JP2006280234A - Cell proliferation or differentiation method - Google Patents
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Abstract
【課題】 ２種類以上の細胞を同時に培養する共培養を行うことなく、簡単な操作で効率良く細胞を増殖・分化させることができる方法を提供すること。
【解決手段】 第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする、細胞の増殖又は分化の制御方法。特に、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する細胞の増殖または分化の制御方法。
【選択図】図１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method capable of efficiently proliferating and differentiating cells by a simple operation without performing co-culture for culturing two or more types of cells simultaneously.
A cell characterized by promoting the proliferation or differentiation of the second type of cells by culturing the second type of cells in the presence of a culture supernatant of the first type of cells. For controlling the growth or differentiation of sucrose. In particular, a method for controlling cell proliferation or differentiation in which mesenchymal cells are cultured in the presence of a culture supernatant of epithelial cells.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、細胞の増殖又は分化方法に関する。より詳細には、本発明は、ある種の細胞の培養上清を用いて別の種の細胞の増殖又は分化を制御する方法に関する。 The present invention relates to a method for cell proliferation or differentiation. More specifically, the present invention relates to a method for controlling the growth or differentiation of cells of another species using the culture supernatant of one cell.
細胞医療や再生医療を実現するためには、細胞の増殖・分化を効率よく制御するための技術を確立することが必要である。従来の細胞培養法において細胞を効率よく増殖・分化させるためには、Fibroblast growth factor (FGF)、Endothelial growth factor(EGF)などのサイトカイン、およびdexamethasoneなどの生理活性作用をもつ薬剤などを用いて培養を行っているが、単一の因子での細胞制御には限界があり、また人為的に合成した生理活性物質の使用には副作用の問題などが懸念される。従って、このような問題を解決するために、細胞に対して無理な負荷がかからず、かつ効率的に細胞の増殖・分化を制御する技術が求められている。 In order to realize cell medicine and regenerative medicine, it is necessary to establish a technique for efficiently controlling cell proliferation and differentiation. In order to efficiently proliferate and differentiate cells using conventional cell culture methods, culture is performed using cytokines such as fibroblast growth factor (FGF) and endothelial growth factor (EGF), and bioactive agents such as dexamethasone. However, there is a limit to cell control with a single factor, and there are concerns about side effects and the like when using artificially synthesized physiologically active substances. Therefore, in order to solve such problems, there is a need for a technique that does not place an excessive load on cells and efficiently controls cell proliferation / differentiation.
特許文献１には、培養上清を利用した細胞培養技術として、自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地に自己組織抽出液を添加してヒト細胞の培養を開始する手順と、細胞培養の過程で前記ヒト細胞から分泌された物質を含む培養上清を利用して細胞培養を継続する手順とを含むヒト細胞培養方法、該方法によって培養された細胞を自己以外の動物由来成分を含まない無血清培地で分離継代する方法、及びこれらの方法で培養された細胞を凍結保存する方法が記載されている。特許文献１に記載の技術は、無血清培地の添加成分として培養上清を加えることで、無血清培地における細胞増殖能を改善するものであり、細胞の増殖・分化の制御を目的としたものではない。
また、非特許文献１には、上皮系および間葉系の細胞の混合培養により、細胞の石灰化および分化誘導を行うことが記載されている。さらに、非特許文献２には、ウサギ切歯由来の上皮細胞と共培養した歯髄細胞では象牙芽細胞への分化のマーカーであるアルカリホスファターゼの合成が増大することが記載されている。しかしながら、これらの方法では、単一容器中で、複数種の細胞を同時に制御する必要があるほか、臨床面で応用する場合に余計な細胞が混入する恐れがあるという問題がある。
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、２種類以上の細胞を同時に培養する共培養を行うことなく、簡単な操作で効率良く細胞を増殖・分化させることができる方法を提供すること解決すべき課題とした。 The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a method capable of efficiently proliferating and differentiating cells with a simple operation without performing co-culture in which two or more types of cells are cultured simultaneously.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ある種の上皮系細胞の培養上清の存在下で間葉系細胞を培養することにより、間葉系細胞の増殖や分化を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have cultivated mesenchymal cells in the presence of a culture supernatant of certain epithelial cells, thereby proliferating and differentiating mesenchymal cells. The present invention has been completed.
即ち、本発明によれば、第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする、細胞の増殖又は分化の制御方法が提供される。 That is, according to the present invention, the growth or differentiation of the second type of cells is promoted by culturing the second type of cells in the presence of the culture supernatant of the first type of cells. A method for controlling cell proliferation or differentiation is provided.
好ましくは、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する。
好ましくは、担体上で、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養する。
好ましくは、上皮系の細胞として、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞、マラッセの上皮遺残細胞、口腔粘膜上皮細胞、上皮細胞又はこれらの前駆細胞を使用する。
好ましくは、間葉系細胞として、歯胚間葉系細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯乳頭細胞、歯嚢細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞、又は間葉系の幹細胞を使用する。
Preferably, mesenchymal cells are cultured in the presence of a culture supernatant of epithelial cells.
Preferably, the mesenchymal cells are cultured in the presence of an epithelial cell culture supernatant on a carrier.
Preferably, as an epithelial cell, an inner enamel epithelial cell, an outer enamel epithelial cell, an enamel medullary cell, an intermediate layer cell, an enamel blast, a Marasse epithelial cell, an oral mucosal epithelial cell, an epithelial cell or a progenitor cell thereof Is used.
Preferably, as mesenchymal cells, tooth germ mesenchymal cells, odontoblasts, dental pulp cells, tooth papilla cells, dental follicle cells, cementoblasts, osteoblasts or their precursor cells, or mesenchymal stem cells Is used.
本発明の一実施態様によれば、口腔粘膜上皮細胞の培養上清の存在下において間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の増殖促進方法が提供される。
本発明の別の実施態様によれば、歯胚上皮細胞の培養上清の存在下において歯胚間葉系細胞を培養することを含む、歯胚間葉系細胞の分化促進方法が提供される。
According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for promoting proliferation of mesenchymal stem cells, comprising culturing mesenchymal stem cells in the presence of a culture supernatant of oral mucosal epithelial cells.
According to another embodiment of the present invention, there is provided a method for promoting differentiation of tooth germ mesenchymal cells, comprising culturing tooth germ mesenchymal cells in the presence of a culture supernatant of tooth germ epithelial cells. .
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により得られる、増殖又は分化した細胞が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法により増殖又は分化した間葉系細胞を用いて、歯胚を再生する方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, proliferated or differentiated cells obtained by the above-described method of the present invention are provided.
According to still another aspect of the present invention, a method for regenerating a tooth germ using mesenchymal cells proliferated or differentiated by the above-described method of the present invention is provided.
本発明は、細胞培養の培地交換の際に得られる培養上清に含まれる生理活性物質の効果を利用して、この培養上清を別の細胞の培養に利用することにより、当該細胞の増殖・分化を促進させる技術である。以下に記載する本発明の実施例に示すとおり、培養上清の由来となる細胞と、上清を用いて培養する細胞との組み合わせを変えることにより、所望の細胞を増殖・分化させることができる。本発明は生体が本来もっている生理活性作用を応用した技術であることから、細胞に不自然な負担をかけずに、細胞を効率よく増殖・分化させることができる。また、移植医療や細胞療法、再生医療など、他家由来の因子などを使用しにくい場面においても、他の因子を用いることなく、患者由来の細胞の組み合わせにより、患者由来の組織・細胞のみで、自在に細胞の増殖・分化を制御できるような系を構築することができる。また、本発明における細胞培養は、単一の種類の細胞の培養であるため、細胞の制御が比較的簡便であり、さらに、臨床へ応用する際にも余計な細胞が混入する恐れがないという利点を有する。 The present invention utilizes the effect of a physiologically active substance contained in a culture supernatant obtained at the time of cell culture medium exchange, and uses this culture supernatant for culturing another cell, thereby proliferating the cell.・ Technology that promotes differentiation. As shown in the examples of the present invention described below, desired cells can be proliferated and differentiated by changing the combination of cells from which the culture supernatant is derived and cells cultured using the supernatant. . Since the present invention is a technique that applies the physiologically active action inherent to living bodies, cells can be efficiently proliferated and differentiated without placing an unnatural burden on the cells. Also, in situations where it is difficult to use factors derived from other families, such as transplantation medicine, cell therapy, and regenerative medicine, it is possible to use only patient-derived tissues and cells by combining patients-derived cells without using other factors. A system capable of freely controlling cell proliferation / differentiation can be constructed. In addition, since the cell culture in the present invention is a single type of cell culture, the control of the cells is relatively simple, and there is no risk of extra cells being mixed in clinical applications. Have advantages.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による細胞の増殖又は分化の制御方法は、第一の種類の細胞の培養上清の存在下において第二の種類の細胞を培養することによって該第二の種類の細胞の増殖又は分化を促進させることを特徴とする方法である。好ましい態様によれば、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養することができる。本発明の別の態様によれば、間葉系細胞の培養上清の存在下において上皮系細胞を培養することもできる。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The method for controlling cell proliferation or differentiation according to the present invention comprises culturing a second type of cell in the presence of a culture supernatant of the first type of cell to thereby proliferate or differentiate the second type of cell. It is a method characterized by promoting. According to a preferred embodiment, mesenchymal cells can be cultured in the presence of a culture supernatant of epithelial cells. According to another aspect of the present invention, epithelial cells can be cultured in the presence of a culture supernatant of mesenchymal cells.
本発明は生体内の上皮・間葉相互作用に関連する因子が、細胞を培養する際に培養上清中に分泌されることを利用した技術である。生体において、上皮・間葉系細胞の相互作用は重要で、生体の器官および組織の発生、あるいはそれらの形態・機能の維持には、それぞれの部位における上皮および間葉系細胞から、増殖・分化の制御因子が放出され、器官・組織の発生・維持をおこなっている。 The present invention is a technique utilizing the fact that factors associated with in vivo epithelial-mesenchymal interaction are secreted into the culture supernatant when cells are cultured. In living organisms, the interaction between epithelial and mesenchymal cells is important, and for the development of organs and tissues in the living body, or to maintain their morphology and function, proliferation and differentiation from epithelial and mesenchymal cells at each site The regulatory factor is released and the organs and tissues are generated and maintained.
本発明は、このような生物学的特性を利用し、細胞培養の培地交換の際に出る培養上清に含まれる生理活性物質の効果を期待し、この培養上清を別の細胞の培養に利用することで、細胞の増殖・分化を促進させる技術である（図１）。 The present invention makes use of such biological characteristics and expects the effect of a physiologically active substance contained in the culture supernatant that is produced when the culture medium is changed in the cell culture. It is a technology that promotes cell proliferation and differentiation by using it (FIG. 1).
本発明では、培養上清を採取するための細胞として、例えば、上皮系細胞を使用することができる。本発明で用いる上皮系細胞としては、上皮系細胞であれば特にその種類は限定されないが、好ましくは、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞、マラッセの上皮遺残細胞、口腔粘膜上皮細胞、上皮細胞、表皮細胞又はこれらの前駆細胞が挙げられる。これらの細胞は、１種類の上皮系細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の上皮系細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。 In the present invention, for example, epithelial cells can be used as cells for collecting the culture supernatant. The epithelial cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is an epithelial cell, but is preferably an inner enamel epithelial cell, an outer enamel epithelial cell, an enamel medullary cell, an intermediate layer cell, an enamel blast, a marasse cell. Epithelial remnant cells, oral mucosal epithelial cells, epithelial cells, epidermal cells, or progenitor cells thereof. These cells may be cultured as a single cell composed of one type of epithelial cell, or may be cultured as a cell mixture composed of two or more types of epithelial cells.
本発明で増殖又は分化を促進するための細胞としては、例えば、間葉系細胞を使用することができる。間葉系細胞としては、間葉系細胞であれば特にその種類は限定されないが、好ましくは、歯胚間葉系細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞、歯乳頭細胞、歯嚢細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞又はこれらの前駆細胞、又は間葉系の幹細胞等が挙げられる。これらの細胞は、１種類の間葉系細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の間葉系細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。 As cells for promoting proliferation or differentiation in the present invention, for example, mesenchymal cells can be used. The mesenchymal cell is not particularly limited as long as it is a mesenchymal cell, but is preferably a tooth germ mesenchymal cell, odontoblast, pulp cell, tooth papilla cell, dental follicle cell, cementoblast , Osteoblasts or their progenitor cells, or mesenchymal stem cells. These cells may be cultured as a single cell composed of one type of mesenchymal cell, or may be cultured as a cell mixture composed of two or more types of mesenchymal cells.
上皮系細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚等）の歯胚、歯根膜（マラッセの上皮遺残）、口腔粘膜、付着上皮、皮膚等から公知の方法により採取することができる。例えば、内エナメル上皮細胞、外エナメル上皮細胞、エナメル髄細胞、中間層細胞、エナメル芽細胞等の上皮系細胞の場合、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Hanks balanced salt solution（ＨＢＳＳ）溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、ＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼとディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。得られた細胞を、培地として、例えばＭＣＤＢ１５３（ｋｙｏｋｕｔｏ Ｃｏ．）を用いて培養すると、歯胚中の間葉系細胞が失われ、上皮系細胞のみを得ることができる。 Epithelial cells can be collected from mammals (eg, humans, pigs, etc.) tooth germ, periodontal ligament (marasse epithelial residue), oral mucosa, adherent epithelium, skin and the like by known methods. For example, in the case of epithelial cells such as inner enamel epithelial cells, outer enamel epithelial cells, enamel medullary cells, intermediate layer cells, and enamel blasts, they can be collected from the mandible of mammals (eg, humans, pigs, etc.) . The impacted teeth are aseptically removed and stored in a suitable storage solution such as Hanks balanced salt solution (HBSS) solution. The calcified portion in the tooth is removed, the tissue is cut into small pieces with a scalpel, and the tissue is washed with an HBSS solution or the like. Subsequently, it is preferable to perform enzyme treatment of the tissue using collagenase and dispase. After the enzyme treatment, the cells can be collected by pipetting and centrifugation. When the obtained cells are cultured using, for example, MCDB153 (kyokuto Co.) as a medium, mesenchymal cells in the tooth germ are lost, and only epithelial cells can be obtained.
また、口腔粘膜上皮細胞の場合、ヒトより採取した口腔粘膜をディスパーゼで処理した後、上皮部分を剥がし、トリプシン処理することにより得ることができる。 In the case of oral mucosal epithelial cells, it can be obtained by treating oral mucosa collected from a human with dispase, then peeling off the epithelial portion and treating with trypsin.
上皮系細胞の培養上清は、当業者に公知の常法により採取することができる。例えば、上皮系細胞の培養中における培地交換の際に培養上清を採取し、採取した培養上清に対してフィルターろ過を行って浮遊している細胞や不純物を除去してから用いることができる。 The culture supernatant of epithelial cells can be collected by a conventional method known to those skilled in the art. For example, the culture supernatant can be collected at the time of medium exchange during the culture of epithelial cells, and the collected culture supernatant can be filtered to remove floating cells and impurities before use. .
間葉系細胞は、哺乳類（例えば、ヒト、豚など）の歯胚、歯髄、歯槽骨、骨髄等から公知の方法により採取することができる。例えば、歯胚中の間葉系細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、ＰＢＳ溶液又はＨＢＳＳ溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、ＰＢＳ溶液又はＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼとディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。得られた細胞を、培地として、Dulbecco's Modified Eagle Mediumに１０％牛胎児血清と１％抗生剤を添加したものを用いて継代培養すると、歯胚中の上皮系細胞が失われ、間葉系の細胞のみを得ることができる。 Mesenchymal cells can be collected from tooth germs, dental pulp, alveolar bone, bone marrow, and the like of mammals (eg, humans, pigs, etc.) by known methods. For example, mesenchymal cells in a tooth germ can be collected from the mandible of a mammal (eg, human, pig, etc.). The impacted teeth are aseptically removed and stored in a suitable storage solution such as PBS solution or HBSS solution. The calcified portion in the tooth is removed, the tissue is cut into small pieces with a scalpel, and the tissue is washed with PBS solution or HBSS solution. Subsequently, it is preferable to perform enzyme treatment of the tissue using collagenase and dispase. After the enzyme treatment, the cells can be collected by pipetting and centrifugation. When the obtained cells are subcultured using Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotics, the epithelial cells in the tooth germ are lost and mesenchymal Only cells can be obtained.
また、歯牙からの歯髄の摘出は、例えばAbout I.,他Experimental cell research.258.33-41,2000に記載の方法に従って行うことができる。無菌的に採取した歯髄を、シャーレに移し、培地中で培養することにより、間葉系細胞を得ることができる。
更に、公知の方法に従い、腸骨等から骨髄穿刺を行って骨髄を採取し、培養することで間葉系の幹細胞を得ることができる。
In addition, the removal of the dental pulp from the tooth can be performed according to the method described in, for example, About I., Other Experimental cell research.258.33-41,2000. Mesenchymal cells can be obtained by transferring aseptically collected dental pulp to a petri dish and culturing it in a medium.
Furthermore, according to a known method, mesenchymal stem cells can be obtained by performing bone marrow puncture from the iliac or the like to collect and culture the bone marrow.
本発明の方法に従って培養した細胞（例えば、間葉系細胞など）は、増殖又は分化が促進されていることから、細胞医療や再生医療に利用することができる。例えば、歯胚間葉系細胞を増殖・分化させることにより象牙芽細胞あるいは歯胚を形成させることが可能であり、これを歯科患者に移植することにより、該患者の治療のために用いられる。この場合、移植に伴う生体適合性などの観点から、培養に用いる間葉系細胞は、該患者に由来する自分の細胞を用いることが好ましいが、同種（他家）の細胞を使用することも可能である。 The cells cultured according to the method of the present invention (for example, mesenchymal cells) can be used for cell medicine and regenerative medicine because their proliferation or differentiation is promoted. For example, it is possible to form odontoblasts or tooth germs by proliferating and differentiating tooth germ mesenchymal cells, which are used for treatment of the patient by transplanting it to a dental patient. In this case, from the viewpoint of biocompatibility associated with transplantation, the mesenchymal cells used for the culture are preferably the own cells derived from the patient, but the same type (other family) cells may also be used. Is possible.
歯牙は、発生から成熟するまでに５つの段階を経て形成されることが知られている。第一期は、Initiation stageと呼ばれ、基底膜に上皮組織と間葉組織が誘導される。第二期は、Bud stageと呼ばれエナメル器が作られる。第三期はCap stageと呼ばれ、歯乳頭が形成され、歯胚が形成される。第四期はBell stageと呼ばれ、歯胚からエナメル質を形成する細胞への分化と歯乳頭から象牙質と歯髄を形成する細胞への分化が開始される。第五期はMaturation stageと呼ばれ、エナメル質と象牙質と歯髄などの歯牙を構成する組織へと分化する。本発明で用いる上皮系細胞及び間葉系細胞としては、これらのうちの好適な時期の細胞を採取して用いることができる。また、歯胚が存在していない症例では、歯根より歯髄を摘出して細胞を分離採取することができる。 It is known that teeth are formed through five stages from development to maturity. The first stage is called the initiation stage, where epithelial and mesenchymal tissues are induced in the basement membrane. The second period is called Bud stage, and an enamel device is made. The third stage is called Cap stage, where the tooth papilla is formed and the tooth germ is formed. The fourth stage, called the Bell stage, begins to differentiate from the tooth germ into cells that form enamel and from the tooth papilla into cells that form dentin and pulp. The fifth stage is called the "Maturation stage" and differentiates into tissues that make up the tooth, such as enamel, dentin, and pulp. Of the epithelial cells and mesenchymal cells used in the present invention, cells at a suitable time can be collected and used. In cases where no tooth germ is present, the pulp can be removed from the root and cells can be isolated and collected.
上皮系細胞及び間葉系細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から３７℃の温度；５から１０％ＣＯ2 インキュベーター内など）の下で行なうことができる。また、上皮系細胞の培養には、無血清培地を使用して培養することも可能であるし、繊維芽細胞等のフィーダー細胞を共存させて培養することも可能である。 Culture of epithelial cells and mesenchymal cells is carried out using normal serum-containing medium used for animal cell culture under normal animal cell culture conditions (for example, a temperature of room temperature to 37 ° C .; 5 to 10% CO 2. Under the incubator). In addition, the epithelial cells can be cultured using a serum-free medium, or in the presence of feeder cells such as fibroblasts.
本発明において細胞の培養は担体上で行ってもよいし、担体なしで培養してもよい。担体の使用は、細胞から歯胚を形成するのに有用である。担体としては、歯胚の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。即ち、皮下、胃大網又は顎骨内などの生体内において適切な吸収速度と特性を有し、かつ細胞と高い親和性を有する材料から成る担体を使用することが好ましい。 In the present invention, cells may be cultured on a carrier or may be cultured without a carrier. The use of a carrier is useful for forming tooth germs from cells. As the carrier, a carrier that can endure the time required for the formation of a tooth germ and is rapidly absorbed thereafter is preferable. That is, it is preferable to use a carrier made of a material having an appropriate absorption rate and characteristics in a living body such as subcutaneous, stomach omentum, or jawbone, and having a high affinity for cells.
担体の素材は、上記特性を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ポリグリコール酸（polyglycolic acid（ＰＧＡ））、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリカプロラクトンなどの合成高分子材料、またはコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの蛋白質材料、あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙質、サンゴなどの天然由来材料を使用することもできる。さらに、リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などの無機材料も使用することができる。 The material of the carrier is not particularly limited as long as it satisfies the above characteristics. For example, polyglycolic acid (PGA), poly (DL-lactide-co-glycoside) (PLGA), polylactic acid (PLLA) Synthetic polymer materials such as polycaprolactone, protein materials such as collagen, gelatin, and fibrin, or natural materials such as hyaluronic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, dentin, and coral can also be used. Furthermore, inorganic materials such as tricalcium phosphate (β-TCP) can also be used.
ＰＧＡは、例えばAlbany International Research Co.などから購入することができ、またＰＬＧＡはSigmaから購入することができる。ＰＧＡの場合、吸収速度が速いため、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）を表面にコートして吸収期間を遅らせることもできる。さらに、ＰＧＡ、ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着及び増殖性を高めるために、表面にコラーゲン溶液又はフィブロネクチン溶液等をコートして使用することもできる。 PGA can be purchased from Albany International Research Co., for example, and PLGA can be purchased from Sigma. In the case of PGA, since the absorption rate is fast, poly (DL-lactide) (PLLA) can be coated on the surface to delay the absorption period. Further, when a synthetic material such as PGA, PLLA, PLGA or polycaprolactone is used, it can be used by coating a collagen solution or fibronectin solution on the surface in order to enhance cell adhesion and proliferation.
上記の担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態、不織布形態などが可能である。 Examples of the form of the carrier include a mesh form, a sponge form, a gel form, and a non-woven form.
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状の多孔体あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血管が進入しやすくなっているものが好ましい。 The carrier is preferably processed into a shape in which cells can be easily transplanted, and is preferably a plate-like or spherical porous body or hollow, with one end being opened and a blood vessel easily entering from the periphery.
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。その後、レジンの型を取り出し、担体を構成する合成材料を流しこむことによって目的の形態を再現することができる。 The carrier is preferably prepared in a form suitable for the purpose. For this purpose, a mold is obtained using an impression material after a desired form is made of a resin. Thereafter, the desired form can be reproduced by taking out the resin mold and pouring the synthetic material constituting the carrier.
本発明の方法では、上皮系細胞の培養上清の存在下において間葉系細胞を培養した後に、該間葉系細胞を移植動物に移植し、該移植動物の体内で象牙質や歯胚を再生させてもよいし、該間葉系細胞を直接患者に移植してもよい。細胞の培養の際に用いた担体も細胞と一緒に、移植動物の体内に移植することができる。 In the method of the present invention, after culturing mesenchymal cells in the presence of epithelial cell culture supernatant, the mesenchymal cells are transplanted into a transplanted animal, and dentin and tooth germ are transplanted in the transplanted animal body. The cells may be regenerated, or the mesenchymal cells may be directly transplanted into the patient. The carrier used for culturing the cells can also be transplanted together with the cells into the body of the transplanted animal.
移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ラット（ヘアレスラットなど）、ウサギ又はマウスなどのげっ歯類動物を使用することができる。移植の部位としては、骨の形成に必要な因子を供給しやすい部位が好ましく、具体的には、血流の豊富な部位が好ましく、例えば、腹腔内の胃大網などが特に好ましい。このような部位に移植することにより、細胞の成長を促進することができ、骨の形成を早めることが可能となる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
Although the kind of transplant animal is not specifically limited, Preferably it is a mammal, For example, rodent animals, such as a rat (hairless rat etc.), a rabbit, or a mouse | mouth, can be used. The site for transplantation is preferably a site that can easily supply factors necessary for bone formation, and specifically, a site where blood flow is abundant is preferable, for example, an intraperitoneal stomach omentum is particularly preferable. By transplanting into such a site, cell growth can be promoted, and bone formation can be accelerated.
The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１：口腔粘膜上皮細胞の培養上清を用いた間葉系幹細胞の増殖
（方法）
ラット口腔粘膜上皮をメンテナンス培地にて培養し、コンフルエントに達した口腔粘膜上皮の培地を交換した。その後、3日おきに培地交換を行い、培地交換の際にでる培養上清を採取した。採取した培養上清に対してはフィルターろ過を行い、浮遊している細胞や不純物を完全に除去した。
Example 1: Proliferation of mesenchymal stem cells using culture supernatant of oral mucosal epithelial cells (method)
Rat oral mucosal epithelium was cultured in maintenance medium, and the oral mucosal epithelial medium that reached confluence was replaced. Thereafter, the medium was changed every three days, and the culture supernatant produced during the medium exchange was collected. The collected culture supernatant was subjected to filter filtration to completely remove floating cells and impurities.
上記の手法で採取した培養上清を、任意の量のDMEMで希釈し、この培養上清を培地として、間葉系幹細胞（MSC）の培養を行い、MSCの増殖能に対する培養上清の影響を検討した。 The culture supernatant collected by the above method is diluted with an arbitrary amount of DMEM, and the culture supernatant is used as a medium to culture mesenchymal stem cells (MSC). The effect of the culture supernatant on the proliferation ability of MSC It was investigated.
（結果）
6well Plateに初期数（１×104個）を播種し、DMEM培地，DMEM：メンテナンス培地＝１：１，DMEM：培養上清＝１：１，DMEM：培養上清＝３：１，DMEM＝培養上清＝７：１の培地を検討した結果、DMEM：培養上清＝７：１の混合比の培地で培養したMSCにおいて、高い細胞増殖能を示した（図２）。また、細胞の形態および増殖速度の低下は観察されなかったことから、この培養上清は、MSCに対して細胞増殖を起こさせる性質があることが示唆された。
(result)
An initial number (1 × 10 4 ) is seeded on a 6-well plate, DMEM medium, DMEM: maintenance medium = 1: 1, DMEM: culture supernatant = 1: 1, DMEM: culture supernatant = 3: 1, DMEM = As a result of examining the culture medium of culture supernatant = 7: 1, MSC cultured in a medium having a mixing ratio of DMEM: culture supernatant = 7: 1 showed high cell proliferation ability (FIG. 2). In addition, no decrease in cell morphology or growth rate was observed, suggesting that this culture supernatant has the property of causing cell growth on MSC.
実施例２：歯胚上皮細胞の培養上清を用いた歯胚間葉系細胞の分化
（方法）
ブタ歯胚よりディスパーゼを用いて分離したブタ歯胚上皮系細胞をKGM培地にて培養し、コンフルエントに達した歯胚上皮の培地を交換した。その後、3日おきに培地交換を行い、培地交換の際にでる培養上清を採取した。採取した培養上清に対してはフィルターろ過を行い、浮遊している細胞や不純物を完全に除去した。
Example 2: Differentiation of tooth germ mesenchymal cells using culture supernatant of tooth germ epithelial cells (method)
Porcine tooth germ epithelial cells isolated from pig tooth germ using dispase were cultured in KGM medium, and the medium of congested tooth germ epithelium was replaced. Thereafter, the medium was changed every three days, and the culture supernatant produced during the medium exchange was collected. The collected culture supernatant was subjected to filter filtration to completely remove floating cells and impurities.
上記の手法で採取した培養上清を、任意の量のDMEMで希釈し、この培養上清を培地として、歯胚間葉系細胞の培養を行い、培養上清の増殖能および分化能に対する培養上清の影響を検討した。 The culture supernatant collected by the above method is diluted with an arbitrary amount of DMEM, and the embryonic mesenchymal cells are cultured using this culture supernatant as a culture medium. The effect of the supernatant was examined.
（結果）
12well Plateに初期数（１×104個）を播種し、DMEM培地，DMEM：KGM培地＝１：１，DMEM：KGM培地＝１：３，DMEM：KGM培地＝３：１，DMEM＝培養上清＝１：１，DMEM：培養上清＝１：３，DMEM：培養上清＝３：１，歯胚上皮上清の培地を検討した結果、歯胚上皮上清を用いた歯胚間葉系細胞においては、ほとんど細胞増殖を示さなかった一方で、非常に高いALP活性を示す結果となった（図３）。従って、培養上清を用いて培養した歯胚間葉系細胞において、細胞増殖がほとんど起こらなかったことと、一方で高いALP活性を示したことから、この培養上清は、歯胚間葉系細胞に対して細胞分化を起こさせる性質があることが示唆された。
(result)
An initial number (1 × 10 4 ) is seeded on a 12-well plate, DMEM medium, DMEM: KGM medium = 1: 1, DMEM: KGM medium = 1: 3, DMEM: KGM medium = 3: 1, DMEM = on top of culture Kiyoshi = 1: 1, DMEM: culture supernatant = 1: 3, DMEM: culture supernatant = 3: 1, examination of tooth germ epithelial supernatant medium, tooth germ mesenchyme using tooth germ epithelial supernatant The system cells showed almost no cell proliferation, but very high ALP activity (FIG. 3). Therefore, in the tooth germ mesenchymal cells cultured using the culture supernatant, cell proliferation hardly occurred, while high ALP activity was exhibited. It was suggested that the cells have the property of causing cell differentiation.
Claims (5)
As mesenchymal cells, tooth germ mesenchymal cells, odontoblasts, dental pulp cells, tooth papilla cells, dental follicle cells, cementoblasts, osteoblasts or their precursor cells, or mesenchymal stem cells are used. A method according to any one of claims 2 to 4.
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