JP2004536052A - コアグリコシル化されたｈｃｖエンベロープタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、真核細胞の発現産物であるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に関する。より詳細には、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質は、平均してそのＮ−グリコシル化部位の８０％までがコアグリコシル化されていることを特徴とする。これらのＮ−グリコシル化された部位のうち、７０％よりも多くが、Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）で定義される構造をもつオリゴマンノースによりグリコシル化されている。さらに、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースに対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースの比率は、０．４５以下である。オリゴマンノースの１０％未満は、α１，３結合されたマンノースで終結している。本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質は特に、診断、予防及び治療目的に適している。本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質の産生のための適切な真核細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞である。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、組換え型タンパク質発現の一般的分野、ＨＣＶ感染の診断、ＨＣＶ感染の治療又は予防そして慢性肝炎を患う個体の治療の臨床的効率の予後診断／監視又は自然疾病の予後診断／監視に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、酵素内のＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質の発現、コアグリコシル化されたウイルスエンベロープタンパク質の発現のための酵母菌株及び本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質の診断、予防又は治療での使用に関する。
【０００３】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、開発国及び開発途上国の両方において大きな健康上の問題である。世界の人口の約１〜５％がこのウイルスに冒されていると推定されている。ＨＣＶ感染は、輸血による肝炎の最も重要な原因であると考えられ、往々にして慢性肝臓障害へと進行する。その上、肝細胞ガン腫の誘発にＨＣＶが関与することを示す証拠が存在している。その結果として、信頼性の高い診断方法及び有効な治療剤に対する需要は高い。同様に、ＨＣＶ感染した血液製剤の高感度かつ特異的スクリーニング方法及びＨＣＶを培養するための改善された方法も必要とされている。
【０００４】
ＨＣＶは、約３０００のアミノ酸の単一のポリタンパク質前駆体をコードする約９６００塩基の正鎖ＲＮＡウイルスである。翻訳後及び同時修飾と結合されたこの前駆体のタンパク質分解による開裂は、少なくとも３個の構造タンパク質及び６個の非構造タンパク質を結果としてもたらすことが示されてきた。配列相同性に基づいて、構造タンパク質は、１つの単一コアタンパク質及び２つのエンベロープ糖タンパク質すなわちＥ１及びＥ２として機能的に帰属されてきた。Ｅ１タンパク質は、１９２個のアミノ酸から成り、ＨＣＶ遺伝子型に応じて、４〜５個のＮ−グリコシル化部位を含む。Ｅ２タンパク質は、３６３〜３７０個のアミノ酸で構成され、ＨＣＶ 遺伝子型に応じて９〜１１個のＮ−グリコシル化部位を含有する（レビューのためには、Ｍａｊｏｒ及びＦｅｉｎｓｔｏｎｅ、１９９７；Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７を参照のこと）。Ｅ１ タンパク質はさまざまな可変ドメイン（Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７）を含有する。Ｅ２タンパク質は３つの超可変ドメインを含み、そのうち主要ドメインは、タンパク質のＮ末端にある（Ｍａｅｒｔｅｎｓ及びＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７）。ＨＣＶ糖タンパク質は、ＥＲ内に大部分が局在化しており、ここでこれらのタンパク質は修飾されオリゴマー複合体の形に組立てられる。
【０００５】
真核生物においては、糖残渣は一般に、４つの異なるアミノ酸残基に結合されている。これらのアミノ酸残基は、Ｏ結合（セリン、トレオニン及びヒドロキシリジン）及びＮ結合（アスパラギン）されたものとして分類される。Ｏ結合型糖は、ヌクレオチド糖から粗面小胞体（ＥＲ）又はゴルジ内で合成される。Ｎ結合型糖は、共通の前駆体から合成され、その後プロセッシングされる。ＨＣＶエンベロープタンパク質はＮ−グリコシル化されていると考えられている。当該技術分野においては、折畳み中間体の安定化ひいては効率の良い折畳み、小胞体内の折畳み不良及び分解の防止、オリゴマー化、生物活性及び糖のタンパク質の輸送のために、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加が重要であることが知られている（Ｒｏｓｅら、１９８８；Ｄｏｍｓら、１９９３；Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、１９９４による再考を参照のこと）。ポリペプチド上のトリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ及びＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでＸは任意のアミノ酸でありうる）は、Ｎ結合型オリゴ糖を結合するためのコンセンサス部位である。ポリペプチドに対するＮ結合型オリゴ糖の付加の後、オリゴ糖はさらに（Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、ガラクトース及びシアル酸を含有する）複合体タイプ又は（Ｎ−アセチルグルコサミン及びマンノースを含有する）高マンノースタイプへとプロセッシングされる。ＨＣＶエンベロープタンパク質は、高マンノースタイプのものであると考えられている。酵母の中のＮ結合型オリゴ糖プロセッシングは、哺乳動物のゴルジプロセッシングとは非常に異なるものである。酵母内で、オリゴ糖鎖は、マンノースの工程的付加を通してゴルジ内で伸長され、過剰グリコシル化（Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる、精巧な高マンノース構造を導く。これとは対照的に、原核生物内で発現されるタンパク質は、決してグリコシル化されることはない。
【０００６】
タンパク質又はペプチドの高マンノースタイプのグリコシル化のパターンは、さまざまな真核細胞について決定されてきた。哺乳動物においては、平均５〜９個のマンノース単位が、コアグリコシル化タイプのオリゴ糖内で２つのＮ−アセチルグルコサミン部分に結合されている（短縮してＭａｎ（５−９）ＧｌｃＮＡｃ（２）と表現される構造）。コアグリコシル化というのは、Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ及びＯｒｌｅａｎｓ（１９９３）の図３中にあるボックス構造に類似した構造を意味する。
【０００７】
メチロトローフ性酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、グリコシル化部位１つあたり平均８〜１４個のマンノース単位すなわちＭａｎ（８−１４）ＧｌｃＮＡｃ（２）を結合させることが報告されており（ＴｓｃｈｏｐｐのＥＰ０２５６４２１）、Ｎ結合型オリゴ糖の約８５％がサイズ範囲Ｍａｎ（８−１４）ＧｌｃＮＡｃ（２）内にある（Ｇｒｉｎｎａ及びＴｓｃｈｏｐｐ（１９８９）。その他の研究者らは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中で発現された異種タンパク質に結合させられたわずかに異なるオリゴ糖構造を公表してきた：Ｍａｎ（８−９）（ＧｌｃＮＡｃ（２）（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら（１９９８）、Ｍａｎ（９−１４）ＧｌｃＮＡｃ（２）又はＭａｎ（９−１５）ＧｌｃＮＡｃ（２）（Ｋａｌｉｄａｓら（２００１））及びＭａｎ（８−１８）ＧｌｃＮＡｃ（２）、ただし優勢であるのはＭａｎ（９−１２）ＧｌｃＮＡｃ（２）であり、主要な全体的オリゴ糖はＭａｎ（１０）ＧｌｃＮＡｃ（２）である（Ｍｉｅｌｅら（１９９８））。（Ｔｒｉｍｂｌｅら（１９９１））は、さらにＮ−グリコシル化部位の１７％がＭａｎ（１０）ＧｌｃＮＡｃ（２）により占有され残りの８％の部位がＭａｎ（１１）ＧｌｃＮＡｃ（２）により占有されている状態で、Ｎ結合型オリゴ糖の約７５％の中のＭａｎ（８）ＧｌｃＮＡｃ（２）及びＭａｎ（９）ＧｌｃＮＡｃ（２）の等しい分布を報告した。時としてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現されたタンパク質の過剰グリコシル化が報告されてきた（Ｓｃｏｒｅｒら（１９９３））。
【０００８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒは、Ｍａｎ（５−１０）ＧｌｃＮＡｃ（２）をＮ−グリコシル化部位に付加している（Ｐａｎｃｈａｌ及びＷｏｄｚｉｎｓｋｉ（１９９８））。
【０００９】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリコシル化欠損突然変異体ｍｎｎ９は、それが過剰グリコシル化されたタンパク質ではなくＭａｎ（９−１３）ＧｌｃＮＡｃ（２）から成る修飾されたオリゴ糖でグリコシル化済みのタンパク質を産生するという点で、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと異なっている（ＭａｃｋａｙらのＵＳ５１３５８５４及びＫｎｉｓｋｅｒｎらのＷＯ９４／０１１３２）。もう１つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体、ｏｃｈｌｍｎｎ９が、タンパク質中のＮ−グリコシル化部位にＭａｎ（８）ＧｌｃＮＡｃ（２）を添加することが報告された（ＹｏｓｈｉｆｕｍｉらのＪＰ０６２７７０８６）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（野生型及びｍｎｎ９突然変異体）コアオリゴ糖の特徴は、末端のα１，３−結合されたマンノース残基の存在にある（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら（１９９８））。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｏｃｈ１ｍｎｎ１の中で発現されたタンパク質のＮ−グリコシル化部位に結合されたオリゴ糖には、このような末端のα１，３−結合されたマンノースが欠けている（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら（２０００））。末端のα１，３結合されたマンノースは、アレルギー誘発性であるとみなされている（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９６））。従って、そのオリゴ糖上に末端のα１，３−結合されたマンノース残基を担持しているタンパク質は、診断又は治療目的では適切でない。
【００１０】
メチルトローフ性酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されるタンパク質上のグリコシル化パターンは、多大な量の異種タンパク質を産生するためにこの酵母を使用するにもかかわらず（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら（２０００）の表３参照）、詳細には研究されたことがない。Ｊａｎｏｗｉｃｚら（１９９１）およびＤｉｍｉｎｓｋｙら（１９９７）の実験から、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、大型又は小型のＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を全く又はわずかしかグリコシル化していないと思われる。これは、ＨＢｓＡｇがシグナルペプチド無しで発現され、かくして産生されたＨＢｓＡｇが小胞体（ＥＲ）の管腔内に入ることそしてグリコシル化を防ぐという事実に起因している確率が最も高い。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で産生されたＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子に対するモノ又はジヘキソースの制限された添加が、報告された（Ｆｉｓｃｈｅｒらの）。他方では、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞内で発現された非相同α−ガラクトンダーゼの過剰グリコシル化が観察された（Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒら１９９１）。
【００１１】
これまでのところ、疾病に対するワクチン接種は、疾病を制御するための最も費用効果が高く効率の良い方法であることが立証されてきた。しかしながら、有望な結果にもかかわらず、効果のあるＨＣＶワクチンを開発する研究努力は、困難をきわめた。ワクチンの必須条件は、患者の体内での免疫応答の誘発である。従って、ＨＣＶ抗原決定基を同定し、適切な環境の中で患者に投与しなければならない。抗原決定基は、線形及びコンホーメーションエピトープという少なくとも２つの形態に分けることができる。コンホーメーションエピトープは、グリコシル化のごとき同時翻訳及び翻訳後修飾を含めた三次元空間内の分子の折畳みの結果得られる。一般には、コンホーメーションエピトープは、未変性様のＨＣＶエピトープに類似しかつ実際の線形アミノ酸配列よりも保存が良い可能性のあるエピトープを表わしていることから、これらのエピトープは最も効果のあるワクチンを実現するであろうと考えられている。従って、ＨＣＶエピトープタンパク質の偶発的グリコシル化度は、未変性様のＨＣＶ抗原決定基を生成するために最大の重要性をもつものである。しかしながら、ほんのわずかな量のビリオンしか結果としてもたらさないＨＣＶを培養することには克服しがたい問題点が存在すると思われる。さらに、少量のタンパク質、過剰グリコシル化タンパク質又はグリコシル化されていないタンパク質のいずれかを結果としてもたらす組換え型タンパク質の発現及び精製に関する莫大な問題が存在する。
【００１２】
ＨＣＶエンベロープタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞の中で組換え型技術により産生されてきた。しかしながら、より高等な真核生物内での発現は、場合によってワクチンを生産するための大量の抗原の入手の問題をその特徴としてきた。Ｅ．ｃｏｌｉのごとき原核生物における発現は、グリコシル化されていないＨＣＶエンベロープタンパク質を結果としてもたらす。酵母におけるＨＣＶエンベロープタンパク質の発現は、過剰グリコシル化を結果としてもたらした。（特許文献１）の中でＭａｅｒｔｅｎｓらによりすでに実証されているように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２の発現は、高度にグリコシル化されたタンパク質を導く。この過剰グリコシル化は、タンパク質エピトープの遮へいを導く。Ｍｕｓｔｉｌｌｉら（１９９９）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＨＣＶ Ｅ２の発現の結果コア−グリコシル化がもたらされるということを断言しているものの、細胞内発現された材料の結果は、その一部分が少なくとも過剰グリコシル化されていることを実証し、一方この材料の残りの部分の適正なプロセッシングは示されなかった。さらに、Ｍｕｓｔｉｌｌｉら（１９９９）が観察した過剰グリコシル化は、グリコシル化抑制剤であるツニカマイシンの存在下でしか防止できず、従ってこれは、正常な、自然の増殖条件下で発生するグリコシル化を反映していない。細胞内供給源に由来するＨＣＶエンベロープタンパク質に対するニーズは、充分受入れられている（特許文献６のＭａｅｒｔｅｎｓら、Ｈｅｉｌｅら（２０００））。このニーズは、Ｍｕｓｔｉｌｌｉら（１９９９）の図５中で立証されているように哺乳動物細胞培養由来のＥ２タンパク質で免疫化されたチンパンジーの血清と分泌された酵母由来のＥ２の反応性が低いことによって例証されている。このことはさらに、酵母由来のＨＣＶエンベロープタンパク質での免疫化が抗原投与に対する防御を提供できないことを示すＲｏｓａら（１９９６）によって立証されている。
【００１３】
従って、同時に末端の１，３−結合マンノースを欠いた未変性様のグリコシル化パターンをもつＨＣＶエンベロープタンパク質の大規模で費用効果性の高い量のＨＣＶエンベロープタンパク質を結果としてもたらす効率的な発現システムに対する必要性が存在している。特に、かかるシステムはＨＣＶエンベロープタンパク質の製造に必要である。
【００１４】
発明の概要
本発明の第１の態様は、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含み、真核細胞の発現産物であること、さらにはＮ−グリコシル化された部位の最高８０％がコアグリコシル化されていることを特徴とする、単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに関する。特に、前記コアグリコシル化された部位の７０％超がＭａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）により定義された構造をもつオリゴマンノースでグリコシル化されている。さらに、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）オリゴマンノースに対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースの比は、０．４５以下である。より詳細には、前記オリゴマンノースは１０％未満の末端α１，３マンノースを含有する。前記単離されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はその一部分を発現する真核細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞のごとき酵母細胞でありうる。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに結合された鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的変異体を含むタンパク質から誘導される、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に関する。より詳細に言うと、ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、
ＣＬ−［（Ａ１）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（Ａ２）_ｃ］−ＨＣＶＥＮＶ−［（Ａ３）_ｄ−（ＰＳ２）_ｅ−（Ａ４）_ｆ］
という構造を特徴とするタンパク質から誘導され、式中
ＣＬは、鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的等価物であり、
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、異なるもの又は同じものでありうるアダプタペプチドであり、
ＰＳ１及びＰＳ２は、異なるもの又は同じものでありうるプロセッシング部位であり、
ＨＣＶＥＮＶは、ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは０又は１であり、
ここで、Ａ１及び／又はＡ２はＰＳ１の一部分であってもよく、かつ／又はＡ３及び／又はＡ４はＰＳ２の一部分であってもよい。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、単量体、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモオリゴマー及びヘテロオリゴマーからなるグループの中から選択された構造の中に含まれている、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを網羅している。あるいはまた、本発明による前記単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントは、ウイルス様粒子内に含まれている。より詳細には、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントは、システインを含む可能性があり、そのうちシステインのチオール基は化学修飾されている。
【００１７】
本発明の特定の態様は、抗原性又は免疫原性でありかつ／又はＴ細胞刺激エピトープを含む本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに関する。
【００１８】
さらなる一態様は、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを含む組成物に関する。前記組成物はさらに、薬学的に受容可能な担体を含むことができ、薬剤又はワクチンでありうる。
【００１９】
本発明は同様に、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを産生するための方法にも関する。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
（ｉ）前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分と前記抗−ＨＣＶ抗体の複合体化を可能にする条件下で前記試料と請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を接触させる段階；
（ｉｉ）（ｉ）で形成された複合体を検出する段階；及び
（ｉｉｉ）前記試料中の前記抗−ＨＣＶ抗体の存在を（ｉｉ）から推論する段階、を含んで成る方法である。
【００２１】
より詳細に言うと、前記方法は、前記接触が競合的条件で起こる段階（ｉ）を含むことができる。特に、前記方法は、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が結合させられている固体支持体を利用することができる。
【００２２】
本発明はさらに、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出するための診断用キットであって、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含んで成るキットに関する。より詳細に言うと、前記キットは、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が固体支持体に結合させられている、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含むことができる。
【００２３】
本発明は同様に、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含む薬剤又はワクチンにも関する。
【００２４】
同様に、本発明によって網羅されているのは、哺乳動物体内でＨＣＶ−特異的免疫応答を誘発するための医薬組成物であって、有効量の本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分及び任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含んで成る、医薬組成物である。前記医薬組成物は、あるいはまた、哺乳動物の体内でＨＣＶ−特異的抗体を誘発するか又は哺乳動物の体内でＴ細胞機能を誘発する能力をもつことができる。さらに、前記医薬組成物は、予防用組成物又は治療用組成物でありうる。特に前記哺乳動物は人間である。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明に導く研究作業においては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｌｙｍｏｒｐｈａ内のグリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質の発現が、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質に結合されたシグナルペプチド配列を含むタンパク質としての前記ＨＣＶエンベロープタンパク質の発現によって可能であるということが観察された。しかしながらこれら３つの酵母種の中で発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質のグリコシル化パターンは、非常に異なっていた（実施例６、１０、１３及び２５参照）。より詳細には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（グリコシル化欠損突然変異体）及びＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質は、コアグリコシル化に類似した要領でグリコシル化された。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質は、この酵母内で発現されたタンパク質が通常、過剰グリコシル化されないという以前の報告（Ｇｅｌｌｉｓｅｎら、２０００，Ｓｕｇｒｕｅら、１９９７）にも関わらず、過剰グリコシル化されていた。
【００２６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（グリコシル化欠損菌株）Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞の中で産生されたＨＣＶタンパク質のグリコシル化パターンをさらに分析した時点で、驚くべきことに、Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＨＣＶエンベロープタンパク質が、これらのＨＣＶエンベロープタンパク質の診断、予防及び治療上の応用のために非常に有利であるグリコシル化パターンを示すということが見出された。この予想外の発見事実は、以下で紹介するような本発明の異なる態様及び実施形態の中に反映されている。
【００２７】
本発明の第１の態様は、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含む単離ＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに関し、該タンパク質又はそのフラグメントは、真核細胞内の発現産物であり、さらにはＮ−グリコシル化された部位の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％までがコアグリコシル化されていることを特徴とする。より詳細には、Ｎ−グリコシル化された部位の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％よりも多くが、Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）によって定義される構造をもつオリゴマンノースでグリコシル化されている。上述のＮ−グリコシル化特徴をより詳細に説明すると、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位に対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位の比率は、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下である。上述のＮ−グリコシル化特徴をさらに詳細に説明すると、前記オリゴマンノースは、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【００２８】
「Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）により定義づけされた構造をもつオリゴマンノースでグリコシル化されたＮ−グリコシル化された部位」というのは、前記Ｎ−グリコシル化された部位が、Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）、Ｍａｎ（９）−ＧｌｃＮＡｃ（２）又はＭａｎ（１６）−ＧｌｃＮＡｃ（２）のうちのいずれか１つでグリコシル化されていることを意味している。
【００２９】
２つのタンパク質中の同じＮ−グリコシル化部位が異なるオリゴマンノースにより占有され得ないということが明らかとなるだろう。
【００３０】
「タンパク質」という語は、アミノ酸の重合体を意味し、産物の特定の長さを意味するものではない。かくして、ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドがタンパク質の定義内に含まれる。この語は同様に、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などのごとき、タンパク質の発現後修飾を意味することもまた除外することもない。この定義内に入るのは、アミノ酸の単数又は複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡなどを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合、ならびに、天然に発生する及び天然に発生しない両方の当該技術分野において既知のその他の修飾を伴うポリペプチドである。
【００３１】
本明細書で使用される「プレプロタンパク質」または「プレタンパク質」という語は、問題のタンパク質に結合されたプレプロ配列を含むタンパク質又はこの問題のタンパク質に結合されたプロ配列を含むタンパク質を含むタンパク質をそれぞれ意味する。「プレ配列」の代替として、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダーペプチド」又は「リーダー配列」のごとき語が使用されている。全ては、（Ｎ−）グリコシル化のための前提条件である粗面小胞体（ＥＲ）にプレタンパク質をターゲティングするアミノ酸配列を意味する。「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダーペプチド」、又は「リーダー配列」は、シグナルペプチターゼと呼ばれる宿主特異的プロテアーゼによりこのＥＲの管腔側において、問題のタンパク質に結合されたシグナル配列を含むタンパク質から開裂、すなわち「除去」される。同様にして、プレプロタンパク質は、ＥＲの管腔に対するトランスロケーションの時点でプロタンパク質に変換される。「プロ」アミノ酸配列の内容に応じて、これを、プレプロタンパク質を発現する宿主細胞により除去することができたりできなかったりする。周知のプレプロアミノ酸配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ交配因子のα交配因子プレプロ配列である。
【００３２】
「ＨＣＶエンベロープタンパク質」というのは、前記タンパク質を任意の遺伝子型のＨＣＶ菌株から誘導させることのできるＨＣＶ Ｅ１又はＨＣＶ Ｅ２エンベロープタンパク質又はその一部分を意味する。より詳細に言うと、ＨＣＶＥＮＶは、配列番号８５〜９８と少なくとも９０％の相同性をもつアミノ酸配列である配列番号８５〜９８からなるアミノ酸配列のグループ及びそのいずれかのフラグメントの中から選択される。「同一の」アミノ酸としては、上述の通りの保存されたアミノ酸の複数のグループ、すなわちＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌからなるグループ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなるグループ；Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒからなるグループ；Ａｓｐ及びＧｌｕからなるグループ；Ａｓｎ及びＧｌｎからなるグループ；Ｃｙｓ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなるグループ；及びＡｌａ及びＧｌｙからなるグループが考慮される。
【００３３】
より詳細には、「ＨＣＶエンベロープタンパク質」という語は、グリコシル化部位以外にＥ１又はＥ２領域のいずれかの少なくとも１つのＨＣＶエピトープを定義づけするアミノ酸配列（及び又はアミノ酸アナログ）を含むポリペプチド又はそのアナログ（例えばミモトープ）に関係する。これらのエンベロープタンパク質は両方共組換え型発現されたエンベロープタンパク質の単量体、ヘテロ−オリゴマー又はホモオリゴマー形態であり得る。標準的には、エピトープを定義づける配列は、ＨＣＶのＥ１又はＥ２領域のいずれかのアミノ酸配列に対応する（同一の形で、あるいはエピトープを破壊しない未変性アミノ酸残基のアナログの置換を介して）。
【００３４】
ＨＣＶエピトープはグリコシル化部位と同じ場所に位置してもよいということがわかるだろう。
【００３５】
一般に、エピトープ定義づけ配列の長さはアミノ酸３〜４個、より標準的には５、６又は７個、さらに標準的には８又は９個そしてさらに一層標準的には１０個以上となる。コンホーメーションエピトープに関しては、エピトープ定義づけ配列の長さは、これらのエピトープが抗原の３次元形状により形成されている（例えば折畳み）と考えられていることから、幅広く変動を受ける可能性がある。かくして、エピトープを定義づけするアミノ酸は、比較的数が少ないが、折畳みを介して適正なエピトープコンホーメーションへともっていかれる状態で一定長の分子に沿って広く分布させられている可能性がある。エピトープを定義づけする残基と残基との間の抗原の部分は、エピトープのコンホーメーション構造にとってさほど重要でない可能性がある。例えば、これらの介在する配列の欠失又は置換は、エピトープでコンホーメーションにとってきわめて重要な配列が維持される（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）ことを条件として、コンホーメーションエピトープに影響を及ぼさないかもしれない。コンホーメーションエピトープは同様に、ホモ−オリゴマー又はヘテロ−オリゴマーのサブユニットの２つ以上の必須領域によって形成され得る。
【００３６】
本明細書で使用されている指定されたポリペプチドのエピトープというのは、指定されたポリペプチド内のエピトープと同じアミノ酸配列をもつエピトープ及びその免疫学的等価物を意味する。かかる等価物は同様に、例えば現在知られている配列をもつ菌株、亜型（遺伝子型）又は型（群）特異的変異体又は遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、６ｃ、７ａ、７ｂ、７ｃ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａ、１１（及びその亜型）、１２（及びその亜型）、または１３（及びその亜型）に属する菌株又はその他の新たに定義づけされたあらゆるＨＣＶ（亜）型を包含する。エピトープを構成するアミノ酸は、線形配列の一部である必要はなく、任意の数のアミノ酸が散在してコンホーメーションエピトープを形成していてもよい。
【００３７】
本発明のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２（エンベロープ）ドメイン由来のコンホーメーションエピトープを含む。ウイルスエンベロープタンパク質に対応すると考えられているＥ１ドメインは、現在、ＨＣＶポリプロテインのアミノ酸１９２−３８３にわたると推定されている（Ｈｉｊｉｋａｔａら、１９９１）。（グリコシル化された）哺乳動物系内での発現時点で、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して決定されるように、およそ３５ｋＤａの分子量をもつと考えられている。以前ＮＳ１と呼ばれていたＥ２タンパク質は、ＨＣＶポリプロテインのアミノ酸３８４−８０９又は３８４−７４６にわたるものであり（グラコヴィ（Ｇｒａｋｏｖｉ）ら、１９９３）、又エンベロープタンパク質であるものと考えられている。（グリコシル化された）ワクシニア系における発現時点で、それは約７２ｋＤａの見かけのゲル分子量を有すると考えられている。これらのタンパク質の終点は近似であるものと了解される（例えば、Ｅ２のカルボキシ末端は、例えばアミノ酸７３０、７３５、７４０、７４２、７４４、７４５、好ましくは７４６、７４７、７４８、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８０９、８１０、８２０で終わる７３０〜８２０個のアミノ酸領域内のどこかにあり得る）。Ｅ２タンパク質は同様に、Ｅ１、及び／又はコア（ａａ１−１９１）及び／又はＰ７（ａａ７４７−８０９）、及び／又はＮＳ２（ａａ８１０〜１０２６）、及び／又はＮＳ３（ａａ１０２７−１６５７）、及び／又はＮＳ４Ａ（ａａ１６５８−１７１１）及び／又はＮＳ４Ｂ（ａａ１７１２−１９７２）及び／又はＮＳ５Ａ（ａａ１９７３−２４２０）、及び／又はＮＳ５Ｂ（ａａ２４２１−３０１１）及び／又はＥ２と異なるいかなるこれらのＨＣＶタンパク質の一部と共に発現され得る。同様にして、Ｅ１タンパク質は、Ｅ２及び／又はコア（ａａ１〜１９１）、及び／又はＰ７（ａａ７４７〜８０９）、及び／又はＮＳ２（ａａ８１０〜１０２６）、及び／又はＮＳ３（ａａ１０２７〜１６５７）、及び／又はＮＳ４Ａ（ａａ１６５８〜１７１１）、及び／又はＮＳ４Ｂ（ａａ１７１２〜１９７２）、及び／又はＮＳ５Ａ（ａａ１９７３〜２４２０）、及び／又はＮＳ５Ｂ（ａａ２４２１〜３０１１）及び／又はＥ２と異なるいかなるこれらのＨＣＶタンパク質の一部と共にでも発現され得る。これらのその他のＨＣＶタンパク質と合わせた発現は、適正なタンパク質折畳みを得るために重要であり得る。
【００３８】
本明細書で使用する「Ｅ１」という語には、天然のＥ１と免疫学的に交叉反応する末端切断形態及びアナログが包含され、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３又はその他の新しく同定されたあらゆるＨＣＶ型又は亜型が含まれる。本明細書で使用する「Ｅ２」という語には、天然のＥ２と免疫学的に交叉反応する末端切断形態及びアナログが包含され、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３又はその他の新しく同定されたあらゆるＨＣＶ型又は亜型が含まれる。例えば、コドン３８３〜３８４の間の多数のコドンの挿入ならびに、アミノ酸３８４〜３８７の欠失がＫａｔｏら、（１９９２）によって報告されてきた。かくして、本発明の実施例の部で使用された分離株は本発明の範囲を制限することを意図したものではないことそしてＨＣＶの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３型又はその他のあらゆる新遺伝子型からのあらゆるＨＣＶ分離株が本発明を実践するための適切なＥ１及び／又はＥ２配列供給源であることも了解される。同様にして、上述のように、本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質と同時発現されるＨＣＶタンパク質は、あらゆるＨＣＶ型から、ひいては本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質と同じ型からも誘導可能である。
【００３９】
本明細書で使用する「Ｅ１／Ｅ２」というのは少なくとも１つのＥ１成分と少なくとも１つのＥ２成分を含有するエンベロープタンパク質のオリゴマー形態を意味する。
【００４０】
「特異的オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という語は、集合体でない組換え発現されたＥ１及び／又はＥ２エンベロープタンパク質の考えられる全てのオリゴマー形態を意味する。Ｅ１及び／又はＥ２特異的オリゴマーエンベロープタンパク質は同様に、ホモ−オリゴマーＥ１又はＥ２エンベロープタンパク質（以下参照）とも呼ばれる。「単一又は特異的オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という語は、単一の単量体Ｅ１又はＥ２タンパク質（厳密な意味での単一）ならびに特異的オリゴマーＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２組換え発現済みタンパク質を意味する。本発明によるこれらの単一又は特異的オリゴマーエンベロープタンパク質は、さらに、（Ｅ１）_ｘ（Ｅ２）_ｙという式で定義づけできる。なお式中、ｘとｙが両方共０ではないことを条件として、ｘは０〜１００の１つの数、ｙは０〜１００の１つの数でありうる。ｘ＝１及びｙ＝０の場合、前記エンベロープタンパク質は、単量体Ｅ１を包含する。
【００４１】
本明細書で使用する「ホモ−オリゴマー」という語は、複数のＥ１又はＥ２単量体を含むＥ１又はＥ２の複合体を意味し、例えば、Ｅ１／Ｅ１ 二量体、Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１ 三量体又はＥ１／Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１ 四量体及びＥ２／Ｅ２二量体、Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２三量体又はＥ２／Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２四量体、Ｅ１五量体及び六量体、Ｅ２五量体及び六量体又は、Ｅ１又はＥ２のあらゆる高次ホモ−オリゴマーが全て、この定義の範囲内の「ホモ−オリゴマー」である。オリゴマーは、例えば、共に当該出願人による、ＭａｅｒｔｅｎｓらのＷＯ９４／２５６０１及びＷＯ９６／１３５９０の中で記載されたものを包含するＣ型ウイルスの異なる型又は亜型から得られるＥ１又はＥ２の異なる単量体を１、２又は数個含有することができる。かかる混合オリゴマーは、本発明の範囲内でなおもホモ−オリゴマーであり、ＨＣＶのより一般的な診断を可能にし得る。
【００４２】
本発明において使用されるＥ１及びＥ２抗原は、全長ウイルスタンパク質、実質的にはその全長バージョン、その機能的フラグメント（例えば、少なくとも１つのエピトープ及び／又はグリコシル化部位）であり得る。さらに、本発明のＨＣＶ抗原は同様に、問題のコンホーメーションエピトープの形成を遮断又は防止しないその他の配列をも包含することができる。コンホーメーションエピトープの有無は、抗体（コンホーメーションエピトープに対しモノクローナルの又はポリクローナルの血清）を用いて問題の抗原をスクリーニングしその反応性を線形エピトープのみを保持する抗原の変性済みバージョンの反応性と比較することによって容易に決定可能である。ポリクローナル抗体を用いた、かかるスクリーニングにおいては、まず第１に変性済み抗原でポリクローナル血清を吸着し、それが問題の抗原に対する抗体を保持するかどうかを見ることが有利であり得る。
【００４３】
本発明のＨＣＶタンパク質はグリコシル化されうる。グリコシル化されたタンパク質というのは、単数又は複数の炭水化物基特に糖基を含有するタンパク質を意味する。一般に全ての真核細胞はタンパク質をグリコシル化することができるＨＣＶ遺伝子型の異なるエンベロープタンパク質配列を整列させた後、適切な折畳み及び反応性のためにＨＣＶ Ｅ１タンパク質上の６個のグリコシル化部位の全てが必要とされるわけではないということを推論することができる。３２５の位置におけるグリコシル化部位は、Ｎ−グリコシル化により修飾されないことはさらに既知である（Ｆｏｕｒｎｉｌｌｉｅｒ−Ｊａｃｏｂら、１９９６、Ｍｅｕｎｉｅｒら、１９９９）。さらに、ＨＣＶ亜型１ｂＥ１タンパク質は６個のグリコシル化部位を含有するが、これらのグリコシル化部位の一部分は、或る種の他の（亜）型には存在しない。型１ｂ、６ａ、７、８及び９の中に存在する第４の炭水化物モチーフ（Ａｓｎ２５０上）は、今日知られているその他全ての型において不在である。この糖付加モチーフは、突然変異を受けて、改善された反応性をもつ１ｂＥ１型タンパク質を生成することができる。同様に、２ｂ型配列は、Ｖ５領域内に追加のグリコシル化部位を示す（Ａｓｎ２９９上）。遺伝子型２Ｃに属する分離株Ｓ８３には、その他全ての分離株上で存在するにもかかわらずＶ１領域内の第１の炭水化物モチーフさえ欠如している（Ｓｔｕｙｖｅｒら、１９９４）。しかしながら、完全に保存された糖付加モチーフの間でさえ、炭水化物の存在は折畳みのために必要とされなかったものの、免疫監視機構の回避において１つの役割を果たす可能性がある。かくして、グリコシル化の役割の同定は、グリコシル化モチーフの突然変異誘発によって、さらにテストすることができる。グリコシル化モチーフの突然変異誘発（ＮＸＳ又はＮＸＴ配列）は、Ｎ、Ｓ、又はＴについてのコドンがＮの場合にはＮと異なるアミノ酸及び／又はＳ及びＴの場合にはＳ又はＴと異なるアミノ酸をコードするような形で、これらのコドンを突然変異させることによって達成可能である。あるいはまた、ＮＰＳ又はＮＰＴが炭水化物で頻繁に修飾されないことがわかっていることから、Ｘ位置をＰへ突然変異させることができる。折畳み及び／又は反応性のためにどの炭水化物−付加モチーフが必要でどれが不要であるかを立証した後、かかる突然変異の組合せを行なうことができる。かかる実験は、参照により本明細書に一体化されるＭａｅｒｔｅｎｓらによるＷＯ９６／０４３８５の実施例８の中で広範に記載されてきた。
【００４４】
本発明内で用いられるグリコシル化という語は、相反する規定のないかぎり、Ｎ−グリコシル化を意味する。
【００４５】
特に、本発明は、コア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に関する。この点において、「コア−グリコシル化」という語は、Ｈｅｒｃｏｖｉｃｓ及びＯｒｌｅａｎ（１９９３）の図３中のボックス構造に描かれている通りの構造に「類似した」構造を意味する。かくして、言及された炭水化物構造は１０〜１１個の単糖を含有する。とりわけ、前記開示は参照により本明細書に一体化される。「類似の」という語は、構造に対し４個以下の付加的単糖しか付加されていないこと、又は構造から約３個以下の単糖しか除去されていないことを意味する。従って、本発明で言及されているコアグリコシル化炭水化物構造は、最小７個そして最大１５個の単糖から成り、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個の単糖から成り得る。含まれる単糖は好ましくは、グルコース、マンノース又はＮ−アセチルグルコサミンである。
【００４６】
本発明の一変形態様は、少なくとも一つのＮ−グリコシル化部位を含む単離ＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを包含し、該タンパク質又はそのフラグメントは真核細胞内の発現産物であり、さらにはＮ−グリコシル化された部位の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％までが、Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）によって定義される構造をもつオリゴマンノースでグリコシル化されていることを特徴とする。上述のＮ−グリコシル化特徴をより詳細に説明すると、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位に対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位の比率は、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下である。上述のＮ−グリコシル化特徴をさらに詳細に説明すると、前記オリゴマンノースは２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【００４７】
本発明のもう一つの変形態様は、少なくとも一つのＮ−グリコシル化部位を含み、真核細胞内の発現産物であるり、さらにはＮ−グリコシル化された部位が構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースに対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノース比率が０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下であることを特徴とする、単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに関する。上述のＮ−グリコシル化特徴をさらに詳細に説明すると、前記オリゴマンノースは、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【００４８】
本発明のもう一つの変形態様では、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含み、非哺乳動物真核細胞内の発現産物であり、さらには、Ｎ−グリコシル化された部位の数が、ワクシニアウイルスに感染しやすい真核細胞内でワクシニアウイルスから発現された同じタンパク質又はそのフラグメント内のＮ−グリコシル化された部位の数よりも少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％少ないことを特徴とする単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントが網羅されている。上述のＮ−グリコシル化特徴にさらに詳細に言うと、前記Ｎ−グリコシル化された部位の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％又は８０％までがコアグリコシル化されている。より詳細には、Ｎ−グリコシル化された部位の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％よりも多くが、Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）によって定義される構造をもつオリゴマンノースでグリコシル化されている。上述のＮ−グリコシル化特徴のいずれかにより詳細に言うと、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位に対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位の比率は、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下である。上述のＮ−グリコシル化特徴のいずれかにさらに詳細に言うと、前期オリゴマンノースは、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【００４９】
発明のもう１つの態様においては、発明に従った単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、酵母細胞内の発現産物である。より詳細には、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍのごときＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌株、Ｓｃｈｉｚｏ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのごときＳｃｈｉｚｏ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｅｔｉｓのごときＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのごときＹａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのごときＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのごときＰｉｃｈｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ菌株、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａのごときＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、又はＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのごときＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ菌株の細胞又はそのいずれかから誘導された突然変異体細胞の中の発現産物である。より詳細には、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分はＨａｎｓｅｎｕｌａ細胞内の発現産物である。より一層詳細には、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、ツニカマイシンのごときグリコシル化阻害物質の不在下での例えばＨａｎｓｅｎｕｌａのごとき酵母細胞内の発現産物である。
【００５０】
本発明のもう１つの態様では、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに結合された鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的変異体を含むタンパク質から誘導される。より詳細に言うと、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、
ＣＬ−［（Ａ１）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（Ａ２）_ｃ］−ＨＣＶＥＮＶ−［（Ａ３）_ｄ−（ＰＳ２）_ｅ−（Ａ４）_ｆ］
という構造を特徴とするタンパク質から誘導され、式中：
ＣＬは、鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的等価物であり、
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、異なるもの又は同じものでありうるアダプタペプチドであり、
ＰＳ１及びＰＳ２は、異なるもの又は同じものでありうるプロセッシング部位であり、
ＨＣＶＥＮＶは、ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは０又は１であり、
ここで、Ａ１及び／又はＡ２はＰＳ１の一部分であってもよく、かつ／又はＡ３及び／又はＡ４はＰＳ２の一部分であってもよい。
【００５１】
「ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に結合された鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的等価物」という語は、前記リーダーペプチドのＣ末端アミノ酸が前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分のＮ末端アミノ酸にペプチド結合を介して共有結合的に結合されていることを意味する。あるいはまた、前記リーダーペプチドのＣ末端アミノ酸は、ペプチド又はタンパク質により、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分のＮ末端アミノ酸から分離される。前記ペプチド又はタンパク質は、上述のように−［（Ａ１）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（Ａ２）_ｃ］という構造をもつ可能性がある。
【００５２】
ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分に結合された鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的等価物を含むタンパク質からの問題のＨＣＶエンベロープタンパク質の又は、構造ＣＬ−［（Ａ１）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（ＡＳ）_ｃ］−ＨＣＶＥＮＶ−［（Ａ３）_ｄ−（ＰＳ２）_ｅ−（Ａ４）_ｆ］によって特徴づけされるタンパク質の誘導は、内部でタンパク質が発現される細胞のタンパク質分解メカニズムによってｉｎ ｖｉｖｏで行なうことができる。より詳細には、鳥類リゾチームリーダーペプチドの除去から成る段階は、好ましくはプレタンパク質が内部で発現される細胞のタンパク質分解メカニズムによってｉｎ ｖｉｖｏで行なわれる。しかしながら、プレタンパク質を発現する細胞及び／又はプレタンパク質を発現する細胞が中で増殖させられる培養液からプレタンパク質及び／又はタンパク質を単離及び／又は精製した後及び／又はその間だけ、誘導を実施することもできる。あるいはまた、前記ｉｎ ｖｉｖｏ誘導は、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導と組合せて実施される。組換えにより発現されたプレタンパク質からの問題のＨＣＶタンパク質の誘導は、さらに、問題のタンパク質と同時に存在する汚染性タンパク質の全て又は大部分が分解され、問題のタンパク質が研磨性タンパク質分解酵素（複数も可）に対する耐性をもつ研磨段階における単数又は複数のタンパク質分解酵素の使用を含む可能性がある。誘導及び研磨は、互いに排他的プロセスではなく、同じ単一のタンパク質分解酵素を用いることによって得ることができる。一例として、ここでは、Ｌｙｓ残基が欠けているＨＣＶ遺伝子型１ｂのＨＣＶ Ｅ１タンパク質（配列番号２）が示されている。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｅｎｄｏ−ｌｙｓＣ）で前記Ｅ１タンパク質を含有するタンパク質抽出物を消化することにより、Ｅ１タンパク質は分解されなくなり、一方単数又は複数のＬｙｓ残基を含有する汚染性タンパク質が分解される。かかるプロセスは、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質の単離及び／又は精製を大幅に単純化又は増強する可能性がある。さらに、プレタンパク質内で例えばリーダーペプチドとＨＣＶ Ｅ１タンパク質の間に付加的なＬｙｓ残基を包含させることにより、ＨＣＶ Ｅ１プレタンパク質からリーダーペプチドの適正なｉｎ ｖｉｔｒｏ分離というさらなる有利な可能性が得られる。その他のＨＣＶ Ｅ１タンパク質は、位置４、４０、４２、４４、６１、６５又は１７９のいずれか単数又は複数の位置において（なおここで位置１はＥ１タンパク質の最初のＮ末端天然アミノ酸、すなわちＨＣＶポリタンパク質内の位置１９２である）Ｌｙｓ残基を含むことができる。上述のように、ｅｎｄｏ−ｌｙｓＣの使用を可能にするため、前記Ｌｙｓ残基をもう１つのアミノ酸残基、好ましくはＡｒｇ残基内に突然変異させることができる。
【００５３】
「適正に除去された」リーダーペプチドという語は、問題のタンパク質に結合されたシグナル配列を含むタンパク質から前記リーダーペプチドが、高効率で除去された（すなわち多数のプレ（プロ）タンパク質がプロタンパク質に又はタンパク質に転換される）かつ高い忠実度で除去される（すなわち、プレアミノ酸配列のみが除去され前記プレアミノ酸配列に結合された問題のタンパク質のいかなるアミノ酸も除去されない）ことを意味する。「高効率でのリーダーペプチドの除去」というのは、プレタンパク質の少なくとも約４０％、ただしより好ましくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％さらにはまた９９％が、プレ配列が除去されているタンパク質へと転換させられるということを意味している。あるいはまた、発現されたプレタンパク質の実質的部分が、プレ配列が除去されているタンパク質へと転換されない場合、これらのプレタンパク質はなおも精製され得る。
【００５４】
「鳥類リゾチーム（ＣＬ）リーダーペプチドの機能的等価物」というのは、単数又は複数のアミノ酸がもう１つのアミノ酸と置換されており、そのためにこの置換が保存的アミノ酸置換であるようなＣＬリーダーペプチドを意味する。「保存的アミノ酸置換」というのは、同じ保存されたアミノ酸グループに属するもう１つのアミノ酸で、１つの保存されたアミノ酸グループに属する１つのアミノ酸を置換することを意味している。保存されたアミノ酸のグループとしては、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌからなるグループ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなるグループ；Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒからなるグループ；Ａｓｎ及びＧｌｎからなるグループ；Ｃｙｓ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなるグループ；及びＡｌａ及びＧｌｙからなるグループが考慮される。ＣＬリーダーペプチド内の保存的アミノ酸置換の例としては、位置６における自然変異がありこの位置にあるアミノ酸はＶａｌ又はＩｌｅである；もう１つの変動は位置１７で起こり、この位置におけるアミノ酸は、なかんずく、Ｌｅｕ又はＰｒｏ（配列番号１参照）である。かくして結果として得られるＣＬリーダーペプチドは、機能的等価物とみなされるべきである。ＣＬリーダーペプチドのその他の機能的等価物としては欠失変異体及び挿入変異体を含め、本発明全体を通して記載されている通りのＣＬリーダーペプチドと同じ技術的態様を再現するようなリーダーペプチドが含まれる。
【００５５】
「Ａ」又は「アダプタペプチド」というのは、例えばリーダーペプチドとプロセッシング部位（ＰＳ）、リーダーペプチドと問題のタンパク質、ＰＳと問題のタンパク質及び／又は、問題のタンパク質とＰＳの間のリンカーとして役立つことができかつ／又は、例えばリーダーペプチド、ＰＳ又は問題のタンパク質のリンカーＮ−又はＣ−末端として役立つことができるペプチド（例えば１〜３０個のアミノ酸）又はタンパク質を意味する。アダプタペプチド「Ａ」は、例えば、α−らせん又はβ−シート構造又はその組合せのごとき或る種の３次元構造を有することができる。あるいはまた、Ａの３次元構造は、明確でなく例えば高次コイル構造である。アダプタＡは、例えばプレ配列、プロ配列、問題の配列のタンパク質又はプロセッシング部位の一部であり得る。アダプタＡは、Ａが一部を成すタンパク質の検出及び／又は精製及び／又はプロセッシングを可能にするか又は増強するタグとして役立つことができる。Ａペプチドの一例としては、ｎが通常６であるが７、８、９、１０、１１又は１２であり得るｈｉｓ−ｔａｇペプチド（ＨＨＨＨＨＨ：配列番号６３）Ｈｎである。Ａ−ペプチドのその他の例としては、問題のタンパク質のＮ末端に存在するとき、発酵収量を増大させるだけでなくジペプチジルアミノペプチターゼによるプロセッシングに対し問題のタンパク質のＮ末端を保護し、かくしてポリペプチドの均質なＮ末端を結果としてもたらすものとして報告されているペプチドＥＥＧＥＰＫ（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら；ＷＯ９８／２８４２９中；配列番号６４）又はＥＥＡＥＰＫ（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ら；ＷＯ９７／２２７０６中；配列番号６５）が包含される。同時に、問題のタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、すなわち前記ペプチドＥＥＧＥＰＫ（配列番号６４）及びＥＥＡＥＰＫ（配列番号６５）の問題のタンパク質からの除去は、例えば前記ペプチド内でＬｙｓ残基のＣ末端を開裂するｅｎｄｏ−ｌｙｓ Ｃを用いることにより達成できる。かくして前記ペプチドは、アダプタペプチド（Ａ）ならびにプロセッシング部位（ＰＳ）の機能を果たす（以下参照）。アダプタペプチドは、配列番号６３−６５、７０−７２及び７４−８２の中で与えられている。アダプタペプチドのもう一つの例は、Ｇ４Ｓ免疫サイレントリンカーである。アダプタペプチド又はアダプタタンパク質のその他の例は、Ｓｔｅｖｅｎｓの表２に列挙されている（Ｓｔｅｎｅｎｓら、２０００）。
【００５６】
「ＰＳ」又は「プロセッシング部位」というのは、特異的タンパク質のプロセッシング中の又はプロセッシング可能な部位を意味する。特異的酵素プロセッシングを受けやすいプロセッシング部位の例としては、ＩＥＧＲ↓Ｘ（配列番号６６）、ＩＤＧＲ↓Ｘ（配列番号６７）、ＡＥＧＲ↓Ｘ（配列番号６８）があり、これらは全て、ウシ因子Ｘａプロテアーゼにより「↓」で表わされたＡｒｇ及びＸａａ（任意のアミノ酸）残基により認識され、これらの間で開裂される（Ｎａｇａｉ，Ｋ．及びＴｈｏｇｅｒｓｅｎ，Ｈ，Ｃ．１９８４）。ＰＳ部位のもう一つの例は、例えば酵母Ｋｅｘ２プロテアーゼによる開裂可能なＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ａｒｇのごとき二塩基部位である（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｄ．ら、１９８４）。ＰＳ部位は同様に、一塩基Ｌｙｓ部位でありうる。前記一塩基Ｌｙｓ−ＰＳ−部位は、ＡペプチドのＣ末端に包含されてもよい。Ｃ末端一塩基Ｌｙｓ−ＰＳ部位を含むＡアダプタペプチドの例は、配列番号６４−６５及び７４−７６によって示されている。Ｈｉｓ−タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号６３）のエキソタンパク質開裂除去は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（ＤＡＰａｓｅ）を単独で又はグルタミンシクロトランスフェラーゼ（Ｑｃｙｃｌａｓｅ）及びピログルタミンアミノペプチダーゼ（ｐＧＡＰａｓｅ）と組合せた形で使用することによって可能である（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．ら、１９９９）。（固定化金属アフィニティクロマトグラフィ、ＩＭＡＣにより反応混合物からペプチダーゼを除去できるようにする）組換え型Ｈｉｓ−タグを含む前記エキソペプチダーゼは、例えばＵｎｉｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，ＤＫ）のＴＡＧＺｙｍｅ系として市販されている。「プロセッシング」という語は、前記プロセッシング部位がそのタンパク質内に存在する場合、少なくとも１つのプロセッシング部位で脱タンパク質が特異的に開裂されるか又は開裂可能であるようにするあらゆる方法又は手順を一般に意味している。ＰＳは、エンド型プロテアーゼ開裂を受けやすい場合もあれば、エキソ型プロテアーゼ開裂を受けやすい可能性もあるが、いずれにせよ、脱開裂は特異的である。すなわちタンパク質分解酵素をプロセッシングすることにより認識された部位以外の部位まで拡大しない。一定数のＰＳ部位が配列番号６６−６８及び８３−８４内に与えられている。
【００５７】
以上で概略的に記した［（Ａ１／３）_ａ／ｄ−（ＰＳ１／２）_ｂ／ｅ−（Ａ２／４）_ｃ／ｆ］構造の汎用性は、いくつかの例を用いて実証される。第１の例では、前記構造は、プレタンパク質内に含まれた問題のタンパク質のＣ末端に存在しており、ここでＡ３は、因子Ｘａ「ＩＥＧＲＸ」ＰＳ部位（配列番号６６）と重ね合わさっている「ＶＩＥＧＲ」ペプチド（配列番号６９）であり、Ｘ＝Ａ４はヒスチジンータグ（配列番号６３）（かくしてｄ、ｅ及びｆはこの場合全て１である）。問題のＨＣＶタンパク質は、（任意には）ＩＭＡＣにより精製され得る。Ｘａ因子でプロセッシングした後、（場合によって精製された）問題のＨＣＶタンパク質はそのＣ末端に、「ＩＥＧＲ」であるプロセッシングされたＰＳ部位（配列番号７０）を担持することになる。プロセッシングされたＸａ因子の別のプロセッシング部位は、ＩＤＧＲ（配列番号７１）又はＡＥＧＲ（配列番号７２）でありうる。さらなる例では、［（Ａ１／３）_ａ／ｄ−（ＰＳ１／２）_ｂ／ｅ−（Ａ２／４）_ｃ／ｆ］構造は、問題のＨＣＶタンパク質のＮ末端に存在している。さらに、Ａ１はヒスチシンータグ（配列番号６３）であり、ＰＳは、Ｘａ因子認識部位（配列番号６６−６８のいずれか）であり、ここでＸは問題のタンパク質で、ａ＝ｂ＝１、ｃ＝０である。例えば宿主細胞によるリーダーペプチドの適正な除去の時点で、結果として得られた問題のＨＣＶタンパク質をＩＭＡＣにより精製することができる（任意）。Ｘａ因子でのプロセッシングの後、問題のタンパク質には［（Ａｌ）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（Ａ２）_ｃ］構造が欠如している。
【００５８】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、ＰＳ１及びＰＳ２のいずれかが存在する場合、それは反復構造で存在しうるということが明らかとなるだろう。このような反復構造は、それが存在する場合、この状況下ではなお１として計数される。すなわちａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ又はｆは、例えばＡ１が例えば２つの反復（Ａ１−Ａ１）として存在している場合であっても１である。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの態様は、システインのチオール基が化学的に修飾されている本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６０】
本発明のさらにもう１つの態様は、抗原性である本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６１】
本発明のさらにもう１つの態様は、免疫原性である本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６２】
本発明のさらにもう１つの態様は、Ｔ細胞エピトープを含んで成る本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６３】
本発明のもう１つの態様は、単量体、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモオリゴマー及びヘテロオリゴマーからなるグループの中から選択された構造の中に含まれている、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６４】
本発明のさらにもう１つの態様は、ウイルス様粒子内に含まれている本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントのいずれかに関する。
【００６５】
少なくとも１つのシステイン残基、ただし好ましくは２つ以上のシステイン残基を含む、本明細書で記載されている通りのＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部において、システインのチオール基は化学的又は酵素的手段によって不可逆的に保護されうる。特に、化学的手段による「不可逆的保護」又は「不可逆的遮断」は、アルキル化、好ましくは例えば活性ハロゲン、エチレンイミン又はＮ−（ヨードエチル）トリフルオロ−アセタミドのごときアルキル化剤を用いたＨＣＶエンベロープタンパク質のアルキル化を意味する。この点において、システインのチオール基のアルキル化が、（ＣＨ_２）_ｎＲ（なお式中ｎは０、１、２、３又は４であり、ＲはＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＣＯＮＨ_２、フェニル又はそれらのあらゆる誘導体である）によるチオールの水素の置換を意味していると了解すべきである。アルキル化は、例えば、ＸをＩ、Ｂｒ、Ｃｌ又はＦのごときハロゲンとして活性ハロゲンＸ（ＣＨ_２）_ｎＲのごとき当該技術分野で既知のあらゆる方法によって実施可能である。活性ハロゲンの例としては、ヨウ化メチル、ヨード酢酸、ヨードアセタミド、及び２−ブロモエチルアミンがある。アルキル化のその他の方法としては、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）又はビオチン−ＮＥＭ、その混合物又は、両方共−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２による−Ｈの置換を結果としてもたらすエチレンイミン又はＮ−（ヨードエチル）トリフルオロアセタミドの使用が含まれる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．１９９６）。本明細書で使用されるような「アルキル化剤」という語は、本明細書に記載されているようなアルキル化を実施することのできる化合物を意味する。かかるアルキル化は最終的に、その他のアミノ酸を模倣できる修飾されたシステインを結果としてもたらす。エチレンイミンによるアルキル化は、結果として、リジンに似た構造をもたらし、そのため、トリプシンのための新しい開裂部位が導入されることになる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．１９９６）。同様にして、ヨウ化メチルの利用は、結果としてメチオンに似たアミノ酸をもたらし、一方ヨードアセテート及びヨードアセタミドの利用は、結果として、それぞれグルタミン酸及びグルタミンに似たアミノ酸をもたらす。同様に、これらのアミノ酸は好ましくは、システインの直接的突然変異において用いられる。従って、本発明は、本明細書に記載されているようなＨＣＶエンベロープタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基が天然アミノ酸、好ましくはメチオニン、グルタミン酸、グルタミン又はリジンに突然変異させられる、本明細書で記載するとおりのＨＣＶエンベロープタンパク質に関係する。「突然変異させられる」という語は、これらのアミノ酸をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、すなわち例えばＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発又は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、１９８９）に記載されているようなオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を介したものなどの、当該技術分野において周知の方法を意味する。本発明の実施例の部については、相反する規定のないかぎり、アルキル化はアルキル化剤としてのヨード−アセタミドの使用を意味するものと理解すべきである。
【００６６】
さらに、本発明のＨＣＶタンパク質又はその一部分のシステインのチオール基は可逆的に保護できるというとことが了解される。可逆的な保護の目的は、ＨＣＶタンパク質又はその一部を安定化させることにある。特に、可逆的な保護の後、硫黄含有官能基（例えばチオール及びジスルフィド）は、非反応性条件下で保持される。硫黄含有官能基はかくしてその他の化合物と反応できず、例えば、以下のようなジスルフィド結合を形成又は交換する傾向は全くもたない。
【化１】

【００６７】
チオール及び／又はジスルフィド残基間の記載された反応は、分子間プロセスに限らず、同様に分子内でも起こり得る。
【００６８】
本明細書で使用される「可逆的に保護する」又は「可逆的にブロックする」という語は、システインのチオール基に対して修飾作用物質を共有結合させることならびに、システインのチオール基の酸化還元状態が精製手順のその後の工程全体にわたり影響されない状態にとどまるような形でＨＣＶタンパク質の環境を操作すること（遮へい）を意図している。
【００６９】
システインのチオール基の可逆的保護は、化学的又は酵素的に実施可能である。
【００７０】
本明細書で使用する「酵素的手段による可逆的保護」は、例えばパルミトイルアシルトランスフェラーゼのごときチオ−エステル化の触媒として作用することに関与するアシルトランスフェラーゼなどのアシル−トランスフェラーゼのごとき酵素により媒介される可逆的保護を意図している（以下を参照のこと）。
【００７１】
本明細書で使用する「化学的手段による可逆的保護」は、次のものによる可逆的保護を意図している：
１．例えばスルホン化及びチオエステル化によるようなシステイニルを可逆的に修飾する修飾剤による：
スルホン化は、ジスルフィド架橋に関与するチオール又はシステインがＳ−スルホネートに修飾される反応である：
【化２】

（Ｄａｒｂｒｅ，Ａ．１９８６）又は
【化３】

ＲＳＨ→ＲＳ−ＳＯ_３ ⁻（Ｄａｒｂｒｅ，Ａ．１９８６）又はＲＳ−ＳＲ→２ＲＳ−ＳＯ_３ ⁻（亜硫酸分解： Ｋｕｍａｒ，Ｎ．ら、１９８６）。スルホン化のための試薬は、例えばＮａ_２ＳＯ_３又はテトラチオン酸ナトリウムである。後者のスルホン化試薬は、１０〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度で使用される。任意にはスルホン化は、例えばＣｕ^２＋（１００μＭ〜１ｍＭ）又はシステイン（１〜１０ｍＭ）のごとき触媒の存在下で実施可能である。
反応は、タンパク質変性ならびに未変性条件下で実施可能である（Ｋｕｍａｒ，Ｎ．ら、１９８５；Ｋｕｍａｒ，Ｎ．ら、１９８６）
チオエステル結合形成又はチオエステル化は、以下の式によって特徴づけされる：
【化４】

なお式中、Ｘは好ましくは化合物Ｒ’ＣＯ−Ｘ内のハロゲニドである。
２．例えば重金属、特にＺｎ^２＋、Ｃｄ^２＋、モノ−、シチオ及びジスルフィド−化合物（例えばアリル−及びアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルフォリン、ジヒドロリポアミン、エルマン試薬、アルドロチオール^ＴＭ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））（Ｒｅｉｎ，Ａ．ら、１９９６）、ジチオカルバメート）、又はチオール化剤（例えばグルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システインアミン）などにより本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾用作用物質による。ジチオカルバメートは、スルフヒドリル基と反応する能力を付与するＲ_１、Ｒ_２ＮＣ（Ｓ）ＳＲ_３官能基を有する広範なクラスの分子を含んで成る。などにより本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾用作用物質による。チオール含有化合物が、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、さらに一層好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度で使用される。
３．１０μＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの濃度範囲内での例えばＤＴＴ、ジヒドロアスコルベート、ビタミンＳ及び誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチド及び誘導体（例えばヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン）、没食子酸塩、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ハイドロキノン、ヒドロキシメチルフェノール及びその誘導体のごとき、チオール状態を保存する（安定化させる）修飾用作用物質、特に酸化防止剤の存在による。
４．例えば（ｉ）金属イオン（Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋）、ＡＴＰのごとき補因子、（ｉｉ）ｐＨ制御（例えば、タンパク質については大部分のケースにおいてｐＨ〜５又はｐＨは好ましくはチオールｐＫ_ａ−２；例えば逆相クロマトグラフィにより精製されたペプチドについてはｐＨ〜２に）のごときチオール安定化条件による。
【００７２】
（１）、（２）、（３）、及び（４）で記載した通りの可逆的保護の組合せは、同じように純粋かつ再度折畳みされたＨＣＶタンパク質を結果としてもたらす可能性がある。実際には、組合せ化合物、例えばＺ１０３（Ｚｎカルノシン）を、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で使用することができる。可逆的保護は又、上述の修飾基又は遮へい以外に、ペプチドバックボーンを分断することなく酵素的又は化学的に逆転させることのできるあらゆるシステイニル保護方法をも意味する。この点において、本発明は、特に、例えばチオエステル結合がチオエステラーゼ、塩基性緩衝液条件（Ｂｅｅｋｍａｎ，Ｎ．Ｊ．ら、１９９７）又はヒドロキシルアミン処理（Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅｄｓ，Ｍ．Ｈ．ら、１９９６）によって開裂される、従来の化学合成（以上参照）によって調製されるペプチドを特に基準としている。
【００７３】
チオール含有ＨＣＶタンパク質は、例えば、（１）ジスルフィド結合を含む開裂可能なコネクタアーム（例えば固定化された ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｊａｙａｂａｓｋａｒａｎ，Ｃ．ら、１９８７）及び活性化されたチオール−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の電子対共有クロマトグラフィ）又は（２）固定化されたリガンドとしてのアミノヘキサノイル−４−アミノフェニルアルシンを含有するアフィニティクロマトグラフィ樹脂上で精製可能である。後者のアフィニティマトリックスは、酸化還元調節を受けるタンパク質及び酸化的ストレスについての標的であるジチオールタンパク質のために使用されてきた（Ｋａｌｅｆ，Ｅ．ら、１９９３）。
【００７４】
ペプチドの可溶化及び抽出を増大させるために、可逆的保護を使用することもできる（Ｐｏｍｒｏｙ，Ｎ．Ｃ．＆Ｄｅｂｅｒ，Ｃ．Ｍ．１９９８）。
【００７５】
可逆的保護及びチオール安定化化合物は、単量体、重合体又はリポソームの形態で提示できる。
【００７６】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば以下のことによって、化学的又は酵素的に達成可能である：
− 特に１〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度での還元剤、特にＤＴＴ、ＤＴＥ、−２−メルカプトエタノール、ジチオナイト、ＳｎＣｌ_２、水素化ホウ酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、ＴＣＥＰ；
− 例えばｐＨ増大によるチオール安定化条件又は作用物質の除去；
− 特に０．０１〜５μＭ、より一層詳細には０．１〜５μＭの濃度範囲内の、特にチオエステラーゼ、グルタレドキシン、チオレドキシンのごとき酵素；
− 上述の化学的及び／又は酵素条件の組合せ。
【００７７】
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば細胞内又は個体内のごときｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施できる。
【００７８】
精製手順内では、システイン残基は不可逆的に遮断されてもされなくてもよく、又、以上で挙げたようなあらゆる可逆的修飾用作用物質により置換されてもされなくてもよいということがわかるだろう。
【００７９】
本発明による還元剤は、システイン残基中の硫黄例えば「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元、システイン残基の脱スルホン化（ＲＳ−ＳＯ_３ ⁻→ＲＳＨ）を達成するあらゆる作用物質である。酸化防止剤は、チオール状態を保存するか又は「Ｓ−Ｓ」形成及び／又は交換を保存するあらゆる試薬である。「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元は、ジスルフィドをチオール（−ＳＨ）に還元させる化学反応である。ＭａｅｒｔｅｎｓらによるＷＯ９６／０４３８５中に開示されているジスルフィド架橋破壊用作用物質及び方法は、ここで参照により本明細書中に一体化される。「Ｓ−Ｓ」還元は、（１）酵素カスケード経路によってか又は（２）還元化合物によって得ることができる。チオレドキシン、グルタレドキシンのごとき酵素が、ジスルフィドのｉｎ ｖｉｖｏ還元に関与するものとして知られており、ｉｎ ｖｉｔｒｏで「Ｓ−Ｓ」架橋を還元する上で有効であることも示されてきた。ジスルフィド結合は、ＤＴＴでの反応について一定である対応する速度よりも１０^４倍前後大きい見かけの二次速度で、ｐＨ７．０で還元済みチオレドキシンにより急速に開裂される。還元反応速度は、１ｍＭのＤＴＴ又はジヒドロリポアミドと共にタンパク質溶液を予めインキュベートすることにより劇的に増大させることができる（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．１９７９）。
【００８０】
タンパク質ジスルフィド架橋を還元することのできるチオール化合物は、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン及びＮ，Ｎ′−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン及び亜ジチオン酸ナトリウムである。ＨＣＶタンパク質の還元のためには、モノクローナル抗体内のジスルフィド架橋の還元において非常に有用であることが示された（Ｔｈａｋｕｒ、Ｍ．Ｌ．ら、１９９１）、アスコルビン酸塩又は塩化第１スズ（ＳｎＣｌ_２）のごときチオール基無しの還元剤も使用することができる。さらにｐＨ値の変化はＨＣＶタンパク質の酸化還元状態に影響を及ぼし得る。水素化ホウ素ナトリウム処理が、ペプチド内のジスルフィド架橋の還元のために有効であることが示されてきた（Ｇａｉｌｉｔ、１９９３）。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、低いｐＨでジスルフィドを還元できる（Ｂｕｒｎｓ Ｊ．ら、１９９１）。還元剤としてＤＴＴ又は水素化ホウ素ナトリウムが用いられる場合、セレノールがジスルフィドからチオールへの還元の触媒として作用する。市販のジセレニドであるセレノシステアミンが、触媒の前駆体として使用された（Ｓｉｎｇｈ及びＫａｔｓ、１９９５）。
【００８１】
「免疫原性」という語は、免疫応答を生成する１つのタンパク質又は物質の能力を意味する。免疫応答は、抗体形成、細胞性免疫、過敏症、又は免疫学的寛容を含む抗原の導入に対する身体の全応答である、細胞性免疫とは、Ｔ−ヘルパー細胞及び／又はＣＴＬ−応答を意味する。
【００８２】
「抗原性」という語は、１つのタンパク質又は物質が抗体の形成をひき起こす又は細胞応答を惹起する能力を意味する。
【００８３】
本発明による「Ｔ細胞刺激エピトープ」という表現は、それぞれＴ細胞又はＣＴＬ細胞を刺激する能力をもつエピトープを意味する。Ｔヘルパー細胞刺激エピトープは、そのアミノ酸配列内に（推定上の）Ｔ細胞刺激エピトープを含有するポリペプチドに向かってのリンパ増殖性応答を監視することによって選択可能である。前記リンパ増殖性応答は、Ｔ細胞刺激活性についてテストすべきペプチドの濃度が変動する状態で患者の血清からの末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激し放射線標識づけされたチミジン摂取量を計数することを含むＴヘルパー検定によって測定することができる。ＣＴＬ刺激エピトープは、^５１Ｃｒ放出を用いて細胞毒性細胞の分解活性を測定する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）検定を用いて選択可能である。増殖は、刺激指数（抗原刺激された培養の平均ｃｐｍ／対照培養の平均ｃｐｍ）が１より大きい、好ましくは２より大きい、最も好ましくは３より大きい場合に、陽性とみなされる。
【００８４】
本発明のもう１つの態様は、本発明による単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを含む組成物に関する。前記組成物はさらに、薬学的に受容可能な担体を含むことができ、薬剤又はワクチンであり得る。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含む薬剤又はワクチンを網羅する。
【００８６】
本発明のさらにもう１つの態様は、哺乳動物体内でＨＣＶ−特異的免疫応答を誘発するための医薬組成物において有効量の本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分及び任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含んで成る医薬組成物を含む。本発明による有効量のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含む前記医薬組成物は同様に、哺乳動物の体内でＨＣＶ−特異的抗体を誘発する能力又は哺乳動物の体内でＴ細胞機能を誘発する能力を有することもできる。本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を有効量含む前記医薬組成物は予防用組成物又は治療用組成物であり得る。特定の実施形態においては、前記哺乳動物はヒトである。
【００８７】
「哺乳動物」というのは、生児出産、体毛、子供を育てるための乳汁を分泌する乳腺を雌が有することを特徴とするヒトを含む高等脊椎動物哺乳網のあらゆる成員として理解すべきである。かくして哺乳動物は、非ヒト霊長類及びｔｒｉｍｅｒａマウスも包含している（Ｚａｕｂｅｒｍａｎら、１９９９）。
【００８８】
「ワクチン」又は「薬剤」というのは、部分的であるか完全であるかに関わらず、また急性又は慢性のいずれの疾患に対するものであるかに関わらず、１つの疾病に対する防御を惹起する能力をもつ組成物である。この場合、ワクチン又は薬剤は、予防用ワクチン又は薬剤である。ワクチン又は薬剤は、すでに病気の個体を治療するためにも有用であり得るが、その場合、それは治療用ワクチンと呼ばれる。同様に、医薬組成物を予防用及び／又は治療用のいずれの用途でも使用することができ、その場合、それはそれぞれ予防用及び／又は治療用組成物である。
【００８９】
本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質は、そのままの状態で、ビオチニル化された形で（ＷＯ９３／１８０５４中で説明されるように）及び／又はＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ’（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，米国オレゴン州ユージーン）、アビジン又はストレプトアビジンに複合体化された状態で使用することができる。又「ワクチン」又は「薬剤」が、活性物質に加えて、それだけでは組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘発せず、防御を惹起することもない適切な賦形剤、希釈剤、担体及び／又はアジュバントでありうる「薬学的に受容可能な担体」又は「薬学的に受容可能なアジュバント」を含んで成る、ということも指摘しておくべきである。適切な担体は、標準的には、タンパク質、多糖、ボリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子のごとき、大きくゆっくりと代謝される巨大分子である。かかる担体は、当業者にとっては周知である。組成物の有効性を増強するための好ましいアジュバントとしては、制限的な意味なく、以下のものが含まれる：水酸化アルミニウム、ＷＯ９３／１９７８０中に記載されているような３−Ｏ−脱アシル化モノホルホリル脂質Ａ、ＷＯ９３／２４１４８に記載されているようなリン酸アルミニウム、米国特許第４，６０６，９１８号に記載されているようなＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニン−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン２−（１’２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン及び、モノホスホリル脂質Ａ、解毒されたエンドトキシン、トレハロース−６，６−ジミコレ−ト及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含有するＲＩＢＩ（イムノケムリサーチ社（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）、米国モンタナ州ハミルトン）。３つの成分ＭＰＬ，ＴＤＭ又はＣＷＳのいずれかを、単独でも又は２つずつ組合わせた状態でも使用することができる。ＭＰＬを、ＲＣ５２９と呼ばれるその合成アナログによって置換することもできる。さらに、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（ケンブリッジバイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、米国マサチューセッツ州ウォーチェスター）、ＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ）又はＩＳＳ（Ｄｙｎａｖａｘ）又はＣｐＧ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などの細菌性ＤＮＡベースのアジュバントのごときアジュバント、ならびにＱＳ２１及び３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（ＷＯ９４／００１５３）又はＭＦ−５９（チロン（Ｃｈｉｒｏｎ））又はポリ〔ジ（カルボキシラトフェノキシ）フォスファゼン〕、ベースのアジュバント（ヴィールスリサーチインスティチュート（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））、又はＯｐｔｉｖａｘ（ヴァクセル（Ｖａｘｃｅｌ）、サイテックス（Ｃｙｔｅｘ））のごときブロック共重合体ベースのアジュバント、又はＡｌｇａｍｍｕｌｉｎ及びＧａｍｍａＩｎｕｌｉｎ （アニュテック（Ａｎｕｔｅｃｈ））、 不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）又はＧｅｒｂｕ調製物（ゲルブバイオテヒニーク（Ｇｅｒｂｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ））のごときインシュリンベースのアジュバントの組合せのごときアジュバントも使用可能である。非ヒト利用分野そして研究目的のためにも、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を使用することができるということを理解すべきである。「ワクチン組成物」はさらに、水、食塩水、グリセロ−ル、エタノ−ル、湿潤剤又は乳化剤ｐＨ緩衝物質、防腐剤などのごとき本質的に非毒性で非治療用のものである賦形剤及び希釈剤を含有しうる。標準的には、ワクチン組成物は、注入物質として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製される。注入は、皮下、筋肉、静脈内、腹腔内、鞘内、皮内であり得る。その他のタイプの投与としては、移植、坐薬、経口摂取、腸溶性適用、吸入、エアロゾル化又は鼻内噴霧が含まれる。注入に先立ち液体ビヒクル上で溶解させるか、又は液体ビヒクル中に懸濁させるために適した固体形態も同じく調製可能である。該調製は同様に、アジュバント効果を増強させるためリボソ−ム内に乳化又は封入することもできる。ポリペプチドは同様に、サポニン例えばＱｕｉｌ Ａ（ＩＳＣＯＭＳ）と合わせてＩｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅ（免疫促進性複合体）の中に取込むこともできる。ワクチン組成物は、反応性物質ならびにその他の上述の成分のいずれかを免疫学的に有効な量だけ含む。「反応性物質の有効量」というのは、単一用量又は一連の用量。一部として個体に対しその量を投与することが病気の予防又は治療のために、または所望の効果をまたらすのにも有効であることを意味している。この量は、治療すべき個体の健康及び身体条件、治療されるべき個体の分類学的群（例えばヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、有効な免疫応答をしかける個体の免疫系の能力、望まれる防御の度合、ワクチンの処方、治療担当医の査定、感染性ＨＣＶの菌株及びその他の関連性ある要因によって変動する。この量は、日常的な試行を通して決定できる比較的広い範囲内に入ることになると予想される。通常、この量は、１用量につき０．０１〜１０００μｇ、より詳細には０．１〜１００μｇとなる。投与治療は単一用量計画又は多用量投与計画でありうる。ワクチンは、その他の免疫調節剤と合わせて投与することができる。
【００９０】
本発明のもう１つの態様は、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを産生するための方法に関する。
【００９１】
ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を産生するための前記方法は、例えば、該ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分をコードする読取り枠を含む組換え型核酸又はベクターでの宿主細胞の形質転換を含んでおり、ここで前記宿主細胞は、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を発現する能力をもつ。前記方法はさらに、前記タンパク質の発現を得るための適切な培地での前記宿主細胞の培養、前記宿主細胞の培養からの又は前記宿主細胞からの発現済みタンパク質の単離を含む可能性がある。前記単離には、（ｉ）カオトロビック剤の存在下での前記宿主細胞の分解、（ｉｉ）可逆的又は不可逆的でありうる単離されたタンパク質内のシステインのチオール基の化学的修飾及び（ｉｉｉ）ヘパリンアフィニティクロマトグラフィの単数又は複数が包含され得る。
【００９２】
「カオトロピック剤」の例としては、塩化グアジニウム及び尿素がある。一般に、カオトロピック剤は、水の水素結合構造を分断できる化学物質である。濃縮された溶液中で、これらは、疎水性効果を低減させることからタンパク質を変性させることができる。
【００９３】
「組換え型核酸」というのは、制限酵素消化、ＰＣＲ、連結、脱ホスホリル化、ホスホリル化、突然変異誘発、非相同細胞内の発現のためのコドンの適合化などのごとき少なくとも１つの組換え型ＤＮＡ技術操作に付された天然又は合成由来の核酸のことである。一般に、組換え型核酸は、天然に発生する核酸のフラグメントであり、そうでなければ、天然に会合されていない少なくとも２つの核酸フラグメントを含むか又は完全に合成の核酸である。
【００９４】
「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「プローブ」、又は「プライマ」という語は、本明細書で使用される場合、あらゆる長さ又はあらゆる形状の重合体形態（例えば分枝ＤＮＡ）での、ヌクレオチドつまりリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド又はロックヌクレオチド又はそれらの組合せを意味する。さらに前記用語は、２本鎖（ｄｓ）及び１本鎖ポリヌクレオチドを包含する。前記用語は、同様に、メチル化、環化及び「ｃａｐｓ」のごとき既知のヌクレオチド修飾及びイノシンのごときアナログ又はＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）のごとき増幅不能な単量体での単数又は複数の天然に発生するヌクレオチドの置換をも包含する。リボヌクレオチドは、ＮＴＰと、デオキシリボヌクレオチドはｄＮＴＰと、ヌジデオキシリボヌクレオチドはｄｄＮＴＰと記される。
【００９５】
ヌクレオチドは一般に、放射線、化学発光、螢光、リン光によって又は赤外線染料で又は表面増強ラマン標識又はプラズモン共鳴粒子（ＰＲＰ）で標識することができる。
【００９６】
前記用語「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「プローブ」、又は「プライマ」は同様に、バックボーンが、糖ではなくむしろＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から成る偽ペプチドであるＤＮＡアナログであるペプチド核酸（ＰＮＡ）をも包含する。ＰＮＡは、ＤＮＡの挙動を模倣し、相補的核酸ストランドを結合する。ＰＮＡの中性バックボーンは、結果として、通常達成されるものよりもさらに強い結合及びより大きい特異性をもたらす。さらに、ＰＮＡがもつ独特の化学的、物理的及び生物学的特性は、強力な生体分子手段、アンチセンス及び抗原作用物質、分子プローブ及びバイオセンサーを産生するために開発利用されてきた。ＰＮＡプローブは、一般にＤＮＡプローブよりも短いものであり得、一般には６〜２０個、より最適には１２〜１８個の長さの塩基（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．２００１）という長さをもつ。前記用語はさらに、２’酸素と４’炭素の間のメチレン結合によってリボース環が制約されているＲＮＡ誘導体であるロック核酸をも包含する。ＬＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的配列に向かって、類をみない結合親和力を示す、ＬＮＡヌクレオチドはオリゴマー化され得、キメラ又はミックスマーＬＮＡ／ＤＮＡ又はＬＮＡ／ＲＮＡ分子の中に取込まれ得る。ＬＮＡは、培養された細胞に対し毒性をもたないように見える（Ｏｒｕｍ，Ｈ．及びＷｅｎｇｅｌ，Ｊ．２００１、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ．ら、２０００）。一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡのいずれかのキメラ又はミックスマーが、ウラシルでチミンが置換されているこれらのいずれかと同様に考慮される。
【００９７】
以上のことから、本発明が同様に、ＨＣＶワクチン組成物の製造のための、本発明によるコア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質又は本発明による組成物の使用にも関していることは明白である。特に、本発明は、慢性ＨＣＶのキャリヤにおいてＨＣＶに対する免役性を誘発するための、本発明によるコア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質の使用にも関する。より詳細には、本発明は、例えば、リバビリンなどのＨＣＶ治療用の小さい薬物の投与と組合せた形又は組合せない形のいずれかでの周知のインターフェロン療法のごときその他のあらゆる療法の前に、同時に又は後で慢性ＨＣＶキャリヤにおいてＨＣＶに対する免疫性を誘発するための、本明細書に定義された通りのコア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質の使用に関する。かかる組成物は同様に、肝臓移植の前後、又は例えば針で刺したけがなどのような推定感染の後にも利用されうる。
【００９８】
本発明のもう１つの態様は、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
（ｉ）前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分と前記抗−ＨＣＶ抗体の複合体化を可能にする条件下で前記試料と本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を接触させる段階；
（ｉｉ）（ｉ）で形成された複合体を検出する段階；及び
（ｉｉｉ）前記試料中の前記抗−ＨＣＶ抗体の存在を（ｉｉ）から推論する段階、を含んで成る方法に関する。特定の実施形態においては、段階（ｉ）での接触は競合的条件で起こる。前記方法に対するもう１つの特定の実施形態においては、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は固体支持体に結合させられている。さらなる一実施形態においては、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている前記試料は生体試料である。
【００９９】
本発明のさらなる一態様は、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出するための診断用キットであって、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含んで成るキットに関する。その特定の一実施形態においていは、前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、固体支持体に結合させられている。さらなる一実施形態においては、抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている前記試料は、生体試料である。
【０１００】
本明細書で使用する「生体試料」という語は、血清、血漿、リンパ液、皮ふ、気道、腸管及び尿生殖路の外部切片、卵母細胞、涙、唾液、乳汁、血球、腫瘍、器官、胃分泌物、粘液、脊髄液、例えば排泄物、尿、精液などのごとき外分泌物を含む（ただしこれらに限られるわけではない）、個体から単離された組織又は流体の試料を意味する。
【０１０１】
本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分は、抗−ＨＣＶ抗体の検出及び／又はＨＣＶの遺伝子型特定のための免疫検定に取込むため、ＨＣＶ疾患の診断／監視のため又は治療剤として、特に適している。
【０１０２】
本発明による免疫検定方法は、ＨＣＶの感染を受けた個体からの血清中で抗体により認識された線形（ペプチドの場合）及びコンホーメーションエピトープを維持する本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質を利用している。本発明のＨＣＶ Ｅ１及びＥ２抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を利用する実質的に任意の検定方式で利用することができる。当然のことながら、ＨＣＶコンホーメーションエピトープを変性する方式は避けるか適合させるべきである。これらの検定全てに共通の特長は、成分中に存在するそのようなあらゆる抗体に抗原が結合できるようにする条件の下で、ＨＣＶ抗体を含有することが推測されている身体成分と抗原を、接触させるという点にある。かかる条件は、標準的には、余剰の抗原を用いたイオン強度、生理的温度及びｐＨとなる。供与体との抗原のインキュベーションの後には、抗原を含む免疫複合体の検出が行なわれる。
【０１０３】
免疫検定の設計は、大きく変貌を遂げ、数多くの方式が当該技術分野において知られている。例えば、プロトコルは、固定支持体又は免疫沈降を使用することができる。大部分の検定には、標識づけされた抗体又はポリペプチドの使用が関与している。標識は、例えば酵素、螢光、化学発光、放射性又は染料分子でありうる。免疫複合体からのシグナルを増幅する検定も同様に知られている。その例としては、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを利用する検定及び、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ検定のごとき酵素標識づけ及び媒介された免疫検定がある。
【０１０４】
免疫検定は、不均質又は均質方式、及び標準型又は競合型であってよいがこれらに限られない。不均質方式では、ポリペプチドは、標準的に、インキュベーション後ポリペプチドからの試料の分離を容易にするため固体マトリックス又は支持体に結合されている。使用可能な固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば膜又はマイクロタイターウエル形態）、ポリ塩化ビニル（例えばシート又はマイクロタイターウエル状）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート状）、ポリフッ化ピリニデン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ^ＴＭとして知られている）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビス及びプロテインＡビーズがある。例えば、不均質方式では、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌｏn^ＴＭ１又はＩｍｍｕｎｏｌｏｎ^ＴＭ２マイクロタイタープレートを使用することができる。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、標準的に、試験試料からそれを分離した後に、及び結合された抗体の検出に先立って洗浄される。標準方式と競合方式の両方が、当該技術分野で知られている。
【０１０５】
均質方式では、試験試料は、溶解状態の抗原の組合せと共にインキュベートされる。例えば、それは、形成されているあらゆる抗原抗体複合体を沈降させることになる条件下にあってよい。これらの検定のための標準方式及び競合方式が、当該技術分野において知られている。
【０１０６】
標準方式では、抗体抗原複合体内のＨＣＶ抗原などの量は、直接監視される。これは、前記抗−ＨＣＶ抗体のような前記抗体上のエピトープを認識する標識づけされた抗異種（例えば抗ヒト）抗体が複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって達成され得る。競合方式では、試料中の前記ＨＣＶ抗体のような前記抗体の量は、複合体内における既知の量の（標識づけされた）抗体（又はその他の競合するリガンド）、又は抗原の結合に対する競合効果を監視することによって、演繹される。
【０１０７】
抗原抗体複合体は、方式に応じて、一定の既知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の標識づけされていない抗−ＨＣＶ抗体のような抗体は、標識（例えば酵素標識）で複合体化された抗−異種Ｉｇの抱合体を用いて検出可能である。
【０１０８】
免疫沈降又は凝集検定方式においては、抗原と抗体の間の反応は、溶液又は懸濁液から沈降して沈降物の目に見える層又はフィルムを形成するタンパク質クラスターを形成する。供与体中、又は試料中に抗体が存在しない場合、沈降物は全く形成されない。
【０１０９】
コンホーメーションエピトープで構成された本発明のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその特定の部分は、標準的には、これらの免疫検定中で使用するためキットの形で包装されることになる。キットは、通常は、別々のコンテナ内に、未変性ＨＣＶ抗原；対照抗体製剤形態（ポジティブ及び／又はネガティブ）、検定方式が必要とする場合には標識づけされた抗体及び標識が直接シグナルを生成しない場合にはシグナル生成用試薬（例えば酵素基板）を収納することになる。未変性ＨＣＶ抗原はすでに固体マトリクスに結合されていてもよいし、又はそれをマトリクスに結合するための試薬を伴って別々であってもよい。キットの中には、通常、検定を実施するための説明書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ）が包含される。
【０１１０】
選択された固相には、ガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレイのマイクロウェル）試験管、及び磁気ビーズが含まれ得る。シグナル生成用化合物としては、酵素、発光性化合物、色原体、放射性元素及び化学発光性化合物が含まれ得る。酵素の例としては、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼが含まれる。エンハンサー化合物には、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが含まれる。エンハンサー化合物結合成員の例としては、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが含まれる。リウマチ因子様物質の効果を遮断するために、試験試料は、リウマチ因子様物質の効果を遮断するのに充分な条件に付される。これらの条件には、混合物を形成するべく一定量の抗−ヒトＩｇＧと試験試料を接触させること及び、実質的にリウマチ因子様物質を含まない反応混合物製品を形成するのに充分な時間、充分な条件下で混合物をインキュベートすることが含まれる。
【０１１１】
特に、本発明は、診断用キットを調製するための、本発明によるＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分の使用に関係する。
【０１１２】
本発明によるコア−グリコシル化されたＨＣＶエンベロープタンパク質は免疫原性がきわめて高く、体液性及び細胞性の両方の免疫応答を刺激することから、本発明はさらに、本発明の精製された単一のＨＣＶエンベロープタンパク質又はオリゴマー粒子を含む、ＨＣＶ関連Ｔ細胞応答を検出するためのキットにも関する。ＨＣＶ Ｔ細胞応答は、例えば、Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら、によりＷＯ９５／１２６７７明細書中で記載されている通りに測定することができる。
【０１１３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物の体内でＨＣＶ−特異的免疫応答を誘発する方法であって、薬学的に受容可能なアジュバントを任意に含む本発明による有効量のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法に関する。本発明による有効量のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記哺乳動物に投与する段階を含む前記方法は、哺乳動物の体内でＨＣＶ−特異的抗体を誘発するため又は哺乳動物内で特異的Ｔ細胞機能を誘発するためにも使用することができる。前記方法においては、前記投与は、予防目的（すなわち予防的投与）又は治療目的（すなわち治療的投与）をもち得る。
【０１１４】
本発明のさらにもう１つの態様は、哺乳動物を免疫化する方法であって、任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含む本発明による有効量のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記哺乳動物に投与する段階を含む方法に関する。
【０１１５】
本発明は、同様に、ＨＣＶに感染した哺乳動物を治療する方法であって、任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含む本発明による有効量のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を前記哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法にも関する。
【０１１６】
本発明の上述の態様又は前記態様に特定の実施形態はいずれも、一般に、真核細胞内の発現産物であり２つの異なるＨＣＶエンベロープタンパク質について上述したものと同じ特性によって特徴づけされる問題のタンパク質にも適用可能である。
【０１１７】
より詳細に言うと、本発明は、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含む単離タンパク質又はそのフラグメントに関し、該タンパク質又はそのフラグメントは、真核細胞内の発現産物であり、さらにはＮ−グリコシル化された部位の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％又は８０％までがコアグリコシル化されていることを特徴とする。より詳細には、Ｎ−グリコシル化された部位の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％よりも多くが、Ｍａｎ（８〜１０）−ＧｌｃＮＡｃ（２）によって定義される構造をもつオリゴマーマンノースでグリコシル化されている。上述のＮ−グリコシル化特徴のいずれかにより詳細に言うと、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位に対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースでコアグリコシル化された部位の比率は、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下である。上述のＮ−グリコシル化特徴のいずれかにさらに詳細に言うと、前記オリゴマンノースは、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【０１１８】
本発明のもう１つの変形態様は、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含む単離されたタンパク質において、真核細胞内の発現産物であることそしてさらには、構造Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースに対する構造Ｍａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）をもつオリゴマンノースの比率が、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４４、０．４５又は０．５０以下であるオリゴマンノースにより、Ｎ−グリコシル化された部位が占有されていることを特徴とする単離されたタンパク質に関する。上述のＮ−グリコシル化特徴のいずれかにさらに詳細に言うと、前記オリゴマンノースは、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満の末端α１，３マンノースを含有する。
【０１１９】
特に、前記単離された問題のタンパク質及びそのフラグメントは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞のごとき酵母細胞内の発現産物である。前記単離された問題のタンパク質又はそのフラグメントは、例えばＨＣＶエンベロープタンパク質又はＨＢＶ（Ｂ型肝炎）エンベロープタンパク質又はそのフラグメントのごときウイルスエンベロープタンパク質又はそのフラグメントであり得る。その他のウイルスエンベロープタンパク質の例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベロープタンパク質ｇｐ１２０及び、Ｆｌａｖｉｒｉｄｅａｅに属するウイルスのウイルスエンベロープタンパク質が含まれる。一般に、前記単離された問題のタンパク質又はそのフラグメントは、本発明のＮ−グリコシル化特性を必要とするあらゆるタンパク質であり得る。
【０１２０】
「ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス」というのは、ＨＣＶタンパク質又はその一部分をコードする核酸配列を含むワクシニアウイルスを意味する。
【０１２１】
「ＨＣＶエンベロープタンパク質から形成されるＨＣＶウイルス様粒子」、「ＨＣＶエンベロープタンパク質から形成されるオリゴマー粒子」という語は、ここでは、それ自体それぞれ１つ又は２つのＥ１及び／又はＥ２単量体から成ると考えられているＨＣＶ Ｅ１及び／又はＥ２エンベロープタンパク質の複数の基本単位を含有する特定の性質及び形状の構造として定義づけされる。本発明の粒子が、感染性ＨＣＶＲＮＡゲノムが欠如しているものとして定義づけされていることは明白であるはずである。本発明の粒子、脂質、界面活性剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子を中に取りこむことのできるエンベロープタンパク質のシェルから成る、空であって良い球状の高次粒子であり得る。後者の粒子は、同様に、例えばアポリポタンパク質Ｂ又は低密度リポタンパク質のごときリポソーム又はアポリポタンパク質によってか又は特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段により包理され得る。この場合、このような空の球状粒子は往々にして、「ウイルス様粒子」又はＶＬＰと呼ばれる。あるいはまた、高次粒子は、中で完全な球がＨＣＶ Ｅ１又はＥ２エンベロープタンパク質オリゴマーで構成され、脂質、界面活性剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子が中にさらに取込まれる可能性があるか又はそれ自体、例えば、アポリポタンパク質Ｂ、低密度リポタンパク質のごときリポソーム又はアポリポタンパク質又は、例えば、アシアログリコタンパク質のごとき特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段によって包埋され得る、固体球状構造であり得る。該粒子は同様に、通常は丸い（以下参照）形状をもち通常はＨＣＶエンベロープタンパク質を単一層しか含まないより小さな構造（上述の空の又は固体球形構造に比べて）で構成される可能性もある。かかる小さな粒子の標準的例は、通常４〜１６の間のより少ない数のＨＣＶエンベロープタンパク質から成るロゼット様の構造である。後者の特定の例には、明らかに８〜１０個のＥ１単量体を含有する、ここで例示されている通りの０．２％のＣＨＡＰＳ中でＥ１で得られるさらに小さい粒子が含まれる。かかるロゼット様の構造は、通常１つの平面内で組織され、丸形、例えばホイール形状をしている。ここでも又、脂質、界面活性剤、ＨＣＶコアタンパク質、又はアジュバント分子をさらに取込ませることもできるし、又、例えばアポリポタンパク質Ｂ又は低密度リポタンパク質のごときリポソーム又はアポリポタンパク質によってか又は特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングする他のあらゆる手段により、さらに小さい粒子を包埋させることもできる。より小さい粒子は、同様に、脂質、界面活性剤、ＨＣＶコアタンパク質、又はアジュバント分子をさらに中に取込ませることができ、又それ自体アポリポタンパク質Ｂ又は低密度リポタンパク質のごときリポソーム又はアポリポタンパク質によってか又は特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングする他のあらゆる手段により、包埋させることのできる、同様のより少数のＨＣＶ Ｅ１又はＥ２エンベロープタンパク質から成る小さい球状又は小球形構造をも形成し得る。当該技術分野において周知の動的光散乱技術（さらに例の項を参照のこと）によって測定される通りの上述の粒子のサイズ（すなわち直径）は、通常１〜１００ｎｍの間、より好ましくは２〜７０ｎｍの間、さらに一層好ましくは２〜４０ｎｍ、３〜２０ｎｍ、５〜１６ｎｍ、７〜１４ｎｍ又は８〜１２ｎｍの間にある。
【０１２２】
特に、本発明は、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
（ｉ） ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる段階；
（ｉｉ） 前記ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす段階、及び
（ｉｉｉ） 前記コア−グリコシル化されたＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を前記細胞培養から精製する段階、
を含んで成る方法に関する。
【０１２３】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
（ｉ） ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる段階、
（ｉｉ） 前記ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす段階、及び
（ｉｉｉ） 前記細胞内で発現されたコア−グリコシル化済みＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分を、形質転換された宿主細胞が溶解してから精製する段階、
を含んで成る方法に関連する。
【０１２４】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって：
（ｉ） 少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる段階、
（ｉｉ） 前記ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす段階、及び
（ｉｉｉ） 前記Ｃｙｓ−アミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記コア−グリコシル化化されたＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその一部分を前記細胞培養から精製する段階、
を含んで成る方法に関連する。
【０１２５】
本発明はさらに、免疫検定又はワクチンでの使用に適した、コア−グリコシル化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法であって、
（ｉ） 少なくとも２つのＣｙｓ−アミノ酸を含むＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその任意の一部分をコードするエンベロープ遺伝子で形質転換されたＨａｎｓｅｎｕｌａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓグリコシル化マイナス菌株を適切な培地で増殖させる段階、
（ｉｉ） 前記ＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２ 遺伝子又はその任意の一部分の発現をひき起こす段階、及び
（ｉｉｉ） 前記Ｃｙｓ−アミノ酸が化学的及び／又は酵素的手段で可逆的に保護されている、前記細胞内発現されたコア−グリコシル化されたＨＣＶ Ｅ１及び／又はＨＣＶ Ｅ２タンパク質又はその一部分を、形質転換された宿主細胞が溶解してから精製する段階、を含んで成る方法に関連する。
【０１２６】
本発明は、詳細にはヘパリンアフィニティクロマトグラフィが包含される、本明細書中に記載される通りの組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法に関する。
【０１２７】
従って、本発明は同様に、前記化学的手段がスルホン化である、以上で記載されている通りの組換え型コア−グリコシル化済み酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法に関する。
【０１２８】
従って本発明は同様に、Ｃｙｓ−アミノ酸の前記可逆的保護が化学的及び／又は酵素的手段による不可逆的保護と交換される、以上で記載されている通りの、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【０１２９】
従って本発明は同様に、化学的手段による前記不可逆的保護がヨードアセタミドである、以上で記載されている通りの、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【０１３０】
従って本発明は同様に、前記化学的手段による不可逆的保護がＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭ又はその混合物である、以上で記載された通りの、組換え型コア−グリコシル化済みＨＣＶ酵母タンパク質又はその任意の一部分を精製するための方法にも関する。
【０１３１】
本発明は同様に、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／又はＮＳ５Ｂ タンパク質又はその一部をも含む上述の通りの組成物にも関する。本発明のコア−グリコシル化されたタンパク質Ｅ１、Ｅ２、及び／又はＥ１／Ｅ２は例えば、その他のＨＣＶ抗原例えばコア、Ｐ７、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／又はＮＳ５Ｂと組合わせることもできる。これらのＮＳ３タンパク質の精製は、好ましくは、システイン残基の可逆的修飾、そしてさらに一層好ましくは、システインのスルホン化を包含することになる。スルホン化を含めた、かかる可逆的修飾を得るための方法がＮＳ３タンパク質についてＭａｅｒｔｅｎｓら、（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０２５４７）の中で記載されてきた。後者の文書における全ての定義づけを含めた全内容が、参照により本明細書に一体化されるという点を強調しておくべきである。
【０１３２】
また、本発明は、コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質が、一連の時間及び化合物の一部として使用されることを特徴とする、ＨＣＶに対する免疫性を誘発するための本明細書に記載された通りのコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質の使用に関する。この点において、「一連の時間及び化合物」という語は、免疫応答を惹起するために用いられる化合物を個体に対し時間的間隔をおいて投与することを意味すると理解すべきである。後者の化合物は、次の成分のうちのいずれかを含むことができる：コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物、ＨＣＶポリペプチド。
この点において、一連のものには、以下のような投与が含まれる：
（ｉ）時間的間隔をおいた、例えばコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質のごときＨＣＶ抗原の投与、又は
（ｉｉ）前記コア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質オリゴマー粒子及び前記ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物を同時に、又は交番する時間的間隔を含めた、異なる時間的間隔をおいて投与できる、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物と組合せた形での、例えばコア−グリコシル化されたエンベロープタンパク質のごときＨＣＶ抗原の投与、又は
（ｉｉｉ）時間的間隔を置いた、場合によってはその他のＨＣＶペプチドと組合わせた形での（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかの投与。
【０１３３】
この点において、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物が、Ｅ１−、Ｅ２−、Ｅ１／Ｅ２−ペプチド、ＮＳ３ペプチド、その他のＨＣＶペプチド又は前記ペプチドの一部分を含めたＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸を含んで成ることは明白であるはずである。その上、前記ＨＣＶペプチドは、Ｅ１−、Ｅ２−、Ｅ１／Ｅ２−ペプチド、その他のＨＣＶペプチド又はその一部分を含めたＨＣＶエンベロープペプチドを含んで成ることを了解すべきである。「その他のＨＣＶペプチド」という語は、あらゆるＨＣＶペプチド又はそのフラグメントを意味する。上述のスキームの項目（ｉｉ）において、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物は、好ましくはＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸を含んで成る。上述のスキームの項目（ｉｉ）において、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物は、より一層好ましくは、場合によってはＨＣＶ−ＮＳ３ＤＮＡワクチン組成物と組合せた形でＨＣＶエンベロープペプチドをコードする核酸で構成されている。この点において、ＨＣＶ ＤＮＡワクチン組成物が転写調節要素に作動可能な形で連結された上述のとおりのＨＣＶペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターを含んで成ることは明白であるはずである。本明細書で使用するように「プラスミドベクター」とは、それが連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。一般に、制限的な意味はないものの、プラスミドベクターは、そのベクター形態で染色体に結合されていない環状２本鎖ＤＮＡループである。本明細書で使用されている「ポリヌクレオチド配列」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のごときポリヌクレオチドそして該当する場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この語は、等価物として、ヌクレオチドアナログ及び１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログを包含するものとして理解されるべきである。本明細書で使用されている「転写調節要素」という語は、生きた脊椎動物の細胞の中に導入した時点で、該ポリヌクレオチドによりコードされた翻訳産物を産生するべく細胞メカニズムを導くことができるような形で必須調節要素を含有するヌクレオチド配列を意味する。作動可能な形で連結されたという語は、構成要素がその通常の機能を果たすように構成されている並置を意味する。かくして、ヌクレオチド配列に対し作動可能な形で連結された転写調節要素は、前記ヌクレオチド配列の発現をもたらす能力をもつ。当業者であれば、異なる転写プロモータ、ターミネーター、担体ベクター又は特異的遺伝子配列をうまく使用することが可能であるということを認識できる。あるいはまた、アデノウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、ＭＶＡなどのごとき生きたベクターを通してＤＮＡワクチンを送達することも可能である。
【０１３４】
本発明は、以下に記載の実施例により例示される。これらの例は、単なる一例にすぎず、いかなる形であれ本発明を制約又は制限するものとみなされるものではない。
【０１３５】
実施例１
ＰＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形質転換のためのプラスミドを以下のように構築した。ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを多工程手順で構築した。最初に、ＨＣＶ Ｅ１ｓタンパク質をコードする核酸配列ＣＳＮ２１をＣＨＨリーダー配列（ＣＨＨ＝Ｃａｒｃｉｎｕｓ ｍａｅｎａｓ血糖上昇ホルモン）に従ってクローニングし、これをその後ＭＦαリーダー配列に変更した（ＭＦα＝Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｒｉｓｉａｅα−交接因子）。
【０１３６】
最初に、シームレスクローニング方法によりＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６単位を包含したｐＵＣ１８誘導体を構築した（パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ），Ｋ．Ａ．および、ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ），Ｊ．Ａ．１９９６）。さらに、Ｅ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメント及びｐＣＨＨ−Ｈｉｖ−由来の受容体プラスミドを以下に記載する通りＰＣＲにより得た。
【０１３７】
Ｅ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメントの生成
プラスミドＰＧＥＭＴＥ１ｓＨ６（配列番号６、図１）からＰＣＲにより、［６−Ｈｉｓ−残基で伸長されたＥ１ｓのアミノ酸１９２〜３２６から成るＨＣＶ１ｂＥ１ｓ型タンパク質についてコードする（配列番号５）］Ｅ１−Ｈ６ＤＮＡフラグメントを単離した。さらに、以下のプライマーを使用した。
−ＣＨＨＥ１−Ｆ：
【化５】

（配列番号７）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨ−ｌｉｎｋｓの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基は、センス方向でＥ１の開始領域（１９２〜３２６）中にアニールする。
−ＣＨＨＥ１−Ｒ：
【化６】

（配列番号８）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＭＦ３０−ｒｅｃｈｔｓの塩基に対し相補的である。その後のクローニング手順に有用なＢａｍＨＩ部位を形成する塩基はイタリックで印刷されている。マークの付いていない塩基は、停止コドン及び停止コドンとＢａｍＨＩ部位との間の３つの塩基を含め、Ｅ１−Ｈ６単位の末端中にアンチセンス方向にアニールする。
【０１３８】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。２０ｎｇのＥｃｏ３１１−線形化ｐＧＥＭＴＥ１ｓＨ６、各々０．２μＭのプライマーＣＨＨＥ１−Ｆ及びＣＨＨＥ１−Ｒ、ｄＮＴＰ’Ｓ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１ ８３４）、２．５ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１ ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１３９】
以下の工程から成るプログラム１を使用した
１． 変性：９５℃で５分
２． ９５℃での変性３０秒、６５℃でのアニーリング３０秒、及び６８℃での伸長１３０秒を１０サイクル。
３． ４℃での終結。
【０１４０】
その後５０μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー；カタログ番号１６８１ ８３４）、４０μＬのＨ_２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２ｍＭ）；１０ｍＭ５−メチルｄＣＴＰ］を、プログラム１に由来する試料に添加し、以下の工程から成るプログラムに従って増幅を実施した。
１． 変性；９５℃で５分
２． ９５℃での変性４５秒、６５℃でのアニーリング３０秒、６８℃での伸長１３０秒を５サイクル。
３． ４℃で終結。
【０１４１】
ｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミドの生成
ｐＣＨＨ−Ｈｉｒプラスミド（配列番号９；図２）からＰＣＲにより受容体プラスミドを製造し、これは、Ｈｉｒコーディング配列がＰＣＲ産物内には存在しないという点を除いて、ほぼ完全なｐＣＨＨ−Ｈｉｒプラスミドで構成されている。このＰＣＲのためには、以下のプライマーを使用した。
１．ＣＨＨ−Ｌｉｎｋｓ：
【化７】

（配列番号１０）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨＥ１−Ｆの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基はアンチセンス方向でＣＨＨ配列の末端中にアニールする。
２．ＣＨＨ−Ｌｉｃｈｔｓ：
【化８】

（配列番号１１）；
Ｅａｍ１１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＣＨＨＥ１−Ｒの塩基に対し相補的である。マークの付いていない塩基は、インサートから離れるような方向で、ｐＣＨＨ−ＨｉｒのクローニングされたＣＨＨ−Ｈｉｒｕｄｉｎ ＨＬ２０の後ろのｐＵＣ１８配列中にアニールする。
【０１４２】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。２０ｎｇのＡｓｐ７１８Ｉ−線形化ｐＣＨＨ−Ｈｉｒ、各々０．２μＭのプライマーＣＨＨ−ｌｉｎｋｓ及びＭＦ３０−ｒｅｃｈｔｓ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガーカタログ番号１６８１ ８３４）、２．５ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号−１６８１ ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１４３】
上述の通りのプログラムを使用した。
【０１４４】
その後５μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー；カタログ番号１６８１ ８３４）、４０μＬのＨ_２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ(各２ｍＭ)；１０ｍＭ５−メチルｄＣＴＰ］を、プログラム１に由来する試料に添加し、上述の通りにプログラムに従って増幅を実施した。
【０１４５】
ベクターｐＣＨＨＥ１の生成
上述の通りＰＣＲにより生成されたｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミドとＥ１ｓ−Ｈ６−コーディングＤＮＡフラグメントを、供給業者の仕様書に従って、ＰＣＲ産物精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。その後、精製されたフラグメントをＥａｍ１１０４Ｉで別々に消化した。その後、Ｅ１ｓ−Ｈ６ＤＮＡフラグメントを供給業者の仕様書に従って、Ｔ４リガーセ（ベーリンガー）を用いてｐＣＨＨ−Ｈｉｒ由来の受容体プラスミド内に連結させた。
【０１４６】
連結混合物でＥ．Ｃｏｌｉ．ＸＬ−Ｇｏｌｄ細胞を形質転換し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩでの消化により、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを分析した。陽性クローンを選択し、これをｐＣＨＨＥ１と呼称した。
【０１４７】
ベクターｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６の生成
ｐＣＨＨＥ１ｋのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２：図３）と連結させた。供給業者の指示に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５αＦ細胞を形質転換するために連結混合物を使用した。プラスミドＤＮＡの制限パターン上でいくつかの形質転換体を分析し、陽性クローンを保留し、これをｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６と呼称した（配列番号１３：図４）。
【０１４８】
ｐＦＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６の生成
最後に、以下のような３つのフラグメントの連結により、シャトルベクターｐＦＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６を生成した。
１． ６．９６１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２：図３）
２． ０．２４５（ｋｂ）のｐＵＣ１８−ＭＦａのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（配列番号６２：図３６）及び
３． ｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１Ｈ６に由来する０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物の０．４４２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント。
【０１４９】
以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、フラグメントＮｏ．３を発生させる０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
１．プライマーＭＦａ−Ｅ１ｆ−Ｈｉ：
【化９】

（配列番号１４）及び
２．プライマーＥ１ｂａｃｋ−Ｂａｍ
【化１０】

（配列番号１５）
【０１５０】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた。反応混合物体積５０μＬ、ｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６（ＥｃｏＲＩ線形化；１５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ；プライマーＭＦａ−Ｅ１ｆ−Ｈｉ（５０μＭ）、０．２５μＬ；プライマーＥ１ｂａｃｋ−Ｂａｍ（５０μＭ）；０．２５μＬ；ｄＮＴＰ（全て２ｍＭで）、５μＬ；ＤＭＳＯ、５μＬ；Ｈ_２Ｏ、３３．５μＬ；Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；カタログ番号１６８１ ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、５μＬ；Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムポリメラーセー混合物（１Ｕ／μＬ）、０．５μＬ。
【０１５１】
以下の工程から成るＰＣＲプログラムを使用した。
１． 変性：９５℃で５分
２． ９５℃での変性４５秒、５５℃でのアニーリング４５秒、及び６８℃での伸長４０秒を２９サイクル。
３． ４℃での終結。
【０１５２】
使用されたプライマーに基づいて、結果としてもたらされた０．４５４ｋｂのＰＣＲ産物は、Ｅ１（１９２−３２６）のコドンとそれに続く６個のヒスチジンコドン及び「ｔａａ」停止コドンを含み、これは上流で、（クローニング関連ＨｉｎｄＩＩＩ部位プラス６塩基対オーバーハングを含む）ＭＦαプレプロＳＡの２２の３’末端塩基対によりフランキングされ、下流で（クローニング関連）ＢａｍＨＩ部位及び６塩基対オーバーハングによりフランキングされていた。
【０１５３】
連結反応のためには、供給業者の条件（試料体積２０μＬ）に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用した。
【０１５４】
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換させ、複数の形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析の後陽性クローンを保留した。陽性プラスミドを選択し、これをｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（配列番号１６、図５）と呼称した。
【０１５５】
実施例２
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換のためのプロスミドを以下のように構築した。ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを、ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（配列番号１６、図５）から出発して３工程で構築した。
【０１５６】
第１工程では、ｐＵＣ１８ベクター内にｐＦＰＭＴ−ＭＦαのＭＦα−Ｅ１−Ｈ６読み取り枠をサブクローニングした。従って、（ＦＭＤプロモータープラスＭＦα−Ｅ１＝Ｈ６を含む）ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６の１．７９８ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ フラグメントを、供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＵＣ１８のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩベクターフラグメントに連結させた。この結果、図６に描かれているプラスミド（配列番号１７）が得られ、さらにこれをｐＭａ１２−１（ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６）と呼称した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換するために連結混合物を使用した。複数のアンピシリン耐性コロニーを採収し、採収したクローンから単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素消化により分析した。ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６コーディング配列のＤＮＡ配列を決定することにより、陽性クローンをさらに分析した。ＭＦαプレプロ配列を鳥類リゾチームプレ配列のコドンで置換するべくＰＣＲ誘導型突然変異誘発のために適正なクローンを使用した（「ＣＬ」：鳥類リゾチームのアミノ酸１〜１８に対応する；配列番号１）。適用されたＰＣＲ誘導型突然変異誘発方法の原理は、プライマーの５’末端にある所望の改変を伴う全プラスミドの増幅に基づいている。下流側の工程では、線形ＰＣＲ産物の終りは、自己連結に先立ち修飾され、所望の改変済みプラスミドをもたらす。
【０１５７】
ＰＣＲ反応のためには、以下のプライマーが用いられた。
１．プライマー ＣＬ ｈｉｎ；
【化１１】

（配列番号１８）
２．プライマー ＣＬ ｈｅｒ ｎｅｕ；
【化１２】

（配列番号１９）
【０１５８】
プライマーの下線のある５’領域は、鳥類リゾチームプレ配列の約半分のコドンを含有する。プライマーＣＬｈｅｒｎｅｕは、ＳｐｅＩ制限部位（イタリック体）を包含する。プライマーの下線の付されていない領域は、Ｅ１（ＣＬ ｈｉｎ）のアミノ酸残基１９２〜１９９についてコドン、又はＥｃｏＲＩ部位を越えてＦＭＤプロモーターの位置−１９（ＥｃｏＲＩ部位から因子）までの「ａｔｇ」開始コドンとアニールする。該プライマーは完全なｐＭａ１２−１を増幅し、かくしてＭＦａプレプロ配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンを置換する。
【０１５９】
反応混合物は、以下のように構成されていた；ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦα−Ｅ１−Ｈ６（ｐＭａ１２−1；１．３ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマー ＣＬ ｈｉｎ（１００μＭ）、２μＬ；プライマー ＣＬ ｈｅｒ ｎｅｕ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ_２Ｏ、７６μＬ；Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム（ベーリンガー；カタログ番号１６８１ ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ；Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムポリメラーセー混合物（１Ｕ／μＬ）、０．５μＬ。
【０１６０】
以下の工程から成るＰＣＲプログラムを使用した；
１． 変性：９５℃で１５分
２． ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、及び７２℃での伸長１分を３５サイクル。
３． ４℃での終結。
【０１６１】
結果として得られたＰＣＲ産物を、その適正なサイズ（３．５ｋｂ）についてアガロースゲル電気泳動により検査した。その後ＰＣＲ産物の３’−Ａオーバーハング形態をＴ４ポリメラーセー反応によって除去し、結果として、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端がもたらされた。従ってＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー；１Ｕ／μＬ）で処理した。すなわち、残った９５μＬのＰＣＲ反応混合物に対して１μＬのＴ４ポリメラーゼ及び４μＬ ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭで）を添加した。３７℃で２０分間試料をインキュベートした。その後、ＤＮＡをエタノールで沈降させ１６μＬのＨ_２Ｏ中で取り上げた。
【０１６２】
その後、５’−リン酸塩をキナーゼ反応により平滑末端ＰＣＲ産物に添加した。従って、１６μＬの平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１６３】
その後、ＤＮＡを１％のアガロースゲル上に適用し、供給業者の条件に従ってゲル抽出キット（キアゲン）を用いて適正な産物バンドを単離した。その後５０ｎｇの精製済み産物を供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で７２時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、２０μＬの水中で溶解させた。
【０１６４】
その後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α−Ｆ’細胞を１０μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピンリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化を用いて検査した。陽性クローンを保留し、これをｐ２７ｄ−３と呼称した（ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６、配列番号２０、図７）。その後、ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６読取り枠をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１６５】
最終工程では、以下に記載する通りにｐＦＰＭＴＭ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６シャトルベクターを構築した。ｐ２７ｄ−３の０．４８６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（ＣＬ−Ｅ１（１９２−３２６）−Ｈ６を包含するものを）をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図３）と連結させた。反応のためには供給業者の推奨事項に従って、Ｔ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。連結試料中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１０μｌのＨ_２Ｏ中に溶解させた。１０μＬの連結試料を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’細胞を形質転換させ、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩでの消化により分析した。プラスミドクローンｐ３７−５（ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６：配列番号２１、図８）は、０．４８６ｋｂ及び６．９６１ｋｂの所望のフラグメントサイズを示した。配列決定により、ｐ３７−５のＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の適正な配列を確認した。
【０１６６】
実施例３
ｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６及びｐＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６シャトルベクターの構築
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐoｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換用プラスミドを以下の通りに構築した。ＭＦα−Ｅ２ｓ（ＨＣＶ Ｅ２アミノ酸３８４−６７３）−ＶＩＥＧＲ−Ｈｉｓ６（配列番号５）をコードするＤＮＡ配列を、プラスミドｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６（配列番号２２、図９）から１．３３１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして単離した。このフラグメントを、供給業者の推奨事項に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いてＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図Ｃ＋２）又はｐＭＰＴ１２１（配列番号２３、図１０）のいずれかと連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換させ制限酵素消化により異なる形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡを検査した後、陽性クローンを保留し、結果として得られたシャトルベクターをそれぞれｐＦＰＭＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６（配列番号２２、図１１）及びｐＭＰＴ−ＭＦα−Ｅ２−Ｈ６（配列番号２３、図１２）と呼称した。
【０１６７】
実施例４
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６シャトルベクターの構築
３工程手順で、シャトルベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６を組み立てた。Ｅ２コーディング配列がＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼのシグナル配列の後ろでクローニングさせた。これは、シームレスクローニング方法（パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ），Ｋ．Ａ．および、ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）Ｊ．Ａ，１９９６）により行われた。
【０１６８】
Ｅ２ｓ−Ｈ６コーディングＤＮＡフラグメントの生成
最初に、Ｅ２−Ｈ６をコードするＤＮＡ配列（リンカーペプチド「ＶＩＥＧＲ」及び６Ｈｉｓ残基、配列番号５で伸長されたＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４−６７３）をｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６プラスミド（配列番号２４、図１１）から、ＰＣＲにより増幅させた。使用したプライマーは、ＭＦ３０Ｅ２／Ｆ及びＭＦ３０Ｅ／Ｒと記され、以下の配列を有している。
−プライマーＭＦＥ２／Ｆ；
【化１３】

（配列番号２６）；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓシグナル配列の前後のコドンは太字で印刷されている；マークの付いていない塩基はＥ２のコドン（ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４〜３９０）とアニールする。
−プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｒ
【化１４】

（配列番号２７）；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された塩基は、プライマーＭＦ３０−Ｒｅｃｈｔｓの塩基に対し相補的である。（以下参照）、構築物に導入されるべきＢａｍＨＩ部位は、イタリック体で印刷されている。マークされていない配列は停止コドン及びＥ２（３８４−６７３）−ＶＩＥＲ−Ｈ６（配列番号５）の６つの末端Ｈｉｓコドンとアニールする。
【０１６９】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた；２０ｎｇのｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６の１．３３ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメント各々０．２μＭのプライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｆ及びＭＦ３０Ｅ２／Ｒ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１ ８３４）、２，５Ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１ ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。
【０１７０】
以下の工程から成るプログラム３を使用した
１． 変性； ９５℃で５分
２． ９５℃での変性３０秒、６５℃でのアニーリング３０秒、及び６８℃での伸長１分を１０サイクル。
３． ４℃での終結。
【０１７１】
その後、１０μＬの１０×緩衝液２（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー、カタログ番号１６８１ ８３４）、４０μＬのＨ_２Ｏ及び５μＬの［ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２ｍＭ）；１０ｍＭ、５−メチル−ｄＣＴＰ］をＰＣＲプログラム３に由来する試料に添加し、以下の工程から成るプログラム４で続行した。
１． 変性；９５℃で５分
２． ９５℃での変性４５秒、６５℃でのアニーリング３０秒、６８℃での伸長１分で５サイクル。
３． ４℃で終結。
【０１７２】
ＰＭＦ３０由来の受容体プラスミドの生成
第２のフラグメントはプラスミドｐＭＦ３０（配列番号２８、図１３）に由来し、アンプリコンは、Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓの成熟α−アミラーゼのコドンを除いて、完全なｐＭＦ３０プラスミドであり、クローニングに関連する修飾をプライマー設計により導入した。以下のプライマーセットを使用した。
−プライマーＭＦ３０−Ｌｉｎｋｓ；
【化１５】

（配列番号２９；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された「ｃｃｔ」は、プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｆの太字で印刷された「ａｇｇ」に対し相補的である。（以上参照）；マークの付いていない及び太字印刷された塩基は、ｐＭＦ３０内のＳ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼのコドンの２６の末端塩基とアニールする）−プライマーＭＦ３Ｕ−Ｒｅｃｈｔｓ；
【化１６】

（配列番号２９；ＥａｍＩ１０４Ｉ部位には下線が付され、ドットは酵素の開裂部位をマークしている。太字で印刷された「ｃｔｇ」は、プライマーＭＦ３０Ｅ２／Ｒの太字印刷された「ｃａｇ」に対し相補的である。（以上参照）マークの付いていない塩基はｐＭＦ３０中のＳ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのα−アミラーゼの停止コドンの下流側のｐＵＣ１８配列とアニールする。）
【０１７３】
反応混合物は、以下の通りに構成されていた；２０ｎｇの−ＢｇｌＩＩ−線形化ｐＭＦ３０、各々０．２μＭのプライマーＭＦ３０−Ｌｉｎｋｓ及びＭＦ３０−Ｒｅｃｈｔｓ、ｄＮＴＰ（各々０．２μＭで）、１×緩衝液１（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；ベーリンガー：カタログ番号１６８１ ８３４）、２．５Ｕのポリメラーゼ混合物（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ：カタログ番号１６８１ ８３４）を含有する合計体積５０μＬ。両方のプログラムで１分から４分に延長された伸長時間を除き、上述のものと同じＰＣＲプログラム（プログラム３及び４）を使用した。
【０１７４】
ベクターｐＡＭＹ−Ｅ２の生成
ＰＣＲにより得たｐＭＦ３０由来の受容体プラスミド及びＥ２ｓ−Ｈ６コーディングＤＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上のゲル電気泳動によりそのそれぞれのサイズに基づき検査した。供給業者の指示に従って、ＰＣＲ産物精製キット（キアゲン）でＰＣＲ産物を精製した。その後、精製したフラグメントをＥａｍ１１００４Ｉで別々に消化した。供給業者の推奨事項に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））を用いることで、ｐＭＦ３０由来の受容体プラスミドとのＥ２ｓ−Ｈ６フラグメントの連結を実施した。連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’細胞を形質転換し、複数のクローンのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ ＨＩ消化により分析した。陽性クローンを選択し、そのプラスミドをさらにｐＡＭＹ−Ｅ２と呼称し、以下に記載するようなさらなる修飾のために利用した。
【０１７５】
ベクターｐＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の生成
α−アミラーゼシグナル配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンと置換する目的で、ｐＡＭＹ−Ｅ２をＰＣＲ誘導突然変異誘発に付した。これは、さらに「ＣＬ」と呼称され、鳥類リゾチームＯＲＦの最初の１８個のアミノ酸（配列番号１）に対応している。この突然変異誘発のためには、以下のプライマーが用いられた：
−プライマー ＣＬ ｈｉｎ：
【化１７】

（配列番号３０）及び
−プライマー ＣＬ２ ｈｅｒ：
【化１８】

（配列番号３１）
【０１７６】
プライマーの下線のある５’領域は、鳥類リゾチームプレ配列の約半分のＤＮＡ配列を含有する。プライマーＣＬ２ ｈｅｒは、ＳｐｅＩ（イタリック体）及びＥｃｏＲＩ（イタリック体、２重下線付き）制限部位を包含する。プライマーの下線の付されていない領域は、Ｅ２（ＣＬ２ ｈｉｎ）のアミノ酸残基３８４−３９２のコドン、又はＥｃｏＲＩ部位を越えてＦＭＤプロモーターの位置−１９（ＥｃｏＲＩ部位から因子）までの「ａｔｇ」開始コドンとアニールする。該プライマーは、完全なｐＡＭＹ−Ｅ２ベクターを増幅し、かくしてα−アミラーゼシグナル配列のコドンを鳥類リゾチームプレ配列のコドンと置換する。
【０１７７】
ＰＣＲ反応は、以下のプログラムに従って実施した：
１． 変性；９５℃で１５分、
２． ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、及び７２℃での伸長１分を３５サイクル。
３． ４℃での終結。
【０１７８】
以下の反応混合物を使用した：ｐＡＭＹ−Ｅ２（１ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマーＣＬ ｈｉｎ（１００μＭ）、２μＬ；プライマー ＣＬ２ ｈｅｒ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（全て２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ_２Ｏ、７６μＬ； Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））；Ｃａｔ Ｎｏ １６８１ ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ：Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムポリメラーゼ混合物（１Ｕ／μＬ）、０．７５μＬ。
【０１７９】
結果として得られたＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル上でゲル電気泳動により検査した。連結に先立ちＰＣＲフラグメントを以下のように修飾した。３’−ＡオーバーハングをＴ４ポリメラーゼによって除去し、結果として、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端がもたらされた。さらに残った９５μＬのＰＣＲ反応混合物に対して１μＬのＴ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１Ｕ／μＬ）を４μＬｄＮＴＰと共に（全て２．５ｍＭで）を添加した。３７℃で２０分間試料をインキュベートした。その後、ＤＮＡをエタノールで沈降させ１６μＬの脱イオン水中に溶解させた。これに続いて平滑末端ＰＣＲ産物に５’−リン酸塩を添加するためキナーゼ処理を行なった１６μＬの溶解した平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１８０】
その後、キナーゼ処理した試料を、１％のアガロースゲル上で分離した。供給業者の推奨事項に従って、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いてアガローススライスからＤＮＡを抽出した。その後５０ｎｇの精製済み産物を、供給業者の条件に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で１６時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、２０μＬの水中で溶解させた（連結試料）。
【０１８１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α−Ｆ’細胞を１０μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピシリン耐性クローンを単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析を用いて特徴づけした。陽性クローンをＰＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６と呼称し、これを以下で記載する通りのさらなる修飾のために使用した。
【０１８２】
シャトルベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の生成
（ＣＬ−Ｅ２（３８４−６７３）−ＶＩＥＧＲ−Ｈ６を包含する）ｐＵＣ１８−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６から０．９６６ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ ＨＩフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ ＨＩで消化されたｐＦＰＭＴ１２１（配列番号１２、図３）の中に連結させた。反応のためには、供給業者の条件に従って、Ｔ４リガーゼ（ベーリンガー）を使用した。連結試料をエタノールで沈降させ、１０μＬの水中で溶解させた。これを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換し、制限分析の後に陽性クローンを保留し、それぞれのプラスミドをｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６（配列番号３２、図４）と呼称した。
【０１８３】
実施例５
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｋ−Ｈ６−Ｅ１シャトルベクターの構築
シャトルベクターの構築は、２工程から成る。
【０１８４】
第１工程では、ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６構築物を、部位特異的突然変異誘発によって構築した。ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６を鋳型として使用した（配列番号２０；図７）。以下のプライマーを使用した。
−プライマー Ｈ６Ｋ ｈｉｎ ｎｅｕ：
【化１９】

（配列番号３７）
−プライマー Ｈ６ＫＲＫ ｈｅｒ ｎｅｕ：
【化２０】

（配列番号３８）
（付加的なコドンを提供する塩基には下線が付されている）。
【０１８５】
ＰＣＲ反応混合物は、以下の通りに構成されていた：ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６（２ｎｇ／μＬ）、１μＬ；プライマー Ｈ６Ｋ ｈｉｎ ｎｅｕ（１００μＭ）
２μＬ：プライマー Ｈ６ＫＲＫ ｈｅｒ ｎｅｕ（１００μＭ）、２μＬ；ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）、８μＬ；Ｈ_２Ｏ、７６μＬ；Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；Ｃａｔ Ｎｏ １６８１ ８３４）緩衝液２（１０倍に濃縮）、１０μＬ：Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムポリメラーゼ混合物（１Ｕ／μＬ）、０．７５μＬ
【０１８６】
使用されたＰＣＲプログラムは、以下の工程で構成されていた：
− 変性；９５℃で１５分
− ９５℃での変性３０秒、６０℃でのアニーリング１分、７２℃での伸長５分を３５サイクル。
− ４℃で終結。
【０１８７】
ＰＣＲ試料のアリコートを１％のアガロースゲル上で分析してそのサイズを検査し、それは適正なものであった（〜４．２ｋｂ）。
【０１８８】
その後、ＰＣＲ産物からの３’−Ａオーバーハングを、Ｔ４ポリメラーゼ反応によって除去し、３’−及び５’−ＯＨ基を伴う平滑末端を結果としてもたらした。従って、ＰＣＲ反応の残りの９５μＬに対して、１μＬのＴ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１Ｕ／μＬ）及び４μＬのｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で２０分間インキュベートした。その後、試料中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１６μＬのＨ_２Ｏ中で溶解させた。
【０１８９】
その後、キナーゼ反応により、平滑末端ＰＣＲ産物に５’−リン酸塩を添加した。従って、１６μＬの溶解した平滑末端ＰＣＲ産物に対して、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）；１Ｕ／μＬ）、２μＬの１０倍濃縮Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液（ベーリンガー）及び１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）を添加した。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１９０】
その後、試料を、１％のアガロースゲル上に適用し、供給業者の条件に従ってゲル抽出キット（キアゲン）を用いて適正な産物バンドを単離した。その後５０ｎｇの精製済み産物を、供給業者の推奨事項に従ってＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて自己連結させた。１６℃で７２時間インキュベートした後、連結混合物中のＤＮＡをエタノールで沈降させ、１０μＬの水中に溶解させた。
【０１９１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α−Ｆ’細胞を５μＬの連結試料で形質転換した。複数のアンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化により分析し、陽性クローンを保留し、対応するプラスミドを次のように呼称した；ｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｅ１−Ｋ−Ｈ６（配列番号３９、図１７）。
【０１９２】
第２工程では、２フラグメント連結によりトランスファベクターを構築した。以下では、ＢｃｌＩ付着末端を伴う構築フラグメントが関与した。ＢａｌＩは、メチル化されていないＤＮＡ上でのみその部位を開裂できることから、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄａｍ−菌株を、関与するプラスミドｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６（配列番号３９、図１７）及びｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１（配列番号３６、図１６）で形質転換させた。各々の形質転換から、アンピシリン耐性コロニーを採取し、液体培養中で増殖させ、メチル化されていないプラスミドＤＮＡをさらなる使用のために調製した。（ＦＭＤプロモーター、ＣＬ−Ｈ６−Ｋ単位のコドン及びＥ１の開始部分を包含する）未メチル化プラスミドｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１−Ｈ６の１．２７３ｋｂのＢｃｌＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント、及び（ＦＭＤプロモーターを除きｐＦＰＭＴ１２１にあるエレメントならびにＣ末端Ｈｉｓタグを伴わないＢｃｌＩ部位から始まったＥ１読取り枠の欠如部分を包含する）プラスミドｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１の６．０５７ｋｂのＢｃｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを調製し、供給業者の仕様に従って合計体積２０μＬでＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用いて１６℃で７２時間連結させた。その後、連結混合物を脱塩する目的でこの混合物を無菌脱イオン水上で浮遊する１片のニトロセルロース膜の上に置いた（室温で３０分間のインキュベーション）。５μＬの脱塩試料での電気泳動によりＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。制限酵素消化により、結果として得られた複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１（配列番号４０、図１８）と呼称した。
【０１９３】
実施例６
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換及び形質転換体の選択
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１を、実施例１〜５に記載されている通りの異なる親シャトルベクターでの修飾（Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ，Ｒ．）ら、１９８６）を用いて、形質転換させた（基本的にＫｌｅｂｅ， Ｒ．Ｊ．）ら、１９８３）に記載の通りのＰＥＧ媒介ＤＮＡ摂取プロトコル）。各々の形質転換について、７２ウラシル原栄養コロニーを選択し、以下の手順により菌株生成のために使用した。各コロニーについて、２ｍＬの液体培養を、４８時間試験管の中で（３７℃；１６０ｒｐｍ；角度４５℃）、選択培地（ＹＮＢ／グルコース、Ｄｉｆｃｏ）内に接種し増殖させた。この工程は、第１継代工程として定義づけされる。第１の継代工程の培養の１５０μＬのアリコートを用いて、２ｍＬの新鮮なＹＮＢ／グルコース培地に接種した。ここでも又、上述のように培養をインキュベートした（第２の継代工程）。一緒にかかる継代工程を８回実施した。２ｍＬの非選択的ＹＰＤ培地（Ｄｉｆｃｏ）を接種するために、第３及び第８の継代工程の実施後の培養アリコートを使用した。３７℃で４８時間のインキュベーション（１６０ｒｐｍ；角度４５℃；いわゆる第１の安定化工程）の後、これらのＹＰＤ培養の１５０μＬのアリコートを用いて、上述のとおりにインキュベートした新鮮な２ｍＬのＹＰＤ培養を接種した（第２の安定化工程）。その後第２の安定化工程の培養のアリコートを、選択的ＹＮＢ／寒天を含有する平板上で、画線培養した。これらの平板を、肉眼的コロニーが目に見えるようになるまで４時間インキュベートした。各分離の明確な単一のコロニーを菌株として定義し、さらなる発現分析のために使用した。
【０１９４】
発現分析を小規模振とうフラスコ培養上で実施した。上述のＹＮＢ／寒天平板からコロニーを採取し、２ｍＬのＹＰＤ内に接種し、上述のように４８時間インキュベートした。この２ｍＬのアリコートを、２ｍＬの振とうフラスコ培養のための種培養として用いた。培地として、ＹＰグリセロール（１％）を用い、振とうフラスコを回転振とう機（２００ｒｐｍ、３７℃）上でインキュベートした。４８時間の増殖後、発現カセットの誘発のため１％のＭｅＯＨを培養に加えた。異なる時間的間隔で、１ｍＬアリコートの細胞ペレットを収集し、さらなる分析まで−２０℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにより、特異的タンパク質発現を分析した。従って、細胞ペレットを試料緩衝液（トリスＨＣｌ−ＳＤＳ）中で可溶化させ、９５℃で１５分超の間インキュベートした。
【０１９５】
１５％のポリアクリル−アミドゲル上でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜上にブロッティングした（湿式ブロット；重炭酸塩緩衝液）。特異的マウス抗Ｅ１（ＩＧＨ２０１）又はマウス抗Ｅ２（ＷＯ９６／０４３８５の中でメルテンスら、によって記載されたＩＧＨ２１６）を第１の抗体として用いて、ブロットを発達させ、ウサギ抗マウス−ＡＰを第２の抗体として使用した。ＮＢＴ−ＢＣＩＰで染色を実施した。
【０１９６】
さらなる調査のため、陽性菌株を保留した。
【０１９７】
振とうフラスコ発現実験の中で、これらの陽性クローンのうちの５個を使用した。それぞれの菌株のコロニーをＹＮＢ平板から採取し、２ｍＬのＹＰＤを接種するのに使用した。これらの培養を上述の通りにインキュベートした。この細胞懸濁液を用いて、５００ｍＬ入り振とうフラスコ内で１００ｍＬのＹＰＤ培地の第２の種培養を接種した。この振とうフラスコを３７℃、２００ｒｐｍで４８時間回転振とう機上で培養した。この種培養の２５ｍＬのアリコートを用いて、２５０ｍＬのＹＰグリセロール（１％）培地に接種し、バッフル付き２ｌ入り振とうフラスコの中で上述の条件下でインキュベートした。接種から４８時間後に、１％のＭｅＯＨ（プロモーター誘発）を添加し、振とうフラスコをさらに上述の条件下でインキュベートした。誘発から２４時間後に、実験を停止し、遠心分離により細胞ペレットを収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにより５つの異なるクローンの発現レベルを分析した（条件は上述の通り）。ゲル上の各クローンの滴定系列を投入し、生産性の最も高い菌株をさらなる発酵及び精製試行のために選択した。
【０１９８】
驚くべきことに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．２０００）に近い関係をもつ酵母菌株であるＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、基本的に過剰グリコシル化無しの、ひいてはＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物の細胞により発現されるＨＣＶウイルス様粒子に匹敵するサイズの糖部分を伴うＨＣＶタンパク質を発現することができる。
【０１９９】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株ＲＢ１１は、ＵＣＬのマイコテーク（ＭＵＣＬ）ルーヴァンカトリック大学菌学研究所（Ｐｌａｃｅ Ｃｒｏｉｘ ｄｕ Ｓｕｄ ３ｂｔｅ ６、Ｂ−１３４８ Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ、ベルギー）にブタペスト条約の条件に基づき２００２年４月１９日に寄託され、ＭＵＣＬ受託番号ＭＵＣＬ４３８０５を有する。
【０２００】
実施例７
ｐＳＹ１ａＭＦＥｌｓＨ６ａベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 発現プラスミドを以下の通りに構築した。Ｅ１コーディング配列をｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓＨ６（配列番号６、図１）からのＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離し、これを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ５ベクター（配列番号４１、図１９）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ１ｓ−Ｈ６コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞内で形質転換させた。その後、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６（ＩＣＣＧ３４７０；配列番号４２、図２０）と呼称した。
【０２０１】
（Ｈｉｓ−ｔａｇ を伴うＥ１ｓコーディング領域及びαＭＦ−配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで消化したＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号２１、図４３）内にｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６のＢａｍＨＩフラグメント（２７９０ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａ（ＩＣＣＧ３４７９；配列番号４４、図２２）と呼称した。
【０２０２】
実施例８
ｐＳＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６ベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 発現プラスミドｐＳＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６を以下の通りに構築した。Ｅ２コーディング配列をｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６（配列番号４５、図２３）からのＳａｌＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして単離し、これを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、その後、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ５ベクター（配列番号４１、図１９）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ２−Ｈ６コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。次に、連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞内で形質転換させ、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６（ＩＣＣＧ２４２４；配列番号４６、図２４）と呼称した。
【０２０３】
（Ｈｉｓ−ｔａｇ を伴うＥ２（３８４−６７３）コーディング領域及びαＭＦ−配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで開かれたＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号４３、図２１）内にｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６のＢａｍＨＩフラグメント（３２８１ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。制限陽性クローンを保留し、これをｐＳＹＩＧＳＥ２Ｈ６（ＩＣＣＧ２４６６；配列番号４７、図２５）と呼称した。
【０２０４】
実施例９
ｐＳＹ１Ｙ１Ｇ７Ｅ１ｓベクターの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 発現プラスミドｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓを以下の通りに構築した。Ｅ１コーディング配列をｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓ（配列番号６、図１）からのＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離し、これを平滑末端化し、供給業者の仕様に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）を用いてｐＹｌＧ７ベクター（配列番号４８、図２６）内でクローニングした。クローニングは、Ｅ１コーディングフラグメントが直接的にかつａＭＦコーディング配列と同一枠内で接合されるようなものであった。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換させ、複数のアンピシリン耐性クローンのプラスミドＤＮＡを制限消化により分析し、陽性クローンを保留し、ｐＹＩＧ７Ｅ１（配列番号４９、図２７）と呼称した。
【０２０５】
（Ｅ１（１９２−３２６）コーディング領域及びＣＬリーダー配列を含有する）発現カセットを、ＢａｍＨＩで消化したＥ．ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＳＹ１シャトルベクター（配列番号４３、図２１）内にｐＹＩＧ７Ｅ１のＢａｍＨＩフラグメント（２７９０ｂｐ）として移した。供給業者の条件に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）で連結を実施した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＦ’細胞へと形質転換し、複数のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、これをｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０、図２８）と呼称した。
【０２０６】
実施例１０
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換及び形質転換体の選択
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で過剰発現されたタンパク質について報告されることの多い過剰グリコシル化の問題を克服するために、突然変異体スクリーニングをセットした。このスクリーニングは、自然発生的劣性オルトバナジウム酸塩耐性突然変異体を選択するＢａｌｌｏｕの方法（Ｂａｌｌｏｕ Ｌ．ら、１９９１）に基づいていた。初期菌株選択は、未変性ゲル電気泳動の後に見られるようなインベルターゼのグリコシル化パターンに基づいて実施された。グリコシル化能力が低減した菌株を、さらなる組換え型タンパク質発現実験のために保留し、これは菌株ＩＹＣＣ１５５より優勢であった。突然変異の性質についてはこれ以上研究しなかった。
【０２０７】
前記グリコシル化欠損菌株ＩＹＣＣ１５５を、基本的にエルブル（ＥＩｂｌｅ， Ｒ．１９９２）によって記載されているような酢酸リチウム方法により、実施例７〜９で記載した通りにプラスミドで形質転換させた。選択的ＹＮＢ＋２％の寒天平板（Ｄｉｆｃｏ）から複数のＵｒａ相補菌株を採収し、２ｍｌのＹＮＢ＋２％グルコースを接種するために使用した。これらの培養を３７℃で７２時間、軌道振とう機上で２００ｒｐｍでインキュベートし、Ｅ１特異的マウスモノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）で発達させたウエスタンブロットにより、Ｅ１の発現のため、培養上清及び細胞内画分を分析した。さらなる実験のため、生産性の高いクローンを保留した。
【０２０８】
ここで使用されるＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅグリコシル化欠損突然変異内のタンパク質の発現は、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に比べて低いバイオマス収量ひいては所望のタンパク質のより低い収量を導く、かかる菌株の最適以下の増殖特性により妨げられている。所望のタンパク質の収量は、なおも哺乳動物細胞中よりも実質的に高いものであった。
【０２０９】
実施例１１
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’ＥｌｓＨ６及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６ベクターの構築
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；配列番号５１、図２９）から出発して、シャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６を構築した。第１工程では、それぞれＫＥＸ２又はＳＴＥ１３処理用プロテアーゼの開裂部位のすぐ後ろでＥ１コーディング配列のクローニングを可能にするように、前記ベクターを適合させた。従って、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩでｐＰＩＣ ＺａｌｐｈａＡを消化した。消化物を１％のアガロースゲル上で分離させ、３５１９ｋｂのフラグメント（ベクターの大部分）を、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて単離させ精製した。このＦＧを、その後、供給業者の条件に従って特異的オリゴヌクレオチドの存在下でＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー）を用いて連結させて、ｐＰＩＣ Ｚａｌｐｈａ Ｄ’（配列番号５２、図３０）又はｐＰＩＣ ＺａｌｐｈａＥ’（配列番号５３、図３１）を生成した。
【０２１０】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
− ｐＰＩＣ ＺａｌｐｈａＤを構築するためには；
【化２１】

（配列番号５４）及び
【化２２】

（配列番号５５）
これは、アニーリングの後、以下のリンカーオリゴヌクレオチドを生成する：
【化２３】

（配列番号５４）
【化２４】

（配列番号５５）
− ｐＰＩＣ ＺａｌｐｈａＥを構築するためには、
【化２５】

（配列番号５６）
【化２６】

（配列番号５７）
これは、アニーリングの後、以下のリンカーオリゴヌクレオチドを生成する：
【化２７】

（配列番号５６）
【化２８】

（配列番号５７）
【０２１１】
これらのシャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’は、それぞれの処理用プロテアーゼ、ＫＥＸ２及びＳＴＥ１３の開裂部位の直ぐ後ろにクローニング部位を新たに導入した。
【０２１２】
Ｅ１−Ｈ６コーディング配列をｐＧＥＮＴ−ＥｌｓＨ６（配列番号６、図１）からＮｓＩ１／Ｅｃｏ５２Ｉフラグメントとして単離させた。１％のアガロースゲル上での消化物の分離の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、フラグメントを精製した。結果として得たフラグメントを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、それぞれの処理用プロテアーゼ開裂部位の直ぐ後ろでｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’又はｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’のいずれかの中に連結させた。
【０２１３】
連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、複数のゼオシン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、それぞれｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ１ｓＨ６（ＩＣＣＧ３６９４；配列番号５８、図３２）及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’ＥｌｓＨ６（ＩＣＣＧ３４７５；配列番号５９、図３３）を呼称した。
【０２１４】
実施例１２
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６ベクターの構築
実施例１１で記載された通りにシャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’を構築した。
【０２１５】
Ｅ２−Ｈ６コーディング配列をｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６（配列番号４５、図２３）からＳａｌＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして単離させた。１％のアガロースゲル上での消化物の分離の後、ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、フラグメントを精製した。結果として得たフラグメントを（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて）平滑末端化し、それぞれの処理用プロテアーゼ開裂部位の直ぐ後ろでｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’又はｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’のいずれかの中に連結させた。
【０２１６】
連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換し、複数のゼオシン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により分析した。陽性クローンを保留し、それぞれｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６（ＩＣＣＧ３６９２；配列番号６０、図３４）及びｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６（ＩＣＣＧ３４７６；配列番号６１、図３５）を呼称した。
【０２１７】
実施例１３
Ｐｉｃｈａ Ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換及び形質転換体の選択
実施例１１及び１２に記載されている通りのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓシャトルプラスミドを、供給業者の条件（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞へと形質転換させた。Ｅ１−及びＥ２−産生菌株をさらなる特徴づけのために保留した。
【０２１８】
過剰グリコシル化が通常不在（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ、Ｇ．２０００）であり以前のＧＳＴ融合としてデング熱ウイルスＥタンパク質を発現するために使用されている（Ｓｕｇｒｕｅ）、Ｒ．Ｊ．ら、 １９９７）という事実のために周知の酵母菌株であるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの中で、ＨＣＶウイルス様粒子を発現させた。注目すべきことに、結果として得られたＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ発現されたＨＣＶウイルス様粒子は、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌株で見られるものに匹敵するグリコシル化を示した。より詳細に言うと、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓにより産生されたＨＣＶウイルス様粒子は、過剰グリコシル化される（形質転換されたＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から単離されたタンパク質のウエスタンブロットの中で検出される発現産物の分子量に基づく）。
【０２１９】
実施例１４
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのための培養条件
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
セルバンキング
選択された組換え型クローンから、マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを調製した。対数増殖中期の振とうフラスコ培養（発酵種培養の場合と同様のインキュベーション条件、以下参照）からクリオ−バイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌs）を調製した。凍結防止剤としてグリセロール（最終濃度５０％）を添加した。
【０２２０】
発酵
低温保存されたワーキングセルバンクから種培養を開始し、４８時間２００ｒｐｍ、３７℃で２Ｌ入り振とう三角フラスコの中で５００ｍＬの培地（２％のスクロールを補足したＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）内でこれを増殖させた。
【０２２１】
発酵は、標準的には、１５Ｌの作業体積でＢｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵装置の中で実施された（ビー．ブラウン社（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｔ．，）ドイツ、メルズンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ））。発酵培地は、炭素源として１％の酵母エキス、２％のペプトン及び２％のスクロースを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。
【０２２２】
標準的に温度、ｐＨ及び溶存酸素を、発酵中制御した。表１に適用可能な設定点をまとめる。溶存酸素を、撹拌及び／通気によりカスケード制御した。ＮａＯＨ（０．５Ｍ）又はＨ_３ＰＯ_４溶液（８．５％）を添加することによってｐＨを制御した。
【０２２３】
【表１】

【０２２４】
発酵を１０％の種培養の添加により開始した。増殖期間中、スクロース濃度をＨＰＬＣ分析によりオフラインで監視した（Ｐｏｌｙｓｐｈｅｒｅ Ｃｏｌｕｍｎ ＯＡＫＣ Ｍｅｒｃｋ）
【０２２５】
増殖期中溶存酸素をカスケード制御により制御した（撹拌／通気）。スクロースが完全に代謝した後、濃度を約０．５％に維持するべくＥｔＯＨを段階的に添加することで補充しながら内部で産生したエタノールにより異種ｐＮ産生を駆動した（オフラインＨＰＬＣ分析、ｐｏｌｙｓｐｈｅｒ ＯＡＫＣカラム）。この誘導期の間、溶存酸素を、空気流速及び撹拌機速度の手動式調整により、５％の空気飽和未満に制御した。
【０２２６】
標準的には、細胞ペレットを得るためタンジェンシャルフローろ過を介した濃縮とそれに続く濃縮した細胞懸濁液の遠心分離により、誘導から４８〜７２時間後に発酵物を収獲した。直ちに分析されない場合には、細胞ペレットを−７０℃で保管した。
【０２２７】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
セルバンキング
選択された組換え型クローンから、マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを調製した。対数増殖中期の振とうフラスコ培養（発酵種培養の場合と同様のインキュベーション条件、以下参照）からクリオ−バイアルを調製した。凍結防止剤としてグリセロール（最終濃度５０％）を添加した。
【０２２８】
発酵
低温保存された（−７０℃）ワーキングセルバンクから種培養を開始し、４８時間２００ｒｐｍ、３７℃で２Ｌ入り三角振とうフラスコの中で５００ｍＬの培地（ＹＰＤ、Ｄｉｆｃｏ）内でこれを増殖させた。
【０２２９】
発酵は、標準的には、１５Ｌの作業体積でＢｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵装置の中で実施された（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、ドイツ）。発酵培地は、炭素源として１％の酵母エキス、２％のペプトン及び１％のグリセロールを含有していた。消泡剤としてポリエチレングリコールを使用した。
【０２３０】
標準的に温度、ｐＨ、空気中及び溶存酸素を、発酵中制御した。表２に適用可能な設定点をまとめる。溶存酸素を、撹拌及び／通気によりカスケード制御した。ＮａＯＨ（０．５Ｍ）又はＨ_３ＰＯ_４溶液（８．５％）を添加することによってｐＨを制御した。
【０２３１】
【表２】

【０２３２】
発酵を１０％の種培養の添加により開始した。増殖期中、グリセロール濃度をオフラインで監視し（Ｐｏｌｙｓｐｈｅｒｅ Ｃｏｌｕｍｎ ＯＡＫＣ ｍｅｒｃｋ）、完全なグリセロール消費から２４時間後に１％メタノールを添加して異種タンパク質の発現を誘導した。細胞ペレットを得るためタンジェンシャルフローろ過を介した濃縮とそれに続く濃縮した細胞懸濁液の遠心分離により、誘導から２４時間後に発酵を収獲した。直ちに分析されない場合には、細胞ペレットを−７０℃で保管した。
【０２３３】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
振とうフラスコ培養中に、組換え型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでの小規模タンパク質産生実験をセットした。ＹＰＤ培地（Ｄｉｆｃｏ）内で一晩、種培養を増殖させた。初期培地のｐＨを４．５に補正した。回転振とう機上で３７℃、２００〜２５０ｒｐｍで振とうフラスコをインキュベートした。
【０２３４】
小規模産生は、標準的に２Ｌ入り振とうフラスコ内で５００ｍＬの規模で実施し、１％の酵母エキス、２％のペプトン（共にＤｉｆｃｏ）及び２％のグリセロールを炭素源として含有する発現培地で１０％の接種から始めた。接種条件は、種培養の場合と同様であった。誘導は、接種から約７２時間後に１％のＭｅＯＨの添加により開始した。遠心分離により、誘導から２４時間後に細胞を収集した。直ちに分析されない場合、細胞ペレットを−７０℃に保管した。
【０２３５】
実施例１５
選択された酵母細胞内で発現されたＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６及びＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質からのリーダーペプチドの除去
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａ−交接因子（ａＭＦ）リーダー配列を伴うＨＣＶ Ｅ１及びＥ２タンパク質構築物のＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリコシル化マイナス菌株の中の発現産物をさらに分析した。両方の遺伝子型１ｂＨＣＶ Ｅ１ｓ（ａａ１９２−３２６）及びＨＣＶ Ｅ２ｓ（ＶＩＥＧＲ（配列番号６９）−配列で伸長されたａａ３８３−６７３）は、共にＣ末端ｈｉｇタグ付けされた（Ｈ６、ＨＨＨＨＨＨ、配列番号６３；このＨＣＶタンパク質は本例ではさらにＭＦ−Ｅ１−Ｈ６及びＭＦ−Ｅ２−Ｈ６と記される）タンパク質として発現されたため、酵母細胞の塩化グアニジニラム（ＧｕＨＣｌ）可溶化後の発現済み産物の迅速かつ効率の良い精製がＮｉ−ＩＤＡ（Ｎｉ−イミノジ酢酸）上で実施された。簡単に言うと、細胞ペレットを５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、ｐＨ７．４（９ｖｏｌ／ｇの細胞）中に再懸濁させた。３２０ｍＭ（４％ｗ／ｖ）の亜硫酸ナトリウム及び６５ｍＭ（２％ｗ／ｖ）の４チオン酸ナトリウムの存在下で室温（ＲＴで一晩、タンパク質をスルホン化した。溶解物を、遠心分離（１０．０００ｇ、３０分、４℃）による凍結−解凍サイクルの後に清澄させ、エンピゲン（アイブライト＆ウィルソン（Ａｉｂｒｉｇｈｔ＆Ｗｉｌｓｏｎ）、英国）及びイミタゾールを、それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び２０ｍＭの最終濃度まで上清に添加した。試料をろ過し（０．２２μＭ）、Ｎｉ−ＩＤＡセファロースＦＦカラム上に投入し、５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、１％のエンピゲン（緩衝液Ａ）に２０ｍＭのイミダゾールを補足したものを用いてこれを平衡化した。その後、カラムをそれぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａを用いて、２８０ｎｍという達成基線レベルまで洗浄した。緩衝液Ｄ、５０ｍＭリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、０．２％（Ｅ１について）又は１％（Ｅ２について）エンピゲン、２００ｍＭイミダゾールを適用することによって、ｈｉｓタグ付生成物を溶出させた。溶出した材料を、Ｅ１（ＩＧＨ２０１）、又はＥ２（ＩＧＨ２１２）に対し向けられた特異的モノクローナル抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。
【０２３６】
Ｅ１産物を、Ｅｄｍａｎ分解により直ちに分析した。
【０２３７】
この工程で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはすでにＨＣＶ Ｅ２についてのタンパク質バンドのきわめて複雑なピクチャを顕示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分留を実施した。Ｎｉ−ＩＤＡ溶出液を、限外ろ過（ＭＷＣ１０ｋＤａ、ｃｅｎｔｉｐｌｕｓ、Ａｍｉｃｏｎ、ｍｉｌｌｉｐｏｖｅ）により濃縮し、ＰＢＳ、１％エンピゲン又はＰＢＳ、３％エンピゲン中でＳｕｐｅｒｄｅｘＧ２００（１０／３０又は１６／１０；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に投入した。８０ｋａＤａと４５ｋＤａの間のＭｒをもつＥ２産物を含有する溶出画分、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３８１上の遊走に基づく図３７中の溶出プロフィールの画分１７−２３をプールし、アルキル化させた（ＲＴで３時間１０ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続くＲＴで３時間の３０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。アミノ末端配列決定のための試料はＥｎｄｏＨ（ロシュバイオケミカルズ）で処理するか、又は未処理のまま放置した。アミノ末端配列決定のためのＰＶＤＦ膜上で、グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ２産物をブロットした。グリコシル化及び脱グリコシル化したＥ２のアミドーブラックで染色したブロットは、図３９に示されている。
【０２３８】
Ｅ１及びＥ２の両方の精製済み産物の配列決定から、残念なことに、ＨＣＶウイルス様粒子からのシグナル配列の除去が部分的にしか発生していないという考察が導かれる（表３参照）。さらに、副産物の大部分（分解産物及びなおもリーダー配列又はその一部分を含有する産物）は、グリコシル化されている。このグリコシル化は、部分的であれ、Ｎ−グリコシル化部位をも含有するシグナル配列の未開裂フラグメント上にある。これらの部位とは、グリコシル化された副産物を少なくする結果となるように突然変異させることができる。しかしながら、より一層問題が大きいのは、交互に開裂された一部の産物が所望の無傷のエンベロープタンパク質に比べて１〜４個のアミノ酸の差異しかないという発見事実にある。その結果、適正にプロセッシングされた産物の精製は、異なる発現産物間に充分に弁別できる生化学物特性が欠如しているために、事実上不可能である。分解産物のいくつかは、ａ−交接因子リーダーの開裂にも必要とされかくしてこの必須プロセスを混乱させることなく遮断され得ないＫｅｘ−２様の開裂（例えば、アルギニンの後での開裂であるＥ１のａａ１９６後に見られる開裂）の結果であり得る。
【０２３９】
ｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０；図２８）でのＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＹＣＣ１５５の形質転換から誘導された高Ｅ１生産性クローンを、ｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａＹＩＧ１Ｅ１ｓ（配列番号４４；図２２）でのＳ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＹＣＣ１５５の形質転換から誘導された高生産性クローンと比較した。Ｅ１タンパク質の細胞内発現を誘導から２〜７日後に、Ｅ１特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いてウエスタンブロットを用いて評価した。図４０から判断できるように、両方の菌株について２日後に最大の発現が観察されたが、両方の菌株についての発現パターンは全く異なっている。α−交接因子リーダーでの発現は、非常に複雑なバンドパターンを結果とてもたらすが、これは、リーダーのプロセッシングが効率の良いものではないという事実に由来する結果である。こうして、異なるアミノ末端をもち一部が１〜５Ｎ−グリコシル化により修飾されている複数の発現産物が導かれる。しかしながら、ＣＬリーダーで発現されたＥ１については、制限された数の全く異なるバンドが目に見え、このことは、適正なＣＬリーダーの除去レベルが高いこと及び、同じＣＬリーダーが発現されたＨａｎｓｅｎｕｌａ由来のＥ１について観察されるようにＮ−グリコシル化（１〜５鎖）によって、この適正にプロセッシングされた材料のみを修飾することができるという事実を反映している。（実施例６参照）。
【０２４０】
Ｅ１に対し導かれたモノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を産生するハイブドーマ細胞系統は、欧州細胞培養収集機関、応用微生物学研究センター、ウイルトシャー州、ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ） ＳＰ４ ０ＪＧ、英国においてブタペスト条約の条件下で１９９８年３月１２日に寄託され、受託番号ＥＣＡＣＣ９８０３１２１６を有している。Ｅ２に対して向けられたモノクローナル抗体（ＩＧＨ２１２）は、ＷＯ９６／０４３８５中でメルテンスら、により実施例７．４中に抗体１２Ｄ１１Ｆ２として記載されている。
【０２４１】
【表３】

【０２４２】
実施例１６
大規模産生及び精製に適した酵母中のＥ１構築物の発現
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａＭＦリーダーペプチドに置き換えるため、ＣＨＨ（Ｃａｒｃｉｎｕｓ ｍａｅｎａｓ高血糖ホルモンのリーダー配列）、Ａｍｇ１（Ｓ．Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのアミラーゼのリーダー配列）、Ｇａｍ１（Ｓ．Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼのリーダー配列）、Ｐｈｙ５（真菌性フィターゼからのリーダー配列）、ｐｈｏ１（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのリーダー配列）及びＣＬ（鳥類リゾチームＣ、１，４−ベータ−Ｎ−アセチルムラミダーゼＣのリーダー）を含むその他の複数のリーダー配列を使用し、Ｅ１−Ｈ６（すなわちＣ末端ｈｉｓ−タグを伴うＥ１）に連結させた。全ての構築物を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現させ、結果として得られた細胞溶解物の各々をウエスタンブロット分析に付した。これによりすでに、ＣＬがリーダーペプチドとして使用される構築物を除いて、リーダー又はシグナル配列又はペプチドの除去程度がきわめて低いという結論を下すことができた。このことは、Ｎｉ−ＩＤＡで精製された材料のＥｄｍａｎ分解により、ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６構築物について確認された：複数の異なる配列が回収されたものの、適正に開裂された産物を検出することはできなかった（表４参照）。
【０２４３】
【表４】

【０２４４】
すでに言及したように、細胞溶解物のウエスタンブロットは、ＣＬリーダーペプチドの高度の適正な除去を表わすＥ１特異的タンパク質バンドのパターンを顕示した。このリーダーは酵母に由来するものでないことから、これは驚くべきことである。ＧｕＨＣｌで可溶化されＮｉ−ＩＤＡで精製された材料のＥｄｍａｎ分解によるアミノ酸配列決定は、実際、Ｅ１タンパク質の８４％が適正に開裂され、材料が基本的に分解産物を含まないということを確認した。なおも１６％の未プロセッシング材料が存在しているが、この材料は未グリコシル化材料であるため、混合物から容易に除去でき、適正に開裂されグリコシル化されたＥ１の特異的豊富化を可能にする。かかる豊富化方法は、レクチン上のアフィニティクロマトグラフィーであり得、その他の代替案も実施例１９で示されている。あるいはまた、その他の豊富化手順を選択し最適化するために、未グリコシル化材料のより高い疎水特性を使用することができる。ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６タンパク質からのＣＬリーダーペプチドの適正な除去はさらに質量分析法によって確認され、この質量分析法は、同様に、遺伝子型１ｂＥ１ｓの５Ｎ−グリコシル化部位のうち最高４つまでが占有され得、かくして配列ＮＮＳＳ（アミノ酸２３３〜２３６、配列番号７３）は単一のＮ−グリコシル化部位であるとみなされるということも確認した。
【０２４５】
実施例１７
ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６コーディング構築物からのＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ Ｅ２タンパク質の精製及び生化学的特徴づけ
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＣＬ−Ｅ２−ＶＩＥＧＲ−Ｈ６（本例では以下「ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６」と記す）タンパク質からのＣＬリーダーペプチドの除去効率を分析した。ＨＣＶ Ｅ２ｓ（ａａ３８３−６７３）はｈｉｓ−タグ付けされたタンパク質として発現されたことから、Ｎｉ−ＩＤＡについて、収集済み細胞のＧｕＨＣｌ可溶化後の発現済みタンパク質の効率の良い高速精製を行った。簡単に説明すると、３０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、ｐＨ７．２の中に細胞ペレットを再懸濁させた（細胞１ｇあたり９ｍＬの緩衝液）。タンパク質を、３２０ｍＭ（４％ｗ／ｖ）の亜硫酸ナトリウム及び６５ｍＭ（２％ｗ／ｖ）の四チオン酸ナトリウムの存在下で室温で一晩、スルホン化させた。遠心分離（１０．０００ｇ、３０分、４℃／による凍結−解凍サイクルの後、溶解物を清澄させた。それぞれ１％（ｗ／ｖ）及び２０ｍＭの最終濃度までエンピゲンＢＢ（アイブライト＆ウィルソン）及びイミダゾールを添加した。さらなるクロマトグラフィー工程はすべて、ＡｋｔａＦＰＬＣワークステーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で実施した。０．２２μｍの孔径の膜（酢酸セルロース）を通して試料をろ過し、Ｎｉ−ＩＤＡカラム（Ｎｉ^２＋と共に投入されるキレート化セファロースＦＦ）上に投入し、これを２０ｍＭのイミダゾールで補足された１％エンピゲンＢＢ、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）、６ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのリン酸塩で平衡化した。カラムをそれぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで、２８０ｎｍでの吸光度が基線レベルに達するまで洗浄した。緩衝液Ｄ、５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧＨＣｌ、０．２％のエンピゲンＢＢ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのイミダゾールを適用することにより、ｈｉｓ−タグ付けされた産物を溶出した。Ｅ２に対し向けられた特異的モノクローナル抗体Ｅ２（ＩＧＨ２１２）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより、精製された材料を分析した（図４１）。ＩＭＡＣで精製されたＥ２−Ｈ６タンパク質を同様に、Ｅｄｍａｎ分解によるＮ末端配列決定に付した。さらに、タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））（０．２Ｕ／μｇのＥ２、ＰＢＳ／３％エンピゲンＢＢ中で３７℃で１時間のインキュベーション）で処理するか、又は未処理のまま放置した。グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ２−Ｈ６タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、アミノ酸配列決定のためＰＶＤＦ膜上でブロットした（分析は、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＲＯＣＩＳＥ^ＴＭ４９２タンパク質シーケンサ、上で実施した。この工程で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは幾分かの分解産物を顕示したため、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分画を実施した。これに関して、Ｎｉ−ＩＤＡ溶出液を限外ろ過によって濃縮させ（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ、ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ、ミリポアアミコン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、ＰＢＳ、１％のエンピゲンＢＢ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））上に投入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動に基づき、〜３０ｋＤａと〜７０ｋＤａの間のＭｒをもつ無傷のＥ２ｓ関連産物を主として含有する溶出画分をプールし、場合によってアルキル化させた（３７℃で３０分間５ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続く３７℃で３０分間２０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。ＩＭＡＣ精製の後に分解産物が存在する可能性は、かくしてサイズ排除クロマトグラフィーを用いた無傷の産物のさらなる分画によって克服できる。予想外に優れた結果を得ることができた。Ｎ末端配列決定に基づいて、ＣＬリーダーペプチドが除去されているＥ２産物の量を推定することができた。タンパク質産物の合計量をＥｄｍａｎ分解により回収されたピークの強度に基づいて、タンパク質のｐｍｏｌとして計算する。その後、各々の特異的タンパク質（すなわち各々の「検出されたＮ末端」）について、合計に対するモル％を推定する。現行の実験では、Ｅ２−Ｈ６の適正なＮ末端のみが検出され、Ｅ２タンパク質内に含まれていないＮ末端アミノ酸を含有するか又はＥ２タンパク質のＥ２−Ｈ６欠如アミノ酸のその他の変異体は存在しなかった。結論としてはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによりＣＬ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質として発現されたＥ２−Ｈ６タンパク質は、９５％以上の適正に開裂されたタンパク質としてそれ以上のいかなるｉｎ ｖｉｔｒｏ処理も行なわずに、単離された。これは、単離されたタンパク質の２５％中に発生すると推定された、Ｅ２−Ｈ６タンパク質に対するＭＦ−Ｅ２−Ｈ６タンパク質のＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによるリーダーペプチド除去の忠実度と好対照をなすものである（表３参照）。
【０２４６】
実施例１８
ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１コーディング構築物からのＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ Ｅ１タンパク質の精製及び生化学的特徴づけ及びＨ６含有タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ処理
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質からＣＬリーダーペプチドの除去の効率、ならびにＨ６（ｈｉｓ−タグ）−アダプタペタペプチド及びＥｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃプロセッシング部位を除去するためのその後のｉｎ ｖｉｔｒｏプロセッシングの効率を分析した。ＨＣＶ Ｅ１ｓ（ａａ１９２−３２６）は、Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｋ−タグ付けされたタンパク質ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１として発現されたことから、実施例１７で記載された通り高速かつ高効率の精製を実施することができた。Ｈ６−Ｋ−Ｅ１（そして場合によってはＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１）タンパク質のＩＭＡＣ−クロマトグラフィー精製の溶出プロフィールは、図４２に示されている。ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色及びＥ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）（図４３）、組換え型Ｅ１ｓ産物を含有する溶出画分（６３−６９）をプールし（「ＩＭＡＣプール」）、一晩エンドプロテイナーセＬｙｓ−Ｃ（ロシュ）処理（酵素／基質比１／５０（ｗ／ｗ）、３７℃）に付してＨ６−Ｋ−融合テールを除去した。未処理の融合産物の除去をＮｉ−ＩＤＡカラム上での頁のＩＭＡＣクロマトグラフィー工程によって実施し、かくしてフロースルー画分内でＥｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃ処理されたタンパク質を収集する。さらに、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ；１％（ｖ／ｖ）のエンピゲンＢ、ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）での１０倍希釈の後、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上にエンドブロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化されたタンパク質試料を適用し、その後、２８０ｎｍでの吸光度が基線レベルに達するまで緩衝液Ｂで洗浄した。フロースルーを異なる画分（１−４０）の形で収集し、これらの画分をＥ１ｓ産物の存在についてスクリーニングした（図４４）。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の遊走とそれに続く銀染色又はＥ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いたウエスタンブロット分析に基づき〜１５ｋＤａと〜３０ｋＤａの間のＭｒでの）Ｎ末端Ｈ６−Ｋ（そして場合によっては残留ＣＬ−Ｈ６−Ｋ）テールが除去されている無傷のＥ１を含有する画分（７〜２８）をプールし、アルキル化した（３７℃で３０分間５ｍＭのＤＴＴでのインキュベーションとそれに続く３７℃で３０分間２０ｍＭのヨードアセタミドでのインキュベーション）。
【０２４７】
この材料をＮ末端配列決定に付した（Ｅｄｍａｎ分解）。さらに、タンパク質試料をＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ）（０．２Ｕ／μｇのＥ１、ＰＢＳ／３％エンピゲンＢＢ中で３７℃で１時間のインキュベーション）で処理するか、又は未処理のまま放置した。グリコシル化及び脱グリコシル化されたＥ１を次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、エドマン分解によるさらなる分析のためＰＤＶ下膜上でブロットした（分析は、アプライドパイオシステムのＰＲＯＣＩＳＥ^ＴＭ４９２タンパク質シーケンサ上で実施した）。Ｎ末端配列決定に基づいて、適正にプロセッシングされたＥ１産物の量を推定することができた（プロセッシングには、Ｈ６−Ｋ−配列の適正な開裂が含まれる）。タンパク質産物の合計量は、エドマン分解によって回収されたピークの強度に基づいてタンパク質のｐｍｏｌとして計算される。その後、各々の特異的タンパク質（すなわち各々の「検出されたＮ末端」について、合計に対するモル％を推定する。現行の実験では、Ｅ１の適正なＮ末端のみが検出され、Ｈ６−Ｋ−Ｅ１のその他のプロセッシング変異体のＮ末端は検出されない。それに基づいて、Ｅ１タンパク質に対するＨ６−Ｋ−Ｅ１Ｅ１（そして場合によっては残留ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１）タンパク質のＥｎｄｏ Ｌｙｓ−Ｃによるｉｎ ｖｉｔｒｏプロセッシングが、９５％超の忠実度で発生すると推定された。
【０２４８】
実施例１９
ヘパリンによるＨＣＶ Ｅ１の低グリコシル化形態の特異的除去
酵母細胞由来のＨＣＶウイルス様粒子のための特異的精製工程を発見するために、ヘパリンとの結合を評価した。ヘパリンは、複数のウイルスに結合することがわかっており、その結果、ＨＣＶウイルス様粒子に対する結合がすでに示唆されてきた（Ｇａｒｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら、１９９９）。この潜在的結合を分析するため、ヘパリンをビオチニル化し、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｐｈａからのスルホン化されたＨＣＶ Ｅ１、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のアルキル化されたＨＣＶ Ｅ１（共に実施例１６に記載されている通りに産生される）及びワクシニア発現ベクターでのトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞の培養由来のアルキル化されたＨＣＶ Ｅ１のいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレートの中で、ＨＣＶ Ｅ１との相互作用を分析した。驚くべきことに、強い結合は、Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のスルホン化されたＨＣＶ Ｅ１でのみ観察され、一方哺乳動物の細胞培養由来のＨＣＶ Ｅ１での結合は全く存在しなかった。ウエスタンブロットを用いて、我々は、この結合が、低グリコシル化された成熟ＨＣＶ Ｅ１い対応するＨＣＶ Ｅ１ｓタンパク質混合物のさらに低い分子量のバンドに特異的であること（図４５）を示すことができた。図４５は同様に、スルホン化を除去した時点でもなお結合が低分子量のＥ１について観察される（レーン４）ことから、このスルホン化がヘパリン結合にとって必須でないということをも顕示している。あるいはまた、アルキル化がこの結合を実質的に低減させているが、これは、この例で用いられている特異的なアルキル化剤（ヨード−アセタミド）によりひき起こされ得る。驚くべきことに、高度のグリコシル化を有する（すなわちより多くのグリコシル化部位が占有されている）ＨＣＶ Ｅ１タンパク質を伴う調製物を得るためにＨＣＶ Ｅ１調製物を豊富化することが特異的に可能であることから、この発見事実はさらに、酵母のためのＣＬ−ＨＣＶ−エンベロープ発現カセットの工業的な利用可能性を実証した。
【０２４９】
実施例２０
ウイルス様の粒子（ＶＬＰ）の形成と分析
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ内で発現されたＨＣＶ Ｅ１及びＥ２タンパク質（実施例１６〜１８）のＶＬＰへの変換は、基本的に、ＷＯ９９／６７２８５中でＤｅｐｌａら、によって又ＷＯ０１／３０８１５中でボスマン（Ｂｏｓｍａｎ）ら、によって記載されている通りに行なわれた。簡単に言うと、ＨＣＶウイルス様粒子が発現された形質転換済みＨ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞の培養の後、細胞を収穫し、実施例１７で記載された通りにＧｕＨＣｌ中で溶解させスルホン化させた。Ｈｉｓ−タグ付けされたタンパク質をその後ＩＭＡＣによって精製し、実施例１７で記載されているように、限外ろ過により濃縮した。
【０２５０】
スルホン化されたＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理に付さずＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のエンピゲンで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００、ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。相対Ｍｒ〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づき）をもつ画分をプールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００上に投入し、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させた。画分でプールし、濃縮し、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対し脱塩した。
【０２５１】
非可逆的に修飾したＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理（ＰＢＳ中の５ｍＭのＤＴＴの存在下でのインキュベーション）に対して、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基を遊離Ｃｙｓ−チオール基に変換した。（ｉ）２０ｍＭのヨートアセタミドの存在下での３０分間のインキュベーション又は（ｉｉ）５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及び１５ｍＭのビオチン−Ｎ−エチルマレイミドの存在下での３０分間のインキュベーションにより、不可逆的Ｃｙｓ−チオール修飾を実施した。その後、ヨードアセタミド遮断の場合にはＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）エンピゲン、又はＮＥＭ及びビオチン−ＮＥＭでの遮断の場合にはＰＢＳ、０．２％ＣＨＡＰＳで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、タンパク質を投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づく）の相対Ｍｒをもつ画分をプールし、濃縮し、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００上に投入した。画分をプールし、濃縮し、ヨードアセタミド遮断の場合にはＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対して、又ＮＥＭ及びビオテン−ＮＥＭでの遮断の場合にはＰＢＳ、０．０５％のＣＨＡＰＳで脱塩した。
【０２５２】
可逆的に修飾されたＣｙｓ−チオール基でのＨＣＶウイルス様粒子のＶＬＰ形成
単離手順中にスルホン化された濃縮ＨＣＶウイルス様粒子を還元処理（ＰＢＳ中の５ｍＭのＤＴＴの存在下でのインキュベーション）に付して、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基を遊離Ｃｙｓ−チオール基に変換した。ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、ジチオカルバメート（ＤＴＣ）又はシステインの存在下での３０分間のインキュベーションにより、可逆的Ｃｙｓ−チオール修飾を実施した。その後、ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）エンピゲンで平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、タンパク質を投入した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法で分析した。〜２９−〜１５ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動に基づき）の相対Ｍｒをもつ画分をプールし、濃縮し、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタインで平衡化された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００上に投入した。画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタインに対して脱塩した。
【０２５３】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｈ６のＶＬＰを得るためのＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタイン中のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィールは、図４６（スルホン化）及び図４７（ヨードアセタミドでアルキル化）の中で示されている。
【０２５４】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のＶＬＰを得るためのＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）ベタイン中のサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィールは、図４８（スルホン化）及び図４８（ヨードアセタミドでアルキル化）の中で示されている。結果として得られたＶＬＰは、図５０に示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により分析された。
【０２５５】
Ｈ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＨＣＶウイルス様粒子により形成されたＶＬＰのサイズ分析
動的光散乱によりＶＬＰ粒度を決定した。光散乱実験のためには、光子相関分光法（ＰＣＳ、ソフトウエアにより制御される粒度分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ １０００ ＨＳ型、マルバーンインストラメント社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，）ウスターマルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）英国）を使用した。光子相関分光法又は動的光散乱（ＤＬＳ）は、ブラウン運動を測定しそれを粒度に関係づけする光学的方法である。連続的な可視レーザービームからの光は、懸濁状態にありブラウン運動に基づいて移動する巨大分子又は粒子全体を通して導かれる。レーザー光の一部分は、粒子によって散乱され、この散乱光は、光電子増倍管によって測定される。散乱光の強度の変動は、相関装置内に供給される。こうして適切なデータ解析が実施されるコンピュータへと渡される自動相関関数が生成される。使用されたレーザーは、６３３ｎｍの固定波長をもつ１０ｍｗの単色コヒーレントＨｅ−Ｎｅレーザーであった。各試料について、３〜６個の連続的測定が行なわれた。これらの実験の結果は表５にまとめられている。
【０２５６】
【表５】

【０２５７】
Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａに由来するスルホン化されたＨＣＶ Ｅ１がなおも、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来のアルキル化されたＨＣＶ Ｅ１と同じ範囲内の１つのサイズをもつ粒子を形成するという観察事実は、驚くべきものである。スルホン化の結果としての負の電荷の高い（最高８個のＣｙｓ−チオール基をＨＣＶ Ｅ１上で修飾できる）正味の増加がサブユニット間のイオン斥力を誘発するはずであることから、かかる効果は、予想されていなかった。テストされたその他の可逆的システイン修飾的用物質も粒子形成を可能にしたが、このようにして産生されたＨＣＶ Ｅ１は、スルホン化された材料よりも安定性が悪く、ＨＣＶ Ｅ１のジスルフィドベースの凝集を結果としてもたらすことが立証された。これらのその他の可逆的遮断薬を使用するためには、条件のさらなる最適化が必要とされる。
【０２５８】
実施例２１
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞が産生したＨＣＶ Ｅ１の抗原的等価性
ＨＣＶ慢性キャリヤからの血清とＨａｎｓｅｎｕｌａ産生したＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６との反応性を、ＷＯ９９／６７２８５でデプラ（Ｄｅｐｌａ）ら、により記載されている通りに、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞が産生したＨＣＶ Ｅ１の反応性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質がＮＥＭ及びヒオチン−ＮＥＭでアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。ＨＣＶ慢性キャリヤからの血清との両方のＨＣＶ Ｅ１ ＶＬＰ調製物の反応性は、ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は表６にまとめられている。表６から導出できるように、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞内で発現されたＨＣＶ Ｅ１と、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの中で発現されたＨＣＶ Ｅ１の間には反応性の違いは全く認められなかった。
【０２５９】
【表６】

【０２６０】
実施例２２
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ１の免疫原性等価性
Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６の免疫原性を、ＷＯ９９／６７２８５でデプラら、が記載している通りにＨＣＶ組換え型ワクシニア感染哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ１の免疫原性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質がヨードアセタミドでアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。ＶＬＰ調製物は両方共ミョウバンと共に処方され、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体内に注入された（各々３週間の間隔をおいて、各々０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマークを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る三回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。
【０２６１】
この実験の結果は、図５１に示されている。図５１の上部部分については、哺乳動物細胞内で産生されたＥ１のＶＬＰでの免疫化の後に発生した抗体を決定した。哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥ１（「Ｈ」）のいずれかを直接ＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングし、その後カゼインで遮断するＥＬＩＳＡ法（実施例２１参照）により抗体力価を決定した。図５１の下部については、Ｈａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥのＶＬＰでの免疫化の後に発生した抗体を決定した。哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａが産生したＥ１（「Ｈ」）のいずれかを直接ＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングし、その後カゼインで遮断するＥＬＩＳＡ法（実施例２１参照）により抗体力価を決定した。
【０２６２】
決定した抗体力価は終点力価であった。終点力価は、検定のバックグラウンドの平均を２倍したものに等しいＯＤ（ＥＬＩＳＡに決定されるもの）を結果としてもたらす血清の希釈度として決定される。
【０２６３】
図５１は、両方のＥ１組成物の免疫原性特性の間にいかなる著しい差異も観察されなかったこと、及び決定された抗体力価が、終点力価を実施するべくＥＬＩＳＡの中で使用される抗原と無関係であることを示している。
【０２６４】
酵母由来のＨＣＶ Ｅ１は、ワクチン接種時点で、哺乳動物の細胞培養に由来するアルキル化されたＨＣＶ Ｅ１でのワクチン接種時点で得られる防御反応に類似した防御反応を誘発した。後者の応答は、急性感染後のＨＣＶの慢性的進行を防ぐことができた。
【０２６５】
実施例２３
スルホン化されているＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６の抗原性及び免疫原生
ＨＣＶ慢性キャリヤの血清とＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６血清の反応性をＷＯ９９／６７２８５内のＤｅｐｌａら、により記載されている通りに、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ１の反応性と比較した。テスト対象のＨＣＶ−Ｅ１調製物は両方共、Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＨＣＶ Ｅ１タンパク質がスルホン化され哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ１がアルキル化されたＶＬＰで構成されていた。結果は、表７に示されている。全体的（平均的）反応性は、同一であったが、個々の血清についていくつかの主要な差異が指摘された。このことは、スルホン化された材料が、アルキル化されたＨＣＶ Ｅ１とは異なる形でそのエピトープの少なくともいくつかを提示するということを暗に意味する。
【０２６６】
スルホン化されたＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６の免疫原性を、アルキル化されたＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６の免疫原性と比較した。テスト対象の両方のＨＣＶ−Ｅ１調製物は共に、ＶＬＰで構成されていた。ＶＬＰ調製物は両方共ミョウバンと共に処方され、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体内に注入された。（各々３週間の間隔をおいて、各々０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマークを含有する１２５μｌ中５μｇのＥ１から成る三回の筋内／皮下注射）。３回目の免疫化の後１０日目にマウスを放血させた。
【０２６７】
実施例２２に記載されているものと同様に、抗体力価を決定した。驚くべきことに、スルホン化された材料での免疫化は、これらの力価を査定するためにＥＬＩＳＡにおいて使用される抗原の如何に関わらず、より高い抗体力価を結果としてもたらした（図５１：上の図版：アルキル化されたＥ１に対し発生させられた抗体の滴定；下の図版：スルホン化されたＥ１に対して発生させられた抗体の滴定；ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたアルキル化されたＥ１；「Ｓ」：ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたスルホン化されたＥ１）。しかしながらこの実験においては、個々の力価は、ＨＣＶ患者からの血清に関して得られた観察事実を確認する分析のために用いられる抗原により異なる。従って、システイン・チオール基が可逆的に修飾されているＨＣＶ Ｅ１は、より免疫原性であり得、かくしてＨＣＶ（慢性感染）に対し防御するワクチンとして増大した効能を有する。それに加えて、不可逆的遮断によって誘発されるネオエピトープに対する応答の誘発が起こる可能性は低い。
【０２６８】
【表７】

【０２６９】
実施例２４
ワクチン接種を受けたチンパンジーからの血清との、Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＨＣＶ Ｅ１−Ｈ６及びワクシニア感染した哺乳動物細胞によって産生されたＨＣＶ Ｅ１の同一の抗原反応性
ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染哺乳動物細胞により産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１−Ｈ６（両方共アルキル化されている）の、ワクチン接種を受けたチンパンジーからの血清及びモノクローナル抗体との反応性を比較した。さらに、前記Ｅ１タンパク質をＥＬＩＳＡ内のプレートに直接コーティングしその後カゼインでプレートを飽和させた。ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされたＥ１タンパク質を結合させる抗体の終点力価を、全て哺乳動物細胞によって産生されたＥ１で免疫化された動物から得られた特異的マウスモノクローナル抗体及びチンパンジー血清について決定した。終点力価決定は、実施例２２に記載されている通りに行なわれた。使用されたマウスモノクローナル抗体はＩＧＨ２０１（実施例１５を参照）、ＩＧＨ１９８（ＩＧＨ１９８＝ＷＯ９６／０４３８５内のメルテンスら、中の２３Ｃ１２）、ＩＧＨ２０３（ＩＧＨ２０３＝ＷＯ９６／０４３８５内のメルテンスら、中の１５Ｇ６）及びＩＧＨ２０２（ＩＧＨ２０２＝ＷＯ９９／５０３０１内のメルテンスら、中の３Ｆ３）であった。
【０２７０】
図５３から導出できるように、７匹の異なるチンパンジーの反応性は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ又は哺乳動物細胞のいずれかにより産生されたＥ１タンパク質でテストされたとき同一である。ＨＣＶ Ｅ１に対するモノクローナル抗体の反応性も同様にほぼ等しいものである。チンパンジーのうち２匹（Ｙｏｒａｎ及びＭａｒｔｉ）が、予防的ワクチン研究に関与し、抗原投与時点で急性感染を一掃することができたのに対し、対照動物は、感染を一掃できなかった。その他の５匹のチンパンジー（Ｔｏｎ、Ｐｈｉｌ、Ｍａｒｃｅｌ、Ｐｅｇｇｙ、Ｆｅｍｍａ）は、治療的ワクチン接種研究に関与し、ＨＣＶ Ｅ１免疫化の時点で、肝臓生検材料上の組織学的活性指標及び／又は血清中のＡＬＴにより測定されるように、肝臓損傷の低減を示した。
【０２７１】
この実験で得られた結果はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ両方においてＥＣＶＥ２タンパク質を発現した。Ｍｕｓｔｉｌｌｉ及び協同研究者（Ｍｕｓｔｉｌｌｉ，Ａ．Ｃ．ら、，１９９９）の発見事実とは明らかに異なっている。しかしながら、精製された酵母により産生されたＥ２は、モノクローナル抗体との反応性が酵母により産生されたＨＣＶ Ｅ２についてより高いものであったものの哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ２で免疫化されたチンパンジーからの血清ではより低い反応性が観察されたという点において、哺乳動物（ＣＨＯ）細胞によって産生されたＨＣＶ Ｅ２とは異なっていた。
【０２７２】
実施例２５
蛍光体援用型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）によるＨＣＶ Ｅ１の糖プロファイリング
グリコシル化プロフィールをＷＯ９９／６７２８５でデプラら、によって記載されているように、ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞により産生されたＨＣＶ Ｅ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａ産生ＨＣＶ Ｅ１について比較した。これは、蛍光体援用型炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）を用いて行なわれた。さらに、オリゴ糖を、ペプチド−Ｎ−グリュシダーゼ（タンパク質Ｇａｓｅ Ｆ）により哺乳動物細胞又はＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから遊離させ、ＡＮＴＳで標識づけした（ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化に先立ち、ヨートアセタミドでＥ１タンパク質をアルキル化した）。２−３時間４℃で１５ｍＡの電流にて２１％のポリアクリルアミド上でＰＡＧＥにより、ＡＮＴＳ標識づけされたオリゴ糖を分離した。図５４から哺乳動物細胞により産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１−Ｈ６上のオリゴ糖が単糖７〜１１個という重合度でオリゴマルトースのように移動するということが結論づけされた。このことはすなわち、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ発現系が驚くべきことに、過剰グリコシル化されずかつ哺乳動物細胞中で産生されたＥ１タンパク質に添加された糖鎖と類似の長さをもつ糖鎖を有するＥ１タンパク質を導く、ということを表わしている。
【０２７３】
実施例２６
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＨａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１ｓ及びＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞により産生されたＥ１ｓから誘導されたＮ−結合したオリゴ糖の配列決定
ＰＢＳ、０．５％ベタイン中に存在しＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＨａｎｓｅｎｕｌａ培養（実施例１５−１６参照）又はＨＣＶ細胞え型ワクシニアウイルスに感染したＲＫ１３細胞の培養（ＭａｅｒｔｅｎｓらＷ０９６／０４３８５明細書参照）から精製されたＥ１ｓ（２２５μｇ）を、４０μｇ／ｍｌという最終濃度まで、脱グリコシル化インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．７５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）で希釈した。溶液のｐＨを濃Ｈ_３ＰＯ_４でｐＨ５．５に調整した。この溶液に対し、２ＵのＰＮＧａｓｅＦ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍのペプチド−Ｎ^４−（アセチル−ベータ−グルコサアニル）−アスパラギンアミダーゼ；ＥＣ３．５．１．５２；Ｒｏｃｈｅ社より入手）を添加し、試料を３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、溶液のｐＨを濃Ｈ_３ＰＯ_４でｐＨ５．５に調整した。タンパク質及びオリゴ糖をその後、４体積のアセトン（−２０℃で）を添加することで沈殿させ、混合物を１５分間−２０℃でインキュベートした。試料を４℃で５分間１３００ｒｐｍで遠心分離させた。アセトン上清を廃棄し、１５０μＬの氷冷６０％メタノールを添加した後１時間−２０℃でペレットをインキュベートした。遊離されたオリゴ糖を含有するメタノール上清を収集し、ロータリーエバポレーション（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ）により乾燥させた。
【０２７４】
乾燥させたＥ１ｓグリカンならびに基準オリゴ糖（全てＧｌｙｋｏ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、英国からのもの、図５５参照１、Ｍａｎ−９（１１の単糖単位）、Ｍａｎ−８（１０の単糖単位）、Ｍａｎ−７（９単糖単位）、Ｍａｎ−６（８単糖単位）及びＭａｎ−５（７単糖単位）を５μＬの２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）標識付け試薬中で溶解させ（３０％ＨＯＡｃ／７０％のＤＭＳＯ中の±０．３５Ｍの２−ＡＢｔ±１ＭのＮａＣＮＢＨ_３）、５〜１００μＭの間の最終グリカン濃度を得た。その後グリカン溶液を６５℃に２時間インキュベートした。３０分後、試料をボルテックスにより混合した。結合の後、余剰の２−ＡＢを以下のように除去した。試料を１６−μＬの精製水（ＭｉｌｌｉＡ）で希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラム（直径１ｃｍ、高さ１．２ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｖａｃ Ｅｌｕｔシステム、Ｖａｒｉａｎにカップリング）をプルドライ（ｐｕｌｌｅｄ ｄｒｙ）した後このカラムに試料を適用した。
【０２７５】
カラムに２×１００−μＬの精製水（ＭｉｌｌｉＡ）を適用することによって、標識づけされたオリゴ糖を溶出させた。基準炭水化物（Ｍａｎ−９、Ｍａｎ−８、Ｍａｎ−７及びＭａｎ−６）の溶出液を乾燥させ、ＨＰＬＣ分析まで−７０℃で保管した。４本の番号入りＰＣＲ管にＥ１ｓ試料の溶出液ならびにＭａｎ−９基準グリカンを分配した。表８中に概略的に記した通りの反応を実施し、１時間後に終了させた管３中の反応を除いて、全ての反応を３７℃で一晩進行させた。使用されたエキソグリコシダーゼ酵素（全てＧｌｙｋｏ，Ｂｉｃｗｓｔｅｒ，英国より入手）の最終濃度は、以下の通りであった：α１−２マンノシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）については：２ｍＵ／ｍｌ；α−マンノシダーゼ（Ｊａｃｋ Ｂｅａｎ）については；５０Ｕ／ｍＬ；そしてβ−マンノシダーゼ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）については；４Ｕ／ｍＬ。
【０２７６】
【表８】

【０２７７】
図５６は、キトビオースにカップリングされた１０個のマンノース部分から成る高次オリゴマンノースを示す。各々の末端マンノース残基は、α１−３結合により非末端マンノース残基に結合される。図５６のオリゴマンノースは、エキソグリュシダーゼα１−２マンノシダーゼによる開裂に対する完全な耐性をもつ。エキソグリュシダーゼα−マンノシダーゼでの図５６のオリゴマンノースの長時間（一晩）インキュベーションの結果、全てのα−結合（α１−２，α１−３，α１−６）は開裂されるがα−結合は開裂されない。かくして、結果としてもたらされるオリゴ糖は、４’−β−マンノシルキトビオースとなる。この４’−β−マンノシルキトビオース部分は、エキソグリコソダーゼであるβ−マンノシダーゼの作用を通してマンノースとキトビオースに転換され得る。供給業者（Ｇｌｙｋｏ）仕様に従うと、α−マンノシダーゼは、基準オリゴ糖Ｍａｎ−６（図５５．Ｄ参照）を４’−β−マンノシルキトビオースに完全に転換し、β−マンノシダーゼによるマンノース及びキトビオースへのそのさらなる変換は、同様に完全であることが報告されている。
【０２７８】
図５７は、キトビオースにカップリングされた９マンノース部分から成るより高いオリゴマンノースを示している。このオリゴマンノースにおいては、１つの末端マンノース残基は、非末端マンノース残基にα１−２結合により結合される。エキソグリコシダーゼα１−２マンノシダーゼの作用時点で、前記α１−２結合されたマンノースは除去されることになる。α−マンノシダーゼ及びβ−マンノシダーゼのその後の作用時点で、図５６のオリゴマンノースについて記載された通りの反応産物が得られることになる。供給業者（Ｇｌｙｋｏ）の仕様に従って、α１−２マンノシダーゼは、９０％を上回る効率で基準オリゴ糖Ｍａｎ−９及びＭａｎ−６をＭａｎ−５（図５５参照）に転換させることができる。
【０２７９】
図５８は、キトビオースにカップリングされた９個のマンノース部分から成る基本高次オリゴマンノースＭａｎ−９を示す。このオリゴマンノースにおいては、全ての末端マンノース残基はα１−２結合によって非末端マンノース残基に結合される。エキソグリコシダーゼα１−２マンノシダーゼの作用時点で、Ｍａｎ−９は、かくして、９０％を上回る割合で供給業者の仕様に従ってＭａｎ−５に転換されることになる。α−マンノシダーゼでのその後の消化は、Ｍａｎ−５を４’−β−マンノシルキトビオースに転換することになる。
【０２８０】
表８に記されているような異なる反応チューブの中味を遠心真空蒸発機内又は凍結乾燥機内で乾燥させ、ＨＰＬＣ分析まで−７０℃で保管した。カラムに適用する前に、各試料（Ｅ１ｓ及び基準）を２５μＬの水中に溶解させ、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣステーションにカップリングされたＴＳＫゲル−Ａｍｉｄｅ−８０（０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）上に投入した。
【０２８１】
オリゴ糖の分離を１．０ｍＬ／分で周囲温度で実施した。溶剤Ａは、アセトニトリル中の０．１％の酢酸から成り、溶剤Ｂは、水中の０．２％の酢酸−０．２％のトリエチルアミンから成っていた。２−ＡＢで標識づけされたオリゴ糖の分離を２８％のＢを用いて実施し、５カラム体積中は一定組成とし、その後１５カラム体積全体にわたり４５％Ｂとなるまで線形に増加させた。
【０２８２】
基準オリゴ糖Ｍａｎ−６は５３±１分で溶出しており、Ｍａｎ−７は５９±１分で、Ｍａｎ−８は６７±２分で、Ｍａｎ−９は７０±１分で；４’−β−マンノシルキトビオースは１０±１分で、キトビオースは６±１分（図示せず）で溶出している。このことは、エキソグリコシダーゼ無しで一晩のインキュベーション後（図６３内のクロマトグラムのトレース１；Ｍａｎ−９のみ）、α１−２マンノシダーゼで一晩のインキュベーションの後（図６３内のクロマトグラムのトレース２；Ｍａｎ−５及びＭａｎ−６の混合物）、α−マンノシダーゼで１時間又は一晩のインキュベーションの後（図６３のクロマトグラムのそれぞれトレース３及び４；４’−β−マンノシルキトビオースのみ）、及びα−及びβ−マンノシダーゼで一晩のインキュベーションの後（図６３中のクロマトグラムのトレース５；キトビオースのみ）、Ｍａｎ−９の反応産物について例示されている。図６３のクロマトグラムのトレース６は、適用された溶剤勾配を表わしている。
【０２８３】
エキソグリコシダーゼ無しで（ＰＮＧａｓｅ処理の後に得られた）Ｓａｃｃｈａｒｍｏｙｃｅｓ産生Ｅ１ｓのオリゴ糖の反応の産物は主として、５９±１分（１５％）、６７±１分（４５％）、７０±１分（２５％）及び７５±１分（１５％）で溶出して存在する４つの炭水化物であった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓ中のＭａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）及びＭａｎ（９）ＧｌｃＮＡｃ（２）の全含有率は最高６５％であった。α１−２マンノシダーゼとの反応において、保持時間７０±１分の炭水化物のみが消滅した。保持時間７５±１分の炭水化物の強度は同じにとどまり、保持時間６７±１分の炭水化物の強度は増大した。このことはすなわち、全ての末端マンノース単位がα（１−２）立体配置を有するわけではないということを意味している。αマンノシダーゼとの一晩のインキュベーションの後、全ての炭水化物鎖は、４’−β−マンノシルキトビオース部分に還元された。このことはすなわち、炭水化物が高次マンノースであり１つを除く全てのマンノース残基がβコンホーメーションを有することを意味している。この４’−β−マンノシルキトビオース部分からキトビオースへの還元は、β−マンノシダーゼとの一晩のインキュベーションの後明らかになった。結果として得られたクロマトグラムは、図６３のクロマトグラムについて記載されたものと同じ条件下で得られた図６４に記されている。結果は、表９にまとめられている。
【０２８４】
ワクシニアに感染した細胞によって産生されたＥ１ｓで同じ実験を反復し、それは驚くべきことに全く異なる写真を示した。酵素無しの反応においては、炭水化物の複合混合物が存在した（図６５及び表９を参照のこと）。単糖（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）及び単糖（９）−ＧｌｃＮＡｃ（２）の全含量率は３７％であった。α１−２マンノシダーゼでの反応後、保持時間７０±１及び５９±１分の炭水化物は消滅した。αマンノシダーゼとの一晩のインキュベーションの後、４’−β−マンノシルキトビオース産物のほかに、実質的量の単糖（６）−ＧｌｃＮＡｃ（２）が残った。これは、オリゴ糖分岐の１つがαマンノシダーゼ分解に対する耐性をもつことを表わしている。これは、Ｎ結合されたオリゴ糖のＭａｎα（１−２）で終結した分岐に結合した１つ又は２つのグルコース−残基の存在によって説明がつく。かかるグルコース含有オリゴ糖の推定上の構造が図６２に描かれている。グルコース含有オリゴ糖の考えられる反応産物は、表１０）に示されている。Ｍａｎ−７等価オリゴ糖（すなわち９個の単糖から成るオリゴ糖）はα１−２マンノシダーゼ反応の後全く残っていないことから、これらのグルコース残基は、図６２に示されたオリゴ糖構造のＢ分岐に結合されている確率が最も高い。しかしながら、図６２のオリゴ糖のＡ及びＢ分岐の両方がグルコースにより部分的に終結されているということを排除することはできない。
【０２８５】
キトビオースへの４’−β−マンノシルキトビオース部分の還元は、βマンノシダーゼでの一晩のインキュベーションの後明らかになった。図６５には、図６３−６４のクロマトグラムについて記載されているのと同じ条件の下で得られた、結果としてのクロマトグラムが描かれている。
【０２８６】
得られた結果は表９でまとめられている。
【０２８７】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１ｓで同じ実験を反復し、驚くべきことにそれは、完全に異なる写真を示した。酵素無しの反応においては、主として６７±２分及び７０±１分の保持時間の２つの炭水化物が存在し、これはそれぞれＭａｎ−８及びＭａｎ−９に対応していた。Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１ｓ内のＭａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）及びＭａｎ（９）ＧｌｃＮＡｃ（２）の全含有率は最高９０％であった。α１−２マンノシダーゼでの反応後、炭水化物は主として保持時間４５±１ｍｉｎのＭａｎ−５及び保持時間５３±１分のＭａｎ−６へと還元された。αマンノシダーゼとの一晩のインキュベーションの後、全ての炭水化物鎖は４’−β−マンノシルキトビオース部分に還元された。このことはすなわち、炭水化物が高次マンノースであり、１つを除くすべてのマンノース残基がβコンホーメーションを有することを意味している。この４’−β−マンノシルキトビオース部分からキトビオースへの還元は、βマンノシダーゼとの一晩のインキュベーションの後明らかになった。図６６には、図６３−６５のクロマトグラムについて記載されているものと同じ条件下で得られた、結果としてのクロマトグラムが描かれている。得られた結果は表９にまとめられている。
【０２８８】
【表９】

【０２８９】
【表１０】

【０２９０】
実施例２７
組換え型ＨＣＶ Ｅ１内のＮ−グリコシル化部位の占有
占有されたＮ−グリコシル化部位の量に応じて、Ｅ１ｓは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析上で異なる泳動挙動を示す。この特性に基づいて、Ｅ１産物内の占有されたＮ−グリコシル化部位の平均的量を推定することができた。この点に関し、精製されたＥ１産物の試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色に付し（図６７）、Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ １ Ｄ Ｐｒｉｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅパケット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてさらに分析した。簡単に説明すると、ゲルをスキャンし、各々の特定のタンパク質バンドについて、出現％（全てのバンドの合計を１００％にする異なるバンドの合計強度との関係におけるその強度）を推定した（表１１）。各々の特定のタンパク質バンドが、同じ占有されたＮ−グリコシル化部位数をもつＥ１ｓ⁻分子を表わしているということに留意すべきである。
【０２９１】
得られた結果は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１産物の主要部分（＞９０％）が、ワクシニア発現系（Ｍａｅｒｔｅｎｓｅｔら、がＷ０９６／０４３８５中で記載しているような）から得られるＥ１ｓよりも占有率の低い単数又は複数のＮ−グリコシル化部位を有することを示した。ワクシニア由来のＥ１産物中全てのＮ−グリコシル化部位が占有されている（ここではＥ１の位置２３３−２３６上の配列「ＮＮＳＳ」（配列７３）が１つのグリコシル化部位であるとみなされる）ということを仮定すると、Ｈａｎｓｅｎｕｌａで発現されたＥ１タンパク質内の占有されたＮ−グリコシル化部位の平均数が、利用可能な全Ｎ−グリコシル化部位の８０％を超えないという結論を下すのがきわめて無難である。
【０２９２】
【表１１】

【０２９３】
実施例２８
組換え型ＨＣＶ Ｅ２内のＮ−グリコシル化部位の占有
Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生された２００μｇのＥ２−Ｈ６タンパク質をＰＮＧａｓｅ下で脱グリコシル化した。脱グリコシル化されたＥ２ｓ−Ｈ６をミニ・ゲル（１０μｇ／レーン）上に投入した。タンパク質バンドをトリプシン及びエンドＡｓｐ−Ｎで消化した。結果として得られたペプチドの質量をＭａｌｄｉ−ＭＳ（乾燥液滴及び薄層法）で決定した。
【０２９４】
この方法をＮ−グリコシル化度を決定する目的で使用することができる： 酵素ＰＮＧａｓｅ下での脱グリコシル化中、完全な糖鎖を開裂して外し、同時にアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）へと加水分解させる。これら２つのアミノ酸の間の質量差は、質量分光法によって決定可能な１Ｄａである。さらに、ＮからＤへの加水分解は、Ａｓｐ−Ｎ酵素のための新しい開裂部位を作り出す。
【０２９５】
Ｅ２ｓ内の考えられるグリコシル化部位は、Ｎ_４１７、Ｎ_４２３、Ｎ_４３０、Ｎ_４４８、Ｎ_４７８、Ｎ_５３２、Ｎ_５４０、Ｎ_５５６、Ｎ_５７６、Ｎ_６２３及びＮ_６４５（図６８を参照）である。Ｍａｌｄｉ−ＭＳ分析は、これらのグリコシル化部位の各々について、ＰＮＧａｓｅ下での脱グリコシル化の後ペプチドがグリコシル化部位にＮ又はＤのいずれかを伴って（質量差１Ｄａ）発見されたことから、Ｎ−グリコシル化が完全でなかったことを示した。Ｎ残基の数に対するＤ残基の数の比は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより発現され分析対象試料中に存在する全てのＥ２タンパク質全体にわたる、糖鎖による単一Ｎ−グリコシル化部位の平均的占有の表示を提供する。これらの結果は、表１２−１４にまとめられている。
【０２９６】
これらの結果から、平均して各々のグリコシル化部位が約５４％グリコシル化されるということが計算された。
【０２９７】
【表１２】

【０２９８】
【表１３】

【０２９９】
【表１４】

【０３００】
実施例２９
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＨＣＶ Ｅ１との血液ドナー血清の反応性
（α−ＭＦリーダーで発現された）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓ−Ｈ６及び（ＣＬリーダで発現された）Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＨ１ｓ−Ｈ６を両方共、実施例１５及び１６の中で記載されている通りに精製し、実施例２０中で記載されている通りに最終的にアルキル化及びＶＬＰ形成に付した。両方のタンパク質を直接０．５μｇ／ｍＬのマイクロタイタープレート上に吸着させ（１時間３７℃）、プレートを遮断した後（ＰＢＳ−０．１％カゼイン、１時間３７℃）、ＨＣＶスクリーニングを受け陰性の血液ドナーからの血清を１／２０の希釈度（ＰＢＳ−０．５％カゼイン、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−７０５、１時間、３７℃）でインキュベートした。最終的に、１／５００００の希釈度で（ＰＢＳ−０．１％カゼイン、１時間、ＲＴ）ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にカップリングされた二次的ウサギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的抗血清を用いて結合を検出し、その後発色させた。全ての段階の間でプレートをＰＢＳ−０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。比較のため、Ｄｅｐｌａら、がＷ０９９／６７２８５明細書中で記載した通りに産生され精製された哺乳動物細胞由来のＥ１ｓについても同一の要領で血清を分析した。
【０３０１】
このＥＬＩＳＡについてのカットオフ値は、バッググラウンド（すなわち、同じセットアップであるがストレプトアビジンが壁に吸着された状態の全ての血清の反応性）の平均の２倍に設定された。
【０３０２】
表１５から、数多くの（７５％）血清が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで産生されたＥ１に関するカットオフ値より高い反応性を示すものの、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ産生Ｅ１とカットオフ値より高い幾分かの反応性を示す血清はわずか（６％）でしかない、ということが判断できる。この反応性の差は、実施例２６で立証されるように、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ産生Ｅ１上のα１−２マンノースに結合された末端α１−３マンノースの存在に原因があった。Ｙｏｕｎｇ及びその共同研究者ら（１９９８）はすでに以前に、このタイプのマンノースがＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ由来のマンナンとヒト血清の反応性の原因でもあるということを示した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来のＥ１に対する反応性がこのタイプの残基に起因しうるということをさらに確認するために、希釈緩衝液に添加された１又は５ｍｇ／ｍＬのマンナン（Ｓｉｇｍａ）で予備インキュベートされた（３７℃で１時間）血液ドナーの希釈液を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ産生Ｅ１についてＥＬＩＳＡを反復した。表１６から判断できるように、マンナンでの予備インキュベーションは、濃度依存的に１つ（Ｆ５５６）を除くすべての分析対象血清についてバックグラウンドレベルまで、血液ドナー血清とのこのＥ１の反応性を低減させた（５ｍｇのマンナン／ｍＬを用いると、平均ＯＤはマンナンによる競合なしの０．２４から０．０６まで減少させられる）。
【０３０３】
【表１５】

【０３０４】
【表１６】

【０３０５】
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【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】配列番号６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＧＥＭＴ−Ｅ１ｓＨ６ＲＢの概略的地図である。
【図２】配列番号９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＣＨＨ−Ｈｉｒの概略的地図である。
【図３】配列番号１２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ１２１の概略的地図である。
【図４】配列番号１３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＨＨ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図５】配列番号１６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図６】配列番号１７中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＭＦａ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図７】配列番号２０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図８】配列番号２１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１−Ｈ６の概略的地図である。
【図９】配列番号２２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＰ７２Ｅ２Ｈ６の概略的地図である。
【図１０】配列番号２３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＰＴ１２１の概略的地図である。
【図１１】配列番号２４中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１２】配列番号２５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＰＴ−ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１３】配列番号２８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＭＦ３０の概略的地図である。
【図１４】配列番号３２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ２−Ｈ６の概略的地図である。
【図１５】配列番号３５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１６】配列番号３６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１７】配列番号３９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８−ＦＭＤ−ＣＬ−Ｈ６−Ｅ１−Ｋ−Ｈ６の概略的地図である。
【図１８】配列番号４０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１の概略的地図である。
【図１９】配列番号４１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５の概略的地図である。
【図２０】配列番号４２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５Ｅ１Ｈ６の概略的地図である。
【図２１】配列番号４３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１の概略的地図である。
【図２２】配列番号４４中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａの概略的地図である。
【図２３】配列番号４５中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＢＳＫ−Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図２４】配列番号４６中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ５ＨＣＣＬ−２２ａＨ６の概略的地図である。
【図２５】配列番号４７中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＹＩＧＳＥ２Ｈ６の概略的地図である。
【図２６】配列番号４８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ７の概略的地図である。
【図２７】配列番号４９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＹＩＧ７Ｅ１の概略的地図である。
【図２８】配列番号５０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓの概略的地図である。
【図２９】配列番号５１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡの概略的地図である。
【図３０】配列番号５２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’の概略的地図である。
【図３１】配列番号５３中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’ の概略的地図である。
【図３２】配列番号５８中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ１ｓＨ６の概略的地図である。
【図３３】配列番号５９中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ１ｓＨ６の概略的地図である。
【図３４】配列番号６０中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＤ’Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図３５】配列番号６１中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＥ’Ｅ２ｓＨ６の概略的地図である。
【図３６】配列番号６２中に定義されている通りの配列を有するベクターｐＵＣ１８ＭＦａの概略的地図である。
【図３７】ＭＦａ−Ｅ２−Ｈ６を発現するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａから発現されたＩＭＡＣによる精製済みのＥ２−Ｈ６タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィの溶出プロフィール（実施例１５参照）。Ｘ軸は、溶出体積（ｍＬ単位）を表わす。溶出プロフィールを通る垂直線は、収集された画分を表わしている。「Ｐ１」＝プールされた画分４〜９、「Ｐ２」＝プールされた画分３０〜３５そして「Ｐ３」＝プールされた画分３７〜４４。Ｙ軸は、ｍＡｕ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を表わす。
【図３８】サイズ排除クロマトグラフィ（図３７参照）の後に収集された異なるプール及び画分を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くポリアクリルアミドゲルの銀染色により分析した。分析されたプール（「Ｐ１」、「Ｐ２」及び「Ｐ３」）及び画分（１６〜２６）は、銀染色されたゲルの写真の上部に示されている。左（レーン「Ｍ」）には、分子質量マーカーのサイズが示されている。
【図３９】図３７に示されている通りのサイズ排除クロマトグラフィ工程の画分１７〜２３をプールし、アルキル化した。その後、タンパク質材料を、脱グリコシル化のためのＥｎｄｏ Ｈ処理に付した。未処理材料及びＥｎｄｏ Ｈ処理済み材料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に対しブロッティングした。ブロットをアミドブラックで染色した。 レーン１：Ｅｎｄｏ Ｈ−処理前のアルキル化されたＥ２−Ｈ６ レーン２：Ｅｎｄｏ Ｈ−処理後のアルキル化されたＥ２−Ｈ６
【図４０】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されたＥ１の細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ウエスタンブロットは、Ｅ１特異的モノクローナル抗体ＩＧＨ２０１を用いて発色させた。 レーン１〜４：Ｅ１−Ｈ６に結合されたニワトリリゾチームリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｐＳＹ１ＹＩＧ７Ｅ１ｓ（配列番号５０、図２８）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓクローン内での、それぞれ２日、３日、５日又は７日間の発現の後の発現産物。 レーン５〜７： Ｅ１−Ｈ６に結合されたａ−交配因子リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｐＳＹ１ａＭＦＥ１ｓＨ６ａＹＩＧＩ（配列番号４４、図２２）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓクローン内での、それぞれ２日、３日、又は５日間の発現の後の発現産物。レーン８：表示された通りのサイズをもつ分子量マーカー レーン９：ＨＣＶ−組換え型ワクシニアウイルス感染した哺乳動物細胞によって産生された精製済みＥ１。
【図４１】Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現されこれによりＣＬ−Ｅ２−Ｈ６からＥ２−Ｈ６までプロセッシングされた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）で精製済みのＥ２−Ｈ６タンパク質分析（実施例１７参照）。異なる洗浄画分（レーン２−４）及び溶出画分（レーン５〜７）内のタンパク質を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くゲルの銀染色（Ａ、写真上）またはＥ２に対して向けられた特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法（Ｂ、写真下）により分析した。分子質量マーカーのサイズは、左に記されている。
【図４２】Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたスルホン化されたＨ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質の精製のための、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上の第１のＩＭＡＣクロマトグラフィ工程の溶出プロフィール（Ｎｉ^２＋が投入されたキレート化セファロースＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（実施例１８参照）。カラムは、２０ｍＭのイミダゾールで補足された緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸塩、６ＭのＧｕＨＣｌ、１％のエンピゲンＢＢ（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．２）で平衡化された。試料適用後、カラムを、（クロマトグラム上で示されているように）それぞれ２０ｍＭ及び５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａで逐次的に洗浄した。Ｈｉｓでタグ付けされた産物のさらなる洗浄及び溶出工程を、（クロマトグラム上で示されているように）それぞれ５０ｍＭのイミダゾール及び２００ｍＭのイミダゾールで補足された緩衝液Ｂ（ＰＢＳ１％ エピゲンＢＢ、ｐＨ７．２）を逐次的に適用することによって実施した。以下の画分をプールした：洗浄プール１（画分８〜１１、５０ｍＭのイミダゾールでの洗浄）。溶出した材料を、別々の画分６３〜７２として収集するか又は、溶出プール（画分６３〜６９）を製造した。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を示している。
【図４３】Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１からＨ６−Ｋ−Ｅ１までプロセッシングされたＩＭＡＣで精製されたＨ６−Ｋ−Ｅ１タンパク質の分析（図４２参照）。洗浄プール１（レーン１２）及び溶出画分６３〜７２（レーン２〜１１）中のタンパク質を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くゲルの銀染色（Ａ、写真上）によって分析した。Ｅ１に対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を用いたウエスタンブロット法により、ＩＭＡＣ前の試料中（レーン２）、フロースループール中（レーン４）、洗浄プール１中（レーン５）、及び溶出プール（レーン６）中に存在するタンパク質を分析した（Ｂ、写真下；レーン３中にはいかなる試料も投入されなかった）。分子質量マーカー（レーンＭ）のサイズは、左側に示されている。
【図４４】Ｅｎｄｏ Ｌｙｓ−ＣでのＨ６−Ｋ−Ｅ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理（精製：図４２参照）の結果をもたらされるＥ１の精製のための、Ｎｉ−ＩＤＡカラム上の第２のＩＭＡＣクロマトグラフィ工程の溶出プロフィール（Ｎｉ^２＋が投入されたキレート化セファロースＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。フロースルーは、異なる画分（１〜４０）の形で収集し、Ｅ１−産物の存在についてこれをスクリーニングした。Ｈ６−Ｋ−Ｅ１から処理された無傷のＥ１を含有する画分（７〜２８）をプールした。ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を表わす。Ｘ軸は、ｍＬ単位の溶出体積を示している。
【図４５】ビオチニル化されたヘパリンと反応する特異的にＥ１ｓタンパク質バンドを示すウエスタンブロット分析（実施例１９も同様に参照のこと）。ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染した哺乳動物培養から精製された又はＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現されたＥ１ｓ調製物を分析した。垂直線から右側の図版は、ビオチニル化されたＥ１特異的モノクローナルＩＧＨ２００で発達されたウエスタンブロット法を示す。垂直線から左側の図版は、ビオチニル化されたヘパリンで現像されたウエスタンブロット法を示す。これらの結果から、主として比較的低いグリコシル化を受けたＥ１ｓがヘパリンに対する高いアフィニティを有するという結論が導かれた。 レーンＭ；分子量マーカー（分子量は左に表示）。 レーン１；単離中にアルキル化された、哺乳動物細胞からのＥ１ｓ。 レーン２；Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、単離中に、スルホン化されたＥ１ｓ−Ｈ６。 レーン３；Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより発現され、単離中に、アルキル化されたＥ１ｓ−Ｈ６。 レーン４；レーン２で投入された通りであるものの、スルホン化されたＣｙｓ−チオール基をＣｙｓ−チオールへと転換するためのシチオトレイトールで処理された同じ材料。
【図４６】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、スルホン化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｅ６のサイズ排除クロマトグラフィラフィ（ＳＥＣ）プロフィール。さらなる研究のために使用されるＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４７】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、アルキル化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ２−Ｅ６のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４８】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、スルホン化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図４９】ベタインに対するエンピゲンＢＢの交換により、ウイルス様粒子を形成させるためのＰＢＳ、３％ベタイン中のランに付された、アルキル化された形の精製済みのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで発現されたＥ１のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）でプロフィール。ＶＬＰを含有するプールされた画分は、「←→」で表わされている。Ｙ軸は、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）で与えられた吸光度を示す。Ｘ軸は、ｍＬ単位で表わした溶出体積を表わす。実施例２０も同様に参照のこと。
【図５０】図４８及び４９中で記載されているようにサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）後に単離された通りのＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元性条件下の）及びウエスタンブロット分析。左側図版：銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。右側図版：Ｅ１対して向けられた特異的モノクローナル抗体（ＩＧＨ２０１）を使用するウエスタンブロット法。レーン１：分子量マーカー（分子量は左側に表示）；レーン２：スルホン化されたＥ１を含有するＶＬＰのプール（図４８参照）；レーン３：アルキル化されたＥ１を含有するＶＬＰのプール（図４９参照）。実施例２０も同様に参照のこと。
【図５１】哺乳動物細胞中で産生されたＥ１を用いたマウスのワクチン接種の後又は（図版上）又はＨａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１でのマウスのワクチン接種後（図版下）に血清中に存在する抗体の終点力価を決定するための、ＥＬＩＳＡ固体支持体上に、哺乳動物細胞内で産生されたＥ１（「Ｍ」）又はＨａｎｓｅｎｕｌａで産生されたＥ１（「Ｈ」）をコーティングした。水平方向の棒は、平均抗体力価を表わす。終点力価（希釈倍数）は、Ｙ軸に表わされている。実施例２２も同様に参照のこと。
【図５２】Ｈａｎｓｅｎｕｌａ産生されたＥ１をアルキル化（「Ａ」又は（「Ｓ」）させ、アルキル化されたＨａｎｓｅｎｕｌａ産生Ｅ１でのマウスのワクチン接種後（図版上）又はスルホン化されたＨａｎｓｅｎｕｌａ産生Ｅ１でのマウスのワクチン接種後（図版下）の血清中に存在する抗体の終点力価を決定するためにＥＬＩＳＡ固体支持体上にコーティングした。水平方向棒は、平均抗体力価を表わす。終点力価（希釈倍数）は、Ｙ軸に表わされている。実施例２３も参照のこと。
【図５３】ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染した哺乳動物細胞によって産生されたＨＣＶ Ｅ１及びＨ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたＨＣＶ Ｅ１を直接ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。哺乳動物細胞によって産生されたＥ１に対し発生させられたマウスのモノクローナル抗体（図版下）及び哺乳動物細胞により産生されたＥ１でワクチン接種されたチンパンジー（図版上）の血清中の抗体の終点力価を決定した。チンパンジーＹｏｒａｎ及びＭａｒｔｉは予防的にワクチン接種を受けた。チンパンジーＴｏｎ、Ｐｈｉｌ、Ｍａｒｃｅｌ、Ｐｅｇｇｙ及びＦｅｍｍａは、治療的にワクチン接種を受けた。黒色棒線：哺乳動物細胞により産生されたＥ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート。白色棒線：Ｈａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート。終点力価（希釈倍数）はＹ軸に示されている。実施例２４も参照のこと。
【図５４】組換え型ワクチンウイルスに感染した哺乳動物細胞によって産生されたＥ１及びＨａｎｓｅｎｕｌａによって産生されたＥ１−Ｈ６タンパク質から遊離されたオリゴ糖の蛍光体援用炭水化物ゲル電気流動法。 レーン１：単糖類の数（３〜１０、Ｇ３〜Ｇ１０により表示）が左に示されているグルコースラダー標準。 レーン２：哺乳動物細胞によって産生された（アルキル化された）Ｅ１から遊離された２５μｇのＮ結合したオリゴ糖。 レーン３：Ｈａｎｓｅｎｕｌａによって産生された（アルキル化された）Ｅ１−Ｈ６から遊離された２５μｇのＮ結合したオリゴ糖。 レーン４：１００ｐｍｏｌｅｓのマルトテトラオース。 図２５も参照のこと。
【図５５】この図は、基準オリゴマンノースＭａｎ−９（図５５、Ａ）、Ｍａｎ−８（図５５、Ｂ）、Ｍａｎ−７（図５５、Ｃ）、Ｍａｎ−６（図５５、Ｄ）、及びＭａｎ−５（図５５、Ｅ）の単純化された構造を示す。「Ｍａｎ」＝マンノース；「ＧｌｃＮＡｃ」＝Ｎ−アセチルグルコサミン；「α」＝２つのマンノースの間のα−結合；「β」＝２つのマンノース間のβ−結合；「（１−３）」、「（１−４）」及び「（１−６）」＝それぞれ２つのマンノース間の（１−３）、（１−４）及び（１−６）結合。図５５、Ｂ及び５５、Ｃ内のカッコは、カッコの左側にそれぞれ２つ及び１つのマンノース残基（単複）が、そのカッコから右に３個の残基のうちのそれぞれ２つ及び１つにα（１−２）結合の形でカップリングされていることを表わしている。実施例２６も参照のこと。
【図５６】この図は、キトビオースにカップリングされた１０個のマンノース部分から成るより高いオリゴマンノースを示している。各々の末端マンノース残基は、非末端マンノース残基に対するα１−３結合によって結合されている。細い上向き矢印は、α１−２マンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わししており（このオリゴマンノースについては無し）、太い上向き又は左向き矢印は、α１−２結合されたマンノースの除去後αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合（このオリゴマンノースには該当せず）を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。実施例２６も参照のこと。
【図５７】この図は、キトビオースにカップリングされた１０個のマンノース部分から成るより高いオリゴマンノースを示している。このオリゴマンノースでは、１つの末端マンノース残基が、非末端マンノース残基に対するα１−２結合によって結合されている。細い上向き矢印は、α１−２マンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わしており、太い上向き又は左向き矢印は、α１−２結合されたマンノースの除去後αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。実施例２６も参照のこと。
【図５８】この図は、キトビオースにカップリングされた９個のマンノース部分から成るより高い基準オリゴマンノースＭａｎ−９を示している。このオリゴマンノースの中では、全ての末端マンノース残基は、非末端マンノース残基に対するα１−２結合によって結合されている。細い上向き矢印は、α１−２マンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わしており、太い上向き矢印は、α１−２結合されたマンノースの除去後αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。実施例２６も参照のこと。
【図５９】この図は、キトビオースにカップリングされた８個のマンノース部分から成るより高いオリゴマンノースＭａｎ−８を示している。このオリゴマンノースの中では、全ての末端マンノース残基は、この構造にをα１−２マンノシダーゼによる開裂に対する完全な耐性を持つものにする非末端マンノースに対する１つのα１−３又は１つのα１−６結合によって結合されている。太い上向き矢印は、αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。例えば、実施例２６を参照のこと。
【図６０】この図は、キトビオースにカップリングされた７個のマンノース部分から成るより高いオリゴマンノースＭａｎ−７を示している。このオリゴマンノース中では、全ての末端マンノース残基は、構造をα１−２マンノシダーゼによる開裂に対する完全な耐性を持つものにする非末端マンノース残基に対するα１−３結合によって結合されている。太い上向き矢印は、αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合（このオリゴマンノースには該当せず）を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。実施例２６も参照のこと。
【図６１】この図は、キトビオースにカップリングされた９個のマンノース部分から成るより高いオリゴマンノースを示している。このオリゴマンノースの中では、１つの末端マンノース残基が、非末端マンノース残基に対するα１−２結合によって結合されている。細い上向き矢印は、α１−２マンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わしており、太い上向き又は左向き矢印は、α１−２結合されたマンノースの除去後αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。実施例２６も参照のこと。
【図６２】この図は、キトビオースにカップリングされた８個のマンノース部分及び１個又は２個のグルコース部分から成る推定上のグルコース含有オリゴ糖を示している。このオリゴ糖の中では、カッコの左側の（Ｇｌｃ）Ｇｌｃによって示されている通り、Ａ−又はＢ分岐（図中の「Ａ→」及び「Ｂ→」）の末端α１−２結合されたマンノース残基のいずれか１つが、１個又は２個のグルコース残基を担持している。細い上向き矢印は、末端マンノース残基にグルコースが全く結合されていないことを前提として、α１−２マンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わしている。太い上向き又は左向き矢印は、α１−２結合されたマンノースの除去後αマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わし、白抜きの下向き矢印は、α−結合されたマンノースの除去後のβマンノシダーゼによる開裂を受けやすいオリゴ糖結合を表わす。考えられる反応生成物の概要は、実施例２６の表１０に示されている。
【図６３】エキソグリコシダーゼを伴う又は伴わない一晩のインキュベーション後のＭａｎ−９の反応生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉｎａｃｅ ＨＰＬＣステーションにカップリングされたＴＳＫゲル−Ａｍｉｄｅ−８０（０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）カラム上で分離した。オリゴ糖の分離を、１．０ｍＬ／分で周囲温度で実施した。溶剤Ａは、アセトニトリル中の０．１％の酢酸から成り、溶剤Ｂは、水中の０．２％の酢酸−０．２％のトリエチルアミンから成っていた。２−ＡＢで標識づけされたオリゴ糖の分離を２８％のＢを用いて実施し、５カラム体積までは定組成とし、その後１５カラム体積全体にわたり４５％Ｂとなるまで線形に増加させた。溶出溶剤の組成は右側Ｙ軸上に、溶剤Ａ中の溶剤Ｂの％（ｖ／ｖ）として示されている。溶出時間はＸ軸上に分単位で示されている。左側Ｙ軸は、溶出している２−アミノゼンズアミド（２−ＡＢ）標識づけされたオリゴ糖の蛍光度を示している。２−ＡＢの励起波長は３３０ｎｍで、発出波長は４２０ｎｍである。クロマトグラムのトレース１（“１”）はエキソグリコシダーゼを伴わずに一晩インキュベートされたＭａｎ−９の溶出を示している。トレース２（“２”）は、α１−２マンノシダーゼでＭａｎ−９を一晩インキュベートした後のＭａｎ−５及びＭａｎ−６の混合物の溶出を示している。トレース３及び４（“３”及び“４”）は、α−マンノシダーゼでのＭａｎ−９の、それぞれ１時間及び一晩のインキュベーション後の４’−β−マンノシルキトビオースの溶出を示している。トレース５（“５”）は、α−及び−βマンノシダーゼでＭａｎ−９を一晩インキュベートした後のキトビオースの溶出を示している。トレース１〜５は、オーバーレイとして表されており、そのために、それぞれの基線は全てゼロレベルにはない。トレース６（“６”）は、適用された溶剤勾配を示している。図の上部にＡ〜Ｋの文字で示されているピークは、それが存在する場合、以下のものを表す：Ａ、キトビオース；Ｂ、４’−β−マンノシル−キトビオース；Ｃ、Ｍａｎ−２；Ｄ、Ｍａｎ−３；Ｅ、Ｍａｎ−４；Ｆ、Ｍａｎ−５；Ｇ、Ｍａｎ−６；Ｈ、Ｍａｎ−７；Ｉ、Ｍａｎ−７；Ｊ、Ｍａｎ−８；及びＫ、Ｍａｎ−１０。実施例２６も参照のこと。
【図６４】のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の反応生成物を、エキソグリコシダーゼを伴う又は伴わない一晩のインキュベーション後Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉｎａｃｅ ＨＰＬＣステーションにカップリングされたＴＳＫゲル−Ａｍｉｄｅ−８０（０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）カラム上で分離した。オリゴ糖の分離を、１．０ｍＬ／分で周囲温度で実施した。溶剤Ａは、アセトニトリル中の０．１％の酢酸から成り、溶剤Ｂは、水中の０．２％の酢酸−０．２％のトリエチルアミンから成っていた。２−ＡＢで標識づけされたオリゴ糖の分離を２８％のＢを用いて実施し、５カラム体積までは定組成とし、その後１５カラム体積全体にわたり４５％Ｂとなるまで線形に増加させた。溶出溶剤の組成は右側Ｙ軸上に、溶剤Ａ中の溶剤Ｂの％（ｖ／ｖ）として示されている。溶出時間はＸ軸上に分単位で示されている。左側Ｙ軸は、溶出している２−アミノゼンズアミド（２−ＡＢ）標識づけされたオリゴ糖の蛍光度を示している。２−ＡＢの励起波長は３３０ｎｍで、発出波長は４２０ｎｍである。クロマトグラムのトレース１（“１”）はエキソグリコシダーゼを伴わずに一晩インキュベートされたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース２（“２”）は、α１−２マンノシダーゼでＭａｎ−９を一晩インキュベーション後のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース３及び４（“３”及び“４”）は、α−マンノシダーゼでの、それぞれ１時間及び一晩のインキュベーション後のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ生成Ｅ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース５（“５”）は、α−及びβ−マンノシダーゼでの一晩のインキュベート後のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース１〜５は、オーバーレイとして表されており、そのために、それぞれの基線は全てゼロレベルにはない。トレース６（“６”）は、適用された溶剤勾配を示している。図の上部にＡ〜Ｋの文字で示されているピークは、それが存在する場合、以下のものを表す：Ａ、キトビオース；Ｂ、４’―β−マンノシル−キトビオース；Ｃ、Ｍａｎ−２；Ｄ、Ｍａｎ−３；Ｅ、Ｍａｎ−４；Ｆ、Ｍａｎ−５；Ｇ、Ｍａｎ−６；Ｈ、Ｍａｎ−７；Ｉ、Ｍａｎ−７；Ｊ、Ｍａｎ−８；及びＫ、Ｍａｎ−１０。実施例２６も参照のこと。
【図６５】エキソグリコシダーゼを伴う又は伴わない一晩のインキュベーション後のワクシニアトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞内で産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の反応生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉｎａｃｅ ＨＰＬＣステーションにカップリングされたＴＳＫゲル−Ａｍｉｄｅ−８０（０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）カラム上で分離した。オリゴ糖の分離を、１．０ｍＬ／分で周囲温度で実施した。溶剤Ａは、アセトニトリル中の０．１％の酢酸から成り、溶剤Ｂは、水中の０．２％の酢酸−０．２％のトリエチルアミンから成っていた。２−ＡＢで標識づけされたオリゴ糖の分離を２８％のＢを用いて実施し、５カラム体積までは定組成とし、その後１５カラム体積全体にわたり４５％Ｂとなるまで線形に増加させた。溶出溶剤の組成は右側Ｙ軸上に、溶剤Ａ中の溶剤Ｂの％（ｖ／ｖ）として示されている。溶出時間はＸ軸上に分単位で示されている。左側Ｙ軸は、溶出２−アミノゼンズアミド（２−ＡＢ）標識づけされたオリゴ糖の蛍光度を示している。２−ＡＢの励起波長は３３０ｎｍで、発出波長は４２０ｎｍである。クロマトグラムのトレース１（“１”）はエキソグリコシダーゼを伴わずに一晩インキュベートされたワクシニアトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞内で産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース２（“２”）は、α１−２マンノシダーゼでＭａｎ−９を一晩インキュベートした後のワクシニアトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞内で生成されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース３及び４（“３”及び“４”）は、α−マンノシダーゼでの、それぞれ１時間及び一晩のインキュベーション後のワクシニアトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞内で産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース５（“５”）は、α−及びβ−マンノシダーゼでの一晩のインキュベート後のワクシニアトランスフェクションを受けた哺乳動物細胞で産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース１〜５は、オーバーレイとして表されており、そのために、それぞれの基線は全てゼロレベルにはない。トレース６（“６”）は、適用された溶剤勾配を示している。 図の上部にＡ〜Ｋの文字で示されているピークは、それが存在する場合、以下のものを表す：Ａ、キトビオース；Ｂ、４’−β−マンノシル−キトビオース；Ｃ、Ｍａｎ−２；Ｄ、Ｍａｎ−３；Ｅ、Ｍａｎ−４；Ｆ、Ｍａｎ−５；Ｇ、Ｍａｎ−６；Ｈ、Ｍａｎ−７；Ｉ、Ｍａｎ−７；Ｊ、Ｍａｎ−８；及びＫ、Ｍａｎ−１０。実施例２６も参照のこと。
【図６６】エキソグリコシダーゼを伴う又は伴わない一晩のインキュベーション後のＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の反応生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉｎａｃｅ ＨＰＬＣステーションにカップリングされたＴＳＫゲル−Ａｍｉｄｅ−８０（０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）カラム上で分離した。オリゴ糖の分離を、１．０ｍＬ／分で周囲温度で実施した。溶剤Ａは、アセトニトリル中の０．１％の酢酸から成り、溶剤Ｂは、水中の０．２％の酢酸−０．２％のトリエチルアミンから成っていた。２−ＡＢで標識づけされたオリゴ糖の分離を２８％のＢを用いて実施し、５カラム体積までは定組成とし、その後１５カラム体積全体にわたり４５％Ｂとなるまで線形に増加させた。溶出溶剤の組成は右側Ｙ軸上に、溶剤Ａ中の溶剤Ｂの％（ｖ／ｖ）として示されている。溶出時間はＸ軸上に分単位で示されている。左側Ｙ軸は、溶出している２−アミノゼンズアミド（２−ＡＢ）標識づけされたオリゴ糖の蛍光度を示している。２−ＡＢの励起波長は３３０ｎｍで、発出波長は４２０ｎｍである。クロマトグラムのトレース１（“１”）はエキソグリコシダーゼを伴わずに一晩インキュベートされたＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース２（“２”）は、α１−２マンノシダーゼでＭａｎ−９を一晩インキュベートした後のＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース３及び４（“３”及び“４”）は、α−マンノシダーゼで一晩インキュベーションした後のＨａｎｓｅｎｕｌａ生成Ｅ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース５（“５”）は、α−及びβ−マンノシダーゼでの一晩のインキュベーションの後のＨａｎｓｅｎｕｌａにより産生されたＥ１ｓから誘導されたオリゴ糖の溶出を示している。トレース１〜５は、オーバーレイとして表されており、そのために、それぞれの基線は全てゼロレベルにはない。トレース６（“６”）は、適用された溶剤勾配を示している。図の上部にＡ〜Ｋの文字で示されているピークは、それが存在する場合、以下のものを表す：Ａ、キトビオース；Ｂ、４’−β−マンノシル−キトビオース；Ｃ、Ｍａｎ−２；Ｄ、Ｍａｎ−３；Ｅ、Ｍａｎ−４；Ｆ、Ｍａｎ−５；Ｇ、Ｍａｎ−６；Ｈ、Ｍａｎ−７；Ｉ、Ｍａｎ−７；Ｊ、Ｍａｎ−８；及びＫ、Ｍａｎ−１０を表している。実施例２６も参照のこと。
【図６７】Ｈａｎｓｅｎｕｌａ及びＨＣＶ−組換え型ワクシニアウイルス感染を受けた哺乳動物細胞により産生されたＥ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びクーマシーブリリアントブルー染色。レーン１：左側に示された分子量をもつ分子量マーカー；レーン２：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによって産生されたアルキル化されたＥ１ｓ（１０μｇ）；レーン３：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたアルキル化されたＥ１（５μｇ）；レーン４：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｌｙｍｏｒｐｈａにより産生されたアルキル化されたＥ１（２．５μｇ）；レーン５：ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルス感染されたベロ細胞によって産生されたアルキル化されたＥ１（１０μｇ）；レーン６：ＨＣＶ組換え型ワクシニアウイルスに感染したベロ細胞により産生されたアルキル化されたＥ１（５μｇ）；レーン７：ＨＣＶ−組換え型ワクシニアウイルスに感染したベロ細胞により産生されたアルキル化されたＥ１（２．５μｇ）。実施例２７も同様に参照のこと。
【図６８】脱グリコシル化したタンパク質のトリプシン消化フラグメント（ボックス配列）の表示を伴う、ＨＣＶＥ２−Ｈ６タンパク質の配列（配列番号５）。グリコシル化されたＡｓｎ−残基は、ＰＮＧアーゼＦ酵素によりＡｓｐ−残基に変換され、配列の下の^「＊」により表わされている。Ａｓｎ−残基は、Ａｓｐ−Ｎエンドプロティナーゼによりタンパク質分解開裂を受けやすい。Ｅ２−Ｈ６（配列５）中の考えられるＮ−グリコシル化部位は、ＨＣＶポリプロテイン内の番号付けに従ってＮ_４１７、Ｎ_４２３、Ｎ_４３０、Ｎ_４４８、Ｎ_４７８、Ｎ_５３２、Ｎ_５４０、Ｎ_５５６、Ｎ_５７６、Ｎ_６２３及びＮ_６４５である；これらの部位は、この囲みの中でＮ_３４、Ｎ_４０、Ｎ_４７、Ｎ_６５、Ｎ_９５、Ｎ_１４９、Ｎ_１５７、Ｎ_１７３、Ｎ_１９３、Ｎ_２４０及びＮ_２６２と番号付けされている。実施例２８も参照のこと。

Claims (33)

1. 少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含み、真核細胞の発現産物であり、さらにはＮ−グリコシル化された部位の８０％までがコアグリコシル化されていることを特徴とする、単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
2. 前記コアグリコシル化された部位の７０％よりも多くが８〜１０個のマンノースを含むオリゴマンノースでグリコシル化されている、請求項１に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
3. Ｍａｎ（８）−ＧｌｃＮＡｃ（２）で定義される構造をもつオリゴマンノースによりコアグリコシル化された部位に対するＭａｎ（７）−ＧｌｃＮＡｃ（２）で定義される構造をもつオリゴマンノースによりコアグリコシル化された部位の比が、０．４５以下である、請求項１または２に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
4. 前記オリゴマンノースが１０％未満の末端α１，３マンノースを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
5. 酵母細胞内の発現産物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分。
6. 前記酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ細胞である、請求項５に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分。
7. 前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントに結合された鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的変異体を含むタンパク質から誘導される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分。
8. ＣＬ−［（Ａ１）_ａ−（ＰＳ１）_ｂ−（Ａ２）_ｃ］−ＨＣＶＥＮＶ−［（Ａ３）_ｄ−（ＰＳ２）_ｅ−（Ａ４）_ｆ］
   という構造を特徴とするタンパク質から誘導され、式中：
   ＣＬは、鳥類リゾチームリーダーペプチド又はその機能的等価物であり、
   Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、異なるもの又は同じものでありうるアダプタペプチドであり、
   ＰＳ１及びＰＳ２は、異なるもの又は同じものでありうるプロセッシング部位であり、
   ＨＣＶＥＮＶは、ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分であり、
   ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは０又は１であり、
   ここで、Ａ１及び／又はＡ２はＰＳ１の一部分であってもよく、かつ／又はＡ３及び／又はＡ４はＰＳ２の一部分であってもよい、
   請求項７に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分。
9. 前記鳥類リゾチームリーダーペプチドＣＬが配列番号１により定義されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
10. Ａが配列番号６３−６５、７０−７２及び７４−８２から選択されるアミノ酸配列を有し、ＰＳが配列番号６６−６８及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を有するか、又はＰＳがＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ｌｙｓのごとき二塩基部位又はＬｙｓのごとき一塩基部位であり、かつＨＣＶＥＮＶが配列番号８５−９８及びそのフラグメントから選択される、請求項８の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
11. 単量体、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモオリゴマー及びヘテロオリゴマーからなるグループの中から選択される構造の中に含まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
12. ウイルス様粒子内に含まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
13. システインのチオール基が化学的に修飾されている請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
14. 抗原性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
15. 免疫原性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
16. Ｔ細胞エピトープを含んで成る、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメント。
17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを含んで成る組成物。
18. 薬学的に受容可能な担体をさらに含み、薬剤である、請求項１７に記載の組成物。
19. 薬学的に受容可能な担体をさらに含み、ワクチンである、請求項１７に記載の組成物。
20. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたＨＣＶエンベロープタンパク質又はそのフラグメントを産生するための方法。
21. 抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
    （ｉ）前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分と前記抗−ＨＣＶ抗体の複合体化を可能にする条件下で前記試料と請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を接触させる段階；
    （ｉｉ）（ｉ）で形成された複合体を検出する段階；及び
    （ｉｉｉ）前記試料中の前記抗−ＨＣＶ抗体の存在を（ｉｉ）から推論する段階、
    を含んで成る方法。
22. 段階（ｉ）での前記接触が競合的条件で起こる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が固体支持体に結合させられている、請求項２１に記載の方法。
24. 抗−ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている試料中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出するための診断用キットであって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含んで成るキット。
25. 前記ＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分が固体支持体に結合させられている、請求項２４に記載の診断用キット。
26. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含む医薬。
27. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分を含むワクチン。
28. 哺乳動物体内でＨＣＶ−特異的免疫応答を誘発するための医薬組成物であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分及び任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含んで成る、医薬組成物。
29. 哺乳動物体内でＨＣＶ−特異的抗体を誘発するための医薬組成物であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分及び任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含んで成る、医薬組成物。
30. 哺乳動物体内で、Ｔ細胞機能を誘発するための医薬組成物であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＶエンベロープタンパク質又はその一部分及び任意には薬学的に受容可能なアジュバントを含んで成る、医薬組成物。
31. 予防用組成物である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
32. 治療用組成物である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
33. 前記哺乳動物が人間である、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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