JP2004035534A - Ｈｃｖ抗コア・モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）コアタンパク質に対する抗体ライブラリーを提供する。
【解決手段】ＨＣＶコア・タンパク質のさまざまの領域をエピトープとして、モノクロナール抗体のライブラリーを作成した。ＨＣＶコア抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体であり、これらの抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株、これらの抗体の作製方法、並びにこれらの抗体を含むキットの使用方法をも提供する。
【選択図】なし

Description

【０００１】
本発明の背景
世界中でおよそ１億７千万人がＣ型肝炎（ＨＣＶ）に感染している。ここ数年のうちに、ＨＣＶを原因とする肝疾患及び肝癌による米国の死亡者の数が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を原因とする死亡者を上回る可能性がある。ＨＣＶの伝染は血液と血液の接触を必要とするようである。１本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）を担持するＨＣＶは後で少なくとも１０の機能性タンパク質に分裂するポリプロテインをコードするたった１つの遺伝子を含む。明らかに、ＨＣＶについて血液供給源を試験する能力が非常に重要である。高感度アッセイは早期段階で感染を検出しうる。故に、単独のアッセイによるＨＣＶ抗原と抗体の両方の検出は有利であろう。
【０００２】
ＨＣＶコア検出アッセイは抗コア・モノクローナル抗体を用いてコートした固相上にＨＣＶ感染試料からのＨＣＶ抗原を捕捉する。この捕捉コア・タンパク質を標準的な免疫アッセイ技術を用いて酵素により標識した抗コア・モノクローナル抗体との結合反応により検出する。ＨＣＶコア抗原の多重エピトープに対する良好なモノクローナル抗体の利用可能性はＨＣＶ抗原検出アッセイの感度を高めるであろう。まず第１に、多重抗体は配列固相上への試料からのＨＣＶ抗原の捕捉効率を高める。第２に、検出への多重抗体の使用は蓄積した高いシグナルを供給することによりこの系の感度を高める。他の利点は、アッセイにおいて抗体を認識する多重エピトープの使用が異なる遺伝子型のＨＣＶウイルスに感染した試料を検出するためのアッセイを可能にすることである。
【０００３】
本発明の概要
本発明は、ＨＣＶコア・タンパク質のさまざまな領域に対するモノクローナル抗体のライブラリーを説明する。これらの抗体はＨＣＶコア領域中の１０の異なるエピトープを認識し、そしてコア・タンパク質の全体に渡って広がる。これらのモノクローナル抗体により認識されるエピトープは５〜８のアミノ酸（「ａａ」）長である。個別のペア又は多重のペアの状態のこれらの抗体はＨＣＶに感染した患者におけるＨＣＶコア・タンパク質の検出に有用である。特に、これらの抗体は感染したヒトからの血中ＨＣＶの検出に有益である。最後に、これらの抗体を適当に目的にかなった組み換えタンパク質と一緒にＨＣＶコア・タンパク質と抗ＨＣＶ抗体の同時検出に使用しうる。
【０００４】
我々は多くの抗ＨＣＶコア・モノクローナル抗体を開発した。これらの抗体は、それらがヒト抗ＨＣＶ抗体により認識される主なエピトープを持たないＨＣＶコア領域中の短かい配列を認識するという珍しい特徴を有する。これらの抗体はＨＣＶに感染した個体からの血液試料中のＨＣＶコア抗原の検出に用いる試薬に有用でありうる。これらのモノクローナル抗体による短かいエピトープの認識及びＨＣＶコア領域中のこれらの配列の配置がこれらのモノクローナル抗体をＨＣＶ抗原／抗体組み合わせアッセイ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）の開発に非常に有用なものにする。組み合わせアッセイのために、これらのモノクローナル抗体をコア抗原と組み合わせて用いるが、ここで、上記抗原はこれらのモノクローナル抗体に結合するためのこれらの抗原の能力をなくし、しかしヒト抗ＨＣＶ抗体に結合する能を維持するように修飾されている。故に、感染血清中に存在する抗体を捕捉するために使用される前記ＨＣＶコア・タンパク質は、上記感染血清中に存在する抗原を同時に捕捉するための試験に使用される前記ＨＣＶコア・モノクローナル抗体と反応しない。組み合わせアッセイは、これまで利用されてきたＨＣＶ抗体アッセイよりも早期にＨＣＶ感染を検出することができる。
【０００５】
本発明の詳細な説明
本発明の有効性及び利点を以下の実施例によりさらに説明する。
【０００６】
実施例１
免疫原
前記抗体の調達のために使用した免疫原は完全長のコア組み換えタンパク質（「ＦＬＣ」）（アミノ酸（ａａ）１〜１９１）；ＳＯＤ融合タンパク質として酵母を用いて発現させたＨＣＶコア・タンパク質（ａａ１〜１２０）、ｃ２２−３；及び巨大合成ペプチド、例えばＯＤＳ２４３（ａａ７０〜１１０）；並びにＨＣＶコア抗原からの配列を含む１５ｍｅｒのペプチドを結合したキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）であった。
【０００７】
実施例２
免疫感作プロトコール
前記抗体を標準的な手順を用いて製造した。例えば、Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　１９８８，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　６を参照のこと。マウスを本明細書中に記載の免疫原により免疫感作した。このマウスを飼育し、そして多数の、ＨＣＶコア配列からの組み換えタンパク質及びペプチドを用いて選別した。純粋なモノクローナル抗体をプロテインＡアフィニティー・クロマトグラフィーにより調製した。このモノクローナル抗体の優れた特異性を、対応の１５ｍｅｒのペプチドのそれぞれが含まれた重複オクタペプチドの結合により確認した。大部分の抗体をＨＣＶコア・タンパク質配列内の６〜８のアミノ酸領域にマッピングした。
【０００８】
実施例３
前記抗体の特徴づけ
前記モノクローナル抗体を約１５ａａ長の重複合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡにより特徴づけした。前記抗体を、応答性の１５ｍｅｒのペプチドに含まれる重複オクタペプチドを用いたペプチドＥＬＩＳＡによりそれらの優れた特異性についてさらなる特徴づけを行った。製造した抗体の概要を以下の表に収録する。
【０００９】
表１
以下の表は１５の新規抗体を同定する。前記抗体を免疫原によりコートしたマイクロタイターウェル・プレートを用いて抗体開発の各段階で選別した。モノクローナル抗体のそれぞれの系統を産生したマウスの免疫感作に使用した免疫原は、以下のものの内の１つと同定される：ペプチドＯＤＳ２４３、さらに実施例１において定義される巨大ペプチド；「ＦＬＣ」は完全長コア抗原を意味し、実施例１において定義される；又はＫＬＨ結合コアペプチド番号８、さらに本明細書中で定義される短かいペプチド。番号付きペプチドに対するそれぞれの特異性を示し、そして各番号付きペプチドのアミノ酸配列を本明細書中で同定する。さらに、前記抗体が特異的に結合するエピトープを最後の列に収録し、そのエピトープをコードするアミノ酸配列により定義する。
【００１０】
【表１】

【００１１】
表２
以下の表はＨＣＶコア合成ペプチドを示す。
【００１２】
【表２】

【００１３】
表３
以下の表は、ＨＣＶコア・ペプチドによりコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いたＰＴＡ−３８１１と同定された抗体の選別を示す。
【００１４】
【表３】

【００１５】
表４
重複オクタペプチドを用いたモノクローナル抗体ＰＴＡ−３８１１のエピトープ・マッピング。
【００１６】
【表４】

【００１７】
化学発光ＥＬＩＳＡによりオクタペプチド８．２，８．３，８．４，８．５と反応したモノクローナル抗体７Ｂ４Ｆ１１を任意の光学単位（ＡＬＵ）として計測した。前記オクタペプチドの応答性に基づき、前記モノクローナル・エピトープは配列ＰＷＰＬの辺りを中心としている。
【００１８】
前記実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲及び本質を制限しない。本発明の範囲及び意図から逸脱することのない多くの変更及び修飾が本発明中で行われうることは理解される。
【００１９】
例えば、本明細書中に開示した全てのモノクローナル抗体を、ＨＣＶコア抗原アッセイ又はＨＣＶ抗体／抗原組み合わせアッセイにおいてＨＣＶコア抗原検出のための捕捉試薬又は検出試薬として別個に又は組み合わせ物として使用しうることは当業者により理解されるであろう。
【００２０】
【配列表】

Claims (4)

1. 以下の：
   ＰＴＡ−３７９９，ＰＴＡ−３８００，ＰＴＡ−３８０１，ＰＴＡ−３８０２，ＰＴＡ−３８０３，ＰＴＡ−３８０４，ＰＴＡ−３８０５，ＰＴＡ−３８０６，ＰＴＡ−３８０７，ＰＴＡ−３８０８，ＰＴＡ−３８０９，ＰＴＡ−３８１０，ＰＴＡ−３８１１，ＰＴＡ−３８１２、及びＰＴＡ−３８１３、
   から成る群から選ばれるＡＴＣＣ番号に対応するハイブリドーマ細胞株。
2. 請求項１に記載のハイブリドーマ細胞株のいずれか１つにより分泌されるモノクローナル抗体。
3. ＨＣＶコア抗原を検出するための請求項２に記載のモノクローナル抗体の使用。
4. １以上の、請求項２に記載のモノクローナル抗体を含むアッセイ・キット。