【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用酵素として有用な変異アルカリプロテアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。中でも最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（ノボザイム）、マクサカル（ジェネンコ）、ブラップ（ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着した蛋白質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することであるが、実際の汚れは蛋白質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、蛋白質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。そして、これらのアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（Ｓａｅｋｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７９，（２０００），３１３−３１９）。
【０００５】
上記アルカリプロテアーゼは高濃度の脂肪酸存在下でも十分なカゼイン分解活性を保持し、蛋白質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有するプロテアーゼではあるが、更なる洗浄性の向上を考えると、当該アルカリプロテアーゼの性質を保持し、更に強力な蛋白質分解力をもつアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００６】
一方、一般に蛋白質分解力を向上させる方法としては、プロテアーゼ遺伝子を改変しプロテアーゼの蛋白質量当たりの分解活性、すなわち比活性を向上させる方法があり、ズブチリシンの比活性向上に対するタンパク質工学的改変に関しても詳細に報告されている（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，（１９８７），１２１９−１２２３、Ｗｅｌｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，（１９８７），５１６７−５１７１、Ｔａｇｕｃｈｉら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，（１９９８），４９２−４９５、Ｔａｋａｇｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１１，（１９９８），１２０５−１２１０、Ｂｒｙａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５４３，（２０００），２０３−２２２等）。しかしながら、これまでに報告されている改変は、ある特定の合成ペプチドに対する比活性は向上させるものの、洗浄力に結びつくと考えられる天然基質に対する活性を向上させるものではなかった。
【０００７】
他方、天然基質に対する比活性向上に関しては、例えばズブチリシンＥの３１位のイソロイシンをロイシンに置換することにより、カゼイン基質に対する分解活性の向上が得られるとする報告があるが（Ｔａｋａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，（１９８８），１９５９２−１９５９６）、上記アルカリプロテアーゼにおける当該アミノ酸は元来ロイシンであること、また上記アルカリプロテアーゼ群は分子量約２８，０００のズブチリシンとは酵素学的性質が異なることから、当該プロテアーゼの比活性向上にはこの事例も参考になるものではなかった。
【０００８】
本発明は、より強力な蛋白質分解力をもち、優れた洗浄能力を発揮するアルカリプロテアーゼを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記アルカリプロテアーゼの変異体について種々検討した結果、当該アルカリプロテアーゼにおいて、そのアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、天然基質に対して優れた比活性を有し、洗浄用酵素として有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼについて、配列番号１の（ａ）１６３位、（ｂ）１７０位若しくは（ｃ）１７１位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の変異アルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼを変異の対象となるプロテアーゼ（以下、「親アルカリプロテアーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の（ａ）１６３位、（ｂ）１７０位若しくは（ｃ）１７１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１３】
親アルカリプロテアーゼである「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する高アルカリプロテアーゼ」としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＫＰ４３［バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８］が挙げられる。
【００１４】
親アルカリプロテアーゼである配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアルカリプロテアーゼとしては、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に９５％以上の相同性を有するものが好ましく、野生型又は野生型の変異体であってもよい。
また、その性質として酸化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であるものが好ましく、特に酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５０℃においてもｐＨ１０で１０分間処理した時、８０％以上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であるものが好ましい。
ここで、酸化剤耐性を有するとは、５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中、ｐＨ１０（２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液）で３０℃、２０分間処理した場合の残存活性が少なくとも５０％以上保持していることをいう。
【００１５】
斯かる配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアルカリプロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼＫＰ９８６０［バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０３］、プロテアーゼＫＰ９８６５［バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）由来、特願２００２−００２６５３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０８４１５５］、プロテアーゼＥ−１［バチルスＮｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭＰ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０２］、プロテアーゼＹａ［バチルスエスピーＹ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０４］、プロテアーゼＳＤ５２１［バチルスＳＤ５２１（ＦＥＲＭＰ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０５］、プロテアーゼＡ−１［ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０６］、プロテアーゼＡ−２［ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７］や、配列番号１のアミノ酸配列の４６位をロイシンに置換した変異体、５７位をアラニンに置換した変異体、１０３位をアルギニンに置換した変異体、１０７位をリジンに置換した変異体、１２４位をそれぞれリジン及びアラニンに置換した変異体、１３６位をアラニンに置換した変異体、１９３位をアラニンに置換した変異体、１９５位をそれぞれアスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、プロリン、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン及びフェニルアラニンに置換した変異体、２４７位をそれぞれスレオニン及びアルギニンに置換した変異体、２５７位をバリンに置換した変異体、３４２位をアラニンに置換した変異体、６６位をアスパラギン酸に置換し且つ２６４位をセリンに置換した二重変異体（特願２０００−３５５１６６号）、配列番号１のアミノ酸配列の８４位をアルギニンに置換した変異体、１０４位をプロリンに置換した変異体、２５６位をそれぞれアラニン及びセリンに置換した変異体、３６９位をアスパラギンに置換した変異体（特願２００１−１１４０４８号）、配列番号１のアミノ酸配列の２５１位をそれぞれアスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン及びグルタミンに置換した変異体、２５６位をそれぞれセリン、グルタミン、アスパラギン、バリン及びアラニンに置換した変異体（特願２００１−３２９４７２号）又はこれらとアミノ酸配列において８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性は、例えば公知のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等を用いて計算することができる。
【００１６】
上記配列番号１で示される親アルカリプロテアーゼの（ａ）〜（ｃ）位におけるアミノ酸残基は、（ａ）位がグルタミン酸、（ｂ）位がイソロイシン、（ｃ）位がセリンであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する親アルカリプロテアーゼにおいては、後述するように、（ａ）位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であるのが好ましく、（ｂ）位に相当する位置のアミノ酸残基はイソロイシンであるのが好ましく、（ｃ）位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンであるのが好ましい。
【００１７】
従って、親アルカリプロテアーゼの中で好ましいものとしては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼの他、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有し、上述した酵素学的性質を有するもの（段落〔００１４〕）及び／又は配列番号１の（ａ）〜（ｃ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１６〕）のものであるプロテアーゼが挙げられる。
【００１８】
そして、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼを親アルカリプロテアーゼとする場合には、当該（ａ）１６３位、（ｂ）１７０位若しくは（ｃ）１７１位のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するプロテアーゼを親アルカリプロテアーゼとする場合には、配列番号１の（ａ）〜（ｃ）位に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものである。
【００１９】
斯かる他のアミノ酸残基としては、（ａ）位置：ヒスチジン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン、セリン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、スレオニン、バリン、（ｂ）位置：バリン、ロイシン、（ｃ）位置：アラニン、グルタミン酸、グリシン、スレオニン、から選ばれたものである。
【００２０】
「相当するアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えば、公知のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等を用いてアミノ酸配列の比較をすることで、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることができる。従って、このようなアルゴリズムを用いアミノ酸配列を整列させることでアミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相当するアミノ酸を特定することができる。
【００２１】
すなわち、上記方法でアミノ酸配列を整列させた図１より、（ａ）配列番号１の１６３位のアミノ酸残基はグルタミン酸残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１６２位のグルタミン酸残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基はヒスチジン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン、セリン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、スレオニン、バリンであるのが好ましく、特にスレオニン、バリンであるのが好ましい。
【００２２】
（ｂ）配列番号１の１７０位のアミノ酸残基はイソロイシン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１６９位のイソロイシン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基はバリン、ロイシン残基であるのが好ましい。
【００２３】
（ｃ）配列番号１の１７１位のアミノ酸残基はセリン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えばプロテアーゼＥ−１においては１７０位のセリン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、アラニン、グルタミン酸、グリシン、スレオニン残基であるのが好ましく、特にグリシン、スレオニン残基であるのが好ましい。
【００２４】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号１）の（ａ）１６３位、（ｂ）１７０位（ｃ）１７１位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するプロテアーゼのうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
【００２５】
【表１】
【００２６】
また、本発明変異アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の（ａ）〜（ｃ）の選択は、酵素特性が変化しない限り２個所が同時になされていていもよい。２箇所が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、アミノ酸は３文字表記とし、「＋」は１箇所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
【００２７】
２重置換体の例としてはＧｌｕ１６３（Ｐｈｅ／Ｌｅｕ／Ｇｌｎ／Ｖａｌ）＋Ｓｅｒ１７１Ａｌａ、Ｇｌｕ１６３（Ａｌａ／Ａｓｐ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｖａｌ）＋Ｓｅｒ１７１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１６３（Ａｌａ／Ｈｉｓ／Ｉｌｅ／Ｌｙｓ／Ｌｅｕ／Ｇｌｎ／Ｔｈｒ／Ｖａｌ）＋Ｓｅｒ１７１Ｔｈｒ等が挙げられるが、Ｇｌｕ１６３Ｔｈｒ＋Ｓｅｒ１７１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１６３Ｔｈｒ＋Ｓｅｒ１７１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１６３Ｖａｌ＋Ｓｅｒ１７１Ｇｌｙ等が特に好ましい。
【００２８】
また、本発明の変異アルカリプロテアーゼには、上記（ａ）〜（ｃ）位又はこれに相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみならず、天然基質に対する比活性が向上するという特性以外の酵素の特性を変化させない限り、該アミノ酸配列中の他の位置において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。
【００２９】
本発明のアルカリプロテアーゼ変異体は、例えば、クローニングされた親アルカリプロテアーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ）をコードする遺伝子（配列番号２）に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用い宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物からアルカリプロテアーゼを採取することによって得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、公知の遺伝子組換え手法を用いれば良く、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行えば良い。
【００３０】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に変異を施す方法としては、一般的に行われているランダム変異法や部位特異的変異法等を用いれば良く、例えば
Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ キット（Ｔａｋａｒａ）等を用いることで、任意の遺伝子配列情報に目的とする変異を与え、結果としてアミノ酸配列に置換、欠失、挿入等の変化を付与出来る。又、リコンビナントＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００３１】
得られた変異遺伝子を用い、本発明アルカリプロテアーゼ変異体を生産するには、例えば、該変異プロテアーゼ遺伝子を安定に増幅出来るＤＮＡベクターに連結させるか、又は該変異プロテアーゼ遺伝子を安定に維持出来る染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法により、該変異プロテアーゼ遺伝子を安定に増幅し、さらに該遺伝子を効率的に発現させることが可能である宿主に導入すれば良い。該変異プロテアーゼ遺伝子を導入し、安定生産出来る宿主としては、例えば、バチルス属細菌、大腸菌、酵母、かび、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。
【００３２】
かくして得られる変異アルカリプロテアーゼは、酵素のカゼイン基質に対する比活性が親アルカリプロテアーゼに比べて向上している。すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有するという性質を有するが、特に段落〔００１４〕に記載の親アルカリプロテアーゼの諸性質を保持しているものが好ましい。
【００３３】
【実施例】
実施例１
バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０ｋｂの範囲に対しランダム変異を与えた。ランダム変異導入法としてはＰＣＲ反応中の塩基の取り込みエラーを利用するために、ＤＮＡポリメラーゼとしてエラー修復能が無いＴａｑポリメラーゼ：Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。まず、上記約２．０ｋｂのＤＮＡを増幅出来るプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いＰＣＲを行った。プライマー１はセンス鎖の５’末端側にＢａｍＨＩリンカーを、プライマー２はアンチセンス鎖の５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。反応系として、鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ添付反応バッファー１０μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕを含有する１００μＬの系とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロッシュ）にて精製し、１００μＬの滅菌水で溶出した。次に溶出液１μＬを鋳型ＤＮＡとして、２回目のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応条件は１回目と同じとした。２回目のＰＣＲ産物も１回目と同様に精製し、以後の実験に供した。
【００３４】
増幅した約２．０ｋｂのＤＮＡ断片の末端制限酵素リンカーを、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ（ロッシュ）により切断した。増幅ＤＮＡを組み込むべき発現ベクターとしてはバチルス属細菌内で複製可能であるｐＨＡ６４（特願平８−３２３０５０）を用いた。ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ処理した増幅ＤＮＡ断片及び同じくＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ処理したｐＨＡ６４を混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、リガーゼ反応を行った。エタノール沈殿により、リガーゼ反応液からＤＮＡを回収し、以後の形質転換用のＤＮＡとした。
【００３５】
形質転換すべき宿主としてバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（以後ＫＰ−４３株と略す）を用いた。形質転換法はエレクトロポレーション法により行い、ＳＳＨ−１０（島津製作所）及びジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用い形質転換を行った。
【００３６】
ＫＰ−４３株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地［スキムミルク（ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン（ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％、無水炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ］に生育させ、ハローの形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。
【００３７】
プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換されたＫＰ−４３株を選抜し、以後の培養に供した。
【００３８】
各形質転換体について単集落分離、ハロー形成の確認を行い、試験管中の５ｍＬ種母培地［ポリペプトンＳ（日本製薬）６．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％、マルトース１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、リン酸２水素カリウム０．１％、無水炭酸ナトリウム０．３％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に植菌し、３０℃、３２０ｒｐｍで一晩前培養した。この種母培養液を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の２０ｍＬ主培地［ポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に１％植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、１２１ｒｐｍで３日間培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼインを基質とした活性測定法により、蛋白質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。野生型酵素遺伝子を有する形質転換体を同条件で培養した場合の培養上清の値と比較することにより、プロテアーゼ活性の向上が認められた変異プロテアーゼ遺伝子を選抜した。尚、培養上清中のプロテアーゼ活性の増加に対して、蛋白質量の顕著な増加は認められなかったことから、得られた変異体は蛋白質量当たりのカゼイン分解活性が向上するのに必要な変異が導入されたことが示唆された。
【００３９】
選抜された形質転換体からＨｉｇｈ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロッシュ）を用いプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。プラスミドＤＮＡ３００ｎｇを鋳型として、プライマーとＢｉｇ Ｄｙｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いて２０μＬの反応系でＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７７型（アプライドバイオシステム）を用いた解析に供した。
その結果、プロテアーゼ活性が向上した変異体は１６３位のグルタミン酸がヒスチジン、１７０位のイソロイシンがバリン、１７１位のセリンがアラニンにそれぞれ置換されていた。
【００４０】
培養液の一部を希釈し、２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）カラムにかけ、非吸着画分を回収することにより、ほぼ均一なプロテアーゼを得た。この精製酵素の蛋白質量、カゼイン分解活性を測定し、その比活性を計算した結果、上記変異の導入によりそれぞれ約１５〜２０％のプロテアーゼ比活性の向上が認められた（表２）。
【００４１】
更に上記変異部位を任意のアミノ酸に置換することにより、プロテアーゼ活性の向上を検討した。部位特異的変異の手段としては、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ キットを用い、以下のプライマーにより、変異部位の組み合わせを検討した。
【００４２】
プライマー３：１６３位のグルタミン酸（Ｅ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（配列番号５）
プライマー４：１７０位のイソロイシン（Ｉ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（配列番号６）
プライマー５：１７１位のセリン（Ｓ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（配列番号７）
プライマー６：１６３位のグルタミン酸（Ｅ）及び１７１位のセリン（Ｓ）を任意のアミノ酸（Ｘ）に置換する（配列番号８）
【００４３】
変異導入用鋳型プラスミドの作製は、カナマイシン選択用アンバー変異マーカーを有するｐＫＦ１８ｋのマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトに、前記スクリーニングで得られた変異プロテアーゼ遺伝子を導入することにより構築した。
【００４４】
部位特異的変異導入用ＰＣＲ反応にはＴａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。５’末端をリン酸化したセレクションプライマー（Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ キット添付）及びプライマー３〜５の各変異導入プライマーを各々５ｐｍｏｌ及び鋳型プラスミド１０ｎｇを用い変異導入ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を用い大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換することにより、変異プラスミドを得た。得られた変異プラスミドは先述の塩基配列決定法に従い変異部位を確認した。
【００４５】
部位特異的変異により変異導入されたプロテアーゼ遺伝子をｐＨＡ６４に導入し、ＫＰ−４３株を形質転換し、先述の条件で培養、精製することにより、野生型酵素に比べプロテアーゼ比活性が更に増大するアミノ酸置換を検討した。
【００４６】
その結果、Ｅ１６３Ｉ、Ｅ１６３Ｌ、Ｅ１６３Ｎ、Ｅ１６３Ｔ、Ｅ１６３Ｖ、Ｉ１７０Ｌ、Ｓ１７１Ｄ、Ｓ１７１Ｇ、Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｆ＋Ｓ１７１Ａ、Ｅ１６３Ｌ＋Ｓ１７１Ａ、Ｅ１６３Ｑ＋Ｓ１７１Ａ、Ｅ１６３Ｖ＋Ｓ１７１Ａ、Ｅ１６３Ａ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ｄ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ｉ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ｌ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ｓ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ｔ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１７１Ｖ＋Ｓ１７１Ｇ、Ｅ１６３Ａ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｈ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｉ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｋ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｌ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｑ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｔ＋Ｓ１７１Ｔ、Ｅ１６３Ｖ＋Ｓ１７１Ｔにおいて約１０〜７０％のプロテアーゼ活性の向上が認められた（表２）。
【００４７】
上記変異部位の組み合わせにより得られる、本発明アルカリプロテアーゼ変異体はカゼインに対する比活性を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００４８】
（プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法）
カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０ｍＬ加え、室温で３０分間放置した後、濾過を行い、濾液中の酸可溶性タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法の変法により定量した。すなわち、０．５ｍＬの濾液にアルカリ性銅溶液（１％酒石酸ナトリウム・カリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝１：１：１００）を２．５ｍＬ加え、室温で１０分間放置後、フェノール溶液［フェノール試薬（関東化学）を蒸留水にて２倍希釈したもの］を０．２５ｍＬ添加し、３０℃で３０分間保温した。その後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。プロテアーゼ１単位は、上記反応条件で１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも活性を有し、蛋白質の他に皮脂等が混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性能を発揮し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼを効率よく生産、提供することができる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するプロテアーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a mutant alkaline protease useful as a detergent enzyme.
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
The use of proteases in the industrial field has a long history, and is very diverse, from detergents such as clothing detergents to fiber modifiers, leather treatment agents, cosmetics, bath agents, food modifiers or pharmaceuticals. Over. Among them, proteases produced on a large scale industrially are detergent proteases, such as Alcalase, Sabinase (Novozyme), Maxacal (Genenco), Blapp (Henkel), and KAP (Kao).
[0003]
The purpose of incorporating protease into detergents is to decompose the protein-based dirt attached to clothing to lower molecular weight and promote solubilization by surfactants. Instead, it is a composite soil containing a plurality of components in which organic substances and inorganic substances are mixed, such as lipids and solid particles derived from sebum, and a detergent having high detergency for such composite soil has been desired.
[0004]
From such a viewpoint, the present inventors maintain a sufficient casein degrading activity even in the presence of a high concentration of fatty acids, and have a molecular weight of about 43, which has excellent detergency not only for proteins but also for complex soils including sebum and the like. Several 000 alkaline proteases have been found, and a patent application has been previously filed (WO 99/18218). And, these alkaline proteases have a molecular weight, a primary structure, enzymatic properties, particularly in that they have very strong resistance to oxidizing agents, and thus are known as subtilisins, which are conventionally known serine proteases derived from Bacillus bacteria. Alternatively, a classification into the new subtilisin subfamily has been proposed (Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, (2000), 313-319).
[0005]
The above alkaline protease is a protease that retains sufficient casein decomposition activity even in the presence of a high concentration of fatty acids and has excellent detergency not only for proteins but also for complex soils including sebum, etc. In view of the improvement of the alkaline protease, there has been a demand for an alkaline protease which retains the properties of the alkaline protease and has a stronger proteolytic activity.
[0006]
On the other hand, in general, as a method for improving the protein decomposing ability, there is a method of modifying a protease gene to improve a protease's degrading activity per protein mass, that is, a specific activity, and also details a protein engineering modification for improving a specific activity of subtilisin. (Wells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, (1987), 1219-1223, Wells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, (1987), 5167-5171, Taguchi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, (1998), 492-495, Takagi et al., Protein Eng., 11, (1998), 1205-1210, Bryan, Biochim. Biophys. Acta, 1543, (2000), 203-222, etc.). However, the modifications reported so far, while improving the specific activity for a specific synthetic peptide, did not improve the activity for a natural substrate which is considered to be associated with detergency.
[0007]
On the other hand, with respect to the improvement of the specific activity with respect to a natural substrate, there is a report that, for example, by replacing isoleucine at position 31 of subtilisin E with leucine, the degradation activity for a casein substrate can be improved (Takagi et al., J. Biol). Chem., 36, (1988), 19592-19596), the amino acid in the alkaline protease is originally leucine, and the alkaline protease group differs in enzymatic properties from subtilisin having a molecular weight of about 28,000. Therefore, this case was not helpful in improving the specific activity of the protease.
[0008]
An object of the present invention is to provide an alkaline protease which has a stronger proteolytic power and exhibits an excellent washing ability.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies on the mutants of the alkaline protease, and found that in the alkaline protease, a mutant in which an amino acid residue at a specific position in the amino acid sequence was replaced with another amino acid residue was used as a natural substrate. It has been found that it has excellent specific activity and is useful as a washing enzyme.
[0010]
That is, the present invention relates to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an alkaline protease having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence, wherein (a) position 163, (b) position 170, or (c) A) a mutant alkaline protease in which the amino acid residue at position 171 or a position corresponding thereto is substituted with another amino acid residue, and a gene encoding the same.
[0011]
The present invention also provides a vector containing the gene and a transformant containing the vector.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The mutant alkaline protease of the present invention is a protease to be mutated (hereinafter, also referred to as “parent alkaline protease”) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an alkaline protease having an amino acid sequence having 80% or more homology thereto. ), Wherein the amino acid residue at position (a) 163, position (b) 170 or position (c) 171 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is replaced with another amino acid residue; These may be wild-type mutants or artificially mutated mutants.
[0013]
As the parent alkali protease, “high alkaline protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1”, for example, KP43 [derived from Bacillus sp. KSM-KP43 (FERMBP-6532) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, WO99 / 18218].
[0014]
As the alkaline protease having a homology of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 which is the parent alkaline protease, those having a homology of preferably 87% or more, more preferably 90% or more, and even 95% or more are preferred. Preferably, it may be a wild type or a wild type mutant.
Further, it is preferable that it has an oxidizing agent resistance and has a molecular weight recognized by SDS-PAGE of 43,000 ± 2,000, and particularly has an oxidizing agent resistance and acts on the alkali side (pH 8 or more). It is stable and shows a survivability of 80% or more when treated at pH 10 for 10 minutes even at 50 ° C., and is inhibited by diisopropylfluorophosphoric acid (DFP) and phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Those having a molecular weight recognized by PAGE of 43,000 ± 2,000 are preferred.
Here, having oxidant resistance means that the residual activity when treated at 30 ° C. for 20 minutes at pH 10 (20 mM Britton-Robinson buffer) in a 50 mM hydrogen peroxide (containing 5 mM calcium chloride) solution is at least 50%. It means that it holds above.
[0015]
Examples of the alkaline protease showing 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include, for example, protease KP9860 [derived from Bacillus sp. KSM-KP9860 (FERMBP-6534), WO99 / 18218, GenBank Accession No. AB046403], derived from protease KP9865 [Bacillus sp. KSM-KP9865 (FERM P-18566), Japanese Patent Application No. 2002-002653, GenBank Accession No. AB081555], protease E-1 [Bacillus No. D-6 (FERMP-1592), JP-A-49-71191, GenBank Accession No. AB046402], derived from protease Ya [Bacillus sp. Y (FERMBP-1029), JP-A-61-280268, GenBank Accession No. AB046404], derived from protease SD521 [Bacillus SD521 (FERMP-11162), JP-A-3-191781, GenBank Accession No. AB046405], protease A-1 [derived from NCIB12289, WO88 / 01293, GenBank Accession No. AB046406], protease A-2 [derived from NCIB12513, WO98 / 56927], a mutant in which position 46 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine, a mutant in which position 57 is substituted with alanine, position 103 is substituted with arginine , Lysine at position 107, lysine at position 124, alanine at position 136, alanine at position 193, and 195 at position 195. Mutants substituted with asparagine, glutamic acid, arginine, proline, threonine, valine, histidine, serine, lysine, glutamine, methionine, cysteine, alanine, aspartic acid, tryptophan, glycine and phenylalanine, respectively, and the 247th position with threonine and arginine, respectively Mutated mutant, mutant in which position 257 was substituted with valine, mutant in which position 342 was substituted with alanine, double mutant in which position 66 was substituted with aspartic acid and position 264 was substituted with serine (Japanese Patent Application 2000- No. 355166), a variant in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine at position 84, a variant with substitution at position 104 with proline, a variant with substitution at position 256 with alanine and serine, and a substitution at position 369 with asparagine Mutant (Japanese Patent Application No. 2001-114048), a mutant in which position 251 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was substituted with asparagine, threonine, isoleucine, valine, leucine and glutamine, respectively, and position 256 was serine, glutamine and asparagine, respectively. Mutants substituted with valine and alanine (Japanese Patent Application No. 2001-329472) or In these amino acid sequences 80% or more, preferably 87% or more, more preferably 90% or more, more preferably include alkaline protease having at least 95% homology.
The homology of the amino acid sequence can be calculated using, for example, the well-known Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985).
[0016]
The amino acid residues at positions (a) to (c) of the parent alkaline protease represented by SEQ ID NO: 1 are glutamic acid at position (a), isoleucine at position (b), and serine at position (c). In a parent alkaline protease having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by 1, the amino acid residue at the position corresponding to the (a) position is preferably glutamic acid, and the (b) position Is preferably isoleucine, and the amino acid residue at the position corresponding to position (c) is preferably serine.
[0017]
Accordingly, preferred among the parent alkaline proteases are, in addition to the alkaline protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 80% or more, preferably 87% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Above, more preferably 95% or more homology and having the above-mentioned enzymatic properties (paragraph [0014]) and / or the positions corresponding to positions (a) to (c) in SEQ ID NO: 1. Proteases whose amino acid residues are as described above (paragraph [0016]) are mentioned.
[0018]
When the protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as the parent alkaline protease, the mutant alkaline protease of the present invention has the (a) position 163, (b) position 170 or (c) position 171. When a protease having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a parent alkaline protease is obtained by substituting an amino acid residue with another amino acid, (a) to SEQ ID NO: 1 (C) Any amino acid residue at the position corresponding to position (c) is replaced with another amino acid.
[0019]
Such other amino acid residues include (a) position: histidine, aspartic acid, phenylalanine, lysine, asparagine, serine, isoleucine, leucine, glutamine, threonine, valine, (b) position: valine, leucine, (c) Position: Alanine, glutamic acid, glycine, threonine.
[0020]
As a method for specifying the “corresponding amino acid residue”, for example, by comparing amino acid sequences using a known Lipman-Pearson method or the like, the conserved amino acid residue present in the amino acid sequence of each alkaline protease is determined. Maximum homology can be given. Accordingly, by aligning the amino acid sequences using such an algorithm, the corresponding amino acids can be specified regardless of the insertion or deletion in the amino acid sequence.
[0021]
That is, from FIG. 1 in which the amino acid sequences were aligned by the above method, (a) the amino acid residue at position 163 of SEQ ID NO: 1 is a glutamic acid residue, and the amino acid residue at the position corresponding to that position is By using the method, for example, in the case of protease E-1, it can be specified as a glutamic acid residue at position 162. The amino acid residue is preferably histidine, aspartic acid, phenylalanine, lysine, asparagine, serine, isoleucine, leucine, glutamine, threonine, and valine, and particularly preferably threonine and valine.
[0022]
(B) The amino acid residue at position 170 of SEQ ID NO: 1 is an isoleucine residue, and the amino acid residue at the position corresponding to that position is, for example, at position 169 in protease E-1 by using the above method. Isoleucine residue. The amino acid residue is preferably a valine or leucine residue.
[0023]
(C) The amino acid residue at position 171 of SEQ ID NO: 1 is a serine residue, and the amino acid residue at a position corresponding to that position is, for example, at position 170 in protease E-1 by using the above method. Serine residue. The amino acid residue is preferably an alanine, glutamic acid, glycine, or threonine residue, particularly preferably a glycine or threonine residue.
[0024]
Specific examples of the positions and amino acid residues corresponding to (a) position 163, (b) position 170 and (c) position 171 of the amino acid sequence of protease KP43 (SEQ ID NO: 1) are as follows: The proteases having a homology of 80% or more are shown as being preferably used (Table 1).
[0025]
[Table 1]
In addition, the amino acid residues (a) to (c) in the mutant alkaline protease of the present invention may be selected at two positions at the same time as long as the enzyme characteristics are not changed. Preferred specific examples in the case where two points are made at the same time are shown below. Amino acids are represented by three letters, "+" represents substitution added to one substitution, and "/" indicates that any of the amino acids described may be used.
[0027]
Examples of the double-substituted product include Glu163 (Phe / Leu / Gln / Val) + Ser171Ala, Glu163 (Ala / Asp / Ile / Leu / Ser / Thr / Val) + Ser171Gly, and Glu163 (Ala / His / Ile / Lys / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu / Lu) Gln / Thr / Val) + Ser171Thr, and the like, but Glu163Thr + Ser171Thr, Glu163Thr + Ser171Gly, and Glu163Val + Ser171Gly are particularly preferable.
[0028]
Further, the mutant alkaline protease of the present invention includes not only those in which any of the amino acid residues at positions (a) to (c) or positions corresponding thereto are substituted with other amino acids, but also specific activity to a natural substrate. As long as the property of the enzyme other than the property of improving the amino acid is not changed, one to several amino acid residues may be deleted, substituted or added at other positions in the amino acid sequence.
[0029]
The alkaline protease mutant of the present invention is, for example, substituted for a gene (SEQ ID NO: 2) encoding a cloned parent alkaline protease (eg, an alkaline protease having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as “mutation”). ), Transforming a host cell with the obtained mutant gene, culturing the resulting transformant, and collecting alkaline protease from the culture. Cloning of the gene encoding the parent alkaline protease may be performed by a known gene recombination technique, for example, according to the method described in WO99 / 18218 and WO98 / 56927.
[0030]
As a method for mutating the gene encoding the parent alkaline protease, a commonly used random mutation method or site-specific mutation method may be used, for example, using a Mutan-Super Express Km kit (Takara) or the like. Thus, a desired mutation can be given to any gene sequence information, and consequently a change such as substitution, deletion, or insertion can be given to the amino acid sequence. In addition, by using a recombinant PCR (polymerase chain reaction) method (PCR protocol, Academic Press, New York, 1990), it is possible to replace an arbitrary sequence of a gene with a sequence corresponding to the arbitrary sequence of another gene. It is possible.
[0031]
In order to produce the alkaline protease mutant of the present invention using the obtained mutant gene, for example, the mutant protease gene is ligated to a DNA vector capable of stably amplifying, or a chromosomal DNA capable of stably maintaining the mutant protease gene. The mutant protease gene may be stably amplified by a method such as introduction into the host, and then introduced into a host capable of efficiently expressing the gene. Hosts capable of stably producing the mutant protease gene by introducing the mutant protease gene include, for example, Bacillus bacteria, Escherichia coli, yeast, mold, actinomycetes, and the like. Using these strains, assimilable carbon sources, nitrogen sources, etc. A medium containing essential nutrients may be inoculated and cultured according to a conventional method.
[0032]
The mutant alkaline protease thus obtained has an improved specific activity of the enzyme for the casein substrate as compared to the parent alkaline protease. That is, it has resistance to oxidants, is not inhibited by high-concentration fatty acids, and has a molecular weight of 43,000 ± 2,000 recognized by SDS-PAGE, and has an activity in an alkaline region. In particular, those which retain the properties of the alkali-philic protease described in paragraph [0014] are preferable.
[0033]
【Example】
Example 1
Random mutation was given to a range of about 2.0 kb including the stop codon of the alkaline protease structural gene derived from Bacillus sp. KSM-KP43 strain. As a random mutation introduction method, a Taq polymerase having no error repairing ability: Takara Taq (Takara) was used as a DNA polymerase in order to utilize a base incorporation error during the PCR reaction. First, PCR was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4) capable of amplifying the above-described DNA of about 2.0 kb. Primer 1 had a Bam HI linker at the 5 ′ end of the sense strand, and primer 2 had an Xba I linker at the 5 ′ end of the antisense strand. The reaction system was a 100 μL system containing 10 ng of template DNA, 10 pmol of each primer, 20 nmol of each dNTP, 10 μL of a reaction buffer attached to Takara Taq, and 2.5 U of Taq polymerase. The PCR reaction conditions were as follows: denaturation of the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes. The PCR product was purified using a PCR product purification kit (Roche) and eluted with 100 μL of sterile water. Next, a second PCR reaction was performed using 1 μL of the eluate as a template DNA. The PCR reaction conditions were the same as the first time. The second PCR product was purified in the same manner as the first PCR product and used for the subsequent experiments.
[0034]
Terminal restriction enzyme linkers amplified DNA fragment of about 2.0 kb, were cut by Bam HI, Xba I (Roche). As an expression vector into which the amplified DNA was to be incorporated, pHA64 (Japanese Patent Application No. 8-332050) capable of replicating in Bacillus bacteria was used. Bam HI, Xba I treated amplified DNA fragment and also Bam HI, after mixing pHA64 was Xba I treated by Ligation High (Toyobo), it was carried out ligase reaction. DNA was recovered from the ligase reaction solution by ethanol precipitation and used as DNA for subsequent transformation.
[0035]
Bacillus sp. KSM-KP43 (hereinafter abbreviated as KP-43 strain) was used as a host to be transformed. The transformation was performed by electroporation, and the transformation was performed using SSH-10 (Shimadzu Corporation) and Gene Pulser Cuvette (Bio-Rad).
[0036]
The transformant of the KP-43 strain was transformed into an alkaline agar medium containing skim milk [Skim milk (Difco) 1% (w / v), bactotripton (Difco) 1%, yeast extract (Difco) 0.5%, sodium chloride 0.1%. 5%, agar 1.5%, anhydrous sodium carbonate 0.05%, tetracycline 15 ppm], and the presence or absence of the protease gene was determined based on the halo formation status.
[0037]
The transformed KP-43 strain carrying the plasmid in which the protease gene was inserted into pHA64 was selected and used for subsequent culture.
[0038]
For each transformant, single colonies were separated and halo formation was confirmed. In a test tube, a 5 mL seed culture medium [Polypeptone S (Nippon Pharmaceutical) 6.0% (w / v), yeast extract 0.1%, maltose 1 0.0%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, anhydrous sodium carbonate 0.3%, tetracycline 30 ppm], and pre-cultured at 30 ° C. and 320 rpm overnight. did. This seed culture was added to a 20 mL main medium [polypeptone S 8% (w / v), yeast extract 0.3%, maltose 10%, magnesium sulfate heptahydrate 0.04%, phosphoric acid 2 in a 500 mL Sakaguchi flask. 1% was inoculated (v / v) into 0.2% of potassium hydrogen, 1.5% of anhydrous sodium carbonate, and 30 ppm of tetracycline], and cultured at 30 ° C. and 121 rpm for 3 days. The obtained culture was centrifuged, and the protease activity in the culture supernatant was measured. Protease activity was measured by an activity measurement method using casein as a substrate, and protein mass was measured using a protein assay kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). By comparing the value of the culture supernatant obtained when the transformant having the wild-type enzyme gene was cultured under the same conditions, a mutant protease gene in which the protease activity was improved was selected. Since no significant increase in the amount of protein was observed with respect to an increase in the protease activity in the culture supernatant, the obtained mutant was a mutant required for improving the casein degrading activity per protein amount. It was suggested that was introduced.
[0039]
Plasmids were recovered from the selected transformants using High pure plasmid isolation kit (Roche), and the nucleotide sequence was determined. Using 300 ng of plasmid DNA as a template, a PCR reaction was performed in a 20 μL reaction system using a primer and a Big Dye DNA Sequencing kit (Applied Biosystem), and subjected to analysis using a DNA Sequencer 377 (Applied Biosystem).
As a result, in the mutant having improved protease activity, glutamic acid at position 163 was substituted with histidine, isoleucine at position 170 with valine, and serine at position 171 with alanine.
[0040]
A part of the culture solution was diluted, applied to a DEAE-Toyopearl (Tosoh) column equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 2 mM calcium chloride, and the non-adsorbed fraction was collected to obtain a substantially homogeneous solution. Protease was obtained. The protein content and casein-degrading activity of this purified enzyme were measured, and the specific activities thereof were calculated. As a result, it was confirmed that the introduction of the above-mentioned mutation resulted in an improvement in the protease specific activity of about 15 to 20% (Table 2).
[0041]
Further, by replacing the mutation site with an arbitrary amino acid, the improvement of the protease activity was examined. As a means of site-specific mutation, Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit was used, and combinations of mutation sites were examined using the following primers.
[0042]
Primer 3: Substitute glutamic acid (E) at position 163 with any amino acid (X) (SEQ ID NO: 5)
Primer 4: Substitute isoleucine (I) at position 170 with any amino acid (X) (SEQ ID NO: 6)
Primer 5: Replace Serine (S) at Position 171 with Any Amino Acid (X) (SEQ ID NO: 7)
Primer 6: Substitute glutamic acid (E) at position 163 and serine (S) at position 171 with any amino acid (X) (SEQ ID NO: 8)
[0043]
Preparation of mutagenesis for template plasmid was constructed by Bam HI in the multiple cloning site of pKF18k having an amber mutation marker for kanamycin selection, the Xba I site, introducing a mutation protease gene obtained by the screening.
[0044]
Takara LA Taq (Takara) was used for the PCR reaction for site-specific mutagenesis. Mutagenesis PCR was carried out using 5 pmol of each of the selection primer (attached to Mutan-Super Express Km kit) and primers 3 to 5 having phosphorylated 5 ′ end and 5 ng of the template plasmid and 10 ng of the template plasmid. The PCR reaction conditions were as follows: denaturation of the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes. A mutant plasmid was obtained by transforming Escherichia coli MV1184 strain using the obtained PCR product. The mutation site of the obtained mutant plasmid was confirmed according to the above-described nucleotide sequencing method.
[0045]
By introducing the protease gene mutated by site-specific mutation into pHA64, transforming the KP-43 strain, and culturing and purifying under the conditions described above, amino acids whose protease specific activity is further increased as compared with the wild-type enzyme Substitution was considered.
[0046]
As a result, E163I, E163L, E163N, E163T, E163V, I170L, S171D, S171G, S171T, E163F + S171A, E163L + S171A, E163Q + S171A, E163V + S171A, E163A + S171G, E163D + S171G, E163I + S171G, E163L + S171G, E163S + S171G, E163T + S171G, E171V + S171G, E163A + S171T, E163H + S171T, E163I + S171T, E163K + S171T , E163L + S171T, E163Q + S171T, E163T + S171T, and E163V + S171T, an improvement in protease activity of about 10 to 70% was observed (Table 2).
[0047]
The alkaline protease mutant of the present invention obtained by the combination of the above mutation sites has the characteristics of the alkali-alkaline protease except that it improves the specific activity for casein, that is, has the resistance to oxidizing agents, and inhibits the casein degradation activity by high-concentration fatty acids. , And the molecular weight observed by SDS-PAGE was 43,000 ± 2,000, confirming that the compound had the property of being active in the alkaline region.
[0048]
(Protease activity measurement method-casein method)
After incubating 1.0 mL of 50 mM borate buffer (pH 10.5) containing 1% (w / v) casein at 30 ° C. for 5 minutes, 0.1 mL of the enzyme solution is added, and the reaction is performed for 15 minutes. 2.0 mL of a reaction stop solution (0.11 M trichloroacetic acid-0.22 M sodium acetate-0.33 M acetic acid) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, followed by filtration. Quantification was carried out by the modified method described above. That is, 2.5 mL of an alkaline copper solution (1% sodium potassium tartrate: 1% copper sulfate: 1% sodium carbonate = 1: 1: 100) was added to 0.5 mL of the filtrate, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. 0.25 mL of [a phenol reagent (Kanto Chemical) diluted twice with distilled water] was added thereto, and the mixture was kept at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the absorbance at 660 nm was measured. One unit of protease was defined as the amount of enzyme required to release an acid-soluble proteolysate equivalent to 1 mmol of tyrosine per minute under the above reaction conditions.
[0049]
[Table 2]
[0050]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has an activity even in the presence of a high concentration of fatty acids, exhibits excellent cleaning performance even on complex soils containing sebum and the like in addition to proteins, and is an alkaline protease useful as a detergent-containing enzyme. Can be efficiently produced and provided.
[0051]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view in which amino acid sequences of proteases having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are aligned.
