JP2006347883A

JP2006347883A - 糖鎖含有キトサン誘導体及びグリコサミノグリカンを含有する医療用組成物

Info

Publication number: JP2006347883A
Application number: JP2003315890A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Ishihara; 雅之石原; Hirofumi Yura; 洋文由良; Yoshio Saito; 芳夫斎藤; Kiyohaya Obara; 聖勇小原; Masataka Fujita; 真敬藤田
Original assignee: NEETEC KK
Current assignee: NEETEC KK
Priority date: 2003-09-08
Filing date: 2003-09-08
Publication date: 2006-12-28
Also published as: WO2005025538A1

Abstract

【課題】難治性創傷の治癒を積極的に促進する機能を有し、血管新生及び組織再生を促進すると同時に癌化などの副作用を生じる危険のない医療用組成物を提供する。
【解決手段】糖鎖含有キトサン誘導体及び酸性多糖類から形成されるハイドロゲルに創傷治癒促進薬を担持せしめてなることを特徴とする医療用組成物。この糖鎖含有キトサン誘導体は、キトサン骨格のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入してなるものが好ましく、酸性多糖類は過ヨウ素酸酸化ヘパリン等のグリコサミノグリカン類が好ましく、創傷治癒促進薬は細胞増殖因子が好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、糖鎖含有キトサン誘導体と酸性多糖類とから形成されるハイドロゲルに創傷治癒促進剤を担持させてなる医療用組成物、特に、糖尿病性皮膚潰瘍や褥創といった難治性皮膚疾患又は創傷に密着して担持せしめた薬剤を除法することにより治癒を促進することのできる組成物に関する。

皮膚等の創傷は、主として、正常皮膚・粘膜組織が離開した解放性創傷、熱や放射線による熱傷、潰瘍（限局性（circumscribed）の組織欠損）、あるいはそれらの複合創傷などに分類される。特に、面積が広く深度が深い重度の創傷では、感染による外来性の炎症を防ぎ肉芽組織の誘導を促進する治療が必須となる。
このような創傷の治療には、ガーゼ等の創傷被覆材を用いることが古くから行われているが、被覆材自体に治癒効果は無いため、抗生剤などの薬剤を併用して治癒効果を上げる工夫がなされている。近年、材料化学の進歩によって、ガス透過性を持ちながら水分の浸入を防ぐような透明粘着フィルムやゼリー状のハイドロゲル、さらには動物の生体膜などを利用した人工皮膚的被覆材も用いられるようになってきたが、創傷の保護や感染防御などのプロテクション機能と治癒を促進するヒーリング機能とを同時に具備するものは未だ提供されるに至っていない。

特に、褥創や糖尿病に由来する皮膚潰瘍といった難治性の創傷では欠損組織の血液循環が阻害されるため、欠損組織の再生が著しく遅延する。現状では、治癒を促進するために有効な治療薬や被覆剤などが提供されていないので、治癒に要する長期間の間に外来性の重篤な感染症を合併する危険があり、感染症を合併した場合には、それらを治療するために壊死した組織を根こそぎ切除するといった患者負担の大きな外科的処置が施されている。
このような難治性の創傷治療のために、組織細胞を体外で培養した再生組織を用いることが検討されているが、簡便性、コスト、時間、安全性などの問題を残している。最近では、組織再生を誘導するために血管新生を促す遺伝子を用いた治療法に関する研究も進められているが、遺伝子を導入するための方法論や導入遺伝子によって産生された蛋白質が臨床効果を有するかなどの多くの課題が未解決である。

一方、細胞増殖因子（ＧＦ）は、細胞の増殖や分化を制御し、組織再生に寄与することが知られてきている。特に、線維芽細胞増殖因子であるＦＧＦ−１とＦＧＦ−２の研究が進んでおり、これらが細胞の増殖、移動、分化、寿命などを制御し、胎児の発生、血管新生、骨形成、神経形成や創傷修復に寄与することが明らかとなった。即ち、糖尿病性皮膚潰瘍を含む虚血性疾患部位にＦＧＦ等の増殖因子を投与することにより血管新生を促して治癒を促進することが期待されている。しかしながらＧＦは、その活性の維持や保存が困難であり、通常、細胞外基質を構成するプロテオグリカン中のヘパリン分子と相互作用して、酸化に対する劣化のプロテクションや機能調節がなされている。また、一時期に高濃度のＧＦが作用した場合、癌的な要素を惹起する危険もあるので、その使用法には注意が必要である。即ち、ＧＦの組織再生機能を創傷治療に利用することが期待されていながら、ＧＦ自身の高い拡散性や機能劣化の早さという問題が実際の臨床応用を妨げていた。

本発明者らは、多糖類であるキトサンを応用した創傷治療剤の開発を進めてきた（特許文献１参照）。キトサンは創傷治癒効果と抗菌性を兼ね備えた素材として知られていたが、水溶性とゲル化の制御が困難であったため、従来は汎用的で機能的な接着剤や被覆材として製品化することが困難であった。しかしながら、特許文献１に記載されているように、酸性領域でしか可溶化しないキトサンの物性を糖鎖修飾によって易溶性に改良することに成功し、このようにして得られた糖鎖含有キトサン誘導体は生理的ｐＨにおいて粘稠水溶液を形成する。また、糖鎖含有キトサン誘導体に光反応性基を更に導入した場合、当該誘導体を含有する水溶液は光照射によって密着型の不溶性ゲル体となる。よって、当該誘導体の水溶液は、あらゆる患部に塗布でき、当該部位での光反応により即座に接着性のゲル体となるため、創傷部位の接着剤として有効に使用できる。
国際公開第ＷＯ００／２７８８９号パンフレット

しかしながら上記の光反応性キトサン誘導体は、紫外線照射により容易に不溶性ゲルを形成できるという利点はあるが、例えば光の届かない皮下に投与した場合に、当該投与部位に光照射する手段を設けなければならず、逆に、投与前に光照射されてしまうと注射器内でゲル化が起こり、注射できなくなるといった問題が生じる場合があった。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討をした結果、糖鎖含有キトサン誘導体とグリコサミノグリカン等の酸性多糖類とを混合することにより注射可能なハイドロゲルを得ることができることを見出し、本発明をなすに至った。
即ち本発明は、糖鎖含有キトサン誘導体と、少なくとも１つの酸性多糖類とを含有するハイドロゲルにＦＧＦ等の創傷治療薬を担持させた医療用組成物を提供する。

本発明の医療用組成物は、生理的ｐＨで調製されるので、ＧＦといった生理的活性を有する創傷治癒促進薬を変性させることなく良好に混和させることができる。得られた組成物は、あらゆる創傷部位に適用可能であるが、特に注射による適用に適しており、注入部位で不溶性ハイドロゲルとなる。当該ハイドロゲルは、単に増殖因子等の創傷治療促進薬を強固に担持するだけでなく、担持されたＧＦ等を適度な速度で徐放することができる。この適度な徐放性により、増殖因子の大量投与による組織の癌化を起こすことなく血管新生誘導効果を長期間に渡って得ることができ、その結果、難治性の潰瘍や創傷の治癒を促進する。

本発明の医療用組成物で使用される糖鎖含有キトサン誘導体は、一般にキチン・キトサン類と呼ばれている高分子骨格に糖鎖構造を導入した構造を有しており、中でも、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を構成するグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入してなるものが好ましい。

通常、キチン・キトサン類は、カニ殻由来のキチン質（ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）をアルカリ処理することによって得られる脱アセチル化した酸可溶性画分であって、一般に下記式（１）、（２）で示される構成単位を有するものである。

これらのキチン・キトサン類のうち脱アセチル化度の低いもの（通常４０％未満のもの）を「キチン」、そして脱アセチル化度の高いもの（通常４０％以上のもの）を「キトサン」と呼ぶこともあるが、以下、本明細書では、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を総称して「キトサン」という。なお、本発明におけるキトサンは天然由来のものに限らず、化学的または遺伝子工学的に合成された類似構造を有する化学修飾糖鎖であってもよい。
ここで、「脱アセチル化度」とは、キトサン（あるいは、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成する糖単位の２位のアセチルアミノ基が脱アセチル化によって遊離アミノ基に変換されている割合である。本明細書では、脱アセチル化度は、「健康食品規格規準集（その４）」財団法人日本健康・栄養食品協会（1996年）第55頁に記載の「コロイド滴定法」によって定量される。

本発明のキトサン誘導体は、このキトサンをさらに化学的に修飾することにより機能化したものであり、原料として使用されるキトサンとしては、脱アセチル化度が少なくとも４０％、特に６０〜１００％、さらに特に６５〜９５％の範囲にあるものが好適である。なお、脱アセチル化度が１００％のキトサンは、上記式（１）の構成単位のみからなり、式（２）の構成単位は含まない。

また、該キトサンの分子量には特に制限はなく、最終のキトサン誘導体の使用目的に応じて広い範囲で変えることができるが、一般には、数平均分子量が５,０００〜２,０００,０００、好ましくは１０,０００〜から１,８００,０００、より好ましくは４０,０００〜１,５００,０００の範囲のものが適している。
本発明で好ましいキトサン誘導体は、上記キトサンを構成する式（１）のグルコサミン単位の２位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入したものである。

キトサン誘導体に導入される還元性末端を有する糖類としては、アルドース類、ケトース類が包含され、中でも、構成糖単位の数が２０個以下、特に１〜７個のものが好適に使用される。具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース、マンノース、アラビノース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロースなどのペンタオースやヘキサオース；グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクサミンなどのアミノ糖類；ウロン酸類やデオキシ糖類などの糖誘導体；これらの単糖類を組み合わせた糖鎖からなる、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、マルトトリオースなどの二もしくは三糖類；各種オリゴ糖類などが挙げられるが、中でもマルトース、ラクトース、メリビオースなどの中性二糖類が好適である。

キトサンの前記式（１）のグルコサミン単位の２位アミノ基への上記の糖類の導入は、それ自体既知の方法を用いて行うことができ、例えば、糖類の還元性末端をカルボキシル化した後、該２位アミノ基にアミド結合により結合させる方法（例えば、特開平１０−１２０７０５号公報参照）や、糖類の還元性末端をアルデヒド化またはカルボニル化した後、グルコサミン単位の２位アミノ基に、シッフ塩基を経由する還元アルキル化法により結合させる方法（例えば、キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサンの応用」53-56頁、1990年2月20日、技法堂出版(株)発行参照）などが含まれる。
本発明でキトサンに導入される糖類は１種のみに限定されるものではなく、２種以上を組み合わせて使用することもできる。

本発明のキトサン誘導体を構成する糖鎖の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
(i) ラクトースから誘導される糖鎖：

(ii) マルトースから誘導される糖鎖：

(iii) メリビオースから誘導される糖鎖：

(iv) セロビオースから誘導される糖鎖：

(v) ラミナリビオースから誘導される糖鎖：

(vi) マンノビオースから誘導される糖鎖：

(vii) Ｎ-アセチルキトビオースから誘導される糖鎖：

上記(i)〜(vii)の糖鎖のうち、左側に記載したものが、糖のカルボキシル基とキトサンの２位アミノ基との縮合によって導入される残基を表し、右側に記載したものが、シッフ塩基を介して結合させた残基を表す。

このようにして、キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基を糖類で置換することにより、キトサンの酸依存的溶解性が緩和され、中性領域での可溶化が達成される。
キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基の糖鎖による置換度は、最終のキトサン誘導体に望まれる物性などに応じて変えることができるが、置換度が、一般的には０．１〜８０％、特に０．５〜６０％、さらに特に１〜４０％の範囲内にあるのが好適である。ここで、糖鎖による「置換度」とは、キトサンを構成する糖単位の２位のアミノ基が糖鎖で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の２位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示す。本明細書では、糖鎖による置換度は、硫酸中で糖鎖がフェノールと反応することに基づく特徴的な発色を４９０ｎｍの吸光度で検知する「フェノール−硫酸法」によって測定される（J.E.Hodge, B.T.Hofreiter, "Methods in Carbohydrate Chemistry", ed. by R.L.Whistler, M.L.Wolfrom, vol.1, p388, Academic Press, New York(1962)参照）。

また、本発明のキトサン誘導体では、キトサンを構成する前記式（１）の糖単位の２位のアミノ基や、式（１）又は（２）の糖単位の３位あるいは６位の水酸基の少なくとも一部に、両親媒性基を導入してもよく、それにより架橋後のハイドロゲルに飛躍的に向上した含水性を付加することができる。この両親媒性基は、疎水性基を具備する疎水ブロックと親水基を具備する親水ブロックとを有する基であり、一般に界面活性剤機能を有する場合が多い。中でも、疎水ブロック（Ｘ）と親水ブロック（Ｙ）の分子量の割合が、Ｘ：Ｙ=１：５〜５：１のものが好適に用いられ、解離性のイオン基を持たない非イオン性の基がより好適に使用できる。特に、疎水性のアルキルブロックと親水性のポリオキシアルキレンブロックから構成される分子量が少なくとも９０以上、より好ましくは５００〜１０,０００のポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。疎水ブロックを持たないポリエーテル類も使用できるが、疎水ブロックと親水ブロックの両方を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含水性向上の点から好ましい。

かかる両親媒性基のキトサンへの導入は、例えば、両親媒性基の親水ブロック又は疎水ブロックのいずれか一方の末端に、アミノ基と反応して共有結合を形成しうる基、例えば、アルデヒド基やエポキシ基などを持つ化合物を導入した後、キトサンのグルコサミンの２位アミノ基と反応させる方法や、カルボキシル基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンを縮合剤の存在下で反応させる方法、さらには酸クロリド基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンの水酸基やアミノ基と反応させる方法などを用いて行うことができる。

例えば、末端にエポキシ基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基あるいは末端にアルデヒド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンのアミノ基に導入した場合、キトサン骨格に結合した側鎖は下記式（ａ）あるいは（ｂ）で表される。また、末端に酸クロリド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンの３位または６位の水酸基に結合させた場合、キトサン骨格に結合した側鎖は、下記式（ｃ）で表される。ただし、下記式（ａ）〜（ｃ）におけるｎ及びｍは１以上の繰返し単位数である。

本発明のキトサン誘導体における両親媒性基の導入の程度は、特に制限されるものではないが、導入後のキトサン誘導体の重量変化に基づいて、通常５〜７０％、好ましくは１５〜５５％の範囲内とすることができる。

本発明の組成物は、上記のような糖鎖含有キトサン誘導体と、少なくとも１種の酸性多糖類とで形成されるハイドロゲルを含む。本発明で用いられる「酸性多糖類」とは、硫酸基、カルボン酸基等の酸性基を有する多糖類又はその構造の一部を有する天然又は合成の有機分子を含み、好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカンを含む硫酸化ムコ多糖、及びこれらの誘導体から選択される。これら酸性多糖類の中で、ヘパリンを酵素的又は化学的に分解して得られる低分子量ヘパリンが好ましく、分解によって未修飾（天然）のヘパリンが有する抗凝固活性を低下させた低分子量ヘパリンが好ましい。特に好ましいのは過ヨウ素酸分解したヘパリン（以下「ＩＯ_４ヘパリン」とする）である。ＩＯ_４ヘパリンの調製方法等は、例えば、K.Ono等, Br. J. Cancer; 86, 1803-1812 (2002)に記載されている。過ヨウ素酸で酸化されたヘパリン（ＩＯ_４ヘパリン）は、アンチトロンビンＩＩＩと相互作用する特有の五単糖構造を持たないことが知られており、従って、その抗凝固活性は未修飾のヘパリンより極めて低い。

本発明にあっては、塩基性のキトサン分子が、酸性多糖類（ＩＯ_４ヘパリン等）と複合し、イオン性相互作用を介してハイドロゲル（ポリイオンコンプレックス）を形成する。
本発明の医療用組成物に使用される糖鎖含有キトサン誘導体にあっては、キトサン骨格に還元性末端を有する糖類が導入され、任意に両親媒性基が導入されていてもよい。糖鎖を導入することにより、キトサン誘導体は中性領域での可溶性に優れており、生理的緩衝液や培地などで溶液化することができ、タンパク質等の酸やアルカリで変性する可能性のある薬物の活性を失うことなく担持させることができる。

本発明の医療用組成物は、糖鎖含有キトサン誘導体と酸性多糖類とから形成されるハイドロゲルに、少なくとも１種の創傷治癒促進薬を包含させている。本発明における創傷治癒促進薬は、あらゆる意味で当該組成物が適用された部位の創傷の治癒効果を促進する物質であればよい。これには、「医薬品要覧第5版」（大阪府病院薬剤師会著、薬業時報社、1992年）及びその追補版（1992年）に記載された創傷治癒効果を有する薬物などが含まれ、例えば、創傷部位の感染や炎症を防ぐことにより治癒を促進する抗菌剤、抗生物質、あるいは創傷による痛みを緩和する鎮痛剤や麻酔薬なども含まれるものとする。特に、褥創や糖尿病性皮膚潰瘍といった血液循環が阻害された難治性皮膚創傷に適用する場合には、血管新生を誘導する物質、例えば増殖因子、血管新生因子などが好ましい。ここで使用される増殖因子は、血管新生を誘導し、肉芽形成を促進する機能を有する細胞増殖因子であれば特に限定されるものではなく、例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＧＦ及びＶＥＧＦ_１６５及びＨＧＦ等を挙げることができる。また、本発明の薬物徐放体は組織密着性が極めて高いので、上記増殖因子を発現する遺伝子を組み込んだプラスミドを包含させて創傷部位での自発的な増殖因子供給を行うことも可能である。

さらに、本発明の組成物は、医療用として許容される他の添加剤を任意に含有していてもよい。例としては、インターロイキン、白血病抑制因子、インターフェロン、ＴＧＦ-β、エリスロポエチン及びトロンボポエチン等が含まれる。また、哺乳動物においてアポトーシスを誘発することが知られている他の薬剤もまた使用することができ、それら薬剤には、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド及び４-１ＢＢリガンドが含まれる。また、癌の治療に有用な化学治療薬を使用してもよく、その例には、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝産物、抗生物質、ピリミジン類似物、５-フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類、あるいはタモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬も含まれる。

本発明の医療用組成物は、糖鎖含有キトサン誘導体、酸性多糖類及び創傷治癒促進薬並びに他の任意成分を、溶媒、好ましくは水性媒体に、好ましくは中性のｐＨで溶解せしめることにより調製することができる。

このようにして調製される組成物は、注射により投与することを考慮すると、例えば、一般に市販されている回転粘度計（例えば、Ｂ型粘度計、TOKIMEC INC. (Tokyo Japan)）で測定した場合に約３００cps（センチポアズ（mPa・s））未満、さらには約２００cps未満、さらには約１００cps未満の低粘度とするのが好ましい。また、純水と同程度の低粘度の組成物は、スプレー装置などを用いて適用することもでき、カテーテル等を介した内視鏡治療においては、管内での流動性や内視鏡手術による切除創での保持性などを考慮して適当な粘度を採用しうる。さらに、水平でない創傷面に塗布する場合などは、約１００〜１０,０００cps、好ましくは約１５０〜８，０００、より好ましくは約２００〜６,５００cpsの粘度とするのが好ましい。このような粘度調節は、糖鎖含有キトサン誘導体等の濃度を適宜選択することによって達成できる。

即ち本発明の医療用組成物における糖鎖含有キトサン誘導体の含有量は、適用部位での保持性を確保し、ゲル化後のハイドロゲルによる内包薬物を確実に担持するためには、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ程度とする。
ＩＯ_４ヘパリン等の酸性多糖類は、好ましくは約１０〜５０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５０〜１０００μｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１００〜５００μｇ／ｍｌの含有量とする。
創傷治癒促進薬の含有量は、適用部位において必要とされる量が徐放されるように適宜決定される。例えば、皮膚創傷部位に適用される場合の増殖因子は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５〜５００μｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１０〜２００μｇ／ｍｌの含有量とする。
その他の任意成分の含有量は、医療の分野で通常使用されている程度の含有量とし、最適な量は当業者が容易に決定することができる。

糖鎖含有キトサン誘導体は、酸性多糖類と混合すると不溶性のハイドロゲルを形成する。形成されたキトサンハイドロゲルは、増殖因子等の創傷治癒促進薬及び他の添加剤を内包している。これらの薬物は薬物自身の拡散性により或る程度初期放出される場合もあるが、その大部分はキトサンハイドロゲル内に強固に担持される。その後、キトサンハイドロゲルが生分解されると、担持されていた薬物が適度な速度で徐放される。

より具体的な使用形態としては、本発明の医療用組成物は、例えば皮膚潰瘍を有する皮下組織に注射され、不溶性ゲル体（ハイドロゲル）となる。このキトサンハイドロゲルは周囲の組織に内包薬剤を徐放して、創傷の保護と治癒を促進する。
また、糖鎖含有キトサン誘導体にポリオキシアルキレンアルキルエーテル等の両親媒性基を導入した場合は、キトサンハイドロゲルは、例えば自重の１００倍に近い水分を迅速に吸収できる程度の高含水性となり、創傷部位や外科処置部位からの出血や浸出液を吸収して患部の衛生状態を改善することもできる。

さらに本発明のキトサンゲルは、内部に細胞増殖因子を包含し、それを徐々に放出するという特性を有するため、組織再生用細胞培養基材として使用することもできる。例えば、細胞培養プレート等の表面に本発明の医療用組成物を塗布してキトサンハイドロゲルを形成し、当該細胞培養プレートの被覆部分に目的とする細胞培地を配置してインキュベートすると、当該細胞の増殖が刺激される。よって本発明では、上記のキトサンハイドロゲル、中でも増殖因子を内包するハイドロゲルは組織再生用細胞培養基材として有効に使用できる。

さらに、本発明のハイドロゲルは、血清タンパク質の添加によって強化されることが見出された。具体的には、ハイドロゲル形成時に、アルブミン、グロブリン等の血清タンパク質を添加しておくことにより、形成されるハイドロゲルの強度が向上する。このことは、本発明のハイドロゲルを生体内に注入した場合に、生体内に存在する各種タンパク質の影響によって劣化することなく安定に存在し、インビボでの薬物徐放担体に適していることを示唆している。

以下、本発明を具体例により更に詳細に説明するが、これらの具体例は本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の医療用組成物の調製
（１）糖鎖含有キトサン誘導体の合成
キトサン骨格に紫外線反応性官能基及び糖鎖を導入したＵＶ-ＲＣを、ＷＯ００／２７８８９に記載された方法に準じて合成した。具体的には、カニ由来の８００〜１０００ｋＤａの分子量及び０．８の脱アセチル化度を持つキトサン（焼津水産工業（株）製）のアミノ基に、ラクトース（ラクトビオン酸）を縮合反応により導入した。ラクトースの導入により中性ｐＨで可溶性であり、その置換度が約２％であることが確認された（得られた糖鎖含有キトサン誘導体を「ＣＨ-ＬＡ」と呼ぶ）。

（２）非-抗凝固性(ＩＯ_４)ヘパリンの調製
ＩＯ_４ヘパリンは、K.Ono等, Br. J. Cancer; 86, 1803-1812 (2002)に記載されているようにして調製した。具体的には、ブタ小腸からのヘパリン25g（185.8USP単位/mg）を、0.05M酢酸ナトリウムバッファー（pH5）中の0.1MのＮａＩＯ_４溶液400mlに溶解させ、4℃で3日間攪拌した。次いで、未反応のＮａＩＯ_４をグリセロール（25ml）の添加により中和し、続いて反応混合物を透析し凍結乾燥した。次に、生成物（過ヨウ素酸酸化ヘパリン）を、0.25M重炭酸ナトリウム中の0.2Mの水素化ホウ素ナトリウム溶液と4℃で3時間混合することにより化学的に還元した。反応液中の過剰な水素化ホウ素を酢酸（pH5）の添加により中和した。還元された過ヨウ素酸酸化ヘパリン（ＩＯ_４ヘパリン）は、ＮａＯＨでの中和、透析、及び凍結乾燥の後に回収した。

（３）ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルの調製
50μg/mlのＦＧＦ-２（Fiblast：科研製薬製）及び1mg/mlのＩＯ_４ヘパリン（上記（２））を含有する1mlのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を、40mg/mlのＣＨ-ＬＡ（上記（１））水溶液1mlと混合し、本発明の組成物（ハイドロゲル）を得た。

ハイドロゲルからのＦＧＦ-２及びＩＯ_４ヘパリンの放出
実施例１（３）で得られたハイドロゲル(50μl)を、24-マルチウェル組織培養プレートの各ウェルに滴下した。各ウェルのハイドロゲルを、10重量％の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)及び抗生物質（100U/mlペニシリンＧ及び100μg/mlストレプトマイシン）を添加した１９９培地（Life Technologies Oriental）で洗浄し、1mlの培地を加えて、ロータリーシェーカー上で室温において振盪を継続した。培地は毎日交換した。各測定日に、培地中に放出されたＦＧＦ-２の濃度を、ヘパリンビーズ（Sigma-Aldrich）を用いたELISAアッセイで測定し（測定法の詳細は、Ono K.等, Glycobiology, 9, 705-711 (1999)参照）、ＩＯ_４ヘパリン濃度を、Farndale, RW等, Biochem. Biophys. Acta, 883, 173-177 (1986)に記載されたジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）法を用いて測定した（グリコサミノグリカンアッセイキット：フナコシ株式会社製を使用した）。

室温におけるハイドロゲルから培地へのＦＧＦ-２及びＩＯ_４ヘパリンの放出プロフィールを図１に示す。ＩＯ_４ヘパリンはハイドロゲルから僅かな量しか放出されず、７日後においても９０％以上がゲル内に保持されていた。ＦＧＦ-２は、初日に約２０％程度が放出されたが、その後に有意な放出は見られなかった。

ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルのＨＵＶＥＣ成長に対する影響
まず、ＦＧＦ-２（1.25μg）及びＩＯ_４ヘパリン（25μg）を含有するＣＨ-ＬＡ水溶液（ハイドロゲル）50μlを24-マルチウェルプレートの各ウェルの中心に滴下した。このＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを、1mlの１９９培地（Life Technologies Oriental製）中で室温で振盪しながら洗浄した。培地は毎日交換した。次いで、ＦＧＦ-２を含まず10重量%の熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質（100U/mlペニシリンＧ及び100μg/mlストレプトマイシン）を添加した１９９培地中のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；タカラ生化学（株）製）を15,000細胞／ウェルの初期密度で蒔き、3日間インキュベートした。インキュベーションの後、使用した培地を、10μlのWST-1試薬（Cell Counting Kit, Dojindo Co. Ltd.,）を含有する新鮮な培地100μlで置換し、37℃で1時間のインキュベーションの後、イムノミニプレートリーダー８９（Nunc InterMed製）を用いて450nmにおける光学密度を読み取った。得られた値からＨＵＶＥＣの増殖速度（相対値）を計算し、洗浄時間に対してプロットしたのが図２である。図２の縦軸は、ハイドロゲル（ＦＧＦ-２）無しの培地でのＨＵＶＥＣの増殖速度を１．０とした場合の相対値を示す。

次に、７日間洗浄したＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを、1mg/mlのキチナーゼ（キチナーゼ-ＲＳ；生化学（株））及び2mg/mlのキトサナーゼ（キトサナーゼ-ＲＤ；生化学（株））を含有する溶液で処理した。次いで、酵素処理したＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを含むウェル中に、ＨＵＶＥＣを蒔き、上記と同様にインキュベートした。その時の増殖速度を図２に合わせて示す。

ＦＧＦ-２が内皮細胞成長の刺激因子であることは良く知られている。従って、ハイドロゲルからＦＧＦ-２が放出されれば、その刺激によってＨＵＶＥＣの増殖速度が向上すると予測された。実際に、洗浄時間１日での増殖速度（相対値）は約２．０となっていたが、その後は増殖速度が低下して、５日目以降ではＦＧＦ-２を添加しない場合と同等の増殖速度となった。これらの結果は、初日に約２０％のＦＧＦ-２が放出され、その後は有意な放出が起こらないという実施例２（図１）の結果とも合致する。

ところが、７日間洗浄したＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルとともに、キチナーゼ及びキトサナーゼの存在下でＨＵＶＥＣを培養した場合、ＨＵＶＥＣ増殖に対する刺激活性が顕著に回復した（図２：●）。なお、ＨＵＶＥＣはキチナーゼ及びキトサナーゼを含有する培地中で正常に増殖し、キチナーゼ及びキトサナーゼはＨＵＶＥＣの増殖性に影響を与えないことは確認されている（データは示さず）。さらに、キチナーゼ及びキトサナーゼ並びにＨＵＶＥＣとともに３日間インキュベートした後、ハイドロゲルには多くのクラックが見られ、培地中にはハイドロゲルの小片が見られた（データは示さず）。即ち、キチナーゼ及びキトサナーゼという酵素の作用によってキトサンハイドロゲルが分解され、内部に包含されていたＦＧＦ-２が放出されてＨＵＶＥＣ増殖を刺激したことは明らかである。このことは、本発明のハイドロゲル内において、ＦＧＦ-２が生物学的に活性な形態を保持していたことも示している。

ハイドロゲルのインビボ分解の評価
100μg/mlのトリパンブルーを含有するキトサン／ＩＯ_４-ヘパリンハイドロゲル（100μl）を、体重約30gのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、10週齢、Crea Japan Inc.,）の背骨の左右に、尾の付け根から2cm位置に注意深く注射した。マウスをハイドロゲル注射の2、5、9、14、及び21日後に犠牲にし、注射したハイドロゲルを含む組織を取り出した。取り出した組織周辺の血液をＰＢＳで洗浄し、ハイドロゲルに接着した組織を完全に取り除いた。残ったハイドロゲルを100mMのＮａＮＯ_２の0.5mlで、pH3.0において処理し、2000rpmで遠心分離した。上清中のトリパンブルーをＯＤ_６４０の測定により定量し、結果を図３に示した。各実験群は３匹のマウスからなる。

観察を容易にするため、ＦＧＦ-２と同様に酸性分子であるトリパンブルー（酸性染料；sigma-Aldrich製）を使用した。事前のインビトロ実験により、キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルに担持されたトリパンブルーはハイドロゲル自体の分解がなければ放出されないことが確認されている。即ち、インビボのハイドロゲルにおけるトリパンブルーの減少はハイドロゲルの生分解によるものと推察される。

マウスの背中に注射されたキトサンハイドロゲル中の染料トリパンブルーの量は、埋設時間とともに減少した（図３）。本発明のキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルでは、2、5、及び14日目において、各々約80%、60%及び30%の染料分子が保持されていた。そして、9、14及び21日目には、埋設部位の近傍に青いゲル断片も観察された。上記のインビトロ実験の結果と考え合わせると、本発明のキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルはインビボで生分解され、内包されたトリパンブルーを約２１日かけて約９０％まで徐放できることがわかった。一方、ＩＯ_４ヘパリンを含まない糖鎖含有キトサン誘導体水溶液に同量のトリパンブルーを添加して同様の実験を行った場合、保存されているトリパンブルーは２日目で約４０％、５日目で約２０％に過ぎず、９日目には約９０％が放出されてしまっていることがわかる（図３：●）。即ち、本発明のハイドロゲルは、ＦＧＦ-２等の酸性分子を安定に包含し、ハイドロゲルの生分解によって徐放するマトリクス材料として使用するのに適している。

実施例２、３及び４の結果を考え合わせると、本発明のキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルは、内部に包含されたＦＧＦ-２等の酸性分子と（静電的に）相互作用し、当該内包分子の活性を維持したまま比較的強固に保持するものと考えられる。しかしながら、インビボにおいてはキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルが生分解され、内包された分子を徐々に放出することができる。よって、本発明のキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルへのＦＧＦ-２等の導入は、優れた薬剤徐放システムを提供する。

ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルで誘導された血管新生の評価
ＦＧＦ−２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル（100μl）をマウスの背骨の左右に、尾の付け根から2cmの位置に注意深く注射した。血管新生を評価するため、ハイドロゲル注射から所定日後にマウスを犠牲にし、組織ヘモグロビンの重量を測定した。具体的には、皮下組織の固定領域及びハイドロゲル注射部位の周囲の皮膚（1cmｘ1cm）をメスで切り出し、過剰な血液をＰＢＳで洗浄した。取り出した組織及び皮膚を2mlの赤血球溶解試薬（Sigma及びAldrich）に浸し、次いでメスで切り刻んだ。組織及び皮膚からのヘモグロビンを、数回のボルテックス混合で4℃において24時間抽出し、最後に2000rpmで遠心分離して固体組織を除去した。上清中の抽出ヘモグロビン量を、全ヘモグロビンアッセイキット（Sigma及びAldrich）を用いて、ヘモグロビン標準溶液（Sigma及びAldrich）を用いて作成した校正曲線に基づいて定量した。

図４は、キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルに導入されるＦＧＦ-２濃度を変化させた場合の組織ヘモグロビン量の変化を示す。ハイドロゲル（100μl）中にＦＧＦ-２を1μg以上包含せしめた場合、濃度依存的にインビボ血管新生の誘導に有効であることがわかる。
図５は、ＦＧＦ-２担持キトサンハイドロゲル（200μl）で誘導された血管新生の時間変化を示す。組織ヘモグロビン量は、ＦＧＦ-２担持キトサンハイドロゲルの注射後８日目までは顕著に増加し、その後僅かに減少したが、２１日目でも高レベルを維持していた（図５：●）。一方、ＦＧＦ-２を含まないキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル（図５：□）、ＦＧＦ-２有無のキトサン（図５：■、○）の注射では有意な血管新生を示さなかった。なお、ＦＧＦ-２水溶液、ＩＯ_４ヘパリン溶液、又はＦＧＦ-２／ＩＯ_４ヘパリン溶液を注射した場合にも、血管新生は見られなかった（データは示さず）。即ち、ＦＧＦ-２とキトサン／ＩＯ_４ヘパリンとを同時に投与した場合にのみが有意に向上した血管新生効果を示した。

組織学的観察
ラット（雄、Sprague Dawley rats; Crea Japan Inc.）の皮下にＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを注射し、所定日後にハイドロゲルを含む組織を取り出して10%ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、4μm厚ずつに切断した（Yamato Kohki社）。切片は前後軸と垂直、かつ創傷表面に垂直にした。切片をガラススライドに配置し、ヘマトキシリン-エオシン（ＨＥ）試薬で染色した。各切片において、最も高い毛細管密度を示す無作為の領域（顕微鏡視野、100X）を写真に撮り、顕微鏡写真当たりの毛細管の数を数えた。赤血球を含む成熟血管のみを数えた。
本発明のＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル以外に、比較として、キトサン、キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル、及びＦＧＦ-２担持キトサンを注射した場合についても同様に実験した。

図６は、注射から４、８、及び１４日目の注射部位近傍の顕微鏡写真である。ＦＧＦ-２有無によらず、キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを注射した部位には、１４日後においてゲル中に遊走した多数の好中球が保持されていることが示されている。注射から４、８及び１４日後に取り出した組織におけるＦＧＦ-２担持キトサンハイドロゲルを保持する領域は、光沢のある平滑な膜で覆われている。また、ハイドロゲルは繊維組織に囲まれ、再生した厚い膜で覆われている（図６）。これらの繊維組織は、ＦＧＦ-２を含まないキトサン及びキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルの注射部位には観察されないが、ＦＧＦ-２担持キトサンの注射部位周囲には僅かな繊維組織が観察された。

各注射部位における注射後８日目における周辺組織の代表的な顕微鏡写真を図７に示す。これらは、図６において四角で囲んだ部分に相当する。図７において黒三角印で示したのは赤血球を含む成熟血管が形成された個所である。ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルの周辺部分では、既に他の条件より顕著に多い成熟血管が観察された。

新生された血管数を日数に対してプロットしたのが図８である。４日目においても、ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルを注射した部位には、他の条件（キトサンのみ、キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル、及びＦＧＦ-２担持キトサン）に比較して約２倍以上の数の血管が生成されており、その差は１４日目でも変わらない。これらの結果は、実施例４（図３）に示したように、本発明のＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルが、生体内で徐々に分解され、それに伴って内包されたＦＧＦ-２が徐放されていることを反映しているものと考察される。
虚血性四肢モデル（糖尿病マウスの皮膚潰瘍モデル）における動物実験においても同様に、ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲルが血管形成及び肉芽組織形成を促進し、創傷閉塞及び治癒を促進するという結果が得られた。

ハイドロゲルの生体内安定性（ハイドロゲルの強度測定）
本発明のキトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル（ＦＧＦ-２担持）は、生体内に注射することを意図されたものであるため、生体内に存在する様々なタンパク質成分と接触することになる。そこで、タンパク質成分のモデルとして血清タンパク質であるウシ胎児血清(ＦＣＳ)を用い、当該タンパク質有無におけるハイドロゲルの強度変化を測定した。

測定方法：
図９に示す測定系を構成した。即ち、上皿天秤（１０）の上皿に、上面が開放された容器（２０）を配置し、当該容器（２０）の上方に、垂直方向に上下可能なプランジャー（３０）を配置した。
容器２０に４％のＣＨ-ＬＡ水溶液（１）100μlを入れ、その上に血清タンパク質有無のＩＯ_４ヘパリン含有上層液（２）100μlを界面を乱さないように重層し、１時間又は２４時間放置してゲル層（３）が形成された後、プランジャー（３０）（直径2mm）を室温下、毎秒0.03mmの速さで下降させてゲルを押し、ゲル層（３）が破断したときの荷重を上皿天秤にて計測した。

上層液（３）として、ＩＯ４ヘパリンの１、５及び１０mg/mlのＰＢＳ溶液を用い、10重量%のＦＣＳを添加した場合と添加しない場合について測定した。さらに、比較のため、ＩＯ_４ヘパリンに換えてアルギン酸ナトリウム（和光純薬製）を使用した場合についても同様の測定を行った。結果を下記の表１に示す（表１のデータは、４回の測定の平均値である）。

ＣＨ-ＬＡ等の糖鎖含有キトサン誘導体（塩基性）は、酸性（アニオン性）分子とイオンコンプレックスを形成してゲル化すると考えられる。しかしながら、上記の結果から、酸性分子としてはＩＯ_４ヘパリン等の酸性多糖類を使用した場合に、高強度のハイドロゲルを形成することがわかる。また、ハイドロゲルの強度は、酸性多糖類の濃度が高い方が向上し、約２４時間後には十分な強度が得られることもわかった。しかも、タンパク質成分が存在してもゲル強度が低下することはなく、ＦＣＳ等の血清タンパク質を加えた場合には、２４時間後のゲル強度がむしろ向上した。このことは、酸性（アニオン性）分子としてアルギン酸ナトリウムを使用した場合とは逆の傾向である。

本発明の医療用組成物を使用すると、糖鎖含有キトサン誘導体／酸性多糖類のハイドロゲルに導入されたＦＧＦ-２等の創傷治癒促進剤がハイドロゲルの生分解により徐々に放出され、血管形成及び繊維組織形成の誘発に有意な効果を示す。さらに、本発明の組成物は注射可能であり、生体内に存在するタンパク質成分によって強度が向上する傾向が見られた。よって、本発明の医療用組成物は、虚血性四肢における血管形成及び繊維組織形成を誘導する新規な医療材料として使用することが可能である。

本発明のハイドロゲルからのＩＯ_４ヘパリン（●）及びＦＧＦ-２（○）の放出プロフィールを示すグラフである。本発明のハイドロゲルのＨＵＶＥＣ増殖刺激作用を示すグラフである。本発明のハイドロゲルのインビボ分解による内包分子（トリパンブルー）の放出を示すグラフである。○：キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル；●：キトサンのみ。本発明のハイドロゲルに担持させるＦＧＦ-２濃度と血管新生効果との関係を示すグラフである。本発明のハイドロゲルを埋入した組織における血管新生効果を示すグラフである。●：ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル；■：ＦＧＦ-２担持キトサン；○：キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル；□：キトサンのみ。本発明のハイドロゲルを埋入した組織における血管新生、繊維組織再生を示す顕微鏡写真である。図６に示した組織の一部を拡大した顕微鏡写真である。本発明のハイドロゲルを埋入した組織において形成された血管数を示すグラフである。●：ＦＧＦ-２担持キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル；■：ＦＧＦ-２担持キトサン；○：キトサン／ＩＯ_４ヘパリンハイドロゲル；□：キトサンのみ。本発明のハイドロゲルの強度を測定するために構成された装置を示す模式図である。

符号の説明

１：ＣＨ-ＬＡ水溶液；２：ＩＯ_４ヘパリン含有上層液；３：ゲル層；１０：上皿天秤；２０：容器；３０：プランジャー。

Claims

糖鎖含有キトサン誘導体及び酸性多糖類から形成されるハイドロゲルに創傷治癒促進薬を担持させてなることを特徴とする医療用組成物。
糖鎖含有キトサン誘導体が、下記式（Ｉ）：

で表される単位を含んでなるキチン・キトサン類のグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入してなる高分子であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
創傷治癒促進薬が増殖因子であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
増殖因子がＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ_１６５又はＨＧＦであることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
酸性多糖類がグリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
グリコサミノグリカンが過ヨウ素酸酸化ヘパリンである、請求項５に記載の組成物。
血清タンパク質をさらに含有することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなることを特徴とする難治性皮膚潰瘍治療薬。
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなることを特徴とする薬物徐放体。
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物を含んでなることを特徴とする組織再生用又は細胞培養用基材。