JP2007529519A

JP2007529519A - ピペラジンおよび置換ピペラジンのプロドラッグ抗ウイルス剤

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Publication number: JP2007529519A
Application number: JP2007503935A
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Inventors: 泰次植田; ティモシー・ピー・コノリー; ジョン・エフ・カドー; ニコラス・エイ・ミーンウェル; タオ・ワン; チュン−ピン・エイチ・チェン; ユン・カプ−スン; チャン・チョンシン; デイビッド・ケネス・リーヒー; ショーン・ケイ・パック; ナチムトゥ・ソウンダララジャン; ピエール・シラール; カティア・レヴェスク; ドミニク・トラヴァル
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
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Publication date: 2007-10-25
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Abstract

本発明は、下式のプロドラッグ化合物（Ｉ）、その医薬組成物、およびＨＩＶ感染の処置でのその用途を提供する。また本発明は、該プロドラッグ化合物（Ｉ）の製造に用いる下式の中間体化合物（ＩＩ）をも提供する。

Description

本発明は、薬物特性および生体作用特性を有する化合物、その医薬組成物および使用方法を提供する。特に本発明は、抗ウイルス活性を持つ新規なプロドラッグ誘導体に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置に有用な化合物に関する。

ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス−１）感染は、重大な医療問題として残され、２００２年の終わりには世界中で、推定４２００万の人が感染している。ＨＩＶやＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の症例の数は、急速に増加している。２００２年において、５００万以下の新たな感染が報告され、３１０万の人がＡＩＤＳで亡くなっている。ＨＩＶの処置のための現在入手しうる薬物としては、１０種のヌクレオシド逆トランスクリプターゼ（ＲＴ）阻害薬または認可シングルピル併用：ジドブジンまたはＡＺＴ（またはRetrovir（登録商標））、ジダノシン（didanosine）（またはVidex（登録商標））、スタブジン（stavudine）（またはZerit（登録商標））、ラミブジン（lamivudine）（または３ＴＣまたはEpivir（登録商標））、ザルシタビン（zalcitabine）（またはＤＤＣまたはHivid（登録商標））、アバカビル・スクシネート（abacavir succinate）（またはZiagen（登録商標））、テノホビル・ジソプロキル・フマレート塩（Tenofovir disoproxil fumarate salt）（またはViread（登録商標））、Combivir（登録商標）（３ＴＣプラスＡＺＴを含有）、Trizivir（登録商標）（アバカビル、ラミブジンおよびジドブジンを含有）およびEmtriva（登録商標）（エムトリシタビン（emtricitabine））；３種の非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼ阻害薬：ネビラピン（nevirapine）（またはViramune（登録商標））、デラビルジン（delavirdine）（またはRescriptor（登録商標））およびエファビレンツ（efavirenz）（またはSustiva（登録商標））；９種のペプチド擬似プロテアーゼ阻害薬または認可製剤：サキナビル（saquinavir）、インジナビル（indinavir）、リトナビル（ritonavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、アンプレナビル（amprenavir）、ロピナビル（lopinavir）、Kaletra（登録商標）（ロピナビルおよびリトナビル）、アタザナビル（atazanavir）（Reyataz（登録商標））、Fosamprenavir（登録商標）；およびウイルス性ｇｐ４１Ｔ−２０を標的にする１種の融合阻害薬（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）が挙げられる。

これら薬物のそれぞれは、単独で使用すれば、ウイルス複製（viral replication）を一時的にしか抑制することができない。しかしながら、これらの薬物は、組合せて用いると、ウイルス血症および疾患進行に対し十分な効果を有する。事実、組合せ療法の広く行きわたった適用の結果として、ＡＩＤＳ患者の中の死亡率の重要な減少が最近文書で証明されている。しかし、これらの印象的な結果に拘らず、結局、３０〜５０％の患者が薬物組合せ療法に失敗している。不十分な薬効、非コンプライアンス、限られた組織浸透および特定細胞型内の薬物−特異的制限（たとえば、ほとんどのヌクレオシド類縁体は、休止細胞においてリン酸化できない）は、敏感なウイルスの不完全抑制に原因しうる。

さらに、変異の頻繁な取込みを兼ねたＨＩＶ−１の高い反復率（replication rate）や急な転換は、最適状態に及ばない薬物濃度であると、薬物−耐性変種や処置不足の様相に導く（LarderおよびKemp ; Gulick ; Kuritzkes ; Morris−Jonesら；Schinaziら； Vaccaおよび Condra ; Flexner ; Berkhoutおよび Renら；（Ref. 6-14））。従って、より多くの処置選択を付与するには、明確な耐性パターンや好都合な薬物動態並びに安全プロフィールを示す新規な抗ＨＩＶ剤が必要である。

目下市場に出されているＨＩＶ−１薬物は、ヌクレオシド逆トランスクリプターゼ阻害薬またはペプチド擬似プロテアーゼ阻害薬のいずれかで支配されている。最近、非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼ阻害薬（ＮＮＲＴＩｓ）が、ＨＩＶ感染の療法において、ますます重要な役割を獲得しつつある（Pedersen & Pedersen , Ref. 15）。少なくとも３０種のＮＮＲＴＩが文献に記載され（De Clercq , Ref. 16）、そして幾種かのＮＮＲＴＩｓが臨床試験で評価されている。ジピリドジアゼピノン（ネビラピン（nevirapine））、ベンゾキサジノン（エファビレンツ（efavirenz））およびビス（ヘテロアリール）ピペラジン誘導体（デラビルジン（delavirdine））が、臨床使用を認可されている。

しかしながら、ＮＮＲＴＩｓの開発や適用の主な欠点は、組織細胞培養および被処置個体、特に単療法を受ける個体の両方において、薬物耐性菌株の急出現の傾向である。結果として、耐性の発現への傾向が少ないＮＮＲＴＩｓの同定に、かなりの関心がある（Pedersen & Pedersen , Ref. 15）。非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼ阻害薬の最近の概観：“ＨＩＶ感染の処置のための新規治療コンパウンドおよび戦略に関する展望”が出た（Buckheit , 参考文献99）。ＮＲＴＩおよびＮＮＲＴＩｓの両方をカバーする論評が出た（De Clercq , 参考文献100）。ＨＩＶ薬物の最新状態の概観が出版された（De Clercq , 参考文献101）。

インドール−３−スルホン化合物、ピペラジノインドール化合物、ピラジノインドール化合物および５Ｈ−インドロ［３，２−ｂ］［１，５］ベンゾチアゼピン誘導体を含む数種のインドール誘導体が、ＨＩＶ−１逆トランスクリプターゼ阻害薬として報告されている（Greenleeら，Ref. 1 ; Williamsら，Ref. 2 ; Romeroら，Ref. 3 ; Fontら，Ref. 17 ; Romeroら，Ref. 18 ; Youngら，Ref. 19 ; Geninら，Ref. 20 ; Silvestriら，Ref. 21）。またインドール−２−カルボキサミド化合物も、細胞癒着およびＨＩＶ感染の阻害薬として記載されている（Boschelliら，ＵＳ５４２４３２９，Ref. 4）。３−置換インドール天然産物（セミコクリオジノール（Semicochliodinol）ＡおよびＢ、ジデメチルアステリキノン（didemethyl asteriiquinone）およびイソコクリオジノール（isocochliodinol））が、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害薬として開示された（Fredenhagenら，Ref. 22）。

以前に、構造上関連するアザ−インドールアミド誘導体が開示されている（Katoら，Ref. 23(a) ; Levacherら，Ref. 23(b) ; Dompe Spa , ＷＯ−０９５０４７４２，Ref. 5(a) ; Smith Kline Beecham ＰＬＣ，ＷＯ−０９６１１９２９，Ref. 5(b) ; Schering Corp., ＵＳ−０５０２３２６５，Ref. 5(c))。しかして、これら誘導体の構造は、オキソアセタミド誘導体よりむしろモノアザ−インドールモノ−アミドである点で、本発明に係るものとは相違し、またこれらの化合物のウイルス性感染、特にＨＩＶを処置する用途についての言及は全くない。

逆トランスクリプターゼあるいはプロテアーゼを標的とする上記の一般認可薬物に対し耐性となる患者の処置には、ＨＩＶ処置の新しい薬物が必要である。これらの薬物を得る１つのアプローチは、ウイルスの新しいかつ異なる標的を阻害する分子を見つけることである。積極的な研究下にある一般部類の阻害薬は、ＨＩＶ進入（entry）阻害薬である。この一般分類には、数種の標的にねらいを定められる薬物が包含され、ケモキネシス・レセプタ（ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）阻害薬、ウイルスｇｐ４１を標的にする融合阻害薬、およびウイルスエンベロープｇｐ１２０，そのヒト細胞標的ＣＤ４の結合を防止する阻害薬が挙げられる。

ウイルス進入阻害薬に関する多くの論評あるいは一般論文が最近出されており、幾つかの選定した参考文献は、以下のものである：
「Expert Opinion on Therapeutic Patents」（14(2), 251-255, 2004），“ＨＩＶ進入阻害薬としてのケモキネシス・レセプタ・アンタゴニスト”
Meanwell Nicholas A.、Kadow John F. の「Current Opinion in Drug Discovery & Development」（6(4), 451-461, 2003），“ＨＩＶの宿主細胞への進入の阻害薬”
Este Jose A. の「Current Medicinal Chemistry」（10(17), 1617-1632, 2003）（Retrovirology Laboratory irsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias ; Pujol, Universitat Autonoma de Barcelona, Badalona, Spain.），“抗ＨＩＶ介入に対する標的としてのウイルス進入”

Rachline A.、Joly V.の「Antibiotiques」（5(2), 77-82, 2003）（Service de Maladies Infectieuses et Tropicales A, Hopital Bichat−Claude Bernard, Paris, Fr.），“新しい抗レトロウイルス剤”
Gulick R. M. の「Clinical Micro biology and Infection」（9(3), 186-193, 2003）（Cornell HIV Clinical Trials Unit, Division of International Medicine and Infectious Diseases, Weill Medical College of Cornell University, New York, NY, USA），“新しい抗レトロウイルス薬”

Reeves Jacqueline D.、Gallo Stephen A.、Ahmad Navid、Miamidian John L.、Harvey Phoebe E.、Sharron Matthew、Pohlmann Stefan、Sfakianos Jeffrey N.、Derdeyn Cynthia A.、Blumenthal Robert、Hunter Eric、Doms Robert W.の「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」（99(25), 16249-16254, 2002, CODEN : PNASA 6 ISSN : 0027-8424）（Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA），“進入阻害薬に対するＨＩＶ−１の感受性は、エンベロープ／コレセプタ親和性、レセプタ密度、および融合動態に関連する”

Biscone Mark J.、Pierson Theodore C.、Doms Robert W.の「Current Opinion in Pharmacology」（2(5), 529-533, 2002）（Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA），“ＨＩＶ進入標的における機会と攻撃”
O'Hara Bryan M.、Olson William C.の「Current Opinion in Pharmacology」（2(5), 523-528,2002）（Progenics Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY,USA），“臨床発現におけるＨＩＶ進入阻害薬”

Hanna Sheri L.、Yang Chunfu、Owen Sherry M.、Lal Renu B.の「AIDS（London, United Kingdom）」（16(12), 1603-1608, 2002）（HIV Immunology and Diagnostics Branch, Division of AIDS, STD, Atlanta, GA, USA），“ＨＩＶ進入阻害薬の耐性変異”
Goldsmith Mark A.、Doms Robert W.の「Nature Immunology」（3(8), 709-710、2002, CODEN : NIAMCZ ISSN : 1529-2908）（Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, USA），“ＨＩＶ進入：全てのレセプタは同等に造られているか？”
Jiang Shibo Zhao Qian、Debnath Asim K.の「Current Pharmaceutical Design」（8(8), 563-580, 2002）（The New York Blood Center, Lindsley F. Kimball Research Institute, New York, NY, USA），“ペプチドおよび非ペプチドＨＩＶ融合阻害薬”

ウイルス膜ｇｐ１２０の細胞ＣＤ４への初期結合を防止する２つの一般アプローチがあり、これらは、
ａ）ヒトＣＤ４に結合し、ウイルスエンベロープ（ｇｐ１２０）の結合をブロックする阻害薬と、
ｂ）ウイルスｇｐ１２０に結合し、細胞ＣＤ４の結合を防止する阻害薬である。第二のアプローチは、ウイルス標的を阻害し、かつ選択すれば、正常なヒト生理機能を混乱させたりあるいは副作用を起す可能性を最小限にするという利点を有する。このアプローチの場合、ウイルスエンベロープの配列の変動によって起る薬物に対する感受性のスペクトルを克服したり、耐性の発現を抑制するためには、ウイルスを殺すのに必要な薬物濃度のＥＣ_５０または他の基準に比し、できるだけ何倍もの（as many multiple as possible）血漿薬物量に達することが重要である。

あとで述べるように、これらの阻害薬は、ヒトにおいて有用性が広がる程度に安全と思われ、このため、ウイルス抑制を可能ならしめるのに十分な暴露レベル（exposure levels）に達しうるものでなければならない。ウイルス生長を阻害するのに必要な薬物量に比しその倍数（multiple）が大きくなるにつれて、ウイルス複製の抑制がより有効かつ完全となり、およびウイルス変異、これに続く処置耐性の発現の機会が少なくなる。すなわち、ウイルス結合阻害薬の効力に寄与する重要な側面としては、内在的な効能と安全性のみならず、身体的に可能な用量および許容しうる、好ましくは便利な投与スケジュールでの高い血漿暴露量の達成を可能にする薬物動態および医薬特性が挙げられる。

本発明は、以前に開示された部類のＨＩＶ結合阻害薬の内、効きめのあるメンバーの用量を漸増したときに、最大限の暴露量と暴露の繰返し（exposure multiples）（すなわち、ＥＣ_５０あるいはＥＣ_９０より大きな薬物暴露の繰返し）を増加する能力を多いに高めるプロドラッグアプローチを記述する。
下記のシリーズの最新出版物や発表記事に、ウイルスｇｐ−１２０を標的にしかつウイルスの宿主ＣＤ４への結合を防止する、一部類のウイルス進入阻害薬のイニシャル・メンバー，ＢＭＳ−８０６の名称の化合物（下式参照）の特性が記載されている。

Lin Pin−Fang、Blain Wade、Wang Tao、Spicer Timothy、Guo Qi、Zhou Nannan、Gong Yi−Fei、Wang H. G. Heidi、Rose Ronald、Yamanaka Gregory、Robinson Brett、Li Chang−Ben、Fridell Robert、Deminie Carol、Demers Gwendeline、Yang Zheng、Zadjura Lisa、Meanwell Nicholas、Colonno Richard の「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」（100(19), 11013-11018、2003），“ＨＩＶ−１エンベロープを標的にしかつＣＤ４レセプタ結合を阻害する小分子ＨＩＶ−１阻害薬”

Guo Qi、Hsu−Tso、Dicker Ira、Fan Li、Zhon Nannan、Friborg Jacques、Wang Tao、McAuliffe Brian V.、Wang Hwei−gene Heidi、Rose Ronald E.、Fang Hua、Scarnati Helen T.、Langley David R.、Meanwell Nicholas A.、Abraham Ralph、Colonno Richard J.、Lin Pin−Fangの「Journal of Virology」（77(19), 10528-10536、2003），“ｇｐ１２０−ＣＤ４相互作用をブロックする新しいＩ型ヒト免疫不全ウイルス阻害薬の生化学および遺伝学特性決定”
Ho Hsu−Tso、Dalterio Richard A.、Guo Qi、Lin Pin−FangのPCT Int. Appl. （2003），ＷＯ２００３０７２０２８Ａ２，“ＣＤ４とｇｐ１２０の相互作用を防止することにより、ＨＩＶ感染を処置する小複素環式化合物の使用方法”

Wang Tao、Zhang Zhongxing、Wallace Owen B.、Deshpande Milind、Fang Haiquan、Yang Zheng、Zadjura Lisa M.、Tweedie Donald L.、Huang Stella、Zhao Fang、Ranadive Sunanda、Robinson Brett S.、Cong Yi−Fei、Ricarrdi Keith、Spicer Timothy P.、Deminie Carol、Rose Ronald、Wang Hwei-Gene Heidi、Blain Wade S.、Shi Pei−Yong、Lin Pin−fang、Colonno Richard J.、Meanwell Nicholas A.の「Journal of Medicinal Chemistry」（46(20), 4236-4239, 2003），“４−ベンゾイル−１−［（４−メトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）オキソアセチル］−２−（Ｒ）−メチルピペラジン（ＢＭＳ−３７８８０６）の発見：ＣＤ−４−ｇｐ１２０相互作用を干渉する新規ＨＩＶ−１結合阻害薬”

この部類からのインドール、アザインドールおよび他のオキソアミド含有誘導体が、種々のＰＣＴ出願およびＵ．Ｓ．特許出願に開示されており（参考文献９３−９５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１１および１１２）、これらの参考文献は、本特許出願の化合物に直接関係する。これら従来技術の参考文献の化合物はいずれも、Ｎ−１窒素に付くリン酸二水素メチル基（またはリン酸基の塩あるいはモノもしくはジエステル）を含有せず、従って、本発明の化合物は新しい合成物の事項を表わす。この成分は、プロドラッグ変性として機能することにより、親化合物（parent compounds）の有用性を劇的に増加せしめ、また、ヒト暴露の臨床前モデルにおいて、親分子（parent molecules）の最大組織暴露を劇的に増加せしめる。我々は、かかる従来技術参考文献において、本発明の化合物および該化合物のＨＩＶ感染を阻害する用途を開示もしくは示唆すると解釈できるものは何もないと確信する。

本発明は、抗ウイルス剤、特に抗ＨＩＶ薬物として親分子の経口有用性を改善するのに極めて有効な、特定のインドールおよびアザインドールケトピペラジン・アミド化合物のプロドラッグを記述する。親分子は比較的に不溶性であり、溶解−制限もしくは溶解性制限吸収を欠点とし、このことは、用量が最大レベルを越えて増加するにつれて、薬物が血液循環への吸収に間に合って溶解するのがだんだん少なくなることを意味し、そして親分子は、代わりに体中を通り抜けて、排泄物として排出される。プロドラッグによって企てられる改善が必要で、それは体内の薬物量を有意に増加させるからで、これによって、ＨＩＶウイルスに対し、特に敏感性が少ないもしくは耐性の大きい菌株に対してより大きな効きめが付与される。

プロドラッグは、この部類の薬物にとって特に重要で、それは該薬物が、菌株と菌株の間を変動する標的、すなわち、最大限の暴露の繰返しが望まれるＨＩＶウイルスのエンベロープを標的にするからである。プロドラッグを用いると、薬物のより多くが吸収され、かつ標的に到達するので、丸剤身体負荷量、患者への費用および投与間隔が減少できるだろう。これらの特性を持つプロドラッグの同定は困難であり、かつ簡単な仕事でもないし、また文献に開示の成功したプロドラッグ設計への支障のない道でもない。プロドラッグの化学作用の採用を教示したり、あるいは最も有効であるとする明確な先行技術は存在しない。以下に示す論議やデータから、本発明で説明するプロドラッグは驚くべきことにふさわしく作用することが示されるだろう。かかるプロドラッグは、親薬物を極めて素早くかつ有効に放出し、そして、暴露のレベルを多くのプロドラッグの場合に報告されているものより高いレベルにまで高める。

薬物の特性を著しく高めたりあるいは薬物の医薬特性もしくは動態特性における固有の欠乏を克服するのに、プロドラッグ戦略または方法論は、一定の環境で用いることにより、薬物の有用性を著しく高めることができる。プロドラッグは、化学変性が、患者への投与時に体内で親分子を再生する、全く新しい化学実体に導く薬剤とは異なる。親薬物の再生のための条件、プロドラッグの物理的、医薬的もしくは薬物動態特性、およびプロドラッグ変性が結合しうる官能基を調節するその選択を付与する、無数のプロドラッグ戦略が存在する。

しかしながら、これらの出版物の内、本発明で創案される特定のプロドラッグに帰着する、如何なるアプローチを使用するかを教示するものは皆無である。プロドラッグ戦略に関する幾つかの概説もしくは論議が発表されており、非徹底的リストを以下に列挙する。
Richard Testa および Joachim Mayer の 2003 Wiley−VCH publisher, ISBN3-906390-25-x, “薬物における加水分解およびプロドラッグ代謝”

Bundgard H. Editor、Elsevier, Amsterdam, 1985, “プロドラッグの設計”
Stella V. J.、Kearney A. S.の Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Handbook of Experimental Pharmacology (1991), 100（Targeted Drug Delivery），71-103. CODEN : HEPHD 2 ISSN : 0171-2004. Journal ; General Review written in English. CAN 116 : 158649 AN 1992 : 158649 CAPLUS（Copyright 2004 ACS on SciFinder (R)),“薬物ターゲッティングの薬物動態：プロドラッグによるターゲッティングの特定連坐”

Stella V. J.、Charman W. N. A.、Naringrekar V. H. の Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Drugs（1985），29(5), 455-73. CODEN : DRUGAY ISSN : 0012-6667. Journal ; General Review written in English. CAN 103 : 115407 AN 1985 : 515407 CAPLUS（Copyright 2004 ACS on SciFinder(R)），“プロドラッグ、それらは臨床実務で利点を有しますか？”

Stella V. J.、Naringrekar V. H.、Charman W. N. A.の Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Pharmacy International（1984），5(11), 276-9. CODEN : PHINDQ ISSN : 0167-3157. Journal ; General Review written in English. CAN 102 : 72143 AN 1985 : 72143 CAPLUS（Copyright 2004 ACS on SciFinder (R)），“プロドラッグ調査の傾向”

特定の適用を有し、すなわち、溶解性または吸収を改善する幾つかの技法が知られているが、たとえばプロドラッグの開発の大部分は、経験的課題が残されている。すなわち、幾つかの戦略または化学変性は通常、詳しく調査しなければならず、またプロドラッグ戦略の成功を確かめ、判断するために、得られる化合物（コンパウンド）を生物モデルで評価しなければならない。

成功したプロドラッグ戦略には、分子中の化学反応部位を、プロドラッグ成分の付加によって変性し、その後、患者の所望の条件下でプロドラッグ成分はマスクを取り、親薬物を放出することが必要である。プロドラッグ分子は、投与に先立ち、許容しうる投与剤形において適当な安全性を有しなければならない。加えて、放出メカニズムは、プロドラッグが親薬物を有効に再生し、かつ疾患標的で治療レベルの親薬物を付与する動力学が伴なうのを可能にしなければならない。我々の分子において、インドールまたはアザインドール窒素は、プロドラッグ成分の結合の許容点を示す。

適当な化学またはリンカーによって結合するホスフェート基が、親薬物の経口暴露を高めうるという提案は、当該分野で公知のコンセプトである。しかしながら、以下で述べるように、ホスフェート基を用いてプロドラッグを創製すれば、該プロドラッグが所定の薬物物質といっしょに作用するだろうことを知りえたと予測することはできない。ホスフェート基は、薬物の物理的性質を一時的に変え、すなわち、体内のアルカリ性ホスファターゼあるいは他の合理的に設計したリンカーの化学反応によって開裂するまで、得られる分子の水溶解性を増大するプロドラッグである。たとえば、下記の参考文献では、著者達はホスフェートが経口効きめを改善しうると推断している。

この参考文献では、水溶性の乏しいアルコール基のホスフェート誘導体，親油性プロドラッグは、２つの他のプロドラッグよりも良好な経口生物学的利用能を示し、かつ経口生物学的利用能の低い親分子を超える利点を供えるようであった。
Chan O. Helen、Schmid Heidi L.、Stilgenbauer Linda A.、Howson William、Horwell David C.、Stewart Barbra H. の「Pharmaceutical Research」（15(7), 1012-1018, 1998），“水溶性の乏しい化合物の経口吸収を高める標的プロドラッグ戦略の評価”
２つの非常に直接関係のある新しい論文が発表され、経口使用にあって親分子を超える重要な利点を持つホスフェートプロドラッグを同定することの困難さが論じられている。

「Pharmaceutical Research 2003」（Vol. 20、No. 6、848-856頁）における Tycho Heimbach らによるタイトル“経口ホスフェートプロドラッグに対する吸収速度制限の考察”の論文に、“ホスフェートプロドラッグを経口ルートで使用することの意外な不能は、薬物候補を吸収可能性について選別するのに使用されているシステムでの研究を促した”と述べられている。また、この論文は、多くのホスフェートプロドラッグが経口使用に不適である理由について概説し、かつ薬物吸収プロセスにおける幾つかの潜在的な速度制限要因を論じている。また、この論文は、二・三の成功した適用を同定している。論文は、幾らかの薬物をホスフェートプロドラッグとして経口デリバリーに適するようにする特性の同定を試みているが、そのメッセージからは、なお経験科学であることが明らかである。

このことは、同じ著者の第二の論文：「International Journal of Pharmaceutics」（261, 81-92, 2003）におけるTycho Heimbach らによるタイトル“親薬物のそのホスフェートプロドラッグからの酵素仲介沈殿”の論文の結論によって強調される。著者らはアブストラクトで、多くの経口ホスフェートプロドラッグが、その不溶性親薬物と比較して、吸収の速度または程度の改善に失敗したと述べている。腸内アルカリ性ホスファターゼによる急速な親薬物発生は、過飽和溶液をもたらすことができ、これは親薬物沈殿に導く。これは、経口ホスフェートの有用性を制限するだろう。

この論文で述べられている結論を引用すると、“概要において、親薬物のホスフェートプロドラッグからの沈殿は、酵素仲介が可能である。また一定薬物の沈殿は、Caco−２モデルにおける一定薬物の場合にも観察することができる。過飽和率が高いと、誘導時間が減少しかつ核形成時間が増加するので、標的のプロドラッグ濃度が親薬物の溶解性よりもはるかに高いとき、すなわち、高い過飽和率を持つ親薬物の場合、親薬物は沈殿することができる。プロドラッグの変換中に親薬物が沈殿する程度は、プロドラッグの親変換への速度、親薬物の沈殿に対するプロドラッグ効果、および親薬物の可溶化に依存する。”とある。

著者の結論から明らかなように、そのプロセスは複雑で、前もって予測できない多くの要因、たとえば過飽和率、インビボでのプロドラッグ変換の速度、および腸内環境の親およびプロドラッグ混合物を可溶化する能力に依存する。
Heimbach の２つの参考文献に、ホスフェートプロドラッグの臨床現状が記載され、かつ多くの失敗や二・三の成功例が論じられている。臨床失敗の一例と成功の一例を以下に示す。
エトポシド（Etoposide、登録商標）は、ivまたは経口ルートのいずれかで投与される抗癌薬物である。

エトポシド・ホスフェートプロドラッグは、臨床使用されるが、このプロドラッグは親薬物のフェノール成分への直接結合によって形成されるホスフェートを含有することから、本願の誘導体とは異なる。薬物エトポシドのホスフェートプロドラッグを製造する主な理由は、溶解性の増加および賦形剤の縮小による静脈内使用の改善であった。ホスフェートプロドラッグを、臨床前と臨床上の両方で経口評価したが、iv投与の場合に臨床使用されているにすぎない。
Saulnier Mark G.、Langley David R.、Kadow John F.、Senter Peter D.、Knipe Jay O.、Tun Min Min、Vyas Dolatrai M.、Doyle Terrence W.の「Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters」（4(21), 2567-72, 1994）（Bristol−Myers Squibb Co., Wallingford, CT, USA），“エトポシドホスフェート，ＢＭＹ−４０４８１の合成：エトポシドの水溶性臨床活性プロドラッグ”およびその参考文献

以下に示す２つの参考文献から明らかなように、経口投与に対するホスフェート成分の利益は、明確ではなかった。
De Jong R. S.、Mulder N. H.、Uges D. R. A.、Kaul S.、Winograd B.、Sleijfer D. Th.、Groen H. J. M.、Willemse P. H. B.、van der Graaf W. T. A.、de Vries E. G. E. の「British Journal of Cancer」（75(11), 1660-1666, 1997），“エトポシドホスフェート経口およびエトポシド経口後の、エトポシド薬物動態のランダム比較”この論文は、親とプロドラッグを直接比較し、かつエトポシドホスフェート経口がエトポシド経口を超える臨床上関連した利益を供与しないと結論付けた。

Chabot G. G.、Armand J. P.、Terref C.、De Forni M.、Abigerges D.、Winograd B.、Igwemezie L.、Schacter L.、Kaul S.らの「Journal of Clinical Oncology」（14(7), 2020-2030, 1996）（Department Medicine, Gustave−Roussy Institute, Villejuif, Fr.），“Ｉ相研究中の癌患者におけるエトポシド・ホスフェートプロドラッグの経口投与後のエトポシド生物学的利用能”

この早期論文は、文献データと比べて、ＥＰ経口は、低用量または高用量のいずれかでＥ経口に比し１９％増のＦ値を有することを見出した。彼らの結論は、このＥＰプロドラッグ経口からのＥ中の高いＦは、この薬物にとって潜在的な薬力学的重要となりうる薬理学的利点と思われるというものであった。しかして、前述した反対結論に達する実験を後に行ったところ、直接比較データがより正当であると思われる。すなわち、ホスフェート基を付加して溶解性を改善することは、経口効きめ改善を保証するものではない。

ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬 Amprenavir のホスフェートプロドラッグを製造したが、その活性成分が経口使用の改善薬物となる。これは、このアプローチによるまれに成功した一例である。ホスフェートは、ヒドロキシ成分に直接結合し、溶解性を高めるのに役立つ。Fosamprenavir単独またはこれと他のプロテアーゼ阻害薬ritonavirとの組合せは、Cytochrome Ｐ４５０３Ａ４−仲介代謝非活性化を阻害するのに役立つが、患者が少数の丸剤、小さな丸剤（これらは賦形剤が少ないための必要に基づく）を受容し、かつ頻度の少ない投与スケジュールを採用するのを可能ならしめる。明らかに、下記 Amprenavirの構造は、本発明の分子と有意に相違し、かつ他の部類の薬物による成功またはホスフェートリンカー化学を予測するものではない。

Fosamprenavirに関する２つの参考文献が下記に挙げられるが、最も最近のデータは、当該分野で周知のデータベース、たとえばＩＤＤＢ（Current Drugs Ltd.製のインベスチゲーショナル・ドラッグス・データベース（Investigational Drugs Database）と呼ばれる市販データベース）の検索によって見つけることができる。

Corbett Amanda H.、Kashuba Angela D. M. の「Current Opinion in Investigational Drugs」（3(5), 824, 2002, Pharma Press Ltd.）（School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA），“Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals／Glaxo Smith Kline [Erratum to document cited in CA 138 : 130388]”
Corbett Amanda H.、Kashuba Angela D. M. の「Current Opinion in Investigational Drugs」（3(3), 384-390, 2002, Pharma Press Ltd.）（School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA），“Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals／Glaxo Smith Kline”

“インドールのプロドラッグ”または“アザインドールのプロドラッグ”のキーワード下のリストから見つけた文献を検索して、記載された幾つかの参考文献を同定する。我々は、Ｎ−１に結合するリン酸二水素メチル（またはホスフェート基の塩あるいはモノもしくはジエステル）成分の使用により、アザインドールプロドラッグを製造したいずれの参考文献にも気づいていない。

インドール・ホスフェートプロドラッグに関して、Zhuらの出版物に、ＰＤ１５４０７５の有効なホスフェートプロドラッグを発見する研究が記載されている。この分子において、直接インドール・ホスフェートまたはリン酸二水素メチルもしくはインドール窒素の塩プロドラッグはいずれも、親分子の再生速度が遅いため、不適当なプロドラッグであった。すなわち、可溶化するホスフェートを導入するため、以下に示す新規で複雑なリンカーが開発された。

Zhu Zhijian、Chen Huai−Gu、Goel Om P.、Chan O. Helen、Stilgenbauer Linda A.、Stewart Barbra H.の「Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters」（10(10), 1121-1124, 2000）（Division of Warner−Lambert Company, Chemical Development, Parke−Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI, USA），“ＰＤ１５４０７５のホスフェートプロドラッグ”

参考文献の多くに、溶解−制限吸収の克服以外を目的とするプロドラッグの設計が記載されている。幾つかのプロドラッグは、インドールまたはアザインドール窒素に結合せず、あるいは親薬物よりはむしろラジカル中間体を放出するように設計されている。この技術で記載のプロドラッグおよびその特性は、親ＨＩＶ結合阻害薬の特性を改善する明白な溶液を付与しない。

ところで、下記に示す一般構造式の新しいリン酸二水素メチルプロドラッグおよび医薬的に許容しうる塩は、現存する薬物が一般に採用していない新しいメカニズムを持つ抗ＨＩＶ剤として、有用であることがわかった。新メカニズムを持つ薬物へのニーズは大きく、何故なら、患者が現行の薬物部類に抵抗力を有するようになれば、その患者は選択の自由がない状態でいるからである。さらに、新メカニズムを持つ薬物は、公知部類は阻害薬と組合せて用いることにより、これら薬物への耐性の緊急事態をカバーすることができ、何故なら、耐性のあるウイルスの菌株はおそらく、代替メカニズムを持つ薬物に対してもなお感受するからである。

我々は、これらのプロドラッグが親分子より水溶性であり、かつネズミ類でまたはヒト酵素あるいは組織を用いるインビトロアッセイでの経口投与後に、急速に親分子に変わることを見出した。さらに、１つの経口用量漸増実験において、プロドラッグは用量の増加に伴って、薬物暴露量（ＡＵＣ）や最大濃度（Ｃmax）の意外な増大を付与した。これらの予測実験は、これらのプロドラッグがイヌやヒトにきっと利点を付与することを示唆する。

この親化合物ＩＶａを、ヒト臨床試験で実験した。該化合物を健康なヒト有志者に投与した。暴露量対用量のグラフを、図１に示す。

図１から明らかなように、単一用量のカプセル製剤（赤の三角形）は、２００〜２４００mgの大きさで２００mg増にて変化する。また経口ＡＵＣから、薬物暴露量の増加は、用量と比較して、はるかにゆっくりとしかふえず、かつ比例しないことが容易に認められる。実際、８００mgより大きい暴露量の差異または増加は、最小である。断食条件下のカプセル処置での用量比１：２：４：６：９：１２の場合、平均ＣmaxおよびＡＵＣ値の比はそれぞれ、１：１．３：２．４：２．３：２．１：２．７および１：１．５：２．３：２．０：１．９：２．４である。２００〜８００mg用量範囲で、全身性暴露量の増加は、用量に関係するが用量に比例せず、しかもかかる暴露量は、用量８００mg以上の用量には依存しない。この現象は、カプセル処方を用いた化合物ＩＶａの吸収が断食条件下で飽和できることを示す。

全身性暴露における用量比例は、食事条件（高脂肪食）下で極めて良好と思われるが、それは、用量比が１：２．３（８００mg対１８００mg）のとき、ＣmaxおよびＡＵＣのそれぞれの比が１．６および１．５であるからである。単一２００mg用量の化合物ＩＶａ溶液（濃赤色の正方形）と２００mgカプセル用量のそれとの比較によって明らかなように、溶液からの暴露量が高かった。溶液による投与は、化合物ＩＶａ暴露量を増加した。溶液のＣmaxおよびＡＵＣはそれぞれ、カプセル（２００mg）のそれの約８倍および３倍であった。溶液処方に対するカプセルの相対生物学的利用能（３２％）は、吸収が溶解速度に制限されることを示唆するが、これは処方の改善による全身性暴露量を増大する可能性を示唆する。

高脂肪食は、化合物に対し積極的な食物効果を有した。食事処置後のＣmaxは８００および１８００mg用量の場合それぞれ、断食処置の約２．６および４．６倍であった。食事処置後のＡＵＣは、８００および１８００mg用量の場合それぞれ、断食処置の約２．５および４．７倍であった。相対生物学的利用能（食事対断食）は、８００mgおよび１８００mg用量の場合、それぞれ２９３％および５０９％であった。Ｔmax中央値は、１．２５または２時間（断食）から４時間（食事）に変化した。

食物付８００mgカプセルの場合、平均血漿濃度は、用量の８および１２時間後でそれぞれ、１００１および２１８ng／mLである。かかる結果は、多重用量（multiple doses）後の少なくとも２００ng／mLの目標Ｃmin値に対して、ｑ１２ｈまたはｑ８ｈ投与の生活規制を支持した。この値は、臨床前のデータに基づき選択された。棒グラフで示されたこのデータの幾つかの他の概要を、図２Ｂの第二の棒グラフで示す。

健康なヒトでの多重用量実験：
健康なヒト被験者において、化合物ＩＶａの安全性、許容性および薬物導体を評価する、プラシーボ−照合の上昇多重用量実験を実施した。投与は、１４日間にわたり１２ｈ間隔で続けた。概要では、予備ＰＫ結果から、以下のことがわかった。すなわち、化合物ＩＶａの単一および多重Ｑ１２Ｈ用量後、暴露量は概して、高脂肪食および軽食の場合それぞれ、４００〜１２００mgおよび４００〜８００mgの用量範囲にわたって用量に比例し；該暴露量は、違う食事タイプで上記の用量レベルより大きい用量には依存しないようであり；累積は中位に対し（〜１．５倍まで）；そして暴露量が朝用量後よりも夜用量後の方が高いという点で、暴露量に日周的な変化がある。すなわち、投与を高脂肪食と組合せたときに暴露量はより良好で、かつ用量による暴露量増は、高脂肪食によって高くなった。
これは、上記の単一用量実験で得た結果に似ている。

ＨＩＶ患者での多重用量実験：
正常な有志者での実験で得た暴露量データに基づき、ＨＩＶ患者において効力実験を実施した。このデータの最初の開示は、講演発表の要約書：G.Hanna、J.Lalezari、J.Hellinger、D.Wohl、T.Masterson、W.Fiske、J.Kadow、P-F．Lin、M.Giordano、R.Colonno、D.Grasela の「Abstract」（Ｊ−３２，０２／１１／２００４，レトロウイルスおよび日和見感染に関する第１１回協議会（ＣＲＯＩ），サンフランシスコ、ＣＡ），“ＨＩＶ−１感染被験者における新規な経口小分子ＨＩＶ−１結合阻止薬，ＩＶａの抗ウイルス活性、安全性および許容性”になされている。この実験設計は、抗レトロウイルス療法をうけたことがない、または＞１６週にわたって抗レトロウイルス療法をやめているＨＩＶ＋成人を包含する。それらのＣＤ４カウントは、＞２５０細胞／mm^３であることを要し、血漿ＨＩＶ-１ＲＮＡは５０００〜５０００００ｃ／ｍＬの範囲にある必要があった。各用量アーム（arm）に１５人の被験者がおり、患者が受容する薬物：プラシーボの比は４：１であった。

プラシーボ−照合の化合物ＩＶａの遂次実験は、１２ｈ毎に８００mgＰＯの初期用量アームを利用した後、１８００mgＰＯの第二投与アームを１２ｈ毎に投与した。薬物はカプセルでかつ高脂肪食と組合せて投与することにより、暴露量および血漿レベルを増加したことに留意することが重要である。実験薬物は、７日間および８日目の朝に投与した。１４日間被験者を追跡した。

実験結果（患者２４人の内１８人が薬物ＩＶａを受容する）

１．高脂肪食と組合せた８００mg投与レベルのデータより明らかなように、重要な抗ウイルス活性が見られた。しかしながら、わずか５８％の患者が、ウイルス負荷において＞１．０log低下を有したにすぎなかった。高脂肪食付きの１８００mg投与生活規制の場合に、より強い抗ウイルス応答が見られ、この場合、平均応答はウイルス負荷において、−．９６log１０低下であった。このデータは、この薬物が高脂肪食との組合せで、１２時間毎に８００mgと１８００mgの用量にて（すなわち、その間で）重要な抗ウイルス活性を有することを示し、従って、組合せ療法での重要な役割を演じることができよう。

口頭発表：G.Hanna、J.Lalezari、J.Hellinger、D.Wohl、T.Masterson、W.Fiske、J.Kadow、P-F．Lin、M.Giordano、R.Colonno、D.Grasela の「Abstract」（Ｊ−３２，０２／１１／２００４，レトロウイルスおよび日和見感染に関する第１１回協議会（ＣＲＯＩ），サンフランシスコ、ＣＡ），“ＨＩＶ−１感染被験者における新規な経口小分子ＨＩＶ−１結合阻止薬，ＢＭＳ−４８８０４３の抗ウイルス活性、安全性および許容性”の要約書またはスライドを考察することにより、ヒトにおけるＢＭＳ−０４３の結果の最新の概要を得ることができる。

残念なことに、明らかに健康上の利用から高脂肪食と組合せた、各２００mgのトータル９カプセルの１日２回の投与に必要としながら、この薬物を多数ケ月間長期にわたってデリバリーすることは実行できず、そこで、低用量で高い暴露量を付与し、かつ高脂肪食の必要を排除する、新しい処方が必要となる。

このように上記臨床データによれば、高脂肪食の無いより低用量から、この薬物の暴露量を改善する方法の必要が認められる。
すなわち、本発明のプロドラッグに関する初期データによれば、該プロドラッグは化合物ＩＶａなどの分子の暴露量を改善し；かつ高脂肪食が無く、カプセル負担を少なくして、および抗レトロウイルス療法の成分として親薬物を長期にわたり使用できるような濃度で該親薬物をデリバリーする、ことが意外にも予測される。

プロドラッグＩａｂ（リシン塩）または固体親分子（ＩＶａ）の固体カプセルをイヌに投与して得られる初期データを、図２の最初の棒グラフ図２Ａに要約する。図示から明らかなように、断食したイヌまたは高脂肪食を与えたイヌにプロドラッグＩａｂ（モノリシン塩）を投与した後、親分子の投与と比較すると、暴露量が意外にも高い。また、給餌対断食状態の効果は、たとえあっても最小限であり、それは、固体親分子の投与後もプロドラッグが暴露量に対してなお明白な効果を有しているからである。すなわち、驚くべきことに、プロドラッグの投与後の親分子の暴露量は、高脂肪食が依存しないことが認められ、このことは、親分子のそれよりも、投与後のより一貫した暴露レベルを予測するものである。

図２Ｂの棒グラフは、親分子ＩＶａに関して前述したヒトデータを要約し、かつ該分子の暴露量が高脂肪食、暴露量対用量における比例しない増加、および固体配合よりもむしろ溶液の投与によって得られる良好な暴露量に依存することを示す。下記で論じるように、これは、前臨床モデルにおいて、ホスフェートプロドラッグの使用によって意外にも改善されると思われる、溶解または吸収速度に制限される暴露量を示す。またホスフェートプロドラッグの使用は、断食イヌ対他の２つのプロドラッグの親における暴露量を増加した。これらの実験の詳細は、実験の箇所に含まれる。加えて、追加２つのプロドラッグ例に関するラット、イヌおよびサルの、並びに別の２つのプロドラッグに関するラットの各種実験の詳細から、ＨＩＶウイルス複製の処置や阻害に対したぶん有用性を有すると思われるものに関連する用量で、親分子を得た暴露量を超えて暴露量を増加させるこれらのプロドラッグの意外な有用性が証明される。

引用した参考文献（Ref.）：
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John A. のＵＳ特許 6476034, “抗ウイルス性アザインドール誘導体”および Wang Tao、Wallace Owen B.、Zhang Zhongxing、Meanwell Nicholas A.、Bender John A. の PCT Int. Appl. (PCT/US 01/02009), WO 0162255A1 (2001年1月19日出願、2001年8月30日公開), “抗ウイルス性アザインドール誘導体の製造”

９５．Wallace Owen B.、Wang Tao、Yeung Kap Sun、Pearce Bradley C.、Meanewll
Nicholas A.、Qiu Zhilei、Fang Haiguan、Xue Qiufen May、Yin Zhiwei の U.S.特許出願 No. 10/027612 (2001年12月19日出願) [ U.S.出願 No. 09/888686 (2001年6月25日出願) の一部継続出願で、PCT Int. Appl. (PCT/US 01/20300), WO 0204440A1 (2001年6月26日出願、2002年1月17日公開) に相当]

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１００．Balzarini J.、De Clercq E. の「Antiretroviral Therapy」 (31-62, 2001)
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１０５．W.J. Spillane らの「J. Chem. Soc.」 (Perkin Trans. 1, 3, 677, 1982)
１０６．Wang Tao、Zhang Zhongxing、Meanwell Nicholas A.、Kadow John F.、Yin Zhiwei、Xue Qiufen May (USA) の U.S.Pat. Appl. Publ. (2003), US 20030207910A1 (2003年11月6日公開) (U.S.特許出願 No. 10/214982、2002年8月7日出願) [U.S.出願 No. 10/038306 (2002年1月2日出願) の一部継続出願で、PCT Int. Appl. (PCT/US 02/00455), WO 02/062423A1 (2002年1月2日出願、2002年8月15日公開)に相当], “置換アザインドールオキソ酢酸ピペラジン誘導体の組成物および抗ウイルス活性”

１０７．(a) Nickel Bernd、Szelenyi Istvan、Schmidt Jurgen、Emig Peter、Reichert Dietmar、Gunther Eckhard、Brune Kay の PCT Int. Appl. (1999), 47pp. CODEN: PIXXD2 WO 9951224, “抗腫瘍剤としてのインドリルグリオキシルアミド化合物の製造”；(b) Emig Peter、Bacher Gerald、Reichert Dietmar、Baasner Silke、Aue Beate、Nickel Bernd、Guenther Eckhard の PCT Int. Appl. (2002), 4WO 2002010152A2, “抗腫瘍剤としてのＮ−（６−キノリニル）−３−インドリルグリオキシアミド化合物の製造”；(c) Nickel Bernd、Klenner Thomas、Bacher Gerald、Beckers Thomas、Emig Peter、Engel Juergen、Bruyneel Erik、Kamp Guenter、Peters Kirsten の PCP Int. Appl. (2001), WO 2001022954A2 , “治療的価値のある性質を有するインドリル−３−グリオキシル酸誘導体”

１０８．Wang Tao.、Wallace Owen B.、Meanwell Nicholas A.、Zhang Zhongxing、Bender John A.、Kadow John F.、Yeung Kap Sun の PCT Int. Appl. WO 2002085301A2 , “ＡＩＤＳの処置用のインドール、アザインドール、および関連複素環式ピペラジンカルボキサミド化合物の製造”
１０９．Kadow John F.、Xue Qiufen May、Wang Tao、Zhang Zhongxing、Meanwell Nicholas A. の PCT Int. Appl. WO 2003068221A1 , “抗ウイルス剤としてのインドール、アザインドールおよび関連複素環式ピロリジン誘導体の製造”

１１０．Wang Tao、Wallace Owen B.、Meanwell Nicholas A.、Kadow John F.、Zhang
Zhongxing、Yang Zhong の PCT Int. Appl. (2003), WO 2003092695A1 , “ビシクロ［４.４.０］抗ウイルス性誘導体”
１１１．Kadow John F.、Regueiro Ren Alicia、Xue Qiufen May の PCT Int. Appl. (2003), WO 2004000210A2 , “ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置用のインドリル、アザインドリルおよび関連複素環式スルホニルウレイドピペラジン化合物の製造”
１１２．Wang Tao、Zhang Zhongxing、Meanwell Nicholas A.、Kadow John F.、Yin Zhiwei、Xue Qiufen May、Regueiro Ren Alicia、Matiskella John D.、Ueda Yasutsugu の U.S. Pat. Appl. Publ. (2004) , US 2004110785A1 , “置換アザインドールオキソ酢酸ピペラジン誘導体の組成物および抗ウイルス活性”

本発明は、式Ｉの化合物、その医薬製剤、およびＨＩＶなどのウイルスに苦しむまたは感受性の患者におけるその使用用途を包含する。式Ｉの化合物（その非毒性で医薬的に許容しうる塩を含む）は、下記の式および意義を有する。

本発明は、下式Ｉで示される化合物を包含する。

［式中、ＸはＣまたはＮ、但し、ＸがＮのとき、Ｒ^１は存在せず；
ＷはＣまたはＮ、但し、ＷがＮのとき、Ｒ^２は存在せず；
ＶはＣ；

Ｒ^１は水素、メトキシまたはハロゲン；
Ｒ^２は水素；
Ｒ^３はメトキシまたはヘテロアリールで、これらのそれぞれは独立して、必要に応じて下記Ｇから選ばれる置換基の１つで置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはトリアゾリル、ピラゾリルまたはオキサジアゾリル）；
Ｅは水素または医薬的に許容しうるモノもしくはジ塩；
Ｙは

からなる群から選ばれ；

Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の多くて２つがメチル；
Ｒ^１８はＣ（Ｏ）−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ピリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、アザベンゾフリルおよびアザインドリルからなる群から選ばれ、これらのそれぞれは独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよく；
Ｄはシアノ、Ｓ（Ｏ_２）Ｒ^２４、ハロゲン、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２１Ｒ^２２、フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、該フェニルまたはヘテロアリールは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３の同一もしくは異なる置換基で置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはピリジニルおよびオキサジアゾリルからなる群から選ばれる）；

Ａはフェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルからなる群から選ばれ、該フェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３つの同一もしくは異なる置換基で置換されてよく；
Ｇは（Ｃ_１−６）アルキル、（Ｃ_１−６）アルケニル、フェニル、ヒドロキシ、メトキシ、ハロゲン、−ＮＲ^２３Ｃ（Ｏ）−（Ｃ_１−６）アルキル、−ＮＲ^２４Ｒ^２５、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＯＯＲ^２６および−ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５からなる群から選ばれ、該（Ｃ_１−６）アルキルは必要に応じて、ヒドロキシ、ジメチルアミノまたは１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンで置換されてよく；

Ｒ^２６は水素および（Ｃ_１−６）アルキルからなる群から選ばれ；
Ｒ^２０，Ｒ^２１，Ｒ^２２，Ｒ^２３，Ｒ^２４，Ｒ^２５はそれぞれ独立して、水素、（Ｃ_１−６）アルキルおよび−（ＣＨ_２）_ｎＮＲ^２７Ｒ^２８からなる群から選ばれ；
ｎは０〜６；および
Ｒ^２７およびＲ^２８はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチルである］

より好ましい具体例は、上記式中、
ＸおよびＷがそれぞれＮ；または
ＸがＣおよびＷがＮの化合物である。

別の好ましい具体例は、上記式中、
Ｒ^１８が−Ｃ（Ｏ）−Ｐｈ；および
Ｙが

の化合物である。

別の好ましい具体例は、上記式中、
Ｒ^３がメトキシまたはトリアゾリル、ここで、該トリアゾリルは必要に応じて、Ｇから選ばれる１つの置換基で置換されてよく；
Ｒ^１０−Ｒ^１７がそれぞれＨ；および
Ｇがメチル
の化合物である。

別の好ましい具体例は、上記式中、
Ｒ^１がＦ、およびＲ^３がＮ−１位で結合する１，２，３−トリアゾリルの化合物である。
別の好ましい具体例は、上記式中、
Ｒ^１がＯＭｅ、およびＲ^３がＮ−１位で結合する３−メチル−１，２，４−トリアゾリルの化合物である。
別の好ましい具体例は、上記式中、
Ｒ^１およびＲ^３がそれぞれトメキシの化合物である。

別の好ましい具体例は、上記式中、塩がナトリウム、リシンまたはトロメタミンの化合物である。
本発明の他の好ましい具体例は、式Ｉの化合物（その医薬的に許容しうる塩も含む）の抗ウイルス有効量、および医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤の１種以上から成る医薬組成物である。

別の好ましい具体例は、さらに、
（ａ）ＡＩＤＳ抗ウイルス剤；
（ｂ）抗感染剤；
（ｃ）免疫調節剤；および
（ｄ）ＨＩＶ進入阻害薬
からなる群から選ばれるＡＩＤＳ処置剤の抗ウイルス有効量を含有し、ＨＩＶ感染を処置するのに使用する上記医薬組成物である。

また本発明の具体例により、ＨＩＶウイルスに感染した哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に対し、式Ｉの化合物（その医薬的に許容しうる塩も含む）の抗ウイルス有効量、および医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤の１種以上を投与することから成る処置法も含まれる。

別の具体例は、哺乳類に対し、式Ｉの化合物（その医薬的に許容しうる塩も含む）の抗ウイルス有効量を、ＡＩＤＳ抗ウイルス剤、抗感染剤、免疫調節剤およびＨＩＶ進入阻害薬からなる群から選ばれるＡＩＤＳ処置剤の抗ウイルス有効量と組合せて投与する上記処置法である。

他の具体例は、化合物Ｉの製造に有用な、下式ＩＩで示される中間体化合物である。

［式中、ＸはＣまたはＮ、但し、ＸがＮのとき、Ｒ^１は存在せず；

ＷはＣまたはＮ、但し、ＷがＮのとき、Ｒ^２は存在せず；
ＶはＣ；
Ｒ^１は水素、メトキシまたはハロゲン；
Ｒ^２は水素；
Ｒ^３はメトキシまたはヘテロアリールで、これらのそれぞれは独立して、必要に応じて下記Ｇから選ばれる置換基の１つで置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはトリアゾリル、ピラゾリルまたはオキサジアゾリル）；

ＬおよびＭは独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、フェニル、ベンジル、トリアルキルシリル、２，２，２−トリクロロエトキシおよび２−トリメチルシリルエトキシからなる群から選ばれ、但し、ＬとＭの多くて１つが水素であってよく；
Ｙは

からなる群から選ばれ；

Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の多くて２つがメチル；
Ｒ^１８はＣ（Ｏ）−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ピリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、アザベンゾフリルおよびアザインドリルからなる群から選ばれ、これらのそれぞれは独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよく；

Ｄはシアノ、Ｓ（Ｏ_２）Ｒ^２４、ハロゲン、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２１Ｒ^２２、フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、該フェニルまたはヘテロアリールは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３の同一もしくは異なる置換基で置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはピリジニルおよびオキサジアゾリルからなる群から選ばれる）；

図１は、化合物ＩＶａのヒト臨床試験におけるＡＵＣ（Area Under the Curve、曲線下面積）対用量を示す。
図２は、イヌおよびヒト実験における断食および給餌条件下の化合物ＩＶａおよびプロドラッグＩａｂのＡＵＣを示す。
図３は、ラットのＩＶｃ経口ＡＵＣ対用量プロットを示す。
図４は、ラットのＩＶｃ経口Ｃｍａｘ対用量プロットを示す。

図５は、Ｉｃの経口投与後のラットにおけるＩＶｃの血漿プロフィールを示す。
図６は、ＩＶａまたはＩａｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶａＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。Ｉａｂのデータは、単一用量毒物動態実験から、ＩＶａのデータは、２週間診査経口用量毒性実験の１日目からのものである。Ｉａｂの投与量は、ＩＶａモル当量として表示する。
図７は、ＩＶａまたはＩａｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶａＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。Ｉａｂのデータは、単一用量毒物動態および許容性実験から、ＩＶａのデータは、２０および１００mg／Kgの投与量での１０日診査経口用量毒性実験または２００mg／Kgの投与量での２週間経口用量毒性実験の１日目からのものである。Ｉａｂの投与量は、ＩＶａモル当量として表示する。
図８は、ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩａｂの加水分解およびＩＶａの形成を示す。

図９は、ラットにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびラットにおけるＩＶａの経過データ（historical data）からの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図１０は、イヌにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびイヌにおけるＩＶａの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図１１は、サルにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびサルにおけるＩＶａの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図１２は、ＩＶｂまたはＩｂｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶｂＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。両ＩｂｂおよびＩＶｂのデータは、単一用量毒物動態実験からのものである。Ｉｂｂの投与量は、ＩＶｂモル当量として表示する。

図１３は、ＩＶｂまたはＩｂｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶｂＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。Ｉｂｂのデータは、単一用量毒物動態および許容性実験から、ＩＶｂ（ＢＩＤ投与）のデータは、毒物動態および許容性実験からのものである。Ｉｂｂの投与量は、ＩＶｂモル当量として表示する。
図１４は、ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｂｂの加水分解およびＩＶｂの形成を示す。
図１５は、ラットにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびラットにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図１６は、イヌにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびイヌにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。

図１７は、サルにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびサルにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図１８は、ＩＶｃまたはＩｃｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶｃＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。Ｉｃｂのデータは、単一用量毒物動態実験およびＩＶｃの２週間毒性実験からのものである。Ｉｃｂの投与量は、ＩＶｃモル当量として表示する。
図１９は、ＩＶｃまたはＩｃｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶｃＣｍａｘおよびＡＵＣの比較を示す。Ｉｃｂのデータは、単一用量毒物動態および許容性実験から、ＩＶｃのデータは、単一用量毒物動態および許容性実験からのものである。Ｉｃｂの投与量は、ＩＶｃモル当量として表示する。
図２０は、ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｃｂの加水分解およびＩＶｃの形成を示す。

図２１は、ラットにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびラットにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図２２は、イヌにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびイヌにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。
図２３は、サルにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびサルにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示す。

（発明の詳細）
本発明の化合物は、不斉中心を有し、このためジアステレオマーおよびエナンチオマーの混合物で存在しうるので、本発明はジアステレオマーおよびエナンチオマーの混合物に加えて、個々のジアステレオマー形態およびエナンチオマー形態も包含する。

定義
本明細書および特許請求の範囲で用いる語句“Ｃ_１−６アルキル”とは、直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アミル、ヘキシル等が挙げられる。
“ハロゲン”とは、塩素、臭素、沃素またはフッ素を指称する。

“アリール”基とは、完全共役π電子系を有する全炭素モノ環式または縮合環多環式（すなわち、環と環が隣接対の炭素原子を分け合っている）基を指称する。アリール基の具体例は、これらに限定されないが、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルである。アリール基は、置換または非置換されてよい。置換されるときの置換基は好ましくは、アルキル。シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、複素脂環式オキシ、チオヒドロキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオ複素脂環式オキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、カルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、トリハロメチル、ウレイド、アミノおよび−ＮＲ^ｘＲ^ｙ（ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙはそれぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、カルボニル、Ｃ−カルボキシ、スルホニル、トリハロメチル、および共に合して形成される５もしくは６員複素脂環式環から選ばれる）から選ばれる１種以上である。

本明細書で用いる“ヘテロアリール”基とは、環中に窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる原子の１個以上を有し、さらに完全共役π電子系を有する、モノ環式または縮合環（すなわち、環と環が隣接対の原子を分け合っている）基を指称する。他に特別な指示がない限り、ヘテロアリール基はヘテロアリール基内の炭素または窒素原子のいずれかで結合することができる。留意すべき点は、語句ヘテロアリールが親ヘテロアリールのＮ−オキシドを含むことが意図されていることで、但し、かかるＮ−オキシドが当該分野で公知のものとして実行できる場合である。

ヘテロアリール基の具体例は、これらに限定されないが、フリル、チエニル、ベンゾチエニル、チアゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピラニル、テトラヒドロピラニル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、プリニル、カルバゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、ピラジニル、ジアジニル、ピラジン、トリアジニルトリアジン、テトラジニルおよびテトラゾリルである。置換されているときの置換基は好ましくは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、複素脂環式オキシ、チオヒドロキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオ複素脂環式オキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、カルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、トリハロメチル、ウレイド、アミノ、および−ＮＲ^ｘＲ^ｙ（ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは前記と同意義である）から選ばれる１種以上である。

本明細書で用いる“複素脂環式”基とは、環中に窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる原子の１個以上を有する、モノ環式または縮合環基を指称する。環は安定な結合配置を付与するものから選ばれ、存在しない系を完成させる意図はない。また環は、１つ以上の二重結合を有していてもよい。しかしながら、環は完全共役π電子系を有しない。

複素脂環式基の具体例は、これらに限定されないが、アゼチジニル、ピペリジル、ピペラジニル、イミダゾリニル、チアゾリジニル、３−ピロリジン−１−イル、モルホリニル、チオモルホリニルおよびテトラヒドロピラニルである。置換されるときの置換基は好ましくは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、複素脂環式オキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオ複素脂環式オキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｃ−チオアミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、トリハロメタンスルホンアミド、トリハロメタンスルホニル、シリル、グアニル、グアニジノ、ウレイド、ホスホニル、アミノおよび−ＮＲ^ｘＲ^ｙ（ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは前記と同意義である）から選ばれる１種以上である。

“アルキル”基とは、直鎖および分枝鎖基を有する飽和脂肪族炭化水素を指称する。好ましくはアルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有する（数的範囲として、たとえば本明細書で“１−２０”と記載されているときは必らず、アルキル基は炭素原子１個、炭素原子２個、炭素原子３個等、２０個までの炭素原子を含有しうる）。より好ましくは、中間大きさの１〜１０個の炭素原子を有するアルキルである。最も好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は、置換または非置換されてよい。

置換されるときの置換基は好ましくは、トリハロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、複素脂環式オキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオ複素脂環式オキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｃ−チオアミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、トリハロメタンスルホンアミド、トリハロメタンスルホニル、および共に合して形成される５員もしくは６員複素脂環式環から選ばれる１種以上である。

“シクロアルキル”基とは、全炭素モノ環式または縮合環（すなわち、環と環が隣接対の炭素原子を分け合っている）基であって、１つ以上の環が完全共役π電子系を有しないものを指称する。シクロアルキル基の具体例は、これらに限定されないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン、シクロヘプタトリエンおよびアダマンタンである。シクロアルキル基は、置換または非置換されてよい。

置換されるときの置換基は好ましくは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、複素脂環式オキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオ複素脂環式オキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｃ−チオアミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、メタンスルホンアミド、トリハロメタンスルホニル、シリル、グアニル、グアニジノ、ウレイド、ホスホニル、アミノおよび−ＮＲ^ｘＲ^ｙ（ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは前記と同意義である）から選ばれる１種以上である。

“アルケニル”基とは、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合からなる、本明細書規定のアルキル基を指称する。
“アルキニル”基とは、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合からなる、本明細書規定のアルキル基を指称する。
“ヒドロキシ”基とは、−ＯＨ基を指称する。
“アルコキシ”基とは、本明細書規定の、−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ−シクロアルキル基の両方を指称する。

“アリールオキシ”基とは、本明細書規定の、−Ｏ−アリールおよび−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を指称する。
“ヘテロアリールオキシ”基とは、本明細書規定のヘテロアリールを持つヘテロアリール−Ｏ−基を指称する。
“複素脂環式オキシ”基とは、本明細書規定の複素脂環式基を持つ複素脂環式基−Ｏ−基を指称する。
“チオヒドロキシ”基とは、−ＳＨ基を指称する。
“チオアルコキシ”基とは、本明細書規定の、−Ｓ−アルキルおよび−Ｓ−シクロアルキル基の両方を指称する。

“チオアリールオキシ”基とは、本明細書規定の、−Ｓ−アリールおよび−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を指称する。
“チオヘテロアリールオキシ”基とは、本明細書規定のヘテロアリールを持つヘテロアリール−Ｓ−基を指称する。
“チオ複素脂環式オキシ”基とは、本明細書規定の複素脂環式基を持つ複素脂環式基−Ｓ−基を指称する。

“カルボニル”基とは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ”基を指称し、この場合、Ｒ”は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合）および複素脂環式基（環炭素を介して結合）からなる群から選ばれる。
“アルデヒド”基とは、Ｒ”が水素のカルボニル基を指称する。
“チオカルボニル”基とは、本明細書規定のＲ”を持つ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ”基を指称する。

“ケト”基とは、−ＣＣ（＝Ｏ）Ｃ−基を指称し、ここで、Ｃ＝Ｏの片側または両側の炭素は、アルキル、シクロアルキル、アリールの炭素またはヘテロアリールもしくは複素脂環式基の炭素であってよい。
“トリハロメタンカルボニル”基とは、Ｚ_３ＣＣ（＝Ｏ）−基（該Ｚはハロゲン）を指称する。
“Ｃ−カルボキシ”基とは、本明細書規定のＲ”を持つ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ”基を指称する。
“Ｏ−カルボキシ”基とは、本明細書規定のＲ”を持つＲ”Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−基を指称する。

“カルボン酸”基とは、Ｒ”が水素のＣ−カルボキシ基を指称する。
“トリハロメチル”基とは、Ｚが本明細書規定のハロゲン基である−ＣＺ_３基を指称する。
“トリハロメタンスルホニル”基とは、本明細書規定のＺを持つＺ_３ＣＳ（＝Ｏ）_２−基を指称する。
“トリハロメタンスルホンアミド”基とは、本明細書規定のＺおよびＲ^ｘを持つＺ_３ＣＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｘ−基を指称する。

“スルフィニル”基とは、本明細書規定のＲ”を持つ−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ”基、および加えて単結合のみの、すなわち、−Ｓ（Ｏ）−を指称する。
“スルホニル”基とは、本明細書規定のＲ”を持つ−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ”基、および加えて単結合のみの、すなわち、−Ｓ（Ｏ）_２−を指称する。
“Ｓ−スルホンアミド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つ−Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ基を指称する。

“Ｎ−スルホンアミド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘを持つＲ”Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｘ−基を指称する。
“Ｏ−カルバミル”基とは、本明細書規定の−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙを指称する。
“Ｎ−カルバミル”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つＲ^ｘＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｙ基を指称する。
“Ｏ−チオカルバミル”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つ−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ基を指称する。

“Ｎ−チオカルバミル”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つＲ^ｘＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ｙ−基を指称する。
“アミノ”基とは、−ＮＨ_２基を指称する。
“Ｃ−アミド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ基を指称する。
“Ｃ−チオアミド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つ−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ基を指称する。
“Ｎ−アミド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つＲ^ｘＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｙ基を指称する。

“ウレイド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙと、該Ｒ^ｘやＲ^ｙと同意義のＲ^ｙ２を持つ−ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｙＲ^ｙ２基を指称する。
“チオウレイド”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙと、該Ｒ^ｘやＲ^ｙと同意義のＲ^ｙ２を持つ−ＮＲ^ｘＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ｙＲ^ｙ２基を指称する。
“グアニジノ”基とは、本明細書規定のＲ^ｘ，Ｒ^ｙおよびＲ^ｙ２を持つ−Ｒ^ｘＮＣ（＝Ｎ）ＮＲ^ｙＲ^ｙ２基を指称する。
“グアニル”基とは、本明細書規定のＲ^ｘおよびＲ^ｙを持つＲ^ｘＲ^ｙＮＣ（＝Ｎ）−基を指称する。

“シアノ”基とは、−ＣＮ基を指称する。
“シリル”基とは、本明細書規定のＲ”を持つ−Ｓｉ（Ｒ”）_３基を指称する。
“ホスホニル”基とは、本明細書規定のＲ^ｘを持つ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ^ｘ）_２基を指称する。
“ヒドラジノ”基とは、本明細書規定のＲ^ｘ、Ｒ^ｙおよびＲ^ｙ２を持つ−ＮＲ^ｘＮＲ^ｙＲ^ｙ２基を指称する。
いずれか２つの隣接Ｒ基は共に合して、これらＲ基を初めに有している環に縮合する、別のアリール、シクロアルキル、ヘテロアリールまたは複素環式環を形成してもよい。

ヘテロアリール系の窒素原子が、“ヘテロアリール環二重結合に関係していること”が可能であることは、当該分野で公知であり、これは、５員環ヘテロアリール基を含有する２つの互変体構造における二重結合の形態を意味する。これは、当該分野の化学者によって十分に理解されるように、窒素が置換されうるかどうかを指図する。本発明の説明および特許請求の範囲は、化学結合に関する公知の一般原則に基づいている。特許請求の範囲は、不安定であったりあるいは文献記載に基づき存在しえないことが知られている構造を含まないことが理解される。

本明細書開示のプロドラッグ化合物の生理的に許容しうる塩は、本発明の技術的範囲に属する。本明細書および特許請求の範囲で用いる語句“医薬的に許容しうる塩”とは、非毒性の塩基付加塩を包含することが意図される。また本明細書で用いる語句“医薬的に許容しうる塩”とは、酸性基、たとえばカルボキシレートまたはホスフェートもしくはホスフェートモノエステルと、アンモニウム、アルカリ金属塩、特にナトリウムまたはカリウム、アルカリ土類金属塩、特にカルシウムまたはマグネシウム、遷移金属塩、たとえば亜鉛などの逆イオンとの塩；および適当な有機塩基、たとえば低級アルキルアミン（メチルアミン、エチルアミン、シクロヘキシルアミン等）による塩；または置換低級アルキルアミン（たとえばジエタノールアミン、トリエタノールアミンまたはモノトロメタミン（ＴＲＩＳもしくは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールとも称す）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、リシン、アルギニン、ヒスチジン、Ｎ−メチルグルカミンによる塩；あるいはピペリジンまたはモルホリンなどの塩基による塩も包含することが意図される。

両医薬的に許容しうる塩はまた、固体または結晶形状で単離されるとき、水和物または生成する化合物Ｉ物質に水分子を閉じ込めたものも包含することが理解される。化学量論の可能性は、当業者にとって周知である。医薬的に許容しうる塩の議論や可能な塩のリストについては、下記の参考文献に記載されている。
Stahl P. Heinrich の「Preparation of water-soluble compounds through salt formation」（Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Germany, Editor(s): Wermuth Camille Georges. 2版、601-615,2003) (Publisher: Elsevier, London, UK CODEN:69EOEZ),“医化学の実務”

Stahl P. Heinrich 、Wermuth Gamille G.の「International Union of Pure and Applied Chemistry」(Weinheim; New York: VHCA;Wiley-VCH,2002),“医薬塩のハンドブック：性質、選択および使用”
本発明の別の側面において、下式ＩＩの新規ホスフェートエステル中間体化合物ＩＩが開示されている。

ホスフェートエステルの場合、モノまたはビスの可能性があり、共に本発明によってカバーされる。

本発明の方法において、語句“抗ウイルス有効量”とは、意義のある患者の利益、すなわち、ＨＩＶ感染の阻害を特徴とする急性状態の治癒を示すのに十分な、該方法の各活性成分のトータル量を意味する。個々の活性成分の単独投与に適用するときの上記語句は、その成分単独の量を指称する。組合せ投与に適用するときの上記語句は、それが混合、連続または同時の投与のいずれであろうと、治療効果をもたらす活性成分の合計量を指称する。本明細書および特許請求の範囲で用いる語句“処置する、処置”とは、ＨＩＶ感染に関連する疾患を予防または改善することを意味する。

また本発明は、当該化合物と、ＡＩＤＳの処置に有用な作用物質の１種以上との組合せにも指向される。たとえば、本発明の化合物は、暴露前および／または暴露後の期間のいずれかで、有効量のＡＩＤＳ抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染剤、またはワクチン、たとえば下記表に示されるものと組合せて、有効に投与することができる。

さらに、本発明の化合物は、ＨＩＶ進入阻害薬と呼ばれる、ＡＩＤＳ処置用の別部類の作用物質と組合せて使用することもできる。かかるＨＩＶ進入阻害薬の具体例は、「ＤＲＵＧＳＯＦＴＨＥＦＵＴＵＲＥ」（２４（１２），pp．１３５５−１３６２，１９９９）；「ＣＥＬＬ」(Ｖol．９，pp．２４３−２４６，１９９９年１０月２９日)；および「ＤＲＵＧＤＩＳＣＯＶＥＲＹＴＯＤＡＹ」（Ｖol．５，Ｎo．５，pp．１８３−１９４，２００年５月）；および Meanwell Nicholas A. 、Kadow John F. の「Current Opinion in Drug Discouery & Development」（６（４），４５１−４６１，２００３），“ＨＩＶの宿主細胞への進入の阻害薬”で詳しく論じられている。本発明化合物は特に、他の結合阻害薬、融合阻害薬、およびＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４コレセプタのいずれかにねらいを定めたケモキネレセプタ・アンタゴニストと組合せて利用することができる。

本発明の化合物と、ＡＩＤＳ抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染剤、ＨＩＶ進入阻害薬またはワクチンとの組合せの範囲は、上記表のリストに限定されず、原則として、ＡＩＤＳの処置に有用ないずれかの医薬組成物との組合せを包含することが理解されよう。

好ましい組合せは、本発明化合物とＨＩＶプロテアーゼの阻害薬および／またはＨＩＶ逆トランスクリプターゼの非ヌクレオシド阻害薬を用いる、同時または交互の処置である。かかる組合せにおける任意の第４成分は、ＨＩＶ逆トランスクリプターゼのヌクレオシド阻害薬、たとえばＡＺＴ、３ＴＣ、ｄｄＣまたはｄｄＩである。好ましいＨＩＶプロテアーゼの阻害薬は、Reyataz （登録商標）（活性成分 Atazanavir）である。典型例として、３００〜６００mgの用量を１日１回投与する。これは低用量の Ritonavir （５０〜５００mg）といっしょに投与してもよい。ＨＩＶプロテアーゼの別の好ましい阻害薬は、Kaletra （登録商標）である。ＨＩＶプロテアーゼの別の有用な阻害薬は、indinavir であって、これはＮ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１−（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−フェニルメチル−４−（Ｓ）−ヒドロキシ−５−（１−（４−（３−ピリジル−メチル）−２（Ｓ）−Ｎ'−（ｔ−ブチルカルボキサミド）−ピペラジニル）−ペンタンアミド・エタノラートのスルフェート塩であって、Ｕ.Ｓ.５４１３９９９に従って合成される。
Indinavir は一般に、８００mgの用量で１日３回投与される。

他の好ましいプロテアーゼ阻害薬は、nelfinavir および ritonavir である。ＨＩＶプロテアーゼの別の好ましい阻害薬は、saquinavir であって、６００または１２００mgの用量で１日３回投与される。ＨＩＶ逆トランスクリプターゼの好ましい非ヌクレオシド阻害薬としては、efavirenz が挙げられる。またｄｄＣ、ｄｄＩおよびＡＺＴの製法は、ＥＰＯ０４８４０７１にも記載されている。これらの組合せは、ＨＩＶ感染の広がりや程度の制限に対し予期しない効果保を有するかもしれない。好ましい組合せとしては、以下のもの、すなわち、（１）indinavir と efavirenz および必要に応じてＡＺＴおよび／または３ＴＣおよび／またはｄｄＣ；（２）indinavir とＡＺＴおよび／またはｄｄＩおよび／またはｄｄＣおよび／または３ＴＣのいずれか、特に indinavir とＡＺＴおよび３ＴＣ；（３）stavudine と３ＴＣおよび／または zidovudine ；（４）zidovudine と
lamivudine および１４１Ｗ９４および１５９２Ｕ８９；（５）zidovudine と lamivudine が挙げられる。

かかる組合せにおいて、本発明化合物と他の活性物質の投与は、別々にまたは合して行なってよい。さらに、１つの要素の投与は、他の剤の投与の前、同時または後に行ってよい。

略語
以下に示す略語（これらのほとんどは、当業者にとって周知の通常の略語である）を、本発明の説明および実施例を通じて使用する。使用する略語の幾つかは、以下の通りである。
ｈ＝時間
r.t.＝室温
mol＝モル
mmol＝ミリモル
ｇ＝グラム
mg＝ミリグラム
mL＝ミリリットル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＤＣＥ＝１,２−ジクロロエタン
ＣＨ_２Ｃl_２＝ジクロロメタン

ＴＰＡＰ＝テトラプロピルアンモニウム・パールテネート
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＤＥＰＢＴ＝３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１,２,３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン
ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン
Ｐ−ＥＤＣ＝ポリマー支持１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＥＤＣ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＤＭＦ＝Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
Hunig塩基＝Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＭＣＰＢＡ＝メタ−クロロ過安息香酸

アザインドール＝１Ｈ−ピロロ−ピリジン
４−アザインドール＝１Ｈ−ピロロ［３,２−ｂ］ピリジン
５−アザインドール＝１Ｈ−ピロロ［３,２−ｃ］ピリジン
６−アザインドール＝１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン
７−アザインドール＝１Ｈ−ピロロ［２,３−ｂ］ピリジン
４,６−ジアザインドール＝５Ｈ−ピロロ［３,２−ｄ］ピリミジン
５,６−ジアザインドール＝１Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリダジン
５,７−ジアザインドール＝７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン

ＰＭＢ＝４−メトキシベンジル
ＤＤＱ＝２,３−ジクロロ−５,６−ジシアノ−１,４−ベンゾキノン
ＯＴｆ＝トリフルオロメタンスルホンオキシ
ＮＭＭ＝４−メチルモルホリン
ＰＩＰ−ＣＯＰh＝１−ベンゾイルピペラジン
ＮaＨＭＤＳ＝ナトリウム・ヘキサメチルジシラジド
ＥＤＡＣ＝１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド
ＴＭＳ＝トリメチルシリル
ＤＣＭ＝ジクロロメタン

ＤＣＥ＝ジクロロエタン
ＭeＯＨ＝メタノール
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＥtＯＡc＝酢酸エチル
ＬＤＡ＝リチウム・ジイソプロピルアミド
ＴＭＰ−Ｌi＝２,２,６,６−テトラメチルピペリジニル・リチウム
ＤＭＥ＝ジメトキシエタン
ＤＩＢＡＬＨ＝水素化ジイソブチルアルミニウム
ＨＯＢＴ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＣＢＺ＝ベンジルオキシカルボニル
ＰＣＣ＝ピリジニウム・クロロクロメート
ＴＲＩＳ＝トロメタミンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１,３−ジオール

化学：
本発明は、式Ｉの化合物、その医薬製剤、およびＨＩＶ感染に苦しむまたは感受性の患者におけるその使用途を包含する。
下記反応式Ａは、本発明のプロドラッグＩの親分子ＩＶからの製造法の概観を示す。

反応式Ａ

反応式Ｂ

方法を詳しく述べるため、反応式Ａで示されるように、興味がある抗ウイルス性親化合物ＩＶは、適当な塩基、たとえば水素化ナトリウム、水素化カリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムｔ−ブトキシド、ナトリウム（ビストリメチルシリル）アミド、カリウム（ビストリメチルシリル）アミド、またはこれらの混合物、たとえば水素化ナトリウム＋ナトリウム（ビストリメチルシリル）アミドの存在下、クロリド中間体ＩＩＩによるＮ−アルキル化によって、ホスフェート中間体ＩＩに変換される。試薬ＩＩＩの製造およびヒドロキシ基のアルキル化によるプロドラッグ製造で用いる方法については、Y. Ueda らのＵ.Ｓ.特許６３６２１７２Ｂ２に記載されている。アルキル化条件、保護基、保護除去および塩形成の条件は一般に、我々がヒドロキシ基よりむしろインドール環でアザインドールをアルキル化しているという事実に拘らず、我々の出願に適用しうる。

本願において、１．１〜５．０当量の塩基を利用することができ、２〜４当量が好ましい。試薬ＩＩＩは基体物質に基づき、１．１〜１２当量が使用でき、５〜１０当量が好ましい。この試薬は一度にまたは時間経過にわたり数量部づつ加えてよい。収率を上げるため、通常沃化物イオン源を反応液に加える。沃化物イオン源として、沃化元素が好ましい。アルキル化されるアザインドール／インドールのＮＨ当り、通常０．１〜１．５当量の沃素を加えるが、収率が最も高いことから、１．０〜１．２当量の沃素が好ましい。沃化物の他の源としては、たとえば沃化ナトリウム、沃化リチウム、沃化セシウム、沃化銅、または沃化テトラブチルアンモニウムが挙げられる。

沃素の機能はたぶん、クロロメチル試薬ＩＩＩからその場で、対応するヨードメチル試薬ＩＩＩａを生成させることと思われる。ＩＩＩに対応するヨードまたはブロモ試薬は、クロリドＩＩＩの代わりに、反応液にそのまま使用できると思われる。工程Ａのアルキル化反応は通常、不活性有機溶媒、たとえばテトラヒドロフラン中、約０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行なわれる。他の無水有機溶媒、たとえばメチルテトラヒドロフラン、メチルｔ−ブチルエーテル、ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、ジメチルアセタミド、またはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドも有用であることが認めることができる。次にエステル中間体ＩＩを、通常の脱保護工程に付して、保護基Ｐr を除去する。

かかる工程で用いる試薬は、使用する保護基に左右されるが、当業者にとって周知である。最も好ましい保護基は、ｔ−ブチル基であって、適当な不活性有機溶媒中、トリフルオロ酢酸、塩化水素酸またはギ酸を用いて除去することができる。不活性有機溶媒はジクロロメタン、あるいはひょっとして、たとえばジクロロエタン、トルエンもしくはトリフルオロメチルベンゼンであってよい。塩化メチレン中、１〜１５当量の酸（あるいは該酸はたとえば溶媒の５容量％溶液として違った方法で計量することができる）および０〜４０℃の温度を用いて、トリフルオロ酢酸による脱保護を行なうことができる。一般に、使用するＴＦＡの過剰分が大きくなれば、利用する温度は低くなる。適正な条件は、基体物質と共に変化する。工程Ｃは、遊離酸または当該分野で周知の多くの標準法により形成できる塩の単離を示す。

一般に、ＴＦＡ脱保護に続いて、水性ワークアップ（workup）を採用し、ここで、過剰の酸を塩基で中和し、有機溶剤、たとえば酢酸エチルまたはジクロロメタンによる抽出で有機不純物を除去する。たとえば、過剰の水性ＮaＯＨを用いて、反応混合物を塩基性にすることができる。これは当業者にとって周知である。水性１Ｎ−ＨＣlを用いて水性相をｐＨ２．５に再酸性化し、次いで有機溶剤で抽出し、溶剤を減圧除去してから、遊離酸を得る。

遊離酸は、水、メタノール、エタノールなどの溶媒中、適当な塩基の添加により無機塩に変換しうる。たとえば、ホスフェートプロドラッグの水溶液に炭酸ナトリウムを加え、ｐＨを約７．６に調整して溶液を得、凍結乾燥により脱水すると、プロドラッグのジナトリウム塩が得られる。同様に、炭酸カリウムも使用できる。重炭酸ナトリウムあるいは重炭酸カリウムの水溶液も同様に使用できる。ホスフェート酸性溶液を２−エチルヘキサン酸ナトリウムまたはカリウムで注意深く滴定することにより、モノカリウムまたはモノナトリウム塩が生成することができる。

遊離酸を有機溶媒、たとえば必要に応じて水を含有してもよい、酢酸エチルもしくはアセトニトリルまたは低分子量アルコールあるいはこれらの混合溶媒に溶解することにより、アミン塩を生成させることができる。塩形成に潜在的に使用できるアミンとしては、低級アルキルアミン（メチルアミン、エチルアミン、シクロヘキシルアミン等）または置換低級アルキルアミン（たとえばジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンなどのヒドロキシル−置換アルキルアミン）、リシン、アルギニン、ヒスチジン、Ｎ−メチルグルカミン、またはピペリジンもしくはモルホリンなどの塩基が挙げられる。出発溶液に低温でアミンをゆっくり加えることにより、化学量論に基づいてモノあるいはジアミン塩のいずれかを得ることができる。

またアミン塩は、溶液を攪拌し、次いで結晶化あるいは沈殿法よりはむしろ溶媒の減圧除去によっても得ることができる。再結晶化の手順は、化合物や塩と共に変化するが、当業者にとって利用できる。
反応式Ｂは、反応式Ａで示す一般順序を実施するのに好ましい順序および試薬と条件のセットを示す。代わりの多くの場合に、ジエステルの脱保護により中間体酸をその場で得た後、反応媒体での塩形成を包含する工程Ｃの順序を実施するのに好ましい方法を利用できる。

たとえば、水と水混和性の補助溶剤、たとえばアセトン、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどとの混合物中、ジエステルＩＩを加熱することにより、反応媒体中（その場で）、Ｉの遊離酸を得ることができる。好ましい溶剤は、アセトンおよびイソプロパノールである。周囲温度〜溶剤の沸点の温度が使用できよう。典型例として４０〜６０℃が好ましい範囲である。水と補助溶剤に遊離酸を含有する反応混合物に、塩基またはより好ましくは上述のアミンを添加することにより、直接塩が生成しうる。適当に条件を選択すれば、反応混合物より塩が結晶化もしくは沈殿し、かつ濾過および乾燥によって単離することができる。特定の実施例は、実験の区分に含まれる。

酸Ｉａｃ，ＩｂｃおよびＩｃの中間体ＩＩａ，ＩＩｂおよびＩＩｃの製造の好ましい方法により、予備的な研究努力中のＩＩａ，ＩＩｂおよびＩＩｃの製造のために最初に用いた手順に比し、幾つかの重要な利点が得られる。３つの中間体ＩＩの全ての製造の最初の発見ルートは、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの製造を使用し、比較的高価なテトラブチルアンモニウム・ジ−ｔ−ブチルホスフェートの使用が必要で、これを１０倍過剰の高価で潜在的に危険なクロロヨードメタンと反応させた。過剰の揮発分とヨードメタンを減圧除去して、粗試薬を得、これをさらに精製せずに用いた。

少なくとも５倍過剰のこの試薬を用いて、化合物ＩＶと反応させた。これは、ＩＶａ，ｂまたはｃの量と比較して、少なくとも５当量のテトラブチルアンモニウムホスフェートと５０当量のクロロヨードメタンを使用したことを意味する。さらに、塩基としてＮaＨおよびアルキル化を促進する添加剤として沃素を用い、化合物ＩＶとこの試薬のアルキル化を行った。これらの条件によれば、主生成物として所望化合物ＩＩと、シリカゲルクロマトグラフィーの使用で除去される副生成物を含有する反応混合物が生成し、特に反応スケールを大きくすると、単調で退屈な消費時間と操作が高価となる。副生成物の除去に失敗すると、次工程により不純物を含有する生成物Ｉが生成し、保護基の除去に際し、合理的な収率あるいは時間の枠内で、満足に除去するのは非常に困難であった。

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの改善製法は、低価格のジ−ｔ−ブチルカリウムホスフェートと、他の反応体クロロメチルスルホニルクロリドと比較してわずかに約２倍過剰のこの試薬を用いるものである。この方法で製造したジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートは、通常の蒸留によって純粋形状で単離される。

ＩＶからＩＩａの変換のため、わずか１．２当量のこの試薬を用い、化合物ＩＶをアルキル化した。さらに、反応性が低く、経済的な塩基，炭酸カリウムをＤＭＳＯといっしょに用いて、アルキル化を達成すると、生成する化合物ＩＩは副生成物が十分に無く、該化合物ＩＩを脱保護反応のため入力（inputs）として、クロマトグラフィー精製せずに使用することができる。クロマトグラフィーをしないこの方法で製造されるＩＩａからは、遊離酸ＩａｃまたはＩａｂなどの塩は、純粋形状で得ることができる。

ＩＶａよりも反応が遅い化合物ＩＩｂおよびＩＩｃの合成のため、２〜２．５当量のジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを用い、かつ改変条件（溶剤ＮＭＰ中、ＫＩと共に塩基として炭酸セシウム）を採用し、ＩＶｂおよびＩＶｃをアルキル化して、それぞれＩＩｂおよびＩＩｃへの高変換を実感した。

繰返すが、新しい条件により、化合物ＩＩを十分な純度で得、クロマトグラフィー精製の必要もなく、化合物Ｉの生成への使用を可能ならしめた。このように新しい条件は、本発明の化合物Ｉを製造するのに必要な試薬の量および化学量論を縮小し、かつ中間体ＩＩのクロマトグラフィー精製の必要を回避する。ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの製造に用いる出発物質は、より経済的でかつ危険が少なく、また最終生成物はより高純度で生成する。最終的に、ＩＶａ，ＩＶｂおよびＩＶｃのアルキル化のための開発条件は、過剰に使用していた反応性で可燃性の水素化ナトリウム塩基の必要を削除し、そして炭酸カリウムまたはセシウムのいずれかを使用する。

アルキル化工程において、適当な塩基、たとえばＭ_２ＣＯ_３（Ｍはリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムまたはセシウム）を使用することができる。ＩＶａからＩＩａの変換のためには、Ｋ_２ＣＯ_３（ＩＶａ１モル当り、１〜５モル当量、好ましくは２モル当量）が好ましい。ＩＶｂからＩＩｂｂのまたはＩＶｃからＩＩｃの変換のためには、炭酸セシウムが好ましい。
また適当な溶剤、たとえばジメチルスルホキシド、Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリジノン、ホルムアミド、テトラヒドロフラン等も必要であり（ＩＶ１ｇ当り２〜５０mL、５mL／gが好ましい）、ＩＶａからＩＩａの変換にはジメチルスルホキシドが好ましく、ＩＶｂからＩＩｂのまたはＩＶｃからＩＩｃの変換にはＮ−メチルピロリジノンが好ましい。

適当な溶剤，沃素源としては、これらに限定されないが、ＭＩ（Ｍはたとえば、リチウム、ナトリウム、カリウム、沃素、テトラブチルアンモニウム等）が挙げられ、沃化カリウムが好ましい（化合物ＩＶ１モル当り、０．１〜５モル当量で、２当量が好ましい）。
アルキル化剤，ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを、ＩＶ１モル当り１〜１０モル当量で使用できるが、約１．２モル当量が好ましい。
反応温度は、１０〜６０℃であってよい（３０℃が好ましい）。

脱保護工程において、ＩＩａから２つのｔ−ブチル基を除去してＩａｃを形成するとき、この除去は適当な溶剤、たとえばジクロロメタン（これが好ましい）、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ベンゼン等の存在下で実施する（溶剤量：ＩＶ１ｇ当り２〜５０mL、１０mL／ｇが好ましい）。
ＩＩｂおよびＩＩｃを脱保護して、それぞれＩｂｃおよびＩｃを得るのに、この脱保護はアセトン／水中、約４０℃の温度で行なう。

さらに、ＩＩａの脱保護中、酸、たとえばトリフルオロ酢酸（これが好ましい）、塩化水素酸、硫酸、硝酸等を存在させることが好ましい（酸量：ＩＶａに対し２〜１００モル当量、１５モル当量が好ましい）。
一般：
出発物質および先駆物質の追加の製法は、WangらのＵ．Ｓ．特許６４７６０３４（２００２年１１月５日特許）に含まれる。

液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の全データは、電気噴霧モードのＬＣ用 Micromass Platform を用いて測定したマススペクトロメトリー（ＭＳ）データを用い、ＳＰＤ−１０ＡＶＵＶ−Ｖｉｓ検出器を用いるShimadzu ＬＣ−１０ＡＳ液体クロマトグラフィーにて記録した。
ＬＣ／ＭＳ法（すなわち、化合物同定）：
カラムＡ：ＹＭＣＯＤＳ−ＡＳ７３．０×５０ｍｍカラム
カラムＢ：ＰＨＸ−ＬＵＮＡＣ１８４．６×３０ｍｍカラム
カラムＣ：ＸＴＥＲＲＡｍｓＣ１８４．６×３０ｍｍカラム

カラムＤ：ＹＭＣＯＤＳ−ＡＣ１８４．６×３０ｍｍカラム
カラムＥ：ＹＭＣＯＤＳ‐ＡＣ１８４．６×３３ｍｍカラム
カラムＦ：ＹＭＣＣ１８Ｓ５４．６×５０ｍｍカラム
カラムＧ：ＸＴＥＲＲＡＣ１８Ｓ７３．０×５０ｍｍカラム
カラムＨ：ＹＭＣＣ１８Ｓ５４．６×３３ｍｍカラム
カラムＩ：ＹＭＣＯＤＳ−ＡＣ１８Ｓ７３．０×５０ｍｍカラム
カラムＪ：ＸＴＥＲＲＡＣ−１８Ｓ５４．６×５０ｍｍカラム
カラムＫ：ＹＭＣＯＤＳ−ＡＣ１８４．６×３３ｍｍカラム
カラムＬ：ＸＴＥＲＲＡＭＳＣ１８５μＭ４．６×３０ｍｍカラム
カラムＭ：ＹＭＣＯＤＳ‐ＡＣ１８Ｓ３４．６×３３ｍｍカラム

標準ＬＣ操作条件（特に言及なければ使用）：
勾配：１００％溶剤Ａ／０％溶剤Ｂ〜０％溶剤Ａ／１００％溶剤Ｂ
溶剤Ａ＝１０％ＭｅＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ
溶剤Ｂ＝９０％ＭｅＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；およびＲｔ（分）
勾配時間＝２分
滞留時間：１分
流速：５ｍＬ／分
検出器波長：２２０ｎｍ
溶剤Ａ：１０％ＭｅＯＨ／９０％Ｈ_２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸
溶剤Ｂ：１０％Ｈ_２Ｏ／９０％ＭｅＯＨ／０．１％トリフルオロ酢酸

他のＬＣ操作条件Ｂ：
勾配：１００％溶剤Ａ／０％溶剤Ｂ〜０％溶剤Ａ／１００％溶剤Ｂ
溶剤Ａ＝１０％ＭｅＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ
溶剤Ｂ＝９０％ＭｅＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；およびＲｔ（分）
勾配時間＝４分
滞留時間：１分
流速：４ｍＬ／分
検出器波長：２２０ｎｍ
溶剤Ａ：１０％ＭｅＯＨ／９０％Ｈ_２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸
溶剤Ｂ：１０％Ｈ_２Ｏ／９０％ＭｅＯＨ／０．１％トリフルオロ酢酸
分取ＨＰＬＣで精製した化合物を、ＭｅＯＨ（１．２ｍＬ）に希釈し、上記と同じ検出器（ＳＰＤ−１０ＡＶＵＶ−ＶＩＳ）波長および溶剤系（ＡおよびＢ）を用い、Shimadzu ＬＣ−１０Ａ自動化分取ＨＰＬＣシステムまたは Shimadzu ＬＣ−８Ａ自動化分取ＨＰＬＣシステムにて、以下の方法で精製する。

分取ＨＰＬＣ法（すなわち、化合物精製）
精製法：２０分にわたって初期勾配（４０％Ｂ，６０％Ａ）から最終勾配（１００％Ｂ，０％Ａ）、３分間保持（１００％Ｂ，０％Ａ）
溶剤Ａ：１０％ＭｅＯＨ／９０％Ｈ_２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸
溶剤Ｂ：１０％Ｈ_２Ｏ／９０％ＭｅＯＨ／０．１％トリフルオロ酢酸
カラム：ＹＭＣＣ１８Ｓ５２０×１００ｍｍカラム
検出器波長：２２０ｎｍ
下記の実験手順にあって、以下に示すＨＰＬＣ条件または標準手順の改変を用いた：
日常ＬＣ純度のＨＰＬＣ条件：
２５４ｎｍで検出；勾配０〜１００％Ｂ／Ａ；Ａ（１０％ＣＨ_３ＣＮ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ），Ｂ（９０％ＣＨ_３ＣＮ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ）；勾配時間４分；カラムＹＭＣＯＤＳ−ＡＱまたはＯＲＤ−Ａ４．６×５０ｍｍ，３ミクロン
ＬＣ／ＭＳ分析のＨＰＬＣ条件：
カラムＪ：ＸＴＥＲＲＡＣ−１８Ｓ５４．６×５０ｍｍカラム；勾配１００％溶剤Ａ／０％溶剤Ｂ〜０％溶剤Ａ／１００％溶剤Ｂ；溶剤Ａ＝１０％ＭｅＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ，溶剤Ｂ＝９０％ＭｅＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；およびＲｔ（分）；勾配時間３分；流速４ｍＬ／分；検出器波長２２０ｎｍ

出発物質は、商業的出所から購入するか、あるいは文献記載手順を用いて製造することができる。
親化合物ＩＶの製造：
親化合物ＩＶの製造は以前より、以下に示す特許文献に記載されている。
W. S. BlairらのＵ．Ｓ．特許６４６９００６（２００２年１０月２２日特許）
Wang らのＵ．Ｓ．特許６４７６０３４（２００２年１１月５日特許）

Meanwell らのＵ．Ｓ．特許６５７３２６２（２００３年６月３日特許）
J. Kadow らのＵ．Ｓ．出願Ｎｏ．１０／６３０２７８（２００３年７月３０日出願）（これは、２００２年１月２日出願のＵ．Ｓ．出願Ｎｏ．１０／０３８３０６の一部継続出願である、２００２年８月７日出願のＵ．Ｓ．出願Ｎｏ．１０／２１４９８２の一部継続出願）であって、ＰＣＴＷＯ０２／０６２４３（２００２年１月２日出願、２００２年８月１５日公開）に相当
Yeung らのＵ．Ｓ．出願Ｎｏ．１０／８７１９３１（２００４年６月１８日出願）
Wang らのＵ．Ｓ．出願Ｎｏ．１０／７６２１０８（２００４年１月２１日出願）であって、ＰＣＴＷＯ２００４／０４３３３７（２００４年５月２７日公開）に相当

精選した詳細な手順を、以下に記す。
親化合物ＩＶの製造のための中間体の典型的製造手順：
１）アザインドール１の製造

アザインドールの製造，方法Ａ：
７−クロロ−６−アザインドール１ｅの製造：
２−クロロ−３−ニトロピリジン２２ｅ（５．０ｇ）を、乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解する。溶液を−７８℃に冷却した後、過剰のビニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中１．０Ｍ、１００ｍＬ）を加える。次いで、反応液を−２０℃で８時間放置してから、２０％ＮＨ_４Ｃｌ（１５０ｍＬ）で反応を抑える。水性相をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ×３）で抽出する。コンバインした有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥する。濾過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、１．５ｇの７−クロロ−６−アザインドール１ｅを得る（収率３１％）。

化合物５ａｎ，ＩＶａおよび５ａｐを、以下に記載する。

アザインドール１ｅで用いた同じ方法で、化合物１ａｍ，４−ブロモ−７−クロロ−６−アザインドール（黄色固体）を製造するが、用いた出発物質は５−ブロモ−２−クロロ−３−ニトロピリジンである（Aldrich Co.より入手可）。ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_７Ｈ_５ＢｒＣｌＮ_２として），計算値２３０．９３；実測値２３１．１５。ＨＰＬＣ保持時間：１．６２分（カラムＢ）

化合物１ａｎ（４−メトキシ−７−クロロ−６−アザインドール）および化合物１ａｏ（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール）：
ＭｅＯＨ（１６ｍＬ）中の４−ブロモ−７−クロロ−６−アザインドール（１ｇ）、ＣｕＩ（０．６５ｇ）およびＮａＯＭｅ（４ｍＬ、２５％）の混合物を、密封チューブ中１１０〜１２０℃で１６時間加熱する。周囲温度に冷却後、反応混合物を１Ｎ−ＨＣｌで中和して、ｐＨ７を得る。水溶液をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出する。次いでコンバインした有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲル（５０ｇ）にて、溶離剤としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：７）を用いるクロマトグラフィーで精製して（カラムの大きさ：２０ｍｍ×３０ｃｍ）、０．３ｇの４−メトキシ−７−クロロ−６−アザインドール（白色固体）および０．１ｇの４，７−ジメトキシ−６−アザインドール（白色固体）を得る。

化合物１ａｎ（４−メトキシ−７−クロロ−６−アザインドール），ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_８Ｈ_８ＣｌＮ_２Ｏとして），計算値１８３．０３；実測値１８３．０９。ＨＰＬＣ保持時間：１．０２分（カラムＢ）
化合物１ａｏ（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール），^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．２８（ｍ，２Ｈ），６．６３（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ）。ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_９Ｈ_１１Ｎ_２Ｏ_２として），計算値１７９．０８；実測値１７９．０５。ＨＰＬＣ保持時間：１．３６分（カラムＢ）

アザインドールのアシル化，方法Ｂ：
メチル（５−アザインドール−３−イル）オキソアセテート２ｂの製造：
５−アザインドール（１ｂ）（０．５ｇ、４．２ミリモル）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中のＡｌＣｌ_３（２．８ｇ、２１．０ミリモル）の懸濁液に加える。攪拌を室温で１時間続けてから、メチルクロロオキソアセテート（２．５ｇ、２１．０ミリモル）を滴下する。反応液を８時間攪拌する。２０ｍＬのＭｅＯＨを用心深く加えて、反応を抑えた後、溶媒を減圧除去する。固体残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製して、０．６ｇ（７０％）のアシル化生成物２ｂを得る。

化合物２の特性決定：

化合物２ｂ（メチル（５−アザインドール−３−イル）−オキソアセテート）：
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 9.61 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.59 (d, 1H, J = 6.63 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 6.60 Hz), 4.00 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ 178.9, 163.0, 145.6, 144.2, 138.3, 135.0, 124.7, 116.3, 112.1, 53.8.
ＭＳｍ／ｚ（Ｃ_１０Ｈ_９Ｎ_２Ｏ_３として），計算値２０５．０６；実測値２０５．０４。ＨＰＬＣ保持時間：０．３２分（カラムＡ）

化合物２ｂで使用した同じ方法で、化合物２ａｏ（エチル（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール−３−イル）−オキソアセテート）を製造するが、用いた出発物質は４，７−ジメトキシ−６−アザインドールである。化合物をシリカゲルにて、溶離剤としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２：３）を用いるクロマトグラフィーで精製して、黄色油状物を得る。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.50 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.39 (q, 2H, d = 7.05 Hz), 4.13 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 1.40 (t, 3H, d = 7.2 Hz).
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_１３Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_５として），計算値２７９．１０；実測値２７９．１６。ＨＰＬＣ保持時間：１．２８分（カラムＢ）

２）カリウムアザインドール−３−グリオキシレート３の製造

カリウム（７−アザインドール−３−イル）−オキソアセテート３ａの製造：
化合物２ａ（４３ｇ、０．２１モル）およびＫ_２ＣＯ_３（５６．９ｇ、０．４１モル）を、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（２００ｍＬ）に溶解する。８時間後、溶液より生成物３ａが析出する。濾過を行って、４３ｇの化合物３ａを白色固体で得る（収率９０．４％）。

化合物３の特性決定：
化合物３ａ，カリウム（７−アザインドール−３−イル）−オキソアセテート：
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.42 (d, 1H, J = 7.86 Hz), 8.26 (d, 1H, J = 4.71 Hz), 8.14 (s, 1H), 7.18 (dd, 1H, J = 7.86, 4.71Hz); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ 169.4, 148.9, 143.6, 135.1, 129.3, 118.2, 117.5, 112.9.
ＭＳｍ／ｚ：化合物３ａの対応酸の（Ｍ＋Ｈ)^＋（３ａ−Ｋ＋Ｈ）（Ｃ_９Ｈ_７Ｎ_２Ｏ_３として），計算値１９１．０５；実測値１９０．９７。ＨＰＬＣ保持時間：０．４８分（カラムＡ）

化合物３ａの製造に用いた同じ方法で、化合物３ａｏ（カリウム（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール−３−イル）−オキソアセテート）を製造し（黄色固体で）、但し、出発物質としてエチル（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール−３−イル）−オキソアセテートを用いる。ＭＳｍ／ｚ：化合物３ａｏの対応酸の（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｍ−Ｋ＋Ｈ)^＋（Ｃ_１１Ｈ_１１Ｎ_２Ｏ_５として），計算値２５１．０７；実測値２５１．０９。ＨＰＬＣ保持時間：０．６９分（カラムＢ）

５ａの製造手順例

（Ｒ）−Ｎ−（ベンゾイル）−３−メチル−Ｎ’−［（７−アザインドール−３−イル）−オキソアセチル］−ピペラジン５ａの製造：
カリウム７−アザインドール・３−グリオキシレート３ａ（２５．４ｇ、０．１１１モル）、（Ｒ）−３−メチル−Ｎ−ベンゾイルピペラジン４ａ（２２．７ｇ、０．１１１モル）、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（３３．３ｇ、０．１１１モル）および Hunig 塩基（２８．６ｇ、０．２２２モル）を、５００ｍＬのＤＭＦ中でコンバインする。混合物を室温で８時間攪拌する。

減圧蒸発によりＤＭＦを除去し、残渣を酢酸エチル（２０００ｍＬ）と５％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（４００ｍＬ×２）間に分配する。水性層を酢酸エチル（３００ｍＬ×３）で抽出する。有機相をコンバインし、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥する。減圧濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲルにて、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（５０：１）を用いるカラムクロマトグラフィーで精製して、３３ｇの生成物５ａを得る（収率８１％）。

下記基礎構造を持つ化合物５の特性決定：

化合物５ａ，ｎ＝２，Ｒ_７−１３＝Ｈ，Ｒ_１４＝（Ｒ）−Ｍｅ，（Ｒ）−Ｎ−（ベンゾイル）−３−メチル−Ｎ’−［（７−アザインドール−３−イル）−オキソアセチル］−ピペラジン：
¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ8.57 (d, 1H, J = 5.97 Hz), 8.38 (d, 1H, J = 4.20 Hz), 8.27 (m, 1H), 7.47 (s, 5H), 7.35 (t, 1H, J = 5.13 Hz), 4.75-2.87 (m, 7H), 1.31 (b, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD) δ 185.6, 172.0, 166.3, 148.9, 144.6, 137.0, 134.8, 130.2, 129.9, 128.4, 126.6, 118.6, 118.0, 112.2, 61.3, 50.3, 45.1, 35.5, 14.9, 13.7.
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_２１Ｈ_２１Ｎ_４Ｏ_３として），計算値３７７．１６；実測値３７７．１８。ＨＰＬＣ保持時間：１．２１分（カラムＡ）
元素分析（Ｃ_２１Ｈ_２０Ｎ_４Ｏ_３として）
計算値：Ｃ６７．０１、Ｈ５．３６、Ｎ１４．８８
実測値：Ｃ６６．０１、Ｈ５．３５、Ｎ１４．６１

化合物５ａの製造で用いた同じ方法で、化合物ＩＶａ，Ｎ−（ベンゾイル）−Ｎ’−［（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール−３−イル）−オキソアセチル］ピペラジンを製造するが、出発物質はカリウム（４，７−ジメトキシ−６−アザインドール−３−イル）−オキソアセテートである。

化合物をシリカゲルにて、溶離剤としてＥｔＯＡｃを用いるクロマトグラフィーで精製して、白色固体を得る。
¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 13.0 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.40 (m, 6H), 4.00 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.63-3.34 (m, 8H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 185.5, 169.3, 166.5, 146.2, 145.7, 136.6, 135.3, 129.6, 128.4, 126.9, 122.2, 122.1, 119.2, 114.4, 56.8, 52.9, 45.5, 39.9.
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)^＋（Ｃ_２２Ｈ_２３Ｎ_４Ｏ_５として），計算値４２３．１７；実測値４２３．１９。ＨＰＬＣ保持時間：１．３３分（カラムＢ）
元素分析（Ｃ_２２Ｈ_２１Ｎ_４Ｏ_５として）
計算値：Ｃ６２．７、Ｈ５．０２、Ｎ１３．２９
実測値：Ｃ６１．９２、Ｈ５．４１、Ｎ１３．０１
融点：２２９．５〜２３２℃

親化合物ＩＶｃの製造手順
３−メチル−１，２，４−トリアゾール（２−８１）の製造

手順：５００ｍＬ丸底フラスコ中のギ酸ヒドラジド（６８ｇ、１．１３モル）およびチオアセトアミド（８５ｇ、１．１３モル）の固体混合物を、穏やかな窒素流と共に攪拌下、１５０℃（油浴温度）で１．５時間加熱して、反応中に形成するＨ_２Ｓおよび水を除去する（約１８ｍＬの液体を集める）。反応混合物を減圧蒸留し、先に液体を除去してから、１０２℃／０．３５〜１ｍｍＨｇにて６０．３ｇ（０．７２６モル、収率６３．３％）の標記化合物を白色固体で収集する。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δｐｐｍ２．５１（３Ｈ，ｓ，３−Ｍｅ），８．０３（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），９．５（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ）；ＴＬＣ，Ｒｆ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）＝０．３（ホスホモリブデート−炭化，白色スポット）
参考文献：Vanek T.、Velkova V.、Gut Jiri の「Coll. Czech. Chem. Comm.」（49, 2492, 1985）

３−８１の製造

手順：５００ｍＬ丸底フラスコに、４−メトキシ−７−クロロ−６−アザインドール２ｅ（９．１ｇ、５０ミリモル、減圧乾燥）、炭酸カリウム（１３．８ｇ、１００ミリモル、２当量）、銅粉末（６．３５ｇ、１００ミリモル、２当量）および３−メチル−１，２，４−トリアゾール（８３ｇ、１．０モル、２０当量）を入れる。固体混合物を穏やかな無水窒素下で、１７０〜１７５℃（外部油浴温度）にて１２ｈ加熱して溶融せしめ、この時点でＨＰＬＣ分析により、出発物質のピーク量が５〜３０％になり、所望生成物のピークが約４５％で同時に異性体副生成物ピークが１５％となることが認められる。反応混合物を冷却しながら、該温かい攪拌混合物に、ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）をゆっくりと加える。

冷却すると、不溶物質（銅粉）をセライト（Celite）パッドで濾去し、メタノールでリンスする。濾液を減圧濃縮して、粘稠ペーストとし、これを水（１Ｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ×３）で抽出する。ＥｔＯＡｃ抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮して約８ｇの粗残渣を得、これを温ＣＨ_３ＣＮ（５０ｍＬ）に溶解して晶出させた後、水（１００ｍＬ）で希釈し、０℃で冷却して１．４５ｇ（１２．７％）の標記化合物を白色固体で収集する。濾液をＣ−１８逆相シリカゲル（ＹＭＣＯＤＳ−Ａ７５μｍ）により、１５−３０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏで溶離して、精製する。適切な画分をコンバインし、回転エバポレータでＣＨ_３ＣＮを除去してから、水溶液を凍結乾燥して、別途１．１５ｇの標記化合物３−８１を得る。

粗水性層をさらに、ＥｔＯＡｃで数回抽出する。酢酸エチル抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、ＭｅＯＨより結晶化して、別途２００ｍｇの標記化合物３−８１を得る。トータル収量２．８ｇ（１２．２ミリモル、収率２４．５％）；ＭＳｍ／ｚ２３０（ＭＨ），ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ)（Ｃ_１１Ｈ_１２Ｎ_５Ｏとして），計算値２３０．１０４２；実測値２３０．１０３８（△−１．７ｐｐｍ）
¹H NMR (CDCl₃) δppm 2.54 (3H, s, CH₃), 4.05 (3H, s, OCH₃), 6.73 (1H, s, H-3), 7.40 (1H, s, H-2), 7.56 (1H, s, H-5), 9.15 (1H, s, triazole-H-5); ¹³C NMR (CDCl₃, 125.7 MHz) δ ppm 14.2 (triazole-Me), 56.3 (OMe), 100.5 (C-3), 116.9 (C-5), 123.5, 127.2, 127.5 (C-2), 129.5 (C-7), 141.2 (C-5'), 149.5 (C-4), 161.8 (C-3');
元素分析（Ｃ_１１Ｈ_１１Ｎ_５Ｏとして）
計算値：Ｃ５７．６３、Ｈ４．８３、Ｎ３０．５５
実測値：Ｃ５７．３７、Ｈ４．６４、Ｎ３０．６８

Ｃ−１８カラム画分から得た結晶を用い、単一Ｘ線結晶分析で構造を確認する。所望の３−メチル−１，２，４−トリアゾイル類縁体３−８１および異性体の５−メチル−１，２，４−トリアゾイル類縁体４−８１の混合物を含有するＣ−１８カラム画分の一部を、さらにＣ−１８逆相カラムにて、８−１０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏで溶離して精製する。適切な画分をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、ゆっくりした溶媒の蒸発により、異性体の７−（５−メチル−１，２，４−トリアゾリル）−４−メトキシ−６−アザインドール（４−８１）の結晶物質を得る。
MS m/z 230 (MH), ¹H NMR (CDCl₃) δppm 3.05 (3H, s, CH₃), 4.07 (3H, s, OCH₃), 6.74 (1H, q, J=2.4, H-2), 7.37 (1H, t, J=2.4, H-3), 7.65 (1H, s, H-5), 8.07 (1H, s, triazole-H-3).
単一Ｘ線結晶分析で、構造を確認する。

５−８１の構造

手順：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）およびニトロメタン（２０ｍＬ）の溶液に乾燥窒素下、ＡｌＣｌ_３（４０ｇ、０．３モル、１５当量）を溶解する。この溶液に攪拌しながらＮ_２下、化合物３−８１（４．５８ｇ、０．０２モル）を加えた後、メチルクロロオキソアセテート（９．８ｇ、０．０８モル、４当量）を加える。混合物をＮ_２下室温にて、１．５ｈ攪拌する。混合物を、２０％酢酸アンモニウム水溶液の冷攪拌溶液（７５０ｍＬ）に滴下する。

混合物を２０分間攪拌し、得られる沈殿物を濾別し、水で十分に洗い、減圧乾燥して４．７ｇ（０．０１５モル、収率７５％）の標記化合物５−８１を白色固体で得る。
MS m/z 316 (MH); HRMS (ESI) m/z calcd for C₁₄H₁₄N₅O₄ (M+H), 316.1046; found 316.1041 (Δ -1.6 ppm); ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δppm 2.58 (3H, s, CH₃), 3.96 (3H, s, OCH₃), 4.05 (3H, s, OCH₃), 7.76 (1H, s, H-5), 8.34 (1H, d, J=3Hz, H-2), 9.15 (1H, s, triazole-H-5), 11.0 (1H, brs, NH).
さらに濾液から、ＥｔＯＡｃによる酸−塩基抽出により、標記化合物５−８１と加水分解酸６−８１を得ることができる。

６−８１の製造

手順：ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のメチルエステル５−８１（２．２ｇ、７．０ミリモル）の懸濁液に、室温で０．２５Ｍ−ＮａＯＨ水溶液（５６ｍＬ、１４ミリモル、２当量）を加え、混合物を１５分間攪拌し、この時点でＨＰＬＣにより、加水分解の完了が認められる。混合物を素早く減圧濃縮して、ＭｅＯＨを除去し、残った溶液に攪拌しながら、水（１００ｍＬ）および１Ｎ−ＨＣｌ（１４ｍＬ）を加えて、混合物を中和する。得られる微細沈殿物を濾別し、水洗し、減圧乾燥して１．９８ｇ（６．５８ミリモル、収率９４％）の標記化合物６−８１をオフホワイト固体で得る。
MS m/z 302 (MH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ ppm 2.50 (3H, s, overlapped with DMSO peaks), 3.98 (3H, s, CH₃O), 7.87 (1H, s, H-5), 8.29 (1H, d, J=3.5Hz, H-2), 9.25 (1H, s, triazole-H-5), 12.37 (1H, s, NH).

他の手順：ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）中のメチルエステル５−８１（１０．７ｇ、３４ミリモル）の懸濁液に、室温で０．２５Ｍ−ＮａＯＨ水溶液（２７２ｍＬ、６８ミリモル、２当量）を加え、混合物を２０分間攪拌し、この時点でＨＰＬＣにより、加水分解の完了が認められる。混合物を素早く減圧濃縮して、ＭｅＯＨを除去し、残った溶液をＥｔＯＡｃで抽出して、いずれの中性不純物をも除去する。水性相に１Ｎ−ＨＣｌ（６８ｍＬ、６８ミリモル）を加えて、生成物を中和する。得られる混合物を冷凍し、凍結乾燥して、１４．１ｇ（３３．７ミリモル、収率９９．２％）の標記化合物６−８１（２モル当量のＮａＣｌ含有）をオフホワイト固体で得る。

この物質をさらに精製せずに、次反応に使用する。重炭酸ナトリウムの処理後、Ｃ−１８逆相カラムクロマトグラフィーにより、標記化合物６−８１のジナトリウム塩を得る。ＨＰＬＣ＞９７％（ＡＰ，２５４ｎｍでｕｖ）；ＨＲＭＳ（Ｎａ塩、ＥＳＩ⁻）ｍ／ｚ：（Ｍ−Ｈ）（Ｃ_１３Ｈ_１０Ｎ_５Ｏ_４として），計算値３００．０７３３；実測値３００．０７２４（Δ−３ｐｐｍ）。
¹H NMR (Na salt, DMSO-d₆, 500 MHz) δ ppm 2.37 (3H, s, Me), 3.83 (3H, s, CH₃O), 7.56 (1H, s, H-5), 8.03 (1H, s, H-2), 9.32 (1H, s, triazole-H-5); ¹³C NMR (Na salt, DMSO-d₆, 125.7 MHz) δ ppm 13.8 (triazole-Me), 57.2 (OMe), 114.8 (C-3), 120.0 (C-5), 125.1, 143.5 (C-5'), 149.8 (C-4), 160.0 (C-3'), 171.7, 191.3.

化合物ＩＶｃの製造

手順：ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の酸６−８１（３．０１ｇ、１０ミリモル）およびベンゾイルピペラジン塩酸塩（３．３９ｇ、１５ミリモル）の溶液に、Ｎ_２下トリエチルアミン（１０．１ｇ、１００ミリモル、１０当量）、次いで１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；５．７５ｇ、３０ミリモル）を加え、超音波処理後混合物を室温で２２ｈおよび４０℃で２ｈ攪拌する。

混合物を減圧濃縮して、ＤＭＦおよびＴＥＡを除去し、残留溶液に攪拌下水（２００ｍＬ）を加え、超音波処理する。形成した沈殿物を集め、水洗し、減圧乾燥して、２．８ｇ（５．９ミリモル、収率５９％）の標記化合物ＩＶｃをオフホワイト固体で得る。濾液をＣＨ_２Ｃｌ_２で２回抽出する。ＣＨ_２Ｃｌ_２抽出物を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮してゴム状物とし、これをＥｔ_２Ｏと共にトリチュレートして、酸を得る。この固体を懸濁し、ＭｅＯＨと共にトリチュレートして、４００ｍｇの標記化合物ＩＶｃをオフホワイト固体で得る。トータル収量：３．２ｇ（６．８ミリモル、収率６８％），ＭＳｍ／ｚ４７４（ＭＨ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）（Ｃ_２４Ｈ_２４Ｎ_７Ｏ_４として），計算値４７４．１８９０；実測値４７４．１８８４（Δ−１．２ｐｐｍ）。

¹H NMR (DMSO-d6) δ ppm 2.50 (3H, s, overlapped with DMSO peaks), 3.43 (4H, br, CH₂N), 3.68 (4H, br, CH₂N), 3.99 (3H, s, CH₃O), 7.46 (5H, br. s, Ar-Hs), 7.88 (1H, s, indole-H-5), 8.25 (1H, s, indole-H-2), 9.25 (1H, s, triazole-H-5), 12.40 (1H, s, NH); ¹³C-NMR (DMSO-d6) δ ppm 13.78, 40.58, 45.11, 56.78, 114.11, 120.95, 122.71, 123.60, 126.98, 128.34, 129.6, 135.43, 138.52, 142.10, 149.15, 161.29, 166.17, 169.22, 185.42; UV (MeOH) λmax 233.6 nm (ε 3.43x10⁴), 314.9 nm (ε 1.73x10⁴);
元素分析（Ｃ_２４Ｈ_２４Ｎ_７Ｏ_４・１／５Ｈ_２Ｏとして）
計算値：Ｃ６０．４２、Ｈ４．９４、Ｎ２０．５５
実測値：Ｃ６０．４２、Ｈ５．０３、Ｎ２０．６５ＫＦ(Ｈ_２Ｏ)０．７５％

またこの反応をＨＡＴＵおよびＤＭＡＰの使用によって行なうことにより、より一貫した収率の標記化合物を得ることができる。すなわち、ＤＭＦ（６０ｍＬ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）中の酸６−８１（１５．６ミリモル）およびＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスホネート］（８．９０ｇ、２３．４ミリモル、１．５当量）の懸濁液に、室温でＤＭＦ（６０ｍＬ）中のＤＭＡＰ（５．７２ｇ、４６．８ミリモル、３当量）およびベンゾイルピペラジン塩酸塩（５．３０ｇ、２３．４ミリモル、１．５当量）の混合物を加え、混合物を窒素雰囲気下で４ｈ攪拌する。

混合物を減圧濃縮して、ＣＨ_２Ｃｌ_２とほとんどのＤＭＦを除去し、残留溶液に攪拌しながら水を加え、超音波処理する。形成した沈殿物を集め、水洗し、減圧乾燥して、５．３８ｇ（１１．４ミリモル、収率７２．８％）の標記化合物ＩＶｃをオフホワイト固体で得る。ＨＰＬＣ＞９５％（ＡＰ，２５４ｎｍでｕｖ）。

化合物ＩＶｂの最良製法の合成実験手順

無水エタノール（２８０ｍＬ）とＨＢＦ_４（水中４８％、１７２ｍＬ）の０℃に冷却した攪拌混合物に、５−アミノ−２−メトキシピリジン（５０ｇ、０．４モル）を加える。亜硝酸ナトリウム（１２９ｇ）を水（５２ｍＬ）に溶解し、これを１ｈにわたって滴下する。攪拌を０℃で２ｈ続ける。反応混合物をエーテル（１Ｌ）で希釈する。固体生成物を濾取し、５００ｍＬのＥｔＯＨ／エーテル（５０：５０）で洗った後、生成物の色が少しピンクがかるまで、エーテルで数回洗う。淡ピンク色固体９０ｇ（収率〜１００％）を、デシケーター中Ｐ_２Ｏ_５上に保持する。

同じ手順を追行して、この反応を下記の大スケールで行なった。（１）（２００ｇ、１．６モル）；ＨＢＦ_４（６８８ｍＬ）；ＮａＮＯ_２（１１６ｇ）；ＥｔＯＨ（１．１２Ｌ）；Ｈ_２Ｏ（２０８ｍＬ）。
反応は４回行なう（トータル８００ｇ（１−８０））。生成物をＰ_２Ｏ_５上で４８ｈ乾燥する（最初のバッチは２４ｈのみ）。
トータル１２９３ｇの（２−８０）を得る（収率９１％）。
Ref ： J. Heterocyclic Chem., 10, 779, 1973（上記反応と分析データに関して）

２０６ｇ、２１９ｇおよび２３１ｇの３バッチにおいて、それぞれ１．３Ｌ、１．４Ｌおよび１．６Ｌの無水トルエンを用い、ジアゾニウム塩の分解を行った。すなわち、機械式攪拌器を備えた２Ｌの三ツ首丸底フラスコにて、窒素下トルエンを予め１００℃に加熱する。やや正の外部窒素流を持つアダプターに取付けた粉末漏斗を介して、大さじで固体を少量づつ加える。添加中、温度を９９〜１０２℃（１００℃にセット）に維持し、激しく攪拌する。トータル添加時間は、小さな２バッチの場合６０分で、最後のバッチは７０分である。添加終了後、それぞれの攪拌反応液を１１０℃で１ｈ加熱する。

加熱マントルを取除き、攪拌を止める。反応液を２ｈ静置せしめる（周囲温度に達する）。安全留意：反応液はＢＦ_３を含有し、そこで反応液との作業に熱い蒸気をさらすと、何人かに皮膚刺激（炎症）をもたらした。周囲温度ではこのような事態はない（６人）。
反応液からの温トルエンを、４Ｌ三角フラスコに注入する（暗褐色の油状物と残渣がフラスコに残る）。残渣を５０ｍＬのトルエンで洗い、元のトルエン抽出物に注ぐ。
トルエン層に１．５Ｌの１Ｎ−ＮａＯＨを加え、抽出し、〜１００ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗う。

ＮａＣｌとＮａＯＨ層をコンバインし、１５０ｍＬのトルエンで再抽出し、５０ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗う。
トルエン層をコンバインする。
反応フラスコの残渣に１Ｌの１Ｎ−ＮａＯＨを加え、渦攪拌してできるだけ多くの残渣を溶解し、次いで５００ｍＬのＥｔ_２Ｏを加え、三角フラスコに注ぐ。
さらに反応フラスコに〜５００ｍＬの１Ｎ−ＮａＯＨを加え、渦攪拌し、〜５００ｍＬのＥｔ_２Ｏを加える。
暗色のＥｔ_２ＯおよびＮａＯＨ洗液を、三角フラスコでコンバインする。
グラスウールのプラグを有する粉末漏斗を介して、Ｅｔ_２Ｏ／ＮａＯＨ混合物を注いで、暗色粘稠固体を６Ｌの分液漏斗に集める（さらに〜５００ｍＬのエーテルを加えて、洗う）。

抽出し、エーテル層を〜２００ｍＬのＨ_２Ｏ、次いで１００ｍＬの sat ＮａＣｌで洗う。
全ての洗液を元のＮａＯＨ aq.層とコンバインし、５００ｍＬのエーテルで再抽出し、１００ｍＬのＨ_２Ｏおよび１００ｍＬのＮａＣｌで洗う。
エーテル抽出物をコンバインし、トルエンおよびエーテル抽出物をＬＣ／ＭＳでチェック＝純粋生成物。
エーテルを回転エバポレータ（rotovap）で濃縮し、残渣をトルエン抽出物とコンバインして、均質溶液とし、そのまま次工程に供す。
他の２つの操作をコンバインし、同様にワークアップする（worked up）。
全ての水性層をＬＣ／ＭＳでチェック＝生成物なし。

Ref ： J. Heterocyclic Chem., 10,779,1973（上記反応と分析データに関して）

３−８０を含有するトータル４．６Ｌのトルエン溶液を、幾つかの密封チューブに入れ、１４５℃にて９００ｍＬの３５％ＨＣｌで２ｈ処理する。ＬＣ／ＭＳにより出発物質はなく、４のみが認められる。トルエン溶液をデカントし、捨てる。水性相をＥｔＯＡｃで洗い、濃縮して揮発分を除去し、所望フルオロ−ヒドロキシピリジン４−８０含有の褐色固体を得る。
トータル２４４ｇのこの固体を集め、そのまま（完全には乾燥せず）次工程に供す。

注：我々は続いて、最初にトルエン層をデカントしてから、加熱して容量を縮小することによりこの操作を行った。ＨＢｒ（水中４８％）を用い同反応を１００℃で６ｈ実施したところ、文献手順の収率４９％に類する結果が得られた。
Ref ： J. Heterocyclic Chem., 10, 779, 1973（上記反応と分析データに関して）

（４−８０）含有の上記固体を４バッチに分け、下記の通りＨ_２ＳＯ_４および発煙ＨＮＯ_３で処理する。使用量は以下の通り。

化合物４−８０を硫酸（上記多量）にｒｔで溶解し、次いで６５℃に加熱する。発煙硝酸と硫酸（上記少量）の予備形成溶液を滴下する。温度を６５〜８０℃間に維持する（発熱反応であり、浴温は６５℃であるが、通常は７５℃、時折り８０℃まで上昇する）。滴下終了後、反応混合物を６５℃でさらに１ｈ加熱する。次いで反応混合物をｒｔまで冷却し、氷含有フラスコに注ぐ（化合物１ｇ当り１０ｇの氷、ガス発生）。固体が析出し、これを濾取する（^１Ｈ−ＮＭＲにより、４−８０と他のもの（これは捨てる）が認められる）。

水性層をＡｃＯＥｔで数回（３〜５回）抽出し、減圧下回転エバポレータで濃縮して、固体を得、これをエーテルと共にトリチュレートして、５−８０を明黄色固体で得る。トータル１１７ｇの所望生成物を第１クロップ（crop）に集める（ジアゾニウム塩から収率２７％）。一部は結晶化せず、この油状物をＭｅＯＨおよびＥｔ_２Ｏと共にトリチュレートして、３．６ｇの５−８０を得る。母液からの別の沈殿物から、別途６．２３ｇの所望生成物５−８０を得る。
トータル：１１７．０＋３．６＋６．２３＝１２６．８３（３０．４％），３工程（ジアゾニウム塩の分解、脱保護およびニトロ化）の収量。

ノートからの分析データ：５３８７７−１１５
¹HNMR(δ, MeOD): 8.56-8.27 (dd, J= 7.5, 3.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J=3.3 Hz, 1H); LC/MS(M+1)⁺= 158.9; rt = 0.15 min.
注：酸性水溶液の一部を取り、Ｎａ_２ＣＯ_３で発泡が止まるまで中和し、次いでＡｃＯＥｔで抽出すると、異なる生成物が得られる。この抽出物には、所望生成物なし。

トータル１１７ｇの５−８０を、３０ｇ×３と２７ｇ×１の４バッチに分け、室温にてＰＯＢｒ_３（３当量；１６３ｇ×３と１５５ｇ×１）および触媒量のＤＭＦ（１５ｍＬ）で処理する（ＤＭＦを注意して加えると、ガス発生）。室温で５分後、溶液を１１０℃で３ｈ加熱する。ＬＣ／ＭＳにより、出発物質の消費が認められる。反応混合物をｒｔまで冷却せしめる。反応フラスコを氷浴に入れ、次いでフラスコに氷を極めてゆっくりかつ注意深く少量づつ加えると、ＨＢｒ形成に基づきガスが発生し、形成する液体および黒色固体を、氷付きビーカーに注ぐ。ＥｔＯＡｃを加え、次いで混合物をＥｔＯＡｃで数回抽出する。有機層を飽和 aq.ＮａＨＣＯ_３、Ｈ_２Ｏおよび塩水で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過する。生成物を一夜ポンプ乾燥して、１２３ｇの６−８０を褐色固体で得る（収率７７％）。
注：反応は１時間以内で終了する。
^１Ｈ−ＮＭＲ（δ，ＣＤＣｌ_３）：８．５２（ｍ，１Ｈ），７．９３（ｍ，１Ｈ）

８００ｍＬのビニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中１Ｍ、Aldrich）を、Ｎ_２下激しく攪拌しながら、−６０℃以下に冷却する。ＴＨＦ２００ｍＬ中の２−ブロモ−５−フルオロ−３−ニトロピリジン（４３．３ｇ、０．１９６モル）を滴下漏斗により、温度が−６０℃以下に保持されるような速度で滴下する。これは〜１．２５ｈ要する。反応混合物を−４０〜−５０℃に加温し、さらに１ｈ攪拌する。次いで１Ｌの飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液をゆっくりかつ注意深く加える。最初、発泡が起り、かなりの固体が存在するが、添加が終了すると実質的に溶解し、物質をｒｔまで加温する。各層を分離し、水性層を酢酸エチルで３回抽出する。有機抽出物を塩水で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、濃縮して〜５０ｇの黒色ゴム状固体を得る。ＨＰＬＣにより５７〜５８％生成物が認められる。

これにＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、固体を濾取し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗って、１２．５ｇの生成物を褐色固体で得る。正確に同じスケールで反応を繰返し、同様にワークアップする。ＣＨ_２Ｃｌ_２トリチュレートにより、１２．４ｇの先駆物質２ｉが得られる（ＨＰＬＣ〜９７％純粋）。粗生成物を回収し、ジクロロメタン中で静置せしめる。静置すると、別途３．６ｇの生成物が分離し、これを濾過して回収する。
トータル収量＝２９．５ｇ（３５％）
¹HNMR(δ, CDCl₃): 8.69(bs, 1H), 7.92 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.41 (m, 1H), 6.77 (m,1H); LC/MS(M+1)⁺ = 216.-217.9; rt = 1.43 min.

反応は、２５０ｍＬフラスコ（加熱時に発泡が起るので、大きいサイズのフラスコがより便宜である）で行なう。先駆物質２ｉ（３ｇ、１３．９５ミリモル）、１，２，３−トリアゾール（１５ｇ、２１７．６ミリモル、１５当量）、Ｋ_２ＣＯ_３（１．９ｇ、１３．９５ミリモル、１当量）およびＣｕ(０)（０．９ｇ、１３．９ミリモル、１当量）の混合物をＮ_２下、１６０℃で７ｈ（ｒｔから１６０℃までトータル７ｈ）加熱する（Ｃｕ(０)ロットに基づき、反応時間を２ｈから７ｈで変化させてよい）。得られる混合物をＭｅＯＨで希釈し、濾紙で濾過する（銅の除去のため）。ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で洗う。

濾液を濃縮し（rotovapで溶媒除去）、酢酸エチルで希釈する。水性層を酢酸エチルで抽出する。コンバインした有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮する。残渣をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、メタノールから７−８０（７５０ｍｇ）が白色固体で晶出し、これを濾取する。（ゆるい勾配容量、母液のシリカゲル hex／ＡｃＯＥｔ（０→１８％）により、さらに通常５〜１０％の７−８０を得る。）
¹HNMR (δ, CDCl₃): 10.47 (bs, 1H), 8.76 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.53 (m, 1 H), 6.78 (m, 1H); LCMS(M+1)⁺= 204; rt = 1.29 min.

エチルメチルイミダゾリウムクロリド（４．３ｇ、２９．６ミリモル、３当量）を、２５０ｍＬフラスコに入れる。フラスコにＡｌＣｌ_３（１１．８ｇ、８８．６ミリモル、９当量）を一度に加える。懸濁液が形成する（若干のＡｌＣｌ_３が固体として残存する）。５〜１０分の攪拌後、化合物（１）（２．０ｇ、９．８５ミリモル）を一度に加えた後、エチルクロロオキサルアセテート（３．３ｍＬ、２９．６ミリモル、３当量）をゆっくり加える（注射器により）。反応液を室温で２０ｈ攪拌する。ＬＣＭＳにより、化合物８−８０：化合物７−８０＝６：２が認められる（化合物Ｉが強いＵＶ吸収を有する）。

０℃で氷水（〜７５ｍＬ）を注意深く加えて、反応を抑える。この時点で、黄色固体が沈殿する。得られる懸濁液を濾過し、固体を水洗する。ＭｅＯＨおよび酢酸エチルで洗って、未反応ＳＭを除去し、固体を風乾する。８−８０含有の２ｇの固体が得られ（ＬＣＭＳ純度７０％〜８０％）、これをさらに精製せずに、次工程に付す。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１)^＋＝２７６；ｒｔ＝０．９７分。

ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の化合物８−８０（４．９ｇ、１７．８ミリモル）およびＮ−ベンゾイルピペラジン塩酸塩８ａ−８０（ＨＣｌ塩、６．０ｇ、２６．７ミリモル、１．５当量）の混合物を、ＲＴで一夜（１６ｈ）攪拌する。スラリーが形成する。該スラリーに別途２０ｍＬのＤＭＦを加える。次いでＨＡＴＵ（１２．２ｇ、２６．７ミリモル、１．５当量）を加えた後、ＤＭＡＰ（４．３ｇ、３５．６ミリモル、２当量）を加える。反応混合物を３０分間攪拌する。ＬＣＭＳにより、出発物質８−８０が完全に生成物（ＥＸＡＭＰＬＥ２１６）に変換したのが認められる。得られる混合物を濾過し、固体を水洗する。濾液を減圧濃縮する。残渣に水を加え、固体を濾取する。固体をコンバインし、水、ＭｅＯＨおよびＥｔＯＡｃで洗う。次いで固体を風乾する。ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣにより、ＩＶｂの純度＞９９％が認められる。固体生成物をさらに、５〜１０％ＣＨ_３ＯＨ／ＣＨＣｌ_３中沈殿および結晶化で精製する。

ＩＶｂの精製
上記で得られる粗化合物ＩＶｂ（１５．３ｇ）を、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３（６００ｍＬ）に溶解する。淡褐色懸濁液が形成し、これを濾紙で濾過し、ＭｅＯＨで２回洗う。褐色がかった固体を捨てる（〜１．２ｇ）。濾液の中で化合物ＩＶｂが晶出し、該固体を濾取し、白色固体を風乾する。濾液を用いて、結晶化を数回繰返す。各濾液から得られる固体を、ＨＰＬＣで分析する。純粋画分を全てコンバインする。それほど純粋でない画分を再度、ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ_３による結晶化に付す。再結晶および沈殿により、トータル１２．７ｇの化合物ＩＶｂが得られる。母液を濃縮し、シリカゲルカラムにて精製し（ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（０−２％））、５０６ｍｇの生成物を白色固体で得る。
¹HNMR (d, DMSO) 13.1 (bs, 1H), 9.0 (s, 1H), 8.4 (s, 1H), 8.3 (s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.4 (bs, 5H), 3.7 (bs, 4H), 3.5 (bs, 4H); MS m/z 448 (MH).
元素分析（Ｃ_２２Ｈ_１８ＦＮ_７Ｏ_３として）
計算値：Ｃ５９．０５、Ｈ４．０５、Ｎ２１．９１、Ｆ４．２４
実測値：Ｃ５７．２８、Ｈ４．１４、Ｎ２１．２２、Ｆ４．０７

実施例１〜４：
親化合物ＩＶからプロドラッグＩの製造
実施例１〜４の合成反応式

実施例１：Ｉａの製造

手順：ＴＨＦ（２ｍＬ；Sure Seal）中のＩＶａ（２１１ｍｇ、０．５ミリモル）の懸濁液を無水Ｎ_２雰囲気下、ＮａＨ（８６ｍｇ、２．２ミリモル、４．４当量、６０％油状分散体）で処理する。室温で数分の撹拌後、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（７８２ｍｇ、３．０ミリモル、製造はＵＳ特許６３６２１７２参照）を加え、混合物を１〜５日間撹拌し、ＨＰＬＣにより反応の終了を監視する（反応をほぼ終了させるのに、別途１〜２当量の各ＮａＨとホスフェートが必要である）。

出発物質の消費後、混合物を減圧濃縮乾固し、残渣（これは、Ｎ−アルキル化インドール・モノおよびビズ−ｔ−ブチルホスフェートの混合物と思われる）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）に溶解し、室温にてＴＦＡ（５ｍＬ）で２ｈ処理する。混合物を減圧濃縮し、残渣をＣ−１８逆相シリカゲルにて、ＮａＨＣＯ_３含有の５−１０％ＣＨ_３ＣＮ／水で溶離して精製し、７５ｍｇ（０．１３ミリモル、収率２６％）の標記化合物Ｉａをオフホワイト粉末（ジナトリウム塩）で得る。

ＨＰＬＣ＞９９％（２５４ｎｍでＡＰ）；ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ^＋）ｍ／ｚ５３３（Ｍ＋Ｈ−２Ｎａ）^＋；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ−２Ｎａ）^＋（Ｃ_２３Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_９Ｐとして），計算値５３３．１４３７；実測値５３３．１４２６（Δ−２．１ｐｐｍ）
¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δppm 3.51 (2H, m), 3.67 (2H, m), 3.73-3.79 (2H, m), 3.89-3.95 (2H, m), 3.94, 3.95 (3H, 2s), 4.05, 4.07 (3H, 2s), 6.02-6.04-6.05-6.07 (2H, ABq.), 7.43, 7.44 (1H, 2s), 7.45-7.56 (5H, m), 8.49, 8.52 (1H, 2s).
同様な手順と条件を用いることにより、ＩＶｂからＩｂを、ＩＶｃおよびＩＶｄからそれぞれＩｃおよびＩｄを製造するが、精製において重炭酸ナトリウムよりはむしろ水を利用する。

実施例２：

Ｉｂ：収率１３％（ジナトリウム塩）；ＨＰＬＣ＞９６％（２５４ｎｍでＡＰ）
LC/MS (ESI+) m/z 558 (M+H minus 2Na)⁺; ¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δppm 3.59 (2H, m), 3.70-3.84 (4H, m), 3.93-3.95 (2H, m), 5.28-5.29-5.30-5.32 (2H, ABq.), 7.4-7.6 (5H, m), 8.09, 8.10 (1H, 2s), 8.34, 8.36 (1H, 2s), 8.59, 8.61 (1H, 2s), 8.72, 8.75 (1H, 2s).

実施例３：

Ｉｃ：収率３７％（酸型）（精製中水性重炭酸ナトリウムの代わりに水を使用）；ＨＰＬＣ＞９８％（２５４ｎｍでＡＰ）
LC/MS (ESI+) m/z 584 (M+H); ¹H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δppm 2.40 (3H, s), 3.44 (4H, br.s), 3.66 (4H, brs), 4.04 (3H, s), 5.79 (1H, s), 5.82 (1H, s), 7.46 (5H, brs), 8.07 (1H, s), 8.41 (1H, s), 8.88 (1H, s).

実施例４

Ｉｄ：収率７％（酸型）（精製中水性重炭酸ナトリウムの代わりに水を使用）
LC/MS (ESI+) m/z 597 (M+H); ¹H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δppm 1.16, 1.21 (3H, 2d, J = 6.5 Hz), 2.29 (3H, s), 2.3-4.5 (7H, m), 4.00, 4.01 (3H, 2s), 5.79-5.85 (2H, m), 6.36 (1H, t, J = 2 Hz), 7.42-7.47 (5H, m), 7.99 (1H, s), 8.08, 8.09 (1H, 2s), 8.34, 8.44 (1H, 2s).

実施例５：Ｉｃａ（ジナトリウム塩）の製造

一般手順：無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＩＶｃ（０．２４ｇ、０．５ミリモル）の懸濁液を窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（６０％油状分散体、０．０８ｇ、２．０ミリモル）で処理し、ガス発生がやむまで（約５分）撹拌する。反応混合物を沃素（０．１３ｇ、０．５ミリモル）で処理し、２〜３分間撹拌した後、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（１．６ｇ、６．０ミリモル、粗製）を加える。反応液に窒素流を通して、ＴＨＦの多くもしくは全ての除去を促進する。反応混合物を一夜撹拌する。粗反応混合物のＨＰＬＣ分析により、出発ＩＶｃ（約５６％）と所望アダクト（約３２％）が認められる。

いくらかの粗反応混合物（出発物質ＩＶｃに基づきトータル６．７ミリモル）を、ジクロロメタンに再溶解し、コンバインし、減圧濃縮して残りのいずれのＴＨＦも除去する。残渣をジクロロメタン／ＴＦＡ（約１：１、トータル容量４０ｍＬ）に懸濁する。混合物を１．５〜２ｈ撹拌し、次いで溶媒を減圧除去する。残渣をジクロロメタンに懸濁し、水（約６０ｍＬ）に抽出し、重炭酸ナトリウム固体または水溶液で弱塩基性とする。水性層を要すれば、回転エバポレータにより容量を縮小し、溶液をＣ−１８逆相カラム（約８０ｇのＣ−１８，ＹＭＣＯＤＳ−Ａｑ，５０ミクロン）に入れ、水で、次いで２．５％アセトニトリル含有の水で溶離する。

純粋生成物を含有する画分をプールし、有機溶媒を回転エバポレータで除去する。凍結乾燥後、精製生成物を回収して、１．００ｇ（１．３０ミリモル、２工程で１９％）の標記化合物Ｉｃａ（ジナトリウム塩）をオフホワイト粉末で得る。ＨＰＬＣ純度＞９９％，２５４ｎｍでＡＰ（勾配０−１００％Ｂ／Ａ；Ａ＝１０％ＣＨ_３ＣＮ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝９０％ＣＨ_３ＣＮ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ，勾配時間４分，ＹＭＣＯＤＳ−Ａｑ４．６×５０ｍｍ，３ミクロン）；ＭＳ−ＥＳＩ−ｍ／ｚ４８２（Ｍ−Ｈ−２Ｎａ）⁻；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ−２Ｎａ）^＋（Ｃ_２５Ｈ_２７Ｎ_７Ｏ_８Ｐとして）、計算値５８４．１６５９；実測値５８４．１６５１（Δ−１．３ｐｐｍ）

¹H NMR (D₂O, 500 MHz) δ ppm 2.53, 2.54 (3H, 2s), 3.56 (2H, s, CH₂N), 3.72 (2H, br.s, CH₂N), 3.78, 3.83 (2H, 2br.s, CH₂N), 3.94, 3.96 (2H, 2br.s, CH₂N), 4.14 (3H, s, CH₃O), 5.38, 5.40 (2H, 2d, J=11Hz), 7.45-7.59 (5H, m, Ar-Hs), 8.07, 8.09 (1H, 2s, indole-H-5), 8.64, 8.67 (1H, 2s, indole-H-2), 8.87, 8.89 (1H, 2s, triazole-H-5); ¹³C-NMR (125.7MHz, D₂O) δ ppm 15.43 (N-Me), 44.03, 44.47, 44.66, 45.05, 48.20, 48.82, 49.60, 50.23, 59.78 (OMe), 75.81 (NCH₂O), 115.6, 126.0, 127.2, 129.6, 131.0, 131.7, 132.1, 133.5, 136.8, 147.6, 150.1, 154.2, 164.8, 170.4, 175.8, 189.2; UV (H2O) λmax 220 nm (ε 3.91x10⁴), 249 nm (ε 2.00x10⁴), 303 nm (ε 1.60x10⁴);
元素分析（Ｃ_２５Ｈ_２４Ｎ_７Ｏ_８ＰＮａ_２・８Ｈ_２Ｏ・０．２ＮａＨＣＯ_３として）
計算値：Ｃ３８．３９、Ｈ５．１４、Ｎ１２．４４、Ｐ３．９３、Ｎａ６．４２
実測値、Ｃ３８．１６、Ｈ４．８１、Ｎ１２．４３、Ｐ３．７２、Ｎａ６．０５
ＫＦ（Ｈ_２Ｏ）１７．３％
純度の低い画分を集めて、０．２２ｇ（０．２９ミリモル、収率４％）の標記化合物Ｉｃａ（ジナトリウム塩）を得る。ＨＰＬＣ純度＞９５％（２５４ｎｍでＡＰ）。

実施例６：Ｉａｂ（水和リシン塩）の製造
工程１

ホスフェートエステルＡ（４５．１ｇ、０．１モル）とクロロヨードメタンＢ（２００ｇ、１．１４モル）を、１００ｍＬのベンゼン中でコンバインし、混合物を室温で４時間撹拌してから、ベンゼンを減圧除去する。次いで残渣に５００ｍＬのエチルエーテルを加え、不溶固体を濾去する。濾液の濃縮により、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを得、これをいずれの精製もせずに、次工程に用いる。

工程２

乾燥ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中のＩＶａの懸濁液に、ＮａＨ（２．４ｇ、６０％油状物）をゆっくり加え、混合物を室温で１時間撹拌せしめる。沃素（５ｇ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、これを撹拌溶液にゆっくり加える。添加終了後、得られる混合物を周囲温度でさらに１５分間撹拌し、次いで工程１で得たジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを加える。１６時間撹拌後、反応混合物を氷水（１２０ｍＬ）に注ぎ、次いでＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ×３）で抽出する。コンバインした有機抽出物を水（１００ｍＬ）、次いで塩水（１００ｍＬ）で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ_３Ｎ（１００／１）、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１００／１）で溶離）で精製して、ジエステルＩＩａを収率７０〜８０％で得る。

工程３

４３．３ｇのジエステルＩＩａを含有する丸底フラスコに、ＴＦＡ（５０ｍＬ）とジクロロメタン（４５０ｍＬ）の混合溶液を加える。室温で１６時間撹拌後、反応混合物を減圧濃縮して、Ｉａｃの残渣を得、これをいずれの精製もせずに、後続工程に使用する。

工程４

上記粗生成物Ｉａｃ５５ｇを、室温でＬ−リシン（１．３６Ｍ、７０ｍＬ）の水溶液に加える。得られる懸濁液（ｐＨ＝１．８３）を、リシン溶液（１．３６Ｍ、〜４０ｍＬ）に加えてｐＨ４．８８とする。得られる懸濁液を、セライトパッドで濾過する。透明淡黄色濾液（〜２００ｍＬ）をアセトン（２００ｍＬ）と混合し、４５℃に加熱する。アセトン（１４００ｍＬ）を４５℃で２ｈにわたって加える。透明溶液に種結晶をまき、４５℃で２ｈ撹拌し、室温までゆっくり冷却し（５ｈ）、懸濁液を一夜撹拌する。白色固体を濾取し、５０℃で２４ｈにわたり減圧乾燥して、４１．２ｇのＩａｂをオフホワイト固体で得る。

上記固体を４５℃で、水／アセトン（１：１、５６０ｍＬ）に溶解する。アセトン（７００ｍＬ）を１ｈにわたり４５℃で加える。透明溶液に種結晶をまき、４５℃で２ｈ撹拌する。室温までゆっくり冷却し（５ｈ）、懸濁液を室温で一夜撹拌する。白色固体を濾取し、５０℃で３６ｈにわたり減圧乾燥して、３３ｇのＩａｂをオフホワイト固体で得る。ＨＰＬＣによるＡＰは＞９９％。
¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ 8.42 (s, 1/2H), 8.39 (s, 1/2H), 7.52 (m, 6H), 6.12 (m, 2H), 4.07 (s, 3H), 3.93 (m, 5H), 3.72 (m, 3H), 3.67 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.50 (m, 2H);
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ−リシン）^＋（Ｃ_２３Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_９Ｐとして），計算値５３３．１４；実測値５３３．０３、Ｍ．Ｐ．１６６．７〜１７２．２度。いくらかの異なるピークの比較１Ｈ−ＮＭＲ積算を用い、リシン：ＩＶａ比を算定すると、リシンと親プロドラッグの当量比は１．０５：１〜１．２：１の範囲である。塩形状は水和物であることが確定する。ＤＳＣ（示差走査熱量測定）およびＴＧＡ（熱重力分析）に基づく、観測水分量は２．８０％である。モノ水和物の理論計算値は、２．５８％である。このように、水和物における水と親分子の比は、１：１から〜１．５：１の範囲となる。

実施例７：結晶性Ｉｃ（遊離酸モノ水和物）の製造

オーブン乾燥した丸底フラスコの無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＩＶｃ（６００ｍｇ、１．２７ミリモル）の混合物に窒素下ｒｔにて、ＮａＨ（１５３ｍｇ、６．３８ミリモル、乾燥粉末、９５％）を加え、白色懸濁液をガス発生が見られなくなるまで撹拌する。次いで混合物にＩ_２（３７５ｍｇ、１．４８ミリモル）を加え、ｒｔで３ｈ撹拌する。反応混合物にＮａＨ（１５３ｍｇ、６．３８ミリモル、乾燥粉末、９５％）を加え、混合物を約５〜１０分間撹拌する。

混合物に粗クロロメチルジ−ｔ−ブチルホスフェート（２．０ｇ、約１．６ｍＬ、７．７９ミリモル）を加え、次いでｒｔで１５ｈ撹拌する。反応液のＬＣＭＳ分析により、出発物質の＞９７％変換が認められる。揮発分の蒸発後、残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）を加え、氷水浴で冷却し、ＴＦＡ（１０ｍＬ）をゆっくり加え、ｒｔで３ｈ撹拌する。次いで反応混合物を蒸発し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）とＨ_２Ｏ（５０ｍＬ）間に分配する。ＣＨ_２Ｃｌ_２層を、未溶解の褐色がかった幾らかの固体含有の反応フラスコに注ぎ、この混合物を希ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）で抽出する。水性混合物を逆相分取ＨＰＬＣ（溶剤Ａ：１０％ＭｅＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；溶剤Ｂ：９０％ＭｅＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；開始Ｂ％＝０，最終Ｂ％＝１００；勾配時間＝６分；流速＝４５ｍＬ／分；カラム：phenomenex-Luna ３０×５０ｍｍ，Ｓ５；画分収集：３．６５〜４．０５分）で精製する。

集めた画分を蒸発乾固し、残渣を高減圧下で乾燥して、酸Ｉｃを淡黄色固体で得る（３５６．６ｍｇ）。
¹H NMR: (500 MHz, CD₃OD) δ 9.05 (s, 1H), 8.46 (s, 1H,), 8.04 (s, 1H), 7.47 (b s, 5H), 5.93 (d, J = 12, 2H), 4.10 (s, 3H), 4.00-3.40 (b s, 8H), 2.53 (s, 3H);
^１９Ｆ−ＮＭＲ分析により、物質は残余のＴＦＡ（割合は測定せず）を含有することが認められる。ＨＰＬＣ分析法：開始Ｂ％＝０，最終Ｂ％＝１００，勾配時間＝２分，流速＝５ｍＬ／分，カラム：Xterra ＭＳＣ１８７ｕ３．０×５０ｍｍ，ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ^＋）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５８４，ＨＰＬＣＲｔ＝０．９８３

１７２．２ｍｇの精製酸Ｉｃを、１ｍＬのＨ_２Ｏに溶解し、次いで約０．３ｍＬの無水ＥｔＯＨ（２００プルーフ）を加える。混合物を冷凍室（温度約３℃）で一夜静置し、その後、結晶物質が見られる。次いで混合物を周囲温度まで加温し、Ｈ_２Ｏで容量３ｍＬまで希釈し、次いで２０ｍＬのＭｅＣＮをゆっくり加える。添加終了後、混合物をｒｔで２ｈ撹拌し、次いで濾過する。集めた固体（９０ｍｇ）を減圧乾燥し、次いで高減圧下で乾燥する。この物質は粉末Ｘ線実験により、結晶性であることが認められる。
元素分析（Ｃ_２５Ｈ_２６Ｎ_７Ｏ_８Ｐ・Ｈ_２Ｏとして）
計算値：Ｃ４９．９２、Ｈ４．６９、Ｎ１６．３０
実測値：Ｃ４９．６６、Ｈ４．６２、Ｎ１５．９９
ｍｐ＝２０５℃（示差走査熱量測定による）。結晶性物質の^１Ｈ−ＮＭＲパターンを、精製酸のそれと比較したところ、両者の構造が一致した。

実施例８：
Ｉａｂ（モノＬ−リシン塩）：｛３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４，７−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル｝メチル・二水素ホスフェート・Ｌ−リシン塩（１：１）の製造
反応の順序を実施例８の反応式で記載する。
実施例８の反応式：

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの製造

ビス−ｔ−ブチルホスフェートのテトラブチルアンモニウム塩（４５．１ｇ、０．１モル）とクロロヨードメタン（２００ｇ、１．１４モル）を、１００ｍＬのベンゼン中でコンバインし、混合物を室温で４時間撹拌し、次いでベンゼンを減圧除去する。残渣に５００ｍＬのエチルエーテルの一部を加え、不溶固体を濾去する。濾液を減圧濃縮し、真空ポンプで揮発分を除去して、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを淡黄色もしくは淡褐色油状物で得、これをさらに精製せずに、次工程に用いる。

ＩＩａ：（３−（２−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４，７−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル・ジ−ｔ−ブチルホスフェートの製造

乾燥ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中のＩＶａ（８．４ｇ、２０ミリモル）の懸濁液に、ＮａＨ（２．４ｇ、６０ミリモル、６０％油状物）をゆっくり加え、混合物を室温で１時間撹拌する。乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した沃素（５ｇ、２０ミリモル）を、上記撹拌溶液にゆっくりかつ注意深く、発泡をコントロール保持する速度で加える。

添加終了後、得られる混合物を周囲温度でさらに１５分間撹拌し、次いで工程１の記載に準じ得た、〜０．１モルのジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを加える。１６時間の撹拌後、反応混合物を氷冷したＮＨ_４ＯＡｃ（３０％）（１２０ｍＬ）に注いだ後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ×３）で抽出する。コンバインした有機抽出物を、水（１００ｍＬ）、次いで塩水（１００ｍＬ）で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ_３Ｎ（１００／１）、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１００／１）で溶離）で精製して、ジエステルＩＩａ（９．０〜１０．３ｇ、ＡＰ〜７５％）を淡黄色固体で、幾つかの操作にわたって収率７０〜８０％にて得る。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.09 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.40 (b, 5H), 6.15 (d, 2H, J = 11.5 Hz), 4.05 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.90 - 3.30 (b, 8H), 1.39 (s, 18H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ185.5, 170.7, 166.5, 146.9, 146.2, 139.6, 135.3, 130.2, 128.7, 128.4, 127.2, 124.5, 122.0, 120.8, 115.8, 83.8, 73.2, 57.3, 53.5, 46.1, 41.7, 29.8; MS m/z: (M+H)⁺ calcd for C₃₁H₄₂N₄O₉P 645.27, found 645.10.

Ｉａｂ：｛３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４，７−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル｝メチル・二水素ホスフェート・Ｌ−シリン塩（１：１）の製造

５００ｍｇのジエステルＩＩａを、水（３ｍＬ）とアセトン（３ｍＬ）の混合物に溶解する。得られる混合物を４０℃で１６時間撹拌して、加溶媒分解を完了せしめる。この反応混合物（〜６９ＡＰ）に、４Ｍリシン水溶液を加えて、ｐＨ４．８３に調整する。反応混合物に４５〜５０℃にてアセトン（３５ｍＬ）を３０分でゆっくり加える。透明溶液に種結晶として結晶性Ｉａｂをまき、同温度で４５分間撹拌保持する。アセトンの添加終了後、溶液を室温まで４時間で冷却し、Ｉａｂの結晶化を一夜で完了する。固体を濾取し、窒素下で２時間吸引する。白色結晶性固体を５０〜５５℃で２４ｈ減圧乾燥して、３４３ｍｇのＩａｂを得る。

上記操作で得たＩａｂ：
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.38 (s, 1H), 7.49 (m, 6H), 6.13 (d, 2H, J = 10.5 Hz), 4.06 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.00 - 3.40 (m, 8H), 3.58 (t, 1H, J = 6 Hz), 2.92 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.90 - 1.40 (m, 6H); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ186.1, 173.2, 171.8, 167.8, 147.4, 146.4, 141.0, 135.4, 130.4, 128.8, 127. 2, 124.6, 122.3, 120.2, 114.6, 73.2, 56.6, 54.7, 53.1, 46.0, 41.6, 39.2, 30.5, 27.0, 22.0.
ＨＲＭＳｍ／ｚ：（Ｍ−リシン＋Ｈ）^＋（Ｃ_２３Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_９Ｐとして），計算値５３３．１４３７；実測値５３３．１４３７
元素分析
計算値：Ｃ５１．３２、Ｈ５．７９、Ｎ１２．３８、Ｐ４．５６
実測値：Ｃ４８．５９、Ｈ５．３２、Ｎ１１．７６、Ｐ４．０４
融点１７０℃

他の方法（塩化メチレン中ＴＦＡで加水分解）で得た、Ｉａｂは１．７０モル水和および１．１４モルリシン塩である。
¹H NMR (500 MHz, D₂O, 60^OC) δ8.72 (s, 1H), 7.84 (m, 6H), 6.44 (d, 2H, J = 10Hz), 4.41 (s, 3H), 4.27 (s, 3H), 4.3 - 3.7 (m, 8H), 4.10 (t, 1H, J = 5Hz), 3.39 (t, 2H, J = 5Hz), 2.30 - 1.80 (m, 6H); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O, 27^OC) δ186.7, 174.9, 173.2, 167.9, 147.7, 145.7, 142.6, 134.3, 131.1, 129.2, 127.1, 124.3, 122.4, 120.1, 113.8, 73.5, 57.1, 54.9, 54.4, 47.7, 47.1, 46.3, 45.7, 42.6, 42.1, 42.0, 41.5, 39.5, 30.2, 26.8, 21.8 .
ＨＲＭＳｍ／ｚ：（Ｍ−リシン＋Ｈ）^＋（Ｃ_２３Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_９Ｐとして），計算値５３３．１４７；実測値５３３，１４２５
元素分析
計算値：Ｃ４９．１１、Ｈ６．１３、Ｎ１２．０５
実測値：Ｃ４８．９３、Ｈ６．２６、Ｎ１２．０７
Ｍ．Ｐ．１６８〜１７２℃

実施例９
Ｉｂｂ（モノＬ−リシン塩）：［３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４−フルオロ−７−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル］メチル・二水素ホスフェート・Ｌ−リシン塩（１：１）の製造
反応の順序を、実施例９の反応式に記す。
実施例９の反応式

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの製造

ビス−ｔ−ブチルホスフェートのテトラブチルアンモニウム塩（５７ｇ、０．１２６モル、Digital Specialty Chemicals）およびクロロヨードメタン（２２１ｇ、１．２６モル）を、室温で４時間撹拌し、次いで揮発分を減圧除去する。残渣に５００ｍＬのエチルエーテルを加え、不溶固体を濾去する。濾液の濃縮および真空ポンプを用いる揮発分の最終除去により、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（１１２ｇ）を、淡黄色または褐色油状物で得、これをさらに精製せずに、次工程に用いる。

ＩＩｂ：（３−（２−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−フルオロ−７−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル・ジ−ｔ−ブチルホスフェートの製造

乾燥ＴＨＦ（４００ｍＬ）中のＩＶｂ（２０ｇ、４４．７ミリモル）の懸濁液に、ＮａＨ（５．６５ｇ、鉱油中９５％分散体、０．２２４モル）をゆっくり加え、混合物を室温で０．５時間撹拌せしめる。

沃素（１１．３ｇ、４４．５ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した溶液を、上記撹拌溶液に反応が激しくなるのを妨げる速度でゆっくりと加える。得られる混合物をさらに３時間撹拌してから、第二部の９５％ＮａＨ（５．６５ｇ、０．２２４モル）を入れる。周囲温度で１５分後、工程１で得たジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（１１２ｇ）を一度に加える。周囲温度で１６時間撹拌後、反応混合物を氷冷ＮＨ_４ＯＡｃ（３０％）（２００ｍＬ）に注ぎ、次いでＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×３）で抽出する。

コンバインした有機抽出物を水（２００ｍＬ）、次いで塩水（２００ｍＬ）で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ_３Ｎ（１００／１／１）で溶離）で精製して、１５．０ｇ（収率４３％、８５％ＡＰに対して調整）のジエステルＩＩｂを淡黄色固体で得る。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.36 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.41 (b, 5H), 5.90 (d, 2H, J = 14.5Hz), 3.90 - 3.40 (b, 8H), 1.23 (s, 18H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ182.9, 170.7, 165.1, 154.6, 152.5, 144.1, 135.1, 134.0, 131.9, 130.3, 128.7, 128.3, 127.2, 125.9, 124.3, 114.0, 84.1, 74.1, 46.2, 41.9, 29.6;
ＨＲＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_３１Ｈ_３８ＦＮ_７Ｏ_７Ｐとして），計算値６７０．２６；実測値６７０．３４

Ｉｂｂ（モノＬ−リシン塩）：［３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４−フルオロ−７−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル］メチル・二水素ホスフェート・Ｌ−リシン塩（１：１）の製造

水（５５ｍＬ）とアセトン（５５ｍＬ）の混合物に、ジエステルＩＩｂ（２７ｇ）を溶解する。得られる混合物（ｐＨ：測定せず）を、４０℃で１６時間撹拌して、加溶媒分解を完了する。この反応混合物に４Ｍリシン水溶液を加えて、ｐＨ３．５１に調整する。溶液にＥｔＯＨ（５００ｍＬ）を加え、一夜後にフラスコの壁にいくらかの生成物がつく。次いで透明溶液を別のフラスコに移し、反応混合物にＥｔＯＨ（１５００ｍＬ）を〜３ｈでゆっくり加える。エタノールの添加終了後、溶液を室温で４８時間撹拌し、得られる固体（Ｉｂｂ）を濾取し、エタノールでリンスする。白色結晶固体を５５℃で２４ｈ減圧乾燥して、１０．９２ｇのＩｂｂ（９８ＡＰ）を得る。

この固体をさらに、他の操作で得た１２．５ｇの塩といっしょに、７０ｍＬの水中で混合する。次いでＥｔＯＨ（１０００ｍＬ）を加え、得られる溶液をｒｔで２０時間にわたり撹拌する。固体を濾取し、ＥｔＯＨ（８０ｍＬ×２）でリンスし、窒素雰囲気下５０℃で４４時間減圧乾燥して、２１．５ｇのＩｂｂをＡＰ９８．７で得る。

上記操作で得たＩｂｂは、〜１モルリシン塩で、１．１２％の水、０．８％のＴＦＡおよび０．０５％のエタノールを有する。
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD, 50^OC) δ8.94 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.83 (m, 5H), 5.81 (d, 2H, J = 12.5Hz), 4.30 - 3.70 (m, 8H), 4.08 (t, 1H, J = 6.5Hz), 3.67 (t, 2H, J = 10Hz), 2.26 (m, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.88 (m, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O, 30^OC) δ185.2, 174.9, 173.3, 166.8, 153.1, 146.8, 134.8, 134.3, 131.3, 131.1, 130.3, 129.3, 128.9, 128.7, 128.5, 127.2, 124.2, 112.6, 74.0, 54.9, 47.9, 47.2, 46.4, 45.9, 42.7, 42.2, 42.0, 41.7, 39.5, 30.3, 26.8, 21.8.
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ−リシン＋Ｈ）^＋（Ｃ_２３Ｈ_２２ＦＮ_７Ｏ_７Ｐとして），計算値５５８．１３０２；実測値５５８．１２９３
元素分析
計算値：Ｃ４８．７５、Ｈ５．０７、Ｎ１７．６３、Ｐ４．３３
実測値：Ｃ４９．０２、Ｈ４．９０、Ｎ１７．９０、Ｐ４．３７
Ｍ．Ｐ．１９３℃、ｐＫａ（電位差測定）６．１，９．１。

実施例１０
Ｉｃｂ（モノトロメタミン塩）：［３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル］メチル・二水素ホスフェート・２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩（１：１）の製造
反応の順序を、実施例１０の反応式に記す。
実施例１０の反応式

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの製造

テトラブチルアンモニウム・ジ−ｔ−ブチルホスフェート（５７ｇ、０．１２６モル、Digital Specialty Chemicals）とクロロヨードメタン（２２１ｇ、１．２６モル）の混合物を、室温で４時間撹拌してから、揮発分を減圧除去する。残渣に５００ｍＬのエチルエーテルを加え、不溶固体を濾去する。濾液の減圧濃縮および真空ポンプを用いる残り揮発分の除去により、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを淡褐色または黄色油状物で得、これをさらに精製せずに、次工程に用いる。

ＩＩｃ：（３−（２−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル・ジ−ｔ−ブチルホスフェートの製造

乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＩＶｃ（１０．０ｇ、２１．１ミリモル）の懸濁液に、ＮａＨ（２．６ｇ、１０．３ミリモル、９５％油状物、５当量）をゆっくり加え、混合物を室温で０．５時間撹拌する。該撹拌溶液に、沃素（５．２７ｇ、２０．８ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した溶液を、発泡または激しい反応を防止する速度でゆっくり加える。

得られる混合物をさらに３ｈ撹拌してから、第二２．６ｇ部のＮａＨを入れる。周囲温度で１５分後、工程１で得たジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの全バッチを加える。１６時間撹拌後、反応混合物を氷冷ＮＨ_４ＯＡｃ（３０％）（１２０ｍＬ）に注いだ後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ×３）で抽出する。コンバインした有機抽出物を水（１００ｍＬ）、次いで塩水（１００ｍＬ）で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ_３Ｎ（５０／１）、次いでＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１００／１）で溶離）で精製して、８．０ｇ（〜７５％ＡＰ，収率〜４１％）のジエステルＩＩｃを淡黄色固体で得る。

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.82 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.47 (b, 5H), 6.00 (d, 2H, J = 14.5Hz), 4.10 (s, 3H), 4.00 - 3.40 (b, 8H), 2.49 (s, 3H), 1.28 (s, 18H); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ18.6, 176.4, 172.9, 168.0, 162.6, 152.6, 147.5, 144.0, 136.5, 131.5, 130.8, 129.9, 129.1, 128.3, 126.1, 124.0, 116.2, 85.8, 75.4, 61.6, 57.7, 30.1, 22.2, 13.7;
ＨＲＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_３３Ｈ_４３Ｎ_７Ｏ_８Ｐとして），計算値６９６．２９；実測値６９６．３４

Ｉｃｂ（モノＬ−トロメタミン塩）：［３−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）（オキソ）アセチル］−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−１−イル］メチル・二水素ホスフェート・２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩（１：１）の製造

５００ｍｇ（〜７５ＡＰ、０．５４ミリモル）のジエステルＩＩｃを、水（２．５ｍＬ）とアセトン（２．５ｍＬ）の混合物に溶解する。得られる混合物を４０℃で１６時間撹拌して、加溶媒分解を完了する。この反応混合物に、３．０Ｍ水性ＴＲＩＳ（モノトロメタミン）溶液を加えて、ｐＨ３．３２に調整する。反応混合物に、アセトン（３０ｍＬ）を１時間^＊でゆっくり加える。アセトンの添加終了後、溶液を一夜撹拌して、Ｉｃｂの結晶化を完了する。固体を濾取し、アセトン／水（２０：１、５ｍＬ×２）でリンスする。白色結晶固体を窒素雰囲気下、５０℃にて２４ｈ減圧乾燥して、２９０ｍｇのＩｃｂを得る（＞９８．５ＡＰ）。
＊）約１５および２０ｍＬのアセトンを加えた後、反応混合物に種結晶として結晶性Ｉｃｂをまく。

上記操作で得たＩｃｂ：
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.83 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.02 (s, 1H) 7.49 (b, 5H), 5.469 (d, 2H, J = 13 Hz), 4.11 (s, 3H), 4.00 - 3.40 (m, 8H), 3.66 (s, 6H), 2.50 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CD₃OD) δ185.6, 171.9, 167.4, 161.4, 151.7, 146.9, 143.8, 135.4, 130.3, 129.7, 128.8, 127.2, 124.9, 122.6, 114.3, 73.5, 61.8, 59.9, 56,5, 46.0, 41.7, 12.6.
ＨＲＭＳｍ／ｚ：（Ｍ−トリスアミン＋Ｈ）^＋（Ｃ_２５Ｈ_２７Ｎ_７Ｏ_８Ｐとして），計算値５８４．１６５９；実測値５８４．１６６４
元素分析
計算値：Ｃ４９．４３、Ｈ５．２９、Ｎ１５．９０、Ｐ４．３９
実測値：Ｃ４９．１８、Ｈ５．３８、Ｎ１５．５９、Ｐ４．２６
融点２０３℃

他の方法（塩化メチレン中ＴＦＡで加水分解）で得た塩Ｉｃｂは、〜１モルモノトロメタミン塩であって、０．４７％の水、０．１％のアセトンおよび０．０５％のメタノールを有する。
¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO, 30^OC) δ8.77 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.00 (s, 1H) 7.44 (b, 5H), 5.42 (d, 2H, J = 15Hz), 4.02 (s, 3H), 3.70 - 3.30 (m, 8H), 3.41 (s, 6H), 2.38 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃, 30^OC) δ184.8, 169.0, 165.8, 160.3, 150.4, 146.2, 143.2, 135.4, 129.4, 128.9, 128.2, 127.7, 126.9, 123.2, 122.2, 112.9, 72.3, 60.7, 59.0, 56.7, 13.4.
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ−トリスアミン＋Ｈ）^＋（Ｃ_２５Ｈ_２７Ｎ_７Ｏ_８Ｐとして），計算値５８４．２；実測値５８４．０
元素分析
計算値：Ｃ４９．１１、Ｈ５．３７、Ｎ１５．７６、Ｐ４．３２
実測値：Ｃ４８．８８、Ｈ５．２８、Ｎ１５．７１、Ｐ４．１６
Ｍ．Ｐ．２０１〜２０５℃

Ｉａｃの別の塩を形成する一般手順

手順Ａ：
ＴＨＦ中のリン酸の溶液に、１．２当量の金属アルコキシドを加え、沈殿物を塩形状で集める。

手順Ｂ：
ＴＨＦ中のリン酸の溶液に、２．２当量（Ｎａ、Ｋの場合）または１．２当量（Ｍｇの場合）の金属アルコキシドを加える。２時間後、溶媒を蒸発し、ＭｅＯＨを加えて透明溶液を得る。次いで該溶液に、ＥｔＯＨまたはｉＰｒＯＨを溶液が濁ってくるまで加える。次にＭｅＯＨを用心深く加えて、溶液が再度まさに透明となるようにする。混合溶液を１６時間空気に触れさせ、得られる沈殿物を塩形状で集める。

手順Ｃ：
ＴＨＦ中のリン酸の溶液に、２．２当量のアミンを加える。２時間後、溶媒を蒸発し、ＭｅＯＨを加えて透明溶液を得る。次いで該溶液に、ＥｔＯＨまたはｉＰｒＯＨを溶液が濁ってくるまで加える。次にＭｅＯＨを用心深く加えて、溶液が再度まさに透明となるようにする。混合溶液を１６時間空気に触れさせ、得られる沈殿物を塩形状で集める。

実施例１１：ＩＩａから化合物ＩＩ’ａの製造

ジ−ホスフェートエステルＩＩａ（５００ｍｇ）を、５ｍＬの１０％ＴＦＡ／ＴＨＦに溶解する。反応混合物を室温で４時間撹拌してから、１０％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（３０ｍＬ）で反応を抑える。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗った後、水性相を減圧濃縮して残渣を得、これを Shimadzu 自動化分取ＨＰＬＣシステムの使用で精製して、所望のモノ−ホスフェートＩＩ’ａ（２６．５ｍｇ）を得る。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d 8.13 (s, 1H), 7.40 (b, 6H), 6.13 (d, 2H, J = 11.5Hz), 4.05 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.90 - 3.40 (m, 8H), 1.39 (s, 9H);
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_２７Ｈ_３４Ｎ_４Ｏ_９Ｐとして），計算値５８９．２１；実測値５８９．１３、ＬＣ保持時間１．３２分（カラム：Xterra ４．６×５０ｍｍＣ１８５μｍ）。

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの他の製造

反応：
不活性反応容器に人的方法で、ジ−ｔ−ブチルカリウムホスフェート（１．６９ｋｇ）、４．０当量の炭酸ナトリウムおよび０．０５当量の硫酸水素テトラブチルアンモニウムを加える。次いでスプレーボール（sprayball）を介して、塩化メチレン（７．７Ｌ／ｋｇ）をホンプ注入して、反応容器壁を洗い流す。ジャケット温度１０℃以下で、１０分にわたって発熱水装入量（water charge）を加える。添加中にバッチ温度が１１．１℃から１６．２℃に上昇し、付随する発熱量が少なくなる。

ジャケット温度およびバッチ温度がそれぞれ、ほぼ７℃および１５℃の場合、添加漏斗で２．０当量のクロロメチルスルホニルクロリド（ＣＭＣＳ）を装入する。装入を２時間続け、その間、ジャケット温度が２０℃までゆっくりと上昇する。ＣＭＣＳ装入中の最高バッチ温度は、２５．３℃である。予備実験データが示すように、発熱は低いバッチ温度でゆっくりするので、発熱の開始を確実にするため、装入中ジャケット温度をゆっくり上昇させる。反応混合物を撹拌し、３．５時間後、ＮＭＲサンプルにより、反応が７２％進行していることが認められる。バッチ温度を１９．７〜２３．６℃にして（デルタＶヒストリアン）、反応を一夜進行せしめる。１６時間後ＮＭＲサンプルを採取すると、７６％の反応変換が認められる。実験バッチの変換率は、６０〜８０％の範囲にある。

ワークアップ：
反応が終了と思った後、バッチに追加の水を９．３Ｌ／kgで加えて、相分離を行なう。生成物豊富な下相をカーボイに移し、水性の上相を廃棄する。小ラグ（rag）層を、生成物豊富な有機物といっしょに保存する。有機相をＲ−１Ａに戻し、ウォッシュとして追加水を５．１Ｌ／kgで加える。各相を分離し、生成物豊富な有機物約１８．５kgをカーボイに送り、一方、水性の上相を廃棄する。２回目の分離では、ラグ層もしくは固体は見られなかった。しかし、生成物豊富有機物のフィルターをみがいて、沈殿した塩を除去することが推奨される。

塩化メチレン蒸留：
生成物豊富有機物を、ＥＶＡＰＯ−１Ａの回転エバポレータに移す。ジャケット温度約２２℃で、塩化メチレンの蒸留を開始する。４．５時間後蒸留速度を遅くし、バッチサンプルを採取して、塩化メチレン含量を分析する。ＮＭＲ分析により、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートと塩化メチレンの比４：１が認められる。この流れの典型的な実験結果では、１０：１比が示され、そこで、回転エバポレータのジャケット温度を上げて、蒸留を続ける。さらに２．５時間後、蒸留速度を止める。バッチのＮＭＲサンプルにより、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートと塩化メチレンの比が５：１まで増加したことが認められる。回転エバポレータの最高ジャケット温度は、２８．４℃である。

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート油状物の純度：
ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート油状物のＮＭＲ分析により、１００％以上のポテンシー（potency）が認められる。開発研究はたとえば、１００±１０％のポテンシーを持つ物質を生成する。Karl Fischer 分析で０．０２wt％の含水量を測定し、ＧＣ分析で、１０．６９wt％の塩化メチレン量を測定する。すなわち、油状物中の塩化メチレンと水の寄与率が原因で、ポテンシー８９．２９％が記録される。

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの貯蔵：
ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート油状物を冷室に入れ、レコーダーの帯記録紙で温度を監視する。実験バッチをたとえば、０〜５℃に保持する。冷室で１０４時間保持した後、生成物のＮＭＲにより、物質にポテンシーの損失のないことが認められる。（キャンペーン中に行った安全試験により、保持に際し、油状物は二次圧力増大と共に自己加熱することが認められる）。

ＮＭＲ標準調製およびサンプル調製：
トリメチルホスフェート（ＴＭＰＯ_４）標準溶液の調製：
ＴＭＰＯ_４の標準溶液は、１００Ｍ％理論収率に基づき調製すべきである。たとえば、１０ｇインプットのジ−ｔ−ブチルカリウムホスフェート塩は、１０．４１ｇ（０．４０２モル）のジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを生成すべきである。反応混合物中のジクロロメタンの容量は、７５mLであろう。溶液のモル濃度は、０．５３６である。ＴＭＰＯ_４溶液はそのモル濃度で調製すべきであり、該溶液の０．５mLを、反応からの０．５mLのジクロロメタン層とコンバインすべきである。^３１Ｐ−ＮＭＲで実測したインテグラル（integrals）を直接比較することができ、これによりジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートの変換率％が得られるだろう。

反応水性相における未反応出発物質％の決定：
反応水性相の容量を記録した後、既知量の内部標準ＴＭＰＯ_４を含有する１−ドラムバイアルに、０．５００mLを正確に移す。約０．２４mLのＤ_２Ｏを加え、振って十分に混合する。^３１Ｐ−定量スペクトルを得る。

下式により、未反応出発物質％を算出する：

具体例：

生成物油状物のポテンシー％の決定：
蒸留した生成物油状物の正味重量を記録した後、既知量の内部標準ＴＭＰＯ_４を含有する１−ドラムねじぶたバイアルの風袋を計る。該バイアルに、約０．０２mLの生成物油状物を移し、生成物油状物の正味重量を記録する。約０．７mLのＣＤＣl_３を加え、振って十分に混合する。^３１Ｐ−定量スペクトルを得る。残留相が存在する場合の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを調べ、触媒（重硫酸テトラｎ−ブチルアンモニウム）と塩化メチレンを移す。これらの生成物に対するモル％で記録する。

下式により、ポテンシー％を算出する：

具体例：

ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートのＮＭＲ：
¹H NMR (300.13 MHz, CDCl₃): δ 1.52 (s, 18H), δ 5.67 (d, J= 15.5, 2H)
¹³C NMR (75.47 MHz, CDCl₃): δ 29.77 (d, J= 4.5, 6C), δ 73.34 (d, J= 7.5, 1C), δ 84.16 (d, J= 1.5, 2C)
³¹P NMR (121.49 MHz, CDCl₃): δ -10.51 (s, 1P)

実施例１２：Ｉａｂ（ＩＶａのプロドラッグ）の他の製造

頭上攪拌器、サーモカップル、添加漏斗、窒素口および隔壁を備えた５００mLの四つ首丸底フラスコに、ＩＶａ（２０．０１ｇ、４７．３７ミリモル）、Ｋ_２ＣＯ_３（１３．１３ｇ、９５．００ミリモル）およびＤＭＳＯ（１００mL、１．４１モル）を装入し、反応液を室温で攪拌して、明褐色不均質懸濁液を生成する。添加漏斗でジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（１４．８３ｇ、５７．３２ミリモル）を加え、反応液を３０℃に１６〜２４時間加熱した後、反応液を１０℃に冷却する。反応液にＤＣＭ（２００mL）を加え、次いで水（２００mL）をゆっくり加えて反応を抑え（反応温度を２０℃以下に維持）、二相混合物を得る。生成物豊富な下層を分離し、水（２００mL）で洗い、次いで頭上攪拌器、サーモカップル、添加漏斗および窒素口を備えた５００mLの四つ首丸底フラスコに移す。添加漏斗でトリフルオロ酢酸（５３．０mL、７００．９４ミリモル）を加えて、やや発熱をもたらす。

反応液を１〜３時間攪拌し、次いで０℃に冷却する。メタノール（３００mL）を加え（反応温度を２０℃以下に保持）、次いで０℃に冷却する。反応フラスコを蒸留装置に取付け、減圧濃縮して容量２００mLとする（２００トル、＜３０℃）。反応液に種結晶としてＩａｃ（０．２００ｇ）をまき、次いで室温で一夜攪拌して、スラリーを得る。スラリーを濾過し、次いで湿潤ケークをＴＨＦ（３００mL）で洗い、次いで５０℃のオーブンにて一夜減圧乾燥して、淡黄色乃至白色粉末（２３．９４ｇ、９５％）を得る。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.30 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.44 (s, 5H), 6.12 (d, J = 10.6 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80-3.22 (m, 8H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 185.49, 169.26, 166.06, 146.20, 145.60, 140.64, 135.50, 129.68, 128.41, 127.04, 123.46, 121.17, 120.08, 114.32, 72.43, 56.92, 53.32, 45.22, 40.50; ES⁺MS m/z (rel. intensity) 533(MH⁺, 100), 453(MH⁺ - H3PO4, 15).

サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた１０Ｌの四つ首反応器に、Ｉａｃ（６１１ｇ、１．１５モル）および水（３８７５mL）を加える。得られる懸濁液に、リシン（１６８ｇ、１．１５モル）を加える。

反応液をＲＴで１時間攪拌し、５０℃に加熱し、次いで攪拌下５０℃で１時間維持する。得られる濁りをおびた溶液（ｐＨ＝４．５５）を、サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた２０Ｌの四つ首反応器の中へ、１０ミクロン・フィルターで濾過する。反応液を５０℃に加熱し、次いでアセトン（８Ｌ）を急速に加える。反応液を５０℃に加温せしめ、次いでアセトン（４Ｌ）を、４５℃以上の反応温度に保持する中速度で加える。反応液に種結晶としてＩａｂ（０．２００ｇ）をまき、次いで５時間にわたって室温まで冷却して、スラリーを得る。スラリーを室温で一夜攪拌し、次いで濾過する。湿潤ケークをアセトン（４Ｌ）で洗い、次いで２５℃の減圧オーブンにて、一夜乾燥して（湿った空気を排出しながら）、毛羽立った白色粉末（７５１ｇ、９６％）を得る。

実施例１３：Ｉｃｂ（ＩＶｃのプロドラッグ）の他の製造

頭上攪拌器、サーモカップル、蒸留装置および窒素口を備えた１０Ｌ反応器に、ＩＶｃ（２００．００ｇ、４２２．３９ミリモル）、Ｃs_２ＣＯ_３（３４４．０６ｇ、１．０６モル）、ＫＩ（１４０．２４ｇ、８４４．８１ミリモル）およびＮＭＰ（１．００Ｌ、１０．３８モル）を装入する。反応液を室温で攪拌して、明褐色不均質懸濁液を得る。添加漏斗でジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（２７３．１６ｇ、１．０６モル）を加え、反応混合物を攪拌下、３０℃に１６〜２４時間加熱した後、反応液を５℃に冷却する。反応液にＤＣＭ（１．５Ｌ）を加え、次いで水（３．５Ｌ）で反応をゆっくり抑え（反応温度を２０℃以下に維持）、二相混合物を得る。

生成物豊富な下層を分離し、水（３．５Ｌ×３）で洗い、次いで反応器に移し戻す。溶液を減圧濃縮して容量１Ｌとする（温度を２５℃以下に保持しながら）。ＩＰＡ（２Ｌ）を加え、次いで反応液を減圧濃縮して容量２Ｌとする（温度を２５℃以下に保持しながら）。次いで反応液に種結晶としてＩＩｃ（０．２００ｇ）をまき、室温で一夜攪拌して、スラリーを得る。スラリーを濾過し、湿潤ケークをＭＴＢＥ（１Ｌ）で洗い、５０℃の減圧オーブンにて一夜乾燥して、黄色／白色粉末（２０７．１ｇ、７０％）を得る。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.54 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.42 (s, 5H), 5.95 (d, J = 14.2 Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.97-3.36 (m, 8H), 2.50 (s, 3H), 1.27 (s, 18H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 184.64, 170.65, 165.91, 161.60, 150.82, 145.38, 141.89, 134.96, 130.20, 129.59, 128.68, 127.58, 127.10, 124.77, 122.64, 115.22, 83.90, 83.83, 73.69, 73.63, 56.95, 46.04, 41.66, 29.61, 29.56, 13.90; ES⁺ MS m/z (rel. intensity) 696 (MH⁺,10), 640 (MH⁺ - イソブチレン, 30), 584 (MH⁺ - 2 イソブチレン, 100).

サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた１０Ｌの四つ首反応器に、ＩＩｃ（２００．２４ｇ、２８７．８２ミリモル）、アセトン（８００．００mL、１０．８８モル）および水（８００．００mL、４４．４１モル）を加える。反応液を４０℃に加熱し、１８〜２４時間攪拌する。

反応液を２０℃に冷却し、次いでトロメタミン（３３．６２ｇ、２７７．５４ミリモル）を加える。反応液を４０℃に加熱し、次いで全ての固体が溶解するまで攪拌する。反応液を２０℃に冷却し、次いでサーモカップル、頭上攪拌器、および窒素口を備えた１０Ｌの四つ首反応器の中へ、１０ミクロン・フィルターで濾過する。アセトン（３Ｌ）を急速に加えた後、種結晶としてＩｃｂ（０．５００ｇ）をまき、次いで別途アセトン（３Ｌ）を加える。反応液を室温で一夜攪拌して、スラリーを得、次いで濾過する。湿潤ケークをアセトン（８００mL）で洗い、次いで５０℃の減圧オーブンにて、一夜乾燥して毛羽立った白色粉末（１６５．９１ｇ、８２％）を得る。

補充の情報：
遊離酸中間体Ｉｃの単離：

サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた２５０mLの三つ首反応器に、ＩＩｃ（１０．０ｇ、１４．３７ミリモル）、アセトン（４０．００mL、５４４．１５ミリモル）および水（４０．００mL、２．２２モル）を加える。反応液を４０℃に加熱し、１４〜２４時間攪拌する。反応液を２０℃に冷却し、次いで３時間攪拌してスラリーを得る。スラリーを濾過し、次いで湿潤ケークをアセトン（４０．００mL）で洗い、次いで５０℃の減圧オーブンにて一夜乾燥して、毛羽立った白色粉末（７．００ｇ、８３％）を得る。
NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.84 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.45 (s, 5H), 5.81 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 4.03 (s, 3H), 3.91-3.19 (m, 8H), 2.39 (s, 3H); ¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 185.20, 169.32, 165.85, 160.75, 150.51, 146.30, 143.24, 135.53, 129.74, 129.22, 128.46, 127.34, 127.09, 123.67, 122.73, 113.94, 72.90 (d, ²J_C-P = 5 Hz), 57.01, 45.2 (bs), 40.8 (bs), 13.66. ES⁺ MS m/z (rel. intensity) 486 (MH⁺ - H₃PO_4, 100).

実施例１４：Ｉｂｂ（ＩＶｂのプロドラッグ）の他の製造

頭上攪拌器、サーモカップル、および窒素口を備えた１０Ｌの反応器に、ＩＶｂ（４００．００ｇ、８９４．７３ミリモル）、Ｃs_２ＣＯ_３（８７３．７０ｇ、２．６８モル）、ＫＩ（２９７．７０ｇ、１．７９モル）およびＮＭＰ（１．００Ｌ、１０．３８モル）を装入する。反応混合物を室温で攪拌して、明褐色不均質懸濁液を得る。添加漏斗でジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（４６０．５０ｇ、１．７８モル）を加え、反応液を３０℃に１６〜２４時間加熱した後、反応液を５℃に冷却する。

反応液にｎ−ＢuＯＡc（２．４Ｌ）を加え、次いで水（４Ｌ）で反応をゆっくり抑え（反応温度を２０℃以下に維持）、二相混合物を得る。反応器から水性の下層を除去し、次いで生成物豊富な上層に種結晶としてＩＩｃ（０．４０ｇ）をまき、次いで室温で３時間攪拌して、スラリーを得る。スラリーを濾過し、次いで湿潤ケークをＭＴＢＥ（１．６Ｌ）で洗い、次いで５０℃の減圧オーブンにて一夜乾燥して、黄色／白色粉末（４８３．２ｇ、８１％）を得る。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.35 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.42, (s, 5H), 5.92, (d, J = 14.9 Hz, 2H), 4.02-3.40 (m, 8H), 1.24 (s, 18H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 182.75, 170.64, 152.07, 144.03, 134.91, 133.96, 131.82, 130.21, 128.68, 128.27, 128.00, 127.07, 125.81, 124.01, 113.82, 84.00, 83.93, 73.97, 46.12, 41.90, 29.57, 29.53; ES⁺ MS m/z (rel. intensity) 558(MH⁺, 100).

サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた３００mLの四つ首反応器に、ＩＩｂ（１８．０ｇ、２６．８７ミリモル）、ＩＰＡ（３６．００mL、４７０．９２モル）および水（３６．００mL、２．０モル）を加える。反応液を４０℃に加熱し、１８〜２４時間攪拌する。反応液を２０℃に冷却し、次いでリシン（３．７３ｇ、２５．５４ミリモル）を加える。

全ての固体が溶解するまで、反応液を１時間攪拌する。ＩＰＡ（５４mL）を３０分にわたって加えた後、種結晶としてＩｂｂ（０．１８０ｇ）をまき、さらに３０分間攪拌する。ＩＰＡ（１８mL）を１時間にわたって加え、次いで反応液を５０℃に加熱して、希薄なスラリーを得る。反応液に種結晶としてＩｂｂ（０．１８０ｇ）をまき、次いでＩＰＡ（３６mL）を２時間にかけて加え、次いで１２時間攪拌してスラリーを得る。反応液を７０〜８０℃に２〜３時間加熱し、次いで５０℃に冷却する。ＩＰＡ（５９mL）を１時間にわたり加え、次いで別途ＩＰＡ（１２１mL）を１時間にわたり加える。反応液を２０℃に２時間にわたって冷却し、次いでさらに２時間攪拌し、濾過する。湿潤ケークをＩＰＡ（１８０mL）で洗い、次いで５０℃の減圧オーブンにて一夜攪拌して、白色粉末（１５．４３ｇ、８２％）を得る。

補充の情報：
遊離酸中間体Ｉｂｃの単離手順：

サーモカップル、頭上攪拌器、コンデンサーおよび窒素口を備えた５００mLの三つ首フラスコに、ＩＩｂ（５０．００ｇ、７４．７６ミリモル）、アセトン（１００．００mL、１．３６モル）および水（１００．００mL、５．５５モル）を加える。反応液を４０℃に加熱し、１８〜２４時間攪拌する。

ｐＨプローブ、磁気攪拌棒および窒素口を備えた２５０mLの三つ首フラスコに、１５０mLの上記Ｉｂｃ溶液を加え、次いで１０Ｎ−ＮaＯＨでｐＨ＝６．２に調整する。溶液を分液漏斗に移し、次いでＥtＯＡc（１００mL）、次いでＤＣＭ（１００mL）で洗い、２５０mLの三つ首フラスコに移し戻す。２Ｎ−ＨＣlでｐＨ＝１．３に調整した後、３時間攪拌してスラリーを得、これを濾過する。湿潤ケークをＭＴＢＥ（１５０mL）に再スラリー化し、次いで濾過した後、ＴＨＦ／水（１００：１、１３０mL）に４５分間再スラリー化し、次いで濾過し、５０℃の減圧オーブンにて一夜乾燥して、白色粉末（１０．０ｇ、３３％）を得る。
NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.69 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.41 (s, 5H), 5.47 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 3.99-3.18 (m, 8H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 183.97, 169.23, 165.20, 151.69, 145.91, 135.48, 133.83, 131.59, 129.65, 129.11, 129.03, 128.42, 127.77, 127.49, 127.03, 122.62, 112.08, 72.57. ES⁺ MS m/z (rel. intensity) 558(MH⁺, 100).

実施例１５：プロドラッグＩｅの製造
工程１：

２−（１−（２−（４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−３−イル）−２−オキソアセチル）ピペリジン−４−イリデン）−２−（ピリジン−２−イル）アセトニトリル（ＩＶｅ）の製造：
２−（４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−３−イル）−２−オキソ酢酸（１．５ｇ）、２−（ピペリジン−４−イリデン）−２−（ピリジン−２−イル）アセトニトリル塩酸塩（１．５ｇ）、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１,２,３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（２．１ｇ）および Hunig 塩基（２mL）を、２０mLのＤＭＦ中でコンバインする。

混合物を室温で１６時間攪拌する。減圧蒸発によりＤＭＦを除去し、残渣をＭeＯＨ（８０mL）で分配する。沈殿物を濾取して、０．８５ｇの生成物，２−（１−（２−（４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−３−イル）−２−オキソアセチル）ピペリジン−４−イリデン）−２−（ピリジン−２−イル）アセトニトリル（ＩＶｅ）を得る。
¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.42 (s, 1H), 9.23 (m, 1H), 8.69 (m, 1H), 8.27 (m, 1H), 7.89 (m, 2H), 7.58 (m, 1H), 7.52 (m, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.99 - 2.70 (m, 8H), 2.60 (m, 3H).
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_２５Ｈ_２３Ｎ_８Ｏ_３として），計算値４８３．１９；実測値４８３．１８

工程２：

ホスフェートエステル（４５．１ｇ、０．１モル）およびクロロヨードメタン（２００ｇ、１．１４モル）を、１００mLのベンゼン中でコンバインし、混合物を室温で４時間攪拌してから、ベンゼンを減圧除去する。次に残渣に５００mLのエチルエーテルを加え、不溶固体を濾去する。濾液の濃縮により、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを得、これをさらに精製せずに、次工程に使用する。

工程３：

乾燥ＴＨＦ（２０mL）中の２−（１−（２−（４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−３−イル）−２−オキソアセチル）ピペリジン−４−イリデン）−２−（ピリジン−２−イル）アセトニトリル（ＩＶｅ）の懸濁液に、ＮaＨ（０．２ｇ、９５％）をゆっくり加え、混合物を室温で１時間攪拌せしめる。該攪拌溶液に、乾燥ＴＨＦ（２mL）に溶解した沃素（０．４ｇ）をゆっくりと加える。

混合物をさらに３時間攪拌してから、０．２ｇのＮaＨを装入する。装入終了後、得られる混合物を周囲温度で１５分間攪拌し、次いで工程２で得たジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを加える。１６時間攪拌後、反応混合物を氷冷ＮＨ_４ＯＡc（３０％）（５０mL）に注いだ後、ＥtＯＡc（１００mL×３）で抽出する。コンバインした有機抽出物を水（５０mL）、次いで塩水（５０mL）で洗い、Ｎa_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（ＥtＯＡc／Ｅt_３Ｎ（１００／１）で溶離）で精製して、３３０mgのジ−ｔ−ブチル（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチルホスフェート（ＩＩｅ）を得る。

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.85 (m, 1H), 8.66 (m, 1H), 8.45 (m, 1H), 8.06 (m,1H), 7.92 (m, 1H), 7.60 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 6.05 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 4.00 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 1.30 (m, 18H).
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_３４Ｈ_４２Ｎ_８Ｏ_７Ｐとして），計算値７０５．２９；実測値６０５．３０

工程４：

ＴＦＡとジクロロメタンの混合溶液（１０％ＴＦＡ／ＣＨ_２Ｃl_２）８mLに、ジ−ｔ−ブチル（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチルホスフェート（ＩＩｅ）を溶解し、混合物を３時間攪拌する。全ての溶媒を減圧除去し、残渣を Shimadzu 自動化分取ＨＰＬＣシステムの使用で精製して、２５mgのｔ−ブチル（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル水素ホスフェート（ＩＩ'ｅ）および３３mgの（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル二水素ホスフェート（Ｉｅ）を得る。

ｔ−ブチル（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル水素ホスフェート（ＩＩ'ｅ）：
¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ8.83 (m, 1H), 8.55 (m, 1H), 8.35 (m, 1H), 7.92 (m, 2H), 7.54 (m, 1H), 7.41 (m, 1H), 5.86 (m, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.92 (m, 1H), 2.85 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 1.15 (m, 9H).
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_３０Ｈ_３４Ｎ_８Ｏ_７Ｐとして），計算値６４９．２３；実測値６４９．２２

（３−（２−（４−（シアノ（ピリジン−２−イル）メチレン）ピペリジン−１−イル）−２−オキソアセチル）−４−メトキシ−７−（３−メチル−１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２,３−ｃ］ピリジン−１−イル）メチル二水素ホスフェート（Ｉｅ）：
¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ8.88 (m, 1H), 8.65 (m, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.06 (m, 1H), 7.90 (m, 1H), 7.49 (m, 2H), 5.82 (m, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 2.82 (m, 2H), 2.73 (m, 1H), 2.40 (m, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ185.2, 165.6, 160.6, 159.1, 151.0, 150.4, 149.5, 146.2, 143.1, 137.4, 129.1, 127.2, 124.4, 123.6, 122.6, 117.4, 116.3, 113.9, 110.0, 72.8, 56.9, 48.4, 44.4, 36.4, 34.0, 13.6.
ＭＳｍ／ｚ：（Ｍ＋Ｈ）^＋（Ｃ_２６Ｈ_２６Ｎ_８Ｏ_７Ｐとして），計算値５９３．１７；実測値５９３．１４

実施例１６：プロドラッグＩｆの製造

ふた付きバイアルの１−メチル−２−ピロリジノン（１．０mL）中のＩＶf（９９．５mg、０．２１ミリモル）の混合物にｒｔで、ＫＩ（１４４mg、０．８７ミリモル）およびＣs_２ＣＯ_３（４１６mg、１．２８ミリモル）を加え、混合物を約５分間攪拌する。次いで、ジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェート試薬（２１８mg、０．８４ミリモル）を滴下する。得られる混合物を３５〜４０℃で２０時間攪拌する。次いで混合物をＨ_２Ｏ（約８mL）で希釈し、ＥtＯＡc（約８mL）で抽出する。有機抽出物を分離し、蒸発してジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートを得る。ＨＰＬＣ分析法：溶剤Ａ＝１０％ＭeＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ＝９０％ＭeＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；開始Ｂ％＝０，最終Ｂ％＝１００、勾配時間＝２分、流速＝５mL／分、カラム：Ｘterra ＭＳＣ１８Ｓ７３．０×５０mm；ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋＝６９４．２２，ＨＰＬＣＲt＝１．２４３

栓付き丸底フラスコのＨ_２Ｏ／イソプロパノール（１．０mL／１．０mL）中の中間体ＩＩｆの混合物を、４０℃で９．５時間攪拌する。次いで混合物をｒｔに冷却し、溶液をピペットでバイアルに移す。この溶液にＭeＣＮ（１．０mL）を加え、これにイソプロパノールをゆっくりかつスパチュラで断続攪拌しながら加える。オフホワイト沈殿物を濾別しし、イソプロパノール（１．０mL×２）で洗い、高減圧下で乾燥して、プロドラッグＩｆを得る。
¹H NMR (500 MHz): (DMSO-d₆) δ 8.76 (s,1H), 8.71 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.09 (d, J = 8, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7, 1H), 7.85 (app t, 1H), 7.59 (app t, 1H), 5.68 (d, J = 13, 2H), 4.00 (b m, 2H), 3.90 (b m, 2H), 3.85 (b m, 2H), 3.65 (b m, 2H);
ＨＰＬＣ分析法：溶剤Ａ＝１０％ＭeＯＨ−９０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ、溶剤Ｂ＝９０％ＭeＯＨ−１０％Ｈ_２Ｏ−０．１％ＴＦＡ；開始Ｂ％＝０，最終Ｂ％＝１００、勾配時間＝２分、流速＝５mL／分、カラム：Ｘterra ＭＳＣ１８Ｓ７３．０×５０mm；ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋＝５８２．００，ＨＰＬＣＲt＝１．７９７

成功のためには、プロドラッグの親への変換はヒトのアルカリ性ホスファターゼで始めなければならない。ヒトの胎盤アルカリ性ホスファターゼを用いる定量インビトロ実験およびラットにおける定量インビボ実験により、プロドラッグの変換は、ヒト酵素によるインビトロおよびラットでのインビボの両方で急速であることが認められる。理想的には、変換の速度が急速なため、プロドラッグへの限られた暴露のみが起こり、そして活性な親抗ウイルス剤への最大暴露が生じるだろう。実験データ（下記）によれば、ラットで評価した３つのプロドラッグ例の全てにおいて、プロドラッグは活性な親薬物に急速に変換し、かつプロドラッグの血漿レベルは全てのデータポイントで、親薬物に比して非常に低いことが認められる。

これらの実験は、親薬物の用量とホスフェートプロドラッグからの当量用量が低く、ほぼ等しい〜５mg／kgとなる用量で行なう。プロドラッグの利点は、溶解制限吸収に打ち勝つことであるので、低用量では、患者の臨床使用の場合溶解性の低い親分子に比しプロドラッグの利点は明らかでないだろう。プロドラッグが親分子を生成しているかどうかを判定するため、インビボ実験で低用量を用いる。親分子ＩＶの溶解性は、結晶形状に依存する。結晶形状はむしろ、薬物開発に関して選ばれる。親分子全てのデータを要約すれば、全親分子ＩＶの場合の結晶物質の水溶解性は、＜５０μg／mLで、場合によっては、これよりはるかに低いと云える。すなわち、親分子の固有の水溶解性は低く、かつ高用量で溶解制限吸収を起こすのに主要な役割を演ずる。

表１：Ｎ−メチル二水素ホスフェート（または塩）アザインドールオキソ酢酸ピペラジン誘導体の生物学的および医薬的特性

注１：薬物誘導薬（濃度〜０．２mＭ）をｐＨのＴris緩衝剤（濃度〜０．０３Ｍ、１mL）中、アルカリ性ホスファターゼ（ヒト胎盤、Sigma、〜１．４ユニット）と共に温置し、次いでＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳで、プロドラッグの消失および親の形成を監視する。ほとんどの場合、１または２時間以内の親の形成に符合して、プロドラッグは完全に消失し、他の中間体は全く検出されない。

注２：プロドラッグをラットに、経口ルート（親の５mg／kgに相当する用量で）または静脈内ルート（親の１mg／kgに相当する用量で）により投与する。血漿レベルは、親への急速変換と、検出しうる量のプロドラッグ（ＰＯ）なしを示す。

下記表において、語句“ＬＬＱ”とは、定量測定の下限（すなわち、検出せず）を意味する。
表２：ＭＡＰ実験Ａ：ラットへのプロドラッグＩａのＰＯおよびＩＶ投与後のＰＫの概要，ラットにおける化合物ＩＶａの経過（Historic）ＰＯとの比較

表３：ＭＡＰ実験Ｂ：ラットへのプロドラッグＩｂのＰＯおよびＩＶ投与後のＰＫの概要，ラットにおける化合物ＩＶｂの経過ＰＯとの比較

表４：ラットへのプロドラッグＩｃのＰＯおよびＩＶ投与後のＰＫの概要，ラットにおける化合物ＩＶｃの経過ＰＯとの比較

表２、３および４の記号：
＊）ＡＵＣ tot 比＝プロドラッグＩＶ投与後の親のトータルＡＵＣ÷親ＩＶ投与後の親のトータルＡＵＣ（経過データ）
＊＊）ＡＵＣ tot 比＝プロドラッグＰＯ投与後の親のトータルＡＵＣ÷親ＰＯ投与後の親のトータルＡＵＣ（経過データ）

プロドラッグの１つの（Ｉｃａ）の用量漸増実験Ｄをラットで実施したが、これは、ＨＩＶ−１患者の処置での潜在的使用に関して経口投与後の親に比しプロドラッグの重要な利点を証明するためである。プロドラッグ用量漸増実験による暴露データおよび測定パラメーターを、親分子で行った経過実験の同じデータと比較する。

図３および４は、プロドラッグＩｃａの経口投与（実験Ｄ）によるＩＶｃのＡＵＣ（曲線下面積、ラットにおける薬物に対する暴露の目安）を、親分子ＩＶｃの投与（実験Ｅ）およびラットの毒物動態実験（ＴＫ）から得たそれと比較する。経過ＩＶｃ用量漸増（実験Ｅ）およびラットＴＫ実験（Ｆ）の詳細をこれらの図に示す。

図３および４から明らかなように、プロドラッグ（三角）の経口投与後の親分子のＡＵＣおよびＣmaxは、２つの異なる実験での親薬物の投与から生じるそれらより大きい。明らかに、データによれば、血漿における薬物の暴露繰返しを最大化するために、プロドラッグは意外な利点を示すことが認められる。この部類の分子の化学構造は似ているので、該部類のプロドラッグは、親よりもむしろプロドラッグの投与により暴露量の増加を示すことが予測される。ホスフェートプロドラッグによる経口暴露改善の不確定や新しい化合物の新規性を仮定すれば、この結果は自明でなく、かつその重要性は驚くべきものである。

表５：ラットＴＫ実験；実験Ｆ；ラットにおける３用量でのＰＯＩＶｃの経過実験

ホスフェートプロドラッグＡ、ＢおよびＣのＩＶおよび経口ラットＰＫ実験プロトコル：
三匹雄スプラーグ−ダウレイ（Sprague - Dawley）ラットのグループに対し、化合物Ｉｃ（ＩＶｃのホスフェートプロドラッグ）、Ｉｂ（ＩＶｂのホスフェートプロドラッグ）およびＩａ（ＩＶａのホスフェートプロドラッグ）を別々に、ＩＶボーラス（１mg／kg；この文書で列挙した全用量は、親化合物に相当）または経口胃管（５mg／kg）で投与する。化合物Ｉｃは遊離酸で投与し、一方、他の２つはナトリウム塩で投与する。ＩＶおよび経口投与両方のための３プロドラッグ全ての投与溶液は、１００％規定食塩水にて１mg／mLで調製する（投与溶液濃度は、親化合物に相当）。血漿サンプルを２４ｈにわたってＥＤＴＡバキュティナー（vacutainers）に収集し、プロドラッグおよび親分子両方についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行なう。Kinetica （登録商標）で薬物動態分析を行なう。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の手順を、下記のプロトコルに示す。
この実験の結果は、表２−４のまん中の２欄に示される。
ラットにおけるＩｃａの経口用量漸増実験プロトコル（実験Ｄ）：
三匹断食雄スプラーグ−ダウレイラットのグループに、化合物Ｉｃａ（ジナトリウム塩）を４．５、２１および１６３mg／kg（用量はＩＶｃに相当）で経口投与する。投与溶液は、４．５、２１および１０３mg／kg用量（化合物ＩＶｃに相当）の場合それぞれ、水にて１、５および２０mg（化合物Ｉｃ（遊離酸）に相当）／mLで調製する。血漿サンプルを２４ｈなわたってＥＤＴＡバキュティナーに収集し、ＩｃおよびＩＶｃ両方についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行なう。Kinetica で薬物動態分析を行なう。

この実験の結果は、下記表４６および図３−５に示される。
表４６：経口ラット用量漸増実験

１．＊）ＡＵＣは０−２４ｈによるが、それはＡＵＣ（２４ｈ−無限）がトータルＡＵＣ（０−無限）の３５％より少なくとも大きいからである。この部分は、トータルＡＵＣの正確な限度を知るには大きすぎる。
２．Ｉｃａ投与後のＩＶｃＡＵＣをＩＶｃの直接投与後のＩＶｃＡＵＣで割った比として算出した、５ｍｇ／ｋｇのＩＶｃでのＩｃａからのＡＵＣ変換比は、０．９９である。
３．プロドラッグＩｃａは、２００ｍｇ／ｋｇ用量グループの各ラットにおいて１〜２サンプルで、〜２０−４０ｎＭにてわずかに検出される。

インビボ方法：
実験Ａ１の手順：ラットへのＩＶａのＰＯおよびＩＶ投与；ＰＯ用量は５ｍｇ／ｋｇ
化合物ＩＶａは、他に特別な注がなければ、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）／エタノール（ＥｔＯＨ）溶液（９０／１０，ｖ／ｖ）で管理する。血漿および組織サンプルを集め、分析まで−２０℃で貯蔵する。化合物ＩＶａの薬物動態実験において、頸静脈および／または胆汁管にカニューレを埋没させた、雄スプラーグ−ダウレイラット（３００〜３５０ｇ、Hilltop Lab Animals Inc., Scottdale,ＰＡ１５６８３）を使用する。ＰＯ実験でラットを一夜断食させる。頸静脈からＥＤＴＡ−含有ミクロタイナー（microtainer）チューブ（Becton Dickinson, Franklin Lakes,ＮＪ０７１４７）に、血液サンプル（０．３ｍＬ）を集め、血漿を得る。ＩＶ実験では、３匹ラットに０．５分にわたって１ｍｇ／ｋｇ用量を投与し、投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血漿サンプルを収集する。ＰＯ実験では、ラット（ｎ＝３）は５および１００ｍｇ／ｋｇのＰＯ用量を受容する。投与前と投与の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血漿サンプルを採取する。
この実験の経口（ＰＯ）結果は、表２の最後の最右欄に示される。

親薬物実験Ｂ１：
ラットにおける化合物ＩＶｂのＩＶおよびＰＯ薬物動態実験の場合、化合物ＩＶｂを溶液として、ＰＥＧ−４００／エタノール（９０／１０）に溶解する。イヌにおける化合物ＩＶｂのＩＶおよびＰＯ薬物動態実験の場合、化合物ＩＶｂをＰＥＧ−４００／エタノール（９０／１０）に溶解し、０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ調整する。処方の詳細は、表６に記す。
ラット：頸静脈および／または胆汁管にカニューレを埋没させた、雄スプラーグ−ダウレイラット（３００〜３５０ｇ、Hilltop Lab Animals Inc., Scottdale,ＰＡ）を使用する。ＰＯ薬物動態実験では、ラットを一夜断食させる。頸静脈からＥＤＴＡ−含有ミクロタイナーチューブ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, ＮＪ）に、０．３ｍＬの血液サンプルを集め、血漿を遠心分離する。

ＩＶ実験では、化合物ＩＶｂをボーラスとして０．５分にわたり、１ｍｇ／ｋｇでデリバリーする（ｎ＝３）。投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血液サンプルを収集する。
化合物ＩＶｂのＰＯ実験では、ラット（ｎ＝３）は化合物ＩＶｂの５ｍｇ／ｋｇ経口用量を受容する。投与前と投与の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血液サンプルを収集する。
この経口（ＰＯ）実験の結果は、表３の最右欄に示される。

表６：インビボ実験のＩＶｂの処方

ＩＶｂについて分析するインビボ実験の生体分析法：
この方法は、ラットの血漿サンプル（実験ＢおよびＢ１で使用）におけるＩＶｂの濃度レベルの分析法にあてはまる。
血漿におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる化合物ＩＶｂの定量測定：ラット、イヌ、サルまたはチンパンジー実験の血漿サンプルのアリコートを用意して、内部標準，化合物ＩＶａを含有するアセトニトリルの２容量で血漿たん白質を沈殿させることによって分析する。１０分間の遠心分離によって、沈殿したたん白質から生成上澄みを分離し、オートサンプラー(autosampler)バイアルに移す。サンプルは、手であるいは Tomtec 自動液体ハンドラー(liquid handler)を用いて調製する。分析のため５μＬのアリコートを注入する。

ＨＰＬＣシステムは、２つの Shimadzu ＬＣ１０ＡＤポンプ（Columbia,ＭＤ）、Shimadzu ＳＩＬ−ＨＴＣオートサンプラー（Columbia,ＭＤ）および Hewlett Packard Series１１００カラム・コンパートメント（compartment）(Palo Alto,ＣＡ)から成る。カラムは、ＹＭＣＰｒｏＣ１８（２．０×５０ｍｍ、３μｍ粒子、Waters Co., Milford,ＭＡ）であって、６０℃および流速０．３ｍＬ／分に維持する。移動相は、（Ａ）水中の１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸と（Ｂ）メタノール中の１０ｍＭギ酸アンモニウム１００％および０．１％ギ酸から成る。最初の移動相組成は、９５％Ａである。サンプル注入後、移動相を２分にわたって１５％Ａ／８５％Ｂに変え、この組成でさらに１分間保持する。次いで移動相を最初の条件に戻し、カラムを１分間再度平衡状態にする。トータル分析時間は４分である。

ＨＰＬＣを Micromass Quattro ＬＣに連動させる(interfaced)。薬液噴霧および脱溶媒ガスとして、超高純度窒素を噴霧用には１００Ｌ／ｈｒの流速で、脱溶媒用には１１００Ｌ／ｈｒの流速で使用する。脱溶媒温度は３００℃で、供給源温度は１５０℃である。データ取得に、選択反応制御（selected reaction monitoring、ＳＲＭ）を利用する。ＩＶｂおよび内部標準の（Ｍ＋Ｈ）^＋種を表わすイオンをＭＳ１で選択し、２×１０^−３トル圧力のアルゴンで衝突解離させて、固有プロダクトイオン（specific product ions）を形成した後、ＭＳ２で監視する。変化（transitions）、電圧（voltages）および保持時間を表７に要約する。

表７：化合物ＩＶＢおよび化合物ＩＶａ（ＩＳ）のＭＳ／ＭＳ分析のパラメーター

血漿標準曲線は４から８０００ｎｇ／ｍＬに変動し、脳曲線（brain curve）は１−１０００ｎｇ／ｍＬに変動する。曲線は、逆濃度（１／ｘ）で加重した二次回帰に一致する。標準は、二重分析する。品質管理（ＱＣ）サンプルは、血漿ブランクにて検量線の範囲内の３濃度で調製し、これらも、各血漿分析セットを用いて三重分析する。この化合物の場合、血漿ＱＣｓの９０％の予測濃度は、呼称濃度の２０％以内にあり、これは、許容できるアッセイ性能を示す。
ビヒクルおよび処方：表８を参照すれば、使用するビヒクルがＮａＯＨを含有するとき、化合物ＩＶｃ溶液配合物をＮａＯＨでｐＨ調整して、ｐＨ８．６−９．０を得、この場合、化合物はその８．４のｐＫａに基づき、部分的にイオン化される。

表８：インビボ実験用の化合物ＩＶｃの処方

血漿（実験Ｃ、Ｃ１およびＤで使用）におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる化合物ＩＶｃの定量測定：ラット、イヌ、サルまたはチンパンジー実験の血漿サンプルのアリコートを用意して、内部標準，化合物ＩＶａを含有するアセトニトリルの２容量で血漿たん白質を沈殿させることによって分析する。１０分間の遠心分離によって、沈殿したたん白質から生成上澄みを分離し、オートサンプラーバイアルに移す。サンプルは、手であるいは Tomtec 自動液体ハンドラーを用いて調製する。ＨＰＬＣシステムは、２つの Shimadzu ＬＣ１０ＡＤポンプ（Columbia,ＭＤ）、Shimadzu ＳＩＬ−ＨＴＣオートサンプラー（Columbia,ＭＤ）および Hewlett Packard Series １１００カラム・コンパートメント(Palo ,Alto,ＣＡ)から成る。

カラムは、ＹＭＣＰｒｏＣ１８（２．０×５０ｍｍ、３μｍ粒子、Waters Co., Milford,ＭＤ）であって、６０℃および流速０．３ｍＬ／分に維持する。移動相は、（Ａ）水中の１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸と（Ｂ）メタノール中の１０ｍＭギ酸アンモニウム１００％および０．１％ギ酸から成る。最初の移動相組成は、９５％Ａである。サンプル注入後、移動相を２分にわたって１５％Ａ／８５％Ｂに変え、この組成でさらに１分間保持する。次いで移動相を最初の条件に戻し、カラムを１分間再度平衡状態にする。トータル分析時間は４分である。

ＨＰＬＣを Micromass Quattro ＬＣに連動させる。薬液噴霧および脱溶媒ガスとして、超高純度窒素を噴霧用には１００Ｌ／ｈｒの流速で、脱溶媒用には１１００Ｌ／ｈｒの流速で使用する。脱溶媒温度は３００℃で、供給源温度は１５０℃である。データ取得に、選択反応制御（ＳＲＭ）を利用する。ＩＶｃおよび内部標準の（Ｍ＋Ｈ）^＋種を表わすイオンをＭＳ１で選択し、２×１０^−３トル圧力のアルゴンで衝突解離させて、固有プロダクトイオンを形成した後、ＭＳ２で監視する。変化、電圧および保持時間を表９に要約する。

表９：ＩＶｃおよびＩＶａ（ＩＳ）のＭＳ／ＭＳ分析のパラメーター

血漿標準曲線は４から８０００ｎｇ／ｍＬに変動し、脳曲線は１−１０００ｎｇ／ｍＬに変動する。曲線は、逆濃度（１／ｘ）で加重した（weighted）二次回帰に一致する。標準は、二重分析する。品質管理（ＱＣ）サンプルは、血漿ブランクにて検量線の範囲内の３濃度で調製し、これらも、各血漿分析セットを用いて三重分析する。この化合物の場合、血漿ＱＣｓの９０％の予測濃度は、呼称濃度の２０％以内にあり、これは、許容できるアッセイ性能を示す。

生物学的基質（matrices、マトリックス）におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる３プロドラッグおよびそれらの親化合物の定量測定：
このＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイは、生物学的基質において３プロドラッグ化合物およびそれらの各親分子を調べるために行った。３プロドラッグ化合物は、化合物Ｉａ、ＩｃおよびＩｂ並びにそれらの他の各塩または遊離酸である。注として、このアッセイは、３プロドラッグの遊離酸や塩形状に対して使用するもので、それは、検出される分子イオンが塩の反対イオンから独立しているからである。それらの各親化合物は、ＩＶａ、ＩＶｃおよびＩＶｂである。

ＨＰＬＣシステムは、Shimadzu ＬＣ１０ＡＤｖｐポンプ（Columbia,ＭＤ）および Synergi Hydro-ＲＰ分析カラム（２．０×５０ｍｍ、Phenomenex,Torrance,ＣＡ）に連結したＨＴＣＰＡＬオートサンプラー（Leap Technologies,Cary,ＮＣ）から成る。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸から成り；移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ギ酸である。ＬＣ流速は、質量分析計中０．４ｍＬ／分である。最初の移動相組成は、１０％Ｂであって１．７５分にわたり７５％Ｂへの勾配をなし、この組成で０．２５分間保持し、０．１分にわたり１００％Ｂへの勾配をなし、０．６分間保持し、次に０．１分にわたって最初の条件に戻し、次いで再度平衡状態にする。トータル分析時間は４分である。全分析の保持時間は、１．５〜２．６分である。

ターボイオンスプレー（Turboionspray）供給源セットを備えた Sciex ＡＰＩ３０００三重四極子（triple quadrupole）質量分析計（トロント、カナダ）に、ＨＰＬＣシステムを４５０℃で連動させ、イオンスプレー電圧を４．５ｋＶにセットする。薬液噴霧および補助ガスとしてＵＨＰ窒素を、それぞれ８０ｐｓｉの圧力および７Ｌ／分で用いる。分析は陽イオンモードで行なう。全化合物について監視した変化およびそれらの衝突エネルギー（collision energies）（ＣＥ）は、Ｉａ（ＣＥ＝１９）の場合でｍ／ｚ５３３．４１＞４３５．２４；Ｉｃ（ＣＥ＝２３）の場合でｍ／ｚ５８４．４６＞４８６．２９；Ｉｂ（ＣＥ＝１９）の場合でｍ／ｚ５５８．３１＞４３２．１３；ＩＶａ（ＣＥ＝３１）の場合で４２３．３９＞２０４．９６；ＩＶｃ（ＣＥ＝２９）の場合で４７４．３６＞２５５．９７；ＩＶｂの場合で４４８．３５＞１０５．２０である。

広く多種の生物学的サンプル基質を適応させるため、サンプル調製でアセトニトリル沈殿を用いる。Packard Multiprobe ＩＩ（Packard Instruments,Downers Grove,ＩＬ）を用い、試験サンプルおよび標準を９６ウエルプレートに移す。該９６ウエルプレートの試験サンプルおよび標準両方の１００μＬアリコートに、Tomtec Quadra ９６を用いて、内部標準（ＢＭＳ−６４７２５７、５００ｎＭ）を含有する２００μＬのアセトニトリルを加える。次いでプレートを約３分間渦撹拌し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。Tomtec Quadra ９６を用いて、プレートから１５０μＬの上澄みをきれいな９６深ウエルプレートに移す。次いでTomtec Quadra ９６を用い、各ウエルに１５０μＬの０．２％ギ酸／水を加え、プレートを渦撹拌してから分析する。

アセトニトリルのストック溶液から、５ｎＭから１０μＭの８濃度ポイントの標準曲線（standard curves）を調製し、両プロドラッグおよび親化合物に対し基質にて連続的に希釈する。標準曲線を二重１００μＬアリコートで、試験サンプルを含有する９６ウエルプレートに移し、上記に準じ試験サンプルで抽出し、次いで分析順序の開始、中間および最後に注入する。標準曲線は、１／ｘ^２加重の一次回帰に一致する。データおよびクロマトグラフィー・ピークを処理し、ＰＥ Biosystems Analyst(登録商標)１．１を用いて、標準および未知試料の濃度を定量する。

インビボ方法：
実験Ｃ１、ＥおよびＦ（ラットＰＫ、ＭＡＰおよびＴＫ実験）の条件：
ラットにおける化合物ＩＶｃのＩＶおよびＰＯ薬物動態実験のため、化合物ＩＶｃを溶液として、ＰＥＧ−４００／エタノール（９０／１０）に溶解する（表８参照）。
ラット：頸静脈および／または胆汁管にカニューレを埋没させた、雄スプラーグ−ダウレイラット（３００〜３５０ｇ、Hilltop Lab Animals Inc.,Scottdale,ＰＡ）を使用する。ＰＯ薬物動態実験では、ラットを一夜断食させる。頸静脈からＥＤＴＡ−含有ミクロタイナーチューブ（Becton Dickinson, Franklin Lakers,ＮＪ）に、０．３ｍＬの血液サンプルを集め、血漿を遠心分離する。

ＩＶ実験では、化合物ＩＶｃをボーラスとして０．５分にわたり、１ｍｇ／ｋｇでデリバリーする（ｎ＝３）。投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血液サンプルを収集する。
ＰＯ単一用量実験Ｃ１：
化合物ＩＶｃのＰＯ実験Ｃ１では、ラット（ｎ＝３）は化合物ＩＶｃの５ｍｇ／ｋｇ経口用量を受容する。投与前と投与の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血液サンプルを収集する。実験Ｃ１の経口（ＰＯ）結果は、表４の最右欄に示される。

経口（ＰＯ）用量漸増実験Ｅ：
化合物ＩＶｃの経口用量漸増実験Ｅでは、グループラット（１グループ当りｎ＝２）は、２５、７５および２００ｍｇ／ｋｇの経口用量を受容する。投与溶液は２５ｍｇ／ｋｇで溶液（soln）となり、用量がそれより高いと、投与溶液は懸濁液（susp）である。投与前と投与の１５、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０、４８０および１４４０分後に、連続的に血液サンプルを収集する。１４４０分で脳サンプルを収集して、脳透徹力を検定する。脳サンプルを吸取り紙で乾燥させ、その湿重量を記録する。実験Ｅの経口（ＰＯ）結果は、表４６にある。

２週経口用量ラット毒物学実験Ｆ：
２週経口ラット実験Ｆ（ｎ＝６／性別／グループ）では、化合物ＩＶｃを１５、７５または２００ｍｇ／ｋｇの毎日用量で投与する。１日目と１４日目の毒物動態評価により、化合物ＩＶｃの全身暴露（ＡＵＣ_{０−２４ｈ}）は、一般に用量に関係するが、用量に比例せず（表５参照）、自己誘発あるいは蓄積の形跡がないことが認められる。１４日目に、ＡＵＣ_{０−２４ｈ}値は投与量＜２００ｍｇ／ｋｇ／日で、雄（＜５２６．８８μｇ^＊ｈｒ／ｍＬ）に比し雌において（＜６４４μｇ^＊ｈｒ／ｍＬ）、少し高くなる。実験Ｆの経口（ＰＯ）結果は、表５にある。

ＭＡＰ実験Ｇ：ラットにおけるジエステルＩＩａのＰＯおよびＩＶ投与実験
化合物ＩＩａの構造

ＭＡＰ実験Ａ１の経口投与Ｉｅｇの手順を追加するが、化合物ＩＶａの代わりにジエステルＩＩａを用いる。化合物ＩＶａの分析は、経口ルートによるジエステルＩＩａの投与が実質的なＩＶａをもたらすことを示す。データを下記表１０に記載する。

表１０：Ｍａｐ実験Ｇ

Ｍａｐ実験Ｈ：ラットにおけるモノエステルＩＩ’ａのＰＯおよびＩＶ投与実験
化合物ＩＩ’ａの構造

ＭＡＰ実験Ａ１の経口投与Ｉｅｇの手順を追加するが、化合物ＩＶａの代わりにモノエステルＩＩ’ａを用いる。化合物ＩＶａの分析は、経口ルートによるモノエステルＩＩ’ａの投与が実質的なＩＶａをもたらすことを示す。データを下記表１１に記載する。

表１１：Ｍａｐ実験Ｈ

プロドラッグＩの意外な有用性を証明しかつ特性を表わすために、かなりの数の実験を行った。親分子ＩＶａ、ＩＶｂおよびＩＶｃのプロドラッグＩに関し、プロドラッグおよび親の投与後に親分子の暴露を比較する用量漸増暴露実験をラットで実施する。プロドラッグＩａｂまたは親ＩＶａの投与後の、ＩＶａの暴露量に関する食物と用量の効果を、イヌで比較する。プロドラッグは、親と比較すれば、暴露量を改善しかつ食事の影響を回避する意外な能力を示す。親化合物ＩＶａ、ＩＶｂおよびＩＶｃへの変換をそれぞれ示す、プロドラッグＩａｂ、ＩｂｂおよびＩｃｂに関し、低投与量の全薬物動態実験（経口およびＩＶ投与）を、ラット、イヌおよびサルで実施する。プロドラッグＩｅ（遊離酸）および親化合物ＩＶｆに関して、ラットの経口投与実験を実施して、それぞれ親ＩＶｅおよびＩＶｆの変換および全身暴露を証明する。データは本明細書の上記または下記で示される。

追加のプロフィーリング・セクション１：
Ｉａｂによる追加実験：
Ｉａｃは、ＩＶａのＮ−ヒドロキシメチルアダクトの遊離酸ホスフェートプロドラッグであって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）によって加水分解され、ＩＶａを形成する。Ｉａｂ，Ｉａｃのモノ−リシン塩を、以下に示す全ての実験で使用する。
ＩａｂのＩＶおよびＰＯ薬物動態実験を、ラット、イヌおよびサルで行なう。全ての場合、血液サンプルはＥＤＴＡの存在下で収集する。公知ＡＬＰ阻害薬のＥＤＴＡの存在は、サンプル処理中のＩａｂの重要な ex vivo 変換を最小化する。ＩａｂのＩＶ投与後、ＩＶａが急速に形成する。ラット、イヌおよびサルにおいて、Ｉａｂの投与後にＩＶａの良好な経口生物学的利用能（６２−９４％）が見られ、しかも、血漿中に存在するＩａｂは極めてほとんどもしくは全くない。腸に高レベルのＡＬＰ発現があるので、Ｉａｂの経口投与後に、Ｉａｂは腸管腔の刷子縁膜に存在するＡＬＰによって加水分解されて、ＩＶａを形成し、これはその高い透過性によって急速に吸収されると思われる。

種々の組織で、ＩａｂのＡＬＰ−依存加水分解の定性評価のため、インビトロ温置（インキューベーション）実験を行なう。Ｉａｂは、ラット、イヌ、サルおよびヒトの血清や肝細胞、並びにヒト胎盤ＡＬＰの存在下で加水分解される。時折、ＩａｂとＩＶａを測定する場合、ＩａｂからＩＶａの変換は化学量論に近い。血清での加水分解により、Ｉａｂのたん白質結合は測定できない。インビトロデータに基づき、ＩａｂはヒトＡＬＰによって加水分解され、ＩＶａはヒト被験者へのＩａｂの経口投与後に形成されることが予想される。

室温でのＩａｂの結晶溶解性は、ｐＨ１．４の０．２２ｍｇ／ｍＬからｐＨ５．４およびｐＨ８．９の＞１２ｍｇ／ｍＬに上昇し；インビボ毒物学実験のため、＞１００ｍｇ／ｍＬ含有の水溶液を調製する。比較として、結晶物質の親化合物ＩＶａの水溶解性を測定すると、０．０４〜０．９ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ範囲１．５〜１０）である。Ｉａｂは、許容しうる溶液および固体安定性を示す。

Ｉａｂの高い水溶解性は、一定用量以下でＩＶａの溶解速度制限吸収を克服する手段を付与することにより、経口用量漸増および毒物動態実験において、ＩＶａの暴露増加を付与する。Ｉａｂは、ＩＶａ相当の〜２００ｍｇ／ｋｇで経口投与すると、同じ用量での経過（histrical）ＩＶａ懸濁液実験のＡＵＣと比較すれば、ラットおよびイヌにおいてＩＶａの２倍高いＡＵＣを付与し、プロドラッグに対する重大な血漿暴露はない。さらに、Ｉａｂを乾燥充填したカプセル（ＩＶａ相当の２００ｍｇ／イヌ）を受容する断食イヌにおけるＩＶａのＡＵＣおよびＣｍａｘ値はそれぞれ、ＩＶａ臨床カプセル製剤を与えた断食イヌで得た値の３８および５８倍で、またＩＶａ臨床カプセル製剤を与えた給餌イヌで得た値の４および６倍である。

Ｉａｂを受容する断食イヌと給餌イヌ間に、ＩＶａのＡＵＣおよびＣｍａｘに有意差は全く見られないのに対し、ＩＶａを受容する断食イヌと比較して、給餌イヌにおいて９倍の改善が見られる。これらのデータは、ＨＩＶ−感染患者において高脂肪食の必要もなく、ＩＶａの効きめのある血液レベルに達しうることを示唆する。ＩＶａの噴霧乾燥形状は、イヌにおけるＩａｂで見られるものと同様なＩＶａの暴露レベルを生じさせる。

ＣＤラットにおける単一用量毒物動態許容性実験：
プロドラッグＩａｂ（モノリシン塩）を用い、１日経口毒物動態実験を行なう。ビヒクルとして水を用い（溶液処方）、３匹雄ラット／グループに対し、Ｉａｂを経口胃管により１６、７２および２６７ｍｇ／ｋｇの投与量で（遊離酸）投与する。プロドラッグ遊離酸の投与量はそれぞれ、１３、５７および２１１ｍｇ／ｋｇのＩＶａ（親）モル当量投与量に相当する。評価のエンドポイントは、個々のラットにおけるＩａｂおよびＩＶａの血漿毒物動態である。

平均毒物動態値を、下記表１２に記す。
表１２：単一経口用量の＜２６７ｍｇ／ｋｇのＩａｂを与えた雄ラットにおけるＩａｂおよびＩＶａの平均毒物動態値

値は、Ｉａｂデータの場合、１−３匹ラット／グループのおよびＩＶａデータの場合３匹ラット／グループの平均値を示す。
１：定量化の下限以下
２：ゼロから最後の定量できるサンプルの時間までのＡＵＣ
３：ゼロから∞までのＡＵＣ

両Ｉａｂ（プロドラッグ）およびＩＶａ（親）の平均最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、投与後１．１時間以内に得られる。プロドラッグの血漿濃度−時間曲線下の血漿面積（ＡＵＣ）は、親のそれの＜０．０３％である。＜２６７ｍｇ／ｋｇのＩａｂを与えたラットでは、ＩＶａのＡＵＣはＩａｂ投与量に比例して増加し、Ｃｍａｘは７２〜２６７ｍｇ／ｋｇのＩａｂ間で、投与量より少ない量に比例して増加する。
ＩＶａ（２）またはＩａｂを与えたラットで得られる、ＩＶａＡＵＣの比較を図６に示す。

臨床前処方の溶解性が、問題点である。ＩＶａのＡＵＣは、低投与量（たとえば＜５０ｍｇ／ｋｇ）で、親およびプロドラッグの両方の場合に同等であり、それは共に溶液（親の場合ＰＥＧ−４００およびプロドラッグの場合水）で処方されるためで、しかし、高投与量（たとえば２００ｍｇ／ｋｇ）では、中性の親は懸濁液で処方されるのに対し、プロドラッグ塩は水溶液で処方される。
ＩＮＤをサポートするため５、５０または５００ｍｇ／ｋｇＢＩＤの投与量を用いる２週ラット毒性実験は進行中である（３）。実験のインライフ（in-life）段階が終了したが、注目すべきインライフは見られない。

イヌ（Dog）における単一用量毒物動態および許容性実験：
プロドラッグＩａｂ（モノリシン塩）の投与量２４、９０または２４０ｍｇ／ｋｇ（遊離酸として親ＩＶａのそれぞれ１９、７１または１９０ｍｇ／ｋｇに対するモル当量）での許容性、およびＩａｂとＩＶａの毒物動態を評価するため、多段階実験を行なう（４）。Ｉａｂを２匹雌イヌ／グループに対し、水溶液（２４または９０ｍｇ／ｋｇ）または乾燥充填カプセル（２４、９０［１日１回および２回］または２４０ｍｇ／ｋｇ）で１日１回投与する。エンドポイントは、臨床徴候、体重、食物消費量、およびＩａｂとＩＶａの血漿毒物動態である。全ての場合に、実験の全段階で、投与と投与の間に１週間の洗浄期間を設ける。

実験の初期段階の血漿毒物動態値を、下記表１３に示す。
表１３：単一経口用量として＜９０ｍｇ／ｋｇのＩａｂを与えた雌イヌにおけるＩＶａの毒物動態値

血漿サンプルでは、Ｉａｂは検出されず、ＩＶａの平均最大血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）は、投与の１−２時間後に得られる。Ｉａｂを溶液で与えると、Ｃ_ｍａｘおよびＡＵＣは共に、２４〜９０ｍｇ／ｋｇ間で、投与量より少ない量に比例して増加する。９０ｍｇ／ｋｇを与えた両イヌで投与の約３０分後に、嘔吐が見られる。乾燥充填カプセルまたは水溶液を用いた２４ｍｇ／ｋｇのＩａｂ投与後の、ＩＶａのＣ_ｍａｘおよびＡＵＣは同等である。
嘔吐以外に臨床徴候は見られず、また体重や食物消費量の影響もない。
乾燥充填カプセルでのＩａｂの投与により、嘔吐をなくしたり／少なくすることができるかを判定するため、９０または２４０ｍｇ／ｋｇの投与量、および４ｈの間隔で２回与える（ＢＩＤ）９０ｍｇ／ｋｇの投与量で、実験の次の段階を行なう。毒物動態値を下記表１４に示す。

表１４：＜２４０ｍｇ／ｋｇのＩａｂを１回経口用量でまたは１日２回投与（ＢＩＤ）で与えた雌イヌにおけるＩＶａの毒物動態値

１）ゼロから２４ｈまでのＡＵＣ

９０または２４０ｍｇ／ｋｇのＩａｂを乾燥充填カプセルで投与したイヌ間で、Ｃ_ｍａｘまたはＡＵＣに差異はない。イヌＤｏｇ＃１２０１、＃２２０１おび＃２２０２において、投与の約１時間後に嘔吐が見られる。嘔吐物を収集し、Ｉａｂ含有量を分析して、トータル用量の損失量を見積もったところ、トータル用量の概算損失割合は、＃１２０１の場合で＜１％、＃２２０１の場合で〜９０％、＃２２０２の場合で〜９％である。“用量損失”の見積もりは、血漿ＡＵＣデータに定量的に一致するとは思われないが、それによって、投与後の短時間内の嘔吐物に、試験物（test article）を見つけることができる。イヌの血漿中において、投与の１時間後に０．００５〜０．０４９μＭのおよび投与の２時間後に０．００５〜０．００６μＭのＩａｂが検出され；その後の時点でのプロドラッグの検出はない。
ＩＶａ（５，６）またはＩａｂを与えたイヌで得られる、ＩＶａＡＵＣの比較を図７に示す。

ビヒクルおよび処方：
Key ＰＫおよび安全性実験に用いた処方の概要：
ラット、イヌおよびサルにおける全てのインビボＰＫ実験は、ＰＯおよびＩＶ投与のため水溶液を用いて行なう。イヌにおける毒物学および暴露実験は、２４および９０ｍｇ／ｋｇ投与量の水溶液および２４、９０および２４０ｍｇ／ｋｇのＩａｂ（モノリシン塩）投与量のカプセル処方の薬物を用いて行なう。
ラット経口用量漸増実験において、Ｉａｂを濃度４．５、２０．０および７３．５ｍｇ／ｍＬ（プロドラッグのモノリシン塩形状）の水溶液で投与する。プロドラッグＩａｂの経口投与後の親ＩＶａのＡＵＣおよびＣ_ｍａｘにおいて、ＩＶａ経口投与の経過データ（historical data）と比較した場合に重要な改善が見られる。

イヌにおける食物影響実験のため、Ｉａｂのカプセル処方の薬物（ドラッグ）を２０ｍｇ／ｋｇＩＶａ相当の用量で使用する。かかるプロドラッグを２０ｍｇ／ｋｇで、親化合物ＩＶａの臨床カプセル処方と比較する。ＩＶａ臨床カプセルを投与するとき、高脂肪食を給餌したイヌにおいて、断食したイヌと比較すると、暴露の９倍増が認められる。プロドラッグＩａｂの投与では、ＩＶａの暴露が有意的に高くなり、予想の通り、断食イヌと給餌イヌとに暴露の有意差はない。

代謝および薬物動態の概要：
知見と解釈の概要：
Ｉａｂは、ＩＶａのＮ−ヒドロキシメチルアダクトのホスフェートプロドラッグであって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）によって加水分解され、ＩＶａを形成する。従って、Ｉａｂの動物への投与後に、公知のＡＬＰ阻害薬のＥＤＴＡの存在下で収集した血液から、血漿サンプルを調製する。ＩａｂからＩＶａの変換は、ＥＤＴＡを含有するラット、サルおよびヒト血液において最小（＜２％）で、ＥＤＴＡ含有のイヌ血液では約６％である。サンプル貯蔵（−２０℃）およびＩａｂの分析中に、Ｉａｂの重要なex vivo変換は予想されない。

動物およびヒトのインビトロシステムで、Ｉａｂの加水分解を実験する。多様なＡＬＰイソフォーム（isoformes）が種々の組織に広く分布しているので、インビトロ対インビボ相関の定量は試みない（Fishmanら，1968；Komodaら，1981；Moss，1983；YoraおよびSakagishi，1986；Sumikawaら，1990）。従って、実験は、種々の組織におけるＡＬＰ−依存加水分解の定性評価に限定する。Ｉａｂは、ラット、イヌ、サルおよびヒトの血清や肝細胞、並びにヒト胎盤ＡＬＰの存在下で加水分解される。時折、ＩａｂとＩＶａを測定する場合、ＩａｂからＩＶａの変換は化学量論に近い。血清での加水分解により、Ｉａｂのたん白質結合は測定できない。

Ｉａｂの経口投与後のラット、イヌおよびサル血漿に検出されるＩａｂは、全くなしあるいは極めて低レベルである。ラット、イヌおよびサルにおいて、ＩａｂのＩＶ投与の後、ＩＶａが急速に形成する。ＩＶのＡＵＣ変換比は、ラットで１．５、イヌで０．８０およびサルで０．７０であって、ＩａｂからＩＶａへの良好な変換が示唆される。

ラット、イヌおよびサルにおいて、Ｉａｂの投与後にＩＶａの良好な経口生物学的利用能（６２〜９４％）が見られる。さらに有意義には、Ｉａｂの高い水溶解性は、一定用量以下のＩＶａの溶解速度制限吸収を少なくし、これによって、経口用量漸増および毒物動態実験でＩＶａの暴露量が増加する（表１２−１４および図６−７）。Ｉａｂカプセルを受容する断食イヌでのＩＶａのＡＵＣレベルは、ＩＶａ臨床型カプセルを与えた断食イヌでのレベルの約４０倍である。４０倍の差は、臨床状況での予測を超えると思われるが、ＩＶａの開発経験に基づき、Ｉａｂは明らかに、親ＩＶａの場合に見られる溶解速度制限吸収を改善する可能性を証明する。

イヌにおけるＩＶａの経口吸収に対する食物（フード）の影響を調べるため、断食および給餌条件下でＩａｂとＩＶａをカプセルにて投与する。Ｉａｂに関してはＡＵＣおよびＣ_ｍａｘに有意差は見られず、一方、ＩＶａに関して給餌すると９倍の改善が見られる。これらのデータは、ＨＩＶ感染患者にとって潜在的な臨床利益を示唆し、該患者において、高脂肪食の必要もなく、ＩＶａの効きめのある血液レベルを得ることができる。

方法
この研究報告で記載の実験には、特に言及がない限り、Ｉａｂのモノリシン塩を使用する。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＩａｂおよびＩＶａの定量測定：
動物薬物動態実験の血漿サンプル並びにインビトロ温置実験のアセトニトリル上澄みにおけるＩａｂおよびＩＶａの分析のために、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を行った。血漿における分析の場合、Packard Multiprobe器具を用いて、５０μＬの各標準、ＱＣおよび血漿サンプルを、たん白質沈殿抽出用のきれいな９６ウェルプレートに移す。

内部標準ＩＶｃを含有する２００μＬのアセトニトリルの添加後、サンプルを渦混合し、得られる上澄みを、１０分間の遠心分離で、沈殿したたん白質から分離する。インビトロ実験で生成した上澄みにおける分析の場合、同容量の上澄みと、内部標準含有のアセトニトリルとを混合する。Tomtec自動化液体ハンドラーを用いて、上記上澄みのアリコートを第二のきれいな９６ウェルプレートに移す。同容量の水を加え、プレートにふたをかぶせ、渦混合する。

ＨＰＬＣシステムは、Shimadzu LC10 AD vp ポンプ（Columbia, MD）、およびPhenomenex Synergi Fusion−ＲＰ分析カラム（２．０×５０ｍｍ、５μ；Torrance, CA）に連結したＨＴＣＰＡＬオートサンプラー（Leap Technologies, cary, NC）から成る。移動相Ａは、水中の５ｍＭギ酸アンモニウムから成り；移動相Ｂは１００％アセトニトリルである。ＬＣ流速は０．３８ｍＬ／分である。最初の移動相組成は３％Ｂであって、１．７５分にわたり６０％Ｂへの勾配をなし、０．２５分間保持し、０．１分にわたり１００％Ｂへの勾配をなし、０．８分間保持し、次に０．１分にわたって最初の条件に戻し、次いで再度平衡状態にする。トータル分析時間は４分である。Ｉａｂ、ＩＶａおよびＩＶｃの保持時間はそれぞれ、１．５０、１．６７および１．７３分である。

ターボイオンスプレー供給源セットを備えたScier ＡＰＩ４０００三重四極子質量分析計（トロント、カナダ）に、ＨＰＬＣシステムを５５０℃で連動させ、イオンスプレー電圧を４．５ｋＶにセットする。薬液噴霧および補助ガスとしてＵＨＰ窒素を、それぞれ８０ｐｓｉの圧力および７Ｌ／分で用いる。Ｉａｂ、ＩＶａおよびＩＶｃの衝突エネルギーはそれぞれ、２１、２９および３１ボルトである。データ取得に、選択反応制御（ＳＲＭ）を利用する。Ｉａｂ、ＩＶａおよび内部標準の陽イオンモード（Ｍ＋Ｈ)^＋種を表わすイオンをＭＳ１で選択し、窒素および最適の衝突エネルギーで衝突解離させて、固有プロダクトイオンを形成し、次いでＭＳ２で監視する。Ｉａｂ、ＩＶａおよびＩＶｃのＳＲＭ変化はそれぞれ、ｍ／ｚ５３３→４３５、４２３→２０５および４７４→２５６である。

ストック溶液から、５ｎＭから１０μＭの標準曲線を調製し、両ＩａｂおよびＩＶａに対し基質にて連続的に希釈する。標準曲線を二等分に分け、サンプルで抽出し、次いで分析順序の開始、中間および最後に注入する。標準曲線は、逆濃度１／ｘ^２加重の一次回帰に一致する。データおよびクロマトグラフィー・ピークを処理し、PE Biosystems Analyst（登録商標）１．１を用いて、標準および未知試料の濃度を定量する。

インビトロ方法：
（１）ＥＤＴＡ血液、血清およびTris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩａｂの安定性
ラット、イヌ、サルおよびヒト（ｎ＝２）の新しい血液および血清におけるＩａｂの安定性を実験する。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を含有するバキュティナー（vacutainers）に、血液を収集する。血清は、抗凝固薬を含有しないバキュティナーに収集する。Ｉａｂを約１０μＭの出発濃度で、３７℃にて６０〜９０分間温置する。所定の時間でサンプルを連続して採取する。血液サンプルのアリコート（２００μＬ）を最初に１００μＬの水と混合した後、４００μＬのアセトニトリルと混合する。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を含有するミクロティナー（microtainers）に、血清サンプル（５０μＬ）を加えた後、１００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みを両ＩａｂおよびＩＶａに関して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。
また上記に準じ、Tris−ＨＣｌ緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中で、Ｉａｂの安定性を評価する。

（２）ヒト胎盤ＡＬＰの存在下でＩａｂの加水分解
Sigma（P-3895、St. Louis, MO）から、固体のヒト胎盤ＡＬＰを得る。Tris−ＨＣｌ緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中、１０００ユニット／Ｌの溶液を調製する。連続希釈で、１００および１０ユニット／Ｌの溶液を得る。Ｉａｂを１０、１００および１０００ユニット／Ｌ溶液（ｎ＝２）中で、３７℃にて２ｈ温置する。温置でのＩａｂの出発濃度は、１０μＭである。所定の時間で１００μＬサンプルのアリコートを採取し、Ｋ_２ＥＤＴＡミクロティナーに加えた後、２００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みを両ＩａｂおよびＩＶａに関して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。

インビボ実験：
血液サンプル（０．３ｍＬ）の全てを、Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を含有するミクロティナーに収集し、氷片に置く。遠心分離後、血漿を分離し、分析まで−２０℃で貯蔵する。薬物動態実験には、Ｉａｂのモノリシン塩（型３、ロット１）を用いる。Ｉａｂの投与溶液を、殺菌水（イヌやサルのＩＶ投与用）または蒸留水（他の全ての投与用）で調製する。

（１）ラットでのインビボ実験
頸静脈にカニューレを埋没させた、雄スプラーグ−ダウレイラット（３００〜３５０ｇ、Hilltop Lab animals Inc., Scottsdale, PA）を使用する。ＰＯ薬物動態実験では、ラットを一夜断食させる。頸静脈から血液サンプルを収集する。
ＩＶ実験において、Ｉａｂを０．５分にわたりボーラスで（ｎ＝３）、１．４ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．１ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）にてデリバリーする。投与溶液の濃度は１．４ｍｇ／ｍＬで、投与容量は１ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験では、Ｉａｂを経口胃管により（ｎ＝３）、７．９ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または６．３ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）で投与する。投与溶液の濃度は４．０ｍｇ／ｍＬで、投与容量は２ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（２）イヌにおけるインビボ実験
３匹の雄ビーグル犬（１１±１．１ｋｇ、Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY）において、ＩａｂのＩＶおよびＰＯ実験を、クロスオーバー型式で行なう。ＩＶとＰＯの実験間に、２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験では、頭部静脈を介して１．２ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または０．９５ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）で、５分にわたり０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度にて注入する。投与溶液の濃度は２．４ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、大腿動脈から連続して血液サンプルを収集する。

ＰＯ実験では、イヌを投与前に一夜断食させる。Ｉａｂを経口胃管により、６．６ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または５．２ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）で投与する。投与溶液の濃度は１３．２ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

ＩａｂおよびＩＶａの投与後のＩＶａの経口吸収に対する食物の影響を実験するため、これら２つの化合物を３匹イヌのグループに対してカプセル中固体で、一夜の断食および給餌条件下クロスオーバー型式で投与する。各実験の間に１週間の洗浄期間を設ける。Ｉａｂを２００ｍｇ／イヌ（約２０ｍｇ／ｋｇ）のＩＶａ当量で投与し；ＩＶａを臨床カプセル処方にて、２００ｍｇ／イヌ（約２０ｍｇ／ｋｇ）で投与する。イヌに給餌する実験では、以下の食事を用意する：ベーコン２きれ、卵２個、バターおよびジェリー付トースト２きれ、４オンスのハッシュブランズおよび８オンスの全乳。実験ブレンダーを用いて均質にした後、該食事を５等分に分け、冷凍保存する。実験の前に、各食事を解凍し、各イヌに１つ分を与える。

ＩＶａの別の処方実験を、断食イヌ（１投与グループ当りｎ＝２）で行なう。カプセルに入った臨床形状または噴霧乾燥形状のＩＶａを、イヌに投与する。臨床カプセル形状のＩＶａは、２０ｍｇ／ｋｇの単一用量で投与する。噴霧乾燥形状のＩＶａは、２０、７５および２００ｍｇ／ｋｇで投与する。

（３）サルにおけるインビボ実験
３匹の雄カニクイザル（１１±１．２ｋｇ、Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX）において、ＩａｂのＩＶおよびＰＯ実験を、クロスオーバー型式で行なう。ＩＶとＰＯの実験間に２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験では、Ｉａｂを大腿静脈を介して１．３ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．１ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）で、５分にわたり０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度にて注入する。投与溶液の濃度は２．６ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、大腿動脈から連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験では、サルに投与前一夜断食させる。Ｉａｂを経口胃管により、７．１ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または５．６ｍｇ／ｋｇのＩＶａ相当）で投与する。投与溶液の濃度は１４．２ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（４）データ分析
全ての結果は、特別に明記されていない限り、平均値±ＳＤで表示する。
ＩａｂおよびＩＶａの薬物動態パラメーターは、ＫＩＮＥＴＩＣＡ（登録商標）ソフトウェア・プログラム（バージョン４．０．２、InnaPhase Co., フィラデルフィア，PA）を用いるNon−Compartmental Analysisで算定する。Ｃ_ｍａｘおよびＴ_ｍａｘ値は、実験観測から直接記録する。ＡＵＣ_ｏ−ｎおよびＡＵＣ_ｔｏｔ値は、混合対数−直線台形加法（mixed log−linear trapezoidal summations）を用いて算定する。また総体内クリアランス（body clearance）（Ｃｌ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および分布の定常状態容量（Ｖｓｓ）は、静脈内投与後に算定する。絶対経口生物学的利用能（％で表示）は、経口投与後の用量−正規ＡＵＣ値と静脈内投与後の該値の比を計算することにより見積もられる。

肝クリアランスＣｌ_Ｈは、よくかきまぜたモデルを用い、次式より算定する。

ここで、Ｑｈはラット、イヌ、サルおよびヒトの場合のそれぞれ５５、３１、４４および２１ｍＬ／分／ｋｇの肝臓血液流である（DavisおよびMorris, 1993）。
肝除去率（ＥＲ）の算定は、以下の通りである。
ＥＲ＝Ｃｌ_Ｈ／Ｑｈ
統計的分析のため、スチューデントのｔ−testを用いる（Microsoft（登録商標）Excel, Redmond, WA）。
差は、Ｐ＜０．０５のレベルの統計的有意と考えられる。

インビトロ実験：
ＥＤＴＡ血液、血清およびTris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩａｂの安定性：
分析アッセイ確認の一部として、アルカリ性ホスファターゼの阻害薬であることが知られている、ＥＤＴＡを含有する血液において、Ｉａｂの安定性を実験する（Bowers, Jr. およびMcComb, 1966；YoraおよびSakagishi, 1986）。３７℃で６０分間の温置後、ラット血液中の初期濃度のＩａｂからＩＶａへの変換率は１．２％であり（下記表１５）、サルおよびヒト血液ではその変換率は１％未満である（表１５および１６）。イヌ血液での変換率は約６％で、この変換率は２種のイヌ間で、並びに同一イヌで２回の試験でも同様である（表１５および１６）。−２０℃のサンプル貯蔵条件下では、上記３７℃で観測した小さな変換率が、Ｉａｂの分析中に有意な ex vivo 変換をもたらすとは予測されない。
Ｉａｂは、６０分の実験期間中、３７℃のTris−ＨＣｌ緩衝剤中で安定である（下記表１７）。

表１５：ラット、イヌおよびサルの新しいＥＤＴＡ血液におけるＩａｂの安定性

＊）Ｉａｂの出発濃度での形成割合

表１６：イヌ（反復）およびヒトの新しいＥＤＴＡ血液におけるＩａｂの安定性

＊）Ｉａｂの出発濃度での形成割合

表１７：Tris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩａｂの安定性

＊）Ｉａｂの出発濃度での形成割合

体循環におけるＩａｂの加水分解を調べるため、Ｉａｂを新しい血清（ラット、イヌ、サルおよびヒト）中、３７℃で９０分間温置する。加水分解の速度は、ラット血清中が最も迅速で、続いてイヌ、サルおよびヒト血清の順である（下記表１８）。ＩａｂからＩＶａの変換率は、化学量論に近い。
血清は、組織と比較して低いＡＬＰ活性を有する（McCombら，1979a）。加えて、血清は組織源、たとえば骨、肝臓および腸と同じＡＬＰイソフォームを含有し、該ＡＬＰイソフォームの特性は、血管を介しての漏出である（Moss, 1983）。従って、血清におけるＩａｂの加水分解はたぶん、ＡＬＰの多様なイソフォームに仲介されると思われる。

表１８：ラット、イヌ、サルおよびヒトの新しい血清におけるＩａｂの安定性

＊）Ｉａｂの消失として計算する。
＊＊）半減期は、温置期間より長い。

ヒト胎盤ＡＬＰの存在下のＩａｂの加水分解：
ヒトＡＬＰの精製形状においてＩａｂの加水分解を実験するため、Ｉａｂを１０、１００および１０００ユニット／Ｌのヒト胎盤ＡＬＰ溶液中、３７℃で２ｈ温置する。Ｉａｂの消失ｔ_1/2 を測定し、下記表１９に記録する。予想通り、加水分解の速度は、ＡＬＰ活性の高い溶液の方が速い。またＩＶａも、それに応じて形成する（図８）。これによって、Ｉａｂはヒトから得られるＡＬＰにより加水分解され、ＩＶａを形成することが認められる。

表１９：ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩａｂの加水分解

注）Ｉａｂを〜１０μＭの出発濃度で３７℃で１２０分間温置する。

ラットにおけるインビボ実験：
ＩａｂのＩＶおよび経口投与後のラットにおけるＩａｂおよびＩＶａの薬物動態パラメーターを下記表２０に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図９に示す。比較のため、ラットにおけるＩＶａの薬物動態実験の経過データも示す。

ＩＶ投与後のＩａｂのトータル体内クリアランス（Ｃl）は１４mL／分／Kgで、Ｉａｂがラットにおいて低クリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後の排泄半減期（ｔ_1/2）および平均滞留時間（ＭＲＴ）はそれぞれ、０．１６ｈおよび０．１４ｈである。Ｉａｂは２ｈ過ぎて検出されず、定常状態のＩａｂの分布容量は０．１２Ｌ／Kgで、非常に限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩａｂからのＩＶａ形成は急速で；最初の２分のサンプリング時点で、ＩＶａが検出される（データは示さず）。Ｉａｂから形成されるＩＶａと経過ＩＶａ実験から形成されるＩＶａのＩＶＡＵＣ比は１．５で（完全変換の理論値＝１）、ＩａｂからＩＶａの完全変換を示唆する。

１つのサンプル（５ｎＭ；表２０）を除いては、経口投与後にいずれのサンプルにもＩａｂは検出せず、Ｉａｂの経口投与後のＩＶａのＴmaxは０．８３ｈで、これはＩＶａの経過Ｔmax ２．０ｈより短く、プロドラッグの経口投与後のＩＶａの急速な吸収を示す。プロドラッグからのＩＶａの急速吸収は、Ｉａｂの良好な水溶解性並びに腸内でＩＶａを形成するＩａｂの急速加水分解の結果と思われる。ＩａｂからのＩＶａの絶対経口生物学的利用能は６２％で、経過ＩＶａデータより低いが、Ｉａｂラット経口用量漸増実験によるＩＶａの暴露は、ＩＶａの経過データに比し優れている（表１６および図８）。
Ｉａｂから形成されるＩＶａの終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶａプロフィールと同様である。

表２０：ラットにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

ＮＡ：適用不可、ＮＤ：検出せず（＜５ｎＭ）
＊）該比は、それぞれＩＶおよびＰＯの、プロドラッグ投与後の‘０４３ＡＵＣ／’０４３投与後の‘０４３ＡＵＣから算定する。
＊＊）１匹のラットで１５分のみでＩａｂが検出される（５ｎＭ）。
＊＊＊）ＩＶａの経過ＩＶデータより算定。

３１．イヌにおけるインビボ実験
ＩａｂのＩＶおよび経口投与後のイヌにおけるＩａｂおよびＩＶａの薬物動態パラメーターを、下記表２１に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図１０に示す。比較のため、イヌにおけるＩＶａの薬物動態実験の経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩａｂのＣlは、７０mL／分／Kgで、これはイヌにおける肝臓血液流３１
mL／分／Kgよりもかなり高く、肝外加水分解および／または他のルートの排泄（たとえば腎排泄）の潜在的必要を示唆する。ＩＶ投与後のｔ_1/2 およびＭＲＴはそれぞれ、０．１５hrおよび０．０７hrである。Ｉａｂは４５分を過ぎて検出されず、ＩａｂのＶssは０．３０Ｌ／Kgで、組織分布の低い可能性を示唆する。ＩＶ投与後のＩａｂからのＩＶａの形成は急速であり；最初のサンプリングの５分の時点では、ＩＶａは検出されない（データは示さず）。Ｉａｂから形成されるＩＶａと経過ＩＶａ実験から形成されるＩＶａのＩＶＡＵＣ比は０．８０で、ＩａｂからＩＶａの良好な変換を示唆する。

Ｉａｂは１匹のイヌにおいて、経口投与後１５分と３０分のみに５ｎＭで検出される（ＬＬＱ）。Ｉａｂの経口投与後のＩＶａのＴmax は０．２５ｈで、これはＩＶａの経過Ｔmax ２．９hrより短く、プロドラッグの経口投与後のＩＶａの急速な吸収を示す。ＩａｂからのＩＶａの絶対経口生物学的利用能は９４％で、経過ＩＶａデータの５７％より高い。Ｉａｂから形成されるＩＶａの終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶａプロフィールと同様である。

表２１：イヌにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後の薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）Ｉａｂは、１匹のイヌにおいて１５分と３０分のみに５ｎＭ（ＬＬＱ）で検出される。

ＩａｂおよびＩＶａの投与後のＩＶａの経口吸収に対する食物の影響を実験するため、イヌに断食および給餌条件下、カプセル中のＩａｂまたはＩＶａを投与する。実験はクロスオーバー型式で行ない、各実験間に１週間の洗浄期間を設ける。Ｉａｂの投与後の断食と給餌の条件間で、ＡＵＣおよびＣmax において有意差は見られず（表２２）、一方、給餌と共にＩＶａの投与後では、ＡＵＣおよびＣmax に９倍の改善が見られる（表２３）。全体的にみて、給餌の影響は、ＩＶａを受容するヒト被験者（表２４）よりもイヌ（表２３）の方が著しい。このことは、ＩＶａの経口吸収に対する食物の影響における量的種の差を示唆する。

ＩＶａの経口吸収は、ヒトおよび動物種において溶解速度に制限されることが認められる。ヒトにおける高脂肪食の摂食時のＩＶａ暴露量の改善はたぶん、ＩＶａの溶解を促進する胆汁酸塩の分泌増に基づく。イヌにおいて、Ｉａｂ投与後のＩＶａの経口吸収に対する食物の影響の欠如は、治療食の変化を要しなくてよいヒトにおいて、潜在的な利益を示唆する。

表２２：乾燥充填カプセルでのＩａｂの経口投与後（２０mg／KgのＩＶａ当量）のイヌにおけるＩＶａの経口暴露に対する食物の影響（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

注）Ｉａｂは数サンプルにおいて、早い時点で＜２００ｎＭにて検出される。

表２３：臨床型カプセルでのＩＶａの経口投与後（２０mg／Kg）のイヌにおけるＩＶａの経口暴露に対する食物の影響（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）断食条件下の数値との有意差

表２４：First−in−ヒト実験におけるＩＶａの経口暴露に対する食物の影響（平均値±ＳＤ，ｎ＝６）

Ｉａｂと比較するため臨床および噴霧乾燥形状のＩＶａを用い、同じ断食イヌにおいて追加のカプセル処方実験を行なう。下記表２５に示すように、２０mg／KgのＩＶａ当量で、Ｉａｂおよび噴霧乾燥形状のＩＶａの投与後に同様なＩＶａ暴露が見られる。しかしながら、Ｉａｂは臨床形状のＩＶａと比較してかなり高いＩＶａ暴露を付与する。プロドラッグからのＩＶａのＡＵＣおよびＣmax はそれぞれ、臨床形状のＩＶａの数値より３７倍および４５倍である。イヌにおける倍増は、ＩＶａの開発経験に基づく臨床状況（データは示さず）の予測を超えると思われる。
イヌにおける噴霧乾燥形状のＩＶａの用量漸増実験において、２０mg／Kgから７５mg／KgでのＡＵＣおよびＣmax の増加は、用量増加に決して比例しない（表２６）。７５mg／Kgから２００mg／Kgでの暴露量に、有意な増加は見られない。

表２５：Ｉａｂおよび異なる処方のカプセル中ＩＶａの経口投与後のイヌにおけるＩＶａの経口暴露量（クロスオーバー実験）

＊）ＡＵＣは０−２４hr

表２６：噴霧乾燥形状のカプセル中ＩＶａの経口投与後のイヌにおけるＩＶａの経口暴露量

＊＊）表２５と同じ。＊＊）ＡＵＣは０−２４hr

サルにおけるインビボ実験：
ＩａｂのＩＶおよび経口投与後のサルにおけるＩａｂおよびＩＶａの薬物動態パラメーターを、下記表２７に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図１１に示す。比較のため、サルにおけるＩＶａの薬物動態実験の経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩａｂのＣlは４．４mL／分／Kgで、これはＩａｂがサルにおける低クリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後のｔ_1/2 およびＭＲＴはそれぞれ、１．０hrおよび０．１８hrである。ＭＲＴは、血漿中のＩａｂの持続時間のより現実的な概要を反映するが、それは、終末相中のＩａｂの血漿濃度が低いからである（図１１）。Ｉａｂは６hrを過ぎて検出されず、ＩａｂのＶssは０．０４８Ｌ／Kgで、これは、極めて限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩａｂからのＩＶａの形成は急速であり；最初のサンプリングの５分の時点でＩＶａが検出される（データは示さず）。Ｉａｂから形成されるＩＶａと経過ＩＶａ実験から形成されるＩＶａのＩＶＡＵＣ比は０．７０で、これは、ＩａｂからＩＶａの良好な変換を示唆する。

Ｉａｂは経口投与後、１匹のサルのみにおいて１５分で１８ｎＭの濃度にて検出される。Ｉａｂの経口投与後のＩＶａのＴmax は０．８３で、これはＩＶａの経過Ｔmax ２．７hrより短かく、プロドラッグの経口投与後のＩＶａのより急速な吸収を示唆する。ＩａｂからのＩＶａの絶対経口生物学的利用能は６６％で、経過ＩＶａデータの６０％に類似する。
Ｉａｂから形成されるＩＶａの終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶａプロフィールと同様である。

表２７：サルにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後の薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）Ｉａｂは１匹のサルのみにおいて、１５分で１８ｎＭにて検出される。

追加のプロフィーリング・セクション２：
プロドラッグＩｂｂを用いる追加実験：
ラット、イヌおよびサルにおいて、ＩｂｂのＩＶおよびＰＯ薬物動態実験を行なう。全ての場合、ＥＤＴＡの存在下で血液サンプルを収集する。公知ＡＬＰ阻害薬のＥＤＴＡの存在は、サンプル処理中のＩｂｂの重要な ex vivo 変換を最小化する。ＩｂｂのＩＶ投与後、ＩＶｂが急速に形成する。血漿中に極めて低レベルのＩｂｂが存在するラット、イヌおよびサルにおいて、Ｉｂｂの投与後にＩＶｂの良好な経口生物学的利用能が見られる（５０−３１０％；ＩＶｂの経過ＩＶＡＵＣを用いて算定）。腸に高レベルのＡＬＰ発現があるので、Ｉｂｂの経口投与後に、Ｉｂｂは腸管腔の刷子縁膜に存在するＡＬＰによって加水分解されて、ＩＶｂを形成し、該ＩＶｂがその高透過性に基づいて急速に吸収されるものと思われる。

種々の組織におけるＩｂｂのＡＬＰ−依存加水分解の定性評価のため、インビトロ温置実験を行なう。Ｉｂｂは、ラット、イヌ、サルおよびヒトの血清および肝細胞並びにヒト胎盤ＡＬＰの存在下で加水分解される。時折り、ＩｂｂとＩＶｂを測定する場合、ＩｂｂからＩＶｂの変換は化学量論に近い。血清中の加水分解に基づき、Ｉｂｂのたん白質結合は測定できない。インビトロデータに基づき、ＩｂｂはヒトＡＬＰによって加水分解され、ヒト被験者へのＩｂｂの経口投与後にＩＶｂは形成されることが予想される。

Ｉｂｂ−０３の室温における結晶溶解性は、１．５〜８．７のpＨ範囲で＞１１mg／mLであり；インビボ毒物学実験のため、＞７５mg／mL含有の水溶液を用意する。比較として、結晶物質の親化合物ＩＶｂの室温における水溶解性を測定すると、０．００７〜０．１９mg／mLである（１．０−９．６のpＨ範囲）。Ｉｂｂ−０３は、許容しうる溶液および固体安定性を示す。

Ｉｂｂの高い水溶解性は、ＩＶｂの一定用量以下での、溶解速度制限吸収を克服する手段を付与し、これによって、経口用量漸増および毒物動態実験においてＩＶｂの暴露量が増加する。Ｉｂｂは、２００mg／KgまでのＩＶｂ当量で経口投与すると、ラットおよびイヌにおいてそれぞれ、ＩＶｂの１１倍および２．６倍（ＢＩＤ）ＡＵＣを付与し、しかも、同じ用量での経過ＩＶｂ懸濁液実験のＡＵＣと比較すれば、プロドラッグに対する血漿暴露は比較的に低い（＜０．９μＭ）。

スプラーグ−ダウレイラットにおける単一用量毒物動態実験：
プロドラッグＩｂｂ（モノリシン塩）を用い、ラットにおける１日経口毒物動態実験を行なう。ビヒクルとして水を用い（溶液処方）、Ｉｂｂを三匹雄ラット／グループに対し、経口胃管により１９、６４および２３６mg／Kg（遊離酸）の投与量で投与する。プロドラッグ遊離酸の上記の投与量はそれぞれ、ＩＶｂ（親）モル当量投与量の１５，５１およぴ１９０mg／Kgに相当する。個々のラットにおいて、評価のエンドポイントはＩｂｂおよぴＩＶｂの血漿毒物動態である。
平均毒物動態値を、下記表２８に示す。

表２８：単一経口用量として＜２００mg／KgのＩｂｂを与えた雄ラットにおけるＩｂｂおよびＩＶｂの平均毒物動態値

数値は、Ｉｂｂデータの場合１〜３匹ラット／グループの、およびＩＶｂデータの場合３匹ラット／グループの平均値を表わす。ＬＬＱは、定量測定の下限である。
１）ゼロから最終時点までのＡＵＣ
２）ゼロから∞までのＡＵＣ

ＩＶｂ（親）の平均最大血漿濃度（Ｃmax）は、投与後〜１−３時間以内で得られる。＜２３６mg／KgのＩｂｂを与えたラットにおいて、ＩＶｂのＡＵＣの増加は、ほぼＩｂｂ投与量に比例し、Ｃmax は１９〜２３６mg／KgのＩｂｂ間で、用量に決して比例せずに増加する。Ｉｂｂは、＞１９mg／KgのＩｂｂを与えたラットの血漿中で検出されるが、ＩＶｂのそれに対して極めて低い濃度である。
ＩＶｂまたはＩｂｂを与えたラットで得られる、ＩＶｂＣmax およびＡＵＣの比較が、図１２に示される。
Ｉｂｂの投与後にＩＶｂによる暴露量は、ＩＶｂ投与後に得られるそれと比較して、実質的に増加する。

イヌにおける単一用量毒物動態および許容性実験：
プロドラッグＩｂｂ（ミノリシン塩）の２５，９２または２５０mg／Kg（遊離酸，それぞれ２０、７４または２０１mg／Kgの親ＩＶｂに対しモル当量）の投与量での許容性およびＩｂｂおよびＩＶｂ（１）の毒物動態を評価するため、二段実験を行なう。１日目（day１）に、１匹イヌ／性別／グループに対し、Ｉｂｂを乾燥充填カプセルにて１日１回上記の投与量で投与する。実験中投与と投与間に１週間の洗浄期間を採用する。８日目（day８）、１匹イヌ／性別／グループに対し、Ｉｂｂを水溶液で２５mg／Kgにて１日１回、または乾燥充填カプセルで４６もしくは１２５mg／Kg ＢＩＤで１日２回投与する。エンドポイントは、臨床徴候、体重、食物消費、血清化学、血液学およびＩｂｂおよびＩＶｂの血漿毒物動態である。
個々のイヌの血漿毒物動態値を、下記表２９に示す。

表２９：＜２５０mg／KgのＩｂｂを与えたイヌにおけるＩＶｂの毒物動態値

１日目に乾燥充填カプセルで処方し、８日目に水溶液で処方（両日共ＱＤ投与）
２）１日目９２mg／Kg ＱＤおよび８日目４６mg／Kg ＢＩＤ；両日共乾燥充填カプセルで処方
３）１日目２５０mg／Kg ＱＤおよび８日目１２５mg／Kg ＢＩＤ；両日共乾燥充填カプセルで処方
４）投与の２時間以内に嘔吐が見られ、カプセルの残物が存在
５）投与の２時間以内に嘔吐が見られ、カプセル残物なし

１日目と８日目の幾つかの血漿サンプルで、低レベル（＜０．９μＭ）のＩｂｂが検出される。ＱＤ投与の１−４時間後と第二のＢＩＤ投与の１−２時間後の間で、ＩＶｂの平均最大血漿濃度（Ｃmax）が得られる。Ｉｂｂを乾燥充填カプセルまたは水溶液で投与するとき、２５mg／Kg ＱＤで、ＩＶｂの同等のＣmax およびＡＵＣが観測される。１日目、＞９２mg／Kg ＱＤ（これは９２と２５０mg／Kg間のフラットな暴露に寄与すると思われる）を与えた全てのイヌ（３１０１Ｍ、３２０１Ｆ、４１０１Ｍおよび４２０１Ｆ）において、投与の約０．５−１．２５時間後に嘔吐（白色、カプセル残物を含む赤色の縞状）が見られる。８日目、＞４６mg／Kg ＢＩＤを与えた全てのイヌにおいて、投与後２時間以内に嘔吐（白色または褐色）が見られ；２匹のイヌ（第１投与後の３１０１Ｍと第２投与後の４２０１Ｆ）の吐物にカプセル残物がわずかに見られる。１日２回投与は、イヌにおいて１日１回投与より、ＩＶｂによる大きな暴露量を付与する。

嘔吐を除いて、臨床徴候は全く見られず、また体重や食物消費に関する影響もない。
イヌに嘔吐が見られるのに拘らず、ＩＶｂを与えたイヌよりもＩｂｂを与えたイヌの方が、高いＩＶｂＡＵＣが観測される。ＩｂｂまたはＩＶｂ（２）を与えたイヌで得られるＩＶｂＡＵＣの比較は、図１３に示される。

ホスフェートプロドラッグＩｂｂ−０３の水溶液の投与後の、親化合物ＩＶｂの絶対経口生物学的利用能は、ラット、イヌおよびサルにおいて５０％から３１０％の範囲にある。これらの計算は、経過（historical，史的）ＩＶデータに基づく。ラット経口用量漸増実験において、１９０mg／KgまでのＩＶｂ当量の用量のプロドラッグＩｂｂ−０３の水溶液の経口投与後の、ＩＶｂの暴露量は、ＩＶｂによる経過データと比較して３−１０倍である。

イヌにおいてＩｂｂ−０３をカプセル中薬物でＢＩＤ投与すると、ＩＶｂ懸濁液のＢＩＤ投与による予備ＥＣＮ毒物学実験の経過データと比べて、暴露量に２−３倍の改善が得られる。カプセル処方薬物のインビボ暴露データは、ヒトにおけるＩＶｂの経口暴露が、伝統的な固体経口投与剤形のＩｂｂの投与によって、有意に改善されうることを示唆する。

Ｉｂｂは、ＩＶｂのＮ−ヒドロキシメチルアダクトのホスフェートプロドラッグであって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）によって加水分解されて、ＩＶｂを形成する。従って、Ｉｂｂの動物への投与後、公知のＡＬＰ阻害薬のＥＤＴＡの存在下で収集した血液から、血漿サンプルを用意する。ＩｂｂからＩＶｂの変換率は、ＥＤＴＡを含有する血液（ラット、イヌ、サルおよびヒト）において最小である（＜２％）。サンプル貯蔵（−２０℃）やＩｂｂ分析中の、Ｉｂｂの有意な ex vivo 変換は予想されない。

動物およびヒトのインビトロシステムにおいて、Ｉｂｂの加水分解を実験する。種々の組織に多様なＡＬＰイソフォームが広く分布しているので、インビトロ／インビボ相関の定量分析は、試みない（Fishman ら，１９６８；Komoda ら，１９８１；Moss,１９８３，Yora および Sakagishi,１９８６；Sumikawa ら，１９９０）。従って、実験は種々組織におけるＡＬＰ−依存加水分解の定性評価に限定する。Ｉｂｂは、血清（ラット、イヌ、サルおよびヒト）、肝細胞（ラット、イヌおよびヒト）の存在下並びにヒトの胎盤ＡＬＰ中で加水分解される。サルの肝細胞では、ターンオーバーは観測されない。ＩｂｂからＩＶｂの変換は、化学量論に近い。血清における加水分解に基づき、Ｉｂｂのたん白質結合は測定できない。

Ｉｂｂは完全に加水分解されて、Caco−２細胞でＩＶｂを形成し、予想通り、Ｉｂｂの経口投与後、ラット、イヌおよびサルの血漿中に極めて低レベルのＩｂｂが検出される。これらのデータは、腸内の高レベルのＡＬＰ発現を記述する報告と一致する（McComb ら,１９７９ａ；Butterworth，１９８３）。膜−結合ＡＬＰは主として、腸管腔内面の微小絨毛の刷子縁膜に局在する（Butterworth,１９８３；Testa および Mayer，２００３）。Ｉｂｂの経口投与の後、Ｉｂｂは腸管腔の刷子縁膜に存在するＡＬＰによって加水分解されて、ＩＶｂを形成し、該ＩＶｂはその高い透過性に基づき急速に吸収される。

種々の組織や種に異なるイソフォームのＡＬＰが存在するが、ＡＬＰの基質特異性は比較的に広く（Heimbach ら，２００３）、このことは上記Ｉｂｂの知見と一致する。
ラット、イヌおよびサルにおいて、ＩｂｂのＩＶ投与の後に、ＩＶｂが急速に形成する。ＩＶＡＵＣ変換比は、ラットで０．６２、イヌで１．６およびサルで１．７であり、これはＩｂｂからＩＶｂの良好な変換による満足感を示唆する。

ラット、イヌおよびサルおいて、Ｉｂｂの投与後にＩＶｂの良好な経口生物学的利用能（５０−３１０％；ＩＶｂの経過ＩＶＡＵＣを用いて算定）が見られる。より有意的には、Ｉｂｂの高い水溶解性は、ＩＶｂの溶解速度制限吸収を少なくし、これによって、経過ＩＶｂ実験の暴露量と比較して、経口用量漸増および毒物動態実験におけるＩＶｂ暴露量を増加する（発見毒物学セクション、表２８−２９、図１２−１３）。
方法：
この報告で記載の実験には、Ｉｂｂのモノリシン塩を用いる。

ＩｂｂおよびＩＶｂのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量測定：
動物薬物動態実験の血漿サンプル中並びにインビトロ温置実験のアセトニトリル上澄み中のＩｂｂおよびＩＶｂの分析のため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を行なう。血漿での分析の場合、Packard Multiprobe 器具を用いて、５０μＬの各標準、ＱＣおよび血漿サンプルを、たん白質沈殿抽出用のきれいな９６ウエルプレートに移す。内部標準ＩＶｃを含有する２００μＬのアセトニトリルの添加後、サンプルを渦混合し、得られる上澄みを１０分間の遠心分離によって、沈殿したたん白質から分離する。インビトロ実験で生成した上澄みの分析の場合、同容量の上澄みと、内部標準含有のアセトニトリルとを混合する。Tomtec自動化液体ハンドラーを用い、上記上澄みのアリコートを第二の９６ウエルプレートに移す。同容量の水を加え、プレートにふたをかぶせ、渦混合する。

ＨＰＬＣシステムは、Shimadzu ＬＣ１０ＡＤｖｐポンプ（Columbia,ＭＤ）、および Phenomenex Synergi Fusion-ＲＰ分析カラム（２．０×５０ｍｍ，５μ；Torrance，ＣＡ）に連結したＨＴＣＰＡＬオートサンプラー（Leap Technologies,Cary,ＮＣ）から成る。移動相Ａは、水中の５ｍＭギ酸アンモニウムから成り；移動相Ｂは１００％アセトニトリルである。ＬＣ流速は０．３８ｍＬ／分である。最初の移動相組成は、１．８分にわたる２％Ｂから５０％Ｂへの勾配で０．５分間保持し、０．１分にわたる１００％Ｂへの勾配で０．５分間保持し、次に０．１分にわたって最初の条件に戻り、再度平衡状態になる。トータル分析時間は４．０分である。Ｉｂｂ、ＩＶｂおよびＩＶｃの保持時間はそれぞれ、１．４２、２．２１および１．７３分である。

ターボイオンスプレー供給源セットを備えた Sciex ＡＰＩ４０００三重四極子質量分析計（トロント、カナダ）に、ＨＰＬＣシステムを５５０℃で連動させ、イオンスプレー電圧を４．５ｋＶにセットする。薬液噴霧および補助ガスとして、ＵＨＰ窒素をそれぞれ８０ｐｓｉの圧力および７Ｌ／分で使用する。Ｉｂｂ、ＩＶｂおよびＩＶｃの衝突エネルギーはそれぞれ、１９、２５および２９ボルトである。データ取得に、選択反応制御（ＳＲＭ）を利用する。Ｉｂｂ、ＩＶｂおよび内部標準の陽イオンモード（Ｍ＋Ｈ）^＋種を表わすイオンを、ＭＳＩで選択し、窒素で衝突解離させ、衝突エネルギーを最適化して、特定プロダクトイオンを形成し、次いでＭＳ２で監視する。Ｉｂｂ、ＩＶｂおよびＩＶｃのＳＲＭ変化はそれぞれ、ｍ／ｚ５５８→４３２、４４８→２０２および４７４→２５６である。

ストック溶液から、５ｎＭから１０μＭ範囲の標準曲線を作成し、両ＩｂｂおよびＩＶｂの基質（マトリックス）中で連続して希釈する。標準曲線を二等分し、サンプルで抽出し、分析順序の開始、中間および最後に注入する。標準曲線は、逆濃度１／ｘ^２加重の一次回帰に一致する。データおよびクロマトグラフィーピークを処理し、ＰＥビオシステムズ Analyst（登録商標）１．１を用い、標準および未知試料の濃度を定量する。

インビトロ方法：
（１）ＥＤＴＡ血液、血清および Tris-HCl 緩衝剤におけるＩｂｂの安定性
ラット、イヌ、サルおよびヒトの新しい血液および血清において、Ｉｂｂの安定性を実験する（ｎ＝２）。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson,Franklin Lakes,ＮＪ）を含有するバキュティナー（vacutainers）に、血液を収集する。抗凝固薬を含有しないバキュティナーに血清を収集する。Ｉｂｂを約１５μＭの出発濃度で、３７℃にて９０分間温置する。所定の時間で連続してサンプルを採取する。血液サンプルのアリコート（２００μＬ）を最初１００μＬの水と混合した後、４００μＬのアセトニトリルと混合する。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson,Franklin Lakes，ＮＪ）を含有するミクロティナーに、血清サンプル（５０μＬ）を加えた後、１００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みの両ＩｂｂおよびＩＶｂを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。
またＩｂｂの安定性も、上記に準じ Tris-HCl 緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中で評価する。

（２）ヒト胎盤ＡＬＰの存在下のＩｂｂの加水分解
Sigma（Ｐ−３８９５，St.Louis,ＭＯ）から、固体ヒト胎盤ＡＬＰを得る。Tris-HCl緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中、１０００ユニット／Ｌの溶液を調製する。連続希釈により、１００および１０ユニット／Ｌの溶液を得る。Ｉｂｂを１０、１００および１０００ユニット／Ｌ溶液（ｎ＝２）中、３７℃で２ｈｒ温置する。温置中のＩｂｂの出発濃度は１０μＭである。１００μＬサンプルのアリコートを所定時間で採取し、Ｋ_２ＥＤＴＡミクロティナーに加えた後、２００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みの両ＩｂｂおよびＩＶｂを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。

インビボ実験：
Ｋ_２ＥＤＴＡ（Beckton Dickinson,Franklin Lakes，ＮＪ）を含有するミクロティナーに、全ての血液サンプル（０．３ｍＬ）を収集し、氷片に置く。遠心分離後、血漿を分離し、分析まで−２０℃で貯蔵する。薬物動態実験のため、Ｉｂｂのモノリシン塩（型３）を使用する。Ｉｂｂの投与溶液を、殺菌水（イヌおよびサルにおけるＩＶ投与用）または蒸留水（他の全ての投与用）中で調製する。

（１）ラットにおけるインビボ実験
頸静脈にカニューレを埋没させた雄スプラーグ−ダウレイラット（３００−３５０ｇ、Hilltop Lab Animals Inc.,Scottsdale,ＰＡ）を用いる。ＰＯ薬物動態実験でラットを一夜断食させる。頸静脈から血液サンプルを収集する。
ＩＶ実験において、Ｉｂｂをボーラスとして１．３ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．０ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で、０．５分にわたってデリバリーする（ｎ＝３）。投与溶液の濃度は１．３ｍｇ／ｍＬで、投与容量は１ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験において、Ｉｂｂを経口胃管により、６．６ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または５．２ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で投与する（ｎ＝３）。投与溶液の濃度は１．３ｍｇ／ｍＬで、投与用量は５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（２）イヌにおけるインビボ実験
雄ビーグル犬（１０±０．７８ｋｇ、Marshall Farms ＵＳＡ Inc.,North Rose,ＮＹ）において、ＩｂｂのＩＶおよびＰＯ実験を行なう。各実験で３匹のイヌを使用する。３匹の内、両ＩＶおよびＰＯ実験に２匹の同じイヌを使用する。ＩＶとＰＯ実験間に、２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験において、Ｉｂｂを頭部静脈を介して、１．３ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．０ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で、０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度で５分にわたって注入する。投与溶液の濃度は２．６ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して大腿動脈から血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験において、イヌに投与前一夜断食させる。Ｉｂｂを経口胃管により、７．０ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または５．６ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で投与する。投与溶液の濃度は７．０ｍｇ／ｍＬで、投与容量は１ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（３）サルにおけるインビボ実験
雄カニクイザル（９．９±２．４ｋｇ、Charles River Biomedical Research Foundation,Houston,ＴＸ）において、ＩｂｂのＩＶおよびＰＯ実験を、クロスオーバー型式で行なう。ＩＶとＰＯ実験間に、２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験において、Ｉｂｂを大腿静脈を介して、１．３ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．１ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度にて、５分にわたり注入する。投与溶液の濃度は２．７ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して大腿動脈から血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験において、サルに投与前一夜断食させる。Ｉｂｂを経口胃管により、５．８ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または４．７ｍｇ／ｋｇのＩＶｂ当量）で投与する。投与溶液の濃度は５．８ｍｇ／ｍＬで、投与容量は１ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈｒ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（４）データ分析
全ての結果は、特に他に明記されていない限り、平均値±ＳＤで表示する。
ＫＩＮＥＴＩＣＡ（登録商標）ソフトウェアプログラム（バージョン４．０．２、InnaPhase Co.,フィラデルフィア，ＰＡ）を用い、Non-Compartmental Aalysis により、ＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーターを算定する。ＣｍａｘおよびＴｍａｘ値は、実験観測から直接記録する。混合対数−直線台形加法（mixed log-linear trapezoidal summations）を用いて、ＡＵＣ_０−ｎおよびＡＵＣ_ｔｏｔ値を算定する。トータル体内クリアランス（Ｃｌ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および分布の定常状態容量（Ｖｓｓ）も、静脈内投与後に算定する。経口投与後と静脈内投与後の用量−規定ＡＵＣの割合を計算することにより、絶対経口生物学的利用能（％で表示）が見積もられる。

肝細胞におけるＩｂｂのインビトロ内因性クリアランス（Ｃｌint）は：下式に従って算出する：

ここで、Rateは肝細胞における代謝の速度、およびＣ_Ｅは温置中のＩｂｂの濃度である。
Ｉｂｂのインビボ内因性肝クリアランス（Ｃｌint,in vivo）は、下式に従って算出する：

ここで、ｘはラット、イヌ、サルおよびヒトそれぞれの場合の、４０、３２、３０および２６ｇ肝／ｋｇ体重である（Davis および Morris，１９９３）。

肝クリアランスＣｌ_Ｈは、十分かきまぜたモデルを用い、下式から算出する：

ここで、Ｑｈはラット、イヌ、サルおよびヒトそれぞれの場合の肝臓血液流、５５、３１、４４および２１ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇである（Davis および Morris，１９９３）。
肝除去率（ＥＲ）は、下式に従って算出する：
ＥＲ＝Ｃｌ_Ｈ／Ｑｈ
統計的分析のため、スチューデントのｔ−testを用いる（Microsoft（登録商標）Excel,Redmond，ＷＡ）。
差は、Ｐ＜０．０５のレベルでの統計上有意と考えられる。

インビトロ実験：
ＥＤＴＡ血液、血清および Tris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩｂｂの安定性：
分析アッセイ確認の一部として、ＡＬＰの阻害薬であることが知られている、ＥＤＴＡを含有する血液において、Ｉｂｂの安定性を実験する（Bowers Jr.および McComb,１９６６；Yora および Sakagishi，１９８６）。３７℃で９０分間の温置後、ＥＤＴＡ含有のおよび Tris−ＨＣｌ緩衝剤の存在下の血液中、ＩｂｂからＩＶｂの変換率は２％以下である（下記表３０および３１）。３７℃で観測される上記小さな変換率は、サンプル貯蔵条件（−２０℃）下の変換が見込みのないことを示す。従って、Ｉｂｂの分析中では、ＩＶｂへの比較的最小限の ex vivo 変換が予想される。

表３０：ラット、イヌおよびサルの新しいＥＤＴＡ血液におけるＩｂｂの安定性

＊）Ｉｂｂの出発濃度での形成割合

表３１：ヒトの新しいＥＤＴＡ血液、および Tris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩｂｂの安定性

＊）Ｉｂｂの出発濃度での形成割合

体循環におけるＩｂｂの加水分解を調べるため、Ｉｂｂを新しい血清中（ラット、イヌ、サルおよびヒト）、３７℃で９０分間温置する。加水分解の速度は、サル血清が最も急速で、次いでヒト、イヌおよびラット血清の順である（表３）。ＩｂｂからＩＶｂの変換は、化学量論に近い。
血清は組織と比較して、低いＡＬＰ活性を有する（McComb ら，１９７９ａ）。加えて、血清はまた、血管を介する酸素漏出の結果、組織源、たとえば骨、肝臓および腸と同じＡＬＰイソフォームを含有する（Moss，１９８３）。従って、血清におけるＩｂｂの加水分解はたぶん、ＡＬＰの多様なイソフォームによって仲介されるだろう。

表３２：ラット、イヌ、サルおよびヒトの新しい血清におけるＩｂｂの安定性

＊）Ｉｂｂの消失として算出
＊＊）半減期は温置期間より長い

ヒト胎盤ＡＬＰの存在下のＩｂｂの加水分解：
精製形態のヒトＡＬＰにおいてＩｂｂの加水分解を実験（検討）するため、ヒト胎盤ＡＬＰ（１０、１００および１０００ユニット／Ｌ）を含有する溶液と共に、Ｉｂｂを３７℃で温置する（２ｈｒ）。Ｉｂｂの消失ｔ_１／２を測定する（表４）。予想通り、加水分解の速度は、溶液中のＡＬＰ活性が高い方が速い。またこれに応じてＩＶｂが形成する（図１４）。このことは、Ｉｂｂがヒトから得られるＡＬＰによって加水分解され、ＩＶｂを形成することを示す。

表３３：ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｂｂの安定性

注）Ｉｂｂを１０μＭの出発濃度で３７℃にて１２０分間温置する。

インビボ実験：
ラットにおけるインビボ実験：
ＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のラットにおけるＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーターを、下記表３４に要約する。血漿濃度対時間ブロフィールは、図１５に示される。比較のため、ラットにおけるＩＶｂの薬物動態実験の経過データも示す。

ＩＶ投与後のＩｂｂのトータル体内クリアランス（Ｃｌ）は、１９ｍＬ／分／ｋｇで、これは、Ｉｂｂがラットにおける低乃至中のクリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後の排泄半減期（ｔ_１／２）および平均滞留時間（ＭＲＴ）はそれぞれ、０．１８ｈｒおよび０．０７９ｈｒである。Ｉｂｂは２ｈｒ過ぎて検出されず。Ｉｂｂの定常状態の分布容量（Ｖｓｓ）は０．１０Ｌ／ｋｇで、これは、非常に限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩｂｂからＩＶｂの形成は急速であり；最初の２分のサンプリング時点でＩＶｂが検出される（データは示さず）。Ｉｂｂから形成されるＩＶｂと経過ＩＶｂ実験から形成されるＩＶｂのＩＶＡＵＣ比は、０．６２（完全変換の理論値＝１）であり、これは、ＩＶ投与後のラットにおけるＩｂｂからＩＶｂの満足な変換を示す。

経口投与後の血漿において（０．２５および０．５ｈｒ）、Ｉｂｂが検出される（＜１０ｎＭ）。Ｉｂｂの経口投与後のＩＶｂの Tmax は０．８３ｈｒであり、これはＩＶｂの経過 Tmax ４．７ｈより短かく、プロドラッグの経口投与後のＩＶｂの急速な吸収を示す。プロドラッグからのＩＶｂの急速な吸収は、Ｉｂｂの良好な水溶解性並びに腸内にＩＶｂを形成するＩｂｂの急速な加水分解の結果と思われる。ＩｂｂからのＩＶｂの絶対経口生物学的利用能は５０％で、経過ＩＶｂ値の６０％に類似する（表３４）。さらに、Ｉｂｂラット経口用量漸増実験によるＩＶｂの暴露量は、ＩＶｂの経過データと比較して優れている（表３１および図１４）。

表３４：ラットにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）

ＮＡ：適用不可、ＮＤ：検出せず（＜５ｎＭ）
＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｂＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれのＩＶｂ投与後のＩＶｂＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｂの経過ＩＶデータから算出

イヌにおけるインビボ実験：
ＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のイヌにおけるＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーターを、下記表３５に要約する。血漿濃度対時間プロフィールは、図１６に示される。比較のため、イヌにおけるＩＶｂの薬物動態実験の経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩｂｂのＣｌは２７ｍＬ／分／ｋｇで、これは、イヌにおける肝臓血液流の３１ｍＬ／分／ｋｇに類似し、Ｉｂｂがイヌにおいて高いクリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後のｔ_１／２およびＭＲＴはそれぞれ、０．８３ｈｒおよび０．２１ｈｒである。ＭＲＴは、血漿におけるＩｂｂの持続時間の理想的な概算を反映し、何故なら、終末相でのＩｂｂの血漿濃度が低い（図３）からである。Ｉｂｂは４ｈｒを過ぎて検出されない。ＩｂｂのＶｓｓは０．３５Ｌ／ｋｇで、これは限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩｂｂからＩＶｂの形成は急速であり；最初の５分のサンプリング時点でＩＶｂが検出される（データは示さず）。Ｉｂｂから形成されるＩＶｂと経過ＩＶｂ実験から形成されるＩＶｂとＩＶＡＵＣ比は１．６で、これは、ＩＶ投与後のイヌにおけるＩｂｂからＩＶｂの完全変換を示唆する。

Ｉｂｂは、経口投与後血漿サンプルにおいて、早い時点で（１匹のイヌで２ｈｒ以内）検出される（Cmax＝０．０３４ｎＭ）。Ｉｂｂの経口投与後のＩＶｂの Tmax は０．４０ｈｒであり、これは、ＩＶｂの経過 Tmax ０．５０ｈｒに類似する。ＩｂｂからのＩＶｂの絶対経口生物学的利用能は３１０％であり、これは、経過ＩＶｂデータの１７９％に類似する。さらに、Ｉｂｂイヌ許容性実験（用量漸増）によるＩＶｂの暴露量は、ＩＶｂの経過データと比較すると多い（表３１および図１５）。
Ｉｂｂから形成されるＩＶｂの、終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶｂプロフィールに類似する（図１６）。

表３５：イヌにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）

＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｂＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれのＩＶｂ投与後ＩＶｂＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｂの経過ＩＶデータから算出

サルにおけるインビボ実験：
ＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のサルにおけるＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーターを、下記表３６に要約する。血漿濃度対時間プロフィールは、図１７に示される。比較のため、サルにおける薬物動態実験による経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩｂｂのＣｌは２８ｍＬ／分／ｋｇであり、これは、Ｉｂｂがサルにおいて中乃至高いクリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後のｔ_１／２およびＭＲＴはそれぞれ、０．１０ｈｒおよび０．０９３ｈｒである。ＩｂｂのＶｓｓは０．１５Ｌ／ｋｇであり、非常に限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩｂｂからＩＶｂの形成は急速であり；最初の５分のサンプリング時点でＩＶｂが検出される（データは示さず）。Ｉｂｂから形成されるＩＶｂと経過ＩＶｂ実験から形成されるＩＶｂのＩＶＡＵＣ比は１．７で、これは、ＩＶ投与後のサルにおけるＩｂｂからＩＶｂの完全な変換を示唆する。

経口投与後のいずれの血漿サンプルにも、Ｉｂｂは検出されない（ＬＬＱ＝５ｎＭ）。Ｉｂｂの経口投与後のＩＶｂの Tmax は１．５ｈｒで、これはＩＶｂの経過 Tmax ２．５ｈに類似する。ＩｂｂからＩＶｂの絶対経口生物学的利用能は１８７％であり、これは、経過ＩＶｂデータの４９％より高い（表３６）。
Ｉｂｂから形成されるＩＶｂの、終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶｂプロフィールに類似する（図１７）。

表３６：サルにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｂＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれのＩＶｂ投与後のＩＶｂＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｂの経過ＩＶデータから算出

プロフィーリング・セクション３：
プロドラッグＩｃｂを用いる追加実験：
ＣＤラットにおける単一用量毒物動態許容性実験：
プロドラッグＩｃｂ（ジナトリウム塩）を用い、ラットにおける１日経口毒物動態実験を行なう。３匹雄ラット／グループに対し、ビヒクルとして水を用い（溶液処方）、Ｉｃｂを経口胃管により、５、２５および２００ｍｇ／ｋｇ（遊離酸）の投与量で投与する。プロドラッグ遊離酸の投与量はそれぞれ、４．５、２１および１６３ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ（親）モル当量投与量に相当する。評価のエンドポイントは、個々のラットにおけるＩｃｂおよびＩＶｃの血漿毒物動態である。
平均毒物動態値を、下記表３７に記す。

表３７：単一経口用量として＜２００ｍｇ／ｋｇのＩｃｂを与えた雄ラットにおけるＩｃｂおよびＩＶｃの平均毒物動態値

数値は、Ｉｃｂデータの場合３匹ラット／グループのおよびＩＶｃデータの場合３匹ラット／グループの平均値を示す。
１）ゼロから∞までのＡＵＣ
２）ゼロから２４ｈまでのＡＵＣ

ＩＶｃ（親）の平均最大血漿濃度（Cmax）は、投与後〜１．７時間以内で得られる。＜２６７ｍｇ／ｋｇのＩｃｂを与えたラットにおいて、ＩＶｃのＡＵＣ増はほぼＩｃｂ用量に比例し、そして２５〜２００ｍｇ／ｋｇのＩｃｂ間で、Cmaxは決して用量に比例せずに増加する。＜２５ｍｇ／ｋｇのＩｃｂを与えたラットの血漿には、Ｉｃｂは検出されず、２００ｍｇ／ｋｇのＩｃｂを与えたラットの血漿では、二・三の時点で極めて低濃度（〜０．０２−０．０４μＭ）が検出される。

ＩＶｃ（１）またはＩｃｂを与えたラットで得られるＩＶｃＡＵＣの比較は、図１８に示される。
ＩＶｃのＡＵＣは、低投与量（たとえば＜２５ｍｇ／ｋｇ）の親またはプロドラッグの投与後に類似するが、それは、両者共溶液（親の場合ＰＥＧ−４００／エタノール／０．１Ｎ−ＮａＯＨおよびプロドラッグの場合水）で処方できるからであり、しかし、高い投与量では（たとえば２００ｍｇ／ｋｇ）、中性の親は懸濁液でしか処方できないのに対し、プロドラッグ塩は、水溶液で処方でき、ＩＶｃの優れた暴露を付与する。

イヌにおける単一用量毒物動態および許容性実験：
プロドラッグＩｃｂ（モノトロメタミン塩）の投与量２５、９２または２５０ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、それぞれ２０、７５または２０３ｍｇ／ｋｇの親ＩＶｃに対するモル当量）での許容性と、ＩｃｂおよびＩＶｃ（２）の毒物動態を評価するため、二段実験を行なう。１日目（day１）、Ｉｃｂを乾燥充填カプセルにて、１匹イヌ／性別／グループに対して上記投与量で１日１回投与する。実験中投与と投与間に１週間の洗浄期間を採用する。８日目（day８）、Ｉｃｂを１匹イヌ／性別／グループに対し、水溶液で２５ｍｇ／ｋｇにて１日１回または乾燥充填カプセルにて４６もしくは１２５ｍｇ／ｋｇＢＩＤで１日２回投与する。エンドポイントは、臨床徴候、体重、食物消費、血清化学、血液学およびＩｃｂおよびＩＶｃの血漿毒物動態である。
個々のイヌの血漿毒物動態値を、下記表３８に示す。

表３８：＜２５０ｍｇ／ｋｇのＩｃｂを与えたイヌにおけるＩＶｃの毒物動態値

１）１日目は乾燥充填カプセルで処方し、８日目は水溶液で処方する（両日共ＱＤ投与）
２）１日目は９２ｍｇ／ｋｇＱＤで、８日目は４６ｍｇ／ｋｇＢＩＤで；両日共乾燥充填カプセルで処方
３）１日目は２５０ｍｇ／ｋｇＱＤで、８日目は１２５ｍｇ／ｋｇＢＩＤで；両日共乾燥充填カプセルで処方
４）投与の２時間以内に嘔吐が見られ、カプセル残物があり
５）投与の２時間以内に嘔吐が見られ、カプセル残物なし

１日目および８日目に、幾つかの血漿サンプルに低レベル（＜０．１μＭ）のＩｃｂが検出される。ＱＤ投与の場合投与の１−２時間後に、およびＢＩＤ投与の場合第二投与の１−２時間後に、ＩＶｃの平均最大血漿濃度（Cmax）が得られる。２５ｍｇ／ｋｇＱＤでは、Ｉｃｂを乾燥充填カプセルにてあるいは水溶液で投与すると、同等な Cmax およびＡＵＣが観測される。１日目、＞９２ｍｇ／ｋｇＱＤを与えたイヌ（３１０１Ｍ、４１０１Ｍおよび４２０１Ｆ）において、投与の約１−１．２５時間後に、嘔吐（白色または褐色、カプセル残物を含む赤色で縞状）が見られ、これはたぶん、９２〜２５０ｍｇ／ｋｇ間でフラットな暴露に寄与すると思われる。８日目、１２５ｍｇ／ｋｇＢＩＤを与えた両イヌにおいて、投与の２時間以内に嘔吐が見られるが、結果は異なる。４１０１Ｍ動物は、嘔吐に拘らず、吐物にカプセル残物が無いのに一致する実質的な暴露を有する。

１日目と８日目の幾つかの血漿サンプルに、わずか低レベル（＜０．１μＭ）のＩｃｂが検出される。
嘔吐を除いて観測される臨床徴候はなく、また体重や食物消費量に関する影響もない。
イヌに見られる嘔吐に拘らず、ＩＶｃを与えたイヌよりもＩｃｂを与えたイヌの方が、高いＩＶｃＡＵＣが見られる。ＩｃｂまたはＩＶｃ（３，４）を与えたイヌにおいて得られるＩＶｃＡＵＣの比較は、図１９に示される。

ビヒクルおよび処方：
KeyＰＫおよび安全性実験に用いる処方の概要：
ＰＯおよびＩＶ投与に水溶液を用い、ラット、イヌおよびサルにおける全てのインビボＰＫ実験を行なう。イヌにおける予備ＥＣＮ毒物学実験は、２０ｍｇ／ｋｇＩＶｃ当量用量で調製した水溶液でおよびカプセル処方の薬物として２０、７５および２０３ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ当量の用量で行なう。
ラット経口用量漸増実験において、Ｉｃｂ−０３を水溶液で、４．５、２１および１６３ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ当量の用量にて投与する。プロドラッグＩｃｂの経口投与後、親化合物ＩＶｃのＡＵＣおよび Cmax において、ＩＶｃ経口投与後の経過データと比較してかなりの改善が観測される。

代謝および薬物動態の概要：
知見と解釈の概要：
Ｉｃｂは、ＩＶｃのＮ−ヒドロキシメチルアダクトのホスフェートプロドラッグであって、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）によって加水分解され、ＩＶｃを形成する。従って、Ｉｃｂの動物への投与後、公知ＡＬＰ阻害薬のＥＤＴＡの存在下で収集した血液から、血漿サンプルを用意する。ＩｃｂからＩＶｃの変換率は、ＥＤＴＡ含有の血液（ラット、イヌ、サルおよびヒト）で最小である（＜２％）。サンプル貯蔵（−２０℃）およびＩｃｂの分析中で、Ｉｃｂの有意な ex vivo 変換は予想されない。

動物およびヒトのインビトロシステムにおいて、Ｉｃｂの加水分解を実験する。多様なＡＬＰイソフォームは、種々の組織に広く分布するので、インビトロ／インビボ相関の定量は試みない（Fishman ら，１９６８；Komoda ら，１９８１；Moss，１９８３；Yora および Sakagishi，１９８６；Sumikawa ら，１９９０）。従って、実験は種々の組織におけるＡＬＰ−依存加水分解の定性評価に限定される。Ｉｃｂは、血清（ラット、イヌ、サルおよびヒト）、肝細胞（ラット、イヌおよびヒト）の存在下並びにヒト胎盤ＡＬＰ中で加水分解される。サルの肝細胞では、ターンオーバーは見られない。ＩｃｂからＩＶｃの変換は、化学量論に近い。血清における加水分解に基づき、Ｉｃｂのたん白質結合を測定できない。

ラット、イヌおよびサルにおいて、ＩｃｂのＩＶ投与後ＩＶｃが急速に形成する。ＩＶＡＵＣ変換比は、ラットで１．０、イヌで０．６７およびサルで０．９０であり、これは、ＩｃｂからＩＶｃの良好な変換を示唆する。
ラット、イヌおよびサルにおいて、Ｉｃｂの投与後ＩＶｃの良好な生物学的利用能（８０−１２２％）が観測される。より有意には、Ｉｃｂの高い水溶解性は、一定用量以下のＩＶｃの溶解速度制限吸収を少なくし、これにより、経過ＩＶｃ実験による暴露量と比較して、経口用量漸増および毒物動態実験におけるＩＶｃの暴露量を増加する。

方法：
この報告で記載の実験には、他に特に言及がない限り、Ｉｃｂのモノトロメタミン塩を使用する。
ＩｃｂおよびＩＶｃのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量測定：
動物薬物動態実験からの血漿サンプル中並びにインビトロ温置実験からのアセトニトリル上澄み中の、ＩｃｂおよびＩＶｃの分析のため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を行なう。血漿での分析のため、Packard Multiprobe 器具を用いて、５０μＬの各標準、ＱＣおよび血漿サンプルを、たん白質沈殿抽出用のきれいな９６ウェルプレートに移す。下記の内部標準，化合物Ｘを含有する２００μＬのアセトニトリルの添加後、サンプルを渦混合し、１０分間の遠心分離により、得られる上澄みを沈殿たん白質から分離する。

インビトロ実験から生成する上澄みの分析のため、同容量の上澄みと、内部標準含有のアセトニトリルとを混合する。Tomtec自動化液体ハンドラーを用い、上記上澄みのアリコートを第二のきれいな９６ウェルプレートに移す。同容量の水を加え、プレートにふたをかぶせ、渦混合する。

４−メトキシ−３−（２−オキソ−２−（４−（キナゾリン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジン−７−カルボキサミド

ＨＰＬＣシステムは、Shimadzu ＬＣ１０ＡＤｖｐポンプ（Columbia，ＭＤ）、およびPhenomenex Synergi Fusion−ＲＰ分析カラム（２．０×５０ｍｍ、５μ；Torrance，ＣＡ）に連結したＨＴＣＰＡＬオートサンプラー（Leap Technologies,Cary,ＮＣ）から成る。移動相Ａは、水中の５ｍＭギ酸アンモニウムから成り；移動相Ｂは１００％アセトニトリルである。ＬＣ流速は０．４ｍＬ／分である。最初の移動相組成は３％Ｂであって、１．７５分にわたり６０％Ｂへの勾配をなし、０．５分間保持し、０．１分にわたり１００％Ｂへの勾配をなし、０．５分保持し、次に０．１分にわたり最初の条件に戻り、再度平衡状態になる。トータル分析時間は、４．０分である。Ｉｃｂ、ＩＶｃおよび化合物Ｘの保持時間はそれぞれ、１．２、１．７および１．６分である。

ターボイオンスプレー供給源セットを備えた Sciex ＡＰＩ４０００三重四極子質量分析計（トロント，カナダ）に、ＨＰＬＣシステムを５５０℃で連動させ、イオンスプレー電圧を４．５ｋＶにセットする。薬液噴霧および補助ガスとして、ＵＨＰ窒素をそれぞれ、８０ｐｓｉの圧力および７Ｌ／分で使用する。Ｉｃｂ、ＩＶｃおよび化合物Ｘの衝突エネルギーはそれぞれ、２３、２９および３７ボルトである。データ取得に、選択反応制御（ＳＲＭ）を利用する。Ｉｃｂ、ＩＶｃおよび内部標準の陽イオンモード（Ｍ＋Ｈ）^＋種を表わすイオンをＭＳ１で選択し、窒素で衝突解離し、衝突エネルギーを最適化して固有プロダクトイオンを形成し、次いでＭＳ２で監視する。Ｉｃｂ、ＩＶｃおよび化合物ＸのＳＲＭ変化はそれぞれ、ｍ／ｚ５８４→４８６、４７４→２５６および４６０→２１８である。

ストック溶液から、５ｎＭから１０μＭの標準曲線を調製し、両ＩｃｂおよびＩＶｃに対し基質にて連続的に希釈する。標準曲線を二重アリコートに分け、サンプルで抽出し、次いで分析順序の開始、中間および最後に注入する。標準曲線は、逆濃度１／ｘ^２加重の一次回帰に一致する。データおよびクロマトグラフィー・ピークを処理し、PE Biosystems Analyst（登録商標）１．１を用いて、標準および未知試料の濃度を定量する。

インビトロ方法：
（１）ＥＤＴＡ血液、血清およびTris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩｃｂの安定性
ラット、イヌ、サルおよびヒト（ｎ＝２）の新しい血液および血清におけるＩｃｂの安定性を実験する。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を含有するバキュティナーに、血液を収集する。血清は、抗凝固薬を含有しないバキュティナーに収集する。Ｉｃｂを約１０μＭの出発濃度で、３７℃にて９０分間温置する。所定の時間でサンプルを連続して採取する。血液サンプルのアリコート（２００μＬ）を最初に１００μＬの水と混合した後、４００μＬのアセトニトリルと混合する。Ｋ_２ＥＤＴＡ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を含有する、ミクロティナーに、血清サンプル（５０μＬ）を加えた後、１００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みを両ＩｃｂおよびＩＶｃに関して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。
また上記に準じ、Tris−ＨＣｌ緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中で、Ｉｃｂの安定性を評価する。

（２）ヒト胎盤ＡＬＰの存在下でＩｃｂの加水分解
Sigma（P-3895、St. Louis, MO）から、固体のヒト胎盤ＡＬＰを得る。Tris−ＨＣｌ緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中、１０００ユニット／Ｌの溶液を調製する。連続希釈で、１００および１０ユニット／Ｌの溶液を得る。Ｉｃｂを１０、１００および１０００ユニット／Ｌ溶液（ｎ＝２）中で、３７℃にて２ｈ温置する。温置でのＩｃｂの出発濃度は、１０μＭである。所定の時間で１００μＬサンプルのアリコートを採取し、Ｋ_２ＥＤＴＡミクロティナーに加えた後、２００μＬのアセトニトリルを加える。上澄みを両ＩｃｂおよびＩＶｃに関して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。

（１）ラットでのインビボ実験
頸静脈にカニューレを埋没させた、雄スプラーグ−ダウレイラット（３００〜３５０ｇ、Hilltop Lab animals Inc., Scottsdale, PA）を使用する。ＰＯ薬物動態実験では、ラットを一夜断食させる。頸静脈から血液サンプルを収集する。
ＩＶ実験において、Ｉｃｂを０．５分にわたりボーラスで（ｎ＝３）、１．４ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．１ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）にてデリバリーする。投与溶液の濃度は１．４ｍｇ／ｍＬで、投与容量は１ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の２、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験では、Ｉｃｂを経口胃管により（ｎ＝３）、６．９ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または５．６ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）で投与する。投与溶液の濃度は１．４ｍｇ／ｍＬで、投与容量は５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（２）イヌにおけるインビボ実験
３匹の雄ビーグル犬（１２±２．８ｋｇ、Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY）において、ＩｃｂのＩＶおよびＰＯ実験を、クロスオーバー型式で行なう。ＩＶとＰＯの実験間に、２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験では、頭部静脈を介して１．３ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．０ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）で、５分にわたり０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度にて注入する。投与溶液の濃度は２．６ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、大腿動脈から連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験では、イヌを投与前に一夜断食させる。Ｉｃｂを経口胃管により、６．０ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または４．９ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）で投与する。投与溶液の濃度は１２ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（３）サルにおけるインビボ実験
３匹の雄カニクイザル（１０±１．６ｋｇ、Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX）において、ＩｃｂのＩＶおよびＰＯ実験を、クロスオーバー型式で行なう。ＩＶとＰＯの実験間に２週間の洗浄期間を設ける。
ＩＶ実験では、Ｉｃｂを大腿静脈を介して１．４ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または１．１ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）で、５分にわたり０．１ｍＬ／ｋｇ／分の一定速度にて注入する。投与溶液の濃度は２．８ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、大腿動脈から連続して血液サンプルを収集する。
ＰＯ実験では、サルに投与前一夜断食させる。Ｉｃｂを経口胃管により、４．９ｍｇ／ｋｇ（遊離酸、または４．０ｍｇ／ｋｇのＩＶｃ相当）で投与する。投与溶液の濃度は９．８ｍｇ／ｍＬで、投与容量は０．５ｍＬ／ｋｇである。投与前と投与の１５、３０、４５分、１、２、４、６、８および２４ｈ後に、連続して血液サンプルを収集する。

（４）データ分析
全ての結果は、特別に明記されていない限り、平均値±ＳＤで表示する。
ＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーターは、ＫＩＮＥＴＩＣＡ（登録商標）ソフトウェア・プログラム（バージョン４．０．２、InnaPhase Co., フィラデルフィア，PA）を用いるNon−Compartmental Analysisで算定する。Ｃ_ｍａｘおよびＴ_ｍａｘ値は、実験観測から直接記録する。ＡＵＣ_ｏ−ｎおよびＡＵＣ_ｔｏｔ値は、混合対数−直線台形加法を用いて算定する。また総体内クリアランス（Ｃｌ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および分布の定常状態容量（Ｖｓｓ）は、静脈内投与後に算定する。絶対経口生物学的利用能（％で表示）は、経口投与後の用量−正規ＡＵＣ値と静脈内投与後の該値の比を計算することにより見積もられる。

肝細胞におけるＩｃｂのインビトロ内因性クリアランス（Cl int）を、下式に従って算出する：

ここで、Rate は肝細胞における代謝速度（pmol／min／ミリオン細胞）、およびＣ_Ｅは温置中のＩｃｂの濃度である。
Ｉｃｂのインビボ内因性肝クリアランス（Cl int, in vivo）は、下式に従って算出する：

ここで、ｘはラット、イヌ、サルおよびヒトの場合のそれぞれ、４０、３２、３０および２６ｇ肝臓／Kg体重である（Davis および Morris , １９９３）。

インビトロ実験：
ＥＤＴＡ血液、血清およびTris−ＨＣｌ緩衝剤におけるＩｃｂの安定性：
分析アッセイ確認の一部として、アルカリ性ホスファターゼの阻害薬であることが知られている、ＥＤＴＡを含有する血液において、Ｉｃｂの安定性を実験する（Bowers, Jr. およびMcComb, 1966；YoraおよびSakagishi, 1986）。３７℃で９０分間の温置後、ＥＤＴＡを含有し、Tris−ＨＣｌ緩衝剤存在下の血液中のＩｃｂからＩＶｃへの変換率は２％以下である（表３９および４０）。−２０℃のサンプル貯蔵条件下では、上記３７℃で観測した小さな変換率が、Ｉｃｂの分析中に有意な ex vivo 変換をもたらすとは予測されない。

表３９：ラット、イヌおよびサルの新しいＥＤＴＡ血液におけるＩｃｂの安定性

＊）Ｉｃｂの出発濃度での形成割合

表４０：ヒトの新しいＥＤＴＡ血液およびＴris−ＨＣl 緩衝剤におけるＩｃｂの安定性

＊）Ｉｃｂの出発濃度での形成割合

体循環におけるＩｃｂの加水分解を調べるため、Ｉｃｂを新しい血清（ラット、イヌ、サルおよびヒト）中、３７℃で９０分間温置する。加水分解の速度は、サル血清中が最も迅速で、続いてラット、ヒトおよびイヌ血清の順である（下記表４１）。ＩｃｂからＩＶｃの変換率は、化学量論に近い。
血清は、組織と比較して低いＡＬＰ活性を有する（McCombら，1979a）。加えて、血清は組織源、たとえば骨、肝臓および腸と同じＡＬＰイソフォームを含有し、該ＡＬＰイソフォームの特性は、血管を介しての漏出である（Moss, 1983）。従って、血清におけるＩｃｂの加水分解はたぶん、ＡＬＰの多様なイソフォームに仲介されると思われる。

表４１：ラット、イヌ、サルおよびヒトの新しい血清におけるＩｃｂの安定性

＊）Ｉｃｂの消失として算出
＊＊）半減期は、温置期間より長い

ヒト胎盤ＡＬＰの存在下のＩｃｂの加水分解：
ヒトＡＬＰの精製形状においてＩｃｂの加水分解を実験するため、Ｉｃｂを１０、１００および１０００ユニット／Ｌのヒト胎盤ＡＬＰ溶液中、３７℃で２ｈ温置する。Ｉｃｂの消失ｔ_1/2 を測定し、下記表４２に記録する。予想通り、加水分解の速度は、ＡＬＰ活性の高い溶液の方が速い。またＩＶｃも、それに応じて形成する（図２０）。これによって、Ｉｃｂはヒトから得られるＡＬＰにより加水分解され、ＩＶｃを形成することが認められる。

表４２：ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｃｂの加水分解

注：Ｉｃｂを１０μＭの出発濃度で、３７℃にて１２０分間温置する。
ラットにおけるインビボ実験：
ＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のラットにおけるＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーターを下記表４３に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図２１に示す。比較のため、ラットにおけるＩＶｃの薬物動態実験の経過データも示す。

ＩＶ投与後のＩｃｂのトータル体内クリアランス（Ｃl）は４９mL／分／Kgで、Ｉｃｂがラットにおいて高いクリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後の排泄半減期（ｔ_1/2）および平均滞留時間（ＭＲＴ）はそれぞれ、０．０８４ｈおよび０．０７２ｈである。定常状態のＩｃｂの分布容量は０．２１Ｌ／Kgで、非常に限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩｃｂからのＩＶｃ形成は急速で；最初の２分のサンプリング時点で、ＩＶｃが検出される（データは示さず）。Ｉｃｂから形成されるＩＶｃと経過ＩＶｃ実験から形成されるＩＶｃのＩＶＡＵＣ比は１．０で（完全変換の理論値＝１）、ＩｃｂからＩＶｃの完全変換を示唆する。

経口投与後にいずれの血漿サンプルにもＩｃｂは検出せず、Ｉｃｂの経口投与後のＩＶｃのＴmaxは０．８０ｈで、これはＩＶｃの経過Ｔmax ４．０ｈより短く、プロドラッグの経口投与後のＩＶｃの急速な吸収を示す。プロドラッグからのＩＶｃの急速吸収は、Ｉｃｂの良好な水溶解性並びに腸内でＩＶｃを形成するＩｃｂの急速加水分解の結果と思われる。ＩｃｂからのＩＶｃの絶対経口生物学的利用能は８０％で、経過ＩＶｃ値８２％に類する（表４３）。さらに、Ｉｃｂラット経口用量漸増実験によるＩＶｃの暴露は、ＩＶｃの経過データに比し優れている（表３７および図１８）。
Ｉｃｂから形成されるＩＶｃの終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶｃプロフィールと同様である（図２１）。

表４３：ラットにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

ＮＡ：適用不可、ＮＤ：検出せず（＜５ｎＭ）
＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｃＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれのＩＶｃ投与後のＩＶｃＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｃの経過ＩＶデータから算出

イヌにおけるインビボ実験
ＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のイヌにおけるＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーターを、下記表４４に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図２２に示す。比較のため、イヌにおけるＩＶｃの薬物動態実験の経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩｃｂのＣlは、６４mL／分／Kgで、これはイヌにおける肝臓血液流３１mL／分／Kgよりもかなり高く、肝外加水分解および／または他のルートの排泄（たとえば腎排泄）の潜在的必要を示唆する。ＩＶ投与後のｔ_1/2 およびＭＲＴはそれぞれ、０．２５hrおよび０．１４hrである。Ｉｃｂは２hrを過ぎて検出されず、ＩｃｂのＶssは０．５０Ｌ／Kgで、組織分布の低い可能性を示唆する。ＩＶ投与後のＩｃｂからのＩＶｃの形成は急速であり；最初のサンプリングの５分の時点で、ＩＶｃが検出される（データは示さず）。Ｉｃｂから形成されるＩＶｃと経過ＩＶｃ実験から形成されるＩＶｃのＩＶＡＵＣ比は０．６７で、ＩＶ投与後のイヌにおけるＩｃｂからＩＶｃの適度の変換を示唆する。

いずれの血漿サンプル経口投与においても、Ｉｃｂは検出されず（ＬＬＱ＝５ｎＭ）。Ｉｃｂの経口投与後のＩＶｃのＴmax は０．５８hrで、これは、ＩＶｃの経過Ｔmax １．３hrより短かく、プロドラッグの経口投与後のＩＶｃの急速な吸収を示す。ＩｃｂからのＩＶｃの絶対経口生物学的利用能は１０４％で、経過ＩＶｃデータの８９％に類似する。さらに、Ｉｃｂイヌ許容性実験（用量漸増）によるＩＶｃの暴露量は、ＩＶｃの経過データと比較すると良好である（表４１および図２１）。
Ｉｃｂから形成されるＩＶｃの、終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶｃプロフィールに類似する（図２２）。

表４４：イヌにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｃＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれのＩＶｃ投与後のＩＶｃＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｃの経過ＩＶデータから算出

サルにおけるインビボ実験：
ＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のサルにおけるＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーターを、下記表４５に要約する。血漿濃度対時間プロフィールを、図２３に示す。比較のため、サルにおけるＩＶｃの薬物動態実験の経過データも示す。
ＩＶ投与後のＩｃｂのＣlは４７mL／分／Kgで、サルにおける肝臓血液流４４mL／分／Kgに類似し、これはＩｃｂがサルにおける高クリアランス化合物であることを示唆する。ＩＶ投与後のｔ_1/2 およびＭＲＴはそれぞれ、０．０８９hrおよび０．０９７hrである。ＩｃｂのＶssは０．２７Ｌ／Kgで、これは、限られた組織分布を示唆する。ＩＶ投与後のＩｃｂからのＩＶｃの形成は急速であり；最初のサンプリングの５分の時点でＩＶｃが検出される（データは示さず）。Ｉｃｂから形成されるＩＶｃと経過ＩＶｃ実験から形成されるＩＶｃのＩＶＡＵＣ比は０．９０で、これは、ＩｃｂからＩＶｃの良好な変換を示唆する。

Ｉｃｂは経口投与後、いずれの血漿サンプルで検出されず（ＬＬＱ＝５ｎＭ）。Ｉｃｂの経口投与後のＩＶｃのＴmax は０．９２hrで、これはＩＶｃの経過Ｔmax ２．３hrより短かく、プロドラッグの経口投与後のＩＶｃのより急速な吸収を示唆する。ＩｃｂからのＩＶｃの絶対経口生物学的利用能は１２２％で、経過ＩＶｃデータの６４％より高い（表４５）。
Ｉｃｂから形成されるＩＶｃの終末血漿濃度対時間プロフィールは、経過ＩＶｃプロフィールと同様である（図２３）。

表４５：サルにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの薬物動態パラメーター（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）

＊）該比は、プロドラッグ投与後のＩＶｃＡＵＣ／ＩＶおよびＰＯそれぞれの経口投与後のＩＶｃＡＵＣから算出する。
＊＊）ＩＶｃの経過ＩＶデータから算出

追加のプロフィーリング・セクション４：
プロドラッグＩｅを用いる追加実験：
他のプロドラッグで上記したものに類する方法を用い、ラットにプロドラッグＩｅを経口投与する。ＰＯ投与の後、親分子ＩＶｅが血漿中に検出される。
追加のプロフィーリング・セクション５：
プロドラッグＩｆを用いる追加実験：
他のプロドラッグで上記したものに類する方法を用い、ラットにプロドラッグＩｆを経口投与する。ＰＯ投与の後、親分子ＩＶｆが血漿中に検出される。

下記表４７は、追加プロフィーリング・セクション４および５に記載の、ラットにおける経口投与実験で得られるデータを示す。
表４７

血漿および他の組織におけるプロドラッグの検出に関する注意。いったん塩形状のプロドラッグを投与すると、体内で該塩のスクランブル（scrambling）が起こりうることが理解される。しかしながら、被験体動物モデルにおけるプロドラッグを定量するのに用いるアッセイは、分析によりホスフェートの遊離酸を検出する。このたとえばリシン塩Ｉａｂまたは遊離酸Ｉａｃの分析は、同種の分析と仮定され、検出される種が実際にリシン塩であると暗示する意図はない。この適用において、このきまりは、インビボ実験で得られるサンプルのみに適用される。

生物学
・“μＭ”はミクロモルを意味する。
・“ｍＬ”はミリリットルを意味する。
・“μＬ”はミクロリットルを意味する。
・“ｍｇ”はミリグラムを意味する。
・“ＤＭＳＯ”はジメチルスルホキシドを意味する。
プロドラッグからインビボで生成する親化合物の抗ＨＩＶ活性を検定するのに用いる物質や実験手順は、以下に記載される。

細胞：
・ヒトＴ細胞系ＭＴ−２およびＰＭ１（AIDS Research and Reference Reagent Program , National Institutes of Health）は、１０％ウシ胎児血清（FBS，Sigma,St. Louis , MO）を含有する培地 Medium ＲＰＭＩ−１６４０（Invitrogen , Carlsbad CA）に維持して、増殖させる。
ウイルス：
・Ｔ−親和性菌株ＬＡＩのＨＩＶ−１実験菌株は、ＡＩＤＳ Research and Reference
Reagent Program , National Institutes of Health を通じて入手する。これをＭＴ−２細胞で増幅し（amplified）、ウイルス収量（yield）アッセイ（２）を用いて滴定する。検出は、Scintillation Proximity 検出プロトコル（１）（Amersham Biosciences , Piscataway , NJ）の使用に適合する、逆トランスクリプターゼアッセイ（３）の使用によって行なう。

実験
１．化合物（コンパウンド、Compound）ストックを、ＤＭＳＯに３０ｍＭで溶解して調製する。希釈プレート（plates、平板）の場合、９６ウェルのポリプロピレンプレートを用い、化合物をＤＭＳＯに連続して３倍希釈し、この結果、濃度が最終アッセイ濃度の１００倍になる。抗ウイルスおよび細胞毒性アッセイの場合、１ウェル当り２μＬを加える（１％最終ＤＭＳＯ濃度）。
２．希釈プレートから、１０％ウシ胎児血清を含有する１００μＬ Medium ＲＰＭＩ−１６４０を含有する９６ウェル組織培養プレートに、化合物を＜２０μＭの濃度で加える。
３．抗ウイルスアッセイの場合、細胞を０．００５の感染多重度（multiplicity of
infection）で感染させる。３７℃で１ｈ後、感染した細胞を１０％ウシ胎児血清含有の Medium ＲＰＭＩ−１６４０中、２０００００細胞／ｍＬに希釈する。１ウェル当りこの溶液１００μＬを加えて、最終容量２００μＬを得る。

４．プレートを加湿ＣＯ_２恒温器中、３７℃で温置し、５日後に採収する。
５．上述の感染ウェルの上澄みの逆トランスクリプターゼ活性を測定することにより、ウイルス感染を監視する。各化合物の存在下で感染した細胞における読出しレベルを、化合物非存在下で感染した細胞に見られるそれの百分率として定量し、かかる測定値を１００から引くことにより、各化合物の阻害率を計算する。
６．ＥＣ_５０は、本発明化合物の抗ウイルス効力を比較する方法を付与する。Microsoft
Excel Xl フィット曲線適応のソフトウェアを用いて、阻害率５０％の有効濃度（ＥＣ_５０）を計算する。各化合物の場合、４パラメーター・ロジスティックモデル（モデル２０５）を用いることにより、８種の濃度で計算した阻害率％から曲線を生成する。化合物のＥＣ_５０データを、表４８に示す。

結果
ＥＤ_５０の生物学的データＫey

表４８：化合物ＩＶ（親分子）の抗ウイルス活性

プロドラッグ自体の抗ＨＩＶ活性は関連しない。何故なら、以下の実験で示されるように、親分子はインビボでプロドラッグから生成する、活性な成分であり、また血漿における主要な種であるからである。加えて、プロドラッグはインビトロアッセイにおいて、少なくとも限度までゆっくりと親に変換し、このため、抗ウイルスデータの解釈を複雑にするかもしれない。

細胞毒性
１．当該分野で周知の方法を用い、同じＭＴ−２細胞により細胞毒性アッセイを行なう。この方法は、文献（４）に記載されている。要するに、細胞を薬物の存在下、６日間温置し、その後、レドックス−活性染料還元アッセイを用い、細胞生存力を測定する。各ウェルに、５０μＬのＸＴＴ試薬（１mg／mLの２,３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、リン酸塩緩衝食塩水に溶解した１０μg／mLのフェナジンメトスルフェート）を加え、３時間温置する。活発に呼吸する細胞による色形成（color formation）を、プレート読取り機にて４５０nmで定量し、これを用いてＣＣ_５０を測定する。ＩＶａ、ＩＶｂ、ＩＶｃおよびＩＶｄ親分子のＣＣ_５０は、この方法で測定すると、１０μＭより大きい。細胞毒性データは第二のスクリーニングであって、該化合物が抗ウイルスアッセイで用いた細胞を非特異的には殺さないことを示し、かつ該化合物が抗ウイルス活性を有するという主張のさらなる裏付けを付与する。

すなわち、本発明によればさらに、ウイルス感染、たとえばＨＩＶ感染やＡＩＤＳを処置する方法および医薬組成物が提供される。この処置には、かかる処置を必要とする患者に対し、医薬用担体および治療上有効量の本発明化合物から成る医薬組成物を投与することが必要である。
医薬組成物は、経口投与しうる懸濁液または錠剤；鼻腔噴霧剤、殺菌注射用製剤、たとえば殺菌注射用水性もしくは油性懸濁液；または坐剤の形状であってよい。

懸濁液で経口投与するとき、これらの組成物は医薬処方の分野で周知の技法に従って調製され、そして、増量のための微結晶セルロース、沈殿防止剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および当該分野で公知の甘味剤および／またはフレーバーを含有してもよい。即時放出錠剤としてのこれらの組成物は、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、スターチ、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトースおよび／または当該分野で公知の他の賦形剤、結合剤、エキステンダー、崩壊剤、希釈剤および潤滑剤を含有してもよい。

注射用溶液または懸濁液は、公知の技法に従って、適当な非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤もしくは溶剤、たとえばマンニトール、１,３−ブタンジオール、水、リンゲル液もしくは等張性塩化ナトリウム溶液、または適当な分散もしくは湿潤および沈殿防止剤、たとえば殺菌性で刺激の少ない固定油（合成モノもしくはジグリセリドを包含）、および脂肪酸（オレイン酸を包含）を用いて処方されてよい。

本発明化合物はヒトに対して、分割用量にて１〜１００mg／Kg体重の投与量範囲で経口投与することができる。１つの好ましい投与量範囲は、分割経口用量の１〜１０mg／Kg体重である。他の好ましい投与量範囲は、分割経口用量の１〜２０mg／Kg体重と１〜３０mg／Kg体重である。しかしながら、個々の患者にとって特別な用量レベルおよび投与の回数は変化させてよく、また種々の要因、例えば使用される特定化合物の活性、該化合物の代謝安定性および作用長さ、患者の年令、体重、通常の健康状態、性別、食事規制、投与のモードおよび時間、排泄速度、薬物の組合せ、個々の病態のきびしさ、および宿主が受ける療法に左右されることが理解されよう。

化合物ＩＶａのヒト臨床試験におけるＡＵＣ対用量を示すグラフである。イヌ（図２Ａ）およびヒト（図２Ｂ）実験における断食および給餌条件下の化合物ＩＶａおよびプロドラッグＩａｂのＡＵＣを示すグラフである。ラットのＩＶｃ経口ＡＵＣ対用量プロットを示すグラフである。ラットのＩＶｃ経口Ｃmax 対用量プロットを示すグラフである。Ｉｃの経口投与後のラットにおけるＩＶｃの血漿プロフィールを示すグラフである。ＩＶａまたはＩａｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶａＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ＩＶａまたはＩａｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶａＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩａｂの加水分解およびＩＶａの形成を示すグラフである。ラットにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびラットにおけるＩＶａの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。イヌにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびイヌにおけるＩＶａの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。サルにおけるＩａｂのＩＶおよび経口投与後のＩａｂおよびＩＶａの、およびサルにおけるＩＶａの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。ＩＶｂまたはＩｂｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶｂＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ＩＶｂまたはＩｂｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶｂＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｂｂの加水分解およびＩＶｂの形成を示すグラフである。ラットにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびラットにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。イヌにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびイヌにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。サルにおけるＩｂｂのＩＶおよび経口投与後のＩｂｂおよびＩＶｂの、およびサルにおけるＩＶｂの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。ＩＶｃまたはＩｃｂのいずれかを与えた雄ラットにおけるＩＶｃＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ＩＶｃまたはＩｃｂのいずれかを与えたイヌにおけるＩＶｃＣmax およびＡＵＣの比較を示すグラフである。ヒト胎盤ＡＬＰ溶液におけるＩｃｂの加水分解およびＩＶｃの形成を示すグラフである。ラットにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびラットにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。イヌにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびイヌにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。サルにおけるＩｃｂのＩＶおよび経口投与後のＩｃｂおよびＩＶｃの、およびサルにおけるＩＶｃの経過データからの、血漿濃度対時間プロフィールを示すグラフである。

Claims

下式Ｉで示される化合物。

［式中、ＸはＣまたはＮ、但し、ＸがＮのとき、Ｒ^１は存在せず；
ＷはＣまたはＮ、但し、ＷがＮのとき、Ｒ^２は存在せず；
ＶはＣ；
Ｒ^１は水素、メトキシまたはハロゲン；
Ｒ^２は水素；
Ｒ^３はメトキシまたはヘテロアリールで、これらのそれぞれは独立して、必要に応じて下記Ｇから選ばれる置換基の１つで置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはトリアゾリル、ピラゾリルまたはオキサジアゾリル）；
Ｅは水素または医薬的に許容しうるモノもしくはジ塩；
Ｙは

からなる群から選ばれ；
Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の多くて２つがメチル；
Ｒ^１８はＣ（Ｏ）−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ピリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、アザベンゾフリルおよびアザインドリルからなる群から選ばれ、これらのそれぞれは独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよく；
Ｄはシアノ、Ｓ(Ｏ_２)Ｒ^２４、ハロゲン、Ｃ(Ｏ)ＮＲ^２１Ｒ^２２、フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、該フェニルまたはヘテロアリールは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３の同一もしくは異なる置換基で置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはピリジニルおよびオキサジアゾリルからなる群から選ばれる）；
Ａはフェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルからなる群から選ばれ、該フェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３つの同一もしくは異なる置換基で置換されてよく；
Ｇは（Ｃ_１−６）アルキル、（Ｃ_１−６）アルケニル、フェニル、ヒドロキシ、メトキシ、ハロゲン、−ＮＲ^２３Ｃ(Ｏ)−(Ｃ_１−６)アルキル、−ＮＲ^２４Ｒ^２５、−Ｓ(Ｏ)_２ＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＯＯＲ^２６および−ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５からなる群から選ばれ、該（Ｃ_１−６）アルキルは必要に応じて、ヒドロキシ、ジメチルアミノまたは１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンで置換されてよく；
Ｒ^２６は水素および（Ｃ_１−６）アルキルからなる群から選ばれ；
Ｒ^２０，Ｒ^２１，Ｒ^２２，Ｒ^２３，Ｒ^２４，Ｒ^２５はそれぞれ独立して、水素、（Ｃ_１−６）アルキルおよび−(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^２７Ｒ^２８からなる群から選ばれ；
ｎは０〜６；および
Ｒ^２７およびＲ^２８はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチルである］
Ｒ^１がメトキシまたはフルオロ；
Ｒ^１８がＣ（Ｏ）−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ピリジニル、イソキノリニル、キナゾリニルおよびフタラジニルからなる群から選ばれ、該イソキノリニル、キナゾリニルまたはフタラジニルが独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよく；
Ｄがシアノ、フェニルおびヘテロアリールからなる群から選ばれ（ここで、ヘテロアリールはピリジニルまたはオキサジアゾリル）、上記フェニルまたはヘテロアリールは独立して、必要に応じてＣ_１−６アルキル、トリフルオロメチル、メトキシおよびハロゲンからなる群から選ばれる１〜３つの同一もしくは異なる置換基で置換されてよく；
Ａがフェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルからなる群から選ばれ、該フェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルまたはオキサゾリルが独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいはメチル、ハロゲン、メトキシおよび−ＮＨ_２からなる群から選ばれる１〜３つの同一もしくは異なる置換基で置換されてよく；および
Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７がそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の最大で１つがメチルである請求項１に記載の化合物。
ＸおよびＷがそれぞれＮである請求項２に記載の化合物。
ＸがＣ；およびＷがＮである請求項２に記載の化合物。
Ｒ^１８が−Ｃ(Ｏ)−Ｐｈ；およびＹが

である請求項４に記載の化合物。
Ｒ^３がメトキシまたはトリアゾリルで、該トリアゾリルが必要に応じて、Ｇから選ばれる１つの置換基で置換されてよく；
Ｒ^１０−Ｒ^１７がそれぞれＨ；および
Ｇがメチルである請求項５に記載の化合物。
Ｒ^１がＦ；およびＲ^３がＮ−１位で結合する１，２，３−トリアゾリルである請求項６に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシ；およびＲ^３がＮ−１位で結合する３−メチル−１，２，４−トリアゾリルである請求項６に記載の化合物。
Ｒ^１およびＲ^３がそれぞれメトキシである請求項６に記載の化合物。
塩がナトリウム、リシンまたはトロメタミンである請求項６に記載の化合物。
請求項１に記載の式Ｉの化合物の抗ウイルス有効量、および医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤の１種以上から成る医薬組成物。
さらに、
（ａ）ＡＩＤＳ抗ウイルス剤；
（ｂ）抗感染剤；
（ｃ）免疫調節剤；および
（ｄ）ＨＩＶ進入阻害薬
からなる群から選ばれるＡＩＤＳ処置剤の抗ウイルス有効量を含有し、ＨＩＶ感染を処置するのに使用する請求項１１に記載の医薬組成物。
ＨＩＶウイルスに感染した哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に対し、請求項１に記載の式Ｉの化合物の抗ウイルス有効量、および医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤の１種以上を投与することから成る処置法。
哺乳類に対し、式Ｉの化合物の抗ウイルス有効量を、ＡＩＤＳ抗ウイルス剤、抗感染剤、免疫調節剤およびＨＩＶ進入阻害薬からなる群から選ばれるＡＩＤＳ処置剤の抗ウイルス有効量と組合せて投与する請求項１３に記載の処置法。
下式ＩＩで示される化合物。

［式中、ＸはＣまたはＮ、但し、ＸがＮのとき、Ｒ^１は存在せず；
ＷはＣまたはＮ、但し、ＷがＮのとき、Ｒ^２は存在せず；
ＶはＣ；
Ｒ^１は水素、メトキシまたはハロゲン；
Ｒ^２は水素；
Ｒ^３はメトキシまたはヘテロアリールで、これらのそれぞれは独立して、必要に応じて下記Ｇから選ばれる置換基の１つで置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはトリアゾリル、ピラゾリルまたはオキサジアゾリル）；
ＬおよびＭは独立して、水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、フェニル、ベンジル、トリアルキルシリル、２，２，２−トリクロロエトキシおよび２−トリメチルシリルエトキシからなる群から選ばれ、但し、ＬとＭの多くて１つが水素であってよく；
Ｙは

からなる群から選ばれ；
Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の多くて２つがメチル；
Ｒ^１８はＣ（Ｏ）−フェニル、Ｃ（Ｏ）−ピリジニル、ピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、アザベンゾフリルおよびアザインドリルからなる群から選ばれ、これらのそれぞれは独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよく；
Ｄはシアノ、Ｓ(Ｏ_２)Ｒ^２４、ハロゲン、Ｃ(Ｏ)ＮＲ^２１Ｒ^２２、フェニルおよびヘテロアリールからなる群から選ばれ、該フェニルまたはヘテロアリールは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３の同一もしくは異なる置換基で置換されてよく（ここで、ヘテロアリールはピリジニルおよびオキサジアゾリルからなる群から選ばれる）；
Ａはフェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルからなる群から選ばれ、該フェニル、ピリジニル、フリル、チエニル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルは独立して、必要に応じて１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンであるいは下記Ｇから選ばれる１〜３つの同一もしくは異なる置換基で置換されてよく；
Ｇは（Ｃ_１−６）アルキル、（Ｃ_１−６）アルケニル、フェニル、ヒドロキシ、メトキシ、ハロゲン、−ＮＲ^２３Ｃ(Ｏ)−(Ｃ_１−６)アルキル、−ＮＲ^２４Ｒ^２５、−Ｓ(Ｏ)_２ＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＯＯＲ^２６および−ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５からなる群から選ばれ、該（Ｃ_１−６）アルキルは必要に応じて、ヒドロキシ、ジメチルアミノまたは１〜３つの同一もしくは異なるハロゲンで置換されてよく；
Ｒ^２６は水素および（Ｃ_１−６）アルキルからなる群から選ばれ；
Ｒ^２０，Ｒ^２１，Ｒ^２２，Ｒ^２３，Ｒ^２４，Ｒ^２５はそれぞれ独立して、水素、（Ｃ_１−６）アルキルおよび−(ＣＨ_２)_ｎＮＲ^２７Ｒ^２８からなる群から選ばれ；
ｎは０〜６；および
Ｒ^２７およびＲ^２８はそれぞれ独立して、Ｈまたはメチルである］
塩がリシンである請求項７に記載の化合物。
塩がトロメタミンである請求項８に記載の化合物。
塩がリシンである請求項９に記載の化合物。
Ｙが

Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７がそれぞれ独立して、Ｈまたはメチル、但し、Ｒ^１０−Ｒ^１７の多くて２つがメチルである請求項１に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシまたはフルオロ；
Ｄがシアノ、フェニルおよびピリジニルからなる群から選ばれ、該フェニルまたはピリジニルは独立して、必要に応じてメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる１つの置換基で置換されてよく；および
Ａがフェニルおよびピリジニルからなる群から選ばれ、該フェニルまたはピリジニルが独立して、必要に応じてメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる１つの置換基で置換されてよい請求項１９に記載の化合物。
Ｄがシアノ；Ａがフェニルおよびピリジニルからなる群から選ばれ；ＸがＣ；ＷがＮ；Ｇがメチル；Ｒ^３がメトキシまたはトリアゾリルで、該トリアゾリルが独立して、必要に応じてＧから選ばれる１つの置換基で置換されてよく；およびＲ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７がそれぞれＨである請求項２０に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシ；およびＲ^３がトリアゾリルで、該トリアゾリルが独立して、必要に応じてＧから選ばれる１つの置換基で置換されてよい請求項２０に記載の化合物。
Ｙが

Ｒ^１８がキノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニルおよびフタラジニルからなる群から選ばれ、これらのそれぞれが独立して、必要に応じてメチル、アミノ、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ_２、メトキシ、ヒドロキシメチルおよびハロゲンからなる群から選ばれる基の１〜２つで置換されてよい請求項１に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシまたはフルオロ；
Ｒ^１８がイソキノリニル、キナゾリニルおよびフタラジニルからなる群から選ばれ、該イソキノリニル、キナゾリニルまたはフタラジニルが独立して、必要に応じてメチルまたはハロゲンの１つの基で置換されてよく；および
Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７がそれぞれ独立して、Ｈである請求項２３に記載の化合物。
ＸがＣ；ＷがＮ；Ｇがメチル；およびＲ^３がメトキシまたはトリアゾリルで、該トリアゾリルが独立して、必要に応じてＧから選ばれる１つの置換基で置換されてよい請求項２４に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシ；Ｒ^３がトリアゾリルで、該トリアゾリルが独立して、必要に応じてＧから選ばれる１つの置換基で置換されてよく；およびＲ^１８がキナゾリニルである請求項２５に記載の化合物。
Ｒ^１がメトキシまたはフルオロ；Ｒ^１８がＣ(Ｏ)−フェニル；Ｒ^１０，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４，Ｒ^１５，Ｒ^１６，Ｒ^１７がそれぞれＨ；およびＧがメチルである請求項１に記載の化合物。
ＸがＣ；およびＷがＮである請求項２７に記載の化合物。
式：

の化合物Ｉａｃを製造する方法であって、
（ａ）式：

の化合物ＩＶａを、該化合物ＩＶａ１モル当り塩基として約２モル当量のＫ_２ＣＯ_３、および該化合物ＩＶａ１ｇ当り溶媒として約５〜１０ｍＬのＮ−メチルピロリジノンの存在下、該化合物ＩＶａ１モル当り約１．２モル当量の式：

のジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートで、約３０℃の反応温度にてアルキル化して、式：

の化合物Ｒを形成し；
（ｂ）工程（ａ）の得られる反応混合物に、上記化合物ＩＶａ１ｇ当り約１０ｍＬのジクロロメタン溶媒および化合物ＩＶａ１モル当り約１５モル当量のトリフルオロ酢酸を加えて、上記化合物Ｒの２つのｔ−ブチル基を室温で脱保護し；次いで
（ｃ）化合物Ｉａｃを回収する
ことを特徴とする製造法。
式：

の化合物Ｉｃを製造する方法であって、
（ａ）式：

の化合物ＩＶｃを、該化合物ＩＶｃ１モル当り塩基として約２．５モル当量のＣｓ_２ＣＯ_３、該化合物ＩＶｃ１モル当り約２モル当量のＫＩ、および該化合物ＩＶｃ１ｇ当り約５〜１０ｍＬのＮ−メチルピロリジノンの存在下、該化合物ＩＶｃ１モル当り約２．５モル当量の式：

のジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートで、約２５〜３０℃の反応温度にてアルキル化して、式：

の化合物ＩＩｃを形成し；
（ｂ）過剰のアセトンおよび水中、上記化合物ＩＩｃの２つのｔ−ブチル基を約４０℃の温度で脱保護し；次いで
（ｃ）化合物Ｉｃを回収する
ことを特徴とする製造法。
式：

の化合物Ｉｂｃを製造する方法であって、
（ａ）式：

の化合物ＩＶｂを、該化合物ＩＶｂ１モル当り塩基として約２モル当量のＣｓ_２ＣＯ_３、該化合物１モル当り約２モル当量のＫＩ、および該化合物１ｇ当り約２．５ｍＬのＮ−メチルピロリジノンの存在下、該化合物ＩＶｂ１モル当り約２モル当量の式：

のジ−ｔ−ブチルクロロメチルホスフェートで、約３０℃の反応温度にてアルキル化して、式：

の化合物ＩＩｂを形成し；
（ｂ）過剰のアセトンおよび水中、上記化合物ＩＩｂの２つのｔ−ブチル基を約４０℃の温度で脱保護し；次いで
（ｃ）化合物Ｉｂｃを回収する
ことを特徴とする製造法。