JP2005245288A - 培養観察方法および倒立顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 培養液の中の細胞を良好に、しかも長時間観察することを可能とする。
【解決手段】 容器３０の中の細胞を培養しながら観察する培養観察方法において、容器３０内の細胞を観察するための対物レンズ８の先端部と容器３０の底面との間を潮解性を有する物質の水溶液５１で満たし、該潮解性を有する物質の水溶液５１を介して対物レンズ８で観察する培養観察方法を提供する。
【選択図】 図４

Description

本発明は、細胞の培養観察のための培養観察方法、および、それに用いる倒立顕微鏡に関するものである。

従来、細胞を観察する手段として、倒立顕微鏡がよく知られている。倒立顕微鏡は、例えば、特許文献１に開示されているように、細胞を載せたカバーガラスの下方から対物レンズで観察するものである。また、高ＮＡの対物レンズを使用する際には、その解像を高めるために、対物レンズの先端部とカバーガラスの下面との間にイマ−ジョンオイルを満たした状態で観察が行われる。

また、このような培養中の細胞を観察する場合においては、容器内の細胞を所定の温度に維持することが一般的である。このような場合においては、容器にヒータを取り付け、このヒータからの熱により細胞の温度を一定に維持している。
特開２００１−２７２６０６号公報（段落００２３等）

しかしながら、特許文献１に記載されているように対物レンズとカバーガラスとの間にイマ−ジョンオイルを満たした場合、観察したい細胞がカバーガラスの上面から離れた位置にあると、細胞とカバーガラスとの間に培養液が存在することになる。この培養液の屈折率はほぼ水の屈折率（約１．３３）に等しいので、イマ−ジョンオイルの屈折率（約１．５２）と培養液の屈折率との差が大きくなり、収差が発生してしまい、良好な観察を行うことができないという不都合がある。

このような場合の対策としては、イマージョンオイルの代わりに水を使用することが考えられる。水と培養液の屈折率の差は小さく、その分、収差の発生を抑えることができる。しかし、水を使う場合は、長時間連続的に観察すると、水自体が蒸発してしまう可能性がある。また、上述したように、培養液を一定温度に保ちながら観察する場合においては、ヒータの熱により、より顕著に水が蒸発してしまう可能性がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養液の中の細胞を良好に、しかも長時間観察することが可能な培養観察方法および倒立顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、容器の中の細胞を培養しながら観察する培養観察方法において、前記容器内の細胞を観察するための対物レンズの先端部と前記容器の底面との間を潮解性を有する物質の水溶液で満たし、該潮解性を有する物質の水溶液を介して前記対物レンズで観察する培養観察方法を提供する。

上記発明においては、前記潮解性を有する物質が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、水酸化ナトリウムまたはエチルアルコールであることが好ましい。
また、上記発明においては、前記潮解性を有する物質の水溶液の濃度が、１ｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましい。
さらに、上記発明においては、前記対物レンズの周囲を加湿しながら観察することとしてもよい。

また、本発明は、容器の中の細胞を培養しながら観察する倒立顕微鏡において、前記細胞を照明する照明光学系と、前記容器を収容し、その内部の湿度および温度を所定の値に維持する細胞活性維持装置と、前記容器の底面との間に間隔をあけて配置された先端部を備え、該先端部と前記容器の底面との間に潮解性を有する物質の水溶液を満たした状態に保持する対物レンズとを備える倒立顕微鏡を提供する。

上記発明においては、前記対物レンズの先端部に配置され、前記潮解性を有する物質の水溶液を、前記容器の底面との間に満たした状態に保持する受け部材を備えることとしてもよい。
また、前記細胞活性維持装置が、前記容器を載置して該容器の底面の少なくとも一部を露出させる開口部を有する載置部材と、該載置部材を加温する加温手段と、前記載置部材の周囲を取り囲む周壁部と、該周壁部の内側に配置され水を溜める水槽と、該水槽に炭酸ガスを供給するガス供給手段と、前記載置部材と前記周壁部とに囲まれる空間を密閉状態に覆う透明な被覆部材と、この被覆部材を保温する保温手段とを備えることとしてもよい。

本発明によれば、培養観察において、長時間にわたり良好に培養観察を行うことができるという効果を奏する。

（第１実施形態）
以下、本発明の第１実施形態に係る培養観察方法と倒立顕微鏡について図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る倒立顕微鏡１は、図１〜図３に示されるように、落射照明の光源としてのキセノンランプ２と、このキセノンランプ２の射出側に配置され、制御装置３により制御される電動シャッタ４と、この電動シャッタ４の射出側に配置され、電動シャッタ４を通過した光線の強度を弱めるための減光フィルタ５と、この減光フィルタ５の射出側に配置される視野絞り６と、この視野絞り６の射出側に配置され、光軸を９０度偏向させるためのミラーユニット７と、このミラーユニット７の射出側に設けられ、図示しないレボルバにより光軸から退避自在な対物レンズ８とを備えている。

ミラーユニット７は、入射側（キセノンランプ側）に励起フィルタ９と、この励起フィルタ９により励起された光線を反射し、対物レンズ８からの蛍光を透過するダイクロイックミラー１０と、このダイクロイックミラー１０を透過し不必要な光線を吸収する吸収フィルタ１１とを備えている。
また、ミラーユニット７に備えられた吸収フィルタ１１の射出側には、該吸収フィルタ１１を透過した光を撮像する冷却ＣＣＤカメラ１２が配置されている。
さらに、本実施形態に係る倒立顕微鏡１は、透過照明の光源としてのハロゲンランプ２０と、このハロゲンランプ２０の射出側に、制御装置３により制御される電動シャッタ２１と、この電動シャッタ２１の射出側に配置されるコンデンサ２２とを備えている。

さらに、本実施形態に係る倒立顕微鏡１は、対物レンズ８の近傍に、容器３０内の細胞の活性を維持するための細胞活性維持装置３１を備えている。この細胞活性維持装置３１は、図２および図３に示すように、容器３０を載置する中央部に開口部３２を有する載置部材３３と、この載置部材３３の周囲を囲む周壁部３４と、この周壁部３４に保持されて、内部に水を溜めるためのドーナツ状の水槽３５と、この水槽３５に図示しない供給装置からの炭酸ガスを供給するための供給チューブ３６と、載置部材３３の温度を温め容器３０内を３７℃前後に保つためのサーモプレート３７と、載置部材３３と周壁部３４とで内部を密閉し、図示しない電熱線を装備し内部を暖めるためのガラス製のトップヒータ３８とを備えている。炭酸ガスは、濃度が５％、流量が１５０ｍｌ／ｍｉｎの目安で供給装置から供給されるようになっている。

さらに、対物レンズ８には、その先端部の外周を覆うリング状の対物レンズヒータ３９が装着されている。
容器３０は、図４に示すように、カバーガラス厚を０．１７ｍｍとして設計した高ＮＡの対物レンズに対応するために、その底面の中央部が、０．１７ｍｍの厚さに形成されている。

また、対物レンズ８の先端部と容器の底面との間には、潮解性を有する物質の水溶液（以下、潮解性水溶液とする。）５１が配置されている。この潮解性水溶液５１は、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、水酸化ナトリウムまたはエチルアルコールのいずれかを水に溶かし込んで生成されたものであり、水とほぼ同じ屈折率を有する。また、潮解性水溶液５１は実験の結果、常温に２日以上放置しても蒸発せず、通常の水と比べて蒸発し難いという性質が判明した。

このように構成された本実施形態に係る倒立顕微鏡の作用について説明する。
落射照明の場合においては、キセノンランプ２から発せられた光は、ミラーユニット７で９０°に偏向されて対物レンズ８に入射する。この対物レンズ８を通過した光は、潮解性水溶液５１を透過して容器３０内の細胞に照射される。細胞において反射された光は、再度潮解性水溶液５１を通過し、ミラーユニット７を通過した後、冷却ＣＣＤカメラ１２に入射する。

一方、透過照明の場合においては、ハロゲンランプ２０から発せられた光は、コンデンサ２２を通過し、容器３０内の細胞に照射される。細胞において反射された光は、潮解性水溶液５１を通過し、ミラーユニット７を通過した後に、冷却ＣＣＤカメラ１２に入射する。

細胞活性維持装置３１では、サーモプレート３７およびトップヒータ３８からの熱が容器３０に伝導し、容器３０内の細胞を約３７℃に保温する。また、対物レンズヒータ３９からの熱により対物レンズ８が温められる。
水が溜められている水槽３５には、供給チューブ３６から濃度５％の炭酸ガスが流量１５０ｍｌ／ｍｉｎで供給され、細胞活性維持装置３１の内部を高湿度に維持している。

このように構成された第１の実施の形態に係る培養観察方法と倒立顕微鏡の効果について以下に説明する。
本発明の第１の実施形態に係る培養観察方法は、潮解性水溶液５１を介して細胞を観察するので、容器３０の底面から離れた位置に観察したい細胞が位置する場合であっても、イマージョンオイルを使用した場合に比べて、収差の発生が抑えられるので、良好な観察を行うことができる。

また、潮解性水溶液５１は、水と比べて蒸発し難いので、水に比べて長時間連続的に観察を行うことができる。
さらに、潮解性水溶液５１は、イマージョンオイルに比べて、熱伝導率が小さいので、サーモプレート３７等からの熱を対物レンズ８側に伝導し難く、効率的に細胞の保温を行うことができる。

また、本実施形態に係る倒立顕微鏡によれば、炭酸ガスの供給により、細胞活性維持装置３１の内部を高湿度に維持することができる。このため、培養液のｐＨを所望の値に維
持することができる。
さらに、本実施形態に係る倒立顕微鏡によれば、容器３０および対物レンズ８をサーモプレート３７および対物レンズヒータ３９を用いているので、各部位の温度を一定にすることができる。このために、対物レンズ８等の温度変化による極微量の対物レンズ８と細
胞との距離の変化によるピントずれを抑えることができるという効果がある。

（第２実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態に係る倒立顕微鏡について、図５を用いて説明する。
本実施形態に係る倒立顕微鏡は、第１の実施形態に係る倒立顕微鏡を、潮解性水溶液５１が対物レンズ８側に流れ出さないように改善したものであり、第１の実施形態に係る倒立顕微鏡と異なる部分のみ説明する。

図５に示すように、本実施形態に係る倒立顕微鏡は、対物レンズ８の先端部に、受け部材６０を備えている。この受け部材６０は、全体がゴム等の弾性部材により構成されており、対物レンズ８の先端部に取り付けるための円筒状の取付部６１と、この取付部６１から対物レンズ８の先端部の形状に沿って先端側に延出する延出部６２とを有している。延出部６２の先端部には、対物レンズの有効径に邪魔にならない程度の開口部６３が設けられている。また、この開口部６３には、潮解性水溶液を受けるための壁部６４が形成されている。

このように構成された本実施形態に係る倒立顕微鏡によれば、対物レンズ８の先端部と容器の底面との間の潮解性水溶液５１は、壁部６４により対物レンズ８側に流れ出さず、対物レンズ８の先端部と底面との間に介在された状態に保持される。
したがって、本実施形態に係る倒立顕微鏡によれば、第１の実施形態に係る倒立顕微鏡と同様の効果に加えて、潮解性水溶液５１が対物レンズ８側に流れ出すことが防止され、さらに長時間にわたって培養観察を行うことができるという効果がある。
また、受け部材６０は、弾性部材の弾性力により対物レンズに取り付けられているので、簡単に着脱することができる。

以下、上記各実施形態に係る培養観察方法に使用する潮解性水溶液の性能を試験する実験例を示す。
実験は、水道水をイオン交換水装置（オルガノ社製）およびＭＩＬＬＩＱ（ミリボア社製）でろ過した超純水に塩化マグネシウム（和光純薬製：型番135-00165）を溶解させたもので行った。
例えば、濃度１ｍｏｌ／リットル（１Ｍ（モーラ））の塩化マグネシウム水溶液を製造するには、まず、上記塩化マグネシウムの重量２０３．３ｇを計測し、そこに超純水を加えて最終的に１リットルとした。同様にして、濃度１０ｍＭ、３３．３ｍＭ、１００ｍＭおよび３Ｍの塩化マグネシウム溶液を製造した。

このようにして製造した塩化マグネシウム水溶液をそれぞれエッペンドルフチューブに入れ、低温アルミブロック高温槽（東京理化器社製ＭＧ−１０００）に収容して３７℃に恒温加熱した。
なお、エッペンドルフチューブの蓋を僅かに開けておき、内部の蒸気圧が高くならないようにした。
高温槽内で３７℃に加温したときの塩化マグネシウム水溶液および超純水の重量の時間変化を図６に示す。
この図によれば、濃度１Ｍ、３Ｍの塩化マグネシウム水溶液は、加温日数が５日程度まではその重量が減少していくものの、それ以降の重量変化がほとんどなく、蒸発し難いことが示されている。また、濃度３Ｍの場合には、５日目までの重量変化が１Ｍの場合と比較して十分に少ないので、さらに蒸発し難いことになる。

本発明の第１の実施形態に係る倒立顕微鏡の全体の説明をする模式図である。 図１の倒立顕微鏡の細胞活性維持装置を示す縦断面図である。 図２の細胞活性維持装置の平面図である。 図１の倒立顕微鏡の対物レンズと容器との間の状態を示す拡大図である。 本発明の第２の実施形態に係る倒立顕微鏡の対物レンズと容器との間の状態を示す拡大図である。 本発明に係る培養観察方法に使用する潮解性水溶液の一例としての塩化マグネシウム水溶液の経時的な質量変化の様子を示すグラフである。

符号の説明

８ 対物レンズ
３０ 容器
３１ 細胞活性維持装置
３３ 載置部材
３４ 周壁部
３５ 水槽
３６ 供給チューブ
３７ サーモプレート
３８ トップヒータ
５１ 潮解性水溶液
６０ 受け部材
６４ 壁部

Claims (7)

1. 容器の中の細胞を培養しながら観察する培養観察方法において、前記容器内の細胞を観察するための対物レンズの先端部と前記容器の底面との間を潮解性を有する物質の水溶液で満たし、該潮解性を有する物質の水溶液を介して前記対物レンズで観察することを特徴とする培養観察方法。
2. 前記潮解性を有する物質が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、水酸化ナトリウムまたはエチルアルコールであることを特徴とする請求項１に記載の培養観察方法。
3. 前記潮解性を有する物質の水溶液の濃度が、１ｍｏｌ／ｌ以上であることを特徴とする請求項２に記載の培養観察方法。
4. 前記対物レンズの周囲を加湿しながら観察することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の培養観察方法。
5. 容器の中の細胞を培養しながら観察する倒立顕微鏡において、前記細胞を照明する照明光学系と、前記容器を収容し、その内部の湿度および温度を所定の値に維持する細胞活性維持装置と、前記容器の底面との間に間隔をあけて配置された先端部を備え、該先端部と前記容器の底面との間に潮解性を有する物質の水溶液を満たした状態に保持する対物レンズとを備えることを特徴とする倒立顕微鏡。
6. 前記対物レンズの先端部に配置され、前記潮解性を有する物質の水溶液を、前記容器の底面との間に満たした状態に保持する受け部材を備えることを特徴とする請求項５に記載の倒立顕微鏡。
7. 前記細胞活性維持装置が、前記容器を載置して該容器の底面の少なくとも一部を露出させる開口部を有する載置部材と、該載置部材を加温する加温手段と、前記載置部材の周囲を取り囲む周壁部と、該周壁部の内側に配置され水を溜める水槽と、該水槽に炭酸ガスを供給するガス供給手段と、前記載置部材と前記周壁部とに囲まれる空間を密閉状態に覆う透明な被覆部材と、この被覆部材を保温する保温手段とを備えることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の倒立顕微鏡。

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