧＳは、真核生物細胞における工業的組み換えタンパク質製造の分野において選択可能なマーカーとして広く使用される。ＧＳ遺伝子は細胞成長に必須であるグルタミンの合成を可能にし、そしてＭＳＸ（Ｌ－メチオニンスルホキシイミン）により阻害される。ＭＳＸの存在下で、多量のＧＳを発現している細胞のみが残存する。適切なスクリーニングの後、外因性タンパク質を産生する細胞を選択する事が可能である。

以前の出願特許文献１において、本発明者らは、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）の選択可能マーカーとしての使用に基づく発現系を開発した。ＤＨＯＤＨはピリミジン合成に必要な酵素である。従って、ＤＨＯＤＨを阻害する化合物はＤＮＡ合成を阻害し、それ故細胞増殖を阻害する。従ってこの選択マーカーは、レフルノミド及びテリフルノミドのようなＤＨＯＤＨ阻害剤と組み合わせて使用されるＤＨＯＤＨをコードする発現ベクターを含む。

しかし、上記の選択マーカーとともに使用される阻害剤の大部分は毒性である。ＤＨＯＤＨ選択マーカーの場合、例えばテリフルノミドは強力な免疫抑制剤であり、そして特に大規模でのその取扱は、安全性の理由から困難な場合がある。ＧＳ選択マーカーの場合、ＭＳＸは高用量ではけいれん薬であり、それ故取り扱いの問題を生じ得る。ＤＨＦＲ選択マーカーの場合、メトトレキサートは造血及び消化の毒性を示すことが知られており、それによりまた取り扱いの問題を生じる。

ＷＯ２０１６／０６２８３７

従って、目的のタンパク質を産生するクローンの選択を、取り扱い困難な化合物を加えることなく行うことができる発現系の必要が存在する。

本発明はこの必要性を満たす。

発明の要旨
本発明は、目的のタンパク質を産生する細胞を、その細胞株におけるＤＨＯＤＨ遺伝子の部分的又は完全な不活化の結果、ウリジンを含まない培地において選択することができる細胞株の本発明者らによる設計から生じるものである。ＤＨＯＤＨ遺伝子が部分的又は完全に不活化されているこの細胞株は、典型的にはウリジンを添加した培地において増殖されるが、哺乳動物ＤＨＯＤＨ、特に変異した哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列、及び目的のタンパク質を発現するための発現カセットを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされた場合、培地は典型的にはウリジンを含まない培地に変更され、それにより目的のタンパク質を産生する細胞を選択する。

選択圧としての阻害剤の使用を避けることにより、産生細胞の生存能が増加するので、このような発現系は特に有利である。本発明者らは、この毒性の減少が高い生産性と関連付けられることをさらに実証した。

従って本発明は、部分的又は完全に不活化された内因性ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）遺伝子を含む細胞株に関する。

特定の実施形態において、上記細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。

より詳細な実施形態において、細胞株は、
ａ）特にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法のような遺伝子編集法により、細胞における内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を不活化すること、及び
ｂ）該細胞を、ウリジンを含む培地で、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子が部分的又は完全に不活化された細胞株を生成するために適した条件下で培養すること
により製造される。

特定の実施形態において、上記細胞株の内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子の対立遺伝子は全て、部分的又は完全に不活化されている。

さらなる実施形態において、上記細胞株は、外因性哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列及び組み換えタンパク質の発現のための少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含み、ここで該外因性ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列又は配列番号４の配列と少なくとも６０％同一である配列を含む。

その特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列又は配列番号３の配列を含む。

その別の特定の実施形態において、上記組み換えタンパク質はモノクローナル抗体である。

そのなお別の特定の実施形態において、上記ベクターは、抗体軽鎖のクローニングに適した第一の発現カセット、及び抗体重鎖のクローニングに適した第二の発現カセットを含む。

本発明の別の目的は：
（ｉ）上で定義された部分的又は完全に不活化されている内因性ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）遺伝子を含む細胞株、並びに
（ｉｉ）外因性哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列及び組み換えタンパク質を発現するための少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター、
を含む発現系であり、ここで該外因性ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列又は配列番号４の配列と少なくとも６０％同一である配列を含む。

特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列又は配列番号３の配列を含む。

別の特定の実施形態において、上記組み換えタンパク質はモノクローナル抗体である。

なお特定の実施形態において、上記ベクターは、抗体軽鎖のクローニングに適した第一の発現カセット及び抗体重鎖のクローニングに適した第二の発現カセットを含む。

本発明はさらに、（ｉ）上で定義された細胞株、又は上で定義された発現系、及び（ｉｉ）ウリジンを含まない培地に関する。

本発明の別の目的は、組み換えタンパク質をインビトロで製造する方法に関し、該方法は：
Ａ） ａ１）外因性哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列及び組み換えタンパク質を発現するための少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、上で定義された細胞株を供給する工程、［ここで該外因性ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列又は配列番号４の配列と少なくとも６０％同一である配列を含む］；
又は
ａ２）上で定義された細胞株を供給する工程、及び
ａ２’）上で定義された発現ベクターを、工程ａ２）において供給された細胞株に導入する工程；
又は
ａ３）内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株を供給する工程、
ａ３’）工程ａ３）において供給された細胞株において内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を部分的もしくは完全に不活化する工程、及び
ａ３’’）上で定義された発現ベクターを、工程ａ３’）において得られた部分的もしくは完全に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株に導入する工程；
Ｂ）該細胞株を、組み換えタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程；並びに
Ｃ）該組み換えタンパク質を単離及び／もしくは精製する工程
を含む。

特定の実施形態において、上記方法の工程Ｂ）は、ウリジンを含まない培地において行われる。

別の特定の実施形態において、上記方法は、上記組み換えタンパク質を製剤化して医薬組成物にする工程Ｄ）をさらに含む。

本発明はさらに、組み換えタンパク質を製造するための、上で定義された細胞株、上で定義された発現系又は上で定義されたキットの使用に関する。

特定の実施形態において、細胞株、発現系又はキットは、ウリジンを含まない培地と組み合わせて使用される。

図１は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣＢＩで２０１８年１２月２１日に利用可能なＧｅｎｅ ＩＤ：１００７５６６３２で参照されるヒトＤＨＯＤＨ遺伝子のゲノム構造を示す。 図２は、配列ｎ°１ ＤＨＯＤＨ ｅｘｏｎ２． ＰＡＭ：プロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＴＧＧ）のアライメントを示す。 図３は、選択剤として様々な濃度のテリフルノミドの存在下での抗体の産生についての、様々なＫＯ（ノックアウト）ＤＨＯＤＨクローンのスクリーニングを示す。 図４は、選択マーカーとして様々なＤＨＯＤＨバリアントを使用して製造されたタンパク質の量をｍｇ／ｍＬで示す。 図５は、ヒトＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａ又はヒトＧＳ選択マーカー及びＤＨＯＤＨ ＫＯ又は野生型ＣＨＯ細胞を使用した、１４日目のリパーゼ産生を示す。 図６は、ヒトＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａ又はヒトＧＳ選択マーカー、及びＤＨＯＤＨ ＫＯ又は野生型ＣＨＯ細胞を使用した、１４日目のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｂの産生を示す。 図７は、ヒトＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａ及び／又はヒトＧＳ選択マーカー、並びにＤＨＯＤＨ ＫＯ又は野生型ＣＨＯ細胞を使用した、１４日目の二重特異性抗体産生を示す。 図８は、ヒトＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａ及びヒトＧＳ選択マーカー、並びにＤＨＯＤＨ ＫＯ又は野生型ＣＨＯ細胞を使用した、１４日目の三重特異性抗体産生を示す。

発明の詳細な説明
ジヒドロオロト酸脱水素酵素
本明細書で使用されるように、用語「ジヒドロオロト酸脱水素酵素」又は「ＤＨＯＤＨ」は、以下の反応により表されるような、ジヒドロオロタート （４，５－ジヒドロオロト酸又は２，６－ジオキソ－１，３－ジアジナン－４－カルボン酸）のオロタート（オロト酸又は１，２，３，６－テトラヒドロ－２，６－ジオキソ－４－ピリミジンカルボン酸）への変換を触媒することができるポリペプチドを指す：
（Ｓ）－ジヒドロオロタート ＋ Ｏ_２ ←→ オロタート ＋ Ｈ_２Ｏ_２
このようなポリペプチドは、酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）（ＥＣ）番号１．３．３．１に分類される。上記の反応を触媒することができるポリペプチドは、「ＤＨＯＤＨ」活性を示す。

上記反応は、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成に必要なウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）のデノボ合成における第四段階である。従って、ＤＨＯＤＨの阻害又は不活化は、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を阻害する効果を有し、それ故細胞増殖を阻害する。

細胞株
本発明は、部分的又は完全に不活化された内因性ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）遺伝子を含む細胞株に関する。

細胞株は真核生物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、サル細胞株又はヒト細胞株のような哺乳動物細胞株である。

特定の実施形態において、細胞株はＣＨＯ細胞株である。

ＣＨＯ細胞株は、工業的タンパク質製造に一般的に使用されており、そして多くのＣＨＯ細胞株が当業者に公知である。例えば、このようなＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＣＨＯ－Ｓ細胞株（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＧｉｂｃｏにより販売されている）、ＣＨＯ ＤＰ－１２細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１２４４４及び１２４４５）及びＣＨＯ １－１５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－９６０６）のようなアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から公開で入手可能である株を含む。工業的タンパク質製造に適した別の細胞株はＣＨＯ ９Ｅ４細胞株である。９Ｅ４細胞株は、単細胞クローニングプロセスによりＣＨＯ－Ｋ１細胞株のクローンから樹立された。９Ｅ４細胞株の樹立は実施例１においてより深く示される。ＣＨＯ－Ｋ１細胞株はＰｕｃｋにより１９５７年に得られ、そしてＡＴＣＣに番号ＣＣＬ－６１で寄託されている。

ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、ＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１２５６８）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ及びＣＡＰ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１０９８）細胞のようなヒト細胞も、組み換えヒトタンパク質のための天然グリコシル化パターンを得るために、タンパク質製造に使用され得る。

一実施形態において、細胞株は、無血清培地（例えば、既知組成培地）及び／又は懸濁液中で増殖することができる。このような細胞株は、親細胞株を無血清培地及び／又は懸濁液中で増殖するように適応させることにより（例えば、単細胞クローニングにより、漸進的適応により及び／又は「飢餓と救出（ｓｔａｒｖｅ ａｎｄ ｓａｖｅ）」のプロセスにより）当業者により容易に得られる。

本発明の細胞株は、部分的又は完全に不活化された内因性ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）遺伝子を含む細胞株である。

「内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子」により、本明細書では、特定の環境条件下で特定の発生段階にあるその特定の細胞中に通常存在するＤＨＯＤＨ遺伝子を意味する。

「内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子」は、外因性ＤＨＯＤＨは以下で定義される発現ベクターにより供給されるという点で、以下で定義される「外因性ＤＨＯＤＨ」と区別され、その外因性ＤＨＯＤＨは該発現ベクターが細胞株中に導入されていた場合には本発明の細胞株中に存在していてもよい。

当業者には当然のことながら、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子は細胞株に依存する。例えば、ＣＨＯ細胞株において、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子はチャイニーズハムスターＤＨＯＤＨ遺伝子であり；ヒト細胞株において、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子はヒトＤＨＯＤＨ遺伝子である。

典型的には、野生型チャイニーズハムスターＤＨＯＤＨは、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる配列、さらにはＤＨＯＤＨ活性を示すそのバリアントを指す。このようなバリアントは、例えば、ハムスター種において天然に存在するバリアント（例えば対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアント）に相当し得る。

典型的に、野生型ヒトＤＨＯＤＨは、配列番号４を含むか配列番号４からなる配列、さらにはＤＨＯＤＨ活性を示すそのバリアントを指す。このようなバリアントは、例えば、ヒト種において天然に存在するバリアント（例えば対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアント）に相当し得る。

本明細書で使用される「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、さらにはそのような制御配列がコード配列及び／又は転写された配列に隣接していても隣接していなくても、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含む。従って、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位のような翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス結合部位並びに遺伝子座調節領域を含む。

遺伝子「不活化」は、対応する野生型細胞と比較して遺伝子発現の任意の減少を指す。遺伝子不活化は、完全（完全な不活化又はノックアウト）であっても、部分的（例えば、遺伝子が正常発現レベルより低いレベルを示すハイポモルフ又はそれが影響を及ぼす活性の部分的な減少を示す変異遺伝子の産物）であってもよい。

特定の実施形態において、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子の全ての対立遺伝子は、部分的又は完全に不活化されている。

特定の実施形態において、上記内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子は完全に不活化されている。

より特定の実施形態において、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子の全ての対立遺伝子は完全に不活化されている。

特定の実施形態において、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子は、Ａｇａら（２０１５） ＢＭＣ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ９（補遺９）：Ｐ２に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法を使用して不活化される。

当業者に周知のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、部位特異的ＤＮＡ切断を誘発するようにＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導するために非コードＲＮＡを使用する原核生物適応性免疫応答系である。このＤＮＡ損傷は、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え修復（ＨＤＲ）経路のいずれかを経て、細胞ＤＮＡ修復機構により修復される。遺伝子破壊を作製ために、ＤＮＡ標的に特異的なｃｒＲＮＡ配列、及びＣａｓ９と相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９タンパク質の組み換え形態に結合する。生じた複合体は、標的特異的二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。切断部位は、遺伝子機能を破壊し得る挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を生じ得るエラープローンプロセスである非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路により修復される。

特定の実施形態において、ＤＨＯＤＨ遺伝子の少なくとも１つのエクソンは、特に、ＣＲＩＰＲ－Ｃａｓ９法のような遺伝子編集法により不活化を標的とする。より特定の実施形態において、ＤＨＯＤＨタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＨＯＤＨ遺伝子の部分は、特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法のような遺伝子編集法により不活化の標的にされる。なお別の実施形態において、ＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンは、特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法のような遺伝子編集法により不活化の標的にされる。

一実施形態において、配列ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号２３）もしくは配列ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧ（配列番号５）の２０ヌクレオチドの配列又はＣＨＯ生存を損なうことなくＤＨＯＤＨ遺伝子のノックアウトと適合性の任意の配列を、ｇＲＮＡを生成するためのＤＮＡの対応部分として使用し、これはＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンを標的とする。このｇＲＮＡは典型的には、配列ＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧ（配列番号６）及びＡＡＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号７）のオリゴヌクレオチドを使用して、又は配列ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴ（配列番号２４）及びＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧ（配列番号２５）のオリゴヌクレオチドを使用して得られ、これらは典型的にはｐＣＭ３５６１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売される）のＢａｅＩ部位のようなプラスミドの独特の制限部位でクローン化され、その結果クローンされたＤＮＡ配列はＵ６プロモーターの制御下にあり、そして該プラスミドが細胞に導入されると、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合されたｃｒＲＮＡ、ＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンに特異的なｃｒＲＮＡ部分、及びＣａｓ９酵素により認識されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含有する単一の転写ユニットに転写される。

ＤＨＯＤＨ遺伝子について、不活化される細胞株を同定するために、典型的にはウェルプレートにおいて限定希釈することにより単細胞を単離し、そして適切なコンフルエンス、例えば９０％コンフルエンスに達した後、細胞を少なくとも２つの条件、例えばウリジンを添加された培地中のものと、ウリジンを含まない培地中の別のものに分ける。目的のクローンは、典型的にはウリジンの欠乏に対して感受性のクローンである。

単離されると、これらの目的の細胞を、ピリミジン塩基を含む培地、特にウリジンを含む培地中で培養することができる。

「ピリミジン塩基」により、本明細書ではピリミジンそれ自体、及び骨格としてピリミジン核を有する様々なピリミジン誘導体を意味する。このようなピリミジン塩基の例としては、ウラシル核酸関連物質、例えばウラシル、ウリジン、ウリジンリン酸類、特にウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンリン酸類、特にデオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）；シトシン核酸関連物質、例えば、シトシン、シチジン、シチジンリン酸類、特にシチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、デオキシシチジン、２’－デオキシシチジン、デオキシシチジンリン酸類、特にデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）；チミン、チミジン、チミジンリン酸類、特にチミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）及びチミジン三リン酸（ＴＴＰ）、デオキシチミジン、デオキシチミジンリン酸類、特にデオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）及びオロタートが挙げられる。

特定の実施形態において、上記ピリミジン塩基はウリジンである。

「ウリジン」により、本明細書では以下の式

のヌクレオシドを意味する。

「ウリジンを含まない培地」により、特定の細胞株の増殖に適した任意の基本培地を意味し、ここで該培地は１ｍＭ未満のウリジンを含み、特に該培地はいずれのウリジンも含まない。

「ウリジンを含む培地」により、特定の細胞株の増殖に適した任意の基本培地を意味し、ここで該培地は１ｍＭから２５ｍＭのウリジン、特に５ｍＭ～１０ｍＭのウリジンをさらに含む。

「基本培地」により、本明細書では、細胞、例えばＣＨＯ細胞への曝露に適した無添加培地を意味する。当業者には当然のことながら、使用するべき基本培地は、使用される細胞の種類によって決まる。基本培地の例としては、ＣＤＣＨＯ培地、ＯＰＴｉＣＨＯ^ＴＭ培地、Ｆｅｃｔｏ ＣＨＯ^ＴＭ培地、ＦｏｒｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地、ＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ培地、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ培地、ＡｃｔｉＰＲＯ^ＴＭ培地、ＭＡＭ ＰＦ７７^ＴＭ培地及びＰｏｗｅｒＣＨＯ^ＴＭ培地が挙げられる。

特定の実施形態において、基本培地は、グルタミン、典型的には４～６ｍＭのグルタミンをさらに添加される。

従って、特定の実施形態において、本発明の細胞株は、
ａ）特にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法のような遺伝子編集法により、細胞における内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を不活化すること、及び
ｂ）該細胞を、ウリジンを含む培地で、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子が部分的又は完全に不活化された細胞株を生成するために適した条件下で培養すること
により製造される。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチにより完全に又は部分的に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含むＣＨＯ細胞株の製造は、実施例２及び３においてより深く例示される。

完全に又は部分的に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含むＣＨＯ細胞株のような細胞株の製造は、当該分野で公知の様々な他の分子生物学技術により生成され得る。例えば、完全に又は部分的に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を有する細胞株を生成するために有用な他の遺伝子編集技術としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が挙げられる。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ法もまた、ＤＨＯＤＨ遺伝子の１つもしくはそれ以上又は全ての対立遺伝子をノックアウトするために使用することができる。

特定の実施形態において、本発明の細胞株は、「発現ベクター」のセクションにおいて以下で定義されるような発現ベクターをさらに含む。

上記発現ベクターは、トランスフェクション、特にエレクトロポレーションもしくは化学トランスフェクション、又は形質導入のような、当業者に周知の任意の適切な技術により細胞株に導入され得る。

特定の実施形態において、本発明の上記細胞株は、本発明の発現ベクターとは異なる選択マーカーを含むさらなる発現ベクター、典型的にはグルタミン合成酵素をコードする配列を含むさらなる発現ベクターをさらに含んでいてもよい。

外因性ＤＨＯＤＨ
本発明において使用される発現ベクターによりコードされるＤＨＯＤＨ（さらに「外因性ＤＨＯＤＨ」と呼ばれる）は、配列番号２又は配列番号４と少なくとも６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％；９２％；９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％又は１００％同一である配列を含んでいても、該配列からなるものであってもよい。また、配列番号２又は配列番号４の少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００又は３５０個の連続したアミノ酸のフラグメントを含んでいても、該フラグメントからなるものであってもよいが、ただしそのタンパク質はＤＨＯＤＨ活性を保持する。

いくつかの実施形態において、本発明に従う外因性ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列及び配列番号４の配列の両方と、少なくとも６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％；９２％；９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％又は１００％同一である配列を含むか又は該配列からなる。

いくつかの実施形態において、本発明に従う外因性ＤＨＯＤＨはヒトＤＨＯＤＨ、すなわち、ヒト起源のＤＨＯＤＨである。

本明細書で使用されるように、用語「ヒトＤＨＯＤＨ」は、配列番号４を含むか又は配列番号４からなる配列のタンパク質、さらにはＤＨＯＤＨ活性を示すそのバリアントを指す。このようなバリアントは、例えばヒト種において天然に存在するバリアント（例えば、対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアント）に相当し得る。あるいは、このようなバリアントは、遺伝子操作により得られるバリアントに相当し得る。一実施形態において、このようなバリアントは、配列番号４と比較して、多くとも１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸変異（これらの変異は置換、挿入及び欠失を含む）の存在だけ配列番号４の配列と異なる。

特定の実施形態において、上記ヒトＤＨＯＤＨは、野生型配列と比較してＧ２０２Ａ変異を含むバリアントであり、典型的には配列番号２６のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２６のアミノ酸配列からなるタンパク質である。

いくつかの実施形態において、外因性ＤＨＯＤＨはハムスターＤＨＯＤＨであり、すなわちハムスター起源のＤＨＯＤＨである。ハムスターＤＨＯＤＨは、例えばチャイニーズハムスター（Ｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ＤＨＯＤＨである。

本明細書で使用されるように、用語「チャイニーズハムスターＤＨＯＤＨ」は、配列番号２を含むか又は配列番号２からなる配列、さらにはＤＨＯＤＨ活性を示すそのバリアントを指す。このようなバリアントは、例えばハムスター種において天然に存在するバリアントに相当し得る（例えば対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアント）。あるいは、このようなバリアントは、遺伝子操作により得られるバリアントに相当し得る。一実施形態において、このようなバリアントは、配列番号２と比較して、多くとも１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸変異（これらの経には置換、挿入及び欠失を含む）の存在だけ配列番号２の配列と異なる。

別の実施形態において、バリアントＤＨＯＤＨはＤＨＯＤＨ活性を有し、場合により、野生型タンパク質と同じレベルの活性、又は野生型タンパク質の活性レベルの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％又はそれ以上のレベルの活性を有する。

本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチドの配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５つまでのアミノ酸変化を含むかもしれないということを除いて、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であるということが意図される。換言すると、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列における５％（１００のうち５）までのアミノ酸残基が、挿入されるか、欠失されるか又は別のアミノ酸で置換されてもよい。

配列同一性は、バリアント配列の全長、参照配列の全長又はその両方にわたって決定され得る。例えば、同一性のパーセンテージは、グローバルアライメントを使用して計算され得る（すなわち、２つの配列は、それらの長さ全体に渡って比較される）。２つ又はそれ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当該分野で周知である。「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムは、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を見出すために、そらら全体の長さを考慮する場合、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用し、例えば、グローバルアライメントを実行する場合に使用され得る。このｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで利用可能である。本発明に従う同一性のパーセンテージは、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄ｜ｅ（グローバル）プログラムを使用して、１０．０に等しい「ギャップオープン」パラメーター、０．５に等しい「ギャップ伸長」パラメーター、及びＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを用いて計算される。

参照配列のバリアントは、参照配列と比較して欠失、挿入及び／又は置換のような変異を含み得る。置換の場合、その置換は好ましくは以下の表に示されるような保存的置換に相当する。

発現ベクター
本発明の状況において使用される発現ベクターは、組み換えタンパク質の製造に適しており、そしてジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）をコードする配列を含む。

発現ベクターは好ましくはＤＮＡベクターである。

本発明の状況において使用される発現ベクターは、上の「外因性ＤＨＯＤＨ」のセクションで定義されたような外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列を含む。

特定の実施形態において、発現ベクターを導入しようとする細胞株はＣＨＯ細胞株であり、そして外因性ＤＨＯＤＨは異種起源である（すなわち、外因性ＤＨＯＤＨはハムスターＤＨＯＤＨではない）。

このような外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、天然に存在するヌクレオチド配列であってよい。あるいは、このようなＤＨＯＤＨをコードする配列のトリプレットコドンは、ＣＨＯ細胞における発現のために偏っていてもよい。最適な発現を得るために配列を偏らせるためのソフトウェア及びアルゴリズムは、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、例えば、Ｒａａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｙｓｔ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．４：２１５－２２５に記載されるアルゴリズムが挙げられる。このアルゴリズムは、発現に裁量の利用可能なコドンを提供するだけでなく、ＧＣ含有量及び望まれないＤＮＡモチーフが存在しないことも考慮に入れる。

例えば、外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、配列番号３の配列（すなわち、配列番号４のヒトＤＨＯＤＨをコードする配列、これはＣＨＯ細胞における最適な発現のために設計された）と、かつ／又は配列番号１の配列（すなわち、配列番号２のハムスターＤＨＯＤＨをコードする配列、これはＣＨＯ細胞での最適な発現のために設計された）と、少なくとも６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を含んでいても、該配列からなるものであってもよい。

一実施形態において、外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、配列番号１もしくは配列番号３の配列を含むか又は配列番号１もしくは配列番号３の配列からなる。

本発明の状況において使用される発現ベクターにおいて、上で定義される外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、当業者に公知の任意のプロモーターの制御下に置かれ得る。

例えば、上で定義される外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、例えばＤＨＯＤＨの発現を推進するために適したプロモーター、例えばサル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、ＳＶ４０の後期又は初期プロモーター）、ＣＭＶプロモーター、伸長因子１プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＲＰＬ３７プロモーター、アクチンプロモーターの制御下に置かれ得る。初期ＳＶ４０プロモーターは、例えばＢｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０及びＭｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：６０４７－６０６８において記載される。特に、上記ＳＶ４０プロモーターは全長プロモーターである。上記ＳＶ４０プロモーターはまた、７２ｂｐの反復を含有する複製起点を有し得る。

いくつかの実施形態において、上記ＳＶ４０プロモーターは、位置１２８～２７０が除去されているＳＶ４０プロモーターではない、すなわち、上記ＳＶ４０プロモーターは、韓国特許第１０－０２６７７２０号に記載され、そして１９９７年１２月１７日に寄託番号：ＫＣＴＣ ８８６０ ＰでＧｅｎｅ Ｂａｎｋ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＫＩＳＴに寄託されたＥ． ｃｏｌｉ形質転換体を形質転換するＳＶ４０プロモーターではない。

他の実施形態において、上で定義された外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列は、ＳＶ４０プロモーターの制御下に置かれない。

組み換えタンパク質の製造に適した発現ベクターは当業者に公知である。このようなベクターは典型的には、複製起点並びにその製造が望まれる組み換えタンパク質のクローニング及び発現を可能にする少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクターに相当する。発現カセットは、典型的には５’非翻訳領域（プロモーター、及び場合によりエンハンサー配列を含むか又はそれらからなる）、組み換えタンパク質をコードする配列のクローニングを可能にする１つ又はそれ以上の制限部位、３’非翻訳領域（例えば、ポリＡシグナル）、及び場合により１つ又はそれ以上のイントロンを含む。プロモーター配列は、例えばヒトＣＭＶプロモーターのような当該分野で周知の任意の強力なプロモーターに相当し得る。場合により、本発明の状況において使用される発現ベクターは、ベクターが原核生物細胞における複製を可能にするように、原核生物複製起点（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉにおけるＣｏｌＥ１のような原核生物レプリコン）及び原核生物選択可能マーカーとしても知られる少なくとも原核生物－選択的マーカー遺伝子を含む。ベクターを複製する細胞は、原核生物－選択的マーカー遺伝子も発現し、従って、それらを同定し選択することができる。原核生物－選択的マーカー遺伝子は当業者に周知である。原核生物－選択的マーカー遺伝子の例は、例えば抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする配列（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、ブラストサイジン又はカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列）である。

組み換えタンパク質は、当業者が興味のある任意のタンパク質に相当し得る。

本明細書で使用されるように、用語「タンパク質」は、ペプチド（すなわち、５０未満のアミノ酸のアミノ酸鎖）、ポリペプチド（すなわち、少なくとも５０アミノ酸のアミノ酸鎖）、単量体タンパク質（すなわち、アミノ酸鎖からなるタンパク質）及び多量体タンパク質（すなわち、例えば、モノクローナル抗体のような２つ又はそれ以上のアミノ酸鎖からなるタンパク質）を包含することを意味する。

本発明の状況において使用される発現ベクターは、典型的には、タンパク質を構成する異なるアミノ酸鎖の数と同じ数の発現カセットを含む（例えば、単量体タンパク質又はホモ二量体タンパク質の場合の１つの発現カセット、モノクローナル抗体のヘテロ二量体タンパク質の場合は２つなど）。

あるいは、本発明の状況において使用される発現ベクターは、ヘテロ二量体タンパク質の産生の場合、又はモノクローナル抗体の産生が望まれる場合でさえ発現カセットを１つだけ含み得る。このような場合において、タンパク質の他のアミノ酸鎖をコードする配列は別個の発現ベクター上に存在し、これは宿主細胞株に、特にＣＨＯ細胞株に、本発明に従う発現ベクターと同時トランスフェクトされる。

その場合、追加の別個の発現ベクターは、ＤＨＦＲ、ＧＳ又はＨＰＲＴのような、本明細書に記載されるＤＨＯＤＨ選択マーカーとは異なる選択マーカーを含み得る。

一実施形態において、本発明の状況において使用される発現ベクターは、発現カセットを含んでいなくてもよい。このような場合、組み換えタンパク質の発現に適した発現カセットは、別個のベクター上に存在し、これは宿主細胞株、特に本発明のＤＨＯＤＨ不活化細胞株中に、より詳細には本発明のＤＨＯＤＨ不活化ＣＨＯ細胞株中に本発明に従う発現ベクターとともに同時トランスフェクトされる。

従って、いくつかの実施形態において、本発明の状況において使用される発現ベクターは：
－ 初期ＳＶ４０プロモーターの制御下に置かれた、上で定義されたような外因性ＤＨＯＤＨをコードする配列；
－ 抗体の軽鎖をコードする配列がＣＭＶプロモーターの制御下に置かれている第一の発現カセット；
－ 抗体の重鎖をコードする配列がＣＭＶプロモーターの制御下に置かれている第二の発現カセット；
－ 原核生物複製起点；及び
－ その天然のプロモーターの制御下に置かれた、原核生物細胞における使用のための選択的マーカー、すなわち、アンピシリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列。

本明細書全体を通して、用語「組み換えタンパク質」は、その製造が望まれる任意の組み換えタンパク質を指す。例えば、これは治療的及び／又は予防的タンパク質、すなわち、薬剤（ワクチンを含む）としての使用を意図されたタンパク質に相当する場合がある。特定の実施形態において、その製造が望まれる組み換えタンパク質はＤＨＯＤＨではない。別の特定の実施形態において、その製造が望まれる組み換えタンパク質は、抗体、例えばモノクローナル抗体である。さらに別の特定の実施形態において、その製造が望まれる組み換えタンパク質は抗原タンパク質である。

用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、詳細には、ｌｇＧ、ｌｇＭ、ｌｇＡ、ｌｇＤ、及びｌｇＥのような任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（二重特異性及び三重特異性抗体を含む）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２フラグメント）、単一ドメイン抗体及びそのフラグメント、並びに抗体フラグメントを含む融合タンパク質を含む。特定の抗原に反応性の抗体は、ファージもしくは同様のベクターにおける組み換え抗体のライブラリーの選択のような組み換え方法により、又は抗原もしくは抗原をコードする核酸を用いて動物を免役することにより生成され得る。

本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体であり、すなわち、この集団を形成する抗体は、少量存在するかもしれない可能な天然に存在する変異を除いて本質的に同一である。これらの抗体は、単一のエピトープ（又は多選択性モノクローナル抗体の場合にはエピトープの単一の群）に対して特異的であり、従って高度に特異的である。

典型的なモノクローナル抗体は、ジスルフィド結合により連結されている２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖から構成される。各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含有する。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）又は「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含有し、これらは抗原のエピトープに結合する主な原因である。これらは通常はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号を付けられる（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照のこと）。可変領域のより高度に保存された部分は「フレームワーク領域」と呼ばれる。

モノクローナル抗体は、例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。

モノクローナル抗体は、単一特異性抗体でも、二重特異性抗体でも三重特異性抗体でもよい。

その製造が望まれる組み換えタンパク質がモノクローナル抗体である場合、本発明に従う発現ベクターは、抗体軽鎖のクローニングに適した第一の発現カセット、及び抗体重鎖のクローニングに適した第二の発現カセットを含み得る。

特定の実施形態において、上記第一及び第二の発現カセットは、それぞれ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばヒト又はマウスＣＭＶ由来のＣＭＶプロモーターを含む。より詳細には、上記第一及び第二の発現カセットは：
－ ＣＭＶ最初期エンハンサープロモーター（例えば、Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：３３２５－３３３０に記載される配列を有するもの）；又は
－ マウスＣＭＶ由来のＩＥ２プロモーター／エンハンサー領域（例えば、Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０６－１１７に記載される配列を有するもの）；又は
－ ｈＣＭＶ－ＭＩＥ制御エレメント（例えば、ＷＯ８９／０１０３６に記載される配列を有するもの）
を含み得る。

用語「抗原タンパク質」は、本明細書において最も広い意味で使用され、そして単独で又はアジュバントと組み合わせて、免疫応答を生じることができる任意のタンパク質を含む。予防的なワクチン又は治療用ワクチンのいずれかにおける使用が意図され得る。特定の実施形態において、抗原タンパク質はワクチンタンパク質、すなわち、予防的ワクチンにおける使用を意図されたタンパク質である。

発現ベクターは、目的の組み換えタンパク質をコードする少なくとも１つの配列（例えば、単量体タンパク質をコードする１つの配列、抗体鎖をコードする１つの配列、又は抗体軽鎖及び抗体重鎖をそれぞれコードする２つの配列）を含んでいても、空であってもよい（すなわち、目的の組み換えタンパク質をコードするような配列を含まない）。

発現系、キット、方法及び使用
本発明は：
（ｉ）上の「細胞株」のセクションにおいて定義されたように部分的又は完全に不活化されている内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む、上の「細胞株」のセクションにおいて定義された細胞株、及び
（ｉｉ）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義された発現ベクター
を含む発現系を提供する。

本発明の発現系は、ＤＨＦＲ、ＧＳ又はＨＰＲＴのようなＤＨＯＤＨとは異なる選択マーカーをコードするヌクレオチド配列、及び組み換えタンパク質を発現するための少なくとも１つの発現カセットをそれぞれ含む追加の別個の発現ベクターをさらに含んでいてもよい。

あるいは、本発明の発現系は、上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される追加の発現ベクターをさらに含んでいてもよい。

本発明は、（ｉ）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを含む本発明に従う細胞株、又は本発明に従う発現系、及び（ｉｉ）上で定義されたような、ウリジンを含まない培地、を含むキットを提供する。

キットは、上記のような外因性ＤＨＯＤＨをコードする発現ベクター（発現系中）を含み得る。このようなキットにおいて、これは当業者が目的のタンパク質をクローニングすることを可能にするので、ベクターは好ましくは空である。さらに、発現ベクターは、好ましくはこのようなキットで細胞株から単離される。

キットは、上の「細胞株」のセクションで定義されたように、ウリジンを含まない培地をさらに含む。

キットは、細胞株の培養に適した培地、細胞株へのベクターのトランスフェクションに適した培地、包装材料及び／又は発現系の使用に関する指示書をさらに含み得る。

特定の実施形態において、キットはＤＨＯＤＨ阻害剤を含まない。

ＤＨＯＤＨ阻害剤の例としては、ビシンコニン酸、ブレキナル （６－フルオロ－２－（２’－フルオロ－１，１’－ビフェニル－４－イル）－３－メチル－４－キノリン カルボン酸）、ジクロロアリルローソンのようなナフトキノン誘導体、レフルノミド （５－メチル－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－イソオキサゾール－４－カルボキサミド）のようなイソオキサゾール誘導体及びその活性代謝物テリフルノミド （（２Ｚ）－２－シアノ－３－ヒドロキシ－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］ブタ－２－エンアミド）、キノロンカルボン酸、ナフトキノン類、イソオキサゾール類、フェノキシキノリン類、レドキサール（ｒｅｄｏｘａｌ）及び誘導体、ローソン、ラパコール、アトバコン及び（８－クロロ－４－（２－クロロ－４－フルオロ－フェノキシ）キノリン）が挙げられる。ＤＨＯＤＨの阻害剤は、ＤＨＯＤＨ活性を少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９又は１００％阻害することができるかもしれない。

特定の実施形態において、キットはテリフルノミドを含まない。

本発明は、上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義された発現ベクター、本発明に従う発現系、又は本発明に従うキットを含む、組み換えタンパク質をインビトロで製造するための本発明に従う細胞株の使用をさらに提供する。

特定の実施形態において、上記細胞株、発現系又はキットは、上で定義されたウリジンを含まない培地と組み合わせて、より詳細にはＤＨＯＤＨ阻害剤の存在しない培地と組み合わせて使用される。

本発明はさらに、本発明に従う発現系、上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義された発現ベクターを含む本発明に従う細胞株、又は本発明に従うキットの、インビトロで、特にＤＨＯＤＨ阻害剤が存在しない場合に、高レベルの組み換えタンパク質を産生するクローン細胞（「高産生クローン」）を単離するための使用を提供する。

本発明の状況において、用語「高レベルの組み換えタンパク質」は、培地において、組み換えタンパク質の濃度が少なくとも０．０５ｇ／Ｉ、好ましくは少なくとも０．１ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｇ／Ｉ、より好ましくは０．３と１ｇ／Ｉとの間であることを意味することを意図される。組み換えタンパク質の濃度は、当業者に周知の方法により決定することができ、これらとしては、特に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、ｃａｌｉｐｅｒ技術及び組み換えタンパク質に対応する精製サレタタンパク質の濃度範囲が挙げられる。

本発明はさらに、組み換えタンパク質を製造するインビトロ方法を提供し、該方法は：
Ａ） ａ１）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを含む本発明に従う細胞株を供給する工程；
又は
ａ２）本発明に従う細胞株を供給する工程、及び
ａ２’）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを、工程ａ２）において供給された細胞株に導入する工程；
又は
ａ３）内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株を供給する工程、
ａ３’）工程ａ３）において供給された細胞株において内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を部分的もしくは完全に不活化する工程、及び
ａ３’’）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを、工程ａ３’）において得られた部分的もしくは完全に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株に導入する工程；
Ｂ）該細胞株を、組み換えタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程；並びに
Ｃ）該組み換えタンパク質を単離及び／もしくは精製する工程
を含む。

特定の実施形態において、上記方法の工程Ｂ）は、ウリジンを含まない培地、より詳細にはＤＨＯＤＨ阻害剤も含まない培地において行われ、そして特にウリジンが存在しないにも関わらず、特にさらにＤＨＯＤＨ阻害剤が存在しないにもかかわらず増殖するトランスフェクトされた細胞を選択することから構成される副工程（ｓｕｂ－ｓｔｅｐ）を含む。

本発明はさらに、高レベルの組み換えタンパク質を産生するクローン細胞を単離するインビトロ方法を提供し、該方法は、以下の工程
Ａ） ａ１）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを含む本発明に従う細胞株を供給する工程；
又は
ａ２）本発明に従う細胞株を供給する工程、及び
ａ２’）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを、工程ａ２）において供給された細胞株に導入する工程；
又は
ａ３）内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株を供給する工程、
ａ３’）工程ａ３）において供給された細胞株において内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を部分的もしくは完全に不活化する工程、及び
ａ３’’）上の「発現ベクター」のセクションにおいて定義される発現ベクターを、工程ａ３’）において得られた部分的もしくは完全に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株に導入する工程；
Ｂ）該細胞株を、組み換えタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程；並びに
Ｃ）高レベルの組み換えタンパク質を産生するクローンを単離する工程
を含む。

特定の実施形態において、上記方法の工程Ｂ）は、ウリジンを含まない培地、より詳細にはＤＨＯＤＨ阻害剤も含まない培地において行われ、そして特にウリジンが存在しないにも関わらず、特にさらにＤＨＯＤＨ阻害剤が存在しないにもかかわらず増殖するトランスフェクトされた細胞を選択することから構成される副工程を含む。

上記発現ベクターは、トランスフェクション、特にエレクトロポレーション又は化学トランスフェクション、又は形質導入のような当業者に周知の任意の技術により、工程ａ２’）又はａ３’’）において上記細胞株に導入され得る。

組み換えタンパク質の製造に適した条件は、当業者に周知である。例えば実施例に記載されるプロトコルが使用され得る。

特定の実施形態において、工程Ｂ）において使用される培地は、減少する濃度のウリジンを含む。これにより、ベクター由来の外因性ＤＨＯＤＨ遺伝子（及び従って組み換えタンパク質をコードする配列が増幅されたクローンを選択することが可能となる。

上記方法は、組み換えタンパク質を製剤化して医薬組成物にする工程をさらに含み得る。

明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような用語は、大部分の特許の権限において、好ましくは問題になっている権限においてそれらに期する意味を有し；例えば、これらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味する場合がある。「からなる」、「本質的に～からなること」及び「本質的に～からなる」のような用語は、大部分の特許の権限において、好ましくは問題になっている権限においてそれらに帰属される意味を有し；例えば、これらは、他の要素を全て、大部分又は無視できる量以外は全て排除することを示し、これらは明示的に記載されていない要素を許容するが、従来技術において見出されているか又は本発明の基本的もしくは新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除する。

本明細書の文章全体をとおしていくつかの書類が引用される。本明細書において引用されるこれらの書類はそれぞれ（任意の学術論文又は要約、公開されたか又は未公開の特許出願、交付済み特許、製造者の仕様書、指示書などを含む）、参照により本明細書に加入される。しかし、本明細書において引用されるいずれかの書類が実際に本発明に関する先行技術であるということを承認するものではない。

本発明は、以下の図面及び実施例を参照してさらに記載され、これらは説明のみのためのものであり、本発明を限定することは意図されない。

本発明は特許請求の範囲によって定義され、これは明細書及び図面を用いて解釈されるべきである。

配列の簡単な説明

実施例１： ＣＨＯ ９Ｅ４細胞株の入手
この実施例は、ＡＴＣＣから番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１で市販されているＣＨＯ－Ｋ１細胞株からＣＨＯ ９Ｅ４細胞株を得ることを記載する。

１． ＣＨＯ－Ｋ１細胞株
ウシ血清の存在下で１９６９年に凍結されたＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）のバイアルをＡＴＣＣから得た。

２． Ｅｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ ３０２培地におけるバイアルの解凍及びＣＨＯ－ＬＧ－ＡＰＦバンクの調製
ＣＨＯ－Ｋ１バイアルを、４ｍＭグルタミンを添加したＥｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ ３０２培地（ＳＡＦＣ）中で直接解凍し、そして静的支持面上で、次いでスピナーにおいて増幅した。得られたＣＨＯ－ＬＧ－ＡＰＦバンクを１２継代及び１７．３世代後にＥｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ ３０２培地中で凍結した。

３． Ｅｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ ３０２培地におけるＣＨＯ－ＬＧ－ＡＰＦバンクの解凍及びＡＢＣ－０２４ Ｐ２２バンクの調製
ＣＨＯ－ＬＧ－ＡＰＦバイアルをＥｘ－Ｃｅｌｌ^ＴＭ ３０２培地中で解凍し、そして増幅した。得られたＡＢＣ－０２４ Ｐ２２バンクを１８．５世代後に解凍した。

４． ＣＭＶ０７－０２４バンクのＣＤＣＨＯフュージョン培地への順化及びＡＢＣ－００３バンクの調製
ＣＭＶ０７－０２４バンクを解凍し、そして４ｍＭグルタミンを添加したＥｘ－ｃｅｌｌ^ＴＭ ＣＤＣＨＯフュージョン培地（ＳＡＦＣ）にそのまま順化させ、そして振盪機で１２．５世代にわたってＡＢＣ－００３バンクをＥｘ－ｃｅｌｌ^ＴＭ ＣＤＣＨＯフュージョン培地で凍結するまで順化させた。

５． ＡＢＣ－００３バンクのＣＤＣＨＯフュージョン培地における解凍及びＡＢＣ－０５３バンクのＣＤＣＨＯフュージョン培地における準備
ＡＢＣ－００３バイアルをＣＤＣＨＯフュージョン培地中で解凍し、そして希釈した後、 ＡＢＣ－５３バンクを４．２世代後に凍結した。

６． ＡＢＣ－０５３バンクのＣＤＣＨＯフュージョン培地における解凍、選択、クローニング及びＣＤＣＨＯフュージョン培地におけるＰ１５Ａ１１バンクの調製
４ｍＭグルタミンを添加したＥｘ－ｃｅｌｌ^ＴＭＣＤＣＨＯフュージョン培地（ＳＡＦＣ）においてＡＢＣ－０５３バンクを解凍した。培養物を増幅した後、プレートでの限界希釈によりクローニングし、次いでＣＤＣＨＯフュージョン培地において増幅した。このクローニングから得られたクローンＰ１５Ａ１１のバンクを凍結した。このクローニング及び増幅は、およそ９４世代に相当する。

７． ＣＤＣＨＯフュージョン培地におけるＰ１５Ａ１１バンクの解凍、ＣＤＣＨＯにおける直接継代によるバンクの順化、及びＣＤＣＨＯ培地におけるＣＨＯＳＰ１０－００２バンクの調製
４ｍＭグルタミンを添加したＥｘ－ｃｅｌｌ^ＴＭ ＣＤＣＨＯフュージョン培地（ＳＡＦＣ）においてＰ１５Ａ１１バンクを解凍し、そしてＣＤＣＨＯフュージョン培地において２継代後に、細胞をＣＤＣＨＯ培地中で希釈した。ＣＤＣＨＯ培地において３継代後、ＣＨＯＳＰ１０－００２バンクを合計１５．９世代後に凍結した。

８． ＣＤＣＨＯ培地におけるＣＨＯＳＰ１０－００２バンクの解凍、増幅、遠心分離による塊の除去、及び９６ウェルプレートにおける塊を含まない継代培養による選択、ＣＤＣＨＯ培地においてＣＨＯＳＰ１０－０１２バンクを調製するための６ウェルプレート及び振盪機における増幅
６ｍＭグルタミンを添加したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＣＨＯＳＰ１０－００２バンクを解凍し、次いで増幅した。細胞塊を除去するために培養物を遠心分離し、そして上清から単離された細胞のみを用いて培養を続けた。この段階で、解凍から１１．３世代が生成された。
この培養物を９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１０細胞で分割した。懸濁液中で孤立して増殖する細胞を含むウェルを６ウェルプレートで、次いで振盪機で増幅した。ＣＨＯＳＰ１０－０１２バンクを凍結するまでに２３．２世代追加された。

９． ＣＨＯＳＰ１０－０１２バンクの解凍、ＣＨＯＳＰ１１－００８バンクの増幅及び調製（９Ｅ４バンク）
６ｍＭグルタミンを添加したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＣＨＯＳＰ１０－０１２バンクを解凍し、次いでエルレンマイヤー段階から１７ｌバイオリアクターまで増幅した。
９Ｅ４バンクを合計１０世代後に凍結した。

実施例２： ＤＨＯＤＨ遺伝子が無効にされたＣＨＯ細胞株の製造
Ａ － ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計及び構築
ＣＨＯ細胞においてＤＨＤＯＨ遺伝子を無効にするために、本発明者らは、ハムスターＤＨＯＤＨ遺伝子配列を回収し、ＣＨＯゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いたトランスフェクションのために異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するために公開で利用可能なＴｅｆｏｒソフトウェアを使用することから開始した。イントロン及びエクソンを含むＣＨＯ ＤＨＯＤＨ配列全体を図１に示す。

このソフトウェアは、ＤＨＯＤＨ遺伝子を標的とし得る８つの配列を決定した：
配列１
ＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧ （配列番号６）
ＡＡＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣ （配列番号７）
配列２
ＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧ （配列番号８）
ＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣ （配列番号９）
配列３
ＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＧ （配列番号１０）
ＡＡＡＡＣＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣ （配列番号１１）
配列４
ＣＡＣＣＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧ （配列番号１２）
ＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣ （配列番号１３）
配列５
ＣＡＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＣＴ （配列番号１４）
ＡＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＴＡＧＣ （配列番号１５）
配列６
ＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴ （配列番号１６）
ＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＣ （配列番号１７）
配列７
ＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＣＧＡＧＧＴ （配列番号１８）
ＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣ （配列番号１９）
配列８
ＣＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡ （配列番号２０）
ＡＡＡＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣ （配列番号２１）

８つの配列を試験し、そしてクローニングしたが、８つの配列のうち４つのクローン化された配列のみがトランスフェクトされ、そしてＤＨＯＤＨ遺伝子のノックアウトを首尾よく生成したのは１つのみであった。以下の２０ヌクレオチドの配列を、図２示されるようにｇＲＮＡを生成するためのＤＮＡの対応する部分として使用した ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧ （配列番号５）。これはＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンを標的とする。適切なｇＲＮＡの転写物を得るために、２つのオリゴヌクレオチド

を合成により作製し、アニーリングし、そしてｐＣＭ３５６１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより市販される）の独特のＢａｅＩ部位でクローン化した。

それによりクローン化されたＤＮＡ配列は、Ｕ６プロモーターの制御下にあり、そしてＤＮＡがＣＨＯ細胞にトランスフェクトされると、これはｔｒａｃｒＲＮＡに融合されたｃｒＲＮＡを含有する単一の転写ユニットに転写された。ｃｒＲＮＡ部分はＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンに対して特異的であるが、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９酵素自体により認識された。

Ｂ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集のための材料の準備
ＣＨＯ ９Ｅ４細胞を単離し、そして実施例１に開示されるように、ＡＴＣＣから購入されたＣＨＯ Ｋ－１細胞から選択し、そして６ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加され、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の増殖に最適化されたＣＤＣＨＯ無血清既知組成培地中で懸濁培養として３７℃でインキュベーターにおいて８％ ＣＯ_２及び８０％湿度を用いて増殖及び維持した。

ｓｇＲＮＡ発現ベクター（ｐＣＭ３５６１）１０μｇを、２０μＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を添加したＢａｅＩ酵素１μＬを５単位／μｌで用いて２５℃で１時間消化し、次いで消化されたプラスミドを１％アガロースゲルを使用して電気泳動により分離した。次いで得られたｓｇＲＮＡクローニングベクターをゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔ）により回収した。

ｓｇＲＮＡクローニングベクター及びアニーリングされたガイドオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して連結し、そして１０分間室温でインキュベートした。

連結産物５μＬを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬに加えた。

細胞及びＤＮＡを３０分間氷上でインキュベートし、次いで４２℃で４５秒間ヒートショック処理した。５００ｍＬ Ｓ．Ｏ．Ｃ培地を加えた後、３７℃（８００ｒｐｍ）で１時間インキュベーションして、プラスミド骨格上でコードされる抗生物質耐性を生じる時間を細菌に与えた。インキュベーション後に、各チューブを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加された１つのコーティングされたＬＢ上に広げた。ディッシュを終夜３７℃でインキュベートした。ネガティブコントロール（挿入ＤＮＡの代わりに水を用いる）を使用して形質転換の成功を評価した。

増殖工程のために、１構築あたり２つのコロニーを選択し、そしてインキュベーターに終夜置いたチューブにおいて１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地２ｍＬに播種した（３７℃、７００ｒｐｍ）。終夜インキュベートした培養物を遠心分離により採取した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ^ＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、増幅されたＤＮＡを回収した（ＥＢ緩衝液で溶出）。次いで、目的のガイドオリゴヌクレオチドの配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法（センス及びアンチセンス配列決定、ＧＡＴＣ Ｃｏｍｐａｎｙ）により確認した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのアライメントによる検証後に、対応するコロニーを使用して、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地２００ｍＬに播種した。２４時間のインキュベーション後に、細菌を６０００ｇで１５分間４℃での遠心分離により採取した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ^ＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＭａｘｉＰｒｅｐを調製した。室温でイソプロパノールを加えることによりＤＮＡを沈殿させた。１時間の遠心分離（４℃、８０００ｒｐｍ）の後、ＤＮＡペレットをエンドトキシンを含まない室温の７０％エタノールにより洗浄した。短い新たな遠心分離の後に、ペレットを１時間の間風乾し、そして適切な体積のエンドトキシンを含まない滅菌水に再溶解して、ＤＮＡ濃縮物を５ｍｇ／ｍＬで得た。ｎａｎｏｄｒｏｐデバイスを使用してＤＮＡ濃度を測定した。

４つの異なるプラスミド、すなわち、ｐＢＨ６８４０プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ１）、ｐＢＨ６８４１プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ４）、ｐＢＨ６８４２プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ５）及びｐＢＨ６８４３プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ７）を準備した。ＣＨＯ ＤＨＯＤＨ遺伝子におけるこれらのプラスミドの標的を配列番号２２の配列に示す。

ＤＮＡ配列決定はＧＡＴＣの再委託業者 － Ａ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙにより行われた。

Ｃ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ及びそのＣＨＯ規定プロトコルを使用してエレクトロポレーションによりトランスフェクションを行った。これらはＯＣ－１００（トランスフェクションあたり２０００万個の細胞）プロセシングアセンブリにおいて行われた。

トランスフェクションの前日に、細胞を１．５×１０^６細胞／ｍＬで６ ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充されたＣＤＣＨＯ培地に播種した。

トランスフェクションの日に、細胞をＶｉＣｅｌｌ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ ＆ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計数した。必要数の細胞を２５０ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を捨てた。

各トランスフェクション条件について、２０×１０^６個の細胞を１０分間２５０ｇで遠心分離した。ペレットを７０μＬ Ｍａｘｃｙｔｅ緩衝液を用いて再懸濁した。ＤＮＡ ３０μｇを加え、そして混合物（細胞、緩衝液及びＤＮＡ）を１００μＬ Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーションカセットに移した。使用したプロセシングアセンブリは、１００μＬカセットに特有のＯＣ－１００であり、そしてＣＨＯに最適化されたプログラムを選択した。

以下のトランスフェクションを行った。

エレクトロポレーション後に、細胞を２５ｍＬ作業エルレンマイヤーフラスコに移した。それらを３７℃、５％ＣＯ_２で静的インキュベーターに４５分置いた。次いで６ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＣＤＣＨＯ培地２５ｍＬを加えて細胞を再懸濁し、そしてエルレンマイヤーフラスコを３７℃、５％ＣＯ_２、湿度７０％、１１０ｒｐｍで振盪機に置いた。

エレクトロポレーションの翌日に、１ウェルあたり単一の細胞を上記のＣＨＯ９Ｅ４トランスフェクトプールからの限界希釈により播種した。約２０日後、細胞が約９０％コンフルエントになり、顕微鏡下で検査した場合に正常に見えたら、細胞をウリジンを含むか又は含まない２つの新しい９６ウェルに分けた。

ウリジンの欠乏に対するそれらの感受性についていくつかのクローンを選択した。これらのクローンを、６ｍＭグルタミン及び５ｍＭウリジンを補充したＣＤＣＨＯ培地における増殖のために順化させた。

遺伝子編集が成功したことを確認するために、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｋｉｔ^ＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９クローン細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により標的化されるＤＨＯＤＨ遺伝子座の領域に適したプライマーを使用して、標的遺伝子座をＰＣＲにより増幅し、そしてＰＣＲ産物を、可能性のある欠失した領域を網羅するＰＣＲフラグメントを使用してＮＧＳにより配列決定した。

実施例３： ＤＨＯＤＨ遺伝子が無効にされているＣＨＯ細胞株の代替の製造
Ａ － ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の設計及び構築
ＣＨＯ細胞においてＤＨＤＯＨ遺伝子を無効にするために、本発明者らは、ハムスターＤＨＯＤＨ遺伝子配列を回収し、そしてＣＨＯゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いたトランスフェクションのために異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するための公開で利用可能なＴｅｆｏｒソフトウェアを使用することから開始した。

ソフトウェアは、ＤＨＯＤＨ遺伝子を標的化し得る８つの配列を決定した：
配列１’
ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴ （配列番号２４）
ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧ （配列番号２５）
配列２’
ＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴ （配列番号２７）
ＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧＧＴＧ （配列番号２８）
配列３’
ＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴ （配列番号２９）
ＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧ （配列番号３０）
配列４’
ＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴ （配列番号３１）
ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＴＧ （配列番号３２）
配列５’
ＧＣＴＡＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴ （配列番号３３）
ＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＴＧ （配列番号３４）
配列６’
ＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴ （配列番号３５）
ＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧ （配列番号３６）
配列７’
ＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＣＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴ （配列番号３７）
ＡＣＣＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧ （配列番号３８）
配列８’
ＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＡＧＴＴＴＴ （配列番号３９）
ＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧ （配列番号４０）

８つの配列を試験しクローニングしたが、８つの配列のうち、４つのクローン化された配列のみがトランスフェクトされ、そしてＤＨＯＤＨ遺伝子のノックアウトを生成することに成功したのは１つのみであった。以下の２０ヌクレオチドの配列を、ｇＲＮＡを生成するためのＤＮＡの対応部分として使用した ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧ （配列番号５）。これはＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンを標的にする。適切なｇＲＮＡの転写を得るために、２つのオリゴヌクレオチド ＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴ （ｏｌｉｇｏ１’、配列番号２４）及びＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧ （ｏｌｉｇｏ２’、配列番号２５）を合成により作製し、アニーリングし、そしてｐＣＭ３５６１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより商品化される）の独特なＢａｅＩ部位においてクローン化した。

それにより、クローン化されたＤＮＡ配列はＵ６プロモーターの制御下にあり、そしてＤＮＡがＣＨＯ細胞においてトランスフェクトされると、これはｔｒａｃｒＲＮＡに融合されたｃｒＲＮＡを含有する単一の転写ユニットに転写された。ｃｒＲＮＡ部分はＤＨＯＤＨ遺伝子の第二のエクソンに特異的であるが、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９酵素自体により認識される。

Ｂ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集のための材料の準備
ＣＨＯ ９Ｅ４細胞を単離し、そして実施例１に開示されるように、ＡＴＣＣから購入されたＣＨＯ Ｋ－１細胞から選択し、そして６ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の増殖に最適化されたＣＤＣＨＯ無血清既知組成培地において３７℃で８％ ＣＯ_２及び湿度８０％における懸濁培養として増殖させ、そして維持した。

ｓｇＲＮＡ発現ベクター（ｐＣＭ３５６１）１０μｇを、２０μＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を添加補充したＢａｅＩ酵素１μＬ ５単位／μｌを用いて２５℃で１時間消化し、次いで、消化されたプラスミドを１％アガロースゲルを使用した電気泳動により分離した。次いで、得られたｓｇＲＮＡクローニングベクターをゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔ）により回収した。

ｓｇＲＮＡクローニングベクター及びアニーリングしたガイドオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して連結し、そして１０分間室温でインキュベートした。

連結産物５μＬを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬに加えた。

細胞及びＤＮＡを３０分間氷上でインキュベートし、次いで４２℃で４５秒間熱ショック処理した。５００ｍＬ Ｓ．Ｏ．Ｃ培地を加えた後、１時間３７℃（８００ｒｐｍ）でインキュベートすることにより、プラスミド骨格上にコードされる抗生物質耐性タンパク質が生成するための時間を細菌に与えた。インキュベーション後に、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加された１つのコーティングされたＬＢ上に各チューブを広げた。ディッシュを終夜３７℃でインキュベートした。ネガティブコントロール（挿入ＤＮＡの代わりに水を用いる）を使用して形質転換の成功を評価した。

増幅工程のために、１構築あたり２つのコロニーを選択し、そしてインキュベーターに終夜（３７℃、７００ｒｐｍ）置いたチューブにおいてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地２ｍＬに播種した。終夜インキュベートした培養物を遠心分離により採取した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ^ＴＭ （ＱＩＡＧＥＮ）を使用して増幅されたＤＮＡを回収した（ＥＢ緩衝液で溶出）。次いで目的のガイドオリゴヌクレオチドの配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法（センス及びアンチセンス配列決定、ＧＡＴＣ Ｃｏｍｐａｎｙ）により確認した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのアライメントによる検証後に、対応するコロニーを使用して、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢに培地２００ｍＬに播種した。２４時間のインキュベーション後に、細菌を６０００ｇで１５分間４℃での遠心分離により採取した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ^ＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＭａｘｉＰｒｅｐを調製した。室温でイソプロパノールを加えることによりＤＮＡを沈殿させた。１時間遠心分離した後（４℃、８０００ｒｐｍ）、ＤＮＡペレットを、エンドトキシンフリーの室温７０％エタノールで洗浄した。新たな短時間の遠心分離の後、ペレットを１時間風乾し、そして適切な体積のエンドトキシンフリー滅菌水に再溶解してＤＮＡ濃度５ｍｇ／ｍＬにした。ｎａｎｏｄｒｏｐデバイスを使用してＤＮＡ濃度を測定した。

４つの異なるプラスミド、すなわちｐＢＨ６８４０プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ１）、ｐＢＨ６８４１プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ４）、ｐＢＨ６８４２プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ５）及びｐＢＨ６８４３プラスミド（ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＳＥＱ７）を準備した。

ＤＮＡ配列決定はＧＡＴＣの再委託業者 － Ａ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙにより行われた。

Ｃ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ及びそのＣＨＯ規定プロトコルを使用するエレクトロポレーションによりトランスフェクションを行った。これらはＯＣ－１００（トランスフェクションあたり２０００万個の細胞）プロセシングアセンブリにおいて行われた。

トランスフェクションの前日に、細胞を１．５×１０^６細胞／ｍＬで６ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＣＤＣＨＯ培地に播種した。

トランスフェクションの日に、細胞をＶｉＣｅｌｌ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ ＆ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計数した。必要数の細胞を２５０ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を捨てた。

各トランスフェクション条件について、２０×１０^６個の細胞を１０分間２５０ｇで遠心分離した。ペレットを７０μＬ Ｍａｘｃｙｔｅ緩衝液を用いて再懸濁した。ＤＮＡ ３０μｇを加え、そして混合物（細胞、緩衝液及びＤＮＡ）を１００μＬ Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーションカセットに移した。使用したプロセシングアセンブリは、１００μＬカセットに特有のＯＣ－１００であり、そしてＣＨＯに最適化されたプログラムを選択した。

以下のトランスフェクションを行った。

エレクトロポレーション後に、細胞を２５ｍＬ作業エルレンマイヤーフラスコに移した。これらを３７℃、５％ＣＯ_２の静的インキュベーターに４５分間置いた。６ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充した２５ｍＬ ＣＤＣＨＯ培地を加えて細胞を再懸濁し、そしてエルレンマイヤーフレスコを３７℃、５％ＣＯ_２、湿度７０％の、１１０ｒｐｍ振盪機に置いた。

エレクトロポレーションの翌日に、１ウェルあたり単一の細胞を上記のＣＨＯ９Ｅ４トランスフェクトプールからの限界希釈により播種した。約２０日後、細胞が約９０％コンフルエントになり、顕微鏡下で検査した場合に正常に見えたら、細胞をウリジンを含むか又は含まない２つの新しい９６ウェルに分けた。

ウリジンの欠乏に対するそれらの感受性についていくつかのクローンを選択した。これらのクローンを、６ｍＭグルタミン及び５ｍＭウリジンを補充したＣＤＣＨＯ培地における増殖のために順化させた。

遺伝子編集が成功したことを確認するために、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｋｉｔ^ＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９クローン細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により標的化されるＤＨＯＤＨ遺伝子座の領域に適したプライマーを使用して、標的遺伝子座をＰＣＲにより増幅し、そしてＰＣＲ産物を、可能性のある欠失した領域を網羅するＰＣＲフラグメントを使用してＮＧＳにより配列決定した。

実施例４： 組み換えタンパク質産生のためのＤＨＯＤＨ欠乏ＣＨＯ細胞株の使用
これらのクローンがテリフルノミドなしで抗体を発現することができるがどうかを検証するために、実施例２又は３において得られた有効なＤＨＯＤＨ欠乏ＣＨＯクローンで抗体産生を試験した。

設計されたベクターを製造して、濃度５ｍｇ／ｍＬで調製した。これらは全て、トランスポサーゼをコードするプラスミドであるｐＢＨ６２０９とは別に、産生細胞のゲノムにおけるプラスミドの組み込みのためのトランスポゾン系の使用を可能にするＩＴＲを有する。

使用された細胞株は、ＣＨＯ ９Ｅ４＿ＳＰ１１野生型並びにＤＨＯＤＨについてのＫＯ２及びＫＯ１９ノックアウトであった。

ＣＨＯ ９Ｅ４＿ＳＰ１１を、６ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＣＤＣＨＯ培地で培養した。

ＫＯ２及びＫＯ１９を、６ｍＭ Ｌ－グルタミン及び５ｍＭウリジンを添加したＣＤＣＨＯ培地で培養した。

これらを初めに２５ｍＬ作業エルレンマイヤーフラスコにおいて培養し、そして必要な生存細胞数に達するまで増幅した。

Ｍａｘｃｙｔｅにより開発された高効率エレクトポレーションプロトコルを使用してＭａｘｃｙｔｅ ＳＴＸ装置において様々なタンパク質を製造した。

トランスフェクションの１日前に細胞を１．５×１０^６に分割した。

トランスフェクションの日に、２つのベクター：ＰｉｇｇｙＢａｃ認識部位（末端逆位反復、ＩＴＲ）に隣接したヒト抗ＣＤ３８重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）発現カセット及びＤＨＯＤＨ選択マーカー（ＷＯ２０１６／０６２８３７に記載されるとおり）を含有するＤＮＡプラスミド発現ベクター並びにトランスポゾンのＴＴＡＡ部位におけるＣＨＯゲノムへの移動を触媒するＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎからのトランスポサーゼベクターを用いて細胞を同時トランスフェクトした。

各トランスフェクション条件のために、８０×１０^６個の細胞を１０分間２５０ｇで遠心分離した。ペレットを２５０μＬ Ｍａｘｃｙｔｅ緩衝液に再懸濁した。ＤＮＡ １２０μｇを加え、そしてこの混合物（細胞、緩衝液及びＤＮＡ）を４００μＬ Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーションカセットに移した。使用したプロセシングアセンブリは４００μＬカセットに特有のＯＣ－４００であり、そしてＣＨＯに最適化されたプログラムを選択した。

回収段階のために、トランスフェクトされた細胞を撹拌することなく１２５ｍｌフラスコに３７℃で４０分間即座に移した。６ｍＭグルタミン（ＫＯ細胞については＋５ｍＭウリジン）を補充した予め温めたＣＤＣＨＯ培地２５ｍＬを加え、そしてトランスフェクトされた培養物を３７℃で８％ＣＯ_２及び湿度８０％のインキュベーターにおいて維持した。トランスフェクションの１日後に、細胞を遠心分離し、そして６ ｍＭグルタミン、３０％ ＦｅｅｄＢ（Ｇｉｂｃｏ）及び様々な量のテリフルノミド（０、５、１５及び２５μＭ）を補充したＣＤ ＯＰＴｉＣＨＯ^ＴＭ選択培地（Ｇｉｂｃｏ）に１×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。

トランスフェクションの１４日後に、細胞を２００ｇで１０分間２５℃で遠心分離した。上清を０．２２μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過し、そして抗体力価をＯｃｔｅｔ装置を使用して測定した。

図３に示されるように、２つのクローン（ＫＯ２及びＫＯ１９）は、テリフルノミド無しで良好な産生を示し、そしてゲノムＮＧＳは、これら２つのクローンがＤＨＯＤＨ遺伝子座の２つの対立遺伝子にノックアウト変異を含有するということを示した。

意外なことに、全てのＫＯクローンは、選択剤としてのテリフルノミドが存在しなくても抗体を産生した。２つのクローンＫＯ２及びＫＯ１９をさらなる試験のために選択した。さらに、ＤＨＯＤＨ遺伝子のホモ接合ノックアウトを示したのはこれらの引用したクローンのみであった。

従って、この実施例は、本発明がいずれの選択圧を使用しなくても抗体の産生を可能にする一組の細胞株及びベクターを提供するということを示す。

実施例５： ３つのヒトＤＨＯＤＨバリアントの評価
ヒトＤＨＯＤＨを損なった形態の使用がＣＨＯゲノムへの組み込みコピー数を増強し、そしてそれによりより良好な生産性を可能にするかどうかを確認するために、ＤＨＯＤＨ ＫＯ２、ＫＯ１９及びＷＴ ＣＨＯ ９Ｅ４細胞株を、ミラー症候群患者において記載される３つのヒトＤＨＯＤＨ ｃＤＮＡバリアント（Ｒ１３５Ｃ、Ｇ２０２Ａ及びＲ３４６Ｗ、詳細にはＦａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｂｉｏｓｃｉ．３２：６３１－６３９を参照のこと）を用いてトランスフェクトした。コントロールベクターとしてヒトＷＴ ＤＨＯＤＨをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドをトランスフェクトした。

ＳａｌＩ－ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化された、ヒト抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、ｍＡｂ－Ａ （ｐＢＨ６２０４）をコードするプラスミドベクター５０ｎｇを、各バリアント（Ｒ１３５Ｃ、Ｇ２０２Ａ、及びＲ３４６Ｗ）に対応するＳａｌＩ－ＢｇｌＩＩ精製ＤＮＡフラグメント３７．５ｎｇと混合した。Ｔ４－ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ）１μＬ及び濃縮ライゲーション緩衝液を加えた後、ライゲーション反応（最終体積１０μＬ）を１０分間室温で行った。

次いで、このＤＮＡプールのアリコートを使用してＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（Ｓｔｅｌｌａｒ^ＴＭ、Ｔａｋａｒａ）を形質転換した。

小スケールプラスミド調製を、市販のＱｉａｇｅｎプラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の推奨に従って行った。

６０３センス（配列 ＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＧＣＴＴ、配列番号４１）及び５０３アンチセンス（配列 ＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＡＴ、配列番号４２）オリゴヌクレオチドを使用したＤＮＡ配列決定は、ＧＡＴＣの再委託業者 － Ａ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙにより行われた。

ＤＨＯＤＨバリアントのトランスフェクションを、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸを使用したエレクトポレーションにより行った。これらは、上記のようにＯＣ－１００プロセシングアセンブリで行われた。

トランスフェクションの１日後に、細胞を遠心分離し、そして９Ｅ４ ＣＨＯ細胞には６ｍＭグルタミン及び２５μＭテリフルノミドを補充し、そしてＫＯ２及びＫＯ１９クローンにはテリフルノミドを用いないＣＤ ＣＨＯ選択培地に１×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。

２継代後に、９Ｅ４ ＣＨＯ細胞には３０％ＦｅｅｄＢ及び６ｍＭグルタミン及び２５μＭテリフルノミドを補充し、そしてＫＯ２及びＫＯ１９クローンにはテリフルノミドを用いないＣＤ ＯＰＴｉＣＨＯ培地で、ｍＡｂ－Ａの産生を０．３×１０^６細胞／ｍＬで開始した。

トランスフェクションの１４日後に、細胞を２００ｇで１０分間２５℃で遠心分離した。上清を０．２２μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過し、そして抗体力価をＯｃｔｅｔ装置を使用して測定した。

図４に示されるように、ＷＴ ＣＨＯ ９Ｅ４及びＤＨＯＤＨ ＫＯクローンでのＲ１３８Ｃ及びＲ３４６Ｗ ＤＨＯＤＨ変異で有意な効果は観察されなかった。他方で、Ｇ２０２Ａ変異は、ＷＴ ＣＨＯ ９Ｅ４株を用いたグラムスケールの抗体製造を獲得し、そしてＤＨＯＤＨ ＫＯ２及びＫＯ１９クローンの生産性を増強することを可能にした。

実施例６： 本発明の発現系を使用したタンパク質製造
最終生産性が、少なくとも選択可能マーカーとしてヒトグルタミン合成酵素（ＧＳ）を使用する従来技術の発現系と同じ範囲であることを確認するために、本発明の発現系を使用して、特に上の実施例３において開示された有効なクローンＣＨＯ ９Ｅ４ ＫＯ２及びＫＯ１９における上で開示されたＧ２０２Ａ変異を含むヒトＤＨＯＤＨ ｃＤＮＡを使用して、様々な種類のタンパク質を製造した。

以下のタンパク質を製造した：
－ リパーゼ：
・ 単シストロン性ｃＤＮＡ ＰＬＢＬ２－Ｈｉｓを使用する、及び
・ 選択可能マーカーｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａプラスミド又はｈＧＳプラスミドを使用する、
－ モノクローナル抗体（ｍＡｂ－Ｂ）：
・ 抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をコードする２シストロン性ｃＤＮＡを使用する、並びに
・ 選択可能マーカーｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａプラスミド又はｈＧＳプラスミドを使用する；
－ 二重特異性抗体：
・ （ｉ）抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をコードする２シストロン性ｃＤＮＡ、又は（ｉｉ）それぞれ抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をコードする２つの単シストロン性を使用する、並びに
・ 選択可能マーカー（ｉ）ｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａプラスミド（２シストロン性ｃＤＮＡ）又は（ｉｉ）２つのｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２ＡプラスミドもしくはｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａプラスミド及びｈＧＳプラスミド（単シストロン性ｃＤＮＡ）を使用する；
－ 三重特異性抗体：
・２つの２シストロン性ｃＤＮＡを使用する、及び
・選択可能マーカーｈＤＨＯＤＨ Ｇ２０２Ａプラスミド及びｈＧＳプラスミドを使用する。

ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）トランスフェクションの１日前に、６ｍＭグルタミン及び５ｍＭウリジンを添加したＣＤ ＣＨＯ培地中１．５×１０^６細胞／ｍＬに細胞を希釈した。

トランスフェクションの日に、６ｍＭ Ｌ－グルタミン及び５ｍＭウリジンを補充したＣＤ ＣＨＯ中１．１×１０^６細胞／ｍｌに細胞懸濁液を希釈した。ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬を５秒間ボルテックスし、そして遠心沈殿した後、空の５０ｍＬチューブに２５μＬ／チューブを加えた。第２の５０ｍＬチューブに、ｃＤＮＡ １２．５μｇをＣＤ ＣＨＯ培地中で希釈し、そして希釈したＤＮＡを純粋なＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）試薬に全て一度に加えた。この溶液をすぐにホモジナイズし、そして１０分間インキュベートした。ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）／ＤＮＡトランスフェクション混合物を細胞上に注ぎ、そして培養物を３７℃、１９０ｒｐｍ及びＣＯ_２レベル８％でインキュベートした。

トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ^ＴＭ装置を用いて計数した。全細胞培養物を２００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを以下に開示された条件で予熱した製造培地２ ５ｍＬに再懸濁した。

３つ又はそれ以上のサブユニットを含む複合体タンパク質の場合、第二のトランスフェクションを上記のトランスフェクションのプロトコルを再度使用して行った。

トランスフェクションの７２時間後に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ^ＴＭ装置を用いて細胞を計数し、そして別の培地に変更することでタンパク質産生をブーストした。さらに、トランスフェクトされた細胞の生存率をトランスフェクションの３日後及び７日後に測定した。

トランスフェクション１４日後に、細胞を２００ｇで１０分間及び２５℃で遠心分離した。上清を０．２２μｍ ＰＥＳフィルターに通して濾過し、そしてタンパク質力価をＯｃｔｅｔ装置を使用して測定した。

以下の結果を得た。

ａ） リパーゼ

１４日目のリパーゼ産生を図５に示す。

これらの結果は、両方のＫＯ ＤＨＯＤＨ細胞株がテリフルノミド選択圧の存在しない場合にリパーゼを産生する能力を有するということを示し、これは産生細胞に対する毒性を減少させることを可能にする。

さらに、ＫＯ ＤＨＯＤＨ細胞株は、従来技術のＧＳ系（野生型９Ｅ４ ＣＨＯ細胞において）と同じ範囲で、すなわち２５ｍｌスケールで１ｇ／ｌでリパーゼを産生することが可能であった。

ｂ）モノクローナル抗体 ｍＡｂ－Ｂ

１４日目のモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｂ産生を図６に示す。

これらの結果は、ＫＯ ＤＨＯＤＨ細胞株が、この特定の抗体の産生の間、異なる挙動を示したということを示す。実際に、たとえ両方のクローンが従来技術のテリフルノミド産生よりも良好な生産性を生じても、ＫＯ１９クローンは、ＫＯ２クローンよりも有意に良好な生産性を生じた。

最良のＫＯ細胞株（ＫＯ１９）において、抗体産生は、２５ｍｌスケールでおよそ０．６７ｇ／ｌという従来技術のＧＳ系（野生型９Ｅ４ ＣＨＯ細胞において）と同じ範囲であった。

さらに、増加した生存率がＫＯ細胞株を使用して観察された。

ｃ）二重特異性抗体

１４日目の二重特異性抗体産生を図７に示す。

二重特異性抗体は、全ての試験された場合において、単一特異性抗体ほど効率的に産生されなかった。しかし、この種の二重特異性抗体を産生する困難性にもかかわらず、最良のＫＯ細胞株の生産性は、従来技術のＧＳ系（野生型９Ｅ４ ＣＨＯ細胞において）と同じ範囲、２５ｍｌスケールでおよそ０．１４５ｇ／ｌであった。

さらに、増加した生存率がＫＯ細胞株を使用して観察された。

ｄ） 三重特異性抗体

１４日目の三重特異性抗体産生を図８に示す。

全ての条件において、２つのＫＯ細胞株は、従来技術の選択系と同じ範囲、すなわち優れた０．５ｇ／ｌの結果を生じた。

従ってこの実施例は、ＫＯ ＤＨＯＤＨ ＣＨＯクローンが様々なタンパク質形式（タンパク質、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体）の発現に適していることを裏付ける。これらのクローンは複合体タンパク質を製造するために二重トランスフェクションにさえ使用することができる。

Claims (19)

1. 部分的又は完全に不活化されている内因性ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）遺伝子を含む細胞株であって、前記細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＥＫ２９３、ＨＫＢ１１、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＴ１０８０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＣＡＰ細胞株の中から選択される、前記細胞株。
2. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１に記載の細胞株。
3. 細胞株は、
   ａ）細胞における内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を不活化すること、及び
   ｂ）該細胞を、ウリジンを含む培地で、内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子が部分的又は完全に不活化された細胞株を生成するために適した条件下で培養すること
   により製造される、請求項１又は２に記載の細胞株。
4. 内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子は遺伝子編集法により不活化される、請求項３に記載の細胞株。
5. 内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法により不活化される、請求項４に記載の細胞株。
6. 内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子の１つもしくはそれ以上又は全ての対立遺伝子が部分的又は完全に不活化されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞株。
7. 細胞株は、外因性哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列及び組み換えタンパク質を発現するための少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含み、ここで該外因性ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列又は配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞株。
8. （ｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞株、並びに
   （ｉｉ）哺乳動物ＤＨＯＤＨをコードするヌクレオチド配列及び組み換えタンパク質を発現するための少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター
   を含む発現系であって、ここで、該ＤＨＯＤＨは、配列番号２の配列又は配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、上記発現系。
9. 上記ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列又は配列番号３の配列を含む、請求項７に記載の細胞株又は請求項８に記載の発現系。
10. 上記組み換えタンパク質はモノクローナル抗体である、請求項７もしくは９に記載の細胞株又は請求項８もしくは９に記載の発現系。
11. 上記ベクターは、抗体軽鎖のクローニングに適した第一の発現カセット、及び抗体重鎖のクローニングに適した第二の発現カセットを含む、請求項７、９及び１０のいずれか１項に記載の細胞株、又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の発現系。
12. （ｉ）請求項７及び９～１１のいずれか１項に記載の細胞株、又は請求項８～１１のいずれか１項に記載の発現系、及び（ｉｉ）ウリジンを含まない培地、を含むキット。
13. Ａ） ａ１）請求項７及び９～１１のいずれか１項に記載の細胞株を供給する工程；
    又は
    ａ２）請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞株を供給する工程、及び
    ａ２’）請求項９～１１のいずれか１項において定義される発現ベクターを、工程ａ２）において供給された細胞株に導入する工程；
    又は
    ａ３）内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株を供給する工程、
    ａ３’）工程ａ３）において供給された細胞株において内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を部分的もしくは完全に不活化する工程、及び
    ａ３’’）請求項９～１１のいずれか１項において定義される発現ベクターを、工程ａ３’）において得られた部分的もしくは完全に不活化された内因性ＤＨＯＤＨ遺伝子を含む細胞株に導入する工程；
    Ｂ）該細胞株を、組み換えタンパク質の産生に適した条件下で培養する工程；並びに
    Ｃ）該組み換えタンパク質を単離及び／もしくは精製する工程
    を含む、組み換えタンパク質をインビトロで製造する方法。
14. 工程Ｂ）は、ウリジンを含まない培地で行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 上記組み換えタンパク質を製剤化して医薬組成物にする工程Ｄ）をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 組み換えタンパク質を製造するための、請求項７及び９～１１のいずれか１項に記載の細胞株、請求項９～１１のいずれか１項に記載の発現系、又は請求項１２に記載のキットの使用。
17. 細胞株、発現系又はキットは、ウリジンを含まない培地と組み合わせて使用される、請求項１６に記載の使用。
18. ウリジンを含まない培地が、さらにＤＨＯＤＨ阻害剤を含まない、請求項１２に記載のキット。
19. ウリジンを含まない培地が、さらにＤＨＯＤＨ阻害剤を含まない、請求項１４に記載の
    方法または請求項１７に記載の使用。

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