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JP2007528845A - Ｐｒｏ１０４抗体組成物および使用方法 - Google Patents

Ｐｒｏ１０４抗体組成物および使用方法 Download PDF

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JP2007528845A JP2006517742A JP2006517742A JP2007528845A JP 2007528845 A JP2007528845 A JP 2007528845A JP 2006517742 A JP2006517742 A JP 2006517742A JP 2006517742 A JP2006517742 A JP 2006517742A JP 2007528845 A JP2007528845 A JP 2007528845A
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cell
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パプコフ，ジャッキー
ピルキントン，グレン
ケラー，ギルバート−アンドレ
リ，ウェンル
コーラル，ローラ
サイモン，アイリス
メット，ムリエル
タン，ジャンウェン
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ディアデクサス インコーポレーテッド
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Abstract

本発明は、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合する、単離された、抗−卵巣癌抗原、膵臓癌抗原、肺癌抗原または乳癌抗原（Ｐｒｏ１０４）抗体を提供する。本発明はまた、抗Ｐｒｏ１０４抗体および担体を含む組成物を包含する。これらの組成物は、製造品またはキット中に提供することも可能である。本発明の他の観点は、抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードする単離核酸、および単離核酸を含む発現ベクターである。さらに提供されるのは、抗Ｐｒｏ１０４抗体を産生する細胞である。本発明は、抗Ｐｒｏ１０４抗体を産生する方法を包含する。本発明の他の観点は、癌細胞を抗Ｐｒｏ１０４抗体と接触させることを含む、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞を死滅させる方法、および、治療的に有効量の抗Ｐｒｏ１０４抗体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるＰｒｏ１０４発現癌を寛解または処置する方法である。

Description

この特許出願は、２００３年１１月１７日出願の米国仮特許出願第60/523,271号、および２００３年６月２７日出願の米国仮特許出願第60/485,346号からの優先権の利益を請求し、この各々を、この全体において、参照により本明細書中に導入する。
発明の分野
本発明は、抗Ｐｒｏ１０４抗体組成物および、Ｐｒｏ１０４を発現する癌を検出する方法およびＰｒｏ１０４を発現する乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞を死滅させる方法に関する。さらに本発明は、Ｐｒｏ１０４機能を調節することができる化合物の有効量を投与することにより、Ｐｒｏ１０４発現細胞を調節または死滅させる方法に関する。
発明の背景
乳癌
乳腺腫瘍癌とも呼ばれる乳癌は、女性の間で２番目に一般的な癌であり、米国において診断された癌の３分の１を占める。９人に１人の女性は、当該女性の生涯において乳癌を発生し、約１９２，０００の新たな乳癌の症例が毎年診断され、死者は約４２，０００人である。Bevers, Primary Prevention of Breast Cancer, in Breast Cancer, 20-54 (Kelly K Hunt et al., ed., 2001)；Kochanek et al., 49 Nat'l. Vital Statistics Reports 1, 14 (2001)。乳癌は、２０歳より若い女性においては極度にまれであり、３０歳未満の女性においては極めてまれである。乳癌の発生率は、年齢に伴って上昇し、５０歳の年齢までに顕著となる。ラテンアメリカ系ではない白人女性は、乳癌について最も高い発生率を有し、韓国の女性は最も低い発生率を有する。乳癌および他の癌を促進する遺伝子的突然変異ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の有病率の増大は、アッシュケナジジュー(Ashkenazi Jews)において見出される。アフリカ系アメリカ人女性は、これらの同一の群の中で、乳癌についての最も高い死亡率を有し（１００，０００人あたり３１人）、一方中国人女性は、１００，０００人あたり１１人の最も低い死亡率を有する。男性は乳癌を罹患し得るが、これは極度にまれである。米国においては、２００４年に、２１７，４４０件の乳癌の新しい症例および４０，５８０件の乳癌による死亡が推定されている。（アメリカ癌協会ウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web）。関連する遺伝子的要因を有する症例を除き、乳癌の正確な原因は知られていない。
乳癌の処置においては、乳癌の早期の正確なステージ分類が生存に対して顕著な影響を有するため、検出およびリスクアセスメントがかなり重要視されている。例えば、初期のステージ（ステージＴ０、以下に記載する）において検出された乳癌は、９２％の５年生存率を有する。逆に、癌が後期のステージ（即ちステージＴ４（ＩＶ））まで検出されない場合、５年生存率は１３％まで低下する。AJCC Cancer Staging Handbook pp. 164-65 (Irvin D. Fleming et al., 5th ed.1998)。いくつかの検出手法、例えばマンモグラフィーおよび生検は、不快感、費用および／または放射線の増加を伴い、増大した乳癌リスクを有する患者のみに処方されるに過ぎない。
乳癌のリスクを予測するかまたは検出するための現在の方法は、最適ではない。乳癌の相対的なリスクを予測するための１つの方法は、患者の危険因子を試験し、高リスクの患者についての攻撃的（agressive）診断および処置計画を探求することによる。患者の乳癌のリスクは、年齢の上昇、未産婦、乳癌の家族履歴、乳癌の個人的履歴、早い初経、遅い閉経、最初の満期妊娠の遅い年齢、前の増殖性乳房疾患、早い年齢での乳房の照射および悪性腫瘍の個人的履歴に正に関連している。ライフスタイル要因、例えば脂肪消費、アルコール消費、教育および社会経済的地位もまた、乳癌の発生率の増大に関連しているが、直接的な因果関係は確立されていない。これらの危険因子は、統計的に有意である一方、これらの乳癌との弱い関連により、その有用性が制限された。乳癌を発生するほとんどの女性は、加齢に伴って到来する危険以外に、上記した危険因子のいずれも有していない。NIH Publication No. 00-1556 (2000)。
癌を検出するための現在のスクリーニング方法、例えば乳房の自己検診、超音波およびマンモグラフィーは、その有効性を低下させる、またはその幅広い採用を妨げる欠点を有する。乳房自己検診は、有用である一方、腫瘍が小さく、触診により検出することが困難である初期の段階においては、乳癌の検出について信頼できない。超音波測定には、増大した費用において熟練したオペレータが必要である。マンモグラフィーは、感度が高い一方で、悪性腫瘍の可能性が疑われる病変の検出において過剰診断となりやすい。また、前の胸の照射が、乳癌発生率の増大に関連する要因であるため、マンモグラフィーにおいて用いられる照射に対する恐れも存在する。
この時点において、乳癌予防の適切な方法はない。乳癌予防の現在の方法は、予防的な乳房切除術（癌診断の前に行う乳房切除術）および化学的予防（癌診断の前の化学療法）を含み、これは、増大した乳癌リスクを有する女性の間でさえもこれらの採用が限定されるような、徹底的な手段である。Bevers、上記。
多くの遺伝子マーカーが乳癌と関連した。これらのマーカーの例には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）(Mughal et al., JAMA 249:1881 (1983))、ＭＵＣ−１(Frische and Liu, J. Clin. Ligand 22:320 (2000))、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ(Haris et al., Proc.Am.Soc.Clin.Oncology 15:A96 (1996))、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＲＡＫおよびＢＲＣＡ(Esteva and Fritsche, Serum and Tissue Markers for Breast Cancer, in Breast Cancer, 286-308 (2001))が含まれる。これらのマーカーは、限定された感度、低い相関関係および偽陰性についての問題を有し、そのためこれらの初期の診断のための使用が制限される。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子突然変異は、乳癌についての増大したリスクの指標として有用である一方、これは、乳癌のわずか６．２％がＢＲＣＡ１陽性であるため、癌診断における使用が限定される。Malone et al., JAMA 279:922 (1998)。またMewman et al., JAMA 279:915 (1998)も参照（わずか３．３％の相関関係）。
出現部位および疾患発達の程度により変化する乳癌について、４つの主な分類がある。
Ｉ．in situでの乳管癌腫（ＤＣＩＳ）：その正常な位置に残留する乳管上皮細胞の悪性形質変換。ＤＣＩＳは純粋に局所的な疾患であり、転移することはできない。
ＩＩ．侵襲性乳管癌腫（ＩＤＣ）：基底膜を突破して乳房の支持組織中に至る乳管上皮細胞の悪性腫瘍。ＩＤＣは、最終的には、身体の別の場所に拡大し得る。
ＩＩＩ．in situでの小葉癌腫（ＬＣＩＳ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を通して拡張しない悪性腫瘍、これは一般に、局所的なままである。
ＩＶ．浸潤性小葉癌腫（ＩＬＣ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を貫通して隣接する組織中に直接侵襲する悪性腫瘍。小葉壁を越えてのこの侵襲により、ＩＬＣは、リンパ管および血管に浸入し、遠位の部位に拡大し得る。
予後および処置を決定するために、これらの４つの乳癌の種類を、主な腫瘍の大きさ（Ｔ）、リンパ節の関与（Ｎ）および転移の存在（Ｍ）によりステージ分類した。定義によれば、ＤＣＩＳは局所的なステージＩの疾患を表すが、乳癌の他の形態は、ステージＩＩからステージＩＶにまでわたり得る。さらに手術的および医学的介入の指針となる、追加的な予後因子がある。最も一般的なものは、関与するリンパ節の合計数、ＥＲ（エストロゲンレセプター）状態、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター状態および組織学的階級である。
乳癌は、異なる処置が癌の異なるステージについてより有効であることを認識する適切なステージカテゴリーに診断される。ステージＴＸは、原発腫瘍が評価できない（即ち腫瘍が除去されたかまたは乳房組織が除去された）ことを示す。ステージＴ０は、過形成などの異常を特徴とするが、原発腫瘍の痕跡を伴わない。ステージＴｉｓは、in situでの腫瘍、管内癌腫、in situでの小葉癌腫または腫瘍を伴わない乳頭のパジェット病を特徴とする。ステージＴ１（Ｉ）は、最大の寸法で２ｃｍまたはこれ以下の腫瘍を有することを特徴とする。ステージＴ１内で、Ｔｍｉｃは、０．１ｃｍまたはこれ以下の微小侵襲を示し、Ｔ１ａは、０．１〜０．５ｃｍの腫瘍を示し、Ｔ１ｂは、０．５〜１ｃｍの腫瘍を示し、そしてＴ１ｃは、１ｃｍ〜２ｃｍの腫瘍を示す。ステージＴ２（ＩＩ）は、最大の寸法で２ｃｍ〜５ｃｍの腫瘍を特徴とする。大きさが５ｃｍより大きい腫瘍は、ステージＴ３（ＩＩＩ）として分類される。ステージＴ４（ＩＶ）は、胸壁または皮膚への拡張を伴う、任意の大きさの腫瘍を示す。ステージＴ４内で、Ｔ４ａは、胸壁への腫瘍の拡張を示し、Ｔ４ｂは、乳房の皮膚または同一の乳房に限定された皮膚衛星結節の浮腫または潰瘍形成を示し、Ｔ４ｃは、Ｔ４ａとＴ４ｂとの組み合わせを示し、そしてＴ４ｄは、炎症性癌腫を示す。AJCC Cancer Staging Handbook pp. 159-70 (Irvin D. Fleming et al., eds., 5th ed.1998)。標準的なステージ分類に加えて、乳房腫瘍を、これらのエストロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプタータンパク質状態により分類することができる。Fisher et al., Breast Cancer Research and Treatment 7:147 (1986)。さらなる病理学的状態、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ状態もまた、有用であり得る。Thor et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 90:1346 (1998); Paik et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 90:1361 (1998); Hutchins et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 17:A2 (1998).；およびSimpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。
原発腫瘍のステージ分類に加えて、所属リンパ節への乳癌転移もステージ分類することができる。ステージＮＸは、リンパ節を評価することができない（即ち、前に除去された）ことを示す。ステージＮ０は、所属リンパ節転移がないことを示す。ステージＮ１は、移動可能な同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ２は、互いに、または他の構造に固定された同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ３は、同側性内部乳腺リンパ節への転移を示す。同上。
ステージ決定は予後値の可能性を有し、最適な治療法を設計するための基準を提供する。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。一般に、乳癌の病理学的ステージ分類はより正確な予後を与えるため、臨床的ステージ分類より好ましい。しかし、臨床的ステージ分類は、これが病理学的ステージ分類と同等に正確であるとしたら好ましい。その理由は、これが、病理学的評価のための組織を得る侵襲性手順に依存しないからである。乳癌のステージ分類は、異なる侵襲のステージ間で区別され得る細胞、組織または体液中の新たなマーカーを検出することにより改善される。この分野における進歩により、乳癌患者を処置するための一層迅速で信頼性のある方法が可能になる。
乳癌の処置は、一般に、原発腫瘍の正確なステージ分類の後に決定される。主な処置の選択肢には、乳房保存療法（乳腺腫瘍摘出術、乳房照射および腋窩の外科的ステージ分類）並びに改善された根治的な乳房切除術が含まれる。追加の処置には、化学療法、領域性照射および極端な場合においては、卵巣切除によるエストロゲン産生の終了が含まれる。
最近まで、すべての乳癌のための一般的な処置は、乳房切除術であった。Fonseca et al., Annals of Internal Medicine 127:1013 (1997)。しかし、最近のデータは、より根治的でない手順が、初期のステージの乳癌について、生存の点において同等に有効であり得ることを示す。Fisher et al., J. of Clinical Oncology 16:441 (1998)。初期のステージの乳癌（即ちステージＴｉｓ）を有する患者についての処置の選択肢は、乳房を残す手術と、続いて乳房における局所的な放射線療法であり得る。代替的に、乳房切除術を随意に放射線または乳房再構成と組み合わせて用いることができる。これらの処置方法は、乳癌の初期ステージにおいて同等に有効である。
ステージＩおよびステージＩＩの乳癌を有する患者には、化学療法および／またはホルモン療法を伴う手術が必要である。手術は、ステージＩＩＩおよびステージＩＶの患者においては有用性が限定される。従って、これらの患者は、化学療法および放射線療法の良好な候補であって、手術は初めのステージ分類またはその後の再ステージ分類を可能にするための生検に限定されるが、その理由は、疾患のこのステージにおいて、癌がほとんど治癒的ではないためである。AJCC Cancer Staging Handbook 84, 164-65 (Irvin D. Fleming et al., eds., 5th ed. 1998)。
患者により多くの処置の選択肢を提供する努力において、再発性が低く、術後の放射線処置を伴わない乳腺腫瘍摘出術での処置が可能な、初期ステージの乳癌を明確にする努力が進行中である。多くの試行が、初期ステージの乳癌を分類するためになされている一方、術後の放射線処置に対する一致した提言は、これらの研究からは得られていない。Page et al., Cancer 75:1219 (1995); Fisher et al., Cancer 75:1223 (1995); Silverstein et al., Cancer 77:2267 (1996)。
卵巣癌
卵巣の癌は、米国における女性の癌死亡の４番目に一般的な原因であり、２３，０００を超える新たな症例および約１４，０００人の死亡が２００１年について予測される。Shridhar, V. et al., Cancer Res. 61(15): 5895-904 (2001); Memarzadeh, S. & Berek, J. S., J. Reprod. Med. 46(7): 621-29 (2001)。米国癌学会は、米国のみにおいて、２００４年に約２５，５８０の新たな症例を予測する。卵巣癌は、米国において約１６，０９０人の死亡の原因となるであろう。ＡＣＳウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web。卵巣癌の発生率は世界的に重大な関心事であり、１９１，０００と概算される新たな症例が毎年予測される。Runnebaum, I. B. & Stickeler, E., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127(2): 73-79 (2001)。不都合なことに、卵巣癌を有する女性は通常、疾患が転移するまで無症候性である。卵巣癌についての有効なスクリーニングが利用可能ではないため、診断された女性の約７０％が進行したステージの癌を有し、５年生存率は約２５〜３０％である。Memarzadeh, S. & Berek, J. S., 上記；Nunns, D. et al., Obstet. Gynecol. Surv. 55(12): 746-51。逆に、初期のステージの卵巣癌を有すると診断された女性は、顕著により高い生存率を享受している。Werness, B. A. & Eltabbakh, G. H., Int'l. J. Gynecol. Pathol. 20(1): 48-63 (2001)。
本発明者らの卵巣癌の病因論の理解は不完全であるが、この領域における大規模な研究の結果は、年齢、遺伝的特徴、生殖的および食事性／環境的要因の組み合わせを指摘している。年齢は、卵巣癌の発生における重要な危険因子である：３０歳前の卵巣癌の発生についてのリスクは低い一方、卵巣癌の発生率は、３０〜５０歳の間に直線的に上昇し、その後より遅い速度で上昇し、最高の発生率は、７０歳代の女性である。Jeanne M. Schilder et al., Heriditary Ovarian Cancer: Clinical Syndromes and Management, in Ovarian Cancer 182 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。
遺伝的要因に関して、卵巣癌の家族履歴は、当該疾患の発生における最も重要な危険因子であり、当該リスクは、罹患した家族の数、該家族の該女性に対する親等に依存し、特に第１度近親者は当該疾患により影響される。同上。いくつかの遺伝子における突然変異は卵巣癌に関連しており、これには、両者共に乳癌の発生において重要な作用を奏しているＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、並びに両者共に遺伝性非ポリープ症結腸癌と関連しているｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１が含まれる。Katherine Y. Look, Epidemiology, Etiology, and Screening of Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 169, 171-73 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。染色体１７上に位置するＢＲＣＡ１および染色体１３上に位置するＢＲＣＡ２は、ＤＮＡ修復に関係する腫瘍抑制遺伝子であり；これらの遺伝子における突然変異は、卵巣癌の約１０％と関連する。同上の171-72; Schilder et al., 上記の185-186。ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１は、ＤＮＡミスマッチ修復に関連し、それぞれ染色体２および３上に位置する；遺伝性卵巣癌腫の約３％は、これらの遺伝子における突然変異のためであると報告されている。Look,上記の173 ；Schilder et al.,上記の184, 188-89。
生殖的要因はまた、卵巣癌のリスクの増加または低下と関連している。遅い閉経、未産婦および早い年齢の初経は、すべて、卵巣癌のリスクの上昇と関連している。Schilder et al., 上記の182。１つの理論の仮説によれば、これらの因子により女性の一生において排卵サイクルの数が増大し、「絶え間のない排卵」がもたらされるとし、これは、卵巣上皮に対する突然変異の主要な原因であると考えられる。同上；Laura J. Havrilesky & Andrew Berchuck, Molecular Alterations in Sporadic Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 25 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。突然変異は、排卵の結果当該上皮の破壊および修復が生じ、細胞分裂の増加が必要となるという事実によって説明することができ、これにより、検出されない突然変異が生じる可能性が増加する。同上。この理論についての支持は、妊娠、授乳および経口避妊薬の使用はすべて排卵を抑制するが、これらは卵巣癌の発生に関する防御効果を付与するという事実において見出すことができる。同上。
食事性／環境的要因の中で、動物性脂肪または赤肉の多量の摂取と卵巣癌との間に、関連があると見られる一方、遊離基形成を防止し、また正常な細胞分化を維持するのを補助する酸化防止剤のビタミンＡは、防御効果を提供し得る。Look, 上記の169。報告はまた、アスベストおよび含水三ケイ酸マグネシウム（タルク）に関連しており、この後者は、隔壁および生理用ナプキン中に存在し得る。同上の169-70。
卵巣癌についての現在のスクリーニング手順は一定の有用性を示す一方で、これらの診断的能力において極めて限定されており、疾患が典型的にまだ無症候性である、癌進行の初期ステージにおいて特に緊急である問題が、最も容易に対処される。Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 166 (1998); Memarzadeh & Berek, 上記；Runnebaum & Stickeler, 上記；Werness & Eltabbakh, 上記。一般的に用いられているスクリーニング試験には、年２回の直腸膣内診、ＣＡ−１２５血清腫瘍マーカーを検出するためのラジオイムノアッセイおよび経膣的超音波検査が含まれる。Burdette, 上記の166。
内診では初期の診断の適切な数が得られておらず、他の方法は十分正確ではない。同上。１つの研究により、卵巣癌を罹患している患者のわずか１５％が、当該患者の内診の時点において疾患を有すると診断されたことが報告された。Look, 上記の174。さらに、ＣＡ−１２５試験は、閉経前の女性において偽陽性を示す傾向があり、閉経後の女性において予測的価値が低いことが報告された。同上の174-75。経膣的超音波検査は、現在では、卵巣癌をスクリーニングするための好ましい手順であるが、良性および悪性の腫瘍を高い信頼性で識別することはできず、また卵巣の大きさが正常である場合には、原発腹膜悪性腫瘍または卵巣癌を発見することができない。Schilder et al., 上記の194-95。ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１遺伝子の突然変異についての遺伝子診断は現在利用可能であるが、これらの試験は、一部の患者に対しては費用がかかりすぎることがあり、また偽陰性の、または不確定な結果を生じ得る。Schilder et al., 上記の191-94。
他の関連するマーカーは、ＨＥ４およびメソセリン(mesothelin)である。Urban et al. Ovarian cancer screening Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug;17(4):989-1005; Hellstrom et al.「ＨＥ４（ＷＦＤＣ２）タンパク質は卵巣癌についての生物マーカーである」[The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma]、Cancer Res. 2003 Jul 1;63(13):3695-700; Ordonez, 「腫瘍診断におけるメソセリン免疫染色の適用」[Application of mesothelin immunostaining in tumor diagnosis]、Am J Surg Pathol. 2003 Nov;27(11):1418-28を参照。
手術的探索により達成された卵巣癌のステージ分類は、当該疾患の処置および管理のコースを決定するにあたり、重要である。AJCC Cancer Staging Handbook 187 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed.1998); Burdette, 上記の170；Memarzadeh & Berek, 上記；Shridhar et al., 上記。ステージ分類は、International Federation of Gynecology and Obstetricsにより開発された分類システムを参照して行われる。David H. Moore, Primary Surgical Management of Early Epithelial Ovarian Carcinoma, in Ovarian Cancer 203 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)；Fleming et al. eds.、上記の188。ステージＩの卵巣癌は、卵巣に限定され、３つのサブステージからなる腫瘍増殖を特徴とする。同上。サブステージＩＡにおいて、腫瘍増殖は１つの卵巣に限定され、卵巣の外部表面上には腫瘍はなく、卵巣カプセルは無傷であり、悪性細胞は腹水または腹膜洗浄液中に存在しない。同上。サブステージＩＢは、腫瘍増殖が両方の卵巣に限定される以外は、Ａ１と同一である。同上。サブステージＩＣは、一方または両方の卵巣に限定される腫瘍増殖の存在を示し、また以下の特徴の１つまたは２つ以上を含む：カプセル破裂、一方または両方の卵巣の表面上での腫瘍増殖、および腹水または腹膜洗浄液中に存在する悪性細胞。同上。
ステージＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣を含む腫瘍増殖および骨盤拡張を意味する。同上。サブステージＩＩＡは、子宮および／またはファロピウス管における拡張および／または移植を含み、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まず、一方サブステージＩＩＢは、他の骨盤内器官および組織中への拡張を含み、再び、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まない。同上。サブステージＩＩＣは、ＩＩＡまたはＩＩＢのような骨盤拡張を含むが、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含む。同上。
ステージＩＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣中に腫瘍増殖を含み、顕微鏡により確認される骨盤を越えての腹膜転移、および／または所属リンパ節における転移を有する。同上。サブステージＩＩＩＡは、骨盤の外側の微細な腹膜転移により特徴付けられ、サブステージＩＩＩＢは、最大の寸法で２ｃｍまたはこれ以下の、骨盤の外側の肉眼で見える腹膜転移を含む。同上。サブステージＩＩＩＣは、転移が、最大の寸法において２ｃｍより大きく、所属リンパ節転移を含み得る以外は、ＩＩＩＢと同一である。同上。最後に、ステージＩＶは、腹膜転移を除く遠隔転移の存在を示す。同上。
手術的ステージ分類が、現在卵巣癌の管理および処置を評価するための基準である一方、これには顕著な欠点があり、これには、手順の侵襲性、合併症の可能性および不正確さについての可能性が含まれる。Moore, 上記の206-208, 213。これらの制限の観点において、卵巣癌の種々のステージにおける異なる遺伝子発現を理解することにより、および当該疾患の進行を一層良好に評価するのを補助する種々の生物マーカーを得ることにより、代替のステージ分類方法を開発することに、注意が向けられた。Vartainen, J. et al., Int'l J. Cancer, 95(5): 313-16 (2001); Shridhar et al. 上記；Baekelandt, M. et al., J. Clin. Oncol. 18(22): 3775-81。
卵巣癌の処置は、典型的には多面的な攻撃を含み、外科的介入は処置の基礎として作用する。Dennis S. Chi & William J. Hoskins, Primary Surgical Management of Advanced Epithelial Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 241 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds, 2d ed. 2001)。例えば、卵巣癌の９０％の症例にのぼる上皮性卵巣癌の場合において、処置は、典型的には、以下からなる：（１）総合的な腹部子宮摘出、両側性卵管卵巣摘出術、オメンテクトミー(omentectomy)およびリンパ節切除を含む、細胞減少性手術、続いて（２）パクリタキセル(paclitaxel)およびシスプラチン(cisplatin)またはカルボプラチン(carboplatin)のいずれかでのアジュバント化学療法。Eltabbakh, G.H. & Awtrey, C.S., Expert Op. Pharmacother. 2(10): 109-24。アジュバント療法の８０％の臨床的応答率にもかかわらず、ほとんどの患者は、処置の３年以内に腫瘍の再発を経験している。同上。ある患者は、第２の細胞減少性手術および／または第二次化学療法を受け得る。Memarzadeh & Berek、上記。
上記のことから、卵巣癌の再発を検出、診断、モニタリング、ステージ分類、予見および予防するために用いられる手順は、患者の予後に決定的に重要であることが明らかである。さらに現在の手順は、これらの分析の各々において有用である一方、これらの特異性、感度、侵襲性および／またはこれらの費用のために制限される。このように、最小の侵襲性を伴って、および合理的な費用において、細胞、組織または体液中の新規なマーカーを検出することにより作用する、高度に特異的で高感度の手順は、非常に望ましい。
従って、ある人が卵巣癌を発生しやすいかどうかを予測するため、卵巣癌の診断のため、疾患の進行のモニタリングのため、卵巣癌のステージ分類のため、卵巣癌が転移したかどうかを決定するため、および、卵巣癌の画像化のための、より感度が高く正確な方法に対する多大な必要性が存在する。卵巣癌のよりよい処置の必要性もまた存在する。
膵臓癌
膵臓癌は、世界で１３番目に一般的な癌であり、癌による死亡の第８位の原因である。Donghui Li, Molecular Epidemiology, in Pancreatic Cancer 3 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。米国においては、膵臓の癌は男性と女性両方において４番目に一般的な癌であり、全体で、癌による死亡の５％およびほぼ３０，０００人の死亡の原因となっている。同上。膵臓癌の割合は女性より男性で高く、白人よりアフリカ系アメリカ人で高い。同上、9。膵臓癌の最も重要な予測指標は、患者の年齢である；白人の中では、膵臓癌の年齢に関連する発症率は連続して増加しており、８５歳以上においても同様である。同上、3。約８０％の症例が６０〜８０歳の年齢範囲で起きており、８０代では、４０代と比べて、疾患を有するリスクが４０倍も高い。同上。さらに、米国癌学会は、２００４年に米国のみにて、３１，８００の新たな症例を予測している。膵臓癌は、同年に約３１，２００人の新たな死亡を引き起こすであろう。ＡＣＳウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web。研究者および医師による膵臓癌の処置を考案するための努力にも関わらず、膵臓癌は例外なく致命的であり続けている。James R. Howe, Molecular Markers as a Tool for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 29 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
年齢に加えて、膵臓癌の多数の危険因子が同定されており、喫煙、食生活、職業、一定の医療状態、遺伝、および分子生物学的因子（molecular biologic）などが含まれる。喫煙は該疾患を生じる最も重要な危険因子であり、喫煙と膵臓癌との関連は多数の研究によって確立されている。Li、上記、3。相対的リスクは少なくとも１．５であり、喫煙の程度と共に上昇し、外部リスク率（outer risk ratio）が１０倍に達する。次に重要な因子は食生活のようであり、リスクの増加は動物性タンパク質および脂肪の摂取と関連し、リスクの減少は果物および野菜の摂取と関連する。同上、3-4。特定の職業については、膵臓癌の過大な率は、化学、石炭およびガスの探査、金属産業、革なめし、繊維、アルミニウム精練、および輸送の従事者と関連している。同上、4。多くの医療状態も膵臓癌の発生率の増加と関連し、糖尿病、慢性膵炎、胃切除術、および胆嚢摘出術を含むが、これらの状態と膵臓癌との間の因果関係は確立されていない。同上。
遺伝的な遺伝因子は、膵臓癌の負荷の１０％未満を構成しており、遺伝性膵炎、および家族性の癌症候群遺伝子、例えばｈＭＳ２およびｈＭＬＨ１（遺伝性非腺腫性大腸癌）、ｐ１６（家族性異型多発性ほくろメラノーマ（mole-melanoma））およびＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳癌および卵巣癌）について関連が記載されている。他のいかなる器官も膵臓より高い遺伝性の基盤を有していない一方で、研究者らは、ある個人の膵臓癌に対する感受性に影響する特定の遺伝的欠陥（単数または複数）を示すことができない。David H. Berger & William E. Fisher, Inherited Pancreatic Cancer Syndromes, in Pancreatic Cancer 73 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
分子生物学の立場から、研究により膵臓癌と多数の遺伝的突然変異の間の関連が明らかとなり、これには、プロトオンコジーンＫ−ｒａｓの活性化および癌抑制遺伝子ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４の不活性化を含む。Marina E. Jean et al., The Molecular Biology of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
膵臓腺癌の１つの研究において、８３％は、ｐ１６およびｐ５３の不活性化と共にＫ−ｒａｓ活性化を有していた。同上。Ｋ−ｒａｓ突然変異は、膵臓腺癌の８０〜９５％に見出され、膵臓の癌においては、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子が、最も頻繁に欠損される癌抑制遺伝子である。Howe、同上29。ホモ接合体欠失、過剰メチル化、およびｐ１６遺伝子の突然変異は、膵臓腺癌の８５〜９８％において見出された。同上。Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子における改変の役割から予想されるように、細胞サイクルの調節を失うことが、膵臓の腫瘍形成の鍵となるようであり、この癌がこのように攻撃的であることを説明するかも知れない。Jean、同上15。研究により、この癌とある種の成長因子および成長因子受容体の異常な調節との間の関連、およびマトリクス・メタロプロテイナーゼと腫瘍血管新生レギュレータの上方調節が明らかにされた。同上。上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、形質転換成長因子β、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、および血管内皮成長因子は、膵臓癌において種々の役割を果たす可能性があるが、かかる役割は明らかにされていない。同上、18-22。
膵臓癌の存在を検出するためのスクリーニング技法の開発は、この致死的な癌に対して特に重要であるが、それは、殆どの患者が、その膵臓腫瘍が膵臓を囲む毛細血管およびリンパ管に侵入し、腫瘍が胆管を閉塞するかまたは痛みを引き起こすときまで、癌の存在を示さないからである：Howe、上記29；残念ながら、この疾患の転位形態を有する患者は、概して診断後１年未満の生存である、Jean et al.、上記15。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）は、症候性の患者の診断を支援することができるが、治療できる可能性のある時期での早期発見を可能とする、膵臓腫瘍のスクリーニングのツールは、現在存在しない。癌胎児性抗原などのマーカー、および，ヒト結腸癌の細胞系に対して生成される抗体（ＣＡ１９−９およびＣＡ１９５）、ヒト卵巣癌の細胞系に対して生成される抗体（ＣＡ１２５）、およびヒト膵臓癌の細胞系に対して生成される抗体（ＳＰＡＮ−１およびＤＵＰＡＮ−２）は、膵臓癌患者の血清において上昇するが、これらのマーカーは特異性の欠如および疾患の後期に現れるために、信頼できるスクリーニングのツールとしては十分ではない。Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 99 (1998); Hasholzner, U. et al., Anticancer res. 19(4A): 2477-80(1999)。
現在適切なスクリーニング法が存在しないために、医師は、この疾患の早期の診断のための最も期待される方法として、分子生物学的方法を用いる技術にますます傾いている。Howe、上記30。現在、無症候性の患者において膵臓癌を検出できる、高感度で高特異性のマーカーは存在しないが、幾つかの生物学的マーカーが検討されている。同上。現在相当の努力がＫ−ｒａｓに集中しており、研究者らは、膵液、胆汁、十二指腸液、またはＥＲＣＰブラッシングの試料をスクリーニングして、Ｋ−ｒａｓの突然変異を検出する技術を考案した。これらの試料の収集は侵襲的であり、無症候性の被験者に対するスクリーニングに特に有用ではないため、研究者らはまた、Ｋ−ｒａｓの突然変異用の血清および大便の分析に向っており、後者は供給源材料の複雑さによる障害があるために、前者が最も期待できる。同上35-38,42。さらに、転写因子タンパク質ｐ５３の血清濃度は癌の進行に平行している可能性があるため、ｐ５３も潜在的な腫瘍マーカーとして研究されている。同上37；Jean et al.、同上17。
一旦膵臓癌と診断されると、癌の進行のステージを参照して処置の決定がなされる。多数の画像技術が膵臓癌のステージ分類のために用いられ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）が現在の選択方法であり、Harmeet Kaur et al., Pancreatic Cancer: Radiologic Staging, in Pancreatic Cancer 86 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)；Ishiguchi, T. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 923-27(2001)、しかしながら、ＣＴは、小容量の転移がしばしばＣＴの解像度を超えるために、癌の範囲について頻繁に過小評価となる、H. J. Kim & K. C. Conlon, Laparascopic Staging, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。ＭＲＩはある時点においてはＣＴに取って代わるものであり、特に以下のその能力の視点においてそうである：（１）種々の組織間にコントラストをつける、（２）パルス順序を修正して病変部の視覚化を改善し、アーチファクトを最小化する、（３）イオン化放射への患者の暴露を制限しながら画像化を行う、（４）ＩＶヨウ化コントラスト試薬の使用なしに血管を視覚化する。Kaur et al., 上記87。しかしながら現在、ＭＲＩはＣＴに対して明確な利点を示さない。Kim & Conlon、上記116。
種々の超音波技術もまた、現在ステージ分類に用いられ、これには経腹的超音波検査（ＴＵＳ）、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、および術中超音波検査（ＩＵＳ）などを含み、ＥＵＳが最も期待されるものの１つである。Kaur et al., 上記86；Richard A. Erickson, Endoscopic Diagnosis and Staging: Endoscopic Ultrasound, Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography, in Pancreatic Cancer 97-106 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。これらの技術はしかし、それぞれ様々な要因によって制限される：ＴＵＳは胃腸管のガスおよび腹膜の脂肪によって妨害され、ＥＵＳは超音波検査および内視鏡検査に相当な経験を必要とし、広く利用可能ではない可能性があり、そしてＩＵＳは、術中にのみ使用できる。Kaur et al., 上記86。
まだ初期の段階ではあるが、膵臓癌のステージ分類を支援するマーカーの探索は、幾つかの可能性のある手がかりを見出した。例えば、２つの転位抑制遺伝子、ｎｍ２３−Ｈ１およびＫＡＩ１が、膵臓癌のステージに依存して異なって発現され、それらの発現は早期のステージでは上方調節され、遅いステージにおいては下方調節されることが、研究により見出された。Friess, H. et al., J. Clin. Oncol. 19(9): 2422-32(2001)。研究者らはまた、遺伝性リンパ節ステージ分類に、特にＫ−ｒａｓプロトオンコジーンにおける突然変異の探索に焦点をあてている。Yamada, T. et al. Int’l J. Oncol. 16(6): 1165-71(2000)。同様に、研究によって、突然変異したＫ−ｒａｓ配列の血漿／血清における存在が、後のステージの膵臓癌と関連することを確認したが、ただし、早いステージの膵臓癌の存在もまたこの方法により検出できる。Sorenson, G.D., Clin. Cancer Res. 6(6): 2129-37(2000)。多数のマーカーの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応試験を用いる、期待されるステージ分類技術は、以下の腫瘍マーカーのｍＲＮＡ発現について血液および組織試料を分析することにより、膵臓癌のステージを識別することに成功した：β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子ｃ−ｍｅｔ、およびβ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ遺伝子。Bilchik, A. et al., Cancer 88(5): 1037-44(2000)。
膵臓癌のステージ分類に一般に用いられる１つの分類システムは、Union Internationale Contre le Cancerにより考案されたＴＮＭシステムである。AJCC Cancer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)。このシステムは、数個の段階に分けられ、その各々は、原発腫瘍（Ｔ）、所属リンパ節（Ｎ）、および遠隔転移（Ｍ）との関連で癌の成長の範囲を評価する。同上。
ステージ０はin situでの癌腫を特徴とし（Ｔｉｓ）、所属リンパ節への転移はなく（Ｎ０）、遠隔転移もない（Ｍ０）。同上113。ステージＩおよびＩＩは、腫瘍のカテゴリーに関してのみ、ステージ０と異なる：ステージＩは、膵臓のみに限定される腫瘍を含み、これは、（１）最大寸法が２ｃｍまたはこれ以下であるか（Ｔ１）、または（２）最大寸法が２ｃｍより大である（Ｔ２）、一方、ステージＩＩは、十二指腸、胆管または膵臓周辺組織まで直接広がった腫瘍（Ｔ３）を含む。同上。ステージＩＩＩは、腫瘍のカテゴリーＴ１、Ｔ２またはＴ３を含む；所属リンパ節転位（Ｎ１）は、単一のリンパ節（ｐＮ１ａ）を含むか、または複数のリンパ節（ｐＮ１ｂ）のどちらかを含み、そして遠隔転移はない（Ｍ０）。ステージＩＶＡは、胃、脾臓、結腸、または隣接する大きな血管まで直接広がった腫瘍を特徴とし（Ｔ４）；任意のＮカテゴリーであり；および、遠隔転移はない（Ｍ０）。最後に、ステージＩＶＢは、任意のＴカテゴリー、任意のＮカテゴリー、および遠隔転移（Ｍ１）を特徴とする。同上。
一旦癌がステージ分類されると、この疾患に対する、唯一の一定して効果的な処置は外科手術であり、潜在的に治療可能な切除術を受けることができるのは１０〜１５％の患者のみである。Jean et al.、上記15；Fleming et al., eds.、上記111；William F. Regine, Postoperative Adjuvant Therapy: Past, Present, and Future Trial Development in Pancreatic Cancer 235 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。さらに、切除術を受けたこれらの患者の５年生存率は、２０％を下回る。Regine、上記235。一方、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルなどの化学療法剤は膵臓癌に対して一定の有効性を示したが、現実的には、化学療法は膵臓癌からの生存に対してはほとんど効果を示さなかった。Burdette、上記101。放射線療法はその有効性について矛盾する結果を示した、同上、しかし、および５−フルオロウラシルと組み合わせた放射線は、一定の見込みを示した、Regine、上記235。
従来技術が膵臓癌の処置に失敗していることから、分子生物学の技術を用いる多くの新規なアプローチが検討されてきた。遺伝子治療の分野で多くの研究がなされ、アンチセンス技術、遺伝子指向的プロドラッグ活性化戦略、プロモーター遺伝子戦略、およびオンコリティックウイルス（oncolytic viral）療法を含む。Eugene A. Choi & Francis R. Spitz, Strategies for Gene Therapy, in Pancreatic Cancer 331 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)；Kasuya, H. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 957-61(2001)。最近の他のアプローチは、マトリクス・メタロプロテイナーゼの阻害に焦点を当て、これは、腫瘍細胞の転位および侵入を、該細胞の基底膜の分解を介して、または腫瘍周辺間質分解および血管形成における役割を通して、促進する酵素である。Alexander S. Rosemurgy, II & Mahmudul Haq, Role of Matrix Metalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 369 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
上記のことから、膵臓癌の再発を検出、診断、モニタリング、ステージ分類、予見および予防するために用いられる方法は、患者の予後に決定的に重要であることが明らかである。さらに、現在の方法は、これらの分析の各々において有用である一方、これらの特異性、感度、侵襲性および／またはこれらの費用により制限される。このように、最小の侵襲性を伴って、および合理的な費用において、細胞、組織または体液中の新規なマーカーを検出することにより作用する、高度に特異的で高感度の手順は、非常に望ましい。
肺癌
最近１００年間、肺癌の発生率は着実に上昇しており、現在では多くの国において最も一般的な癌である。事実、肺癌は米国の男性と女性の両方において２番目に広まった癌であり、両方において最も一般的な癌による死亡の原因である。肺癌による死亡は、男性と女性の両方において１９３０年から１０倍増加したが、これは主として、煙草の喫煙の増加のため、しかしまた、ヒ素、アスベスト、クロメート、クロロメチルエーテル、ニッケル、多環式芳香族炭化水素および他の剤への暴露の増加による。Scott, Lung Cancer: A Guide to Diagnosis and Treatment, Addicus Books (2000)およびAlberg et al. in Kane et al. (eds.) Biology of Lung Cancer, pp. 11-52, Marcel Dekker, Inc. (1998)を参照のこと。米国癌学会は、２００４年に１７３，５５０の肺癌の新たな症例を予測する。さらに、２００４年に１６０，４４０人の肺癌による死亡が推定される。ＡＣＳウェブサイト：cancer with the extension .org of the world wide web。
肺癌は、肺に始まる原発腫瘍から、または腸もしくは乳房などの他の器官から広がった二次性腫瘍から生じ得る。１２種類を超える肺癌があるが、９０％を超える肺癌は２つのカテゴリーに分類される：小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。Scott、上記を参照。全肺癌の約２０〜２５％はＳＣＬＣとして特徴付けられ、一方７０〜８０％は、ＮＳＣＬＣとして特徴付けられる。同上。稀な種類の肺癌は、中皮腫であり、これは一般にアスベストへの暴露によって引き起こされ、肺の胸膜が影響される。肺癌は通常、胸部Ｘ線写真、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン、または喀痰細胞診によって診断またはスクリーニングされる。肺癌の診断は通常、組織の生検によって確認される。同上。
ＳＣＬＣ腫瘍は非常に転移性が高く、迅速に増殖する。患者がＳＣＬＣと診断されたときには、癌は通常、既に身体の他の部分にも広がっており、これには、リンパ節、副腎、肝臓、骨、脳および骨髄を含む。Scott、上記；Van Houtte et al. (eds.), Progress and Perspective in the Treatment of Lung Cancer, Springer-Verlag (1999)を参照。疾患は通常、手術が選択肢となりえない程度に広がっているため、現在の処置の選択肢は、化学療法に胸部放射線を加えたものである。Van Houtte、上記を参照。疾患のステージは長期生存率の第一の予測判断材料である。片側の肺および周辺のリンパ節を超えて広がった疾患を有する患者の５％未満が、２年より長く生存する。同上。しかし、５年生存確率は、疾患がまだ限定されたステージ、すなわち、片側の肺を越えて広がっていないステージで診断および処置されれば、３〜４倍高くなる。同上。
ＮＳＣＬＣは一般に３つの種類に分類される：扁平上皮（細胞）癌、腺癌および大細胞癌である。扁平上皮（細胞）癌および腺癌は、気道に並ぶ細胞から発生する；しかし、腺癌は粘液を産生する杯細胞から発生する。大細胞肺癌は、従って、肉眼で見ると細胞が大きく丸く見えるために命名され、一般に比較的未分化であると考えられる。Yesner, Atlas of Lung Cancer, Lippincott-Raven (1998)参照。
二次性肺癌は、身体の別に部分に始まり肺に広がった癌である。肺に転移する癌は、限定はされないが、乳癌、メラノーマ、結腸癌およびホジキンリンパ腫を含む。二次性肺癌の処置は、原発癌の源に依存することができる。すなわち、乳癌から始まった肺癌は、乳癌の処置により応答的であり、結腸癌から始まった肺癌は、結腸癌の処置により応答的であり得る。
癌のステージはそれがどの程度広がっているかを示し、予後の重要な指標である。さらに、ステージ分類は、処置がしばしば癌のステージによって決定されるために重要である。ＳＣＬＣは２つのステージに分類される：限定疾患、すなわち、片側の肺および近くのリンパ節のみに見られる癌；および広範囲の癌、すなわち、肺の外側、胸または身体の他の部分まで広がった癌である。ＳＣＬＣを有する殆どの患者について、診断時には、疾患はすでにリンパ節または身体の他の部分まで進行している。Scott、上記参照。広がりがスキャンによって明らかでなくても、幾つかの癌細胞は、血流またはリンパ系を通って広がり輸送されている可能性がある。一般に、放射線療法有りまたはなしの化学療法がよく好まれる処置である。最初に行われる初期のスキャンおよび試験は、処置に対して患者がどのように応答しているかを診るために、後に使用される。
対照的に、非小細胞癌は４つのステージに分類される。ステージＩは非常に局所的な癌で、リンパ節には癌はない。ステージＩＩの癌は、影響された肺の上端のリンパ節まで広がっている。ステージＩＩＩの癌は、癌が始まった場所の近くまで広がっている。これは、胸壁、肺（胸膜）の被覆、胸の中部（縦隔）または他のリンパ節であってよい。ステージＩＶの癌は、身体の他の部分に広がっている。ステージＩ〜ＩＩＩの癌は、通常は手術により処置され、化学療法はある場合もない場合もある。ステージＩＶの癌は通常は化学療法および／または緩和ケアにより処置される。
肺癌では多数の染色体異常よび遺伝的異常が観察されている。ＮＳＣＬＣにおいては、染色体異常は３ｐ、９ｐ、１１ｐ、１５ｐおよび１７ｐに記述され、染色体欠失は染色体７、１１、１３および１９上に見られた。Skarin (ed.), Multimodality Treatment of Lung Cancer, Marcel Dekker, Inc. (2000)；Gemmill et al., pp.465-502, in Kane、上記；Bailey-Wilson et al., pp.53-98, in Kane、上記、を参照のこと。ＳＣＬＣにおいては、染色体異常は１ｐ、３ｐ、５ｑ、６ｑ、８ｑ、１３ｑおよび１７ｐに記述された。同上。さらに、染色体３ｐの短腕の欠損も、９０％を超えるＳＣＬＣ腫瘍において観察され、またＮＳＣＬＣ腫瘍の約５０％で観察された。同上。
多数の腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が肺癌に関係する。Mabry, pp.391-412, in Kane、上記、およびSclafani et al., pp.295-316, in Kane、上記を参照。ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣの両方において、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、５０％を超える肺癌において突然変異している。Yesner、上記参照。他の腫瘍抑制遺伝子であるＦＨＩＴは、染色体３ｐ上に見出され、煙草の煙により突然変異する。同上；Skarin、上記。さらに、９５％を超えるＳＣＬＣ、およびＮＳＣＬＣの約２０〜６０％が、他の腫瘍抑制遺伝子である網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパクの欠損または異常を有する。ｒａｓ腫瘍遺伝子（特にＫ−ｒａｓ）は、ＮＳＣＬＣ試料の２０〜３０％において突然変異し、ｃ−ｅｒｂＢ２腫瘍遺伝子は、ステージ２のＮＳＣＬＣ試料の１８％およびステージ４のＮＳＣＬＣ試料の６０％において突然変異している。Van Houtte、上記参照。染色体９の領域、特に９ｐ２１の領域に見出される他の腫瘍抑制遺伝子は、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１５ＩＮＫ４Ｂを含む多くの癌細胞において削除される。Bailey-Wilson、上記；Sclafani et al.、上記参照。これらの腫瘍抑制遺伝子もまた、肺癌の発症機序に関連し得る。
さらに、多くの肺癌細胞は、肺癌細胞上で自己分泌または傍分泌の様式で作用できる、増殖因子を産生する。Siegfried et al., pp. 317-336, in Kane、上記；Moody, pp. 337-370, in Kane、上記およびHeasley et al., 371-390, in Kane、上記参照。ＳＣＬＣにおいて、多くの腫瘍細胞はガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）を産生し、これはこれらの細胞に対する増殖性成長因子である。Skarin、上記参照。多くのＮＳＣＬＣ腫瘍は上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体を発現し、ＮＳＣＬＣ細胞をＥＧＦに応答して増殖させる。インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、９５％を超えるＳＣＬＣにおいて、また８０％を超えるＮＳＣＬＣ腫瘍において、増加する；これは、自己分泌成長因子として機能すると考えられる。同上。最後に、幹細胞因子（ＳＣＦ、スチール因子（steel factor）またはキットリガンド（kit rigand）としても知られる）およびｃ−Ｋｉｔ（ＳＣＦに対するプロト癌タンパクチロシンキナーゼ受容体）は、両方ともＳＣＬＣにおいて高濃度で発現され、従って、増殖を増大させる自己分泌ループを形成することができる。同上。
多くの肺癌の症例は喫煙に起因するが、ほとんどの喫煙者は肺癌を発症しない。疫学的証拠によれば、肺癌に対する感受性はメンデル型の様式で遺伝され得、従って遺伝的要素を有することが示唆された。Bailey-Wilson、上記。従って、幾つかの遺伝子座におけるある種の対立遺伝子多型が、肺癌の感受性に影響すると考えられる。同上。どの対立遺伝子多型が、肺癌感受性および他の疾患の感受性に関与する可能性が高いかを同定するための１つの方法は、肺で高度に発現される遺伝子の対立遺伝子多型を観察することである。
肺はまた多数の他の衰弱させる疾患にも影響され、これには、限定なく、気腫、肺炎、嚢胞性線維症および喘息が含まれる。Stockley (ed.), Molecular Biology of the Lung, Volume I: Emphysema and Infection, Birkhauser Verlag (1999)を参照、以下ではStockley Iとする、およびStockley (ed.), Molecular Biology of the Lung, Volume II: Asthma and Cancer, Birkhauser Verlag (1999)、 以下ではStockley IIとする、を参照。多くのこれらの疾患の原因は未だによく理解されておらず、多くのこれらの非癌性肺疾患の優れた処置方法は、たとえあったとしても数少ない。従って、種々の非癌性肺疾患を理解する必要性および、これらの疾患の処置を同定する必要性が残されている。
胚発生の間の肺組織の発達および分化もまた非常に重要である。肺および気管支を含む、気道の全上皮細胞は、胎生の突起に並ぶ未発達な内胚葉細胞から生じる。Yesner、上記参照。胚発生の間、多能性内胚葉幹細胞は多くの種類の特殊化した細胞に分化し、これには、吸入した粒子を動かすための繊毛細胞、粘液を産生する杯細胞、内分泌機能のためのクルチクスキー細胞、およびサーファクタント・タンパク質を分泌するためのクララ細胞およびＩＩ型肺細胞が含まれる。同上。不適切な発達および分化は、乳児、特に、誕生時にその肺が十分なサーファクタントを産生できない早産児において、呼吸器疾患および呼吸困難を引き起こす可能性がある。さらに、ある肺癌細胞、特に小細胞癌は、可塑性があり、その表現型を多数の細胞型に変えることができ、これには大細胞癌、腺癌および扁平上皮細胞癌を含む。同上。従って、肺の発達および分化のよりよい理解は、肺癌の始まりおよび進行の理解を促進する助けとなる。
最も一般的な肺癌のスクリーニング試験は、胸部Ｘ線写真および喀痰細胞診である。ランダム化され対照を用いる試験では、胸部Ｘ線写真および／または喀痰細胞診のスクリーニングによる肺癌の死亡率の減少は示されなかった。さらに、喀痰細胞診は、毎年の胸部Ｘ線写真の補助として用いられた場合に有効であることは示されなかった。胸部Ｘ線写真と喀痰細胞診によるスクリーニングは、初期のステージの肺癌を検出するように見えるが、スクリーニング試験において期待されるのは、死亡率を低下させるのに有効であるかどうかである。現在のスクリーニング方法による初期の検出が、肺癌患者の死亡率の低下に失敗しているため、現在の肺癌のスクリーニング方法は不適切である。
胸部放射線スクリーニングに関連する、２つの重大な危険が存在する。第１に、偽陽性の試験結果が、経皮針生検または開胸術などの不必要な侵襲的方法を導く可能性がある。これらの方法は費用がかかり、またその侵襲的な性質により、それ自体のリスクを負っている。胸部放射線スクリーニングに関連する第２の危険は、過剰診断である。過剰診断とは、もしスクリーニングによって検出されなければ臨床的に重大にならないような、小さな、またはゆっくり増殖する腫瘍の診断である。過剰診断を生きている個人において立証するのは不可能であるが、解剖試験によれば、多くの個人は、肺癌のために死亡するというより、肺癌を有して死亡することが示唆される。
さらに、肺癌の種類の範囲は最近２０年間で変化している。最も一般的な種類は扁平上皮細胞癌（通常中心に位置する）であったが、現在の最も一般的な種類は腺癌（通常周辺に位置する）である。後者は、胸部Ｘ線写真により初期に検出しやすく、その限界は上述されている。対照的に、喀痰細胞診は、腺癌の検出よりも扁平上皮細胞癌の検出により感度が高く、従ってより一般的な腺癌の検出に対する有効性に欠ける。明らかに、肺癌を検出する高感度で非侵襲的な新しい方法が必要である。
より新しい技術による肺癌のスクリーニングを改善するための集中的な努力が存在し、これには、低用量らせんコンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）および分子技術が含まれる。ＬＤＣＴは胸部放射線よりはるかに感度が高い。最近のスクリーニングの研究においては、ＣＴは胸部放射線よりもほとんど６倍も多いステージＩ肺癌を検出し、これらの腫瘍の殆どは直径１ｃｍ以下であった。しかし、ＬＤＣＴによるスクリーニングの有効性は、まだ対照臨床試験によって評価されていない。
ＬＤＣＴによるスクリーニングの任意の潜在的な利点に対して考慮すべき、２つの潜在的な危険が存在する。より一般的で知られた危険は偽陽性の試験結果であり、これは心配と侵襲的診断方法を導く可能性がある。より知られていない危険は過剰診断であり、スクリーニングによって検出されなければ臨床的に重要にならなかったであろう状態の診断である。ＬＤＣＴによるスクリーニングの場合は、過剰診断は不要な肺癌の診断を導く可能性があり、この診断は、例えば肺葉切除、化学療法および放射線療法などの幾つかの手術の組み合わせを要求する。上記のように、過剰診断は、生きている個人において立証するのは不可能である。１つの大規模な研究において、病理解剖により見出された全肺癌の約６分の１は、死亡の前に臨床的に認識されていなかった。さらに、病理解剖はおそらく、ＣＴによって検出可能な多くの小さな肺癌を検出することができない。
肺癌に対する現在の療法は非常に限られている。一般に患者の選択肢は、手術、放射線療法および化学療法を含む。
肺癌の種類およびステージに依存して、手術は、周辺の肺組織とともに腫瘍を除去するために用いることができる。肺葉切除は、肺葉（一部）の除去をさす。肺全体を除去する場合は、手術は、肺全摘術と呼ばれる。葉の一部のみの除去は、区域切除または楔状切除術として知られている。
癌が脳まで広がっている場合は、脳転移の除去から利点が得られる可能性がある。これは、開頭術（頭蓋骨の穴を介した手術）を含む。
放射線療法には幾つかの方法が存在する。外照射療法は、癌に焦点を合わせた、身体の外部から送達する放射線を用いる。この種類の放射線療法は、原発性肺癌または他の器官へのその転位の処置に最も多く用いられる。
近接照射療法は、癌組織の中または癌に隣接した気道中に直接配置された、放射性物質の小さなペレットを用いる。放射線療法は時には肺癌の主要な（第一の）処置として用いられ、特に患者の一般健康状態が手術を受けるには悪すぎる場合はそうである。近接照射療法はまた、癌による大きな気道の閉塞を解放するのを助けるために用いることができる。
さらに、放射線療法は術後の処置として、術中に見ることができないか、または除去できなかった、非常に小さい癌の沈着物を死滅させるために用いることができる。放射線療法はまた、肺癌の症状、例えば痛み、出血、嚥下困難、および脳への転移によって生じる問題などを和らげる（軽減する）ために用いることもできる。
化学療法については、シスプラチンまたは関連する薬剤のカルボプラチンが、ＮＳＣＬＣの処置に最も多く用いられる化学療法剤である。最近の研究により、これらのどれかを、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシドまたはビノレルビンなどの薬剤と組み合わせると、ＮＳＣＬＣの処置により効果的であることが見出された。
近年、世界の１９の主要な癌センターの連合であるNational Comprehensive Cancer Network（ＮＣＣＮ：nccn with the extension .org of the world wide web）が、ＮＣＣＮ非小細胞肺癌の臨床診療指針の主要な更新を発表した。ＮＣＣＮは、腫瘍学における臨床ポリシーに関する標準として広く認知されている。
近年承認された標的療法、ゲフィチニブ（イレッサ(登録商標)、AstraZeneca Pharmaceuticals LP）は、三次治療として現在推奨されており、プラチナ／ドセタキセルの組み合わせが一次治療として用いられた場合にのみ、二次治療として推奨される。
ＮＣＣＮの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）指針は、この疾患を有する患者に対する化学療法の投与についての推奨を含み、これには、患者の選択基準および一次、二次、および三次治療剤および組み合わせの定義を含む。
化学療法剤は、一次治療に対しては２剤療法、二次治療に対しては２剤療法または１剤、および三次治療に対しては１剤として特定される。一次および二次治療に用いる剤は：
Figure 2007528845
 である。
ＳＣＬＣを有する患者に対する、通常の化学療法の組み合わせの幾つかは、ＥＰ（エトポシドおよびシスプラチン）；ＥＴ（エトポシドおよびカルボプラチン）；ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、およびエトポシド）；およびＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびビンクリスチン）を含む。
ゲムシタビン、パクリタキセル、ビノレルビン、トポテカン、およびテニポシドなどの新しい薬剤は、幾つかのＳＣＬＣ研究において有望な結果を示した。患者の健康状態が良い場合には、化学療法剤と組み合わせて成長因子を与えることもできる。成長因子の投与は、骨髄の副作用の予防を支援する。
肺癌の処置のための、種々の化合物に対する、実施中または最近完了した治療的試行には、
Figure 2007528845
 が含まれる。
上記のように、多くの治療薬が、一次治療との組み合わせにおいて用いることが推奨され、または、他の治療法が失敗した場合には、二次、および三次治療剤として用いることが推奨される。実施中または最近完了した治療的試行には多くの化合物があるが、初期ステージおよび進行または転位した肺癌を処置することができる、さらなる治療化合物に対する多大な必要性が存在する。
従って、ある人が肺癌を発症しやすいかどうかを予測するため、肺癌を診断するため、該疾患の進行をモニタリングするため、肺癌のステージ分類のため、肺癌が転位しているかどうかを決定するため、および肺癌の画像化のための、より感度が高く正確な方法に対する多大な必要性が存在する。また、肺癌のよりよい処置の必要性も存在する。さらに、例えば気腫、肺炎、肺の感染症、肺繊維症、嚢胞性線維症および喘息などの非癌性肺疾患の診断および処置のための方法に対する多大な必要性も存在する。また、組成物および、これらの組成物を用いて、法医学の目的のため、および特定の細胞または組織が肺特異的な性質を示すかどうかを決定するために、肺組織を同定するための方法の必要性も存在する。
上記のように、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌の診断およびステージ分類のための方法の各々は、用いる技術によって制限される。従って、転移癌を含む乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌の検出のための、感度の高い分子マーカーまたは細胞マーカーおよび試薬の必要性が存在する。また、処置方法を最適化するために、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌の臨床的また病理学的ステージ分類を含む、正確なステージ分類のための分子マーカーおよび試薬の必要性が存在する。最後に、癌の処置の進行を監視するための、感度の高い分子マーカーまたは細胞マーカーおよび試薬の必要性が存在し、これは、寛解後の乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌の再発を検出できるマーカーを含む。
本発明は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌を処置するための、従来の治療方法の制限を克服し、以下の詳細な説明から明らかな付加的な利点を提供する、代替的試薬および方法を提供する。
癌における血管形成（angiogenesis）
固体腫瘍の増殖および転位はまた、血管形成に依存する。Folkman, J., 1986, Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J., 1989, Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6。例えば、２ｍｍより大きく広がった腫瘍は、それ自身の血液供給を受けねばならず、これは新しい毛細血管の成長を誘導することにより達成される。これらの新しい血管が一旦腫瘍に埋め込まれると、それらは腫瘍細胞に対し、循環に入り、遠隔部位、例えば肝臓、肺または骨などに転位する手段を提供する。Weidner, N., et al., 1991, The New England Journal of Medicine, 324(1), 1-8。
既存の血管からの新たな血管の増殖または発生として定義される血管形成は、第一に胚発生中に起こる複雑なプロセスである。このプロセスは、血管に並ぶ新しい内皮細胞が、幹細胞からの分化ではなく、既存の細胞の増殖により作られる点で、脈管形成（vasculogenesis）とは区別される。このプロセスは侵襲的であり、細胞外基質（ＥＣＭ）のタンパク質分解、新しい内皮細胞の移動、および新しいマトリクス成分の合成に依存する。血管形成は、循環系の胚発生中に起こるが、しかし成長したヒトにおいては、血管形成は病的な状態への応答としてのみ起こる（ただし、女性の生殖周期を除く）。
成人の正常な生理学的状態のもとで、血管形成は、毛髪の成長および創傷の治癒などの非常に限定された状況でのみ起こる。Auerbach, W. and Auerbach, R., 1994, Pharmacol. Ther. 63(3):265-311; Ribatti et al., 1991, Haematologica 76(4):311-20; Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4。血管形成は、内皮細胞の移動するカラムの形成を引き起こす刺激によって進行する。タンパク質分解活性は、この「血管新生の芽（vascular sprout）」が前進する先端に集中され、これは、細胞のカラムが侵入し移動することを許容するのに十分なだけ、ＥＣＭを破壊する。前進部の後ろでは内皮細胞が分化し、互いに付着し始めて、新しい基底膜を形成する。次に細胞は増殖をやめ、最終的には新しい細動脈または毛細血管の内腔を規定する。
制御されない血管形成が、広い範囲の疾患に対して責任を負うことが次第に認識されてきたが、これには限定されることなく、癌、心臓血管疾患、関節リューマチ、乾癬および糖尿病性網膜症を含む。Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 28(2):103-12; Ware and Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64。
特に重要であるのは、血管形成が、固体腫瘍によってその増殖と転位のために必要とされるとの観察である。Folkman, 1986上記；Folkman 1990, J Natl. Cancer Inst., 82(1)4-6; Folkman, 1992, Semin Cancer Biol 3(2):65-71; Zetter, 1998, Annu Rev Med 49:407-24。腫瘍は通常は、利用可能な毛細管ベッドからの距離のために数立方ミリメーターの大きさにまでしか増殖できない、単一の異常細胞（aberran cell）として始まり、さらなる増殖および播種なしに長期間「潜伏して」留まることができる。幾つかの腫瘍細胞は、次に、血管形成の表現型に切り換わり、内皮細胞を活性化し、これは新しい毛細血管に増殖および成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発腫瘍の連続した増殖を許容するのみでなく、転位腫瘍細胞の播種および再コロニー形成を許容する。血管形成の切換えを制御する正確なメカニズムはよく理解されていないが、腫瘤の新血管形成は、多数の血管形成促進剤と阻害剤との間の純バランスから生じると考えられる。Folkman, 1995、上記。
最も強力な血管形成阻害剤の１つは、O’ReillyおよびFolkmanによって同定されたエンドスタチンである。O’Reilly et al., 1997, Cell 88(2):277-85; O’Reilly et al., 1994, Cell 79(2):315-28。この発見は、ある種の原発腫瘍が遠隔転移の増殖を阻害できるという現象に基づいていた。O’ReillyおよびFolkmanは、原発腫瘍が、過剰な阻害剤の下で血管新生促進剤を生成することにより、血管新生を開始させるとの仮説を立てた。しかし、血管新生阻害剤は、それらの循環における長い半減期によって、過剰な促進剤の中で二次腫瘍の部位に到達する。この最終結果は、原発腫瘍の増殖と二次腫瘍の阻害である。エンドスタチンは、原発腫瘍により産生される、かかる血管新生促進剤の増加するリストの中の１つである。これは大きなタンパク質の、タンパク質分解断片である：エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩ（マウスコラーゲンＸＶＩＩＩのアミノ酸Ｈ１１３２−Ｋ１３１５）の２０ｋＤａの断片である。エンドスタチンは、in vitroで内皮細胞の増殖を特異的に阻害し、in vivoで血管新生をブロックすることが示された。より重要なことには、エンドスタチンを腫瘍を有するマウスに投与すると、顕著な腫瘍の退縮を引き起こし、毒性または薬剤耐性は、複数の処置サイクルの後にも観察されなかった。Boehm et al., 1997, Nature 390(6658):404-407。エンドスタチンが遺伝的に安定な内皮細胞を標的化し、種々の固体腫瘍を阻害するという事実は、エンドスタチンを抗癌療法の非常に魅力的な候補にする。Fidler and Ellis, 1994, Cell 79(2):185-8; Gastl et al., 1997, Oncology 54(3):177-84; Hinsbergh et al., 1999, Ann Oncol 10 Suppl 4:60-3。さらに、血管新生阻害剤は、放射線および化学療法剤と組み合わされるとより効果的であることが示された。Klement, 2000, J. Clin Invest, 105(8) R15-24. Browder, 2000, Cancer Res. 6-(7) 1878-86, Arap et al., 1998, Science 279(5349):377-80; Mauceri et al., 1998, Nature 394(6690):287-91。
本発明は、従来の治療方法の制限を克服し、以下の詳細な記載から明らかであるさらなる利点を提供する、乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌を処置する代替の方法を提供する。
発明の概要
本発明は、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合する、単離されたＰｒｏ１０４抗体に関する。本発明はさらに、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合すると内部移行する、単離されたＰｒｏ１０４抗体に関する。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。代替的に、抗体は、抗体断片またはキメラもしくはヒト化抗体である。モノクローナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078の下で寄託されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生され得る。
抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078の下で寄託されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体により結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することについて競合することができる。
本発明はまた、結合した抗体に関する。これらは、増殖阻害剤または細胞毒性剤に結合することができる。細胞毒性剤は、毒素、抗生物質、放射性同位体並びに核酸分解酵素および毒素からなる群から選択され得る。毒素の例には、メイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド類(maytansinoids)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、リシンまたはカリケアマイシン(calicheamicin)が含まれるが、これらには限定されない。
哺乳類細胞は、癌細胞であってもよい。好ましくは、抗Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体は、in vivoでＰｒｏ１０４発現癌細胞の増殖を阻害する。
抗体は、細菌中で産生され得る。代替的に、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｐｒｏ１０４抗体のヒト化形態であってもよい。
好ましくは、癌は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌からなる群から選択される。本発明はまた、抗体を産生する方法であって、適切な細胞を培養することおよび該抗体を該細胞培養物から回収することを含む、前記方法に関する。
本発明はまた、抗体および担体を含む組成物に関する。抗体は、細胞毒性剤に結合することができる。細胞毒性剤は、放射性同位体または他の化学療法剤であってもよい。
本発明はまた、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、本発明の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法に関する。癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞からなる群から選択することができる。
卵巣癌は、卵巣漿液性腺癌であってもよい。
乳癌は、乳房浸潤性乳管癌であってもよい。
乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌はまた、転移癌であってもよい。
本発明はまた、哺乳類におけるＰｒｏ１０４発現癌を寛解する方法であって、抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法に関する
さらに、本発明は、容器およびこの中に含まれた組成物を含む製造品であって、該組成物が、本明細書中に記載した抗体を含む、前記製造品に関する。この製造品はまた、追加の成分、例えば、組成物が卵巣癌または膵臓癌の処置に使用可能であることを示す添付文書を含むことができる。
発明の詳細な説明
定義および一般的手法
本明細書中で用いるヒト「Ｐｒｏ１０４」は、細胞表面上に糖タンパク質として発現された、３１４個のアミノ酸のタンパク質を意味する。Ｐｒｏ１０４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、WO200016805-A1 PA(DIAD-)DIADEXUSヒト癌特異的遺伝子、Ｐｒｏ１０４；WO9836054-A1 PA(AMRA-)AMRAD ＨＥＬＡ２の短アイソフォームのヌクレオチド配列；およびJ.D. Hooper et al., テスチシン、減数分裂前の精巣生殖細胞により発現され精巣生殖細胞癌において失われる新たなヒトセリンプロテアーゼ（Testisin, a new human serine protease expressed by premeiotic testicular germ cells and lost in testicular germ cell tumors.）Cancer Research 59:3199-3205 (1999)、などに開示されている。Ｐｒｏ１０４は、ＲＥＦＳＥＱデータベースにおいて、NM_006799.2(GI: 21614534)ホモサピエンスプロテアーゼ、セリン、２１（テスチシン）（ＰＲＳＳ２１）、転写変異体１、ｍＲＮＡとして開示されている。ＲｅｆＳｅｑは、ＰＲＳＳ２１（Ｐｒｏ１０４）の以下の要約を与えている：
「この遺伝子は、細胞表面に結合されたセリンプロテアーゼをコードし、これはセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーのメンバーである。リシンまたはアルギニンのカルボキシル基を含むペプチド結合上で活性であると予想されている。このタンパク質は細胞質および、減数分裂前の精巣生殖細胞のプラズマ細胞膜に局在し、生殖細胞から発生した精巣腫瘍の進行に関与する可能性がある。この遺伝子を代替的にスプライシングすると、３つの異なるアイソフォームをコードする、３つの転写変異体が生じる。」
Ｐｒｏ１０４のアミノ酸は、細胞表面に局在すると推定される。本明細書中で用いるＰｒｏ１０４は、Ｐｒｏ１０４の生物学的活性を有するタンパク質の対立遺伝子多型および保守的置換変異体を含む。さらに、スプライス変異もＰｒｏ１０４の生物学的活性を有することができる。上で参照されるスプライス変異に対するＲｅｆＳｅｑアクセッションは以下を含む：NM_144956.1 (GI: 21614530)ホモサピエンスプロテアーゼ、セリン、２１（テスチシン）（PRSS21）、転写変異体２、ｍＲＭＡ；およびNM_144957 (GI: 21614532) ホモサピエンスプロテアーゼ、セリン、２１（テスチシン）（PRSS21）、転写変異体３、ｍＲＭＡ。
Ｐｒｏ１０４が明らかにより攻撃的な乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌に関連するとの我々の所見は、この細胞表面抗原を、これらおよび潜在的に他の腫瘍の種類に対する、魅力的なターゲットにしている。
本明細書において用語「抗体」（Ａｂ）とは、これらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば２重特異性抗体）、および抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中では、「抗体」と同義的に用いる。
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然の環境の汚染された成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含むことができる。好ましくは、抗体を、次のように均一に精製する：すなわち、（１）ローリー法により決定して、９５重量％より高い、および最も好ましくは９９重量％より高い抗体に、（２）回転カップ配列決定装置を用いることにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に、または（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、クマジーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件の下で、均一に精製する。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内にin situの抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成されている、ヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの塩基性ヘテロ四量体単位からなり、従って、１０個の抗原結合部位を含み、一方分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖と共に２〜５個の塩基性の４鎖単位を含む多価の集合を形成することができる）。ＩｇＧの場合において、４鎖単位は、一般的に、約１５０，０００ダルトンである。各々のＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に結合しており、一方２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つまたは２つ以上のジスルフィド結合により互いに結合している。各々のＨおよびＬ鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変領域（ＶＨ）、続いて、α、δ、およびγ鎖の各々について３つの定常領域（ＣＨ）並びにμおよびεアイソタイプについて４つのＣＨ領域を有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変領域（ＶＬ）、続いてその他方の末端において定常領域（ＣＬ）を有する。
ＶＬは、ＶＨと共に整列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨＩ）と共に整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬの一緒の対形成により、単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition、Daniel P. Stites, Abba I. Teff and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁および６章を参照。
すべての脊椎動物種からのＬ鎖は、これらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に識別できるタイプの１つに割り当てることができる。これらの重鎖（ＣＨ）の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと示される重鎖を有する。γおよびαクラスは、さらに、ＣＨ配列および機能における比較的主要でない差異に基づいてサブクラスに分けられ、例えばヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
用語「可変」は、可変領域の一定のセグメントが、抗体間の配列において、大きく異なるという事実を意味する。Ｖ領域は抗原結合を媒介し、この特定の抗原への特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の１〜１０のアミノ酸範囲にわたり均一に分散されてはいない。代わりにＶ領域は、各々９〜１２個のアミノ酸の長さの、「超可変領域」と呼ばれる極めての可変性の高い比較的短い領域により分離された、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的不変の伸長からなる。天然の重および軽鎖の可変領域は、各々４つのＦＲを含み、これらは大きくＰシート形状を採り、３つの超可変領域により結合されており、該領域はループを形成してＰシート構造に結合し、そしてある場合はこの一部を形成する。各々の鎖における超可変領域は、ＦＲにより一緒に密接に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与せず、種々のエフェクター機能、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への関与を示す。
用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる際には、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、ＶＬ中のおよその残基２４〜３４（Ｌ１）、５０５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、並びにＶＨ中のおよそ１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（１１３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）からのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（例えば、ＶＬ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｕ）、並びにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（１−１２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）からの当該残基を含む。
本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在してよい、天然に存在する可能性のある突然変異体を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向される。さらに、種々の決定因子（エピトープ）に指向される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に指向される。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、これらが、他の抗体により汚染されることなく合成され得るという点で、有利である。修飾語句「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることと解釈すべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製することができ、または細菌性、真核生物動物もしくは植物細胞における組換えＤＮＡ方法を用いて作製することができる（例えば米国特許第4,816,567号を参照）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載されている手法を用いて単離することができる。
本明細書中のモノクローナル抗体は、これらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて「キメラ」抗体を含み、該「キメラ」抗体とは、その重および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一であるか、またはこれと相同的であり、一方残りの１または２以上の鎖が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにこのような抗体の断片中の、対応する配列と同一であるか、またはこれと相同的であるものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照）。関連するキメラ抗体は、本明細書中では、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変領域抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む、「霊長類化された(primatized)」抗体を含む。
「無傷の」抗体は、抗原結合部位およびＣＬ並びに少なくとも重鎖定常領域、ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、天然配列定常領域（例えばヒト天然配列定常領域）またはこのアミノ酸配列変異体であってもよい。好ましくは、無傷の抗体は、１つまたは２つ以上のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディー(diabody)；直線状抗体（米国特許第5,641,870号、例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を参照）；単一鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多選択性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片および残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２種の同一な抗原結合断片が生じ、表示は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第１の定常領域（ＣＨＩ）と共に完全なＬ鎖からなる。各々のＦａｂ断片は、抗原結合に関して１価であり、即ち、これは、単一の抗原結合部位を有する。
抗体のペプシン処理により、ジスルフィドが結合した２つのＦａｂ断片にほぼ相当し、２価の抗原結合活性を有し、尚抗原を架橋することができる、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは２つ以上のシステインを含むＣＨＩ領域のカルボキシ末端において、追加のいくつかの残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域の１または２以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての、本明細書中での表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、もともとはこれらの間にヒンジシステインを有する８つのＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
Ｆｃ断片は、両方のＨ鎖がジスルフィドにより一緒に保持されたカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列により決定され、この領域はまた、ある種類の細胞上に見出されるＦｃレセプター（ＦｃＲ）により認識される部分である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、厳密な、非共有的な会合における、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つの領域の折り畳みから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が放射し、これは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３つのみのＣＤＲを含むＦｖの半分）さえも、抗原を認識し、これを結合する能力を有するが、ただし、完全な結合部位よりも低い親和性においてである。
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、これは単一のポリペプチド鎖に結合したＶＨおよびＶＬ抗体領域を含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨおよびＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含み、これによってｓＦｖは、抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの概説のために、PluckthunによるThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Mooreeds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 下記、を参照。
用語「ダイアボディー」は、小さい抗体断片であって、対形成が鎖内ではなくＶ領域の鎖間に達成され、これによって２価の断片、即ち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨおよびＶＬ領域の間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を有するｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構成することにより調製された、前記小さい抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディーは、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、ここで、２つの抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディーは、例えばEP 404,097; WO 93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに完全に記載されている。
「天然配列」のポリペプチドは、天然のものに由来するポリペプチド（例えば抗体）と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列のポリペプチドは、天然のものから単離することができるか、または組換えもしくは合成手段により産生することができる。従って、天然配列のポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたはすべての他の哺乳類種からのポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。
用語「アミノ酸配列変異体」は、ある程度に天然配列のポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、Ｐｒｏ１０４のアミノ酸配列変異体は、天然配列のＰｒｏ１０４と少なくとも約７０％の相同性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の相同性、および最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。アミノ酸配列変異体は、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置において、置換、欠失および／または挿入を有し得る。
抗体の「機能的断片または類似体」の語句は、全長抗体と共通する定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的断片または類似体は、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合できるものであって、ここでかかる分子の能力が、高親和性のレセプターであるＦｃεＲＩに結合する能力を有することを防止または実質的に低減する方法で、結合することができるものである。
「相同性」は、最大のパーセンテージの相同性を達成するために、配列を整列させ、所要に応じて間隙を導入した後に同一である、アミノ酸配列変異体中の残基のパーセンテージとして定義される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において十分知られている。配列の類似性を、任意の一般的な配列分析アルゴリズム、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴまたは他の変法のSmith-Waterman整列により測定することができる。T. F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)およびW.R. Pearson, Genomics 11:635-650 (1991)を参照。
非ヒト（例えば、げっ歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の、超可変領域からの残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体中または供与者抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精巧にするためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、随意にまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
本明細書中において、「内部移行する」抗Ｐｒｏ１０４抗体は、哺乳類細胞上でＰｒｏ１０４（即ち細胞表面Ｐｒｏ１０４）に結合することにより細胞により取り込まれる（即ち進入する）ものである。内部移行する抗体は、当然、抗体断片、ヒトまたはヒト化抗体および抗体結合体を含む。治療的用途のために、in vivoでの内部移行が意図される。内部移行した抗体分子の数は、Ｐｒｏ１０４発現細胞、特にＰｒｏ１０４発現癌細胞を死滅させるのに十分または適切な数である。抗体または抗体結合体の効能に依存して、いくつかの例において、単一の抗体分子の細胞中への取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は、抗体に結合した毒素の１つの分子の内部移行が腫瘍細胞を死滅させるのに十分であるように、死滅させるのに高度に有効である。
抗Ｐｒｏ１０４抗体が、哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合すると内部移行するか否かは、以下の実験例において記載するものを含む、種々のアッセイにより決定することができる。例えば、in vivoでの内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、ある細胞の表面上で発現されるＰｒｏ１０４を有することが知られている動物中に導入する。この抗体を、放射性標識するかまたは、例えば蛍光または金粒子で標識することができる。このアッセイに適する動物には、哺乳類、例えばヒトＰｒｏ１０４発現腫瘍移植または異種移植を含むＮＣＲヌードマウス、またはヒトＰｒｏ１０４を形質移入した細胞が導入されたマウス、またはヒトＰｒｏ１０４導入遺伝子を発現する遺伝子組換えマウスが含まれる。適切な対照には、試験抗体が施与されていないかまたは関連しない抗体が施与された動物、および関連する細胞上の他の抗原に対する抗体が施与され、この抗体が、抗原に結合すると内部移行することが知られている動物が含まれる。抗体を、動物に、例えば静脈内注射により投与することができる。好適な時間間隔において、この動物の組織切片を、既知の方法を用いて、または以下の実験例中に記載したように調製し、光学顕微鏡または電子顕微鏡により、内部移行および細胞中の内部移行した抗体の位置について分析することができる。in vitroでの内部移行について、細胞を、組織培養皿中で、培養培地に加えられた関連する抗体の存在または不存在においてインキュベートし、所望の時点において顕微鏡分析のために加工することができる。
細胞中の内部移行した標識抗体の存在を、顕微鏡により、または放射性標識した抗体を用いる場合にはオートラジオグラフィーにより、直接視覚化することができる。代替的に、定量的な生化学的アッセイにおいて、Ｐｒｏ１０４発現細胞を含む細胞の集団を、in vitroまたはin vivoで、放射性標識した試験抗体と接触させ、細胞（in vivoで接触させた場合には、次に、好適な量の時間の後に細胞を単離する）を、プロテアーゼで処理するか、またはこれに酸洗浄を施して、細胞表面上の内部移行していない抗体を除去する。細胞を粉砕し、細胞の各々のバッチに付随する１分当たりのプロテアーゼ耐性放射線計測値（ｃｐｍ）の値を、ホモジネートをシンチレーションカウンターを通過させることにより測定する。放射性標識抗体の既知の特定の活性に基づいて、細胞あたり内部移行した抗体分子の数を、粉砕した細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。細胞は、in vitroで、好ましくは溶液形態で、以下のようにして抗体と「接触」させる：例えば細胞を培養皿またはフラスコ中の細胞培養培地に加え、抗体を培地と十分に混合して、抗体に対する細胞の均一な曝露を確実にすることにより、抗体と「接触」させる。培養培地に加える代わりに、細胞を、試験抗体と、試験管内のＰＢＳなどの等張性溶液中で、所望の時間にわたり接触させることができる。患者に投与された際には、細胞は抗体とin vivoで、試験抗体を投与する任意の好適な方法、例えば以下に記載する投与方法により接触させられる。
in vivoでのＰｒｏ１０４発現細胞に結合した際の抗体の内部移行の速度が速くなるに従って、標的Ｐｒｏ１０４発現細胞に対する所望の死滅または増殖阻害効果を、例えば細胞毒性免疫結合体により一層迅速に達成することができる。好ましくは、抗Ｐｒｏ１０４抗体の内部移行の動力学は、これらが、Ｐｒｏ１０４発現標的細胞の迅速な死滅を好む程度である。従って、抗Ｐｒｏ１０４抗体は、好ましくはin vivoで抗体を投与してから２４時間以内に、一層好ましくは約１２時間以内に、さらに一層好ましくは約３０分〜１時間以内に、最も好ましくは約３０分以内に、内部移行の迅速な速度を示すのが望ましい。本発明は、in vivoで抗Ｐｒｏ１０４抗体を導入した時から約１５分程度で迅速に内部移行する抗体を提供する。抗体は、好ましくは、細胞表面上のＰｒｏ１０４に結合した際に、数時間以内に、好ましくは１時間以内に、さらに一層好ましくは１５〜３０分以内に、細胞中に内部移行する。
試験抗体が、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生された抗体を含む、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体により結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することについて競合することができるか否かを試験するために、クロスブロッキング(cross-blocking)アッセイ、例えば競合的ＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。例示的な競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのＰｒｏ１０４で被覆したウェルまたはＰｒｏ１０４で被覆したセファロースビーズを、候補の競合的抗体と共に、またはこれを伴わずにプレインキュベートし、次にビオチン標識した本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体を加える。ウェル中で、またはビーズ上でＰｒｏ１０４抗原に結合した、標識した抗Ｐｒｏ１０４抗体の量を、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体および適切な基質を用いて測定する。
代替的に、抗Ｐｒｏ１０４抗体を、例えば放射性もしくは蛍光標識またはある他の検出可能な、および測定可能な標識で標識することができる。抗原に結合する標識した抗Ｐｒｏ１０４抗体の量は、候補の競合的抗体（試験抗体）が、抗原上の同一のエピトープに結合することについて競合する能力に対して、逆相関を有する。即ち、同一のエピトープへの試験抗体の親和性が大きくなるに従って、より少量の標識した抗Ｐｒｏ１０４抗体が、抗原で被覆したウェルに結合する。候補の競合的抗体が、候補の競合的抗体の不存在において（しかし、既知の非競合的抗体の存在下であってもよい）平行して行う対照と比較して、抗Ｐｒｏ１０４抗体の結合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに一層好ましくは少なくとも５０％遮断することができる場合には、候補の競合的な抗体は、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体と同一のエピトープに実質的に結合する抗体であるか、または、これと同一のエピトープに結合することについて競合する抗体であると考えられる。このアッセイの変更を行って、同一の定量的数値データに到達することができることが、理解される。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体、例えば次のモノクローナル抗体：
Figure 2007528845
の任意のものは、同一の抗原に結合する他の抗体と区別される当該抗体の生物学的特徴の１つまたは２つ以上を有するものであり、
Figure 2007528845
 は、
Figure 2007528845
 により結合されたものと同じエピトープに結合し（例えば、以下のモノクローナル抗体：
Figure 2007528845
 の、Ｐｒｏ１０４への結合と競合し、またはＰｒｏ１０４への結合を遮断し）、in vivoでＰｒｏ１０４発現腫瘍細胞を標的化することができ、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合する。
さらに、
Figure 2007528845
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 抗体の生物学的特性を有する抗体は、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合すると、内部移行する。
同様に、
Figure 2007528845
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 抗体の生物学的特性を有する抗体は、前者の抗体と同じ、エピトープ結合、標的化、内部移行、腫瘍増殖阻害および細胞毒性の特性を有する。
用語「アンタゴニスト」抗体は最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示した天然のＰｒｏ１０４タンパク質の生物学的活性を、部分的に、または完全に遮断、阻害または中和する抗体を含む。Ｐｒｏ１０４ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、Ｐｒｏ１０４ポリペプチドまたはＰｒｏ１０４を細胞表面上で発現する細胞を、候補のアンタゴニスト抗体と接触させることおよび、通常Ｐｒｏ１０４ポリペプチドと関連する１または２以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含むことができる。
「Ｐｒｏ１０４を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体」または「増殖阻害」抗体は、Ｐｒｏ１０４を発現するかまたは過剰発現する癌細胞に結合して、測定可能な増殖阻害をもたらすものである。好ましい増殖阻害抗Ｐｒｏ１０４抗体は、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍細胞（例えば乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞）の増殖を、適切な対照と比較して２０％より大きく、好ましくは約２０％〜約５０％、およびさらに一層好ましくは５０％より大きく（例えば約５０％〜約１００％）阻害し、対照は、典型的には、試験する抗体で処置していない腫瘍細胞である。増殖阻害を、細胞培養物中の約０．１〜３０ｐｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、ここで、増殖阻害は、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定される。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法で決定することができる。抗Ｐｒｏ１０４抗体を、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇで投与することにより、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少が、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内にもたらされる場合に、抗体はin vivoで増殖阻害的である。
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化および／または膜小胞の形成（アポトーシス体と呼ばれる）により決定される、プログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は、通常、Ｐｒｏ１０４を過剰発現するものである。好ましくは、細胞は、腫瘍細胞、例えば乳房細胞、卵巣細胞、膵臓細胞または肺細胞である。種々の方法が、アポトーシスに関連する細胞の事象を評価するのに利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座を、アネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化を、ＤＮＡラダリング(laddering)により評価することができ；およびＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン縮合を、低二倍体細胞の任意の増大により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘発をもたらすものである。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプに伴って変化する。抗体エフェクター機能の例には、以下のものが含まれる：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター）の下方調節；およびＢ細胞活性化。
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用」または「ＡＤＣＣ」は、ある細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲ）上に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞毒性エフェクター細胞が標的細胞を有する抗原に特異的に結合し、その後標的細胞を細胞毒で死滅させることを可能にする、細胞毒性の形態を意味する。抗体は細胞毒性細胞を「武装し(arm)」、このような死滅に絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。関連する分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、in vitroＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第5,500,362号または5,821,337号に記載されているものを、行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、またはさらに、関連する分子のＡＤＣＣ活性を、in vivoで、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて、評価することができる。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）を結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、対立形質の変異体および代替的にこれらのレセプターのスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、これは、主にこの細胞質ドメインにおいて異なっている、類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を、この細胞質ドメイン中に含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を、この細胞質ドメイン中に含む。（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の概説Ｍ．を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126.330-41 (1995)中に概説されている。将来同定されるべきものを含む、他のＦｃＲは、本明細書中の用語「ＦｃＲ」により包含される。この用語はまた、母系性のＩｇＧの胎児への輸送に関連する新生児レセプター、ＦｃＲｎを含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは２つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞および好中球が含まれ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、自然の供給源、例えば血液から単離することができる。
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、これらの同族の抗原に結合する抗体（適切なサブクラスの）への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
用語「癌」および「癌性」は、調節されていない細胞増殖により典型的に特徴付けられる、哺乳類の生理学的状態を意味するかまたは記述する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ様悪性腫瘍が含まれるが、これらには限定されない。このような癌のより特定的な例には、扁平細胞癌（例えば上皮性扁平細胞癌）並びに、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃癌(gastric or stomach cancer)、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓(kidney or renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳および頭および首の癌、並びに関連する転移が含まれる。
「Ｐｒｏ１０４発現細胞」は、細胞表面上で内因性のまたは形質移入したＰｒｏ１０４を発現する細胞である。「Ｐｒｏ１０４発現癌」は、細胞表面上に存在するＰｒｏ１０４タンパク質を有する細胞を含む癌である。「Ｐｒｏ１０４発現癌」は、この細胞の表面上で、抗Ｐｒｏ１０４抗体がこれに結合することができ癌に関して治療的効果を有するのに十分なレベルのＰｒｏ１０４を、産生する。Ｐｒｏ１０４を「過剰発現する」癌は、同一の組織の型の非癌性細胞と比較して、顕著に高いレベルのＰｒｏ１０４をこの細胞表面において有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、または増大した転写もしくは翻訳により生じ得る。Ｐｒｏ１０４過剰発現は、診断または予見アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＰｒｏ１０４タンパク質の増大したレベルを評価することにより（例えば免疫組織化学的アッセイ；ＦＡＣＳ分析により）、決定され得る。代替的に、または付加的に、細胞中のＰｒｏ１０４がコードする核酸またはｍＲＮＡのレベルを、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に刊行されたWO98/45479を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定することができる。また、Ｐｒｏ１０４過剰発現を、生物学的液体、例えば血清中における剥離した(shed)抗原を、例えば抗体に基づくアッセイを用いて測定することにより検討することができる（また、例えば米国特許第4,933,294号、１９９０年６月１２日刊行；W091/05264、１９９１年４月１８日刊行；米国特許第5,401,638号、１９９５年３月２８日刊行；およびSias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)を参照）。上記のアッセイとは別に、種々のin vivoアッセイが、技術のある実行者に有用である。例えば、細胞を、患者の体内で、随意に検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に曝露することができ、この抗体の患者の細胞への結合を、例えば放射性について外部走査することにより、または前に抗体に曝露した患者から採取した生検を分析することにより評価することができる。Ｐｒｏ１０４発現癌は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を含む。
癌を処置するかまたは癌の症状を寛解する目的のための「哺乳類」は任意の哺乳類を意味し、ヒト、家畜および養殖の動物、並びに動物園の、スポーツの、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳類は、ヒトである。
「処置する」または「処置」または「寛解」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を意味し、ここで、目的は、標的となる病理学的状態または障害を防止するかまたは遅延させる（低下させる）ことである。処置を必要としているものには、すでに障害を有しているもの、および障害を有する傾向があるもの、または障害が防止されるべきであるものが含まれる。対象または哺乳類は、本発明の方法により抗Ｐｒｏ１０４抗体の治療的な量が施与された後に、該患者が、以下の１つまたは２つの観察可能な、および／または測定可能な低減またはこの欠如を示す場合に、Ｐｒｏ１０４発現癌について成功に「処置される」：癌細胞の数の減少または癌細胞の欠如；腫瘍の大きさの減少；軟組織および骨中への癌の拡大を含む、癌細胞の末梢器官中への浸潤の阻害（即ち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（即ち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度までの阻害；および／または特定の癌に関連する症状の１つまたは２つ以上の、ある程度までの寛解；減少された罹患率および死亡率、並びに生活の質の問題における改善。抗Ｐｒｏ１０４抗体が、存在する癌細胞の増殖を防止し、かつ／またはこれを死滅させることができる程度に、これは、細胞分裂停止性および／または細胞毒性であり得る。これらの徴候または症状の低減はまた、患者により感じられ得る。
疾患における成功した処置および改善を評価するための上記のパラメーターは、医師に十分知られている常習的な手順により容易に測定可能である。癌療法のために、例えば疾患進行のための時間（ＴＴＰ）を評価し、かつ／または応答率（ＲＲ）を決定することにより、効能を測定することができる。
用語「治療的に有効な量」は、対象または哺乳類における疾患または障害を「処置する」のに有効な、抗体または薬剤の量を意味する。癌の場合において、薬剤の治療的に有効な量により、癌細胞の数が減少し；腫瘍の大きさが減少し；末梢器官中への癌細胞の浸潤が阻害され（即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止し）；腫瘍転移が阻害され（即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止し）；腫瘍増殖がある程度まで阻害され；かつ／または癌に関連する症状の１つまたは２つ以上が、ある程度まで寛解され得る。「処置する」の前記定義を参照。薬剤が、存在する癌細胞の増殖を防止し、かつ／またはこれを死滅させることができる程度に、これは、細胞分裂停止性および／または細胞毒性であり得る。
「慢性の」投与は、１種または２種以上の剤を、急性の方式に対して連続的な方式で投与して、長期間にわたり最初の治療的効果（活性）が維持されるようにすることを意味する。
「間欠性」投与は、中断なく連続的にはなされず、むしろ周期的な性質の処置である。
１種または２種以上の他の治療剤「と組み合わせて」の投与は、任意の順序での、同時の（併用）および連続的な投与を含む。
本明細書中で用いる「担体」には、用いられる投与量および濃度において曝露された細胞または哺乳類に無毒である、薬学的に許容し得る担体、添加剤または安定剤が含まれる。
しばしば、生理学的に許容し得る担体は、水性のｐＨ緩衝された溶液である。生理学的に許容し得る担体の例には、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個の残基よりも少ない）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。
本明細書中で用いる用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を生じる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamicin)、ビンカアルカロイド類(vinca alkaloids)（ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、エトポシド(etoposide)）、ドキソルビシン(doxorubicin)、メルファラン(melphalan)、マイトマイシン(mitomycin)Ｃ、クロラムブシル(chlorambucil)、ダウノルビシン(daunorubicin)または他の挿入剤、酵素およびこの断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、並びに毒素、例えば小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素であって、これらの断片および／または変種を含むもの、例えばゲロニン(gelonin)、リシン、サポリン並びに以下に開示する種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことを意図する。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を生じる。
本明細書中で用いる際には、「増殖阻害剤」は、細胞、特にＰｒｏ１０４発現癌細胞の増殖を、in vitroまたはin vivoのいずれかで阻害する化合物または組成物を意味する。従って、増殖阻害剤は、Ｓ期においてＰｒｏ１０４発現細胞のパーセンテージを顕著に減少させるものであってもよい。増殖阻害剤の例には、（Ｓ期以外の位置において）細胞サイクル進行を遮断する剤、例えばＧＩ停止およびＭ期停止を誘発する剤が含まれる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン(taxane)類およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシン(bleomycin)が含まれる。ＧＩを停止する剤はまたＳ期停止に波及し、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン(tamoxifen)、プレドニソン(prednisone)、ダカルバジン(dacarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびアラ(ara)−Ｃである。さらなる情報は、Murakami et al.によるThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel編、第１章、題名「細胞サイクル調節、発癌遺伝子および抗悪性腫瘍薬」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁中に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、脱重合を防止することにより微小管を安定化し、これにより細胞中での有糸分裂の阻害をもたらす。
本明細書中で用いる「標識」は、抗体に直接的に、または間接的に結合して、「標識した」抗体を生じる、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素的標識の場合においては、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。
本明細書中で用いる用語「エピトープタグ化」は、「タグポリペプチド」に融合した抗Ｐｒｏ１０４抗体ポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体を作成することができるエピトープを提供するのに十分であるが、これが融合するＩｇポリペプチドの活性に干渉しない程度には十分短い、残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、極めて独特であり、従って抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。好適なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６個のアミノ酸残基および通常８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
「小分子」は、本明細書中では、約５００ダルトンより小さい分子量を有すると定義される。
用語「添付文書」は、慣例的に治療製品の市販の包装中に含まれ、このような治療製品の使用に関する適応、使用、投与量、投与、禁忌および／または注意についての情報を含む使用説明書を意味するために用いる。
「単離された核酸分子」は、核酸分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーであって、これらは実質的に他のゲノムＤＮＡ配列およびタンパク質または複合体、例えばリボゾームおよびポリメラーゼから分離され、天然に天然配列を伴う。この用語は、この天然に存在する環境から除去された核酸分子を包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物および化学的に合成された類似体または異種性の系により生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸分子は、核酸分子の単離された形態を含む。
「ベクター」は、シャトルおよび発現ベクターを含み、例えばプラスミド、コスミドまたはファージミドを含む。典型的に、プラスミド構成物（construct）はまた、それぞれ細菌におけるプラスミドの複製および選択のための、複製の起点（例えば複製のＣｏｌＥｌ起点）および選択可能なマーカー（例えばアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）を含む。「発現ベクター」は、抗体の発現に必要な対照配列または調節要素を含むベクターを意味し、原核生物、例えば細菌または真核生物細胞における本発明の抗体断片を含む。好適なベクターを以下に開示する。
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、例えばＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ、並びに抗体をコードする核酸が導入された、細菌および真核生物宿主細胞が含まれる。好適な宿主細胞を、以下に開示する。
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する(Fire et al., 1998, Nature, 391, 806)。植物における対応するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、また真菌における停止を意味する。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、種々の植物相および門により一般的に共有された外来の遺伝子の発現を防止するために用いられる、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる(Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358)。外来の遺伝子発現からのこのような保護は、相同的な単鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答による、ウイルス感染またはホストゲノム中へのトランスポゾン要素の無秩序な一体化に由来する、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して進化した場合がある。細胞中のｄｓＲＮＡの存在によりＲＮＡｉ応答が誘発されるが、機構は未だ完全には特徴付けられていない。この機構は、プロテインキナーゼＰＫＰおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化からもたらされ、結果としてリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断を生じさせるインターフェロン応答とは、異なると考えられる。
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られている、ｄｓＲＮＡの短い片中へのｄｓＲＮＡの加工に関与する(Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363)。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には、長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９個の塩基対二本鎖を含む。ダイサーはまた、翻訳制御に関係する、保存された構造のＲＮＡ前駆体からの２１および２２ヌクレオチドの小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除に関係していた(Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834)。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、一般にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において起こる(Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188)。
低分子干渉ＲＮＡが媒介するＲＮＡｉは、種々の系において研究された。Fire et al., 1998, Nature, 391, 806は、C. Elegans中のＲＮＡｉを最初に観察した。Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70には、マウス胚におけるｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉが記載されている。Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293には、ｄｓＲＮＡを形質移入したショウジョウバエ細胞中のＲＮＡｉが記載されている。Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494には、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養した哺乳類細胞中の、合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖の導入により誘発されたＲＮＡｉが記載されている。ショウジョウバエ胚可溶化液における最近の研究（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877）により、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するのに必須のｓｉＲＮＡ長さ、構造、化学的組成および配列についてのある必要条件が明らかになった。これらの研究により、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が、２個のヌクレオチド３’−オーバーハングを含む際に、最も活性であることが示された。さらに、２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有する一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換により、ＲＮＡｉ活性が消失し、一方３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による置換は、耐容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心での単一のミスマッチ配列はまた、ＲＮＡｉ活性を消失させることが示された。さらに、これらの研究はまた、標的のＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡ案内配列の３’末端ではなく、５’末端により定められることを示す(Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)。他の研究により、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補的鎖上の５’リン酸塩がｓｉＲＮＡ活性のために必要であること、および、ＡＴＰによってｓｉＲＮＡ上の５’リン酸塩部分が維持されることが示された（Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309)。
研究により、２個のヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体のｓｉＲＮＡ二本鎖の３’オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換することは、ＲＮＡｉ活性に対して悪影響を有さないことが示された。ｓｉＲＮＡの各末端上での４個までのヌクレオチドの、デオキシリボヌクレオチドによる置換は、良好に耐容される一方、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換の結果、ＲＮＡｉ活性はもたらされないことが、報告された(Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)。さらに、Elbashir et al.、上記はまた、ｓｉＲＮＡの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの置換により、ＲＮＡｉ活性が完全に消失されることを報告している。Li et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/44914およびBeach et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/68836は、共に、ｓｉＲＮＡが、「リン酸塩−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含んで、少なくとも１個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含むことができる」ことを示唆しているが、いずれの出願にも、いずれの程度まで、これらの修飾が、ｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかが教示されておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供されていない。Kreutzer and Limmer、カナダ国特許出願第2,359,180号にはまた、ｄｓＲＮＡ構成物において用いて、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＰＫＲ、特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を妨げるための、ある化学的修飾が記載されている。しかし、KreutzerおよびLimmerは、同様に、いずれの程度まで、これらの修飾が、ｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかを示しておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供していない。
Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087は、C. elegansにおけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的化するある化学的修飾を、長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いて試験した。この著者は、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼを有するチオリン酸塩ヌクレオチド類似体を包含させることによる、これらのｓｉＲＮＡ転写物中へのチオリン酸塩残基の導入を記載し、「２つの（ホスホロチオエート）修飾塩基を有するＲＮＡがまた、ＲＮＡｉトリガーとしての有効性の顕著な低下を有し（データは示していない）；２つよりも多い残基の（ホスホロチオエート）修飾により、in vitroでＲＮＡが大きく不安定になり、我々は、干渉活性を分析することができなかった」ことを観察した。同上、1081。この著者はまた、長いｓｉＲＮＡ転写物中のヌクレオチド糖の２’位置において、ある修飾を試験し、デオキシリボヌクレオチドのリボヌクレオチドによる置換が、「干渉活性の顕著な低下を生じる」ことを観察し、特にウリジンのチミジンへの、および／またはシチジンのデオキシシチジンへの置換の場合においてそうであった。同上。さらに、この著者は、ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖における４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、３−（アミノアリル）ウラシルの、ウラシルへの置換、およびイノシンのグアノシンへの置換を含む、ある塩基修飾を試験し、いずれの鎖中に含まれる際にも、４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルがすべて良好に耐容される一方、イノシンが「干渉活性において顕著な低下を生じた」ことを見出した。５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの、アンチセンス鎖における導入の結果、ＲＮＡｉ活性の顕著な低下が同様にもたらされた。
Beach et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/68836には、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いた、遺伝子発現を減衰する特定の方法が記載されている。Tuschl et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/75164には、ショウジョウバエin vitroＲＮＡｉ系並びに、特定のｓｉＲＮＡ分子の、ある機能的ゲノムおよびある治療的用途のための使用が記載されている；しかし、Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245では、「インターフェロン応答を活性化する危険」のために、ＲＮＡｉを用いて遺伝子的疾患またはウイルス感染を治療することは、できないのではないかと疑われている。Li et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/44914には、ある標的遺伝子の発現の減衰において用いるための、特定のｄｓＲＮＡの使用が記載されている。Zernicka-Goetz et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/36646には、哺乳類細胞における特定の遺伝子の発現を、あるｄｓＲＮＡ分子を用いて阻害するための、ある方法が記載されている。Fire et al., 国際ＰＣＴ公開WO 99/32619には、遺伝子発現の阻害において用いるための、あるｄｓＲＮＡ分子を細胞中に導入する特定の方法が記載されている。Plaetinck et al., 国際ＰＣＴ公開WO 00/01846には、細胞中の特定の表現型を付与する原因となる特定の遺伝子を、特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて同定するためのある方法が記載されている。Mello et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/29058には、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定が記載されている。Deschamps Depaillette et al., 国際ＰＣＴ公開WO 99/07409には、ある抗ウイルス剤と組み合わされた、特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物が記載されている。Driscoll et al., 国際ＰＣＴ公開WO 01/49844には、標的の生物における遺伝子サイレンシングの促進において用いるための、特定のＤＮＡ構成物が記載されている。Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087には、C. elegansのｕｎｃ−２２遺伝子を標的にする、特定の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。Tuschl et al., 国際ＰＣＴ公開WO 02/44321には、ある合成ｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。
本発明の組成物および方法
本発明は、抗Ｐｒｏ１０４抗体を提供する。好ましくは、抗Ｐｒｏ１０４抗体は、哺乳類細胞上の細胞表面Ｐｒｏ１０４に結合すると内部移行する。抗Ｐｒｏ１０４抗体はまた、Ｐｒｏ１０４を有する腫瘍細胞を破壊するか、またはこの破壊をもたらすことができる。
Ｐｒｏ１０４は、内部移行競合的であることは、明らかではなかった。さらに、抗体が内部移行する能力は、親和性、結合活性、および抗体のアイソタイプ、およびこれが結合するエピトープを含むいくつかの要因に依存する。本発明者らは、本明細書中で、細胞表面Ｐｒｏ１０４が、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体により結合されると内部移行競合的であることを例証した。さらに、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体が、in vivoでＰｒｏ１０４発現腫瘍細胞を特定的に標的化し、これらの細胞を阻害するかまたは死滅させることができることが、例証された。抗Ｐｒｏ１０４抗体のこれらのin vivoでの腫瘍標的化、内部移行および増殖阻害特性により、これらの抗体が、治療的使用、例えば、乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌を含む種々の癌の処置において、極めて好適となる。抗Ｐｒｏ１０４抗体の内部移行は、例えば、抗体または抗体結合体が作用の細胞内部位を有する場合、およびこの抗体に結合した細胞毒性剤（例えば毒素カリケアマイシン）が血漿膜を容易に横断しない場合に、好ましい。内部移行は、抗体または抗体に結合した剤が作用の細胞内部位を有さない場合、例えば抗体が、ＡＤＣＣまたはある他の機構により腫瘍細胞を死滅させることができる場合には、必要ではない。
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体はまた、種々の非治療的用途を有する。本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体は、Ｐｒｏ１０４発現癌の診断およびステージ分類のために有用であり得る（例えば放射性イメージングにおいて）。これらを、単独で、または他の卵巣癌マーカーと組み合わせて用いることができ、該マーカーには、限定されることなく、ＣＡ１２５、ＨＥ４およびメソセリンが含まれる。この抗体はまた、Ｐｒｏ１０４を細胞から精製または免疫沈殿するために、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいてin vitroでＰｒｏ１０４を検出および定量するために、他の細胞の精製における１ステップとして、Ｐｒｏ１０４発現細胞を混合細胞の集団から死滅させ、排除するために、有用である。本発明の内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体は、本明細書中で「抗体」の定義により包含される種々の形態であってもよい。従って、抗体は、全長の、または無傷な抗体、抗体断片、天然配列の抗体またはアミノ酸変異体、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫結合体およびこれらの機能的断片を含む。融合抗体においては、抗体配列は、異種性のポリペプチド配列に融合される。抗体を、Ｆｃ領域において修飾して、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の章において一層詳細に記載するように、適切なＦｃ領域を用いて、細胞表面上に結合した裸の抗体は、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）により、または補体依存性細胞傷害作用において補体を獲得することにより、またはある他の機構により、細胞毒性を誘発することができる。代替的に、エフェクター機能を消失させるかまたは低減させて、副作用または治療の合併症を最小にするのが望ましい場合において、ある他のＦｃ領域を用いることができる。
抗体は、本発明の抗体により結合された同一のエピトープに結合することについて競合し、または実質的にこれに結合することができる。本発明のこの抗Ｐｒｏ１０４抗体の生物学的特徴を有する抗体も意図され、例えば、特にin vivoでの腫瘍標的化、内部移行およびすべての細胞増殖阻害または細胞毒性特徴を含む、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078に一致するハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体の生物学的特徴を有する抗Ｐｒｏ１０４抗体である。具体的に提供されるのは、ヒトＰｒｏ１０４のアミノ酸１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３１０〜３１４、において存在するエピトープに結合する、抗Ｐｒｏ１０４抗体である。
上記の抗体を産生するための方法を、以下に詳細に記載する。
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体は、哺乳類におけるＰｒｏ１０４発現癌を処置するかまたは癌の１つもしくは２つ以上の症状を寛解するのに、有用である。このような癌は、卵巣癌および膵臓癌、尿路の癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、および肺癌を含む。かかる癌には、より具体的に、卵巣漿液性腺癌、乳房浸潤性乳管癌、前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、直腸結腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫および胸膜中皮腫が含まれる。乳癌は、ＨＥＲ−２陰性または陽性乳癌であってよい。癌は、上記の任意の転移性癌、例えば乳癌転移、卵巣癌転移、膵臓癌転移および肺癌転移を包含する。この抗体は、哺乳類におけるＰｒｏ１０４を発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができ、好ましくはＨＡＭＡ応答を誘発しないかまたはこれを最小化するものである。好ましくは、抗体は、in vivoまたはin vitroで、細胞上のＰｒｏ１０４に結合すると、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞を破壊または死滅させるか、またはかかる腫瘍細胞の増殖を阻害するのに、有効なものである。かかる抗体は、裸の抗Ｐｒｏ１０４抗体（いかなる剤にも結合していないもの）を含む。in vivoでの腫瘍増殖阻害特性を有する裸の抗Ｐｒｏ１０４抗体には、以下の実験例に記載する抗体が含まれる。細胞毒性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体を、さらに、細胞毒性剤と結合させて、これらを、腫瘍細胞破壊において尚一層有効にすることができる。例えばこの抗Ｐｒｏ１０４抗体を細胞毒性剤と結合させて、以下に記載するように免疫結合体を形成することにより、抗Ｐｒｏ１０４抗体に細胞毒性特性を付与することができる。細胞毒性剤または増殖阻害剤は、好ましくは、小分子である。毒素、例えばメイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド(maytansinoid)、サポリン、ゲロニン、リシンまたはカリケアマイシンおよびこれらの類似体または誘導体が、好ましい。
本発明は、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体および担体を含む組成物を提供する。癌の処置のために、組成物を、かかる処置を必要としている患者に投与することができ、ここでこの組成物は、免疫結合体として、または裸の抗体として存在する１種または２種以上の抗Ｐｒｏ１０４抗体を含むことができる。さらに、この組成物は、これらの抗体を、他の治療剤、例えば化学療法剤を含む細胞毒性または増殖阻害剤と組み合わせて含むことができる。本発明はまた、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体および担体を含む製剤を提供する。この製剤は、薬学的に許容し得る担体を含む治療的製剤であってもよい。
本発明の他の観点は、内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードする、単離された核酸である。ＨおよびＬ鎖の両方並びに特に超可変領域残基をコードする核酸、天然配列の抗体および変異体をコードする鎖、抗体の修飾物およびヒト化された様式が包含される。
本発明はまた、哺乳類におけるＰｒｏ１０４発現癌を処置するかまたはこの癌の１つもしくは２つ以上の症状を寛解するのに有用な方法であって、内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体の治療的に有効な量を該哺乳類に投与することを含む、前記方法を提供する。この抗体治療組成物を、医師により指示されたように、短期間（急性）もしくは慢性的に、または間欠的に投与することができる。また提供されるのは、Ｐｒｏ１０４発現細胞の増殖を阻害し、これを死滅させる方法である。最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１種の抗体を含むキットおよび製造品、好ましくは、in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合する本発明の少なくとも１種の抗Ｐｒｏ１０４抗体、または本発明の少なくとも１種の内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体を含む、キットおよび製造品を提供する。抗Ｐｒｏ１０４抗体を含むキットは、Ｐｒｏ１０４発現の検出において、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて、例えばＰｒｏ１０４細胞死滅アッセイのために、またはＰｒｏ１０４の細胞からの精製および／または免疫沈殿のために、用途が見出される。例えば、Ｐｒｏ１０４の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｐｒｏ１０４抗体を含むことができる。in vitroでの、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおけるＰｒｏ１０４の検出および定量のための抗体を含むキットを、提供することができる。検出に有用なこのような抗体は、標識、例えば蛍光または放射性標識と共に提供することができる。
抗Ｐｒｏ１０４抗体の産生
以下に、本発明において有用な抗体の産生のための例示的な手法を記載する。これらの手法のいくつかを、さらに例１に記載する。抗体の産生のために用いるべきＰｒｏ１０４抗原は、例えば、膜貫通配列を欠いているＰｒｏ１０４の溶解性形態またはタンパク質の選択された部分に対する合成ペプチドを含む、全長ポリペプチドまたはこの一部であってもよい。
代替的に、細胞表面においてＰｒｏ１０４を発現する細胞（例えばＰｒｏ１０４を過剰発現するように形質転換されたＣＨＯまたはＮＩＨ−３Ｔ３細胞；卵巣、膵臓、肺、乳房もしくは他のＰｒｏ１０４発現腫瘍細胞系）、またはかかる細胞から調製される膜を用いて、抗体を生成することができる。ヒトおよびマウスＰｒｏ１０４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、前に示したように入手可能である。Ｐｒｏ１０４は、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて、原核細胞、例えば細菌細胞、または真核細胞において組換え的に産生し、これから単離することができる。Ｐｒｏ１０４を、タグ化（例えばエピトープタグ）として、または他の融合タンパク質として発現させて、種々のアッセイにおけるその単離およびその同定を容易にすることができる。
種々のタグおよび融合配列に結合する抗体または結合タンパク質は、以下に詳しく述べるように入手可能である。抗体を生成するのに有用なＰｒｏ１０４の他の形態は、当業者に明らかである。
タグ
種々のタグポリペプチドおよびこれらのそれぞれの抗体が、当該分野においてよく知られている。例には、ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびこの抗体１２ＣＡ５(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988))；ｃ−ｍｙｃタグ並びにこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985))；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびこの抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))が含まれる。ＦＬＡＧペプチド(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988))は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体により認識される(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。ＦＬＡＧペプチドを含むタンパク質の精製は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、アガロースに共有結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を含むアフィニティーマトリックスを用いて行うことができる(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。他のタグポリペプチドには、ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]；α−チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chenz., 266:15163-15166 (1991))；およびＴ７遺伝子タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物、好ましくは非ヒト動物において、関連する抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により生じる。関連する抗原を、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質に結合させることが（特に合成ペプチドを用いる場合）、有用であり得る。例えば、抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能化または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１が異なるアルキル基である）を用いて結合させることができる。結合体はまた、タンパク質融合として組換え細胞培養物中に作製することができる。
動物を、抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して、例えば５〜１００ｐｇのタンパク質または結合体（それぞれウサギまたはマウスに対して）を、３容量の完全フロイントアジュバントと混ぜ合わせ、溶液を皮内に、複数の部位において注射することにより免疫化することができる。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバント中のペプチドまたは結合体の最初の量の１／５〜１／１０で、複数の部位における皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後、動物を放血させ、血清を、抗体力価についてアッセイする。動物を、力価が水平状態になるまで追加免疫する。また、凝集剤、例えばミョウバンを、好適に用いて、免疫応答を増強する。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)により記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製するか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第4,816,567号）により、作製することができる。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切なホスト動物、例えばハムスターを、上記のように免疫化して、免疫化のために用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を顕在化させる。代替的に、リンパ球を、in vitroで免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次に「融合パートナー」、例えば骨髄腫細胞系と、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。
このように調製したハイブリドーマ細胞を好適な培養培地中に播種し、この中で増殖させ、この培地は、好ましくは、融合していない融合パートナー例えば親骨髄腫細胞の、増殖または生存を阻害する１種または２種以上の物質を含む。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合には、ハイブリドーマのための選択的な培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、融合していない親細胞に対して選択する選択的培地に高感度であるものである。好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−ＩＩマウス腫瘍に由来するもの並びにＳＰ−２および誘導体、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville, Maryland USAから入手できるＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫(heteromyeloma)細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈殿により、またはin vitro結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する。
モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているScatchard分析により決定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、クローンを、制限希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。この目的に適する培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、in vivoで、動物における腹水腫瘍として、例えばマウス中への細胞のｉ．ｐ．注射により増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、培養培地、腹水流体または血清から、慣用の抗体精製手順、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースを用いて）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより好適に分離する。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を用いて（例えばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として作用する。単離した後に、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、次にこれを、他の方法では抗体タンパク質を産生しない、原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞に形質転換または形質移入して、組換え宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現についての概説記事は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)およびPhickthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
さらに、モノクローナル抗体または抗体断片を、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)中に記載された手法を用いて生成した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)には、ファージライブラリーを用いた、マウスおよびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。その後の刊行物には、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の、連鎖混合による産生(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに極めて大きいファージライブラリーを構成するための方法としての、組み合わせ感染およびin vivo組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))が記載されている。従って、これらの手法は、モノクローナル抗体を単離するための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に代わる実行可能な代替法である。
抗体をコードするＤＮＡを修飾して、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを産生することができ、この修飾は例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域（ＣＨおよびＣＬ）配列を、相同的なマウス配列で置換することによる（米国特許第4,816,567号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチド（異種性ポリペプチド）についてのコード配列の全部または一部と融合することによる修飾である。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常領域で置換することができ、または、これらを抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変領域で置換して、１つの抗原への特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位と、異なる抗原への特異性を有する他の抗原組み合わせ部位とを含む、キメラの２価の抗体を作製する。
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、この中に非ヒトである供給源から導入された１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは、典型的には、「移入」可変領域から採取される。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法に従って(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、ここで、無傷のヒト可変領域より顕著に小さいものが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における同様の部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製において用いるべき、軽および重の両方のヒト可変領域の選択は、抗体のヒトの治療的使用を意図する際には、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低減するのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、げっ歯類抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングする。げっ歯類のものに最も近いヒトＶ領域配列を同定し、この中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト化抗体のために受容される(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために用いることができる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993))。
抗体が、抗原に対する高い結合親和性および他の好ましい生物学的特性を維持してヒト化されるのが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列の分析のプロセスおよび種々の概念的ヒト化生成物により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者に精通されている。
選択された免疫グロブリン候補配列の可能な三次元高次構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の検査により、免疫グロブリン候補配列の機能における残基の、可能性のある作用の分析、即ちこの抗原に結合する免疫グロブリン候補の能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を、受容者から選択し、組み合わせ、配列を移入して、所望の抗体特性、例えば１または２以上の標的抗原への増大した親和性を達成することができる。一般に超可変領域残基は、抗原結合への影響において直接的に、および最も実質的に関与する。
ヒト化抗Ｐｒｏ１０４抗体の種々の形態が意図される。例えば、ヒト化抗体は、随意に１種または２種以上の細胞毒性剤と結合して、免疫結合体を生じる抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。代替的に、ヒト化抗体は、無傷の抗体、例えば無傷のＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記述された。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、かかる生殖系列突然変異マウスへ移動した結果、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号、5,569,825号、5,591,669号（すべてGenPharm）；5,545,807号を参照；および、代替的に、ファージ提示手法(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、in vitroで、免疫化していない供与者からの免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから産生することができる。この手法によれば、抗体Ｖ領域遺伝子を、インフレームで、糸状バクテリオファージ、例えばＭｌ３またはｆｄの主要な、または主要でない被覆タンパク質遺伝子のいずれか中にクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体断片として表示する。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的な特性に基づく選択によっても、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。従って、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示法を、種々の様式で行うことができ、これは、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)中に概説されている。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージ提示法のために用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さい無秩序な組み合わせライブラリーから単離した。免疫化していないヒト供与者からのＶ遺伝子のレパートリーを構成することができ、抗原（自己抗原を含む）の種々のアレイに対する抗体を、本質的にMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された手法に従って単離することができる。また米国特許第5,565,332号および5,573,905号も参照。上記したように、ヒト抗体もまた、in vitro活性化Ｂ細胞により生成することができる（米国特許第5,567,610号および5,229,275号を参照）。
抗体断片
ある状況においては、完全抗体よりむしろ抗体断片を用いる方に利点がある。断片のより小さいサイズにより、迅速なクリアランスが可能になり、固体腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。種々の手法が、抗体断片の産生のために開発された。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化に由来した（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしこれらの断片は、現在では、直接組換え宿主細胞により産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌において発現され、これから分泌されることができ、従って大量のこれらの断片の容易な産生が可能になる。抗体断片を、上記した抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ）２断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。他の方法において、Ｆ（ａｂ）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含む、増大したin vivoでの半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片は、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片の産生のための他の手法は、技術のある実行者に明らかである。選択された抗体はまた、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であってもよい。WO 93/16185；米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号を参照。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠いている無傷の組み合わせ部位を有する唯一の種である；従って、これらは、in vivoで用いる間に低下した非特異的結合に適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構成して、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を得ることができる。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck、上記を参照。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直線状抗体」であってもよい。かかる直線状抗体断片は、単一特異的または二重特異的であってもよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｐｒｏ１０４タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、Ｐｒｏ１０４結合部位を、他のタンパク質についての結合部位と組み合わせることができる。代替的に、抗Ｐｒｏ１０４アームを、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞レセプター分子（例えばＣ１３３）またはＩｇＧについてのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をＰｒｏ１０４発現細胞に集中させ、局在化させることができる。二重特異性抗体はまた、細胞毒性剤をＰｒｏ１０４を発現する細胞に局在化させるために用いることもできる。これらの抗体は、Ｐｒｏ１０４結合アームおよび細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。WO 96/16673には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、WO98/02463中に示されている。米国特許第5,821,337号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において知られている。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで、２つの鎖は、異なる特異性を有する(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の無秩序な分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能な混合物を産生し、この中で、１個のみが、正確な二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィーのステップにより行われる、正確な分子の精製は、いくらか面倒であり、生成物の収量は低い。同様の手順は、WO 93/08829およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
別の方法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗体可変領域が、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。好ましくは、この融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含むＩｇ重鎖定常領域との融合である。軽鎖結合に必要な部位を含み、融合の少なくとも１つに存在する、第１の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有するのが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主細胞中に同時形質移入する。これにより、構造において用いられる３つのポリペプチド鎖の異なる比率によって所望の二重特異性抗体の最適な収量を提供する態様において、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際のより大きい柔軟性が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現の結果、高い収量が得られる場合、または、所望の鎖の組み合わせの収量に対してこの比率が顕著な影響を及ぼさない場合には、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を、単一の発現ベクター中に挿入することが可能である。
好ましくは、この方法における二重特異性抗体は、一方のアーム中に第１の結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖および、他方のアーム中のハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造により、所望の二重特異性化合物が、所望でない免疫グロブリン鎖組み合わせから容易に分離されることが見出され、これは、二重特異性分子の片半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、容易な分離方法が提供されるからである。この方法はWO 94/04690中に開示されている。二重特異性抗体を生じるさらなる詳細について、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。
米国特許第5,731,168号に記載されている他の方法によれば、一対の抗体分子の間の界面を設計して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることができる。好ましい界面は、ＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つまたは２つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置換される。１つまたは２つ以上の大きい側鎖と同一であるか、またはこれと類似した大きさの補償的な「空洞」が、第２の抗体分子の界面上に、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することにより作り出される。これにより、ヘテロ二量体の収量を、例えばホモ二量体などの他の所望でない最終生成物より多くするための機構が提供される。
二重特異性抗体には、架橋した、または「ヘテロ結合した(heteroconjugate)」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ結合体中の抗体の一方をアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、所望でない細胞に対して（米国特許第4,676,980号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（WO 91/00360、WO 92/200373およびEP 03089）、免疫系細胞を標的化するために提案されている。ヘテロ結合抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において十分知られており、米国特許第4,676,980号に、多くの架橋手法と共に開示されている。
二重特異性抗体を抗体断片から生成するための手法は、文献にも記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)には、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤、ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近隣のジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生じたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再び変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための剤として用いることができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接的な回収が容易になり、これを化学的に結合して、二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各々のＦａｂ’断片は、大腸菌から別個に分泌されており、これに、in vitroでの定方向化学的カップリングを施して、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成した二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合でき、またヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接作製し、単離するための種々の手法もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体が、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により結合された。抗体ホモ二量体を、ヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次に再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。また、この方法を、抗体ホモ二量体の産生のために用いることができる。
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記載された「ダイアボディー」手法により、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構が提供された。この断片は、同一の鎖上の２つの領域間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによりＶＬに結合するＶＨを含む。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬ領域を、他の断片の相補的なＶＬおよびＶＨ領域と強制的に対形成させ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いることにより二重特異性抗体断片を作製するための、他の方法も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
２よりも大きい価数を有する抗体が、意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、２価の抗体よりも迅速に内部移行する（および／または異化する）ことができる。本発明の抗体は、３つまたは４つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外である）多価の抗体（例えば４価の抗体）であってもよく、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価の抗体は、二量体化領域および３つまたは４つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化領域は、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれからなる）。この筋書きにおいて、抗体は、Ｆｃ領域および、Ｆｃ領域に対する３つまたは４つ以上の抗原結合部位アミノ末端を含む。本明細書中で好ましい多価抗体は、３個〜約８個、しかし好ましくは４個の、抗原結合部位を含む（またはこれからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、２つまたは３つ以上の可変領域を含む。例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、ＶＤｌ（Ｘ１ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここで、ＶＤ１は、最初の可変領域であり、ＶＤ２は、２番目の可変領域であり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、以下のものを含むことができる：ＶＨ−ＣＨＩ−柔軟リンカー−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、さらに、少なくとも２つ（および好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２個〜約８個の軽鎖可変領域ポリペプチドを含むことができる。本明細書中で意図する軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、随意にさらにＣＬ領域を含む。
他のアミノ酸配列修飾
本明細書中に記載した抗Ｐｒｏ１０４抗体の１または２以上のアミノ酸配列修飾が、意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗Ｐｒｏ１０４抗体のアミノ酸配列変異体を、適切なヌクレオチド変化を抗Ｐｒｏ１０４抗体核酸中に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。
かかる修飾には、例えば、抗Ｐｒｏ１０４抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはこの中への挿入および／またはこの置換が含まれる。最終的な構成物が、所望の特徴を有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って、最終的な構成物に到達する。アミノ酸変化はまた、抗Ｐｒｏ１０４抗体の翻訳後プロセスを変えることができ、例えばグリコシル化部位の数または位置の変化させる。
変異原性のための好ましい位置である抗Ｐｒｏ１０４抗体のある残基または領域の同定に有用な方法は、Cunningham and Wellsにより、Science, 244:1081-1085 (1989)中に記載されているように、「アラニン走査変異原性」と呼ばれる。ここで、抗Ｐｒｏ１０４抗体内の残基または標的残基の群（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ）を同定し、中性の、または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換して、アミノ酸のＰｒｏ１０４抗原との相互作用に影響を及ぼす。
次に、置換に対する機能的な感受性を例証するアミノ酸の位置を、置換の部位において、またはこの部位についてさらなる、または他の変種を導入することにより精巧にする。従って、アミノ酸配列の変更を導入するための部位が、予め決定されている一方、これ自体の突然変異の性質を、予め決定する必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａ走査または無秩序な変異原性を、標的コドンまたは領域において行い、発現された抗Ｐｒｏ１０４抗体変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から、１００個またはこれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲内のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一の、または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗Ｐｒｏ１０４抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗Ｐｒｏ１０４抗体分子の他の挿入変異体には、酵素に対する（例えばＡＤＥＰＴについての）抗Ｐｒｏ１０４抗体のＮもしくはＣ末端への融合、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合が含まれる。
変異体の他の種類は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、少なくとも１個のアミノ酸残基を、異なる残基により置換された抗Ｐｒｏ１０４抗体分子中に有する。置換変異原性に最も大きく関連する部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変化もまた意図される。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に、表Ｉに示す。かかる置換により、生物学的活性の変化がもたらされる場合には、表１において「例示的な置換」と命名されているか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されている、さらに実質的な変化を導入し、生成物を、所望の特性についてスクリーニングすることができる。
Figure 2007528845
抗体の生物学的特性における実質的な修飾が、（ａ）例えばシートもしくはらせん高次構造としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するこれらの効果において顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｌｉｅ；（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存性置換は、これらの群の１つの要素の、他の群のものでの交換を伴う。抗Ｐｒｏ１０４抗体の適切な高次構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基はまた、一般にセリンで置換されることができ、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止する。逆に、１または２以上のシステイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体が、例えばＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
置換変異体の特に好ましい種類は、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の１つまたは２つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる発生について選択された、得られた１種または２種以上の変異体は、これらを生成する親抗体に比べて改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生じるための好都合な方法は、ファージ提示法を用いた親和性成熟を伴う。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を変異させて、各々の部位において可能なアミノ酸置換のすべてを生じさせる。このようにして生じた抗体変異体を、糸状ファージ粒子から、各々の粒子内に包装されたＭｌ３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合として、１価の様式で提示する。次に、ファージ提示された変異体を、本明細書中に開示したように、これらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補の超可変領域部位を同定するために、アラニン走査変異生成を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的に、または付加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＰｒｏ１０４との間の接触点を同定することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接する残基は、本明細書中で詳しく述べる手法による置換のための候補である。かかる変異体が生じた後に、変異体のパネルに、本明細書中に記載したようにスクリーニングを施し、１つまたは２つ以上の関連するアッセイにおける優れた特性を有する抗体を、さらなる発生について選択することができる。
抗体の他の種類のアミノ酸変異体は、抗体のもとのグリコシル化パターンを変化させる。変化させることにより、抗体中に見出される１つもしくは２つ以上の炭水化物部分の欠失、および／または抗体中に存在しない１つもしくは２つ以上のグリコシル化部位の添加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、炭水化物部分が、アスパラギン残基の側鎖に結合していることを意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のいずれかが、ポリペプチド中に存在することにより、有効なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いることができる。アミノ酸配列を変化させて、これが上記したトリペプチド配列の１つまたは２つ以上を含むようにする（Ｎ結合型グリコシル化部位について）ことにより、抗体へのグリコシル化部位の添加が好都合に達成される。変化はまた、１つまたは２つ以上のセリンまたはスレオニン残基の、もとの抗体の配列への添加、またはこれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
抗Ｐｒｏ１０４抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を、当該分野において知られている種々の方法により調製する。これらの方法には、自然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的な）変異生成、ＰＣＲ変異生成、および抗Ｐｒｏ１０４抗体の変異体もしくは非変異体方式をコードする、早期に調製された核酸分子のカセット変異生成による調製が含まれるが、これらには限定されない。
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して修飾して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するのが、望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域における１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。代替的に、または付加的に、１個または２個以上のシステイン残基をＦｃ領域中に導入して、これによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして生じたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されたように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。代替的に、二重のＦｃ領域を有し、これにより増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を設計することができる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体断片）中に導入することができる。本明細書中で用いる用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、抗体のＦｃ領域のエピトープを意味する。
所望の特性を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を生成するための手法は、上に記載した。さらに、所望により、ある生物学的特性を有する抗体を選択することができる。
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体の増殖阻害効果を、当該分野において知られている方法により、例えばＰｒｏ１０４を発現する細胞を、内因的に、またはＰｒｏ１０４遺伝子の形質移入に続いて用いて、評価することができる。例えば、以下の例１に提供する腫瘍細胞系およびＰｒｏ１０４形質移入細胞を、本発明の抗Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体で、種々の濃度において、数日（例えば２〜７日）にわたり処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し、またはある他の比色アッセイにより分析することができる。増殖を測定する他の方法は、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体の存在下で、または不存在下で処理した細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収穫し、ＤＮＡ中に導入された放射能の量を、シンチレーションカウンターにおいて定量する。適切な陽性対照には、選択された細胞系の、当該細胞系の増殖を阻害することが知られている増殖阻害抗体による処理が含まれる。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法により決定することができる。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｐｒｏ１０４を過剰発現するものである。好ましくは、抗Ｐｒｏ１０４抗体は、in vitroまたはin vivoでＰｒｏ１０４発現腫瘍細胞の細胞増殖を、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、未処理の腫瘍細胞と比較して、約２５〜１００％、さらに好ましくは約３０〜１００％、およびさらにより好ましくは約５０〜１００％または７０〜１００％、阻害する。増殖阻害は、細胞培養物中で、約０．５〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度において測定することができ、ここで、増殖阻害を、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定する。抗体は、約１μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇにおける抗Ｐｒｏ１０４抗体の投与により、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少がもたらされた場合に、in vivoで増殖阻害的である。
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばプロピジウムヨージド（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みにより示される膜完全性の損失を、対照に対して評価することができる。ＰＩ取り込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不存在において行うことができる。Ｐｒｏ１０４発現腫瘍細胞は、培地のみ、または例えば約１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含む培地と共にインキュベートする。細胞は、３日の期間にわたりインキュベートする。各々の処理に続いて、細胞は、３５ｍｍの濾過器でキャップした１２×７５の管（管あたり１ｍｌ、処理群あたり３つの管）中に、細胞凝集塊の除去のために洗浄し、等分する。次に、管に、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を施与する。試料を、FACSCAN（登録商標）フローサイトメーターおよびFACSCONVERT（登録商標）CellQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて分析することができる。ＰＩ取り込みにより決定される、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体を、細胞死誘発抗体として選択することができる。
例えば本発明のＰｒｏ１０４抗体などの関連する抗体により結合されるＰｒｏ１０４上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような、常習的なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイを用いて、試験抗体が、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体と同一の部位またはエピトープに結合するか否かを決定することができる。代替的に、または付加的に、エピトープマッピングを、当該分野において知られている方法により行うことができる。例えば、抗体配列を、例えばアラニン走査により変異誘発して、接触残基を同定することができる。変異体抗体を、最初にポリクローナル抗体との結合について試験して、適切な折り畳みを確保する。異なる方法においては、Ｐｒｏ１０４の種々の領域に対応するペプチドを、試験抗体を用いた、または試験抗体および特徴付けられるかもしくは既知のエピトープを有する抗体を用いた、競合アッセイにおいて用いることができる。
例えば、本発明の抗体により結合されるエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするための方法は、Ｐｒｏ１０４含有試料を試験抗体および本発明の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成することを含むことができ、次に混合物中のＰｒｏ１０４に結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルを決定し、混合物中で結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルについて対照混合物に対して比較し、ここで、対照と比較しての混合物中のＰｒｏ１０４に結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルは、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体により結合されるエピトープへの試験抗体の結合の指標である。Ｐｒｏ１０４に結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定する。対照は、陽性対照または陰性対照または両方であってもよい。例えば、対照は、Ｐｒｏ１０４、本発明のＰｒｏ１０４抗体および本発明のＰｒｏ１０４抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物であってもよい。抗Ｐｒｏ１０４抗体は、本明細書中に開示されているような標識で標識されている。Ｐｒｏ１０４は、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ、例えばセファロースビーズに結合していてもよい。
免疫結合体
本発明はまた、抗癌剤、例えば細胞毒性剤または増殖阻害剤に結合した抗体を含む免疫結合体を用いる療法に関する。
このような免疫結合体の発生において有用な化学療法剤は、前に記載した。抗体および１種または２種以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド類、トリコテンおよびＣＣ１０６５の結合体並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、本明細書において意図される。
メイタンシンおよびメイタンシノイド類
好ましくは、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体（全長または断片）を、１または２以上のメイタンシノイド分子に結合させる。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合を阻害することにより作用する、有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、キャストアフリカ低木Maytenus serrataから最初に単離された（米国特許第3,896,111号）。その後、ある微生物もまた、メイタンシノイド類、例えばメイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが見出された（米国特許第4,151,042号）。合成メイタンシノール並びにこの誘導体および類似体は、例えば、米国特許第4,137,230号；4,248,870号；4,256,746号；4,260,608号；4,265,814号；4,294,757号；4,307,016号；4,308,268号；4,308,269号；4,309,428号；4,313,946号；4,315,929号；4,317,821号；4,322,348号；4,331,598号；4,361,650号；4,364,866号；4,424,219号；4,450,254号；4,362,663号；および4,371,533号に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。
メイタンシノイド−抗体結合体
これらの治療指数を改善する試行において、メイタンシンおよびメイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合させた。メイタンシノイドを含む免疫結合体およびこれらの治療的使用は、例えば、米国特許第5,208,020号、5,416,064号および欧州特許EP 0 425 235 B1に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)には、ヒト直腸結腸癌に指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合した、ＤＭＩと表示されるメイタンシノイドを含む免疫結合体が記載されている。この結合体は、培養した結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性であることが見出され、in vivoでの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)には、ヒト結腸癌細胞系における抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して結合している免疫結合体が記載されている。ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の細胞毒性が、細胞あたり３×１０ ５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３に対してin vitroで試験された。薬剤結合体は、遊離のメイタンシノイド薬剤と同様の程度の細胞毒性を達成し、これは、抗体分子あたりのメイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大し得る。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身的細胞毒性を示した。
抗Ｐｒｏ１０４抗体−メイタンシノイド結合体（免疫結合体）
抗Ｐｒｏ１０４抗体−メイタンシノイド結合体を、抗Ｐｒｏ１０４抗体をメイタンシノイド分子に、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれかの生物学的活性を顕著に低下させずに化学的に結合させることにより調製する。抗体分子あたり結合した平均３〜４個のメイタンシノイド分子が、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えずに標的細胞の細胞毒性を増強させることにおいて効能を示したが、１個の毒素分子／抗体さえも、裸の抗体の使用にまさって細胞毒性を増強すると予測される。メイタンシノイド類は、当該分野において十分知られており、既知の手法により合成するかまたは自然の供給源から単離され得る。好適なメイタンシノイド類は、例えば、米国特許第5,208,020号並びに上記で言及した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールおよび、芳香環またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されているメイタンシノール類似体、例えば種々のメイタンシノールエステルである。
例えば米国特許第5,208,020号またはEP特許0 425 235 B1およびChari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)中に開示されているものを含む、抗体−メイタンシノイド結合体を作製するための、当該分野において知られている多くの結合基がある。この結合基には、上記で識別した特許中に開示されているジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基またはエステラーゼ不安定基が含まれ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。抗体およびメイタンシノイドの結合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ2-pyridyidithio）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するための、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978])およびＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
リンカーは、結合の種類に依存して、メイタンシノイド分子に、種々の位置において結合していてもよい。例えば、エステル結合は、慣用のカップリング手法を用いた水酸基との反応により形成し得る。反応は、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、水酸基で修飾されたＣ−１５位置および水酸基を有するＣ−２０位置において起こり得る。好ましくは、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ−３位置において形成される。
カリケアマイシン
関連する他の免疫結合体は、１または２以上のカリケアマイシン分子に結合した抗Ｐｒｏ１０４抗体を含む。カリケアマイシン族の抗生物質は、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を発生させることができる。カリケアマイシン族の結合体の調製について、米国特許第5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285号、5,770,701号、5,770,710号、5,773,001号、5,877,296号（すべてAmerican Cyanamid Company）を参照。用いることができるカリケアマイシンの構造的類似体には、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧおよびθ１ Ｉ（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336 (1993), Lode et al. Cancer Research 5 8: 2925-2928 (1998)およびAmerican Cyanamidの前述の米国特許明細書）が含まれるが、これらには限定されない。抗体を結合させることができる他の抗腫瘍薬剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは共に、作用の細胞内部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。従って、抗体媒介内部移行によるこれらの剤の細胞への取り込みにより、これらの細胞毒性効果が大幅に増大する。
他の細胞毒性剤
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体に結合することができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン(streptozoicin)、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号および5,770,710号に記載されている、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と知られている剤の族並びにエスペラマイシン(esperamicin)類（米国特許第5,877,296号）が含まれる。用いることができる酵素的に活性な毒素およびこの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の１ ５ 非結合活性断片、エクソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosaから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、カルシン(curcin)、クロチン(crotin)、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン(gelonin)、マイトジェリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)およびトリコテセン(tricothecene)類が含まれる。例えば１９９３年１０月２８日に刊行されたWO 93/21232を参照。本発明は、さらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間に形成された免疫結合体を意図する。
腫瘍の選択的な破壊のために、抗体は、高度の放射性原子を含むことができる。種々の放射性同位体は、放射結合した抗Ｐｒｏ１０４抗体の産生のために有用である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。結合体が診断のために用いられる場合には、これは、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えばＴｃ９９ＭもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（また磁気共鳴画像法、ｍｒｉとして知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含むことができる。
放射標識または他の標識を、結合体中に、既知の方法により導入することができる。例えば、ペプチドを、生合成することができるか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む、好適なアミノ酸前駆体を用いて、化学的アミノ酸合成により合成することができる。標識、例えばＴｃ９９Ｍ、Ｉ１２３、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合することができる。IODOGEN法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)を用いて、ヨウ素を導入することができる。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)には、他の方法が詳細に記載されている。
抗体および細胞毒性剤の結合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、作製することができる。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素標識１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ラジオヌクレオチド(radionucleotide)の抗体への結合のための例示的なキレート剤である。WO 94/11026を参照。リンカーは、細胞中での細胞毒性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号)を用いることができる。
代替的に、抗Ｐｒｏ１０４抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え手法またはペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されている、結合体の２つの部分をコードする、それぞれの領域を含むことができる。
さらに、腫瘍の前標的化において用いるために、抗体を「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に結合させることができ、ここで、抗体−レセプター結合体を患者に投与し、続いて結合していない結合体を循環から清澄剤を用いて除去し、次に、細胞毒性剤（例えばラジオヌクレオチド）に結合する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照）を活性抗癌薬剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、抗体を結合させることにより、本発明の抗体をＡＤＥＰＴにおいても用いることができる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分には、プロドラッグに対して作用することができ、これをより活性な細胞毒性の形態に変換する任意の酵素が含まれる。本発明の方法において有用な酵素には、リン酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒生フルオロシトシンを抗癌薬剤である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア(serratia)プロテアーゼ、テルモリシン(thermolysin)、サブチリシン(subtilisin)、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄアミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用な炭水化物切断酵素、例えばＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；Ｐ−ラクタム類で誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；並びにこれらのアミン窒素においてそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ類、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが含まれるが、これらには限定されない。代替的に、また当該分野において「アブザイム（abzymes）」として知られている、酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離の活性な薬剤に変換することができる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照）。アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するための酵素−アブザイム結合体を、本明細書中に記載したようにして調製することができる。本発明の酵素は、当該分野において十分知られている手法、例えば上記したヘテロ二官能性架橋試薬を用いることにより、抗Ｐｒｏ１０４抗体に共有結合させることができる。
代替的に、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した本発明の抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野において十分知られている組換えＤＮＡ手法を用いて構成することができる（例えばNeuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)を参照）。
他の抗体修飾
抗体の他の修飾が本明細書で意図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーの１種に結合させることができる。抗体はまた、例えばコアセルベーション手法により、または界面重合により調製したマイクロカプセル中に（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて捕獲することができる。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
本明細書中に開示した抗Ｐｒｏ１０４抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。「リポソーム」は、種々のタイプの脂質、リン脂質および／または、薬剤を哺乳類に送達するのに有用な界面活性剤で構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に、二層形態において配置されている。抗体を含むリポソームは、当該分野において知られている方法により、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第4,485,045号および4,544,545号；並びに１９９７年１０月２３日刊行のW097/38731に記載されているように、調製される。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法により生成することができる。リポソームを所定の孔の大きさを有するフィルターを通して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片を、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているようにして、ジスルフィド交換反応によりリポソームに結合させることができる。化学療法剤は、随意的に、リポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照。
ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明はまた、ヒト化抗Ｐｒｏ１０４抗体、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞をコードする、単離された核酸分子、並びに抗体を産生するための組換え手法を提供する。抗体の組換え産生のために、これをコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために複製可能なベクター中に挿入するか、または発現のためのプロモーターを有する作動可能な(operable)結合においてベクター中に挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に以下の１種または２種以上が含まれるが、これらには限定されない：シグナル配列、複製の起点、１種または２種以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
シグナル配列成分
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体は、直接、組換え的に産生するだけでなく、異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生することができ、ここで該異種性ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種性シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、加工される（即ちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。天然の抗Ｐｒｏ１０４抗体シグナル配列を認識および加工しない原核宿主細胞に対しては、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換する。酵母分泌のために、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ｏｃ因子リーダー（SaccharomycesおよびKluyveromycesｃｃ因子リーダーを含む）または酸ホスファターゼリーダー、C albicansグルコアミラーゼリーダー、またはWO 90/13646に記載されているシグナルにより置換することができる。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域についてのＤＮＡは、抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードするＤＮＡにリーディング・フレームにおいて連結する。
複製の起点
発現およびクローニングベクターは、共に、ベクターが、１または２以上の選択された宿主細胞中で複製されるのを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが、ホスト染色体ＤＮＡとは独立して複製されるのを可能にするものであり、複製の起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起点はほとんどのグラム陰性細菌に適し、２μプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターについては必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、これが早期のプロモーターを含むとの理由のみにより用いることができる）。
選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完し、または（ｃ）天然培地から入手可能ではない臨界的に重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードし、例えば、これは、桿菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択スキームの１つの例では、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を用いる。異種性遺伝子で成功に形質転換されたこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、従って選択計画を生き延びる。このような優性の選択の例では、薬剤であるネオマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンを用いる。
哺乳類細胞に適する選択可能なマーカーの他の例は、抗Ｐｒｏ１０４抗体核酸、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−１１、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを吸収することについて競合性の細胞を同定することを可能にするものである。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換される細胞を、先ず、メトトレキセート（Ｍｔｘ）、即ちＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することにより同定する。野生型のＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠乏しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えばATCC CRL-9096）である。
代替的に、抗Ｐｒｏ１０４抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質および他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能なマーカーのための選択剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８のための選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
酵母において用いるのに適する選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の、突然変異菌株、例えばATCC No. 44076またはPEP4 Jones, Genetics, 85:12 (1977)のための選択マーカーを提供する。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１病変の存在は、トリプトファンの不存在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母菌株(ATCC 20,622または38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
さらに、１．６ｐｍ環状プラスミドｐＫＤＩに由来するベクターを、Kluyveromyces酵母の形質転換のために用いることができる。代替的に、組換え子ウシキモシンの大規模な産生のための発現系が、K. lactisについて報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。Kluyveromycesの工業的な菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、抗Ｐｒｏ１０４抗体核酸に作動的に結合している。原核宿主と共に用いるのに適するプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、Ｐ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系において用いるためのプロモーターはまた、抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードするＤＮＡに作動的に結合したShine-Dalgarno（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
プロモーター配列は、真核生物について知られている。事実上すべての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴが豊富な領域を有する。多くの遺伝子において転写開始部位の７０〜８０塩基上流に見出される他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは、任意のヌクレオチドであってよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端において、ポリＡ尾のコード配列を３’末端へ添加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてを、真核発現ベクター中に好適に挿入する。酵母宿主と共に用いるのに適するプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素についてのプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼについてのプロモーターが含まれる。
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、以下についてのプロモーター領域である：アルコールデヒドロゲナーゼ２，イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびガラクトース利用の原因となる酵素。酵母発現において用いるのに適するベクターおよびプロモーターは、さらに、EP 73,657に記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
哺乳類宿主細胞中のベクターからの抗Ｐｒｏ１０４抗体転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合性である場合には、例えば、ウイルスのゲノムから、例えばポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス（シミアン・ウイルス）４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種性哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、得られたプロモーターにより制御される。
ＳＶ４０ウイルスの初期の、および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即座の早期のプロモーターは、ＨｉｎｄＩｌｌ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳類宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変更は、米国特許第4,601,978号に記載されている。また単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御の下での、マウス細胞におけるヒトＰ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返しを、プロモーターとして用いることができる。
エンハンサー要素成分
高等真核生物による本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増強される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例には、複製起点の後期の側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期の側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンシング要素については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、ベクター中に、抗Ｐｒｏ１０４抗体コード配列に５’または３’の位置においてスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置させる。
転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写を終結させるのに、およびｍＲＮＡを安定化させるのに必要な配列を含む。かかる配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合によっては３’未翻訳領域から一般的に入手できる。これらの領域は、抗Ｐｒｏ１０４抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO 94/11026およびこの中に開示されている発現ベクターを参照。
宿主細胞の選択および形質転換
ここでのベクター中でＤＮＡをクローニングするかまたは発現するのに適する宿主細胞は、上記した原核、酵母または高等真核細胞である。この目的に適する原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、例えばEscherichiaなどの腸内細菌科、、例えば大腸菌、エンテロバクター、Erwinia、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばSalmonella typhimurium、セラチア属、例えばSerratia marcescans、および赤痢菌属、並びに桿菌、例えばB. subtilisおよびB. licheniformis（例えばDD 266,710、１９８９年４月１２日刊行中に開示されているB. licheniformis 41P）、シュードモナス属、例えばP. aeruginosa、並びにストレプトマイセス属が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ATCC 31,446）であるが、他の菌株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）および大腸菌Ｗ３１ １０（ATCC 27,325）が好適である。これらの例は、限定的であるよりむしろ例示的である。
全長抗体、抗体断片および抗体融合タンパク質を細菌中に産生することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合に、例えば治療的抗体が細胞毒性剤（例えば毒素）に結合しており、免疫結合体が単独で腫瘍細胞破壊における有効性を示す場合にそうである。全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌での産生はより迅速で費用効率的である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、翻訳開始領域（ＴＩＲ）並びに発現および分泌を最適化するためのシグナル配列を記載している、例えば米国特許第5,648,237号(Carter et. al.)、米国特許第5,789,199号(Joly et al.)および米国特許第5,840,523号(Simmons et al.)を参照。これらの特許は、参照として本明細書中に導入する。発現の後に、抗体は大腸菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離し、アイソタイプに依存して、例えばプロテインＡまたはＧカラムにより精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するための方法と同様にして、行うことができる。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状真菌類または酵母が、抗Ｐｒｏ１０４抗体コードベクターに適するクローニングまたは発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは一般的なパン酵母は、下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかし、多くの他の属、種および菌株が一般に入手可能で有用であり、例えばSchizosaccharomyces pombe；Kluyveromyces宿主、例えばK. lactis、K. fragilis (ATCC 12,424)、K. bulgaricus (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24,178)、K. waltii (ATCC 56,500)、K. drosophilarum (ATCC 36,906)、K . thermotoleransおよびK. marxianus; yarrowia (EP 402,226)；Pichia pastoris (EP 183,070)；カンジダ；Trichoderma reesia (EP 244,234)；Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えばSchwanniomyces occidentalis；並びに糸状真菌類、例えばパンカビ属、アオカビ属、Tolypocladiumおよびコウジカビ属宿主、例えばA. nidulansおよびA. nigerなどである。
グリコシル化された抗Ｐｒｏ１０４抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス菌株および変異体並びに宿主、例えばSpodoptera frugiperda（鱗翅目幼虫）、Aedes aegypti（カ）、Aedes albopictus（カ）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）およびBombyx moriからの対応する許容的な昆虫宿主細胞が、同定されている。形質移入のための種々のウイルス菌株、例えばAutographa californica NPVのＬ−１変種およびBombyx mori NPVのＢｍ−５菌株が公的に入手可能であり、かかるウイルスは、ここで本発明のウイルスとして、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質移入のために用いることができる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として用いることができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生において有用なクローニングおよび発現ベクターは、当業者に知られている。例えばHiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986を参照。
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も大きく、培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が常習的な手順となった。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎臓系列（２９３または懸濁液培養物中で増殖するためにサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL1587）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、1413 8065）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ATCC CCL5 1）；ＴＲＩ細胞(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系列（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞を、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて抗Ｐｒｏ１０４抗体産生のために形質転換し、プロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変した、慣用の栄養素培地中で培養する。
宿主細胞の培養
本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体を産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。商業的に入手できる培地、例えばハムのＦＩＯ(Sigma)、基礎培地(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Sigma)は、宿主細胞を培養するのに適する。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；4,657,866号；4,927,762号；4,560,655号；もしくは5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；または米国特許Re. 30,985号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として用いることができる。これらの培地のすべてに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリンもしくは上皮細胞成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド類（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばGENTAMYCIN（登録商標）薬剤）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足することができる。すべての他の必要な補足物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含有させることができる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞について前に用いられているものであり、通常の当業者には明らかである。
抗Ｐｒｏ１０４抗体の精製
組換え手法を用いる場合、抗体は、細胞内で、細胞膜周辺腔で産生するか、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合は、第１のステップとして粒子状残骸、宿主細胞または溶解した断片のいずれかを、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたり融解させる。細胞残骸は遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、このような発現系からの上清は一般に、先ず商業的に入手できるタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮する。例えばＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、前述のステージのいずれかにおいて導入して、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を導入して、外来性の汚染物の増殖を防止することができる。
細胞から調製された抗体組成物を、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986))。アフィニティーリガンドが付着したマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば細孔性ガラス（controlled pore glass）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンにより、アガロースを用いて達成できるよりも速い流速および短い加工時間が可能になる。抗体がＣＨ３領域を含む場合、Bakerbond ABX（登録商標）樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＩＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿がまた、回収されるべき抗体に依存して利用可能である。
１または２以上のすべての予備の精製ステップに続いて、関連する抗体および汚染物を含む混合物に、約２．５〜４．５のｐＨにおいて溶離緩衝液を用いて、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）において行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことができる。
医薬製剤
本発明により用いる抗体の医薬製剤を、貯蔵のために、所望の程度の純度を有する抗体を随意の薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と、凍結乾燥した製剤または水性溶液の形態で混合することにより調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度において受容者に対して無毒性であり、そして以下を含む：緩衝液、例えば酢酸、トリス、リン酸、クエン酸および他の有機酸類；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個の残基よりも小さい）ポリペプチド類；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン類；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸類、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；トニシファイヤー(tonicifier)、例えばトレハロースおよび塩化ナトリウム；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；界面活性剤、例えばポリソルベート；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体類（例えばＺｎ−タンパク質複合体類）；および／または非イオン系界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。抗体は、好ましくは、５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度での抗体を含む。
ここでの製剤はまた、処置される特定の適応のための必要に応じて、１種より多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むことができる。例えば、内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体に加えて、１つの製剤において、追加の抗体、例えばＰｒｏ１０４上の異なるエピトープに結合する第２の抗Ｐｒｏ１０４抗体、または、例えば特定の癌の増殖に影響する成長因子などの他の標的に対する抗体を含むのが望ましい場合がある。代替的に、または付加的に、この組成物はさらに、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤および／または心臓保護剤(cardioprotectant)を含むことができる。かかる分子は、好適に、意図される目的のために有効な量で、組み合わせて存在する。
活性成分はまた、例えばコアセルベーション手法により、または界面重合により、調製したマイクロカプセルに捕獲することができ、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて捕獲することができる。かかる手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマー類の半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形した物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー類、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成された注射可能な微粒子）、並びにポリ−Ｄ−（−）ヒドロキシ酪酸が含まれる。
in vivoでの投与のために用いるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
抗Ｐｒｏ１０４抗体を用いた方法および処置
本発明によれば、細胞表面上のＰｒｏ１０４に結合すると内部移行する抗Ｐｒｏ１０４抗体を用いて、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞を特徴とする癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌、例えば卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌、および関連する転移を有する、これを必要としている対象を処置する。
前記の癌は一般にＰｒｏ１０４発現細胞を含み、従って抗Ｐｒｏ１０４抗体はこれに結合することができる。前記の癌はＰｒｏ１０４分子の過剰発現により特徴付けられ得る一方、本出願はさらに、Ｐｒｏ１０４過剰発現癌であるとは考えられない癌を処置するための方法を提供する。
本発明はまた、Ｐｒｏ１０４を過剰発現する細胞を検出するための方法および、Ｐｒｏ１０４を発現する細胞を検出するにあたり、または患者からの血清中のＰｒｏ１０４を検出するにあたり有用な診断キットに関する。この方法は、細胞含有試験試料を本発明の抗体と混ぜ合わせること、試験試料を、試験試料中の細胞に結合する抗体についてアッセイすること、および試験試料において結合する抗体のレベルを、細胞の対照試料において結合する抗体のレベルに対して比較することを含むことができる。好適な対照は、例えば、試験試料と同一のタイプの正常な細胞の試料、またはＰｒｏ１０４過剰発現細胞を含まないことが知られている細胞試料である。かかる対照試料より高いＰｒｏ１０４結合のレベルは、Ｐｒｏ１０４を過剰発現する細胞を含む試験試料の指標である。代替的に、対照は、Ｐｒｏ１０４を過剰発現する細胞を含むことが知られている細胞の試料であってもよい。このような場合において、対照試料に類似した、またはこれを超える、試験試料におけるＰｒｏ１０４抗体結合のレベルは、Ｐｒｏ１０４を過剰発現する細胞を含む試験試料の指標である。
Ｐｒｏ１０４過剰発現は、種々の診断アッセイで検出することができる。例えば、Ｐｒｏ１０４の過剰発現は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によりアッセイすることができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片に、ＩＨＣアッセイを施し、Ｐｒｏ１０４タンパク質染色強度の以下の基準と一致させることができる。
スコア０ 染色は観察されないか、または腫瘍細胞の１０％未満において膜染色が観察される。
スコア１＋ わずかな／辛うじて知覚可能な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において検出される。細胞は、それらの膜の一部において染色されるに過ぎない。
スコア２＋ 弱い、ないし中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において観察される。
スコア３＋ 中程度ないし強い完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超える比率において観察される。
Ｐｒｏ１０４発現についての０または１＋のスコアを有する腫瘍を、Ｐｒｏ１０４を過剰発現しないとして特徴付けることができ、一方２＋または３＋のスコアを有する腫瘍を、Ｐｒｏ１０４を過剰発現するとして特徴付けることができる。
代替的に、または付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばINFORM（登録商標）（Ventana, Arizonaにより販売されている）またはPATHVISION（登録商標）(VySiS, Illinois)を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織において行って、腫瘍におけるＰｒｏ１０４過剰発現の程度（存在する場合には）を決定することができる。Ｐｒｏ１０４過剰発現または増幅を、in vivo診断アッセイを用いて評価することができ、例えばＰｒｏ１０４を結合する、検出可能な標識（例えば放射性同位体または蛍光標識）で標識した分子（例えば本発明の抗体）を投与し、患者を該標識の局在について外部から走査することにより、評価することができる。
Ｐｒｏ１０４を発現するかまたは過剰発現する細胞を含むことが疑われる試料を、本発明の抗体と、抗体のＰｒｏ１０４への特異的な結合に適する条件の下で、混ぜ合わせる。本発明のＰｒｏ１０４抗体の結合および／または内部移行は、Ｐｒｏ１０４を発現する細胞の指標である。結合のレベルを決定して好適な対照と比較することができ、ここで、対照と比較して結合Ｐｒｏ１０４の上昇したレベルは、Ｐｒｏ１０４過剰発現の指標である。Ｐｒｏ１０４を過剰発現する細胞を含むことが疑われる試料は、癌細胞試料、特に卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌の試料であってもよい。対象からの血清試料もまた、対象からの血清試料を本発明のＰｒｏ１０４抗体と混ぜ合わせ、抗体に結合したＰｒｏ１０４のレベルを決定し、このレベルを対照と比較することにより、Ｐｒｏ１０４のレベルについてアッセイすることができ、ここで、対照と比較して、患者の血清中におけるＰｒｏ１０４の上昇したレベルは、患者の細胞によるＰｒｏ１０４の過剰発現の指標である。対象は、癌、例えば卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌を有してよい。
現在、癌のステージに依存して、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置は、以下の療法の１種または組み合わせを含む：癌組織を除去するための手術、放射線療法、アンドロゲン剥脱（例えばホルモン療法）、および化学療法。抗Ｐｒｏ１０４抗体療法は、化学療法の毒性および副作用を十分に耐容しない年長の患者において、放射線療法の有用性が限定された転移性疾患において、およびアンドロゲン剥脱処置に耐性である前立腺癌腫の管理のために、特に望ましい場合がある。本発明の腫瘍標的化および内部移行抗Ｐｒｏ１０４抗体は、Ｐｒｏ１０４発現癌、例えば卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を、疾患の最初の診断の際に、または再発の間に寛解するのに有用である。治療的用途のために、抗Ｐｒｏ１０４抗体を単独で、または組み合わせ療法において用いることができ、例えばホルモン、抗血管新生剤もしくは放射標識した化合物との組み合わせ、または手術、凍結療法および／または放射線療法との組み合わせ療法において、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌のために、また特に排出された細胞が到達し得ない場合において用いることができる。抗Ｐｒｏ１０４抗体による処置はまた、他の形態の従来の療法と組み合わせて、前または後慣用療法に連続して投与することができ、化学療法薬剤、例えばタキソテレ(Taxotere)（登録商標）（ドセタキセル）、タキソール(Taxol)（登録商標）（パクリタキセル）、エストラムスチンおよびマイトキサントロンは、転移性およびホルモン抵抗性卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置において、特に危険の少ない患者において用いることができる。癌、特に、アンドロゲン非依存性および／または転移性卵巣癌、膵臓癌、肺癌もしくは乳癌を処置または寛解するための、本発明のこの方法において、癌患者に、抗Ｐｒｏ１０４抗体を、１種または２種以上の前の化学療法剤での処置と組み合わせて投与することができる。特に、パクリタキセルおよび修飾した誘導体（例えばEP0600517を参照）との組み合わせ療法が意図される。抗Ｐｒｏ１０４抗体を、治療的に有効な用量の化学療法剤と共に投与する。抗Ｐｒｏ１０４抗体はまた、化学療法と組み合わせて投与して、化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性および効能を増強することができる。米国医薬品便覧（ＰＤＲ）には、種々の癌の処置において用いられている当該剤の投与量が開示されている。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬剤の投薬計画および投与量は、処置される特定の癌、疾患の程度および当該分野における技術のある医師が精通している他の要因に依存し、医師により決定することができる。
特に、細胞毒性剤と結合した抗Ｐｒｏ１０４抗体を含む免疫結合体を、患者に投与することができる。好ましくは、Ｐｒｏ１０４タンパク質に結合した免疫結合体は細胞により内部移行され、これが結合する癌細胞の死滅における、免疫結合体の増大した治療効果がもたらされる。好ましくは、細胞毒性剤は、癌細胞の核酸を標的化するかまたはこれに干渉する。かかる細胞毒性剤の例は上記した通りであり、メイタンシン、メイタンシノイド類、サポリン、ゲロニン、リシン、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗Ｐｒｏ１０４抗体または免疫結合体を、ヒト患者に、既知の方法、例えば静脈内投与により、例えば大量瞬時投与として、またはある期間にわたる連続的な注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内(intracerobrospinal)、皮下、関節内、滑膜内(intrasynovial)、くも膜下腔内、経口、局所的または吸入経路により投与する。抗体または免疫結合体は、腫瘍本体中に直接注射することができる。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。他の治療計画を、抗Ｐｒｏ１０４抗体の投与と組み合わせることができる。
組み合わされた投与には、個別の製剤または単一の医薬製剤を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与が含まれ、ここで、両方（またはすべて）の活性剤が、その生物学的活性を同時に奏する期間があるのが好ましい。好ましくは、かかる組み合わされた療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。
また、１種または２種以上の抗Ｐｒｏ１０４抗体の投与を、特定の癌に関連する他の腫瘍抗原に指向された抗体の投与と組み合わせるのが、望ましい場合がある。このようにして、本発明はまた、本発明の１種または２種以上の抗体および、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍細胞と関連する他の腫瘍抗原に結合する少なくとも１種の他の抗体を含む、抗体「カクテル」に関する。カクテルはまた、Ｐｒｏ１０４の他のエピトープに指向された抗体を含むことができる。好ましくは、他の抗体は、本発明の抗体の結合およびまたは内部移行に干渉しない。
本発明の抗体治療処置方法は、１種または２種以上の抗Ｐｒｏ１０４抗体および１種または２種以上の化学療法剤もしくは増殖阻害剤の組合わせ投与を含むことができ、種々の化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。化学療法剤には、例えば、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン類（例えばパクリタキセルおよびドキセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質が含まれる。かかる化学療法剤のための調製および投与計画は、製造者の指示に従って、または技術のある開業医により経験的に決定されたようにして、用いることができる。このような化学療法のための調製および投与計画はまた、Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。
抗体を、抗ホルモン化合物；例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン化合物、例えばオナプリストン（EP 616 812を参照）；または抗アンドロゲン化合物、例えばフルタミドと、かかる分子について知られている投与量で混ぜ合わせることができる。処置されるべき癌がアンドロゲン非依存性癌である場合には、患者は予め抗アンドロゲン療法を受けていてもよく、癌がアンドロゲン非依存性となった後に、抗Ｐｒｏ１０４抗体（および随意に本明細書中に記載した他の剤）を、患者に投与することができる。
時々、心臓保護剤（療法に付随する心筋機能障害を予防するかまたは低減させるために）または１種もしくは２種以上のサイトカインを患者に同時投与することも、有益であり得る。前述の療法計画に加えて、患者に対して、癌細胞の手術的除去および／または放射線療法を、抗体療法の前、これと同時に、またはこの後に施すことができる。前述の同時投与された任意の剤に適する投与量は、ここで用いられたものであり、剤および抗Ｐｒｏ１０４抗体の組み合わされた作用（相乗作用）のために低下され得る。
疾患の予防または処置のために、投与量および投与の方式を、既知の基準に従って医師が選択する。抗体の適切な投与量は、前に定義したように、処置すべき疾患の種類、疾患の重篤度および経過、抗体が予防的目的で投与されるか治療的目的で投与されるか、前の療法、患者の臨床的な履歴および抗体への応答並びにかかっている医師の裁量に依存する。抗体は、患者に対して、１回でまたは一連の処置にわたり好適に投与する。好ましくは抗体は、静脈内注入により、または皮下注射により投与する。疾患の種類および重篤度に依存して、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇ（例えば約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体を、例えば、１もしくは２以上の別個の投与による、または連続的な注入による、患者への投与のための最初の候補投与量とすることができる。投与計画は、約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷用量を投与し，続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗Ｐｒｏ１０４抗体の用量を毎週維持することを含むことができる。しかし、他の投与計画も有用であり得る。典型的な毎日の投与量は、前述の要因に依存して、約１ｐｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれ以上の範囲内であり得る。状態に依存した、数日またはこれより長い期間にわたる繰り返し投与については、疾患症状の所望の抑制が発生するまで処置を持続させる。この療法の進行を、慣用の方法およびアッセイにより、および医師または他の当業者に知られている基準に基づいて、容易にモニタリングすることができる。
抗体タンパク質の患者への投与に加えて、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与を意図する。抗体をコードする核酸分子のこのような投与は、表現「抗体の治療的に有効な量を投与する」により包含される。例えば、遺伝子療法を用いて細胞内抗体を生成することに関する、１９９６年３月１４日刊行のWO 96/07321を参照。
核酸分子（随意にベクター中に包含されている）を患者の細胞中に導入するための２つの主な方法がある；in vivoおよびex vivo。in vivo送達に対しては、核酸分子を、患者に直接、通常抗体が必要である部位において注射する。ex vivo処置に対しては、患者の細胞を取り出し、核酸分子をこれらの単離した細胞中に導入し、修飾した細胞を、患者に、直接、または例えば多孔質膜内にカプセル封入し、これを患者中に移植して、投与する（例えば米国特許第4,892,538号および5,283,187号を参照）。核酸分子を生存可能な細胞中に導入するのに利用可能な種々の手法がある。この手法は、核酸が、培養した細胞中にin vitroで移送されるか、意図された宿主の細胞中にin vivoで移送されるかに依存して、変化する。核酸を哺乳類細胞中にin vitroで移送するのに適する手法には、リポソーム、電気穿孔法、マイクロ注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などの使用が含まれる。遺伝子のex vivo送達のために共通して用いられるベクターは、レトロウイルスベクターである。
現在の好ましいin vivoの核酸分子移送手法には、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス）および脂質に基づく系（遺伝子の脂質媒介移送に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）での形質移入が含まれる。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの概説について、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照。またWO 93/25673およびこの中に引用されている参考文献を参照。
製造品およびキット
本発明はまた、Ｐｒｏ１０４過剰発現細胞の検出および／またはＰｒｏ１０４発現癌、特に乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌の処置に有用な物質を含む、製造品に関する。製造品は、容器およびこの中に含まれた組成物を含み、該組成物は本発明の抗体を含む。該組成物はさらに、担体を含むことができる。製造品はまた、容器上またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成することができる。容器は、Ｐｒｏ１０４発現細胞を検出し、および／または癌状態を処置するのに有効な組成物を保持し、また無菌のアクセス口を有することができる（例えば、この容器は、静脈内溶液袋または皮下組織注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性な剤は、本発明の抗Ｐｒｏ１０４抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、Ｐｒｏ１０４発現細胞を検出し、および／または乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌、またはさらに具体的に卵巣漿液性腺癌、乳房浸潤性乳管癌、前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、直腸結腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫および胸膜中皮腫を、これを必要としている患者において処置するのに用いられることを示す。乳癌は、ＨＥＲ−２陰性または陽性乳癌であってよい。癌は、前記の任意の転移癌、例えば乳癌転移、卵巣癌転移、膵臓癌転移および肺癌転移を包含する。ラベルまたは添付文書は、さらに、抗体組成物を癌患者に投与するための指示を含むことができる。さらに、製造品は、本発明の抗体を検出する物質、例えば本発明の抗体に結合する第２の抗体を含む第２の容器をさらに含むことができる。この物質は、検出可能な標識、例えば本明細書中に開示したもので標識することができる。第２の容器は、例えば、薬学的に許容し得る緩衝液、例えば注射用の静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含むことができる。製造品はさらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができ、これらには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが含まれる。
種々の目的のために有用なキットが提供され、例えばＰｒｏ１０４細胞死滅アッセイのために、Ｐｒｏ１０４を細胞から精製もしくは免疫沈澱するために、または血清試料中のＰｒｏ１０４の存在を検出するかもしくは細胞試料中のＰｒｏ１０４発現細胞の存在を検出するために有用なキットである。Ｐｒｏ１０４の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｐｒｏ１０４抗体を含むことができる。Ｐｒｏ１０４をin vitroで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて検出し、定量するための抗体を含むキットを提供することができる。製造品について、キットは、容器および、この中に含まれた組成物であって本発明の抗体を含む該組成物を含む。キットはさらに、容器上の、またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。キットは、追加の成分を含むことができ、例えば希釈剤および緩衝液、本発明の抗体に結合する物質、これは、例えば本明細書中に開示したような標識、例えば放射性標識、蛍光標識を含むことができる第２の抗体もしくは酵素を含むことができ、またはキットはまた対照の抗体を含むことができる。追加の成分は、キット内の別個の容器内にあってもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明および、意図されたin vitroまたは診断的使用のための指示を提供することができる。
例
例１：モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの産生および単離
本発明の次のＭＡｂ／ハイブリドーマを、以下に記載する：
Figure 2007528845
 ＭＡｂがクローニングされている場合には、これは、「Ｘ．１」の命名を得る。例えば、Ａ７の最初のクローンをＡ７．１と呼び、Ａ７の第２のクローンをＡ７．２と呼ぶなどである。本発明のために、Ａ７についての言及は、すべてのクローン、例えばＡ７．１、Ａ７．２などを含む。
免疫原および抗原（組換えタンパク質、ＨＡおよびＨｉｓタグおよび形質移入した細胞）
Ｐｒｏ１０４（テスチシン（testisin））全長、断片大腸菌発現配列およびタンパク質の産生
マウスの免疫化とＭＡｂのＣシリーズの産生のため、Ｐｒｏ１０４の領域Ｌｙｓ２０〜Ｔｒｐ２９７をコードするＰｒｏ１０４構成物（construct）を、制限酵素部位を介して標準大腸菌発現ベクターに導入した。構成物を、インフレームで６個のヒスチジンタグのＣ末端へクローニングし、Ｐｒｏ１０４構成物を、６個のヒスチジンタグ付きの、２８８個のアミノ酸のタンパク質として発現させた。組換えプラスミドを用いて競合的大腸菌細胞を形質転換し、Ｐｒｏ１０４の発現を振盪フラスコで行った。ＩＰＴＧによる誘導後に採集した細菌ペーストを、Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィによるＰｒｏ１０４の精製に用いた。
Ｐｒｏ１０４（Ｌｙｓ２０（下線部）〜Ｔｒｐ２９７）発現アミノ酸配列（太字はヘキサヒスチジンタグを表す）（配列番号１）
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４（テスチシン）昆虫細胞発現配列およびタンパク質の産生
マウスの免疫化とＭＡｂのＤシリーズの産生のため、ミツバチのメレチン（melletin）分泌信号、Ｐｒｏ１０４の領域Ｉｌｅ４２〜Ｔｒｐ２９７をコードするＰｒｏ１０４構成物、および６個のヒスチジンタグを、標準の手法を用いてクローニングおよび発現させた。Ｐｒｏ１０４をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。
Ｐｒｏ１０４（Ｉｌｅ４２〜Ｔｒｐ２９７）発現アミノ酸配列（下線部はミツバチメレチン分泌信号を、太字はヘキサヒスチジンタグを表す）（配列番号２）
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４（テスチシン）２９３ＴおよびＬＭＴＫ細胞発現配列およびタンパク質の産生
Ｐｒｏ１０４ＭＡｂのＣおよびＤシリーズ両方のスクリーニングのため、全長Ｐｒｏ１０４タンパク質（Ｍｅｔ１〜Ｖａｌ３１４）を、組換え部位（イタリック体）の下流、Ｃ末端に位置するＨＡタグ（太字）およびスペーサー（下線部）の有り無しの両方の場合において、標準の哺乳類発現手法を用いて発現させた。
Ｐｒｏ１０４形質移入ヒト２９３ＴおよびマウスＬＭＴＫ細胞アミノ酸配列（配列番号３）
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４（テスチシン）ＣＨＯ細胞発現配列およびタンパク質の産生
マウスの免疫化とＰｒｏ１０４ＭＡｂのＫシリーズの産生のため、全長Ｐｒｏ１０４タンパク質（Ｍｅｔ１〜Ｖａｌ３１４）を、タグ無しで、標準の哺乳類発現手法を用いて発現させた。
ハムスターＣＨＯ細胞を、標準の組換え手法を用いて、テトラサイクリンレセプター（ＴＲ）で安定して形質移入した。Ｐｒｏ１０４形質移入の前に、ＣＨＯ−ＴＲ細胞を、１０％ウシ血清（ＦＢＳ）を有するＨＡＭ Ｆ１２培地中で培養した。全長Ｐｒｏ１０４タンパク質（Ｍｅｔ１〜Ｖａｌ３１４）をコードするベクターを、ＣＨＯ細胞内に形質移入した。安定な形質移入物を、１０％ＦＢＳおよび３００ｕｇ／ｍｌのヒドロマイシンＢを有するＨＡＭ Ｆ１２培地中で１５日間選択した。テトラサイクリン１ｕｇ／ｍｌによる１６〜２０時間の刺激の後に、ウェスタンブロットでdiaDexusＰｒｏ１０４．Ｃ２５．１モノクローナル抗体を用いて、ヒドロマイシンＢ耐性細胞を、Ｐｒｏ１０４の発現について検査した。細胞を拡張し、スケールアップし、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で凍結保存し、−１９６℃の液体窒素中に貯蔵して、生存可能なクローン培養物の維持を確実にした。
Ｐｒｏ１０４形質移入ハムスターＣＨＯ細胞のアミノ酸配列（配列番号４）
Figure 2007528845
Ｏｖｒ１１５セリンプロテアーゼ領域配列およびタンパク質の産生
Ｏｖｒ（ＴＭＰＲＳＳ４）を用いて、交差反応性ハイブリドーマクローンをスクリーニングしたが、これは、この抗原が、卵巣癌および膵臓癌において上方調節されており、また潜在的に交差反応的なセリンプロテアーゼ領域を含有するからである。
タバコエッチウィルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）認識部位をコードするＯｖｒ１１５構成物および、Ｏｖｒ１１５のＶａｌ２０３〜Ｌｅｕ４３５のセリンプロテアーゼ領域を、インフレームでグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端にクローニングして、Ｏｖｒ１１５構成物を４８６個のアミノ酸のＧＳＴ融合タンパク質として標準手法を用いて発現させた。Ｏｖｒ１１５の精製は、グルタチオンセファロースカラムを介して完了させた。
Ｏｖｒ１１５セリンプロテアーゼ領域構成物アミノ酸配列（ＧＳＴ配列は下線部、ＴＥＶ配列はイタリック体、タグ配列は太字）（配列番号５）
Figure 2007528845
Ｏｖｒ１１５細胞外断片配列およびタンパク質の産生
分子の予想される細胞外部分のみを構成しているＯｖｒ１１５のＬｙｓ５２〜Ｌｅｕ４３５の領域をコードするＯｖｒ１１５（ＴＭＰＲＳＳ４）構成物を、コドンＬｅｕ４３５の直ぐ下流の６個のヒスチジンタグによりクローニングした。Ｏｖｒ１１５は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。
Ｏｖｒ１１５細胞外構成物（Ｏｖｒ１１５・Ｌｙｓ５２（下線部）−Ｌｅｕ４３５）アミノ酸配列（６個のＨｉｓタグ配列は太字）（配列番号６）
Figure 2007528845
安定Ｏｖｒ１１５ＬＭＴＫマウス細胞系の生成
全長ＨＡタグ化Ｏｖｒ１１５（Ｍｅｔ１〜Ｌｅｕ４３５）（下線部）を、ＨＡタグを用いて哺乳類発現ベクターにクローニングした後、マウスのＬＭＴＫ細胞に形質移入した。個々のクローンを、Ｏｖｒ１１５の発現について、ウェスタンブロットで抗ＨＡ抗体（Covance, Richmond, CA）を用い、１週間の培養後に試験した。
Ｏｖｒ１１５形質移入ＬＭＴＫアミノ酸配列（配列番号７）
Figure 2007528845
免疫化
ＣシリーズＭＡｂの生成のために、全長タンパク質のＬｙｓ２０〜Ｔｒｐ２９７のＰｒｏ１０４の領域をコードする、可溶性の大腸菌発現Ｐｒｏ１０４組換えタンパク質で、マウスを免疫化した。８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、両方の後ろ足蹠に皮内免疫化した。全ての注射は、１つの足当たり２５ｕＬであった。１匹のマウス当たり１０ｕｇの抗原の最初の注射（１日目）は、等しい容積対容積比でTitermax gold アジュバント(Sigma, Saint Louis, MS)と混合したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）において行った。マウス当たり１０ｕｇの抗原のその後の注射は、５、９、１２、１６、１９、２３、２６、２９、３０日目に行い、マウス当たり、２０ｕＬのＤＰＢＳおよび５ｕＬのAdju-phosアジュバント(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY)中の抗原からなっていた。３３日目の最後の追加免疫注射は、ＤＰＢＳのみに希釈した抗原からなっていた。融合は、３７日目に生じた。
ＤシリーズＭＡｂの生成のために、マウスは上記と同様にして、全長タンパク質のＩｌｅ４２〜Ｔｒｐ２９７領域に相当する、可溶性の昆虫細胞が発現したＰｒｏ１０４組換えタンパク質で免疫化した。
ＫシリーズＭＡｂのために、細胞表面上でＰｒｏ１０４を発現する、安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞系で免疫化した。Ｐｒｏ１０４の細胞表面発現は、１３．３％〜９７．０％の範囲であった。初めの２回の注射により、マウスを１．２５×１０６細胞／マウスで免疫化し、３〜９回の注射においては、３．７５×１０６細胞／マウスをマウスに注射した。マウスには、最終の注射で２．５×１０６細胞を与えた。アジュバントなしのＨＢＳＳ中の全細胞が、免疫化の系列を通して用いられた。Ｋシリーズの免疫化スケジュールは、上のＣおよびＤシリーズに用いられたものと同一であった。
ハイブリドーマ融合
マウスを、免疫化プロトコルの完了時に絶命させ、排出するリンパ節（膝窩）組織を、無菌の解剖により採集した。リンパ節細胞は、Tenbroeck組織グラインダー（Wheaton #357426, VWR, Brisbane, CA）を用い、続いて無菌の４０ｕＭふるい（VWR）を通してＤＭＥＭ中に押圧し、Ｔ細胞を抗ＣＤ９０（Ｔｈｙ１．２）で被覆した磁性ビーズ(Miltenyl Biotech, Baraisch-Gladbach, Germany)で除去することにより、分散させた。
次に、これらの一次Ｂ細胞が豊富なリンパ節細胞を、連続的な骨髄腫細胞系Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３(Kearney, J.F. et al., J. Immunology 123: 1548-1550, 1979)との電子−細胞融合(BTX, San Diego, CA)により不死化した。成功に融合した細胞を、標準的なヒポキサンチン、アザセリン（ＨＡ）(Sigma, St. Louis, MO)含有選択培地（ＤＭＥＭ／１５％ＦＢＳ／０．５ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−６(Sigma, St. Louis, MO)／１０％Ｐ３８８Ｄ１（ATCC, Manassas, VA）調整培地）中で培養することにより選択した。これらの融合培養物を、直ちにプレートあたり２００万個の細胞で、９６ウェル培養プレート（Costar Cat. #3585, VWR）のウェル中に分散させた。融合後直ちに、培養物を９６ウェル培養プレート中に分散させることにより、単一の特異的な抗体を産生するより広範囲の種類のハイブリドーマクローンの選択が容易になった。ウェルからの上清液を、ＥＬＩＳＡにより、Ｐｒｏ１０４大腸菌発現タンパク質、Ｐｒｏ１０４昆虫発現タンパク質に対する反応性について、および、セリンプロテアーゼＯｖｒ１１５細胞外領域（昆虫発現）との交差反応性の不在について、スクリーニングした。
単一の細胞からの遺伝子的に均一な子孫からなるモノクローナル培養物を、上記のスクリーニング手順の後に、限界希釈法（Coller, H and Coller, B. Hybridoma 2: 91-6, 1983）により、または、単一の生存可能な細胞を２つの９６ウェルプレート（VWR）のウェル中に、フローサイトメトリー(Coulter Elite, Beckman Coulter, Miami, FL)を用いて分類することにより確立した。得られたマウスＢ細胞ハイブリドーマ培養物は、標準的な組織培養手法を用いて拡張させた。選択されたハイブリドーマを、１０％ＤＭＳＯを有する胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で凍結保存し、−１９６℃の液体窒素中に貯蔵して、生存可能なクローン培養物の維持を確実にした。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよび選択
ハイブリドーマ細胞系を、Ｐｒｏ１０４特異的抗体の産生について、酵素結合固相イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により選択した。Ｐｒｏ１０４またはＯｖｒ１１５タンパク質を、９６ウェルポリスチレンＥＩＡプレート（VWR）のウェルに非特異的に吸着させた。（ＤＰＢＳ）中で約０．1ｕｇ／ｍＬにおいて、１００ｕＬのＰｒｏ１０４タンパク質またはＯｖｒ１１５タンパク質を、９６ウェルポリスチレンＥＩＡプレートのウェル中で、一晩４℃でインキュベートした。プレートを、０．０５％のTween 20、ｐＨ７．４を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で２回洗浄した。次に、プレートウェルを排出し、非特異的結合能力を、アッセイウェルをＴＢＳＴ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＴＢＳＴ／ＢＳＡ）で完全に満たし、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートすことにより遮断した。次に、プレートウェルを排出し、ＴＢＳＴ／ＢＳＡで１：１に希釈した１００ｕＬのハイブリドーマ培養培地試料をウェルに加え、１時間ＲＴでインキュベートした。次に、ウェルを、（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。次に、ＴＢＳＴ／ＢＳＡで１：５０００に希釈した１００ｕＬのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を、各々のウェルに加え、１時間ＲＴでインキュベートした。次に、ウェルを、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．９(Pierce, Rockford IL)中の１００ｕＬのアルカリホスファターゼ基質パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）(Sigma, Saint Louis, MS)、１ｍｇ／ｍＬを、各々のウェルに加え、２０分間ＲＴでインキュベートした。５０ｕＬの２ＮのＮａＯＨ／ウェルを加えることにより、発色を終了させた。結合したアルカリホスファターゼ活性を、視覚可能な黄色の発色により示した。酵素反応を、溶液の吸光度を４０５ｎｍの波長において測定することにより定量した。最高の吸光度の値を生じる培養物を、拡張およびさらなる評価のために選択した。もとの９６ウェルプレートから選択されたＥＬＩＳＡ陽性培養物を、新しい９６ウェル組織培養プレート（ＶＷＲ）へ移送した。
Ｐｒｏ１０４ＭＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング
ハイブリドーマを再試験して、Ｐｒｏ１０４特異的ＭＡｂの連続産生を確認した。Ｐｒｏ１０４について１．０より大きい、およびＯｖｒ１１５について０．２より小さいＥＬＩＳＡ吸光度値を生じる上清を有するハイブリドーマ培養物を組織培養において拡張し、上記のように冷凍保存した。選択されたＰｒｏ１０４特異的培養物を、限界希釈法または単一細胞分類（Coulter Elite）によりサブクローニングして、遺伝的に安定で均一な子孫を確実にした。
クローニングしたＰｒｏ１０４ＭＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニングからの結果
大腸菌発現Ｐｒｏ１０４による最初の免疫化からのクローンPro104.C13、Pro104.C18、Pro104.C25およびPro104.C55は、ＥＬＩＳＡにより、大腸菌発現Ｐｒｏ１０４、昆虫発現Ｐｒｏ１０４、ヒト２９３Ｔ細胞発現Ｐｒｏ１０４の、ＨＡタグ有り無しの場合に対し陽性であり（下の表１）、他のヒトセリンプロテアーゼ膵臓トリプシン、肺トリプターゼおよびカリクレイン(Cal Biochem, San Diego, CA)、プラスミン、またはウロキナーゼ（American Diagnostics, Greenwich, CT）とは反応しなかった。Pro104.C13、Pro104.C18、Pro104.C19、Pro104.C25およびPro104.C55を、ウェスタンブロット、免疫組織化学法および免疫蛍光法によるさらなる特徴付けのためにサブクローニングしスケールアップした。Pro104.C37およびPro104.C48のＭＡｂはヒトウロキナーゼに交差反応し、免疫組織化学法または免疫蛍光法による評価は行わなかった。
昆虫発現Ｐｒｏ１０４による免疫化からのクローン：
Figure 2007528845
 は、ＥＬＩＳＡにより、大腸菌発現Ｐｒｏ１０４、昆虫発現Ｐｒｏ１０４、ヒト２９３Ｔ細胞発現Ｐｒｏ１０４のＨＡタグ有り無しの場合に対し陽性であり(表２)、他のヒトセリンプロテアーゼ膵臓トリプシン、肺トリプターゼおよびカリクレイン、プラスミン、またはウロキナーゼとは反応しなかった、下の表２参照。クローンPro104.D12、Pro104. D15、Pro104.D55、Pro104.D62、Pro104.D68およびPro104.D106は、ＥＬＩＳＡにより、大腸菌発現Ｐｒｏ１０４、昆虫発現Ｐｒｏ１０４に陽性であり、ヒト２９３Ｔ細胞発現Ｐｒｏ１０４にはより弱く反応したが（ＥＬＩＳＡ ＯＤ４０５ｎｍ、０．３〜０．８）（データ示さず）、膵臓トリプシン、肺トリプターゼおよびカリクレイン、プラスミン、またはウロキナーゼには反応しなかった（表２）。Pro104.D20およびPro104.D21は、哺乳類（２９３Ｔ）Ｐｒｏ１０４たんぱく質に対してのみ陽性であった。
Figure 2007528845
 は、ウェスタンブロット、免疫組織化学法および免疫蛍光法によるさらなる特徴付けのためにサブクローニングし、スケールアップした。他のヒトセリンプロターゼと交差反応したＰｒｏ１０４ＭＡｂ（Pro104.D29およびPro104.D31）は、免疫組織化学法または免疫蛍光法による評価を行わなかった。
Ｐｒｏ１０４ＣシリーズＭＡｂの細胞表面結合についてのＦＡＣＳスクリーニング
ＣＡＯＶ３（Ｐｒｏ１０４に対してＲＴ−ＰＣＲ陽性）およびＳＫＯＶ３（Ｐｒｏ１０４に対してＲＴ−ＰＣＲ陰性）卵巣腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。染色の前に、細胞は１０ｍｌのＣａ＋２／Ｍｇ＋２非含有ＤＰＢＳで１回洗浄し、次に７ｍｌの温かい（３７℃）Cellstripper(Mediatech, Herndon, VA)を１５０ｃｍ２のフラスコにつき加えた。次に、細胞を、５分間３７℃で、フラスコを軽くたたいてしっかり付着した細胞を除去しながらインキュベートした。細胞を除去し、数回ピペットで採取して、凝集体を破壊し、次に直ちにＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に配置した。次に、細胞を、５分間１３００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁させた。細胞を、３７℃で３０分の回収時間にわたりインキュベートした。染色の前に、細胞の生存可能性をGuava Viacount (Guava Cytometers, City, CA)を用いて測定し、＞９０％生存可能である場合には、これらを９６ウェルｖ底プレート（ＶＷＲ）中に分散させて、ＭＡｂで染色した。
細胞を、９６ウェルｖ底プレート中に、０．５〜１．０×１０６個の細胞／ウェルにおいて等分し、２分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、プレートをボルテックスミキサー上で短時間振盪して細胞を再懸濁させ、次に２００ｕｌのＤＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０．０１％アジ化Ｎａ（ＦＡＣＳ緩衝液）を、各々のウェルに加えた。遠心分離および吸引を繰り返し、次に２５ｕＬのハイブリドーマ上清または精製したＭＡｂを、細胞に加えた。プレートをボルテックスして細胞を再懸濁させ、氷上で１５分間貯蔵し、次に前述のように、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、遠心分離した。この洗浄手順を２回繰り返し、次に２５ｕＬのフィコエリスリン（ＰＥ）結合ロバ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA)を、細胞に加えた。氷上で１５分後、細胞を、前述のように２回洗浄し、次に２５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、細胞選別機またはフローサイトメーター上で分析した。ある場合において、分析前に４℃で一晩貯蔵するために、１３３ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液および６７ｕＬの１％パラホルムアルデヒド／ＤＰＢＳを、固定のために各々のウェルに加え、次に、容積を、ＤＰＢＳで２５０ｕＬに増加させた。染色した細胞を、Elite蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）(Beckman-Coulter, Miami, FL)上で分析した。
免疫蛍光ＦＡＣＳおよび顕微鏡分析による、幾つかのＣシリーズＭＡｂの細胞表面結合を示す結果を、表１にまとめる。ヒト腫瘍細胞系を用いたさらなる免疫蛍光顕微鏡データを、下に示す。ＣシリーズＭＡｂのアイソタイプは、市場で入手可能なマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用免疫測定試験キット（IsoStrip, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN）を用いて決定した。アイソタイプ決定結果は、表１に示す。
Figure 2007528845
 ＊４＝ＨＡとの強い共局所化、非形質移入２９３Ｔ細胞の背景染色なし、３＝ＨＡとの強い共局所化、非形質移入２９３Ｔ細胞の背景染色あり、２＝ＨＡとの部分的共局所化、非形質移入２９３Ｔ細胞の背景染色あり、１＝弱いＨＡ染色（おそらく試験ＭＡｂにより遮断された）、非形質移入２９３Ｔ細胞の強い背景染色あり。
Figure 2007528845
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４ＤシリーズおよびＫシリーズＭＡｂの細胞表面結合についてのＦＡＣＳスクリーニング
５０μｇのプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ還元血清媒地（ＧＩＢＣＯ）中に希釈して総容量を１．５ｍｌとし、続いてゆっくり混合して脂質−ＤＮＡ複合体を調製することにより、５千万個の２９３Ｆ細胞に形質移入した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに７５μｌの２９３フェクチン（Invitrogen）を希釈して１．５ｍｌとしたものをゆっくり混合して、室温で５分間インキュベートした。５分間のインキュベートの後、希釈ＤＮＡを希釈２９３フェクチンに混合した。この混合物を室温で２０〜３０分間インキュベートさせて、ＤＮＡ−２９３フェクチン複合体を形成させた。ＤＮＡ−２９３フェクチン複合体をインキュベートする間、５０ｍｌの細胞懸濁液のアリコート（１Ｅ６生存可能細胞／ｍｌ）を、無菌の使い捨てフラスコに配置した。ＤＮＡ−２９３フェクチン複合体のインキュベーションが完了した後、これを細胞入りの各フラスコに移した。フラスコは、３７℃のインキュベータ内で１２０ｒｐｍで振盪させつつインキュベートした。細胞は、形質移入の約４８時間後に、染色実験に用いた。
２９３Ｆ細胞の形質移入に用いたＤＮＡ配列は、全長Ｐｒｏ１０４配列（ｍｅｔ１〜ｖａｌ３１４）、タグ無しであり、上の配列番号：３を参照。
染色の前に、２９３Ｆおよび対照細胞の生存可能性を、Guava Viacount（Guava Technologies, Hayward, CA）を用いて測定し、＞９０％生存可能である場合には、これらを９６ウェルｖ底プレート（ＶＷＲ）中に分散させて、ＭＡｂで染色した。
細胞を、９６ウェルｖ底プレート中に、０．５〜１．０×１０６個の細胞／ウェルにおいて等分し、２分間１５００ｒｐｍにおいて遠心分離した。上清を吸引し、プレートを、ボルテックスミキサー上で短時間振盪して細胞を再懸濁させ、次に２００ｕｌのＤＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０．０１％アジ化Ｎａ（ＦＡＣＳ緩衝液）を、各々のウェルに加えた。遠心分離および吸引を繰り返し、次に２５ｕＬのハイブリドーマ上清または精製したＭＡｂを細胞百万個当たり１ｕｇ、細胞に加えた。プレートを氷上で１５分間貯蔵し、次に前述のように、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、遠心分離した。この洗浄手順を２回繰り返し、次に２５ｕＬのヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ビオチン結合抗体（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）をウェルに１５分間加えて、上のように洗浄した。２５ｕＬのフィコエリスリンストレプトアビジン（ＰＥＳＡ）を細胞に加えた。氷上で１５分後、細胞を前述のように２回洗浄し、次に、細胞選別機またはフローサイトメーター上での分析のために２５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。染色した細胞は、Elite蛍光活性化細胞選別機 (Beckman-Coulter, Miami, FL)上で分析した。
ＦＡＣＳ分析による、多数のＤシリーズおよびＫシリーズＭＡｂの細胞表面結合を示す結果を、下の表３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示す。ＦＡＣＳ分析による、細胞表面発現を示す代表的な実験結果を、図１（ＡおよびＢ）および図２（ＡおよびＢ）に示す。
特に、図１ＡはPro104.D116.1抗体の、一過性形質移入２９３Ｆ細胞への細胞表面結合を、対照抗体（Ovr110.A57.1）と比較して示す。図１Ｂは、図１Ａで観察される結合はＰｒｏ１０４に特異的であることを示す。さらに、図２Ａは、Pro104.D118.1抗体の、一過性形質移入２９３Ｆ細胞への細胞表面結合を、対照抗体（Ovr110.A57.1）と比較して示す。図２Ｂは、図２Ａで観察される結合はＰｒｏ１０４に特異的であることを示す
ＭＡｂPro104.D116.1の結合の結果、８５％のＰｒｏ１０４形質移入ヒト２９３Ｆ細胞が陽性であり、対照抗体（Ovr110.A57.1）単独で染色した細胞よりも９倍高いＭＦＩ（平均蛍光強度）がもたらされた。Pro104. D118.1の結合の結果、７０％の細胞がＰｒｏ１０４に陽性となる二峰性分布と、対照抗体より２２倍高い平均蛍光強度がもたらされた。
Ｐｒｏ１０４−２９３Ｆ形質移入細胞に特異的に結合し、非形質移入２９３Ｆに結合しない、他のＤシリーズ抗体は、
Figure 2007528845
 である（下の表３Ａ参照）。
Figure 2007528845
Pro104.K81（Ｋシリーズからの）抗体もまた、Ｐｒｏ１０４を一過性に形質移入した２９３Ｆに結合する。約５４％の細胞が陽性で、平均蛍光強度は１．６９であり、これは陰性対照抗体に対して３倍であった。
Ｐｒｏ１０４−２９３Ｆ形質移入細胞に特異的に結合し、非形質移入２９３Ｆに結合しない、他のＫシリーズ抗体は、Pro104.K72、Pro104.K78、Pro104.K81、Pro104.K88、Pro104.K156、Pro104.K159、Pro104.K164およびPro104.K176である（下の表３Ｂ参照）。
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４のＤシリーズおよびＫシリーズ抗体を、Ｐｒｏ１０４転写物（ＨｅＬａ）に対してＱＰＣＲ陽性であり、Ｐｒｏ１０４転写物（ＨＣＴ１１６）に対してＱＰＣＲ陰性である細胞系についても試験した。Pro104.K81は、ＨｅＬａ細胞の９７％およびＨＣＴ１１６細胞の９％に結合し、８倍高い平均蛍光強度であった。（下の表３Ｃ参照）
Figure 2007528845
Figure 2007528845
Figure 2007528845
 これらの結果は、表３Ａ、３Ｂおよび３Ｃの抗体、および特にPro104.K81Ｍａｂは、結合する薬剤、毒素、酵素、プロドラッグ活性化分子または同位体と共にまたはそれなしで、腫瘍の免疫療法に適することを示す。
Ｐｒｏ１０４ＭＡｂ親和性分析
結合動力学および親和性定数を、表面プラスモン共鳴測定から、BIACORE 3000機器(Biacore, Piscataway, NJ)を用いて計算した。実験を設計して、Ｐｒｏ１０４ＭＡｂについてのオンレート、オフレートおよび親和性値を同時に発生させた。
Ｐｒｏ１０４タンパク質ロット＃060402（diaDexus）を、ＣＭ５センサーチップ(Biacore)の流動細胞２上で、標準的なアミンカップリング(Biacore)により固定化した。流動細胞１を、基準の減算のためのブランク表面として用い、これを活性化し、次にエタノールアミンで不活性化した。Ｐｒｏ１０４ＭＡｂをＨＢＳ ＥＰ緩衝液(Biacore)で希釈し、流動細胞１および２を続けて通過させた。ＭＡｂは、順番に５種類の濃度：２００、１００、５０、２５、１２．５ｕｇ／ｍｌの各々でデュプリケートで注射した。ＭＡｂの分子量を１５８，０００ｋＤａと仮定すると、それぞれのｎＭ濃度は、１２６６、６３３、３１７、１５８および７９と計算される。ＭＡｂは、３分間３０ｕＬ／分で注入され、続いて１２分間の解離時間をとった。チップ表面の再生、またはサイクル間でのＭＡｂの除去は、ｐＨ１．５の１００ｍＭのグリシンを流動細胞を通して２回、初めに３０秒間、次に１２秒間、どちらも１００ｕｌ／分で注入して通すことにより行なった。
上記の手順は、Biacore 制御ソフトウェアに含まれているBiacoreの動力学分析ウィザードにより行った。得られたセンソグラム（sensogram）は、自動的に、１：１のラングミュア結合モデルを仮定して当てはめた。下の表４に示された結果は、ウィザードデータ加工機能を用いて計算した。表３に示す親和性の計算値は、Pro104.C34を除いて全て１０−９Ｍの範囲であり、従って、Pro104.C34を除き、in vivoでの治療用量を１０ｍｇ／ｋｇ以下で達成するのに十分に高かった。
Figure 2007528845
ウェスタンブロット
ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物を、細胞溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０／１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２／５０ｍＭの塩化ナトリウム）中に、Ｐｒｏ１０４−２９３Ｔ一過性形質移入体および哺乳類腺癌細胞系から調製した。タンパク質は、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)上での電気泳動により、変性条件下で、Novex-XCell II Minicellゲル装置(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)において分離し、その後ＰＶＤＦ膜に、XCell II Blot Module (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて移送した。タンパク質の移送に続いて、膜を、１％遮断試薬(Cat. #1 096 176, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)中で遮断し、精製した一次抗体、すなわちPro104.C4、Pro104.C13、Pro104.C18、Pro104.C19、Pro104.C25、Pro104.C34、Pro104.C37、Pro104.C48、Pro104.C55、Pro104.C60またはPro104.C66と共に、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ (Cat. #115-036-062, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)と共に、４℃で一晩インキュベートした。バンドを化学発光により、ＥＣＬアドバンスウェスタンブロッティング検出キット(Cat. #RPN2135, Amersham Biosiences, Piscataway, NJ)を用いて視覚化した。
脱グリコシル化実験を、Ｐｒｏ１０４−２９３Ｔ形質移入体、哺乳類腺癌細胞系および正常ヒト睾丸からのタンパク質抽出物に対して、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ(PNGaseF, Cat. #P0704S, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)を用いて、製造者の指示に従って試験して行った。次に、脱グリコシル化された試料を、前述のようにウェスタンブロットにより分析した。簡単に述べると、１００ｕｇのタンパク質抽出物を、糖タンパク質変性緩衝液（０．５％ＳＤＳ／１％ベータ−メルカプトエタノール）中で、１００℃で１０分間変性させた。これに続いて、キット反応緩衝液（New England Biolabs）を、１％のＮＰ−４０および５０ｍＭのリン酸ナトリウムの最終濃度で加え、１００単位のPNGaseFを加え、３７℃で４時間インキュベートした。
Figure 2007528845
ウェスタンブロット実験の結果を、上の表５にまとめる。Ｐｒｏ１０４−２９３Ｔ形質移入体からの完全細胞溶解物、ＭＡｂのPro104.C4、Pro104.C13、Pro104.C18、Pro104.C19、Pro104.C25、Pro104.C34、Pro104.C37、Pro104.C48、Pro104.C55およびPro104.C60は、約３５ｋＤａ〜４０ｋＤａまでの幾つかのタンパク質バンドに特異的に反応し、これは全長Ｐｒｏ１０４／テスチシンを加工した後に形成されるＰｒｏ−１０４のグリコシル化形態と整合していた。これらのバンドは、非形質移入２９３Ｔ細胞系試料には存在しなかった。Pro104 ＭＡｂ−C66は、ウェスタンブロット分析では反応せず、従ってさらなる試験からは除いた。約３８ｋＤａのタンパク質ｅバンドは、ＭＡｂPro104.C25、Pro104.C55およびPro104.C37によっては、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡ陽性（ＲＴ−ＰＣＲ＋）癌細胞系ＨｅＬａおよびＣａＯｖ３（ＡＴＣＣ）からの溶解物において検出されたが、ＲＴ−ＰＣＲ陰性卵巣癌細胞系ＳｋＯｖ３（ＡＴＣＣ）からの溶解物においては、予想通り存在しなかった。同様に、ＭＡｂPro104.C25およびPro104.C55は、予想分子量（３８ｋＤａ）のバンドを、正常ヒト睾丸からの溶解物において検出した（データ示さず）。ＭＡｂPro104.C25およびPro104.C55はまた、組換えおよび天然のマウステスチシンと、ウェスタンブロットにおいて反応した（データ示さず）。
Ｐｒｏ１０４形質移入体、ＲＴ−ＰＣＲ陽性細胞系および正常ヒト睾丸からの脱グリコシル化溶解物のウェスタンブロットにおいて、Pro104.C25により検出されるＰｒｏ１０４タンパク質の移動は、約３８−４０ｋＤａ（グリコシル化）から約３０ｋＤａ（非グリコシル化）へとシフトした。Ｐｒｏ１０４のこの分子量の減少は、Ｐｒｏ１０４タンパク質の触媒サブユニット上の３つのＮ−グリコシル化部位の予想と整合する。
例２：免疫蛍光法により示される、生きている癌細胞におけるＰｒｏ１０４ＭＡｂの細胞表面結合
以下の癌細胞系をこの試験で用い、これらはＡＴＣＣより入手した：子宮頚部（ＨｅＬａ）、卵巣（Ｔｏｖ−１１２Ｄ、Ｔｏｖ−２１Ｇ、ＣａＯＶ−３およびＳＫＯＶ−３）、結腸（ＨＣＴ１１６）、および膵臓（ＭＩＡ Ｐａｃａ−２およびＡｓＰＣ）。ＨｅＬａ、ＣａＯＶ−３細胞系は、ＱＰＣＲにより決定されるようにＰｒｏ１０４ＲＮＡを発現する。対照ＨＣＴ１１６およびＳＫＯＶ−３細胞は、Ｐｒｏ１０４ＲＮＡを発現しない。
上の細胞系を、無菌の１８ｍｍガラス製カバースリップ上に播種し、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で、３７℃にて４８時間培養し、その後一次抗体（Ｐｒｏ１０４ＭＡｂ）で処理した。
ＭＡｂ：Pro104.C19.1、Pro104.C25.1、Pro104.C55.1およびPro104.D9を免疫蛍光顕微鏡で検査し、いずれの抗体が、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞の細胞表面に結合するかを決定した。一次ＭＡｂを、培地に、１０ｕｇ／ｍｌの最終濃度で加え、３７℃で１時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％ホルムアルデヒドで固定した後に、細胞を、二次Ｃｙ３標識したロバ抗マウス(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)、濃度５ｕｇ／ｍｌ、と共に３０分間インキュベートした。洗浄に続いて、細胞を、ＤＡＰＩを含む培地Vectastain（Vector, Burlingame, CA)中に載置して細胞核を視覚化し、適切な蛍光フィルターを備えたZeiss Axiophot蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡写真はＣＣＤカメラで記録した。
Pro104.C19.1、Pro104.C25.1、Pro104.C55.1およびPro104.D9は全てＰｒｏ１０４発現細胞に結合した。図３Ａおよび３Ｂは、Pro104.C19.1のＨｅＬａ細胞への結合を示す(図３Ａ)。視野内のほとんどの細胞は、Ｐｒｏ１０４への標識を示す。Pro104.C19.1は、細胞の細胞膜を修飾しているのがはっきりと見られる（矢印）。しかし、Pro104.C19.1は対照陰性（ＱＰＣＲ）ＳＫＯＶ−３癌細胞には結合しなかった（図３Ｂ、Ｎは細胞核の位置を示す）。
生きている癌細胞におけるＣｙ３結合抗体による結合および内部移行
この試験は、直接結合蛍光抗体（ＭＡｂ）を用いて行った。蛍光色素Ｃｙ３が直接結合した抗体を用いて、抗体結合および内部移行を、蛍光顕微鏡観察により視覚化することができる。この手法は当分野によく知られている。Ｐｒｏ１０４を発現しないＳＫＯＶ−３細胞（ＱＰＣＲ陰性）を、陰性対照として用いた。
Ｃｙ３結合
Pro104.C19.1、Pro104.C25.1およびPro104.A55.1のＭＡｂをそれぞれＣｙ−３に結合した。Ｃｙ３結合は、製造者のガイドライン（Pierce）の標準的な手順に従って行った。簡単に述べると、１ｍｇの抗体を、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．３）に対して６０分間透析し、Ｃｙ３染料と混合し、ＲＴで２時間インキュベートし、次にSlide-A Lyzer透析カセット（Pierce）中に移送して、２リットルのＰＢＳ中で６時間、４℃において透析した。透析緩衝液を入れ替えて、透析を６回繰り返した。Ｃｙ３結合抗体を回収し、濃度を分光計において、２８０ｎｍで測定した。
細胞標識
Ｃｙ３−Pro104.C19.1、Ｃｙ３−Pro104.C25.1およびＣｙ３−Pro104.A55.1ＭＡｂを、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で、細胞と共に３７℃で、水チャンバー中で６０分間インキュベートし、細胞を含むカバースリップをＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。固定に続いて、細胞を含むカバースリップを、ＤＡＰＩを含む培地(Vectastain)中に載置して細胞核を視覚化し、細胞を適切な蛍光フィルターを備えたZeiss蛍光顕微鏡Axiophotを用いて観察した。顕微鏡写真をＣＣＤカメラで得た。
結果
Ｃｙ３−Pro104.C19.1、Ｃｙ３−Pro104.C25.1およびＣｙ３−Pro104.A55.1で処理した癌細胞の免疫蛍光顕微鏡観察により、Ｐｒｏ１０４を発現する卵巣癌および膵臓癌細胞が、蛍光抗体に結合し、これを内部移行できることが示された。図４Ａ（矢印）は、Ｐｒｏ１０４を発現する細胞系であるＨｅＬａ細胞の表面への、Ｃｙ３−Pro104.C25.1の結合を示す。Ｃｙ３−Pro104.C25.1抗体は、Ｐｒｏ１０４を発現しない対照細胞ＳＫＯＶ−３には結合しなかった。図４Ｂ参照、Ｎは幾つかの非標識細胞の核を示す。図５は、細胞膜への結合の後に、Ｃｙ３−Pro104.C25.1が生きているＨｅＬａ細胞中に内部移行されること、および内部移行小胞はこれら細胞の細胞質に観察できることを示す。特に、小胞はしばしば細胞核（Ｎ）に近接して視覚化される（矢印）。図６Ａおよび７Ａはそれぞれ、Ｃｙ３−Pro104.C19.1およびＣｙ３−Pro104.C55.1のＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞内への結合および内部移行を示す。ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞はＰｒｏ１０４を発現する膵臓細胞系である。内部移行パターンは、ゴルジ体（矢印）に近接して位置するエンドソームに対応する傾向がある核周囲小胞の存在により、特徴付けられる。Ｃｙ３−Pro104.C19.1およびＣｙ３−Pro104.C55.1は、Ｐｒｏ１０４を発現しない対照細胞系ＨＣＴ−１１６の細胞には結合しなかった（図６Ｂおよび７Ｂ）。
Ｃｙ３結合ＭＡｂである、Pro104.C19.1およびPro104.C25.1およびPro104.A55.1は全て、in vitroで、Ｐｒｏ１０４発現癌細胞の細胞表面に結合すると内部移行される。これらの結果は、抗Ｐｒｏ１０４抗体、そして特にPro104.C19.1、Pro104.C55.1およびPro104.A55.1ＭＡｂは、結合する薬剤、毒素、酵素、プロドラッグ活性化分子または同位体と共にまたはそれなしで、腫瘍の免疫療法に適することを示す。
免疫組織化学法（ＩＨＣ）により評価された腫瘍および正常組織におけるＰｒｏ１０４分布
卵巣癌および膵臓癌および正常な隣接組織のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックをNational Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)から得た。正常な器官のＯＣＴ包埋ブロックをZoion (Hawthorne, NY)から得た。
ホルマリン固定パラフィン包埋切片についての免疫組織化学的染色
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから切断した厚さ６μｍの切片を、４５℃で１５分間加熱し、Histoclear（National Diagnostics, Atlanta, GA）中で脱パラフィンし、ＰＢＳまで一連の減少エタノール濃度により再水和した。抗原検索を、切片スライドを１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２０℃、１５〜１７ＰＳＩにおいて、デクローキング(decloaking)チャンバー(Biocare, Walnut Creek, CA)内で１０分間沸騰することにより行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素溶液で１５分間切片を処理することにより停止した。スライドを１％ＢＳＡと共にインキュベートして非特異的抗体結合を遮断し、次に、一次Ｐｒｏ１０４ＭＡｂを１０ｕｇ／ｍｌの濃度で用いて、１時間、室温でＤＡＫＯオートステイナー(autostainer)(Dako Co., Carpinteria, CA)中で反応させた。０．５％のTween-20を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で洗浄した後に、スライドを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）(Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)に結合した抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。０．５％のTween-20を含むＴＢＳ中で洗浄した後に、切片を、３，３’−ジアミノベンジジン色素原で２〜５分間処理し(Immunovision Technologies)、ヘマトキシリンで対比染色し、その後脱水後にPermount培地（American Master Tech Scientific, Inc. Lodi, CA）中に載置した。一次抗体と同一の濃度の正常なマウスＩｇＧを、免疫標識特異性の陰性対照とした。付加的な対照実験においては、Ｐｒｏ１０４ＭＡｂを、組織学切片に適用する前に抗原Ｐｒｏ１０４と共にインキュベートした。
ＯＣＴ包埋凍結未固定切片についての免疫組織化学的染色
スライドを、クリオチャンバー(cryochamber)内で、適切な温度において５〜８ｕｍに切断し、少なくとも３０分間室温で風乾した。簡単に述べると、スライドをＴＢＳ中で洗浄して、ＯＣＴを除去し、室温で１時間インキュベートした。ＩＨＣはImmunovision Powervision Kit (Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)を用いて行った。簡単に述べると、スライドはＴＢＳ−Ｔで洗浄してＯＣＴを除去し、Ｐｒｏ１０４一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。これらは次に、４％パラホルムアルデヒド固定液中で、室温で１０分間後固定し、上記のようにして処理した。
結果
Pro104.C25.1、Pro104.A55.1、Pro104.D9およびPro104.D133を用いて、卵巣癌および膵臓癌の切片を免疫標識した。卵巣腫瘍および膵臓腫瘍中の上皮細胞は標識されたが、正常卵巣および膵臓は標識されなかった。Pro104.C25.1は、１７個の卵巣漿液性腺癌臨床試料のうち１０個（５８％）、および膵臓癌の臨床試料の１１／１１（１００％）の細胞表面を標識した。Pro104.C55.1は、８個の卵巣癌臨床試料のうち６個（７５％）、および膵臓癌の臨床試料の３／３（１００％）の細胞表面を標識した。Pro104.D9は、卵巣漿癌の１／４（２５％）において細胞表面を標識した。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、２個の卵巣癌臨床試料におけるPro104.C25.1により得られたＩＨＣの結果を示す（図８Ａおよび８Ｂ）。対照の正常卵巣はPro104.C25.1 ＭＡｂによっては標識されなかった（図８Ｂおよび８Ｄ）。図９は、Pro104.C25.1により標識された卵巣癌組織切片の高倍率の図を示す。標識は、腫瘍上皮細胞の細胞膜に明確に局在化していた（矢印）。
図１０は、Pro104.D9が卵巣癌細胞の細胞表面を標識することを示す（矢印）。さらに、図１１はPro104.D133が漿液性卵巣癌細胞の細胞表面を標識することを示す。
図１２Ａおよび１２Ｃは、膵臓腺癌の臨床試料においてPro104.C25.1により得られた免疫標識パターンを示す。Ｐｒｏ１０４標識は、ほとんどが上皮細胞の細胞表面（矢印）に限定され、時々細胞質標識がみられた（図１２Ｃ）。正常膵臓細胞にはほとんど特異的標識はなかった（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。さらに、図１３は、Pro104.C25の代わりに正常マウスＩｇＧが用いられた場合（図１３Ａ）、またはＩＨＣ用の加工の前にPro104.C25.1がＰｒｏ１０４抗原に吸着された場合（図１３Ｂ）には、特異的標識が観察されないことを示す。
Ｐｒｏ１０４発現を、正常な器官においても分析した。ＯＣＴ凍結切片上のＩＨＣは、次の細胞の細胞表面上では検出可能な標識を示さなかった：心臓、肝臓、腎臓、脳、結腸、胃、肺、前立腺、卵巣、膵臓および乳房。しかし、睾丸の生殖細胞の膜は、強いＰｒｏ１０４免疫標識を示した。この結果は、科学文献において発表されたデータから予想された（J. D. Hooper et al., Testisin, a new human serine protease expressed by premeiotic testicular germ cells and lost in testicular germ cell tumors. Cancer Research 59:3199-3205 (1999)）。概要について下の表６を参照。
Figure 2007528845
 ＊正常生体器官は、心臓、肝臓および腎臓を含む。
上記の免疫組織化学法の結果は、Ｐｒｏ１０４が卵巣および膵臓癌のケースで高パーセンテージで発現されることを示す。Ｐｒｏ１０４が癌細胞の細胞表面上で発現されるという事実は、Ｐｒｏ１０４を抗体に基づく療法についての理想的な標的にする。さらに、ＩＨＣにより示された、抗Ｐｒｏ１０４抗体の卵巣癌および膵臓癌細胞への結合は、抗Ｐｒｏ１０４抗体、特にPro104.C25.1、Pro104.D9およびPro104.D133ＭＡｂが、結合する薬剤、毒素、酵素、プロドラッグ活性化分子または同位体と共にまたはそれなしで、腫瘍の免疫療法に適することを示す。
例３：Ｐｒｏ１０４のマウスモノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ検出
Ｐｒｏ１０４競合的チェッカー盤ＥＬＩＳＡ
高結合ポリスチレンプレート(Corning Life Sciences (MA))を、１μｇ／ウェルの抗Ｐｒｏ１０４ＭＡｂで４℃にて一晩被覆した。被覆溶液を吸引して除去し、遊離の結合部位を、３００μｌ／ウェルのSuperblock-TBS (Pierce Biotechnology, Illinois)を加えて、１時間ＲＴで遮断した。Wash Buffer (１×ＴＢＳ／０．０５％Tween 20)で２回洗浄した後、１００μｌのＰｒｏ１０４抗原を各ウェルに加えた。、各々の対を、アッセイ緩衝液（１ＸＴＢＳ、１％ＢＳＡ／１％マウス血清／１％子牛血清／０．１％Tween 20）中に希釈した、１００ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌの組換えＰｒｏ１０４大腸菌発現タンパク質と共に試験した。添加後、プレートをＲＴで振盪しながら１時間インキュベートし、３６０μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄した。次に、アッセイ緩衝液中２０μｌ／ｍｌにて、５０μｌの非標識の被覆ＭＡｂを加えて、ＲＴで振盪しながら１０分間インキュベートした。その後、５０μｌのビオチン化検出ＭＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、プレートをＲＴで１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、１００μｌのアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, １：２０００希釈）をウェルに加え、プレートをＲＴで３０分間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、プレートを次に１×ＤＥＡ緩衝液（Pierce Biotechnology, Illinois）中のｐＮＰＰ基質を用いて、ＲＴで３０分間発現させた。反応は、１ＮのＮａＯＨを１００μｌ／ウェル添加することにより停止させ、プレートをSpectramax１９０プレートリ−ダー(Molecular Devices, CA)を用いて４０５ｎｍで読み取った。４０５ｎｍでのＯＤ読み取り値を用いて、各Ａｂ対のシグナル対ノイズ比（１００ｎｇ／ｍＬでのＯＤを、０ｎｇ／ｍＬでのＯＤで割り算する）を計算した。
１３種類のＭａｂを試験したチェッカー盤ＥＬＩＳＡの結果を、下の表７に示す。各々の抗体は、可能な全組み合わせにおいて、被覆抗体と検出抗体の両方として用いた。すべての対を、アッセイ緩衝液（マウス血清、子牛血清、およびブランクとして用いるＢＳＡを含有する）中の１００ｎｇおよび０ｎｇのＰｒｏ１０４大腸菌タンパク質上でデュプリケートに試験した。検出抗体とのインキュベーションの間、１０倍高い濃度の被覆抗体をウェルに加えて、自己対形成（self-pairing）を防止した。自己対形成は、抗原が部分的に重合される（multimerize）場合に観察されることがあり、ＭＡｂ対形成結果を混乱させる可能性がある。競合的条件下でＥＬＩＳＡアッセイを行うことにより、抗原が凝集している場合に、抗体が同一または近接のエピトープに結合できないことを確実にする。
データは、最小５個のエピトープが同定されたことを示唆したが、これは、立体障害（steric hindrance）がＭＡｂの非対形成に寄与する因子にもなり得るためである。表７の結果から導かれる、Ｐｒｏ１０４ＭＡｂのエピトープマップを、図１４に示す。５０％を超えるモノクローナル抗体（Pro104.C4、Pro104.C18、Pro104.C25、Pro104.C37、Pro104.C48およびPro104.C60）が、立体障害を生じるのに十分近接した、１つまたは２つ以上のエピトープと反応し、従ってアッセイにおけるＭＡｂ対形成を遮断した。ＭＡｂ Pro104.C34およびPro104.C13は共に、互いに異なり、また他のエピトープもしくはＭＡｂ群とも異なるエピトープと反応した。ＭＡｂ Pro104.C55およびPro104.C19は、Pro104.C66によって同定され部分的遮断を引き起こすエピトープに十分近い、１つのエピトープまたは２つの近接エピトープと反応した。ＭＡｂ Pro104.C55およびPro104.C19はまた、ＭＡｂ群のPro104.C4、Pro104.C18、Pro104.C25、Pro104.C37、Pro104.C48およびPro104.C60によって同定され部分的遮断を引き起こす１つまたは２つ以上のエピトープに十分近い、１つまたは２つ以上のエピトープと反応した。しかし、ＭＡｂ Pro104.C66は、Pro104.C4、Pro104.C18、Pro104.C25、Pro104.C37、Pro104.C48およびPro104.C60によって同定され、この群のＭＡｂとの対形成を許容する１つまたは２つ以上のエピトープから十分離れた１つのエピトープと反応した。
幾つかの異なるＭＡｂの組み合わせを試験して、癌細胞系、形質移入細胞系および癌組織の倍地または溶解物からの天然のＰｒｏ１０４を検出するための、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを確立した。Pro104.C19／C48およびPro104.C55／C34の対は、組換えＰｒｏ１０４に対する約１ｎｇ／ｍｌの感度で、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて最も優れていた。Ｐｒｏ１０４は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＲＴ−ＰＣＲ陽性のＣａＯＶ３卵巣癌細胞、ＲＴ−ＰＣＲ陽性のＨｅＬａ子宮頚部癌細胞からのＣＨＡＰＳ（Pierce）洗浄溶解物中、および形質移入の４８時間後のＰｒｏ１０４形質移入２９３ＴおよびＬＭＴＫ細胞からの溶解物中において検出された。Ｐｒｏ１０４は、ＲＴ−ＰＣＲでＰｒｏ１０４陰性である、前立腺癌細胞系ＰＣ３（ＡＴＣＣ）または結腸癌系ＨＴ２９（ＡＴＣＣ）からの溶解物中には検出されなかった。これらの結果は、免疫蛍光法データとも一致した。しかし、Ｐｒｏ１０４タンパク質は、これらのいずれの癌細胞系からの組織培養培地中にも、またはＰｒｏ１０４形質移入細胞からの培地中にも、形質移入の４８時間後においては、検出できなかった。
Figure 2007528845
 ＊シグナル対ノイズ比（１００ｎｇ／ｍＬでのＯＤを、０ｎｇ／ｍＬ（アッセイ緩衝液のみ）でのＯＤで割り算する）。
例４：Ｐｒｏ１０４タンパク質の検出およびＥＧＦレセプターのリン酸化
細胞系および卵巣癌腫瘍中のＰｒｏ１０４タンパク質のウェスタンブロットによる検出
Ｒｋ３Ｅ、ＨｅＬａ、ＡｓＰＣ１およびＨＴ２９細胞系を、Ｐｒｏ１０４発現について評価した。Ｒｋ３ＥおよびＨＴ２９細胞系は、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡに陰性である。対照として、当分野に知られた方法を用いて、ＲＫ３ＥにＰｒｏ１０４を形質移入した（ＲＫ３Ｅ−１０４）。さらなる対照として、ＲＫ３Ｅ細胞にアルカリホスファターゼを形質移入した（ＲＫ３Ｅ−ＡＰ）。ＨｅＬａおよびＡｓＰＣ１は、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡに陽性である。細胞系に加えて、卵巣癌および腫瘍に隣接する正常組織を、Ｐｒｏ１０４の存在について評価した。
細胞抽出物を、氷上で修飾ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ４０、１０ｍＭＮａ２ＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ）に加えてプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Inc.）を用いて調製した。タンパク質抽出物２０〜５０ｕｇを、各ゲルレイン（gel lane）に用いた：タンパク質当量濃度を評価して、同一ゲル上でのタンパク質レベルの比較をした。浄化した抽出物を、等しい容積の２×濃縮Laemmli試料緩衝液（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）と混合し、７０℃に１０分間加熱し、次に、プレキャスト(pre-cast)４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル(Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)をＭＥＳ実行緩衝液(Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)と共に用いて分析した。ゲルを、０．４５μｍの孔サイズのImmobilon-P PVDF膜（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に、１×Nupage移送緩衝液および１０％メタノールを用いて移送した。膜を洗浄し、１時間室温で、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳を用いて遮断した。膜を、一次抗体と共に一晩、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳中でインキュベートした。Ｐｒｏ１０４に対して指向されたマウスモノクローナル抗体を、組換え細菌性Ｐｒｏ１０４タンパク質を用いて自家で産生した。Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体を、１：１０００で希釈して１ｕｇ／ｍｌの最終濃度とし、ＧＡＰＤＨ(Chemicon Inc.)に対するマウスモノクローナル抗体を、１：５０００で希釈した（最終濃度２ｕｇ／ｍｌ）。一次抗体インキュベーションに続いて、膜を、室温で１０分間４回、各々０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Jackson Lab Inc., Bar Harbor, ME)を、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳中で、１時間室温で用いて（１：１０，０００希釈）、一次モノクローナル抗体を検出した。膜を、最後に、０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で１０分間、４回洗浄し、続いて製造者の指示(Amersham, Piscataway, NJ)により増強した化学発光（ＥＣＬ）試薬、およびＸ線フィルム（Kodak, Rochester, NY）への露光を用いて検出した。ＡＰ（アルカリホスファターゼ）発現レトロウイルスに感染させたＲＫ３Ｅ細胞を、Ｐｒｏ１０４発現レトロウイルスに感染させた同じ細胞と比較するウェスタンイムノブロット実験のために、細胞を、１％または１０％のＦＢＳを含有する成長培地中に４８時間播種した。細胞抽出物を、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Calibiochem）を含む修飾ＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、２５ｕｇの浄化した抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンイムノブロットにより、リン酸化ＥＧＦレセプター（BioSource Internaitonal, Camarillo, CA）に特異的なポリクローナル抗体を用いて評価した。
図１５Ａは、ウェスタンブロットにより、Ｐｒｏ１０４タンパク質が、Ｐｒｏ１０４形質移入細胞系（ＲＫ３Ｅ−１０４）および天然にＰｒｏ１０４を発現する細胞系（ＨｅＬａおよびＡｓＰＣ１）において検出されたことを示す。Ｐｒｏ１０４タンパク質は、ＡＰ形質移入細胞系（Ｒｋ３Ｅ−ＡＰ）およびｍＲＮＡ陰性細胞系（ＨＴ２９）では検出されなかった。さらに、図１５Ｂは、ウェスタンブロットにより、Ｐｒｏ１０４タンパク質が卵巣癌腫瘍組織中で検出されたが、正常隣接組織中では検出されなかったことを示す。
Ｐｒｏ１０４が癌細胞系および卵巣腫瘍組織中に検出可能であるという事実は、Ｐｒｏ１０４を、抗体に基づく療法の理想的な標的にする。抗Ｐｒｏ１０４抗体は、結合する薬剤、毒素、酵素、プロドラッグ活性化分子または同位体と共にまたはそれなしで、腫瘍の免疫療法に好適である。
ＥＧＦレセプターのリン酸化
Ｐｒｏ１０４を過剰発現するＲＫ３Ｅ形質移入細胞系（ＲＫ３Ｅ−１０４）を、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプターのリン酸化について評価した。対照として、ＲＫ３Ｅ細胞にはまたアルカリホスファターゼを形質移入した（ＲＫ３Ｅ−ＡＰ）。当分野に知られた方法を用いて、ＥＧＦレセプターのリン酸化を、ＲＫ３Ｅ−Ｐｒｏ１０４およびＲＫ３Ｅ−ＡＰ細胞からの１０％および１％血清により評価した。
Ｐｒｏ１０４の過剰発現は、ＥＧＦレセプターのリン酸化を引き起こすことが見出された。図１６は、リン酸化されたＥＧＦレセプターに対するウェスタンイムノブロットであり、ＡＰ対照と比較して、ＥＧＦレセプターがＰｒｏ１０４の過剰発現からリン酸化されることを示す。
例５：Ｐｒｏ１０４タンパク質のグリコシル化、ＧＰＩ結合およびビオチン化
Ｐｒｏ１０４グリコシル化
脱クリコシル化実験を、ＨｅＬａ細胞系（Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡ陽性）および卵巣癌腫瘍試料からのタンパク質抽出物に対して、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ(PNGaseF, Cat#P0704S, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)を用いて、製造者から提供された指示に従って行った。次に、脱グリコシル化された試料を、前述のようにウェスタンブロットにより分析した。簡潔に述べると、１００ｕｇのタンパク質抽出物を、糖タンパク質変性緩衝液／０．５％ＳＤＳ／１％ベータ−メルカプトエタノール中で、１００℃で１０分間変性させた。これに続いて、キット反応緩衝液（New England Biolabs）を、１％のＮＰ−４０および５０ｍＭのリン酸ナトリウムの最終濃度で加え、その後１００単位のPNGaseFを加え、３７℃で４時間インキュベートした。
図１７Ａに、Ｐｒｏ１０４タンパク質の、ＨｅＬＡ細胞系および卵巣癌試料の両方からの、Pangsで処置された場合の移動におけるシフトを示す。これらの結果は、Ｐｒｏ１０４がグリコシル化されるだけでなく、抗Ｐｒｏ１０４抗体が、天然のＰｒｏ１０４のグリコシル化および脱グリコシル化された形態の両方を検出することができることを示す。
Ｐｒｏ１０４ＧＰＩ結合のＰＩ−ＰＬＣによる特徴付け
ＨｅＬａ細胞を６ウェルプレート上に播種し、４８時間後に９０％の集密において、培地を、０．５単位のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ、Sigma）含有、非含有の１ｍｌの新鮮な増殖培地と交換した。１時間３７℃でのインキュベーションの後に、培地を収穫して、短時間微量遠心処理した（microfuged）。１５μｌの非濃縮培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。細胞は、上記のようにイムノブロット分析のために可溶化した。
ヒトＰｒｏ１０４はＧＰＩ結合タンパク質であることが予想されるため、これを、生きているＨｅＬａ細胞をホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ）で上記のように処理することにより、試験した。ＰＩ−ＰＬＣは、ＧＰＩ結合タンパク質から膜アンカーを切断し、タンパク質を培地中に放出する。図１７Ｂは、Ｐｒｏ１０４タンパク質は無処理のＨｅＬａ細胞の培地中には脱離されなかったが、しかし、ＰＩ−ＰＬＣ処理により、Ｐｒｏ１０４が培地中に放出され、そこでイムノブロットにより検出できたことを示す。ＰＩ−ＰＬＣ処理は、他のＧＰＩ非結合膜タンパク質は放出せず、Ｐｒｏ１０４の放出が、ＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩアンカーの特異的切断のためであることを示唆する。この実験は、Ｐｒｏ１０４がＧＰＩ結合を介して腫瘍細胞表面に局在化していることを示す。
Ｐｒｏ１０４ビオチン化
付着細胞
Ｃａｃｏ２、ＣａＯＶ３、またはＨｅＬａ細胞を、３７℃のインキュベーターから取り出して、氷上に載せ、実験期間中氷上にとどめた。細胞は、氷で冷却したｐＨ７．４のＰＢＳ（１０ｍＭのＮａ−Ｐ）で３回洗浄した。氷で冷却したＰＢＳ中に溶解して最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとしたビオチン化試薬（Sulfo-NHS-SS-Biotin; Pierce, Rockford, IL）を加えて、細胞を完全に覆い（約２００μｌ）、氷上で３０分間インキュベートした。ビオチン化試薬を除去し、細胞を（１×ＰＢＳ＋２５ｍＭトリス）で１回洗浄し、次に氷で冷却したＰＢＳで３回洗浄した。５００μｌの溶解緩衝液（１×ＰＢＳ＋１．０％トリトン）および１×プロテアーゼ阻害剤を細胞に加え、氷上で１０分間インキュベートした。得られた溶解物は微量遠心管に移送し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２分間回転させた。５０μｌの上清を、総タンパク質抽出物としてゲル上に流すために保存し、上清の残りの容量は、２０μｌのストレプトアビジンアガロースビーズ（Pierce）で免疫沈降させた。免疫沈降の後、ビーズは細胞溶解緩衝液（１ｖＰＢＳ＋１．０％トリトン）で３回洗浄した。１００μｌの１×ＬＤＳ試料緩衝液（NuPage; Invitrogen）および１×試料還元剤（NuPage; Invitrogen）を各試料に加え、７０℃で１０分間インキュベートして、ゲル上に流した。次に標準ウェスタンブロットを上述のようにして行った。
分離細胞
Ｃａｃｏ２、ＣａＯＶ３、またはＨｅＬａ細胞を、３７℃のインキュベーターから取り出して、氷上に載せ、実験期間中氷上にとどめた。細胞を分離し、氷で冷却したｐＨ７．４のＰＢＳ（１０ｍＭのＮａ−Ｐ）で３回洗浄し、５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。氷で冷却したＰＢＳ中に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したビオチン化試薬（Sulfo-NHS-SS-Biotin; Pierce, Rockford, IL）を細胞に加えて、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとし、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２０００ｒｐｍで５分間回転させた。ビオチン化試薬を除去し、細胞を１×ＰＢＳ＋２５ｍＭトリスで１回洗浄し、次に氷で冷却したＰＢＳで３回洗浄した。細胞は、洗浄と洗浄の間に２０００ｒｐｍで５分間回転させて、緩衝液を除去した。５００μｌの溶解緩衝液（１×ＰＢＳ＋１．０％トリトン）および１×プロテアーゼ阻害剤を細胞に加え、氷上で１０分間インキュベートした。得られた溶解物は、微量遠心管に移送し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２分間回転させた。上清を新しい微量遠心管に移送し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Pierce）を用いて決定した。５０μｌの上清を、総タンパク質抽出物としてゲル上に流すために保存し、上清の残りの容量は、２０μｌのストレプトアビジンアガロースビーズ（Pierce）で免疫沈降させた。免疫沈降の後、ビーズは細胞溶解緩衝液（１×ＰＢＳ＋１．０％トリトン）で３回洗浄した。１００μｌの１×ＬＤＳ試料緩衝液（NuPage; Invitrogen）および１×試料還元剤（NuPage; Invitrogen）を各試料に加え、７０℃で１０分間インキュベートして、ゲル上に流した。次に標準ウェスタンブロットを上述のようにして行った。
図１８は、天然のＰｒｏ１０４が、ＮａＫ−ＡＴＰａｓｅ（陽性対照）およびＧＡＰＤＨ（陰性対照）と比較して、細胞表面でビオチン化されていることを示す。
Ｐｒｏ１０４が細胞系のＧＰＩ結合を介して細胞表面に局在化するとの事実は、Ｐｒｏ１０４を、抗体に基づく療法の理想的な標的にする。さらに、抗Ｐｒｏ１０４抗体の、細胞系および卵巣癌細胞上のグリコシル化したＰｒｏ１０４および脱グリコシル化したＰｒｏ１０４への結合は、抗Ｐｒｏ１０４抗体が、結合する薬剤、毒素、酵素、プロドラッグ活性化分子または同位体と共にまたはそれなしで、腫瘍の免疫療法に好適であることを示す。
例６：Ｐｒｏ１０４発現細胞系の生成
細胞および細胞培養物
ＳＫＯＶ３、ＲＫ３Ｅ、２９３Ｔ、ＨｅＬａ，ＣａＯＶ３、ＮＣＩＨ５２２およびＨＣＴ１１６細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Manassas, VA)から購入した。細胞は、Ｌ−グルタミンおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを有し、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン(Cellgro, Herndon, VA)を補足したＤＭＥＭ(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中で増殖させた。すべての細胞を、加湿した３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２と共に保持した。
発現ベクター構成
Ｐｒｏ１０４のクローニングの供給源として、ヒト卵巣癌ｃＤＮＡを、ポリＡ＋ｍＲＮＡから、ＢＤ ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（BD Biosceince/Clontech, Palo Alto, CA）を用いて調製した。タグなしＰｒｏ１０４（ｐＬＸＳＮ−Ｐｒｏ１０４）をコードするレトロウイルス発現ベクターの構成のために、Ｐｒｏ１０４ ｃＤＮＡをＰＣＲ反応により、卵巣癌５’−ＲＡＣＥ−完了ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、また以下の遺伝子特異的プライマー用いて合成した：
Figure 2007528845
ＰＣＲ断片は、ｐＬＸＳＮベクター（BD Bioscience/Clontech）のＨｐａＩクローニング部位内にクローニングし、配列を検証した。ｐＬＸＳＮベクターのGenbankのアクセッションは、#M28248である。
インフレームＣＯＯＨ末端ヘマグルチニンタグを有するＰｒｏ１０４（ｐＬＸＳＮ−Ｐｒｏ１０４ＨＡ）をコードするレトロウイルス発現ベクターの構成のために、同じ手順を用いたが、ただし用いた３’プライマーは：
Figure 2007528845
 （ＨＡタグは太字）
であった。
ｐＬＸＳＮレトロウイルスベクターは、５’Ｍｏ−ＭｕＳＶ（モロニーマウス肉腫ウイルス）ＬＴＲおよび３’Ｍｏ−ＭｕＳＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲを利用して、複数のクローニング部位にクローニングされたｃＤＮＡの発現を駆動し、およびＧ４１８耐性をコードするＮｅｏｒ遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターを駆動する。ｐＬＡＰＳＮ、すなわちアルカリホスファターゼ（ＡＰ）をコードするレトロウイルス発現ベクターは、BD Biosceicne/Clontechより購入した（ｐＬＸＳＮ−ＡＰと呼ぶ）。
ウイルス産生
狭宿主性ウイルスを用いて、ＲＫ３Ｅ細胞を感染し、広宿主性ウイルスを用いて、ＳＫＯＶ３細胞を感染した。狭宿主性ウイルスパッケージングのために、形質移入の１日前に、２９３Ｔ細胞を、６ウェル皿のウェルあたり８×１０５個の細胞の密度で、Biocoatコラーゲン被覆プレート（ＢＤ）上に播種した。細胞は、精製したプラスミドＤＮＡで、ＰＬＵＳ試薬(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を加えたリポフェクタミンを用いて形質移入した。細胞ウェルあたり０．８μｇのウイルスプラスミドＤＮＡ：ｐＬＸＳＮ−Ｐｒｏ１０４、ｐＬＸＳＮ−Ｐｒｏ１０４ＨＡまたはｐＬＸＳＮ−ＡＰと、０．８μｇのｐＶｐａｃｋ−ＥＣＯおよび０．８μｇのｐＶｐａｃｋＧＰ(Stratagene, La Jolla, CA)を、血清を含まない１２５μＬのＤＭＥＭおよび１０μＬのＰＬＵＳ試薬のストックに添加し、続いて１５分間室温でインキュベートした。その後、１２５μＬのＤＭＥＭ培地中に希釈した８μＬのリポフェクタミンを、ＤＮＡ／ＰＬＵＳ試薬混合物に加え、１５分間室温でインキュベートした。１ｍｌのＤＭＥＭを、最終的なリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物に加え、すでに１ｍｌのＤＭＥＭを含むが血清は含まない細胞単層に適用し、続いて３７℃で３時間インキュベートした。２０％ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭを、３時間のインキュベーションおよび一晩増殖させた後に形質移入混合物に加えた。最後に、培地を、１０％のＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのPen/Strepを補足したＤＭＥＭと交換して、ウイルスを採集した。ウイルス含有培地を２４時間後に収穫し、０．４５μｍのポリスルホンフィルターを通して濾過した。
広宿主性ウイルスパッケージングのために同一の手順を繰り返したが、ただし、ｐＶｐａｃｋ Ｅｃｏプラスミドの代わりに、ｐＶｐａｃｋ Ａｍｐｈｏプラスミド(Stratagene)を用いた。
ウイルス感染および選択
ポリブレン(Hexadimethrine Bromide; Sigma, Saint Louis, MS)を、新鮮なウイルス含有培地に、４μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。前日に１００ｍｍ２の皿あたり３×１０５個の細胞の密度で播種した、ＲＫ３ＥまたはＳＫＯＶ３細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むリン酸緩衝生理食塩水(Cellgro)で１回洗浄した。ウイルス溶液（１００ｍｍ２の皿あたり６ｍｌ）を、細胞に直接適用し、次に３時間、加湿した３７℃インキュベーター中で、５％ＣＯ２と共に、時々回旋しながらインキュベートした。ウイルス含有培地を、新鮮な増殖培地と交換し、細胞を、３７℃で６０〜７２時間インキュベートし、この時点で、３５０ｕｇ／ｍＬの最終濃度のＧ４１８硫酸塩(Cellgro)を、増殖培地中に含有させて、ウイルスに感染した細胞を選択した。細胞は７０〜８０％の集密に維持し、Ｇ４１８含有培地を２日毎に交換した。Ｇ４１８選択に続いて、細胞のプールを、ウェスタンイムノブロット分析によるＰｒｏ１０４タンパク質発現の検証を含むその後の実験のために用い、ここで細胞は、上記したように抽出し分析した。感染した細胞単層によるＡＰの発現を、染色によりモニタリングし、これにより、細胞の単層を、１０分間室温で０．５％グルタルアルデヒドの溶液で固定し、ＰＢＳで洗浄し、６５℃に３０分間加熱し、ＡＰを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質(Sigma, Saint Louis, MS)と共に２〜３時間インキュベートすることにより視覚化した。
細胞系のウイルス感染および選択の結果
ＳＫＯＶ３、ＲＫ３Ｅ、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣａＯＶ３、ＮＣＩＨ５２２およびＨＣＴ１１６細胞系をウイルス感染させ、Ｐｒｏ１０４の過剰発現について選択した。
ＲＫ３Ｅ細胞における、レトロウイルスが媒介するＰｒｏ１０４タンパク質の過剰発現が、ウェスタンイムノブロットにより確認された。図１９は、レトロウイルスパッケージング細胞系およびウイルス感染ＲＫ３Ｅ細胞における、Ｐｒｏ１０４タンパク質の発現を示すウェスタンイムノブロットである。
ＳＫＯＶ３細胞における、レトロウイルスが媒介するＰｒｏ１０４タンパク質の過剰発現が、ウェスタンイムノブロットにより確認された。図２０は、レトロウイルスパッケージング細胞系およびウイルス感染ＳＫＯＶ３細胞における、Ｐｒｏ１０４タンパク質の発現を示すウェスタンイムノブロットである。
例７：ｓｉＲＮＡの生成および形質移入
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計および調製
Ｐｒｏ１０４特異的ｓｉＲＮＡ分子を設計するために、配列を、前に記載された方法(Elbashir et al., 2001, Nature 411:494-498)に基づいて、Ｐｒｏ１０４ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームから選択した。いかなる既知の細胞ｍＲＮＡのノックダウンをも生じない、無秩序な「スクランブルした」ｓｉＲＮＡ配列を、陰性対照として用いた。追加の陰性対照として、Emerinを標的化するｓｉＲＮＡ用いて、非必須ｍＲＮＡのノックダウンが、Ｐｒｏ１０４レベルにも、試験したいずれの生物学的終点にも影響しないことを例証した。アポトーシス誘発をもたらすｍＲＮＡのノックダウンについての陽性対照として、ＤＡＸＸまたはＯＰＡ１を標的化するｓｉＲＮＡを、刊行されたデータに基づいて用いた。Michaelson et al., 2002, Journal of Cell Science, 116:345-352; Olichen et al., 2003, J Biol Chem., 278(10):7743-6。ヒトゲノムに対するBLAST探索を、各々の選択されたｓｉＲＮＡ配列について行って、ｓｉＲＮＡが、標的に特異的であり、他の配列をノックダウンする機能を有しないことを確実にした。EmerinおよびＤＡＸＸをノックダウンするために用いたｓｉＲＮＡ配列は、刊行された論文から得た。Michaelson et al., 2002; Harborth et al., 2001, Journal of Cell Science, 114:4557-4565。
すべてのｓｉＲＮＡ分子（ＨＰＰ精製階級）は、Xeragon Inc. (Germantown, MD)により化学的に合成した。ｓｉＲＮＡは用いる前に、無菌の緩衝液に溶解し、９０℃で１分間加熱し、次に３７℃で１時間インキュベートした。配列の３’末端における２つのチミジン残基（ｄＴｄＴ）を有するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、以下の特異的なＲＮＡ配列からなっていた：
Figure 2007528845
Ｐｒｏ１０４に特異的な、配列の３’末端において２つのチミジン残基（ｄＴｄＴ）を有する追加のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、以下の特異的なＲＮＡ配列からなっていた：
Figure 2007528845
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの形質移入
Ｐｒｏ１０４を発現するＨｅＬａ細胞（４×１０４個）およびＣａＯＶ３細胞（６×１０４個）を、１２ウェルプレート中に、形質移入前に１８〜２４時間にわたり播種した。一過性形質移入を、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）試薬(Invitrogen Life technologies, Carlsbad, CA)を用いて、製造者のプロトコルに従って行った。１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（２００ｎＭであったＤＡＸＸ ｓｉＲＮＡを除く）の最終濃度および１．５ｕｌのオリゴフェクタミンを、細胞のウェルあたり用いた。すべての実験について、Ｐｒｏ１０４、スクランブルｓｉＲＮＡ、ＤＡＸＸｓｉＲＮＡおよびEmerinｓｉＲＮＡをトリプリケートで形質移入した。細胞の平行ウェルを、形質移入の７２時間後、ｍＲＮＡレベルの変化については定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により、タンパク質レベルの変化についてはウェスタンイムノブロットにより、およびアポトーシスの変化については２つの異なるアッセイシステム（以下を参照）によって、評価した。すべての所見は、少なくとも２回の追加実験で確認した。
例８：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンイムノブロット分析
ｓｉＲＮＡの形質移入の７２時間後に、細胞抽出物を、氷上で、修飾ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ４０、１０ｍＭのＮａ２ＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ）とプロテアーゼ阻害剤とのカクテル(Roche Inc.)を用いて調製した。タンパク質抽出物２０〜５０ｕｇを、各ゲルレイン（gel lane）に用いた：タンパク質当量濃度を評価して、同一ゲル上でのタンパク質レベルの比較をした。浄化した抽出物を、等しい容積の２×濃縮Laemmli試料緩衝液（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）と混合し、７０℃に１０分間加熱し、次に、プレキャスト４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル(Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)をＭＥＳ実行緩衝液(Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)と共に用いて分析した。ゲルを、０．４５μｍの孔サイズのImmobilon-P PVDF膜（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に、１×Nupage移送緩衝液および１０％メタノールを用いて移送した。膜を洗浄し、１時間室温で、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳を用いて遮断した。膜を、一次抗体と共に一晩、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳中でインキュベートした。Ｐｒｏ１０４に対して指向されたマウスモノクローナル抗体を、組換えの細菌性Ｐｒｏ１０４タンパク質を用いて自家で産生した。Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体を、１：１０００で希釈して１ｕｇ／ｍｌの最終濃度とし、ＧＡＰＤＨ(Chemicon Inc., Temecula, CA)に対するマウスモノクローナル抗体を、１：５０００で希釈した（最終濃度２ｕｇ／ｍｌ）。一次抗体インキュベーションに続いて、膜を、室温で１０分間、各々０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で４回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Jackson Lab Inc., Bar Harbor, ME)を、０．０５％のTween-20を含むＰＢＳ中の５％脱脂乾燥乳中で、室温で１時間用いて（１：１０，０００希釈）、一次モノクローナル抗体を検出した。膜を、最後に、０．０５％のTween-20を含む１×ＰＢＳ中で１０分間、４回洗浄し、続いて製造者の指示(Amersham, Piscataway, NG)による増強した化学発光（ＥＣＬ）試薬、およびＸ線フィルム（Kodak, Rochester, NY）への露光を用いて検出した。ＡＰ（アルカリホスファターゼ）発現レトロウイルスに感染させたＲＫ３Ｅ細胞を、Ｐｒｏ１０４発現レトロウイルスに感染させた同じ細胞と比較するウェスタンイムノブロット実験のために、細胞を、１％または１０％のＦＢＳを含有する成長培地中に４８時間、播種した。細胞抽出物を、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Calibiochem）を含む修飾ＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、２５ｕｇの浄化した抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンイムノブロットにより、リン酸化ＥＧＦレセプター（BioSource Internaitonal Camarillo, CA）に特異的なポリクローナル抗体を用いて評価した。
Ｐｒｏ１０４特異的ｓｉＲＮＡのＰｒｏ１０４タンパク質に対する効果を、ウェスタンブロットにより決定した。図２１は、ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞中で、Ｐｒｏ１０４タンパク質の特異的下方調節を媒介することを示す。Ｐｒｏ１０４タンパク質の６０％のノックダウン(ΔＣＴ＝１．３)が観察された。これらの結果は単一の細胞種類には限定されなかった。図２２は、ｓｉＲＮＡが、ＣａＯＶ３細胞中で、Ｐｒｏ１０４タンパク質の特異的下方調節を媒介することを示す。Ｐｒｏ１０４タンパク質の、５５％のノックダウン(ΔＣＴ＝１．２)が観察された。
例９：定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
Qiagen Inc.からのQuantiTech SYBR Green RT-PCRキットを、ＱＰＣＲ評価のために用いた。最終反応容量は２０ｕｌであり、１０ｕｌのRT-PCR Master Mix、２ｕｌのフォワードプライマー（５ｕＭ）、２ｕｌのリバースプライマー（５ｕＭ）、QuantiTect RT mix０．２ｕｌおよびRNase非含有水を含む。２０〜４０ｎｇの鋳型ＲＮＡを、反応あたり用いた。ＱＰＣＲは、Taqman 7700配列検出システム(Applied Biosystem Inc.)を用いて、以下のサイクル条件で行った：５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、４０サイクルを９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、次に７２℃で２分間保持。
ＱＰＣＲアッセイを、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡの遺伝子の転写レベルへの効果を決定するために用いた。
ＱＰＣＲアッセイにより、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＣａＯＶ３細胞中で、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを特異的にノックダウンすることが示された。図２３Ａは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＣａＯＶ３細胞中で、陰性対照と比較して、非Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）をノックダウンしないことを示した。図２３Ｂは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＣａＯＶ３細胞中で、陰性対照と比較して、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡをノックダウンすることを示した。
Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡの特異性は、細胞種類によって制限されなかった。ＱＰＣＲアッセイはさらに、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞中で、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを特異的にノックダウンすることを示した。図２４Ａは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞中で、陰性対照と比較して、非Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）をノックダウンしないことを示した。図２４Ｂは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞中で、陰性対照と比較して、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡをノックダウンすることを示した。Ｐｒｏ１０４の７５％のノックダウン(ΔＣＴ＝２)がＨｅＬａ細胞中で観察された。
ＤＡＸＸなどの必須ｍＲＮＡのノックダウンは、アポトーシス誘発を導く。Michaelson 2002、上記；Olichen 2002、上記。ＱＰＣＲ実験により、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンが、アポトーシス誘発を導く可能性があることが示された。図２５は、アポトーシス誘発について陽性対照と比較した、ＨｅＬａ細胞における、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンを示す（ＤＡＸＸ）。
さらに、ＱＰＣＲアッセイは、異なるＰｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞においてＰｒｏ１０４ｍＲＮＡをノックダウンすることを確認した。図２６Ｂは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡ#56（配列番号：１０）、#79（配列番号：１１）、#80（配列番号：１２）、および#81（配列番号：１３）が、陰性対照（スクランブルｓｉＲＮＡ）と比較して、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡをノックダウンすることを示す。Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡのために特異的に設計された４つの異なるｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンは、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡに干渉するように設計されたｓｉＲＮＡが、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡおよびタンパク質発現をノックダウンできることを示唆する。
例１０：アポトーシスアッセイ
２つの異なるアッセイキット、アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼアッセイを用いて、ｓｉＲＮＡのアポトーシスに対する影響を評価した。
「Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay」キット(Promega Inc., Madison, WI)を用いて、試験細胞を、培養プレート内で直接可溶化し、蛍光読み取り値に反映されるカスパーゼ活性を、供給者の指示に従って測定した。
第２のキットである「Guava Nexin V-PE Kit」(Guava Technologies Inc.)を用いて、処理した細胞を、トリプシン処理および洗浄により収穫し、約１０５個の細胞を、４０ｕｌの提供された緩衝液中に再懸濁させ、各々５ｕｌのアネキシンＶ（＋）および７−ＡＡＤ（−）を加えた。氷上での２０分間のインキュベーションに続いて、細胞を、製造者の指示に従ってGuava PCA装置を用いて分析した。
アネキシンＶアッセイ結果は、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡをノックダウンする異なるＰｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡがアポトーシスを誘発することを示す。図２６Ａは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡ#56（配列番号：１０）、#79（配列番号：１１）、#80（配列番号：１２）および#81（配列番号：１３）またはＤＡＸＸｓｉＲＮＡが、スクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）と比べて、ＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを誘発することを示す。
アネキシンＶアッセイ結果はまた、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンが、細胞死を誘発することを示す。図２７Ａは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡを形質移入された場合、陰性対照（ｓｉＲＮＡなし、およびスクランブルｓｉＲＮＡ）と比べて、より高いパーセンテージのＨｅＬａ細胞が早期にアポトーシスとなることを示す。さらに、図２７Ｂは、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡを形質移入された場合、陰性対照（ｓｉＲＮＡなし、およびスクランブルｓｉＲＮＡ）と比べて、より高いパーセンテージのＨｅＬａ細胞が壊死となることを示す。
Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンによるアポトーシスの誘発が、アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼアッセイにより示された。図２８ＡのアネキシンＶアッセイの結果は、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡまたはＤＡＸＸｓｉＲＮＡ（陽性対照）を形質移入された場合、スクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）と比べて、より高いパーセンテージのＨｅＬａ細胞がアポトーシスとなることを示す。図２８Ｂのカスパーゼアッセイの結果は、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡまたはＤＡＸＸｓｉＲＮＡ（陽性対照）を形質移入された場合、スクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）と比べて、より高いパーセンテージのＨｅＬａ細胞がアポトーシスとなることを示す。
Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンによるアポトーシスの誘発は、細胞種類により制限されない。図２９のアネキシンＶアッセイの結果は、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡまたはＯＰＡＩｓｉＲＮＡ（陽性対照）を形質移入された場合、スクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）およびｓｉＲＮＡなし（陰性対照）と比べて、より高いパーセンテージのＣａＯＶ３細胞がアポトーシスとなることを示す。
Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンによるアポトーシスの誘発は、Ｐｒｏ１０４機能の損失のためである。Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡは、Ｐｒｏ１０４を発現しない細胞中ではアポトーシスを誘発しない。図３０Ａは、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを発現しないＳＫＢＲ３細胞中の、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡ、Emerin ｍＲＮＡ（陽性対照、非必須）およびＤＡＸＸｍＲＮＡ（陽性対照、必須）のノックダウンのレベルを示す。Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンレベルは、スクランブルｓｉＲＮＡとＰｒｏ１０４特異的ｓｉＲＮＡの間に差はなく、一方、EmerinおよびＤＡＸＸｍＲＮＡレベルは、それぞれ５０％と６５％、特異的ｓｉＲＮＡにより、スクランブルｓｉＲＮＡと比較してノックダウンされた。
図３０Ｂのカスパーゼアッセイの結果は、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを発現しないＳＫＢＲ３細胞は、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡを形質移入されてもアポトーシスは生じず、一方、ＤＡＸＸｓｉＲＮＡ（陽性対照）を形質移入されるとアポトーシスが誘発されることを示す。さらに、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを発現しないＳＫＢＲ３細胞は、Emerin ｍＲＮＡ（非必須）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）を形質移入された場合、アポトーシスは生じない。
図３０Ａおよび３０Ｂからの結果は、Ｐｒｏ１０４ ｓｉＲＮＡ形質移入が、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡを特異的にノックダウンし、Ｐｒｏ１０４タンパク質を下方調節することにより、アポトーシスを誘発することを示す、陰性対照となる。
さらに、Ｐｒｏ１０４は細胞の生存に必須であることが示される。図３０Ａおよび３０Ｂは、非必須ｍＲＮＡ（Emerin）のノックダウンは、スクランブルｓｉＲＮＡ（陰性対照）と比べて、アポトーシスを誘発しないことを示す。例えばＤＡＸＸ（陽性対照）などの必須のｍＲＮＡおよびＰｒｏ１０４のノックダウンのみが、アポトーシスを誘発する。
例１１：軟寒天アッセイ
軟寒天アッセイを、６ウェルプレート（Corning, VWR）を用いて行った。２ｍｌの底部寒天基層は、０．８％寒天およびIscove培地中の１０％ＦＢＳ（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）からなる。トリプシン化細胞を、０．４％寒天、Iscove培地中の１０％ＦＢＳの中に懸濁させて、５ｍｌの最終容量で固体化基層の上に適用した。３つの異なる生存可能細胞数、１０５、１０４および５×１０３細胞を、６ｃｍ２ウェルの寒天にデュプリケートで播種した。０．８％寒天、Iscove培地中の１０％ＦＢＳからなる層の２ｍｌの最終容量を、固体化細胞層の上に適用した。寒天プレートを次に、加湿した３７℃のインキュベーターで５％ＣＯ２と共に、コロニーが現れるまで約２週間インキュベートした。軟寒天は、増殖培地を各週与えることで維持した。コロニーは、２〜４週間の間に計測した。ｓｉＲＮＡ形質移入の２４〜３６時間後に、ＨｅＬａ細胞をトリプシン化し、軟寒天にウェル当たり１０４細胞の密度で、上記のようにして播種した。
軟寒天アッセイを行って、Ｐｒｏ１０４の過剰発現、Ｐｒｏ１０４プロテアーゼ活性およびＰｒｏ１０４のノックダウンの、細胞に及ぼす効果を評価した。
図３１は、Ｐｒｏ１０４の過剰発現が軟寒天中で細胞増殖を誘発することを示す。下の表８は、図３１の各細胞種類について、軟寒天プレート中に観察されたコロニー数を示す。
Figure 2007528845
細胞増殖にはＰｒｏ１０４プロテアーゼ活性が必要とされる
ＲＫ３Ｅ細胞を、野生型Ｐｒｏ１０４タンパク質（ＰＲＯ１０４）を発現するレトロウイルスベクターに、Ｃ末端ヘマグルチニンタグ（ＨＡ）の有り無しにて感染させた。さらに、ＲＫ３Ｅ細胞を、酵素活性を欠き、触媒トライアッド（catalytic triad）（Ｐｒｏ１０４−ｍｕｔ）内またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ対照）内に点突然変異を有する、Ｐｒｏ１０４タンパク質を発現するレトロウイルスベクターに、感染させた。レトロウイルス感染に続き、感染した細胞についてのＧ４１８選択を行った。
Ｇ４１８選択細胞プールにおけるＰｒｏ１０４タンパク質の発現は、Ｐｒｏ１０４に対して指向されたモノクローナル抗体のイムノブロットにより確認された、図３２Ａ。Ｇ４１８選択細胞におけるＡＰの発現は、ＡＰ活性についての細胞単層染色により評価し、これは、実質的に全ての細胞が陽性(図３２Ｂ)であり、従ってほとんどのＧ４１８選択細胞が当該遺伝子を発現することを示した。ウイルス感染した選択細胞は、次に、軟寒天内に播種して、コロニー形成についてモニタリングした。親ＲＫ３Ｅ細胞は、アッセイに用いられた条件下ではコロニーを形成せず、ＡＰ発現細胞も同様であった(図３２Ｃ、３２Ｄ)。しかし、ＨＡタグあり（Ｐｒｏ１０４−ＨＡ）またはタグなしＰｒｏ１０４タンパク質を発現する細胞はコロニーを形成し、タンパク質のエピトープ発現は、形質転換を促進することを示した(図３２Ｃ、３２Ｄ)。変異体Ｐｒｏ１０４（Ｐｒｏ１０４−ｍｕｔ）タンパク質は、ＲＫ３Ｅ細胞の軟寒天増殖を誘発することができず(図３２Ｃ、３２Ｄ)、Ｐｒｏ１０４の触媒作用が形質転換に必要であることを示唆する。
ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４のノックダウンは細胞増殖を阻害する
上に示したように、ＨｅＬａ細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡおよびタンパク質の特異的ノックダウンは、２種類の異なる方法で計測したアポトーシスの増加をもたらした。我々は次に、Ｐｒｏ１０４のノックダウンが、ＨｅＬａ細胞の軟寒天中でのコロニー形成能力に効果を及ぼし得るかどうかを検討した。ＨｅＬａ細胞は、スクランブル、Ｐｒｏ１０４−またはＤＡＸＸ−特異的ｓｉＲＮＡにより処理して、続いて軟寒天に播種してコロニー形成を評価した。スクランブルｓｉＲＮＡは陰性対照であり、一方ＤＡＸＸ特異的ｓｉＲＮＡは、アポトーシスの誘発についての陽性対照である。ＨｅＬａ細胞は、多数の大きなコロニーを寒天中に形成し、これは、図３３Ｃおよび３３Ｆに示すように、クランブルｓｉＲＮＡによっては影響されなかった。対照的に、Ｐｒｏ１０４−およびＤＡＸＸ−特異的ｓｉＲＮＡの両方は、形成されるコロニー数をそれぞれ約８８％および８０％阻害した（それぞれ図３３Ａおよび３３Ｂ）。さらに、Ｐｒｏ１０４−およびＤＡＸＸ−特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞によって形成されるコロニーの大きさと形態は、より小さくまた限定されていた（それぞれ図３３Ｄおよび３３Ｅ）。
ＳｉＲＮＡの形質移入後に行われたＱＰＣＲは、Ｐｒｏ１０４、ＤＡＸＸおよびEmerin ｍＲＮＡレベルが、スクランブルｓｉＲＮＡの形質移入に比べて減少していることを示す(図３４Ａ)。この実験においては、Ｐｒｏ１０４およびＤＡＸＸｓｉＲＮＡはまた、カスパーゼ活性を誘発することができ、一方、スクランブルおよびEmerin特異的ｓｉＲＮＡは誘発しなかった（図３４Ｂ）。Emerinに対するｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞のコロニー形成能力に効果を有さなかった。
結果
これらのアッセイは、Ｐｒｏ１０４が細胞の生存に必須であり、過剰発現は細胞増殖を誘発することを確認する(図３１)。ＳｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウン（図２３−２６）は、タンパク質の発現を低下させ（図２１、２２）、これはアポトーシスを誘発する（図２７−３０）。これは次に、軟寒天中のアポトーシスの指標である、より少ないコロニー数、コロニーの大きさおよび形態をもたらす(図３３)。プロテアーゼ活性を欠く変異したＰｒｏ１０４は、細胞増殖を誘発せず、Ｐｒｏ１０４活性が細胞増殖に必須であることを裏付ける(図３２)。
例１２：腫瘍異種移植実験
Ｐｒｏ１０４の形質転換能をさらに評価するため、Ｐｒｏ１０４またはＡＰを発現するＲＫ３Ｅ細胞を、皮下的にヌードマウスまたはＳＣＩＤ／ベージュマウスに移植し、腫瘍形成をモニタリングした。
ヌードマウスにおける、Ｐｒｏ１０４過剰発現卵巣腫瘍細胞の増殖の増加
ＡＰまたはＰｒｏ１０４のいずれかを発現するＳＫＯＶ３またはＲＫ３Ｅ細胞の、レトロウイルスに感染したＧ４１８選択プールを、皮下的にヌードマウス中に注射した。親ＳＫＯＶ３細胞をまた、比較のために用いた。ＳＫＯＶ３については、各種類の１０７の細胞を、マトリゲルで、６匹のマウスそれぞれに移植した。ＲＫ３Ｅ細胞については、５×１０６の細胞を、マトリゲルなしで、８匹のマウスそれぞれに移植した。腫瘍の形成は、触診および可能な際にはノギス測定にて、４日おきに４週間にわたりモニタリングした。
動物モデルは、Ｐｒｏ１０４を過剰発現するヒト卵巣腫瘍細胞の増殖を示した。Ｐｒｏ１０４を過剰発現するＳＫＯＶ３細胞は、親ＳＫＯＶ３細胞(対照)またはＡＰ発現ＳＫＯＶ３細胞（増殖を誘発しない対照）に比べて容積が増した。
さらに、下の表９は、Ｐｒｏ１０４の過剰発現が、ヌードマウスにおける皮下細胞異種移植片における腫瘍形成を促進することを示す。
Figure 2007528845
 これらの動物モデルは、Ｐｒｏ１０４過剰発現細胞が、増殖して結節を形成することを示す。
ＳＣＩＤマウスにおける、Ｐｒｏ１０４過剰発現卵巣腫瘍細胞の増殖の増加
ＡＰまたはＰｒｏ１０４のいずれかを発現するＳＫＯＶ３またはＲＫ３Ｅ細胞の、レトロウイルスに感染したＧ４１８選択プールを、皮下的にＳＣＩＤ／ベージュマウス（Charles River Laboratories）中に注射した。示したように、１群あたり９匹または１０匹のマウスを用いた。ＳＫＯＶ３細胞については、１００ｕｌのＰＢＳ中の１０７の細胞をマトリゲルで移植し、ＲＫ３Ｅ細胞については、１００ｕｌのＰＢＳ中の５×１０６の細胞をマトリゲルなしで移植した。腫瘍の形成は、触診およびノギス測定にてモニタリングし、腫瘍容積は式：（長さ×幅２）／２を用いて計算した。図３６Ａおよび３６Ｃに示されたグラフは、群平均腫瘍容積の時間変化をプロットしたものである。全ての動物実験は、機関のガイドラインに完全に準拠して行った。
ＳＫＯＶ３異種移植試験のために、単一因子ＡＮＯＶＡを実施して、最終測定日において対照群とＰｒｏ１０４群の腫瘍容積測定値が異なるかどうかを試験した。結果は、＞９９．０％の確率で２つの群は同じ腫瘍容積を有さないことを示した。さらに、Bonferroni補正分析つき不等分散を仮定したペアワイズ２標本ｔ検定を行って、ＳＫＯＶ３−テスチシン腫瘍をＳＫＯＶ３−対照腫瘍と比較した。最終測定日からのデータの解析は、ＳＫＯＶ３−Ｐｒｏ１０４腫瘍が、ＳＫＯＶ３−対照腫瘍より、９９．０％の信頼水準で有意に大きい容積を有することを明らかにした。
ＫＲ３Ｅ−Ｐｒｏ１０４腫瘍細胞増殖
Ｐｒｏ１０４を発現するＲＫ３Ｅを移植された９匹のマウスのうちの９匹が大きな腫瘍を発生し、一方でＡＰを発現する細胞を移植されたマウスのいずれも腫瘍を形成しなかった(図３５Ａ)。異種移植試験の終わりに、腫瘍を収穫し、Ｐｒｏ１０４タンパク質の存在についてイムノブロットで評価した。腫瘍は、Ｐｒｏ１０４タンパク質の発現を、移植前に感染させたＲＫ３Ｅ細胞において観察されるのと同じレベルで維持していた。
ＳＫＯＶ３−Ｐｒｏ１０４腫瘍細胞増殖
我々は次に、異所性のＰｒｏ１０４発現の腫瘍形成に及ぼす効果を、ヒトＳＫＯＶ３卵巣癌細胞系によって評価したが、該細胞系は、外因性Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡおよびＰｒｏ１０４タンパク質のどちらも発現しないために（イムノブロットによる評価、図３５Ｄ）、この目的のために選ばれた。ＳＫＯＶ３細胞は、Ｐｒｏ１０４を発現するレトロウイルスまたはＡＰ対照のどちらかを感染させ、続いてＧ４１８選択を適用した。選択した細胞におけるＰｒｏ１０４タンパク質の発現は、イムノブロットにより検証した(図３５Ｄ)。ＡＰ対照およびＰｒｏ１０４発現ＳＫＯＶ３細胞を、皮下的にＳＣＩＤ／ベージュマウスに移植し、腫瘍形成についてモニタリングした。ＳＫＯＶ３癌細胞は、マウスにおいて腫瘍を異種移植片として形成することが知られている。予想通り、ＡＰ対照を発現するＳＫＯＶ３細胞もまた、異種移植片として増殖することができ、移植された１０匹のマウスの１０匹が、腫瘍を形成した(図３５Ｃ)。しかし、異所性のＰｒｏ１０４タンパク質を発現する細胞は、ＡＰ対照細胞と比べて、時間経過を通してより大きな腫瘍を形成した(図３５Ｃ)。データの統計学的解析により、ＡＰ対照ＳＫＯＶ３腫瘍と比較して、ＳＫＯＶ３−Ｐｒｏ１０４細胞の増大したサイズは有意であることが示された。
例１３：抗血管形成および抗血管分子と組み合わせた抗Ｐｒｏ１０４分子
血管形成は、胚形成、創傷治癒、および月経などの多くの生理学的過程において、ならびにある病理学的事象、例えば固形腫瘍増殖および転位、関節炎、乾癬、および糖尿病網膜症などにおいて、上記したように重要な役割を果たす。
さらに、腫瘍の血管を選択的に破壊する血管標的剤は、固形腫瘍の処置の魅力ある剤となりえる。それらは、血液の通る、腫瘍の成熟した血管を標的とすることで、抗血管形成剤とは異なる。血管標的剤は、血管形成が頻繁に起こり得ない大きな腫瘍に対してより適している。血管標的剤は、特定の標的または複合体に結合する抗体を含む。ヒトへの適用については、腫瘍の血管内皮細胞上で選択的に発現される標的分子が必要である。
Ｐｒｏ１０４を、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍の増殖を調節するように標的化することに加えて、血管形成関連分子または血管関連分子および複合体の標的化を、抗Ｐｒｏ１０４療法を増強するために用いることができる。具体的には、抗Ｐｒｏ１０４抗体は、血管形成関連分子または血管関連分子および複合体を特異的に標的とする抗体と組み合わせて、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍の増殖または転位を遅延させる、停止させる、退行させる、逆行させる、または阻害することができる。
Feng D., et al. J Histochem Cytochem. 2000 Apr; 48(4):545-56；Brekken RA., et al. Cancer Res. 2000 Sep 15; 60(18):5117-24；Brekken RA., et al., Anticancer Res. 2001 Nov-Dec; 21(6B):4221-9；およびBrekken RA., et al., Int J Cancer: 2002 Jul 10; 100(2):123-30を参照。
抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせた抗Ｐｒｏ１０４抗体
血管透過性因子／血管内皮増殖因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞を血漿タンパク質に透過させ、内皮細胞遺伝子発現を再プログラムして、血管形成を誘導する、有力な多機能性サイトカインである。ＶＰＦ／ＶＥＧＦは、多くの腫瘍により、および、活性化されたマクロファージ、ケラチン生成細胞、滑膜細胞、種々の胚細胞、ならびに培養された内皮細胞系および間葉細胞系により、分泌される。１２１、１４５、１６５、１８９および２０６個のアミノ酸のタンパク質をコードする、少なくとも５つの、ＶＥＧＦのスプライス変異体が存在する。１２１、１４５および１６５個のアミノ酸を有する小さいものは、細胞から分泌される。分泌されたＶＥＧＦは、Ｍｒ３８，０００〜Ｍｒ４６，０００の偏性二量体（obligate dimer）であり、ここでモノマーは２つのジスルフィド結合によって結合されている。ＶＥＧＦ二量体は、２つのよく特徴付けられているレセプター、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のうちの１つに結合し、これらは内皮細胞上で選択的に発現される。最近同定された第３の細胞表面タンパク質であるニューロピリン−１は、ＶＥＧＦ１６５を高い親和性で結合する。ＶＰＦ／ＶＥＧＦはその生物学的効果を、血管内皮細胞内で選択的に発現されるこれらのレセプターに結合することにより誘導する。
抗Ｐｒｏ１０４抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍の増殖または転位を遅延させる、停止させる、退行させる、逆行させる、または阻害するために、用いることができる。
抗ＶＥＧＦレセプター抗体と組み合わせた抗Ｐｒｏ１０４抗体
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、７個の細胞外ＩｇＧ様反復（repeat）、１つの膜貫通領域、および細胞内分裂チロシンキナーゼ領域を特徴とする、ＩＩＩ型レセプター、トロシンキナーゼ族のメンバーである。両レセプターは、腫瘍、創傷、およびＶＰＦ／ＶＥＧＦが過剰発現されるある種の炎症（例えば、関節リューマチ、乾癬）において、大きく上方調整される。腫瘍が分泌するＶＰＦ／ＶＥＧＦとそのレセプターとの間に形成される複合体が、抗血管形成療法のための、魅力ある潜在的な標的として認識された。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に、それぞれ１５〜１００ｐＭおよび４００〜８００ｐＭのＫｄ（解離定数）を有する高い親和性で結合する。ＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦ誘導の有糸分裂誘発および透過性における、主要な信号レセプターのように見られる。
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２両方の発現は、in situでのハイブリダイゼーションにより正常な腎臓の微小血管内皮細胞および腫瘍に局在化され、創傷および炎症部位を治癒する。ＶＥＧＦＲ−２はまた、ヒト胎盤、乳がんおよび胃の腫瘍の血管中に、光学顕微鏡免疫組織化学法によって同定された。参照。
抗Ｐｒｏ１０４抗体は、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２に対する抗体またはニューロピリン−１と組み合わせて、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍の増殖または転位を遅延させる、停止させる、退行させる、逆行させる、または阻害するために、用いることができる。
抗血管標的抗体と組み合わせた抗Ｐｒｏ１０４抗体
血管標的抗体は、血管関連マーカーに特異的に結合する。かかるマーカーは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）がそのレセプター（ＶＥＧＦＲ）に結合する際に形成される複合体を含む。腫瘍細胞によるＶＥＧＦ産生は、発癌遺伝子突然変異により、および腫瘤内の低酸素条件により誘導される。レセプターであるＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）は、腫瘍内の血管内皮細胞上で、低酸素状態により、およびＶＥＧＦの局所濃度の増加により、上方調節される。その結果、腫瘍血管内皮細胞上に高濃度の占有されたレセプターが存在する。
ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ複合体に結合する血管標的モノクローナル抗体および、それらの腫瘍血管標的剤としての使用は、当業者に知られている。ＶＥＧＦをＶＥＧＦＲ２への結合から遮断するが、ＶＥＧＦＲ１への結合は遮断しない抗体は、ＶＥＧＦＲ２活性を阻害することによる抗血管形成剤として、また腫瘍血管への選択的薬剤送達のための血管標的剤として、二重の活性を有し得る。
抗Ｐｒｏ１０４抗体は、ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ複合体に対する抗体と組み合わせて、Ｐｒｏ１０４発現腫瘍の増殖または転位を遅延させる、停止させる、退行させる、逆行させる、または阻害するために、用いることができる。抗体の例には、限定はされないが、以下の、
Figure 2007528845
 が含まれる。さらに、ＥＧＦＲに対する組合せ療法、例えば抗ＥＧＦＲ、cetuximab、C225（Andre et al. Bull Cancer. 2004 Jan; 91(1):75-80）、gefitinib、ZD1839（Ciardiello et al. Clin Cancer Res. 2004 Jan 15; 10(2):784-93）も用いることができる。
例１４：細胞系およびＤＮＡの寄託
ハイブリドーマ細胞系を、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. に位置するアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号が付与された。
以下のハイブリドーマ細胞系が、ATCC, Pro104.C55.1、Pro104.C25.1、Pro104.D9.1およびPro104.K81.15として寄託された。上記の寄託されたハイブリドーマ細胞系の名称を、参照の便宜上短縮することができる。例えば、A01.1はPro104.A01.1に相当する。さらに、寄託されたハイブリドーマ細胞系の名称には、「Ｐｒｏ１０４」をハイブリドーマクローンから分けているピリオドがあっても無くてもよく、例えば、Pro104 C55.1はPro104.C55.1に相当する。これらのハイブリドーマは、ＡＴＣＣに寄託されたクローン（これらの完全な名称と共に）に相当する。表１０は、ＡＴＣＣに寄託されたクローン、付与されたＡＴＣＣ寄託番号、および寄託の日付を示す。
Figure 2007528845
これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項、およびそのもと（ブダペスト条約）での規定の下でなされた。これは、寄託の日付から３０年間の生存可能な培養物の維持を確実にする。生物は、ブダペスト条約の規約の下およびdiaDexus, Inc.とＡＴＣＣとの間の合意に従って、ＡＴＣＣにより入手可能にされており、これは、関連する米国特許の発行または米国もしくは外国の任意の特許出願の公共への公開のうち、いずれか最初に到来する際に、培養物の子孫の永久的で制限されない公共への入手可能性を保証し、３５ ＵＳＣ§１２２およびこれに準拠する長官の規則（８８６ ＯＧ ６３８に対する特定の参照を有する３ ７ ＣＦＲ§１．１４を含む）に従って、米国の特許および商標局長官によって権利を付与すべきものとすると決定されたものに対する、子孫の入手可能性を保証する。
本出願の出願人は、寄託された培養物が、好適な条件の下で培養された際に死滅するかまたは失われるかまたは破壊された場合に、通知によりこれらを同一の培養物の生存可能な標本と即座に交換することに同意した。寄託された菌株の入手可能性は、特許法に従い任意の政府の権力の下に付与された権利に違反して本発明の実施の許諾として考慮されるべきではない。これらの寄託をなすことは、いかなる意味においても、寄託が、本発明を可能にするのに必要であることを承認するものではない。
Pro104.D116.1ＭＡｂが、Ｐｒｏ１０４を一過性に形質移入された２９３Ｆ細胞に結合することを示す図である。 Pro104.D118.1ＭＡｂが、Ｐｒｏ１０４を一過性に形質移入された２９３Ｆ細胞に結合することを示す図である。 Pro104.C19.1が、Ｐｒｏ１０４を発現する生きているＨｅＬａ癌細胞に結合することを示す図である。 Cy3-Pro104.C25.1が、Ｐｒｏ１０４を発現する生きているＨｅＬａ癌細胞に結合することを示す図である。 Cy3-Pro104.C25.1が、Ｐｒｏ１０４を発現する生きているＨｅＬａ癌細胞に結合し、内部移行されることを示す図である。
Cy3-Pro104.C19.1が、Ｐｒｏ１０４を発現する膵臓癌細胞に結合し、内部移行されることを示す図である。 Cy3-Pro104.C55.1が、Ｐｒｏ１０４を発現する膵臓癌細胞に結合し、内部移行されることを示す図である。 Pro104.C25.1が、卵巣腫瘍の癌細胞上のＰｒｏ１０４に結合することを示す図である。 Pro104.C25.1が、卵巣癌細胞の細胞膜上のＰｒｏ１０４に結合することを示す図である。 Pro104.D9が、卵巣癌細胞の細胞膜上のＰｒｏ１０４に結合することを示す図である。
Pro104.D133が、漿液性卵巣癌細胞の細胞膜上のＰｒｏ１０４に結合することを示す図である。 Pro104. C25.1が、膵臓腫瘍の細胞上のＰｒｏ１０４に結合することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ Ｍａｂ免疫標識特異性を示す対照を示す図である。 Ｐｒｏ１０４ Ｍａｂのエピトープマップを示す図である。 Ｐｒｏ１０４タンパク質が、ｍＲＮＡ＋細胞系および卵巣腫瘍組織（Ｔ）においては検出されるが、正常隣接組織（Ｎ）では検出されないことを示すウェスタンブロットを示す図である。
Ｐｒｏ１０４の過剰発現が、ＥＧＦレセプターのリン酸化を誘導することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４タンパク質がグリコシル化されＧＰＩ結合されることを示す図である。 細胞系における天然のＰｒｏ１０４の、表面でのビオチン化を示す図である。 ＲＫ３Ｅ細胞における、レトロウイルスが媒介するＰｒｏ１０４タンパク質の過剰発現を示す図である。 ＳＫＯＶ３細胞における、レトロウイルスが媒介するＰｒｏ１０４タンパク質の過剰発現を示す図である。
ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞においてＰｒｏ１０４タンパク質の特異的下方調節を媒介することを示す図である。 ｓｉＲＮＡが、ＣａＯＶ３細胞においてＰｒｏ１０４タンパク質の下方調節を媒介することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ｓｉＲＮＡによる、ＣａＯＶ３細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンを、陽性対照と比較して示した図である。
異なるＰｒｏ１０４ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞においてｍＲＮＡの特異的ノックダウンおよびアポトーシスを誘発することを示す図である。 ＨｅＬａ細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンが、細胞死を誘発することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの特異的ノックダウンが、ＨｅＬａ細胞におけるアポトーシスを誘発することを示す図である。 ＣａＯＶ３細胞におけるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡの特異的ノックダウンが、アポトーシスを誘発することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４ｓｉＲＮＡが、Ｐｒｏ１０４ｍＲＮＡなしの細胞におけるアポトーシスに効果を有さないことを示す図である。
Ｐｒｏ１０４の過剰発現が、軟寒天での細胞増殖を誘発することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４プロテアーゼ活性が細胞増殖に必要であることを示す図である。 ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンが、軟寒天でのＨｅＬａ細胞増殖を阻害することを示す図である。 ｓｉＲＮＡによるＰｒｏ１０４ｍＲＮＡのノックダウンが、軟寒天でのＨｅＬａ細胞増殖を阻害することを示す図である。 Ｐｒｏ１０４を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖の増加を示す図である。

Claims (71)

  1. in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合する、単離されたＰｒｏ１０４抗体。
  2. in vivoで哺乳類細胞上のＰｒｏ１０４に結合すると内部移行する、請求項１に記載の抗体。
  3. モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 抗体断片である、請求項１または２に記載の抗体。
  5. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
  6. アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される、請求項３に記載の抗体。
  7. 抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープへの結合に対して競合する、請求項３に記載の抗体。
  8. 増殖阻害剤に結合している、請求項３に記載の抗体。
  9. 細胞毒性剤に結合している、請求項３に記載の抗体。
  10. 細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体および核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
  11. 細胞毒性剤が、毒素である、請求項１０に記載の抗体。
  12. 毒素が、リシン、サポニン、メイタンシノイドおよびカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。
  13. 毒素が、メイタンシノイドである、請求項１２に記載の抗体。
  14. 哺乳類細胞が、癌細胞である、請求項３に記載の抗体。
  15. Ｐｒｏ１０４発現細胞に選択的に結合する、抗Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体。
  16. in vivoでＰｒｏ１０４発現癌細胞の増殖を阻害する、抗Ｐｒｏ１０４モノクローナル抗体。
  17. ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１６に記載の抗体。
  18. 細菌中で産生される、請求項１７に記載の抗体。
  19. ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｐｒｏ１０４抗体のヒト化形態である、請求項１５に記載の抗体。
  20. 癌細胞が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌からなる群から選択される癌からのものである、請求項１６に記載の抗体。
  21. 癌細胞が、卵巣癌細胞または膵臓癌細胞である、請求項２０に記載の抗体。
  22. 請求項３に記載の抗体を産生する、細胞。
  23. 細胞が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078の下で寄託されるハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の前記細胞。
  24. 適切な細胞を培養し、抗体を該細胞培養物から回収することを含む、請求項３に記載の抗体を産生する方法。
  25. 請求項３または１５に記載の抗体および担体を含む、組成物。
  26. 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項２５に記載の組成物。
  27. 細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、担体が、薬学的担体である、請求項２５に記載の組成物。
  29. ヒト化抗体が、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ｐｒｏ１０４抗体のヒト化形態である、請求項２８に記載の組成物。
  30. Ｐｒｏ１０４発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、請求項１または２に記載の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法。
  31. 癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞および肺癌細胞からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 癌細胞が、卵巣癌細胞または膵臓癌細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、または乳癌が乳房浸潤性乳管癌である、請求項３１に記載の方法。
  34. 癌細胞が、転移性の乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌からのものである、請求項３１に記載の方法。
  35. 抗体が、抗体断片である、請求項３０に記載の方法。
  36. 抗体が、ヒト化抗体である、請求項３０に記載の方法。
  37. 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項３０に記載の方法。
  38. 細胞毒性剤が、メイタンシノイド、リシン、サポリンおよびカリケアマイシンからなる群から選択される毒素である、請求項３７に記載の方法。
  39. 抗体が、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体のヒト化形態である、請求項３０に記載の方法。
  40. 細胞毒性剤が、放射性同位体である、請求項３７に記載の方法。
  41. 哺乳類におけるＰｒｏ１０４発現癌を寛解する方法であって、請求項１５に記載の抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法。
  42. 癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および肺癌からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  43. 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、または乳癌が乳房浸潤性乳管癌である、請求項４２に記載の方法。
  44. 抗体が、ヒト化抗体である、請求項４１に記載の方法。
  45. 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項４１に記載の方法。
  46. 細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項４０に記載の方法。
  47. 抗体を、少なくとも１種の化学療法剤と組み合わせて投与する、請求項４６に記載の方法。
  48. 化学療法剤が、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項４７に記載の方法。
  49. 容器およびその中に含まれた組成物を含む製造品であって、該組成物が、請求項３に記載の抗体を含む、前記製造品。
  50. 組成物が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌を処置するために用いることができることを示す添付文書をさらに含む、請求項４９に記載の製造品。
  51. 試料中の細胞がＰｒｏ１０４を発現するか否かを決定する方法であって、
    （ａ）細胞の試料を、請求項３に記載のＰｒｏ１０４抗体と、Ｐｒｏ１０４抗体のＰｒｏ１０４への特異的な結合に適する条件の下で接触させること、および
    （ｂ）該抗体の前記試料中の細胞への結合のレベル、または前記試料中の細胞によるＰｒｏ１０４抗体の内部移行のレベルを決定すること
    を含み、ここで、前記試料中の細胞に結合するＰｒｏ１０４抗体、または前記試料中の細胞によるＰｒｏ１０４抗体の内部移行が、前記試料中の細胞がＰｒｏ１０４を発現することを示す、前記方法。
  52. 細胞の試料を、ＡＴＣＣ受託番号PTA-5277、PTA-6076、PTA-6077およびPTA-6078からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体と接触させる、請求項５１に記載の方法。
  53. 細胞の試料が、癌を有し、癌を有することが疑われ、または癌を発生する素因を有し得る対象からのものである、請求項５１に記載の方法。
  54. 癌が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記抗体が、標識抗体である、請求項５１に記載の方法。
  56. 試験細胞試料中でのＰｒｏ１０４過剰発現を検出するための方法であって：
    （ａ）Ｐｒｏ１０４の、試験試料中の細胞により発現されたＰｒｏ１０４への特異的な結合に適する条件の下で、前記試験細胞試料を請求項３に記載のＰｒｏ１０４抗体と混ぜ合わせること、
    （ｂ）該Ｐｒｏ１０４抗体の前記試験試料中の細胞への結合のレベルを決定すること、
    （ｃ）ステップ（ｂ）において細胞に結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルを、対照の細胞試料中の細胞に結合するＰｒｏ１０４抗体のレベルと比較すること、
    を含み、ここで、対照と比較した前記試験細胞試料中のＰｒｏ１０４抗体の結合の増加が、前記試験細胞試料中の細胞によるＰｒｏ１０４過剰発現の指標である、前記方法。
  57. 試験細胞試料が、癌細胞試料である、請求項５６に記載の方法。
  58. 癌細胞試料が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌または肺癌のものである、請求項５７に記載の方法。
  59. 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、または乳癌が乳房浸潤性乳管癌である、請求項５８に記載の方法。
  60. 対照が、隣接する正常組織の試料である、請求項５７に記載の方法。
  61. Ｐｒｏ１０４過剰発現を、その検出を必要としている対象において検出する方法であって、
    （ａ）対象の血清試料を、請求項３に記載のＰｒｏ１０４抗体と、Ｐｒｏ１０４抗体の、前記血清試料中のＰｒｏ１０４への特異的な結合に適する条件の下で混ぜ合わせること、
    （ｂ）Ｐｒｏ１０４の前記血清試料中のレベルを決定すること、
    （ｃ）ステップｂにおいて決定したＰｒｏ１０４のレベルを、対照中のＰｒｏ１０４のレベルと比較すること、を含み、ここで、対照と比較した、対象からの前記血清試料中のＰｒｏ１０４のレベルの増大が、対象におけるＰｒｏ１０４過剰発現の指標である、前記方法。
  62. 対象が、癌を有する、請求項６１に記載の方法。
  63. 対象が、乳癌、卵巣癌、膵臓癌もしくは肺癌またはこれらの転移癌を有する、請求項６２に記載の方法。
  64. 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、または乳癌が乳房浸潤性乳管癌である、請求項６３に記載の方法。
  65. 対照が、Ｐｒｏ１０４を過剰発現する癌を有さない対象からの血清試料である、請求項６１に記載の方法。
  66. 請求項３に記載の抗体により結合されたエピトープに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
    （ａ）Ｐｒｏ１０４含有試料を、試験抗体および請求項３に記載の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成すること、
    （ｂ）混合物中のＰｒｏ１０４に結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルを決定すること、および
    （ｃ）ステップ（ａ）の混合物中で結合したＰｒｏ１０４抗体のレベルを、対照混合物と比較すること、
    を含み、ここで、対照と比較した、混合物中のＰｒｏ１０４に結合するＰｒｏ１０４抗体のレベルが、請求項３に記載の抗Ｐｒｏ１０４抗体により結合されたエピトープへの試験抗体の結合の指標である、前記スクリーニング方法。
  67. Ｐｒｏ１０４に結合するＰｒｏ１０４抗体のレベルを、ＥＬＩＳＡにより決定する、請求項６６に記載のスクリーニング方法。
  68. 対照が、Ｐｒｏ１０４、請求項３に記載のＰｒｏ１０４抗体および、請求項３に記載のＰｒｏ１０４抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物である、請求項６６に記載のスクリーニング方法。
  69. 抗Ｐｒｏ１０４抗体が標識されている、請求項６６に記載のスクリーニング方法。
  70. Ｐｒｏ１０４が固体支持体に結合された、請求項６９に記載のスクリーニング方法。
  71. 固体支持体がセファロースビーズである、請求項７０に記載のスクリーニング方法。
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