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BRPI0508876B1 - Pró medicamentos de agentes antivirais de piperazina e piperidina substituída - Google Patents

Pró medicamentos de agentes antivirais de piperazina e piperidina substituída Download PDF

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BRPI0508876B1
BRPI0508876B1 BRPI0508876-3A BRPI0508876A BRPI0508876B1 BR PI0508876 B1 BRPI0508876 B1 BR PI0508876B1 BR PI0508876 A BRPI0508876 A BR PI0508876A BR PI0508876 B1 BRPI0508876 B1 BR PI0508876B1
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BR
Brazil
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hiv
group
reaction
aids
Prior art date
Application number
BRPI0508876-3A
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English (en)
Inventor
Yasutsugu Ueda
Timothy P. Connolly
John F. Kadow
Nicholas A. Meanwell
Tao Wang
Chung-Pin H. Chen
Kap-Sun Yeung
Zhongxing Zhang
Kenneth David Leahy
Shawn K. Pack
Nachimuthu Soundararajan
Pierre Sirard
Kathia Levesque
Dominique Thoraval
Original Assignee
Viiv Healthcare Uk (No.
Limited
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Publication date
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Application filed by Viiv Healthcare Uk (No., Limited filed Critical Viiv Healthcare Uk (No.
Publication of BRPI0508876A publication Critical patent/BRPI0508876A/pt
Publication of BRPI0508876B1 publication Critical patent/BRPI0508876B1/pt
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Abstract

"pró medicamentos de agentes antivirais de piperazina e piperidina substituída".esta invenção fornece compostos de pró medicamento (i), composições farmacêuticas destes e seu usos em tratar infecção por hiv. também, esta invenção fornece compostos intermediários (ii) úteis na manufatura dos compostos de pró medicamento (i).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para 1BENZOIL-4-[2-[4-METÓXI-7-(3-METIL-1 H-1,2,4-TRIAZOL-1 -IL)-1 [(FOSFONOÓXI)METIL]-1H-PIRROLO [2,3-C] PIRIDIN-3-IL]-1,2DIOXOETIL]PIPERAZINA E SEUS SAIS, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE OS COMPREENDE.
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório US Números de série 60/635.231 depositado em 10 de dezembro de 2004 e 60/553.320 depositado em 15 de março de 2004. CAMPO DA INVENÇÃO
[002] Esta invenção refere-se compostos tendo propriedades de fármaco e de bio-afetação, suas composições farmacêuticas e método de uso. Em particular, a invenção concerne aos derivados de prófármaco novos com atividade antiviral. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito aos compostos úteis para o tratamento de HIV e AIDS.
TÉCNICA ANTERIOR
[003] Infecção por HIV-1 (vírus da imunodeficiência humana-1) permanece um problema médico principal, com 42 milhões de pessoas estimadas mundialmente infetadas no final de 2002. O número de casos de HIV e AIDS (síndrome de imunodeficiência adquirida) subiu rapidamente. Em 2002, ~5,0 milhões de infecções novas foram relatados, e 3,1 milhões de pessoas morreram de AIDS. Correntemente fármacos disponíveis para o tratamento de HIV incluem dez inibidores de transcriptase reversa (RT) de nucleosídeo ou combinações de pílula simples aprovadas (zidovudina ou AZT (ou Retrovir®), didanosina (ou Videx), estavudina (ou Zerit®), lamivudina (ou 3TC ou Epivir®), zalcitabina (ou DDC ou Hivid®), succinato de abacavir (ou Ziagen®), sal de fumarato de disoproxila de Tenofovir (ou Viread®), Combivir® (con
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2/233 tém -3TC mais AZT), Trizivir® (contém abacavir, lamivudina e zidovudina) e Emtriva® (emtricitabina); três inibidores de transcriptase reversa de não-nucleosídeo: nevirapina (ou Viramune), delavirdina (ou Rescriptor®) e efavirenz (ou Sustiva®), nove inibidores de protease de peptidomimética ou formulações aprovadas: saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfmavir, amprenavir, lopinavir, Kaletra® (lopinavir e Ritonavir), Atazanavir (Reyataz®), Fosampre navir® e um inibidor de fusão que alveja gp41 viral T-20 (FUZEON®). Cada um destes fármacos pode apenas transientemente conter replicação viral se usados sozinhos. Porém, quando usados em combinação, estes fármacos têm um efeito profundo em viremia e progressão da doença. De fato, reduções significativas nos índices de mortalidade entre pacientes com AIDS foram recentemente documentadas como conseqüência da aplicação difundida da terapia de combinação. Porém, apesar destes resultados impressionantes, 30 a 50% dos pacientes por fim falham com terapias de fármaco de combinação. Potência de fármaco insuficiente, nãocomplacência, penetração de tecido restringida e limitações fármacoespecíficas dentro de certos tipos de célula (por exemplo a maioria dos análogos de nucleosídeo não pode ser fosforiladas em células em repouso) podem responder pela supressão incompleta dos vírus sensíveis. Além disso, a taxa de replicação alta e giro rápido de HIV-1 combinada com a incorporação freqüente das mutações, conduzem ao aparecimento de variantes resistentes ao fármaco e falhas do tratamento quando concentrações de fármaco subótimas estiverem presentes (Larder e Kemp; Gulick; Kuritzkes; Morris-Jones et al; Schinazi et al; Vacca e Condra; Flexner; Berkhout e Ren et al; (Ref. 6-14)). Portanto, agentes anti-HIV novos que exibem padrões de resistência distintos, e farmacocinética favorável como também perfis de segurança são necessários para fornecer mais opções de tratamento.
[004] Fármacos para HIV-1 correntemente comercializados são
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3/233 dominados por quaisquer inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo ou inibidores de protease peptidomimética. Inibidores de transcriptase reversa de não-nucleosídeo (NNRTIs) recentemente ganharam um papel crescentemente importante na terapia de infecções por HIV (Pedersen & Pedersen, Ref 15). Pelo menos 30 classes diferentes de NNRTI foram descritas na literatura (De Clercq, Ref. 16) e vários NNRTIs foram avaliados em experimentações clínicas. Dipiridodiazepinona (nevirapina), benzoxazinona (efavirenz) e derivados de bis(heteroaril) piperazina (delavirdina) foram aprovados para uso clínico. Porém, o inconveniente principal para o desenvolvimento e aplicação dos NNRTIs é a tendência ao aparecimento rápido de cepas resistentes ao fármaco, tanto na cultura das células de tecido quanto nos indivíduos tratados, particularmente aqueles sujeitos à monoterapia. Como uma conseqüência, há interesse considerável na identificação de NNRTIs menos propensos ao desenvolvimento de resistência (Pedersen & Pedersen, Ref 15). Uma recente visão geral de inibidores de transcriptase reversa de não-nucleosídeo surgiu Perspectives on novel therapeutic compounds and strategies for the treatment of HIV infection (Buckheit, referência 99).
[005] Uma revisão abrangendo NRTI e NNRTIs surgiu (De Clercq, referência 100). Uma visão geral do estado atual dos fármacos de HIV foi publicada (De Clercq, referência 101).
[006] Vários derivados de indol incluindo indol-3-sulfonas, piperazino indóis, pirazino indóis e derivados de 5H-indolo[3,2b][1,5]benzotiazepina foram relatados como inibidores de transcriptase reversa de HIV-1 (Greenlee et al, Ref. 1; Williams et al, Ref. 2; Romero et al, Ref. 3; Font al, Ref. 17; Romero et al, Ref. 18; Young et al, Ref. 19; Genin et al, Ref. 20; Silvestri et al, Ref. 21). 2-carboxamidas de indol foram também descritas como inibidores de adesão de células e de infecção por HIV (Boschelli et al, US 5.424.329, Ref. 4). Produtos natu
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4/233 rais de indol 3-substituído (Semicochliodinol A e B, didemetilasterriquinona e isocochliodinol) foram descritos como inibidores de HIV-1 protease (Fredenhagen et al, Ref. 22).
[007] Derivados de amida de aza-indol estruturalmente relacionados foram previamente descritos (Kato et al, Ref. 23(a); Levacher et al, Ref. 23(b); Dompe Spa, WO-09504742, Ref. 5(a); SmithKlina Beecham PLC, WO-09611929, Ref. 5(b); Schering Corp., US-05023265, Ref. 5(c)). Porém, estas estruturas diferem daquelas reivindicadas aqui em que elas são mono-amida de monoaza-indol ao invés de derivados de oxoacetamida, e há nenhuma menção do uso destes compostos para tratar infecções virais, particularmente HIV.
[008] Fármacos novos para o tratamento de HIV são necessários para o tratamento de pacientes que tornam resistentes aos fármacos correntemente aprovados descritos acima que alvejam transcriptase reversa ou a protease. Um método para obter estes fármacos é descobrir moléculas que inibem alvos novos e diferentes do vírus. Uma classe geral de inibidores que estão sob estudo ativo é inibidores de entrada de HIV. Esta classificação geral inclui fármacos apontadas a vários alvos que incluem inibidores de receptor de quimiocina (CCR5 ou CXCR4), inibidores de fusão que alvejam gp41 viral e inibidores que impedem ligação do envelope viral, gp120, a seu CD4 celular humano alvo. Várias revisões ou documentos gerais sobre inibidores de entrada viral surgiram recentemente e algumas referências selecionadas são:
Chemokine receptor antagonists as HIV entry inhibitors. Expert Opinion on Therapeutic Patents (2004), 14(2), 251-255.
Inhibitors of the entry of HIV into host cells. Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F. Current Opinion in Drug Discovery & Development (2003), 6(4), 451-461.
Virus entry as a target for anti-HIV intervention. Este, Jose
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5/233
A. Retrovirology Laboratory irsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autonoma de Barcelona, Badalona, Espanha. Current Medicinal Chemistry (2003), 10(17), 1617-1632.
New antirretroviral agents. Rachline, A.; Joly, V. Service de Maladies Infectieuses et Tropicales A, Hopital Bichat-Claude Bernard, Paris, Fr. Antibiotiques (2003), 5(2), 77-82.
New antirretroviral drugs. Gulick, R. M. Cornell HIV Clinical Trials Unit, Division of International Medicine and Infectious Diseases, Weill Medical College of Cornell University, Nova Yorque, NY, USA. Clinical Microbiology and Infection (2003), 9(3), 186-193.
Sensitivity of HIV-1 to entry inhibitors correlates with envelope/coreceptor affinity, receptor density, and fusion kmetics. Reeves, Jacqueline D.; Gallo, Stephen A.; Ahmad, Navid; Miamidian, John L.; Harvey, Phoebe E.; Sharron, Matthew; Pohlmann, Stefan; Sfakianos, Jeffrey N.; Derdeyn, Cynthia A.; Blumenthal, Robert; Hunter, Eric; Doms, Robert W. Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Filadélfia, PA, USA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2002), 99(25), 16249-16254. CODEN: PNASA6 ISSN: 0027-8424.
Opportunities and challenges in targeting HIV entry. Biscona, Mark J.; Pierson, Theodore C.; Doms, Robert W. Department of Microbiology, University of Pennsylvania, Filadélfia, PA, USA. Current Opinion in Pharmacology (2002), 2(5), 529-533.
HIV entry inhibitors in clinical development. O'Hara, Bryan M.; Olson, William C. Progenies Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY, USA. Current Opinion in Pharmacology (2002), 2(5), 523-528.
Resistance mutation in HIV entry inhibitors. Hanna, Sheri L.; Yang, Chunfu; Owen, Sherry M.; Lal, Renu B. HIV Immunology and Diagnostics Branch, Division of AIDS, STD, Atlanta, GA, USA. AIDS (Londres, United Kingdom) (2002), 16(12), 1603-1608.
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6/233
HIV entry: are all receptors created equal? Goldsmith, Mark A.; Doms, Robert W. Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, USA. Nature Immunology (2002), 3(8), 709-710. CODEN: NIAMCZ ISSN: 1529-2908.
Peptide and non peptide HIV fusion inhibitors. Jiang, Shibo; Zhao, Qian; Debnath, Asim K. The Nova Yorque Blood Center, Lindsley F. Kimball Research Institute, Nova Yorque, NY, USA. Current Pharmaceutical Design (2002), 8(8), 563-580.
[009] Há dois métodos gerais para impedir a ligação inicial da membrana viral, gp120, ao CD4 celular, que são a) inibidores que ligam ao CD4 humano e bloqueiam a ligação do envelope viral (gp120) e b) inibidores que ligam a gp120 viral e impedem a ligação do CD4 celular. O segundo método tem a vantagem que inibe um alvo viral e, se seletivo, minimiza as chances de perturbar a fisiologia humana normal ou causar efeitos colaterais. Com este método para superar um espectro em susceptibilidade à fármaco causada por variabilidade nas seqüências de envelope viral e suprimir o desenvolvimento de resistência, é importante alcançar níveis de fármaco no plasma que sejam tantos múltiplos quanto possíveis na EC50 ou outra medida da concentração de fármaco necessária para matar o vírus. Como debatido mais tarde, estes inibidores parecem seguros assim para serem de ampla utilidade no homem eles, portanto, devem ser capazes de alcançar níveis de exposição suficiente para permitir supressão de vírus. Quanto mais alto o múltiplo de níveis de fármaco sobre o nível necessário para inibir crescimento viral, mais eficaz e completamente a supressão de replicação viral e menor a chance para mutação viral e desenvolvimento subseqüente de resistência ao tratamento. Desse modo, aspectos importantes que contribuem para a eficácia dos inibidores de ligação viral não só incluem potência intrínseca e segurança, mas também farmacocinéticas e propriedades farmacêuticas que permitem
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 10/244
7/233 o conseguimento da exposição de plasma alta em uma dose fisicamente possível e um programa de administração aceitável, preferivelmente conveniente. Esta invenção descreve um método de prófármaco que grandemente intensifica a exposição máxima e a capacidade de aumentar múltiplos de exposição (isto é, múltiplos de exposição de fármaco maior que EC50 ou EC90) em escalação de dose de membros eficazes de uma classe previamente descrita de inibidores de ligação de HIV.
[0010] Uma série de recentes publicações e revelações caracteriza e descreve um composto rotulado como BMS-806, um membro inicial de uma classe de inibidores de entrada viral que alvejam gp-120 viral e impedem a ligação do vírus ao CD4 do hospedeiro.
[0011] A small molecule HIV-1 inhibitor that targets the HIV-1 envelope and inhibits CD4 receptor binding. Lin, Pin-Fang; Blair, Wade; Wang, Tao; Spicer, Timothy; Guo, Qi; Zhou, Nannan; Gong, Yi-Fei; Wang, H. -G. Heidi; Rose, Ronald; Yamanaka, Gregory; Robinson, Brett; Li, Chang-Ben; Fridell, Robert; Deminie, Carol; Demers, Gwendeline; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa; Meanwell, Nicholas; Colonno, Richard. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2003), 100(19), 1101311018.
[0012] Biochemical and genetic characterizations of a novel human immunodeficiency virus type 1 inhibitor that blocks gp120CD4 interactions. Guo, Qi; Ho, Hsu-Tso; Dicker, Ira; Fan, Li; Zhou, Nannan; Friborg, Jacques; Wang, Tao; McAuliffe, Brian V.; Wang, Hwei-gene Heidi; Rose, Ronald E.; Fang, Hua; Scarnati, Helen T.; Langley, David R.; Meanwell, Nicholas A.; Abraham, Ralph; Colonno, Richard J.; Lin, Pin-fang. Journal of Virology (2003), 77(19), 10528-10536.
[0013] Method using small heteroyícyico compounds for treating
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HIV infection by preventing interaction of CD4 and gp120. Ho, HsuTso; Dalterio, Richard A.; Guo, Qi; Lin, Pin-Fang. Pedido de Pat. PCT (2003), WO 2003072028Α2.
[0014] Discovery of 4-benzoyl-1-[(4-metoxy-1H-pyrrolo[2,3-
b]pyridin-3 yl)oxoacetyl]-2- (R)-methylpiperazine (BMS-378806): A Novel HIV-1 Attachment Inhibitor That Interferes with CD4-gp120 Interactions. Wang, Tao; Zhang, Zhongxing; Wallace, Owen B.; Deshpande, Milind; Fang, Haiquan; Yang, Zheng; Zadjura, Lisa M.; Tweedie, Donald L.; Huang, Stella; Zhao, Fang; Ranadive, Sunanda; Robinson, Brett S.; Gong, Yi-Fei; Ricarrdi, Keith; Spicer, Timothy P.; Deminie, Carol; Rose, Ronald; Wang, Hwei-Gene Heidi; Blair, Wade S.; Shi, Pei-Yong; Lin, Pin-fang; Colonno, Richard J.; Meanwell, Nicholas A. Journal of Medicinal Chemistry (2003), 46(20), 4236-4239.
o
Figure BRPI0508876B1_D0001
BMS-806
[0015] Indol, azaindol e outros derivados contendo oxo amida desta classe foram descritos em vários pedidos de patente do PCT e U. S. emitidos diferente (Referência 93-95, 106, 108, 109, 110, 111 e 112) e estas referências concernem diretamente aos compostos neste pedido de patente. Nenhum dos compostos nestas referências da técnica anterior contém um grupo diidrogênio fosfato de di-hidrogênio de metila (ou sal ou mono ou di éster do grupo fosfato) ligado ao N-1 nitrogênio e desse modo os compostos desta invenção atual representam novas composições de substância. Esta porção aumenta a utilidade dos compostos de origem dramaticamente funcionando como uma modificação de pró-fármaco que dramaticamente aumenta a exposição sis
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9/233 têmica máxima das moléculas de origem em modelos pré-clínicos de exposição humana. Acredita-se que nada nas anterioridades pode ser interpretado revelar ou sugerir os compostos novos desta invenção e seu uso para inibir infecção por HIV.
[0016] Esta invenção descreve pró-fármacos de amidas de cetopiperazina de indol e de azaindol específicas que são extremamente eficazes para melhorar a utilidade oral das moléculas de origem como particularmente agentes antivirais como fármacos anti HIV. As moléculas de origem são relativamente insolúveis, e sofrem absorção limitada por dissolução ou limitada por solubilidade o que significa que a dose é aumentada acima de um nível máximo, cada vez menos o fármaco dissolve-se no tempo para ser absorvido na circulação e eles são ao contrário passados através do corpo para serem eliminados como resíduo. As melhorias oferecidas pelo pró-fármaco são necessárias, porque elas permitem os níveis de fármaco no corpo serem aumentados significativamente, que fornece maior eficácia vs vírus de HIV e em particular vs cepas menos sensíveis ou mais resistentes. Pró-fármacos são especialmente importantes para esta classe de fármacos uma vez que os fármacos alvejam o envelope do vírus de HIV, um alvo que varia de cepa para cepa e desse modo em que múltiplos de exposição máxima são desejados. Porque com um pró-fármaco, mais do fármaco será absorvido e alcançará o alvo, volume de pílula, custo ao paciente e intervalos de doseamento poderiam ser reduzidos. A identificação dos pró-fármacos com estas propriedades é difícil e indireta, nem é uma trajetória clara para o projeto de pró-fármaco com sucesso descrito na literatura. Não há nenhuma técnica anterior clara que ensine a química do pró-fármaco a empregar nem que será muito eficaz. O debate e os dados a seguir mostrarão que os pró-fármacos descritos nesta invenção funcionarão surpreendentemente bem. Eles liberam fármaco de origem extremamente de forma rápida e eficaz e intensifiPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 13/244
10/233 cam a exposição a níveis que são mais altos que relatados a muitos pró-fármacos.
[0017] O uso de estratégias ou metodologias de pró-fármaco para notadamente intensificar as propriedades de um fármaco ou superar uma deficiência inerente nas propriedades farmacêuticas ou farmacocinéticas de um fármaco pode ser usado em certas circunstâncias para notadamente intensificar a utilidade de um fármaco. Pró-fármacos diferem das formulações em que modificações químicas conduzem a uma entidade química completamente nova que sob administração ao paciente, regenera a molécula de origem dentro do corpo. Uma miríade de estratégias de pró-fármaco existe que fornece escolhas na modulação das condições para regeneração do fármaco de origem, as propriedades físicas, farmacêuticas ou farmacocinéticas do pró-fármaco, e a funcionalidade à qual as modificações de pró-fármaco podem ser ligadas. Porém, nenhuma destas publicações ensina que método usar que resulte nos pró-fármacos específicos aqui inventados. Várias revisões ou debates foram publicados sobre estratégias de pró-fármaco e uma lista não-exaustiva é fornecida abaixo:
[0018] Hydrolysis in Drug and prodrug Metabolism. Richard Testa e Joachim Mayer, 2003 publicador Wiley-VCH, ISBN 3-906390-25-x.
[0019] Design of Prodrugs, Editor Bundgard, H., Elsevier, Amsterdã, 1985. Pharimnacokinetics of drug targeting: specific implications for targeting via prodrugs. Stella, V. J.; Kearney, A. S. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Handbook of Experimental Pharmacology (1991), 100(Targeted Drug Delivery), 71-103. CODEN: HEPHD2 ISSN: 0171-2004. Diário; Revisão Geral escrita em inglês. CAN 116:158649 AN 1992:158649 CAPLUS (Copyright 2004 ACS em SciFinder (R)).
[0020] Prodrugs. Do they have advantages in clinical practice? Stella, V. J.; Charman, W. N. A.; Naringrekar, V. H. Dep. Pharm.
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Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Drugs (1985), 29(5), 45573. CODEN: DRUGAY ISSN: 0012-6667. Diário; Revisão Geral escrita em inglês. CAN 103:115407 AN 1985:515407 CAPLUS (Copyright 2004 ACS em SciFinder (R)).
[0021] Trends in prodrug research. Stella, V. J.; Naringrekar, V. H.; Charman, W. N. A. Dep. Pharm. Chem., Univ. Kansas, Lawrence, KS, USA. Pharmacy International (1984), 5(11), 276-9. CODEN: PHINDQ ISSN: 0167-3157. Diário; Revisão Geral escrita em inglês. CAN 102:72143 AN 1985:72143 CAPLUS (Copyright 2004 ACS em SciFinder (R)).
[0022] Embora algumas tecnologias sejam conhecidas ter aplicações específicas, isto é para melhorar a solubilidade ou absorção, por exemplo, o desenvolvimento de pró-fármacos permanece, em grande proporção, um exercício empírico. Desse modo várias estratégias ou modificações químicas devem ser usualmente inspecionadas e os compostos resultantes avaliados em modelos biológicos a fim de averiguar e medir o sucesso das estratégias de pró-fármaco.
[0023] Uma estratégia de pró-fármaco com sucesso requer que um sítio quimicamente reativo em uma molécula seja modificado por meio da adição da porção de pró-fármaco e que depois sob as condições desejadas nos pacientes a porção de pró-fármaco desmascarará e liberará o fármaco de origem. A molécula de pró-fármaco tem que ter estabilidade adequada em uma forma de dosagem aceitável antes do doseamento. Além disso, o mecanismo de liberação tem que permitir o pró-fármaco regenerar o fármaco de origem eficazmente e com cinética que fornece níveis terapêuticos de fármaco de origem no alvo da doença. Em moléculas, o nitrogênio de indol ou azaindol representa um ponto aceitável de ligação para uma porção de pró-fármaco.
[0024] A sugestão que um grupo fosfato unido por uma química ou ligante apropriado pode intensificar a exposição oral de um fármaco de
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12/233 origem é um conceito conhecido na técnica. Porém, como será debatido abaixo, é imprevisível saber que se usando um grupo fosfato para criar um pró-fármaco trabalhará com uma substância de fármaco dada. O grupo fosfato temporariamente altera as propriedades físicas do fármaco e é, desse modo, um pró-fármaco que aumenta a solubilidade aquosa da molécula resultante, até que seja clivada através de fosfatase alcalina no corpo ou outra reação química de um ligador racionalmente projetado. Por exemplo, na referência a seguir, os autores concluem que fosfato pode melhorar a eficácia oral. Nesta referência um derivado de fosfato de um grupo álcool em um fármaco fracamente solúvel em água, lipofílica exibiu biodisponibilidade oral melhor que os dois outros pró-fármacos e pareceu oferecer uma vantagem na molécula de origem que possuía baixa biodisponibilidade oral.
[0025] Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhance oral absorption of poorly water-soluble compounds. Chan, O. Helen; Schmid, Heidi L.; Stilgenbauer, Linda A.; Howson, William; Horwell, David
C.; Stewart, Barbra H. Pharmaceutical Research (1998), 15(7), 10121018.
[0026] Dois documentos muito pertinentes e recentes publicaram que debatem as dificuldades de identificar pró-fármacos de fosfato com vantagens significativas na molécula de origem para uso oral.
[0027] Um documento intitulado Absorption Rate Limit Considerations for Oral Phosphate Prodrugs por Tycho Heimbach et. al. in Pharmaceutical Research 2003, Vol 20, No. 6 páginas 848-856 declara A inabilidade surpreendente de usar pró-fármacos de fosfato pela via oral incitou um estudo em um sistema sendo usado para triar candidatos de fármaco para potencial de absorção. Este documento também revisa as razões que muitos pró-fármacos de fosfato eram inadequados para uso oral e debatem vários fatores limitativos de taxa potenciais no processo de absorção de fármaco. O documento também
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13/233 identifica as poucas aplicações com sucesso. O documento tenta identificar propriedades que podem tornar alguns fármacos adequados para liberação oral como pró-fármacos de fosfato mas a mensagem está clara que esta ainda é uma ciência empírica. Isto é enfatizado pelas conclusões de um segundo documento pelos mesmos autores intitulados Enzyme mediated precipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs por Tycho Heimbach et. al em International Journal of Pharmaceutics 2003, 261, 81-92. Os autores declaram no Resumo que muitos pró-fármacos de fosfato orais falharam em melhorar a taxa ou extensão de absorção comparada a seus fármacos de origem insolúveis. Geração rápida de fármaco de origem por meio de fosfatase alcalina intestinal pode resultar em soluções supersaturadas, levando à precipitação do fármaco de origem. Isto limitaria a utilidade dos fosfatos orais. As conclusões deste documento declaram (citado) Em resumo, a precipitação das fármacos de origem de pró-fármacos de fosfato pode ser mediada por enzima. A precipitação de certas fármacos pode também ser observada para certas fármacos no modelo de Caco-2. Uma vez que os tempos de indução diminuem e os tempos de nucleação aumentam com razões de supersaturação altas, os fármacos de origem podem precipitar-se quando concentração dos prófármacos alvejados for muito mais alta que a solubilidade do fármaco de origem para fármacos de origem com razões de supersaturação altas. A extensão na qual um fármaco de origem precipita-se durante a conversão do pró-fármaco é dependente das taxas de conversão de pró-fármaco para origem, efeito do pró-fármaco na precipitação do fármaco de origem e na solubilização do fármaco de origem. Como pode ser visto pela conclusão do autor, o processo é um complexo e é dependente de muitos fatores que são impossíveis prognosticar com antecedência como razões de supersaturação, taxa de conversões de pró-fármaco in vivo e capacidade do ambiente intestinal de solubilizar
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14/233 as misturas de origem e de pró-fármaco.
[0028] As duas referências por Heimbach descrevem o estado clínico dos pró-fármacos de fosfato e debatem as muitas falhas e os poucos exemplos com sucesso. Um exemplo de uma falha clínica e um exemplo de um sucesso são fornecidos abaixo:
[0029] Etoposide® é um fármaco anticâncer que ou é administrado por meio de vias iv ou orais. Pró-fármacos de fosfato de etoposídeo são clinicamente usados, mas estas estruturas diferem dos derivados da pedido de patente atual visto que este pró-fármaco contêm um fosfato formado por ligação direta a uma metade de fenol do fármaco de origem. As razões principais para preparar um pró-fármaco de fosfato do etoposídeo de fármaco eram melhorar o uso intravenoso por meio de solubilidade aumentada e redução de excipientes. Embora o prófármaco de fosfato tenha sido avaliado pré-clinicamente de forma oral e clínica, ele é apenas usado clinicamente para administração iv.
[0030] Synthesis of etoposide phosphate, BMY-40481: a watersoluble clinically active prodrug of etoposide. Saulnier, Markg.; Langley, David R.; Kadow, John F.; Senter, Peter D.; Knipe, Jay O.; Tun, Min Min; Vyas, Dolatrai M.; Doyle, Terrence W. Bristol-Myers Squibb Co., Wallingford, CT, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (1994), 4(21), 2567-72 e referências nele.
[0031] Como pode ser visto das duas referências seguintes, os benefícios da porção de fosfato para doseamento oral não estavam claros.
[0032] Randomized comparison of etoposide phamacokmetics after oral etoposide phosphate and oral etoposide. De Jong, R. S.; Mulder, N. H.; Uges, D. R. A.; Kaul, S.; Winograd, B.; Sleijfer, D.Th.; Groen, H. J. M.; Willemse, P. H. B.; van der Graaf, W. T. A.; de Vries, POR EXEMPLO E. Department of Medical Oncology, University Hospital Groningen, Groningen, Neth. British Journal of Cancer (1997), 75(11),
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1660-1666. Este documento comparou a origem e o pró-fármaco diretamente e concluiu que fosfato de etoposídeo oral não oferece um benefício clinicamente relevante em etoposídeo oral.
[0033] Etoposídeo bioavailability after oral administration of the prodrug etoposídeo phosphate in cancer patients during a phase I study. Chabot, G. G.; Armand, J.-P.; Terref, C.; De Forni, M.; Abigerges,
D.; Winograd, B.; Igwemezie, L.; Schacter, L.; Kaul, S.; et al. Department Medicine, Gustave-Roussy Institute, Villejuif, Fr. Journal of Clinical Oncology (1996), 14(7), 2020-2030.
[0034] Este documento mais precoce observado que comparado com os dados de literatura, EP oral teve um valor F 19% mais alto ou comparado com E oral em doses baixas ou altas. Eles concluíram este F mais alto em E do pró-fármaco oral EP parece ser uma vantagem farmacológica que poderia ser de importância farmacodinâmica potencial por este fármaco. Porém o estudo previamente mencionado que chegou a conclusões opostas foi depois feito e pareceu que os dados da comparação direta eram mais válidos. Desse modo adicionar um grupo fosfato para melhorar a solubilidade não é uma garantia de eficácia oral melhorada.
[0035] Um pró-fármaco de fosfato do inibidor de HIV protease Amprenavir foi preparado e é o ingrediente ativo tendo agora se tornado um fármaco melhorado para o uso oral. Este é um exemplo de um sucesso raro deste método. O fosfato é ligado diretamente a uma metade de hidróxi e serve para intensificar a solubilidade. Fosamprenavir sozinho ou em combinação com outro inibidor de protease ritonavir, que serve para inibir desativação metabólica mediada por 3A4 do Citocromo P450, permite os pacientes receber menos pílulas, pílulas menores (devido à necessidade de menos excipientes), e empregar um programa de doseamento menos freqüente. Claramente, a estrutura de Amprenavir é significativamente diferente que as moléculas da
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16/233 presente invenção e não prognostica sucesso com outras classes de fármacos ou química de ligante de fosfato. Duas referências sobre Fosamprenavir são incluídas abaixo mas a maioria dos dados recentes pode ser encontrada pesquisando uma base de dados bem conhecido na técnica como IDDB (Uma base de dados comercial chamada Investigational Drugs Database produzida por Current Drugs Ltd.).
[0036] Fosamprenavir vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline. [Errata ao documento citado em CA138:130388]. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(5), 824.
[0037] Fosamprenavir Vertex Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline. Corbett, Amanda H.; Kashuba, Angela D. M. School of Pharmacy, The University of North Carolina Hospitals, Chapel Hill, NC, USA. Current Opinion in Investigational Drugs (PharmaPress Ltd.) (2002), 3(3), 384390
[0038] Pesquisando a literatura por exemplos que podem ser encontrados listadas sob palavras-chaves pró-fármacos de indóis ou pró-fármacos de azaindóis identificou-se várias referências que foram descritas. Não têm consciência de qualquer referência em que os prófármacos de azaindol foram preparados por meio do uso de uma porção de diidrogênio fosfato de metila (ou sal ou mono ou diéster do grupo fosfato) ligada a N-1.
[0039] Com relação aos pró-fármacos de fosfato de indol, a publicação por Zhu. al. descreve um estudo para descobrir um pró-fármaco de fosfato eficaz de PD 154075. Ou nesta molécula, o fosfato de indol
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17/233 direto ou um diidrogênio fosfato de metila ou pró-fármaco de sal do nitrogênio de indol são pró-fármacos inadequados devido a uma taxa lenta de regenerar a molécula de origem. Desse modo o ligante novo e complexo descrito abaixo foi desenvolvido incorporar um fosfato solubilizante.
[0040] Phosphate prodrugs of PD 154075. Zhu, Zhijian; Chen, Huai-Gu; Goel, Om P.; Chan, O. Helen; Stilgenbauer, Linda A.; Stewart, Barbra H. Division of Warner-Lambert Company, Chemical Development, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Ann Arbor, MI, USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2000), 10(10), 1121-1124.
Figure BRPI0508876B1_D0002
N
Figure BRPI0508876B1_D0003
[0041] Muitas das referências descrevem o modelo de prófármacos para propósitos diferentes de superar a absorção limitada por dissolução. Vários pró-fármacos não são ligados ao nitrogênio de indol ou de azaindol ou são projetados para liberar intermediários de radicais ao invés do fármaco de origem. Os pró-fármacos descritos nesta técnica e suas propriedades não fornecem soluções óbvias para melhorar as propriedades dos inibidores de ligação de HIV de origem.
[0042] Foi agora descoberto que pró-fármacos de fosfato de diidrogênio de metila novos e sais farmaceuticamente aceitáveis da estrutura geral mostrados abaixo são úteis como agentes anti-HIV com
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18/233 um mecanismo novo que não é correntemente empregado por fármacos existentes. A necessidade por fármacos com mecanismos novos é grande uma vez que os pacientes são deixados sem opções se eles tornarem resistentes às atuais classes de fármaco. Além disso, fármacos com mecanismos novos podem ser usados em combinações com classes conhecidas de inibidores para abranger o aparecimento de resistência a estes fármacos uma vez que cepas de vírus resistente provavelmente ainda são suscetíveis às fármacos com um mecanismo alternativo.
R1 o
Figure BRPI0508876B1_D0004
r3 L OP(O)(OH)2
[0043] Observa-se que estes pró-fármacos são mais solúveis em água que as moléculas de origem, e rapidamente convertem nas origens após doseamento oral em roedores ou em ensaios in vitro com enzimas ou tecidos humanos. Além disso, em um estudo de escalação de dose oral, um pró-fármaco forneceu intensificações surpreendentes sob exposição ao fármaco (AUC) e concentração máxima (Cmax) quando que a dose aumentou. Estes estudos prognósticos sugerem que estes pró-fármacos deveriam fornecer vantagens em cachorros e seres humanos.
Figure BRPI0508876B1_D0005
OMe
IVa
[0044] O composto IVa de origem foi estudado em experimentações clínicas humanas. O composto foi dosado em voluntários huma
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19/233 nos saudáveis. Um gráfico da exposição vs dose é mostrado na figura
1.
[0045] Como pode ser visto, doses simples de uma formulação de cápsula (triângulos vermelhos) variaram em tamanho de 200-2400 mg em incrementos de 200 mg. É também facilmente evidente das AUCs orais, que aumentos sob exposição ao fármaco aumentaram muito mais lentamente e menos que proporcionalmente com a dose. De fato as diferenças ou aumento na exposição acima de 800 mg é mínimo. Com as razões de dose de 1:2:4:6:9:12 para tratamento com cápsula sob condição em jejum, as razões de Cmax média e valores de AUC são 1:1,3:2,4:2,3:2,1:2,7 e 1:1,5:2,3:2,0:1,9:2,4, respectivamente. Em faixa de dose de 200-800 mg os aumentos em exposição sistêmica estão relacionados à dose embora menos que proporcional à dose, embora tal exposição seja independente da dose acima de dose de 800 mg. Este fenômeno indica que a absorção do composto IVa com a formulação de cápsula usada é saturável sob condições em jejum.
[0046] A proporcionalidade da dose em exposição sistêmica parece ser muito melhor apresentada sob condição alimentada (refeição gordurosa alta) visto que as razões de Cmax e AUC são 1,6 e 1,5, respectivamente, quando a razão de dose for 1:2,3 (800 mg vs. 1800 mg). Como pode ser visto comparando a dose simples de 200 mg de uma solução de IVa (quadrado vermelho escuro) com a da dose de cápsula de 200 mg, a exposição da solução foi mais alta. Doseamento com uma solução aumentou a exposição do composto IVa. A Cmax e AUC da solução tinham quase 8 e 3 vezes, respectivamente, daquelas da cápsula (200 mg). A biodisponibilidade relativa (32%) da cápsula para a formulação de solução sugere que a absorção é dissolução limitada por taxa, sugerindo um potencial para intensificar a exposição sistêmica melhorando a formulação.
[0047] Uma refeição gordurosa alta teve um efeito de alimento po
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20/233 sitivo no composto. As Cmax após um tratamento alimentado foram aproximadamente 2,6 e 4,6 vezes para doses de 800 e 1800 mg, respectivamente, das do tratamento em jejum. As AUCs após um tratamento alimentado foram aproximadamente 2,5 e 4,7 vezes para doses de 800 e 1800 mg, respectivamente, das do tratamento em jejum. Os valores da biodisponibilidade relativa (alimentado vs. em jejum) foram 293% e 509% para doses de 800 mg e 1800 mg, respectivamente. A Tmax mediana alterou de 1,25 ou 2 (em jejum) para 4 (alimentado) horas.
[0048] Para a cápsula de 800 mg com alimento, a concentração de plasma média é 1001 e 218 ng/mL a 8 e 12 horas pós dose, respectivamente. Os resultados suportaram um regime de doseamento de q12h ou q8h para um valor de Cmin alvejado de pelo menos 200 ng/mL após doses múltiplas. Este valor foi selecionado com base nos dados pré-clínicos. Um outro sumário de alguns destes dados apresentado como um gráfico de barras é mostrado no segundo gráfico de barras na figura 2B.
ESTUDO DE DOSES MÚLTIPLAS EM SERES HUMANOS SAUDÁVEIS
[0049] Um estudo de múltiplas doses ascendente controlado por placebo para avaliar a segurança, tolerabilidade e farmacocinética do composto IVa em indivíduos humanos saudáveis foi realizado. Doseamento foi continuado em intervalos de 12 h por 14 dias. Em resumo, os resultados de PK preliminares indicaram que, após doses de Q12H simples e múltiplas do composto IVa, a exposição é em geral proporcional à dose nas faixas de dose de 400 a 1200 mg e 400 a 800 mg com refeição gordurosa alta e refeição leve, respectivamente, a exposição parece ser independente da dose acima destes níveis de dose com os tipos diferentes de refeição, a acumulação é baixa a moderada (até ~1,5 vez), e que há uma variação diurna na exposição em que a expo
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21/233 sição é mais alta após uma dose noturna que após uma dose matutina. Desse modo, a exposição foi melhor quando o doseamento foi combinado com uma refeição gordurosa alta e aumentos de exposição com dose foram mais altos com uma refeição gordurosa alta.
[0050] Este é similar aos resultados obtidos no estudo de dose simples acima.
ESTUDO DE DOSES MÚLTIPLAS EM PACIENTES COM HIV
[0051] Com base nos dados de exposição dos estudos em voluntários normais, um estudo de eficácia foi realizado em pacientes com HIV. Uma revelação inicial destes dados foi feita em uma conversa e resumo publicado. Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, IVa, in HIV-1-Infected Subjects G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Resumo J-32, 11/02/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), São Francisco, CA. O projeto do estudo incluiu adultos com HIV+ que ou estavam ingênuos à terapia antiretrovirótica ou livres de terapia antirretrovirótica por > 16 semanas. Suas contagens de CD4 foram requeridas ser > 250 células/mm3 e RNA de HIV-1 no plasma necessitou estar na faixa 5.000~500.000 c/mL. Havia 15 indivíduos em cada braço de dose e a razão de pacientes que recebem fármaco:placebo era 4:1.
[0052] O estudo seqüencial controlado por placebo de IVa utilizou um braço de dose inicial de 800 mg de PO a cada 12 h seguido por um segundo braço de doseamento de 1800 mg de PO administrados a cada 12 h. É importante notar que o fármaco foi administrada em uma cápsula e em combinação com uma refeição gordurosa alta para aumentar a exposição e os níveis de plasma. Fármaco do estudo foi administrada durante 7 dias e na manhã do Dia 8. Indivíduos foram acompanhados durante 14 dias.
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Resultados do estudo (para 18 dos 24 Pacientes Recebendo Fármaco
IVa)
Composto IVa Placebo
Dia 8 Alteração no RNA de HIV em 14 dias, log10 c/mL Média (SD) -0,72 (0,51) -0,02 (0,40)
Faixa +0,34 a -1,37 +0,45 a -0,26
Alteração máxima em RNA de HIV em 14 dias, log10 c/mL Média (SD) -1,00 (0,50) -0,30 (0,08)
Faixa -0,32 a -1,60 -0,22 a -0,38
Dia 8 Alteração em CD4, células/mm3 Média (SD) 106 (151) 6 (57)
Faixa -214 a+272 -35 a +47
Resultados do estudo (para 18 dos 24 Pacientes Recebendo Fármaco
IVa)
Composto IVa Placebo
Alteração máxima em RNA de HIV em 14 dias n (%) >0,5 log10 c/mL 8(67%) 0
>1,0 log10 c/mL 7 (58%) 0
>1,5 log10 c/mL 3 (25%)
[0053] 1. Como pode ser visto pelos dados para o nível de doseamento de 800 mg em combinação com uma refeição gordurosa alta, atividade antiviral significativa foi observada. Porém, apenas 58% dos pacientes tiveram queda de >1,0 log na carga viral. Uma resposta antiviral mais robusta foi vista com o regime de doseamento de 1800 mg com uma refeição gordurosa alta onde a resposta média foi uma queda de -0,96 log10 na carga viral. Estes dados mostram que este fármaco tem atividade antiviral significativa em doses de 800 mg e 1800 mg (e assim entre elas) a cada 12 horas em combinação com uma refeição gordurosa alta e portanto poderiam tornar um documento signi
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23/233 ficativo em terapia de combinação. Um sumário atualizado dos resultados com BMS-043 no homem pode ser obtido vendo o resumo ou eslaides da apresentação oral: Antiviral Activity, Safety, and Tolerability of a Novel, Oral Small-Molecule HIV-1 Attachment Inhibitor, BMS488043, in HIV-1-Infected Subjects G. Hanna, J. Lalezari, J. Hellinger, D. Wohl, T. Masterson, W. Fiske, J. Kadow, P-F. Lin, M. Giordano, R. Colonno, D. Grasela. Resumo J-32, 02/11/2004, 11th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), São Francisco CA. [0054] Infelizmente, será impraticável liberar este fármaco cronicamente durante muitos meses envolvendo administração de um total de 9 cápsulas de 200 mg cada, duas vezes ao dia em combinação com uma refeição gordurosa alta por razões de saúde óbvias, assim uma formulação nova será necessária que forneça exposição aumentada de uma dose inferior e que elimine a necessidade de uma refeição gordurosa alta.
[0055] Desse modo os dados clínicos mostram que um método para melhorar a exposição deste fármaco de doses inferiores e na ausência de uma refeição gordurosa alta é necessário.
[0056] Desse modo os dados iniciais nos pró-fármacos desta invenção surpreendentemente prognosticam que eles melhorarão a exposição das moléculas como IVa e liberarão os fármacos de origem em concentrações que permitirão usar as fármacos na ausência de refeições gordurosas altas, com volume de cápsula inferior, e cronicamente como um componente de terapia anti-retrovirótica.
[0057] Dados iniciais obtidos de doseamento de cápsulas sólidas ou pró-fármaco Iab (sal de lisina) ou molécula de origem sólida (IVa) em cachorros estão resumidos no primeiro gráfico de barras figura 2A da figura 2. Como pode ser visto, após doseamento do pró-fármaco Iab (sal de mono lisina) em cachorros ou em jejum ou alimentados com uma refeição gordurosa alta, a exposição é surpreendentemente
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24/233 alta quando comparada ao doseamento de molécula de origem. Também, o efeito do estado em jejum vs alimentado é mínimo, se houver, para o pró-fármaco ainda tem um efeito óbvio na exposição após doseamento da molécula de origem sólida. Desse modo, surpreendentemente, a exposição da molécula de origem após doseamento do prófármaco, não mostra nenhuma dependência de uma refeição gordurosa alta que prognostica níveis de exposição mais consistentes após doseamento que aqueles da molécula de origem. O gráfico de barras na figura 2B resume os dados humanos previamente debatidos para molécula de origem IVa e mostra a dependência de exposição pela molécula na refeição gordurosa alta, os aumentos não-proporcionais em exposição vs dose e a exposição melhor de dosar uma solução ao invés da formulação sólida. Como debatido abaixo, isto mostra exposição limitada por taxa de dissolução ou de absorção que, em modelos pré-clínicos, parece ser surpreendentemente melhorada por meio do uso do pró-fármaco de fosfato. O uso dos pró-fármacos de fosfato também aumentou a exposição em cachorro em jejum vs origem para dois outros pró-fármacos. Detalhes destes experimentos estão contidos na seção experimental. Além disso, detalhes de vários estudos em ratos, cachorros e macacos para dois exemplos de pró-fármaco adicionais e em ratos para outros dois pró-fármacos demonstram a utilidade surpreendente destes pró-fármacos para aumentar a exposição acima da obtida com molécula de origem em doses que correlatam com as prováveis de ser de utilidade para o tratamento e inibição de replicação viral de HIV.
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Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 39/244
36/233 indolylglyoxylamides as antitumor agents. Ped. de Pat. do PCT (2002), 4W0 2002010152A2 c) Nickel, Bernd; Klenner, Thomas; Bacher, Gerald; Beckers, Thomas; Emig, Peter; Engel, Juergen; Bruyneel, Erik; Kamp, Guenter; Peters, Kirsten. Indolyl-3-glyoxylic acid derivatives comprising therapeutically valuable properties. Ped. de Pat. do PCT (2001), WO 2001022954A2.
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Kadow, John F.; Zhang, Zhongxing; Yang, Zhong. Bicyclo 4.4.0 antiviral derivatives Ped. de Pat. do PCT (2003), WO 2003092695A1.
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00170] A presente invenção compreende compostos da fórmula I, suas formulações farmacêuticas e seu uso em pacientes que sofrem
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37/233 ou suscetíveis a um vírus como HIV. Os compostos da fórmula I, que incluem sais farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos destes, têm a fórmula e significado como descritos abaixo.
[00171] A presente invenção compreende um composto da fórmula I,
R1 i
X>
Figure BRPI0508876B1_D0006
OP(O)(OE)2
[00172] em que:
[00173] X é C ou N com a condição que quando X for N, R1 não exista;
[00174] W é C ou N com a condição que quando W for N, R2 não exista;
[00175] V é C;
[00176] R1 é hidrogênio, metóxi ou halogênio;
[00177] R2 é hidrogênio;
[00178] R3 é metóxi ou heteroarila, cada um destes pode ser de forma independente opcionalmente substituído com um substituinte selecionado de G; em que heteroarila é triazolila, pirazolila ou oxadiazolila;
[00179] E é hidrogênio ou um mono ou bis sal farmaceuticamente aceitável deste;
[00180] Y é selecionado do grupo que consiste em
R15 r16
N-R18 ''R17 t~t-r17
R15 r16
[00181] R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 são cada um indepen
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38/233 dentemente H ou metila, com a condição que não mais que dois de rio_ri7 sejam metila;
[00182] R18 é selecionado do grupo que consiste em C(O)_fenila, C(O)_piridinila, piridinila, pirimidinila, quinolinila, isoquinolinila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila, ftalazinila, azabenzofurila e azaindolila, cada uma destas pode ser de forma independente opcionalmente substituída com de um a dois membros selecionados do grupo que consiste em metila, -amino, -NHMe, _NMe2, metóxi, hidroximetila e ha_ logênio;
[00183] D é selecionado do grupo que consiste em ciano, S(O)2R24, halogênio, C(O)NR21R22, fenila e heteroarila; em que a dita fenila ou heteroarila é de forma independente opcionalmente substituída com um a três halogênios iguais ou diferentes ou de um a três substituintes iguais ou diferentes selecionados de G; em que heteroarila é selecionada do grupo que consiste em piridinila e oxadiazolila;
[00184] A é selecionado do grupo que consiste em fenila, piridinila, furila, tienila, isoxazolila e oxazolila em que a dita fenila, piridinila, furila, tienila, isoxazolila e oxazolila são de forma independente opcionalmente substituídas com um a três halogênios iguais ou diferentes ou de um a três substituintes iguais ou diferentes selecionados de G;
[00185] G é selecionado do grupo que consiste em (C1_6)alquila, (C16) alquenila, fenila, hidróxi, metóxi, halogênio, -NR23C(O)-(C1-6)alquila, NR24R25, -S(O)2NR24R25, COOR26 e -CONR24R25; em que a dita (C16)alquila é opcionalmente substituída com hidróxi, dimetilamino ou um a três halogênios iguais ou diferentes;
[00186] R26 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e (C1-6) alquila;
[00187] R20, R21, R22, R23, R24, R25 são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, (C1-6)alquila e (CH2)nNR27R28;
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39/233
[00188] n é 0-6; e
[00189] R27 e R28 são cada um independentemente H ou metila.
[00190] Uma modalidade mais preferida é os compostos acima em que:
[00191] X e W são cada N;
[00192] ou compostos acima em que:
[00193] X é C; e
[00194] W é N.
[00195] Outra modalidade preferida é compostos como descritos acima em que:
[00196] R18 é -C(O)-Ph; e
[00197] Y é
Figure BRPI0508876B1_D0007
[00198] Outra modalidade preferida é os compostos como descritos acima em que:
[00199] R3 é metóxi ou triazolila; em que a dita triazolila é opcio nalmente substituída com um substituinte selecionado de G;
[00200] R10-R17 são cada um H; e
[00201] G é metila.
[00202] Outra modalidade preferida é os compostos como descritos acima em que:
[00203] R1 é F e R3 é 1,2,3-triazolila ligada na posição N-1.
[00204] Outra modalidade preferida é os compostos como descritos acima em que:
[00205] R1 é OMe e R3 é 3-metil-1,2,4-triazolila ligada na posição N1.
[00206] Outra modalidade preferida é os compostos como descritos acima em que:
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40/233
[00207] R1 e R3 são cada metóxi.
[00208] Outra modalidade preferida é os compostos como descritos acima em que o sal é sódio, lisina ou trometamina.
[00209] Outra modalidade preferida da invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz antiviral de um composto da fórmula I, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis destes, e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
[00210] Outra modalidade preferida é a composição farmacêutica acima, útil para tratar infecção por HIV que adicionalmente compreende uma quantidade eficaz antiviral de um agente de tratamento de AIDS selecionado do grupo que consiste em: [00211 ] (a) um agente antiviral de AIDS;
[00212] (b) um agente antiinfeccioso;
[00213] (c) um imunomodulador; e
[00214] (d) inibidores de entrada de HIV.
[00215] Também abrangido pelas modalidades é um método para tratar um mamífero infetado com o vírus de HIV compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz antiviral de um composto da fórmula I, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis destes, e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
[00216] Outra modalidade é método descrito acima, compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz antiviral de um composto da fórmula I, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis destes, em combinação com uma quantidade eficaz antiviral de um agente de tratamento de AIDS selecionado do grupo que consiste em um agente antiviral de AIDS; um agente antiinfeccioso; um imunomodulador; e um inibidor de entrada de HIV.
[00217] Outra modalidade é os compostos intermediários da fórmuPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 44/244
41/233 la II, úteis em fazer os compostos I,
Figure BRPI0508876B1_D0008
r3 L ^OP(OL)(OM)
Π o
[00218] em que:
[00219] X é C ou N com a condição que quando X for N, R1 não exista;
[00220] W é C ou N com a condição que quando W for N, R2 não exista;
[00221] V é C;
[00222] R1 é hidrogênio, metóxi ou halogênio;
[00223] R2 é hidrogênio;
[00224] R3 é metóxi ou heteroarila, cada um destes pode ser de forma independente opcionalmente substituído com um substituinte selecionado de G; em que heteroarila é triazolila, pirazolila ou oxadiazolila;
[00225] L e M são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alquila, fenila, benzila, trialquilsilila, -
2,2,2-tricloroetóxi e 2-trimetilsililetóxi com a condição que não mais que um de L e M possa ser hidrogênio;
[00226] Y é selecionado do grupo que consiste em
Figure BRPI0508876B1_D0009
e
[00227] R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 são cada um independentemente H ou metila, com a condição que não mais que dois de
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42/233 rio_ri7 sejam metila;
[00228] R18 é selecionado do grupo que consiste em C(O)_fenila, C(O)_piridinila, piridinila, pirimidinila, quinolinila, isoquinolinila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila, ftalazinila, azabenzofurila e azaindolila, cada um destes pode ser de forma independente opcionalmente substituído com de um a dois membros selecionados do grupo que consiste em metila, -amino, -NHMe, _NMe2, metóxi, hidroximetila e halogênio;
[00229] D é selecionado do grupo que consiste em ciano, S(O)2R24, halogênio, C(O)NR21R22, fenila e heteroarila; em que a dita fenila ou heteroarila é de forma independente opcionalmente substituída com um a três halogênios iguais ou diferentes ou de um a três substituintes iguais ou diferentes selecionados de G; em que heteroarila é selecionada do grupo que consiste em piridinila e oxadiazolila;
[00230] A é selecionado do grupo que consiste em fenila, piridinila, furila, tienila, isoxazolila e oxazolila em que a dita fenila, piridinila, furila, tienila, isoxazolila e oxazolila são de forma independente opcionalmente substituídas com um a três halogênios iguais ou diferentes ou de um a três substituintes iguais ou diferentes selecionados de G;
[00231] G é selecionado do grupo que consiste em (Ci-s)alquila, (Ci6) alquenila, fenila, hidróxi, metóxi, halogênio, -NR23C(O)-(Ci-6)alquila, NR24R25, -S(O)2NR24R25, COOR26 e -CONR24R25; em que a dita (Ci6)alquila é opcionalmente substituída com hidróxi, dimetilamino ou um a três halogênios iguais ou diferentes;
[00232] R26 é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e (Ci-6) alquila;
[00233] R20, R2i, R22, R23, R24, R25 são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, (Ci-6)alquila e (CH2)nNR27R28;
[00234] R27 e R28 são cada um independentemente H ou metila; e
[00235] n é 0-6.
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BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00236] Figura 1 ilustra AUC (Área Sob a Curva) Versus Dosagem em Experimentações Clínicas Humanas para o Composto IVa.
[00237] Figura 2 ilustra AUC para o Composto IVa e Pró-fármaco Iab Sob Condições em Jejum e Alimentadas em Estudos em Cachorro e seres Humanos
[00238] Figura 3 ilustra AUC Oral de IVc em Ratos versus Diagramas de Dose
[00239] Figura 4 ilustra Cmax Oral de IVc em Ratos versus Diagramas de Dose
[00240] Figura 5 ilustra Perfis de Plasma de IVc em Ratos Após Doseamento Oral de Ic
[00241] Figura 6 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVa em Ratos Machos Dados IVa ou Iab
[00242] Figura 7 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVa em Cachorros Dados IVa ou Iab
[00243] Figura 8 ilustra Hidrólise de Iab em Soluções de ALP placentária humana e a Formação de IVa
[00244] Figura 9 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Iab e IVa Seguindo Administração IV e Oral de Iab em Ratos e dos Dados Históricos de IVa em Ratos
[00245] Figura 10 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Iab e IVa Seguindo Administração IV e Oral de Iab em Cachorros e dos Dados Históricos de IVa em Cachorros
[00246] Figura 11 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Iab e IVa Seguindo Administração IV Oral de Iab em Macacos e dos Dados Históricos de IVa em Macacos
[00247] Figura 12 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVb em Ratos Machos Dados IVb ou Ibb
[00248] Figura 13 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVb em
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44/233
Cachorros Dados IVb ou Ibb
[00249] Figura 14 ilustra Hidrólise de Ibb em Soluções de ALP placentária humana e a Formação de IVb
[00250] Figura 15 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Ibb e IVb Seguindo Administração Oral de IV e Ibb no Rato e os Dados Históricos de IVb no Rato
[00251] Figura 16 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Ibb e IVb Seguindo Administração IV e Oral de Ibb no Cachorro e os Dados Históricos de IVb no Cachorro
[00252] Figura 17 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Ibb e IVb Seguindo Administração Oral de IV e Ibb no Macaco e os Dados Históricos de IVb no Macaco
[00253] Figura 18 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVc em Ratos Machos Dados IVc ou Icb
[00254] Figura 19 ilustra Comparação de Cmax e AUC de IVc em Cachorros Dados IVc ou Icb
[00255] Figura 20 ilustra Hidrólise de Icb em Soluções de ALP placentária humana e a Formação de IVc
[00256] Figura 21 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Icb e IVc Seguindo Administração Oral de IV e Icb no Rato e os Dados Históricos de IVc no Rato
[00257] Figura 22 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Icb e IVc Seguindo Administração Oral de IV e Icb no Cachorro e os Dados Históricos de IVc no Cachorro
[00258] Figura 23 ilustra Concentração de Plasma Versus Perfis de Tempo de Icb e IVc Seguindo Administração Oral de IV e Icb no Macaco e os Dados Históricos de IVc no Macaco.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00259] Uma vez que os compostos da presente invenção podem possuir centros assimétricos e portanto podem ocorrer como misturas
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45/233 de diastereômeros e enantiômeros, a presente invenção inclui as formas diastereoisoméricas e enantioméricas individuais dos compostos da fórmula I além das misturas destes.
DEFINIÇÕES
[00260] O termo C1-6 alquila como aqui usado e nas reivindicações (a menos que do contrário especificado) significa grupos alquila de cadeia reta ou ramificada como metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, t-butila, amila, hexila e similares.
[00261] Halogênio refere-se a cloro, bromo, iodo ou flúor.
[00262] Um grupo arila refere-se a uns grupos monocíclicos ou policíclicos de anel fundido todos carbono (isto é, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos de carbono) tendo um sistema de pielétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupos arila são fenila, naftalenila e antracenila. O grupo arila pode ser substituído ou não-substituído. Quando substituído o(s) grupo(s) substituído(s) é/são preferivelmente um ou mais selecionados de alquila, cicloalquila, arila, heteroarila, heteroalicíclico, hidróxi, alcóxi, arilóxi, heteroarilóxi, heteroaliciclóxi, tioidróxi, tioarilóxi, tioeteroarilóxi, tioeteroaliciclóxi, ciano, halogênio, nitro, carbonila, O-carbamila, Ncarbamila, C-amido, N-amido, C-carbóxi, O-carbóxi, sulfinila, sulfonila, sulfonamido, trialometila, ureído, amino e -NRxRy, em que Rx e Ry são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, cicloalquila, arila, carbonila, C-carbóxi, sulfonila, trialometila, e, combinados, um anel heteroalicíclico de cinco ou seis membros.
[00263] Como aqui usado, um grupo heteroarila refere-se a um grupo de anel monocíclico ou fundido (isto é, anéis que compartilham um par adjacente de átomos) tendo no(s) anel(éis) um ou mais átomos selecionados do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre e, além disso, tendo um sistema de pi-elétron completamente conjugado. A menos que do contrário indicado, o grupo heteroarila pode ser
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46/233 ligado a um átomo de carbono ou de nitrogênio dentro do grupo heteroarila. Deveria ser observado que o termo heteroarila é intencionado abranger um N-óxido do heteroarila de origem se um tal N-óxido for quimicamente possível como é conhecido na técnica. Exemplos, sem limitação, de grupos heteroarila são furila, tienila, benzotienila, tiazolila, imidazolila, oxazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, benzotiazolila, triazolila, tetrazolila, isoxazolila, isotiazolila, pirrolila, piranila, tetraidropiranila, pirazolila, piridila, pirimidinila, quinolinila, isoquinolinila, purinila, carbazolila, benzoxazolila, benzimidazolila, indolila, isoindolila, pirazinila, diazinila, pirazina, triaziniltriazina, tetrazinila e tetrazolila. Quando substituído o(s) grupo(s) substituído(s) é/são preferivelmente um ou mais selecionados de alquila, cicloalquila, arila, heteroarila, heteroalicíclico, hidróxi, alcóxi, arilóxi, heteroarilóxi, heteroaliciclóxi, tioidróxi, tioarilóxi, tioeteroarilóxi, tioeteroaliciclóxi, ciano, halogênio, nitro, carbonila, Ocarbamila, N-carbamila, C-amido, N-amido, C-carbóxi, O-carbóxi, sulfinila, sulfonila, sulfonamido, trialometila, ureído, amino e -NRxRy, em que Rx e Ry são como definidos acima.
[00264] Como aqui usado, um grupo heteroalicíclico refere-se a um grupo de anel monocíclico ou fundido tendo no(s) anel(éis) um ou mais átomos selecionados do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. Anéis são selecionados daqueles que fornece arranjos estáveis de ligações e não são intencionados abranger sistemas que não existiriam. Os anéis podem também ter uma ou mais ligações duplas. Porém, os anéis não têm um sistema de pi-elétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupos heteroalicíclicos são azetidinila, piperidila, piperazinila, imidazolinila, tiazolidinila, 3pirrolidin-1-ila, morfolinila, tiomorfolinila e tetraidropiranila. Quando substituído o(s) grupo(s) substituído(s) é/são preferivelmente um ou mais selecionados de alquila, cicloalquila, arila, heteroarila, heteroalicíclico, hidróxi, alcóxi, arilóxi, heteroarilóxi, heteroaliciclóxi, tioidróxi,
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47/233 tioalcóxi, tioarilóxi, tioeteroarilóxi, tioeteroaliciclóxi, ciano, halogênio, nitro, carbonila, tiocarbonila, O-carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, N-tiocarbamila, C-amido, C-tioarnido, N-amido, C-carbóxi, O-carbóxi, sulfinila, sulfonila, sulfonamido, trialometanossulfonamido, trialometano-sulfonila, silila, guanila, guanidino, ureído, fosfonila, amino e NRxRy, em que Rx e Ry são como definidos acima.
[00265] Um grupo alquila refere-se a um hidrocarboneto alifático saturado incluindo grupos de cadeia reta e ramificada. Preferivelmente, o grupo alquila tem 1 a 20 átomos de carbono (sempre que uma faixa numérica; por exemplo, 1-20, for declarada aqui, significa que o grupo, neste caso o grupo alquila pode conter 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. até e incluindo 20 átomos de carbono). Mais preferivelmente, é uma alquila de tamanho médio tendo 1 a 10 átomos de carbono. O mais preferivelmente, é uma alquila inferior tendo 1 a 4 átomos de carbono. O grupo alquila pode ser substituído ou não-substituído. Quando substituído, o(s) grupo(s) de substituinte é preferivelmente um ou mais individualmente selecionados de trialoalquila, cicloalquila, arila, heteroarila, heteroalicíclico, hidróxi, alcóxi, arilóxi, heteroarilóxi, heteroaliciclóxi, tioidróxi, tioalcóxi, tioarilóxi, tioeteroarilóxi, tioeteroaliciclóxi, ciano, halo, nitro, carbonila, tiocarbonila, O-carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, Ntiocarbamila, C-amido, C-tioamido, N-amido, C-carbóxi, O-carbóxi, sulfinila, sulfonila, sulfonamido, trialometanossulfonamido, trialometanosulfonila, e combinados, um anel heteroalicíclico de cinco ou seis membros.
[00266] Um grupo cicloalquila refere-se a um grupo de anel monocíclico ou fundido todos carbono (isto é, anéis que compartilham par adjacente de átomos de carbono) em que um ou mais anéis não têm um sistema de pi-elétron completamente conjugado. Exemplos, sem limitação, de grupos cicloalquila são ciclopropano, ciclobutano, ciclo
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48/233 pentano, ciclopenteno, cicloexano, cicloexadieno, cicloeptano, cicloeptatrieno e adamantano. Um grupo cicloalquila pode ser substituído ou não-substituído. Quando substituído, o(s) grupo(s) de substituinte é/são preferivelmente um ou mais individualmente selecionados de alquila, arila, heteroarila, heteroalicíclico, hidróxi, alcóxi, arilóxi, heteroarilóxi, heteroaliciclóxi, tioidróxi, tioalcóxi, tioarilóxi, tioeteroarilóxi, tioeteroaliciclóxi, ciano, halo, nitro, carbonila, tiocarbonila, O-carbamila, Ncarbamila, O-tiocarbamila, N-tiocarbamila, C-amido, C-tioamido, Namido, C-carbóxi, O-carbóxi, sulfinila, sulfonila, sulfonamido, trialometanossulfonamido, trialometano-sulfonila, silila, guanila, guanidino, ureído, fosfonila, amino e NRxRy com Rx e Ry como definidos acima.
[00267] Um grupo alquenila refere-se a um grupo alquila, como definido aqui, consistindo em pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono.
[00268] Um grupo alquinila refere-se a um grupo alquila, como definido aqui, consistindo em pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono.
[00269] Um grupo hidróxi refere-se a um grupo -OH.
[00270] Um grupo alcóxi refere-se a um grupo de -O-alquila e um de -O-cicloalquila como definidos aqui.
[00271] Um grupo arilóxi refere-se a um grupo -O-arila e um -Oheteroarila, como definidos aqui.
[00272] Um grupo heteroarilóxi refere-se a um grupo heteroaril-O com heteroarila como definida aqui.
[00273] Um grupo heteroaliciclóxi refere-se a um grupo heteroalicíclico-O- com heteroalicíclico como definido aqui.
[00274] Um tioidróxi grupo refere-se a um grupo -SH.
[00275] Um grupo tioalcóxi refere-se a um grupo S-alquila e um S-cicloalquila, como definidos aqui.
[00276] Um grupo tioarilóxi refere-se tanto a um grupo -S-arila e
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49/233 um -S-heteroarila, como definidos aqui.
[00277] Um grupo tioeteroarilóxi refere-se a um grupo heteroarilS- com heteroarila como definida aqui.
[00278] Um grupo tioeteroaliciclóxi refere-se a um grupo heteroalicíclico-S- com heteroalicíclico como definido aqui.
[00279] Um grupo carbonila refere-se a um grupo -C(=O)-R onde R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, arila, heteroarila (ligado através de um carbono de anel) e heteroalicíclico (ligado através de um carbono de anel), como cada um sendo definido aqui.
[00280] Um grupo aldeído refere-se a um grupo carbonila onde R é hidrogênio.
[00281] Um grupo tiocarbonila refere-se a um grupo -C(=S)-R, com R como definido aqui.
[00282] Um grupo Ceto refere-se a um grupo -CC(=O)C- em que o carbono em qualquer um ou ambos os lados do C=O pode ser alquila, cicloalquila, arila ou um carbono de um grupo heteroarila ou heteroaliacíclico.
[00283] Um grupo trialometanocarbonila refere-se a um grupo Z3CC(=O)- com o dito Z sendo um halogênio.
[00284] Um grupo C-carbóxi refere-se a um grupo -C(=O)O-R, com R como definido aqui.
[00285] Um grupo O-carbóxi refere-se a um grupo RC(=O)O-, com R como definido aqui.
[00286] Um grupo ácido carboxílico refere-se a um grupo Ccarbóxi em que R é hidrogênio.
[00287] Um grupo trialometila refere-se a um grupo -CZ3, grupo em que Z é um grupo halogênio como definido aqui.
[00288] Um grupo trialometanossulfonila refere-se a um grupo Z3CS(=O)2- com Z como definido acima.
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[00289] Um grupo trialometanossulfonamido refere-se a um grupo Z3CS(=O)2NRx- com Z e Rx como definido aqui.
[00290] Um grupo sulfinila refere-se a um grupo -S(=O)-R, com R como definido aqui e, além disso, como uma ligação apenas; isto é, -S(O)-.
[00291] Um grupo sulfonila refere-se a um grupo -S(=O)2R com R como definido aqui e, além disso como uma ligação apenas; isto é, -S(O)2-.
[00292] Um grupo S-sulfonamida refere-se a um grupo S(=O)2NRxRy, com Rx e Ry como definido aqui.
[00293] Um grupo N-Sulfonamido refere-se a um grupo
RS(=O)2NRx- com Rx como definido aqui.
[00294] Um grupo O-carbamila refere-se a um grupo OC(=O)NRxRy como definido aqui.
[00295] Um grupo N-carbamila refere-se a um grupo
RxOC(=O)NRy, com Rx e Ry como definido aqui.
[00296] Um grupo O-tiocarbamila refere-se a um grupo OC(=S)NRxRy com Rx e Ry como definido aqui.
[00297] Um grupo N-tiocarbamila refere-se a um grupo RxOC(=S)NR3- com Rx e Ry como definido aqui.
[00298] Um grupo amino refere-se a um grupo -NH2.
[00299] Um grupo C-amido refere-se a um grupo -C(=O)NRxRy com Rx e Ry como definido aqui.
[00300] Um grupo C-tioamido refere-se a um grupo -C(=S)NRxRy, com Rx e Ry como definido aqui.
[00301] Um grupo N-amido refere-se a um grupo RxC(=O)NR3-, com Rx e Ry como definido aqui.
[00302] Um grupo ureído refere-se a um grupo NRxC(=O)NRyRy2 com Rx e Ry como definido aqui e Ry2 definido igual a Rx e Ry.
[00303] Um grupo tioureído refere-se a um grupo
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NRxC(=S)NRyRy2 com Rx e Ry como definido aqui e Ry2 definido igual a Rx e Ry.
[00304] Um grupo guanidina refere-se a um grupo RxNC(=N)NRyRy2, com Rx, Ry e Ry2 como definido aqui.
[00305] Um grupo guanila refere-se a um grupo RxRyNC(=N)-, com Rx e Ry como definido aqui.
[00306] Um grupo ciano refere-se a um grupo -CN.
[00307] Um grupo silila refere-se a um grupo -Si(R)3, com R como definido aqui.
[00308] Um grupo fosfonila refere-se a um P(=O)(ORx)2 com Rx como definido aqui.
[00309] Um grupo hidrazino refere-se a um grupo de NRxNRyRy2 com Rx, Ry e Ry2 como definido aqui.
[00310] Qualquer dois grupos R adjacentes podem combinar para formar um anel adicional de arila, cicloalquila, heteroarila ou heterocíclico fundido ao anel que inicialmente carrega aqueles grupos R.
[00311] É conhecido na técnica que os átomos de nitrogênio nos sistemas de heteroarila podem ser participantes em uma ligação dupla do anel de heteroarila, e isto se refere à forma de ligações duplas nas duas estruturas tautoméricas que compreendem grupos heteroarila de anel de cinco membros. Isto dita se os nitrogênios podem ser substituídos como bem entendido por químicos na técnica. A descrição e reivindicações da presente invenção são com base nos princípios gerais conhecidos de ligação química. É entendido que as reivindicações não abrangem estruturas conhecidas ser instáveis ou não capazes de existir com base na literatura.
[00312] Sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de prófármaco descritos aqui estão dentro do escopo desta invenção. O termo sal farmaceuticamente aceitável como aqui usado e nas reivindicações é intencionado incluir sais de adição de base não-tóxicos. O
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52/233 termo sal farmaceuticamente aceitável como aqui usado é também intencionado incluir sais de grupos acídicos, como um carboxilato ou fosfato ou éster de mono de fosfato, com tais contraíons como amônio, sais de metal alcalino, particularmente sódio ou potássio, sais de metal alcalino-terroso, particularmente cálcio ou magnésio, sais de metal de transição como zinco e sais com bases orgânicas adequadas como alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, cicloexilamina e similares) ou com alquilaminas inferiores substituídas (por exemplo, alquilaminas hidroxil-substituídas como dietanolamina, trietanolamina ou mono trometamina (também chamada TRIS ou 2-amino-2-(hidroximetil) propano-1,3-diol) tris(hidroximetil)-aminometano), lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina, ou com bases como piperidina ou morfolina. É entendido que ambos os sais farmaceuticamente aceitáveis, quando isolados em forma sólida ou cristalina, também incluem hidratos ou moléculas de água dentro da substância resultante do Composto I. Possibilidades de estequiometria são bem conhecidas àqueles na técnica. Debates de sais farmaceuticamente aceitáveis e listas de possíveis sais estão contidos nas referências a seguir:
[00313] Preparation of water-soluble compounds through salt formation. Stahl, P. Heinrich. Cosmas Consult, Freiburg im Breisgau, Germany. Editor(s): Wermuth, Camille Georges. Practice of Medicinal Chemistry (2a Edição) (2003), 601-615. Publicador: Elsevier, Londres, UK CODEN: 69EOEZ.
[00314] Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use by Stahl, P. Heinrich, Wermuth, Camille G., International Union of Pure and Applied Chemistry. Weinheim; Nova Yorque: VHCA ; Wiley-VCH, 2002.
[00315] Em outro aspecto da invenção, novos Compostos II de intermediário de éster de fosfato são descritos.
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Figure BRPI0508876B1_D0010
d3 I ^OP(OL)(OM) π o
[00316] No caso de ésteres de fosfato, a possibilidade de mono ou bis existe e ambos são abrangidos por esta invenção.
[00317] No método da presente invenção, o termo quantidade eficaz antiviral significa a quantidade total de cada componente ativo do método que é suficiente para mostrar um benefício significante ao paciente, isto é, cura de condições agudas caracterizadas por inibição da infecção por HIV. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, o termo refere-se àquele ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos resultando no efeito terapêutico, se administrados em combinação, serial ou simultaneamente. Os termos tratar, tratando, tratamento como aqui usados e nas reivindicações significam impedir ou melhorar doenças associadas à infecção por HIV.
[00318] A presente invenção é também direcionada às combinações dos compostos com um ou mais agentes úteis no tratamento de AIDS. Por exemplo, os compostos desta invenção podem ser administrados eficazmente, quer em períodos de pré-exposição e/ou pósexposição, em combinação com quantidades eficazes dos antivirais de AIDS, imunomoduladores, antiinfectivos ou vacinas, como aqueles na tabela a seguir.
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ANTIVIRAIS
NOME DO FÁRMACO FABRICANTE INDICAÇÃO
097 Hoechst/Bayer Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de transcriptase reversa de não-nucleosídeo (RT))
Amprenavir 141 W94 GW 141 Glaxo Wellcome Infecção por HIV, AIDS, ARC, (inibidor de protease)
Abacavir (1592U89) GW 1592 Glaxo Wellcome Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de RT)
Acemannan Carrington Labs (Irving, TX) ARC
Aciclovir Burroughs Wellcome infecção por HIV, AIDS, ARC, em combinação com AZT
AD-439 Tanox Biosystems Infecção por HIV, AIDS, ARC
AD-519 Tanox Biosystems Infecção por HIV, AIDS, ARC
Adefovir Dipivoxila AL- Gilead Sciences Etigen (Los Infecção por HIV, ARC, PGL,
721 Angeles, CA) HIV positivo, AIDS
Interferona alfa Glaxo Wellcome Sarcoma de Kaposi, HIV em combinação c/ Retrovir
Ansamicina LM 427 Adria Laboratories (Dublin, OH) Erbamont (Stamford, CT) ARC
Anticorpo que neutraliza pH lábil de Interferona alfa aberrante Advanced Biotherapy Concepts (Rockville, MD) AIDS, ARC
AR177 Aronex Pharm Infecção por HIV, AIDS, ARC
Beta-fluoro-ddA Nat'l Cancer Institute Doenças associadas a AIDS
BMS-232623 (CGP- Bristol-Myers Infecção de HIV, AIDS, ARC
73547) Squibb/Novartis (inibidor de protease)
BMS-234475 (CGP- Bristol-Myers Infecção por HIV, AIDS, ARC
61755) Squibb/Novartis (inibidor de protease)
CI-1012 Warner-Lambert Infecção por HIV-1
Cidofovir Gilead Science retinite de CMV, herpes, papilomavírus
Sulfato de Curdlano AJI Pharma USA Infecção por HIV
Imunoglobulina de citomegalovírus Medlmmune Retinite de CMV
Cytovene Ganciclovir Syntex Ameaça da visão CMV, CMV periférico, retinite
Delaviridina Pharmacia-Upjohn Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de RT)
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Sulfato de dextrano Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japão) AIDS, ARC, HIV positivo assintomático
ddC Didesoxicitidina Hoffman-La Roche Infecção por HIV, AIDS, ARC
ddl Didesoxiinosina Bristol-Myers Squibb Infecção por HIV, AIDS, ARC; combinação com AZT/d4T
DMP-450 AVID (Camden, NJ) Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de protease)
Efavirenz (DMP 266) (-)6-Cloro-4-(S)ciclopropiletinil-4(S)trifluoro-metil-1,4diidro-2H-3,1benzoxazin-2-ona, STOCRINA DuPont Merck Infecção por HIV, AIDS, ARC, (inibidore de RT de nãonucleosídeo)
EL10 Elan Corp, PLC (Gainesville, GA) Infecção por HIV
Famciclovir Smith Kline herpes zóster, herpes simples
FTC Emory University Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de transcriptase reversa)
GS 840 Gilead Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de transcriptase reversa)
HBY097 Hoechst Marion Roussel Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de transcriptase reversa de não-nucleosídeo)
Hipericina VIMRx Pharm. Infecção por HIV, AIDS, ARC
Interferona beta hu- Triton Biosciences AIDS, sarcoma de Kaposi,
mana recombinante (Almeda, CA) ARC
Interferona alfa-n3 Interferon Science ARC, AIDS
Indinavir Merck Infecção por HIV, AIDS, ARC, HIV positivo assintomático, também em combinação com AZT/ddI/ddC
ISIS 2922 ISIS Pharmaceuticals Retinite de CMV
KNI-272 Nat'l édute doenças assoc. a HIV
Lamivudina, 3TC Glaxo Wellcome Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de transcriptase reveras); também com AZT
Lobucavir Bristol-Myers Squibb Infecção por CMV
Nelfmavir Pharmaceuticals Agouron Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de protease)
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Nevirapina Boeheringer Ingleheim Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de RT)
Novapren Novaferon Labs, Inc. (Akron, OH) Inibidor de HIV
Seqüência de Octapeptídeo de Peptídeo T Peninsula Labs (Belmont, CA) AIDS
Fosfonoformato de Astra Pharm. Products, Retinite de CMV, infecção por
trissódio Inc. HIV, outras infecções por CMV
PNU-140690 Pharmacia Upjohn Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de protease)
Probucol Vyrex Infecção por HIV, AIDS
RBC-CD4 Sheffield éd. Tech (Houston, TX) Infecção por HIV, AIDS, ARC
Ritonavir Abbott Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de protease)
Saquinavir Estavudina; d4T Dideidrodeóxi-timidina Bristol-Myers Squibb H offm ann-LaRoche Infecção por HIV, AIDS, ARC (inibidor de protease) Infecção por HIV, AIDS, ARC
Valaciclovir Glaxo Wellcome Infecções genitais por HSV & CMV
Virazol Ribavirina Viratek/ICN (Costa Mesa, CA) HIV positivo assintomático, LAS, ARC
VX-478 Vertex Infecção por HIV, AIDS, ARC
Zalcitabina H offm ann-LaRoche Infecção por HIV, AIDS, ARC, com AZT
Zidovudina; AZT Glaxo Wellcome Infecção por HIV, AIDS, ARC, sarcoma de Kaposi, em combinação com outras terapias
Disoproxila de Tenofovir, sal de fumarato (Viread®) Gilead Infecção por HIV, AIDS, (inibidor de transcriptase reversa)
Emtriva® (Entricitabina) Gilead Infecção por HIV, AIDS, (inibidor de transcriptase reversa)
Combivir® GSK Infecção por HIV, AIDS, (inibidor de transcriptase reversa)
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Succinato de abacavir GSK (ou Ziagen®)
Reyataz® (ou atazanavir)
Fuzeon® (ou T-20)
Bristol-Myers Squibb
Roche / T rimeris
Lexiva® (ou Cálcio de GSK/Vertex fosamprenavir)
Infecção por HIV, AIDS, (inibidor de transcriptase reversa)
Infecção por HIV, AIDS, inibidor de protease
Infecção por HIV, AIDS, inibidor de Fusão viral,
Infecção por HIV, AIDS, inibidor de protease viral
IMUNOMODULADORES
NOME DO FÁRMACO FABRICANTE INDICAÇÃO
AS-101 Wyeth-Ayerst AIDS
Bropirimina Pharmacia Upjohn AIDS avançada
Acemannan Carrington Labs, Inc., (Irving, TX) AIDS, ARC
CL246.738 American Cyanamid Lederle Labs AIDS, sarcoma de Kaposi
FP-21399 Fuki ImmunoPharm Bloqueia fusão de HIV com células CD4+
Interferona gama Genentech ARC, em combinação c/ TNF (fator de necrose tumoral)
Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos Macrófagos Genetics Institute Sandoz AIDS
Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos Macrófagos Hoechst-Roussel Immunex AIDS
Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos Macrófagos Schering-Plough AIDS, combinação c/ AZT
Imunoestimulante de Partícula de Núcleo de HIV Rorer HIV Soropositivo
Interleucina-2 de IL-2 Cetus AIDS, em combinação, c/ AZT
Interleucina-2 de IL-2 Hoffman-LaRoche Inununex AIDS, ARC, HIV, em combinação c/ AZT
Interleucina-2 de IL-2 (aldeslucina) Chiron AIDS, aumento nas contagens de células CD4
Imuno Globulina Intravenosa (humana) Cutter Biological (Berkeley, CA) AIDS pediátrica, em combinação c/ AZT
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IMREG-1 Imreg (Nova Orleans, LA) AIDS, sarcoma de Kaposi, ARC, PGL
IMREG-2 Imreg (Nova Orleans, LA) AIDS, sarcoma de Kaposi, ARC, PGL
Ditio Carbamato de Imutiol Dietila Merieux Institute AIDS, ARC
Interferona Alfa-2 Schering Plough Sarcoma de Kaposi c/ AZT, AIDS
Metionina-Encefalina TNI Pharmaceutical (Chicago, IL) AIDS, ARC
Tripeptídeo de Muramil-MTP-PE Ciba-Geigy Corp. Sarcoma de Kaposi
Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos Macrófagos Amgen AIDS, em combinação c/ AZT
Remune Immune Responde Corp. Imunoterapêutico
CD4 Humano Solúvel Recombinante de rCD4 Genentech AIDS, ARC
Híbridos de rCD4-IgG AIDS, ARC
CD4 Humano Solúvel Recombinante Biogen AIDS, ARC
Interferona Alfa 2a Hoffman-La Roche Sarcoma de Kaposi, AIDS, ARC, em combinação c/ AZT
T4 Solúvel em SK&F106528 Smith Kline Infecção por HIV
Timopentina Imunobiology Research Institute (Annandale, NJ) Infecção por HIV
Fator de Necrose Tumoral; TNF Genentech ARC, em combinação c/ Interferona gama
ANTIINFECCIOSOS
NOME DO FÁRMACO FABRICANTE INDICAÇÃO
Clindamicina com Primaquina Pharmacia Upjohn PCP
Fluconazol Pfizer Meningite criptocócica, candidíase
Pastilha Pastilha de Nistatina Squibb Corp. Prevenção de candidíase oral
Eflornitina de Ornidil Merrell Dow PCP
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Pentamidina Isetionato (IM & IV) LyphoMed (Rosemont, IL) Tratamento de PCP
Trimetoprim Antibacteriano
Trimetoprim/sulfa Antibacteriano
Piritrexim Burroughs Wellcome Tratamento de PCP
Isetionato de Pentamidina para Inalação Fisons Corporation PCP
Espiramicina Rhone-Poulenc Diarréia por Cryptosporidium
Intraconazol-R51211 Janssen-Pharm. Histoplasmose; meningite criptocócica
Trimetrexato Warner-Lambert PCP
Daunorrubicina NeXstar, Sequus Sarcoma de Kaposi
Eritropoetina Humana Recombinante Ortho Pharm. Corp. Anemia severa assoc. com terapia de AZT
Hormônio de Crescimento Humano Recombinante Serono Cansaço relacionado a AIDS, caquexia
Acetato de megestrol Bristol-Myers Squibb Tratamento de anorexia assoc. c/ AIDS
Testosterona Alza, Smith Kline Cansaço relacionado à AIDS
Nutrição Enteral Total Norwich Eaton Pharmaceuticals Diarréia e má absorção relacionada a AIDS
[00319] Adicionalmente, os compostos da invenção aqui podem ser usados em combinação com outra classe de agentes para tratar AIDS que são chamados inibidores de entrada de HIV. Exemplos de tais inibidores de entrada de HIV são debatidos em DRUGS OF THE FUTURE 1999, 24(12), págs. 1355-1362; CELL, Vol. 9, págs. 243-246, 29 de out., 1999; e DRUG DISCOVERY TODAY, Vol. 5, No. 5, maio de 2000, págs. 183-194 e Inhibitors of the entry of HIV into host cells. Meanwell, Nicholas A.; Kadow, John F., Current Opinion in Drug Discovery & Develpment (2003), 6(4), 451-461. Especificamente os compostos podem ser utilizados em combinação com outros inibidores de ligação, inibidores de fusão e antagonistas de receptor de quimiocina apontados para o co-receptor de CCR5 ou CXCR4.
[00320] Será entendido que o escopo das combinações dos com
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60/233 postos desta invenção com antivirais de AIDS, imunomoduladores, antiinfecciosos, inibidores de entrada de HIV ou vacinas não são limitadas à lista na Tabela acima mas incluem, em princípio, qualquer combinação com qualquer composição farmacêutica útil para o tratamento de AIDS.
[00321] Combinações preferidas são tratamentos simultâneos ou alternados com um composto da presente invenção e um inibidor de protease de HIV e/ou um inibidor de transcriptase reversa de nãonucleosídeo de HIV. Um quarto componente opcional na combinação é um inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeo de HIV, como AZT, 3TC, ddC ou ddI. Um inibidor preferido de protease de HIV é Reyataz® (Atazanavir de ingrediente ativo). Tipicamente uma dose de 300 a 600 mg é administrada uma vez um dia. Esta pode ser coadministrada com uma baixa dose de Ritonavir (50 a 500 mg). Outro inibidor preferido de HIV protease é Kaletra®. Outro inibidor útil de HIV protease é indinavir que é o sal de sulfato de etanolato de N-(2(R)hidróxi-1-(S)-indanil)-2(R)-fenilmetil-4-(S)-hidróxi-5-(1-(4-(3-piridilmetil)-2(S)-N’-(t-butilcarboxamido)-piperazinil))-pentanoamida, e é sintetizado de acordo com U. S. 5.413.999. Indinavir é em geral administrado a uma dosagem de 800 mg três vezes ao dia. Outros inibidores de protease preferidos são nelfinavir e ritonavir. Outro inibidor preferido de protease de HIV é saquinavir que é administrado em uma dosagem de 600 ou 1200 mg tid. Inibidores de não-nucleosídeo preferidos de transcriptase reversa de HIV inclui efavirenz. A preparação de ddC, ddI e AZT é também descrita em EPO 0.484.071. Estas combinações podem ter efeitos inesperados em limitar a expansão e grau de infecção por HIV. Combinações preferidas incluem aquelas com o seguinte (1) indinavir com efavirenz, e, opcionalmente, AZT e/ou 3TC e/ou ddI e/ou ddC; (2) indinavir, e qualquer um de AZT e/ou ddI e/ou ddC e/ou 3TC, em particular, indinavir e AZT e 3TC; (3) estavudina e 3TC e/ou
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61/233 zidovudina; (4) zidovudina e lamivudina e 141W94 e 1592U89; (5) zidovudina e lamivudina.
[00322] Em tais combinações o composto da presente invenção e outros agentes ativos podem ser administrados separadamente ou em conjunção. Além disso, a administração de um elemento pode ser antes, simultânea ou subseqüente à administração de outro(s) agente(s). ABREVIAÇÕES
[00323] As abreviações a seguir, a maioria destas são abreviações bem convencionais conhecidas a aqueles versados na técnica, são usadas ao longo da descrição da invenção e dos exemplos. Algumas das abreviações usadas são como segue:
h = hora(s)
t.a. = temperatura ambiente mol = mol(s) mmol = millimol(s) g = grama(s) mg = miligrama(s) ml = mililitro(s)
TFA = Ácido trifluoroacético
DCE = 1,2-Dicloroetano
CH2Cl2 = Diclorometano
TPAP = Perrutenato de tetrapropilamônio
THF = Tetraidrofurano
DEPBT = 3-(Dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona
DMAP = 4-dimetilaminopiridina
P-EDC = 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida suporEDC
DMF
Base de Hunig tado por polímero
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
N,N-dimetilformamida
N,N-Diisopropiletilamina
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MCPBA Ácido meta-cloroperbenzóico
azaindol 1H-Pirrolo-piridina
4-azaindol 1H-pirrolo[3,2-b]piridina
5-azaindol 1H-Pirrolo[3,2-c]piridina
6-azaindol 1H-pirrolo[2,3-c]piridina
7-azaindol 1H-Pirrolo[2,3-b]piridina
4,6-diazaindol 5H-Pirrolo[3,2-d]pirimidina
5,6-diazaindol 1H-Pirrolo[2,3-d]piridazina
5,7-diazaindol 7H-Pirrolo[2,3-d]pirimidina
PMB 4-Metoxibenzila
DDQ 2,3-Dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
OTf T rifluorometanossulfonóxi
NMM 4-Metilmorfolina
PIP-COPh 1-Benzoilpiperazina
NaHMDS Hexametildissilazida de sódio
EDAC 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
TMS Trimetilsilila
DCM Diclorometano
DCE Dicloroetano
MeOH Metanol
THF Tetraidrofurano
EtOAc Acetato de etila
LDA Diisopropilamida de lítio
TMP-Li 2,2,6,6-tetrametilpiperidinil lítio
DME Dimetoxietano
DIBALH Hidreto de Diisobutilalumínio
HOBT 1-hidroxibenzotriazol
CBZ Benziloxicarbonila
PCC Clorocromato de Piridínio
TRIS = Trometamina ou 2-amino-2-(hidroximetil)propano-
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1,3-diol
QUÍMICA
[00324] A presente invenção compreende os compostos da fórmula I, suas formulações farmacêuticas e seu uso em pacientes que sofrem ou suscetível à infecção por HIV.
[00325] Esquema A descreve uma visão geral do processo para preparar os pró-fármacos I da invenção das moléculas de origem IV. ESQUEMA A
Figure BRPI0508876B1_D0011
Etapa A:
1) mocHsOPíÜXOPrh
Base/solve nte.'adifwo
Etapa EL
2} Cesproteçao (Remoção de Pr)
Figure BRPI0508876B1_D0012
Intermediarieis, protegidos Pr= grupa de proteção ttapa C:
------R
Figure BRPI0508876B1_D0013
rí l nrçojictk
1I Formação e Isolamento de sai cu tadarneriSo de ácida Jv re j
CompciEtos da Reivindicação 1
E = hidrogênio, ou como definido para formar mona □ u bis sal(armaceudcamente aceitável
ESQUEMA B
Figure BRPI0508876B1_D0014
IV
Etapa A. Preferido:
1) CJCHaOP(O)(OtBy)E
NaH f THFh í2 napa EL pMcnda:
2) TFAfCE^CI?
R1 O ‘Bu = grupo de proteção
Figure BRPI0508876B1_D0015
Compostos da Reivindicação t
E = hidrogênio, ou como delihitfo para formar mono ou bis sal farmacQuticamenfe aceitável
[00326] Para elaborar o método, como mostrado no Esquema A, o
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64/233 composto de origem antiviral de interesse, IV, é convertido no intermediário de fosfato II, por N-alquilação com intermediário de cloreto III, na presença de uma base adequada como hidreto de sódio, hidreto de potássio, amida de sódio, t-butóxido de sódio, (bis trimetilsilil) amida de sódio, (bis trimetil silil) amida de potássio ou combinações destes como hidreto de sódio mais bis (trimetilsilil) amida de sódio. A preparação do reagente III e a metodologia para o uso na preparação dos prófármacos pelos grupos hidróxi de alquilação foram descritas em Y. Ueda et. al. Patente U. S. 6.362.172B2 que é incorporada por referência em sua totalidade. As condições de alquilação, grupos de proteção, remoção do grupo de proteção e condições para formação de sal são em geral aplicáveis a nossa aplicação apesar do fato que nós estamos alquilando um azaindol no anel de indol ao invés de um grupo hidróxi. Na aplicação atual, de 1,1 a 5,0 equivalentes de base podem ser utilizados com entre 2 e 4 equivalentes sendo preferidos. De 1,1 até 12 equivalentes de reagente III podem ser usados com 5 a 10 sendo preferidos dependendo do substrato. O reagente pode ser adicionado com o passar do tempo em uma porção ou incrementalmente em várias porções. Uma fonte de íon de iodeto usualmente é adicionada à reação para fornecer rendimentos aumentados. Iodo elementar é correntemente preferido como a fonte de iodeto. 0,1 a 1,5 equivalente de iodo são usualmente adicionados por azaindol/indol NH sendo alquilado com 1,0 a 1,2 equivalente de iodo sendo preferido uma vez que os rendimentos são mais altos. Fontes alternadas de iodeto incluem, por exemplo, iodeto de sódio, iodeto de lítio, iodeto de césio, iodeto de cobre ou iodeto de amônio de tetrabutila. A função de iodo é presumivelmente para gerar o reagente de iodometila correspondente IIIa in situ do reagente de metila de cloro III. Os reagentes de iodo ou de bromo que correspondem a III puderam provavelmente ser usados diretamente na reação no lugar do cloreto III. A reação de alquilação da
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65/233 etapa A é usualmente realizada em um solvente orgânico inerte como tetraidrofurano em uma temperatura de cerca de 0° C a 50° C, mais preferivelmente entre 20° e 40° C. Outros solventes orgânicos anidros como tetraidrofurano de metila, éter de t-butila de metila, dioxano, éter de dimetila de etileno glicol, acetamida de dimetila ou N,Ndimetilformamida puderam também encontrar utilidade. Intermediário de éster II é depois submetido a uma etapa de desproteção convencional para remover os grupos de proteção Pr. Os reagentes usados em tal etapa dependerão do grupo de proteção usado, mas serão bem conhecidos a aqueles versados na técnica. O grupo de proteção mais preferido é o grupo t-butila que pode ser removido com ácido trifluoroacético, ácido hidroclórico ou ácido fórmico em um solvente orgânico inerte apropriado. O solvente inerte pode ser diclorometano, ou possivelmente, por exemplo, dicloroetano, tolueno ou benzeno de trifluorometila. Em cloreto de metileno, desproteção de ácido trifluoroacético pode ser realizada usando de 1 a 15 equivalentes de ácido (ou o ácido pode ser medido diferentemente como por exemplo uma solução a 5% em solvente por volume) e temperaturas de entre 0° e 40°. Em geral, quanto mais excesso de TFA empregado, mais baixa a temperatura utilizada. Condições exatas variam com o substrato. Etapa 3 descreve o isolamento do ácido livre ou sais que podem ser formados por meio de muitos modos padrões que são bem conhecidos na técnica. Em geral, seguindo desproteção de TFA, um processamento aquoso é empregado em que o ácido de excesso é neutralizado com uma base e as impurezas orgânicas removidas por meio de extração com um solvente orgânico como acetato de etila ou diclorometano. Por exemplo, NaOH aquoso de excesso pode ser usado para basificar a mistura de reação. Este é bem conhecido a qualquer químico versado na técnica. Reacidificação da fase aquosa para pH 2,5 com 1 N de HCl aquoso e depois extração com um solvente orgânico fornecerá, após
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66/233 remoção a vácuo do solvente, o ácido livre. O ácido livre pode ser convertido nos sais inorgânicos pela adição de bases apropriadas em solventes como água, metanol, etanol, etc. Por exemplo, adição de carbonato de sódio para uma solução aquosa de pró-fármaco de fosfato e ajuste do pH para aproximadamente 7,6 fornece uma solução que sob remoção de água por meio de liofilização deixa o sal de dissódio do pró-fármaco. Carbonato de potássio poderia ser similarmente usado. Soluções aquosas de bicarbonato de sódio ou bicarbonato de potássio poderiam ser usadas similarmente. Sais de monopotássio ou monossódio poderiam ser gerados por meio de titulação cuidadosa das soluções de ácido de fosfato com potássio ou 2-etil hexanoato de sódio. Sais de amina podem ser gerados dissolvendo o ácido livre em solventes orgânicos como acetato de etila ou acetonitrila ou álcoois de peso molecular baixo ou misturas destes solventes opcionalmente contendo água. Algumas aminas potencialmente úteis para a formação de sal incluem: alquilaminas inferiores (metilamina, etilamina, cicloexilamina e similares) ou alquilaminas inferiores substituídas (por exemplo, alquilaminas substituídas por hidroxila como dietanolamina, trietanolamina ou tris(hidroximetil)-aminometano), lisina, arginina, histidina, N-metilglucamina ou bases como piperidina ou morfolina. Adição lenta de uma amina a uma solução de agitação em temperatura baixa ou pode fornecer o mono de bis sal de amina dependendo da estequiometria. Sais de amina podem também ser obtidos agitando a solução e removendo o solvente a vácuo ao invés de cristalização ou precipitação. Procedimentos de recristalização variarão por composto e sal mas estarão disponíveis a um versado na técnica. Esquema B descreve uma seqüência preferida e conjunto de reagentes e condições para realizar a seqüência geral mostrada no Esquema A. Um substituto e em muitos casos o método preferido para realizar a seqüência na etapa C que inclui a desproteção do diéster para fornecer o intermediário
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67/233 de ácido in situ seguido por formação de sal no meio de reação pode ser utilizado. Por exemplo, aquecendo o diéster II em uma mistura de água e um co-solvente miscível com água como por exemplo acetona, metanol, etanol ou isopropanol podem produzir o ácido livre de I no meio de reação (in situ). Um solvente preferido é acetona e isopropanol. Temperaturas entre ambiente e os pontos de ebulição dos solventes poderiam ser utilizadas. Tipicamente 40° a 60° C estão na faixa preferida. Adição de uma base ou mais preferivelmente uma amina como descrita acima para a mistura de reação contendo o ácido livre na água e co-solvente pode produzir o sal diretamente. Se as condições apropriadas forem selecionadas, o sal, pode cristalizar ou precipitar diretamente do meio de reação e isolar através de filtração e secagem. Exemplos específicos estão contidos na seção experimental.
[00327] O método preferido de preparação dos intermediários Ila, llb e IIc e dos ácidos Iac, Ibc e Ic oferece várias vantagens significativas nos procedimentos usados inicialmente para preparação de Ha, IIb e IIc durante esforços de pesquisa exploratória. As vias de descoberta iniciais para a preparação de todos os três intermediários II usaram uma preparação de di-tercbutila fosfato de clorometila que requereu o uso de fosfato de diterc-butila de tetrabutilamônio relativamente caro que foi reagido com um excesso de 10 vezes e cloro iodometano potencialmente perigoso. Os voláteis de excesso e iodometano foram removidos a vácuo para fornecer o reagente bruto que foi usado sem outra purificação. Pelo menos um excesso de 5 vezes deste reagente foi usado para reagir com os compostos IV que significa que pelo menos 5 equivalentes de fosfato de tetrabutilamônio e 50 equivalentes de cloroiodometano foram usados quando comparados às quantidades de IVa, b ou c. Além disso, alquilação dos compostos IV com este reagente foi alcançada usando NaH como base e iodo como um aditivo para promover alquilação. Estas condições produziram uma mistura de
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68/233 reação contendo o composto II desejado como um produto principal e produtos laterais que foram removidos usando cromatografia em sílicagel, uma operação tediosa, duradoura e cara especialmente em reações de escala crescente. Falha para remover os subprodutos, resultou em produtos I da próxima etapa, a remoção dos grupos de proteção, que continham impurezas que foram muito difíceis de remover de uma maneira satisfatória em um rendimento ou prazo razoável.
[00328] A preparação melhorada de di-terc-butil fosfato clorometila utiliza ditercbutila fosfato de potássio de menos caro e apenas um excesso de 2 vezes aproximado deste reagente quando comparado ao outro reagente de clorometil cloreto de sulfonila. O di-tercbutil fosfato de clorometila preparado por este método é isolado em forma pura por meio de destilação conveniente.
[00329] Para a conversão de IVa em IIa, foram usados apenas 1,2 equivalente deste reagente para alquilar os compostos IV. Além disso, uma base menos reativa e econômica, carbonato de potássio, foi usada junto com DMSO para alcançar uma alquilação em que os compostos II produzidos estão suficientemente livres dos subprodutos que eles podem ser usados sem purificação cromatográfica como entradas para a reação de desproteção. O ácido livre lac ou sais como lab por exemplo podem ser obtidos em forma pura de IIa preparada desta maneira sem cromatografia.
[00330] Para a síntese dos compostos IIb e IIc que são mais lentos para reagir que IVa, foram empregados 2 a 2,5 equivalentes de ditercbutil fosfato de clorometila e condições modificadas (carbonato de césio como base com KI no solvente, NMP) ou foram usados para alquilar IVb e IVc e perceber a conversão alta respectivamente em IIb e IIc.
[00331] Novamente as condições novas forneceram compostos II em pureza suficientes para lhes permitir ser usados para produzir os
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69/233 compostos I sem a necessidade de purificação cromatográfica. Desse modo as condições novas reduzem as quantidades e estequiometria dos reagentes necessários para preparar o composto I desta invenção e evitar a necessidade por purificação cromatográfica dos intermediários II. Os materiais de partida empregados para preparar o di-tercbutil fosfato de clorometila são mais econômicos e menos perigosos e o produto final é produzido em pureza mais alta. Por fim, as condições desenvolvidas para alquilar IVa, IVb e IVc eliminam a necessidade pela base de hidreto de sódio reativo inflamável que tinha sido usado em excesso e tinha empregado carbonato de potássio ou de césio.
[00332] Na etapa de alquilação, uma base adequada pode ser usada como M2CO3 (M é lítio, sódio, potássio, rubídio ou césio). Para converter IVa em IIa, é preferido K2CO3 (1-5 equivalente molar, preferivelmente 2 equivalentes molares por mole de IVa). Para converter IVb em IIb ou IVc em IIc, é preferido carbonato de césio.
[00333] Também, um solvente adequado é necessário como dimetilsulfóxido, N-dimetilformamida, acetona, acetonitrila, Nmetilpirrolidinona, formamida, tetraidrofurano, etc. (2-50 ml/grama de IV, com 5 ml/grama preferido); dimetilsulfóxido é preferido para converter IVa em IIa; N-metilpirrolidinona é preferida para converter IVb em IIb ou IVc em IIc.
[00334] Uma fonte de iodo de solvente adequada inclui, mas não é limitada a, MI (M é, por exemplo, lítio, sódio, potássio, iodo, tetrabutilamônio, etc.); com iodeto de potássio preferido (0,1-5 equivalentes molares/mol de Composto IV; 2 equivalentes preferido).
[00335] O agente de alquilação, fosfato de clorometila de di-tercbutila, pode ser usado em 1-10 equivalentes molares por mole de IV; mas cerca de 1,2 equivalente molar é preferido.
[00336] A temperatura de reação pode ser 10-60°C (30°C preferido).
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[00337] Na etapa de desproteção, quando os dois grupos de tercbutila forem removidos de IIa para formar Iac, isto é realizado na presença de um solvente adequado como diclorometano (preferido), dicloroetano, clorofórmio, carbontetracloreto, tolueno, benzeno, etc. (2-50 ml/grama de IV, preferivelmente 10 ml/grama)
[00338] Para desproteger IIb e IIc para obter Ibc e Ic, respectivamente, isto é realizado em acetona/água em uma temperatura de cerca de 40° C.
[00339] Adicionalmente, durante desproteção de IIa, é preferido ter um ácido presente como ácido trifluoroacético (preferido), clorídrico, sulfúrico, nítrico, etc. (2-100 equivalentes molares com base em IVa, com 15 equivalentes molares preferido).
QUÍMICA
GERAL:
[00340] As preparações adicionais dos materiais de partida e precursores são contidos em Wang et. al. Patente U. S. 6.476.034, concedida em 5 de novembro de 2002, que é incorporada por referência em sua totalidade.
[00341] Todos os dados de Cromatografia Líquida (LC) foram registrados em uma cromatografia líquida de Shimadzu LC-10AS usando um detector de UV-Vis de SPD-10AV com dados de Espectrometria de Massa (MS) determinados usando uma Plataforma de Micromass para LC em modo de eletropulverização.
MÉTODO DE LC/MS (ISTO É, IDENTIFICAÇÃO DO COMPOSTO) [00342] Coluna A: coluna de YMC ODS-A S7 3,0x50 mm
[00343] Coluna B: coluna de PHX-LUNA C18 4,6x30 mm
[00344] Coluna C: coluna de XTERRA Ms C18 4,6x30mm
[00345] Coluna D: coluna de YMC ODS-A C18 4,6x30mm
[00346] Coluna E: coluna de YMC ODS-A C18 4,6x33mm
[00347] Coluna F: coluna de YMC C18 S5 4,6x50 mm
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[00348] Coluna G: coluna de XTERRA C18 S7 3,0x50 mm
[00349] Coluna H: coluna de YMC C18 S5 4,6x33 mm
[00350] Coluna I: coluna de YMC ODS-A C18 S7 3,0x50 mm
[00351] Coluna J: coluna de XTERRA C-18 55 4,6x50mm
[00352] Coluna K: coluna de YMC ODS-A C18 4,6x33mm
[00353] Coluna L: coluna de Xterra MS C18 5uM 4,6x30mm
[00354] Coluna M: coluna de YMC ODS-A C18 S3 4,6x33mm
CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO DE LC PADRÃO (USADAS A MENOS QUE DO CONTRÁRIO OBSERVADO):
[00355] Gradiente: 100% de solvente A / 0% de Solvente B a 0% de Solvente A / 100% de Solvente B
[00356] Solvente A = 10% de MeOH - 90% de H2O-0,1% de TFA, Solvente B = 90% de MeOH - 10% de H2O-0,1% de TFA; e Tr em min. [00357] Tempo de gradiente: 2 minutos
[00358] Tempo de contenção: 1 minuto
[00359] Taxa de fluxo: 5 mL/min
[00360] Comprimento de onda do detector: 220 nm
[00361] Solvente A: 10% de MeOH / 90% de H2O / 0,1 % de Ácido T rifluoroacético
[00362] Solvente B: 10% de H2O / 90% de MeOH / 0,1% de Ácido Trifluoroacético
CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO DE LC ALTERNADA B:
[00363] Gradiente: 100% de solvente A / 0% de Solvente B a 0% de Solvente A / 100% de Solvente B
[00364] Solvente A = 10% de MeOH - 90% de H2O-0,1% de TFA, Solvente B = 90% de MeOH - 10% de H2O-0,1% de TFA; e Tr em min. [00365] Tempo de gradiente: 4 minutos
[00366] Tempo de contenção: 1 minuto
[00367] Taxa de fluxo: 4 mL/min
[00368] Comprimento de onda do detector: 220 nm
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[00369] Solvente A: 10% de MeOH / 90% de H2O / 0,1 % de Ácido T rifluoroacético
[00370] Solvente B: 10% de H2O / 90% de MeOH / 0,1% de Ácido Trifluoroacético
[00371] Os compostos purificados por HPLC preparativa foram diluídos em MeOH (1,2 ml) e purificados usando os métodos a seguir em um sistema de HPLC preparativa de Shimadzu LC-10A automatizado em um sistema de HPLC preparativa de Shimadzu LC-8A automatizado com detector (SPD-10AV UV-VIS) comprimento de onda e sistemas de solvente (A e B) iguais ao acima.
MÉTODO DE HPLC PREPARATIVA (ISTO É, PURIFICAÇÃO DO COMPOSTO)
[00372] Método de purificação: Gradiente inicial (40% de B, 60% A) elevar para gradiente final (100% de B, 0% de A) mais de 20 minutos, reter durante 3 minutos (100% de B, 0% de A)
[00373] Solvente A: 10% de MeOH / 90% de H2O / 0,1 % de Ácido Trifluoroacético
[00374] Solvente B: 10% de H2O / 90% de MeOH / 0,1% de Ácido Trifluoroacético
[00375] Coluna: Coluna de YMC C18 S5 20x100 mm
[00376] Comprimento de onda do detector: 220 nm
[00377] Para os procedimentos experimentais abaixo as condições de HPLC a seguir ou modificações dos procedimentos padrão foram empregadas:
[00378] Condições de HPLC para pureza de LC rotineira:
[00379] Detecção a 254 nm; Gradiente 0-100% de B/A; A 10% CH3CN-90% de H2O-0,1% de TFA, B 90% de CH3CN-10% de H2O0,1% de TFA; Tempo de gradiente 4 min; Coluna YMC ODS-AQ ou ORD-A 4,6x50mm 3 mícrons.
[00380] Condições de HPLC para análise de LC/MS:
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[00381] Coluna J: coluna de XTERRA C-18 S5 4,6x50min, Gradiente: 100% de Solvente A / 0% de Solvente B a 0% de Solvente A / 100% de Solvente B
[00382] Solvente A = 10% de MeOH - 90% de H2Ü-0,1% de TFA, Solvente B 90% de MeOH -10% de H2O-0,1% de TFA; e Rt em min; Tempo de gradiente: 3 minutos; Taxa de fluxo: 4 mL/min; Comprimento de Onda do Detector: 220 nm
[00383] Materiais de partida podem ser comprados de fontes comerciais ou preparados usando procedimentos da literatura.
PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS DE ORIGEM IV:
[00384] A preparação dos Compostos de origem IV foi previamente descrita no seguinte, todos estes são aqui incorporados por referência em sua totalidade como segue:
[00385] Patente U. S. 6.469.006, 22 de outubro de 2002 concedida por W. S. Blair et al;
[00386] Patente U. S. 6.476.034, 5 de novembro de 2002 concedida por Wang et al;
[00387] Patente U. S. 6.573.262, 3 de junho de 2003 concedida por Meanwell et al;
[00388] U. S. Número de série 10/630.278 depositada em 30 de julho de 2003 por J. Kadow et al; que é uma continuação-em-parte da U. S. Número de série 10/214.982 depositada em 7 de agosto de 2002, que é uma continuação-em-parte da U. S. Número de série 10/038.306 depositada em 2 de janeiro de 2002 que corresponde ao PCT WO 02/062423 depositado em 2 de janeiro de 2002, publicado em 15 de agosto de 2002;
[00389] U. S. Número de série 10/871.931 depositada em 18 de junho de 2004 por Yeung et al;
[00390] U. S. Número de série 10/762.108 depositada em 21 de janeiro de 2004 por Wang et al, correspondendo ao PCT WO
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2004/043337 publicado em 27 de maio de 2004.
[00391] Procedimentos detalhados selecionados são fornecidos abaixo:
PROCEDIMENTO TÍPICO PARA A PREPARAÇÃO DOS INTERMEDIÁRIOS PARA A PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS DE ORIGEM IV
1) PREPARAÇÃO DE AZAINDOL 1
Figure BRPI0508876B1_D0016
[00392] Preparação de azaindol, Método A: Preparação de 7-Cloro6-azaindol 1e: 2-Cloro-3-nitropiridina 22e (5,0 g) foi dissolvido em THF seco (200 ml). Após a solução ter sido resfriada até -78° C, um excesso de vinil brometo de magnésio (1,0 M em THF, 100 ml) foi adicionado. Depois, a reação foi deixada a -20° C durante oito horas antes de ser extinguida com 20% de NH4Cl (150 ml). A fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 150 ml). A camada orgânica combinada foi secada em MgO4. Após filtração e concentração, o produto bruto foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel para fornecer 1,5 g de 7-cloro-6-azaindol 1e em 31% de rendimento.
[00393] Compostos 5an, IVa e 5ap são descritos abaixo.
Br Br ^MgBr nL *
Y N°2 THF γ H
Cl Cl
1am
[00394] Composto 1am, 4-bromo-7-cloro-6-azaindol (sólido amarelo) foi preparado pelo mesmo método usado para azaindol 1e mas o material de partida empregado foi 5-bromo-2-cloro-3-nitropiridina. (dis
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75/233 ponível de Aldrich, Co.). MS m/z: (M+H)+ calc. para C7H5BrClN2:
230,93; encontrado 231,15. Tempo de retenção de HPLC: 1,62 minuto (coluna B).
Figure BRPI0508876B1_D0017
1am 1an -|ao
[00395] Composto 1an (4-metóxi-7-cloro-6-azaindol) e composto 1ao (4,7-dimetóxi-6-azaindol): Uma mistura de 4-bromo-7-cloro-6azaindol (1 g), Cui (0,65 g) e NaOMe (4 ml, 25%) em MeOH (16 ml) foi aquecida para 110-120° C durante 16 horas em um tubo vedado. Após resfriar para temperatura ambiente, a mistura de reação foi neutralizada com 1 N de HCl para alcançar pH 7. A solução aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 30 ml). Depois a camada orgânica combinada foi secada em MgO4 e concentrada a vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (50 g) usando 1:7 EtOAc: hexano como o eluente. (Dimensão de coluna: 20 mm x 30 cm) para dar 0,3 g de 4-metóxi-7-cloro-6-azaindol (sólido branco) e 0,1 g de 4,7-dimetóxi-6-azaindol (sólido branco).
[00396] Composto 1an (4-metóxi-7-cloro-6-azaindol). MS m/z: (M+H)+ calc. para CsHsCl^O: 183,03; encontrado 183,09. Tempo de retenção de HPLC: 1,02 minuto (coluna B).
[00397] Composto 1ao (4,7-dimetóxi-6-azaindol). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 7,28 (m, 2H), 6,63 (m, 1H), 4,14 (s, 3H), 3,95 (s, 3H). MS m/z: (M+H)+ calc. para C9H11N2O2: 179,08; encontrado 179,05. Tempo de retenção de HPLC: 1,36 minuto (coluna B).
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I
Figure BRPI0508876B1_D0018
CICOCOOMe
AICI3
1b
CH2CI2
N
Figure BRPI0508876B1_D0019
O
H 2b
OMe
[00398] ACILAÇÃO DE AZAINDOL, MÉTODO B: PREPARAÇÃO DE (5-AZAINDOL-3-IL)-OXOACETATO DE METILA 2b: 5-Azaindol (1b) (0,5 g, 4,2 mmols) foi adicionado a uma suspensão de AlCh (2,8 g, 21,0 mmols) em CH2Cl2 (100 ml). Agitação foi continuada em temperatura ambiente durante 1 hora antes de clorooxoacetato de metila (2,5 g, 21,0 mmols) ter sido adicionado a gotas. A reação foi agitada durante 8 horas. Após 20 ml de MeOH ter sido cautelosamente adicionado para extinguir a reação, os solventes foram removidos sob vácuo. O resíduo sólido foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel (EtOAc/MeOH = 10: 1) para fornecer 0,6 g (70%) do produto acilado 2b.
[00399] Caracterização dos compostos 2:
OMe
[00400] Composto 2b ((5-AZAINDOL-3-IL)-OXOACETATO DE METILA): 1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 9,61 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,59 (d, 1H, J = 6,63 Hz), 8,15 (d, 1H, J = 6,60 Hz), 4,00 (s, 3H); 13C RMN (125 MHz, CD3OD) δ 178,9, 163,0, 145,6, 144,2, 138,3, 135,0, 124,7, 116,3,
112,1, 53,8. MS m/z: (M+H)+ calc. para C10H9N2O3: 205,06; encontrado 205,04. Tempo de retenção de HPLC: 0,32 minuto (coluna A).
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Figure BRPI0508876B1_D0020
1ao 2ao
[00401] Composto 2ao ((4,7-dimetóxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de etila) foi preparado pelo mesmo método como usado para o composto
2b mas o material de partida empregado foi 4,7-dimetóxi-6-azaindol. O composto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel usando 2:3 EtOAc: Hexano como o eluente para dar um óleo amarelo: 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 9,50 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,39 (q, 2H, d = 7,05 Hz), 4,13 (s, 3H), 3,93 (s, 3H), 1,40 (t, 3H, d = 7,2 Hz). MS m/z: (M+H)+ calc. para C13H15N2O5: 279,10; encontrado 279,16. Tempo de retenção de HPLC: 1,28 minuto (coluna B).
Figure BRPI0508876B1_D0021
2) PREPARAÇÃO DE AZAINDOL 3-GLIOXILATO DE POTÁSSIO
[00402]
Figure BRPI0508876B1_D0022
DE POTÁSSIO
PREPARAÇÃO (7-AZAINDO1-3-IL)OXOACETATO 3a: Composto 2a (43 g, 0,21 mol) e K2CO3 (56,9 g,
0,41 mol) foi dissolvido em MeOH (200 ml) e H2O (200 ml). Após 8 ho ras, o produto 3a preciptou-se da solução. Filtração forneceu 43 g do composto 3a como um sólido branco em 90,4% de rendimento.
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CARACTERIZAÇÃO DOS COMPOSTOS 3:
[00403] Composto 3a, (7-AZAINDOL-3 IL)-OXOACETATO DE POTÁSSIO: Ή RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,42 (d, 1H, J = 7,86 Hz),
8,26 (d, 1H, J = 4,71 Hz), 8,14 (s, 1H), 7,18 (dd, 1H, J= 7,86, 4,71Hz); 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) δ 169,4, 148,9, 143,6, 135,1, 129,3,
118,2, 117,5, 112,9. MS n?/z: (M+H)+ do ácido correspondente do composto 3a (3a-K+H) calc, para C9H7N2O3: 191,05; encontrado 190,97. Tempo de retenção de HPLC: 0,48 minuto (coluna A).
[00404] Composto 3ao ((4,7-DIMETÓXI-6-AZAINDOL-3-IL)OXOACETATO DE POTÁSSIO) foi preparado (como um sólido amarelo), pelo mesmo método usado para preparar 0 composto 3a exceto (4,7-dimetóxi-6-azaindol-3-il)-oxoacetato de etila foi empregado como 0 material de partida. MS n?/z: (M+H)+ do ácido correspondente do composto 3ao (M-K+H)+ calc, para C11H11N2O5: 251,07; encontrado 251,09. Tempo de retenção de HPLC: 0,69 minuto (coluna B).
PREP. DO PROCEDIMENTO DO EXEMPLO DE 5a
Figure BRPI0508876B1_D0023
[00405] PREPARAÇÃO DE (R)-N-(BENZOIL)-3-METIL-N’-[(7AZAINDOL-3 IL)-OXOACETIL]-PIPERAZINA 5a: 7-azaindol 3-glioxilato de potássio 3a (25,4 g, 0,111 mol), (R)-3-metil-N-benzoilpiperazina 4a (22,7 g, 0,111 mol), 3-(dietoxifosforilóxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT) (33,3 g, 0,111 mol) e Base de Hunig (28,6 g, 0,222 mol) foram combinados em 500 ml de DMF. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 8 horas.
[00406] DMF foi removido por meio de evaporação a pressão reduzida e 0 resíduo foi dividido entre acetato de etila (2000 ml) e 5% de solução de Na2COs aquoso (2 x 400 ml). A camada aquosa foi extraída
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79/233 com acetato de etila (3 x 300 ml). A fase orgânica combinada e secada em MgÜ4 anidro. Concentração a vácuo forneceu um produto bruto que foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel com EtOAc/MeOH (50:1) para dar 33 g do produto 5a em 81% de rendimento.
[00407] Caracterização dos compostos 5 com a subestrutura a se guir:
Figure BRPI0508876B1_D0024
[00408] Composto 5a, n = 2, R7-13 = H, R14 = (R)-Me, (R)-N(BENZOIL)-3-METIL-N’-[(7-AZAINDOL-3-IL)-OXOACETIL]PIPERAZINA: 1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,57 (d, 1H, J = 5,97 Hz), 8,38 (d, 1H, J = 4,20 Hz), 8,27 (m, 1H), 7,47 (s, 5H), 7,35 (t, 1H, J =
5,13 Hz), 4,75-2,87 (m, 7H), 1,31 (b, 3H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD) δ 185,6, 172,0, 166,3, 148,9, 144,6, 137,0, 134,8, 130,2, 129,9, 128,4,
126,6, 118,6, 118,0, 112,2, 61,3, 50,3, 45,1, 35,5, 14,9, 13,7. MS m/z: (M+H)+ calc. para C21H21N4O3: 377,16; encontrado 377,18. Tempo de retenção de HPLC: 1,21 minuto (coluna A). Anal. calc. para C21H2ON4O3: C, 67,01; H, 5,36; N, 14,88. Encontrado: C, 66,01; H, 5,35; N, 14,61.
Figure BRPI0508876B1_D0025
3a0 IVa
[00409] Composto IVa, N-(benzoil)-N’-[(4,7-dimetóxi-6-azaindol-3il)-oxoacetil]piperazina, foi preparado pelo mesmo método usado para preparar o composto 5a mas o material de partida foi (4,7-dimetóxi-6
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80/233 azaindol-3-il)-oxoacetato de potássio. O composto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel usando EtOAc como o solvente eluindo para dar um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 13,0 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,40 (m, 6H), 4,00 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 3,63-3,34 (m, 8H); 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) δ 185,5, 169,3, 166,5, 146,2,
145,7, 136,6, 135,3, 129,6, 128,4, 126,9, 122,2, 122,1, 119,2, 114,4, 56,8, 52,9, 45,5, 39,9. MS m/z: (M+H)+ calc, para C22H23N4O5: 423,17; encontrado 423,19. Tempo de retenção de HPLC: 1,33 minuto (coluna B). Anal. calc, para C22H21N4O5: C, 62,7; H, 5,02; N, 13,29. Encontrado: C, 61,92; H, 5,41; 13,01. Ponto de fusão: 229,5-232° C.
PROCEDIMENTOS PARA PREPARAÇÃO DO COMPOSTO DE ORIGEM IVC
PREPARAÇÃO DE 3-METIL-1,2,4-TRIAZOL (2-81)
H
150¾
H
CH4N2O
Mai. Med: 60,06
HjC NH2
QsHsNS
Mol. Mol: 75,13 ί-ai
Cg^Nj
Mol. Mok 83,09
[00410] PROCEDIMENTO: Uma mistura sólida de hidrazida fórmica (68 g, 1,13 mol) e tioacetamida (85 g, 1,13 mol) em um frasco de fundo redondo de 500 mL foi aquecida com agitação a 150°C (temp, do banho de óleo) por 1,5 h com um fluxo suave de nitrogênio, removendo H2S e água (cerca de 18 ml de líquido colhido) formado durante a reação. A mistura de reação foi destilada sob pressão reduzida, coletando
60,3 g (0,726 mol, R. 63,3%) do composto do título a 102° C / 0,35-1 mm de Hg como um sólido branco após remover um líquido precedido: 1H RMN (CDCh) δ ppm 2,51 (3H, s, 3-Me), 8,03 (1H, s, 5-H), 9,5 (1H, br, NH); TLC Rf (10% MeOH/CH2CI2) = 0,3 (fosfomolibdatochamuscando, mancha branca). Referência: Vanek, T.; Velkova, V.; Destripe, Jiri Coll. Czech. Chem. Comm. 1985, 49, 2492.
PREPARAÇÃO DE 3-81
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Figure BRPI0508876B1_D0026
[00411] PROCEDIMENTO: Um frasco de fundo redondo de 500 ml foi carregado com 4-metóxi-7-cloro-6-azaindol 2e (9,1 g, 50 mmols; secado a vácuo), carbonato de potássio (13,8 g, 100 mmols, 2 eq.), pó de cobre (6,35 g, 100 mmols, 2 eq.) e 3-metil-1,2,4-triazol (83 g, 1,0 mol, 20 eq.). A mistura sólida foi aquecida para fundir a 170-175° C (temperatura externa do banho de óleo) sob um fluxo suave de nitrogênio anidro por 12 h, em cujo tempo análise de HPLC indicada que a quantidade do pico para o material de partida tinha se tomado 5-30% e o pico do produto desejado se toma cerca de 45% com pico do subproduto isomérico se toma 15%. Enquanto a mistura de reação resfriava, MeOH (150 ml) foi adicionado lentamente à mistura morna agitado. Ao resfriar, o material insolúvel (pó de cobre) foi filtrado através de uma almofada de celite, e enxagüado com metanol. O filtrado foi concentrado a vácuo a uma pasta grossa que foi diluída com água (1 L) e extraído com EtOAc (3x150 ml). Os extratos de EtOAc foram secados (MgSÜ4), filtrados e concentrados para obter cerca de 8 g de resíduo bruto que foi cristalizado dissolvendo em CH3CN quente (50 ml), seguido diluindo com água (100 ml) e esfriando para 0°C para colher 1,45 g (12,7%) do composto do título como sólido branco. O filtrado foi purificado por sílica-gel de fase reversa de C-18 (YMC ODS-A 75 pm) eluído com 15-30% de CH3CN/H2O. Frações apropriadas foram combinadas e a solução aquosa após remover CH3CN através de evaporador rotativo foi liofilizada para dar um adicional de 1,15 g do composto do título 3-81. A camada aquosa bruta foi também extraída várias vezes com EtOAc. Os extratos de acetato de etila foram secados
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82/233 (MgS04), filtrados, concentrados e cristalizados de MeOH para dar um adicional de 200 mg do composto do título 3-81. O rendimento total: 2,8 g (12,2 mmols, R. 24,5%); MS m/z 230 (MH), HRMS (ESI) m/z calc, para C11H12N5O (M+H), 230,1042, encontrado 230,1038 (Δ -1,7 ppm); 1H RMN (CDCh) δ ppm 2,54 (3H, s, CH3), 4,05 (3H, s, OCH3), 6,73 (1H, s, H-3), 7,40 (1H, s, H-2), 7,56 (1H, s, H-5), 9,15 (1H, s, triazol-H-5); 13C RMN (CDCh, 125,7 MHz) δ ppm 14,2 (triazol-Me),
56,3 (OMe), 100,5 (C-3), 116,9 (C-5), 123,5, 127,2, 127,5 (C-2), 129,5 (C-7), 141,2 (C-5’), 149,5 (C-4), 161,8 (C-3’); Anal. calc. para C11H11N5O: C 57,63, H 4,83, N 30,55, encontrado C 57,37, H 4,64, N 30,68.
[00412] A estrutura foi confirmada por um análise cristalográfica de raio X simples usando cristais obtidos de frações de coluna C-18. Uma porção das frações de coluna C-18 contendo uma mistura da 3-metil-
1,2,4-triazolila desejada análoga a 3-81 e 5-metil-1,2,4-triazolila isomérica análoga a 4-81 foi também purificada por coluna de fase reversa C-18 eluindo com 8-10% CH3CN/H2O. As frações apropriadas foram extraídas com CH2CI2, e evaporação lenta do solvente deu material cristalino do 7-(5-metil-1,2,4-triazolil)-4-metóxi-6-azaindol isomérico (481): MS m/z 230 (ΜΗ), Ή RMN (CDCh) δ ppm 3,05 (3H, s, CH3), 4,07 (3H, s, OCH3), 6,74 (1H, q, J= 2,4, H-2), 7,37 (1H, t, J= 2,4, H-3), 7,65 (1H, s, H-5), 8,07 (1H, s, triazol-H-3). A estrutura foi confirmada por um análise cristalográfica de raios X simples.
PREPARAÇÃO DE 5-81
[00413] PROCEDIMENTO: AICI3 (40 g, 0,3 mol, 15 eq.) foi dissolvido em uma solução de CH2CI2 (100 ml) e nitrometano (20 ml) sob ni
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83/233 trogênio seco. A esta solução foi adicionado o composto 3-81 (4,58 g, 0,02 mol) sob agitação e sob N2, seguido por clorooxoacetato de metila (9,8 g, 0,08 mol, 4 eq.). A mistura foi agitada sob N2 em temperatura ambiente por 1,5 h. A mistura foi adicionada a gotas a uma solução gelada e agitado de 20% de solução de acetato de amônio aquoso (750 ml). A mistura foi agitada por 20 min e 0 precipitado resultante foi filtrado, lavado completamente com água e secado a vácuo para obter 4,7 g (0,015 mol, R. 75%) do composto do título 5-81 como sólido branco: MS m/z 316 (MH); HRMS (ESI) m/z calc, para C14H14N5O4 (M+H), 316,1046; encontrado 316,1041 (Δ -1,6 ppm); Ή RMN (CDCh, 500 MHz) δ ppm 2,58 (3H, s, CH3), 3,96 (3H, s, OCH3), 4,05 (3H, s, OCH3), 7,76 (1H, s, H-5), 8,34 (1H, d, J = 3Hz, H-2), 9,15 (1H, s, triazol-H-5), 11,0 (1H, brs, NH). Mais composto do título 5-81 e ácido hidrolisado 6-81 pode ser obtido do filtrado através de extração de ácido-base com EtOAc.
PREPARAÇÃO DE 6-81
Figure BRPI0508876B1_D0027
[00414] PROCEDIMENTO: A uma suspensão do éster de metila 581 (2,2 g, 7,0 mmols) em MeOH (50 ml) foi adicionado 0,25 M de solução de NaOH em água (56 ml, 14 mmols, 2 eq.) em temperatura ambiente e a mistura agitado por 15 min, em cujo tempo HPLC indicada estar a hidrólise completa. A mistura foi rapidamente concentrada a vácuo para remover MeOH, e à solução residual foi adicionada água (100 ml) e 1 N de HCI (14 ml) com agitação para neutralizar a mistura. O precipitado bom resultante foi filtrado, lavado com água e secado a vácuo para obter 1,98 g (6,58 mmols, R. 94%) do composto do título 6
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84/233 como sólido esbranquiçado: MS m/z 302 (MH); 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz) δ ppm 2,50 (3H, s, sobreposto com picos de DMSO), 3,98 (3H, s, CH3O), 7,87 (1H, s, H-5), 8,29 (1H, d, J = 3,5Hz, H-2), 9,25 (1H, s, triazol-H-5), 12,37 (1H, s, NH).
[00415] Procedimento alternativo: A uma suspensão do éster de metila 5-81 (10,7 g, 34 mmols) em MeOH (150 ml) foi adicionado 0,25 M de solução de NaOH em água (272 ml, 68 mmols, 2 eq.) em temperatura ambiente e a mistura agitado por 20 min, em cujo tempo HPLC indicada estar completa a hidrólise. A mistura foi rapidamente concentrada a vácuo para remover MeOH, e a solução residual foi extraída com EtOAc para remover qualquer impureza neutra. À fase aquosa foi adicionado 1 N de HCl (68 ml, 68 mmols) para neutralizar o produto. A mistura resultante foi congelada e liofilizada para obter 14,1 g (33,7 mmols, R. 99,2%) do composto do título 6-81, contendo 2 equivalentes de mole de NaCl como sólido branco-sujo. Este material foi usado na reação subseqüente sem outra purificação. O sal de dissódio do composto do título 6-81 foi obtido por cromatografia de coluna de fase reversa C-18 após tratamento de bicarbonato de sódio: HPLC >97% (AP, uv a 254 nm); HRMS (sal de Na, ESI-) m/z calc. para C13H10N5O4 (M-H), 300,0733; encontrado 300,0724 (Δ -3 ppm); 1H RMN (sal de Na, DMSO-de, 500 MHz) δ ppm 2,37 (3H, s, Me), 3,83 (3H, s, CH3O), 7,56 (1H, s, H-5), 8,03 (1H, s, H-2), 9,32 (1H, s, triazol-H-5); 13C RMN (sal de Na, DMSO-cfe, 125,7 MHz) δ ppm 13,8 (triazol-Me), 57,2 (OMe), 114,8 (C-3), 120,0 (C-5), 125,1, 143,5 (C-5'), 149,8 (C-4), 160,0 (C-3'),
171,7, 191,3.
PREPARAÇÃO DO COMPOSTO IVc
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Figure BRPI0508876B1_D0028
[00416] PROCEDIMENTO: A uma solução do ácido 6-81 (3,01 g, 10 mmols) e cloridrato de benzoilpiperazina (3,39 g, 15 mmols) em DMF (50 ml) foi adicionada trietilamina (10,1 g, 100 mmols, 10 eq.), seguido por cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC; 5,75 g, 30 mmols) sob N2 e a mistura agitado em temperatura ambiente por 22 h após sonicação e a 40°C por 2 h. A mistura foi concentrada a vácuo para remover DMF e TEA, e à solução residual foi adicionada água (200 ml) sob agitação e sonicação. Os precipitados formados foram colhidos, foram lavados com água e secados a vácuo para obter 2,8 g (5,9 mmols, R. 59%) do composto do título IVc como sólido esbranquiçado. O filtrado foi extraído com CH2Cl2 (x2). Os extratos de CH2Cl2 foram secados (Na2SO4), filtrados e concentrados em goma que foi triturada com Et2O para obter um sólido. Este sólido foi suspenso e triturado com MeOH para obter 400 mg do composto do título IVc como sólido esbranquiçado. Rendimento total: 3,2 g (6,8 mmols, R. 68%): MS m/z 474 (MH); HRMS (ESI) m/z calc. para C24H24N7O4 (M+H) 474,1890, encontrado 474,1884 (Δ -1,2 ppm); 1H RMN (DMSO-cfe) δ ppm 2,50 (3H, s, sobreposto com picos de DMSO), 3,43 (4H, br, CH2N), 3,68 (4H, br, CH2N), 3,99 (3H, s, CH3O), 7,46 (5H, br.s, Ar-Hs), 7,88 (1H, s, indol-H-5), 8,25 (1H, s, indol-H-2), 9,25 (1H, s, triazol-H-5), 12,40 (1H, s, NH); 13C-RMN (DMSO-cfe) δ ppm 13,78, 40,58, 45,11, 56,78, 114,11, 120,95, 122,71, 123,60, 126,98, 128,34,
129,6, 135,43, 138,52, 142,10, 149,15, 161,29, 166,17, 169,22, 185,42; UV (MeOH) Àmax 233,6 nm (ε 3,43x104), 314,9 nm (ε 1,73x104); Anal. calc. para C24H24N7O4.1/5H2O; C 60,42, H 4,94, N
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20,55, Encontrado; C 60,42, H 5,03, N 20,65; KF (H2O) 0,75%.
[00417] Esta reação pode também ser executada por uso de HATU e DMAP para fornecer rendimento mais consistente do composto do título: A uma suspensão do ácido 6-81 (15,6 mmols) e HATU [hexafluorofosfonato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio] (8,90 g, 23,4 mmols; 1,5 eq.) em DMF (60 ml) e CH2Cl2 (60 ml) foi adicionada uma mistura de DMAP (5,72 g, 46,8 mmols, 3 eq.) e cloridrato de benzoilpiperazina (5,30 g, 23,4 mmols; 1,5 eq.) em DMF (60 ml) em temperatura ambiente e a mistura foi agitada sob atmosfera de nitrogênio por 4 h. A mistura foi concentrada a vácuo para remover CH2Cl2 e a maioria de DMF, e à solução residual foi adicionada água sob agitação e sonicação. Os precipitados formados foram colhidos, lavados com água e secados a vácuo para obter 5,38 g (11,4 mmols, R. 72,8%) do composto do título IVc como sólido esbranquiçado: HPLC >95% (AP, uv a 254 nm).
Figure BRPI0508876B1_D0029
r-N
D
Composto IVb PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS SINTÉTICOS PARA PREPARAÇÃO MELHOR DO COMPOSTO IVb ^ΥΝΗ2 HBFa .
Jl NaNO2 Γ || ? N -99% ° TT 1 1-80 I 2-80
FW = 223
[00418] 5-amino-2-metoxipiridina (50 g, 0,4 mol) foi adicionada a
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87/233 uma mistura de agitação de etanol absoluto (280 ml) e HBF4 (48% em água, 172 ml) e resfriada para 0° C. Nitrito de sódio (129g) foi dissolvido em água (52 ml) e adicionado por 1 h em partes). A agitação foi continuada a 0° C por 2 h. A mistura de reação foi diluída com éter (1L). O produto sólido foi colhido através de filtração e lavado com 500 ml de 50:50 EtOH/éter e subseqüentemente várias vezes com éter até que 0 produto ficasse ligeiramente rosado na cor. O sólido rosa pálido 90 g (~100% de rendimento) foi mantido em um dessecador em P2O5.
[00419] O mesmo procedimento foi seguido para executar a reação em escala maior:
[00420] (1) (200g, 1,6 mol); HBF4 (688 ml); NaNO2 (116 g); EtOH (1,12 L); H2O (208 ml)
[00421] A reação foi operada 4 vezes (800 gramas totais (1-80)). O produto foi secado em P2O5 por 48 h. (apenas 24 h para primeira batelada).
[00422] Um total de 1,293 g de (2-80) foi obtido, (91% de rendimento).
[00423] Ref: J. Heterocyclic. Chem, 10, 779, 1973 (para reações acima, incluindo dados analíticos)
Tolueno aHi*0F4- A j ao loLennl· ™ |
Muilo
Limpo
[00424] A decomposição do sal de diazônio foi operada em 3 bate ladas de:
[00425] 206g, 219g e 231 g usando 1,3L, 1,4L e 1,6L de tolueno anidro respectivamente. O tolueno foi preaquecido sob nitrogênio a 100° C (temperatura interna) em um frasco de fundo redondo de 3 gargalos de 2 L equipado com um agitador mecânico. O sólido foi adicionado sólido em partes por meio de uma concha através de um funil
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88/233 de pó que foi preso a um adaptador com fluxo de nitrogênio positivo para for a suave. Durante a adição, a temperatura foi mantida entre 99-102° C (ajustada em 100° C) e agitado vigorosamente. Tempo de adição total foi 60 min. para as duas bateladas menores e 70 min. para a última. Após a adição ter terminado, cada reação de agitação foi aquecida para 110° C por 1 h. O manto de aquecimento foi removido e agitação foi parada. As reações foram deixadas repousar 2 h (alcançaram temp. ambiente). Nota de segurança: A reação contém BF3 assim trabalhando com a reação quente expõe vapores que causaram irritação à pele a algumas pessoas. Nenhum incidente foi observado em temperatura ambiente (6 pessoas diferentes). O tolueno quente da reação foi vertido em um Erlenmeyer de 4 L (um óleo marrom escuro e o resíduo permaneceram no frasco). O resíduo foi lavado com 50 ml de tolueno e vertido nos extratos originais de tolueno.
[00426] Adicionar 1,5 L de 1N de NaOH à camada de tolueno, extrair e lavar com ~100 ml de NaCl sat. aq.
[00427] Combinar NaCl com a camada de NaOH, re-extrair com 150 ml de tolueno, lavar com 50 ml de NaCl sat..
[00428] Combinar as camadas de tolueno.
[00429] Adicionar 1L de 1N de NaOH ao resíduo no frasco de reação e girar para dissolver tanto resíduo quanto possível depois adicionar 500 ml de Et2O e verter em Erlenmeyer.
[00430] Adicionar ~500 ml por 1 N de NaOH ao frasco de reação e girar ~500 ml de Et2O.
[00431] Combinar lavagens de Et2O escuro e NaOH no frasco de erlenmyer.
[00432] Mistura de Et2O/NaOH foi vertida através de funil de pó contendo um plugue de lã de vidro para colher o sólido viscoso escuro. (Adicionar ~500 ml de mais éter à lavagem) em funil sep. de 6L [00433] Extrair. Lavar a camada de éter com 200 ml de H2O e de
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89/233 pois 100 ml de NaCI sat..
[00434] Combinar todas as lavagens com NaOH aq. original. Colocar em camadas e reextrair com 500 ml de éter. Lavar com 100 ml de
H2O e 100 ml de NaCI.
[00435] Combinar os extratos de éter. Extratos de toluene e éter foram verificados por produto limpo de LC/MS.
[00436] O éter foi concentrado em um evaporador ratativo e o resíduo foi combinado com os extratos de tolueno para fazer uma solução homogênea que é tomada para a próxima etapa como se encontra.
[00437] As outras duas operações foram combinadas e trabalhadas da mesma maneira que acima.
[00438] Todas as camadas aquosas foram verificadas por LC/MS = nenhum produto.
[00439] Ref J. Heterocyclic. Chem, 10, 779, 1973 (para reações acima, incluindo dados analíticos)
Figure BRPI0508876B1_D0030
14Q griui, vaaoa vedados, 1 h
3-80
Figure BRPI0508876B1_D0031
4-S0
[00440] Um total de 4,6 L de solução de tolueno contendo 3-80 foi colocado em vários tubos vedados e tratados com 900 ml de 35% de HCI a 145°C em 2 h. LC/MS não mostrou nenhum material de partida, apenas 4. A solução de tolueno foi decantada e descartada. A fase aquosa foi lavada com EtOAc e concentrada até remover os voláteis para fornecer um sólido marrom contendo a fluoro-hidroxipiridina 4-80 desejada.
[00441] Um total de 244 g deste sólido foi colhido e tomado para a próxima etapa como se encontra (não estava completamente seco).
[00442] Nota: Opera-se subseqüentemente operamos isto decantando a camada de tolueno primeiro antes de aquecer para reduzir os volumes. A mesma reação foi realizada usando HBr (48% em H2O) a
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100° C por 6 h com resultado similar para o procedimento de literatura 49% de rendimento.
[00443] Ref J. Heterocyclic. Chem, 10, 779, 1973 (para reações acima, incluindo dados analíticos)
Figure BRPI0508876B1_D0032
UNO, defumado
H2$Ox
Rendimento: 3ffltde salde diazónio
Figure BRPI0508876B1_D0033
5-BO
1. Precipitado fusueimente] - 2. Estraido com EtCAc, triturado com êler
[00444] O sólido do acima contendo (4-80) foi dividido em 4 bateladas e tratado com H2SO4 e HNO3 defumado como mostrado abaixo. As quantidades usadas eram:
batelada 1 batelada 2 batelada 3 batelada 4
(1) 25 g 54 g 75 g 90 g
HNO3 defumado 20,8 ml 45 ml 62,4 ml 75 ml
H2SO4.(para adição) 5,6 ml+ 12 ml+ 16,8 ml+ 20 ml+
(para sol.) 56 ml 120 ml 168 ml 200 ml
[00445] Composl to 4-80 foi dissolvido em ácido sulfúrico (as quanti-
dades maiores indicadas acima) em rt e depois aquecido para 65° C. Uma solução pré-formada de ácido nítrico defumado e ácido sulfúrico (a quantidade menor indicada acima) foi adicionada a gotas. A temperatura foi mantida entre 65° C e 80° C (rxn é exotérmico e embora 0 banho esteja a 65° C, a temperatura vai mais alta, usualmente 75, às vezes 80° C). Após a adição estar completa, a mistura de reação foi aquecida para 65° C em um adicional de h. A mistura de reação foi depois resfriada para t.a. e vertida em um frasco contendo gelo) (20 g de gelo/g do composto, evolução gasosa ocorreu). Um sólido preciptou-se e foi colhido através de filtração (1H RMN mostrou 4-80 e qualquer outra coisa (descartada)).
[00446] A camada aquosa foi extraída várias vezes com AcOEt (35) e concentrada em um evaporador rotativo sob vácuo para fornecer um sólido que foi triturado com éter para fornecer 5-80 como um sólido
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91/233 amarelo luminoso. Um total de 117g do produto desejado foi colhido na primeira plantação (27% de rendimento de sal de diazônio). Uma porção não cristalizada: este óleo foi triturado com MeOH e Et2O para fornecer 3,6 g de 5-80; outra precipitação do líquido-mãe rendeu um adicional 6,23 g do produto 5-80 desejado.
[00447] Total: 117,0+3,6+6,23 = 126,83,30,4%). Rendimento para 3 etapas (decomposição de sal de diazônio; desproteção e nitração).
[00448] Dados analíticos de Caderno de Anotações: 53877-115: 1H RMN (δ, MeOD): 8,56-8,27 (dd, J = 7,5, 3,3 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 3,3 Hz, 1H); LC/MS(M+1)+=158,9; T.a. = 0,15 min.
[00449] Nota: Uma porção da solução acídica aquosa foi tirada e neutralizada com Na2COs até que efervescência parasse e depois extraída com AcOEt => Um produto diferente foi obtido. Nenhum produto desejado nestes extratos.
Figure BRPI0508876B1_D0034
5-8Q
POBrs 1ÍOPC
77-97’λ
Figure BRPI0508876B1_D0035
Usado sem purificação
6-RO
[00450] Um total de 117 g de 5-80 foi dividido em 4 bateladas de 30 gx3e27gx1 e tratado com POBrs (3 equiv.; 163gx3e155gx1)e uma quantidade catalítica de DMF (15 ml) em ta (DMF foi adicionado cuidadosamente = evolução gasosa). Após 5 min. em temperatura ambiente, as soluções foram aquecidas para 110° C em 3 h. LC/MS mostrou que o material de partida tinha sido consumido. As misturas de reação foram deixadas esfriar para rt. Os frascos de reação foram colocados em um banho de gelo; e depois gelo foi adicionado muito lentamente e de forma cuidadosa em partes no frasco, evolução gasosa foi devido à formação de HBr; o sólido líquido e preto que formou foi vertido em um béquer com gelo. EtOAc foi adicionado e a mistura foi depois extraída várias vezes com EtOAc. A camada orgânica foi lava
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92/233 da com NaHCOs aq. saturado; H2O e salmoura; secada em Na2SO4 e filtrada. O produto foi secado na bomba durante a noite para fornecer
123g de 6-80 como um sólido marrom (77% de rendimento).
[00451] Nota: Reação é completada dentro de 1 h.
[00452] 1H RMN (ó, CDCh): 8,52 (m, 1H), 7,93 (m, 1H).
Broreto de Magnésia de V3nia em THF'Alta, 0,B a 1,(1 M;
Figure BRPI0508876B1_D0036
MO
2) ΝΗ4Π
Figure BRPI0508876B1_D0037
2S-S3&
precursor Í9 CMLBrFN,
Massa Exata: 213.95 - P. Mal.: 215,02
C, 39,1D:H 1.BB: Br, 37,16:
F, B,a<;N, 13,03
[00453] 800 ml de vinil brometo de magnésio (1M em THF, Aldrich) foram resfriados para abaixo de -60° C com agitação vigorosa sob N2. 2-bromo-5-fluoro-3-nitro piridina (43,3 g, 0,196 mol) em 200 ml de THF foi adicionado a gotas por meio de funil de adição a um tal taxa que a temp, foi mantida abaixo de -60° C. Isto levou ~1,25 h. A mistura de reação foi aquecida para -40 a -50° C e agitado por 1 h. Depois 1 L de NH4CI aquoso saturado foi lentamente e de forma cuidadosa adicionado. No princípio, espuma ocorreu e sólido considerável estava presente, mas este essencialmente dissolveu-se quando a adição foi completada e 0 material aquecido para rt. As camadas foram separadas e a camada aquosa extraída 3 vezes com acetato de etila. Os extratos orgânicos foram lavados com salmoura, secados em Na2SO4, filtrados e concentrados para render -50 g de um sólido pastoso preto. HPLC indicou 57-58% de produto. A este foi adicionado CH2CI2 e 0 sólido foi colhido através de filtração e lavado com CH2CI2 para fornecer 12,5 g do produto como um sólido marrom. A reação foi repetida exatamente na mesma escala e processada da mesma maneira. Da trituração de CH2CI2 foram obtidos 12,4 g de Precursor 2i (HPLC ~97% puro). O bruto foi restabelecido e deixado repousar em diclorometano. Sob re
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93/233 pouso 3,6 g do produto adicional separaram-se e foram restabelecidos através de filtração.
[00454] Rendimento total = 29,5 g (35%).
[00455] 1H RMN (δ, CDCh): 8,69 (bs, 1H), 7,92 (d, J= 1,8 Hz, 1H),
7,41 (m, 1H), 6,77 (m, 1H); LC/MS(M+1)+= 216 - 217,9; Tr = 1,43 min.
Figure BRPI0508876B1_D0038
iri-azul
Cu(ü)
KjCQa, 160DG
Figure BRPI0508876B1_D0039
precursor 2Í
25,35%
-2-8 h
Figure BRPI0508876B1_D0040
7-ÍO
Cromatografado, - razso de tsõmerti -1:1
[00456] Reação foi carregada em um frasco de 250 ml (espuma ocorreu ao aquecer e o frasco de tamanho grande é mais conveniente). Uma mistura de precursor 2i (3 g, 13,95 mmols), 1,2,3-triazol (15 g, 217,6 mmols, 15 eq), K2CO3 (1,9 g, 13,95 mmols, 1 eq) e Cu(0) (0,9 g, 13,9 mmols, 1 eq) foi aquecida para 160° C por 7 h (de ta a 160° C 7 h total) sob N2 (dependendo do lote de Cu(0), tempo de reação pode variar de 2 h a 7 h). A mistura resultante foi diluída com MeOH, filtrada através de papel de filtro (para remover 0 cobre). Lavada com MeOH (20 ml) e água (30 ml).
[00457] O filtrado foi concentrado (para remover 0 solvente em evaporador rotativo) e diluído com etilacetato. A camada aquosa foi extraída com etilacetato. A camada orgânica combinada foi secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em MeOH (20 ml), 7-80 (750 mg) cristalizado do metanol como um sólido branco e foi colhido através de filtração. (Volume de gradiente lento, hex de sílica-gel / AcOEt (0 -> 18%) dos líquidos mãe usualmente fornecem 5-10% mais de 7-80.
[00458] 1H RMN (ó, CDCh): 10,47 (bs, 1H), 8,76 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,53 (m, 1 H), 6,78 (m, 1H); LCMS(M+1)+ = 204; Tr =
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94/233
1,29 min.
F
Figure BRPI0508876B1_D0041
Figure BRPI0508876B1_D0042
Figure BRPI0508876B1_D0043
7-80
A1CJ3 ococooet
Figure BRPI0508876B1_D0044
Figure BRPI0508876B1_D0045
6-80
Gromatograiaoo. razao de isãfTie ro de -1 it
[00459] Etila cloreto de metilimidazólio (4,3 g, 29,6 mmols, 3 eq) foi colocado em um frasco de 250 ml. AlCh (11,8 g, 88,6 mmols, 9 eq) foi adicionado no frasco em uma porção. Uma suspensão líquida foi formada (algum de AlCh permaneceu como sólido). Após agitar por 5-10 min. o composto (1) (2,0 g, 9,85mmols) foi adicionado em uma porção seguida por adição lenta (por meio de uma seringa) de clorooxalacetato de etila (3,3 ml, 29,6 mmols, 3 eq). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 20 h. LCMS indicou composto 8-80:composto 7-80 = 6:2. (Composto I tem absorção de UV forte). A reação foi extinguida adicionando água de gelo cuidadosamente (~75 ml) a 0° C. Um sólido amarelo precipitou-se neste momento. A suspensão resultante foi filtrada e o sólido foi lavado com água. MeOH e acetato de etila (para remover SM não-reagido) e o sólido foi secado ao ar. (Pureza de LCMS 70%-80%) 2 g de sólido contendo 8-80 foram obtidos e tomados para próxima etapa sem outra purificação. LCMS(M+1)+ = 276; Tr =0,97 min.
Figure BRPI0508876B1_D0046
(4ίι-50Ψ=Γ para as duas ijlbmas eiapas (AalaçOo e acopíairentO)
Figure BRPI0508876B1_D0047
340
Figure BRPI0508876B1_D0048
[00460] Uma mistura do composto 8-80 (4,9 g, 17,8 mmols) & clori drato de N-benzoilpiperazina 8a-80 (sal de HCI; 6,0 g, 26,7 mmols, 1,5
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95/233 eq) em DMF (30 ml) foi agitado em ta durante a noite (16 h). Uma pasta fluida foi formada. Um adicional de 20 ml de DMF foi adicionado à pasta fluida. Depois HATU (12,2 g, 26,7 mmols, 1,5 eq) foi adicionado seguido por DMAP (4,3 g, 35,6 mmols, 2 eq). A mistura de reação foi agitada por 30 min. LCMS indicou que o material de partida 8-80 foi completamente convertido no produto (EXEMPLO 216). A mistura resultante foi filtrada e o sólido lavado com água. O filtrado foi concentrado a vácuo. Água foi adicionada ao resíduo e o sólido foi colhido através de filtração. Os sólidos foram combinados e lavados com água, MeOH e EtOAc. Depois o sólido foi secado ao ar. LCMS & HPLC mostrou IVb, >99% puro. O produto sólido foi também purificado por precipitação e cristalização em 5-10% de CH3OH/CHCl3. PURIFICAÇÃO DE IVb
[00461] Composto IVb bruto como obtido acima (15,3 g) foi dissolvido em 10% de MeOH/CHCl3 (600 ml). Uma suspensão marrom clara foi formada, filtrada através de papel de filtro e lavada com MeOH duas vezes. O sólido castanho foi descartado (~1,2g). Composto IVb foi cristalizado no filtrado, o sólido foi colhido por filtração e o sólido branco foi secado ao ar. O filtrado foi usado para repetir várias vezes a cristalização. O sólido obtido de cada filtração foi analisado por HPLC. Todas as frações puras foram combinadas. As frações não tão puras foram re-submetidas à cristalização com MeOH & CHCh. Um total de 12,7 g do Composto IVb foi obtido de recristalização e precipitação. O líquido-mãe foi concentrado e purificado em coluna de sílica-gel (EtOAc, depois CHCl3/MeOH (0-2%)) para fornecer 506mg do produto) como um sólido branco.
[00462] 1H RMN (d, DMSO) 13,1 (bs, 1H), 9,0 (s, 1H), 8,4 (s, 1H),
8,3 (s, 1H), 8,2 (s, 1H), 7,4 (bs, 5H), 3,7 (bs, 4H), 3,5 (bs, 4H); MS m/z 448 (MH). Anal. calc. para C22H18FN7O3; C 59,05, H 4,05, N 21,91, F 4,24. Encontrado; C 57,28, H 4,14, N 21,22; F 4,07%.
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96/233
EXEMPLOS 1-4:
PREPARAÇÃO DOS PRÓ-FÁRMACOS DOS COMPOSTOS IV DE
ORIGEM
ESQUEMA SINTÉTICO PARA EXEMPLOS 1-4
Figure BRPI0508876B1_D0049
3] água, NaHGÜ3; crcmatoofaíia
Q
Figure BRPI0508876B1_D0050
Ia
Figure BRPI0508876B1_D0051
Figure BRPI0508876B1_D0052
IV( It
Figure BRPI0508876B1_D0053
EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DE IA
Figure BRPI0508876B1_D0054
IVa Ia
[00463] PROCEDIMENTO: Uma suspensão de IVa (211 mg, 0,5
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97/233 mmol) em THF (2 ml; Sure Seal) sob atmosfera de N2 anidra foi tratada com NaH (86 mg, 2,2 mmols; 4,4 eq.; 60% de dispersão de óleo). Após alguns minutos agitando em temperatura ambiente, di-terc-butil fosfato de clorometila (782 mg, 3,0 mmols; preparação, ver Patente US 6.362.172) foi adicionado e a mistura agitada durante 1-5 dias, monitorando a conclusão da reação por HPLC (adicional de 1-2 eq. de cada NaH e o fosfato podem ser requeridos para trazer a reação para próximo da conclusão). Após o material de partida ter sido consumido, a mistura foi concentrada a vácuo à secura e o resíduo, que parecia ser uma mistura de fosfato de mono- e bis-t-butila de indol N-alquilado, foi dissolvido em CH2Cl2 (5 ml), tratado com TFA (5 ml) em temperatura ambiente por 2 h. A mistura foi concentrada a vácuo e o resíduo foi purificado por sílica-gel de fase reversa de C-18, eluindo com 5-10% de CH3CN em água contendo NaHCO3, para obter 75 mg (0,13 mmol; R. 26%) do composto do título Ia como um pó esbranquiçado (sal de dissódio): HPLC >99% (AP a 254 mn); LC/MS (ESI+) m/z 533 (M+H menos 2Na)+; HRMS (ESI) m/z calc. para C23H26N4O9P (M+H menos 2Na)+ 533,1437, encontrado 533,1426 (Δ, ~2,1 ppm); 1H RMN (D2O, 500 MHz) δ ppm 3,51 (2H, m), 3,67 (2H, m), 3,73-3,79 (2H, m), 3,893,95 (2H, m), 3,94, 3,95 (3H, 2s), 4,05, 4,07 (3H, 2s), 6,02-6,04-6,056,07 (2H, ABq.), 7,43, 7,44 (1H, 2s), 7,45-7,56 (5H, m), 8,49, 8,52 (1H, 2s).
[00464] Usando um procedimento e condições similares, Ib foi preparado de IVb. Ic e Id foram preparados de IVc e IVd, respectivamente, mas água ao invés de solução de bicarbonato de sódio foi utilizada na purificação.
EXEMPLO 2
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98/233 ο
Figure BRPI0508876B1_D0055
lb
[00465] Ib: Rendimento 13% (sal de dissódio); HPLC >96% (AP a 254 nm); LC/MS (ESI+) m/z 558 (M+H menos 2Na)+; 1H RMN (D2O, 500 MHz) δ ppm 3,59 (2H, m), 3,70-3,84 (4H, m), 3,93-3,95 (2H, m), 5,28-5,29-5,30-5,32 (2H, ABq.), 7,4-7,6 (5H, m), 8,09, 8,10 (1H, 2s), 8,34, 8,36 (1H, 2s), 8,59, 8,61 (1H, 2s), 8,72, 8,75 (1H, 2s).
EXEMPLO 3
Figure BRPI0508876B1_D0056
[00466] Ic: Rendimento 37% (forma de ácido. Água foi usada no lugar de bicarbonato de sódio aquoso durante a purificação; HPLC >98% (AP a 254 nm); LC/MS (ESI+) m/z 584 (M+H); 1H RMN (DMSOdQ, 500 MHz) δ ppm 2,40 (3H, s), 3,44 (4H, br.s), 3,66 (4H, brs), 4,04 (3H, s), 5,79 (1H, s), 5,82 (1H, s), 7,46 (5H, brs), 8,07 (1H, s), 8,41 (1H, s), 8,88 (1H, s).
EXEMPLO 4
Figure BRPI0508876B1_D0057
Id
[00467] Id: Rendimento 7% (forma de ácido). Água foi usada no lu
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99/233 gar de bicarbonato de sódio aquoso durante a purificação; LC/MS (ESI+) m/z 597 (M+H); 1H RMN (DMSO-cfe, 500 MHz) δ ppm 1,16, 1,21 (3H, 2d, J = 6,5 Hz), 2,29 (3H, s), 2,3-4,5 (7H, m), 4,00, 4,01 (3H, 2s), 5,79-5,85 (2H, m), 6,36 (1H, t, J = 2 Hz), 7,42-7,47 (5H, m), 7,99 (1H, s), 8,08, 8,09 (1H, 2s), 8,34, 8,44 (1H, 2s).
EXEMPLO 5
PREPARAÇÃO DE Ica, (SAL DE DISSÓDIO)
Figure BRPI0508876B1_D0058
R = *Bu —
TFA/CH2CI2
Ic, R = H tZ
NaHCO3 Ica, R = Na[00468] Procedimento Geral: Uma suspensão de IVc (0,24 g, 0,5 mmol) em THF anidro (4 ml) sob atmosfera de nitrogênio foi tratada com hidreto de sódio (60% de dispersão de óleo, 0,08 g, 2,0 mmols) e agitada até que evolução gasosa cessasse (cerca de 5 minutos). A mistura de reação foi tratada com iodo (0,13 g, 0,5 mmol) e agitado durante 2-3 minutos seguidos por adição de di-terc-butil fosfato de clorometila (1,6 g, 6,0 mmols, bruto). Um fluxo de nitrogênio foi deixado passar pela reação para facilitar a remoção de muito ou todo do THF. A mistura de reação foi agitada durante à noite. Análise de HPLC do bruto indicou IVc de partida (cerca de 56%) e aduto desejado (cerca 32%).
[00469] Várias misturas brutas de reação (um total de 6,7 mmols com base no material de partida IVc) foram re-dissolvidas em diclorometano, combinadas, concentradas a vácuo para remover qualquer THF restante. O resíduo foi suspenso em diclorometano e TFA (1:1, cerca de 40 ml de volume total). A mistura foi agitada por 1,5-2 horas e
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100/233 depois solvente foi removido a vácuo. O resíduo foi suspenso em diclorometano e extraído em água (cerca de 60 ml) tornado fracamente básico com bicarbonato de sódio sólido ou aquoso. A camada aquosa foi, se preciso for, reduzida em volume através de evaporador rotativo e a solução foi carregada em uma coluna de fase reversa C-18 (cerca de 80 g de C-18, YMC ODS-Aq, 50 mícrons) e eluída com água, seguida por água contendo 2,5% de acetonitrila. As frações contendo produto puro foram agrupadas e o solvente orgânico foi removido através de evaporador rotativo. Produto purificado foi restabelecido após liofilização para dar 1,00 g (1,30 mmol, 19% mais de 2 etapas) do composto do título Ica (sal de dissódio) como um pó esbranquiçado: pureza de HPLC >99% AP a 254 nm (gradiente 0-100% B/A; A 10% de CH3CN-90% de HaO-0,1% de TFA, B 90% de CH3CN-10% de H2O0,1% de TFA, Tempo de gradiente 4 min, coluna YMC ODS-Aq 4,6x50mm 3 mícrons); MS-ESI- m/z 482 (M-H menos 2Na)-; HRMS (ESI) m/z calc. para C25H27N7O8P (M+H menos 2Na)+ 584,1659, encontrado 584,1651 (Δ -1,3 ppm); 1H RMN (D2O, 500 MHz) δ ppm 2,53, 2,54 (3H, 2s), 3,56 (2H, s, CH2N), 3,72 (2H, br.s, CH2N), 3,78, 3,83 (2H, 2br.s, CH2N), 3,94, 3,96 (2H, 2br.s, CH2N), 4,14 (3H, s, CH3O), 5,38, 5,40 (2H, 2d, J = 11 Hz), 7,45-7,59 (5H, m, Ar-Hs), 8,07, 8,09 (1H, 2s, indol-H-5), 8,64, 8,67 (1H, 2s, indol-H-2), 8,87, 8,89 (1H, 2s, triazolH-5); 13C-RMN (125,7MHz, D2O) δ ppm 15,43 (N-Me), 44,03, 44,47, 44,66, 45,05, 48,20, 48,82, 49,60, 50,23, 59,78 (OMe), 75,81 (NCH2O),
115,6, 126,0, 127,2, 129,6, 131,0, 131,7, 132,1, 133,5, 136,8, 147,6,
150,1, 154,2, 164,8, 170,4, 175,8, 189,2; LTV (H2O) Àmax 220 nm (ε 3,91x104), 249 nm (ε 2,00 x104), 303 nm (ε 1,60x104); Anal. calc para C25H24N7OsPNa2,8H2O.0,2NaHCO3; C 38,39, H 5,14, N 12,44, P 3,93, Na
6,42 Encontrado; C 38,16, H 4,81, N 12,43, P 3,72, Na 6,05; KF (H2O) 17,3%. Umas frações menos puras foram colhidas para obter 0,22 g (0,29 mmol, R. 4%) do composto do título Ica (sal de dissódio): pureza
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101/233 de HPLC >95% (AP a 254 nm).
EXEMPLO 6
PREPARAÇÃO DE IAB (SAL DE LISINA HIDRATADO)
ETAPA UM
Figure BRPI0508876B1_D0059
PP4DJTklL: 422,43 ífi.4^. 2Q.0 ΊΤΜΠΟΙί)
A
Doq.
*
CMpCII
ΙΈ-ΜΠΙΓιί:
i:2OOg, i.LJmmi]
B benzene (IDO ml) !b.. 4 h,Süb N,
Figure BRPI0508876B1_D0060
mzj. wl: 2sa_aa b 100¾ He rendimento iDEteto de docmedils de ttra-t-buSda.
III. Z - iBu
[00470]
Éster de fosfato A (45,1 g, 0,1 mol) e cloroiodometano B (200 g, 1,14 mol) foi combinado em 100 ml de benzeno e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas antes do benzeno ter sido removido sob vácuo. Depois, foram adicionados 500 ml de éter etílico ao resíduo e sólido insolúvel foi separado por filtração. Concentração do filtrado forneceu di-terc-butil fosfato de clorometila que foi utilizado na próxima etapa sem qualquer purificação.
ETAPA DOIS
Figure BRPI0508876B1_D0061
ΜαίΙΛίυ *2243 (S.4fl, ÍQ.OitwtM
IVú
Figure BRPI0508876B1_D0062
Md. Em pese: 644,GS
NaH;UB<3«|.(BaK)
C : 266, 6e<» : S.Og. 1,0eq (TDO) - p. mol.
[00471] NaH (2,4 g, 60% em óleo) foi adicionado lentamente em uma suspensão de IVa em THF seco (120 ml) e a mistura foi deixada agitar durante uma hora em temperatura ambiente, lodo (5g) dissolvido em THF seco (10 ml) foi adicionado lentamente na solução de agitação. Seguindo conclusão da adição a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante um adicional de 15 minutos e depois composto di-terc-butil fosfato de clorometila, obtido da etapa um, foi adicionado. Após agitar durante 16 horas, a mistura de reação foi
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102/233 vertida em água de gelo (120 ml), seguido por extração com EtOAc (3 x 300 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (100 ml) e depois salmoura (100 ml), secados em Na2SO4 e concentrados sob vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (eluição com EtOAc/EtsN (100/1) e depois EtOAc/MeOH (100/1)) para dar para diéster lia em rendimentos de 70 - 80%.
ETAPA TRÊS
Figure BRPI0508876B1_D0063
[00472] Uma solução misturada de TFA (50 ml) e diclorometano (450 ml) foi adicionada em um frasco de fundo redondo contendo 43,3 g de diéster lia. Agitando em temperatura ambiente durante 16 horas, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo para oferecer um resíduo de lac que foi usado em outras etapas sem qualquer purificação. ETAPA QUATRO
Figure BRPI0508876B1_D0064
OH
L-Usina
Figure BRPI0508876B1_D0065
O=P-0H i L-Fisina· HiO
QH
[00473] O produto bruto lac acima de 55 g foi adicionado a uma solução aquosa de L-lisina (1,36 M, 70 ml) em temperatura ambiente. A suspensão resultante (pH=1,83) foi adicionada a uma solução de lisina (1,36 M, ~40 ml) para pH 4,88. A suspensão resultante foi filtrada através de um bloco de Celite. O filtrado amarelo claro transparente (~200 ml) foi misturado com acetona (200 ml) e aquecido para 45° C. Acetona (1400 ml) foi adicionada por 2h a 45° C. A solução clara foi semeada e agitado a 45° C por 2h, e lentamente resfriada para temperatura
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103/233 ambiente (5 h) e a suspensão agitada durante a noite. O sólido branco foi colhido através de filtração e secado sob vácuo em câmara a 50° C por 24 h para fornecer 41,2 g de Iab como um sólido esbranquiçado.
[00474] O sólido acima foi dissolvido em 1:1 água-acetona (560 ml) a 45° C. Acetona (700 ml) foi adicionada em um período de 1 h a 45° C. A solução clara foi semeada e agitado a 45° C por 2 h. Lentamente resfriada para temperatura ambiente (5 h) e a suspensão agitado em temperatura ambiente durante a noite. O sólido branco foi colhido através de filtração e secado sob vác. em câmara a 50° C por 36 h para fornecer 33 g de Iab como um sólido esbranquiçado. O AP foi >99% por HPLC.
[00475] 1H RMN (500 MHz, D2O) δ 8,42 (s, 1/2H), 8,39 (s, 1/2H),
7,52 (m, 6H), 6,12 (m, 2H), 4,07 (s, 3H), 3,93 (m, 5H), 3,72 (m, 3H), 3,67 (m, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 1,93 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,50 (m, 2H); MS m/z: (calc. de M+H-lisina)+ calc. para C23H26N4O9P 533,14, encontrado 533,03. M.P. 166,7 a 172,2 graus. Usando integração de 1H RMN comparativa de vários picos diferentes, a razão de lisina para IVa é calculada para variar de 1,05:1 a 1,2:1 equivalentes de lisina para pró-fármaco de origem. A forma de sal foi determinada ser um hidrato. Com base em DSC (calorimetria de varredura de difração) e TGA (análise de gravidade térmica), o teor de água observado é 2,80%. Cálculo teórico para um monoidrato é 2,58%. Desse modo, a razão de água para molécula de origem no hidrato poderia ser na faixa 1:1 a ~1,5:1.
EXEMPLO 7
PREPARAÇÃO DE IC CRISTALINO (MONOHIDRATO DE ÁCIDO LIVRE)
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104/233
Figure BRPI0508876B1_D0066
morȟafci de IccriilaJino
Figure BRPI0508876B1_D0067
[00476] A uma mistura de IVc (600 mg, 1,27 mmol) em THF anidro (10 ml) em um frasco de garrafa redonda secado ao forno sob nitrogênio em t.a. foi adicionado NaH (153 mg, 6,38 mmols, pó seco, 95%), e a suspensão branca agitado até que nenhuma evolução gasosa fosse observada. A mistura foi depois adicionada h (375 mg, 1,48 mmol), e agitado em t.a. por 3 h. À mistura de reação foi adicionado NaH (153 mg, 6,38 mmols, pó seco, 95%), e a mistura agitado durante cerca de 5 a 10 min. O di-terc-butilfosfato de clorometila bruto (2,0 g, cerca de 1,6 ml, 7,79 mmols) foi adicionado à mistura que foi depois agitado em t.a. por 15 h. Análise de LCMS da reação mostrou uma conversão de >97% do material de partida. Após evaporação dos voláteis, o resíduo foi adicionado CH2CI2 (10 ml), resfriado em um banho de gelo-água, lentamente adicionado TFA (10 ml) e agitado em t.a. por 3 h. A mistura de reação foi depois evaporada, e 0 resíduo dividido entre CH2CI2 (50 ml) e H2O (50 ml). A camada de CH2CI2 foi vertida no frasco de reação que continha algum sólido não-dissolvido castanho, e esta mistura foi extraída com uma solução diluta de NaHCO3 aquosa (50 ml). A mistura aquosa foi purificada através de HPLC preparativa de fase reversa (solvente A: 10% de MeOH-90% de H2O-0,1% de TFA; solvente B: 90% de MeOH-10% de H2O-0,1% de TFA; começo% de B = 0, final% de B = 100; Tempo de gradiente = 6 min; taxa de fluxo = 45 ml/min; coluna: phenomenex-Luna 30 x 50 mm, S5; fração colhida: 3,65 a 4,05 min). As frações colhidas foram evaporadas à secura, e 0 resíduo secado sob vácuo alto para obter 0 ácido Ic como um sólido amarelo pálido (356,6 mg); Ή RMN (500 MHz, CD3OD) δ 9,05 (s, 1H), 8,46 (s,
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1H,), 8,04 (s, 1H), 7,47 (b s, 5H), 5,93 (d, J = 12, 2H), 4,10 (s, 3H), 4,00-3,40 (b s, 8H), 2,53 (s, 3H); análise de 19F RMN mostrou que o material continha TFA residual, (a porcentagem não foi quantificada); método de HPLC Analítica: Começo% de B = 0, Final% de B = 100, Tempo de gradiente = 2 min, Taxa de Fluxo = 5 mL/min, Coluna: Xterra MS C18 7u 3,0x50mm, LC/MS: (ES+) m/z (M+H)+ = 584, HPLC ta = 0,983.
[00477] 172,2 mg do ácido Ic purificado foram dissolvidos em 1 ml de H2O e depois cerca de 0,3 ml de EtOH absoluto (prova 200) foi adicionado. A mistura foi deixada repousar em um refrigerador (temperatura cerca de 3° C) durante a noite, após cujo tempo, o material cristalino foi observado. A mistura foi depois aquecida para temperatura ambiente, diluída com H2O para um volume de 3 ml, e depois 20 ml de MeCN foi adicionado lentamente. Seguindo a conclusão da adição, a mistura foi agitada em t.a. por 2 h e depois filtrada.
[00478] O sólido colhido (90 mg) foi secado a vácuo, e depois sob vácuo alto. Este material foi mostrado através de estudos de raios X de pó ser cristalino; Análise Elementar calculada para C25H26N7O8P*H2O: C 49,92; H 4,69; N 16,30; observado: C 49,66; H 4,62; N 15,99; p.f = 205°C (medida através de calorimetria diferencial de varredura). O padrão de 1H RMN para o material cristalino foi comparado com o do ácido purificado e ambos foram consistentes com a estrutura.
EXEMPLO 8
[00479] Preparação de lab (sal de mono L-lisina): diidrogênio fosfato de de {3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4,7-dimetóxi-1H-pirrolo [2,3-c] piridin-1-il}metila, sal de L-lisina (1:1). A seqüência das reações é descrita no Esquema para o exemplo 8.
ESQUEMA PARA O EXEMPLO 8
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106/233
Figure BRPI0508876B1_D0068
Figure BRPI0508876B1_D0069
Figure BRPI0508876B1_D0070
Figure BRPI0508876B1_D0071
L-lieina
Figure BRPI0508876B1_D0072
ctÍElBlizaçio
Figure BRPI0508876B1_D0073
PREPARAÇÃO DE DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA
Figure BRPI0508876B1_D0074
ι^α
10eq.
bercena
1..an 4 hfiob
Figure BRPI0508876B1_D0075
[00480] O sal de tetrabutilamônio de fosfato de bis-terc butila (45,1 g, 0,1 mol) e cloroiodometano (200 g, 1,14 mol) foi combinado em 100 ml de benzene e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas e depois benzene foi removido sob vácuo. Uma porção de 500 ml de éter etílico foi adicionada ao resíduo e sólido insolúvel foi separado por filtração. Concentração a vácuo do filtrado e remoção dos voláteis em uma bomba de vácuo forneceu di-terc-butil fosfato de clorometila, como um óleo amarelo claro ou marrom claro que foi utiliPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 110/244
107/233 zado na próxima etapa sem outra purificação.
PREPARAÇÃO DE IIA: DI-TERC-BUTIL FOSFATO (3-(2-(4BENZOILPIPERAZIN-1-IL)-2-OXOACETIL)-4,7-DIMETÓXI-1HPIRROLO[2,3-C]PIRIDIN-1-IL)METILA o
O=p-O.
I o
[00481] NaH (2,4 g, 60 mmols, 60% em óleo) foi adicionado lentamente a uma suspensão de (8,4 g, 20 mmols) de IVa em THF seco (120 ml) e a mistura foi deixada agitar durante uma hora em temperatura ambiente. Iodo (5 g, 20 mmols) dissolvido em THF seco (10 ml) foi adicionado lentamente e com cautela à solução de agitação a uma taxa para manter a espuma sob controle.
[00482] Seguindo a conclusão da adição, a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante um adicional de 15 minutos e depois ~0,1 mol de di-terc-butil fosfato de clorometila, obtido como descrito na etapa um, foi adicionado. Após agitar durante 16 horas, a mistura de reação foi vertida em NH4OAc gelado (30%) (120 ml), seguido por extração com EtOAc (3 x 300 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (100 ml) e depois salmoura (100 ml), secados em Na2SO4 e concentrado a vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (elução com EtOAc/Et3N (100/1) e depois EtOAc/MeOH (100/1) para dar diéster IIa (9,0-10,3 g, AP ~75%) como um sólido amarelo claro em rendimentos de 70 - 80% em várias operações.
[00483] 1H RMN (500 MHz, CDCh) δ 8,09 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,40 (b, 5H), 6,15 (d, 2H, J = 11,5 Hz), 4,05 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,90 - 3,30
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 111/244
108/233 (b, 8H), 1,39 (s, 18H); 13C RMN (125 MHz, CDCh) δ 185,5, 170,7,
166,5, 146,9, 146,2, 139,6, 135,3, 130,2, 128,7, 128,4, 127,2, 124,5, 122,0, 120,8, 115,8, 83,8, 73,2, 57,3, 53,5, 46,1, 41,7, 29,8; MS m/z: (M+H) calc, para C31H42N4O9P 645,27, encontrado 645,10.
PREPARAÇÃO DE IAB: DIIDROGÊNIO FOSFATO DE (34-(4BENZOILPIPERAZIN-1-IL)(OXO)ACETILl-4,7-DIMETÓXI-1 HPIRROLOÍ2.3-C1PIRIDIN-1-IUMETILA, SAL DE L-LISINA (1:1)
Figure BRPI0508876B1_D0076
iab
Figure BRPI0508876B1_D0077
[00484] 500 mg de diéster Ila foi dissolvido em uma mistura de água (3 ml) e acetona (3 ml). A mistura resultante foi agitada a 40° C durante 16 horas para permitir a solvólise alcançar a conclusão. A esta mistura de reação (~69 AP) foi adicionado 4 M de solução de lisina aquosa para ajustar 0 pH em 4,83. Acetona (35 ml) foi lentamente adicionada na mistura de reação em 30 min a 45 - 50° C. A 45° C, a solução clara foi semeada com lab cristalino e mantida agitada nesta temperatura por 45 min. Após adição completa de acetona, a solução foi resfriada para temperatura ambiente em 4 horas e a cristalização de lab completada durante a noite. O sólido foi colhido por filtração e sucção sob nitrogênio durante 2 horas. O sólido cristalino branco foi secado sob vácuo em câmara a 50 - 55°C em 24 h para fornecer 343 mg de lab.
[00485] lab obtido na operação acima: 1H RMN (500 MHz, CD3OD)
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 112/244
109/233 δ 8,38 (s, 1 Η), 7,49 (m, 6Η), 6,13 (d, 2H, J = 10,5 Hz), 4,06 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 4,00 - 3,40 (m, 8H), 3,58 (t, 1H, J = 6 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,90 - 1,40 (m, 6H); 13C RMN (125 MHz, CD3OD) δ 186,1,
173,2, 171,8, 167,8, 147,4, 146,4, 141,0, 135,4, 130,4, 128,8, 127,2,
124,6, 122,3, 120,2, 114,6, 73,2, 56,6, 54,7, 53,1, 46,0, 41,6, 39,2,
30,5, 27,0, 22,0. HRMS m/z\ (M-lisina+H)+ calc, para C23H26N4O9P 533,1437, encontrado 533,1437. Anal. calc.. C, 51,32; H, 5,79; N, 12,38; P, 4,56; encontrado: C, 48,54; H, 5,32; N, 11,76; P, 4,04. Ponte de fusão 170°C.
[00486] Obtido por meio de outro processo (hidrólise com TFA em cloreto de metileno), lab era um hidrato de 1,70 molar e sal de lisina de
1,14 molar. 1H RMN (500 MHz, D2O, 60° C) δ 8,72 (s, 1H), 7,84 (m, 6H), 6,44 (d, 2H, J = 10Hz), 4,41 (s, 3H), 4,27 (s, 3H), 4,3 -3,7 (m, 8H), 4,10 (t, 1H, J = 5Hz), 3,39 (t, 2H, J = 5Hz), 2,30 - 1,80 (m, 6H); 13C RMN (125 MHz, D2O, 27° C) δ 186,7, 174,9, 173,2, 167,9, 147,7,
145,7, 142,6, 134,3, 131,1, 129,2, 127,1, 124,3, 122,4, 120,1, 113,8,
73.5, 57,1, 54,9, 54,4, 47,7, 47,1, 46,3, 45,7, 42,6, 42,1, 42,0, 41,5,
39.5, 30,2, 26,8, 21,8. HRMS m/z: (M-lisina+H)+ calc. para C23H26N4O9P 533,1437, encontrado 533,1425. Anal. calc.. C, 49,11; H 6,13; N, 12,05; encontrado: C, 48,93; H 6,26; N 12,07. P.l. 168 172°C.
EXEMPLO 9
[00487] Preparação de Ibb (sal de mono L-lisina): diidrogênio fosfato de de [3-[(4-benzoilpiperazin-1-il)(oxo)acetil]-4-fluoro-7-(1H-1,2,3triazol-1 -il)-1 H-pirrolo[2,3-c]piridin-1 -il]metila, sal de L-lisina (1:1). A seqüência das reações é descrita no Esquema para 0 exemplo 9. ESQUEMA PARA O EXEMPLO 9
Figure BRPI0508876B1_D0078
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 113/244
110/233
Figure BRPI0508876B1_D0079
Figure BRPI0508876B1_D0080
Figure BRPI0508876B1_D0081
l_-bsina aoelonaiãgus (1:1)
Figure BRPI0508876B1_D0082
aaelona
Ida
O
Figure BRPI0508876B1_D0083
PREPARAÇÃO DE DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA o
Figure BRPI0508876B1_D0084
Figure BRPI0508876B1_D0085
[00488] O sal de tetrabutilamônio de fosfato de bis-terc-butila (57 g, 0,126 mol, Sigital Specialty Chemicals) e cloroiodometano (221 g, 1,26 mol) foram agitados em temperatura ambiente durante quatro horas e depois os voláteis foram removidos a vácuo. Foram adicionados 500 ml de éter etílico ao resíduo e o sólido insolúvel foi separado por filtração. Concentração do filtrado e remoção final dos voláteis usando uma bomba de vácuo forneceu di-terc-butil fosfato de clorometila (112 g), tipicamente como um óleo amarelo claro ou marrom que foi utilizado na próxima etapa sem qualquer outra purificação.
PREPARAÇÃO DE IIB: FOSFATO DE DI-TERC-BUTILA DE (3-(2-(4BENZOILPIPERAZIN-1-IL)-2-OXOACETIL)-4-FLUORO-7-(1H-1,2,3TRIAZOL-1-IL)-1 H-PIRROLO[2,3-C]PIRIDIN-1-IL)METILA
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 114/244
111/233
Figure BRPI0508876B1_D0086
lib
[00489] NaH (5,65 g, 95% de dispersão em óleo mineral, 0,224 mol) foi adicionado lentamente em uma suspensão de IVb (20 g, 44,7 mmols) em THF seco (400 ml) e a mistura foi deixada agitar durante 0,5 hora em temperatura ambiente. Uma solução de iodo (11,3 g, 44,5 mmols) dissolvida em THF seco (20 ml) foi adicionada lentamente na solução de agitação a uma taxa que impediu a reação de ficar violenta. A mistura resultante foi agitada durante um adicional de 3 horas antes de uma segunda porção de 95% de NaH (5,65 g, 0,224 mol) ter sido introduzida. Após 15 minutos em temperatura ambiente, di-terc-butil fosfato de clorometila, (112g), obtido da etapa um, foi adicionado em uma porção. Após agitar durante 16 horas em temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em NH4OAc gelado (30%) (200 ml) e depois extraída com EtOAc (3 x 500 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (200 ml) e depois salmoura (200 ml), secados em Na2SO4 e concentrados sob vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (elução com EtOAc/ MeOH/Et3N (100/1/1) para dar 15,0 g (43% de rendimento corrigido para 85% de AP) do diéster IIb como um sólido de amareloclaro.
[00490] 1H RMN (500 MHz, CDCh) 4,36 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,41 (b, 5H), 5,90 (d, 2H, J = 14,5Hz), 3,90 - 3,40 (b, 8H), 1,23 (s, 18H); 13C RMN (125 MHz, CDCh) δ 182,9; 170,7,
165,1, 154,6, 152,5, 144,1, 135,1, 134,0, 131,9, 130,3, 128,7, 128,3,
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 115/244
112/233
127,2, 125,9, 124,3, 114,0, 84,1, 74,1, 46,2, 41,9, 29,6; HRMS m/z: (M+H)+ calc. para C31H38FN7O7P 670,26, encontrado 670,34.
PREPARAÇÃO DE IBB (SAL DE MONO L-LISINA): DIIDROGÊNIO DE FOSFATO DE [3-[-(4-BENZOILPIPERAZIN-1-IL)(OXO)ACETIL1-4FLUORO-7-(1H-1,2,3-TRIAZOL-1-IL)-1H-PIRROLO[2,3-E1PIRIDIN-1IL1METILA, SAL DE L-LISINA (1:1)
Figure BRPI0508876B1_D0087
Ibb
[00491] Diéster IIb (27g) foi dissolvido em uma mistura de água (55 ml) e acetona (55 ml). A mistura resultante (pH: não determinado) foi agitada a 40°C durante 16 horas para completar a solvólise. A esta mistura de reação 4 M de solução de lisina aquosa foram adicionados para ajustar pH em 3,51. EtOH (500 ml) foi adicionado na solução e a parede do frasco foi revestida com algum produto após durante a noite. A solução clara foi depois transferida para outro frasco e EtOH (1500 ml) foi lentamente adicionado à mistura de reação em ~3 h. Após adição completa de etanol, a solução foi agitada em temperatura ambiente por 48 horas e o sólido resultante (Ibb) foi colhido através de filtração e enxagüado com etanol. O sólido cristalino branco foi secado sob vácuo em câmara a 55° C por 24 h para fornecer 10,92 g de Ibb (98 AP).
[00492] Este sólido foi também misturado com 12,5 g de sal obtidos de outras operações em 70 ml de água. EtOH (1000 ml) foi depois adicionado e a solução resultante foi agitada em t.a. durante mais de 20 horas. O sólido foi colhido através de filtração, enxagüado com EtOH
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 116/244
113/233 (2 x 80 ml) e secado sob vácuo em câmara a 50° C sob atmosfera de nitrogênio durante 44 horas para fornecer 21,5 g de Ibb em AP de
98,7.
[00493] Ibb obtido no procedimento acima foi ~1 molar de sal de lisina com 1,12% de água, 0,8% de TFA e 0,05% de etanol. 1H RMN (500 MHz, CD3OD, 50° C) δ 8,94 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,69 (s, 1H),
8,42 (s, 1H), 7,83 (m, 5H), 5,81 (d, 2H, J = 12,5Hz), 4,30 - 3,70 (m, 8H), 4,08 (t, 1H, J = 6,5Hz), 3,67 (t, 2H, J = 10Hz), 2,26 (m, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,88 (m, 2H); 13C RMN (125 MHz, D2O, 30° C) 8185,2, 174,9,
173,3, 166,8, 153,1, 146,8, 134,8, 134,3, 131,3, 131,1, 130,3, 129,3,
128.9, 128,7, 128,5, 127,2, 124,2, 112,6, 74,0, 54,9, 47,9, 47,2, 46,4,
45.9, 42,7, 42,2, 42,0, 41,7, 39,5, 30,3, 26,8, 21,8. MS m/z: (Mlisina+H)+ calc, para C23H22FN7O7P 558,1302, encontrado 558,1293. Anal. calc.. C, 48,75; H, 5,07; N, 17,63; P, 4,33; encontrado: C, 49,02; H 4,90; N, 17,90; P, 4,37. Μ. P. 193° C. pKa (potenciométrica) 6,1,9,1. EXEMPLO 10
[00494] Preparação de Icb (sal de monotrometamina): diidrogênio de fosfato [3-[(4-benzoilpiperazin-1 -il)(oxo)acetil]-4-metóxi-7-(3-metil
1H-1,2,4-triazol-1-il)-1 H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il]metila, sal de 2-amino2-(hidroximetil) propano-1,3-diol (1:1). A seqüência das reações é descrita no Esquema para 0 exemplo 10.
ESQUEMA PARA O EXEMPLO 10
Figure BRPI0508876B1_D0088
Figure BRPI0508876B1_D0089
Figure BRPI0508876B1_D0090
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 117/244
114/233
Figure BRPI0508876B1_D0091
Figure BRPI0508876B1_D0092
lob·
PREPARAÇÃO DE DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA
Figure BRPI0508876B1_D0093
[00495] Uma mistura de di-terc-butil fosfato de tetrabutilamônio (57 g, 0,126 mol, Sigital Specialty Chemicals) e cloroiodometano (221 g,
1,26 mol) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas antes dos voláteis terem sido removidos sob vácuo. 500 ml de éter etílico foram adicionados ao resíduo e sólido insolúvel foi separado por filtração. Concentração do filtrado a vácuo e remoção dos voláteis restantes usando uma bomba de vácuo forneceu di-terc-butil fosfato de clorometila como um óleo marrom claro ou amarelo que foram utilizados na próxima etapa sem outra purificação.
PREPARAÇÃO DE IIC: FOSFATO DE DI-TERC-BUTILA DE (3-(2-(4BENZOILPIPERAZIN-1-IL)-2-OXOACETIL)-4-METÓXI-7-(3-METIL-1H-
1,2,4-TRIAZOL-1-IL)-1 H-PIRROLO[2,3-C]PIRIDIN-1-IL)METILA
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 118/244
115/233
Figure BRPI0508876B1_D0094
[00496] NaH (2,6 g, 10,3 mmols, 95% em óleo, 5 eq.) foi adicionado lentamente em uma suspensão de IVc (10,0 g, 21,1 mmols) em THF seco (100 ml) e a mistura foi deixada agitar durante 0,5 hora em temperatura ambiente. Uma solução de iodo (5,27 g, 20,8 mmols) dissolvida em THF seco (10 ml) foi adicionada lentamente na solução de agitação a uma taxa que impediu espuma ou uma reação violenta. A mistura resultante foi agitada durante um adicional de 3 horas antes de uma porção de 2,6 g de NaH ter sido introduzida. Após 15 minutos em temperatura ambiente, di-terc-butil fosfato de clorometila, a batelada inteira de di-terc-butil fosfato de clorometila, obtida da etapa um, foi adicionado. Após agitar durante 16 horas, a mistura de reação foi vertida em NH4ÜAc gelado (30%) (120 ml), seguido por extração com EtOAc (3 x 300 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (100 ml) e depois salmoura (100 ml), secados em Na2SO4 e concentrados sob vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (elução com EtOAc/Et3N (50/1) e depois EtOAc/MeOH (100/1)) para dar 8,0 g (~75% de AP, ~41% de rendimento) de diéster IIc como um sólido de amarelo-claro.
[00497] 1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 8,82 (s, 1H), 8,41 (s, 1H),
8,04 (s, 1H), 7,47 (b, 5H), 6,00 (d, 2H, J = 14,5Hz), 4,10 (s, 3H), 4,00 3,40 (b, 8H), 2,49 (s, 3H), 1,28 (s, 18H); 13C RMN (125 MHz, CD3OD) δ
18,6, 176,4, 172,9, 168,0, 162,6, 152,6, 147,5, 144,0, 136,5, 131,5, 130,8, 129,9, 129,1, 128,3, 126,1, 124,0, 116,2, 85,8, 75,4, 61,6, 57,7,
30,1, 22,2, 13,7; HRMS m/z: (M+H)+ calc. para C33H43N7O8P 696,29, encontrado 696,34.
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 119/244
116/233
PREPARAÇÃO DE ICB (SAL DE MONO L TROMETAMINA): DIIDROGÊNIO DE FOSFATO 1-3-[(4-BENZOILPIPERAZIN-1IL)(OXO)ACETIL]-4-METÓXI-7-(3-METIL-1H-1,2,4-TRIAZOL-1-IL)-1HPIRROLO[2,3-C]PIRIDIN-1-IL]METILA, SAL DE 2-AMINO-2(HIDROXIMETIL)PROPANO-1,3-DIOL (1:1)
Figure BRPI0508876B1_D0095
Figure BRPI0508876B1_D0096
Icb
[00498] 500 mg (~75 AP, 0,54 mmol) de diéster IIc foram dissolvidos em uma mistura de água (2,5 ml) e acetona (2,5 ml). A mistura resultante foi agitada a 40° C durante 16 horas para completar a solvólise. A esta mistura de reação foram adicionados 3,0 M de solução de TRIS aquosa (mono trometamina) para ajustar o pH em 3,32. Acetona (30 ml) foi lentamente adicionada à mistura de reação em 1 hora. *Após adição completa da acetona, a solução foi agitada durante a noite para completar a cristalização de Icb. O sólido foi colhido através de filtração e enxagüado com 20:1 acetona-água (2 x 5 ml). O sólido cristalino branco foi secado sob vácuo em câmara sob atmosfera de nitrogênio a 50° C por 24 h para fornecer 290 mg de Icb (>98,5 AP).
[00499] *Após adicionar cerca de 15 e 20 ml de acetona, a mistura de reação foi semeada com Icb cristalino.
[00500] Icb obtido na operação acima: 1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 8,83 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,02 (s, 1H) 7,49 (b, 5H), 5,469 (d, 2H, J = 13 Hz), 4,11 (s, 3H), 4,00 - 3,40 (m, 8H), 3,66 (s, 6H), 2,50 (s, 3H); 13C RMN (125 MHz, CD3OD) δ 185,6, 171,9, 167,4, 161,4, 151,7, 146,9,
143.8, 135,4, 130,3, 129,7, 128,8, 127,2, 124,9, 122,6, 114,3, 73,5,
61.8, 59,9, 56,5, 46,0, 41,7, 12,6. HRMS m/z: (M-trisamina+H)+ calc.
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 120/244
117/233 para C25H27N7O8P 584,1659, encontrado 584,1664. Anal. calc.. C, 49,43; H, 5,29; N, 15,90; P, 4,39; encontrado: C, 49,18; H, 5,38; N, 15,59; P, 4,26. Ponto 203° C de fusão.
[00501] Obtido por meio de outro processo (hidrólise com TFA em cloreto de metileno), sal Icb é ~1 molar de sal mono trometamina com 0,47% de água, 0,1% de acetona e 0,05% de metanol. 1H RMN (500 MHz, d6-DMSO, 30° C) δ 8,77 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,00 (s, 1H) 7,44 (b, 5H), 5,42 (d, 2H, J = 15Hz), 4,02 (s, 3H), 3,70 - 3,30 (m, 8H), 3,41 (s, 6H), 2,38 (s, 3H); 13C RMN (125 MHz, CDCh, 30° C) δ 184,8, 169,0,
165.8, 160,3, 150,4, 146,2, 143,2, 135,4, 129,4, 128,9, 128,2, 127,7,
126.9, 123,2, 122,2, 112,9, 72,3, 60,7, 59,0, 56,7, 13,4. MS m/z: (Mtrisamina+H)+ calc. para C25H27N7O8P 584,2, encontrado 584,0. Anal. calc. C, 49,11; H, 5,37; N, 15,76; P, 4,32; encontrado: C, 48,88; H 5,28; N, 15,71; P, 4,16. P.F. 201 - 205° C.
Procedimento geral para Formar Sais Adicionais de lac
O=P-OH OH lac
PROCEDIMENTO A:
[00502] 1,2 eq. de alcóxido de metal foi adicionado em uma solução de ácido fosfórico em THF e precipitado foi colhido como forma de sal. PROCEDIMENTO B:
[00503] 2,2 eq. (para Na, K) ou 1,2 eq. (para Mg) de alcóxido de metal foram adicionados em uma solução de ácido fosfórico em THF. Após 2 horas, solvente foi evaporado e MeOH foi adicionado para fornecer uma solução clara. EtOH ou iPrOH foram depois adicionados na solução até que ficasse nublados. Depois, MeOH foi adicionado com cautela para deixar a solução apenas ficar novamente clara. A solução misturada foi deixada ao por 16 horas e o precipitado resultante foi coPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 121/244
118/233
Ihido como a forma de sal.
PROCEDIMENTO C:
[00504] 2,2 eq. de amina foram adicionado em uma solução de ácido fosfórico em THF. Após 2 horas, solvente foi evaporado e MeOH foi adicionado para fornecer uma solução clara. EtOH ou iPrOH foram depois adicionados na solução até que ficasse nublado. Depois,
MeOH foi adicionado com cautela para deixar solução apenas ficar novamente clara. A solução misturada foi deixada ao ar por 16 horas e o precipitado resultante foi colhido como forma de sal.
Composto Molécula de Origem Análise de elemento (Comp. Teórica) Análise de Elemento (Comp. Observada%) Procedimento Usado
Iac OMe \ JJ OMe ) O O H0 OH C 51,88% H 4,73% N 10,52% P 5,82%
Forma de Sal Análise de elemento (Comp. Teórica) Análise de Elemento (Comp. Observada%)
Mistura de Iad com quantidade pequena de Ia θχ /? OMe d-/ζ ΛΓn N / X—N / /> n\í^-n OMe ) O O Uo xNa H0 OH mono sal de Na C 49,83% H 4,36% N 5,59% Na 4,15% di sal de Na C 47,93% H 4,02% N 9,72% P 5,37% Na 7,89% C 47,43% H 4,59% N 9,24% P 5,72% Na 4,48% principalmente monossal de Na procedimento B NaOMe usado
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Composto Molécula de Origem Análise de elemento (Comp. Teórica) Análise de Elemento (Comp. Observada%) Procedimento Usado
Mistura de lae e lac Οχ /? OMe ATOn γ η y-W OMe / O O >^o xK H0 OH mono sal de K C 48,42% H 4,24% N 9,82% P 5,43% K 6,85% di sal de K C 45,39% H 3,81% N 9,21% P 5,09% K 12,85% C 49,36% H 5,25% N 9,56% P 4,25% (4,33%) K 3,31% (3,18%) mistura de sal de K e ácido livre Procedimento B KOMe usado
Mistura ~1:1 de Iaf e Iag <\ /7 OMe .MQn N Jj OMe ) O O zk-o xCa HO OH sal de Ca C 50,09% H 4,39% N 10,16% P 5,62% Ca 3,63% sal de Ca C 48,42% H 4,06% N 9,82% P 5,43% Ca 7,03% C 46,77% H 4,22% N 9,33% P 5,52%(5,70%) Ca 4,95%(5,30%) mistura de 0,5 sal de Ca e monossal de Ca (~1:1) Procedimento A Ca(OMe)2 usado
Iaj O /? OMe Ύ-\ T N\ YxJ OMe / O O A*O xZn H0 OH 0,5 sal de Zn C 48,97% H 4,29% N 9,93% P 5,49% Zn 5,80% mono sal de Zn C 46,36% H 3,89% N 9,40% P 5,20% Zn 10,97% C 44,87% H 4,08% N 9,00% P 5,54%(5,45%) Zn 9,18%(9,47%) mistura monossal de Zn Procedimento A Zn(O-tBu)2 usado
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Composto Molécula de Origem Análise de elemento (Comp. Teórica) Análise de Elemento (Comp. Observada%) Procedimento Usado
Mustura lak /7 OMe AVO yA dl OMe ) O O λ-Ο xMg HO OH 0,5 sal de Mg C 50,82% H 4,45% N 10,31% P 5,70% Mg 2,44% mono sal de Mg C 49,80% H4,18% N 10,10% P 5,58% Mg 4,38% C 46,22% H 4,48% N 8,90% P 3,88% Mg 3,60% mistura monossal de Mg Procedimento A Mg(OEt)2 usado
mistura de Iam e lan <\ /? OMe ÃWn t , Y\J OMe / O °\ HO. ,p x-o Ί HO X 0H X H2N-Jx^OH OH mono sal de Tris C 49,62% H 5,55% N 10,72% P 4,74% di sal de Tris C 48,06% H 6,11% N 10,85% P 4,00% C 45,30% H 5,60% N 9,59% P 2,98% principalmente dissal de Tris mistura com Tris Procedimento C Trometamina usado
EXEMPLO 11
PREPARAÇÃO DO COMPOSTO ΙΙΆ DE IIa
Figure BRPI0508876B1_D0097
La., 4 h
10% de TFA em THF
Figure BRPI0508876B1_D0098
[00505] Éster de difosfato IIa (500 mg) foi dissolvido em 5 ml de
10% de TFA em THF. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas antes de ser extinguida por 10% de solução de Na2COs aquosa (30 ml). Após ter sido lavada com EtOAc (50 ml), a fase aquosa foi concentrada sob vácuo para fornecer um resíduo que
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121/233 foi purificado usando Sistema de HPLC preparativa de Shimadzu automatizado para fornecer o mono-fosfato desejado ll’a (26,5 mg)). 1H RMN (500 MHz, CDCh) δ 8,13 (s, 1H), 7,40 (b, 6H), 6,13 (d, 2H, J =11,5Hz), 4,05 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,90 - 3,40 (m, 8H), 1,39 (s, 9H); MS m/z: (M+H)+ calc, para C27H34N4O9P 589,21, encontrado 589,13; tempo de retenção de LC tempo 1,32 min (coluna: Xterra 4,6x50mm C18 5um).
PREPARAÇÃO ALTERNADA DE DI-TERC-BUTIL DE FOSFATO CLOROMETILA e lí / IE ΰ ' 0 eq.
4&q.
0.S
DCM/âJUS
Figure BRPI0508876B1_D0099
rl.O eq, KG +1.Q eg. SO,
Figure BRPI0508876B1_D0100
REAÇÃO
[00506] Ao reator inerte, fosfato de potássio de di-terc-butila (1,69 kg), 4,0 eq. de carbonato de sódio e 0,05 eq de sulfato de hidrogênio de tetrabutil amônio foram adicionados por meio de forma humana. Cloreto de metileno (7,7 L/kg) foi depois bombeado através do bola de pulverização para lavar as paredes do reator. Com a temperatura da camisa abaixo de 10° C, a carga de água exotérmica foi adicionada no curso de dez minutos (7,6 L/kg). O exotérmico associado foi menos com uma temperatura de batelada elevando de 11,1 para 16,2° C no curso da adição. Com a temperatura da camisa e de batelada próxima de 7 e 15° C, respectivamente, 2,0 eq. de clorometilsulfonilcloreto (CMOS) foram carregados por meio de funil de adição. A carga continuou durante 2 horas enquanto a temperatura da camisa foi lentamente elevada para 20° C durante a carga. A temperatura de batelada máxima durante a carga de CMOS foi 25,3° C. A temperatura da camisa foi lentamente elevada durante a carga para assegurar que 0 exotérmico iniciasse visto que os dados de laboratório preliminares indicaram que 0 exotérmico pode ser reduzido para temperaturas de batelada
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122/233 inferiores. A mistura de reação foi agitada e após 3,5 horas, indicou uma amostra de RMN que a reação tinha progredido para 72%. A reação foi deixada prosseguir durante a noite com uma temperatura de batelada entre 19,7 e 23,6° C (Delta V historian). Uma amostra de RMN tirada após 16 horas indicou uma conversão de reação de 76%. Bateladas de laboratório variaram na conversão de 60 a 80%. PROCESSAMENTO
[00507] Após a reação ter sido julgada completa, água adicional a
9,3 L/kg foi adicionada à batelada para afetar uma divisão de fase. O produto de fase inferior rico foi transferido para um garrafão de vidro e a fase aquosa superior foi jogada fora. Uma camada de sobra pequena foi mantida com os ricos do produto orgânico. A fase orgânica foi retornada para R-1A e água adicional a 5,1 L/kg foi adicionada como uma lavagem. As fases foram separadas com o produto orgânico rico, cerca de 18,5 kg, sendo enviado para um garrafão de vidro enquanto a fase aquosa superior foi jogada fora. Nenhuma camada de sobra ou sólidos foram observados na segunda divisão. Porém, foi recomendado polir o filtro o produto orgânico rico para remover os sais precipitados.
DESTILAÇÃO DE CLORETO DE METILENO
[00508] O produto orgânico rico foi transferido para a tigela de evaporador rotativo de EVAPO-1A. Destilação do cloreto de metileno foi iniciada com uma temperatura da camisa de cerca de 22° C. A taxa de destilação reduziu após 4,5 horas e uma amostra de batelada foi tomada para analisar o teor de cloreto de metileno. Análise de RMN indicou uma razão de 4:1 de di-terc-butil fosfato de clorometila para cloreto de metileno. Resultados laboratoriais típicos deste fluxo indicariam uma razão de 10:1 assim a destilação foi continuada com um aumento na temperatura da camisa do evaporador rotativo. Após um adicional de 2,5 horas, a taxa de destilação parou. Uma amostra de RMN da
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123/233 batelada indicou que a razão tinha aumentado para 5:1 de di-terc-butil fosfato de clorometila para cloreto de metileno. A temperatura da camisa do evaporador rotativo máxima foi 28,4° C.
PUREZA DO ÓLEO DE DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA
[00509] Análise de RMN do óleo de di-terc-butil fosfato de clorometila indicou a potência ser maior que 100%. Trabalho de desenvolvimento tipicamente produziu material com uma potência de 100 ± 10%. Análise de Karl-Fischer mediu o teor de água em 0,02% em peso e análise de GC mediu o cloreto de metileno em 10,69% em peso. Desse modo, a potência relatada é 89,29% em peso respondendo pela contribuição de cloreto de metileno e de água no óleo.
ARMAZENAMENTO DE DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA
[00510] O óleo de di-terc-butil fosfato de clorometila foi colocado em quarto frio e a temperatura foi monitorada com um registrador de gráfico de listras. Bateladas de laboratório foram tipicamente mantidas entre 0 a 5° C. Uma RMN do produto após a contensão de 104 horas no quarto frio indicou que o material não tinha perdido a potência.
[00511] (Teste de segurança conduzido durante a campanha indica que sob contensão o óleo se auto-aquece com uma formação de pressão subseqüente).
PREP PADRÃO DE RMN E PREP DE AMOSTRA
SOLUÇÃO PADRÃO DE PREPARAÇÃO DE FOSFATO DE TRIMETILA (TMPO4):
[00512] Uma solução padrão de TMPO4 deveria ser preparada com base em um rendimento teórico de 100% M. Por exemplo: uma entrada de 10 g do sal de di-t-butil fosfato de potássio deveria render 10,41 g (0,402 mols) de di-terc-butil fosfato de clorometila. O volume de diclorometano na mistura de reação será 75 ml. A molaridade da solu
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124/233 ção é 0,536. Uma solução de TMPO4 deveria ser preparada em que molaridade e 0,5 ml desta solução deveria ser combinada com 0,5 ml da camada de diclorometano da reação. Os integrais encontrados no 31P RMN podem ser comparados diretamente e darão 0 % de conversão do di-terc-butil fosfato de clorometila.
DETERMINAÇÃO DO % DE MATERIAL DE PARTIDA NÀO-REAGIDO NA FASE AQUOSA DE REAÇÃO:
[00513] Após registrar 0 volume da fase aquosa de reação, com precisão transferir 0,500 ml em um frasco de 1 dracma contendo um peso conhecido de padrão interno de TMPO4. Adicionar cerca de 0,24 ml de D2O. Agitar para misturar completamente. Obter espectros de 31P-quant.
[00514] Cálculo de% do material de partida não-reagido:
vol. mal. de
aq. mg de part, de
Esp. IMPO, PM24B.30
g de vol. da TMPO(
at. Amostra de
entr. (0.5 mL) PM 140.03
mal. de
212. 13.4 part, de
mL TMPOj PM 246,.30
fl.Og TMPO<
at. 0.600 mL PM
140,08
mal. de part.
de irttegraçaa de 10
alP RMN 0 % de material de parti-
da nao-rea-
gido no ιϊπ.
TLIPOj de 10 aq.
integração de Ü1P RMN OO
9.617 10
11P RMN 0 3.26 % de maseiial de
partida nao-
reaighdo
10
270.392 00
DETERMINAÇÃO DO%-POTÊNCIA DO ÓLEO DO PRODUTO [00515] Após registrar 0 peso líquido do óleo de produto destilado, tarar um frasco de rosca no topo de 1 dracma contendo um peso conhecido de TMPO4 padrão interno. Transferir aproximadamente 0,02 mL de óleo de produto para 0 frasco e registrar 0 peso líquido do óleo
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125/233 de produto. Adicionar aproximadamente 0,7 ml de CDCh. Agitar para misturar completamente. Obter os espectros de 31P-quant. Inspecionar os espectros de 1H RMN quanto à presença de catalisador de transferência de fase residual (bissulfato de tetra-n-butil-amônio) e cloreto de metileno. Relatar estes como% em mol com relação ao produto.
Càlcuta de%-potência:
mg de produto de
TMPOj 253.6BMW
--------- x -----------mg de TMPO£
AmosUa de
PM 140,00
Exemplo:
13,7 mg produto· de
TMPO, PM 25B,6fl
-------- x -----------22r3 mg TMPO« amostra PM
140.08
Produto de integração alP RMN
---------------------x 100
TMPO< de integração de J1P RMN
44,7440 x x 100
55.25S10 % na potênci a (fVp) do óleo de produto
91,9% üe potência íppído óleo do produto
DADOS DE RMN PARA DI-TERC-BUTIL FOSFATO DE CLOROMETILA
[00516] 1H RMN (300,13 MHz, CDCh): δ 1,52 (s, 18H), 8 5,67 (d, J = 15,5, 2H)
[00517] 13C RMN (75,47 MHz, CDCh): δ 29,77 (d, J = 4,5, 6C), 6
73,34 (d, J= 7,5, 1C), 8 84,16 (d, J= 1,5, 2C)
[00518] 31P RMN (121,49 MHz, CDCh): δ -10,51 (s, 1P)
EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO ALTERNADA DE IAB (PRÓFÁRMACO DE IVa)
Figure BRPI0508876B1_D0101
Peso md- 42243
Peso mol - 532,44
K,CO3h EMSO, 30 *C
2. TFA, CHjCti, RT
[00519] Um frasco de fundo redondo de 500 ml de 4 gargalos equipado com um agitador suspenso, termopar, funil de adição, uma entrada de nitrogênio e um septo foi carregado com IVa (20,01 g, 47,37
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126/233 mmols), K2CO3 (13,13 g, 95,00 mmols) e DMSO (100 ml, 1,41 mol) e a reação foi agitada em temperatura ambiente que resulta em uma suspensão heterogênea marrom-clara. Di-terc-butil fosfato de clorometila (14,83 g, 57,32 mmols) foi adicionado por meio de funil de adição e a reação foi aquecida para 30°C durante 16-24 horas após cujo tempo a reação foi resfriada para 10°C. À reação foi adicionado DCM (200 ml) depois foi lentamente extinguida com água (200 ml) mantendo a temperatura de reação abaixo de 20° C resultando em uma mistura bifásica. A camada do fundo rica em produto foi separada, lavada com água (200 ml), depois transferida para um frasco de fundo redondo de 500 ml de 4 gargalos equipado com um agitador suspenso, termopar, funil de adição e entrada de nitrogênio. Ácido trifluoroacético (53,0 ml, 700,94 mmols) foi adicionado por meio de funil de adição que resulta em um exotérmico leve. A reação foi agitada durante 1-3 horas depois resfriada para 0°C. Metanol (300 ml) foi adicionado mantendo a temperatura da reação sob 20°C, e depois resfriada para 0°C. O frasco de reação foi equipado com um aparelho de destilação e concentrado sob vácuo para um volume de 200 ml (200 tonelada, < 30°C). A reação foi semeada com lac (0,200 g) depois agitada durante a noite em temperatura ambiente que resulta em uma pasta fluida. A pasta fluida foi filtrada depois a torta úmida foi lavada com THF (300 ml) depois secada em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um amarelo-pálido a pó branco (23,94 g, 95%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) δ 8,30 (s, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,44 (s, 5H), 6,12 (d, J = 10,6 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,80-3,22 (m, 8H); 13C RMN (100 MHz, DMSO-cfe) δ 185,49, 169,26, 166,06, 146,20, 145,60, 140,64, 135,50, 129,68, 128,41, 127,04, 123,46, 121,17, 120,08, 114,32, 72,43, 56,92, 53,32, 45,22, 40,50; ES+ MS m/z (intensidade rel.) 533 (MH+, 100), 453(MH+ H3PO4, 15).
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127/233
Figure BRPI0508876B1_D0102
Ιαπ
Pê5QITrCd- 532,44
Figure BRPI0508876B1_D0103
HD
Peso mnl - 67B,6i
[00520] A um reator de 4 gargalos de 10 L equipado com um termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio foram adicionados lac (611 g, 1,15 mol) e água (3875 ml). À suspensão resultante foi adicionada lisina (168 g, 1,15 mol). A reação foi agitada durante uma hora em RT, aquecida para 50° C depois mantida a 50° C com agitação durante uma hora adicional. A solução nebulosa resultante (pH = 4,55) foi filtrada através de um filtro cuno de 10 microns em um reator de 4 gargalos de 20 L equipado com um termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio. A reação foi aquecida para 50°C depois acetona (8 L) foi adicionada rapidamente. A reação foi deixada aquecer para 50° C depois acetona (4 L) foi adicionada a uma taxa moderada mantendo a temperatura de reação acima de 45° C. A reação foi semeada com lab (0,200 g) depois resfriada para temperatura ambiente por 5 horas resultando em uma pasta fluida. A pasta fluida foi agitada durante a noite em temperatura ambiente depois filtrada. A torta úmida foi lavada com acetona (4 L) depois secado em um forno a vácuo a 25° C durante a noite com um sangrador de ar úmido resultando em um pó branco fofo (751 g, 96%).
EXEMPLO 13: PREPARAÇÃO DE Icb ALTERNADA (PRÓ-FÁRMACO DE IVc)
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Figure BRPI0508876B1_D0104
[00521] A um reator de 10 L equipado com um agitador suspenso, termopar, aparelho de destilação e entrada de nitrogênio foi carregado IVc (200,00 g, 422,39 mmols), Cs2CO3 (344,06 g, 1,06 mol), Kl (140,24 g, 844,81 mmols) e NMP (1,00 L, 10,38 mol). A reação foi agitada em temperatura ambiente resultando em uma suspensão heterogênea marrom-clara. Di-terc-butil fosfato de clorometila (273,16 g, 1,06 mol) foi adicionado por meio de funil de adição e a mistura de reação foi aquecida para 30°C durante 16-24 horas com agitação após cujo tempo a reação foi resfriada para 5°C. À reação foi adicionado DCM (1,5 L) depois a reação foi lentamente extinguida com água (3,5 L) mantendo a temperatura de reação abaixo de 20°C resultando em uma mistura bifásica. A camada do fundo rica em produto foi separada, lavada com água (3,5 L x 3), depois transferida de volta ao reator. A solução foi concentrada sob vácuo para um volume de 1 L mantendo a temperatura abaixo de 25°C. IPA foi adicionado (2 L) depois a reação foi concentrada sob vácuo para um volume de 2 L mantendo a temperatura abaixo de 25°C. A reação foi depois semeada com IIc (0,200 g), agitada durante a noite em temperatura ambiente resultando em uma pasta fluida. A pasta fluida foi filtrada e a torta úmida foi lavada com MTBE (1 L), secado em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um pó amarelo/branco (207,1 g, 70%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) δ 8,54 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,42 (s, 5H), 5,95 (d, J = 14,2 Hz, 2H), 4,06 (s, 3H), 3,97-3,36 (m, 8H), 2,50 (s, 3H),
1,27 (s, 18H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) δ 184,64, 170,65, 165,91, 161,60, 150,82, 145,38, 141,89, 134,96, 130,20, 129,59, 128,68,
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 132/244
129/233
127,58, 127,10, 124,77, 122,64, 115,22, 83,90, 83,83, 73,69, 73,63, 56,95, 46,04, 41,66, 29,61, 29,56, 13,90; ES+ MS m/z (intensidade rei.) 696 (MH+,10), 640 (MH+ - isobutileno, 30), 584 (MH+ - 2 isobutileno, 100).
Figure BRPI0508876B1_D0105
Peso ma - £55,70
Figure BRPI0508876B1_D0106
[00522] A um reator de 4 gargalos de 10 L equipado com urn termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio foram adicionados lie (200,24 g, 287,82 mmols), acetona (800,00 ml, 10,88 mol) e água (800,00 ml, 44,41 mol). A reação foi aquecida para 40°C e agitada durante 18-24 horas. A reação foi resfriada para 20° C depois trometamina (33,62 g, 277,54 mmols) foi adicionada. A reação foi aquecida para 40° C depois agitado durante uma hora adicional até que todos os sólidos fossem dissolvidos. A reação foi resfriada para 20°C depois filtrada através de um filtro CUNO de 10 microns em um reator de 4 gargalos de 10 L equipado com um termopar, agitador suspenso e entrada de nitrogênio. Acetona (3 L) foi adicionada rapidamente, seguido semeando com Icb (0,500 g), depois acetona adicional (3 L) foi adicionada. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite resultando em uma pasta fluida depois filtrada. A torta úmida foi lavada com acetona (800 ml) depois secada em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um pó branco fofo (165,91 g, 82%).
INFORMAÇÃO ADICIONAL:
ISOLAMENTO DO INTERMEDIÁRIO DE ÁCIDO LIVRE Ic:
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 133/244
130/233
Figure BRPI0508876B1_D0107
lie
Pese mol - £95,70
Is
Peso mol- 563,40
[00523] Em um reator de 3 gargalos de 250 ml equipado com urn termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio foram adicionados lie (10,0 g, 14,37 mmols), acetona (40,00 ml, 544,15 mmols) e água (40,00 ml, 2,22 mols). A reação foi aquecida para 40°C e agitada durante 14-24 horas. A reação foi resfriada para 20°C depois agitada durante três horas, resultando em uma pasta fluida. A pasta fluida foi filtrada, depois a torta úmida lavada com acetona (40,00 ml) depois secado em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um pó branco fofo (7,00 g, 83%). RMN (400 MHz, DMSO-c/e) δ
8,84 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,45 (s, 5H), 5,81 (d, J= 12,3 Hz, 2H), 4,03 (s, 3H), 3,91-3,19 (m, 8H), 2,39 (s, 3H); 13C RMN (500 MHz, DMSO-ds) δ 185,20, 169,32, 165,85, 160,75, 150,51, 146,30, 143,24, 135,53, 129,74, 129,22, 128,46, 127,34, 127,09, 123,67, 122,73, 113,94,72,90 (d, 2Jc-p = 5 Hz), 57,01, 45,2 (bs), 40,8 (bs), 13,66. ES+ MS m/z (intensidade rei.) 486 (MH+ - H3PO4, 100).
EXEMPLO 14: PREPARAÇÃO ALTERNADA DE Ibb (PRÓ-FÁRMACO DE IVb)
Figure BRPI0508876B1_D0108
[00524] A um reator de 10 L equipado com um agitador suspenso, termopar e entrada de nitrogênio foram carregados IVb (400,00 g,
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 134/244
131/233
894,73 mmols), Cs2CO3 (873,70 g, 2,68 mols), KI (297,70 g, 1,79 mol) e NMP (1,00 L, 10,38 mols). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente resultando em uma suspensão heterogênea marrom-clara. Di-terc-butil fosfato de clorometila (460,50 g, 1,78 mol) foi adicionado por meio de funil de adição e a reação foi aquecida para 30°C durante 16-24 horas em cujo tempo a reação foi resfriada para 5°C. À reação foi adicionado n-BuOAc (2,4 L) depois a reação foi lentamente extinguida com água (4 L) mantendo a temperatura de reação abaixo de 20°C resultando em uma mistura bifásica. A camada aquosa do fundo foi removida do reator, depois a camada do topo rica em produto foi semeada com llc, (0,40 g) depois agitada 3 horas em temperatura ambiente resultando em uma pasta fluida. A pasta fluida foi filtrada depois a torta úmida foi lavada com MTBE (1,6 L) depois secado em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um pó amarelo/branco (483,2 g, 81%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) δ 8,35 (s, 1H),
8,27 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,42, (s, 5H), 5,92, (d, J= 14,9 Hz, 2H), 4,02-3,40 (m, 8H), 1,24 (s, 18H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) δ 182,75, 170,64, 152,07, 144,03, 134,91, 133,96, 131,82, 130,21, 128,68, 128,27, 128,00, 127,07, 125,81, 124,01, 113,82, 84,00, 83,93, 73,97, 46,12, 41,90, 29,57, 29,53; m/z de ES+MS (intensidade rei.) 558 (MH+, 100).
Figure BRPI0508876B1_D0109
Ret» mol - 6S0.64 Peao md-7Ü3.G2
[00525] A um reator de 4 gargalos de 300 ml equipado com um termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio foram adicionados lib (18,0 g, 26,87 mmols), IPA (36,00 ml, 470,92 mols) e água (36,00 ml, 2,0 mols). A reação foi aquecida para 40°C e
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 135/244
132/233 agitada durante 18-24 horas. A reação foi resfriada para 20°C depois lisina (3,73, 25,54 mmols) foi adicionada. A reação foi agitada durante 1 hora até que todos os sólidos fossem dissolvidos. IPA (54 ml) foi adicionado por 30 minutos seguido semeando com Ibb (0,180 g) e agitando durante um adicional de 30 minutos. IPA foi adicionado (18 ml) mais de 1 hora depois a reação que resultou em uma pasta fluida fina foi aquecida para 50°C. A reação foi semeada com Ibb (0,180 g) depois IPA (36 ml) foi adicionado por 2 horas depois agitada durante 12 horas resultando em uma pasta fluida. A reação foi aquecida para 7080°C durante 2 a 3 horas depois resfriada para 50°C. IPA (59 ml) foi adicionado por 1 hora depois IPA adicional (121 ml) foi adicionado por 1 hora. A reação foi resfriada para 20°C por 2 horas depois agitada durante um adicional de 2 horas depois filtrado. A torta úmida foi lavada com IPA (180 ml) depois secado em um forno a vácuo a 50°C durante a noite resultando em um pó branco (15,43 g, 82%).
INFORMAÇÃO ADICIONAL:
PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DO INTERMEDIÁRIO DE ÁCIDO LIVRE Ibc:
Figure BRPI0508876B1_D0110
Jlb
Peso mol - SMiC4
Ace torta' água °C
Figure BRPI0508876B1_D0111
Ibc
Peso moi - 557.43
[00526] Em um frasco de 3 gargalos de 500 ml equipado com um termopar, agitador suspenso, condensador e entrada de nitrogênio foram adicionados llb (50,00 g, 74,76 mmols), Acetona (100,00 ml, 1,36 mol) e água (100,00 ml, 5,55 mols). A reação foi aquecida para 40°C e agitada durante 18-24 horas.
[00527] Em um frasco de 3 gargalos de 250 ml equipado com uma sonda de pH, barra de agitação magnética e entrada de nitrogênio fo
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 136/244
133/233 ram adicionados 150 ml da solução de Ibc acima depois o pH foi ajustado em pH = 6,2 com 10 N de NaOH. A solução foi transferida para um funil separador, depois lavada com EtOAc (100 ml) depois DCM (100 ml), depois transferida de volta para frasco de 3 gargalos de 250 ml. O pH foi ajustado em pH = 1,3 com 2 N de HCl seguido agitando durante três horas, resultando em uma pasta fluida que foi filtrada. A torta úmida foi refluidizada em pasta em MTBE (150 ml), depois filtrado, seguido refluidizando em pasta em THF/água (100:1, 130 ml) durante 45 minutos, depois filtrado e secado em um forno a vácuo a 50° C durante a noite resultando em um pó branco (10,0 g, 33%). RMN (400 MHz, DMSO-ó6) δ 8,69 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,41 (s, 5H), 5,47 (d, J = 13,3 Hz, 2H), 3,99-3,18 (m, 8H); 13C RMN (100 MHz, DMSO-ó6) δ 183,97, 169,23, 165,20, 151,69, 145,91,
135.48, 133,83, 131,59, 129,65, 129,11, 129,03, 128,42, 127,77,
127.49, 127,03, 122,62, 112,08, 72,57. ES+ MS m/z (intensidade rel.) 558 (MH+, 100).
EXEMPLO 15: PREPARAÇÃO DE PRÓ-FÁRMACO le
ETAPA UM
CN
[00528] PREPARAÇÃO DE 2-(1-(2-(4-METÓXI-7-(3-METIL-1 H-
1,2,4-TRIAZOL-1-IL)-1H-PIRROLO[2,3-C]PIRIDIN-3-IL)-2-OXOACETIL)PIPERIDIN-4-ILIDENO)-2-IL)ACETONITRILA (IVe): ácido 2(4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1-il)-1 H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2oxoacético (1,5 g), cloridrato de 2-(piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2il)acetonitrila (1,5g), 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (DEPBT) (2,1g) e Base de Hunig (2 ml) foram combinados em 20 ml
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 137/244
134/233 de DMF. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. DMF foi removido por meio de evaporação a pressão reduzida e o resíduo foi dividido com MeOH (80 ml). O precipitado foi colhido por meio de filtração para fornecer 0,85 g do produto, 2-(1-(2-(4metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 H-pirrolo[2,3-c]pirid in-3-il)-2oxoacetil)piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2-il)acetonitrila (IVe). 1H RMN (500 MHz, DMSO-c/e) δ 12,42 (s, 1H), 9,23 (m, 1H), 8,69 (m, 1H), 8,27 (m, 1H), 7,89 (m, 2H), 7,58 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,99 2,70 (m, 8H), 2,60 (m, 3H). MS m/z: (M+H)+ calc, para C25H23N8O3 483,19, encontrado 483,18.
ETAPA DOIS
Figure BRPI0508876B1_D0112
tenzeno
Figure BRPI0508876B1_D0113
[00529] Éster de fosfato (45,1 g, 0,1 mol) e cloroiodometano (200 g,
1,14 mol) foram combinados em 100 ml de benzene e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas antes de 0 benzeno ter sido removido sob vácuo. Depois, 500 ml de éter etílico foram adicionados ao resíduo e sólido insolúvel foi separado por filtração. Concentração do filtrado forneceu di-terc-butil fosfato de clorometila que foi utilizado na próxima etapa sem qualquer outra purificação. ETAPA TRÊS
Figure BRPI0508876B1_D0114
Figure BRPI0508876B1_D0115
[00530] NaH (0,2 g, 95%) foi adicionado lentamente em uma suspensão de 2-(1 -(2-(4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 HPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 138/244
135/233 pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)-2-oxoacetil)piperidin-4-ilideno)-2-(piridin-2il)acetonitrila (IVe) em THF seco (20 ml) e a mistura foi deixada agitar durante uma hora em temperatura ambiente. Iodo (0,4g) dissolvido em THF seco (2 ml) foi adicionado lentamente na solução de agitação. A mistura foi agitada por 3 horas adicionais antes de 0,2 g de NaH fosse carregado. Seguindo conclusão da adição a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante uns 15 minutos adicionais e depois di-terc-butil fosfato de clorometila, obtido da etapa dois, foi adicionado. Após agitar durante 16 horas, a mistura de reação foi vertida em NH4ÜAc gelado (30%) (50 ml), seguido por extração com EtOAc (3 x 100 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (50 ml) e depois salmoura (50 ml), secados em Na2SO4 e concentrados sob vácuo para fornecer um resíduo que foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (elução com EtOAc/Et3N (100/1)) para dar 330 mg de di-terc-butil fosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2il)metileno)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1H-1,2,4triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metila (IIe). 1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 8,85 (m, 1H), 8,66 (m, 1H), 8,45 (m, 1H), 8,06 (m,1 H), 7,92 (m, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,43 (m, 1H), 6,05 (m, 2H), 4,11 (s, 3H), 4,00 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,95 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,52 (s, 3H), 1,30 (m, 18H). MS m/z: (M+H)+ calc. para C34H42N8O7P 705,29, encontrado 605,30. ETAPA QUATRO
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 139/244
136/233
CN
Figure BRPI0508876B1_D0116
[00531] Di-terc-butil Fosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2il)metileno)piperidin-1 -il)-2-oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4triazol-1-il)-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metila (IIe) foi dissolvido em 8 ml de uma solução misturada de TFA e diclorometano (10% TFA/CH2Cl2) e a mistura foi agitada durante três horas. Todos os solventes foram removidos sob vácuo e o resíduo foi purificado usando um Sistema de HPLC preparativa de Shimadzu automatizado para dar 25 mg de tercbutil hidrogênio fosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin1 -il)-2-oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 Hpirrolo[2,3-c]piridin-1-il)metila de terc-butila (II'e) e 33 mg de diidrogênio de fosfato (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il)metileno)piperidin-1-il)-2oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 H-pirrolo[2,3c]piridin-1-il)metila (Ie).
[00532] Terc-butil hidrogênio fosfato de (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il) metileno) piperidin-1 -il)-2-oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4triazol-1-il)-1H-pirrolo [2,3-c]piridin-1-il)metila (II'e): 1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 8,83 (m, 1H), 8,55 (m, 1H), 8,35 (m, 1H), 7,92 (m, 2H), 7,54 (m, 1H), 7,41 (m, 1H), 5,86 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,96 (m, 1H), 3,72 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,71 (m, 1H), 2,65 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 1,15 (m, 9H). MS m/z: (M+H)+ calc. para C30H34N8O7P 649,23, encontrado 649,22.
[00533] Diidrogênio fosfato (3-(2-(4-(ciano(piridin-2-il) metilePetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 140/244
137/233 no)piperidin-1-il)-2-oxoacetil)-4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)1H-pirrolo[2,3-c] piridin-1-il)metila (Ie): 1H RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 8,88 (m, 1H), 8,65 (m, 1H), 8,50 (m, 1H), 8,06 (m, 1H), 7,90 (m, 1H),
7,49 (m, 2H), 5,82 (m, 2H), 4,04 (s, 3H), 3,96 (m, 1H), 3,88 (m, 1H),
3,72 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,82 (m, 2H), 2,73 (m, 1H),
2,40 (m, 3H); 13C RMN (125 MHz, DMSO-de) δ 185,2, 165,6, 160,6,
159,1, 151,0, 150,4, 149,5, 146,2, 143,1, 137,4, 129,1, 127,2, 124,4,
123,6, 122,6, 117,4, 116,3, 113,9, 110,0, 72,8, 56,9, 48,4, 44,4, 36,4, 34,0, 13,6. MS m/z: (M+H)+ calc. para C26H26N8O7P 593,17, encontrado 593,14.
EXEMPLO 16: PREPARAÇÃO DE PRÓ-FÁRMACO If
Figure BRPI0508876B1_D0117
Figure BRPI0508876B1_D0118
Figure BRPI0508876B1_D0119
OÍ=POH If OH
[00534] A uma mistura de IVf (99,5 mg, 0,21 mmol) em 1-metil-2pirrolidinona (1,0 ml) em t.a. em um frasco tampado foram adicionados KI (144 mg, 0,87 mmol) e Cs2CO3 (416 mg, 1,28 mmol)), e a mistura foi agitada durante cerca de 5 min. reagente de di-tercbutil fosfato de clorometila (218 mg, 0,84 mmol) foi depois adicionado a gotas. A mistura resultante foi depois agitada a 35 a 40°C durante 20 horas. A mistura foi depois diluída com H2O (cerca de 8 ml) e extraída com EtOAc (cerca de 8 ml). O extrato orgânico foi separado e evaporado para dar o di-t-butil fosfato de clorometila; método de HPLC Analítico: Solvente A 10% de MeOH-90% de H2O-0,1% de TFA; Solvente B 90% de
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MeOH-10% de H2O-0,1% de TFA; Começo% de B = 0, Final% de B = 100, Tempo de gradiente = 2 min, Taxa de Fluxo = 5 mL/min, Coluna: Xterra MS C18 S7 3,0x50mm; LC/MS: (ES) m/z (M+H)+ = 694,22. HPLC ta =1,243.
[00535] Uma mistura do Intermediário IIf em H2O/isopropanol (1,0 ml/1,0 ml) em um frasco de fundo redondo tapado foi agitado a 40° C durante 9,5 horas. A mistura foi depois resfriada para t.a., e a solução transferida para um frasco usando uma pipeta. MeCN (1,0 mL) foi adicionado a esta solução, que foi depois adicionado isopropanol lentamente e com agitação intermitente usando uma espátula. O precipitado branco foi depois filtrado, lavado com isopropanol (2 x 1,0 ml) e depois secado sob vácuo alto para dar o pró-fármaco If; 1H RMN (500 MHz): (DMSO-ó6) δ 8,76 (s,1H), 8,71 (s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,09 (d, J = 8, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,89 (d, J = 7, 1H), 7,85 (app t, 1H), 7,59 (app t, 1H), 5,68 (d, J = 13, 2H), 4,00 (b m, 2H), 3,90 (b m, 2H), 3,85 (b m, 2H), 3,65 (b m, 2H); método de HPLC Analítica: Solvente A 10% de MeOH-90% de H2O-0,1% de TFA; Solvente B 90% de MeOH10% de H2O-0,1% de TFA; Começo% de B = 0, Final% de B = 100, Tempo de gradiente = 2 min, Taxa de Fluxo = 5 mL/min, Coluna: Xterra MS C18 S7 3,0x50mm; LC/MS: (ES) m/z (M+H)+ = 582,00, HPLC Tr = 1,797.
[00536] Para ter êxito, a conversão do pró-fármaco em origem deve ser iniciada através de fosfatases alcalinas no homem. Estudos qualitativos in vitro usando o fosfatase alcalina placentária humano e estudos in vivo em ratos mostraram que a conversão do pró-fármaco foi rápida tanto in vitro com enzimas humanas quanto in vivo em ratos. Idealmente, a taxa de conversão será rápida de forma que apenas exposição limitada ao pró-fármaco ocorra e exposição máxima ao agente antiviral de origem ativo resultará. Dados de estudos (abaixo) mostram que em todos os três exemplos de pró-fármaco avaliados em ratos, o
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139/233 pró-fármaco é convertido rapidamente no fármaco de origem ativa e que níveis de plasma de pró-fármaco são muito baixos em comparação com o fármaco de origem em todos pontos de dados. Estes estudos foram feitos em doses em que as doses de fármaco de origem e dose do equivalente de pró-fármaco de fosfato foram baixas e aproximadamente iguais, ~5 mg/kg. Considerando que as vantagens dos pró-fármacos são superar absorção limitada por dissolução, em baixas doses as vantagens dos pró-fármacos nas moléculas de origem menos solúveis para uso clínico em pacientes não serão óbvias.
[00537] Estudos in vivo de baixa dose foram usados para determinar se os pró-fármacos fossem gerar molécula de origem. A solubilidade das moléculas de origem IV é dependente da forma cristalina. Uma forma cristalina é preferida para desenvolvimento do fármaco. Os dados para todas as moléculas de origem podem ser resumidos dizendo que a solubilidade aquosa do material cristalino para todas as moléculas de origem IV é < 50 pg/mL e em alguns casos muito menos. Desse modo, a solubilidade aquosa intrínseca das moléculas de origem é baixa e representa um papel principal causando absorção limitada por dissolução em doses mais altas.
TABELA 1 - PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E FARMACÊUTICAS DE
DIIDROGÊNIO DE FOSFATO N-METILA (OU SAIS) DERIVADOS DE
PIPERAZINA AZAINDOLOXOACÉTICA
Composto Ia (sal de dissódio) Composto Ib (sal de dissódio) Composto Ic (forma de ácido)
Solubilidade (mg/ ml), pH 6,5 >18 >8 1
Conversão In vitro em fosfatase alcalina (nota 1) Conversão completa e rápida para origem sem qualquer formação de intermediário Conversão completa e rápida para origem sem qualquer formação de intermediário Conversão completa e rápida para origem sem qualquer formação de intermediário
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Composto Ia (sal de dissódio) Composto Ib (sal de dissódio) Composto Ic (forma de ácido)
Conversão in vivo em ratosoral (nota 2) Estudo de MAP Geração rápida de origem no plasma Geração rápida de origem no plasma Geração rápida de origem no plasma
Conversão in vivo em ratos-iv (nota 2) Estudo de MAP Geração rápida de origem no plasma Geração rápida de origem no plasma Geração rápida de origem no plasma
[00538] Nota 1: O derivado de pró-fármaco (conc. -0,2 mM) foi incubado com fosfatase alcalina (placenta humana, Sigma, ~1,4 unidade) em tampão de Tris de pH 8 (conc. ~0,03 M, 1 ml), e desaparecimento do pró-fármaco e formação da origem foram monitorados por HPLC e LC/MS. Na maioria dos casos, o pró-fármaco desapareceu completamente, correspondendo com formação da origem dentro de uma hora ou duas, e nenhum outro intermediário foi detectado.
[00539] Nota 2: O pró-fármaco foi administrado em ratos pela via oral (na dose equiv. a 5 mg/kg da origem) ou intravenosa (na dose equiv. a 1 mg/kg da origem). Os níveis de plasma indicam conversão rápida na origem sem quantidade detectável do pró-fármaco (po).
[00540] Nas tabelas abaixo o termo LLQ significa limite inferior de quantificação (isto é, não detectado).
TABELA 2: ESTUDO DE MAP A: SUMÁRIO DE PK APÓS ADMINISTRAÇÃO PO E IV DE PRÓ-FÁRMACO Ia EM RATOS. COMPARAÇÃO AO PO HISTÓRICO DO COMPOSTO IVa EM RATOS
PK(5 mg/kg po) Ia Após doseamento do prófármaco IV Após doseamento do prófármaco Iva Histórico após doseamento de Iva de origem (Estudo A1)
rO çp A-s. 1
sal de dissódio 1
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PK(5 mg/kg po) Ia Após doseamento do prófármaco IV Após doseamento do prófármaco Iva Histórico após doseamento de Iva de origem (Estudo A1)
Dose PO (mpk) 6,3 mpk Equivalente a 5 mpk de IVa 5 mpk
Cmax (μΜ) LLQ 1,4±0,6 4,5±1,5
Tmax(h) LLQ 1,7 2
AUC 0-24h ^M*H) LLQ 5,9±1 14,9±6,2
Cp @ 24h p.o. (nM) LLQ 35,2 (n=1) 9,2(n=1)
Dose IV (mpk) 1,26 mpk Equivalente a 1 mpk de Iva) 1
CL i.v (ml/min/kg) 16±0,95 - 13±4,6
Vss i.v. (L/kg) 0,095±0,001 - 1,4±0,4
T1/2 i.v. (h) 0,14±0,2 2,8±1,5 4±2,6
T1/2 p.o.(h) 3,3±2,2 1,9±0,8
razão de AUC0 total após administração de IV* 0,534
razão de AUC total após administração de PO** 0,39
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TABELA 3: ESTUDO DE MAP B: SUMÁRIO DE PK APÓS ADMINISTRAÇÃO PO E IV DE PRÓ-FÁRMACO Ib EM RATOS. COMPARAÇÃO AO PO HISTÓRICO DO COMPOSTO IVb EM RATOS
PK (5 g/kg po) Ib após doseamento do prófármaco Ivb após doseamento do pró-fármaco IVb Histórico após doseamento de IVb de origem (Estudo B1)
hà Qt . sal de dissódio
Dose PO 7 mpk (mpk) equivalente a 5 mpk de Ivb) 5
Cmax (gM) LLQ 3,9±0,8 9,5±2,8
Tmax (h) LLQ 1,1 4,6
AUC 0-24h LLQ (gM*h) 13,7±2,6 86±33
Cp @ 24h LLQ p.o. (nM) 7,5 (n=1) 161
Dose IV 1,4 (mpk) equivalente a 1 mpk de Iva) 1
CL i.v 46±10 (ml/min/kg) - 1,6±0,2
Vss i.v. (L/kg) 0,97±0,47 - 0,49±0,26
T1/2 i.v. (h) 1,8±1,2 1,5±0,2 5,9±4,9
T1/2 p.o. (h) 2,4±0,5 3,7±0,9
razão de AUC0 total após administração de IV* 0,10
razão de AUC total após administração de PO** 0,14
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TABELA 4: ESTUDO DE MAP C: SUMÁRIO DE PK APÓS ADMINISTRAÇÃO PO E IV DE PRÓ-FÁRMACO Ic EM RATOS. COMPARAÇÃO AO PO HISTÓRICO DO COMPOSTO IVc EM RATOS
PK (5 mg/kg po) Ic após doseamento do prófármaco IVc após doseamento do prófármaco IVc Histórico após doseamento de IVc de origem (Estudo C1)
EM q
Dose PO (mpk) 6,5 mpk equivalente a 5 mpk de Ivc) 5
Cmax (qM) LLQ 10,2±2,1 13,4±3,6
Tmax (h) LLQ 0,8±0,1 4
AUC 0-24h (qM*h) LLQ 56±7,5 110±25
Cp @ 24h p.o. (nM) LLQ 84,3 (n=2) 61
Dose IV (mpk) 1,3 equivalente a 1 mpk de Iva) 1
CL I.v. (ml/min/kg) 77,9±44,3 - 1,3±0,2
Vss i.v. (L/kg) 1,8±2,6 - 0,4±0,09
TI/2 i.v.(h) 1,2±1 3,2±0,2 4,3±1,1
TI/2 p.o.(h) 2,7±1 3,0±0,3
razão de AUC0 total após administração de IV* 0,54
razão de AUC total após administração de PO** 0,43
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Legenda para todas as três tabelas 2, 3 e 4:
* Razão de AUCtot = AUC total de origem após administração de IV do pró-fármaco
AUC total da origem após administração de IV da origem (dados históricos) ** Razão de AUCtot = AUC total de origem após administração de PO de Pró-fármaco AUC total de origem após administração de PO de origem (dados históricos)
[00541] Um estudo de escalação de dose D de um dos prófármacos (Ica) foi realizado em ratos para demonstrar as vantagens significativas dos pró-fármacos sobre a origem para o uso potencial no tratamento de pacientes com HIV-1 após doseamento oral. Os dados de exposição e os parâmetros medidos do estudo de escalação de dose de pró-fármaco foram comparados aos dados similares dos estudos históricos conduzidos com moléculas de origem.
[00542] Figuras 3 e 4 comparam a AUC (a área sob a curva, uma medida de exposição ao fármaco no rato) de IVc de doseamento oral de pró-fármaco Ica (estudo D) à obtida da molécula de origem de doseamento IVc (Estudo E) e um estudo de toxicocinética em rato (TK). Detalhes para a escalação dose de IVc histórica (Estudo E) e o estudo de TK em rato (F) são mostrados nestas figuras.
[00543] Como pode ser visto das figuras 3 e 4, a AUC e Cmax da molécula de origem após administração oral do pró-fármaco (triângulos) é maior que à resultada da administração do fármaco de origem em dois estudos separados. Claramente, os dados mostram que para maximizar os múltiplos de exposição do fármaco no plasma, o prófármaco oferece uma vantagem surpreendente. Considerando que as estruturas químicas desta classe de moléculas são similares, prófármacos da classe são esperados mostrar intensificação na exposição de administração dos pró-fármacos ao invés da origem. Dada a incerteza de melhorar a exposição oral com os pró-fármacos de fosfato e a novidade dos compostos novos, este resultado não foi óbvio e é
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145/233 surpreendente em sua magnitude.
Tabela 5. Estudo de TK em rato; Estudo F; Estudo Histórico de IVc de
PO em Ratos em Três Doses
Composto IVc (Dados Históricos)
Dose (mg/kg) 15 (sol) 75 (susp) 200 (susp)
Veículo 80/10/10 PEG-400/Etanol/0,1 NaOH
Cmax média (MM) 42 65 76
AUC média-24 h (pM*h) 418 792 1077
Razão de dose 1 : 5 :1 3
Razão de Cmax 1 : 1,5 : 1,8
Razão de AUC 1 : 1,9 : 2,6
PROTOCOLO DE ESTUDO DE PK EM RATO IV E ORAL DOS ESTUDOS DE PRÓ-FÁRMACOS DE FOSFATO A, B E C
[00544] Compostos Ic (pró-fármaco de fosfato de IVc), Ib (prófármaco de fosfato de IVb) e Ia (pró-fármaco de fosfato de Na) foram administrados separadamente em grupos de três ratos de SpragueDawley através de bolo IV (1 mg/kg; todas as doses listadas neste documento foram equivalente de composto de origem) ou gavagem oral (5 mg/kg). Os ratos foram jejuados para estudos de doseamento oral durante a noite. Composto Ic foi administrado como um ácido livre, enquanto que os outros dois foram como sais de sódio. As soluções de doseamento de todos os três pró-fármacos para administração IV e oral foram preparadas em 100% de solução salina normal a 1 mg/ml (concentrações de solução de doseamento foram equivalente de composto de origem). As amostras de plasma foram colhidas em tubos de vácuo de EDTA por 24 h, e analisadas por LC/MS/MS para os prófármacos e moléculas de origem. Análise farmacocinética foi executada em Kinetica®.
[00545] Procedimentos para análise de LC/MS/MS são mostrados
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146/233 nos protocolos abaixo.
[00546] Os resultados deste estudo são mostrados nas Tabelas 24, duas colunas do meio.
PROTOCOLO DE ESTUDO DE ESCALAÇÃO DOSE ORAL DE Ica EM RATOS (ESTUDO D)
[00547] Grupos de três ratos de Sprague-Dawley jejuados foram administrados oralmente com composto de Ica (sal de dissódio) em
4,5, 21 e 163 mg/kg (doses foram equivalentes a IVc). As soluções de doseamento foram preparadas em água a 1, 5 e 20 mg (equivalente de composto Ic (ácido livre))/mL para as doses de 4,5, 21 e 163 mg (equivalente de composto IVc)/kg, respectivamente. As amostras de plasma foram colhidas em tubos de vácuo de EDTA por 24 h, e analisadas por LC/MS/MS para Ic e IVc. Análise farmacocinética foi executada em Kinetica®.
[00548] Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 46 e figuras 3-5.
TABELA 46. ESTUDO DE ESCALAÇÃO DE DOSE ORAL EM RATO
Doseamento de Ica - IVc após prófármaco de fosfato Ica (sal de Na) (todas as doses são equivalentes de IVc) (n = 3) IVc (n=2) Dados históricos
5 (sol) 25 (sol) 200 (sol) 25 (sol) 75 (sol) 200 (sol)
Veículo Água 80/10/10 PEG-400/Etanol/0,1 NaOH
Tamanho de partícula (pm) Sol Sol Sol Sol 27 31
Cmax média (pM) 29 ± 14 98 ± 21 281 ± 55 46 86 42
C-24 h (pM) 0,029 ± 0,008 0,35 ± 0,13 58 ± 36 0,61 5,2 10 (n =1)
AUCtot média (pM*h) 109 ± 15 586 ±53 2925 ±304* 458 1071 518*
Tmax médio (h) 0,50 ± 0,25 1,7 ± 2,0 1,1 ± 0,80 4,0 5,0 4,0
T1/2 média (h) 2,3 ± 0,07 2,5 ± 0,15 13 ± 7,5 3,4 6,8 20
Razão de dose 1 : 5 : 40 1 : 3 : 8
Razão de Cmax média 1 : 3,4 : 9,7 1 : 1,9 : 0,91
Razão de AUC média 1 : 5,4 : 27 1 : 2,6 : 1,1*
1. * A AUC era de 0-24 h uma vez que a AUC (24 h-infinidade) foi pelo
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147/233 menos maior que 35% da AUC total (0-infinidade). Esta porção foi muito grande para ter uma medida precisa da AUC total.
1. A razão de conversão de AUC a 5 mg/kg de IVc de Ica, calculada como a razão de AUC de IVc após doseamento de Ica dividido por AUC de IVc após doseamento direto de IVc, foi 0,99.
3. O pró-fármaco Ica foi apenas detectada a ~20-40 nM em uma a duas amostras em cada rato no grupo de dose de 200 mg/kg.
MÉTODOS IN VIVO
PROCEDIMENTO PARA ESTUDO A1: ADMINISTRAÇÃO DE PO E IV DE IVa EM RATOS; DOSE DE PO FOI 5 mg/kg
[00549] Composto IVa foi administrado em uma solução de polietileno glicol 400 (PEG400)/etanol (EtOH) (90/10, v/v) a menos que observado do contrário. As amostras de plasma e tecido foram colhidas e armazenadas a -20°C até a análise. Ratos de Sprague-Dawley (300 350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA 15683) com cânulas implantadas na veia jugular e/ou duto da bílis foram usados nos estudos farmacocinéticos de composto IVa. Os ratos foram jejuados durante a noite em estudos de PO. Amostras de sangue (0,3 ml) foram colhidas da veia jugular em microtubos contendo EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07147) para obter o plasma. Nos estudos de IV, uma dose de 1 mg/kg foi administrada em 3 ratos por 0,5 min, e amostras de plasma seriais foram colhidas antes do doseamento e 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 e 1440 min após o doseamento. Nos estudos de PO, ratos (n = 3) receberam doses de PO de 5 e 100 mg/kg. As amostras de plasma seriais foram tiradas antes do doseamento e 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 e 1440 min após o doseamento.
[00550] Os resultados orais (PO) deste estudo são mostrados na última coluna mais à direita da Tabela 2.
ESTUDO DE FÁRMACO DE ORIGEM B1
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[00551] Para os estudos farmacocinéticos de IV e PO do COMPOSTO IVb em ratos, o COMPOSTO IVb foi dissolvido em PEG400/etanol (90/10) como uma solução. Para os estudos farmacocinéticos de IV e PO do COMPOSTO IVb em cachorros, o COMPOSTO IVb foi dissolvido em PEG-400/etanol (90/10) com ajuste de pH com 0,1 N de NaOH. Detalhes são fornecidos das formulações na Tabela 6.
[00552] RATO. Ratos de Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA) com cânulas implantadas na veia jugular e/ou no duto de bílis foram usados. Os ratos foram jejuados durante a noite nos estudos farmacocinéticos de PO. Amostras de sangue de 0,3 ml foram colhidas da veia jugular nos microtubos contendo EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), e centrifugadas para separar o plasma.
[00553] No estudo de IV, COMPOSTO IVb foi liberado a 1 mg/kg como um bolo por 0,5 min (n = 3). As amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, e 1440 min após o doseamento.
[00554] No estudo de PO do COMPOSTO IVb, os ratos (n = 3) receberam uma dose oral de 5 mg/kg de COMPOSTO IVb. As amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 e 1440 min após o doseamento.
[00555] Os resultados deste estudo oral (PO) estão mostrados na Tabela 3, coluna mais à direita.
Tabela 6: Formulações de IVb para Estudos in vivo
Estudos de IVb do Composto Forma Veículo 90:10, PEG 400/EtOH Conc. (mg/ml) Tamanho de partícula
PK de Rato (Estudo B1) amorfa adj. para pH 8,6-9,0 3 NA (sol)
MÉTODOS BIOANALÍTICOS PARA ESTUDOS IN VIVO QUE ANALIPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 152/244
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SAM PARA IVb
[00556] Este refere-se ao método para analisar os níveis de concentração de IVb em amostras de plasma de rato (usado para estudos B e B1).
[00557] QUANTIFICAÇÃO DO COMPOSTO IVB POR LC/MS/MS EM PLASMA. Alíquotas de amostras de plasma de estudos de rato, cachorro, macaco ou chimpanzé foram preparadas para análise precipitando proteínas de plasma com dois volumes de acetonitrila contendo o padrão interno, COMPOSTO IVa. Os sobrenadantes resultantes foram separados das proteínas precipitadas através de centrifugação durante 10 minutos e transferidos para frascos de auto-amostragem. Amostras ou foram manualmente preparadas, ou com o uso do manipulador de líquido Tomtec automatizado. Uma alíquota de 5 pL foi injetado para análise.
[00558] O sistema de HPLC consistiu em duas bombas de Shimadzu LC10AD (Columbia, MD), uma auto-amostragem de Shimadzu de SIL-HTC (Columbia, MD) e um compartimento de coluna Hewlett Packard Série 1100 (Palo Alto, CA). A coluna era uma YMC Pro C18 (2,0 x 50 mm, partículas de 3 pm, Waters Co., Milford, MA), mantida a 60°C e uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. A fase móvel consistiu em 10 mM de formiato de amônio e 0,1% de ácido fórmico em água (A) e 100% de 10 mM de formato de amônio e 0,1% de ácido fórmico em metanol (B). A composição de fase móvel inicial foi 95% de A. Após injeção de amostra, a fase móvel foi alterada para 15% de A/85% de B por 2 minutos e mantida naquela composição durante um 1 minuto adicional. A fase móvel foi depois retornada para as condições iniciais e a coluna re-equilibrada durante 1 minuto. Tempo de análise total foi de 4 minutos.
[00559] A HPLC foi interfaceada a em um Micromass Quattro LC. Nitrogênio de pureza ultra alta foi usado como o gás nebulizante e de
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150/233 desolvação em taxas de fluxo de 100 L/h para nebulização e 1100 L/h para dessolvação. A temperatura de desolvação foi 300°C e a temperatura de fonte fio 150°C. Aquisição dos dados utilizou monitoramento de reação selecionada (SRM). Íons que representam as espécies selecionadas de (M+H)+ para IVb e o padrão interno foram selecionados em MS1 e com colisão dissociados com argônio a uma pressão de 2 x 10-3 toneladas para formar íons de produto específico que foram subseqüentemente monitorados por MS2. As transições, voltagens e tempos de retenção estão resumidos na Tabela 7.
TABELA 7: PARÂMETROS PARA ANÁLISE DE MS/MS DE COMPOSTO IVb E COMPOSTO IVa (IS)
COMPOSTO IVb COMPOSTO IVa
transição de SRM mz 448 >105 423 > 205
Voltagem de cone (V) 22 30
Energia de colisão (V) 16 30
Tempo de retenção (minutos) 2,6 2,4
[00560] A curva-padrão de plasma variou de 4 a 8000 ng/ml, a curva de cérebro de 1-1000 ng/ml. As curvas foram fornecidas com uma regressão quadrática ponderada através de concentração recíproca (1/x). Os padrões foram analisados em duplicata. Amostras de controle de qualidade (QC), preparadas em plasma em branco, em três concentrações dentro da faixa da curva de calibração foram também analisadas em triplicata com cada conjunto analítico de plasma. Para este composto, as concentrações prognosticadas de 90% dos QCs de plasma estavam dentro de 20% da concentração nominal, indicando desempenho de ensaio aceitável.
[00561] VEÍCULOS E FORMULAÇÕES. Referindo à Tabela 8, quando o veículo usado contiver NaOH, formulações de solução do composto IVc foram ajustadas em pH usando NaOH para obter um pH de 8,6-9,0, onde o composto é ionizado parcialmente, com base em seu pKa em 8,4.
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TABELA 8: FORMULAÇÕES DE COMPOSTO IVC PARA ESTUDOS
IN VIVO
Estudos do Composto IVc Forma-Lote Estado Veículo Conc. (mg/ml) Tamanho de partícula
PK de rato (Estudo C1) 02-001 02-003 desconhecido 90:10, PEG400/EtOH adj. para pH 8,6-9,0 3 NA
Dose de Escalação de Pré- Tox (Estudo E) 02-004 cristalino 80:10:10 PEG400/EtOH/0,1N NaOH 2.5 7.5 20 NA média = 27,22 pm (95% < 84,4 pm) - Distribuição Multimodal, 3 picos - Média geral = 31,07 pm (95% < 157,7 pm)
Tox em Rato de Pré-ECN (TK de Rato) (Estudo F) 02-005 desconhecido 80:10:10 PEG400/EtOH/0,1N NaOH 3 15 40 NA Distribuição Multi-modal, 2 picos - Média geral = 19,25 pm (95% < 52,3 pm) - Distribuição Multimodal, 2 picos - Média geral = 21,78 pm (95% < 57,5 pm)
[00562] QUANTIFICAÇÃO DO COMPOSTO IVC POR LC/MS/MS EM PLASMA (USADO EM ESTUDOS C, C1 E D). Alíquotas das amostras de plasma de estudos de rato, cachorro, macaco e chimpanzé foram preparadas para análise precipitando proteínas do plasma com dois volumes de acetonitrila contendo o padrão interno, composto IVa. Os sobrenadantes resultantes foram separados das proteínas precipitadas através de centrifugação durante 10 minutos e transferidos para frascos de auto-amostragem. Amostras ou foram manualmente preparadas, ou com o uso do manipulador de líquido Tomtec automatizado. O sistema de HPLC consistiu em duas bombas de Shimadzu LC10AD (Columbia, MD), uma auto-amostragem de SIL-HTC de Shimadzu (Columbia, MD), e um compartimento de coluna Hewlett Packard Série 1100 (Palo Alto, CA). A coluna era uma YMC Pro C18 (2,0 x 50 mm, partículas de 3 μm, Waters Co., Milford, MA), mantida a 60°C e uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. A fase móvel consistiu em 10
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152/233 mM de formiato de amônio e 0,1% de ácido fórmico em água (A) e 100% de 10 mM de formiato de amônio e 0,1% de ácido fórmico em metanol (B). A composição de fase móvel inicial foi 95% A. Após injeção de amostra, a fase móvel foi alterada para 15% de A/85% de B por 2 minutos e mantida naquela composição durante um adicional de 1 minuto. A fase móvel foi depois retornada para condições iniciais e a coluna reequilibrada durante 1 minuto. Tempo de análise total foi de 4 minutos.
[00563] A HPLC foi interfaceada a um Micromass Quattro LC. Nitrogênio de pureza ultra-alta foi usado como o gás nebulizante e de dessolvação em taxas de fluxo de 100 L/h para nebulização e 1100 L/h para dessolvação. A temperatura de desolvação era 300°C e a temperatura de fonte era 150°C. Aquisição de dados utilizou monitoramento de reação selecionada (SRM). Íons que representam as espécies de (M+H)+ para IVc e o padrão interno foram selecionadas em MS1 e em colisão dissociados com argônio a uma pressão de 2 x 10-3 toneladas para formar íons de produto específico que foram subseqüentemente monitorados por MS2. As transições, voltagens e tempos de retenção estão resumidos na Tabela 9.
Tabela 9: Parâmetros para Análise de MS/MS de IVc e IVa (IS)
IVc IVa
Transição de SRM mz 474 > 256 mz 423 > 205
Voltagem de cone (V) 22 30
Energia de colisão (V) 22 30
Tempo de retenção (minutos) 2,5 2,4
[00564] A curva-padrão de plasma variou de 4 a 8000 ng/ml, a curva de cérebro de 1-1000 ng/ml. As curvas foram equipadas com uma regressão quadrática ponderada através de concentração recíproca (1/x). Os padrões foram analisados em duplicata. Amostras de controle de qualidade (QC), preparadas em plasma em branco, em três con
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153/233 centrações dentro da faixa da curva de calibração foram também analisadas em triplicata com cada conjunto analítico de plasma. Para este composto, as concentrações prognosticadas de 90% das QCs do plasma estavam dentro de 20% de concentração nominal, indicando desempenho de ensaio aceitável.
QUANTIFICAÇÃO DE TRÊS PRÓ-FÁRMACOS E SEUS COMPOSTOS DE ORIGEM POR LC/MS/MS EM MATRIZES BIOLÓGICAS [00565] Este ensaio de LC/MS/MS foi desenvolvido para investigar três compostos de pró-fármaco e suas respectivas moléculas de origem em matrizes biológicas. Os três compostos de pró-fármaco eram: Compostos Ia, Ic e Ib e seus outros respectivos sais ou ácidos livres. Nota este ensaio é usado para o ácido livre e forma de sal dos três pró-fármacos como íon molecular detectado é independente do contraíon de sal. Seus respectivos compostos de origem eram: IVa, IVc, e IVb.
[00566] O sistema de HPLC consistiu em bombas de Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) e auto-amostragem de HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligado a uma coluna analítica de Synergi Hydro-RP (2,0 x 50 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Fase móvel A consistiu em 0,1% de ácido fórmico em água; fase móvel B foi 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Taxa de fluxo de LC foi 0,4 mL/min no espectrômetro de massa. A composição de fase móvel inicial foi 10% de B elevada para 75% de B em 1,75 min, mantida naquela composição por 0,25 min, elevada para 100% de B por 0,1 min, mantida por 0,6 min, retornada para condições iniciais no próximo 0,1 minuto e depois reequilibrada. Tempo de análise total foi 4 min. Tempos de retenção para todos os analitos variaram entre 1,5 e 2,6 min.
[00567] O sistema de HPLC foi interfaceado com um espectrômetro de massa de quadrupolo triplo Sciex API3000 (Toronto, Canadá) equipado com a fonte de Turboionspray ajustada em 450°C e voltagem de
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154/233 pulverização de íon ajustada em 4,5 kV. Nitrogênio de UHP foi usado como nebulizador e gases auxiliares com pressões de 5,62 kg/cm2 (80 psi) e 7L/min, respectivamente. A análise foi executada em modo de íon positivo. As transições monitoradas para todos os compostos e suas energias de colisão (CE) foram: m/z 533,41 > 435,24 para Ia (CE=19); m/z 584,46 > 486,29 para Ic (CE=23); m/z 558,31 > 432,13 para Ib (CE=19); 423,39 > 204,96 para IVa (CE=31); 474,36 > 255,97 para IVc (CE=29); 448,35 > 105,20 para IVb (CE=35).
[00568] Para acomodar uma ampla variedade de matrizes de amostras biológicas, precipitação de acetonitrila foi usada na preparação da amostra. Amostras de teste e padrão foram transferidas para uma placa de 96 cavidades usando Packard Multiprobe II (Packard Instruments, Downers Grove, IL). 200 pL de acetonitrila contendo o padrão interno (BMS-647257, 500 nM) foram adicionados a 100 pL de alíquotas de amostras de teste e padrão na placa de 96 cavidades usando o Tomtec Quadra 96. A placa foi depois submetida a vórtice durante cerca de 3 minutos e centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos. Usando o Tomtec Quadra 96, 150 pL de sobrenadante foram transferidos da placa para uma placa de 96 cavidades fundas limpas. 150 pL de 0,2% de ácido fórmico em água foram depois adicionados a cada cavidade usando a Tomtec Quadra 96 e a placa foi submetida a vórtice antes da análise.
[00569] Curvas-padrão em oito pontos de concentração de 5 nM a 10 μΜ foram preparadas de soluções de matéria-prima em acetonitrila e serialmente diluídas em matriz para o pró-fármaco e os compostos de origem. As curvas-padrão foram transferidas em duplicata 100 uL de alíquotas para uma placa de 96 cavidades contendo as amostras de teste, extraídas com as amostras de teste como descrito acima, e injetadas no princípio, meio e fim da seqüência analítica. As curvaspadrão foram providas com uma regressão linear ponderada 1/x2. Da
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155/233 dos e picos cromatográficos foram processados e as concentrações dos padrões e desconhecidos foram quantificadas usando PEBiosystems Analyst® 1.1.
MÉTODOS IN VIVO
[00570] Condições para Estudo C1, E e F (Estudos de PK, MAP e TK em ratos)
[00571] Para os estudos farmacocinéticos de IV e PO do composto IVc em ratos, composto IVc foi dissolvido em PEG-400/etanol (90/10) como uma solução. Por favor referir à Tabela 8.
[00572] RATO. Ratos de Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottdale, PA) com cânulas implantadas na veia jugular e/ou duto da bílis foram usados. Os ratos foram jejuados durante a noite nos estudos farmacocinéticos de PO. Amostras de sangue de 0,3 ml foram colhidas da veia jugular em microtubos contendo EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), e centrifugadas para separar o plasma.
[00573] Em um estudo de IV, Composto IVc foi liberado a 1 mg/kg como um bolo por 0,5 min (n = 3). Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e 2, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, e 1440 min após o doseamento.
ESTUDO DE DOSE SIMPLES DE PO C1
[00574] No estudo de Cl de PO do Composto IVc, os ratos (n = 3) receberam uma dose oral de 5 mg/kg de Composto IVc. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 e 1440 min após o doseamento. Os resultados orais (PO) do Estudo C1 estão na Tabela 4, coluna mais à direita. ESTUDO DE ESCALAÇÃO DE DOSE ORAL (PO) E
[00575] No estudo de escalação de dose oral E de Composto IVc, grupos de ratos (n = 2 por grupo) receberam doses orais de 25, 75 e 200 mg/kg. Em 25 mg/kg, a solução de doseamento estava em solução; em doses mais altas, as soluções de doseamento eram suspen
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156/233 sões. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480 e 1440 min após o doseamento. Amostras de cérebro fora colhidas a 1440 min para avaliar a penetração no cérebro. As amostras de cérebro foram manchadas a seco e os pesos molhados foram registrados. Os resultados orais (PO) do Estudo E estão na Tabela 46.
ESTUDO DE TOXICOLOGIA EM RATO DE DOSE ORAL DE 2 SEMANAS F
[00576] No estudo de rato oral de 2 semanas F (n=seis/sexo/grupo), o composto IVc foi administrado em doses diárias de 15, 75 ou 200 mg/kg. Avaliações toxicocinéticas nos dias 1 e 14 indicaram que exposições sistêmicas (AUC0-24h) do composto IVc estavam em geral relacionadas à dose mas não eram proporcionais à dose (ver Tabela 5), sem evidência de auto-indução ou acumulação. No Dia 14, valores de AUC0-24h foram ligeiramente mais altos em fêmeas (< 644 pg*h/ml) comparados aos machos (< 526,88 pg*h/ml) em dosagens < 200 mg/kg/dia. Os resultados orais (PO) do Estudo F estão na Tabela 5.
ESTUDO DE MAP G: ESTUDO DE DOSEAMENTO PO E IV DE DIÉSTER IIA EM ESTRUTURA DE RATOS DO COMPOSTO IIA
Figure BRPI0508876B1_D0120
Figure BRPI0508876B1_D0121
[00577] O procedimento para a perna de doseamento oral do estudo de MAP A1 foi seguido exceto que diéster IIa foi utilizado no lugar do composto IVa. Análise para o composto IVa mostrou que doseamento do diéster IIa através de via oral produziu o IVa substancial. Os dados estão descritos na Tabela 10 abaixo:
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TABELA 10 PARA ESTUDO DE MAP G
Dados medidos para IVa seguindo doseamento de PO de diéster I Ia (pró-fármaco de di-terc butil éster de IVa)
Dose e Via: PO 5 mg/kg
Cmax p.o. (nM) 1123±270 ('IVa conc)
Tmax p.o. (h) 2,7±1,2 (IVa)
F (%) 33 (do IVa)
AUC p.o. (pM*h) 4,0±1,0 (IVa)
Cp @ 24h p.o. (nm) Não detectado
T1/2 p.o. (h) 1,3±0,26 (IVa)
ESTUDO DE MAP H: ESTUDO DE DOSEAMENTO DE PO E IV DE MONOÉSTER II'A EM ESTRUTURA DE RATOS DO COMPOSTO II'a
O
Figure BRPI0508876B1_D0122
[00578] O procedimento para a perna de doseamento oral do estudo de MAP A1 foi seguido exceto que monoéster II'a foi utilizado no lugar do composto IVa. Análise para composto IVa mostrou que doseamento do monoéster II'a através de via oral produziu o IVa substancial. Os dados são descritos na tabela abaixo:
TABELA 11 PARA ESTUDO DE MAP H
Dados medidos para IVa seguindo doseamento de PO do monoéster II'a (prófármaco de éster de mono-terc butila de IVa)
Dose e Via: PO 5 mg/kg
Cmax p.o. (nM) 1586±615 ('IVa conc)
Tmax p.o. (h) 2,0±1,7 (IVa)
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F (%) 44 (do IVa)
AUC p.o. ^M*h) 5,9±2,2 (IVa)
Cp @ 24h p.o. (nm) 3,61±(n=2/3)
T1/2 p.o. (h) 2,8±1,6 (IVa)
[00579] Um número significativo de estudos foi feito para demonstrar e caracterizar a utilidade surpreendente dos pró-fármacos I. Experimentos de exposição de escalação de dose comparando exposição das moléculas de origem após dosar o pró-fármaco e origem foram realizados em ratos e cachorros para pró-fármacos I das moléculas de origem IVa, IVb e IVc. O efeito de alimento e dose na exposição de IVa após dosar o pró-fármaco Iab ou origem IVa foi comparado em cachorros. O pró-fármaco mostrou habilidade surpreendente para melhorar exposição e evitar efeitos de alimentação quando comparados à origem. Estudos farmacocinéticos totais de baixa dosagem (doseamento oral e de IV) foram realizados em ratos, cachorros e macacos para os pró-fármacos Iab, Ibb e Icb mostrar conversão nos compostos de origem IVa, IVb e IVc respectivamente. Estudos de doseamento oral em ratos foram realizados para pró-fármaco Ie (ácido livre), e para origem IVf do composto para demonstrar conversão e exposição sistêmica das origens IVe e IVf respectivamente. Os dados são mostrados acima ou abaixo neste pedido de patente.
SEÇÃO DE PERFILAÇÃO ADICIONAL 1
ESTUDOS ADICIONAIS COM IAB:
[00580] Iac é o pró-fármaco de fosfato de ácido livre do aduto de Nhidroximetila de IVa e é hidrolisado através de fosfatase alcalina (ALP) para formar IVa. Iab, um sal de monolisina de Iac, foi usado para todos os estudos a seguir.
[00581] Estudos farmacocinéticos de IV e PO foram conduzidos de Iab em ratos, cachorros e macacos. Em todos os casos, amostras de sangue foram colhidas na presença de EDTA. A presença de EDTA,
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159/233 um inibidor de ALP conhecido, minimizou conversão significativa ex vivo de Iab durante o processamento da amostra. IVa foi rapidamente formado seguindo administração de IV de Iab. Biodisponibilidades orais boas (62-94%) de IVa foram observadas após administração de Iab em ratos, cachorros e macacos com muito pequeno ou nenhum Iab presente no plasma. Uma vez que há níveis altos de expressão de ALP no intestino, é provável que seguindo administração oral de Iab, Iab é hidrolisado por ALP presente nas membranas de bordas franjadas do lúmen intestinal para formar IVa, que é rapidamente absorvido devido a sua permeabilidade alta.
[00582] Estudos de incubação in vitro foram conduzidos para uma avaliação qualitativa de hidrólise dependente de ALP de Iab em tecidos diferentes. Iab foi hidrolisado na presença de soro e hepatócitos de rato, cachorro, macaco e ser humano, como também ALP placentária humana. Nas ocasiões onde Iab e IVa foram medidos, a conversão de Iab para IVa estava próxima de estequiométrica. Devido à hidrólise em soro, a ligação de proteína não pôde ser determinada de Iab. Com base nos dados in vitro, é antecipado que Iab será hidrolisado por ALP humana e que IVa será formado após administração oral de Iab em indivíduos humanos.
[00583] A solubilidade cristalina de Iab em temperatura ambiente aumenta de 0,22 mg/ml em pH 1,4 para >12 mg/ml em pH 5,4 e pH 8,9; soluções aquosas contendo >100 mg/ml foram preparadas para estudos de toxicologia in vivo. Em comparação, a solubilidade aquosa do composto de origem, IVa, em temperatura ambiente como material cristalino foi determinada para ser 0,04 - 0,9 mg/ml (faixa de pH de 1,5-10). Iab exibe solução aceitável e estabilidades sólidas.
[00584] A solubilidade aquosa mais alta de Iab fornece um meio para superar a absorção limitada por taxa de dissolução de IVa abaixo de certas doses e assim aumentou as exposições de IVa em estudos
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160/233 de escalação de dose oral e de toxicocinética. lab, quando dosado oralmente a ~200 mg/kg de equivalente de IVa, forneceu AUC 2 vezes mais alta de IVa em ratos e cachorros, sem exposição de plasma significativa para o pró-fármaco, quando comparado a AUC dos estudos de suspensão de IVa histórica em dose similar. Além disso, os valores de AUC e de Cmax de IVa em cachorros em jejum recebendo cápsulas enchidas a seco de Iab (200 mg de equivalente de IVa/cachorro) foram 38 e 58 vezes, respectivamente, aqueles atingidos em cachorros jejuados dados a formulação de cápsula clínica de IVa, e 4 e 6 vezes, respectivamente, aos atingidos em cachorros alimentados dados a formulação de cápsula clínica de IVa.
[00585] Nenhuma diferença significativa em AUC e Cmax de IVa foi observada entre cachorros em jejum e alimentados recebendo Iab, enquanto que uma melhoria de 9 vezes foi observada em cachorros alimentados quando comparados aos cachorros em jejum recebendo IVa. Estes dados sugerem que níveis de sangue eficazes de IVa podem ser alcançados em pacientes infetados com HIV sem o requerimento de uma refeição gordurosa alta. A forma seca de pulverização de IVa deu origem a níveis de exposição similares de IVa como aqueles observados de Iab em cachorros.
ESTUDO DE TOLERABILIDADE TOXICOCINÉTICA DE DOSE SIMPLES EM RATOS DE CD
[00586] Um estudo de oxicocinética oral de 1 dia em ratos foi conduzido usando o pró-fármaco Iab (sal de monolisina). Iab foi administrado em dosagens de 16, 72 e 267 mg/kg (ácido livre) por gavagem oral para três ratos/grupo usando água como o veículo (formulação de solução). As dosagens de ácido livre de pró-fármaco correspondem às dosagens de equivalente molar de IVa (origem) de 13, 57 e 211 mg/kg, respectivamente. O ponto terminal avaliado foi toxicocinética de plasma de Iab e IVa nos ratos individuais.
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[00587] Os valores de toxicocinética médios são fornecidos na Tabela 12.
TABELA 12: VALORES DE TOXICOCINÉTICA MÉDIOS PARA Iab E
IVa EM RATOS MACHOS DADOS < 267 mg/kg DE Iab COMO UMA
DOSE ORAL SIMPLES
Dosagens (mg/kg)
Iab 16 72 267
IVa 13 57 211
Equiv. molar
Iab IVa Iab IVa Iab IVa
Cmax (pM) 0,068 26 0,095 104 0,11 214
C24h (pM) <LLQ1 0,090 <LLQ O,027 <LLQ 1,9
AUC (pM*h) 0,0202 673 0,0492 2613 0,0572 11613
T1/2(h) 0,64 3,2 0,37 2,3 0,045 3,4
Valores representam médias de 1-3 ratos/grupo para dados de Iab e 3 ratos/grupo para dados de IVa.
1 Abaixo do limite inferior de quantificação.
2 AUC de zero a tempo de última amostra quantificável 3 AUC de zero a ».
[00588] Concentração de plasma máxima médio (Cmax) tanto de Iab (pró-fármaco) quanto IVa (origem) foi alcançada dentro de pósdose de 1,1 hora. A área de plasma sob a curva de concentraçãotempo de plasma (AUC) do pró-fármaco foi 5-0,03% que da origem. (Em ratos dados < 267 mg/kg de Iab, a AUC de IVa aumentou proporcionalmente com dosagem de Iab, e Cmax aumentou em um menos que a maneira proporcional à dosagem entre 72 e 267 mg/kg de Iab.
[00589] Uma comparação de AUC de IVa obtida em ratos ou dados IVa (2) ou Iab, são mostrados na figura 6.
[00590] Solubilidade nas formulações pré-clínicas é um problema. A AUC de IVa é equivalente à origem e ao pró-fármaco em dosagens mais baixas (por exemplo, < 50 mg/kg) porque ambos foram formulados como soluções (PEG-400 para a origem e água para o pró
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162/233 fármaco) mas em uma dosagem alta (por exemplo, 200 mg/kg) a origem neutra foi formulada como uma suspensão enquanto que o sal de pró-fármaco foi formulado como uma solução aquosa.
[00591] Um estudo de toxicidade de 2 semanas em rato usando dosagens de 5, 50 ou 500 mg/kg de BID para suportar o IND é contínuo (3). A fase em vida do estudo foi completada, e não havia nenhuma observação de em-vida notável.
ESTUDO DE TOXICOCINÉTICA E DE TOLERABILIDADE DE DOSE SIMPLES EM CACHORROS
[00592] Um estudo de multifases foi conduzido para avaliar a tolerabilidade do pró-fármaco, Iab (sal de monolisina) em dosagens de 24, 90 ou 240 mg/kg (ácido livre, equivalente molar para 19, 71 ou 190 mg/kg de IVa de origem, respectivamente) e a toxicocinética de Iab e IVa (4). Iab foi administrado em dois cachorros/grupo uma vez diariamente ou como uma solução aquosa (24 ou 90 mg/kg) ou cápsulas enchidas a seco (24, 90 [uma vez e duas vezes diariamente] ou 240 mg/kg). Os pontos terminais foram: sinais clínicos, peso do corpo, consumo alimentar e toxicocinética de plasma de Iab e IVa. Em todos os casos, um período de lavagem de 1 semana foi usado entre as doses para todas as fases do estudo.
[00593] Os valores de toxicocinética de plasma da fase inicial do estudo estão mostrados na Tabela 13.
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TABELA 13: VALORES DE TOXICOCINÉTICA PARA IVa EM CADELAS DADOS < 90 MG/KG DE IAB COMO UMA DOSE ORAL SIMPLES
Ibb IVa Equiv. molar Formulação 24 19 Solução Cachorro N°1202 Dosagens (mg/kg) 90 71 Solução Cachorro N° 3201 24 19 Cápsula enchida a seco |
Cachorro N°1201 Cachorro N°1201 Cachorro N°1202
Cmax (pM) 72,3 66,5 124 Cmax (pM) 72,3 66,5
C24h (pM) 0,61 0,33 3,2 C24h (pM) 0,61 0,33
AUC0-oo 465 330 844 AUC0-oo 465 330
(pM*h) (pM*h)
T1/2(h) 3,2 3,1 4,4 T1/2(h) 3,2 3,1
[00594] Iab não foi detectado nas amostras de plasma. Concentração de plasma máxima média (Cmax) de IVa foi alcançada entre 1-2 horas pós-dose. Quando Iab foi dado como uma solução, tanto Cmax quanto AUC aumentaram em menos que maneira proporcional à dosagem entre 24 e 90 mg/kg. Êmese foi observada em cerca de 30 minutos após doseamento em ambos os cachorros dados 90 mg/kg. A Cmax e AUC de IVa foram equivalentes seguindo administração de Iab a 24 mg/kg usando cápsulas enchida a seco ou uma solução aquosa.
[00595] Diferente da êmese, não houve nenhum sinal clínico observado, e não há nenhum efeito no peso do corpo e consumo alimentar.
[00596] Para determinar se êmese poderia ser eliminada/reduzida por administração de Iab como umas cápsulas enchidas a seco, a próxima fase do estudo foi conduzida usando dosagens de 90 ou 240 mg/kg, e 90 mg/kg dados duas vezes 4 h uma da outra (BID). Os valores de toxicocinética estão mostrados na Tabela 14.
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Tabela 14: Valores de Toxicocinética para IVa em cadelas X40 dados < 240 mg/kg de Iab como uma dose oral simples ou com doseamento diário de duas vezes (BID)
Ibb IVa Equiv. molar Formulação 90 71 Solução Cachorro N°1202 Dosagens (mg/kg) 240 190 Solução Cachorro Cachorro 180 (90 BID) 142 (71 BID) Cápsula enchida a seco
Cachorro N°1201 Cachorro N° 3201 Cachorro N° 3202
N° 2201 N° 2202
Cmax 214 152 172 189 311 248
(μΜ)
C24h (μΜ) 4,6 0,89 2,8 6,6 34 50
AUC0-oo 1740 960 1186 1584 33051 2485
(μΜ-h)
T1/2(h) 3,6 2,9 3,7 4,5 6,1 13
1 AUC de zero a 24 h
[00597] Não houve nenhuma diferença em Cmax ou AUC entre cachorros dados 90 ou 240 mg/kg de Iab administrados através de cápsulas enchidas a seco. Êmese foi observada em Cachorros N° 1201, N° 2201 e N° 2202 cerca de 1 hora após doseamento. O vômito foi colhido e ensaiado quanto ao teor de Iab para estimar a quantidade da dose total que foi perdida; a porcentagem de dose total estimada perdida foi < 1% para N° 1201, «90% para N° 2201, para N° 2202. Embora as estimações de dose perdida não pareçam ser quantitativamente consistentes com o dados de AUC de plasma, elas indicam que o artigo de teste pode ser encontrado no vômito dentro de pouco tempo após o doseamento. Iab foi detectado em plasma dos cachorros, 0,005-0,049 μΜ em pós dose de 1 hora e 0,005-0,006 μΜ em pós dose de 2 horas; o pró-fármaco não foi detectável em pontos de tempo posteriores.
[00598] Uma comparação de AUC de IVa obtida em cachorros ou dados ou IVa (5, 6) ou Iab, é mostrada na figura 7.
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VEÍCULOS E FORMULAÇÕES
SUMÁRIO DAS FORMULAÇÕES USADAS PARA ESTUDOS-CHAVE DE PK E DE SEGURANÇA
[00599] Todos estudos de PK in vivo em ratos, cachorros e macacos foram executados usando soluções aquosas para doseamento de PO e IV. Estudos de toxicologia e exposição em cachorros foram executados com soluções aquosas em dosagens de 24 e 90 mg/kg e fármaco em formulações de cápsula em dosagens de 24, 90 e 240 mg/kg de Iab, sal de monolisina.
[00600] No estudo de escalação de dose oral de rato, Iab foi dosado como soluções aquosas em concentrações de 4,5, 20,0 e 73,5 mg/ml (forma de sal de monolisina de pró-fármaco). Uma melhoria significativa em AUC e Cmax de IVa, origem, após doseamento oral de Iab, pró-fármaco, foi observada comparados aos dados históricos de doseamento oral de IVa.
[00601] Fármaco nas formulações de cápsula de Iab em doses de 20 mg/kg de equivalente de IVa foi usada para estudos de efeito de alimento em cachorros. O pró-fármaco foi comparado à formulação de cápsula clínica do composto de origem, IVa, em 20 mg/kg. Quando cápsula clínica de IVa foi dosada, um aumento de 9 vezes na exposição foi visto em cachorros alimentados com uma refeição gordurosa alta comparados aos cachorros jejuados. Em doseamento do prófármaco, Iab, a exposição de IVa foi significativamente mais alta e como esperado, a exposição não foi significativamente diferente entre cachorros jejuados e alimentados.
METABOLISMO E SUMÁRIO DE FARMACOCINÉTICA SUMÁRIO DE DESCOBERTAS E INTERPRETAÇÃO
[00602] Iab é o pró-fármaco de fosfato do aduto de N-hidroximetila de IVa e é hidrolisado através de fosfatase alcalina (ALP) para formar IVa. Após administração de Iab em animais, portanto, as amostras de
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166/233 plasma foram preparadas de sangue colhido na presença de EDTA, um inibidor de ALP conhecido. Conversão de Iab em IVa foi mínima (< 2%) em rato, macaco e sangue humano contendo EDTA, e cerca de 6% em sangue de cachorro contendo EDTA. Nenhuma conversão significativa ex vivo de Iab é esperada durante o armazenamento da amostra (-20°C) e análise de Iab.
[00603] A hidrólise de Iab foi estudada em sistemas de animal e ser humano in vitro. Uma vez que múltiplas isoformas de ALP são amplamente distribuídas em vários tecidos, correlações quantitativas in vitro a in vivo não foram tentadas (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora e Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). Portanto, os estudos foram limitados a uma avaliação qualitativa de hidrólise ALP-dependente em tecidos diferentes. Iab foi hidrolisado na presença de soro e hepatócitos de rato, cachorro, macaco e ser humano, como também em ALP placentária humana. Nas ocasiões onde Iab e IVa foram medidos, a conversão de Iab para IVa foi quase estequiométrica. Devido à hidrólise em soro, a ligação de proteína de Iab não pôde ser determinada.
[00604] Nenhum ou níveis muito baixos de Iab foram detectados em plasma de rato, cachorro e macaco após administração oral de Iab. IVa foi formado seguindo administração de IV de Iab rapidamente em ratos, cachorros e macacos. As razões de conversão de AUC de IV foram 1,5 em ratos, 0,80 em cachorros e 0,70 em macacos, sugerindo conversão boa de Iab para IVa.
[00605] Biodisponibilidades orais boas (62-94%) de IVa foram observadas após administração de Iab em ratos, cachorros e macacos. Mais significativamente, a solubilidade aquosa mais alta de Iab diminuiu a absorção limitada por taxa de dissolução de IVa abaixo de certas doses e assim aumentou as exposições de IVa em estudos de escalação de dose oral e toxicocinética (Tabelas 12-14 e Figs. 6-7). Os níveis
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167/233 de AUC de IVa em cachorros em jejum recebendo cápsulas de Iab foram cerca de 40 vezes os níveis em cachorros jejuados dados cápsulas de forma clínica de IVa. Embora uma diferença de 40 vezes seja provavelmente uma superpredição da situação clínica, com base na experiência de desenvolvimento com IVa, Iab claramente demonstrou o potencial para melhorar a absorção limitada por taxa de dissolução vista com origem IVa.
[00606] Para investigar o efeito do alimento na absorção oral de IVa em cachorros, Iab e IVa foram administrados em cápsulas sob condições de jejum e alimentada. Nenhuma diferença significativa foi observada em AUC e Cmax com Iab, enquanto que uma melhoria de 9 vezes foi observada com IVa ao alimentar. Estes dados sugerem benefícios clínicos potenciais para pacientes infetados com HIV, em quem níveis de sangue eficazes de IVa podem ser alcançados sem o requerimento de uma refeição gordurosa alta.
MÉTODOS
[00607] Os estudos descritos neste relatório usaram o sal de monolisina de Iab, a menos que do contrário declarado. QUANTIFICAÇÃO DE Iab e IVa POR LC/MS/MS
[00608] Um método de LC/MS/MS foi desenvolvido para a análise de Iab e IVa em amostras de plasma dos estudos farmacocinéticos em animais como também em sobrenadante de acetonitrila de estudos de incubação in vitro. Para a análise em plasma, um instrumento de Packard Multiprobe foi usado para transferir 50 pL de cada padrão, QC, e amostra de plasma em uma placa de 96 cavidades limpa para extração de precipitação da proteína. Após a adição de 200 pL de acetonitrila contendo o padrão interno IVc, as amostras foram misturadas sob vórtice e o sobrenadante resultante foi separado das proteínas precipitadas através de centrifugação por 10 min. Para a análise no sobrenadante gerado dos estudos in vitro, um volume igual do sobre
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168/233 nadante e acetonitrila contendo o padrão interno foi misturado. Uma alíquota do sobrenadante acima foi transferida usando um manipulador de líquido Tomtec automatizado em uma segunda placa de 96 cavidades limpa. Um volume igual de água foi adicionado, e a placa foi tampada e mistura sob vórtice.
[00609] O sistema de HPLC consistiu em bombas de Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) e uma auto-amostragem de HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligadas a um coluna analítica de Phenomenex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 g; Torrance, CA). Fase móvel A consistiu em 5 mM de formato de amônio em água; fase móvel B foi 100% de acetonitrila. Taxa de fluxo de LC foi 0,38 mL/min. A composição de fase móvel inicial foi 3% de B, elevada para 60% de B por 1,75 min e mantida por 0,25 min, elevada para 100% de B por 0,1 min e mantida por 0,8 min, retornada para condições iniciais no próximo 0,1 min, e reequilibrada. Tempo de análise total foi 4,0 min. O tempo de retenção para Iab, IVa e IVc foi 1,50, 1,67 e 1,73 min, respectivamente.
[00610] O sistema de HPLC foi interfaceado em um espectrômetro de massa de quadrupolo triplo Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado com a fonte de Turboionspray ajustada em 550°C e a voltagem de pulverização de íon ajustada em 4,5 kV. Nitrogênio de UHP foi usado como nebulizador e gás auxiliar com a pressão de 80 psi (5,62 kg/cm2) e 7 L/min, respectivamente. As energias de colisão para Iab, IVa e IVc foram 21, 29 e 31 volts, respectivamente. Aquisição dos dados utilizou monitoramento de reação selecionado (SRM). Íons que representam o modo de íon positivo (espécies de M+H)+ para Iab, IVa e o padrão interno foram selecionados em MS1 e com colisão dissociados com nitrogênio e otimizados com energias de colisão para formar íons de produto específico subseqüentemente monitorados por MS2. As transições de SRM para Iab, IVa e IVc foram m/z 533-435, 423-205
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169/233 e 474-4256, respectivamente.
[00611] Curvas-padrão variando de 5 nM a 10 pM foram preparadas das soluções de matéria-prima e serialmente diluídas em matriz para lab e IVa. Curvas-padrão foram aliquotadas em duplicata, extraídas com as amostras, e injetadas no princípio, meio e fim da seqüência analítica. As Curvas-padrão foram providas com um regressão linear ponderada através de concentração 1/x2 recíproca. Dados e picos cromatográficos foram processados e as concentrações dos padrões e desconhecidos foram quantificadas usando PEBiosystems Analyst®
1.1.
MÉTODOS IN VITRO (1) ESTABILIDADE DE lab EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCl
[00612] A estabilidade de Iab foi estudada em sangue fresco e soro de rato, cachorro, macaco e humano (n = 2). O sangue foi colhido em tubos de vácuo contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). O soro foi colhido em tubos de vácuo não contendo nenhum anticoagulante. Iab foi incubado a uma concentração de partida de cerca de 10 pM a 60-90 min a 37°C. Amostras seriais foram tiradas nos momentos predeterminados. Alíquotas de amostras de sangue (200 pL) foram primeiro misturadas com 100 pL de água seguido por 400 pL de acetonitrila. As amostras de soro (50 pL) foram adicionadas em microrrecipientes contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido pela adição de 100 pL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Iab e IVa por LC/MS/MS.
[00613] A estabilidade de Iab foi também avaliada, como descrita acima, em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
(2) HIDRÓLISE DE Iab NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00614] ALP Placentária Humana sólida foi obtida de Sigma (PPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 173/244
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3895, St. Louis, MO). Uma solução de 1000 unidades/L foi preparada em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Soluções de 100 e 10 unidades/L foram obtidas por diluição serial. Iab foi incubado nas 10, 100 e 1000 unidades/L de soluções (n = 2) a 37°C por 2 h. A concentração de partida de Iab na incubação foi 10 μΜ. Alíquotas de 100 pL de amostras foram tiradas nos tempos predeterminados e adicionadas em microrrecipientes de K2EDTA seguido pela adição de 200 pL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Iab e IVa por LC/MS/MS. ESTUDOS IN VIVO
[00615] Todas as amostras de sangue (0,3 ml) foram colhidas em microrrecipientes contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e colocadas em gelo fragmentado. Após centrifugação, o plasma foi separado e armazenado a -20°C até análise. O sal de monolisina de Iab (Forma 3, Lote 1) foi usado para os estudos farmacocinéticos. As soluções de doseamento de Iab foram preparadas em qualquer água estéril (para administração de IV em cachorros e macacos) ou água destilada (para cada outra administração de dose).
(1) ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00616] Ratos de Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) com cânulas implantadas na veia jugular foram usados. Os ratos foram jejuados durante a noite nos estudos farmacocinéticos de PO. As amostras de sangue da veia jugular foram colhidas.
[00617] No estudo de IV, Iab foi liberado a 1,4 mg/kg (ácido livre, ou 1,1 mg/kg de equivalente de IVa) como um bolo por 0,5 min (n = 3). A concentração da solução de doseamento foi 1,4 mg/ml, e o volume de doseamento foi 1 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 2, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00618] No estudo de PO, Iab foi administrado a 7,9 mg/kg (ácido
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171/233 livre, ou 6,3 mg/kg de equivalente de IVa) através de gavagem oral (n = 3). A concentração da solução de doseamento foi 4,0 mg/ml, e o volume de doseamento foi 2 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(2) ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00619] Os estudos de IV e PO de Iab foram conduzidos em uma maneira cruzada em três cachorros beagles (11 ± 1,1 kg, Marshall Farms USA Inc., Norths Rose, NY). Houve um período de lavagem de duas semanas entre o estudos de IV e PO.
[00620] No estudo de IV, Iab foi infundido por meio da veia cefálica a 1,2 mg/kg (ácido livre, ou 0,95 mg/kg de equivalente de IVa) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de doseamento foi 2,4 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e a 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00621] No estudo de PO, os cachorros foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Iab foi administrado através de gavagem oral a 6,6 mg/kg (ácido livre, ou 5,2 mg/kg de equivalente de IVa). A concentração da solução de doseamento foi 13,2 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00622] Para estudar o efeito de alimento na absorção oral de IVa após administração de Iab e IVa, estes dois compostos foram administrados em cápsulas como sólido a um grupo de três cachorros em uma maneira cruzada durante a noite sob condições de jejum e alimentado. Houve um período de lavagem de um semana entre cada estudo. Iab foi administrado a 200 mg por cachorro (ca 20 mg/kg) de equivalente
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172/233 de IVa; IVa foi administrado em uma formulação de cápsula clínica a 200 mg por cachorro (ca 20 mg/kg). Nos estudos onde os cachorros foram alimentados, a refeição a seguir foi preparada: 2 fatias de toucinho, 2 ovos, 2 pedaços de torrada com manteiga e geléia, 4 oz. (113,39 g) de batata ralada frita e 8 oz. (226,79 g) de leite integral. Após homogeneização usando um misturador de laboratório, a refeição foi dividida igualmente em cinco porções e mantida congelada. Antes do estudo, as refeições foram descongeladas e cada cachorro foi alimentado com uma porção.
[00623] Estudos de formulação adicional de IVa foram conduzidos em cachorros jejuados (n = 2 por grupo de dose). Os cachorros ou foram administrados com a forma clínica ou a forma seca pulverizada de IVa em cápsulas. A forma de cápsula clínica de IVa foi administrada a uma dose simples de 20 mg/kg. A forma secada por pulverização de IVa foi administrada a 20, 75 e 200 mg/kg.
(3) ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00624] Os estudos de IV e PO de Iab foram conduzidos em uma maneira cruzada em três macacos cinomólogos (11 ± 1,2 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Houve um período de lavagem de duas semanas entre os estudos de IV e PO.
[00625] No estudo de IV, Iab foi infundido por meio da veia femoral a 1,3 mg/kg (ácido livre, ou 1,1 mg/kg de equivalente de IVa) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de doseamento foi 2,6 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00626] No estudo de PO, os macacos foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Iab foi administrado através de gavagem oral a 7,1 mg/kg (ácido livre, ou 5,6 mg/kg de equivalente de IVa). A
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173/233 concentração da solução de doseamento foi 14,2 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(4) ANÁLISE DOS DADOS
[00627] Todos os resultados são expressos como ± SD médio, a menos que do contrário especificado.
[00628] Os parâmetros farmacocinéticos de Iab e IVa foram calculados por Análise Não-Compartimental usando o programa de software de KMETICA® (versão 4.0.2, InnaPhase Co., Filadélfia, PA). Os valores de Cmax e Tmax foram registrados diretamente das observações experimentais. Os valores de AUCO-n e AUCtot foram calculados usando as adições trapezoidais log-lineares misturadas. A liberação de corpo total (Cl), tempo de permanência médio (MRT) e o volume de estado constante de distribuição (Vss) foram também calculados após administração intravenosa. A biodisponibilidade oral absoluta (expressa como%) foi estimada tirando a razão dos valores de AUC normalizada em dose após doses orais para aqueles após as doses intravenosas.
[00629] A liberação hepática CIh foi calculada da equação a seguir usando o modelo bem agitado:
Oh X Cl. jm_ tn mo
CIh (mUmin/kg) = --------------Qtl + Cl.jnt.jnWVD onde Qh é o fluxo sangüíneo do fígado de 55, 31, 44 e 21 mL/min/kg para o rato, cachorro, macaco e humano, respectivamente (Davis e Morris, 1993).
[00630] A ração de extração hepática (ER) foi calculada como segue:
ER = CIH/Qh
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[00631] O t-teste de Student foi usado para análise estatística (Microsoft® Excel, Redmond, WA). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas no nível de P < 0,05.
ESTUDOS IN VITRO
ESTABILIDADE DE Iab EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCl
[00632] Como parte da validação do ensaio analítico, a estabilidade de Iab foi estudada em sangue contendo EDTA que é conhecido ser um inibidor de fosfatases alcalinas (Bowers, Jr. e McComb, 1966; Yora e Sakagishi, 1986). Após incubação a 37°C por 60 min, houve 1,2% de conversão da concentração inicial de Iab para IVa no sangue de rato (Tabela 15), e menos de 1% de conversão no sangue de macaco e humano (Tabelas 15 e 16). Houve aproximadamente 6% de conversão no sangue de cachorro, e as porcentagens de conversão foram similares entre os dois cachorros diferentes, como também no mesmo cachorro em duas ocasiões de teste diferentes (Tabelas 15 e 16). Sob a condição de armazenamento de amostra de -20°C, as porcentagens pequenas acima de conversão observadas a 37°C não são esperadas introduzir qualquer conversão significativa ex vivo durante a análise de Iab.
[00633] Iab foi estável no tampão de Tris-HCl a 37°C durante o período de estudo de 60 min (Tabela 17).
TABELA 15: ESTABILIDADE DE IAB NO SANGUE DE EDTA FRESCO DE RATO, CACHORRO E MACACO
Tempo sangue de rato (n = 2) Sangue de cachorro A (n = 2) Sangue de macaco (n = 2)
(min) Iab(pM) IVa formado (pM) IVa formado * Iab(pM) IVa formado (pM) IVa formado * Iab(pM) IVa formado (pM) IVa formado *
0 8,0 0,019 0,24 12 0,036 0,30 8,5 0,011 0,13
20 8,8 0,056 0,70 12 0,29 2,4 9,2 0,024 0,28
40 10 0,072 0,90 11 0,49 4,1 9,2 0,041 0,48
60 10 0,093 1,2 11 0,74 6,2 8,7 0,048 0,56
* Porcentagem formada como a concentração de partida de Iab.
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TABELA 16: ESTABILIDADE DE Iab NO SANGUE DE EDTA FRESCO DE CACHORRO (REPETIDO) E HUMANO
Tempo sangue de rato (n = 2) Sangue de cachorro B (n = 2) Sangue de huimano (n = 2)
(min) Iab(gM) IVa formado(gM) IVa formado * Iab(gM) IVa formado(gM) IVa formado * Iab(gM) IVa formado(gM) IVa formado *
0 110 0,069 0,63 12 0,084 0,68 11 0,061 0,55
15 11 0,25 2,3 11 0,25 2,0 11 0,067 0,59
30 11 0,37 3,4 11 0,43 3,5 7,1 0,057 0,50
45 11 0,53 4,8 13 0,56 4,5 9,8 0,073 0,65
60 10 0,67 6,1 14 0,72 5,8 9,8 0,084 0,75
* Porcentagem formada como a concentração de partida de Iab. TABELA 17: ESTABILIDADE DE Iab EM TAMPÃO DE TRIS-HCl
Tempo Tris-HCl(n=2)
(min) Iab (gM) IVa Formado(gM) % de IVa formado*
0 10 0,011 0,11
20 10 0,008 0,081
40 7,6 0,008 0,076
60 10 0,009 0,088
* porcentagem formada como a concentração de partida de Iab.
[00634] Para investigar a hidrólise de Iab na circulação sistêmica, Iab foi incubado em soro fresco (rato, cachorro, macaco e humano) a 37°C por 90 min. A taxa de hidrólise foi mais rápida no soro de rato, seguido por soros de cachorro, macaco e humano (Tabela 18). A conversão de Iab para IVa foi quase estequiométrica.
[00635] Soro contém atividades de ALP inferiores quando comparado aos tecidos (McComb et al., 1979a). Além disso, soro também contém isoformas de ALP de fontes de tecido como osso, fígado e intestino que são atribuídos ao vazamento através dos vasos sangüíneos (Moss, 1983). Portanto, a hidrólise de Iab em soro foi provavelmente mediada por isoformas múltiplas de ALP.
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TABELA 18: ESTABILIDADE DE Iab NO SORO FRESCO DE RATO,
CACHORRO, MACACO E HUMANO
Tempo (min) Soro de rato (n = 2) Soro de cachorro (n = 2) Soro de macaco (n=2) Soro humano (n=2)
Iab(pM) IVa formado (pM) Iab(pM) IVa formado (pM) Iab(pM) IVa formado (pM) Iab(pM) IVa formado (pM)
0 6,8 0,25 9,2 0,066 9,0 0,20 9,5 0,10
15 5,8 1,1 9,0 0,85 7,3 0,48 9,2 0,10
30 5,4 1,8 7,8 1,6 6,8 0,75 9,0 0,15
45 4,9 2,8 7,8 2,5 6,5 1,2 9,6 0,20
60 4,3 3,7 7,1 3,2 6,3 1,5 9,1 0,24
90 3,3 5,4 6,7 4,4 6,3 2,0 9,4 0,32
T1/2(min)* 80 182** 365** >2000
* Calcu ado como o desaparecimento de Iab. ** As meia-vidas são maiores que o período de incubação.
HIDRÓLISE DE Iab NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00636] Para estudar a hidrólise de Iab em uma forma purificada de ALP humana, Iab foi incubado em soluções de ALP placentária humana a 10, 100 e 1000 unidades/L a 37°C por 2 h. A t1/2 de desaparecimento de Iab foi determinada e relatada na Tabela 19. Como esperado, a taxa de hidrólise foi mais rápida nas soluções com atividades de ALP mais altas. IVa foi também formado conseqüentemente (Fig. 8). Isto indica que Iab é hidrolisado pela ALP derivada de humanos para formar IVa.
TABELA 19: HIDRÓLISE DE Iab EM SOLUÇÕES DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
atividade de ALP (Unidades/L) (n = 2)
10 100 1000
T1/2 (min) 186 14 1,4
Nota: Iab foi incubado a uma concentração de partida de ~10 pM a 37°C por 120 min.
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ESTUDOS IN VIVO
ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00637] Os parâmetros farmacocinéticos de Iab e IVa em ratos após administração IV e oral de Iab estão resumidos na Tabela 20. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na figura 9. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVa em ratos estão também mostrados.
[00638] A liberação de corpo total (Cl) de Iab seguindo administração de IV foi 14 mL/min/kg, sugerindo que Iab é um composto de liberação baixa em ratos. A meia-vida de eliminação (t1/2) e tempo de permanência médio (MRT) após administração de IV foi 0,16 h e 0,14 h, respectivamente. Iab não foi detectado além de 2 h. O volume de distribuição de Iab em estado constante (Vss) foi 0,12 L/kg, sugerindo distribuição de tecido muito limitada. A formação de IVa de Iab após administração de IV foi rápida; IVa foi detectado ao primeiro ponto de tempo de amostragem de 2 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVa formado de Iab vs. do estudo de IVa histórico foi 1,5 (valor teórico para conversão completa = 1), sugerindo conversão completa de Iab a IVa.
[00639] Com a exceção de uma amostra (5 nM; Tabela 20), Iab não foi detectado em qualquer amostra após administração oral. A Tmax de IVa após administração oral de Iab foi 0,83 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVa de 2,0 h indicando absorção mais rápida de IVa seguindo a administração oral do pró-fármaco. A absorção mais rápida de IVa do pró-fármaco é provavelmente o resultado de solubilidade aquosa melhor de Iab como também hidrólise rápida de Iab para formar IVa no intestino. Embora a biodisponibilidade oral absoluta de IVa de Iab fosse 62%, inferior que os dados de IVa históricos, a exposição de IVa do estudo de escalação de dose oral de Iab de rato foi superior quando comparado para os dados históricos com IVa (Tabela
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178/233 e Fig. 8).
[00640] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVa formado de Iab são similares aos perfis de IVa históricos.
TABELA 20: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICO DE Iab E IVa SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO IV E ORAL DE Iab EM RATOS (±SD MÉDIO, N = 3)
Parâmetro de PK Iab IVa Formado após doseamento com Iab IVa histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,4 ácido livre ou 1,1 de equivalente de IVa 1
AUCtot(pM.H) 3,3±1,0 5,4±0,93 3,3±1,1
CLtot(mL/min/kg) 14±4,2 NA 13±4,0
T1/2 (h) 0,16±0,052 4,4±1,9 2,4±0,32
MRT (h) 0,14±0,020 NA 2,2±1,5
Vdss (L/kg) 0,12±0,019 NA 1,5±0,25
Razão de AUC de Iv NA 15* NA
PO
Dose (mg/kg) 7,9 ácido livre ou 6,3 de equivalente de IVa 5
Tmax (h) ND 0,83±0,29 2,0
Cmac (pM) ND** 3,9±0,98 4,5±1,5
C-24 h (pM) ND ND 9(n=1)
AUCtot(pM.H) ND 13±1,4 15±6,3
T1/2 (h) ND 1,5±0,24 1,7±0,92
Biodisponibilidade (%) ND 62*** 90
Razão de AUC de PO de IVa NA 0,69* NA
NA - não aplicável; ND - não detectado (< 5 nM).
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179/233 '043 AUC apóe doBeamen1a(t pió-farnuoD ‘ As raztetfaram calculadas (fe -------------------------------------------- para IV e PO, reapearvamente.
'043 AUC após '043 dossamenlu ** lab foi detectado em um rato apenas em 15 min (5 nM) *** Calculado de dados de IV históricos de IVa.
31. ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00641] Os parâmetros farmacocinéticos de lab e IVa em cachorros após administração IV e oral de lab estão resumidos na Tabela 21. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na figura 10. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVa em cachorros estão também mostrados.
[00642] A Cl de lab após administração de IV foi 70 mL/min/kg que é significativamente mais alta que o fluxo sangüíneo de fígado de 31 mL/min/kg em cachorros sugestivos de envolvimento potencial de hidrólise extra-hepática e/ou outra(s) via(s) de eliminação (por exemplo, excreção renal). A ti/2 e MRT após administração de IV foram 0,15 h e 0,07 h, respectivamente, lab não foi detectado além de 45 min. O Vss de lab foi 0,30 L/kg, sugerindo baixo potencial para distribuição de tecido. A formação de IVa de lab após administração de IV foi rápida; IVa foi detectado no primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVa formado de lab vs. do estudo de IVa histórico foi 0,80, sugerindo conversão boa de lab para IVa.
[00643] lab foi detectado a 5 nM (LLQ) apenas a 15 min e 30 min em um cachorro após administração oral. A Tmax de IVa após administração oral de lab foi 0,25 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVa de 2,9 h indicando absorção mais rápida de IVa seguindo a administração oral do pró-fármaco. A biodisponibilidade oral absoluta de IVa de lab foi 94%, mais alta que os dados de IVa históricos de 57%. Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVa formado de lab são similares aos perfis de IVa históricos.
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Tabela 21: Parâmetros farmacocinéticos de Iab e IVa Seguindo Administração IV e Oral de Iab em Cachorros (±SD Médio, n = 3)
Parâmetro de PK Iab IVa Formado após doseamento com Iab IVa histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,2 ácido livre ou 0,95 de equivalente de IVa 1
AUCtot(pM.H) 0,56±0,12 13±2,2 17±3,5
CLtot(mL/min/kg) 70±16 NA 2,4±0,43
T1/2 (h) 0,15±0,010 5,2±1,0 2,6±1,2
MRT (h) 0,07±0,006 NA 3,3±0,71
Vdss (L/kg) 0,30±0,094 NA 0,45±0,083
Razão de AUC de IV de IVa NA 0,80 NA
PO
Dose (mg/kg) 6,6 ácido livre ou 5,2 de equivalente de IVa 5
Tmax (h) ND 0,25 29±1,9
Cmax (pM) ND* 14±1,3 6,5±1,2
C-24 h (pM) ND 0,26±0,12 0,15±0,093
AUCtot(pM.H) ND 83±16 47±7,2
T1/2 (h) ND 4,1±0,52 3,8±0,81
Biodisponibilidade (%) ND 94 57±17
Razão de AUC de PO de IVa NA 0,7 NA
* Iab foi detectado a 5 nM (LLQ) apenas a 15 min e 30 min em um cachorro.
[00644] Para estudar o efeito de alimento na absorção oral de IVa após administração de Iab e IVa, os cachorros foram administrados com Iab ou IVa em cápsulas sob condições de jejum ou alimentados. O estudo foi conduzido em uma maneira cruzada, com um período de lavagem de uma semana entre cada estudo. Nenhuma diferença significativa foi observada no AUC e Cmax entre as condições de jejum e alimentados após administração de Iab (Tabela 22), enquanto que uma melhoria de 9 vezes em AUC e Cmax foi observada após administração de IVa com alimentação (Tabela 23). Em geral, o efeito de alimentação foi mais pronunciado em cachorros (Tabela 23) que em indivíduos humanos (Tabela 24) recebendo IVa. Isto é sugestivo das diferenças de espécies quantitativas no efeito de alimento na absorção
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181/233 oral de IVa.
[00645] A absorção oral de IVa foi mostrada ser limitada por taxa de dissolução nos seres humanos e espécies animais. A melhoria da exposição de IVa em seres humanos ao alimentar com uma refeição gordurosa alta foi presumivelmente devido à secreção aumentada de sais de bílis que facilitaram a dissolução de IVa. Em cachorros, a carência do efeito de alimento na absorção oral de IVa após administração de Iab sugere benefícios potenciais em seres humanos, para quem pode não ser requerida modificação de dieta.
TABELA 22: EFEITO DE ALIMENTO NA EXPOSIÇÃO ORAL DE IVa EM CACHORROS SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE Iab EM CÁPSULAS ENCHIDAS A SECO (20 mg/kg DE EQUIVALENTE DE IVa) (±SD Médio, n = 3)
Parâmetros Em Jejum Alimentados
AUCtot(pM.H) 414±70 422±57
Cmax (pM) 70±12 130±102
Tmax (h) 2,0 1,5±0,87
T1/2 (h) 4,2±0,42 3,2±1,0
Nota: Iab foi detectado a < 200 nM em algumas amostras nos pontos de tempo precoces.
TABELA 23: EFEITO DE ALIMENTO NA EXPOSIÇÃO ORAL DE IVa EM CACHORROS SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IVa EM CÁPSULAS DE FORMA CLÍNICA (20 mg/kg) ((±SD Médio, n = 3)
Parâmetros Em Jejum Alimentados Razão de Alimentados/Em jejum
AUCtot(pM.H) 11 ±1,4 96±10* 9,0±2,2
Cmax (pM) 1,2±0,22 11 ±0,99* 9,1±0,92
Tmax (h) 3,3±1,2 4,0
T1/2 (h) 5,3±2,7 8,0±3,1
* Significativamente diferente dos valores sob condição de jejum.
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TABELA 24: EFEITO DE ALIMENTO NA EXPOSIÇÃO ORAL DE IVa
NO PRIMEIRO ESTUDO EM HUMANO (±SD Médio, n = 6)
800 mg 1800 mg
Em jejum Alimentados Razão de em Jejum/Alimentados Em jejum Alimentados Razão de em Jejum/Alimentados
AUCtot(gM.H) 22±12 53±10 2,4 19±5,8 82±16 4,3
Cmax (gM) 3,7±1,1 9,8±1,3 2,6 3,3±0,84 15±5,0 4,5
[00646] Estudos de formulação de cápsula adicionais foram conduzidos nos mesmos cachorros em jejum com a forma clínica e secada por pulverização de IVa para comparar com Iab. Como mostrado na Tabela 25, a 20 mg/kg de IVa foi observada exposição equivalente, similar de IVa seguindo administração de Iab e a forma secada por pulverização de IVa. Porém, Iab forneceu exposição significativamente mais alta de IVa quando comparado à forma clínica de IVa. O AUC e Cmax de IVa do pró-fármaco foram 37 vezes e 45 vezes mais altos, respectivamente, que os valores da forma clínica de IVa. O aumento de vezes em cachorros é provavelmente uma super-predição da situação clínica com base na experiência com IVa em desenvolvimento (dados não mostrados).
[00647] No estudo de escalação de dose da forma secada por pulverização de IVa em cachorros, os aumentos de AUC e Cmax de 20 mg/kg para 75 mg/kg foram menos que proporcionais ao aumento de dose (Tabela 26).
[00648] Não foi observado nenhum outro aumento significativo em exposição de 75 mg/kg a 200 mg/kg.
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TABELA 25: EXPOSIÇÃO ORAL DE IVa EM CACHORROS APÓS ADMINISTRAÇÃO ORAL DE Iab E FORMULAÇÕES DIFERENTES DE IVa EM CÁPSULAS (ESTUDOS CRUZADOS)
Parâmetros Cachorro n° 4201 Cachorro n° 4202 Cachorro n° 4201 Cachorro n° 4202 Cachorro n° 4201 Cachorro n° 4202
Formulação Iab Iab IVa secado por pulverização IVa secado por pulverização forma clínica de ‘IVa forma clínica de ‘IVa
Dose (mg/kg; 'IV a eq.) 19 19 20 20 20 20
AUCtot (gM*hr) 486 514 303* 338 11 16
Cmax ^M) 80 86 46 81 1,3 2,4
Tmax (hr) 1,0 1,0 2,0 1,0 1,0 4,0
t1/2 (hr) 4,2 3,4 57 4,2 7,1 4,5
* AUC era 0-24 h.
TABELA 26: EXPOSIÇÃO ORAL DE IVa EM CACHORROS APÓS ADMINISTRAÇÃO ORAL DA FORMA SECADA POR PULVERIZAÇÃO DE IVa EM CÁPSULAS
Parâmetros Cachorro n°4201* Cachorro n° 4202* Cachorro n° 1201 Cachorro n° 1202 Cachorro n° 2201 Cachorro n° 2202
Dose (mg/kg) 20 20 75 75 200 200
AUCtot (gM*hr) 303** 338 759 923 935** 1209
Cmax ^M) 46 81 156 192 178 210
Tmax (hr) 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0
t1/2 (hr) 57 4,2' 2,1 1,9 3,0 2,3
Razão de dose 1 : 3,8 : 10
Razão de AUC Média 1 : 2,6 : 3,4
Razão de Cmax Média 1 : 2,7 : 3,0
** Como na Tabela 25.
** AUC era 0-24 h.
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ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00649] Os parâmetros farmacocinéticos de Iab e IVa em macacos após administração IV e oral de Iab estão resumidos na Tabela 27. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 11. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVa em macacos estão também mostrados.
[00650] A Cl de Iab após administração de IV foi 4,4 mL/min/kg, sugerindo que Iab é um composto de liberação baixa em macacos. A t1/2 e MRT após administração de IV foram 1,0 h e 0,18 h, respectivamente. O MRT refletiu uma estimativa mais realística da duração de Iab no plasma uma vez que as concentrações de plasma de Iab na fase terminal foram baixas (Fig. 11). Iab não foi detectado além de 6 h. O Vss de Iab foi 0,048 L/kg, sugerindo distribuição de tecido muito limitada. A formação de IVa de Iab após administração de IV foi rápida; o IVa foi detectado ao primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVa formado de Iab vs. do estudo de IVa histórico foi 0,70, sugerindo conversão boa de Iab para IVa.
[00651] Iab foi detectado a uma concentração de 18 nM em 15 min em apenas um macaco após administração oral. A Tmax de IVa após administração oral de Iab foi 0,83 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVa de 2,7 h indicando absorção mais rápida de IVa seguindo a administração oral do pró medicamento. A biodisponibilidade oral absoluta de IVa de Iab foi 66%, similar aos dados de IVa históricos de 60%.
[00652] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVa formado de Iab são similares aos perfis de IVa históricos.
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Tabela 27: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Iab E IVa SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO DE IV E ORAL DE Iab EM MACACOS (±
SD Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Iab IVa Formado após Doseamento com Iab IVa Histórico
IV
Dose ()mg/kg) 1,3 ácido livre ou 1,1 de eqv. de IVa 1
AUCtot (pM-hr) 6,5 ± 0,38 7,1 ± 1,0 9,2 ± 0,53
CLtot(mL/min/kg) 4,4 ± 0,18 NA 4,3 ± 0,26
t1/2 (hr) 1,0 ± 0,78 4,8 ± 1,9 4,7 ± 0,31
MRT (hr) 0,18 ± 0,059 NA 2,4 ± 0,15
Vdss (L/kg) 0,048 ± 0,017 NA 0,63 ± 0,39
Razão de AUC de IV NA 0,70 NA
IVa
PO
Dose ()mg/kg) 7,1 ácido livre ou 5,6 de eqv. de IVa 5
Tmax (hr) ND 0,83 ± 0,14 2,7 ± 1,2
Cmax (pM) ND* 16 ± 6,4 5,8 ± 1,2
C-24 hr (pM) ND 0,067 ± 0,039 0,074 ± 0,032
AUCtot (pM-hr) ND 34 ± 2,7 27 ± 2,9
t1/2 (hr) ND 4,8 ± 1,3 4,2 ± 0,64
Biodisponibilidade (%) ND 66 60 ± 4
Razão de AUC de PO de IVa NA 1,1 NA
* Iab foi detectado a 18 nM em 15 min em apenas um macaco.
SEÇÃO DE PERFILAÇÃO ADICIONAL 2
ESTUDOS ADICIONAIS COM PRÓ MEDICAMENTO Ibb
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[00653] Estudos farmacocinéticos de IV e PO foram conduzidos de Ibb em ratos, cachorros e macacos. Em todos os casos, amostras de sangue foram colhidas na presença de EDTA. A presença de EDTA, um inibidor de ALP conhecido, minimizou conversão ex vivo significativa de Ibb durante processamento de amostra. IVb foi formado seguindo administração de IV de Ibb rapidamente. Biodisponibilidades orais boas de IVb (50-310%; calculados usando o AUC de IV histórico de IVb) foram observadas após administração de Ibb em ratos, cachorros e macacos com níveis muito baixos de Ibb presentes em plasma. Uma vez que há níveis altos de expressão de ALP no intestino, é provavelmente que seguindo administração oral de Ibb, Ibb seja hidrolisado por ALP presente nas membranas de bordas franjadas do lúmen intestinal para formar IVb que é rapidamente absorvido devido a sua permeabilidade alta.
[00654] Estudos de incubação in vitro foram conduzidos para uma avaliação qualitativa de hidrólise ALP-dependente de Ibb em tecidos diferentes. Ibb foi hidrolisado na presença de soro e hepatócitos de rato, cachorro, macaco e ser humano, como também ALP Placentária Humana. Nas ocasiões onde Ibb e IVb foram medidos, a conversão de Ibb para IVb foi quase estequiométrica. Devido à hidrólise em soro, ligação de proteína de Ibb não pôde ser determinada. Com base nos dados in vitro, é antecipado que Ibb será hidrolisado por ALP humana e que IVb será formado após administração oral de Ibb em indivíduos humanos.
[00655] A solubilidade cristalina de Ibb-03 em temperatura ambiente é >11 mg/ml na faixa de pH de 1,5 a 8,7; soluções aquosas contendo >75 mg/ml foram preparadas para estudos de toxicologia in vivo. Em comparação, a solubilidade aquosa do composto de origem, IVb, em temperatura ambiente como material cristalino foi determinada para ser 0,007-0,19 mg/ml (faixa de pH 1,0-9,6). Ibb-03 exibe solução acei
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187/233 tável e estabilidades sólidas.
[00656] A solubilidade aquosa mais alta de Ibb fornece um meio para superar a absorção limitada por taxa de dissolução de IVb abaixo de certas doses e assim aumentou as exposições de IVb em estudos de escalação de dose oral e de toxicocinética. Ibb, quando dosado oralmente até 200 mg/kg de equivalente de IVb, forneceu 11 e 2,6 vezes (BID) AUC mais alto de IVb em ratos e cachorros, respectivamente, com exposição de plasma relativamente baixa ao pró medicamento (< 0,9 μΜ), quando comparado à AUC dos estudos de suspensão de IVb históricos em dose similar.
ESTUDO DE TOXICOCINÉTICA DE DOSE SIMPLES EM RATOS DE SPRAGUE DAWLEY
[00657] Um estudo de toxicocinética de 1 dia em ratos foi conduzido usando o pró medicamento Ibb (sal de monolisina). Ibb foi administrado em dosagens de 19, 64 e 236 mg/kg (ácido livre) por gavagem oral para três ratos/grupo usando água como o veículo (formulação de solução). As dosagens de pró medicamento ácido livre correspondem às dosagens de equivalente molar de IVb (origem) de 15, 51 e 190 mg/kg, respectivamente. O ponto terminal avaliado foi toxicocinética de plasma de Ibb e IVb nos ratos individuais.
[00658] Os valores de toxicocinética médios são fornecidos na Tabela 28.
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188/233
TABELA 28: VALORES DE TOXICOCINÉTICA MÉDIOS PARA Ibb E
IVb EM RATOS DADOS 5200 mg/kg DE Ibb COMO UMA DOSE
ORAL SIMPLES
Dosagens (mg/kg)
Ibb Equiv. molar de IVb 19 15 64 51 236 190
Ibb IVb Ibb IVb Ibb IVb
Cmax (pM) 0,027 58 0,14 135 0,25 290
C24 h (pM) <LLQ 0,048 <LLQ 0,29 <LLQ 29
AUC 0,0301 2832 0,181 9972 0,491 37002
(pM-h)
t1/2 (h) 1,3 2,1 4,6 2,1 3,6 5,8
Valores representam médias de um a três ratos/grupo para dados de Ibb e 3 ratos/grupo para dados de IVb. LLQ é o limite inferior de quantificação.
1 AUC de zero a última vez de tempo.
2 AUC de zero a »
[00659] Concentração de plasma máxima média (Cmax) de IVb (origem) foi alcançada dentro de pós-dose de «1-3 horas. Em ratos dados 5<236 mg/kg de Ibb, o aumento em AUC de IVb foi quase proporcional com dosagem de Ibb, e Cmax aumentou menos em uma maneira proporcional à dosagem entre 19 e 236 mg/kg de Ibb. Ibb foi detectado em plasma de ratos dados >19 mg/kg de Ibb mas em concentrações muito baixas com relação às de IVb.
[00660] Uma comparação de Cmax de IVb e AUC obtidos em ratos dados IVb ou Ibb é mostrado na Figura 12.
[00661] A exposição a IVb é substancialmente aumentada seguindo administração de Ibb comparada à alcançada após doseamento IVb.
ESTUDO TOXICOCINÉTICO DE DOSE SIMPLES E DE TOLERABILIDADE EM CACHORROS
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[00662] Um estudo bifásico foi conduzido para avaliar a tolerabilidade do pró medicamento, Ibb (sal de monolisina) em dosagens de 25, 92, ou 250 mg/kg (ácido livre, equivalente molar para 20, 74 ou 201 mg/kg de IVb de origem, respectivamente) e a toxicocinética de Ibb e IVb (1). No dia 1, Ibb foi administrado a um Cachorro/sexo/grupo uma vez diariamente em cápsulas enchidas a seco nas dosagens acima. Um período de lavagem de 1 semana foi usado entre doses no estudo. No dia 8, Ibb foi administrado a um Cachorro/sexo/grupo uma vez diariamente como uma solução aquosa a 25 mg/kg ou duas vezes diariamente em cápsulas enchidas a seco a 46 ou 125 mg/kg de BID. Os pontos terminais foram: sinais clínicos, peso do corpo, consumo alimentar, química do soro, hematologia e toxicocinética de plasma de Ibb e IVb.
[00663] Os valores de toxicocinética de plasma de cachorros individuais são mostrados na Tabela 29.
TABELA 29: VALORES DE TOXICOCINÉTICA PARA IVb EM CACHORROS DADOS < 250 mg/kg DE Ibb
Dosagens (mg/kg)
Ibb Equiv. molar de IVb 251 20 922 75 2503 203
Animal 2101M 2201F 3101M /1 3201F 4101M 1201F
Cmax (pM)
dia 1 72 34 284 664 614 934
dia 8 56 33 744 1085 1585 884’5
C24 h (pM)
dia 1 0,008 0,688 1,90 0,202 2,61 0,704
dia 8 0,547 0,107 10,6 0,307 54,2 1,96
AUC (pM-h)
dia 1 259 136 1114 3294 3344 7454
dia 8 324 139 4784 10535 13935 9784’5
t1/2 (h)
dia 1 1,5 4,5 3,6 2,3 4,1 3,2
dia 8 3,3 3,4 5,2 2,4 8,0 3,3
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190/233 1 Formulado como cápsulas enchidas a seco no dia 1 e como uma solução aquosa no dia 8 formulado (doseamento de QD em ambos dias) 2 Como 92 mg/kg QD no dia 1 e como 46 mg/kg de BID no dia 8; formulado como cápsulas enchidas a seco em ambos os dias 3 Como 250 mg/kg QD no dia 1 e como 125 mg/kg de BID no dia 8; formulado como cápsulas enchidas a seco em ambos os dias 4 Êmese observado dentro de 2 horas de doseamento com sobra de cápsula presente 5 Êmese observado dentro de 2 horas de doseamento sem sobra de cápsula
[00664] Baixos níveis (< 0,9 μΜ) de Ibb foram detectados em algumas amostras de plasma nos dias 1 e 8. Concentração de plasma máxima média (Cmax) de IVb foi alcançada entre 1-4 horas pós-dose para doseamento de QD, e 1-2 horas pós-segunda dose para doseamento de BID. A 25 mg/kg QD, Cmax equivalente e AUC de IVb foi observado quando Ibb foi administrado como cápsulas enchidas a seco ou uma solução aquosa. No dia 1, êmese (branco, listrado com vermelho que continha sobras de cápsula) foi observada a cerca de 0,5-1,25 hora após doseamento em todos os cachorros dados >92 mg/kg QD (3101Μ, 3201F, 4101Μ e 4201F) que provavelmente contribuíram para exposição uniforme entre 92 e 250 mg/kg. No dia 8, êmese (branco ou marrom) foi observada dentro de 2 horas após doseamento em todos os cachorros dados >46 mg/kg de BID; sobras de cápsula foram apenas observadas em vômito de dois cachorros (3101M pós-primeira dose e 4201F pós segunda dose). Doseamento duas vezes diariamente forneceu maior exposição a IVb em cachorros que doseamento uma vez diária.
[00665] Diferente de êmese, não havia nenhum sinal clínico observado, e não havia nenhum efeito no peso do corpo e consumo alimentar.
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[00666] Apesar da êmese observada em cachorros, uma AUC de IVb mais alta é observada em cachorros dados Ibb que em cachorros dados IVb. Uma comparação de AUC de IVb obtida em cachorros dados Ibb ou IVb (2) é mostrado na Figura 13.
[00667] A biodisponibilidade oral absoluta de IVb, composto de origem, após administração das soluções aquosas de Ibb-03, o pró medicamento de fosfato, variou de 50% a 310% em ratos, cachorros e macacos. Estes cálculos são com base em dados de IV históricos. A exposição de IVb, após administração oral das soluções aquosas do pró medicamento, Ibb-03, dosado até 190 mg/kg de equivalente de IVb é 3-10 vezes mais alta no estudo de escalação de dose oral de rato quando comparada aos dados históricos com IVb. Quando Ibb-03 for dosado BID como fármaco em cápsula em cachorros, melhoria de 2-3 vezes em exposição é alcançada comparada aos dados históricos de estudos de toxicologia de pré-ECN com doseamento de BID de IVb como suspensões. Os dados de exposição in vivo do fármaco em formulações de cápsula sugerem que a exposição oral de IVb em seres humanos pudesse ser melhorada significativamente pelas formas de administração de dosagem oral sólida tradicionais de Ibb.
[00668] Ibb é o pró medicamento de fosfato do aduto de Nhidroximetila de IVb e é hidrolisado através de fosfatase alcalina (ALP) para formar IVb. Após administração de Ibb em animais, portanto, as amostras de plasma foram preparadas de sangue colhido na presença de EDTA, um inibidor de ALP conhecido. Conversão de Ibb para IVb foi mínima (< 2%) no sangue contendo EDTA (rato, cachorro, macaco e ser humano). Nenhuma conversão significativa ex vivo de Ibb é esperada durante armazenamento da amostra (-20° C) e análise de Ibb.
[00669] A hidrólise de Ibb foi estudada em sistemas in vitro de animal e ser humano. Uma vez que isoformas de ALP múltiplas são amplamente distribuídas em vários tecidos, correlações quantitativas in
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192/233 vitro a in vivo não foram tentadas (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora e Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). Portanto, os estudos foram limitados a uma avaliação qualitativa de hidrólise ALP-dependente em tecidos diferentes. Ibb foi hidrolisado na presença de soro (rato, cachorro, macaco e ser humano), hepatócitos (rato, cachorro e ser humano) como também em ALP Placentária Humana. Nenhum giro foi observado em hepatócitos de macaco. A conversão de Ibb para IVb foi quase estequiométrica. Devido à hidrólise em soro, ligação de proteína de Ibb não pôde ser determinada.
[00670] Ibb foi completamente hidrolisado para formar IVb em células de Caco-2 e, como esperado, níveis muito baixos de Ibb foram detectados em plasma de rato, cachorro e macaco após administração oral de Ibb. Estes dados são consistentes com relatórios que descrevem os níveis altos de expressão de ALP no intestino (McComb et al., 1979a; Butterworth, 1983). A ALP ligada à membrana está principalmente localizada nas membranas de bordas franjadas das microvilosidades revestindo o lúmen intestinal (Butterworth, 1983; Testa e Mayer, 2003). É provável que seguindo administração oral de Ibb, Ibb é hidrolisado por ALP presente nas membranas de bordas franjadas do lúmen intestinal para formar IVb que é rapidamente absorvido devido a sua permeabilidade alta.
[00671] Embora isoformas diferentes de ALP existam em tecidos diferentes e espécies, a especificidade de substrato para ALP é relativamente vasta (Heimbach et al., 2003), que é consistente com as descobertas acima para Ibb.
[00672] IVb foi rapidamente formado seguindo administração de IV de Ibb em ratos, cachorros e macacos. As razões conversão de AUC de IV foram 0,62 em ratos, 1,6 em cachorros e 1,7 em macacos, sugerindo conversão satisfatória a boa de Ibb para IVb.
[00673] Biodisponibilidades orais boas (50-310%; calculados usan
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193/233 do o AUC de IV histórico de IVb) de IVb foram observadas após administração de Ibb em ratos, cachorros e macacos. Mais significativamente, a solubilidade aquosa mais alta de Ibb diminuiu a absorção limitada por taxa de dissolução de IVb e assim aumentou as exposições de IVb em estudos de escalação de dose oral e toxicocinética quando comparados às exposições dos estudos de IVb históricos (Seção de Toxicologia de Descoberta Tabelas 28-29 e Figs. 12-13).
MÉTODOS
[00674] Os estudos descritos neste relatório usaram o sal de monolisina de Ibb.
QUANTIFICAÇÃO DE Ibb E IVb POR LC/MS/MS
[00675] Um método de LC/MS/MS foi desenvolvido para a análise de Ibb e IVb em amostras de plasma dos estudos farmacocinéticos animais como também em sobrenadante de acetonitrila de estudos de incubação in vitro. Para a análise em plasma, um instrumento de Packard Multiprobe foi usado para transferir 50 pL de cada padrão, QC, e amostra de plasma para uma placa de 96 poços limpa para extração de precipitação de proteína. Após a adição de 200 pL de acetonitrila contendo o IVc padrão interno, as amostras foram misturadas por vórtice e o sobrenadante resultante foi separado das proteínas precipitadas através de centrifugação por 10 min. Para a análise no sobrenadante gerado dos estudos in vitro, um volume igual do sobrenadante e acetonitrila contendo o padrão interno foi misturado. Uma alíquota do sobrenadante acima foi transferida usando um manipulador de líquido Tomtec automatizado em uma segunda placa de 96 poços limpa. Um volume igual de água foi adicionado, e a placa foi tampada e misturadas por vórtice.
[00676] O sistema de HPLC consistiu em bombas de Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) e uma auto-amostragem de HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligada a uma coluna analítica Phenome
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194/233 nex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 μ; Torrance, CA). Fase móvel A consistiu em 5 mM de formato de amônio em água; fase móvel B foi 100% de acetonitrila. Taxa de fluxo de LC foi 0,38 mL/min. A composição de fase móvel inicial foi 2% de B, elevada para 50% de B por 1,8 min e mantida por 0,5 min, elevada para 100% de B por 0,1 min e mantida por 0,5 min, retornada para condições iniciais no próximo 0,1 min, e reequilibrada. Tempo de análise total foi 4,0 min. O tempo de retenção para Ibb, IVb e IVc foi 1,42, 2,21 e 1,73 min, respectivamente.
[00677] O sistema de HPLC foi interfaceado com um espectrômetro de massa de quadrupolo triplo Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado com a fonte de Turboionspray ajustada em 550° C e a voltagem de pulverização de íon ajustada em 4,5 kV. Nitrogênio de UHP foi usado como nebulizador e gás auxiliar com a pressão de 80 psi (5,62 kg/cm2) e 7 L/min, respectivamente. As energias de colisão para Ibb, IVb e IVc foram 19, 25 e 29 volts, respectivamente. Aquisição de dados utilizou monitoramento de reação selecionado (SRM). Íons que representam o modo de íon positivo (espécies de M+H)+ para Ibb, IVb e o padrão interno foram selecionados em MS1 e com colisão dissociados com nitrogênio e otimizados com energias de colisão para formar íons de produto específico subseqüentemente monitorados por MS2. As transições de SRM para Ibb, IVb e Plc foram m/z 558^432, 448^202 e 474^256, respectivamente.
[00678] Curvas padrão variando de 5 nM a 10 μM foram preparadas de soluções de matéria-prima e serialmente diluídas em matriz para Ibb e IVb. Curvas padrão foram aliquotadas em duplicata, extraídas com as amostras e injetadas no princípio, meio e fim da seqüência analítica. As curvas padrão foram providas com um regressão linear ponderada através de concentração 1/x2 recíproca. Dados e picos cromatográficos foram processados e as concentrações dos padrões e
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195/233 desconhecidos foram quantificadas usando PEBiosystems Analyst®
1.1.
MÉTODOS IN VITRO (1) ESTABILIDADE DE Ibb EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCl
[00679] A estabilidade de Ibb foi estudada em sangue fresco e soro de rato, cachorro, macaco e ser humano (n = 2). O sangue foi colhido em tubos de vácuo contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). O soro foi colhido em tubos de vácuo não contendo nenhum anticoagulante. Ibb foi incubado em uma concentração inicial de cerca de 15 μΜ a 90 min a 37° C. Amostras seriais foram tiradas nos momentos predeterminados. Alíquotas de amostras de sangue (200 μL) foram primeiro misturadas com 100 μL de água seguido por 400 μL de acetonitrila. As amostras de soro (50 μL) foram adicionados em microrecipientes contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido pela adição de 100 μL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Ibb e IVb por LC/MS/MS.
[00680] A estabilidade de Ibb foi também avaliada, como descrita acima, em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
(2) HIDRÓLISE DE Ibb NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00681] ALP Placentária Humana sólida foi obtida de Sigma (P3895, St. Louis, MO). Uma solução de 1000 unidades/L foi preparada em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Soluções de 100 e 10 unidades/L foram obtidas por diluição serial. Ibb foi incubado nas soluções de 10, 100 e 1000 unidades/L (n = 2) a 37° C por 2 h. A concentração de partida de Ibb na incubação foi 10 μM. Alíquotas de amostras de 100 μL foram tiradas em tempos predeterminados e adicionadas em micro-recipientes de K2EDTA seguido pela adição de 200 μL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Ibb e IVb por LC/MS/MS.
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ESTUDOS IN VIVO
[00682] Todas as amostras de sangue (0,3 ml) foram colhidas em micro-recipientes contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e colocadas em gelo quebrado. Após centrifugação, o plasma foi separado e armazenado a -20° C até análise. O sal de mono-lisina de Ibb (Forma 3) foi usado para os estudos farmacocinéticos. As soluções de doseamento de Ibb foram preparadas em qualquer água estéril (para administração de IV em cachorros e macacos) ou água destilada (para toda outra administração de dose).
(1) ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00683] Ratos de Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) com cânulas implantadas na veia jugular foram usados. Os ratos foram jejuados durante a noite nos estudos farmacocinéticos de PO. As amostras de sangue foram colhidas da veia jugular.
[00684] No estudo de IV, Ibb foi liberado a 1,3 mg/kg (ácido livre, ou 1,0 mg/kg de equivalente de IVb) como um bolo por 0,5 min (n = 3). A concentração da solução de doseamento foi 1,3 mg/ml, e o volume de doseamento foi 1 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 2, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00685] No estudo de PO, Ibb foi administrado a 6,6 mg/kg (ácido livre, ou 5,2 mg/kg de equivalente de IVb) através de gavagem oral (n = 3). A concentração da solução de doseamento foi 1,3 mg/ml, e o volume de doseamento foi 5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(2) ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00686] Os estudos de IV e PO de Ibb foram conduzidos em cachorros beagles (10 ± 0,78 kg, Marshall Farms USA Inc., Norths Rose,
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NY). Três cachorros foram usados em cada estudo. Dos três cachorros, dois cachorros iguais foram usados para estudos de IV e PO. Houve um período de lavagem de duas semanas entre os estudos de IV e PO.
[00687] No estudo de IV, Ibb foi infundido por meio da veia cefálica a 1,3 mg/kg (ácido livre, ou 1,0 mg/kg de equivalente de IVb) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de doseamento foi 2,6 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e a 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00688] No estudo de PO, os cachorros foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Ibb foi administrado através de gavagem oral a 7,0 mg/kg (ácido livre, ou 5,6 mg/kg de equivalente de IVb). A concentração da solução de doseamento foi 7,0 mg/ml, e o volume de doseamento foi 1 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(3) ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00689] Os estudos de IV e PO de Ibb foram conduzidos em uma maneira cruzada em três macacos cinomólogos (9,9 ± 2,4 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Houve um período de lavagem de duas semanas entre os estudos de IV e PO.
[00690] No estudo de IV, Ibb foi infundido por meio da veia femoral a 1,3 mg/kg (ácido livre, ou 1,1 mg/kg de equivalente de IVb) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de doseamento foi 2,7 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e a 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
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[00691] No estudo de PO, os macacos foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Ibb foi administrado através de gavagem oral a 5,8 mg/kg (ácido livre, ou 4,7 mg/kg de equivalente de IVb). A concentração da solução de doseamento foi 5,8 mg/ml, e o volume de doseamento foi 1 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(4) ANÁLISE DE DADOS
[00692] Todos os resultados são expressos como ± SD médio, a menos que do contrário especificado.
[00693] Os parâmetros farmacocinéticos de Ibb e IVb foram calculados por Análise Não-Compartimental usando o programa de software de KMETICA® (versão 4.0.2, InnaPhase Co., Filadélfia, PA). Os valores de Cmax e Tmax foram registrados diretamente de observações experimentais. Os valores de AUCo-n e AUCtot foram calculados usando as adições trapezóides log-lineares misturadas. A liberação de corpo total (Cl), tempo de permanência médio (MRT) e o volume de estado constante de distribuição (Vss) foi também calculado após administração intravenosa. A biodisponibilidade oral absoluta (expressa como %) foi estimada tirando a razão de valores de AUC normalizados em dose para doses orais para aquelas após doses intravenosas.
[00694] A liberação intrínseca in vitro de Icb em hepatócitos (Clint) foi calculada como segue:
Clint·n(mLfmin/kg) = Clilirx 120 [milhões de células) γ g de ligado χ 1 .
g de ligado kg do peso do corpo 1000 onde χ θ 40, 32, 30 e 26 g de fígado/kg do peso do corpo para o rato, cachorro, macaco e ser humano, respectivamente (Davis e Morris, 1993).
[00695] A liberação hepática CIh foi calculada da equação a seguir usando o modelo bem agitado:
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CIH (mLJmin/kg) = Qh χ ΟΙ.^,π^ο
Qtl + Cl.int. in vivo onde Qh é o fluxo sangüíneo do fígado de 55, 31, 44 e 21 mL/min/kg para o rato, cachorro, macaco e ser humano, respectivamente (Davis e Morris, 1993).
[00696] A ração de extração hepática (ER) foi calculada como segue:
ER = CIh/Qíi
[00697] O t-teste de Student foi usado para análise estatística (Microsoft® Excel, Redmond, WA). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas no nível de P < 0,05.
ESTUDOS IN VITRO
ESTABILIDADE DE Ibb EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCI
[00698] Como parte da validação de ensaio analítico, a estabilidade de Ibb foi estudada em sangue contendo EDTA que é conhecido ser um inibidor de ALP (Bowers, Jr. e McComb, 1966; Yora e Sakagishi, 1986). Após incubação a 37° C por 90 min foi menos de 2% de conversão de Ibb a IVb em sangue contendo EDTA e na presença de tampão de Tris-HCI (Tabelas 30 e 31). As porcentagens pequenas acima de conversão observadas a 37° C indicam que conversão sob as condições de armazenamento de amostra (-20° C) são improváveis. Portanto, conversão ex vivo relativamente mínima para IVb é esperada durante a análise de Ibb.
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TABELA 30: ESTABILIDADE DE Ibb NO SANGUE DE EDTA FRESCO DE RATO, CACHORRO E MACACO
Tempo (min) Sangue de rato (n = 2) Sangue de Cachorro (n = 2) Sangue de macaco (n = 2)
Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado *
0 15 0,23 1,6 13 0,089 0,68 16 0,075 0,47
15 15 0,22 1,5 12 0,079 0,60 19 0,12 0,76
30 18 0,26 1,7 15 0,085 0,65 18 0,13 175 0,80
45 15 0,29 1,9 16 0,095 0,73 18 0,13 0,82
60 16 0,31 2,0 13 0,088 0,67 19 0,14 0,86
90 17 0,32 2,1 16 0,11 0,82 17 0,14 0,89
* Porcentagem formada como a concentração de partida de Ibb.
TABELA 31: ESTABILIDADE DE Ibb NO SANGUE DE EDTA FRESCO DE SER HUMANO E TAMPÃO DE TRIS-HC
Tempo (min) Sangue humano (n =2) Tampão de Tris-HCl (n = 2)
Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado *
0 16 0,099 0,62 14 0,20 2,2
15 15 0,093 0,58 12 0,30 2,1
30 16 0,097 0,60 13 0,33 2,3
45 16 0,11 0,67 12 0,41 2,9
60 15 0,10 0,65 13 0,51 3,7
90 18 0,12 0,73 12 0,51 3,6
* Porcentagem formada como a concen tração de partida de bb.
[00699] Para investigar a hidrólise de Ibb na circulação sistêmica, Ibb foi incubado em soro fresco (rato, cachorro, macaco e ser humano) a 37° C por 90 min. A taxa de hidrólise foi muito rápida no soro de macaco, seguido pelos soros de ser humano, cachorro e rato (Tabela 3). A conversão de Ibb para IVb foi quase estequiométrica.
[00700] Soro contém atividades de ALP inferiores quando compa
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201/233 rado aos tecidos (McComb et al., 1979a). Além disso, soro também contém isoformas de ALP de fontes de tecido como osso, fígado e intestino, como resultado de vazamento de enzima através dos vasos sanguíneos (Moss, 1983). Portanto, a hidrólise de Ibb em soro foi provavelmente mediada por isoformas múltiplas de ALP.
TABELA 32: ESTABILIDADE DE Ibb NO SORO FRESCO DE RATO,
CACHORRO, MACACO E SER HUMANO
Tempo (min) Soro de rato (n = 2) Soro de Cachorro (n = 2) Soro de macaco (n = 2) Soro humano (n = 2)
Ibb ^M) Ivb Formado ^M) Ibb ^M) Ivb Formado ^M) Ibb ^M) Ivb Formado ^M) Ibb ^M) Ivb Formado ^M)
0 12 0,095 13 0,13 14 0,34 13 0,14
15 9,4 0,33 12 0,66 6,6 6,5 9,0 0,96
30 9,2 0,60 11 1,2 3,1 8,5 10 2,0
45 9,4 0,92 10 1,7 1,7 10 10 3,1
60 9,3 1,3 10 2,4 0,85 11 8,0 3,6
90 9,0 2,2 8,9 3,6 0,22 13 6,5 5,0
t1/2 (min)* 704** 167** 15 75
* Calculado como o desaparecimento de Ibb.
** As meia-vidas são maiores que o período de incubação.
HIDRÓLISE DE Ibb NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00701] Para estudar a hidrólise de Ibb em uma forma purificada de ALP humana, Ibb foi incubado a 37° C (2 h) com soluções contendo ALP Placentária Humana (10, 100 e 1000 unidades/L). A t1/2 de desaparecimento de Ibb foi determinada (Tabela 4). Como esperado, a taxa de hidrólise foi mais rápida nas soluções com atividades de ALP mais altas. IVb foi também formado conseqüentemente (Fig. 14). Isto indica que Ibb é hidrolisado pela ALP derivada de seres humanos para formar IVb.
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TABELA 33: HIDRÓLISE DE Ibb EM SOLUÇÕES DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
Atividade de ALP (Unidades/L) (n = 2)
10 10 1000
t1/2 (min) 198 16 2,0
Nota: Ibb foi incubado a uma concentração de partida de 10 pM a 37° C por 120 min.
ESTUDOS IN VIVO
ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00702] Os parâmetros farmacocinéticos de Ibb e IVb em ratos após administração IV e oral de Ibb estão resumidos na Tabela 34. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 15. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVb em ratos estão também mostrados.
[00703] A liberação de corpo total (Cl) de Ibb seguindo administração de IV foi 19 mL/min/kg, sugerindo que Ibb é um composto de liberação baixa a moderada em ratos. A meia-vida de eliminação (t1/2) e tempo de permanência médio (MRT) após administração de IV foi 0,18 h e 0,079 h, respectivamente. Iab não foi detectado além 2 h. O volume de distribuição de Ibb em estado constante (Vss) foi 0,10 L/kg, sugerindo distribuição de tecido muito limitada. A formação de IVb de Ibb após administração de IV foi rápida; IVb foi detectado ao primeiro ponto de tempo de amostragem de 2 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVb formado de Ibb vs. estudo de IVb histórico foi 0,62 (valor teórico para conversão completa = 1), indicando conversão satisfatória de Ibb em IVb em ratos após doseamento de IV.
[00704] Ibb foi detectado (< 10 nM) no plasma (0,25 e 0,5 h) após administração oral. A Tmax de IVb após administração oral de Ibb foi 0,83 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVb de 4,7 h indicando absorção mais rápida de IVb seguindo a administração oral do prómedicamento. A absorção mais rápida de IVb do pró-medicamento é
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203/233 provavelmente o resultado de solubilidade aquosa melhor de Ibb como também hidrólise rápida de Ibb para formar IVb no intestino. A biodisponibilidade oral absoluta de IVb de Ibb foi 50%, similar ao valor de IVb histórico de 60% (Tabela 34). Além disso, a exposição de IVb do rato de estudo de escalação de dose oral de Ibb foi superior quando comparada aos dados históricos com IVb (Tabela 31 e Fig. 14).
TABELA 34: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Ibb E IVb
SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IV E Ibb NO RATO (±SD
Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Ibb (03-002) IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,3 ácido livre ou 1,0 de eqv. de IVb 1
AUCtot (pM*h) 2,5 ± 1,4 15 ± 5,4 24 ± 3,2
CLtot (mL/min/kg)) 19 ± 8,9 NA 1,6 ± 0,20
t % (H) 0,18 ± 0,050 3,0 ± 1,8 5,9 ± 4,9
MRT (h) 0,079 ± 0,041 NA 5,6 ± 3,6
Vdss (L/kg) 0,010 ± 0,093 NA 0,49 ± 0,26
Razão de AUC de IVb de IV NA 0,62* NA
PO
Dose (mg/kg) 6,6 ácido livre ou 5,2 de eqv. de IVb 5
Tmax (h) 0,25 0,83 ± 0,14 4,7 ± 1,2
Cmax (pM) 0,008 ± 0,003 19 ± 1,8 9,5 ± 2,8
C-24 h (pM) ND 0,009 ± 0,004 0,16 (n=2)
AUCtot (pM*h) ND 62 ± 3,3 96 ± 33
T % (H) ND 2,2 ± 0,11 3,7 ± 8,6
Biodisponibilidade nd 50** 60
Razão de AUC de IVb de PO NA 0,69* NA
NA - não aplicável; ND - não detectado (< 5 nM).
* As razões foram calculadas de AUC de IVb após doseamento de
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204/233 pró-medicamento/AUC de IVb após doseamento de IVb para IV e PO, respectivamente.
** Calculado dos dados de IV históricos de IVb.
ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00705] Os parâmetros farmacocinéticos de Ibb e IVb em cachorros após administração IV e oral de Ibb estão resumidos na Tabela 35. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 16. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVb em cachorros estão também mostrados.
[00706] A Cl de Ibb após administração de IV foi 27 mL/min/kg, similar ao fluxo sangüíneo de fígado de 31 mL/min/kg em cachorros, sugerindo que Ibb é um composto de liberação alta em cachorros. A t1/2 e MRT após administração de IV foram 0,83 h e 0,21 h, respectivamente. O MRT refletiu uma estimativa mais realística da duração de Ibb no plasma uma vez que as concentrações de plasma de Ibb na fase terminal foram baixas (Fig. 3). Ibb não foi detectado além de 4 h. O Vss de Ibb foi 0,35 L/kg, sugerindo distribuição de tecido limitada. A formação de IVb de Ibb após administração de IV foi rápida; IVb foi detectado ao primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVb formado de Ibb vs. estudo de IVb histórico foi 1,6, sugerindo conversão completa de Ibb em IVb em cachorros após administração de IV.
[00707] Ibb foi detectado (Cmax = 0,034 nM) em amostras de plasma em pontos de tempo precoces (até 2 h em um cachorro) seguindo administração oral. A Tmax de IVb após administração oral de Ibb foi 0,40 h, similar à Tmax histórica de IVb de 0,50 h. A biodisponibilidade oral absoluta de IVb de Ibb foi 310%, similar aos dados de IVb históricos de 179%. Além disso, a exposição de IVb do estudo de tolerabilidade de cachorro de Ibb (escalação de dose) foi maior quando comparado aos dados históricos com IVb (Tabela 31 e Fig. 15).
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205/233
[00708] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVb formados de Ibb são similares aos perfis de IVb históricos (Fig. 16).
TABELA 35: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Ibb E IVb
SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IV E Ibb NO CACHORRO (±SD Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Ibb IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,3 ácido livre (03-001) ou 1,0 de eqv. de IVb 1 (n=2)
AUCtot ^M*h) 1,4 ± 0,18 6,2 ± 0,80 3,8
CLtot (mL/min/kg)) 27 ± 3.2 NA 9,8
t (H) 0,83 ± 0,58 2,0 ± 0,21 1,6
MRT (h) 0,21 ± 0,043 NA 1,8
Vdss (L/kg) 0,35 ± 0,091 NA 1,1
Razão de AUC de IVb de IV NA 1,6* NA
PO
Dose (mg/kg) 7,0 ácido livre (03-002) ou 5,6 de eqv de IVb 5 (n= 3)
Tmax (h) 0,33 ± 0,14 0,40 ± 0,13 0,50 ± 0,25
Cmax ^M) 0,034 ± 0,018 20 ± 2,4 7,7 ± 0,25
C-24 h (gM) ND 0,037 ± 0,026 0,034 (n=2)
AUCtot ^M*h) 0,059 (n=1) 66 ± 17 30 ± 11
T 1/2 (H) NA 2,6 ± 0,21 2,7 ±0,40
Biodisponibilidade NA 310** 179 ± 56
Razão de AUC de IVb de PO NA 2,2* NA
* As razões foram calculadas de AU C de IVb após doseamento de pró-
medicamento/IVb após doseamento de IVb para IV e PO, respectivamente.
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206/233 ** Calculado de dados de IV históricos de IVb
ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00709] Os parâmetros farmacocinéticos de Ibb e IVb em macacos são resumidas Seguindo Administração Oral de IV e Ibb na Tabela 36. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 17. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVb em macacos estão também mostrados.
[00710] A Cl de Ibb após administração de IV foi 28 mL/min/kg, sugerindo que Ibb é um composto de liberação moderada a alta em macacos. A t1/2 e MRT após administração de IV foram 0,10 h e 0,093 h, respectivamente. O Vss de Ibb foi 0,15 L/kg, sugerindo distribuição de tecido muito limitada. A formação de IVb de Ibb após administração de IV foi rápida; IVb foi detectado ao primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVb formado de Ibb vs. estudo de IVb histórico foi 1,7, sugerindo conversão completa de Ibb em IVb em macacos após doseamento de IV.
[00711] Ibb não foi detectado (LLQ = 5 nM) em quaisquer amostras de plasma após administração oral. A Tmax de IVb após administração oral de Ibb foi 1,5 h, similar à Tmax histórica de IVb de 2,5 h. A biodisponibilidade oral absoluta de IVb de Ibb foi 187% que é mais alta que os dados de IVb históricos de 49% (Tabela 36).
[00712] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVb formados de Ibb são similares aos perfis de IVb históricos (Fig. 17).
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TABELA 36: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Ibb E IVb
SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IV E Ibb NO MACACO (±
SD Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Ibb IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,3 ácido livre ou 1,1 de eqv de IVb 1 (n=3)
AUCtot (pM*h) 1,5 ± 0,40 19, ± 1,8 10 ± 1,2
CLtot (mL/min/kg)) 28 ± 6,8 NA 3,7 ± 0,43
t (H) 0,10 ± 0,042 6,5 ± 2,4 19 ± 20
MRT (h) 0,093 ± 0,00076 NA 5,5 ± 6,3
Vdss (L/kg) 0,15 ± 0,039 NA 1,2 ± 1,4
Razão de AUC de IVb de IV NA 1,7* NA
PO
Dose (mg/kg) 5,8 ácido livre ou 4,7 de eqv de IVb 5 (n= 3)
Tmax (h) NA 1,5 ± 0,87 2,5
Cmax (pM) ND 31 ± 11 4,2
C-24 h (pM) ND 0,11 ±0,075 0,24
AUCtot (pM*h) ND 88 ± 4,6 24
T 1/2 (H) NA 4,1 ± 1,1 11
Biodisponibilidade NA 187 ** 49
Razão de AUC de IVb de PO NA 3,4* NA
* As razões foram calculadas de AU C de IVb após doseamento de pró-
medicamento/IVb para AUC após doseamento de IVb IV e PO, respectivamente.
** Calculado de dados de IV históricos de IVb
SEÇÃO DE PERFILAÇÃO 3:
ESTUDOS ADICIONAIS COM PRÓ-MEDICAMENTO Icb
ESTUDO DE TOLERABILIDADE DE TOXICOCINÉTICA DE DOSE
SIMPLES EM RATOS DE CD
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[00713] Um estudo de toxicocinética do 1 dia em ratos foi conduzido usando o pró-medicamento Icb (sal de dissódio). Icb foi administrado em dosagens de 5, 25 e 200 mg/kg (ácido livre) por gavagem oral para três ratos/grupo usando água como o veículo (formulação de solução). As dosagens de pró-medicamento ácido livre correspondem às dosagens de equivalente molar de IVc (origem) de 4,5, 21 e 163 mg/kg, respectivamente. O ponto terminal avaliado foi toxicocinética de plasma de Icb e IVc nos ratos individuais.
[00714] Os valores de toxicocinética médios estão fornecidos na Tabela 37.
TABELA 37: VALORES DE TOXICOCINÉTICA MÉDIOS PARA ICb E IVc EM RATOS DADOS < 200 mg/kg DE ICb COMO UMA DOSE ORAL SIMPLES
Dosagens (mg/kg)
Icb 5 25 200
Equiv. molar de IVc 4,5 21 163
Ivc Ivc IVc
Cmax (gM) 29 98 281
C24 (gM) 0,029 0,35 58
AUC (gM*h) 1091 2 5861 29252
T1/2(h) 3,2 2,3 3,4
Valores representam médias de três ratos/grupo para dados de Icb e 3 ratos/grupo para dados de IVc.
1 AUC de zero a » 2 AUC de zero a 24 h
[00715] Concentração de plasma máxima média (Cmax) de IVc (origem) foi alcançada dentro de »1,7 hora pós-dose. Em ratos dados <267 mg/kg de Icb, o aumento em AUC de IVc foi quase proporcional à dosagem de Icb, e Cmax aumentou menos em uma maneira proporcional na dosagem entre 25 e 200 mg/kg de Icb. Icb não foi detectado em plasma de ratos dados < 25 mg/kg de Icb, e concentrações muito
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209/233 baixas (0,02-0,04 μΜ) foram detectadas em plasma de ratos dados 200 mg/kg de Icb em poucos pontos de tempo.
[00716] Uma comparação de AUC de IVc obtido em ratos dados IVc (1) ou Icb é mostrada na Figura 18.
[00717] O AUC de IVc é similar após administração de origem ou pró-medicamento em dosagens inferiores (e.g., < 25 mg/kg) porque ambos podem ser formulados como soluções (PEG-400/etanol/NaOH a para 0,1N a origem e água para o pró-medicamento) mas em uma dosagem alta (e.g., 200 mg/kg) a origem neutra pode apenas ser formulada como uma suspensão enquanto que o sal de pró-medicamento pode ser formulado como uma solução aquosa que fornece exposição superior de IVc.
ESTUDO DE TOXICOCINÉTICA E DE TOLERABILIDADE DE DOSE SIMPLES EM CACHORROS
[00718] Um estudo bifásico foi conduzido para avaliar a tolerabilidade do pró-medicamento, Icb (sal de monotrometamina) em dosagens de 25, 92 ou 250 mg/kg (ácido livre, equivalente molar para 20, 75 ou 203 mg/kg de IVc de origem, respectivamente) e a toxicocinética de Icb e IVc (2). No dia 1, Icb foi administrado a um Cachorro/sexo/grupo uma vez diariamente em cápsulas enchidas a seco nas dosagens acima. Um período de lavagem de 1 semana foi usado entre as doses no estudo. No dia 8, Icb foi administrado a um Cachorro/sexo/grupo uma vez diariamente como uma solução aquosa as 25 mg/kg ou duas vezes diariamente em cápsulas enchidas a seco a 46 ou 125 mg/kg de BID. Os pontos terminais eram: sinais clínicos, peso do corpo, consumo alimentar, química de soro, hematologia e toxicocinética de plasma de Icb e IVc.
[00719] Os valores de toxicocinética de plasma de cachorros individuais estão mostrados na Tabela 38.
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Tabela 38: VALORES DE TOXICOCINÉTICA PARA IVc EM CACHORROS DADOS < 250 mg/kg DE Icb
Dosagens (mg/kg)
Icb Equiv. molar de IVc 5 20 25 75 250 203
Animal 2101M 2201F 3101M 3201F 4101MF 4201 F
Cmax (μΜ)
Dia 1 65,1 24,6 1174 157 92,64 88,94
Dia 8 59,4 46,8 121 104 2265 96,94
C24 (μΜ)
Dia 1 0,008 0,688 1,90 0,202 2,61 0,704
Dia 8 0,547 0,107 10,6 0,307 54,2 1,96
AUC (μΜ·^
Dia 1 365 122 8204 730 7394 5234
Dia 8 362 173 1137 490 37835 5964’5
T1/2(h)
Dia 1 1,5 4,5 3,6 2,3 4,1 3,2
Dia 8 3,3 3,4 5,2 2,4 8,0 3,3
1 Formulado como cápsulas enchidas a seco no dia 1 e como uma solução aquosa no dia 8 formulado (doseamento de QD em ambos dias) 2 Como 92 mg/kg de QD no dia 1 e como 46 mg/kg de BID no dia 8; formulado como cápsulas enchidas a seco em ambos os dias 3 Como 250 mg/kg de QD no dia 1 e como 125 mg/kg de BID no dia 8; formulado como cápsulas enchidas a seco em ambos os dias 4 Êmese observado dentro de 2 horas de doseamento com sobra de cápsula presente 5 Êmese observado dentro de 2 horas de doseamento sem sobra de cápsula
[00720] Baixos níveis (< 0,1 μΜ) de Icb foi detectado em algumas
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211/233 amostras de plasma nos dias 1 e 8. Concentração de plasma máxima média (Cmax) de IVc foi alcançada entre 1-2 horas pós-dose para doseamento de QD e 1-2 horas pós-segunda dose para doseamento de BID. A 25 mg/kg de QD, Cmax equivalente e AUC de IVc foram observados quando Icb foi administrado como cápsulas enchidas a seco ou uma solução aquosa. No dia 1, êmese (branca ou marrom, listrada com vermelho que continha sobras de cápsula) foi observada a cerca de 1-1,25 hora após doseamento em cachorros dados > 92 mg/kg de QD (3101M, 4101M e 4201F) que provavelmente contribuiu para exposição uniforme entre 92 e 250 mg/kg. No dia 8, êmese foi observada dentro de 2 horas após doseamento em ambos os cachorros dados 125 mg/kg de BID mas com resultados diferentes. Animal 4101M tinha exposição substancial apesar da êmese, consistente com a ausência de sobra de cápsula no vômito.
[00721] Apenas baixos níveis (55,0,1 μΜ) de Icb foram detectados em algumas amostras de plasma nos dias 1 e 8.
[00722] Diferente da êmese, não houve nenhum sinal clínico observado, e não houve nenhum efeito no peso do corpo e consumo alimentar.
[00723] Apesar da êmese observada em cachorros, um AUC de IVc mais alto é observado em cachorros dados Icb que em cachorros dados IVc. Uma comparação de AUC de IVc obtida em cachorros dados Icb ou IVc (3, 4) é mostrada na Figura 19.
VEÍCULOS E FORMULAÇÕES
SUMÁRIO DAS FORMULAÇÕES USADAS PARA ESTUDOS-CHAVE DE PK E DE SEGURANÇA
[00724] Todos estudos de PK in vivo em ratos, cachorros e macacos foram executados usando soluções aquosas para doseamento de PO e IV. Estudos de toxicologia de pré-ECN em cachorros foi executado com soluções aquosas preparadas a 20 mg/kg de dose de equi
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212/233 valente de IVc e como fármaco nas formulações de cápsula em doses de 20, 75 e 203 mg/kg de equivalentes de IVc.
[00725] Em estudo de escalação de dose oral em rato, Icb-03 foi dosado como soluções aquosas em doses de 4,5, 21 e 163 mg/kg de equivalentes de IVc. Melhorias significativas em AUC e Cmax de IVc, composto de origem, após doseamento oral de Icb, o prómedicamento, foram observadas comparadas aos dados históricos após doseamento oral de IVc.
METABOLISMO E SUMÁRIO DE FARMACOCINÉTICA SUMÁRIO DE DESCOBERTAS E INTERPRETAÇÃO
[00726] Icb é o pró-medicamento de fosfato do aduto de Nhidroximetila de IVc e é hidrolisado através de fosfatase alcalina (ALP) para formar IVc. Após administração de Icb em animais, portanto, as amostras de plasma foram preparadas de sangue colhido na presença de EDTA, um inibidor de ALP conhecido. Conversão de Icb para IVc foi mínima (< 2%) no sangue contendo EDTA (rato, cachorro, macaco e ser humano). Nenhuma conversão significativa ex vivo de Icb é esperada durante o armazenamento de amostra (-20° C) e análise de Icb.
[00727] A hidrólise de Icb foi estudada em sistemas de animal e ser humano in vitro. Uma vez que isoformas de ALP múltiplas são amplamente distribuídas em vários tecidos, correlações quantitativas in vitro a in vivo não foram tentadas (Fishman et al., 1968; Komoda et al., 1981; Moss, 1983; Yora e Sakagishi, 1986; Sumikawa et al., 1990). Portanto, os estudos foram limitados a uma avaliação qualitativa de hidrólise ALP-dependente em tecidos diferentes. Icb foi hidrolisado na presença de soro (rato, cachorro, macaco e ser humano), hepatócitos (rato, cachorro e ser humano) como também em ALP Placentária Humana. Nenhum giro foi observado em hepatócitos de macaco. A conversão de Icb para IVc foi quase estequiométrica. Devido à hidrólise
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213/233 em soro, a ligação de proteína de Icb não pôde ser determinada. [00728] IVc foi rapidamente formado seguindo administração de IV de Icb em ratos, cachorros e macacos. As razões de conversão de AUC de IV foram 1,0 em ratos, 0,67 em cachorros e 0,90 em macacos, sugerindo conversão boa de Icb para IVc.
[00729] Biodisponibilidades orais boas (80-122%) de IVc foram observadas após administração de Icb em ratos, cachorros e macacos. Mais significativamente, a solubilidade aquosa mais alta de Icb diminuiu o absorção limitada por taxa de dissolução de IVc abaixo de certas doses e assim aumentou as exposições de IVc em estudos de escalação de dose oral e toxicocinética quando comparados às exposições dos estudos de IVc históricos.
MÉTODOS
[00730] Os estudos descritos neste relatório usaram o sal de monotrometamina de Icb, a menos que do contrário declarado. QUANTIFICAÇÃO DE Icb E IVc POR LC/MS/MS
[00731] Um método de LC/MS/MS foi desenvolvido para a análise de Icb e IVc em amostras de plasma dos estudos farmacocinéticos em animais como também em sobrenadante de acetonitrila dos estudos de incubação in vitro. Para a análise em plasma, um instrumento de Packard Multiprobe foi usado para transferir 50 pL de cada padrão, QC, e amostra de plasma para uma placa de 96 cavidades limpa para extração de precipitação de proteína. Após a adição de 200 pL de acetonitrila contendo o Composto padrão interno X abaixo, as amostras foram misturadas por vórtice e o sobrenadante resultante foi separado das proteínas precipitadas através de centrifugação por 10 min. Para a análise no sobrenadante gerado dos estudos in vitro, um volume igual do sobrenadante e acetonitrila contendo o padrão interno foi misturado. Uma alíquota do sobrenadante acima foi transferida usando um manipulador de líquido Tomtec automatizado em uma segunda placa
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214/233 de 96 cavidades limpa. Um volume igual de água foi adicionado, e a placa foi tampada e misturada por vórtice.
Composto X
[00732] 4-metóxi-3-(2-oxo-2-(4-(quinazolin-4-il) piperazin-1-il)acetil)1H-pirrolo[2,3-c]piridino-7-carboxamida
[00733] O sistema de HPLC consistiu em bombas de Shimadzu LC10ADvp (Columbia, MD) e uma auto-amostragem de HTC PAL (Leap Technologies, Cary, NC) ligada a uma coluna analítica Phenomenex Synergi Fusion-RP (2,0 x 50 mm, 5 g; Torrance, CA). Fase móvel A consistiu em 5 mM de formato de amônio em água; fase móvel B foi 100% de acetonitrila. Taxa de fluxo de LC foi 0,4 mL/min. A composição de fase móvel inicial foi 3% de B, elevada para 60% de B por 1,75 min e mantida por 0,5 min, elevada para 100% de B por 0,1 min e mantida por 0,5 min, retornada para condições iniciais no próximo 0,1 min, e reequilibrada. Tempo de análise total foi 4,0 min. O tempo de retenção para Icb, IVc e Composto X foi 1,2, 1,7 e 1,6 min, respectivamente.
[00734] O sistema de HPLC foi interfaceado com um espectrômetro de massa de quadruplo triplo Sciex API4000 (Toronto, Canadá) equipado com a fonte de Turboionspray ajustada em 550° C e a voltagem de pulverização de íon ajustada em 4,5 kV. Nitrogênio de UHP foi usado como nebulizador e gás auxiliar com a pressão de 80 psi (5,62 kg/cm2) e 7 L/min, respectivamente. As energias de colisão para Icb,
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IVc e Composto X foram 23, 29 e 37 volts, respectivamente. Aquisição de dados utilizou monitoramento de reação selecionado (SRM). Íons que representam o modo de íon positivo (espécies de M+H)+ para Icb, IVc e o padrão interno foram selecionados em MS1 e com colisão dissociados com nitrogênio e otimizados com energias de colisão para formar íons de produto específico subseqüentemente monitorados por MS2. As transições de SRM para Icb, IVc e Composto X foram m/z 584 486, 474 256 e 460 218, respectivamente.
[00735] Curvas padrão variando de 5 nM a 10 pM foram preparadas de soluções de matéria-prima e serialmente diluídas em matriz para Icb e IVc. Curvas padrão foram aliquotadas em duplicata, extraídas com as amostras e injetadas no princípio, meio e fim da seqüência analítica. As curvas padrões foram providas com uma regressão linear ponderada através de concentração 1/x2 recíproca. Dados e picos cromatográficos foram processados e as concentrações dos padrões e desconhecidos foram quantificadas usando PEBiosystems Analyst®
1.1.
METODOS IN VITRO (1) ESTABILIDADE DE Icb EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCl
[00736] A estabilidade de Icb foi estudada em sangue fresco e soro de rato, cachorro, macaco e ser humano (n = 2). O sangue foi colhido em tubos de vácuo contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). O soro foi colhido em tubos de vácuo não contendo nenhum anticoagulante. Icb foi incubado a uma concentração de partida de cerca de 10 pM a 90 min a 37° C. Amostras seriais foram tiradas nos momentos predeterminados. Alíquotas de amostras de sangue (200 pL) foi primeiro misturada com 100 pL de água seguido por 400 pL de acetonitrila. As amostras de soro (50 pL) foram adicionadas em microrecipientes contendo K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)
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216/233 seguido pela adição de 100 pL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Icb e IVc por LC/MS/MS.
[00737] A estabilidade de Icb foi também avaliada, como descrita acima, em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5).
(2) HIDRÓLISE DE ICB NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00738] ALP Placentária Humana sólida foi obtida de Sigma (P3895, St. Louis, MO). Uma solução de 1000 unidades/L foi preparada em tampão de Tris-HCl (0,1 M, pH 7,5). Soluções de 100 e 10 unidades/L foram obtidas por diluição serial. Icb foi incubado nas soluções de 10, 100 e 1000 unidades/L (n = 2) a 37° C por 2 h. A concentração de partida de Icb na incubação foi 10 pM. Alíquotas de amostras 100 pL foram tiradas em tempos predeterminados e adicionadas em microrecipientes de K2EDTA seguida pela adição de 200 pL de acetonitrila. O sobrenadante foi analisado para Icb e IVc por LC/MS/MS.
(1) ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00739] Ratos de Sprague-Dawley (300-350 g, Hilltop Lab Animals, Inc., Scottsdale, PA) com cânulas implantadas na veia jugular foram usados. Os ratos foram jejuados durante a noite nos estudos farmacocinéticos de PO. As amostras de sangue foram colhidas da veia jugular.
[00740] No estudo de IV, Icb foi liberado a 1,4 mg/kg (ácido livre, ou 1,1 mg/kg de equivalente de IVc) como um bolo por 0,5 min (n = 3). A concentração da solução de doseamento foi 1,4 mg/ml, e o volume de doseamento foi 1 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 2, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00741] No estudo de PO, Icb foi administrado a 6,9 mg/kg (ácido livre ou 5,6 mg/kg de equivalente de IVc) através de gavagem oral (n =
3). A concentração da solução de doseamento foi 1,4 mg/ml, e o volu
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217/233 me de doseamento foi 5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(2) ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00742] Os estudos de IV e PO de Icb foram conduzidos em uma maneira cruzada em três cachorros beagles (12 ± 2,8 kg, Marshall Farms USA Inc., Norths Rose, NY). Houve um período de lavagem de duas semanas entre os estudos de IV e PO.
[00743] No estudo de IV, Icb foi infundido por meio da veia cefálica a 1,3 mg/kg (ácido livre, ou 1,0 mg/kg de equivalente de IVc) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de doseamento foi 2,6 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e a 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00744] No estudo de PO, os cachorros foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Icb foi administrado através de gavagem oral a 6,0 mg/kg (ácido livre, ou 4,9 mg/kg de equivalente de IVc). A concentração da solução de doseamento foi 12 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(3) ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00745] Os estudos de IV e PO de Icb foram conduzidos em uma maneira cruzada em três macacos cinomólogos (10 ± 1,6 kg, Charles River Biomedical Research Foundation, Houston, TX). Houve um período de lavagem de duas semanas entre os estudos de IV e PO.
[00746] No estudo de IV, Icb foi infundido por meio da veia femoral a 1,4 mg/kg (ácido livre ou 1,1 mg/kg de equivalente de IVc) por 5 min a uma taxa constante de 0,1 mL/kg/min. A concentração da solução de
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218/233 doseamento foi 2,8 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas da artéria femoral antes do doseamento e a 5, 10; 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
[00747] No estudo de PO, os macacos foram jejuados durante a noite antes do doseamento. Icb foi administrado através de gavagem oral a 4,9 mg/kg (ácido livre, ou 4,0 mg/kg de equivalente de IVc). A concentração da solução de doseamento foi 9,8 mg/ml, e o volume de doseamento foi 0,5 mL/kg. Amostras de sangue seriais foram colhidas antes do doseamento e a 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h após doseamento.
(4) ANÁLISE DE DADOS
[00748] Todos os resultados são expressos como ± SD médio, a menos que do contrário especificado.
[00749] Os parâmetros farmacocinéticos de Icb e IVc foram calculados por Análise Não-Compartimental usando o programa de software de KMETICA® (versão 4.0.2, InnaPhase Co., Filadélfia, PA). Os valores de Cmax e Tmax foram registrados diretamente a partir de observações experimentais. Os valores de AUC0-n e AUCtot foram calculados usando as adições trapezóides log-lineares misturadas. A liberação de corpo total (Cl), tempo de permanência médio (MRT) e o volume de estado constante de distribuição (Vss) foram também calculados após administração intravenosa. A biodisponibilidade oral absoluta (expressa como%) foi estimada tirando a razão de valores de AUC normalizados em dose para doses orais para aquelas após doses intravenosas.
[00750] A liberação intrínseca in vitro de Icb em hepatócitos (Clint) foi calculada como segue:
Clint (pL/min/milhões de células) = Taxa/CE onde Taxa é a taxa de metabolismo em hepatócitos (pmol/min/milhões de células) e Ce é a concentração de Icb na incubação.
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219/233
[00751] A liberação hepática intrínseca in vivo de Icb (Chntin vivo) foi calculada como segue:
Clini-ãvivD (mUmin/kg) = Glin, x 120 (milhões de células) x y q de fiqado x 1 .
g de fígado kg do peso do corpo 1000 onde χ é 40, 32, 30 e 26 g de fígado/kg do peso do corpo para o rato, cachorro, macaco e ser humano, respectivamente (Davis e Morris, 1993).
[00752] A liberação hepática CIh foi calculada da equação a seguir usando o modelo bem agitado:
CIh (mUmin/kg) = Qh x Cl.inr invivn
Qb + Cl.jnt. |'n VÍVO onde Qh é o fluxo sangüíneo do fígado de 55, 31, 44 e 21 mL/min/kg para o rato, cachorro, macaco e ser humano, respectivamente (Davis e Morris, 1993).
[00753] A razão de extração hepática (ER) foi calculada como segue:
ER = CIH/Qh
[00754] O teste t Student foi usado para análise estatística (Microsoft® Excel, Redmond, WA). Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas no nível de P < 0,05.
ESTUDOS IN VITRO
ESTABILIDADE DE Icb EM SANGUE DE EDTA, SORO E TAMPÃO DE TRIS-HCI
[00755] Como parte da validação de ensaio analítico, a estabilidade de Icb foi estudada em sangue contendo EDTA que é conhecido ser um inibidor de fosfatases alcalinas (Bowers, Jr. e McComb, 1966; Yora e Sakagishi, 1986). Incubação a 37° C por 90 min foi menos de 2% de conversão de Icb para IVc em sangue contendo EDTA e na presença de tampão de Tris-HCl (Tabelas 39 e 40). Sob a condição de armazenamento de amostra de -20° C, as porcentagens pequenas de conver
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220/233 são acima observadas a 37° C não são esperadas introduzir qualquer conversão significativa ex vivo durante a análise de Icb.
TABELA 39: ESTABILIDADE DE Icb NO SANGUE DE EDTA FRESCO DE RATO, CACHORRO E MACACO
Tempo (min) Sangue de rato (n = 2) Sangue de Cachorro (n = 2) Sangue de macaco (n = 2)
Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado *
0 12 0,21 1,7 10 0,087 0,72 12 0,26 2,2
15 11 0,26 2,2 10 0,087 0,72 12 0,17 1,4
30 15 0,37 3,1 9,4 0,087 0,72 11 0,16 195 1,4
45 14 0,38 3,2 11 0,10 0,76 12 0,19 1,6
60 14 0,41 3,4 11 0,10 0,84 11 0,19 1,6
90 12 0,39 3,3 11 0,11 0,91 11 0,19 1,5
* Porcentagem formada como a concentração de partida de Icb
TABELA 40: ESTABILIDADE DE Icb NO SANGUE DE EDTA FRESCO
DE SER HUMANO E TAMPÃO DE TRIS-HCl
Tempo (min) Sangue humano (n =2) Tampão de Tris-HCl (n = 2)
Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado * Ibb (μΜ) Ivb Formado (μΜ) % de IVb Formado *
0 11 0,083 0,69 11 0,17 1,5
15 11 0,088 0,74 11 0,18 1,5
30 13 0,091 0,76 11 0,23 1,9
45 12 0,10 0,80 11 0,24 2,0
60 11 0,092 0,76 10 0,26 2,2
90 11 0,091 0,76 11 0,30 2,5
* Porcentagem formada como a concen tração de partida de cb
[00756] Para investigar a hidrólise de Icb na circulação sistêmica, Icb foi incubado em soro fresco (rato, cachorro, macaco e ser humano) a 37° C por 90 min. A taxa de hidrólise foi muito rápida no soro de ma
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221/233 caco, seguido por soros de rato, humano e cachorro (Tabela 41). A conversão de Icb para IVc foi quase estequiométrica.
[00757] Soro contém atividades de ALP inferiores quando comparado aos tecidos (McComb et al., 1979a). Além disso, soro também contém isoformas de ALP de fontes de tecido como osso, fígado e intestino, como resultado de vazamento de enzima através dos vasos sanguíneos (Moss, 1983). Portanto, a hidrólise de Icb em soro foi provavelmente mediada por isoformas múltiplas de ALP.
TABELA 41: ESTABILIDADE DE Icb NO SORO FRESCO DE RATO,
CACHORRO, MACACO E SER HUMANO
Tempo (min) Soro de rato (n = 2) Soro de Cachorro (n = 2) Soro de macaco (n = 2) Soro humano (n = 2)
Ibb (pM) Ivb Formado (pM) Ibb (pM) Ivb Formado (pM) Ibb (pM) Ivb Formado (pM) Ibb (pM) Ivb Formado (pM)
0 7,6 0,23 10 0,046 9,3 0,15 10 0,087
15 6,5 1,4 9,7 0,52 7,1 2,4 8,8 1,2
30 4,9 3,4 9,1 1,5 4,5 4,8 7,7 2,7
45 4,4 5,6 8,5 2,3 3,3 7,2 6,6 3,9
60 3,4 7,1 8,1 3,0 2,3 8,4 5,9 4,6
90 2,1 8,7 6,9 4,0 1,1 9,6 4,7 6,1
t1/2 (min)* 42 156* 30 89
* Calcu ado como o desaparecimento de Icb. ** As meia-vidas são maiores que o período de incubação.
HIDRÓLISE DE Icb NA PRESENÇA DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
[00758] Para estudar a hidrólise de Icb em uma forma purificada de ALP humana, Icb foi incubado a 37° C (2 h) com soluções contendo ALP Placentária Humana (10, 100 e 1000 unidades/L). A t1/2 de desaparecimento de Icb foi determinada (Tabela 42). Como esperado, a taxa de hidrólise foi mais rápida nas soluções com atividades de ALP mais altas. IVc foi também formado conseqüentemente (Fig. 20). Isto indica que Icb é hidrolisado pela ALP derivada de ser humanos para formar IVc.
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TABELA 42: HIDRÓLISE DE Icb EM SOLUÇÕES DE ALP PLACENTÁRIA HUMANA
Atividade de ALP (Unidades/L) (n = 2)
10 10 1000
t1/2 (min) 250 29 2,4
Nota: Icb foi incubado a uma concentração de partida de 10 pM a 37° C por 120 min.
ESTUDOS IN VIVO
ESTUDOS IN VIVO NO RATO
[00759] Os parâmetros farmacocinéticos de Icb e IVc em ratos após administração IV e oral de Icb estão resumidos na Tabela 43. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 21. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVc em ratos são também mostrados.
[00760] A liberação de corpo total (Cl) de Icb seguindo administração de IV foi 49 mL/min/kg, sugerindo que Icb é um composto de liberação alta em ratos. A meia-vida de eliminação (ti/2) e o tempo de permanência médio (MRT) após administração de IV foram 0,084 h e 0,072 h, respectivamente. O volume de distribuição de Icb em estado constante (Vss) foi 0,21 L/kg, sugerindo distribuição de tecido muito limitada. A formação de IVc de Icb após administração de IV foi rápida; IVc foi detectado no primeiro ponto de tempo de amostragem de 2 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVc formada de Icb vs. estudo de IVc histórico foi 1,0 (valor teórico para conversão completa = 1), sugerindo conversão completa de Icb em IVc.
[00761] Icb não foi detectado (LLQ = 5 nM) em quaisquer amostras de plasma após administração oral. A Tmax de IVc após administração oral de Icb foi 0,80 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVc de 4,0 h indicando absorção mais rápida de IVc seguindo a administração oral do pró-medicamento. A absorção mais rápida de IVc do prómedicamento é provavelmente o resultado de solubilidade aquosa me
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Ihor de Icb como também hidrólise rápida de Icb para formar IVc no intestino. A biodisponibilidade oral absoluta de IVc de Icb foi 80%, similar ao valor de IVc histórico de 82% (Tabela 43). Além disso, a exposição de IVc do rato de Icb estudo de escalação de dose oral foi superior quando comparada aos dados históricos com IVc (Tabela 37 e Fig. 18). [00762] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVc formados de Icb são similares aos perfis de IVc históricos (Fig. 21). TABELA 43: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Icb E IVc SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IV E IVb NO RATO (±SD Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Ibb (03-002) IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,4 ácido livre ou 1,1 de eqv de IVc 1
AUCtot (gM*h) 0,84 ± 0,24 30 ± 4,1 27 ± 4,0
CLtot (mL/min/kg)) 49 ± 12 NA 1,3 ± 0,19
t % (H) 0,084 ± 0,012 2,9 ± 0,14 4,3 ± 1,1
MRT (h) 0,072 ± 0,008 NA 4,5 ± 0,77
Vdss (L/kg) 0,21 ± 0,033 NA 0,36 ± 0,098
Razão de AUC de IVb de IV NA 1,0* NA
PO
Dose (mg/kg) 6,9 ácido livre ou 5,6 de eqv de IVc 5
Tmax (h) ND 0,80 ± 0,30 4,0
Cmax (gM) ND 23 ± 0,60 13 ± 3,6
C-24 h (gM) ND 0,14 ± 0,063 0,19 ±0,048
AUCtot (gM*h) ND 122 ± 17 111± 25
T % (H) ND 3,1 ± 0,42 3,0 ± 0,28
Biodisponibilidade ND 80**82 82
Razão de AUC de IVb de PO NA 0,98* NA
NA - não aplicável; ND - não detectado (< 5 nM).
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224/233 * As razões foram calculadas de AUC de IVc após doseamento de prómedicamento/AUC de IVc após doseamento de IVc para IV e PO, respectivamente.
** Calculado de dados de IV históricos de IVc
ESTUDOS IN VIVO NO CACHORRO
[00763] Os parâmetros farmacocinéticos de Icb e IVc em cachorros após administração IV e oral de Icb estão resumidas na Tabela 44. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 22. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVc em cachorros são também mostrados.
[00764] O Cl de Icb após administração de IV foi 64 mL/min/kg, significativamente mais alto que o fluxo sangüíneo de fígado de 31 mL/min/kg em cachorros, e sugere o envolvimento de hidrólise extrahepática e/ou outra(s) via(s) de eliminação (e.g., excreção renal). A t1/2 e MRT após administração de IV foram 0,25 h e 0,14 h, respectivamente. Icb não foi detectado além de 2 h. O Vss de Icb foi 0,50 L/kg, sugerindo baixo potencial para distribuição de tecido. A formação de IVc de Icb após administração de IV foi rápida; IVc foi detectado no primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVc formado de Icb vs. estudo de IVc histórico foi 0,67, sugerindo conversão moderada de Icb para IVc em cachorros após administração de IV.
[00765] Icb não foi detectado (LLQ = 5 nM) em quaisquer amostras de plasma após administração oral. A Tmax de IVc após administração oral de Icb foi 0,58 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVc de
1,3 h indicando absorção mais rápida de IVc seguindo a administração oral do pró-medicamento. A biodisponibilidade oral absoluta de IVc de Icb foi 104%, similar aos dados de IVe históricos de 89%. Além disso, a exposição de IVc do estudo de tolerabilidade de Icb em cachorro (escalação de dose) foi melhor quando comparada aos dados históri
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225/233 cos com IVc (Tabela 41 e Fig. 21).
[00766] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVc formados de Icb são similares para os perfis de histórico de IVc (Fig. 22).
TABELA 44: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Icb E IVc SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO ORAL DE IV DE Icb NO CACHORRO (±SD Médio, n = 3)
Parâmetros de PK Ibb (03-002) IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,28 ácido livre ou 1,04 de eqv de IVc 1
AUCtot ^M*h) 0,61 ± 0,20 9,8 ± 3,6 14 ± 2,5
CLtot (mL/min/kg)) 64 ± 18 NA 2,6 ± 0,46
t (H) 0,25 ± 0,10 4,1 ± 0,54 4,6 ± 1,7
MRT (h) 0,14 ± 0,021 NA 6,3 ± 1,9
Vdss (L/kg) 0,50 ± 0,088 NA 0,93 ± 0,14
Razão de AUC de IVb de IV NA 0,67* NA
PO
Dose (mg/kg) 6,05 ácido livre ou 4,92 de eqv de IVc. 5
Tmax (h) ND 0,58 ± 0,38 1,3 ± 0,58
Cmax ^M) ND 16 ± 3,9 9,6 ± 0,87
C-24 h (gM) ND 0,22 ± 0,16 0,15 ± 0,027
AUCtot ^M*h) ND 72 ± 27 63 ± 2,4
T % (H) ND 4,2 ± 0,58 3,6 ± 0,42
Biodisponibilidade ND 104** 89 ± 12
Razão de AUC de IVb de PO NA 1,2* NA
* As razões foram calculadas de AUC de IVc após doseamento de prómedicamento/AUC de IVc após doseamento de IVc para IV e PO, resPetição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 229/244
226/233 pectivamente.
** Calculado de dados de IV históricos de IVc
ESTUDOS IN VIVO NO MACACO
[00767] Os parâmetros farmacocinéticos de Icb e IVc em macacos seguindo administração IV e oral de Icb estão resumidos na Tabela 45. Os perfis de concentração de plasma versus tempo estão mostrados na Figura 23. Para comparação, os dados históricos dos estudos farmacocinéticos de IVc em macacos são também mostrados.
[00768] A Cl de Icb após administração de IV foi 47 mL/min/kg, similar ao fluxo sangüíneo de fígado de 44 mL/min/kg em macacos, sugerindo que Icb é um composto de liberação alta em macacos. A t1/2 e MRT após administração de IV foram 0,089 h e 0,097 h, respectivamente. O Vss de Icb foi 0,27 L/kg, sugerindo distribuição de tecido limitada. A formação de IVc de Icb após administração de IV foi rápida; IVc foi detectado no primeiro ponto de tempo de amostragem de 5 min (dados não mostrados). A razão de AUC de IV de IVc formado de Icb vs. estudo de IVc histórico foi 0,90, sugerindo conversão boa de Icb em IVc.
[00769] Icb não foi detectado (LLQ = 5 nM) em quaisquer amostras de plasma após administração oral. A Tmax de IVc após administração oral de Icb foi 0,92 h que é mais curta que a Tmax histórica de IVc de
2,3 h indicando absorção mais rápida de IVc seguindo a administração oral do pró-medicamento. A biodisponibilidade oral absoluta de IVc de Icb foi 122% que é mais alta que os dados de IVc históricos de 64% (Tabela 45).
[00770] Os perfis de concentração de plasma terminal vs. tempo de IVc formados de Icb são similares aos perfis de IVc históricos (Fig. 23). TABELA 45: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DE Icb E IVc SEGUINDO ADMINISTRAÇÃO IV E ORAL DE Icb NO MACACO (± SD Médio, n = 3)
Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 230/244
227/233
Parâmetros de PK Ibb (03-002) IVb formado após doseamento com Ibb IVb histórico
IV
Dose (mg/kg) 1,4 ácido livre ou 1,1 de eqv. de IVc 1
AUCtot (qM*h) 0,87 ± 0,14 5,0 ± 0,57 5,0 ± 1,0
CLtot (mL/min/kg)) 47 ± 8,1 NA 7,5 ± 1,5
t % (H) 0,089 ± 0,031 1,2 ± 0,63 0,92 ± 0,30
MRT (h) 0,097 ± 0,003 NA 0,87 ± 0,085
Vdss (L/kg) 0,27 ± 0,043 NA 0,40 ± 0,097
Razão de AUC de IVb de IV NA 0,90* NA
PO
Dose (mg/kg) 4,9 ácido livre ou 4,0 de eqv. de IVc 5
Tmax (h) ND 0,92 ± 0,14 2,3 ±1,5
Cmax (qM) ND 9,5 ± 102 4,2 ± 2,6
C-24 h (qM) ND 0,007 ± 0,002 0,017 ± 0,011
AUCtot (qM*h) ND 24 ± 4,6 14 ± 4,0
T % (H) ND 3,2 ± 0,37 3,3 ± 0,53
Biodisponibilidade ND 122** 64 ± 29
Razão de AUC de IVb de PO NA 2,1* NA
* As razões foram calculadas de AUC de IVc após doseamento de prómedicamento/AUC de IVc após doseamento oral para IV e PO, respectivamente.
** Calculado de dados de IV históricos de IVc
SEÇÃO DE PERFILAÇÃO ADICIONAL 4:
ESTUDOS ADICIONAIS COM PRÓ-FÁRMACO Ie
[00771] Pró-fármaco Ie foi oralmente dosado em ratos usando metodologia similar à descrita acima para os outros pró-fármacos. Seguindo doseamento de PO, molécula de origem Ive foi detectada no plasma.
SEÇÃO DE PERFILAÇÃO ADICIONAL 5:
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228/233
ESTUDOS ADICIONAIS COM PRÓ-FÁRMACO If
[00772] Pró-fármaco If foi oralmente dosado em ratos usando metodologia similar à descrita acima para os outros pró-fármacos. Seguindo doseamento de PO, a molécula de origem IVf foi detectada no plasma.
[00773] A Tabela 47 a seguir mostra os dados contidos de estudos de doseamento orais em ratos como descritos nas seções de perfila ção adicionais 4 e 5.
Composto dosado If le lle lle
Detalhes e estrutura do Composto dosado Pró-fármaco de fosfato IVf PO 1,3 mg/kg (IVfeq) PK deIVfapenas Pró-fármaco de fosfato IVe PO 6,0 mg/kg (IVeeq) PK de IVfapenas Pró-fármaco de monoéster de IVe PO 6,0 mg/kg (IVeeq) PK de IVe apenas cAo Pró-fármaco de diéster de IVe PO 7,0 mg/kg (Ive eq) PK de IVe apenas
O1 J'S? ft g*
Cmax (pM) 2960±859 10058±2755 4678±3295 1545±332
Tmax(h) 1,3±0,66 0,58±0,14 0,92±0,95 3,3±1,2
F (%) (calc. em dados de IV históricos para origem) 91 28 11 7,7
AUC 0-24h (pM*H) 12,5±5,1 22±6,3 8,7±2,7 6,9±1,8
Cp @ 24h p.o. (nM) nada detectado 53,9(1/3 ratos) nada detectado 8,17 (1/3 ratos)
CL i.v (ml/min/kg) Sem IV Sem IV Sem IV Sem IV
Vss i.v. (L/kg) Sem IV Sem IV Sem IV Sem IV
T1/2 i.v. (h) 1,9±0,66
T1/2 p.o.(h) não IV não IV não IV não IV
00774] Nota sobre a detecção de pró-fármacos em plasma e outros tecidos. Uma vez que uma forma de sal de um pró-fármaco é administrada, entende-se que no corpo, a mistura do sal pode ocorrer. Porém os ensaios usados para quantificar os pró-fármacos nos modelos ani mais em questão detectam por análise o ácido livre do fosfato. Consi
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229/233 dera-se que esta análise por exemplo de um sal de lisina Iab ou um ácido livre Iac seja uma análise para as mesmas espécies e não implica que as espécies detectadas fossem de fato o sal de lisina. Neste pedido de patente, esta convenção aplica-se às amostras obtidas de estudos in vivo e amostras apenas.
BIOLOGIA • μΜ significa micromolar;
• ml significa mililitro;
• μυ' significa microlitro;
• mg significa miligrama;
• DMSO significa dimetilsulfóxido
[00775] Os materiais e procedimentos experimentais usados para analisar a atividade anti-HIV dos compostos de origem que são gerados dos pró-fármacos in vivo são descritos abaixo:
CÉLULAS:
• A linhagem de células de T humanas MT-2 e PM1 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health) foi mantida e propagada em Meio de RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), contendo 10% de soro bovino fetal. (FBS, Sigma, St. Louis, MO).
VÍRUS:
• CEPAS DE LABORATÓRIO DE HIV-1 - a cepa T-trópica LAI foi obtida através de AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Health. Ela foi amplificada em células de MT-2 e tituladas usando um ensaio de rendimento de vírus (2). Detecção foi alcançada através do uso de um ensaio de transcriptase reversa (3), adaptado para o uso com um protocolo de detecção de Cintilação Proximidade (1) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). EXPERIMENTO
1. Matérias-primas dos compostos foram preparadas dis
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230/233 solvendo em DMSO a 30 mm. Para placas de diluição, os compostos foram serialmente diluídos 3 vezes em DMSO, usando placas de polipropileno de 96 cavidades, de forma que as concentrações foram 100 vezes maiores que a concentração de ensaio de final. Para ensaios antivirais e de citotoxicidade, 2 pl foram adicionados por cavidade (1% de concentração final de DMSO).
2. Os compostos foram adicionados das placas de diluição às placas de cultura de tecido de 96 cavidades, contendo 100 pl de Meio de RPMI-1640, contendo 10% de soro bovino fetal a uma concentração de < 20 pM.
3. Para ensaios antivirais, células foram infetadas a uma multiplicidade de infecção de 0,005. Após 1 h a 37°C, células infetadas foram diluídas a 200.000 células por ml em Meio de RPMI-1640, contendo 10% de soro bovino fetal. 100 pl desta solução foram adicionados por cavidade, dando um volume final de 200 pl.
4. As placas foram incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2 umedecida e foram colhidas após 5 dias.
5. Infecções virais foram monitoradas medindo atividade de transcriptase reversa nos sobrenadantes de cavidades infetadas como descrito acima. A porcentagem de inibição para cada composto foi calculada quantificando o nível de estágio de leitura em células infetadas na presença de cada composto como uma porcentagem daquela observada para células infetadas na ausência do composto e subtraindo um tal valor determinado de 100.
6. Um EC50 fornece um método para comparar a potência antiviral dos compostos desta invenção. A concentração eficaz para cinqüenta por cento de inibição (EC50) foi calculada com o software de ajuste de curva de Microsoft Excel Xlfit. Para cada composto, as curvas foram geradas da porcentagem de inibição calculada em 8 concentrações diferentes usando um modelo logístico de quatro parâme
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231/233 tros (modelo 205). Os dados de EC50 estão mostrados para os compostos na Tabela 48.
RESULTADOS
CHAVE DE DADOS BIOLÓGICA PARA EC50s
Compostos com EC50s> 5 pm Compostos com EC50s >1 pM mas < 5 pM Compostos com EC50 > 50 nm mas não ainda testado em concentrações mais altas Compostos com EC50 < 1 pM
Grupo C Grupo B Grupo A' Grupo A
TABELA 48. ATIVIDADE ANTIVIRAL DOS COMPOSTOS IV (MOLÉCULAS DE ORIGEM)
Composto IVa Composto IVa (sal de sódio) Composto IVa (forma de ácido) Composto IVd (forma de ácido)
EC50LAI A A A A
[00776] A atividade anti-HIV dos pró-fármacos em si não são relevantes uma vez que as moléculas de origem, como mostrado pelos estudos abaixo, são geradas dos pró-fármacos in vivo e são o ingrediente ativo e também as espécies principais no plasma. Além disso, os pró-fármacos podem lentamente se converter em origens nos ensaios in vitro pelo menos a uma extensão limitada, desse modo, complicando a interpretação dos dados antivirais.
CITOTOXICIDADE
[00777] 1. Ensaios de citotoxicidade foram conduzidos com as mesmas células MT-2, usando metodologia bem-conhecida na técnica. Este método foi descrito na literatura (4). Em resumo, células foram incubadas na presença de fármaco durante seis dias após os quais a viabilidade das células foi medida usando um ensaio de redução de
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232/233 tintura ativa de redox. 50 μΙ de reagente de XTT (1 mg/ml de grupo
2,3-bis[2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazólio-5-carboxanilida, 10 μg/ml de metossulfato de fenazina dissolvidos em solução salina tamponada de fosfato) foram adicionados a cada cavidade e incubados durante 3 horas. A formação de cor por células ativamente respirando foi quantificada em uma leitora de placa a 450 nm, e usada para determinar uma CC50. A CC50 para moléculas origem de IVa, IVb, IVc e IVd foi maior que 10 μΜ quando medida por este método. Os dados de citotoxicidade são uma grade secundária que mostra os compostos não estão não-especificamente matando as células que foram usadas no ensaio antiviral e fornecem outro suporte para a questão se os compostos possuem atividade antiviral.
[00778] Desse modo, de acordo com a presente invenção é também fornecido um método de tratar e uma composição farmacêutica para tratar infecções virais como infecção por HIV e AIDS. O tratamento envolve administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmacêutico e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção.
[00779] A composição farmacêutica pode ser na forma de suspensões ou comprimidos oralmente administráveis; pulverizações nasais, preparações injetáveis estéreis, por exemplo, como suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis ou supositórios.
[00780] Quando administradas oralmente como uma suspensão, estas composições são preparadas de acordo com técnicas bemconhecidas na técnica de formulação farmacêutica e podem conter celulose microcristalina para dar volume, ácido algínico ou alginato de sódio como um agente de suspensão, metilcelulose como um intensificador de viscosidade e agentes adoçantes/aromatizantes conhecidos na técnica. Como comprimidos de liberação imediata, estas composi
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233/233 ções podem conter celulose microcristalina, fosfato de dicálcio, amido, estearato de magnésio e lactose e/ou outros excipientes, aglutinantes, extensores, desintegrantes, diluentes e lubrificantes conhecidos na técnica.
[00781] As soluções ou suspensões injetáveis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida, usando diluentes ou solventes parenteralmente aceitáveis não-tóxicos, adequados, como manitol,
1,3-butanodiol, água, solução de Ringer ou solução de cloreto de sódio isotônica, ou agentes dispersante ou umectantes adequados e suspensão, como óleos estéreis, insípidos, fixos, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos e ácidos graxos, incluindo ácido oléico.
[00782] Os compostos desta invenção podem ser administrados oralmente em seres humanos em uma faixa de dosagem de 1 a 100 mg/kg do peso do corpo em doses divididas. Uma faixa de dosagem preferida é 1 a 10 mg/kg do peso do corpo oralmente em doses divididas. Outras faixas de dosagem preferidas são 1 a 20 mg/kg e 1 a 30 mg/kg do peso do corpo oralmente em doses divididas. Porém, será entendido que o nível de dose específico e a freqüência de dosagem podem ser variados para qualquer paciente particular e dependerão de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a estabilidade metabólica e comprimento de ação daquele composto, a idade, peso do corpo, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação do fármaco, a severidade da condição particular e a terapia que sofre o hospedeiro.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que é 1-benzoil-4[2-[4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 -[(fosfonoóxi)metil]-1 Hpirrolo [2,3-c] piridin-3-il]-1,2-dioxoetil]piperazina tendo a seguinte estrutura:
    Figure BRPI0508876B1_C0001
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 1-benzoil-4-[2-[4-metóxi-7-(3-metil-1H-1,2,4triazol-1 -il)-1 -[(fosfonoóxi)metil]-1 H-pirrolo [2,3-c] pirid in-3-i I]-1,2dioxoetil]piperazina tendo a seguinte estrutura:
    Figure BRPI0508876B1_C0002
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um sal farmaceuticamente aceitável do composto 1 -benzoil-4-[2-[4-metóxi-7-(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-1 -il)-1 - [(fosfonoóxi)metil]-1 H-pirrolo [2,3-c] piridin-3-il]-1,2-dioxoetil]piperazina, tendo a seguinte estrutura:
    Petição 870200027776, de 02/03/2020, pág. 238/244
    2/2
    Figure BRPI0508876B1_C0003
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é um sal mono trometamina (TRIS).
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
BRPI0508876A 2004-03-15 2005-03-03 1-benzoil-4-[2-[4-metóxi-7-(3-metil-1h-1,2,4-triazol-1-il)-1-[(fosfonoóxi)metil]-1h-pirrolo [2,3-c] piridin-3-il]-1,2-dioxoetil]piperazina e seus sais, bem como composição farmacêutica que os compreende BRPI0508876B8 (pt)

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