JP4991203B2 - Teeth manufacturing method - Google Patents
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Description
本発明は、歯の製造方法に関し、特に細胞を用いた歯の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for manufacturing a tooth, and particularly to a method for manufacturing a tooth using cells.
歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有し、齲蝕や歯周病等によって失われることがある器官である。一般に歯の損失については、生命に対する危惧が少ないと考えられているため、現在は主として入れ歯やインプラントにより補うことが多い。しかしながら、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持や質の高い生活を維持するという観点から歯の再生技術の開発への関心が高まって来た。
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位であり、器官や臓器と同じであると考えられている。そのため歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではなく、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することができない。また、歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も考えられているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することができない。
そこで、近年、単離された歯胚細胞を用いた歯胚を再構成させて、この再構成歯胚を移植することによる歯の再生を中心とした検討が行われている。
Teeth have a hard tissue called enamel in the outermost layer and dentin in the inner layer, and further have dentin blasts that produce dentin inside, and a pulp in the center, which is lost due to caries, periodontal disease, etc. It is an organ that can be broken. In general, it is considered that there is little concern about life with regard to tooth loss, and at present, it is often compensated mainly by dentures and implants. However, the presence or absence of teeth greatly affects the appearance and taste of food, and interest in the development of tooth regeneration technology has increased from the viewpoint of maintaining health and maintaining a high quality of life.
A tooth is a functional unit that is formed by induction of the developmental process of the fetal period and is constructed by a plurality of cell types, and is considered to be the same as an organ. Therefore, teeth are not generated by a stem cell system in which cell types are generated from stem cells such as hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in adults, but only by stem cell transfer currently being promoted by regenerative medicine (stem cell transfer therapy) ) Cannot regenerate teeth. In addition, it is also considered to identify genes that are specifically expressed during tooth development and artificially induce tooth germs to regenerate teeth. I can't guide you.
Therefore, in recent years, studies have been conducted focusing on tooth regeneration by reconstituting a tooth germ using isolated tooth germ cells and transplanting the reconstructed tooth germ.
例えば、非特許文献１には、歯胚から単離された上皮系細胞や間葉系の歯嚢細胞などの細胞を、生体吸収性の担体と共にラットの腹腔内に移植することで歯様の組織が再生されることが開示されている。
また、非特許文献２には、継代された培養細胞による上皮−間葉相互作用が実現可能な系とし、コラーゲンゲルによる共培養が有効であると記載されている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特許文献１には、歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特許文献２には、歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
For example, Non-Patent Document 1 discloses that cells such as epithelial cells and mesenchymal dental follicle cells isolated from a tooth germ are transplanted into a rat abdominal cavity together with a bioabsorbable carrier. It is disclosed that the tissue is regenerated.
Non-Patent Document 2 describes that a system capable of realizing an epithelial-mesenchymal interaction by passaged cultured cells is effective and co-culture with collagen gel is effective.
As a method for regenerating tooth germ, for example, Patent Document 1 describes culturing tooth germ cells in the presence of a physiologically active substance such as fibroblast growth factor. Patent Document 2 proposes culturing at least one kind of tooth germ cells and cells differentiable into these cells together with a carrier containing fibrin, where the carrier containing fibrin is It is described that a tooth having a specific shape is formed using a tooth germ having a desired shape.
特許文献３及び４には、６ヶ月のブタの下顎骨から、象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚との細胞混合物を、ポリグリコール酸−ポリ酢酸共重合体からなる生分解性ポリマーを固化させた担体（Scaffold）に播種して、動物の体内へ移植し、歯を形成する方法が開示されている。ここで担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
一方、特許文献５には、骨の欠損又は損傷を有する患者を治療するための歯の再生方法を開示している。この方法によれば、ポリグリコール酸メッシュ担体に間葉系細胞を播種した後に、上皮系細胞をコラーゲンと共に重層する又は上皮細胞シートで包むことによって、骨が形成される。なお、特許文献５では、骨の形状を構築するために担体を用いている。
更に、非特許文献３には、マウス足裏の上皮組織と歯胚由来の間葉組織から歯様の組織が形成されることが開示されている。
On the other hand, Patent Document 5 discloses a tooth regeneration method for treating a patient having a bone defect or damage. According to this method, after seeding mesenchymal cells on a polyglycolic acid mesh carrier, epithelial cells are overlaid with collagen or wrapped with an epithelial cell sheet to form bone. In Patent Document 5, a carrier is used to construct a bone shape.
Furthermore, Non-Patent Document 3 discloses that a tooth-like tissue is formed from an epithelial tissue of a mouse foot and a mesenchymal tissue derived from a tooth germ.
上記技術はいずれも細胞や細胞因子等を用いて歯胚の再構築を行っているが、歯としての充分な機能を発現しうる特徴的な細胞配置や方向性を再現するものではない。また、組織を構成している複数の細胞を単に単離して培養しただけでは、特有の細胞配置を備えた組織を再構築することが困難であった。
また、歯胚の再構築に歯胚由来の組織又は細胞、特に自家組織を利用する場合には、使用できる細胞数には限界があった。
In any of the above techniques, the tooth germ is reconstructed using cells, cellular factors, etc., but it does not reproduce the characteristic cell arrangement and directionality that can express sufficient functions as a tooth. In addition, simply isolating and culturing a plurality of cells constituting a tissue makes it difficult to reconstruct a tissue having a specific cell arrangement.
In addition, when a tooth germ-derived tissue or cell, particularly an autologous tissue, is used to reconstruct a tooth germ, the number of cells that can be used is limited.
本発明は、特有の細胞配置を保持した歯を効率よく製造する方法を提供することを目的とし、該目的を達成することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a tooth having a specific cell arrangement and to achieve the object.
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１） 支持担体であるゲルの内部に、口腔内粘膜上皮組織、舌上皮組織、及び歯肉上皮組織からなる群より選択された少なくとも１種の上皮組織由来である培養細胞から実質的になる第１の細胞集合体と、歯胚由来である間葉系細胞から実質的になる第２の細胞集合体とを接触させて配置する配置工程と、前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する培養工程と、を含む歯の製造方法である。
（２） 前記第１の細胞集合体を調製する第１の調製工程と、前記第２の細胞集合体を調製する第２の調製工程と、を前記配置工程の前に更に含む前記（１）に記載の歯の製造方法である。
（３） 前記第１の細胞集合体及び前記第２の細胞集合体の少なくとも一方が単一細胞集合物であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の歯の製造方法である。
（４） 前記上皮系組織が、成体由来の上皮系組織であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の歯の製造方法である。
（５） 前記培養細胞が、初代培養細胞であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の歯の製造方法である。
（６） 前記培養工程を他の動物細胞の存在下で行うことを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の歯の製造方法である。
（７） 前記培養工程を、歯周組織が形成されるまで継続することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の歯の製造方法である。
Specific means for solving the above problems are as follows.
(1) A gel consisting essentially of cultured cells derived from at least one epithelial tissue selected from the group consisting of an oral mucosal epithelial tissue, a tongue epithelial tissue, and a gingival epithelial tissue inside a gel as a support carrier. An arrangement step of placing the first cell aggregate in contact with a second cell aggregate substantially consisting of mesenchymal cells derived from a tooth germ; and the first and second cell aggregates, And a culturing step of culturing inside the support carrier.
(2) The above (1) further including a first preparation step for preparing the first cell aggregate and a second preparation step for preparing the second cell aggregate before the arranging step. It is the manufacturing method of the tooth | gear as described in above.
(3) In the method for manufacturing a tooth according to (1) or (2), at least one of the first cell aggregate and the second cell aggregate is a single cell aggregate. is there.
(4) before SL epithelial tissue, is a manufacturing method of a tooth according to any one of above, wherein (1) to (3) that the epithelial tissue from adult.
( 5 ) The method for producing a tooth according to any one of (1) to ( 4 ), wherein the cultured cell is a primary cultured cell.
( 6 ) The method for producing a tooth according to any one of (1) to ( 5 ), wherein the culturing step is performed in the presence of another animal cell.
( 7 ) The method for producing teeth according to any one of (1) to ( 6 ), wherein the culturing step is continued until periodontal tissue is formed.
本発明によれば、特有の細胞配置を保持した歯を効率よく製造する方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method of manufacturing efficiently the tooth | gear holding the specific cell arrangement | positioning can be provided.
本発明の歯の製造方法は、支持担体の内部に、歯胚以外の上皮系組織由来である培養細胞から実質的になる第１の細胞集合体と、歯胚由来である間葉系細胞から実質的になる第２の細胞集合体とを接触させて配置する配置工程と、前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する培養工程と、を含むことを特徴とする。 The method for producing a tooth according to the present invention includes a first cell aggregate consisting essentially of cultured cells derived from an epithelial tissue other than a tooth germ and a mesenchymal cell derived from a tooth germ inside a support carrier. An arrangement step of placing the second cell aggregate substantially in contact with each other, and a culture step of culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier, To do.
本製造方法においては、第１の細胞集合体として歯胚以外の上皮系組織由来である培養細胞から実質的になる細胞集合体を用いる。歯胚以外の上皮系組織由来の培養細胞を用いることで、必要な数量の第１の細胞集合体を調製することが容易になる。歯胚は胎児期に特有の器官原基であり、自家組織を用いようとする場合には、第三大臼歯（親知らず）が発生する限られた時期にしか取得できないため、必要とする数量の歯胚組織を用意することは極めて困難である。従って、歯胚以外の上皮系組織を用いて上皮系細胞からなる細胞集合体を調製できる意義は大きい。
また、第１及び第２の細胞集合体の緊密な接触状態によって細胞間相互作用を効果的に再現することができ、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯に特有の層構造を有する歯を製造することができる。
In this production method, a cell aggregate consisting essentially of cultured cells derived from epithelial tissues other than tooth germ is used as the first cell aggregate. By using cultured cells derived from epithelial tissues other than tooth germs, it becomes easy to prepare a necessary number of first cell aggregates. The tooth germ is a unique organ primordium in the fetal period, and when using autologous tissue, it can only be acquired at a limited time when the third molar (a wisdom tooth) is generated. It is extremely difficult to prepare a tooth germ tissue. Therefore, it is significant that a cell aggregate composed of epithelial cells can be prepared using epithelial tissues other than tooth germ.
In addition, the close contact state of the first and second cell aggregates can effectively reproduce the cell-cell interaction, and the tooth has a layer structure peculiar to the teeth of dentin on the inside and enamel on the outside. Can be manufactured.
本発明において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織をいう。象牙質及びエナメル質は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニン、又はその遺伝子の発現の有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙質芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテイン、又はその遺伝子の発現の有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認はこの分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、in situ ハイブリダイゼーション、抗体染色等をあげることができる。
また、歯の方向性は、歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。
In the present invention, the term “tooth” refers to a tissue having a dentin layer on the inside and an enamel layer on the outside in a continuous manner, and refers to a tissue having directionality having a crown and a root. Dentin and enamel can be easily identified morphologically by those skilled in the art by tissue staining or the like. Enamel can be identified by the presence of enamel blasts, and the presence of enamel blasts can be confirmed by the presence or absence of expression of amelogenin or its gene. On the other hand, dentin can be identified by the presence of odontoblasts, and the presence of dentin blasts can be confirmed by the presence or absence of the expression of dentin sialoprotein or its gene. Confirmation of amelogenin and dentin sialoprotein can be easily carried out by methods well known in the art, and examples thereof include in situ hybridization and antibody staining.
In addition, the directionality of teeth can be specified by the arrangement of crowns and roots. The crown and root can be visually confirmed based on the shape and tissue staining.
また本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
なお、本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
In the present invention, “periodontal tissue” refers to alveolar bone and periodontal ligament formed mainly in the outer layer of the tooth. The alveolar bone and periodontal ligament can be easily identified by those skilled in the art by histological staining or the like.
In the present invention, “mesenchymal cell” means a cell derived from mesenchymal tissue, and “epithelial cell” means a cell derived from epithelial tissue.
本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、後述する発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚（器官原基）であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Bud stage）から鐘状期（Bell stage）までの段階であり、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織であり、「歯芽」とは本発明で用いられる「歯胚」の段階移行の、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から歯が歯肉から萌芽して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。 In the present invention, “tooth germ” and “tooth germ” are expressions used when particularly referring to those distinguished based on the developmental stage described later. The “tooth germ” in this case is the early tooth embryo (organ primordium) that has been determined to become a tooth in the future, and is generally used in the tooth development stage (Bud stage). It is a stage up to the bell stage (Bell stage), and is a tissue in which accumulation of dentin and enamel, which is a characteristic of a hard tissue of a tooth, is not particularly recognized, and “dental bud” is used in the present invention. The structure of the stage of `` dental germ '', the stage before the tooth emerges from the gingiva from the stage where the accumulation of dentin and enamel, which is a characteristic of the hard tissue of the tooth, has generally developed its function as a tooth Say.
歯胚は、図１に示されるように個体発生の過程で、蕾状期、帽状期、鐘状前期及び後期の各ステージを経て行われる。ここで、蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞を包むように陥入し（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）、鐘状前期及び鐘状後期に至ると、上皮系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成するようになる（図１（Ｃ）及び（Ｄ）参照）。従って、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用によって歯胚が形成する。
本発明における間葉系細胞は、歯胚を形成する又は形成する可能性がある上記蕾状期から鐘状後期までのもの（以下、単に「歯胚」という）であればよく、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から蕾状期から帽状期からのものであることが好ましい。
As shown in FIG. 1, the tooth germ is performed through each stage of the rod-like stage, the cap-like stage, the bell-like early stage, and the late stage in the process of ontogeny. Here, in the rod-like phase, epithelial cells invaginate so as to wrap mesenchymal cells (see FIGS. 1 (A) and (B)). Becomes the outer enamel, and the mesenchymal cell part forms dentin inside (see FIGS. 1C and 1D). Therefore, a tooth germ is formed by cell-cell interaction between epithelial cells and mesenchymal cells.
The mesenchymal cells in the present invention may be those from the above-mentioned rod-like stage to the bell-like stage (hereinafter simply referred to as “tooth germ”) that form or possibly form a tooth germ. From the viewpoint of juvenileness and homogeneity of the stage, it is preferable that the stage is from the saddle stage to the cap stage.
また、「細胞集合体」とは、細胞が密集した状態をいい、また「実質的になる」とは、対象となる細胞以外のものをできるだけ含まないことを意味する。本発明においては、前記第１の細胞集合体を、単一細胞の集合体とすることができる。また、前記第２の細胞集合体を組織自体若しくはその一部、又は単一細胞の集合体とすることができる。 In addition, “cell aggregate” means a state where cells are densely packed, and “substantially” means that it contains as little as possible cells other than the target cell. In the present invention, the first cell aggregate can be a single cell aggregate. Further, the second cell aggregate can be the tissue itself or a part thereof, or an aggregate of single cells.
第１及び第２の細胞集合体は、本発明によって組織の再構成を効率よく達成するためには、少なくとも一方が単一細胞で構成されていることが好ましく、共に単一細胞で構成されていることがより好ましい。
第１及び第２の細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体１個あたり、一般に１０１〜１０８個、好ましくは１０３〜１０８個とすることができる。
In order to efficiently achieve tissue reconstitution according to the present invention, at least one of the first and second cell aggregates is preferably composed of a single cell, and both are composed of a single cell. More preferably.
The number of cells constituting the first and second cell aggregates varies depending on the type of animal, the type of support carrier, hardness, and size, but generally 10 1 to 10 8 cells per cell aggregate. , Preferably 10 3 to 10 8 .
配置工程では、支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体とを接触させて配置する。
本発明の製造方法における配置工程では、上記第１及び第２の細胞集合体を、細胞の接触状態を保持可能な支持担体の内部に配置するので、それぞれの細胞集合体を構成する細胞が、他方の細胞集合体を構成する細胞と混じり合うことがない。このように配置工程では、各細胞集合体を混合することなく配置するので、細胞集合体の間に境界線が形成される。このような配置形態を、本明細書中では適宜「区画化」と表現する。
In the arranging step, the first cell aggregate and the second cell aggregate are placed in contact with each other inside the support carrier.
In the arranging step in the production method of the present invention, the first and second cell aggregates are arranged inside a support carrier capable of maintaining the contact state of the cells. Therefore, the cells constituting each cell aggregate are It does not mix with the cells that make up the other cell assembly. In this way, in the arranging step, the cell aggregates are arranged without being mixed, so that a boundary line is formed between the cell aggregates. Such an arrangement is appropriately expressed as “partitioning” in this specification.
ここで、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ間葉系細胞及び上皮系細胞から実質的に構成されるように、別個の調製工程（第１の細胞調製工程及び第２の細胞調製工程）によって調製されることが好ましい。
本製造方法で用いられる第２の細胞集合体を構成する間葉系細胞は、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成するために、歯胚由来であることが必要である。
Here, the first cell assembly and the second cell assembly are configured in separate preparation steps (first cell preparation step and first cell assembly so as to be substantially composed of mesenchymal cells and epithelial cells, respectively. 2 cell preparation step).
The mesenchymal cells constituting the second cell aggregate used in the present production method are used to effectively form teeth having a specific structure and direction by reproducing the cell arrangement in the living body. It must be derived from an embryo.
また、本製造方法で用いられる第１の細胞集合体は、歯胚以外の上皮系組織由来である培養細胞（以下、上皮系培養細胞という場合がある。）から実質的になることを特徴とする。前記上皮系組織としては、歯胚以外の上皮系組織であれば特に制限はないが、歯科治療という観点から歯科医等が容易に採取することが出来る歯胚以外の口腔内上皮系組織であることが好ましい。
歯胚以外の口腔内上皮系組織としては、例えば、口腔内の粘膜上皮組織、舌上皮組織、歯肉上皮組織等を挙げることができる。
In addition, the first cell aggregate used in the present production method is substantially composed of cultured cells derived from epithelial tissues other than tooth germs (hereinafter sometimes referred to as epithelial cultured cells). To do. The epithelial tissue is not particularly limited as long as it is an epithelial tissue other than a tooth germ, but is an oral epithelial tissue other than a tooth germ that can be easily collected by a dentist from the viewpoint of dental treatment. It is preferable.
Examples of oral epithelial tissues other than tooth germs include mucosal epithelial tissues, tongue epithelial tissues, and gingival epithelial tissues in the oral cavity.
本製造方法においては、前記上皮系組織として、胎児から採取した未成熟の上皮系組織に限らず、成体から採取した上皮系組織も用いることができる。自家移植の観点から、成体から採取した上皮系組織を用いることが好ましい。用いることができる成体としては、例えばマウスの場合、９週齢以下のマウスを用いることができ、好ましくは３〜６週齢のマウスを用いることができる。 In this production method, the epithelial tissue is not limited to immature epithelial tissue collected from a fetus, but epithelial tissue collected from an adult can also be used. From the viewpoint of autotransplantation, it is preferable to use epithelial tissue collected from adults. As an adult that can be used, for example, in the case of a mouse, a mouse of 9 weeks of age or less can be used, and preferably a mouse of 3 to 6 weeks of age can be used.
歯胚及び歯胚以外の上皮系組織は、哺乳動物の霊長類、例えばヒト、サルなど、有蹄類、例えば豚、牛、馬など、小型哺乳類の齧歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなどの種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び歯胚以外の上皮系組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存するか、適当な培養液を用いて培養すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚の他、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用との観点から、親知らず歯胚やその培養細胞を用いることが好ましい。 Tooth germs and epithelial tissues other than tooth germs include mammalian primates such as humans and monkeys, ungulates such as pigs, cows and horses, and small mammal rodents such as mice, rats and rabbits. From various animal jaw bones. To collect tooth germs and epithelial tissues other than tooth germs, the conditions generally used for tissue collection may be applied as they are. They are taken out aseptically and stored in an appropriate preservation solution or using an appropriate culture solution. Culture. Examples of human tooth germs include fetal tooth germs as well as third molars, so-called wisdom tooth germs. From the viewpoint of use of autologous tissues, wisdom tooth germs and cultured cells thereof should be used. Is preferred.
この歯胚からの間葉系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分けることによって行われる。このとき、歯胚組織は顕微鏡下で構造的に見分けることが可能であるため、解剖用ハサミやピンセット等で切断、あるいは引き剥がすことによって容易に分離することができる。また、歯胚組織からの歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織の分離は、その形状に従って注射針、タングステンニードル、ピンセット等で切断、あるいは引き剥がすことにより容易に行うことができる。
好ましくは、周囲組織から歯胚組織を容易に分離するため及び／又は歯胚組織から上皮組織及び間葉組織を分離するために、酵素を用いてもよい。このような用途に用いられる酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
Preparation of mesenchymal cells from the tooth germ is performed by first dividing the tooth germ isolated from the surrounding tissue into a tooth germ mesenchymal tissue and a tooth germ epithelial tissue according to the shape. At this time, since the tooth germ tissue can be structurally distinguished under a microscope, it can be easily separated by cutting or peeling off with scissors for anatomy or tweezers. Further, the separation of the tooth germ mesenchymal tissue and the tooth germ epithelial tissue from the tooth germ tissue can be easily performed by cutting or peeling with an injection needle, a tungsten needle, tweezers or the like according to the shape.
Preferably, enzymes may be used to easily separate tooth germ tissue from surrounding tissue and / or to separate epithelial tissue and mesenchymal tissue from tooth germ tissue. Enzymes used for such applications include dispase, collagenase, trypsin and the like.
間葉系細胞は、間葉組織から単一細胞の状態に調製してもよい。調製工程では、単一の細胞に容易に分散可能とするために、酵素を用いてもよい。このような酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。このとき、間葉組織からの間葉系細胞の分離には、コラーゲナーゼとトリプシンで同時に処理し、最終的にＤＮａｓｅ処理をすることが好ましい。このときＤＮａｓｅ処理を行うのは、酵素処理により一部の細胞がダメージをうけ、細胞膜が溶解したときに溶液中に放出されるＤＮＡによって細胞が凝集し細胞の回収量が低下することすることを防ぐためである。 Mesenchymal cells may be prepared from mesenchymal tissue into a single cell. In the preparation step, an enzyme may be used in order to make it easily dispersible in a single cell. Examples of such enzymes include dispase, collagenase, trypsin and the like. At this time, for the separation of mesenchymal cells from the mesenchymal tissue, it is preferable to simultaneously treat with collagenase and trypsin and finally treat with DNase. At this time, DNase treatment is carried out because some cells are damaged by the enzyme treatment, and the cells are aggregated by the DNA released into the solution when the cell membrane is dissolved, resulting in a decrease in the amount of collected cells. This is to prevent it.
なお、間葉系細胞は、それぞれ充分な細胞数を得るために、配置工程に先立って予備的な培養を経たものであってもよい。間葉系細胞の培養は、一般に動物細胞の培養に用いられる温度等の条件をそのまま用いることができる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質やインスリン、コレラトキシン等を添加したものであってもよい。
The mesenchymal cells may have undergone preliminary culture prior to the placement step in order to obtain a sufficient number of cells. In the mesenchymal cell culture, conditions such as temperature generally used for animal cell culture can be used as they are.
As a medium used for culturing, a medium generally used for culturing animal cells, such as Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), can be used, and serum for promoting cell growth is added to the serum. As an alternative, for example, cell growth factors such as FGF, EGF, and PDGF, and known serum components such as transferrin may be added. In addition, although the density | concentration in the case of adding serum can be suitably changed with the culture state at that time, it can usually be 10%. For cell culture, normal culture conditions, for example, culture in an incubator with a temperature of 37 ° C. and a concentration of 5% CO 2 are applied. Moreover, what added antibiotics, such as streptomycin, insulin, a cholera toxin, etc. may be used suitably.
本発明における上皮系組織は、上記間葉系組織の分離と同様の方法で得ることができる。分離された上皮系組織は、上記間葉系組織から単一細胞の状態に調製する方法と同様にして、単一細胞の状態に調製することができる。このとき、上皮組織からの上皮系細胞の分離にはコラーゲナーゼ処理後にトリプシン処理とＤＮａｓｅ処理をすることが好ましい。
単一細胞の状態になった上皮系細胞を、上記間葉系細胞の予備的培養条件と同様の条件を適用して培養することで上皮系の培養細胞を得ることができる。培養細胞を用いることで、必要な数量の第１の細胞集合体を調製することができ、また、より確実に歯を形成することができる。
The epithelial tissue in the present invention can be obtained by the same method as the separation of the mesenchymal tissue. The separated epithelial tissue can be prepared in a single cell state in the same manner as the method for preparing a mesenchymal tissue into a single cell state. At this time, it is preferable to perform trypsin treatment and DNase treatment after collagenase treatment for separation of epithelial cells from epithelial tissue.
Epithelial cells can be obtained by culturing epithelial cells in a single cell state under the same conditions as the pre-culture conditions for the mesenchymal cells. By using the cultured cells, the necessary number of first cell aggregates can be prepared, and teeth can be more reliably formed.
本発明における培養細胞は、形態的、生化学的又は免疫化学的な特徴に基づいて選別し、特定の特徴を有する培養細胞として用いることもできる。これにより歯の形成効率を高めることができる。
本発明における培養細胞は、細胞株として樹立されたものであっても、初代培養細胞であってもよいが、安全性と自家移植の観点から、初代培養細胞であることが好ましい。初代培養細胞は、例えば、単一細胞状態の上皮系細胞を、ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を用い、コラーゲンコートした培養シャーレなどで１日〜１０日程度培養することで得ることができる。このときトランスフェリン、インスリン、コレラトキシン、上皮増殖因子等を適宜添加してもよい。また、培養液として市販のDefined keratinocyte serum-free medium（In vitorogen社製）などを用いてもよい。
The cultured cells in the present invention can be selected based on morphological, biochemical or immunochemical characteristics and used as cultured cells having specific characteristics. Thereby, the formation efficiency of teeth can be improved.
The cultured cell in the present invention may be a cell line established or a primary cultured cell, but is preferably a primary cultured cell from the viewpoint of safety and autotransplantation. Primary cultured cells can be obtained, for example, by culturing epithelial cells in a single cell state for about 1 to 10 days in a collagen-coated culture dish using a DMEM / F12 culture solution supplemented with FCS. . At this time, transferrin, insulin, cholera toxin, epidermal growth factor and the like may be added as appropriate. Further, a commercially available Defined keratinocyte serum-free medium (manufactured by Invitorogen) or the like may be used as the culture medium.
本発明における培養細胞は、間葉系細胞のマーカーを発現していないことが好ましい。間葉系細胞のマーカーの具体例としては、中間系フィラメントであるビメンチンを挙げることができる。また、本発明における培養細胞は、特定の上皮系細胞のマーカーを発現していることが好ましい。特定の上皮系細胞のマーカーとしては、中間系フィラメントであるサイトケラチン１４や上皮幹細胞マーカーであるｐ６３、又はＣＤ７１、β１−インテグリン、β４−インテグリン、α６−インテグリンを挙げることができる。上記マーカーは、例えば、蛍光や酵素により標識された抗マーカー抗体での免疫染色や、抗マーカー抗体と蛍光や酵素により標識された二次抗体とを用いた免疫染色を行うことでその発現を確認することができる。 The cultured cells in the present invention preferably do not express a mesenchymal cell marker. Specific examples of the mesenchymal cell marker include vimentin, which is an intermediate filament. The cultured cells in the present invention preferably express a specific epithelial cell marker. Examples of specific epithelial cell markers include cytokeratin 14 which is an intermediate filament, p63 which is an epithelial stem cell marker, CD71, β1-integrin, β4-integrin and α6-integrin. Confirmation of the expression of the marker by, for example, immunostaining with an anti-marker antibody labeled with fluorescence or an enzyme, or immunostaining with an anti-marker antibody and a secondary antibody labeled with fluorescence or an enzyme can do.
本発明で用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく、好ましくは、上記培地との混合物である。このような支持担体としては、コラーゲン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）等を挙げることができる。これらの支持担体は、細胞を内部に配置したときに配置した位置をほぼ維持可能な程度な硬さを有するものであればよく、ゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。ここで、細胞の位置を維持可能な硬さとは、通常、三次元培養として適用される硬さ、即ち、細胞の配置を保持できると共に増殖による肥大化を阻害しない硬さであればよく、容易に決定することができる。例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２．４ｍｇ／ｍｌの濃度での使用が適切な硬さを提供する。
なお、ここで支持担体は、第１及び第２の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。
The support carrier used in the present invention may be any support carrier capable of culturing cells therein, and is preferably a mixture with the above medium. As such a support carrier, collagen, fibrin, laminin, extracellular matrix mixture, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA), cell matrix (trade name), Examples include meviol gel (trade name) and matrigel (trade name). These support carriers only need to have a hardness sufficient to maintain the position at which the cells are placed inside, and examples thereof include gels, fibers, and solids. Here, the hardness that can maintain the position of the cells is usually a hardness that is applied as a three-dimensional culture, that is, a hardness that can maintain the arrangement of the cells and does not inhibit the enlargement due to proliferation. Can be determined. For example, in the case of collagen, use at a final concentration of 2.4 mg / ml provides adequate hardness.
Here, the support carrier only needs to have a thickness that allows the first and second cell aggregates to grow inside the carrier, and can be appropriately set depending on the size of the target tissue and the like. .
また、支持担体は、細胞の接触状態を保持可能であればよいが、ここでいう「接触状態」とは、各細胞集合体において、また細胞集合体間において、確実に細胞相互作用させるために高密度の状態であることが好ましい。
高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、細胞集合体の場合、細胞配置時で５×１０７〜１×１０９個／ｍｌ、細胞の活性を損なわずに確実に細胞相互作用させるため好ましくは１×１０８〜１×１０９個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０８〜８×１０８個／ｍｌの密度をいう。このような細胞密度に細胞集合体を調製するには、細胞を遠心によって凝集させ沈殿化することが細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。このような遠心は、細胞の生存を損ねない３００〜１２００×ｇ、好ましくは５００〜１０００×ｇの遠心力に該当する回転数で３〜１０分間おこなえばよい。３００×ｇよりも低い遠心では、細胞の沈殿が不十分となって細胞密度が低くなる場合があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心では細胞が損傷を受ける場合があるため、それぞれ好ましくない。
In addition, the support carrier may be any cell as long as it can maintain the contact state of the cells. The term “contact state” as used herein refers to a cell interaction in each cell assembly and between cell assemblies. A high density state is preferable.
The high density state means that the density is equivalent to the density at the time of constituting the tissue. For example, in the case of a cell aggregate, 5 × 10 7 to 1 × 10 9 cells / ml at the time of cell placement, In order to ensure cell interaction without impairing the activity, the density is preferably 1 × 10 8 to 1 × 10 9 cells / ml, most preferably 2 × 10 8 to 8 × 10 8 cells / ml. In order to prepare a cell aggregate at such a cell density, it is preferable to aggregate and precipitate cells by centrifugation because the density can be easily increased without impairing the cell activity. Such centrifugation may be performed for 3 to 10 minutes at a rotational speed corresponding to a centrifugal force of 300 to 1200 × g, preferably 500 to 1000 × g, which does not impair cell survival. Centrifugation lower than 300 × g may result in insufficient cell precipitation and lower cell density, while centrifugation higher than 1200 × g may result in cell damage, which is undesirable. .
遠心分離によって高密度の細胞を調製する場合には、通常、細胞遠心分離するために用いられるチューブ等の容器に単一細胞の懸濁液を調製した後に遠心分離し、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ取り除けばよい。このときに使用されるチューブ等の容器は、上清を完全に除去する観点から、シリコーンコートされたものであることが好ましい。 When preparing high-density cells by centrifugation, a single-cell suspension is usually prepared in a container such as a tube used for cell centrifugation, and then centrifuged to remove the cells as a precipitate. Leave as much of the supernatant as possible. The container such as a tube used at this time is preferably silicone-coated from the viewpoint of completely removing the supernatant.
遠心分離による沈殿物とした場合には、沈殿物をそのまま支持担体の内部に配置すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液、支持担体等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことを最も好ましい。このような高密度の細胞集合体では、細胞が緊密に接触しており、細胞間相互作用が効果的に発揮される。 In the case of a precipitate by centrifugation, the precipitate may be placed inside the support carrier as it is. At this time, it is preferable that components other than the target cells (for example, a culture solution, a buffer solution, a support carrier, etc.) are equal to or less than the volume of the cells and do not contain components other than the target cells. Most preferred. In such a high-density cell assembly, cells are in close contact with each other, and cell-cell interaction is effectively exhibited.
組織の状態で使用する場合には、酵素処理等を行って、対象となる細胞以外の結合組織等を除去することが好ましい。目的とする細胞以外の成分が多い場合、例えば細胞の容量と等量以上になると、細胞間相互作用が充分に発揮されないため、好ましくない。 When used in a tissue state, it is preferable to remove the connective tissue other than the target cells by performing an enzyme treatment or the like. When there are many components other than the target cell, for example, when the amount is equal to or greater than the volume of the cell, cell-cell interaction is not sufficiently exhibited, which is not preferable.
また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触は密接であるほど好ましく、第１の細胞集合体に対して第２の細胞集合体を押し付けて配置することが特に好ましい。また、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との周囲を培養液、酸素透過を阻害しない固形物で包み込むことも、細胞集合体同士の接触を密接にするのに有効であり、粘度の異なる溶液に密度の高い細胞懸濁液を入れて配置させ、溶液をそのまま固化することも、細胞の接触の保持を容易に達成できるため、好ましい。 In addition, it is preferable that the contact between the first cell aggregate and the second cell aggregate is close, and it is particularly preferable that the second cell aggregate is pressed against the first cell aggregate. In addition, wrapping the surroundings of the first cell aggregate and the second cell aggregate with a culture medium and a solid material that does not inhibit oxygen permeation is also effective for bringing the cell aggregates into close contact with each other. It is also preferable to place a cell suspension having a high density in solutions having different viscosities and solidify the solution as it is because the contact of cells can be easily maintained.
支持担体がゲル状、あるいは溶液状等の場合には、配置工程の後に支持担体を固化する固化工程を設けてもよい。固化工程によって、支持担体内部に配置された細胞が支持担体内部に固定化される。支持担体の固化には、一般に用いた支持担体の固化条件をそのまま適用すればよい。例えば支持担体にコラーゲン等の固化可能な化合物を用いた場合には、通常適用される条件で、例えば培養温度下で数分〜数十分間静置させることにより、固化することができる。これにより、支持担体内部における細胞間の結合を固定化できると共に、強固なものにすることができる。 When the support carrier is in the form of a gel or a solution, a solidification step for solidifying the support carrier may be provided after the arrangement step. By the solidification step, the cells arranged inside the support carrier are fixed inside the support carrier. For solidification of the support carrier, generally used solidification conditions for the support carrier may be applied as they are. For example, when a solidifiable compound such as collagen is used for the support carrier, it can be solidified by allowing it to stand for several minutes to several tens of minutes under the conditions usually applied, for example, at the culture temperature. As a result, it is possible to fix the bonds between the cells inside the support carrier and to make them strong.
本発明の製造方法における培養工程では、第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体を支持担体内部で培養する。この培養工程では、互いに緊密に接触された第１の細胞集合体及び第２の細胞集合体によって細胞間相互作用が効果的に行われて、組織、即ち歯が再構成される。
培養工程は、支持担体によって第１の細胞集合体と第２の細胞集合体との接触状態が維持されて行われればよく、第１及び第２の細胞集合体を有する支持担体単独による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよい。
培養期間としては、支持担体内部に配置された細胞数及び細胞集合体の状態、更には培養工程の実施条件によって異なるが、一般に、１〜３００日、エナメル質を外側に有し、象牙質を内側に有する歯を形成するためには、好ましくは１〜１２０日、迅速に提供可能とする観点からは、好ましくは１〜６０日とすることができる。更に歯周組織を備えた歯とするためには、一般に１〜３００日、好ましくは１〜６０日とすることができる。
In the culturing step in the production method of the present invention, the first cell aggregate and the second cell aggregate are cultured inside the support carrier. In this culturing step, cell-cell interaction is effectively performed by the first cell aggregate and the second cell aggregate in close contact with each other, and the tissue, that is, the tooth is reconstructed.
The culturing step may be performed by maintaining the contact state between the first cell aggregate and the second cell aggregate by the support carrier, and the culture step is performed by culturing with the support carrier alone having the first and second cell aggregates. Alternatively, it may be cultured in the presence of other animal cells.
The culture period varies depending on the number of cells arranged inside the support carrier and the state of the cell aggregate, and further the conditions of the culture process, but generally has an enamel on the outside for 1 to 300 days. In order to form the teeth on the inside, it is preferably 1 to 120 days, and preferably 1 to 60 days from the viewpoint of enabling rapid provision. Furthermore, in order to obtain a tooth having a periodontal tissue, it is generally 1 to 300 days, preferably 1 to 60 days.
支持担体のみによる培養とした場合には、動物細胞の培養に用いられる通常の条件下での培養とすることができる。ここでの培養は、一般に動物細胞での培養条件をそのまま適用すればよく、前述した条件をそのまま適用することができる。また培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが既知の各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
また、組織や細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点から器官培養を用いることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に支持担体で包埋された細胞集合体を置いて培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜には、０．３〜５μｍ程度の孔を多数有した膜であることが好ましく、具体的にはセルカルチャーインサート（商品名）、アイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
When the culture is carried out using only the support carrier, the culture can be carried out under the usual conditions used for culturing animal cells. For the culture here, generally, the culture conditions in animal cells may be applied as they are, and the conditions described above can be applied as they are. Moreover, serum derived from mammals may be added to the culture, and various cellular factors known to be effective for the growth and differentiation of these cells may be added. Examples of such cellular factors include FGF and BMP.
Moreover, it is preferable to use organ culture from the viewpoint of gas exchange and nutrient supply of tissues and cell aggregates. In organ culture, generally, a porous membrane is floated on a medium suitable for the growth of animal cells, and a cell aggregate embedded with a support carrier is placed on the membrane to perform culture. The porous membrane used here is preferably a membrane having a large number of pores of about 0.3 to 5 μm. Specifically, a cell culture insert (trade name) and an isopore filter (trade name) are used. Can be mentioned.
他の動物細胞の存在下での培養の場合には、動物細胞からの各種サイトカイン等の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができるので、好ましい。このような他の動物細胞の存在下での培養は、単離細胞や培養細胞を用いて生体外での培養によって行ってもよい。 In the case of culturing in the presence of other animal cells, teeth having a specific cell arrangement can be formed at an early stage under the action of various cytokines from animal cells. Such culture in the presence of other animal cells may be performed by in vitro culture using isolated cells or cultured cells.
また、第１及び第２の細胞集合体を有する支持担体を生体へ移植して生体内で培養を行うことが、歯及び／又は歯周組織の形成を早期に行うことができるため、特に好ましい。この場合、支持担体と共に第１及び第２の細胞集合体が生体内へ移植される。
この用途に利用可能な動物は、哺乳動物、例えばヒト、豚、マウス等を好ましく挙げることができ、歯胚組織と同一の種に由来するものであることが更に好ましい。ヒト歯胚組織を移植する場合には、ヒト、又は免疫不全に改変したヒト以外の他の哺乳動物を用いることが好ましい。このような生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるためには、腎臓皮膜下、腸間膜、皮下移植等が好ましい。
移植による成育期間としては、移植時の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に、３〜４００日とすることができる。例えば、腎臓皮膜下への移植期間は移植する培養物の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、歯の再生と移植先で発生させる歯の大きさの観点から７〜６０日間であることが好ましい。
In addition, it is particularly preferable that the support carrier having the first and second cell aggregates is transplanted into a living body and cultured in the living body because teeth and / or periodontal tissue can be formed at an early stage. . In this case, the first and second cell aggregates are transplanted into the living body together with the support carrier.
Preferred examples of animals that can be used for this purpose include mammals such as humans, pigs, mice, and the like, and it is more preferable that they are derived from the same species as the tooth germ tissue. When transplanting human tooth germ tissue, it is preferable to use humans or mammals other than humans modified to immunodeficiency. In order to generate animal cell organs and tissues as normally as possible, such biological sites suitable for in vivo growth are preferably under the kidney capsule, mesentery, subcutaneous transplantation, and the like.
The growth period by transplantation varies depending on the size at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can generally be 3 to 400 days. For example, the period of transplantation under the kidney capsule varies depending on the size of the culture to be transplanted and the size of the tooth to be regenerated, but is 7 to 60 days from the viewpoint of tooth regeneration and the size of the tooth generated at the transplant destination. It is preferable.
生体への移植を行う前に、生体外での培養（前培養）を行ってもよい。この前培養によって細胞間の結合と第１及び第２の細胞集合体同士の結合を強固にして、細胞間相互作用をより強固にすることができるため好ましい。その結果、全体の成育期間を短縮することができる。
前培養の期間は短期であっても長期であってもよい。長期間、例えば３日以上、好ましくは７日以上とした場合には、歯胚から歯芽に発生させることができるので、移植後に歯ができるまでの期間を短縮することもできるため好ましい。前培養の期間としては、例えば腎臓皮膜下へ移植を行う場合の器官培養として、好ましくは１〜７日とすることが効率よく歯を再生するために好ましい。
Prior to transplantation into a living body, in vitro culture (pre-culture) may be performed. This pre-culture is preferable because the binding between cells and the binding between the first and second cell aggregates can be strengthened and the interaction between cells can be further strengthened. As a result, the overall growth period can be shortened.
The preculture period may be short or long. A long period of time, for example, 3 days or more, preferably 7 days or more, is preferable because it can be generated from tooth germs to tooth buds, and the period until teeth are formed after transplantation can be shortened. The pre-culture period is preferably 1 to 7 days, for example, for organ culture when transplanting under the kidney capsule, in order to efficiently regenerate teeth.
本発明の製造方法によって製造された歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯としての特有の細胞配置（構造）を有するものであり、また好ましくは、更に歯の先端（歯冠）と歯根という方向性も備えているものである。少なくともこのような特有の細胞配置、好ましくは細胞配置に加えて方向性を有することによって、歯としての機能も発揮できるものである。このため、歯の代替物として広く利用することが可能である。特に、自家の歯胚に由来した間葉系細胞及び上皮系細胞を用いた場合には、拒絶反応による問題を回避しつつ使用することができる。また一般に移植抗原が適合した他人の歯胚に由来する細胞を用いる場合にも拒絶反応による問題を回避することが可能である。 The tooth manufactured by the manufacturing method of the present invention has a specific cell arrangement (structure) as a dentine inside and an enamel outside, and preferably further, the tip of the tooth (crown) It also has the direction of tooth root. By having directionality in addition to at least such a specific cell arrangement, preferably cell arrangement, it can also function as a tooth. For this reason, it can be widely used as a substitute for teeth. In particular, when mesenchymal cells and epithelial cells derived from autologous tooth germs are used, they can be used while avoiding problems due to rejection. Moreover, it is possible to avoid the problem due to rejection even when using cells derived from another person's tooth germ, which are generally compatible with the transplantation antigen.
さらに本発明では、培養期間を延長させることによって、歯そのものに加えて、歯を顎骨上で支持し、固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。この結果、移植後に実用可能な歯を提供することが可能である。 Furthermore, in the present invention, by extending the culture period, in addition to the teeth themselves, periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament can be formed to support and fix the teeth on the jawbone. As a result, it is possible to provide a usable tooth after transplantation.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、質量基準である。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Moreover,% in an Example is a mass reference | standard unless there is particular notice.
［参考例］
（歯胚間葉系細胞と歯胚上皮系細胞の調製）
歯の形成を行うために、歯胚の再構築を行った。この実験モデルとしてマウスを用いた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本クレアから購入）の胎齢１４．５日、胚仔から下顎切歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎切歯歯胚組織をＣａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で洗浄し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて１２．５分間処理した後、１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したＤＭＥＭ（Sigma, St. Louis, MO)で３回洗浄した。さらにＤＮａｓｅ Ｉ溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度７０Ｕ／ｍｌになるよう添加し歯胚組織を分散させ、２５Ｇ注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
[Reference example]
(Preparation of tooth germ mesenchymal cells and tooth germ epithelial cells)
To perform tooth formation, tooth germs were reconstructed. A mouse was used as this experimental model.
C57BL / 6N mice (purchased from Clea Japan) were born at 14.5 days, and the mandibular incisor tooth tissue was removed from the embryo by a conventional method under a microscope. Mandibular incisor tooth germ tissue was washed with Ca 2+ , Mg 2+ -free phosphate buffer (PBS (−)), and dispase II (Roche, Mannheim, Germany) at a final concentration of 1.2 U / ml in PBS (−) After treatment with an enzyme solution supplemented with 12.5 minutes at room temperature, the plate was washed three times with DMEM (Sigma, St. Louis, MO) supplemented with 10% FCS (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Furthermore, DNase I solution (Takara, Siga, Japan) was added to a final concentration of 70 U / ml to disperse the tooth germ tissue, and the tooth germ epithelial tissue was surgically treated with a 25 G injection needle (Terumo, Tokyo, Japan). Tooth germ mesenchymal tissue was isolated.
歯胚間葉系細胞は、上記により得られた歯胚間葉組織をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．２５％トリプシン （Sigma）、５０Ｕ／ｍｌのコラーゲナーゼ I （Worthington）を含むＰＢＳ（−）で３７℃、５分間処理した。１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで、細胞を３回洗浄した後、細胞に最終濃度７０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ I (Takara)を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚間葉系細胞を得た。 Tooth germ mesenchymal cells were obtained by washing the tooth germ mesenchymal tissue obtained above three times with PBS (−) and containing 0.25% trypsin (Sigma) and 50 U / ml collagenase I (Worthington). Treated with PBS (−) at 37 ° C. for 5 minutes. After washing the cells three times with DMEM supplemented with 10% FCS, DNase I (Takara) at a final concentration of 70 U / ml was added to the cells, and single tooth germ mesenchymal cells were obtained by pipetting.
一方、歯胚上皮系細胞は、上記により得られた歯胚上皮組織をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１００Ｕ／ｍｌのコラーゲナーゼ Ｉ（Worthington, Lakewood, NJ）を溶解した酵素液で３７℃にて２０分間の処理を２回繰り返した。遠心分離によって沈殿回収した細胞を、さらに０．２５％ トリプシン (Sigma)−ＰＢＳ（−）で３７℃、５分間処理した。１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで、細胞を３回洗浄した後、細胞に最終濃度７０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ溶液を添加して、ピペッティングにより単一の歯胚上皮系細胞を得た。 On the other hand, for tooth germ epithelial cells, the tooth germ epithelial tissue obtained as described above was washed three times with PBS (−), and collagenase I (Worthington, Lakewood, NJ) at a final concentration of 100 U / ml in PBS (−). The treatment for 20 minutes at 37 ° C. with the enzyme solution in which was dissolved was repeated twice. The cells collected by precipitation by centrifugation were further treated with 0.25% trypsin (Sigma) -PBS (−) at 37 ° C. for 5 minutes. After washing the cells three times with DMEM supplemented with 10% FCS, a DNase I solution having a final concentration of 70 U / ml was added to the cells, and single tooth germ epithelial cells were obtained by pipetting.
（再構成歯胚の作製）
シリコングリースを塗布した１．５ｍＬマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞を入れ、遠心分離（５８０×ｇ）により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip ０．５−２０μＬ (eppendorf) を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。
(Preparation of reconstructed tooth germ)
Place tooth germ epithelial cells suspended in DMEM (Sigma) supplemented with 10% FCS (JRH Biosciences) into a 1.5 mL microtube (Eppendorf, Hamburg, Germany) coated with silicone grease, and centrifuge (580 × g) To collect the cells as a precipitate. Remove the supernatant of the culture solution after centrifugation as much as possible, perform centrifugation again, and completely observe the culture solution remaining around the cell precipitate using GELoader Tip 0.5-20 μL (eppendorf) while observing with a stereomicroscope. The cells used for the preparation of reconstructed tooth germs were prepared.
（再構成歯胚の作製）
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。
シリコングリースを塗布した１．５ｍＬマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、遠心分離（５８０×ｇ）により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液を GELoader Tip ０．５−２０μＬ (eppendorf) を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いる細胞を準備した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュに、２．４ｍｇ/ｍｌの濃度に上記培養液で調製したCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を３０μＬ滴下してコラーゲンゲル溶液のドロップ（ゲルドロップ）を作製した。この溶液に、歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、０．１−１０μＬのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、０．２−０．３μＬアプライして、細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。次いで、先に作製した歯胚間葉系細胞の細胞凝集塊に接するように、歯胚上皮系細胞を同様の方法によりアプライして細胞凝集塊を作製し、両者が互いに密接するようにして再構成歯胚を作製した。
(Preparation of reconstructed tooth germ)
Next, tooth germ reconstruction was performed using the tooth germ epithelial cells and tooth germ mesenchymal cells prepared above.
Place tooth germ epithelial cells or tooth germ mesenchymal cells suspended in DMEM (Sigma) supplemented with 10% FCS (JRH Biosciences) in a 1.5 mL microtube (Eppendorf, Hamburg, Germany) coated with silicone grease. The cells were collected as a precipitate by centrifugation (580 × g). Remove the supernatant of the culture solution after centrifugation as much as possible, perform centrifugation again, and completely observe the culture solution remaining around the cell precipitate using GELoader Tip 0.5-20 μL (eppendorf) while observing with a stereomicroscope. The cells used for the preparation of reconstructed tooth germs were prepared.
30 μL of Cellmatrix type IA (Nitta gelatin, Osaka, Japan) prepared in the above culture solution at a concentration of 2.4 mg / ml was dropped onto a Petri dish coated with silicone grease to produce a collagen gel solution drop (gel drop). did. To this solution, 0.2 to 0.3 μL of the precipitate after centrifugation of the tooth germ mesenchymal cells was applied using a 0.1 to 10 μL pipette tip (Quality Scientific plastics), and a cell aggregate was obtained. Cell aggregates were made. Next, the tooth germ epithelial cells are applied by the same method so as to be in contact with the previously produced tooth germ mesenchymal cell clumps, and the cell clumps are made in close contact with each other. A component tooth germ was prepared.
これを、図２を参照して説明する。
ピペットチップ１６で先にゲルドロップ１０内に配置された細胞凝集塊１２は、ゲルドロップ１０内で球体を構成する（図２（Ｂ）参照）。この後に他方の細胞凝集塊１４を押し込むことによって、球体の細胞凝集塊１２がつぶされて、他方の細胞凝集塊１４を包むようになることが多い（図２（Ｃ）参照）。その後にゲルドロップ１０を固化させることにより、細胞間の結合が強固になる（図２（Ｄ）参照）。
This will be described with reference to FIG.
The cell aggregate 12 previously arranged in the gel drop 10 with the pipette tip 16 constitutes a sphere in the gel drop 10 (see FIG. 2B). By pushing the other cell aggregate 14 after this, the spherical cell aggregate 12 is often crushed and wraps around the other cell aggregate 14 (see FIG. 2C). Thereafter, the gel drop 10 is solidified, thereby strengthening the bond between cells (see FIG. 2D).
（再構成歯胚の培養）
ゲルドロップ中で作製した再構成歯胚は、ＣＯ２インキュベーターに１０分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固化し、１０％ＦＣＳ（JRH) 添加ＤＭＥＭ（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが０．４ミクロンのＰＥＴメンブレン；BD, Franklin Lakes, NJ）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、細胞凝集塊を支持担体である周囲のゲルと共に移して、１８−２４時間、器官培養した。培養後、周囲のゲルごと８週齢Ｃ５７ＢＬ／６の腎皮膜下に移植して異所的な歯の発生を進行させて、歯を作製した。
(Culture of reconstructed tooth germ)
The reconstructed tooth germ prepared in the gel drop was allowed to stand in a CO 2 incubator for 10 minutes to solidify Cellmatrix type IA (Nitta Gelatin), and cell culture insert (pore size) in DMEM (Sigma) supplemented with 10% FCS (JRH). Is transferred onto the membrane of the cell culture insert of the culture vessel set so that the 0.4 μm PET membrane (BD, Franklin Lakes, NJ) is in contact with the surrounding gel as a support carrier. Organ culture was performed for 24 hours. After culturing, the surrounding gel was transplanted under an 8 week-old C57BL / 6 renal capsule to develop ectopic teeth, and teeth were prepared.
（組織学的解析）
移植後１４日目に周囲の腎組織ごと再構成歯胚を摘出し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で６時間固定した後、４．５％のＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で２４時間脱灰し、常法によりパラフィン包埋して、１０μｍの厚さで切片化した。各切片について、組織学的解析のために常法に従い、ヘマトキシリン−エオジン染色を行った。結果を図３に示す。
(Histological analysis)
On the 14th day after transplantation, the reconstructed tooth germ was removed together with the surrounding kidney tissue, fixed with 4% paraformaldehyde-phosphate buffer for 6 hours, and then removed with 4.5% EDTA (pH 7.2) for 24 hours. Ashed, embedded in paraffin by a conventional method, and sectioned at a thickness of 10 μm. Each section was stained with hematoxylin-eosin according to a conventional method for histological analysis. The results are shown in FIG.
図３に示されているように、間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体とを区画化して密着させることにより、内側に象牙質、外側にエナメル質を有する特有の細胞配置を備えた歯が４本形成されていることがわかる。 As shown in FIG. 3, the mesenchymal cell aggregate and the epithelial cell aggregate were partitioned and brought into close contact with each other to have a specific cell arrangement having dentin on the inside and enamel on the outside. It can be seen that four teeth are formed.
［実施例１〜２及び比較例１〜２］
（１）口腔内上皮組織からの初代培養細胞の取得
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（３〜６週齢、日本クレアから購入）の口腔内、頬内面の粘膜組織及び舌組織をそれぞれ摘出し、Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で数回洗浄した。口腔内粘膜組織は、メスで細切し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて１５分間処理した後、粘膜上皮組織をピンセットで選別した。一方、舌組織は、舌上皮組織と中央部の筋肉組織の間に、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液を注射器で注入し、１０から２０分間処理した後、舌の上皮組織と筋肉組織をピンセットで分離した後、上皮組織をメスで細切した。それぞれの上皮組織から、上皮細胞をマイクロチップでピペッティングすることにより分散させ、それぞれ１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences, Lenexa, KS)、ペニシリン（３１μｇ／ｍｌ, Sigma）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ, Sigma)、トランスフェリン（T; １０μｇ／ｍｌ, Sigma）、インスリン（I; １０μｇ／ｍｌ, Sigma）、コレラトキシン（C;１０ｎｇ／ｍｌ, Sigma）を添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium とHam’s nutrient F-12 の１対１の混合溶液であるＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma, Chemical Company, St. Lois, MO）培養液に分散し、コラーゲンコートした培養シャーレに播種した。５日から２週間程度の培養で、上皮細胞が増殖し、コロニーを形成した。その後、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ（Sigma）を含むＰＢＳ（−）溶液で３７℃にて１５分間処理し、上皮細胞をシャーレから剥離して、粘膜上皮組織由来の初代培養細胞懸濁液と舌上皮組織由来の初代培養細胞懸濁液とをそれぞれ調製した。
[Examples 1-2 and Comparative Examples 1-2]
(1) Acquisition of primary cultured cells from oral epithelial tissue The mucosal tissue and tongue tissue of the oral cavity and buccal lining of C57BL / 6N mice (3 to 6 weeks old, purchased from CLEA Japan, Inc.) were respectively removed, Ca 2+ , The plate was washed several times with Mg 2+ -free phosphate buffer (PBS (−)). The oral mucosal tissue is minced with a scalpel and treated with an enzyme solution containing dispase II (Roche, Mannheim, Germany) with a final concentration of 1.2 U / ml in PBS (-) for 15 minutes at room temperature. The epithelial tissue was selected with tweezers. On the other hand, for the tongue tissue, an enzyme solution with a final concentration of 1.2 U / ml dispase II (Roche, Mannheim, Germany) added to PBS (-) is injected between the tongue epithelial tissue and the central muscle tissue with a syringe. After treatment for 10 to 20 minutes, the epithelial tissue and muscle tissue of the tongue were separated with tweezers, and then the epithelial tissue was minced with a scalpel. From each epithelial tissue, epithelial cells were dispersed by pipetting with a microchip, and 10% FCS (JRH Biosciences, Lenexa, KS), penicillin (31 μg / ml, Sigma), streptomycin (50 μg / ml, Sigma), respectively. , Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient F-12 supplemented with transferrin (T; 10 μg / ml, Sigma), insulin (I; 10 μg / ml, Sigma), and cholera toxin (C; 10 ng / ml, Sigma) 1 was dispersed in a culture solution of DMEM / F12 (Sigma, Chemical Company, St. Lois, MO), which was a mixed solution of No. 1, and seeded in a culture dish coated with collagen. Epithelial cells proliferated and formed colonies in the culture for about 2 weeks from 5 days. Thereafter, the cells were treated with a PBS (−) solution containing 0.05% trypsin-0.02% EDTA (Sigma) at 37 ° C. for 15 minutes, the epithelial cells were detached from the petri dish, and primary cultured cells derived from mucosal epithelial tissue. Suspension and primary cultured cell suspension derived from tongue epithelial tissue were prepared respectively.
上記により得られた、口腔粘膜上皮組織及び舌上皮組織から得られたそれぞれの上皮系初代培養細胞の代表的な位相差顕微鏡像を、図４に示した。いずれの細胞においても、数日間程度の培養において上皮系細胞のコロニーが形成され、形態的に複数種の細胞が認められた。
これらのコロニーを、間葉系細胞のマーカーとなる中間系フィラメントのビメンチンについて、抗ビメンチン抗体（Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany）とＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ血清（MP Biomedicals, Ohio, USA）とを用いて免疫染色を行ったところ、いずれの上皮系細胞においてもビメンチン陽性の間葉細胞のコロニーは認められなかった。また上皮系細胞のマーカーであるサイトケラチン１４（ＣＫ１４）とサイトケラチン１８（ＣＫ１８）について、抗ＣＫ１４抗体（Serotec, Oxford, UK）又は抗ＣＫ１８抗体（Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany）とＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ血清（MP Biomedicals, Ohio, USA）とを用いて免疫染色を行ったところ、口腔粘膜上皮系細胞ではそのほとんどがＣＫ１４陽性細胞であり、一方、舌上皮系細胞の場合には、ＣＫ１４又はＣＫ１８陽性のコロニー、及びその両方とも陽性のコロニーが存在した。これらのことから、上記方法によって、いずれの上皮組織からも上皮系初代培養細胞を取得することが可能であり、それぞれの上皮系初代培養細胞には複数種類の上皮系初代培養細胞が存在した。
Representative phase contrast microscopic images of the respective epithelial primary cultured cells obtained from the oral mucosa epithelial tissue and tongue epithelial tissue obtained as described above are shown in FIG. In any of the cells, colonies of epithelial cells were formed in culture for several days, and a plurality of types of cells were recognized morphologically.
These colonies were treated with anti-vimentin antibody (Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany) and FITC-conjugated anti-mouse IgG serum (MP Biomedicals, Ohio, USA) for vimentin, an intermediate filament that serves as a marker for mesenchymal cells. When immunostaining was performed, no vimentin-positive mesenchymal cell colonies were observed in any of the epithelial cells. In addition, cytokeratin 14 (CK14) and cytokeratin 18 (CK18), which are markers of epithelial cells, are combined with anti-CK14 antibody (Serotec, Oxford, UK) or anti-CK18 antibody (Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany) and FITC-conjugated anti-antibody. When immunostaining was performed using mouse IgG serum (MP Biomedicals, Ohio, USA), most oral mucosal epithelial cells were CK14-positive cells, whereas in the case of tongue epithelial cells, CK14 or There were CK18 positive colonies, and both positive colonies. From these facts, it was possible to obtain epithelial primary cultured cells from any epithelial tissue by the above method, and each epithelial primary cultured cell had a plurality of types of epithelial primary cultured cells.
（２）歯胚間葉組織の取得
参考例と同様にして、歯胚組織から歯胚間葉組織を分離した。
(2) Acquisition of tooth germ mesenchymal tissue In the same manner as in the reference example, the tooth germ mesenchymal tissue was separated from the tooth germ tissue.
（３）再構成歯胚の作製
次に、上記で調製された口腔粘膜上皮組織由来の初代培養細胞（実施例１）又は舌上皮組織由来の初代培養細胞（実施例２）と、歯胚間葉組織とを用いて、歯胚再構築を行った。
参考例と同様にして、口腔粘膜上皮組織由来の初代培養細胞又は舌上皮組織由来の初代培養細胞を用いて、第1の細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。
歯胚間葉組織をゲルドロップ中に移した後、上記細胞凝集塊に、歯胚間葉組織の歯胚における組織境界面側を、タングステン針を用いて細胞凝集塊に密着させて再構成歯胚を作製した。
(3) Production of Reconstructed Tooth Germ Next, the primary cultured cells derived from oral mucosa epithelial tissue (Example 1) or the primary cultured cells derived from tongue epithelial tissue (Example 2) prepared above, and between tooth germs Tooth germ reconstruction was performed using the leaf tissue.
In the same manner as in the Reference Example, a cell aggregate as a first cell aggregate was prepared using primary cultured cells derived from oral mucosal epithelial tissue or primary cultured cells derived from tongue epithelial tissue.
After transferring the tooth germ mesenchymal tissue into the gel drop, the tissue boundary surface side of the tooth germ of the tooth germ mesenchymal tissue is brought into close contact with the cell aggregate using a tungsten needle to reconstruct the tooth. Embryos were produced.
また比較例としては、歯胚組織をそのまま腎皮膜下に移植したもの（比較例１）と、歯胚から分離した上皮組織と間葉組織を用いて再構成歯胚を作製して移植したもの（比較例２）を、それぞれ上記と同様にして調製した。 In addition, as comparative examples, a tooth germ tissue transplanted directly under the renal capsule (Comparative Example 1), and a reconstructed tooth germ prepared using an epithelial tissue and a mesenchymal tissue separated from the tooth germ and transplanted (Comparative Example 2) was prepared in the same manner as above.
参考例と同様にして、再構成歯胚を培養して歯を作製し、組織学的解析を行った。実施例１及び２の結果を図５に、比較例１及び２の結果を図６に示す。 In the same manner as in the reference example, the reconstructed tooth germ was cultured to prepare teeth, and histological analysis was performed. The results of Examples 1 and 2 are shown in FIG. 5, and the results of Comparative Examples 1 and 2 are shown in FIG.
口腔粘膜上皮組織（実施例１）又は舌上皮組織（実施例２）に由来する上皮系初代培養細胞と歯胚間葉組織を用いた再構成歯胚を腎臓皮膜下へ移植した場合には、図５に示されるように、歯胚をそのまま移植して得られた正常発生のもの（図６（１））と同様の歯を発生させることがわかる。口腔粘膜上皮組織又は舌上皮組織のいずれに由来する上皮系初代培養細胞であってもエナメル質及び象牙質がそれぞれ外側及び内側に配置され、歯冠と歯根を有する歯としての特徴的な構造を有する歯を発生させることが可能であった。 When the reconstructed tooth germ using the epithelial primary culture cells derived from the oral mucosa epithelial tissue (Example 1) or the tongue epithelial tissue (Example 2) and the tooth germ mesenchymal tissue is transplanted under the kidney capsule, As shown in FIG. 5, it can be seen that the same tooth as that of a normal development obtained by transplanting a tooth germ as it is (FIG. 6 (1)) is generated. Even in epithelial primary cultured cells derived from oral mucosal epithelial tissue or tongue epithelial tissue, enamel and dentin are arranged on the outside and inside, respectively, and have a characteristic structure as a tooth having a crown and a root It was possible to generate teeth with.
摘出された歯胚のまま腎皮膜下移植を行った比較例１では、図６（１）に示されるように、歯胚を構成している間葉系細胞と上皮系細胞との細胞間相互作用が損なわれないため、上皮系細胞に由来するエナメル質、間葉系細胞に由来する象牙質と歯髄が形成されており、エナメル質及び象牙質を所定の位置に配置すると共に、歯先端部と歯根を有する歯が形成された。 In Comparative Example 1, in which the sub-renal capsule was transplanted with the extracted tooth germ, as shown in FIG. 6 (1), the intercellular relationship between the mesenchymal cells and the epithelial cells constituting the tooth germ. Since the action is not impaired, enamel derived from epithelial cells, dentine derived from mesenchymal cells and dental pulp are formed, and the enamel and dentin are placed in a predetermined position and the tip of the tooth And teeth with roots were formed.
歯胚上皮系細胞に歯胚間葉組織を組み合わせて再構成歯胚を作製した比較例２の場合（図６（２）参照）には、それぞれ、内側に象牙質及び外側にエナメル質を有する特有の細胞配置を備えた歯を、１４日の期間で腎皮膜下移植により発生させることができた。ここで得られた歯は、歯胚をそのまま移植して得られた正常発生のもの（図６（１））と同様の歯を再構成できることが示された。 In the case of Comparative Example 2 in which a reconstructed tooth germ was prepared by combining tooth germ epithelial cells with a tooth germ mesenchymal tissue (see FIG. 6 (2)), each has dentin on the inside and enamel on the outside. Teeth with unique cell placement could be generated by subrenal transplantation for a period of 14 days. It was shown that the teeth obtained here can reconstruct the same teeth as those of normal development obtained by transplanting a tooth germ as it is (FIG. 6 (1)).
［実施例３］
（１）クローニングと細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡのハイブリッドである胎齢１８日のｐ５３ノックアウトマウスから、口腔粘膜組織を摘出した。この組織をＣａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で数回洗浄した。口腔内粘膜組織は、メスで細切し、ＰＢＳ（−）に最終濃度１．２Ｕ／ｍｌのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて１５分間処理した後、粘膜上皮組織をピンセットで選別した。上皮組織から、上皮細胞をマイクロチップでピペッティングすることにより分散させ、それぞれ１０％ＦＣＳ（HyClone, Utah, USA)、ペニシリン（３１μｇ／ｍｌ, Sigma）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ, Sigma)、トランスフェリン（T; １０μｇ／ｍｌ, Sigma）、インスリン（I; １０μｇ／ｍｌ, Sigma）、コレラトキシン（C;１０ｎｇ／ｍｌ, Sigma）を添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium とHam’s nutrient F-12 の１対１の混合溶液であるＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma, Chemical Company, St. Lois, MO）培養液に分散し、組織培養シャーレ又はコラーゲンコートした培養シャーレに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）にて培養した。その後、限界希釈して増殖したコロニーの中で、均質な形態を有するコロニーを位相差顕微鏡下で選別し、マイクロピペットのチップで機械的に剥離させることで、単一のクローンに由来する細胞株を単離した。単離した細胞を２４穴培養プレートに移して同様の条件で培養し、高細胞密度になったところで０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡにて処理し、１００〜３００個の細胞を再播種した。この継代操作を数回繰り返して、組織培養シャーレに播種した細胞からoe系列の上皮系培養細胞株（oe5, oe7, oe1c2, oe2d1, oe2i）を、コラーゲンコートした培養シャーレに播種した細胞からbm系列の上皮系培養細胞株（bm4a5, bm6bg, bm6b3b）をそれぞれ得た。上皮系培養細胞株の代表的な位相差顕微鏡像を図７に示す。
また、歯胚上皮組織を用い、上記と同様にして、歯胚由来の上皮系培養細胞株（de1〜de5）を得た。
[Example 3]
(1) Cloning and cell culture Oral mucosal tissue was excised from a p53 knockout mouse of embryonic day 18 which is a hybrid of C57BL / 6 and CBA. The tissue was washed several times with Ca 2+ and Mg 2+ -free phosphate buffer (PBS (−)). The oral mucosal tissue is minced with a scalpel and treated with an enzyme solution containing dispase II (Roche, Mannheim, Germany) with a final concentration of 1.2 U / ml in PBS (-) for 15 minutes at room temperature. The epithelial tissue was selected with tweezers. Epithelial cells were dispersed from the epithelial tissue by pipetting with a microchip, and 10% FCS (HyClone, Utah, USA), penicillin (31 μg / ml, Sigma), streptomycin (50 μg / ml, Sigma), transferrin ( One-to-one mixing of Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient F-12 supplemented with T (10 μg / ml, Sigma), insulin (I; 10 μg / ml, Sigma), and cholera toxin (C; 10 ng / ml, Sigma) Disperse in a DMEM / F12 (Sigma, Chemical Company, St. Lois, MO) culture solution as a solution, inoculate in a tissue culture petri dish or a collagen-coated culture petri dish, and place in a 37 ° C. CO 2 incubator (5% CO 2 ). And cultured. Then, among the colonies grown by limiting dilution, colonies with a homogeneous morphology are selected under a phase contrast microscope and mechanically detached with a micropipette tip, so that a cell line derived from a single clone Was isolated. The isolated cells are transferred to a 24-well culture plate and cultured under the same conditions. When the cell density becomes high, the cells are treated with 0.05% trypsin-0.02% EDTA, and 100 to 300 cells are re-applied. Sowing. This subculture was repeated several times, and oe-series epithelial cell lines (oe5, oe7, oe1c2, oe2d1, oe2i) were transferred from cells seeded in tissue culture dishes to bm from cells seeded in collagen-coated culture dishes. Lineage epithelial cell lines (bm4a5, bm6bg, bm6b3b) were obtained, respectively. A typical phase contrast microscopic image of the epithelial cell line is shown in FIG.
In addition, tooth germ-derived epithelial cell lines (de1 to de5) were obtained using tooth germ epithelial tissue in the same manner as described above.
（２）細胞分析
（ａ）免疫細胞化学染色
上記により得られた細胞株について、二次抗体としてＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ血清を用い、一次抗体として抗サイトケラチン１８（ＣＫ１８）（Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany）、抗ビメンチン（Progen）、抗サイトケラチン１０（ＣＫ１０）（1/10; Progen）、抗サイトケラチン１３（ＣＫ１３）（1/10; Progen）、抗サイトケラチン１４（ＣＫ１４）（1/100; Serotec, Oxford, UK）、抗ｐ６３（4A4, 1/100; Calbiochem, Damstadt, Germany）のそれぞれの抗体を用いて、実施例１と同様にして免疫染色を行った。結果を表１に示す。
(2) Cell analysis (a) Immunocytochemical staining For the cell line obtained above, FITC-conjugated anti-mouse IgG serum was used as the secondary antibody, and anti-cytokeratin 18 (CK18) (Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg as the primary antibody). Germany), anti-vimentin (Progen), anti-cytokeratin 10 (CK10) (1/10; Progen), anti-cytokeratin 13 (CK13) (1/10; Progen), anti-cytokeratin 14 (CK14) (1 / 100; Serotec, Oxford, UK) and anti-p63 (4A4, 1/100; Calbiochem, Damstadt, Germany) were used for immunostaining in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.
（ｂ）免疫ブロット分析
上記により得られた細胞株について、常法によりタンパク質を抽出し、それぞれのサンプルに５０μｇのタンパク質が含まれるように調製した。一次抗体として抗ＣＫ１８、抗ＣＫ１４、抗ビメンチンのそれぞれの抗体を用い、二次抗体としてホースラディッシュ過酸化酵素結合抗体（1/5000, MP Biomedicals）を用いて常法により化学発光分析を行った。結果を表１に示す。
(B) Immunoblot analysis For the cell lines obtained as described above, proteins were extracted by a conventional method and prepared so that 50 μg of protein was contained in each sample. Chemiluminescence analysis was performed by a conventional method using anti-CK18, anti-CK14, and anti-vimentin antibodies as primary antibodies and a horseradish peroxidase-conjugated antibody (1/5000, MP Biomedicals) as secondary antibodies. The results are shown in Table 1.
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
上記により得られた細胞株（oe2, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b）及び歯胚上皮細胞株（de3）から、それぞれ全ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＤ７１、β１−インテグリン、β４−インテグリン、α６−インテグリン、アメロジェニン、ｍＢＤ１、プレキシンＡ１〜Ａ４及びＧＡＰＤＨの各遺伝子の発現の有無を確認した。尚、ＰＣＲに用いたそれぞれのプライマー対（配列番号１〜２２）を表２に示す。
(3) RT-PCR
Total RNA was extracted from the cell lines (oe2, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b) and the tooth germ epithelial cell line (de3) obtained as described above, and cDNA was prepared by a conventional method. PCR was performed using this cDNA as a template, and the presence or absence of expression of each gene of CD71, β1-integrin, β4-integrin, α6-integrin, amelogenin, mBD1, plexins A1 to A4 and GAPDH was confirmed. Each primer pair (SEQ ID NOs: 1-22) used for PCR is shown in Table 2.
未分化上皮系のマーカー遺伝子であるＣＤ７１、β１−インテグリン、β４−インテグリン及びα６−インテグリンの発現については、すべての細胞株で発現が認められ、細胞株間で発現の差異は認められなかった。また、粘膜上皮細胞に特異的なマーカー遺伝子であるｍＢＤ１は、口腔上皮粘膜組織由来の細胞株（oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg）にのみ発現が認められた。また、エナメル芽細胞に特異的マーカー遺伝子であるアメロジェニンは、歯胚上皮組織由来の細胞株（de3）にのみ発現が認められた。
プレキシンＡ１は、すべての細胞株（oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b, de3）で発現が認められ、プレキシンＡ４はすべての細胞株（oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b, de3）で発現が認められなかった。また、プレキシンＡ２及びＡ３については、口腔上皮粘膜組織由来の細胞株（oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b）で発現が認められ、歯胚上皮組織由来の細胞株（de3）では発現が認められなかった。
Regarding expression of CD71, β1-integrin, β4-integrin and α6-integrin, which are marker genes of undifferentiated epithelial system, expression was observed in all cell lines, and no difference in expression was observed between the cell lines. In addition, expression of mBD1, a marker gene specific for mucosal epithelial cells, was observed only in cell lines derived from oral epithelial mucosal tissues (oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg). In addition, amelogenin, which is a specific marker gene for enamel blasts, was only expressed in the tooth germ epithelial tissue-derived cell line (de3).
Plexin A1 is expressed in all cell lines (oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b, de3), and plexin A4 is expressed in all cell lines (oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6bg, bm6b3, de3) ) Was not observed. Plexins A2 and A3 are expressed in oral epithelial mucosal tissue-derived cell lines (oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b) and expressed in tooth germ epithelial tissue-derived cell lines (de3). I was not able to admit.
（４）再構成歯胚の作製
次に、口腔粘膜上皮組織由来の細胞株（oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b）及び歯胚上皮組織由来の細胞株（de1〜de5）と、ＣＤ−１マウス（胎齢１６．５日）の下顎第一臼歯の歯胚から分離した歯胚間葉組織とを用いて、歯胚再構築を行った。
参考例と同様にして、口腔粘膜上皮組織由来の細胞株及び歯胚上皮由来の細胞株を用いて、第1の細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。
上記細胞凝集塊を用い、実施例１と同様にして再構成歯胚を作製した。
得られた再構成歯胚を、参考例と同様に培養して歯を作製し、組織学的解析を行った。結果を図８に示す。また、再構成歯胚によって作製できた歯の数を表３に示す。
(4) Preparation of reconstructed tooth germ Next, cell lines derived from oral mucosal epithelial tissues (oe5, oe7, oe2i, bm4a5, bm6bg, bm6b3b), cell lines derived from tooth germ epithelial tissues (de1-de5), CD Tooth germ reconstruction was performed using a tooth germ mesenchymal tissue isolated from a tooth germ of a mandibular first molar of -1 mouse (embryonic age 16.5 days).
Similarly to the reference example, a cell aggregate as a first cell aggregate was prepared using a cell line derived from oral mucosa epithelial tissue and a cell line derived from tooth germ epithelium.
A reconstructed tooth germ was prepared in the same manner as in Example 1 using the cell aggregate.
The obtained reconstructed tooth germ was cultured in the same manner as in the reference example to prepare teeth, and histological analysis was performed. The results are shown in FIG. In addition, Table 3 shows the number of teeth that can be produced by the reconstructed tooth germ.
表３において、「total」は実験の総サンプル数、「tooth」は実験によって歯を形成したサンプル数、「others」は歯以外の骨などの組織を形成したサンプル数を意味する。また、「dental epi.」は歯胚上皮組織由来細胞株、「oral epi.」は口腔粘膜由来上皮系細胞株を意味する。 In Table 3, “total” means the total number of samples in the experiment, “tooth” means the number of samples in which teeth are formed by the experiment, and “others” means the number of samples in which tissues such as bones other than teeth are formed. “Dental epi.” Means a tooth germ epithelial tissue-derived cell line, and “oral epi.” Means an oral mucosa-derived epithelial cell line.
上皮系初代培養細胞に代えて、上皮系細胞株を用いた場合でも、歯が製造できることが分かる。 It can be seen that teeth can be manufactured even when an epithelial cell line is used instead of the epithelial primary cultured cells.
１０ ゲルパック（支持担体）
１２ 細胞凝集塊（第１の細胞集合体）
１４ 細胞凝集塊（第２の細胞集合体）
１６ ピペットチップ
10 Gel pack (support carrier)
12 Cell aggregate (first cell aggregate)
14 Cell aggregate (second cell aggregate)
16 Pipette tips
Claims (7)
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する培養工程と、
を含む歯の製造方法。 A first cell substantially comprising a cultured cell derived from at least one epithelial tissue selected from the group consisting of an oral mucosal epithelial tissue, a tongue epithelial tissue, and a gingival epithelial tissue inside a gel as a support carrier An arrangement step of placing the aggregate in contact with a second cell aggregate substantially consisting of mesenchymal cells derived from a tooth germ; and
A culture step of culturing the first and second cell aggregates inside the support carrier;
A method of manufacturing a tooth including
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