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JP2003524381A - システインノット成長因子ミュータント - Google Patents

システインノット成長因子ミュータント

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JP2003524381A
JP2003524381A JP2000574259A JP2000574259A JP2003524381A JP 2003524381 A JP2003524381 A JP 2003524381A JP 2000574259 A JP2000574259 A JP 2000574259A JP 2000574259 A JP2000574259 A JP 2000574259A JP 2003524381 A JP2003524381 A JP 2003524381A
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growth factor
amino acid
human
factor family
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JP2000574259A
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ブルース ディー． ウェイントラウブ
マリウス ダブリュ． スズクドリンスキー
Original Assignee
ユニヴァーシティ オブ メリーランド，ボルチモア
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Abstract

(57)【要約】 野生型ホルモン／成長因子に対するアミノ酸置換を含む、ミュータント・シスチンノット成長因子(CKGFs)に基づく組成物および方法。甲状腺刺激ホルモン(TSH)および絨毛性ゴナドトロピン(CG)を含む突然変異された糖タンパク質ホルモンが、例示的なミュータントCKGFsとして開示されている。ミュータントTSHヘテロダイマーおよびhCHヘテロダイマーは、スーパーアゴニスト活性を含む、修飾された生物活性を有した。従って、本発明は、疾患を治療または予防するための、ミュータントCKGFs、CKGFアナローグ、そのフラグメントおよび誘導体を使用する方法を提供する。薬学的および診断的組成物、代謝性および生殖性疾患の治療および予防に有用性を有するミュータントTSHヘテロダイマーおよびTSHアナローグを使用する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
発明の分野 本発明は、一般的にタンパク質成長因子の分野に関する。特に具体的には、本
発明は、所望の薬理的な性質を有するシステインノット成長因子（ＣＫＧＦ）ミ
ュータントに関する。本発明は、更に、これらミュータントを製造する方法、薬
学的な組成物、及びこれらに基づく治療及び診断方法にも関する。
【０００１】 発明の背景 成長因子は、細胞の成長、分化及び細胞−細胞伝達を調節するタンパク質の多
様な群である。成長因子−媒介プロセスを支配する分子的なメカニズムはほとん
ど未知のままであるが、成長因子を構造的及び機能的な類似に基づいていくつか
のスーパーファミリーの一つに分類できることが知られている。
【０００２】 ４つの別々のタンパク質ファミリーを示す、４種の異なる成長因子、神経成長
因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由
来成長因子（ＰＤＧＦ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の結晶構造か
ら、ファミリーのメンバーが構造的に関係し、共通の全体的なトポロジーを共有
していることが明らかになった。これら４種のタンパク質はほとんど配列のホモ
ロジーを共有しないが、”システイン−ノット”コンホメーション中に結合する
６個のシステインの特徴的な配列が存在していた。これらタンパク質の活性型は
、ホモダイマー又はヘテロダイマーのいずれかのダイマーである。変異の分析に
よって、６個いずれの保存されたシステイン残基の変異が成長因子活性を失わせ
る結果を招くことが判明した（Brunner et al., 1992, Mol. Endocrinol. 6:169
1-1700;, Glase et al., 1987, Science 236:1315-18）。
【０００３】 システインノット成長因子間で共有する著しい構造的な類似は、共通の祖先の
遺伝子からの進化を示唆する。ＣＫＧＦスーパーファミリーの構造的及び機能的
な性質、及びＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ及びｈＣＧの結晶構造については、
Ｓｕｎ及びＤａｖｉｅｓ（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24:269
-291）、ＭａＤｏｎａｌｄ及びＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ（Cell, 1993, 73:421-4
24）及びＭｕｒｒａｙ−Ｒｕｓｔら（Structure, 1993, 1:153-159）によって総
説されている。
【０００４】 糖タンパク質ホルモン 糖タンパク質ホルモンは、再生及び代謝の調節に関与する進化的に保存された
ホルモンの群である（Pierce 及び Parsons, 1981, Endocr. Rev. 11:354-385）
。このホルモンのファミリーは卵胞−刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ
）を含む。構造的には、糖タンパク質ホルモンは、共通のα−サブユニット及び
ホルモン−特異的なβ−サブユニットからなるヘテロダイマーである。
【０００５】 ヒト糖タンパク質ホルモン内の構造−機能関係は、ゴナドトロピン群のモデル
、特にヒトＣＧに、実質的に基づいている。近年、部分的な脱グリコシル化した
ｈＣＧの結晶構造によって、他の糖タンパク質ホルモンに関連する２つの鍵とな
る構造的な特徴が明らかとなった（Lapthorn et al., 1994, Nature 369:455-46
1; Wu et al., 1994, Structure 2:548-558）。共通のα−サブユニットは、全
てがジスルフィド結合中にある１０個の半−シスチン残基を含む９２個のアミノ
酸のアポタンパク質のコアを含む。提案される対は、１０−６０、２８−８２、
３２−８４、７−３１及び５９−８７である。結合２８−８２及び３２−８４は
、システイン残基１０及び６０を架橋する結合によって貫通された環構造を形成
し、その結果、コア内に、３種のヘアピン構造を形成する−システインノット−
を作る。α−サブユニット及びｈＣＧβ−サブユニットは共に全体のトポロジー
、各サブユニットは、中心のシステインノットの一方の側上に２つのβ−ヘアピ
ンループ（Ｌ１及びＬ３）及び他方上に長いループ（Ｌ２）を有する。
【０００６】 ＴＳＨは、脳下垂体前葉の甲状腺刺激ホルモン分泌細胞中に産生される２８−
３０ｋＤａのヘテロダイマーの糖タンパク質である。このホルモンは、Ｇタンパ
ク質−結合ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）（Vassant 及び Dumont, 1992, Endoc
r. Rev. 13:596-611）と相互作用することによって、甲状腺の機能を支配し、結
果としてサイクリック アデノシン３’５’−モノフォスフェート（ｃＡＭＰ）
等の第２のメッセンジャー分子に関与する経路の刺激を導き、結果として究極的
に甲状腺の遺伝子発現の調節を招く。ＴＳＨの生理学的な役割は、ヨウ素取り込
み等の分化した甲状腺機能の刺激、該腺からの甲状腺ホルモンの遊離、及び甲状
腺の成長の促進を含む（Wondisford et al., 1996, Thyrotropin. In: Braverma
n et al(eds.), Werner 及び Ingbar's The Thyroid, Lippencott-Raven, Phila
delphia, pp190-207）。
【０００７】 構造的には、糖タンパク質ホルモンは共通のα−サブユニット及びホルモンの
特異的なβ−サブユニットからなる関連したヘテロダイマーである。上述したよ
うに、共通のヒトα−サブユニットは、全てがジスルフィド結合中にある１０個
の半−シスチン残基を含む９２個のアミノ酸のアポタンパク質のコアを含む。該
α−サブユニットは、ヒトにおいては染色体６上に位置する単一の遺伝子によっ
てコードされており、与えられた種の範囲内においてアミノ酸配列は同一である
（Fiddes 及び Goodman, 1981, J. Mol. Appl. Gen. 1:3-18）。ホルモン特異的
なβ−サブユニット遺伝子は、長さ、構造的な組織及び染色体上での位置が異な
る（Shupnik et al., 1989, Endocr. Rev. 10:459-475）。該ヒトＴＳＨβ−サ
ブユニット遺伝子は、１１８アミノ酸残基を有する成熟したタンパク質であると
予測され、染色体１上に位置する（Wondisford et al.,上記）。種々のβ−サブ
ユニットは、６個のジスルフィド結合を形成する１２個の不変の半−シスチン残
基によって整列化できる。３０〜８０％のアミノ酸配列がホルモン間で同一であ
るにもかかわらず、β−サブユニットは、高い特異性を有する異なるレセプター
結合を示す（Pierce 及び Parsons,上記）。
【０００８】 重要的には、糖タンパク質ホルモンの糖質の部分は、ホルモン重量の１５―３
５％を構成する。共通のα−サブユニットは２個のアスパラギン（Ｎ）−結合オ
リゴサッカライドを有し、β−サブユニットは（ＴＳＨ及びＬＨでは）１個、（
ＣＧ及びＦＳＨでは）２個を有する。加えて、ＣＧβ−サブユニットは４個のセ
リン（Ｏ）−結合グリコシル化部位と共に、特有のカルボキシル−末端延長ペプ
チド（ＣＴＥＰ）を有する。（Baenziger, 1994, Glycosylation 及び glyco蛋
白質 hormone function, in Lustbander et al. (eds.) Glyco蛋白質 Hormones:
Structure, Function 及び Clinical Implications. Springer-Verlag, New Yo
rk, pages 167-174）。
【０００９】 ヒトＴＳＨにおける分子的な研究が、ＴＳＨβ−サブユニットｃＤＮＡ及び遺
伝子のクローニング（Joshi et al., 1995,Endocrinol. 136:3839-3848）、ＴＳ
ＨレセプターｃＤＮＡのクローニング（Parmentier et al., 1989, Science, 2
46:1620-1622; Nagayama et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 166:
394-403）、及び組換えＴＳＨの発現（Cole et al., 1993, Bio/Technol. 11:10
14-1024; Grossmann et al., 1995, Mol. Endocrinol. 9:948-958; Szkudlinski
et al, 1996 上記）によって容易になった。これまでの構造−機能研究は、一
次的に高く保存された領域に集中したＴＳＨ及びキメラのサブユニットの創造に
向けられた。しかしながら、これらアプローチは、インビトロでの生物学的活性
を有するミュータントホルモンを導かなかった（Grossmann et al., 1997, Endo
cr. Rev. 18:476-501）。
【００１０】 循環における糖タンパク質ホルモンの半減期の延ばす方法も、また展開された
。遺伝子融合実験において、数個のＯ−結合糖質を有するｈＣＧ βサブユニッ
トのカルボキシル−末端延長ペプチド（ＣＴＥＰ）が、ヒトＴＳＨβサブユニッ
トに結合した（Joshi et al., 1995, Endocrinol., 136:3839-3848; Grossmann
et al., 1997, J. Biol. Chem. 277:21312-21316）。これらキメラのインビトロ
での活性は、変化無かったが、それらの循環の半減期は、延び、インビボの生物
学的活性において増強された。加えて、単一鎖の融合タンパク質としてのβ及び
αサブユニット発現が、安定性を増強させ、野生型の糖タンパク質ホルモンに比
して血漿の半減期を延ばした（Sugahara et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 92:2041-2045; Grossmann et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:21312-2131
6）。
【００１１】 甲状腺癌の診断及びモニタリングにおけるＴＳＨの使用 組換えＴＳＨを、分化した甲状腺癌を有する１９人の被験者の診断及びフォロ ーアップにおける131Ｉ取り込み及びサイログロブリンを分泌を刺激するために
試験し、甲状腺ホルモンの副作用の中止を阻止した（Meier et al., J. Clin. E ndocrinol. Metab. 78:188-196）。最初の試みの予備的な結果は、高く奨励でき る。 米国における甲状腺癌の発生率は１年につき約14000ケースである。これら
のほとんどは分化しており、乳頭又は卵胞の癌がほぼ共通のサブタイプである。
そのような分化した甲状腺癌の１０−及び２０−歳の生存率は、各々９０％及び
６０％であり、長期のモニタリングで局所的な再発を検出しており、そのような
被験者、特に癌が第１回目の治療後に１０年後再発した被験者の管理において遠
い転移が必須となっている。フォロー−アップに使用される主要な方法は、全身
の放射性ヨウ素のスキャンニング及び血清サイログロブリン測定である。これら
診断の手段の最適の感受性においては、131Ｉ取り込み及びサイログロブリンを
分泌を促進させるためのＴＳＨによる残りの甲状腺組織への刺激が要求される。
しかしながら、甲状腺摘出術後の甲状腺癌被験者は、甲状腺ホルモンで治療され
、甲状腺機能正常を維持すると共に、内因性のＴＳＨを抑制して残りの甲状腺組
織での潜在的なＴＳＨの刺激効果を避ける。それゆえ、通常、Levo-Ｔ4又はほと
んど一般的でないＴ3が、内因性のＴＳＨ分泌を刺激するために、放射性ヨウ素
のスキャンニング及びサイログロブリンの決定の４−６及び２週間前に回収され
る。付随の一次的だが深刻な甲状腺機能低下症が、相当に生命の質を低下させ、
働く能力を干渉する。更に、ＴＳＨは、悪性の甲状腺組織における成長因子とし
て作用することができるが、増大した内因性のＴＳＨ分泌の延長した期間が、そ
のような被験者において潜在的な危険性を引き起こす。
【００１２】 １９６０年代においては、ウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ）が残りの甲状腺組織を刺激
するために使用され、内因性のＴＳＨを上昇させるための必要性を打開した（Bl
ahd et al., 1960, Cancer 13:745-756）。しかしながら、臨床的な実行におい
ていくつかの不都合がその使用を中断させた。ホルモンの中断に比して、ｂＴＳ
Ｈは、残りの悪性の甲状腺組織の検出及び転移において、効果がないことが判明
した。加えて、アレルギー反応及び抗体中和現象が、次のｂＴＳＨの投与の効果
を限定し、内因性のＴＳＨの決定を干渉した（Braverman et al., 1992, J. Cli
n. Endocrinol. Metab. 74:1135-1139）。
【００１３】 以下に、所望の薬理学的な特徴を有する新規なミュータントＣＫＧＦｓの製造
方法及び使用方法を示す。より具体的には、ホルモンの延長した半減期又は増大
した内因性の活性を有するアゴニストとして有用なホルモン組成物を以下に示す
。また、ホルモン組成物は、減少したホルモン性の活性を示し、その結果潜在的
なアンタゴニストを示す。 （発明の概要） 野生型ホルモン／成長因子に対するアミノ酸置換を含む、ミュータント・シス
チンノット成長因子(Cystine Knot Growth Factors: CKGFs)に基づく組成物およ
び方法。甲状腺刺激ホルモン(TSH)および絨毛性ゴナドトロピン(CG)を含む突然
変異された糖タンパク質ホルモンが、例示的なミュータントCKGFsとして開示さ
れている。ミュータントTSHヘテロダイマーおよびhCHヘテロダイマーは、スーパ
ーアゴニスト活性を含む、修飾された生物活性を有した。さらに、様々なミュー
タントCKGFファミリータンパク質が開示されている。例えば、開示されるミュー
タントCKGFタンパク質は、ミュータントCKGFホモおよびヘテロダイマーのような
ミュータント血小板由来成長因子(PDGF)ファミリータンパク質、およびミュータ
ント血管上皮細胞成長因子(VEGF)タンパク質；ミュータント神経成長因子(NGF)
、ミュータント脳由来神経栄養因子(BDNF)タンパク質、およびミュータントニュ
ーロトロフィン-3(NT-3)およびミュータントニューロトロフィン-4(NT-4)タンパ
ク質のようなミュータントニューロトロフィンファミリータンパク質；ミュータ
ントTGF-β1、ミュータントTGF-β2、ミュータントTGF-β3、ミュータントTGF-
β4/ebaf、ミュータントニュールチュリン(neurturin)、ミュータントインヒビ
ンA(inhibin A)、ミュータントインヒビンB、ミュータントアクチビンA(Activin
A)、ミュータントアクチビンB、ミュータントアクチビンAB、ミュータントMull
erian阻害物質(MIS)、ミュータント骨形態形成タンパク質-2(BMP-2)、ミュータ
ント骨形態形成タンパク質-3(BMP-3)/オステオゲニン、ミュータント骨形態形成
タンパク質-3b(BMP-3b)、ミュータント骨形態形成タンパク質-4(BMP-4)、ミュー
タント骨形態形成タンパク質-5(BMP-5)(前駆体のみ)、ミュータント骨形態形成
タンパク質-6(BMP-6)/Vgrl、ミュータント骨形態形成タンパク質-7(BMP-7)/骨形
成タンパク質(OP)-1、ミュータント骨形態形成タンパク質-8(BMP-8)/骨形成タン
パク質(OP)-2、ミュータント骨形態形成タンパク質-10(BMP-10)、ミュータント
骨形態形成タンパク質-11(BMP-11)、ミュータント骨形態形成タンパク質-15(BMP
-15)、ミュータントノリエ病タンパク質(NDP)、ミュータント成長/分化因子-1(G
DF-1)、ミュータント成長/分化因子-5(GDF-5)(前駆体のみ)、ミュータント成長/
分化因子-8(GDF-8)、ミュータント成長/分化因子-9(GDF-9)、ミュータントグリ
ア細胞由来神経栄養因子(GDNF)/アルテミン(Artemin)、およびミュータントグリ
ア細胞由来神経栄養因子(GDNF)/ペルセフィン(Persephin)タンパク質のようなミ
ュータントトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)ファミリータンパク質を
含む。従って、本発明は、疾病を治療または予防するための、ミュータントCKGF
s、CKGFアナローグ、フラグメント、およびその誘導体を使用するための方法を
提供する。代謝性および生殖性疾患の治療および予防に有用性を有する、TSHヘ
テロダイマーおよびTSHアナローグを含むミュータントCKGFタンパク質を使用す
る薬学的および診断的組成物、方法も提供する。
【００１４】 定義 本明細書で使用されるとき、下記の用語は、示された意味を有する： 用語TSHは、甲状腺刺激ホルモンを意味する。
【００１５】 用語TSHRは、甲状腺刺激ホルモンレセプターを意味する。
【００１６】 用語hCGは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを意味する。
【００１７】 用語CTEPは、hCGβサブユニットのカルボキシル末端伸張ペプチドを指す。
【００１８】 用語末梢ループは、逆平行βシートおよび実際のループで構成されるCKGFタン
パク質のβヘアピンループを意味する。代表的なCKGFサブユニット中には、２つ
の末梢ループがある。
【００１９】 用語「電荷逆転技術」は、野生型CKGFタンパク質中に存在する残基の正電荷の
荷電した残基を導入することによる、ミュータントCKGFの生成を意味する。
【００２０】 慣用されている１文字コードは、アミノ酸残基を指定するために使用される。
【００２１】 本明細書中で使用されるとき、TSHサブユニットのようなCKGFサブユニット内
の突然変異は、野生型CKGFタンパク質アミノ酸、その後にアミノ酸位置、および
続いて、ミュータントアミノ酸残基によって示される。例えば、I58Rは、58位で
のイソロイシンからアルギニンへの突然変異を意味する。
【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、１つ以上のミュータントサブユニットを含む新規なシスチンノット
成長因子(CKGF)タンパク質に関する。これらのミュータントサブユニットは、新
規なミュータントCFGFタンパク質に変化した結合特性を担わせるアミノ酸の置換
、付加、または欠失を含む。本発明は、さらに、ミュータントCKGFサブユニット
をコードするポリヌクレオチド、タンパク質およびポリヌクレオチドを作製する
方法ならびにそれに基づく診断および治療方法に関する。
【００２３】 本発明の新規なミュータントCKGFsは、代替的に、(a)天然に生じるまたは野生
型CKGFsにはない新規な特性、或いは(b)野生型CKGFsを特徴付ける所望の薬理学
的特性の改善を有する。好ましくは、野生型CKGFsと比較したとき、本明細書中
に開示される新規なミュータントCKGFsは、それらの同族のレセプターに関する
より高い親和性を有する。さらに、新規なミュータントCKGFsは、レセプター仲
介シグナル変換を生じることにおいて、より活性な又はより活性が乏しいかのい
ずれかであり得る。特定の実施態様では、新規なミュータントCKGFsは、インビ
ボで半減期を延長させた。
【００２４】 ミュータントCKGFタンパク質に保持される新規な特性は、リガンドとしてのCK
GFタンパク質とその生物学的レセプターとの間に起こる静電的相互作用を変化さ
せるアミノ酸置換、付加、または欠失から生じる。CKGFタンパク質の末梢ループ
中の正に荷電した残基は、レセプター相互作用において重要な役割を果たす。CK
GFスーパーファミリーのタンパク質に共通する末梢ループの特性を変化させるこ
とにより、野生型形態の分子と比較して増大した生物学的活性を発揮するミュー
タントCKGFタンパク質が作製される。それらのタンパク質は、本発明の１局面で
ある。
【００２５】 シスチンノット成長因子 CKGFスーパーファミリーは、細胞の増殖、分化および生存をコントロールする
タンパク質を含む。今日まで、タンパク質の４つの異なるファミリーが、そのス
ーパーファミリー内に同定された。これらは、糖タンパク質ホルモン、血小板由
来成長因子および関連するタンパク質、ニューロトロフィン類(neurotrophins)
および関連するタンパク質、並びにトランスフォーミング成長因子タイプβ(TGF
-β)および関連するタンパク質である(第１表を参照)。
【００２６】 本発明のCKGFスーパーファミリー内のタンパク質ファミリーは、機能およびポ
リペプチド配列において互いに異なる。CKGFスーパーファミリー内では、１ファ
ミリーのメンバーは、必ずしも、他のファミリーのメンバーと重要な配列同一性
を共有する必要はない。にもかかわらず、スーパーファミリーメンバーの３次元
構造は、シスチンノット(cystine knot)トポロジーを含む。さらに、シスチンノ
ットトポロジーは、CKGFスーパーファミリーメンバーおよびそれらのレセプター
のリガンド-レセプター相互作用を決定するのに重要な役割を果たす、CKGFスー
パーファミリーメンバー内に様々なヘアピンループ構造の作製をもたらす。従っ
て、CKGFスーパーファミリーメンバーをリンクする共通の構造的特徴がある。
【００２７】 興味深いことに、スーパーファミリーメンバーは、それらの活性なダイマー形
態中に異なる数のシスチンジスルフィドを有し、異なる細胞表面レセプターを介
して作用する。例えば、NGFおよびPDGFは、それぞれ、チロシンキナーゼドメイ
ンを介して機能するレセプターを有するが、TGF-βは、セリン/トレオニンキナ
ーゼを包含する複雑なシグナリングシステムを有する。糖タンパク質ホルモンに
関するレセプターは、Gタンパク質仲介シグナリング経路に結合する。
【００２８】 生物学的活性を調節するループ構造の同定 本発明は、CKGFヘアピンループ中の特定の位置での突然変異が、アセンブリー
されたCKGFsの生物学的活性を有意に変化させるという発見に基づく。１クラス
の突然変異は、CKGFタンパク質のヘアピンループの静電特性を変化させることに
向けられる。
【００２９】 突然変異誘発されるアミノ酸を選択するために、CKGFファミリー内の様々なCK
GFsメンバータンパク質のアミノ酸配列を比較した。この比較は、様々な動物種
から選択された、メンバータンパク質からのアミノ酸配列を調べた。比較は、CK
GFファミリーのメンバー間に存在する特定の非同類(non-conservative)アミノ酸
置換の存在を発見した。例えば、ヒトおよびウシの甲状腺刺激ホルモン(それぞ
れ、hTSHおよびbTSH)は、それらのαサブユニット間で70%ホモロジー、およびそ
れらのβサブユニット間で89%ホモロジーを共有する。さらに、bTSHは、hTSHよ
りも6-10倍効力が大きい(Yamazakiら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 80: 473-4
79(1995))。
【００３０】 これらのアミノ酸置換の更なる調査は、多くのこれらの非同類アミノ酸置換が
、これらのタンパク質のヘアピンループ中で起こることを示した。さらに、調べ
られたタンパク質のアミノ酸配列中の変化は、これらのタンパク質のヘアピンル
ープの静電特性を変化させることが見い出された。部位指定突然変異誘発を用い
て、これらの領域に現れる突然変異の機能的重要性が研究された。CKGFsの生物
学的活性に影響する重要な位置は、CKGFサブユニットのβヘアピンL1ループおよ
びβヘアピンL3ループを構成するポリペプチドのセグメント近くまたは内部に位
置する。
【００３１】 従って、これらのβヘアピンループを構成するアミノ酸配列中に突然変異を有
する、CKGFsのミュータントサブユニット、CKGF誘導体、CKGFアナローグ、およ
びそれらのフラグメントが、作製され、本明細書に記載された。突然変異は、CK
GFサブユニットのβヘアピンL1ループおよび／またはL3ループの静電特性を変化
させて、野生型CKGFサブユニットの特定の所望の特性を増強させる、アミノ酸残
基の挿入および／または欠失、および好ましくはアミノ酸置換を含み得る。
【００３２】 生物活性を増加させる本明細書に記載される突然変異が、互いに相乗効果を発
揮し得、その結果、多重突然変異を有するミュータントサブユニットが、突然変
異それぞれによって個々に付与される更なる活性の総計から予想されるであろう
よりも、かなりより高い生物活性を有することも見い出された。
【００３３】 本発明は、当業者に公知であるCKGFsのサブユニット中の突然変異を含まない
。
【００３４】 ミュータントCKGFsを合理的にデザインする方法 本発明の１つの局面に従うと、ミュータントCKGFサブユニットを合理的にデザ
インする方法は、CKGFのサブユニットのアミノ酸配列中の１つ以上の候補となる
位置を同定する工程、候補位置中に突然変異を含むミュータントサブユニットを
作製する工程、およびミュータントサブユニットが修飾された生物学的活性を有
することを確認するインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて、ミュータ
ントサブユニットおよびアセンブリーされたダイマー分子の機能的特性を研究す
る工程を包含する。タンパク質データベースは、CKGFの構造の３次元モデルを作
製するのに使用される、必要な物理的および化学的パラメーターを提供する。
【００３５】 本明細書の開示では、CKGFサブユニットを修飾する方法に特異的に適用され得
る１セットのガイドラインが開発された。１つの実施態様では、デザインのガイ
ドラインは、CKGFsの末梢ループに焦点を当てる。これらのガイドラインの１つ
の目標は、末梢ヘアピンループの静電特性を変化させる、そのそれぞれのレセプ
ター等価物に関する、CKGFスーパーファミリーメンバーの親和性を増大すること
である。ヘアピンループの静電特性を変化させることは、選択されたヘアピンル
ープ領域中のアミノ酸残基を選択すること、および野生型残基を、より望ましい
静電特性を有するアミノ酸残基で置換するまたは欠失することである。
【００３６】 一般に、末梢ヘアピンループの静電特性が、酸性または中性状態からより塩基
性状態に変化されるとき、CKGFタンパク質は、増大した生物学的活性を発揮する
。この観察に照らして、この領域中のアミノ酸置換は、突然変異誘発されたCKGF
タンパク質の塩基性性質または正電荷を増加する本発明のデザインガイドライン
下で作製される。例えば、ヘアピンループ中の酸性残基は、構造領域の静電特性
を変化させるように、中性または塩基性残基に突然変異誘発され得る。また、弱
い塩基性残基ヒスチジンは、より塩基性の残基に突然変異誘発され得る。さらに
、中性アミノ酸は、構造的領域の静電特性を変化させるように塩基性残基に突然
変異誘発され得る。ガイドラインは更に、興味ある領域の正の静電的電荷の一般
的増加を創出するために、ヘアピンループの一般的領域中の残基を欠失させるこ
とにより、ヘアピンループ領域を突然変異させることを包含する。
【００３７】 本発明は、末梢ループの塩基性または正電荷を増大させることを指向する突然
変異誘発ガイドラインに限定されないことが注目されるべきである。本発明は、
さらに、末梢ヘアピンループを塩基性の静電的電荷から酸性のものに変化させる
ことを包含する。そのようなデザイン下では、ヘアピンループ領域中のアミノ酸
置換は、突然変異誘発されたCKGFタンパク質の酸性状態または負電荷を増大させ
るデザインガイドライン下で為される。例えば、ヘアピンループ領域中の塩基性
残基は、構造領域の静電特性を変化させるために、中性または酸性残基に突然変
異誘発され得る。さらに、中性アミノ酸は、構造領域の静電特性を変化させるた
めに、酸性残基に突然変異誘発され得る。ガイドラインは、さらに、興味ある領
域の負の静電的電荷中の一般的増加を創出するために、ヘアピンループの一般的
領域中の残基を欠失することにより、ヘアピンループ領域を突然変異させること
を包含する。
【００３８】 末梢ヘアピンループ中の置換のために選択される残基は、多くのファクターを
用いて選択される。先に議論したように、標的CKGFタンパク質のアミノ酸配列中
の突然変異は、様々な異なる種の相同性CKGFタンパク質からのアミノ酸配列を比
較するアミノ酸配列整列によって、一部導かれる。
【００３９】 可能性のある突然変異誘発部位の位置は、好ましくは、末梢ループの高度に変
化する領域中にあるが、しかしながら、得られたミュータントCKGFタンパク質が
、所望の生物学的活性を有するならば、保存(conserved)領域も突然変異誘発さ
れ得る。さらに、可能性のある突然変異誘発部位は、末梢ループの溶媒にさらさ
れる残基中に位置し得る、というのも、これらの領域中の残基は、一般にアミノ
酸欠失または置換に、より耐性であると一般に考えられるからである。得られた
ミュータントCKGFタンパク質が、所望の生物学的活性を有するならば、「埋もれ
た」または溶媒にさらされないアミノ酸残基は、突然変異誘発の部位であり得る
。さらに、可能性のある突然変異誘発部位は、好ましくは、実際のヘアピンルー
プ内から選択される。にもかかわらず、突然変異誘発の可能性のある部位は、ヘ
アピンループの末梢に位置し得る。
【００４０】 本発明は、さらに、末梢ヘアピンループの静電特性を変化させる多重突然変異
の導入を包含する。
【００４１】 本発明の突然変異誘発ガイドラインは、本発明のデザインプロセスを用いて実
施される。このプロセスは、先述の標的CKGFタンパク質中の可能性のある突然変
異誘発部位の選択、および当分野で周知のコンピューターモデリング法を用いる
、これらの可能性のある突然変異部位の評価を包含する。これらの方法は、オペ
レーター者によってモデル化され、評価され、およびランク付けされるように、
サブユニット中のそれぞれの突然変異の構造および活性を予測するために使用さ
れる。可能性のある有用性を有するものとして評価される可能性のある突然変異
は、将来の使用のために貯蔵され、有害であると評価されるそれらの突然変異は
、考慮から省かれる。
【００４２】 デザインプロセスの各サイクル後に集められた情報は、CKGFサブユニットに関
する構造的および機能的データのデータベースを発展させるように付加される。
プロセスは、ミュータントCKGFのデザインを更に洗練し、分子の新規な特性を探
索するために、繰返される。
【００４３】 一旦、ミュータントCKGFサブユニットのアミノ酸配列が上記のプロセスによっ
てデザインされると、ミュータントCKGFタンパク質が作製される。当業者に周知
である標準的な分子生物学的技術が、ミュータントサブユニットをコードするポ
リヌクレオチド配列を調製するために使用される。このポリヌクレオチド配列の
調製では、全体的配列を新規に合成することにより、合成DNAを活用することが
可能である。或いは、野生型CKGFサブユニットをコードするコーディング配列を
得て、その後、部位指定突然変異誘発によりヌクレオチド置換を生じることが可
能である。得られた配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅して、周知
の容易に利用可能なクローニングベクターおよび宿主を利用して増殖される。こ
れらのベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得、宿主は、真核
または原核生物の宿主であり得る。
【００４４】 さらに、ミュータントCKGFサブユニットをコードする突然変異されたポリヌク
レオチド配列を含む発現ベクターが、作製され得る。これらの発現ベクターは、
突然変異ポリペプチド配列を好適な発現ベクターに挿入して構築され、真核また
は原核生物のような宿主に形質転換される。様々な発現ベクターが、当分野で周
知であり、容易に利用可能である。そのようなベクターは、ミュータントCKGF単
独、または融合タンパク質の形態で発現し得、そこでは、ミュータントCKGFタン
パク質および融合パートナー配列は、一般に発現ベクター内で連結される。細菌
、酵母(または他の真菌)または哺乳動物細胞が、発現構築物のための宿主として
、利用され得る。一旦、突然変異されたCKGF配列を含む発現ベクターが構築され
宿主細胞に挿入されると、ミュータントCKGFタンパク質が発現される。
【００４５】 CKGFダイマー形成は、ミュータントCKGFタンパク質の組換え発現後に、促進さ
れる。組換えタンパク質は、その天然配列として又は融合ポリペプチドとしての
いずれかで、折り畳まれ、等価物サブユニットとアセンブリーされてダイマーを
形成する。一般に、ダイマー化は、好適な条件のpH、イオン強度、温度、および
レドックス電位で、生理学的食塩水中で起こる。その後、ダイマー化された組換
えCKGFタンパク質は回収され、必要に応じて、標準的分離手順を用いて精製され
る。好適な分離手順は、クロマトグラフィーを含む。
【００４６】 少なくとも１つのミュータントサブユニットを含む、このようにして得られた
新規なミュータントCKGFタンパク質は、様々な形態で利用され得る。ミュータン
トCKGFタンパク質は、それ自身で、検出可能な形態で、固定化形態で、または薬
剤もしくは他の好適な治療剤と複合体化されて、使用され得る。新規なミュータ
ントCKGFタンパク質は、診断的、画像化、ならびに治療的手順および組成物中で
使用され得る。融合タンパク質、アナローグ、誘導体、並びにそのようなタンパ
ク質およびアナローグをコードする核酸分子、並びに、例えば、組換えDNA法に
よる上記のタンパク質およびアナローグの産生も、提供される。
【００４７】 特定の局面では、本発明は、他の場合に機能的に活性であるCKGFsのミュータ
ントサブユニットのアミノ酸配列を提供する。本明細書中で使用される「機能的
に活性な」ミュータントサブユニットは、野生型サブユニットと関連する１つ以
上の公知の機能的活性を発揮する物質を指す。これらの活性は、ホモダイマーま
たはヘテロダイマーを形成する他のサブユニットとの会合、サブユニットとして
若しくはアセンブリーされたダイマー分子としての分泌、そのレセプターへの結
合、レセプター仲介シグナル変換のトリガー、抗原性および免疫原性を含み得る
。
【００４８】 特定の実施態様では、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸、６アミノ酸、10
アミノ酸、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるCKGFsのミュータ
ントサブユニットのフラグメントを提供する。様々な実施態様では、ミュータン
トサブユニットは、突然変異したL1ループドメインおよび／または突然変異した
L3ループドメインを含むか又は実質的にそれからなる。
【００４９】 開示を明確にするために、および限定せず、本発明の詳細な説明を、以下のサ
ブセクションに分ける。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【表２】 シスチンノット成長因子の構造的特徴 前記のように、シスチンノット成長因子(CKGF)スーパーファミリーは、成長因
子の少なくとも４つのファミリー：糖タンパク質ホルモン、PDGFファミリー、ニ
ューロトロフィン、およびTGF-βファミリーを含む。上記の４つのファミリーに
属さないが、シスチンノットトポロジーおよびβヘアピンループを含む構造を有
する他のタンパク質も、CKGFスーパーファミリーのメンバーであり、本発明の範
囲内にある。
【００５２】 ４つの成長因子ファミリー中の構造的類似性は、３次元構造または代替的ファ
ミリーメンバーの溶解前に予測された。この結論は、個々のCKGFスーパーファミ
リーメンバーのポリペプチド配列中のホモロジーの欠如に基づく。にもかかわら
ず、成長因子の全ての４つのファミリーが、共通の折り畳み又はトポロジー的構
造を共有することが今日明らかである。NGF(McDonaldら、1991, Nature, 354: 4
11-414)、TGF-β2(Schluneggerら、1993, J. Mol. Biol., 231: 445-458)、PDGF
-BB(Osfnerら、1992, EMBO J., 11: 3921-3926)およびhCG(Lapthornら、1994, 3
69: 445-461)の結晶構造は、それぞれのタンパク質が、３つの保存された分子内
ジスルフィド結合の非常に類似のクラスターを含むことを明示する。さらに、CK
GFスーパーファミリーのメンバーの骨格コンホメーションは、第４ストランドの
中間にある保存された捻れ(twist)を含む、シスチンノット近くの領域で特に、
極めて類似している。
【００５３】 シスチンノット構造のシステインの比較は、解像されたシスチン構造中で同一
であるこれらのハーフ-システインの連結のみならず、これらのシステインの中
の６つのCα原子の位置もまた、容易にスーパーインポーズ可能であり、スーパ
ーファミリーの異なるメンバー中で0.5〜1.5Åの二乗平均平方根(rms)一致を生
じることを、明らかに示す。例えば、当価のCα原子の対のスーパーポジション
は、次の二乗平均平方根(rms)距離数値を生じる；NGF対PDGF-BBに関しては、0.8
8Å；PDGF-BB対TGF-β2に関しては、0.65ÅおよびNGF対TGF-β2に関しては、0.9
3Å。
【００５４】 それぞれのシスチンノット構造は、３つの保存システインが対：I-IV、II-V、
およびIII-VIになるように形態化される(第２表)。ジスルフィド結合II-Vおよび
III-VIは、それらの結合残基により環を形成し、それを介して、I-VIジスルフィ
ド結合は、同じトポロジーと共に、殆ど正しい角度で通過し、こうしてジスルフ
ィドクラスターを形成する(図１)。環サイズは、配列Cys(II)-X-Gly-X-Cys(III)
およびCys(V)-Lys-cys(VI)を有するTGF-β2およびPDGF-BB中で同一である。それ
ぞれの場合、Cys(II)とCys(III)との間のグリシンは、正のφコンホメーション
である。これは、グリシン上の側鎖の欠如とカップリングして、環を介したジス
ルフィド結合I-IVの通過を促進する。NGFでは、Cys(II)とCys(III)との間の配列
は、一連のタイトな曲がり(turn)中の９アミノ酸からなり、グリシンは、Cys(II
I)に先んずる位置で正のφコンホメーション中で起こるけれども、いずれの場合
も、より長いループは、Cys(I)-Cys(IV)結合を収容するのに充分である。
【００５５】 幾つかの一般的特徴は、構造的スーパーポジションにより提供される配列整列
から生じる。例えば、最後の２つのシステインのスペーシングは、常に、Cys V
とCys VIとの間に１個のみの残基を有するCXCであり；シスチン環のサイズは、C
ys IIとCys IIIとの間のスペーシングに依存し、それは3〜15変化する。TGF-β2
、PDGF-BB、β-NGF、およびhCGの構造中の５つのペプチド鎖中で、４つは、8員
シスチン環を有し、および１つのβ-NGFは、14員シスチン環を有する。TGF-βお
よびPDGFファミリーおよび糖タンパク質ホルモンの全てのメンバーに関する場合
のように、３つの残基のみがCys IIとCys IIIとの間にある場合、２つのシステ
イン間の中間残基は、常にグリシンであり、CXGXC(配列番号５)パターンを生じ
る。
【００５６】 シスチンノット構造は、おおよそ60×20×15Åの全体的寸法を有する、カール
したシート様の非球状形態を推定する。シートの面は、４つの不整な(irregular
)、歪んだ(distorted)逆平行のβシートによって、形成される。３つの分子内ジ
スルフィドは、疎水性コアの中心を形成し、該コアは、分子の最も硬く最も露出
されない部分である。シスチン残基に結合するβストランドループは、サイズお
よび配列変位に関して重要な範囲を示し、コアの基本的構造を妨害することなし
に、異なるレセプター結合特異性を提供する。
【００５７】 CKGFメンバータンパク質中で共有される全体的トポロジー中の類似性は、Cys(
I)とCys(II)との間、およびCys(IV)とCys(V)との間、およびよりオープンな結合
ではCys(III)とCys(VI)との間での、歪んだβヘアピンループも包含する。３つ
のループは、長さにおいて異なるけれども、特にシステインのクラスター周囲の
水素結合パターンは、極めて類似している。それぞれのメンバー中では、Cys(I)
とCys(II)周囲の逆平行ストランド間に水素結合があり、その結果、Cys(I)後の
残基(NGF中のAsp16)は、Cys(II)後の残基(NGF中のAsp59)への水素結合を作製す
る。２つのβストランド間には水素結合の伸張したβヘアピンラダーがあるが、
それらの間のループは、ファミリー中の長さ、コンホメーションおよび水素結合
パターンにおいて異なる。
【００５８】 Cys(IV)、Cys(V)およびCys(IV)周囲の逆平行βストランド間の水素結合も、類
似している。水素結合は、Cys(IV)(NGF中のTyr79)前でCys(VI)後の残基(例えば
、NGF中のVal111)の間；cys(IV)後の残基(NGF中のThr81)の間；およびCys(V)とC
ys(VI)との間にある残基(NGF中のVal109)；およびCys(IV)から３番目の残基(NGF
中のThr83)とCys(V)前のもの(NGF中のAla107)との間、に存在する。ヘアピンの
βラダーは、第１βヘアピン中よりもかなり広く、Cys(V)直前には常にβバルジ
(β-bulge)がある。NGFおよびPDGF-B中の捻れた(twisted)ヘアピンは、類似して
いるが、後者の方が長い。TGF-β2では、このヘアピンは、さらに、２つの残基(
Asn103およびMet104)の挿入によって歪み、それは、より広い範囲にわたって、
ヘアピンの折り畳みを生じる。Cys(III)とCys(IV)との間の結合は、NGF、TGF-β
2およびPDGF-BBの間で、長さにおいて異なる。PDGF-Bでは、より短いループが、
起こる。NGFでは、それは、より長いシリーズのβうねり路(β-meander)で置き
換えられ、TGF-β2では、12残基αヘリックスを含むさらにより長い結合が起こ
る。しかしながら、全ては、２つのヘアピンおよびジスルフィドクラスターを形
成するストランドの不変(fixed)のフレームワーク内に収容される。
【００５９】 CKGFスーパーファミリーのメンバーは、全てが前記の所望のものでないとして
も、最適のトポロジー的および構造的特徴を有することが示された。これらの特
徴を有する他のタンパク質も、CKGFスーパーファミリーのメンバーであると考え
られる。本明細書中に開示される、CKGFsに適用され得る合理的デザインの方法
も、それらのタンパク質に適用され得る。
【００６０】
【表３】 CKGFサブユニットの構造および機能分析 本発明は、１つ以上のミュータントサブユニットを含む新規なミュータントCK
GFタンパク質の合理的なデザインのための体系的(systematic)なアプローチも提
供する。本明細書に記載されるのは、野生型およびミュータントCKGFサブユニッ
ト、CKGFダイマーおよびCKGFアナローグの構造を分析する方法、およびこれらの
分子のインビトロ活性およびインビボでの生物学的機能を測定する方法である。
【００６１】 CKGFタンパク質中の突然変異誘発されたアミノ酸の位置を特定するための幾つ
かの配慮がある。特定の領域中の特定の残基の耐性(tolerance)を予測し、アナ
ローグ特異性または安定性における望ましくない変化を回避するための多くの配
慮もある。３次元モデリングと組合せた相同性タンパク質の配列比較は、タンパ
ク質間の構造-機能関係を解釈するのに有用な情報の豊富なソースを提供する。
【００６２】 hTSHの分子モデルは、Brookhaven Protein Data Bank(PDB)からの結晶学デー
タ由来のhCGモデルを、テンプレートとして使用して構築された。このモデルは
、必要な置換の数を限定するアナローグデザインに関する重要なリードを提供す
る。ミュータントのモデリングも、機能的データの解釈に極めて重要である。我
々は、組合せられた配列-構造に基づく予測が、アナローグで観察された機能的
変化によってしばしば証明されることを見出している。
【００６３】 デザイン配慮の中の第１は、それぞれのタンパク質が、機能的により重要な領
域(酵素のレセプター結合部位または活性部位のような)およびより重要でない領
域を含むことである。タンパク質の機能的により重要な部分中の進化の速度は、
例えば、糖タンパク質ホルモンの末梢βヘアピンループのような、機能的により
窮屈(constrained)でない部分の分子よりも、かなり短いことが、一致して見い
出されている。従って、末梢ループ中でのもののような、溶媒にさらされる残基
は、タンパク質コア内に埋もれた残基よりも、保存されていない。最も保存され
たアミノ酸の保存的変化は、最も有害になり易い。対照的に、タンパク質のより
機能的に窮屈でない部分における類似の変化は、自然選択に好まれる「ファイン
チューニング(fine-tuning)」タイプの改善を示す、より高いチャンスを有し得
る。タンパク質の全体的折り畳みは、通常は、多重アミノ酸置換の後であっても
、高度に保存されることが、一般に公知である。従って、hTSHの末梢ループ中に
位置する突然変異は、hTSHの全体的折り畳みを変化させることは予測されない。
そのような予測は、アナローグのホモロジー・モデリング、並びに「機能の獲得
」突然変異の存在によって、支持される。
【００６４】 デザイン配慮の中の第２は、糖タンパク質ホルモン・スーパーアゴニストの最
新の開発が、タンパク質進化の特定の段階で既に最大化された、活性またはレセ
プター結合特異性を有するドメインの組合せは、ヒトタンパク質アナローグを工
作する普遍的戦略を提供し得るという予測を支持することである。ヒト糖タンパ
ク質ホルモンの場合、異なる脊椎動物種中の相同性配列の大きなライブラリーか
らの置換の選択は、極めて有害で非最終的な突然変異の確率を大きく減少させる
。この観察は、異なる種からの糖タンパク質ホルモンサブユニットが、機能的に
活性なホルモンに再会合する公知の能力と一致する。
【００６５】 デザイン配慮の中の第３は、ホルモン特異性の変化が、意図された修飾の一部
でない場合、タンパク質特異性を付与することが公知の領域は、アナローグデザ
イン中で一般に回避されるべきであるということである。例えば、βサブユニッ
ト・キメラを包含する最近の研究は、「シートベルト」領域が、恐らく、異種リ
ガンド-レセプター相互作用を制限することにより、および／または複合体結合
タンパク質のコンホメーションに影響することにより、糖タンパク質ホルモン特
異性を付与するのに決定的てあることを示した。さらに、hCG/hFSHキメラの予想
外に高い甲状腺刺激活性は、特異性が、アミノ酸配列からは容易に予測され得な
いこと、および全キメラに関して実証されるべきであることを示唆する。
【００６６】 デザイン考慮の中の第４は、哺乳動物の糖タンパク質ホルモンが、低い程度の
種特異性を有することが示されたことである。例えば、哺乳動物TSHタンパク質
は、特定の魚を例外として全ての脊椎動物で、甲状腺機能を刺激することが示さ
れた。さらに、高度に精製された哺乳動物LHも、真骨魚類と遠く関連するだけの
種を含む他の種において、甲状腺刺激活性を有する。更に、我々は、異なる哺乳
動物種からのTSHレセプターを用いて、ヒトTSHのレセプター結合親和性と生物学
的活性との間の相関関係を見い出した。同様に、他の種または相同性ホルモンに
存在する残基およびドメインの導入は、多くの場合、ホルモン特異性の変化なし
に、耐性である。
【００６７】 最後に、部位指定突然変異誘発に関する主要な標的は、配列比較によって予測
され得る修飾許容ドメインである。これらのドメインは、非保存的(nonconserva
tive)アミノ酸変化の導入を可能にし、サブユニット合成またはアセンブリーを
危うくすることなしに、機能の調節を可能にする分子の領域として定義される。
重要なこととして、進化の間に多重および／または非保存的変化を受けるアミノ
酸残基の突然変異誘発は、通常は、ホルモン発現の機能損失または減少をもたら
さない。
【００６８】 CKGFミュータントをデザインするための機能獲得方法は、先ず、タンパク質合
成を危うくすることなしに、非保存的置換の導入に耐えるCKGFタンパク質の「修
飾許容ドメイン」を同定することを包含する。修飾許容ドメイン中の更なる突然
変異誘発は、増大したホルモン生物活性をもたらす置換の同定を可能にする。そ
の後の多重残基置換は、個々の残基の協調的効果を説明するのに使用され得、多
重ホルモンドメインの同時的突然変異誘発に拡大され得る。機能獲得突然変異の
同定は、１ドメイン中の修飾により生じたhTSH活性の部分的または全体的損失が
、完全に代償され得、それにより、TSHレセプターは「アナローグに誘発される
フィット」により、有意な構造的修飾を有するリガンドを収容し得ることを示す
という発見を導く。さらにシグナルを交換し得るアナローグおよびレセプターの
代替的接触ドメインを創ることさえ可能である。
【００６９】 さらに、協調的、非協調的および相互に排他的なホルモンドメインの同定は、
治療的に有用なホルモンアナローグの開発のための重要なリードを提供し得る。
そのようなアプローチを用いると、CKGFsの生物学的特性を個別に調節したり分
離することが、究極的に可能であるはずである。
【００７０】 ３次元構造および配列整列に基づく方法 CKGFサブユニットの構造を分析する方法は、ポリペプチド配列データおよび３
次元タンパク質構造データの分析に基づく。当業者は、他の生物学的データも、
分析において使用され得ることを容易に認識する。
【００７１】 タンパク質のポリペプチド配列は、タンパク質配列決定、またはタンパク質を
コードする遺伝子配列の理論的翻訳の標準的技術的のような、当業者に周知の方
法によって決定され得る。ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列は、Ge
nBankのような配列データベース中で、一般に利用可能である。Entrezのような
コンピュータープログラムが、更なる分析のために、データベースをブラウズし
、興味ある任意のアミノ酸配列および遺伝子配列データを検索するのに使用され
得る。アミノ酸配列および遺伝子配列は、受付番号により、データベースから検
索し得る。これらのデータベースはまた、FASTAおよびBLASTのようなプログラム
を用いて質問配列に様々な程度の類似性を有する配列を同定するためにサーチさ
れ得、該プログラムは、整列スコアおよび統計によって類似の配列をランクして
いる。CKGFスーパーファミリー内の異なるファミリーのメンバー間の配列類似性
の程度は低いので、質問配列を用いるサーチは、同じファミリー内のメンバーを
同定するために主として為される。
【００７２】 CKGFサブユニットのタンパク質配列は、親和性分析(Hopp, T.およびWoods, K.
, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824)を用いても、特徴付けされ
得る。親和性プロフィールは、サブユニットの疎水性および親水性領域を同定す
るために使用され得る。当業者に知られているこの情報および手順を用いると、
これらの領域をコードする対応するポリヌクレオチド配列が、続いて、決定され
得る。
【００７３】 第２の構造分析(Chou, P.およびFasman, G.、1974, Biochemistry 13: 222)も
、特異的な二次構造を推定するサブユニットの領域を同定するためにCKGFサブユ
ニットのタンパク質配列を用いて、為され得る。
【００７４】 X線結晶学(Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)およびコンピ
ューターモデリング(Fletterick, R.およびZoller, M.(編), 1986, Computer Gr
aphics and Molecular Modeling, Current Communications in Molecular Biolo
gy, Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨ
ーク)を含む構造分析の方法も、使用され得る。構造予測、結晶学データの分析
、配列整列、並びにホモロジー・モデリングは、BLAST、ConvexのためのCHARMm
リリース21.2、およびQUANTA v.3.3(Molecular Simulations, Inc.、ヨーク、英
国)のような当分野で容易に利用可能な市販されているコンピューターソフトウ
ェアを用いて、達成され得る。
【００７５】 コンピューターにアシストされる方法 CKGFサブユニットの３次元(3D)構造のコンピューターモデルは、ポリペプチド
配列データに基づき構築され得る。他のCKGFサブユニットのポリペプチド配列お
よび3D構造を含む他の情報も、コンピューターモデリング中で使用され得る。CK
GFまたはCKGFサブユニットのモデルは、シスチン残基の同じ結合性を有する分子
の３D構造を示すために構築される。
【００７６】 コンピューターモデルは、エネルギーを最小化し、疎水性、静電性、ファンデ
ルワールス、および水素結合相互作用のような分子内折り畳みを決定する力を最
適化するための、当分野で公知のソフトウェアアルゴリズムを用いて、考案され
得る。それぞれ他の原子に対する分子内の各原子の配置は、全体的なシスチンノ
ットトポロジーに一致するように最適化される。最適化プロセスは、コンピュー
ターソフトウェアおよび／または熟練したオペレーター者によって、自動的に形
成され得る。トポロジー内の水素結合およびストランドコンホメーションの様々
な比較は、インテラクティブコンピューターグラフィックスディスプレーシステ
ムの援助を得て為され得る。
【００７７】 現在、2.0Åまたはそれ以上の解像度で測定されるCKGFサブユニットの少なく
とも５つのタンパク質構造が、公に利用可能である。これら及び他のCKGFsの構
造は、X線結晶学、中性子回折、および核磁気共鳴(NMR)のような技術を用いて、
測定または洗練され得る。
【００７８】 X線結晶学による構造決定は、タンパク質に関するデータのファイルを生み出
す。Brookhaven Protein Data Bank(BPDB)は、タンパク質構造情報の貯蔵所を例
示し、それは、ニューヨーク州ロングアイランド、アップトンにある、Brookhav
en National Laboratoryによって作成され補充される。下記のデータを暗示的に
または明示的に含む任意の他のデータベースは、本明細書に記載される方法と関
連して有用である：(1)それぞれのポリペプチド鎖のアミノ酸配列；(2)ジスルフ
ィドの結合性；(3)任意の補欠分子族(prothetic group)の名称および結合性；(4
)それぞれの観察されるコンフィギュレーション中の各原子の座標(x, y, z)；(5
)各原子のフラクション占有；および(6)原子の温度ファクター。座標が決定され
る、各原子に関する少なくとも１つの記録がある。座標は、長方形のデカルト格
子上に、オングストローム単位(100,000,000=1 cm)で示される。タンパク質の幾
つかの部分は、１以上の空間的コンフィギュレーションを採り得るので、幾つか
の原子に関して２以上の座標があり得る。そのような場合、フラクション占有は
、それぞれの代替的位置に関して報告される。X線結晶学データは、温度または"
Debye-Waller"ファクターとして示される原子運動の推定を示し得る。
【００７９】 タンパク質座標は、結晶のタンパク質に関して最も一般的に測定されるけれど
も、タンパク質の溶解構造がマイナーな詳細においてのみ、結晶構造から異なる
ことが、現在、一般に受け入れられている。従って、原子の座標を与えられると
、それぞれの原子の溶媒許容性を計算し得る。分子の表面許容性も測定され得、
溶媒と接触する疎水性残基に基づくスコアが測定され得る。さらに、座標は、タ
ンパク質全体を通して、電荷分布を暗示的に示す。これは、ミュータントサブユ
ニットが、折り畳み、および／または会合してダイマーを形成するかどうか推定
するのに有用である。
【００８０】 本発明の合理的なデザインプロセスの特定の工程は、アミノ酸配列、構造デー
タベース、並びに配列比較および構造モデリングを行なうのに使用される様々な
アプリケーションプログラムを貯蔵可能なストレージデバイスを有する慣用され
ているコンピューターシステム上で、為される。インテラクティブコンピュータ
ーグラフィックスディスプレーシステムは、本発明のデザインプロセス中で評価
される化学的構造を、オペレーター者が視ることを可能にする。グラフィックス
およびソフトウェアプログラムは、野生型およびミュータントサブユニットをモ
デルし、候補をランクするために、使用される。
【００８１】 例えば、コンピューターグラフィックスインテラクティブディスプレーシステ
ムは、オペレーター者に、CKGFファミリーのメンバーの１つ以上の構造または部
分的構造を視覚的にディスプレーすることを可能にする。複数のポリペプチド鎖
およびアミノ酸の側鎖の視覚的表示は、望まれるように操作されスーパーインポ
ーズされ得、それは、構造的デザインプロセスを行なう能力を増加させる。コン
ピューターグラフィックスディスプレーシステムは、ズーミング、クリッピング
、強度深度クーイング(intensity depth queuing)のような、それに限定されな
い１セットの機能(そこでは、ビューアーからさらに遠い対象物がダイマーにさ
れて、イメージがディスプレーされる所望の深度効果を提供する)；座標システ
ムの３つの軸の何れかにおいてイメージの翻訳および回転を行ない得る。本発明
は、他のコンピュータープログラム、作動システムおよびプログラム原語を用い
て行われ得る。任意の好適なタイプのソフトウェアおよびハードウェアは、これ
らの分子の構造のコンピューター表示をディスプレーおよび操作するために、使
用され得る。
【００８２】 コンピュータープログラムは、野生型およびミュータント構造のそれぞれに関
するエネルギーを計算し、エネルギーを最小にするために理論的構造物中に局所
的調節物を作製するために、利用され得る。最後に、プログラムは、分子の不安
定な部分を同定し、ミュータントCKGFダイマーの形成(他のサブユニットの構造
は、ヘテロダイマーに関して要求され得る)およびミュータントCKGFダイマーの
そのレセプターへの結合(レセプターの構造が、既存のデータから決定または予
測可能である場合)を刺激するように、使用され得る。
【００８３】 データベースからの構造的データは、３次元対象物を確定する。CKGFスーパー
ファミリーの多くのメンバーのために、シスチンノットの３つのジスルフィド結
合の形成に関与するシステイン残基が同定された。そのような情報が公知でない
場合、シスチンノットを形成するシステイン残基は、分子中のシステイン残基の
体系的な突然変異誘発によって、容易に同定され得る。
【００８４】 一旦、シスチンノットを形成するシステイン残基の全てが同定されると、CKGF
サブユニットのこれらの残基は、他のCKGFsのものと共に整列され、ポリペプチ
ドのどのセグメントがCKGFサブユニット中のβヘアピンL1およびL3ループを最も
好ましく形成するかが予測され得る。
【００８５】 最小自乗分析が、１つのCKGFサブユニットからの原子を、他からの原子に適合
させるよう適用される。この最小自乗適合は、空間中の２つの３次元対象物をス
ーパーインポーズする自由度を可能にする。もし、二乗平均平方根(RMS)エラー
が、幾つかのプリセット閾値より小さいなら、その構造は、考慮されるモデルに
関して優れた適合である。プロセス中の最終工程は、もっともらしいものからも
っともらしくないものへ、もっともらしい候補をランキングし、熟練したオペレ
ーター者および／または専門のコンピューターシステムにより利用される基準に
基づき、もっともらしいとは見えないそれらの候補を排除することを包含する。
【００８６】 例えば、水素結合は、CysIV前の残基とcysVIとの間；cysIV後の残基と、cysV
とcysVIIの間の残基との間；CysIVから沿って第３残基とcysVの前のものとの間
、に存在することが好ましい。エキスパート者は、CKGFサブユニットのヒト構造
物の視覚的比較、および構造物の可能な／最適な予測をランキングすることによ
りコンピューターモデルを洗練することが好ましい。
【００８７】 置換、挿入、または欠失のための候補は、オペレーター者に提供され、その者
は、コンピューターグラフィックスディスプレーシステムを利用して、それらを
３次元でディスプレーする。オペレーター者は続いて、全体的シスチンノットト
ポロジーおよびレセプター結合に関する変化したアミノ酸残基の、タンパク質の
化学的および物理的関係に関する知識に基づいて、候補についての決定を下し得
る。この分析は、最も最適／もっともらしいものから、最も最適／もっともらし
くないものへ、候補をランク付けするのに使用され得る。これらのランキングに
基づき、最も最適な候補が、部位指定突然変異誘発および産生に関して選択され
得る。先のモデリングおよび／または実際の遺伝子工学実験から引き出された先
の経験に基づき、ランキング選択の作成および候補排除をすることにおいて、コ
ンピューターはオペレーター者をアシストすることも望ましい。
【００８８】 ミュータントCKGFの任意の原子が、最小に可能な分離よりも、天然タンパク質
構造の任意の保持された原子により近くなる場合、候補は拒否され得る。例えば
、最小に可能な分離は、2.0オングストロームでセットされ得た。任意の他の数
値が選択され得ることに注目のこと。この工程は、所望ならば、オペレーター者
が、この排除プロセスを手動で行なわないように、自動化され得る。
【００８９】 候補は、疎水性残基が、溶媒に高度の露出を有する場合、ペナルティー適用さ
れ得る。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシ
ン、メチオニン、およびバリンの側鎖は、疎水性である。
【００９０】 候補は、親水性残基が、溶媒に低度の露出を有する場合、ペナルティー適用さ
れ得る。セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、
グルタミン、リシン、アルギニン、およびプロリンの側鎖は、親水性である。
【００９１】 候補は、得られたミュータントポリペプチドが、６個のシステイン近くの残基
間に存在する水素結合を形成し得ない、または任意の６個のシステイン間のジス
ルフィド結合を崩壊させる傾向がある水素結合を形成する場合、ペナルティー適
用され得る。
【００９２】 他のデザインルールは、ミュータントポリペプチドに沿った望ましくない位置
で、立体配置的にバルキーな側鎖を有する候補にペナルティー適用する。さらに
、バルキーな側鎖を余りバルキーでないもので置換することによって、バルキー
な側鎖を有する候補をスイッチすることが可能である。例えば、側鎖は、ロイシ
ンまたはイソロイシンのようなバルキーな置換基を有し、可能性のあるデザイン
工程は、このアミノ酸を、最もバルキーでない側鎖であるグリシンで置換する。
【００９３】 他のルールおよび／または基準は、選択プロセスにおいて利用され得、本発明
は議論されたルールおよび／または基準に限定されない。
【００９４】 このように、本発明のトポロジーに基づくアプローチおよび方法は、ランダム
選択プロセスを用いて得られるであろうよりも、増大した生物活性を有する非常
に増大された確率を有するミュータントCKGFsを工作するために、利用され得る
。これは、作製されテストされなければならない候補の数が減少するので、所望
のミュータントを作製する遺伝子工学的局面が有意に減少することを意味する。
最ももっともらしい候補は、実際の分子を遺伝子的に工作するために使用され得
る。
【００９５】 糖タンパク質ホルモンのミュータント 下記でより充分に詳論されるように、本発明の１つの局面は、αおよび／また
はβサブユニットのβヘアピンL1ループおよびβヘアピンL3ループ内に位置する
アミノ酸位置で突然変異を有する少なくとも１つのサブユニットを含む糖タンパ
ク質ホルモンであるCKGFsを提供する。本発明に関連して、糖タンパク質ホルモ
ンβサブユニットは、hCGβサブユニット、LHβサブユニット、FSHβサブユニッ
トおよびTSHβサブユニットを含む。
【００９６】 ミュータントサブユニットは、１つのサブユニット内の個々の突然変異を組合
せ、ミュータントサブユニットを複合化することによって二重のミュータントヘ
テロダイマーを作製して、作製され得る。特に、本発明者は、ミュータントαお
よびミュータントβのミュータントサブユニットを含むヘテロダイマーをデザイ
ンし、そこでは、ミュータントサブユニットは、特定のドメイン中に突然変異を
有する。これらのドメインは、共通αサブユニットのβヘアピンL1ループおよび
L3ループ(図２に示されるように)、および糖タンパク質ホルモンβサブユニット
のβヘアピンL1ループおよびL3ループを含む。１つの実施態様では、本発明は、
ミュータントαサブユニット、ミュータントTSHβサブユニット、ミュータントh
CGβサブユニット、並びに１つのミュータントαサブユニットまたは１つのミュ
ータントβサブユニットのいずれかを含むTSHおよびhCGヘテロダイマーを提供し
、そこでは、ミュータントαサブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、
好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近く
に位置して含み、および、ミュータントβサブユニットは、１つ又は複数のアミ
ノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ
内または近くに位置して含む。好ましくは、これらの突然変異は、ミュータント
サブユニットを含む糖タンパク質ホルモンヘテロダイマーの生物活性を増加し、
ミュータントサブユニットを有するTSHヘテロダイマーは、野生型TSHヘテロダイ
マーに対して血清半減期を増大させるように修飾もされた。
【００９７】 αサブユニットは、５つのジスルフィド結合を含み、そのうちの３つ、Cys10-
Cys60、Cys28-Cys82、およびCys32-Cys84は、ノットされたコンフィギュレーシ
ョンを採る(第２表)。残基40および47間に位置する短い３つの曲がり(turn)のα
ヘリックスを除いて、αサブユニット中の二次構造の殆どは、不整(irregular)
なβストランドおよびβヘアピンループである。βサブユニットは、６つのジス
ルフィド結合を含む；その中で、Cys9-Cys57、Cys34-Cys88、およびCys38-Cys90
は、トポロジカルなシスチンノットを形成する。
【００９８】 ダイマー化は、Lapthornら(Lapthornら、1994, Nature, 369:455-61)によると
、トータルで4525平方オングストロームの表面積、およびWuら(1994, Structure
, 2:545-58)によると、3860Å２を埋める。
【００９９】 本発明者は、ヒトαサブユニットのL1およびL3βヘアピンループ領域(図２(配
列番号１)に示されるように)の静電的電荷を変化させる１つ以上のアミノ酸置換
が、野生型形態の分子と比較して、ミュータントタンパク質の生物活性の増加を
生じることも見い出した。１つの実施態様では、リシンまたはアルギニンのよう
な塩基性アミノ酸、より好ましくはアルギニンの置換は、野生型TSHに比較してT
SHの生物活性を増加する。
【０１００】 他の実施態様では、本発明は、図３に示される(配列番号２)ように、６位でア
ミノ酸置換を有するミュータントTSHβサブユニットであるミュータントCKGFサ
ブユニットを提供する。本発明は、図４に示される(配列番号３)ように、75およ
び／または77位でアミノ酸置換を有するミュータントhCGβサブユニットである
ミュータントCKGFサブユニットも提供する。
【０１０１】 好ましい実施態様では、本発明は、上記のミュータント糖タンパク質ホルモン
αおよび／またはβサブユニットの少なくとも１つを含む、ミュータントhCGま
たはミュータントTSHのようなヘテロダイマー性糖タンパク質ホルモンであるミ
ュータントCKGFを提供する。
【０１０２】 本発明に従うと、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニット
のβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含むミュータントβサブユニット
は、CTEPに対してそのカルボキシル末端で融合され得る。そのようなミュータン
トβサブユニット-CTEPサブユニットは、同時発現および／または野生型もしく
はミュータントαサブユニットとアセンブリーされて、野生型TSHよりも大きい
生物活性および血清半減期を有する機能的TSHヘテロダイマーを形成し得る。
【０１０３】 他の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニッ
トのβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含むミュータントβサブユニッ
ト、および１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはαサブユニットのβヘア
ピンL1ループ内または近くに位置して含むミュータントαサブユニットが融合さ
れ、一本鎖TSHアナローグを形成する。そのようなミュータントβサブユニット-
ミュータントαサブユニットの融合物は、野生型TSHよりも大きい生物活性およ
び血清半減期を有する。
【０１０４】 更に他の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユ
ニットのβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含み、更にカルボキシル末
端にCTEPを含むミュータントβサブユニット、および１つ又は複数のアミノ酸置
換を、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近くに位置して
含むミュータントαサブユニットが融合され、一本鎖TSHアナローグを形成する
。
【０１０５】 共通αサブユニットのミュータント 糖タンパク質ホルモンの共通ヒトαサブユニットは、92アミノ酸を含む。この
アミノ酸配列は、10個のハーフ-システイン残基を含み、その全てはジスルフィ
ド結合である。本発明は、ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのミュー
タントに関し、そこでは、サブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好
ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近くに位置して含む。図
２に示されるように8-30位置から始まる、αL1ループ内または近くに位置するア
ミノ酸残基は、レセプター結合およびシグナル変換を発生させるのに重要である
ことが見い出されている。11-22位でのもののように、αL1ループ内に位置する
アミノ酸残基は、ヒト科を除く全ての脊椎動物で塩基性残基のクラスターを形成
し、レセプター結合およびシグナル変換を増進する能力を有する。
【０１０６】 本発明に従うと、ミュータントαサブユニットは、野生型タンパク質において
、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有す
る。
【０１０７】 ヒト糖タンパク質βサブユニットのミュータント ヒト糖タンパク質ホルモンのβサブユニット中のアミノ酸の数は、図６(配列
番号５)に示されるFSH中の109から、図４(配列番号３)に示されるhCG中の140ア
ミノ酸の範囲である。本発明は、TSH、CG、LHおよびFSHを含むヒト糖タンパク質
のβサブユニットのミュータントに関し、そこでは、これらのタンパク質ホルモ
ンの１つのミュータントサブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ま
しくはβサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位
置して含み、そこでは、そのようなミュータントβサブユニットは、hCGのよう
な別のヒト糖タンパク質のβサブユニットのCTEPに融合されるか、又は22位置で
アミノ酸置換を有する(図２に示される(配列番号１)ように)ミュータントαサブ
ユニットを有するCKGFヘテロダイマーの一部である、またはαサブユニット-β
サブユニット融合物である。本発明のミュータントβサブユニットは、野生型サ
ブユニットと比較して、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、
欠失または挿入を有する。
【０１０８】 PDGFファミリーのミュータント 血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉起源の細胞に関する主要なマイトジェン因
子である。それは、発生および胚形成の間、線維芽細胞および平滑筋細胞の増殖
および分化を促進する。それは、傷治癒の間、炎症細胞に関する走化性試薬とし
ても機能する(Heldin, 1992, EMBO J., 11:4251-59)。PDGF遺伝子の２つの形態
である、PDGF-AおよびPDGF-Bが発現され、ダイマー性成長因子の３つのイソ型、
PDGF-AA、PDGF-AB、およびPDGF-BBを生じる。PDGFファミリーの他のメンバーは
、血管内皮成長因子(VEGF)およびp28ｖ−ｓｉｓのv-sisオンコジーン産物、αお
よびβPDGFレセプターの両方に結合し活性化するサル肉腫ウイルス(SSV)のトラ
ンスフォーミングタンパク質(LeeおよびDonoghue, 1991, J. Cell. Biol., 113: 361-70)を含む。
【０１０９】 Oefnerら(1992, EMBO J. 11: 3921-26)は、ヒト血小板由来成長因子の成熟ホ
モダイマー性イソ型、PDGF-BBの結晶構造を、3.0-Å解像度で決定した。シスチ
ンノット構造は、109アミノ酸を含み、４つの不整な逆平行βストランドおよび1
7残基N末端テールからなる。８つのジスルフィド結合されたシステインのうちの
６つ、Cys16-Cys60、Cys49-Cys97、およびCys53-Cys99は、ノットされたアレン
ジメントを形成し、２つ、Cys43-Cys52は、２つの鎖内ジスルフィド結合を形成
する(第２表)。４ストランドのβシートの縁は、ダイマーを形成し、それは、β
シートの最初の２つのストランドおよびN末端テール間であるサブユニット間接
触の大部分を生じる。埋もれたトータルの表面積は、2200平方オングストローム
であると推定され、埋もれた残基の殆どは、天然には疎水性である。
【０１１０】 血小板由来成長因子(PDGF)ファミリーは、図７−９(配列番号６−８)に示され
るように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成される。しばしば、こ
のファミリーのタンパク質の活性形態は、ダイマー、ホモもしくはヘテロダイマ
ーのいずれかである。本発明は、これらのタンパク質のモノマー性サブユニット
中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモノマーは、１つ又は複数のアミ
ノ酸置換を、好ましくはβヘアピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含
む。ヘアピンループの構造を変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプタ
ーとの間の静電的相互作用が増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の
突然変異も、包含される。融合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニッ
トも、本発明に包含される。本発明のミュータントPDGFモノマーは、野生型サブ
ユニットと比較したとき、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠
失または挿入を有する。
【０１１１】 ニューロトロフィンファミリーのミュータント ニューロトロフィンは、末梢神経系(PNS)および中枢神経系(CNS)の両方で特定
のニューロンの発生および生存をコントロールする成長因子のファミリーを示す
。このファミリーのメンバーは、神経成長因子(NGF)(Levi-Montalcini, 1987, E
MBO J. 6: 1145-54)、脳由来神経栄養因子(BDNF)(Hohnら、1990, Nature, 344:
339-41;およびLeibrockら、1989, Nature, 341: 149-52)、ニューロトロフィン-
3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-4)、およびニューロトロフィン-5(NT-5)(Ba
rde, 1989, Neuron, 2: 1525-34; Berkemeierら、1991, Neuron, 7: 857-66; お
よびHallbookら、1991, Neuron, 6: 845-58)を含む。
【０１１２】 ニューロトロフィンファミリーのプロトタイプメンバー、β-NGFのシスチンノ
ット構造は、第１と第２ストランド間に２つのより短いストランドの挿入を有す
る、４つの不整な逆平行βストランド(McDonaldら、1991, Nature, 354: 411-14
；およびHollandら、1994, J. Mol. Biol. 239: 385-400)から主としてなる。分
子の全体的寸法は、おおよそ、60×25×25Åである。各モノマー中の６つのシス
テインは、全てのβストランドの一端でクラスター化されたノットされたジスル
フィド結合(Cys15-Cys80、Cys58-Cys108、およびCys68-Cys110、第２表を参照)
を形成する。ダイマーは、トータル2300平方オングストロームの表面積を埋めて
いる、４ストランドのβシートの２つの平たい面の間で形成される。界面は、非
常に疎水性のものとして特徴付けられる。
【０１１３】 ニューロトロフィンファミリーは、図１０−１３(配列番号９−１２)に示され
るように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成される。しばしば、こ
のファミリーのタンパク質の活性形態は、ダイマー、ホモもしくはヘテロダイマ
ーのいずれかである。本発明は、これらのタンパク質のモノマー性サブユニット
中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモノマーは、１つ又は複数のアミ
ノ酸置換を、好ましくはβヘアピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含
む。ヘアピンループの構造を変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプタ
ーとの間の静電的相互作用が増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の
突然変異も、包含される。融合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニッ
トも、本発明に包含される。本発明のミュータントニューロトロフィンモノマー
は、野生型サブユニットと比較したとき、１、２、３、４またはそれ以上のアミ
ノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１１４】 TGF-βファミリーのミュータント TGF-βファミリーは、それらの成熟アミノ酸配列中で少なくとも25%の配列同
一性を共有する１セットの成長因子からなる。この遺伝子ファミリー中のメンバ
ーは、トランスフォーミング成長因子、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4お
よびTGF-β5(Assoanら、1983, J. Biol. Chem., 258: 7155-60; Cheifetzら、19
87, Cell, 48: 409-15; Derynckら、1988, EMBO J., 7: 3737-43; Jakowlewら、
1988, J. Mol. Biol., 239; 385-400; Jakowlewら、1988, Mol. Endocrinol, 2:
1186-95; Kondaiahら、1990, J. Biol. Chem., 265: 1089-93; およびTen Dikj
eら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 85: 4715-19)；インヒビンおよび
アクチビン(インヒビンA、インヒビンB、アクチビンA、およびアクチビンB)(For
ageら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83: 301-95; Lingら、1986, Natu
re, 321: 779-82; Masonら、1985, Nature, 318: 659-63;およびValeら、1986,
Nature, 321: 776-79)；骨形態形成タンパク質(bone morphogenic proteins)、B
MP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびBMP-7(Celesteら、1990, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 87: 9843-47; Ozkaynakら、1992, J. Biol. Chem., 267: 25
220-27;およびWozneyら、1988, Science, 242: 1528-34)；デカペンタプレジッ
ク遺伝子コンプレックス(decapentaplegic gene complex)、DPP-C(Padgettら、1
987, Nature, 325: 81-84)；Vgl(WeeksおよびMelton, 1987, Cell, 51: 861-67)
; vgr-1(Lyonsら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 4554-58)；Muller
ian阻害物質(MIS)(Cateら、1986, Cell, 45: 685-98)；成長分化因子、GDF-1(Le
e, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 88: 4250-54)；およびドルサリン-1(
dorsalin-1)、dsl-1(Centrellaら、1988, FASEB J., 2: 3066-73)を含むが、そ
れらに限定されない。このファミリー中の殆どのタンパク質は、ホモもしくはヘ
テロダイマーとして存在する。
【０１１５】 細胞増殖および調節におけるTGF-βの種々の生物学的活性は、(a)後期G1期の
間に細胞サイクルを妨害し、DNA合成の導入およびS期への進行を妨げるその能力
(Thompsonら、1989, J. Cell. Biol., 108: 661-69; Centrellaら、1988, FASEB
J. 2: 3066-73; およびHeineら、1987, J. Cell Biol., 105: 2861-76)、(b)細
胞蓄積、ならびにタイプI、III、IVおよびVコラーゲン；テナスチン(tenascin)
；およびエラスチンを含む細胞外マトリックス成分へのそれらの反応(Liuおよび
Davidson, 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun., 154: 895-901; Pearsonら
、1988, EMBO J., 7: 2677-81; およびVargaら、1987: Biochem J., 247: 597-6
04)、および(c)他の成長因子、例えば、PDGFの分泌を調節することによる細胞成
長の促進または阻害(Robertsら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 119
-23)を含む。
【０１１６】 TGF-β2のシスチンノット構造は、４つの不整な逆平行βストランドおよび第
２と第３ストランド間の11残基のαヘリックスから主としてなる。各モノマー中
の９個のシスチンのうち、８個は、４つの鎖内ジスルフィドを形成する。３つの
鎖内ジスルフィド結合Cys15-Cys78、Cys44-Cys109、およびCys48-Cys111は、ト
ポロジカルなシスチンノットを明示し、そこでは、Cys15-Cys78ジスルフィドは
、連結ポリペプチド骨格である残基44-48および109-111と共に、Cys44-Cys109お
よびCys48-Cys11ジスルフィドによって結合された環を通って通過する。
【０１１７】 ２つのモノマーは、βシートの末端近くの残基に対してパックされた長いヘリ
ックス(残基58-68)上の残基と共に、ヘッドからテールへのダイマーを形成する
。TGF-β2成長因子は、ジスルフィド連結されたダイマーとして存在し、そこで
は、各モノマーの全体的寸法は、60×20×15Åである。
【０１１８】 トランスフォーミング成長因子-βファミリーは、図１４−４２(配列番号１３
−４１)に示されるように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成され
る。しばしば、TGF-βファミリーのタンパク質のメンバーの活性形態は、ダイマ
ー、ホモもしくはヘテロダイマーのいずれかである。本発明は、これらのタンパ
ク質のモノマー性サブユニット中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモ
ノマーは、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を、好ましくはβヘ
アピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含む。ヘアピンループの構造を
変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプターとの間の静電的相互作用が
増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の突然変異も、包含される。融
合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニットも、本発明に包含される。
本発明のミュータントTGF-βモノマーは、野生型サブユニットと比較したとき、
１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する
。
【０１１９】 ミュータントCKGFおよびアナローグをコードするポリヌクレオチド 本発明は、CKGFsのミュータントサブユニットおよびCKGFアナローグをコード
するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関し、そこでは、野生型CKGFに対
して１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失および置換を生じる少なくとも１つの
塩基の挿入、欠失または置換、あるいはそれらの組合せを含む。本明細書で使用
されるとき、２つのコーディング領域が融合されると言われるとき、１つの核酸
分子の3'末端は、他の核酸分子の5'末端に連結されて、その結果、１つの核酸分
子のコーディング領域から他へと、フレームシフトなしに翻訳が進む。
【０１２０】 ヌクレオチド・コーディング配列の同義性により、ミュータントサブユニット
に関する同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列は、本発明の実践において
使用され得る。これらは、配列内で同じアミノ酸残基をコードする異なるコドン
の置換によって変化され、その結果、サイレントな変化を生じる、CKGFサブユニ
ットのコーディング領域の全部または部分を含むヌクレオチド配列を含むが、そ
れらに限定されない。
【０１２１】 更に他の実施態様では、本発明は、一本鎖の糖タンパク質ホルモンアナローグ
をコードする配列を含む核酸分子を提供し、そこでは、１つ又は複数のアミノ酸
置換を、好ましくは共通のαサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ルー
プ内または近くに位置して含むミュータントαサブユニットのコーディング領域
は、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL1
および／またはL3ループ内または近くに位置して含むミュータント糖タンパク質
ホルモンβサブユニットのコーディング領域に融合される。さらに、一本鎖糖タ
ンパク質ホルモンアナローグをコードする核酸分子も提供され、そこでは、ミュ
ータント糖タンパク質ホルモンβサブユニットのカルボキシル末端は、hCGのβ
サブユニットのCTEPを介してミュータント共通αサブユニットのアミノ末端に連
結される。好ましい実施態様では、核酸分子は、一本鎖糖タンパク質ホルモンア
ナローグをコードし、そこでは、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末
端はCTEPのアミノ末端に共有結合的に結合され、CTEPのカルボキシル末端は、シ
グナルペプチド無しに、ミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結合的
に結合される。
【０１２２】 本発明の一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグは、ミュータントαおよびβ
サブユニットをコードする核酸配列を、当分野で公知の方法によって、適切なコ
ーディングフレームで互いに連結し、当分野で公知の方法により融合タンパク質
を発現することによって、作製され得る。或いは、そのような融合タンパク質は
、ペプチドシンセサイザーを使用するタンパク質合成技術によって作製され得る
。
【０１２３】 本発明のミュータントサブユニット、ミュータントダイマー、一本鎖糖タンパ
ク質ホルモンアナローグの作製および使用は、本発明の範囲内にある。
【０１２４】 CKGF遺伝子クローニング CKGFサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、生物学的クローンの「ラ
イブラリー」によって示されるように、クローン化されたDNAのソースから、化
学的合成により、cDNAクローニングにより、または所望の細胞タイプから精製さ
れたゲノムDNAのクローニングによって、標準的手順によって得ることができる
。これらの手順を行なうための有用な方法は、Sambrookら、Molecular Cloning, A laboratory Manual , 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press、コー
ルドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)；およびGlover, M.D.(編)、DNA Cloning: A Practical Approach , MRL Press, Ltd., オックスフォード、英国(1
985)に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ゲノムまたはcDNAライ
ブラリー中のCKGFサブユニットをコードする配列を増幅するために、使用され得
る。合成オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドテンプレートのソースとして
、RNAまたはDNA、好ましくはcDNAライブラリーを用いて、PCRプロトコール中で
プライマーとして利用され得る。増幅されるDNAは、任意のヒトからのcDNAまた
はゲノムDNA含み得る。CKGFサブユニットのセグメントをコードするポリヌクレ
オチドの成功した単離または増幅の後、そのセグメントは、分子的にクローン化
され、配列決定され、完全なcDNAまたはゲノムクローンを単離するプローブとし
て利用され得る。これは、続いて、CKGFをコードするポリヌクレオチドのヌクレ
オチド配列の特徴付け、および機能的分析および／または治療的もしくは診断的
使用のためのCKGFタンパク質の産生を可能にする。
【０１２５】 サブユニットに関するコーディング領域を単離する代替物は、公開された配列
からの遺伝子配列それ自身を化学的に合成することを含む。他の方法が可能であ
り、本発明の範囲にある。上記の方法は、それによってホルモンサブユニットの
ミュータントが得られ得る方法の、下記の一般的説明を限定することを意味しな
い。
【０１２６】 同定され単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子配列の増幅のために、適切な
クローニングベクター中に挿入され得る。当分野で公知の多くのベクター-宿主
システムが、この目的のために使用され得る。可能なベクターは、プラスミドま
たは修飾されたウイルスを含むが、それに限定されない。勿論、ベクターシステ
ムは、これらの手順で使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのよ
うなベクターは、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322もしくはpU
Cプラスミド誘導体のようなプラスミドあるいはpBLUESCRIPTベクター(Stratagen
e)を含むが、それらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば
、相補性の付着末端を有するクローニングベクターにDNAフラグメントを連結す
ることによって、達成され得る。しかしながら、DNAをフラグメント化するのに
使用される相補性制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、DNA
分子の末端は、酵素的に修飾され得る。或いは、任意の所望の部位は、ヌクレオ
チド配列(リンカー)をDNA末端上に連結することによって作製され得る；これら
の連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含み得る。代替的方法では、開裂され
たベクターおよびミュータントサブユニット遺伝子は、ホモポリマー製テーリン
グによって修飾され得る。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感
染またはエレクトロポレーションを介して宿主細胞に導入され得、その結果、遺
伝子配列の多くのコピーが生成され得る。
【０１２７】 代替的方法では、所望の遺伝子が、「ショットガン」アプローチにおいて、好
適なクローニングベクターへの挿入後に、同定され単離され得る。例えば、サイ
ズ分画による、所望の遺伝子の豊富化は、クローニングベクターに挿入する前に
、為され得る。
【０１２８】 特定の実施態様では、ミュータントサブユニット遺伝子、cDNA、または合成DN
A配列を含む組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数コピーの
生成を可能にする。従って、CKGFをコードするポリヌクレオチドは、形質転換体
を増殖させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要な場合、単離された
組換えDNAから挿入遺伝子を回収することによって、多量に得られ得る。遺伝子
のコピーは、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマーおよびCKGF
アナローグの構造および機能を研究するための突然変異誘発実験において、使用
される。
【０１２９】 突然変異誘発 本発明のミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマー、アナローグ
、フラグメントおよび誘導体中に存在する突然変異は、当分野で公知の様々な方
法によって作製され得る。それらの作製をもたらす操作は、遺伝子またはタンパ
ク質レベルで起こり得る。例えば、サブユニットのクローン化されたコーディン
グ領域は、当分野で公知の多くの戦略のいずれかによって修飾され得る(Sambroo
kら、1990、Molecular Cloning, A laboratory Manual, 第２版, Cold Spring H
arbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)。ポリヌクレ
オチド配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて、好適な部位で開裂され、続い
て、さらに所望ならば酵素的修飾が為され、単離され、インビトロで連結され得
る。ミュータントサブユニットの作製では、修飾遺伝子が同じ翻訳リーディング
フレーム内に残り、サブユニットがコードされる遺伝子領域中の翻訳停止シグナ
ルによって妨害されないように、注意が払われなければならない。
【０１３０】 さらに、サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、インビトロまた
はインビボで突然変異され、コーディング領域中の変位を創出し(例えば、アミ
ノ酸置換)、および／または翻訳、開始、および／または停止配列を創出および
／または破壊し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成また
は既存のものを破壊して、さらにインビトロでの修飾を促進し得る。当分野で公
知の突然変異誘発のための任意の技術が使用され得、化学的突然変異誘発、イン
ビトロ部位指定突然変異誘発(Hutchinson, C.ら、1978, J. Biol. Chem 253: 65
51)、PCRに基づくオーバーラップ伸張(Hoら、1998, Gene 77: 51-59)、PCRに基
づくメガプライマー突然変異誘発(Sarkarら、1990, Biotechniques, 8: 404-407
)、または類似の方法を含むが、それらに限定されない。突然変異の存在は、二
本鎖ジデオキシDNA配列決定によって確認され得る。
【０１３１】 サブユニット内の１つ以上のアミノ酸残基は、好ましくは異なる特異性を有す
る別のアミノ酸によって置換されて、或る範囲の機能的な差異を生じ得る。配列
内のアミノ酸に関する置換は、それにアミノ酸が属する異なるクラスのメンバー
から選択され得る。非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン
を含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チ
ロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した(塩基性)アミノ
酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した(酸性)アミノ
酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【０１３２】 ミュータントサブユニット配列の操作は、タンパク質レベルでも為され得る。
本発明の範囲に含まれるのは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、
アミド化、公知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解性開裂、抗体分子また
は他の細胞性リガンドへの連結による誘導体化による、翻訳の間または後で区別
的に修飾される、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマー、CKGF
アナローグである。任意の多くの化学的修飾が、公知の技術によって為され得、
それには、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアー
ゼ、NaBH４による特異的な化学的開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；
またはツニカマイシンの存在下での代謝的合成を含むが、それらに限定されない
。
【０１３３】 さらに、ミュータントCKGFサブユニットおよびアナローグは、化学的に合成さ
れ得る。例えば、所望の突然変異されたドメインを含むミュータントサブユニッ
トの一部に対応するペプチドが、自動化されたペプチドシンセサイザーを用いて
、合成され得る。必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナロ
ーグが、ミュータントサブユニット配列への置換または付加として導入され得る
。非古典的アミノ酸は、共通アミノ酸のD-異性体、αアミノイソ酪酸、4-アミノ
酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミ
ノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、
ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシ
ン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、βアラニ
ン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Cαメ
チルアミノ酸、Nαメチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナローグを含む
が、それらに限定されない。さらに、アミノ酸は、D(右旋性)またはL(左旋性)で
あり得る。
【０１３４】 ミュータントCKGFをコードするポリヌクレオチドの発現 CKGFのミュータントサブユニットまたは機能的に活性なアナローグもしくはそ
の他の誘導体をコードするポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターに挿入
され得る。本発明に関連して、好適な発現ベクターは、挿入されたタンパク質を
コードする配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含む。必要な転写
および翻訳のシグナルは、天然CKGFサブユニットcDNAまたは遺伝子、および／ま
たはサブユニット遺伝子のそれぞれをフランキングするゲノム配列によっても供
給され得る。様々な宿主-ベクターシステムが、タンパク質をコードする配列を
発現するために、利用され得る。これらは、ワクシニアウイルスまたはアデノウ
イルスのような組換えウイルスで感染された哺乳動物細胞システム；組換えバキ
ュロウイルスのようなウイルスで感染された昆虫細胞システム；および酵母中で
複製が可能なベクターを含む酵母のような微生物を含む。
【０１３５】 ベクターの発現エレメントは、それらの強さ及び特異性において、様々である
。利用される宿主-ベクターシステムに依存して、多くの好適な転写および翻訳
エレメントの任意の１つが、使用され得る。特定の実施態様では、ミュータント
サブユニットコーディング領域または、それぞれのミュータントサブユニットの
突然変異された及び機能的に活性な部分をコードする配列が、発現される。
【０１３６】 DNAフラグメントの挿入に関して先に記載された方法のいずれも、好適な転写
／翻訳のコントロールシグナルおよびタンパク質コーディング配列からなるキメ
ラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために、使用され得る。これらの方法は
、インビトロでの組換えDNA合成技術ならびにインビボでの組換えを含み得る。
ミュータントCKGFサブユニットまたはそのペプチドフラグメントをコードするポ
リヌクレオチド配列の発現は、ミュータントサブユニットまたはペプチドが、組
換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２ポリヌクレオチ
ド配列によって制御され得る。例えば、ミュータントサブユニットまたはペプチ
ドフラグメントの発現は、当分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー・
エレメントによってコントロールされ得る。使用され得るプロモーターは、SV40
早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290: 304-310)、
ラウス肉腫ウイルスの3'長い末端繰返しに含まれるプロモーター(Yamamotoら、1
980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1
981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78: 1441-1445)、およびメタロチオネイン
遺伝子の制御配列(Brinsterら、1982, Nature 296: 39-42)を含むが、それらに
限定されない。
【０１３７】 特定の実施態様では、ミュータントCKGFサブユニットのコーディング領域に作
動可能に連結された１つ以上のプロモーター、１つ以上の複製起源、および必要
に応じて、１つ以上の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクタ
ーが使用される。ヘテロダイマーとして天然に存在するそれらのCKGFsのために
、同じ原核宿主細胞内の２つのサブユニットの発現が好ましい、というのも、そ
のような同時発現は、機能的ヘテロダイマー性CKGFの適切なアセンブリーおよび
グリコシル化に好都合であるからである。従って、好ましい実施態様では、その
ようなベクターは、宿主細胞中で第１のミュータントサブユニットおよび第２の
ミュータントサブユニットを共に発現するために、使用される。ミュータントサ
ブユニットのそれぞれのコーディング領域は、別々のベクターにクローン化され
得る；ベクターは、宿主細胞に、連続的または同時に導入される。或いは、両方
のサブユニットのコーディング領域は、好適なプロモーターがそれに作動可能に
連結された１つのベクター中に挿入され得る。
【０１３８】 挿入された配列の発現を調節し、または遺伝子産物を所望の特定の方法で修飾
およびプロセッシングする、宿主細胞株が選択され得る。特定のプロモーターか
らの発現は、特定の誘導物質の存在下で増加され得る。この様に、遺伝子工作さ
れたミュータントサブユニットの発現は、コントロールされ得る。さらに、異な
る宿主細胞は、転写および翻訳後のプロセッシングおよび修飾(例えば、タンパ
ク質のグリコシル化、リン酸化)のための特徴的な特殊なメカニズムを有する。
好適な細胞系または宿主システムは、発現された外来タンパク質の所望の修飾お
よびプロセッシングを確実にするように、選択され得る。哺乳動物細胞中での発
現は、異種タンパク質の「天然の」グリコシル化を確実にするように、使用され
得る。さらに、異なるベクター／宿主発現システムは、プロセッシング反応を様
々な範囲にまで、影響し得る。
【０１３９】 一旦、ミュータントサブユニット遺伝子配列を発現する組換え宿主細胞が同定
されると、遺伝子産物は、分析され得る。これは、産物の放射性標識、その後に
、ゲル電気泳動、イムノアッセイまたはミュータントサブユニットの生物学的活
性を検出するのに有用な他の技術を含む、産物の物理的または機能的特性に基づ
くアッセイによって達成される。
【０１４０】 ミュータントサブユニットおよびそのアナローグに対する抗体の作製 本発明に従うと、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー
、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラグメントまたは他の誘導体
は、そのような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原とし
て使用され得る。好ましくは、抗体は、野生型サブユニットまたは野生型サブユ
ニットを含むダイマーに結合しない。そのような抗体は、ポリクローナル、モノ
クローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーを
含むが、それらに限定されない。他の実施態様では、ミュータントサブユニット
のドメインに対する抗体が、作製される。特定の実施態様では、TSHのようなミ
ュータント糖タンパク質ホルモンに対する抗体が、作製される。
【０１４１】 当分野で公知の様々な手順が、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータント
CKGFダイマー、アナローグ、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラ
グメントまたは他のその誘導体に対するポリクローナル抗体の作製のために、使
用され得る。抗体の作製のために、サブユニット、ヘテロダイマー、一本鎖アナ
ローグ、およびその誘導体で注射することによって、様々な宿主動物が、免疫さ
れ得る。好適な宿主動物は、ウサギ、マウス、ラット、他の哺乳動物ならびにニ
ワトリのような鳥を含む。様々なアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的
反応を増大させるために使用され得、それらには、フロイント(完全および不完
全)、水酸化アルミニウムのような金属ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリ
オール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、スカシガイ・ヘモシア
ニン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、およびBCGのような可能性と
して有用なヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。
【０１４２】 ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー、アナローグ、一
本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラグメントまたは他のその誘導体
に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中で連続的細胞系による抗体
分子の産生を提供する任意の技術が、使用され得る。例えば、KohlerおよびMils
teinによって最初に開発(1975, Nature 256: 495-497)されたハイブリドーマ技
術、並びにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983, Im
munology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハ
イブリドーマ技術(Coleら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)である。本発明の更なる実施態様では、最近の
技術(PCT/US90/02545)を用いて、細菌を含まない動物中で、モノクローナル抗体
が作製され得る。本発明に従うと、ヒト抗体は使用され得、ヒトハイブリドーマ
を用いることにより(Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 2026-20
30)、またはヒトB細胞をインビトロでEBVウイルスで形質転換することによって(
Coleら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp
. 77-96)、得られ得る。事実、エピトープに特異的であるマウス抗体分子からの
遺伝子を、好適な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシン
グすることによる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術(Morrisonら
、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81: 6851-6855；Neubergerら、1984, N
ature 312: 604-608；Takedaら、1985, Nature 314: 452-454)が、使用され得る
。これらの技術による抗体産生は、本発明の範囲内にある。
【０１４３】 本発明に従うと、一本鎖抗体を作製するために記載された技術(米国特許第4,9
46,778号)は、CKGFサブユニット、ヘテロダイマー、一本鎖アナローグ、又はそ
のフラグメントもしくは誘導体に対する特異的な一本鎖抗体を作製するために、
適合され得る。本発明の更なる実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築のため
に記載された技術(Huseら、1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、所望の
特性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする
。
【０１４４】 イデオタイプの分子を含む抗体フラグメントは、公知の技術により、生成され
得る。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化よって作製
され得るF(ab')２フラグメント、F(ab')２フラグメントのジスルフィド結合を減
少させて生成され得るFab'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処
理して作製され得るFabフラグメント、およびFvフラグメントを含むが、それら
に限定されない。
【０１４５】 抗体の作製において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で公知の標準的
技術を用いて為され得る。例えば、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ)
は、好適なスクリーニング技術である。例えば、ミュータントサブユニットの特
異的ドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含むミュ
ータントサブユニットのフラグメントに結合する産物に関して、ハイブリドーマ
をアッセイし得る。ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー
または一本鎖アナローグに特異的に結合するが、野生型タンパク質には特異的に
結合しない抗体を選択するために、ミュータントへの正の結合および野生型タン
パク質への結合の欠如に基づいて選択することができる。ミュータントCKGFサブ
ユニット、ミュータントCKGFダイマーまたは一本鎖アナローグのドメインに特異
的である抗体も、本発明により提供される。
【０１４６】 上記の抗体は、本発明のミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダ
イマーまたは一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグの局在および活性に関する
、当分野で公知の方法の中で使用され得る。
【０１４７】 ミュータントCKGFサブユニットの構造および機能分析 本明細書に記載されるのは、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCK
GFダイマーおよびCKGFアナローグの構造を決定する方法、および上記のインビト
ロ活性およびインビボでの生物学的機能を分析する方法である。
【０１４８】 一旦、ミュータントCKGFサブユニットが同定されると、それは、クロマトグラ
フィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマト
グラフィー)、遠心分離、分別溶解性、またはタンパク質を精製するのに有用な
任意の他の標準的技術を含む標準的方法によって、単離され精製され得る。タン
パク質の機能的特性は、野生型またはミュータントCKGFタンパク質による刺激へ
の反応として、細胞によりそれが作製した産物を検出するイムノアッセイまたは
生物学的アッセイを含む、任意の好適なアッセイを用いて、評価され得る。
【０１４９】 或いは、一旦、組換え宿主細胞によって作製されたミュータントCKGFサブユニ
ットが同定されると、サブユニットのアミノ酸配列は、自動化アミノ酸シークエ
ンサーの使用を含む、タンパク質配列決定のための標準的技術を用いて、決定さ
れ得る。
【０１５０】 ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーアナローグ、一本
鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、その誘導体およびフラグメントの機能的活
性は、当分野で公知の様々な方法により、アッセイされ得る。
【０１５１】 例えば、ミュータントCKGFサブユニットまたはミュータントCKGFダイマーが、
対応する野生型CKGFへの結合または競合する能力に関してアッセイされる場合、
またはCKGFサブユニットが、抗体結合に関してアッセイされる場合、当分野で公
知の様々なイムノアッセイが、使用され得る。これらのイムノアッセイは、放射
性イムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメ
トリックアッセイ、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、in situイ
ムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素または放射性アイソトープ標識を用い
る)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ
、赤血球凝集反応アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテイ
ンAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる、競合的およ
び非競合的アッセイシステムを含む。抗体結合は、一次抗体上の標識を検出する
ことにより、検出され得る。或いは、一次抗体は、二次抗体が標識される場合は
特に、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって、検出さ
れ得る。
【０１５２】 ミュータントCKGFsの診断的および治療的使用 本発明は、本発明の治療的化合物(本明細書では「治療薬」と称する)の投与に
よる、様々な疾患および疾病の治療または予防を提供する。
【０１５３】 CKGFレセプターシグナル変換の不存在または減少に関与する疾患は、CKGFシグ
ナル変換を促進する治療薬の投与によって治療または予防され得る。構成的また
は増大したCKGFレセプターシグナル変換が不十分または望ましい疾患は、CKGFレ
セプターシグナル変換に拮抗または阻害する治療薬の投与によって、治療または
予防される。
【０１５４】 薬学的組成物 本発明は、有効量の本発明の治療薬を被験体に投与することによる、診断方法
および治療方法を提供する。好ましい局面では、治療薬は、実質的に精製されて
いる。被験体は、好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの
ような動物を含むが、それらに限定されない動物であり、好ましくは、哺乳動物
、最も好ましくは、ヒトである。特定の実施態様では、非ヒトの哺乳動物が、被
験体である。従って、特に好ましい実施態様では、ミュータントおよび／または
修飾されたヒトCKGFホモダイマー、ヘテロダイマー、誘導体またはアナローグ、
または核酸が、ヒト患者に、治療的または予防的または診断的に投与される。
【０１５５】 本発明のCKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、所望ならばヒトでの
使用に先立って、好ましくは、インビトロで、続いて、インビボで試験される。
様々な特定の実施態様では、インビトロアッセイは、患者の疾患に関与する細胞
タイプ(例えば、甲状腺細胞)の代表的細胞を用いて行われ、ミュータントタンパ
ク質が、そのような細胞タイプに対して所望の効果を有するかどうか決定され得
る。
【０１５６】 治療に使用される化合物は、ヒトでのテストに先立って、好適な動物モデルシ
ステムでテストされ得、それらには、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、
ウサギなどを含むが、それらに限定されない。インビボでのテストのために、ヒ
トへの投与に先立って、当分野で公知の任意の動物システムが、使用され得る。
【０１５７】 様々なデリバリーシステムが、公知であり、本発明のCKGFミュータント、誘導
体またはアナローグを投与するために使用され得、例えば、リポソーム中のカプ
セル化、微粒子、マイクロカプセル、CKGFミュータント、誘導体またはアナロー
グを発現可能な組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス(例えば、Wuお
よびWu、1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)などである。投与方法は、皮下
、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、
それらに限定されない。化合物は、任意の慣用されている経路、例えば、注入ま
たはボーラス注入により、上皮または粘膜皮膚のライニング(例えば、口内粘膜
、直腸および腸の粘膜など)を介する吸収により投与され得、および他の生物学
的活性剤と共に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに
、本発明の薬学的組成物を、脳室内および硬膜下腔注射を含む任意の好適な経路
により、中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない；脳室内注射は、例
えば、Ommaya容器のような容器に連結された脳室内カテーテルによって、促進さ
れ得る。肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザーの使用により、およびエ
ーロゾル剤による剤形化により、使用され得る。
【０１５８】 特定の実施態様では、治療が必要な領域に局所的に、本発明の薬学的組成物を
投与することも所望され得る；これは、例えば、カテーテルにより、坐剤により
、インプラントにより、手術の間に局所的に注入することによって為され得、イ
ンプラントは、多孔性、非多孔性、またはシアル酸膜もしくはファイバーのよう
な膜を含む、ゼラチン材料のものである。
【０１５９】 他の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、ビヒクル
、特にリポソーム中でデリバリーされ得る(Langer, Science 249: 1527-1533 (1
990)；Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer
, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss、ニューヨーク、pp. 353-365 (1989
)；Lopez-Berestein、同上、pp. 317-327を参照。
【０１６０】 更に他の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、制御
放出システムを用いてデリバリーされ得る。１つの実施態様では、ポンプが使用
され得る(Langer、上記；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987
)；Buchwaldら、Surgery 88: 507 (1980)；Saudekら、N. Engl. J. Med. 321: 5
74(1989)を参照)。他の実施態様では、ポリマー製材料が、使用され得る(Medica
l Applications of Controlled Release, LangerおよびWise(編), CRC Press.,
Boca Raton, (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design
and Performance, SmolenおよびBall(編), Wiley, ニューヨーク(1984)；Range
rおよびPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61(1983)を参照
；およびLevyら、Science 228: 190 (1985)；Duringら、Ann. Neurol. 25: 351(
1989)；Howardら、J. Neurosurg. 71: 105 (1989)も参照)。更に他の実施態様で
は、制御放出システムは、治療標的の近くに設置され得、こうして、全身投与量
のフラクションのみを要求する(例えば、Goodson, Medical Applications of Co
ntrolled Release、上記、第２巻、pp. 115-138(1984)を参照)。他の制御放出シ
ステムは、Langer (Science 249: 1527-1533 (1990))の概説中で考察されている
。
【０１６１】 特定の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグをコードす
る核酸は、それを好適な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを投与する
ことにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するためにインビボで投
与され得、その結果、レトロウイルスベクターの使用により(米国特許第4,980,2
86号を参照)、または直接注入により、または微粒子ボンバードメントの使用に
より(例えば、遺伝子ガン；Biolistic, Dupont)、または脂質もしくは細胞表面
レセプターもしくはトランスフェクト剤でコートすることにより、または核を進
入させることが公知のホメオボックス様ペプチド(例えば、Joliotら、1991, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868を参照)に連結してそれを投与すること
などにより、それは細胞内のものになる。或いは、CKGFミュータント、誘導体ま
たはアナローグをコードする核酸分子は、細胞内に導入され、相同組換えにより
、発現のための宿主細胞DNA内に組込まれ得る。
【０１６２】 本発明は、薬学的組成物も提供する。そのような組成物は、治療的に有効量の
ミュータントCKGFミュータント、誘導体またはアナローグ、および薬学的に許容
される担体を含む。具体的な実施態様では、用語「薬学的に許容される」は、連
邦政府または州政府の規制機関(regulatory agency)によって承認された、又は
米国薬局方にリストされている若しくは他の一般的に認証されている動物用によ
り好ましくはヒト用に使用される薬局方にリストされていることを意味する。用
語「担体」は、治療剤がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、
またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、滅菌された液体、例えば、水
およびオイルであり、石油製、動物性、植物性または合成起源のもの、例えば、
ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内に
投与されるとき、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロー
スおよびグリセロール溶液が、特に注射液用の液体担体としても使用され得る。
好適な薬学的賦形剤は、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラ
チン、モルト、コメ、粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グ
リセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グ
リセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所
望ならば、少量の湿潤化剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤な
どの形態をとり得る。組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担
体とともに、坐剤として剤型化され得る。経口製剤は、薬学的グレードのマンニ
トール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ
ウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的担体を含み得る。好適
な薬学的担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Science
s"に記載されている。そのような組成物は、治療的有効量のミュータントTSHヘ
テロダイマーまたはTSHアナローグを好ましくは精製形態で、好適な量の担体と
ともに含み、患者への好適な投与のための形態を提供する。剤型は、投与モード
に適合すべきである。
【０１６３】 好ましい実施態様では、組成物は、人間への静脈内投与に適合した薬学的組成
物としてルーチンの手順に従い、剤型化される。代表的には、静脈内投与用の組
成物は、滅菌された等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可
溶化剤およびリグノカインのような局所麻酔剤も含み、注射部位での痛みを軽減
する。一般に、成分は、別々に又は混合のいずれかで、単位投与量形態、例えば
、凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性剤の量を表示するアンプ
ルまたはサチェットのような気密シールされた容器中で、供給される。組成物が
、注入により投与される場合、滅菌された薬学的グレードの水または生理食塩水
を含む注入ビンとともに分配され得る。組成物が注射で投与される場合、注射用
滅菌液または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るようにして
提供され得る。
【０１６４】 本発明のミュータントCKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、中性ま
たは塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢
酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもののような遊離アミノ基とともに形
成されたもの、並びに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム
、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものの
ような遊離カルボキシル基とともに形成されたものを含む。
【０１６５】 特定の疾患または状態の治療に有効である本発明のミュータントCKGFミュータ
ント、誘導体またはアナローグの量は、その疾患または状態の性質に依存し、標
準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビトロ・アッセイおよび
動物モデルは、最適な投与量範囲を同定するのを援助するために、必要に応じて
使用され得る。製剤中で使用される正確な用量は、投与経路、疾患または疾病の
重篤度にも依存し、開業医およびそれぞれの患者の環境の判断に応じて決定され
るべきである。
【０１６６】 具体的な実施態様では、本発明の治療剤は、筋肉内に投与される。筋肉内投与
のための好適な範囲は、一般に、投与量当り約10μg〜1 mg、好ましくは投与量
当り約10μg〜100μgである。一般に、ヨウ素取込みを刺激するためにミュータ
ントTSHヘテロダイマーが投与される診断的および治療的方法のために、ミュー
タントTSHヘテロダイマーは、１−３注射のレジメで投与され得る。１つの実施
態様では、治療剤は、２用量で投与され、ここで、第２用量は第１用量の24時間
後に投与される；他の実施態様では、治療剤は、３用量で投与され、１用量は、
７日間レジメの第１、４および７日目に投与される。
【０１６７】 有効な用量は、インビトロまたは動物モデルのテスト・システムから誘導した
用量応答曲線から外挿され得る。
【０１６８】 坐剤は、一般に、0.5重量％〜10重量％の範囲で活性成分を含む；経口製剤は
、一般に、10重量％〜95重量％の活性成分を含む。
【０１６９】 本発明は、本発明の薬学的組成物の１種以上の成分で満たされた１種以上の容
器を含む、治療的または診断的使用のためのパックまたはキットも提供する。そ
のような容器と必要に応じて関連するのは、薬品または診断用製品の製造、使用
または販売を規制している政府機関によって記載された注意書であり得、該注意
書は、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売について機関の承認を反映し
ている。
【０１７０】 甲状腺刺激ホルモンのミュータント 上記のように、本発明の１つの局面は、新規なミュータントTSHタンパク質、
ミュータントTSHタンパク質をコードする核酸分子、その作製方法、並びにその
診断および治療方法に関する。本発明者は、ミュータント甲状腺刺激ホルモン(T
SH)、TSH誘導体、TSHアナローグ、およびそのフラグメントをデザインして作製
し、両方は、αおよびβサブユニットからなるTSHヘテロダイマーの生物活性を
野生型TSHの生物活性に対して増加させ、循環中のホルモン半減期を増加するた
めに修飾されたαおよびβサブユニット中の突然変異(好ましくは、アミノ酸置
換)を有する。本発明者は、生物活性を増大するこれらの突然変異およびホルモ
ン半減期を増大する戦略は、TSHヘテロダイマーが超活性突然変異および長く作
用する修飾を共に有する超活性突然変異および長く作用する修飾により個々に賦
与された追加の活性の総計から予測されたであろうより高い生物活性を有する佐
薬として作用することを見い出した。
【０１７１】 本発明者は、ヒトαサブユニットのアミノ酸22でのアミノ酸置換、好ましくは
、リシンまたはアルギニン、より好ましくはアルギニンのような塩基性アミノ酸
の置換が、野生型TSHに対して、TSHの生物活性を増加させることも見い出した。
【０１７２】 本発明者は、インビボでヘテロダイマーの半減期を増加するように、単一サブ
ユニット内で個々の突然変異を組合せ、サブユニットとヘテロダイマーを修飾す
ることによって、ミュータントサブユニットをデザインした(下記で説明する)。
特に、本発明者は、突然変異、特に特定ドメイン中に突然変異を有する、突然変
異α、突然変異βのミュータントTSHヘテロダイマーをデザインした。これらの
ドメインは、共通のαサブユニットのβヘアピンL1ループ、およびTSHβサブユ
ニットのβヘアピンL3ループ3を含む。１つの実施態様では、本発明は、ミュー
タントαサブユニット、ミュータントTSHβサブユニット、および１つのミュー
タントαサブユニットまたは１つのミュータントβサブユニットのいずれかを含
むTSHヘテロダイマーを提供し、ここで、ミュータントαサブユニットは、好ま
しくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置した単一または
複数のアミノ酸置換を含み、およびミュータントβサブユニットは、好ましくは
βサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近傍に位置した単一または複数の
アミノ酸置換を含む(好ましくは、これらの突然変異は、ミュータントサブユニ
ットを含むTSHヘテロダイマーの生物活性を増加させ、ミュータントサブユニッ
トを有するTSHヘテロダイマーも野生型TSHヘテロダイマーに対して血清半減期を
増加するように修飾された)。
【０１７３】 本発明によれば、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近
傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニット
は、そのカルボキシル末端でCTEPに融合され得る。そのようなミュータントβサ
ブユニット-CTEPサブユニットは、共同発現され、および／または野生型もしく
はミュータントαサブユニットのいずれかと組立てられて機能的TSHヘテロダイ
マーを形成し得、該ヘテロダイマーは、野生型TSHよりも大きい生物活性および
血清半減期を有する。
【０１７４】 他の実施態様では、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または
近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニッ
ト、および好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置
した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットは、融合
されて、単一鎖のTSHアナローグを形成する。そのようなミュータントβサブユ
ニット-ミュータントαサブユニットの融合物は、野生型TSHよりも大きい生物活
性および血清半減期を有する。
【０１７５】 さらに他の実施態様では、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内
または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含み、さらにカルボキシ
ル末端にCTEPを含むミュータントβサブユニット、および好ましくはαサブユニ
ットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置
換を含むミュータントαサブユニットは、融合されて、単一鎖のTSHアナローグ
を形成する。
【０１７６】 融合タンパク質、アナローグ、並びにそのようなタンパク質およびアナローグ
をコードする核酸分子、並びに例えば組換えDNA法による上記タンパク質および
アナローグの作製も提供される。
【０１７７】 特定の局面では、本発明は、突然変異αおよびβサブユニットの核酸配列、な
らびに特に機能的に活性であるそのフラグメントおよび誘導体を、提供する。本
明細書中で使用される「機能的に活性な」ミュータントTSHαおよびβサブユニ
ットは、野生型サブユニットと関係して１種以上の公知の機能的な活性、例えば
、TSHRへの結合、TSHRシグナル変換のトリガリング、抗原性(抗TSH抗体への結合
)、免疫原性などを発揮する材料を指す。
【０１７８】 具体的な実施態様では、本発明は、少なくとも６アミノ酸、10アミノ酸、50ア
ミノ酸または少なくとも75アミノ酸からなる突然変異αおよびTSHβサブユニッ
トのフラグメントを提供する。様々な実施態様では、ミュータントαサブユニッ
トは、突然変異したαL1ループドメインを含む又は本質的にそれからなり；ミュ
ータントβサブユニットは、突然変異したαL3ループドメインを含む又は本質的
にそれからなる。
【０１７９】 本発明はさらに、突然変異αおよびミュータントβサブユニットならびに修飾
されたミュータントαサブユニットおよびβサブユニット(例えば、ミュータン
トβサブユニット-CTEP融合物またはミュータントβサブユニット-ミュータント
αサブユニット融合物)をコードする核酸配列、および該核酸配列を使用する方
法を提供する。αサブユニットおよびβサブユニット中の突然変異は、下記の５
．１節および５．２節において、それぞれより詳細に説明される。
【０１８０】 本発明は、ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュ
ータントTSHヘテロダイマー、およびTSHアナローグ、その誘導体およびフラグメ
ントに基づく、治療的および診断的方法および組成物にも関する。本発明は、野
生型TSHよりも活性で循環中でより長い半減期を有するミュータントTSHおよびア
ナローグを投与することによる、甲状腺癌の診断および治療における、本発明の
ミュータントTSHおよびアナローグの使用を提供する。本発明はさらに、TSHレセ
プター結合阻害アッセイで本発明のミュータントTSHヘテロダイマーおよびアナ
ローグを用い、TSHレセプターに対する自己抗体の存在によって特徴付けられる
疾患および疾病を診断する方法を提供する。診断用キットも、本発明によって提
供される。
【０１８１】 本発明は、甲状腺癌のような甲状腺の疾患を量する方法も提供する。
【０１８２】 開示を明確にするために、また限定されないために、発明の詳細な説明を以下
の副節に分ける。
【０１８３】 TSHαサブユニットのミュータント 上記したように、糖タンパク質ホルモンの共通の(common)ヒトαサブユニット
は、図２（配列番号１）に示す９２個のアミノ酸を含むものであって、１０のハ
ーフ−システイン残基(half-cysteine residues)を含み、その全てがジスルフィ
ド結合の形態である。一つの実施態様において、本発明は、ヒト糖タンパク質ホ
ルモンのαサブユニットのミュータントに関するものであって、該サブユニット
は、好ましくは該αサブユニットのβヘアピンL1及び／又はL3ループの中又は近
傍に位置する1又は複数のアミノ酸置換を含む。図２に示すように、位置８〜３
０から始まるαL1ループ及び位置６１〜８５から始まるαL3ループの中又は近傍
に位置するアミノ酸残基が、レセプター結合(receptor binding)及びシグナル伝
達を行うのに重要であることが見出された。例えば、位置11-22のようなαL1ル
ープ内に存在するアミノ酸配列は、ヒト科(hominoids)を除く全ての脊椎動物に
おいて塩基残基のクラスターを形成し、レセプター結合及びシグナル伝達をプロ
モートする能力を有する。特に、位置２２のアミノ酸残基は、TSHの効力（poten
cy）に影響を与える残基の一つであることが見出された。本発明によると、上記
ミュータントαサブユニットは、野生型タンパク質における１，２，３，４，又
はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有している。
【０１８４】 一つの実施態様において、上記ミュータントαサブユニットは、本発明の野生
型αサブユニットに比し、アミノ酸残基の一又はそれ以上の置換を有し、好まし
くは位置8-30及び61-85の残基から選ばれるアミノ酸残基における一又はそれ以
上の置換を有している。
【０１８５】 この実施態様の一つの側面において、TSHのαサブユニットにおける一連の変
異は、本発明の方法を用いて発生させる。該変異操作のゴールは、野生型TSHダ
イマーに比し、増大した生物活性を有するミュータントTSHタンパク質αサブユ
ニットを製造することである。これらミュータントTSHタンパク質は、以下のア
ミノ酸の置換の少なくとも1つを有する、αL1サブユニットに関する配列番号１
のアミノ酸配列を有する：P8X、E9X、T11X, L12X, Q13X、E14X, N15X, P16X
, F17X, F18X, S19X, Q20X, P21X, G22X, A23X, P24X, I25X, Q26X, M28X, 又はG30X。“X”は、野生型残基を置換するのに使用されたアミノ酸を
表す。
【０１８６】 ここで述べられる全ての変異におけるように、“X”が対応するアミノ酸は、
本発明の方法を用いて当業者によって要求された静電荷改変の性質に基く。外縁
のループのオーバーオール（overall）の正の又は塩基性の静電荷の増加が要求
される時、“X”はリジン（K）、アルギニン（R）又はヒスチジン（H）のような
塩基性残基に対応する。外縁のループのオーバーオールの負の又は酸性の静電荷
の増加が要求される時、“X”はアスパラギン酸（D）又はグルタミン酸（E）の
ような酸性残基に対応する。脂肪族アミノ酸のような他のアミノ酸は、ここで述
べられる方法において用いることが企図される。
【０１８７】 本発明の1つの側面において、TSHのαサブユニットにおける中性又は酸生アミ
ノ酸残基は、L1ループの静電荷を改変するために突然変異される。静電荷の変化
は、野生型のTSHに比しミュータントの生物活性を上昇させるために設計される
。これらミュータントTSHタンパク質は、少なくとも1つの、以下のアミノ酸置換
を有するαL1サブユニットに関する配列番号１のアミノ酸配列を有する：E9B, T
11B, Q13B, E14B, N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, G22B, P24B, 又はQ26
B。“B”は野生型の残基を置換するために用いられる塩基性アミノ酸を表す。塩
基性アミノ酸残基はリジン（K）、アルギニン（R）及びヒスチジン（H）からな
る群から選ばれる。
【０１８８】 本発明はまた、電荷残基を中性残基に突然変異させることによりL1へアピンル
ープにおける正の又は負の電荷を減少させようとするものでもある。例えば、1
つ又はそれ以上の中性アミノ酸は、可変“X”が中性アミノ酸に対応する、上述
したL1配列に導入され得る。他の例において、1又はそれ以上の中性残基は、E9U
及びE14Uで導入され得る。ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０１８９】 非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL1へアピンループアミノ酸配
列における突然変異を改変させる1又はそれ以上の静電荷改変変異を含む、ミュ
ータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットモノマータ
ンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は、P8Z,
C10Z, T11Z, L12Z, Q13Z, N15Z, P16Z, F17Z, F18Z, S19Z, Q20Z, P21Z, G22Z,
A23Z, P24Z, I25Z, L26Z, Q27Z, C28Z, M29Z, G30Z, P8B, C10B, T11B, L12B,
Q13B, N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, P21B, G22B, A23B, P24B, I25B,
L26B, Q27B, C28B, M29B, 及びG30Bを含む。ここで、“Z”は酸性アミノ酸であ
り、“B”は塩基性アミノ酸である。
【０１９０】 他の実施態様において、本発明は、Cys残基を除いて（Cys残基を除いて）61か
ら85のどの位置にでもアミノ酸置換を有するミュータントヒト糖タンパク質ホル
モンαサブユニットL3へアピンループであるミュータントCKGFサブユニットを提
供する。この配列もまた図2に示されている。これらのミュータントTSHタンパク
質は、少なくとも1つの以下のアミノ酸置換を有するαL3サブユニットに関する
配列番号１のアミノ酸配列を有する：V61X, A62X, K63X, S64X, Y65X, N66X, R6
7X, V68X, T69X, V70X, M71X, G72X, G73X, F74X, K75X, V76X, E77X, N78X H79
X, T80X, A81X, H83X, 又はS85X。“X”は野生型の残基を置換するために用いら
れるアミノ酸を表す。
【０１９１】 この実施態様の1つの側面において、TSHのαサブユニット中の中性又は酸性ア
ミノ酸残基が突然変異させられる。得られた変異サブユニットは、以下のアミノ
酸の位置で配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含む：S64B, N
66B, M71B, G72B, G73B, V76B, E77B, 又はA81B。
【０１９２】 本発明は更に、1又はそれ以上の酸性残基を、ヒト糖タンパク質ホルモンの共
通のアルファ−サブユニットのL3へアピンループのアミノ酸配列中に導入するこ
とを企図するものである。例えば、1又はそれ以上の酸性アミノ酸が、上述した
ものの中に導入され得る。ここで可変“X”は酸性アミノ酸に対応する。そのよ
うな変異の具体的な例は、K63Z、R67Z、K75Z、H79Z及びH83Zを含み、ここで“Z
”は酸性アミノ酸残基である。
【０１９３】 本発明はまた、L3ヘアピンループ中において、この領域中の電荷残基を中性残
基に突然変異させることにより、正の又は負の静電荷を減少させることを企図す
るものでもある。例えば、1又はそれ以上の中性アミノ酸が、可変“X”が中性ア
ミノ酸に対応する上述のL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入され得る。例え
ば、1又はそれ以上の中性残基が、K63U、R67U、K75U、E77U、H79U、及びH83Uに
おいて導入され得る。ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０１９４】 非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL3へアピンループアミノ酸配
列中の1又はそれ以上の静電荷改変変異を含む、ミュータントヒト糖タンパク質
ホルモンの共通のアルファ−サブユニットタンパク質が提供される。中性アミノ
酸残基を電荷残基に変える変異の例は、V61Z, A62Z, S64Z, Y65Z, N66Z, V68Z,
T69Z, V70Z, M71Z, G72Z, G73Z, F74Z, V76Z, N78Z, T80Z, A81Z, C82Z, C84Z,
S85Z, V61B, A62B, S64B, Y65B, N66B, V68B, T69B, V70B, M71B, G72B, G73B,
F74B, V76B, N78B, T80B, A81B, C82B, C84B,及びS85Bを含む。ここで、“Z”は
酸性アミノ酸であり、“B”は塩基性アミノ酸である。
【０１９５】 本発明はまた、上記βヘアピンループ構造の外側で、それらのヘアピンループ
の構造又は形態を変える変異を含むヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ
−サブユニットも企図する。これらの構造改変は、二量体分子中に含まれるヒト
糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのβヘアピンループ構造
の領域と、該二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互
作用を増加させるのに役立つ。これらの変異は、ヒト糖タンパク質ホルモンの共
通のアルファ−サブユニットモノマーの1-7、31-60、及び86-92の位置からなる
群から選ばれる位置で見出される。
【０１９６】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の外側のこれらの変異の具体的な例は、A1J, P
2J, D3J, V4J, Q5J, D6J, C7J, C31J, C32J, F33J, S34J, R35J, A36J, Y37J, P
38J, T39J, P40J, L41J, R42J, S43J, K44J, K45J, T46J, M47J, L48J, V49J, Q
50J, K51J, N52J, V53J, T54J, S55J, E56J, S57J, T58J, C59J, C60J, T86J, C
87J, Y88J, Y89J, H90J, K91J, 及びS92Jを含む。可変“J”は、導入によってヒ
ト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのL1及びL3βヘアピン
ループ構造と、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブ
ユニットモノマーを含む二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の
静電的相互作用の増加が得られるようなアミノ酸なら何でもよい。
【０１９７】 本発明はまた、修飾された形の多くのヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアル
ファ−サブユニットを企図するものでもある。これらの修飾された形は、他のシ
スチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合されたヒト
糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットを含む。
【０１９８】 特定の実施態様において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上
述した一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナ
ログを含む、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユ
ニットヘテロダイマーは機能的に活性がある、つまり、ヒト糖タンパク質ホルモ
ンの共通のアルファ−サブユニットレセプター結合、ヒト糖タンパク質ホルモン
の共通のアルファ−サブユニットのタンパク質ファミリーのレセプターシグナリ
ング及び細胞外分泌のような、野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルフ
ァ−サブユニットと関連した1又はそれ以上の機能活性を示すことができる。好
ましくは、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニ
ットヘテロダイマー又は一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サ
ブユニットのアナログは、好ましくは野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通の
アルファ−サブユニットよりも大きな親和力で、ヒト糖タンパク質ホルモンの共
通のアルファ−サブユニットレセプターに結合することができる。また、そのよ
うなミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘ
テロダイマー又は一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニ
ットのアナログは、シグナル伝達を引き起こすことが好ましい。最も好ましくは
、少なくとも1つのミュータントサブユニットを含むミュータントヒト糖タンパ
ク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマー、又は本発明の一
本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログは、
野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットよりも大きな
インビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型BMP-11よりも長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通
のアルファ−サブユニットヘテロダイマー及び一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモン
の共通のアルファ−サブユニットのアナログは、当業者に公知の操作に従い、所
望の活性について試験され得る。
【０１９９】 好ましい実施態様において、本発明のミュータントαサブユニットは、22の位
置に1つのアミノ酸置換を有しており、そこではグリシン残基がアルギニンに置
換されている。つまりαG22R。αG22R変異を有するミュータントαサブユニット
は、少なくとも1又はそれ以上の付加的なアミノ酸置換、例えば、αT11K、αQ13
K、αE14K、αP16K、αF17R、及びαQ20K等（これに限定されない）を有してい
てもよい。他の好ましい実施態様において、ミュータントαサブユニットは、α
T11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、αQ20K、及びαG22Rからなる群から選
ばれる1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。例えば、（ミュータン
トαサブユニットを有するTSHヘテロダイマーの血清半減期を増加させるための
修飾と共に用いられる）好ましいミュータントαサブユニットのうちの1つは、
ここではまたα4Kとも言われるが、4つの変異を含む：αQ13K+αE14K+αP16K+α
Q20K。
【０２００】 本発明のミュータントαサブユニットは機能的に活性であり、つまり、野生型
αサブユニットに関連する1又はそれ以上の機能的活性を示すことができる。好
ましくは、ミュータントαサブユニットは、TSHRに結合するTSHヘテロダイマー
を形成する野生型又はミュータントβサブユニットに非共有的に結合することが
できる。好ましくは、そのようなTSHヘテロダイマーもまたシグナル伝達を引き
起こす。最も好ましくは、ミュータントαサブユニットを含むそのようなTSHヘ
テロダイマーは、野生型TSHよりも大きなインビトロ生物活性及び／又はインビ
ボ生物活性を有する。本発明においては、野生型又はミュータントβサブユニッ
トと共に、野生型TSHに比し生物活性の著しい上昇を有するTSHヘテロダイマーを
形成するスーパーアクティブ（superactive）αミュータントを作るために、1を
超える変異をミュータントαサブユニット内で組合わせることが企図される。ま
た、ミュータントαサブユニットを有するTSHヘテロダイマー（つまり、βサブ
ユニット−CTEP融合又はβサブユニット−αサブユニット融合を有するTSHヘテ
ロダイマー）の血清半減期を上昇させるための戦略（strategies）として、複数
のαサブユニット変異を組合わせることが企図される。サブユニット内の変異及
び長く作用する修飾は相乗的に作用し、生物活性の予想外の上昇を生ずる。
【０２０１】 他の例として、望ましい免疫原性又は抗原性を有するそのようなミュータント
αサブユニットは、例えば、イムノアッセイ、免疫感作及びTSHレセプター（TSH
R）のシグナル伝達の阻害に用いることができる。 TSHβサブユニットのミュータント 糖タンパク質ホルモンの共通のヒトβサブユニットは、図3（配列番号2）に示
すように118個のアミノ酸を含む。本発明は、TSHのβサブユニットのミュータン
トに関するものであって、該サブユニットは、好ましくは該βサブユニットのβ
ヘアピンL3ループの中又は近傍に位置する１又は複数のアミノ酸置換を含み、そ
のようなミュータントβサブユニットは、hCGのβサブユニットのCTEPのような
タンパク質の半減期を増加させるために他のCKGFタンパク質又はポリペプチドに
融合されるか、又は22の位置（図2（配列番号1）に示される）にアミノ酸置換を
有するミュータントαサブユニットを有するTSHヘテロダイマーの部分であるか
、又はαサブユニット−βサブユニット融合体である。ヒトTSHβサブユニット
の53-87の位置のβL3ループの中又は近傍に位置するアミノ酸残基は、結晶構造
における周縁に位置し、そして表面に曝されているように見えるhCGのアミノ酸
残基に写像（map to）される。TSH中に存在しないｈCG中の塩基性残基のクラス
ター（位置58-69から始まる）は特に興味深い。塩基性の又は正電荷を有する残
基をヒトTSHのこのドメインへ置換すると、固有活性(intrinsic activity)だけ
でなくTSHR結合親和力の付加的な(additive)且つ本質的な上昇がもたらされる。
【０２０２】 本発明は、本発明の方法を用いて作られた、TSHβサブユニット中の一連の変
異を提供する。本発明のミュータントTSHヘテロダイマーは、野生型サブユニッ
ト中の1、2、3、4、又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有して
いるβサブユニットを有する。このサブユニットのL1ループにおける変異は、Cy
s残基を除いて1-30のアミノ酸残基において企図される。該変異操作のゴールは
、野生型TSHダイマーに比し、二量体のときに増大した生物活性を有するミュー
タントTSHタンパク質βサブユニットを製造することである。
【０２０３】 本発明の1つの実施態様は、以下のアミノ酸置換の少なくとも1つを有する配列
番号2のアミノ酸配列によってコードされた、ミュータントTSHαサブユニットの
L1ヘアピンループのサブユニットを提供する：F1X, I3X, P4X, T5X, E6X, Y7X,
T8X, M9X, H10X, I11X, E12X, R13X, R14X, E15X, A17X, Y18X, L20X, T21X, I2
2X, N23X, T24X, T25X, I26X, A28X, G29X, 又はY30X 。“X”は、その置換がL1
ループの静電的性質を改変する全てのアミノ酸残基を表す。
【０２０４】 この実施態様の1つの側面において、αサブユニットL1ヘアピンループのサブ
ユニット中の中性又は酸性アミノ酸残基は、このタンパク質ドメインの正の静電
的性質を増加させるために突然変異させられる。得られた変異サブユニットは、
以下のアミノ酸の位置で配列番号2のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含
む：F1B, I3B, T5B, E6B, T8B, M9B, E12B, E15B, A17B, T21B, N23B, T24B, T2
5B, I26B, A28B, G29B, 及び Y30B。“B”は塩基性アミノ酸残基を表す。
【０２０５】 酸性アミノ酸残基を、hTSHのβサブユニットモノマーの配列中の塩基性アミノ
酸が存在する所に導入することもまた考えられる。この実施態様において、可変
“X”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループ
の静電的性質をより負の状態に改変するのに役立つ。そのようなアミノ酸置換の
例は、以下のH10Z、R13Z及びR14Zのうちの1又はそれ以上を含む。ここで“Z”は
酸性アミノ酸残基である。
【０２０６】 本発明はまた、電荷残基を中性残基に変異させることによりL1ヘアピンループ
中の正のまたは負の電荷を減少させることも企図する。例えば、1又はそれ以上
の中性アミノ酸が、可変“X”が中性アミノ酸に対応する上述のL1配列に導入さ
れ得る。他の例では、1又はそれ以上の中性残基が、E6U、H10U、E12U、R13U、R1
4U及びE15Uに導入され得る。ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０２０７】 非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL1へアピンループアミノ酸配
列中の1又はそれ以上の静電荷改変変異を含むミュータントhTSHベータサブユニ
ットモノマータンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変
異の例は、I1Z, C2Z, I3Z, P4Z, T5Z, Y7Z, T8Z, M9Z, I11Z, C16Z, A17Z, Y18Z
, C19Z, L20Z, T21Z, I22Z, N23Z, T24Z, T25Z, I26Z, C27Z, A28Z, G29Z, Y30Z
, I1B, C2B, I3B, P4B, T5B, Y7B, T8B, M9B, I11B. C16B, A17B, Y18B, C19B,
L20B, T21B, I22B, N23B, T24B, T25B, I26B, C27B, A28B, G29B, 及び Y30Bの
。ここで、“Z”は酸性アミノ酸であり、“B”は塩基性アミノ酸である。
【０２０８】 βサブユニットのL3ループ中の変異はまた、Cys残基を除いて53-87のアミノ酸
残基において企図される。これらミュータントTSHタンパク質は、以下のアミノ
酸置換の少なくとも1つを有する配列番号2のアミノ酸配列を有する：T53X, Y54X
, R55X, D56X, F57X, I58X, Y59X, R60X, T61X, V62X, E63X, I64X, P65X, G66X
, P68X, L69X, H70X, V71X, A72X, P73X, Y74X, F75X, S76X, Y77X, P78X, V79X
, A80X, L81X, S82X, K84X, G86X, 又はK87X。
【０２０９】 この実施態様の1つの側面において、TSHのβサブユニット中の中性又は酸性ア
ミノ酸残基が、突然変異される。得られるサブユニットは、以下のアミノ酸の位
置で配列番号2のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含む：I58B, Y59B, T6
1B, V62B, E63B, S64B, P65B, G66B, P68B, L69B, V71B, 及びA72B。ここで“B
”は塩基性アミノ酸残基を表す。
【０２１０】 本発明は更に、1又はそれ以上の酸性残基を、hTSHβサブユニットL3へアピン
ループのアミノ酸配列に導入することも企図する。例えば、1又はそれ以上の酸
性アミノ酸が、上述の配列中に導入され得る。ここで可変“X”は酸性アミノ酸
に対応する。そのような変異の具体的な例はR55Z、R60Z、H70Z、K84Z、及びK87Z
を含み、“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０２１１】 本発明はまた、L3へアピンループにおいて、この領域中の電荷残基を中性残基
に突然変異させることによって、正の又は負の静電荷を減少させることも企図す
る。例えば、1又はそれ以上の中性アミノ酸が、可変“X”が中性アミノ酸に対応
する上述のL3へアピンループのアミノ酸配列に導入され得る。例えば、1又はそ
れ以上の中性残基が、R55U、D56U、R60U、E63U、H70U、K84U、及びK87Uにおいて
導入され得る。ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０２１２】 非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL3へアピンループアミノ酸配
列における1又はそれ以上の静電荷改変変異を含むミュータントhTSHβサブユニ
ットタンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は
、
【０２１３】
【化１】 を含む。ここで、“Z”は酸性アミノ酸であり、“B”は塩基性アミノ酸である。
【０２１４】 本発明はまた、上記βへアピンループ構造の外側でそれらへアピンループの構
造または形態を改変する変異を含むhTSHベータサブユニットを企図するものでも
ある。これらの構造改変は、二量体分子中に含まれるhTSHベータサブユニットの
βへアピンループ構造の領域と、該二量体タンパク質に親和性を有するレセプタ
ーとの間の静電的相互作用を増加させるのに役立つ。これらの変異は、hTSHのベ
ータサブユニットモノマーの31-52及び88-118の位置からなる群から選ばれる位
置で見出される。
【０２１５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の外側のこれら変異の具体的な例は、
【０２１６】
【化２】 を含む。可変“J”は、その導入によってhTSHのベータサブユニットのL1及びL3
βヘアピンループ構造と、ミュータントhTSHのベータサブユニットモノマーを含
む二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用の増加
が得られるようなアミノ酸なら何でもよい。
【０２１７】 本発明はまた、修飾された形で多くのhTSHベータサブユニットも企図する。こ
れらの修飾された形は、他のシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーの
フラクションに結合したhTSHベータサブユニットを含む。
【０２１８】 特定の実施態様において、上述したような少なくとも1つのミュータントサブ
ユニット又は一本鎖hTSHベータサブユニットアナログを含む、ミュータントhTSH
ベータサブユニットヘテロダイマーは、機能的に活性がある、つまり、hTSHベー
タサブユニットレセプター結合、hTSHベータサブユニットのタンパク質ファミリ
ーのレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型hTSHベータサブユ
ニットと関連した1又はそれ以上の機能活性を示すことができる。好ましくは、
ミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマー又は一本鎖hTSHのベータサ
ブユニットのアナログは、好ましくは野生型hTSHベータサブユニットよりも大き
な親和力で、hTSHベータサブユニットレセプターに結合することができる。また
、そのようなミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマー又は一本鎖hT
SHベータサブユニットのアナログは、シグナル伝達を引き起こすことが好ましい
。最も好ましくは、本発明の少なくとも1つのミュータントサブユニット又は一
本鎖hTSHベータサブユニットのアナログを含むミュータントhTSHベータサブユニ
ットへテロダイマーは、野生型hTSHベータサブユニットよりも大きなインビトロ
生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型hTSHベータサブユニットよ
りも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントhTSHベータサブユニットヘ
テロダイマー及び一本鎖hTSHベータサブユニットのアナログは、当業者に公知の
操作によって、所望の活性の試験を行うことができる。
【０２１９】 1つの実施態様において、ミュータントβサブユニットは、野生型βサブユニ
ットに比し、1又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、好ましくは、図3（配列番号
2）に示すβサブユニットの53−87の位置の残基から選ばれるアミノ酸残基中に1
又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。
【０２２０】 好ましい実施態様において、ミュータントβサブユニットは、βI58R、βE63R
、及びβL69Rからなる群から選ばれる1、2、3、又はそれ以上のアミノ酸残基を
有する。例えば、ここでβ3Rとも言われる好ましいミュータントβサブユニット
に１つは、3つの変異：βI58R＋βE63R＋βL69Rを含む。
【０２２１】 ミュータントβサブユニットを有する本発明のミュータントTSH、TSHアナログ
、誘導体、及びそれらのフラグメントはまた、22の位置（図2（配列番号1）に示
す）にアミノ酸置換を有する1つのミュータントαサブユニットを有し、且つ／
又は野生型TSHよりも大きな血清半減期を有する。1つの実施態様において、野生
型βサブユニットに比し、1又はそれ以上のアミノ酸残基の置換を含むミュータ
ントβサブユニットは、他のCKGFタンパク質のカルボキシル末端部分（その1つ
の例はhCGのカルボキシル末端部分伸張ペプチド（CTEP）である）に共有結合さ
れている。CTEPは、hCGβサブユニットのカルボキシル末端の32アミノ酸を含み
（図4に示す）、ミュータントβサブユニットに共有結合され、好ましくは、ミ
ュータントβサブユニットのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端に共有結合さ
れる。βサブユニット及びCTEPは、当業者に公知の任意の方法、例えば、ペプチ
ド結合によって又はタンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端の間の共有結
合を形成することができるヘテロ二官能試薬、例えば限定されないがペプチドリ
ンカーによって共有結合され得る。好ましい実施態様において、ミュータントβ
サブユニット及びCTEPはペプチド結合によって結合される。種々の好ましい実施
態様において、ミュータントβサブユニット−CTEPの融合体は、βI58R、βE63R
、及びβL69Rからなる群から選ばれる1、2、3、又はそれ以上のアミノ酸置換を
含んでもよい。
【０２２２】 他の実施態様において、ミュータントβサブユニットは融合される、つまりα
サブユニット、好ましくはミュータントαサブユニットに共有結合される。
【０２２３】 本発明のミュータントβサブユニットは機能的に活性である、つまり、野生型
βサブユニットに関連した1又はそれ以上の機能的な活性を示すことができる。
好ましくは、ミュータントβサブユニットは、野生型又はミュータントαサブユ
ニットに非共有的に結合することができ、TSHRに結合するTSHヘテロダイマーを
形成する。好ましくは、そのようなTSHヘテロダイマーもまたシグナル伝達を引
き起こす。最も好ましくは、ミュータントβサブユニットを含むそのようなTSH
ヘテロダイマーは、野生型TSHの生物活性よりも大きなインビトロ生物活性及び
／又はインビボ生物活性を有する。本発明において、1を超えるの変異をミュー
タントβサブユニット内で結合することができ、こうして野生型TSHに比し生物
活性の著しい上昇を有するTSHヘテロダイマーを製造することが企図される。本
発明者らは、サブユニット内の多数の変異及びTSHヘテロダイマーの半減期を増
加させる修飾（つまりβサブユニット−CTEP融合及び／又はβサブユニット−α
サブユニット融合）が相乗的に作用して、変異及び長く作用している修飾の上昇
の合計よりも大きい生物活性を達成し得ることを発見した。
【０２２４】 ミュータントβサブユニットは、当業者によく知られた手法によって所望の活
性について試験することができる。 ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログ 本発明は、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを含
むミュータントヒトＴＳＨヘテロダイマー及びヒトＴＳＨアナログであって、該
ミュータントαサブユニットは、該αサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又は
Ｌ３ループ又はその近傍にしばしば位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含み
、該ミュータントβサブユニットは、該βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／
又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換
を含むものであり、また、該ヘテロダイマー又はアナログは、（例えば、ＣＴＥ
Ｐ融合等のβサブユニット−ＣＫＧＦ融合又はαサブユニット−βサブユニット
融合によって）血清半減期が増加するように変性されている、ミュータントヒト
ＴＳＨヘテロダイマー及びヒトＴＳＨアナログを提供する。ミュータントαサブ
ユニットでの一個又は複数のアミノ酸置換は、ヒトαサブユニットのアミノ酸配
列の８−３０位及び６１−８５位から選ばれたアミノ酸残基で行うことができる
。ミュータントＴＳＨβサブユニットでの一個又は複数のアミノ酸置換は、ヒト
ＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の１−３０位及び５３−８７位から選ばれ
たアミノ酸残基で行うことができる。特に限定されるものではないが、この様な
ミュータントＴＳＨの具体例は、上記したミュータントαサブユニット、α４Ｋ
、及びミュータントβサブユニット、β３Ｒのヘテロダイマーを含む。
【０２２５】 一つの実施態様として、本発明は、αサブユニット、好ましくはミュータント
αサブユニット、及びβサブユニット、好ましくはヒトβサブユニットを含むＴ
ＳＨヘテロダイマーであって、該ミュータントα又はミュータントβサブユニッ
トの何れかが、ｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰ等の他のＣＫＧＦタンパクの
一部に融合している、ＴＳＨヘテロダイマーを提供する。本明細書では、融合タ
ンパクとは、２個のペプチドの共有結合の生成物であるタンパクを意味する。融
合は、全体又はそのタンパクの一部として、他のＣＫＧＦに対してでよい。共有
結合とは、そのアミノ−及びカルボキシル末端のそれぞれで、共有結合的に２個
のペプチドを結合する公知の方法を含むものであり、この様な方法は、特に限定
的ではないが、ペプチド結合、又は限定的ではないが、例えば、ペプチドリンカ
ー等のヘテロ二官能性試薬を介して結合することを含む。好ましい具体例として
は、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、ミュータントヒトαサブユニット及
びミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含んでもよく、該ミュータントヒト
ＴＳＨβサブユニットは、ＣＴＥＰのアミノ末端にそのカルボキシル末端で共有
結合している。
【０２２６】 本発明は、また、ミュータントヒトＴＳＨβサブユニットに共有結合（上記し
たβサブユニット−ＣＴＥＰ融合の様に）したミュータントヒトαサブユニット
を含む単鎖ヒトＴＳＨアナログであって、該ミュータントαサブユニット及びミ
ュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、それぞれ各サブユニットのアミノ酸配
列に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む単鎖ヒトＴＳＨアナログに関する。好
ましい具体例では、ミュータントβサブユニットは、ミュータントαサブユニッ
トにペプチドリンカーを介して結合している。より好ましい具体例では、高いセ
リン／プロリン含量を有し、有効な二次構造を欠いたｈＣＧのＣＴＥＰが、ペプ
チドリンカーである。
【０２２７】 αサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好まし
くは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットは
、βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好まし
くは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニットに
共有結合することが好ましい。
【０２２８】 一つの実施態様として、ヒトＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の１−３０
位、好ましくは５３−８７位から選ばれたアミノ酸残基に少なくとも一個のアミ
ノ酸置換を含むミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、野生型ヒトＴＳＨα
サブユニット、又は少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントＴＳＨα
サブユニットのアミノ末端とそのカルボキシル末端で共有結合しており、１個又
は二個以上の置換がヒトαサブユニットのアミノ酸配列の８−３０位及び６１−
８５位から選ばれたアミノ酸残基にある。
【０２２９】 ミュータントαサブユニット又はミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは
、それぞれ、そのシグナル配列を欠いても良い。
【０２３０】 本発明は、また、ミュータントαサブユニットに共有結合しているＣＴＥＰに
共有結合したミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含むヒトＴＳＨアナログ
であって、該ミュータントαサブユニット及びミュータントヒトＴＳＨβサブユ
ニットが、それぞれ、各サブユニットのアミノ酸配列に少なくとも一個のアミノ
酸置換を含む、ヒトＴＳＨアナログを提供する。
【０２３１】 具体例としては、ミュータントβサブユニット−ＣＴＥＰ融合体は、ミュータ
ントαサブユニットに共有結合し、ミュータントβサブユニットのカルボキシル
末端は、ｈＣＧのＣＴＥＰを介してミュータントαサブユニットのアミノ末端に
結合する。好ましくは、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端はＣＴ
ＥＰのアミノ末端に共有結合し、ＣＴＥＰのカルボキシル末端は、シグナルペプ
チド無しに、ミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結合する。
【０２３２】 従って、具体例として、ヒトＴＳＨアナログは、一個又は二個以上の置換がヒ
トαサブユニットのアミノ酸配列の８−３０位及び６１−８５位から選ばれたア
ミノ酸残基に存在する、少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントαサ
ブユニットのアミノ末端とカルボキシル末端エクステンションペプチドのカルボ
キシル末端で共有結合しているＣＴＥＰのアミノ末端とミュータントヒトＴＳＨ
βサブユニットのカルボキシル末端で共有結合しているヒトＴＳＨβサブユニッ
トのアミノ酸配列の１−３０位及び５３−８７位から選ばれたアミノ酸残基に少
なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含
むものである。
【０２３３】 他の好ましい実施態様としては、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、ヒト
αサブユニット配列（図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）参照）の２２位にアミノ
酸置換、好ましくは塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、多少好まし
くないがヒスチジン）、より好ましくはアルギニンによる置換を有するミュータ
ントαサブユニットを含む。
【０２３４】 具体的な実施態様として、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニッ
トを含むミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、機能的
に活性、即ち、ＴＳＨＲ結合、ＴＳＨＲシグナリング、及び細胞外分泌等の野生
型ＴＳＨに関連する一種又は二種以上の機能的活性を示すことができる。好まし
くは、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、好ましく
は野生型ＴＳＨよりも強い親和力で、ＴＳＨＲに結合することができる。また、
この様なミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、シグナ
ルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明
の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントＴＳＨヘテロ
ダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、野生型ＴＳＨよりも高いインビトロ生物活
性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ＴＳＨよりも長い血清半減期を有
する。本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び単鎖ＴＳＨアナログは、
公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０２３５】 ミュータントＴＳＨ及びアナログをコードするポリヌクレオチド また、本発明は、本発明のヒトＴＳＨ及びＴＳＨアナログのミュータントサブ
ユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個
の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによっ
て野生型ＴＳＨと比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせ
ているものである、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを
変更することのない塩基突然変異が好ましい。ここでは、２つのコード領域が融
合されているという場合には、核酸分子の３’末端が他の核酸分子の５’（又は
ペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレー
ムシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０２３６】 遺伝コードの同義性により、ミュータントα又はβサブユニットに同じアミノ
酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、本発明を実施するために使用できる。こ
れらは、特に限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコード
する異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、α
又はβサブユニットのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む
。
【０２３７】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントαサブユニットをコードする配
列を含む核酸分子であって、該ミュータントαサブユニットが、好ましくは該α
サブユニットのβヘアピンＬ１又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸
置換を含むものである、核酸分子を提供する。具体的な実施態様としては、本発
明は、図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示されたαサブユニットのアミノ酸配
列の２２位にアミノ酸置換、好ましくは塩基性アミノ酸、より好ましくはアルギ
ニンとの置換を有するミュータントαサブユニットをコードする核酸を提供する
。本発明は、更に、βサブユニットのβヘアピンＬ３ループ又はその近傍に好ま
しくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含み、及び／又はＣＴＥＰに共有
結合しているミュータントβサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提
供する。
【０２３８】 更に他の実施態様としては、本発明は、単鎖ＴＳＨアナログをコードする配列
を含む核酸分子であって、αサブユニットのβヘアピンＬ１ループ又はその近傍
に位置することが好ましい一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサ
ブユニットのコード領域が、βサブユニットのβヘアピンＬ３ループ又はその近
傍に位置することが好ましい一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントβ
サブユニットのコード領域と融合している、核酸分子を提供する。更に、ミュー
タントβサブユニットのカルボキシル末端がｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰ
を介してミュータントαサブユニットのアミノ末端に結合している単鎖ＴＳＨア
ナログをコードする核酸分子も提供する。好ましい実施態様としては、該核酸分
子は単鎖ＴＳＨアナログをコードし、ここでミュータントβサブユニットのカル
ボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末端に共有結合し、ＣＴＥＰのカルボキシル末
端はシグナルペプチド無しにミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結
合している。
【０２３９】 本発明の単鎖アナログは、適切なコーディングフレーム内で、ミュータントα
及びβサブユニットをコードする核酸配列を、公知の方法によって互いに連結し
、当業者に通常知られている方法によって、融合タンパクを発現させることによ
って作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチ
ドシンセサイザーの使用などのタンパク合成方法によって作製できる。
【０２４０】 ミュータントＴＳＨサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュー
タントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体
及びフラグメントの作製及び使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態
様としては、ミュータントサブユニット又はＴＳＨアナログは、これに限定はさ
れないが、例えば、ミュータントβサブユニットとｈＣＧのβサブユニットのＣ
ＴＥＰを含むか、又はミュータントβサブユニットとミュータントαサブユニッ
トを含む融合タンパクである。一つの実施態様としては、この様な融合タンパク
は、これに限定されるものではないが、リシン又はジフテリア毒素等の毒素類の
様な他のタンパクのコード配列にフレーム内で結合されたミュータント又は野生
型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な
融合タンパクは、適切なコードフレーム内で、公知の方法によって、所望のアミ
ノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、公知の方法によって融合
タンパクを発現させることによって作製できる。或いは、この様な融合タンパク
は、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用のような、タンパク合成方法によっ
て作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニットの部分を含み、異種タ
ンパク−コード配列に融合されたキメラ遺伝子も構成できる。具体的な実施態様
は、好ましくはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットの間
にペプチドリンカーを介して、ミュータントβサブユニットに融合されたミュー
タントαサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０２４１】 ミュータントＴＳＨサブユニットの構造及び機能解析 以下に、ミュータントＴＳＨサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及び
ＴＳＨアナログの構造決定方法、及びこれらのインビトロ活性及びインビボ生物
学的機能の解析方法を記載する。
【０２４２】 ミュータントα又はＴＳＨβサブユニットが一旦確認されれば、クロマトグラ
フィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマト
グラフィー）、遠心分離、溶解度差等の標準的な方法、又はタンパク精製のため
の他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、
適当なアッセイ（後述する免疫検定法等）を用いて評価できる。
【０２４３】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントαサブユニット及び／又は
ＴＳＨβサブユニットが確認されれば、そのサブユニットのアミノ酸配列は、例
えば、自動アミノ酸シークエンサーなどにより、タンパク配列決定の標準的な方
法によって決定できる。
【０２４４】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びその領域をコー
ドする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０２４５】 二次的な構造解析（Chou, P. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特別な二次構造をとるサブユニットの領域を同定するために行うことができ
る。
【０２４６】 構造解析のための他の方法を利用しても良い。これらの方法は、特に限定的で
はないが、Ｘ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及
びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986,
Computer Graphics and Molecular Modeling , in Current Communications in
Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ne
w York）等である。ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析
、配列アラインメントも、ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭｍリリース２１．２（コン
ベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc.,
York, 英国)等の当業界で利用できるコンピューターソフトウエアープログラム
を用いて行うことができる。
【０２４７】 ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＴ
ＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラ
グメントの機能的活性についても、各種の公知の方法で評価することができる。
【０２４８】 例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントＴＳＨについて、抗体に
結合する能力或いは結合するために野生型ＴＳＨ又はそのサブユニットと競合す
る能力を評価する場合には、公知の各種のイムノアッセイ法を用いることができ
、これに限定されるものではないが、これには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、イムノ
放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えば、コロ
イドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ
、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、
血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡア
ッセイ、及び電気泳動イムノアッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッ
セイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することによ
って認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、
特に二次結合がラベルされている場所を検出することによって認められる。免疫
検定法で結合を検出するための多くの手段が公知であり、本発明の範囲に含まれ
る。
【０２４９】 ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＴ
ＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラ
グメントの甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）への結合は、例えば、こ
れに限定されないが、Szkudlinski他（1993, Endocrinol. 133:1490-1503）によ
って記載された子ウシＴＳＨ等の他の種の放射腺ラベルしたＴＳＨのＴＳＨＲか
らの置換に基づく、インビトロアッセイ等の当該技術分野で公知の方法によって
決定できる。ミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナロ
グ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性も、例えば、Grossmann 他（19
95, Mol. Endocrinol. 9:948-958）によって開示された方法等のＴＳＨＲを発現
する細胞における環状ＡＭＰ刺激；及び、例えば、これに限定されないが、Szku
dlinski他（1993, Endocrinol. 133:1490-1503）に記載された、甲状腺細胞で摂
取されたチミジンの刺激に基づくアッセイ等によって測定できる。
【０２５０】 インビボ生物活性は、例えば、East-Palmer他（1995, Thyroid 5:55-59）によ
って記載されたミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、又は単鎖
アナログの注射後、マウスのＴ４分泌物の測定などの動物モデルにおけるＴＳＨ
Ｒ結合の生理的相関性によって決定できる。例えば、野生型ＴＳＨは及びミュー
タントＴＳＨは、６日間飲料水中に入れた３μｇ／ｍｌ Ｔ３を投与して、予め
抑制された内生的ＴＳＨを有する雄のアルビノSwiss Crl:CF-1マウスに腹腔内投
与される。６時間後、血液サンプルを眼窩腔及び血清Ｔ４から採取し、ＴＳＨレ
ベルをそれぞれの化学ルミネセンス検定（Nichols Institute）により測定する
。
【０２５１】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の大きさであり、タンパク濃度が１／２
に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＴＳＨの半減期は、例えば、
これに限定されるものではないが、抗−ＴＳＨ抗体を用いて、ミュータントＴＳ
Ｈの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントＴＳＨレベルを
測定する免疫検定法、又は放射線ラベルしたミュータントＴＳＨを投与後に対象
物から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＴＳＨの検出等
、一定期間後の対象物からのサンプルにおけるＴＳＨレベルを測定するいかなる
方法によっても決定できる。
【０２５２】 他の方法が当業者には公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０２５３】 診断及び治療における使用 本発明は、本発明の治療用物質（ここでは、治療薬という）の投与による各種
の病気及び障害の治療又は予防法を提供する。該治療薬は、図２（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）に示されたαサブユニットの２２位に少なくとも一個のアミノ酸置
換を有するミュータントαサブユニット及びミュータント又は野生型βサブユニ
ットを有するＴＳＨヘテロダイマー；好ましくはＬ１ループ（図２（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１）に示されたアミノ酸８−３０）又はその近傍に一個又は２個以上
のアミノ酸置換を有するミュータントαサブユニット及び好ましくはＬ３ループ
（図３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示されたアミノ酸５２−８７）又はその近
傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントβサブユニットを有
し、ｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰに共有結合したＴＳＨヘテロダイマー；
好ましくはＬ１ループ又はその近傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有する
ミュータントαサブユニット及び好ましくはＬ３ループ又はその近傍に一個又は
２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントβサブユニットを有し、該ミュー
タントαサブユニット及びミュータントβサブユニットは共有結合して単鎖アナ
ログを形成するＴＳＨヘテロダイマー、例えば、ミュータントαサブユニット及
びミュータントβサブユニット及びｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰが単鎖ア
ナログに共有結合しているＴＳＨヘテロダイマー、他の誘導体、これらのアナロ
グ及びフラグメント（例えば、上記したもの）、並びに本発明のＴＳＨヘテロダ
イマー、及びその誘導体、アナログ及びフラグメントをコードする核酸等を含む
。
【０２５４】 該治療薬を投与する被験者は、これに限定されるものではないが、好ましくは
雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物であり、好ましくは哺乳動
物である。好ましい例として、被験者は、ヒトである。一般的に、被験者と同じ
種である種起源の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、
ヒトミュータント及び／又は変性されたＴＳＨヘテロダイマー、誘導体若しくは
アナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与され
る。
【０２５５】 好ましくは、本発明の治療薬は、実質的に精製される。
【０２５６】 甲状腺機能低下症として示される多くの障害は、本発明の方法によって治療す
ることができる。ＴＳＨが欠如又は通常若しくは好ましいレベルと比べて減少し
ている障害は、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマー又はＴＳＨアナログ
の投与によって治療又は予防される。ＴＳＨレセプターが欠如若しくは通常のレ
ベルより減少しているか、或いは野生型ＴＳＨに対して無反応若しくは通常のＴ
ＳＨＲより反応性が低い障害も、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー又はＴＳＨ
アナログの投与によって治療できる。構造的に活性なＴＳＨＲは、甲状腺機能亢
進症に導くことができ、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログ
が拮抗薬として使用できることが予想される。
【０２５７】 具体例として、分化した甲状腺機能を刺激できるミュータントＴＳＨヘテロダ
イマー及びＴＳＨアナログが、予防を含む治療のために投与される。治療又は予
防できる病気及び障害としては、これに限定されるものではないが、甲状腺機能
低下症、甲状腺機能亢進症、甲状腺デベロップメント、甲状腺癌、良性甲状腺腫
、拡大甲状腺、アポプトシスからの甲状腺細胞保護などがある。
【０２５８】 ＴＳＨタンパク若しくはその機能、又はＴＳＨＲタンパク及びその機能の不存
在又はレベルの低下は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から
）得て、ＴＳＨ若しくはＴＳＨＲの発現したＲＮＡ又はタンパクのＲＮＡ若しく
はタンパクレベル、構造及び／又は活性をインビトロでアッセイするこによって
容易に検出できる。従って、特に限定的ではないが、ＴＳＨ又はＴＳＨＲタンパ
クを検出及び／又は視覚化する免疫検定（たとえなウエスタンブロット（Wester
n blot）、免疫沈降を行い、次いで、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、免疫細胞化学等による）及び／又はＴＳＨ又はＴＳＨＲ ｍＲ
ＮＡを検出及び／又は視覚化することによって、ＴＳＨ又はＴＳＨＲ発現を検出
する混成アッセイ等（ナーザンアッセイ（Northern assay), ドットブロット（d
ot blots)、in situハイブリッド形成など）、この分野で標準的な多くの方法を
利用できる。
【０２５９】 具体的な態様としては、本発明の治療薬は、甲状腺癌の治療に使用される。ミ
ュータントＴＳＨヘテロダイマー及びアナログは、放射性ヨウ素を用いた治療と
しての切除の前に、甲状腺及び転移組織の刺激に有用である。例えば、本発明の
ミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、放射線切除のための放射線ラベルされた
ヨウ素の投与の前に、甲状腺癌の患者に投与することができる。また、本発明の
治療薬は、多結節性甲状腺腫の治療としての放射線切除に先だって、良性の多結
節性甲状腺腫によるヨウ素摂取の刺激、又は拡大甲状腺の治療のための放射線切
除に先だって、甲状腺組織によるヨウ素摂取の刺激に使用できる。
【０２６０】 特に、放射線切除療法は、本発明の治療薬の投与、好ましくは該治療薬を筋肉
内に、例えば、これに限定されるものではないが、一日一回の投与を二日間、又
は７日間養生法において一日目、４日目及び７日目に一回投与する１〜３回投与
法によって行われる。投与量は、任意の適切な投与量、例えば、特に限定的では
無いが、約１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜１００μｇの投与量であ
る。上記養生法による最後の投与後一日目に、放射線ラベルヨウ素、好ましくは
１３１Ｉを、癌、非癌性甲状腺腫又は拡大甲状腺を治療するために充分な量を患
者に投与する。投与すべき放射線ラベルヨウ素の量は、疾患の種類及び激しさに
依存する。一般に、３０〜３００ｍＣｉの１３１Ｉが甲状腺腫瘍の治療のために
投与される。
【０２６１】 他の具体例としては、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、甲状腺
又は甲状腺癌細胞への治療薬の標的放出、例えば、遺伝子治療のための核酸の標
的放出（例えば、甲状腺癌細胞に向けた腫瘍抑制遺伝子の標的放出）又は、例え
ば、これに限定されないが、リシン、ジフテリア毒素等の毒素類の標的放出に使
用することができる。
【０２６２】 本発明は、更に、甲状腺癌、好ましくは甲状腺カルシノーマの診断、予知、ス
クリーニング方法、及び、例えば、本発明のＴＳＨヘテロダイマーの投与による
、甲状腺癌治療のモニタリング方法を提供する。具体的な態様として、本発明の
治療薬は、甲状腺細胞（甲状腺癌細胞を含む）のヨウ素摂取（特に限定的ではな
いが、好ましくは１３１Ｉ又は１２５Ｉ等の放射線ラベルヨウ素）を刺激するた
め、及び／又は甲状腺細胞（甲状腺癌細胞を含む）からの甲状腺グロブリンの分
泌を刺激するために患者に投与される。該治療薬の投与に続いて、放射線ラベル
ヨウ素を患者に投与し、ついで、患者における放射線ラベルヨウ素の存在及び局
所化（すなわち、甲状腺細胞）を検出し（例えば、限定的ではないが、全身スキ
ャニングによって）、及び／又は患者における甲状腺グロブリンのレベルを測定
又は検出する。ここで、甲状腺癌又は甲状腺疾患の無い患者のレベル又は標準的
なレベルと比べて、放射性ヨウ素摂取量のレベルの増加、又は甲状腺グロブリン
分泌のレベルの増加は、この患者が甲状腺癌を持つことを示す。ある種の患者は
甲状腺除去又は甲状腺組織切除療法を受けたことがあるようであり、残存する甲
状腺組織がほとんど又は全く存在しない。このような患者、又は非癌性甲状腺細
胞を欠如する他のいかなる患者も、どのようなヨウ素摂取又は甲状腺グロブリン
分泌の検出（甲状腺除去若しくは切除療法の後、又は他の理由による甲状腺組織
の喪失の後に残る残存レベルを上回る）であっても、甲状腺癌細胞の存在を示す
。患者に導入された放射線ラベルヨウ素の局在化は、疾患又は悪性腫瘍の広がり
又は転移を検出するために使用できる。更に、本発明の診断方法は、治療の過程
に応じて放射線ラベルヨウ素又は甲状腺グロブリンレベルの変化を測定するか、
又は甲状腺腫瘍の退化若しくは成長又は転移を検出することによって、甲状腺癌
の治療をモニターするために使用できる。
【０２６３】 特に、診断方法は、本発明の治療薬の投与、好ましくは該治療薬を筋肉内に、
例えば、これに限定されるものではないが、一日一回の投与を二日間、又は７日
間養生法において一日目、４日目及び７日目に一回投与する１〜３回投与法で投
与することによって行われる。投与量は、任意の適切な投与量、例えば、特に限
定的では無いが、約１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜１００μｇの投
与量である。上記養生法による最後の投与後一日目に、放射線ラベルヨウ素、好
ましくは１３１Ｉを、甲状腺細胞（ガン細胞を含む）の検出に充分な量だけ患者
に投与する。一般に、１〜５ｍＣｉの１３１Ｉが、甲状腺カルシノーマを診断す
るために投与される。放射線ラベルヨウ素の投与の２日後に、患者における放射
線ラベルヨウ素の摂取は、例えば、これには限定されないが、全身放射性ヨウ素
スキャニングによって、患者において検出及び／又は局所化される。あるいは、
甲状腺細胞の全て又はほとんどが取り除かれている場合には（例えば、既に甲状
腺除去若しくは甲状腺組織切除療法を行った患者）、甲状腺グロブリンレベルは
、本発明の治療薬の最終投与後、２〜７日目に測定できる。甲状腺グロブリンは
、当業界に公知の甲状腺グロブリンに特有の免疫放射線検定法の利用を含む、当
業者に公知のあらゆる方法で測定できる。
【０２６４】 また、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、例えばKakinurma他（1
997, J. Clin., Endo. Met. 82 ; 2129-2134)に記載された、ＴＳＨレセプター
自己抗体に対するＴＳＨ結合抑制アッセイで使用できる。ＴＳＨレセプターに対
する抗体は、例えば、特に限定的ではないが、グレイブ疾患（Graves' disease
)及び橋本甲状腺炎（Hashimoto' s thyroiditis）等のある種の甲状腺疾患にお
いて含まれ、従って、これらの結合抑制アッセイは、グレイブ疾患及び橋本甲状
腺炎等の甲状腺疾患の診断として使用できる。簡単に言えば、該ＴＳＨレセプタ
ーを含む細胞又は膜を、ＴＳＨＲ抗体に対して試験されるべきサンプル及び本発
明の放射線ラベルミュータントＴＳＨと接触させ、試験されるサンプルと接触さ
せることなく、放射線ラベルミュータントＴＳＨと接触させた細胞又は膜に対す
る結合と比べて、本発明の放射線ラベルミュータントＴＳＨの結合が抑制される
ことは、試験すべきサンプルがＴＳＨレセプターに結合する抗体を有することを
示すものである。野生型ＴＳＨより高い生物活性を有する本発明のミュータント
ＴＳＨヘテロダイマーを使用した結合抑制アッセイは、野生型ＴＳＨを用いた結
合抑制アッセイを行うよりも、抗−ＴＳＨレセプター抗体に対する高い感受性を
有する。
【０２６５】 従って、本発明の実施態様は、ＴＳＨレセプターを含む培養された細胞又は単
離された膜を、患者からの抗体を含むと思われるサンプル及び診断のための有効
量の放射線ラベルされた本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーと接触させ
、放射線ラベルされたミュータントＴＳＨの培養された細胞又は単離された膜に
対する結合を測定することを含む方法であって、この場合、該サンプルの非存在
下又はこの病気若しくは障害を有さない類似サンプルの存在下での結合と比べて
、放射線ラベルされたＴＳＨの結合が減少することは、この病気又は障害が存在
することを示すものである、ＴＳＨＲに対する抗体の存在によって特徴づけられ
る病気又は障害、好ましくは、グレイブ疾患を診断又はスクリーニングする方法
を提供する。
【０２６６】 また、ミュータントヘテロダイマー及びアナログは、自律性過機能甲状腺結節
又は外因性甲状腺ホルモン療法による患者における抑制されているが、機能的で
ある甲状腺組織を検出する診断方法においても使用できる。ミュータントＴＳＨ
ヘテロダイマー及びＴＳＨアナログは、限定的ではないが、中枢性及び結合され
た一次性及び中枢性甲状腺機能低下、甲状腺の片側萎縮、及びＴＳＨ作用に対す
る抵抗性の診断に関連するその他の応用を有することができる。
【０２６７】 ｈＣＧβサブユニットのミュータント 繊毛性性腺刺激ホルモンのヒトβサブユニットは、図４（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ
：２）に示される１４５個のアミノ酸を含む。本発明は、ｈＣＧのβサブユニッ
トが、βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位
置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである該サブユニットのミュータ
ントであって、該ミュータントが、全体又は一部について、例えば、ＴＳＨへの
融合等、他のＣＫＧＦタンパクに融合されているか、又はｈＣＧヘテロダイマー
の一部であるものを意図する。本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマーは、
野生型サブユニットと比べて、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸
残基の置換、欠損又は挿入を含むβサブユニットを有する。
【０２６８】 また、本発明は、Ｃｙｓ残基を除き、図４（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３）に示さ
れたものを含む、１及び３７位の間に１個又は２個以上のアミノ酸置換を有する
Ｌ１ヘアピンループを有するミュータントｈＣＧβサブユニットも提供する。該
アミノ酸置換は、次のものを含む：S1X, K2X, E3X, P4X, L5X, R6X, P7X, R8X,
R10X, P11X, I12X, N13X, A14X, T15X, L16X, A17X, V18X, E19X, K20X, E21X,
G22X, P24X, V25X, I27X, T28X, V29X, N30X, T31X, T32X, I33X, A35X, G36X,
及びY37X。
【０２６９】 この具体例の他の態様では、ｈＣＧβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにお
ける中性又は酸性アミノ酸残基が、突然変異している。突然変異したサブユニッ
トは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列に少
なくとも一個の突然変異を含む：S1B, E3B, P4B, L5B, P7B, R8B, R10B, P11B,
I12B, N13B, A14B, T15B, L16B, A17B, V18B, E19B, E21B, G22B, P24B, V25B,
I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, I33B, A35B, G36B, 及び Y37B。
【０２７０】 また、塩基性残基がｈＣＧβサブユニットモノマー配列に存在する場所に酸性
アミノ酸残基を導入することも意図されている。この例では、変数“Ｘ”は、酸
性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電
特性をよりネガティブ状態に変化させる働きをする。この様なアミノ酸置換の例
は、K2Z, K6Z, K8Z, K10Z, 及びK20Z（“Ｚ”は酸性アミノ酸残基である）を一
個又は二個以上含む。
【０２７１】 又、本発明は、電荷を有する残基を中性残基に突然変異させることによって、
Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例え
ば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数“Ｘ”が中性アミノ酸に対応する
上記したＬ１配列に導入することができる。他の具体例としては、一個又は二個
以上の中性残基を、K2U, E3U, R6U, R8U, R10U, E19U, K20U 及びE21U（“Ｕ”
は中性アミノ酸である）に導入することができる。
【０２７２】 無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ１ヘアピンルー
プアミノ酸配列における一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミ
ュータントｈＣＧβサブユニットモノマータンパクが提供される。中性のアミノ
酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は次のものである：
【０２７３】
【化３】 （ここで、“Ｚ”は、酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミノ酸である）。
【０２７４】 本発明は、また、Ｃｙｓ残基を除き、図４（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３）に示
されたものを含む、Ｌ３ヘアピンループが５８及び８７位の間に１個又は２個以
上のアミノ酸置換を有するミュータントｈＣＧβサブユニットであるミュータン
トＣＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：N58X
, Y59X, R60X, D61X, V62X, R63X, F64X, E65X, S66X, I67X, R68X, L69X, P70X
, G71X, C72X, P73X, R74X, G75X, V76X, N77X, P78X, V79X, V80X, S81X, Y82X
, A83X, V84X, A85X, L86X及びS87X（“Ｘ”はアミノ酸残基であり、該置換は、
ヘアピンループの静電的性質を変更する。）。
【０２７５】 本発明の他の例では、ｈＣＧβサブユニット、Ｌ３ループにおける中性又は酸
性アミノ酸残基が突然変異している。突然変異したサブユニットは、次のアミノ
酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列に少なくとも一個の突
然変異を含む：N58B, Y59B, D61B, V62B, F64B, E65B, S66B, I67B, L69B, P70B
, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B
, A85B, L86B, 及びS87B（“Ｂ”は塩基性アミノ酸である）。
【０２７６】 本発明は、更に、ｈＣＧβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に
一個又は二個以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば一個又は２個以
上の酸性アミノ酸を、変数“Ｘ”が酸性アミノ酸に対応する上記した配列に導入
することができる。この様な突然変異の具体例は、R60Z, R63Z, R68Z及びR73Z（
“Ｚ”は酸性アミノ酸残基である）である。
【０２７７】 本発明は、また、電荷を有する残基をこの領域において中性残基に突然変異さ
せることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させる
ことも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数“Ｘ”が中
性アミノ酸に対応する上記したＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入すること
ができる。例えば、一個又は二個以上の中性残基をR60U, D61U, R63U, E65U, R6
8U, 及びR74U（“Ｕ”は中性アミノ酸である）に導入することができる。
【０２７８】 Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列において非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷
を有する残基に変換する一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミ
ュータントｈＣＧβサブユニットタンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を
電荷を有する残基に変換する突然変異の例は下記の通りである：N58Z, Y59Z, V6
2Z, F64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, N77Z, P7
8Z, V79Z, V80Z, S81Z, Y82Z, A83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, N58B, Y59B, V6
2B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, N77B, P7
8B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B（“Ｚ”は酸
性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミノ酸である）。
【０２７９】 また、本発明は、これらのヘアピンループの構造又は配置を変換するβヘアピ
ンループ構造の外部の突然変異を含むｈＣＧβサブユニットも意図する。これら
の構造変化は、二量体分子に含まれるｈＣＧβサブユニットのβヘアピンループ
構造の領域と該二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電
的相互作用を増加させる働きをする。これらの突然変異は、ｈＣＧβサブユニッ
トモノマーの３８−５７位及び８８−１４０位からなるグループから選ばれた位
置において見られる βヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外部の突然変異の具体例は、次の通りで
ある。
【０２８０】
【化４】 変数“Ｊ”は、その導入が、ｈＣＧβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピン
ループ構造とミュータントｈＣＧβサブユニットモノマーを含む二量体タンパク
に対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる何れか
のアミノ酸である。
【０２８１】 本発明は、また、変性された形態の多くのｈＣＧβサブユニットも意図する。
これらの変性された形態は、他のシスチンノット成長要因又は該モノマーのフラ
クションに結合されたｈＣＧβサブユニットを含む。
【０２８２】 具体的な態様としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニット
を含むミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧβサブ
ユニットアナログが、機能的に活性、即ち、ｈＣＧβサブユニットレセプター結
合、ｈＣＧβサブユニットタンパク族レセプターシグナリング及び細胞外分泌な
どの野生型ｈＣＧβサブユニットに関連する一又は二以上の機能的活性を示すこ
とができる。好ましくは、ミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又
は単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、ｈＣＧβサブユニットレセプターと、
好ましくは野生型ｈＣＧβサブユニットより大きい親和性をもって、結合するこ
とができる。また、ミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖
ｈＣＧβサブユニットアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーする
ことが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブ
ユニットを含むミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣ
Ｇβサブユニットアナログは、野生型ｈＣＧβサブユニットより高いインビトロ
生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＣＧβサブユニットより
も長い血清半減期を有する。本発明のミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロ
ダイマー及び単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、公知の方法によって、所望
の活性をテストすることができる。
【０２８３】 一つの実施態様として、本発明は、ミュータントＴＳＨ又はミュータントｈＣ
Ｇ等の、上記したミュータントα及び／又はβサブユニットを少なくとも一個含
むヘテロダイマータンパクであるミュータントｈＣＧを提供する。該ミュータン
トサブユニットは、一個又は二個以上のアミノ酸置換を含む。
【０２８４】 具体例としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含む
ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、機能的に活性、
即ち、ｈＣＧＲ結合、ｈＣＧＲシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ｈＣＧ
βサブユニットと関連する一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ま
しくは、該ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、ｈＣ
ＧＲに、好ましくは野生型ｈＣＧより大きい親和性をもって、結合することがで
きる。また、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、シ
グナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本
発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＣＧヘ
テロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、野生型ｈＣＧより高いインビトロ生物
活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＣＧよりも長い血清半減期を
有する。本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマー及び単鎖ｈＣＧアナログは
、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０２８５】 ミュータントｈＣＧサブユニット及びアナログをコードするポリヌクレオチ ド また、本発明は、本発明のヒトｈＣＧβサブユニット及びｈＣＧサブユニット
及びアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であ
って、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれら
の組み合わせを含み、これによって野生型タンパクと比べて一個又は複数のアミ
ノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域の
リーディングフレームを変更することのない塩基突然変異が好ましい。ここでは
、２つのコード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３’末端が他
の核酸分子の５’（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連
結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に
進行する。
【０２８６】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーに同じア
ミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、本発明を実施するために使用できる
。これらは、特に限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコ
ードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる
、サブユニット又は分子のコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を
含む。
【０２８７】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントｈＣＧサブユニットをコードす
る配列を含む核酸分子であって、該ミュータントｈＣＧサブユニットサブユニッ
トが、標的タンパクのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ま
しくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供
する。本発明は、また、それらのループとｈＣＧサブユニット全タンパクの同族
レセプターの間の静電的相互作用が増加するように、Ｌ１及び／又はＬ３ループ
の外部にアミノ酸置換を有するミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットを
コードする核酸分子も提供する。本発明は、更に、ｈＣＧサブユニットサブユニ
ットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する
一個又は複数のアミノ酸置換を含み、及び／又はＣＴＥＰ又は他のＣＫＧＦタン
パクに共有結合しているミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットをコード
する配列を含む核酸分子を提供する。
【０２８８】 更に他の実施態様としては、本発明は、ｈＣＧサブユニットアナログをコード
する配列を含む核酸分子であって、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータ
ントｈＣＧサブユニットサブユニットのコード領域が対応する二量体単位のコー
ド領域と融合し、これは野生型サブユニット又は他の突然変異したモノメリック
サブユニットであることができる、核酸分子を提供する。更に、ミュータントｈ
ＣＧサブユニットモノマーのカルボキシル末端が、ｈＣＧのβサブユニットのＣ
ＴＥＰ等、他のＣＫＧＦタンパクのアミノ末端に結合している、単鎖ｈＣＧサブ
ユニットアナログをコードする核酸分子も提供する。更に、他の実施態様として
は、核酸分子は、単鎖ｈＣＧサブユニットアナログをコードするものであり、こ
こでミュータントｈＣＧサブユニットモノマーのカルボキシル末端がＣＴＥＰの
アミノ末端等の他のアミノ末端ＣＫＧＦタンパクに共有結合し、結合したアミノ
酸配列のカルボキシル末端がシグナルペプチド無しにミュータントｈＣＧサブユ
ニットモノマーのアミノ末端に共有結合している。
【０２８９】 本発明の単鎖アナログは、適切なコーディングフレーム内で、ｈＣＧサブユニ
ットのモノメリックサブユニットをコードする核酸配列を、公知の方法によって
互いに連結し、公知の方法によって、融合タンパクを発現させることによって作
製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチドシン
セサイザーの使用などのタンパク合成方法によって作製できる。
【０２９０】 ミュータントｈＣＧサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイ
マー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製
及び使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータン
トサブユニット又はｈＣＧアナログは、これに限定はされないが、例えば、ミュ
ータントβサブユニットと他のＣＫＧＦタンパク若しくはそのフラグメントを含
むか、又はミュータントβサブユニットとミュータントαサブユニットを含む融
合タンパクである。一つの実施態様としては、この様な融合タンパクは、これに
限定されるものではないが、リシン又はジフテリア毒素等の毒素類の様な他のタ
ンパクのコード配列にフレーム内で結合されたミュータント又は野生型サブユニ
ットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパ
クは、適切なコードフレーム内で、公知の方法によって、所望のアミノ酸配列を
コードする適切な核酸配列を互いに連結し、公知の方法によって融合タンパクを
発現させることによって作製できる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば
、ペプチドシンセサイザーの使用のような、タンパク合成方法によって作製でき
る。ミュータントα及び／又はβサブユニットの部分を含み、異種タンパク−コ
ード配列に融合されたキメラ遺伝子も構成できる。具体的な実施態様は、好まし
くはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットの間にペプチド
リンカーを介して、ミュータントβサブユニットに融合されたミュータントαサ
ブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０２９１】 ミュータントｈＣＧサブユニットの構造及び機能解析 以下に、ミュータントｈＣＧサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及び
ｈＣＧアナログの構造決定方法、及びこれらのインビトロ活性及びインビボ生物
学的機能の解析方法を記載する。
【０２９２】 ミュータントｈＣＧβサブユニットが一旦確認されれば、クロマトグラフィー
（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフ
ィー）、遠心分離、溶解度差等の標準的な方法、又はタンパク精製のための他の
標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当な
アッセイ（後述する免疫検定法等）を用いて評価できる。
【０２９３】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントｈＣＧサブユニットが一旦
確認されれば、そのサブユニットのアミノ酸配列は、例えば、自動アミノ酸シー
クエンサーなどにより、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０２９４】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びその領域をコー
ドする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０２９５】 二次的な構造解析（Chou, P. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特別な二次構造をとるサブユニットの領域を同定するために行うことができ
る。
【０２９６】 構造解析のための他の方法を利用しても良い。これらの方法は、特に限定的で
はないが、Ｘ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及
びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986,
Computer Graphics and Molecular Modeling , in Current Communications in
Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ne
w York）等である。ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析
、配列アラインメントも、ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベ
ックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., Y
ork, 英国)等の当業界で利用できるコンピューターソフトウエアープログラムを
用いて行うことができる。
【０２９７】 ミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈ
ＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性に
ついても、各種の公知の方法で評価することができる。
【０２９８】 例えば、ミュータントｈＣＧβサブユニット又はミュータントｈＣＧについて
、抗体に結合する能力或いは結合するために野生型ｈＣＧ又はそのサブユニット
と競合する能力を評価する場合には、公知の各種のイムノアッセイ法を用いるこ
とができ、例えば、これに限定されるものではないが、これには、ラジオイムノ
アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドウィッチ”イムノ
アッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ
、（例えば、コロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in sit
uイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲ
ル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ
、プロテインＡアッセイ、及び電気泳動イムノアッセイ等の方法を用いた競合的
及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを
検出することによって認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一
次抗体への結合、特に二次結合がラベルされている場所を検出することによって
認められる。免疫検定法で結合を検出するための多くの手段が公知であり、本発
明の範囲に含まれる。
【０２９９】 ミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈ
ＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントのヒト絨毛性性
腺刺激ホルモンレセプター（ｈＣＧＲ）への結合は、これに限定されないが、例
えば、野生型ｈＣＧによる放射線ラベルされたミュータントｈＣＧのｈＣＧＲか
らの置換に基づく、インビトロアッセイ等の当該技術分野で公知の方法によって
決定できる。ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナロ
グ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性も、細胞に基づくアッセイ（ce
ll-based assay）で測定できる。例えば、形質転換されたライディッヒ腫瘍細胞
系ＭＡ−１０（Dr. Mario Ascoli, University of Iowa, Iowa City, IA）が、
本発明のミュータントｈＣＧタンパクの生物活性の測定に使用される。この細胞
は、１５％ウマ血清（Hyclone Laboratory, Park City, UT）、４．７７ｇ／Ｌ
ヘペス（Hepes）、２．２４ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン
、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１
．０μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（増殖培地）を追加されたウエイマウス（Waym
outh）ＭＢ７５２／１培地で増殖される。細胞は、５％ＣＯ２中で３７℃に維持
され、継代５と１５の間でアッセイに使用される。細胞は、増殖培地１ｍｌ中で
ウェルについて２．５×１０５細胞の濃度で２４−ウエルプレート中にプレート
される。最初の４８時間の培養に続いて、培地は、ウマ血清に代えて１ｍｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡを含む増殖培地１ｍｌで置き換えられる。ほぼ１２時間後、ｈＣＧ又
はＬＨ誘発プロゲステロン生成のレベルが、２時間アッセイにおいて測定される
。
【０３００】 野生型ｈＣＧタンパクの標準ラインは、プロゲステロン生成が最大５０％（Ｅ
Ｃ５０）で刺激される濃度を決定する各アッセイで含まれる。ｈＣＧのＥＣ５０
は、０．１２５ｎＭである。各２４−ウエルプレートは、変性された増殖培地（
ウマ血清を含まない１０μｇ／ｍｌＢＳＡ）４５０μｌ及び無菌の脱イオン蒸留
水５０μｌからなる３個の参照ウエルを含む。また、各プレートは、５００μｌ
中に０．１２５ｍＭの最終濃度のｈＣＧ野生型タンパクを含む参照ウエルと同様
の培地を含む２個のウエルを有する。テストウエルは、５００μｌ中にミュータ
ントｈＣＧタンパク０．１２５ｎＭを含有した。ホルモン添加２時間後、培地を
取り入れ、後でプロゲステロンを解析するために冷凍保存する。次いで、細胞単
層を塩水で一回洗浄し、５００μｌデタージェント（Triton X-100）でインキュ
ベートし、タンパク濃度分析のために冷凍保存する。プロゲステロン濃度は、放
射線免疫検定キット（Diagnostic Pruducts, Los Angels, CA）を用いて決定さ
れる。プロゲステロン値の大きな変化が、細胞数の相違に依存するのであれば、
タンパクレベルが決定される。
【０３０１】 プロゲステロンの生成量が、テストされるタンパクの野生型形態を含むウエル
とミュータントタンパクを含むウエルとの間で比較される。テストされるミュー
タントタンパクの生物活性が、ミュータントタンパクによって示された野生型プ
ロゲステロン生成のパーセンテージとして表される。このアッセイの例は、Morb
eck, 他., Mole. and Cell. Endocrinol., 97:173-181(1993)に見られる。
【０３０２】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の大きさであり、タンパク濃度が１／２
に減少するために必要な時間を示す。ミュータントｈＣＧの半減期は、例えば、
これに限定されるものではないが、抗−ｈＣＧ抗体を用いて、ミュータントｈＣ
Ｇの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントｈＣＧレベルを
測定する免疫検定法、又は放射線ラベルしたミュータントｈＣＧの投与後に対象
物から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータンｈＣＧの検出等、
一定期間後の対象物からのサンプルにおけるｈＣＧレベルを測定するいかなる方
法によっても決定できる。
【０３０３】 他の方法が当業者には公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０３０４】 診断及び治療における使用 本発明は、本発明の治療用物質（ここでは、治療薬という）の投与による各種
の病気及び障害の治療又は予防法を提供する。該治療薬は、ミュータントα及び
ミュータント又は野生型のいずれかのｈＣＧβサブユニットを有するｈＣＧヘテ
ロダイマー；Ｌ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に一個又は二個以上のアミ
ノ酸置換を好ましくは有するミュータントαサブユニット及びＬ１及び／又はＬ
３ループ又はその近傍に一個又は二個以上のアミノ酸置換を好ましくは有するミ
ュータントβサブユニットを有し、全体又は部分的に他のＣＫＧＦタンパクに共
有結合しているｈＣＧヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット、及びミュ
ータントβサブユニットを有し、ここでミュータントαサブユニットとミュータ
ントβサブユニットは共有結合して単鎖を形成するｈＣＧヘテロダイマー、例え
ば、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及び他のＣＫ
ＧＦタンパクが単鎖アナログに共有結合しているｈＣＧヘテロダイマー、他の誘
導体、これらのアナログ及びフラグメント（例えば、上記したもの）、並びに本
発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマー、及びその誘導体、アナログ及びフラ
グメントをコードする核酸等を含む。
【０３０５】 該治療薬を投与する被験者は、これに限定されるものではないが、好ましくは
雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物であり、好ましくは哺乳動
物である。好ましい例として、被験者は、ヒトである。一般的に、被験者と同じ
種である種起源の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、
ヒトミュータント及び／又は変性されたｈＣＧヘテロダイマー、誘導体若しくは
アナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与され
る。
【０３０６】 好ましくは、本発明の治療剤は、実質的に精製される。
【０３０７】 ヒト繊毛性性腺刺激ホルモンは、妊娠期間に胎盤から大量に分泌される。この
ホルモンは、胎児の検査において、ライディッヒ細胞（Leydig cell)の形成を刺
激し、テストステロンの分泌を引き起こす。胎児の発育中にテストステロン分泌
は男性生殖器の形成を促進するために重要なので、不十分なｈＣＧは男性におけ
る性機能低下につながる。この状態の一つの形態が、低ゴナドトロピン性性機能
低下である。ｈＣＧが不存在であるか、又は正常若しくは望まれるレベルより低
い低ゴナドトロピン性性機能低下などの障害は、本発明のミュータントｈＣＧヘ
テロダイマー又はｈＣＧアナログの投与によって治療又は予防することができる
。ｈＣＧレセプターが欠如若しくは通常のレベルより低い、或いは野生型ｈＣＧ
に対して無反応若しくは正常なｈＣＧＲより反応性が低い障害も、ミュータント
ｈＣＧヘテロダイマー又はｈＣＧアナログの投与によって治療できる。構造的に
活性なｈＣＧＲは、性機能亢進に導くことができ、ミュータントｈＣＧヘテロダ
イマー及びｈＣＧアナログが拮抗薬として使用できることが予想される。
【０３０８】 また、ｈＣＧの投与は、黄体機能不全の治療に有効であることも示されている
。Blumenfeld & Nahhas, Fertil. Steril., 50(3):403-7(1988)。従って、本発
明のミュータントｈＣＧタンパクは、黄体機能不全の治療に使用できる。
【０３０９】 更に、本発明は、卵巣、膵臓、胃及び肝細胞の癌の診断、予知、スクリーニン
グ方法、及び睾丸癌の治療のモニタリング方法を提供する。
【０３１０】 ｈＬＨβサブユニットのミュータント ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）のヒトβサブユニットは、図５（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ：４）に示される１２１個のアミノ酸を含む。本発明は、ｈＬＨのβサブ
ユニットが、該βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその
近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである該βサブユニット
のミュータントであって、該ミュータントが、ＴＳＨ又は他のＣＫＧＦタンパク
に融合されているか、又はｈＬＨヘテロダイマーの一部であるものを意図する。
【０３１１】 本発明のミュータントｈＬＨヘテロダイマーは、野生型サブユニットと比べて
、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠損又は挿入を
含むβサブユニットを有する。更に、本発明は、Ｃｙｓ残基を除き、図５（ＳＥ
Ｑ．ＩＤ ＮＯ：４）に示されたものを含む、１及び３３位の間に１個又は２個
以上のアミノ酸置換を有するＬ１ヘアピンループを有するミュータントｈＬＨβ
サブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：W8X, H10X, P11
X, I12X, N13X, A14X, I15X, L16X, A17X, V18X, E19X, K20X, E21X, G22X, P24
X, V25X, I27X, T28X, V29X, N30X, T31X, T32X, 及びI33X。
【０３１２】 この具体例の他の態様では、ｈＬＨβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにお
ける中性又は酸性アミノ酸残基が、突然変異している。突然変異したサブユニッ
トは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列に少
なくとも一個の突然変異を含む：W8B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A
17B, V18B, E19B, E21B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T
32B, 及びI33B。
【０３１３】 また、塩基性残基がｈＬＨβサブユニットモノマー配列に存在する場所に酸性
アミノ酸残基を導入することも意図されている。この例では、変数“Ｘ”は、酸
性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電
特性をよりネガティブ状態に変化させる働きをする。この様なアミノ酸置換の例
は、下記の１個又は二個以上である：R2Z, R6Z, H10Z, 及びK20Z（“Ｚ”は酸性
アミノ酸残基である）。
【０３１４】 又、本発明は、電荷を有する残基を中性残基に突然変異させることによって、
Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例え
ば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数“Ｘ”が中性アミノ酸に対応する
上記したＬ１配列に導入することができる。他の具体例としては、一個又は二個
以上の中性残基を、R2U, E3U, R6U, E19U, K20U 及びE21U（“Ｕ”は中性アミノ
酸である）で導入することができる。
【０３１５】 無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ１ヘアピンルー
プアミノ酸配列における一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミ
ュータントｈＬＨβサブユニットモノマータンパクが提供される。中性のアミノ
酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は次のものである：S1Z, P4Z
, L5Z, P7Z, W8Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, I15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G2
2Z, C23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, S1
B, P4B, L5B, P7B, W8B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V1
8B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B,及
びI33B（“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミノ酸である）。
【０３１６】 本発明は、また、Ｃｙｓ残基を除き、図５（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４）に示さ
れたものを含む、Ｌ３ヘアピンループが５８及び８７位の間に１個又は２個以上
のアミノ酸置換を有するミュータントｈＬＨβサブユニットであるミュータント
ＣＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：N58X,
Y59X, R60X, D61X, V62X, R63X, F64X, E65X, S66X, I67X, R68X, L69X, P70X,
G71X, C72X, P73X, R74X, G75X, V76X, N77X, P78X, V79X, V80X, S81X, Y82X,
A83X, V84X, A85X, L86X, 又はS87X。
【０３１７】 本発明の他の例では、ｈＬＨβサブユニット、Ｌ３ヘアピンループにおける中
性又は酸性アミノ酸残基が突然変異している。突然変異したサブユニットは、次
のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列に少なくとも
一個の突然変異を含む：N58B, Y59B, D61B, V62B, F64B, E65B, S66B, I67B, L6
9B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V79B, V80B, S81B, Y8
2B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B。
【０３１８】 本発明は、更に、ｈＬＨβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に
一個又は二個以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば一個又は２個以
上の酸性アミノ酸を、変数“Ｘ”が酸性アミノ酸に対応する上記した配列に導入
することができる。この様な突然変異の具体例は、R60Z, R63Z, R68Z, 及びR74Z
（“Ｚ”は酸性アミノ酸残基である）である。
【０３１９】 本発明は、また、電荷を有する残基をこの領域において中性残基に突然変異さ
せることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させる
ことも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数“Ｘ”が中
性アミノ酸に対応する上記したＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入すること
ができる。例えば、一個又は二個以上の中性残基を、R60U, D61U, R63U, E65U,
R68U, R74U, 及びD77U（“Ｕ”は中性アミノ酸である）で導入することができる
。
【０３２０】 無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ３ヘアピンルー
プアミノ酸配列において一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミ
ュータントｈＬＨβサブユニットタンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を
電荷を有する残基に変換する突然変異の例は下記の通りである：T58Z, Y59Z, V6
2Z, I64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, P78Z, V7
9Z, V80Z, S81Z, F82Z, P83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, T58B, Y59B, V62B, I6
4B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, P78B, V79B, V8
0B, S81B, F82B, P83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B（“Ｚ”は酸性アミノ酸、
“Ｂ”は塩基性アミノ酸である）。
【０３２１】 また、本発明は、これらのヘアピンループの構造又は配置を変換するβヘアピ
ンループ構造の外部の突然変異を含むｈＬＨβサブユニットも意図する。これら
の構造変化は、二量体分子に含まれるｈＬＨβサブユニットのβヘアピンループ
構造の領域と該二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電
的相互作用を増加させる働きをする。これらの突然変異は、ｈＬＨβサブユニッ
トモノマーの３４−５７位及び８８−１２１位からなるグループから選ばれた位
置において見られる βヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外部の突然変異の具体例は、次の通りで
ある：
【０３２２】
【化５】 変数“Ｊ”は、その導入が、ｈＬＨβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピン
ループ構造とミュータントｈＬＨβサブユニットモノマーを含む二量体タンパク
に対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる何れか
のアミノ酸である。
【０３２３】 本発明は、また、変性された形態の多くのｈＬＨβサブユニットも意図する。
これらの変性された形態は、他のシスチンノット成長要因（cystine not growth
factor）又は該モノマーのフラクションに結合されたｈＬＨβサブユニットを
含む。
【０３２４】 具体的な態様としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニット
を含むミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブ
ユニットアナログが、機能的に活性、即ち、ｈＬＨβサブユニットレセプター結
合、ｈＬＨβサブユニットタンパク族レセプターシグナリング及び細胞外分泌な
どの野生型ｈＬＨβサブユニットに関連する一又は二以上の機能的活性を示すこ
とができる。好ましくは、ミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又
は単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、ｈＬＨβサブユニットレセプターと、
好ましくは野生型ｈＬＨβサブユニットより大きい親和性をもって、結合するこ
とができる。また、ミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖
ｈＬＨβサブユニットアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーする
ことが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブ
ユニットを含むｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブユニ
ットアナログは、野生型ｈＬＨβサブユニットより高いインビトロ生物活性及び
／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＬＨβサブユニットよりも長い血清半
減期を有する。本発明のミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー及び
単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテス
トすることができる。
【０３２５】 一つの実施態様として、本発明は、ミュータントＴＳＨ又はミュータントｈＬ
Ｈ等の、上記したミュータントα及び／又はβサブユニットを少なくとも一個含
むヘテロダイマータンパクであるミュータントＣＫＧＦを提供する。該ミュータ
ントサブユニットは、一個又は二個以上のアミノ酸置換を含む。
【０３２６】 具体例としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含む
ミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、機能的に活性、即ち
、ＬＨＲ結合、ＬＨＲシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ＬＨと関連する
一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、該ミュータントＬ
Ｈヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、ＬＨＲに、好ましくは野生型ＬＨよ
り大きい親和性をもって、結合することができる。また、ミュータントＬＨヘテ
ロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーす
ることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサ
ブユニットを含むミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、野
生型ＬＨより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生
型ＬＨよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントＬＨヘテロダイマ
ー及び単鎖ｈＬＨアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストするこ
とができる。
【０３２７】 ミュータントＬＨ及びアナログをエンコードするポリヌクレオチド 本発明はまた、本発明のヒトＬＨβサブユニット及びＬＨアナログのミュータ
ントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なく
とも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、こ
れによって野生型タンパク質と比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置
換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレーム
を変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコー
ド領域が融合されているという場合には、核酸分子の３’末端が他の核酸分子の
５’（又はペプチドリンカーをエンコードする核酸を介して）末端に連結され、
翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する
。
【０３２８】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための
同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施にお
いて使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を
配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変
化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌク
レオチド配列を含む。
【０３２９】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＬＨサブユニットをコードする
配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＬＨサブユニットが、好ましくは
該標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置す
る一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本発明
はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこ
れらのループとＬＨサブユニットホロタンパク質の同族体レセプターとの間の静
電相互作用が高められた、ミュータントＬＨサブユニットをコードする核酸分子
を提供する。本発明は更に、好ましくはＬＨサブユニットのβヘアピンＬ１及び
／又はＬ３ループ又はその近傍に位置し、及び／又はＣＴＥＰ或いは別のＣＫＥ
Ｐタンパク質に共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータント
ＬＨサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０３３０】 更に別の実施態様として、本発明は、ＬＨサブユニットアナログをコードする
配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュー
タントＬＨサブユニットのコード領域は、野生型サブユニット又は別の突然変異
モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融
合している。更に、ミュータントＬＨサブユニットモノマーのカルボキシル末端
が、ＬＨβサブユニットのＣＴＥＰのような、別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ
末端に結合している、単鎖ＬＨサブユニットアナログをコードする核酸分子も提
供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ＬＨサブユニットアナログ
をコードし、ここでミュータントＬＨサブユニットモノマーのカルボキシル末端
はＣＴＥＰのアミノ末端のような別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に共有結
合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのない
ミュータントＬＨサブユニットモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０３３１】 本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＬＨサブユ
ニットのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを公知の方法で互い
に連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することが
できる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使
用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
【０３３２】 ミュータントＬＨサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＬＨβサブユニット、ミ
ュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体
及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様
としては、ミュータントサブユニット又はＬＨアナログは融合タンパクであり、
これに限定はされないが例えばミュータントＬＨβサブユニット及び別のＣＫＧ
Ｆタンパク質又はそのフラグメントを含むか、或いはミュータントβサブユニッ
ト及びミュータントαサブユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融
合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン
等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュ
ータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製
される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望
のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを公知の方法で互いに連結し
、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することができる。
或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のよう
なタンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニ
ットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子
をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニット
とミュータントβサブユニットとの間にペプチドリンカーを介して、ミュータン
トβサブユニットと融合したミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに
関するものである。
【０３３３】 ミュータントＬＨサブユニットの構造及び機能解析 ここに示すのは、ミュータントＬＨサブユニット、ミュータントヘテロダイマ
ー及びＬＨアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生
物機能の解析方法である。
【０３３４】 ひとたびミュータントＬＨβサブユニットが確認されれば、クロマトグラフィ
ー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラ
フィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精製のため
の他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、
適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて評価できる。
【０３３５】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントＬＨサブユニットがひとた
び確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば自動アミノ酸シーク
エンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０３３６】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコ
ードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０３３７】 二次的な構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる
。
【０３３８】 他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engs
tom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及びコンピューターモデリング
（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Mole
cular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ
、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．
３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国)等の当業界で利用できるコ
ンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、
構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０３３９】 ミュータントＬＨβサブユニット、ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨア
ナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントも、各種の公知の方法
で分析することができる。
【０３４０】 例えば、ミュータントＬＨβサブユニット又はミュータントＬＨについて、抗
体に結合するために野生型ＬＨ又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を
評価する場合には、公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定され
ないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法
）、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈
降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同
位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応
、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッ
セイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡアッセイ、及び電気泳動イムノアッセ
イ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合
性は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は
、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検
出することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術にお
いては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０３４１】 ミュータントＬＨβサブユニット、ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨア
ナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの絨毛膜刺激ホルモン
レセプター（ＬＨＲ）への結合は、限定されないが、例えばＬＨＲからの放射線
ラベルミュータントＬＨの野生型ＬＨへの置換に基づくインビトロアッセイ等、
該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＬＨヘテロダイマー
、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性も
また、Morbeck, et al., Mole. and Cell. Endocrinol., 97:173-181 (1993)に
おける研究をモデルとする、ＦＳＨ生物活性のため用いられる細胞ベースアッセ
イにおいて測定できる。
【０３４２】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクレベルが１／２
に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＬＨの半減期は、限定されな
いが、例えば、抗−ＬＨ抗体を用いてミュータントＬＨの投与後一定期間後に採
取したサンプルにおけるミュータントＬＨレベルを測定するイムノアッセイ、又
は放射線ラベルしたミュータントＬＨの投与後採取したサンプルにおける放射線
ラベルしたミュータントＬＨの検出等、一定期間後の対象物からのサンプルにお
けるＬＨレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定できる。
【０３４３】 他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる
。
【０３４４】 診断及び治療における使用 本発明は、本発明の治療用化合物（ここでは“治療剤”という）の投与による
各種の疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような治療剤は以下を含
む；ミュータントα及びミュータント或いは野生型いずれかのＬＨβサブユニッ
トを有するＬＨヘテロダイマー；好ましくは１又はそれ以上のアミノ酸置換をＬ
１及び／又はＬ３ループ或いはその近傍に有するミュータントαサブユニット及
び好ましくは１又はそれ以上のアミノ酸置換をＬ１及び／又はＬ３ループ或いは
その近傍に有し別のＣＫＧＦタンパク質と全部又は一部共有結合しているミュー
タントβサブユニットを有するＬＨヘテロダイマー；ミュータントαサブユニッ
ト及びミュータントβサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパク質が単鎖アナログ
に共有結合したＬＨヘテロダイマー、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメン
ト（例えば上述のような）及び本発明のミュータントＬＨヘテロダイマー、及び
誘導体、アナログ、及びそのフラグメントをコードする核酸を含み、ミュータン
トαサブユニット及びミュータントβサブユニットが共有結合して単鎖アナログ
を形成している、ミュータントαサブユニット、及びミュータントβサブユニッ
トを有するＬＨヘテロダイマー。
【０３４５】 該治療薬を投与する対象は、これに限定されるものではないが、好ましくはウ
シ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動
物である。好ましい例として、対象はヒトである。一般的に、対象物と同種であ
る種に由来する生産物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒ
トのミュータント及び／又は修飾されたＬＨヘテロダイマー、誘導体若しくはア
ナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与される
。
【０３４６】 好ましくは、本発明の治療剤は実質的に精製されたものである。
【０３４７】 黄体期疾患として知られる生殖疾患は、黄体の発達に影響を及ぼす。ＬＨの投
与は、１段階として黄体期を有する排卵メカニズムを正常機能へ戻すことができ
る。ＬＨが欠乏或いは正常又は所望のレベルに比して減少している状態は、本発
明のミュータントＬＨヘテロダイマー又はＬＨアナログの投与により治療或いは
予防される。ＬＨレセプターが欠乏もしくは正常レベルに比して減少している、
又は野生型ＬＨに対して無反応もしくは正常ＬＨＲに比べ反応性が低い疾患もま
た、ミュータントＬＨヘテロダイマー又はＬＨアナログの投与により治療或いは
予防できる。構成的に活性なＬＨＲは甲状腺機能亢進症につながり、ミュータン
トＬＨヘテロダイマー及びＬＨアナログをアンタゴニストとして用い得ることが
意図される。
【０３４８】 具体例として、黄体又は性特有発達機能を刺激できるＬＨヘテロダイマー又は
ＬＨアナログは、予防を含む治療のために投与される。治療又は予防できる病気
及び疾患としては、これに限定されるものではないが、生殖機能不全、性機能亢
進症、黄体期疾患、原因不明の不妊等を含む。
【０３４９】 ＬＨタンパク若しくは機能、あるいはＬＨＲタンパク及び機能の欠如又は減少
は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば生検細胞から）得て、ＲＮＡ若しく
はタンパクレベル、又はＬＨ若しくはＬＨＲの発現したＲＮＡ又はタンパクの構
造及び／又は活性をインビトロでアッセイすることによって容易に検出できる。
従って、特に限定的ではないが、ＬＨ又はＬＨＲタンパクを検出及び／又は視覚
化するイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈降、免疫細胞化学等）及び／又は
ＬＨ又はＬＨＲ ｍＲＮＡを検出及び／又は視覚化することによって、ＬＨ又は
ＬＨＲ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセ
イ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション）等、この分野で標準的
な多くの方法を利用できる。
【０３５０】 ＦＳＨβサブユニットのミュータント ヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のヒトβサブユニットは、図６（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ Ｎｏ：５）に示される１０９個のアミノ酸を含む。本発明は、サブユニット
がβサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に一個又
は複数のアミノ酸置換を含む、ｈＦＳＨのβサブユニットのミュータントであっ
て、このような該ミュータントの全部又は一部がＴＳＨ又はｈＦＳＨヘテロダイ
マーの一部のような別のＣＫＧＦタンパクと融合したものを意図する。野生型サ
ブユニットと比べると、本発明のミュータントｈＦＳＨヘテロダイマーは、１個
、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠損又は挿入を含むβ
サブユニットを有する。
【０３５１】 本発明は更に、図６（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５）に示すように、Ｃｙｓ残基を
除き４位から２７位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＬ１ヘ
アピンループをもつ、ミュータントｈＦＳＨβサブユニットも提供する。該アミ
ノ酸置換は、次のものを含む：E4X, L5X, T6X, N7X, I8X, T9X, I10X, A11X, I1
2X, E13X, K14X, E15X, E16X, R18X, F19X, I21X, S22X, I23X, N24X, T25X, T2
6X,及びW27X。
【０３５２】 本実施例の別の態様では、ｈＦＳＨβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにお
ける中性又は酸性アミノ酸残基は突然変異している。突然変異したサブユニット
は、以下のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列中に
少なくとも一個の突然変異を含む：E4B, L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B
, I12B, E13B, E15B, E16B, F19B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B,及びW
27B。
【０３５３】 また、塩基性残基がｈＦＳＨβサブユニットモノマー配列に存在する箇所に酸
性アミノ酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数”Ｘ”は
酸性アミノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電
特性をより低電位の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例
には下記のＫ１４Ｚ及びＲ１８Ｚが１又はそれ以上含まれ、ここで“Ｚ”は酸性
アミノ酸残基である。
【０３５４】 本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンル
ープにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそ
れ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入し、変数”Ｘ”を中性アミノ酸に
対応させることができる。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、
Ｅ４Ｕ、Ｅ１３Ｕ、Ｋ１４Ｕ、Ｅ１５Ｕ，Ｅ１６Ｕ及びＲ１８Ｕに導入すること
ができ、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸に対応する。
【０３５５】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントｈＦＳＨ
βサブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に
変換する変異の例には以下が含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩
基性アミノ酸である：L5Z, T6Z, N7Z, I8Z, T9Z, I10Z, A11Z, I12Z, C17Z, F19
Z, C20Z, I21Z, S22Z, I23Z, N24Z, T25Z, T26Z, W27Z, L5B, T6B, N7B, I8B, T
9B, I10B, A11B, I12B, C17B, F19B, C20B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T2
6B,及びW27B。
【０３５６】 本発明はまた、図６（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５）に示すように、Ｌ３ヘアピン
ループがＣｙｓ残基を除き６５位から８１位までの間に１個又はそれ以上のアミ
ノ酸置換を有するミュータントｈＦＳＨβサブユニットである、ミュータントＣ
ＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：A65X, H6
6X, H67X, A68X, D69X, S70X, L71 X, Y72X, T73X, Y74X, P75X, V76X, A77X, T
78X, Q79X, 及びH81X。
【０３５７】 本実施例の別の態様では、ｈＦＳＨβサブユニット、Ｌ３ヘアピンループにお
ける中性又は酸性アミノ酸残基は突然変異している。突然変異したサブユニット
は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列中、以下のアミノ酸位置において少
なくとも１個の突然変異を含む：A65B, A68B, D69B, S70B, L71B, Y72B, T73B,
Y74B, P75B, V76B, A77B, T78B, 及びQ79B。
【０３５８】 更に本発明は、ｈＦＳＨβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列中
に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ
以上の酸性アミノ酸を上述の配列に導入することができ、ここで変数”Ｘ”は酸
性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはＨ６６Ｚ、Ｈ６７Ｚ、及び
Ｈ８１Ｚが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸残基である。
【０３５９】 本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、
Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。
例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸
配列に導入することができ、ここで変数”Ｘ”を中性アミノ酸に対応する。例と
して、１又はそれ以上の中性残基を、Ｈ６６Ｕ、Ｈ６７Ｕ、Ｄ６９Ｕ、及びＨ８
１Ｕに導入することができ、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸である。
【０３６０】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントｈＦＳＨ
βサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する
変異の例には以下が含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミ
ノ酸である。A66Z, H67Z, H68Z, A69Z, D70Z, S71Z, L72Z, Y73Z, T74Z, Y75Z,
P76Z, V77Z, A78Z, T79Z, Q80Z, A66B, H67B, H68B, A69B, D70B, S71B, L72B,
Y73B, T74B, Y75B, P76B, V77B, A78B, T79B, 及びQ80B。
【０３６１】 本発明はまた、該βヘアピンループの外側にこれらヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ｈＦＳＨβサブユニットも意
図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるｈＦＳＨβサブユ
ニットのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレ
セプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ｈＦ
ＳＨβサブユニットモノマーの１−３位、２８−６４位、及び８２−１０９位か
らなる群より選ばれる位置にみられる。
【０３６２】 このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には以下
のものが含まれる：
【０３６３】
【化６】 変数“Ｊ”は、その導入が、ｈＦＳＨβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピン
ループ構造とミュータントｈＦＳＨβサブユニットモノマーを含むダイマータン
パクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいず
れのアミノ酸でもよい。
【０３６４】 本発明はまた、修飾された形態での多数のｈＦＳＨβサブユニットを意図する
。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子又はそのようなモノマー
のフラクションに結合したｈＦＳＨβサブユニットが含まれる。
【０３６５】 具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ｈＦＳＨβサ
ブユニットアナログを少なくとも１つ含むｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマ
ーは機能的に活性であり、すなわち、ｈＦＳＨβサブユニットレセプター結合、
ｈＦＳＨβサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナリング及び細胞外
分泌のような、野生型ｈＦＳＨβサブユニットに関連した１又はそれ以上の機能
活性を呈することができる。好ましくは、ミュータントｈＦＳＨβサブユニット
ヘテロダイマー又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、ｈＦＳＨβサブユ
ニットレセプターに結合でき、好ましくは野生型ｈＦＳＨβサブユニットより大
きい親和性を有する。また、そのようなミュータントｈＦＳＨβサブユニットヘ
テロダイマー又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、シグナルトランスダ
クションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサ
ブユニット又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログを少なくとも１つ含むｈＦ
ＳＨβサブユニットヘテロダイマーは、野生型ｈＦＳＨβサブユニットより高い
インビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ｈＦＳＨβサブ
ユニットより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントｈＦＳＨβサブユニ
ットヘテロダイマー及び単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、該分野におい
て公知の手順により所望の活性についてテストされ得る。
【０３６６】 １実施例として、本発明は、ミュータントｈＦＳＨ又はミュータントｈＦＳＨ
のような、少なくとも１つの上記ミュータントα及び／又はβサブユニットを含
むヘテロダイマータンパクであるミュータントＣＫＧＦを提供する。該ミュータ
ントサブユニットは１又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。
【０３６７】 具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＦＳＨアナ
ログを少なくとも１つ含むＦＳＨヘテロダイマーは機能的に活性であり、すなわ
ち、ＦＳＨＲ結合、ＦＳＨＲシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ＦＳ
Ｈに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、該
ミュータントＦＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＦＳＨアナログは、ＦＳＨＲに結合
でき、好ましくは野生型ＦＳＨより大きい親和性を有する。また、そのようなミ
ュータントＦＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＦＳＨアナログは、シグナルトランス
ダクションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータント
サブユニット又は単鎖ＦＳＨアナログを少なくとも１つ含むミュータントＦＳＨ
ヘテロダイマーは、野生型ＦＳＨより高いインビトロ生物活性及び／又はインビ
ボ生物活性をもち、野生型ＦＳＨより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータ
ントＦＳＨヘテロダイマー及び単鎖ＦＳＨアナログは、該分野において公知の手
順により所望の活性についてテストされ得る。
【０３６８】 ミュータントＦＳＨ及びアナログをエンコードするポリヌクレオチド 本発明はまた、本発明のヒトＦＳＨサブユニット及びＦＳＨアナログのミュー
タントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少な
くとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、
これによって野生型タンパク質と比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は
置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレー
ムを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコ
ード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３’末端が他の核酸分子
の５’（又はペプチドリンカーをエンコードする核酸を介して）末端に連結され
、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行す
る。
【０３６９】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための
同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施にお
いて使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を
配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変
化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌク
レオチド配列を含む。
【０３７０】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＦＳＨサブユニットをコードす
る配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＦＳＨサブユニットが、好まし
くは該標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位
置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本
発明はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによ
りこれらのループとＦＳＨダイマーの同族体レセプターとの間の静電相互作用が
高められた、ミュータントＦＳＨサブユニットをコードする核酸分子を提供する
。本発明は更に、好ましくはＦＳＨサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ
３ループ又はその近傍に位置し、及び／又はＣＴＥＰ或いは別のＣＫＥＰタンパ
ク質に共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＦＳＨサ
ブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０３７１】 更に別の実施態様として、本発明は、ＦＳＨサブユニットアナログをコードす
る配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュ
ータントＦＳＨサブユニットのコード領域は、野生型サブユニット又は別の突然
変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域
と融合している。更に、ミュータントＦＳＨモノマーのカルボキシル末端が、ｈ ＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰのような 、別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末
端に結合している、単鎖ＦＳＨアナログをコードする核酸分子も提供する。更に
別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ＦＳＨサブユニットアナログをコードし
、ここでミュータントＦＳＨモノマーのカルボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末
端のような別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合ア
ミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントＦＳＨモ
ノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０３７２】 本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＦＳＨサブ
ユニットのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを公知の方法で互
いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製すること
ができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの
使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
【０３７３】 ミュータントＦＳＨサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＦＳＨβサブユニット、
ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの
誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実
施態様としては、ミュータントサブユニット又はＦＳＨアナログは融合タンパク
であり、これに限定はされないが例えばミュータントＦＳＨβサブユニット及び
ｈＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰを含むか、或いはミュータントβサブユニッ
ト及びミュータントαサブユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融
合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン
等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュ
ータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製
される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望
のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを公知の方法で互いに連結し
、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することができる。
或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のよう
なタンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニ
ットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子
をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニット
とミュータントβサブユニットとの間にペプチドリンカーを介して、ミュータン
トβサブユニットと融合したミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに
関するものである。
【０３７４】 ミュータントＦＳＨサブユニットの構造及び機能解析 ここに示すのは、ミュータントＦＳＨサブユニット、ミュータントヘテロダイ
マー及びＦＳＨアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビ
ボ生物機能の解析方法である。
【０３７５】 ミュータントα又はＦＳＨβサブユニットがひとたび確認されれば、クロマト
グラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロ
マトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精
製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的
特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて評価できる。
【０３７６】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントαサブユニット及び／又は
ＦＳＨβサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列
は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的
な方法によって決定できる。
【０３７７】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコ
ードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０３７８】 二次的な構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる
。
【０３７９】 他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engs
tom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及びコンピューターモデリング
（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Mole
cular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ
、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．
３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国)等の当業界で利用できるコ
ンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、
構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０３８０】 ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＦ
ＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラ
グメントも、各種の公知の方法で分析することができる。
【０３８１】 例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントＦＳＨについて、抗体に
結合するために野生型ＦＳＨ又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評
価する場合には、公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されな
いが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）
、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降
素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位
体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、
凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセ
イ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡアッセイ、及び電気泳動イムノアッセイ
等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性
は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、
二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出
することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術におい
ては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０３８２】 ミュータントＦＳＨβサブユニット、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、Ｆ
ＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの濾胞刺激ホル
モンレセプター（ＦＳＨＲ）への結合は、限定されないが、例えばＦＳＨＲから
のウシＦＳＨのような別種の放射線ラベルＦＳＨの置換に基づくインビトロアッ
セイ等、該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＦＳＨヘテ
ロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメント
の生物活性もまた、例えば、ヒトＦＳＨレセプター及びｃＡＭＰ反応性ヒト糖タ
ンパクホルモンαサブユニットルシフェラーゼリポーターコンストラクトを安定
して発現する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における測定に基づ
くアッセイにより測定できる。このアッセイでは、テスト細胞群から誘導された
ルシフェラーゼ活性の総計を確証し、その値を該タンパクの野生型に誘導された
ルシフェラーゼ活性と比較することにより、ミュータントＦＳＨタンパクの生物
活性を決定する。
【０３８３】 チャイニーズハムスター卵巣細胞（American Type Culture Collection, Rock
ville, MD）を、Albanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 101: 211-219 (1
994)により示されるように、ヒトＦＳＨレセプターでトランスフェクションする
。これらの細胞もまた、Albanese et al.に示されるようにリポーター遺伝子コ
ンストラクトでトランスフェクションする。手短に言えば、指数的に分裂する細
胞を、100mmプレート当たりコンストラクトを発現するＦＳＨレセプターを10μg
及びリポーター遺伝子コンストラクトを2μg使用し、３０％の融合度でリン酸カ
ルシウム沈殿法を用いてトランスフェクションする。Geneticin (GIBCO/BRL, Gr
and Island, NY)を用いて安定な形質転換体を選抜する。耐性細胞をサブクロー
ンし、細胞系ＣＨＯ／ＦＳＨ−Ｒをルシフェラーゼリポーター活性のＦＳＨ刺激
により選抜する。24ウェルの組織培養プレートにウェル当たり5×105細胞を、或
いは96ウェルの培養プレートに4×104細胞を分配することにより、レセプター刺
激アッセイを行う。16-20時間後、３−イソブチル−１−メチルザンシン、表示
の添加に加えIBMX (Sigma, St.Louis, MO)を含むそれぞれ300μlまたは100μlの
0.25mMの培養培地中、37℃で細胞をインキュベートする。
【０３８４】 Albanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 5: 693-702 (1991)に示される
ようにルシフェラーゼアッセイを行う。手短に言うと、インキュベーション後、
組織培養培地を吸引し、25mMのEGTA、1%のTriton X-100及び1mMのDTTを含む200
μlの溶解溶液を各ウェルに加え、10分間放置する。攪拌後、25mMのグリシルグ
リシン（pH7.8）、15mMのMgSO4、4mMのEGTA、16.5mMのKPO4、1mMのDTT及び2.2mM
のATPを含む365μlのアッセイバッファーに細胞ライゼートを加える。室温で100
μlの250μMルシフェリン及び10mMのDTTの注入し、ルミノメーター(Monolight20
10, Analytical Luminescensce Laboratory, San Diego, CA)で反応最初の10秒
間に放射された光を測定することにより、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。
本アッセイの例はAlbanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 101: 211-219 (
1994)に見られる。
【０３８５】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクレベルが１／２
に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＦＳＨの半減期は、限定され
ないが、例えば、抗−ＦＳＨ抗体を用いてミュータントＦＳＨの投与後一定期間
後に採取したサンプルにおけるミュータントＦＳＨレベルを測定するイムノアッ
セイ、又は放射線ラベルしたミュータントＦＳＨの投与後採取したサンプルにお
ける放射線ラベルしたミュータントＦＳＨの検出等、一定期間後の対象物からの
サンプルにおけるＦＳＨレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定で
きる。
【０３８６】 他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる
。
【０３８７】 診断及び治療における使用 本発明は、本発明の治療用化合物（ここでは“治療剤”という）の投与による
各種の疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような治療剤は以下を含
む；ミュータントαサブユニット及びミュータント或いは野生型いずれかのβサ
ブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー；ｈＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰ
のような、ミュータントαサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパクに全部又は一
部共有結合したミュータントβサブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー；ミ
ュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及びＣＫＧＦタンパ
ク又はフラグメントが単鎖アナログに共有結合したＦＳＨヘテロダイマー、他の
誘導体、アナログ及びそのフラグメント（例えば上述のような）及び本発明のミ
ュータントＦＳＨヘテロダイマー、及び誘導体、アナログ、及びそのフラグメン
トをコードする核酸を含み、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサ
ブユニットが共有結合して単鎖アナログを形成している、ミュータントαサブユ
ニット及びミュータントβサブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー。
【０３８８】 該治療薬を投与する対象は、これに限定されるものではないが、好ましくはウ
シ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動
物である。好ましい例として、対象はヒトである。一般的に、対象物と同種であ
る種に由来する生産物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒ
トのミュータント及び／又は修飾されたＦＳＨヘテロダイマー、誘導体若しくは
アナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与され
る。
【０３８９】 好ましくは、本発明の治療剤は実質的に精製される。
【０３９０】 本発明の方法により、不妊症或いは性機能不全として表れる多くの疾患を治療
できる。ＦＳＨが欠乏或いは正常又は所望のレベルに比して減少している疾患は
、本発明のミュータントＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログの投与により
治療或いは予防される。ＦＳＨレセプターが欠乏もしくは正常レベルに比して減
少している、又は野生型ＦＳＨに対して無反応もしくは正常ＦＳＨＲに比べ反応
性が低い疾患もまた、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログの
投与により治療或いは予防できる。アンタゴニストとしての使用のためのミュー
タントＦＳＨヘテロダイマー及びＦＳＨアナログが本発明により意図される。
【０３９１】 具体例として、生物活性をもつＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログは、
卵巣機能不全、黄体期欠陥、原因不明の不妊症、期間の限られた妊娠、及び援助
生殖を治療するため、予防を含む治療のために投与される。
【０３９２】 ＦＳＨタンパク若しくは機能、あるいはＦＳＨＲタンパク及び機能の欠如又は
減少は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば生検細胞から）得て、ＲＮＡ若
しくはタンパクレベル、又はＦＳＨ若しくはＦＳＨＲの発現したＲＮＡ又はタン
パクの構造及び／又は活性をインビトロでアッセイすることによって容易に検出
できる。従って、特に限定的ではないが、ＦＳＨ又はＦＳＨＲタンパクを検出及
び／又は視覚化するイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈降、免疫細胞化学等
）及び／又はＦＳＨ又はＦＳＨＲ ｍＲＮＡを検出及び／又は視覚化することに
よって、ＦＳＨ又はＦＳＨＲ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（
例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション）
等、この分野で標準的な多くの方法を利用できる。
【０３９３】 ＰＤＧＦファミリーのミュータント 本発明は、ＰＤＧＦモノマーのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループの血小板
由来増殖因子配列の至る箇所に変異を導入し、これによりこれらの構造の静電電
荷を変化させることを意図する。本発明は、ＰＤＧＦモノマー鎖のβヘアピンＬ
１及び／又はＬ３ループはその近傍に１つ又は複数のアミノ酸置換、又はアミノ
酸欠損或いは挿入を含み、この結果これらタンパクのβヘアピンループの静電的
特徴が変化する、ＰＤＧＦモノマー鎖のミュータントを意図する。本発明はさら
に、該タンパクのβヘアピンループのコンフォメーションを変化させてＰＤＧＦ
ダイマーとその同族体レセプターとの間の相互作用を高める、ＰＤＧＦモノマー
鎖への変異を意図する。さらには、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合してい
るミュータントＰＤＧＦモノマーを意図する。
【０３９４】 ＰＤＧＦ−Ａ（ＰＤＧＦ Ａ−鎖）のミュータント ヒト血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）のヒトＡ鎖は、図７（ＳＥＱ．
ＩＤ Ｎｏ：６）に示される１２５個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブ
ユニットと比べると、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠
損又は挿入を含むＰＤＧＦ−Ａ鎖のミュータントを意図する。更に、本発明は別
のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖分子を意図する
。
【０３９５】 本発明は、図７（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：６）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き
１１位から３６位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュー
タントＰＤＧＦ−Ａ鎖Ｌ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換は、次の
ものを含み、ここで“Ｘ”はいずれのアミノ酸残基をも表わす。：K11X, T12X,
R13X, T14X, V15X, I16X, Y17X, E18X, I19X, P20X, R21X, S22X, Q23X, V24X,
D25X, P26X, T27X, S28X, A29X, N30X, F31X, L32X, I33X, W34X, P35X, 及びP3
6X。
【０３９６】 本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性アミノ酸残基が存在する箇所への塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。これらの塩基性残基の導入は、導入された各塩
基性アミノ酸について、より高電位の特性をもつようＬ１ヘアピンループの静電
電荷を変化させる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ−ＡモノマーのＬ１ループに
導入した場合、変数”Ｘ”はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）よりなる群から
選ばれる塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ−Ａモノマーに
導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち１つ又はそれ以
上を含む：Ｅ１８Ｂ及びＤ２５Ｂ、ここで“Ｂ”は塩基性アミノ酸残基である。
【０３９７】 また、塩基性残基がＰＤＧＦ−Ａモノマー配列に存在する箇所に酸性アミノ酸
残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数”Ｘ”はアスパラギ
ン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）のような酸性アミノ酸に対応する。これらア
ミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより低電位の状態に変化させ
る働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のものが１又はそれ以上含
まれる：Ｋ１１Ｚ、Ｒ１３Ｚ、及びＲ２１Ｚ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸残基
である。
【０３９８】 本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンル
ープにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそ
れ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入し、変数”Ｘ”を中性アミノ酸に
対応させることができる。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、
Ｋ１１Ｕ、Ｒ１３Ｕ、Ｅ１８Ｕ、Ｒ２１Ｕ、及びＤ２５Ｕに導入することができ
、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸である。本発明の目的のためには、中性アミノ酸
はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、又はＨ以外のいずれかのアミノ酸である。従って、中性アミ
ノ酸はＡ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから
なる群より選ばれる。
【０３９９】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ
−Ａ鎖モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する
変異の例には以下が含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミ
ノ酸である：T12Z, T14Z, V15Z, I16Z, Y17Z, I19Z, P20Z, S22Z, Q23Z, V24Z,
P26Z, T27Z, S28Z, A29Z, N30Z, F31Z, L32Z, I33Z, W34Z, P35Z, P36Z, T12B,
T14B, V15B, I16B, Y17B, I19B, P20B, S22B, Q23B, V24B, P26B, T27B, S28B,
A29B, N30B, F31B, L32B, I33B, W34B, P35B, 及びP36B。
【０４００】 Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖モノ
マーもまた示される。これらのミュータントタンパクは、図７（ＳＥＱ．ＩＤ
ＮＯ：６）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの５８位から８
８位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠損又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次のものを含む：R58X, V59X, H60X, H61X, R62X, S63X, V64X, K6
5X, V66X, A67X, K68X, V69X, E70X, Y71X, V72X, R73X, K74X, K75X, P76X, K7
7X, L78X, K79X, E80X, V81X, Q82X, V83X, R84X, L85X, E86X, E87X, 及び H88
X。ここで“Ｘ”はいずれかのアミノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの
静電特性を変化させる。
【０４０１】 Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、酸性アミノ酸残基を置換する、Ｐ
ＤＧＦ−Ａ鎖Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中への塩基性アミノ酸残基の導入
が含まれる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ−ＡモノマーのＬ３ループに導入し
た場合、変数”Ｘ”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ−
Ａモノマーに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のＥ７０
Ｂ、Ｅ８０Ｂ、Ｅ８６Ｂ及びＥ８７Ｂを１つ又はそれ以上を含み、ここで“Ｂ”
は塩基性アミノ酸残基である。
【０４０２】 更に本発明は、ＰＤＧＦＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列中塩基性アミノ酸
残基の存在箇所に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば
、一個又はそれ以上の酸性アミノ酸を上述５８−８８の配列に導入することがで
き、ここで変数”Ｘ”は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例には
R58Z, H60Z, H61Z, R62Z, K65Z, K68Z, R73Z, K74Z, K75Z, K77Z, K79Z, R84Z,
及びH88Zが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸残基である。
【０４０３】 本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ３ヘアピンル
ープにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそ
れ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入すること
ができ、ここで変数”Ｘ”を中性アミノ酸に対応する。例として、１又はそれ以
上の中性残基をR58U, H60U, H61U, R62U, K65U, K68U, E70U, R73U, K74U, K75U
, K77U, K79U, E80U, R84U, E86U, E87U, 及びH88Uに導入することができ、ここ
で“Ｕ”は中性アミノ酸である。
【０４０４】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ Ａ−鎖タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の
例にはV59Z, S63Z, V64Z, V66Z, A67Z, V69Z, Y71Z, V72Z, P76Z, L78Z, V81Z,
Q82Z, V83Z, L85Z, V59B, S63B, V64B, V66B, A67B, V69B, Y71B, V72B, P76B,
L78B, V81B, Q82B, V83B, 及びL85Bが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“
Ｂ”は塩基性アミノ酸である。
【０４０５】 本発明はまた、該βヘアピンループの外側にこれらヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーも
意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＰＤＧＦ Ａ−
鎖モノマーのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有す
るレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、
ＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーの１−９位、３８−５７位、及び８９−１２５位から
なる群より選ばれる位置にみられる。
【０４０６】 このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４０７】
【化７】 が含まれる。変数“Ｊ”は、その導入が、ＰＤＧＦ Ａ−鎖のＬ１及びＬ３βヘ
アピンループ構造とミュータントＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーを含むダイマータン
パクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいず
れのアミノ酸でもよい。
【０４０８】 本発明はまた、修飾された形態での多数のＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーを意図す
る。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのよう
なモノマーのフラクションに結合したＰＤＧＦ Ａ−モノマーが含まれる。
【０４０９】 ＰＤＧＦ−Ｂ（ＰＤＧＦ Ｂ−鎖）のミュータント ヒト血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）のヒトＢ鎖は、図８（ＳＥＱ．
ＩＤ Ｎｏ：７）に示される１６０個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブ
ユニットと比べて１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の、１つ
又は複数のアミノ酸置換、欠損又は挿入を含むＰＤＧＦ−Ｂ鎖のミュータントを
意図する。更に、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントＰ
ＤＧＦ−Ａ鎖分子を意図する。
【０４１０】 本発明は、図８（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：７）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き
１７位から４２位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュー
タントＰＤＧＦ−Ｂ鎖Ｌ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換は次のも
のを含む：K17X, T18X, R19X, T20X, E21X, V22X, F23X, E24X, I25X, S26X, R2
7X, R28X, L29X, I30X, D31X, R32X, T33X, N34X, A35X, N36X, F37X, L38X, V3
9X, W40X, P41X, 及びP42X。ここで“Ｘ”はいずれかのアミノ酸残基であり、そ
れによる置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０４１１】 本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性残基が存在する箇所への塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ“Ｂ”モノマーのＬ１ル
ープに導入した場合、変数”Ｘ”はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）よりなる
群から選ばれる塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ“Ｂ”モ
ノマーに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち１つ又
はそれ以上を含む：Ｅ２１Ｂ、Ｅ２４Ｂ及びＤ３１Ｂ、ここで“Ｂ”は塩基性ア
ミノ酸残基である。
【０４１２】 また、塩基性残基がＰＤＧＦ“Ｂ”モノマー配列に存在する箇所に酸性アミノ
酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数”Ｘ”は酸性アミ
ノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をよ
り低電位の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記
のものが１又はそれ以上含まれる：Ｋ１７Ｚ、Ｒ１９Ｚ、Ｒ２７Ｚ、Ｒ２８Ｚ、
及びＲ３２Ｚ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸である。
【０４１３】 本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンル
ープにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそ
れ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入し、変数”Ｘ”を中性アミノ酸に
対応させることができる。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、
Ｋ１７Ｕ、Ｒ１９Ｕ、Ｅ２１Ｕ、Ｅ２４Ｕ、Ｒ２７Ｕ、Ｒ２８Ｕ、Ｄ３１Ｕ、及
びＲ３２Ｕに導入することができ、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸に対応する。
【０４１４】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ
−Ｂ鎖モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する
変異の例には以下が含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミ
ノ酸である：T18Z, T20Z, V22Z, F23Z, I25Z, S26Z, L29Z, I30Z, T33Z, N34Z,
A35Z, N36Z, F37Z, L38Z, V39Z, W40Z, P41Z, P42Z, T18B, T20B, V22B, F23B,
I25B, S26B, L29B, I30B, T33B, N34B, A35B, N36B, F37B, L38B, V39B, W40B,
P41B, 及びP42B。
【０４１５】 Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＰＤＧＦ−Ｂ鎖モノ
マーもまた示される。これらのミュータントタンパクは、図８（ＳＥＱ．ＩＤ
ＮＯ：７）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの６４位から９
４位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠損又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次のものを含む：Q64X, V65X, Q66X, L67X, R68X, P69X, V70X, Q7
1X, V72X, R73X, K74X, I75X, E76X, I77X, V78X, R79X, K80X, K81X, P82X, I8
3X, F84X, K85X, K86X, A87X, T88X, V89X, T90X, L91X, E92X, D93X, 及びH94X
、ここで“Ｘ”はいずれかのアミノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの静
電特性を変化させる。
【０４１６】 Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、酸性アミノ酸残基を置換する、Ｐ
ＤＧＦ−Ｂ鎖Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中への塩基性アミノ酸残基の導入
が含まれる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ“Ｂ”モノマーのＬ３ループに導入
した場合、上記配列の変数”Ｘ”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基
がＰＤＧＦ“Ｂ”モノマー中酸性残基の存在箇所に導入された、静電電荷を変化
させる変異の具体例には、以下が１つ又はそれ以上含まれ：Ｅ７６Ｂ、Ｅ９２Ｂ
、及びＤ９３Ｂ、ここで“Ｂ”は塩基性アミノ酸残基である。
【０４１７】 更に本発明は、ＰＤＧＦＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に１又はそれ以上
の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸性アミノ
酸を上述６４−９４配列の塩基性残基存在箇所に導入することができ、ここで変
数”Ｘ”は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはR73Z, K74Z,
R79Z, K80Z, K81Z, K85Z, K86Z, 及びH94Zが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ
酸残基である。
【０４１８】 本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、
Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。
例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸
配列に導入することができ、ここで変数”Ｘ”を中性アミノ酸に対応する。例と
して、１又はそれ以上の中性残基をR68U, R73U, K74U, E76U, R79U, K80U, K81U
, K85U, K86U, E92U, D93U, 及びH94Uに導入することができ、ここで“Ｕ”は中
性アミノ酸である。
【０４１９】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ
Ｂ−鎖タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の
例にはQ64Z, V65Z, Q66Z, L67Z, P69Z, V70Z, Q71Z, V72Z, I75Z, I77Z, V78Z,
P82Z, I83Z, F84Z, A87Z, T88Z, V89Z, T90Z, L91Z, Q64B, V65B, Q66B, L67B,
P69B, V70B, Q71B, V72B, I75B, I77B, V78B, P82B, I83B, F84B, A87B, T88B,
V89B, T90B, 及びL91Bが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性
アミノ酸である。
【０４２０】 本発明はまた、該βヘアピンループの外側にこれらヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーも
意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＰＤＧＦ Ｂ−
鎖モノマーのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有す
るレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、
ＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーの１−１５位、４４−６３位、及び９５−１６０位か
らなる群より選ばれる位置にみられる。
【０４２１】 このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４２２】
【化８】 が含まれる。変数“Ｊ”は、その導入が、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖のＬ１及びＬ３βヘ
アピンループ構造とミュータントＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーを含むダイマータン
パクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいず
れのアミノ酸でもよい。
【０４２３】 本発明はまた、修飾された形態での多数のＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーを意図す
る。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのよう
なモノマーのフラクションに結合したＰＤＧＦ Ｂ−モノマーが含まれる。
【０４２４】 具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＰＤＧＦアナ
ログを少なくとも１つ含むＰＤＧＦ（Ａ又はＢ−鎖）ヘテロダイマーは機能的に
活性であり、すなわち、ＰＤＧＦＲ結合、ＰＤＧＦＲシグナリング及び細胞外分
泌のような、野生型ＰＤＧＦに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈すること
ができる。好ましくは、該ミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー又は単鎖ＰＤＧ
Ｆアナログは、ＰＤＧＦＲに結合でき、好ましくは野生型ＰＤＧＦより大きい親
和性を有する。また、そのようなミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー又は単鎖
ＰＤＧＦアナログは、シグナルトランスダクションを引き起こすのが好ましい。
最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニット又は単鎖ＰＤＧＦアナログ
を少なくとも１つ含むミュータントＰＤＧＦヘテロダイマーは、野生型ＰＤＧＦ
より高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ＰＤＧ
Ｆより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー及
び単鎖ＰＤＧＦアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性につい
てテストされ得る。
【０４２５】 ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のミュータント ヒトＶＥＧＦタンパク質は、図９（ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ：８）に示される１９
７個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブユニットと比べて１個、２個、３
個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠損又
は挿入を含むヒトＶＥＧＦタンパクのミュータントを意図する。更に、本発明は
別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントヒトＶＥＧＦタンパクを意図
する。
【０４２６】 本発明は、図９（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：８）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き
２７位から５０位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュー
タントＶＥＧＦタンパクＬ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換H27X,
P28X, I29X, E30X, T31X, L32X, V33X, D34X, I35X, F36X, Q37X, E38X, Y39X,
P40X, D41X, E42X, I43X, E44X, Y45X, I46X, F47X, K48X, P49X, 及びS50X。
“Ｘ”はいずれかのアミノ酸残基であり、それによる置換はヘアピンループの静
電特性を変化させる。
【０４２７】 本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性残基が存在する箇所への塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、塩基性残基をＶＥＧＦタンパクのＬ１ループ中
酸性残基存在箇所に導入した場合、変数”Ｘ”はリジン（Ｋ）又はアルギニン（
Ｒ）よりなる群から選ばれる塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＶＥ
ＧＦタンパクに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち
１つ又はそれ以上を含む：Ｅ３０Ｂ、Ｄ３４Ｂ、Ｅ３８Ｂ、Ｄ４１Ｂ、Ｅ４２Ｂ
、及びＥ４４Ｂ、ここで“Ｂ”は塩基性アミノ酸残基である。
【０４２８】 また、塩基性残基がＶＥＧＦタンパク配列に存在する箇所に酸性アミノ酸残基
を導入することも意図されている。本実施例では、変数”Ｘ”は酸性アミノ酸に
対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより低電
位の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のもの
が１又はそれ以上含まれる：Ｈ２７Ｚ及びＫ４８Ｚ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ
酸残基である。
【０４２９】 本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンル
ープにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそ
れ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入し、変数”Ｘ”を中性アミノ酸に
対応させることができる。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、
Ｈ２７Ｕ、Ｅ３０Ｕ、Ｄ３４Ｕ、Ｅ３８Ｕ、Ｄ４１Ｕ、Ｅ４２Ｕ、Ｅ４４Ｕ、及
びＫ４８Ｕに導入することができ、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸に対応する。
【０４３０】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＶＥＧＦ
タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以
下が含まれる：P28Z, I29Z, T31Z, L32Z, V33Z, I35Z, F36Z, Q37Z, Y39Z, P40Z
, I43Z, Y45Z, I46Z, F47Z, P49Z, S50Z, P28B, I29B, T31B, L32B, V33B, I35B
, F36B, Q37B, Y39B, P40B, I43B, Y45B, I46B, F47B, P49B, 及びS50B、ここで
“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩基性アミノ酸である。
【０４３１】 Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＶＥＧＦタンパクも
また示される。これらのミュータントタンパクは、図９（ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：
８）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの７３位から９９位ま
での間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠損又は挿入を有する。該アミノ酸
置換は次のものを含む：E73X, S74X, N75X, I76X, T77X, M78X, Q79X, I80X, M8
1X, R82X, I83X, K84X, P85X, H86X, Q87X, G88X, Q89X, H90X, I91X, G92X, E9
3X, M94X, S95X, F96X, L97X, Q98X, 及びH99X、ここで“Ｘ”はいずれかのアミ
ノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの静電特性を変化させる。
【０４３２】 Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、酸性アミノ酸残基を置換する、Ｖ
ＥＧＦタンパクＬ３ヘアピンループアミノ酸配列中への塩基性アミノ酸残基の導
入が含まれる。例えば、塩基性残基をＶＥＧＦタンパクのＬ３ループに導入した
場合、上記配列の変数”Ｘ”は塩基性アミノ酸残基に対応する。ＶＥＧＦタンパ
ク中に塩基性残基が導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、以下
が１つ又はそれ以上含まれ：Ｅ７３Ｂ及びＥ９３Ｂ、ここで“Ｂ”は塩基性アミ
ノ酸残基である。
【０４３３】 更に本発明は、ＶＥＧＦタンパクＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に１又は
それ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸
性アミノ酸を上述１６６−３１９３の配列に導入することができ、ここで変数”
Ｘ”は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはＲ８２Ｚ、Ｋ８４
Ｚ、Ｈ８６Ｚ、Ｈ９０Ｚ，及びＨ９９Ｚが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸
残基である。
【０４３４】 本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、
Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。
例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸
配列に導入することができ、ここで変数”Ｘ”を中性アミノ酸に対応する。例と
して、１又はそれ以上の中性残基をE73U, R82U, K84U, H86U, H90U, E93B, 及び
H99Uに導入することができ、ここで“Ｕ”は中性アミノ酸である。
【０４３５】 非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、
Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＶＥＧＦ
タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例にはS7
4Z, N75Z, I76Z, T77Z, M78Z, Q79Z, I80Z, M81Z, I83Z, P85Z, Q87Z, G88Z, Q8
9Z, I91Z, G92Z, M94Z, S95Z, F96Z, L97Z, Q98Z, S74B, N75B, I76B, T77B, M7
8B, Q79B, I80B, M81B, I83B, P85B, Q87B, G88B, Q89B, I91B, G92B, M94B, S9
5B, F96B, L97B, 及びQ98Bが含まれ、ここで“Ｚ”は酸性アミノ酸、“Ｂ”は塩
基性アミノ酸である。
【０４３６】 本発明はまた、該βヘアピンループの外側にこれらヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＶＥＧＦタンパクも意図する
。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＶＥＧＦタンパクのβヘ
アピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの
間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ＶＥＧＦタンパク
の１−２６位、５１−７２位、及び１００−１８９位からなる群より選ばれる位
置にみられる。
【０４３７】 このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４３８】
【化９】 が含まれる。変数“Ｊ”は、その導入が、ＶＥＧＦタンパクのＬ１及びＬ３βヘ
アピンループ構造とミュータントＶＥＧＦタンパクモノマーを含むダイマータン
パクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいず
れのアミノ酸でもよい。
【０４３９】 本発明はまた、修飾された形態での多数のＶＥＧＦタンパクを意図する。これ
らの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのようなモノマ
ーのフラクションに結合したＶＥＧＦタンパクが含まれる。
【０４４０】 具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＶＥＧＦタン
パクアナログを少なくとも１つ含むＶＥＧＦタンパクヘテロダイマーは機能的に
活性であり、すなわち、ＶＥＧＦタンパクレセプター結合、ＶＥＧＦタンパクフ
ァミリーレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ＶＥＧＦタン
パクに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、
該ミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマー又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナ
ログは、ＶＥＧＦタンパクＲに結合でき、好ましくは野生型ＶＥＧＦタンパクよ
り大きい親和性を有する。また、そのようなミュータントＶＥＧＦタンパクヘテ
ロダイマー又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログは、シグナルトランスダクション
を引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニッ
ト又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログを少なくとも１つ含むミュータントＶＥＧ
Ｆタンパクヘテロダイマーは、野生型ＶＥＧＦタンパクより高いインビトロ生物
活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ＶＥＧＦタンパクより長い血清
半減期をもつ。本発明のミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマー及び単鎖
ＶＥＧＦタンパクアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性につ
いてテストされ得る。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク及びアナログをエンコードするポリヌ クレオチド 本発明はまた、本発明のヒトＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及びＰ
ＤＧＦファミリータンパクアナログのミュータントサブユニットをコードする配
列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若し
くは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型タンパク質と比
べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子に
も関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基ミュー
テーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合されているという場
合には、核酸分子の３’末端が他の核酸分子の５’（又はペプチドリンカーをエ
ンコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、
一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０４４１】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための
同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施にお
いて使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を
配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変
化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌク
レオチド配列を含む。
【０４４２】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサ
ブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＰＤＧＦ
ファミリータンパクサブユニットが、好ましくは該標的タンパク質のβヘアピン
Ｌ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換
を含むものである、核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ル
ープの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこれらのループとＰＤＧＦファミ
リータンパクダイマーの同族体レセプターとの間の静電相互作用が高められた、
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットをコードする核酸分子を
提供する。本発明は更に、好ましくはＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット
のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置し、及び／又は別の
ＣＫＥＰタンパク質に全体又は一部が共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置
換を含むミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットをコードする配
列を含む核酸分子を提供する。
【０４４３】 更に別の実施態様として、本発明は、ＰＤＧＦファミリータンパクサブユニッ
トアナログをコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のア
ミノ酸置換を含むミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットのコー
ド領域は、野生型サブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得
る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合している。更に、ミュータン
トＰＤＧＦファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端が、別のＣＫＧＦタ
ンパク質のアミノ末端に結合している、単鎖ＰＤＧＦファミリータンパクアナロ
グをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単
鎖ＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットアナログをコードし、ここでミュー
タントＰＤＧＦファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端は別のＣＫＧＦ
タンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシ
ル末端はシグナルペプチドのないミュータントＰＤＧＦファミリータンパクモノ
マーのアミノ末端と共有結合している。
【０４４４】 本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＰＤＧＦフ
ァミリータンパクサブユニットのモノマーサブユニットをコードする核酸配列ど
うしを公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させること
によって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプ
チドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる
。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータン
パクβサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクヘテロダイマー
、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフ
ラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様として
は、ミュータントサブユニット又はＰＤＧＦアナログは融合タンパクであり、こ
れに限定はされないが例えばミュータントＰＤＧＦファミリータンパクβサブユ
ニット及び別のＣＫＧＦタンパク又は２つのミュータントＰＤＧＦファミリータ
ンパクサブユニットを含むか、或いは１つのミュータントＰＤＧＦファミリータ
ンパクサブユニット及び１つの対応する野生型ＰＤＧＦファミリータンパクサブ
ユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定
されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタン
パクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント又は野生型サブユ
ニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タン
パクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードす
る適切な核酸配列どうしを公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方
法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タン
パクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によっ
て作製できる。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットの一部分
を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子をも構築しう
る。具体的な実施態様は、好ましくは２つのサブユニット間にペプチドリンカー
を介して、別のＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットと融合したミュータン
トＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットを含む単鎖アナログに関するもので
ある。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットの構造及び機能解析 ここに示すのは、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミ
ュータントファミリータンパクヘテロダイマー及びＰＤＧＦファミリータンパク
アナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解
析方法である。
【０４４５】 ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットがひとたび確認されれ
ば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジン
グカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又
はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することがで
きる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて
評価できる。
【０４４６】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントＰＤＧＦファミリータンパ
クサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例
えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法
によって決定できる。
【０４４７】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコ
ードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０４４８】 二次的な構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる
。
【０４４９】 他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engs
tom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及びコンピューターモデリング
（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Mole
cular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ
、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．
３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国)等の当業界で利用できるコ
ンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、
構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０４５０】 ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミュータントＰＤＧ
Ｆファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、
単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントも、各種の公知の方法で分析す
ることができる。
【０４５１】 例えば、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク又はサブユニットについて
、抗体に結合するために野生型ＰＤＧＦファミリータンパク又はそのサブユニッ
トと結合又は競合する能力を評価する場合には、公知の各種イムノアッセイ法を
用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳ
Ａ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、イムノ放
射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイド
ゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウ
ェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝
集アッセイ）、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡアッセイ
、及び電気泳動イムノアッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシ
ステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することにより認め
られる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次
結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセイで結
合を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは本発明の
範囲に含まれる。
【０４５２】 ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミュータントＰＤＧ
Ｆファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、
単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの血小板由来増殖因子ファミリ
ータンパクレセプター（ＰＤＧＦファミリータンパクＲ）への結合は、限定され
ないが、例えばＰＤＧＦＲからのウシＰＤＧＦのような別種の放射線ラベルされ
たＰＤＧＦファミリータンパクの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術分
野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク
ヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これら
の誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、種々のバイオアッセイにより測定
できる。タンパクの血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）は、様々なタイ
プの細胞の増殖に影響を与える。タンパクチロシンキナーゼレセプターと結合す
ることで多数の細胞系を活性化することにより、ＰＤＧＦタンパクは細胞増殖へ
の刺激的影響を及ぼす。 細胞応答アッセイ（例えば細胞増殖及びＤＮＡ合成アッセイ）、ホルモン刺激タ
ンパク発現アッセイ、及び結合アッセイは全て、本発明で示されるミュータント
ＰＤＧＦタンパクの生物活性を測定するために用い得るアッセイ系の例である。
アンドロゲン代謝バイオアッセイ 慢性的歯肉炎組織由来のヒト歯肉繊維芽細胞を用いて、ＰＤＧＦミュータント
タンパクの生物活性を測定及び野生型の分子と比較する。本アッセイの１つの実
施例として、炭素１４（14Ｃ）ラベルした前駆体分子を用いて本発明のミュータ
ントＰＤＧＦ増殖因子の生物活性を測定する。繊維芽細胞では、テストステロン
がＤＨＴと４−アンドロスタンジオンに代謝される。繊維芽細胞はまた、４−ア
ンドロスタンジオンをＤＨＴとテストステロンに代謝する。これら２つの代謝経
路における生成物の合成速度はＰＤＧＦ刺激に敏感である。従って、放射線ラベ
ルした基質分子を用いて、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクによる刺激
の結果として生成したラベルされた生成物の量を測定し、野生型ＰＤＧＦファミ
リータンパクに刺激された生成物合成のレベルと比較することができる。
【０４５３】 本アッセイ系の１つの実施例として、14Ｃ−テストステロン及び14Ｃ−４−ア
ンドロスタンジオンを用いてミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの生物活
性を測定することができる。これらの試薬はAmersham International (Princeto
n, NJ)から工業的に入手し得る。本アッセイでの使用のため、放射線ラベルした
基質を十分な濃度準備する。例えば、50μCi/mlのテストステロンを本アッセイ
で用い得る。本発明に示す方法に従って、ミュータント及び野生型のＰＤＧＦフ
ァミリータンパクを発現し、精製する。一連の希釈液を準備し、各ミュータント
ＰＤＧＦファミリータンパクについてアンドロゲン代謝のための刺激性濃度を確
立する。例えば、0.5ng/mlの野生型ＰＤＧＦは刺激性濃度であると報告されてい
る（Kasasa et al., J. Clin. Periodontal., 25: 640-646 (1998)）。
【０４５４】 治療初期段階完了後の患者３−７人の歯周ポケット由来の慢性歯肉炎組織より
５−９経代のヒト歯肉繊維芽細胞を得て、ポケット除去（執刀時出血なし、深さ
６−８mm）のための歯周手術中に単離する。炎症箇所より得られた繊維芽細胞は
、アンドロゲンに対する基準の代謝応答が高く、健康なコントロールに比べ炎症
性刺激に応答すると報告されている。よって、このタイプの供給源からの細胞を
本アッセイに用いる。
【０４５５】 ３−７細胞系より得られた単層培地中の融合性歯肉繊維芽細胞を、アンドロゲ
ン基質である１４Ｃ−テストステロン／１４Ｃ−４−アンドロスタンジオンを加
えたEagle's MEM培地でマルチウェルディッシュ中、一連でインキュベートし、
増殖因子の活性をテストする。野生型タンパクのED50値に近い濃度範囲を用いて
、個々のＰＤＧＦファミリータンパクインキュベーションに応答する、アンドロ
ゲン代謝のための好適な刺激性濃度を確立する。
【０４５６】 インキュベーションは24時間37℃でCO2が5%の加湿組織培地インキュベーター
内で行う。インキュベーション過程の最後に、酢酸エチル（2ml×3）を用いて代
謝物を培地より分離し、ロータリーエバポレーター（Gyrovap, V.A. Howe Ltd.,
Banbury, Oxon, UK）でエバポレートし、ベンゼン：アセトン溶媒系（4:1 v/v
）にて薄層クロマトグラフィーにより単離する。単離した代謝物は放射線同位体
スキャナー（Berthold linear analyzer, Victoria, Australia）を用いて定量
する。生物的に活性な代謝物ＤＨＴを評価してミュータントＰＤＧＦファミリー
タンパクの生物活性を決定する。
【０４５７】 ＤＨＴは、単離後、ガスクロマトグラフィー及びマススペクトルのような標準
的な技術を用いて特徴づけられる。これらの技術はSoory, M., J. Periodontal
Res., 30:124-131 (1995)に示される。ＤＮＡ合成アッセイ 別の実施例として、ミュータントタンパクの存在下増殖中の繊維芽細胞に組み
込まれた3Ｈ−ヒスチジンの量を測定することによりミュータントＰＤＧＦファ
ミリータンパクの生物活性をアッセイする。上胸部にケロイドのある患者より得
たケロイド繊維芽細胞を採取することにより本アッセイを行う。これらの細胞を
Ｔ75フラスコ内、minimum essential medium（ＭＥＭ）を含む子ウシ胎児血清（
ＦＣＳ）中、37℃、95%の空気及び5%のCO2中で培養する。第５経代の細胞を本ア
ッセイに用いる。24ウェルプレート内、10%FCSを加えたＭＥＭ中に準備した細胞
（2×104/ウェル）を入れ、融合するまで増殖させる。該細胞をリン酸バッファ
ー処理した塩水で一度洗浄し、次に0.1%のウシ血清アルブミンを加えたＭＥＭ中
で（無血清培地）24時間インキュベーションする。次に血清の非存在下で、増殖
因子により24時間該細胞に刺激を加える。次に最終濃度1μCi/mlの3Ｈ−ヒスチ
ジン（NEN, Boston, MA）の存在下で該細胞を2時間増殖させ、リン酸バッファー
処理した低温塩水で３度、5%のトリクロロ酢酸で４度洗浄する。５００マイクロ
リットルの0.1N NaOH/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、液体シンチレーシ
ョンシステムを用いて5mlのACS II (Amersham Corp., Arlington Heights, IL)
中で放射能を測定する。実験は全て３連で行う。
【０４５８】 ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの刺激を受けた細胞中の3Ｈ−ヒス
チジン取り込み量を野生型ＰＤＧＦファミリータンパクの刺激を受けた細胞中の
ものと比較すると、ＰＤＧＦアミノ酸配列へのどちらの変異が結果として生物活
性を高めるかを決定することができる。本アッセイの例はKikuchi et al., Derm
atology, 190: 4-8 (1995)に見られる。細胞外Ｐ１ＣＰアッセイ 別の実施態様においては、培養中の繊維芽細胞がミュータントＰＤＧＦファミ
リータンパク刺激に応答して生産するＩ型プロコラーゲンカルボキシル末端ペプ
チド（Ｐ１ＣＰ）量を測定することにより、ミュータントＰＤＧＦファミリータ
ンパクの生物活性を野生型タンパクの生物活性と比較する。Ｐ１ＣＰの生産は、
ＰＤＧＦファミリータンパク及び他のタイプの増殖因子への露出により刺激され
るＩ型コラーゲン代謝を反映する。本アッセイにおいては、3Ｈ−ヒスチジンア
ッセイで述べた方法を用いて培養された繊維芽細胞を、ウェル当たり1×104細胞
で24ウェル培養プレートに入れる。一晩のインキュベーションの後、該ウェルを
洗浄して新たに調製した無血清培地をＰＤＧＦファミリータンパクと共に或いは
伴わずに加える。72時間のインキュベーション後、上清を集めて4℃で保存する
。Takara Shuzo (Kyoto, Japan)から得られる酵素結合免疫溶媒アッセイキット
を用い、Ryan, et al., Hum., Pathol., 4: 55-67 (1974)に示すようにして上清
中のＰ１ＣＰ量を測定する。実験は全て２連で行う。Ｐ１ＣＰ量の値は2×104繊
維芽細胞当たりで表わされる。本アッセイの例はKikuchi et al., Dermatology,
190: 4-8 (1995)に見られる。
【０４５９】 ＶＥＧＦバイオアッセイ系 血管内皮増殖因子サブファミリータンパクはＰＤＧＦファミリーのメンバーで
ある。それでも、本発明で示すミュータントＶＥＧＦタンパクの結合特性及び生
物活性を分析するために得られる特定のバイオアッセイ系がある。そのような２
つの系は、ミュータントＶＥＧＦタンパクについて行う直接的な結合研究および
ミュータントＶＥＧＦタンパクにより誘導される細胞増殖の測定である。ＶＥＧＦレセプター結合アッセイ 96ウェルイムノプレート（Immunlon-1, DYNEX TECHNOLOGIES, Chantilly, VA
）中で結合アッセイを行う；50mMの炭酸ナトリウムバッファー中に10μgのウサ
ギIgG抗−ヒトIgG (Fc-特異的)を含む100μlの溶液、pH9.6、4℃で一晩各ウェル
を覆う。上清を捨てた後、洗浄バッファー（PBS中0.01%のTween 80）中でウェル
を３度洗浄する。プレートを１時間アッセイバッファー（PBS中0.5%BSA、0.03%T
ween80、0.01%Thimerosal）中で塞ぐ（300μl/ウェル）。次に上清を捨て、ウェ
ルを洗浄する。野生型又はミュータントのいずれかのＶＥＧＦファミリータンパ
クを種々の濃度で（100μl）及び125I−放射線ラベル野生型ＶＥＧＦファミリー
タンパク（50ml中5×103 cpm）を含む条件培地について混合液を調製し、これを
ミクロン試験管に50μl、最終濃度3-15ng/mlのＶＥＧＦレセプター特異的抗体と
混合する。無関係な抗体を、放射線ラベルしたＶＥＧＦファミリータンパクの非
特異的結合のためのコントロールとして用いる。これらの溶液の等量（100μl）
をプレコートしたマイクロ滴定プレートに加え、25℃で4時間インキュベートす
る。上清を捨て、プレートを洗浄し、個々のウェルをγシンチグラフィー（LKB
model 1277）で計数する。ラベルのない野生型又はミュータントＶＥＧＦファミ
リータンパクとラベルされた野生型ＶＥＧＦとの間のＶＥＧＦファミリータンパ
クレセプターへの競合的結合をプロットし、４パラメーターフィッティング（Ka
leidagraph. Abelbeck Software）にて分析する。50%の阻害（IC50）に要する濃
度から、各ミュータントＶＥＧＦファミリータンパクについて見かけの解離定数
を求める。本アッセイの例はKeyt, et al., J. Biol., Chem., 271(10):5638-56
46 (1996)に見られる。ＶＥＧＦ誘導血管内皮細胞増殖アッセイ 別の実施例として、Ferra&Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:85
1-859 (1989)に示されるように、標的細胞としてウシ副腎皮質内皮細胞を用いて
ミュータントＶＥＧＦファミリータンパクのマイトジェン活性を測定する。手短
に言えば、12ウェルプレートに細胞をまばらにプレーティングし（7000細胞/ウ
ェル）、10%の子ウシ血清、2mMのグルタミン、及び抗生物質を加えたDulbecco's
modified Eagle's培地で一晩インキュベートする。該培地を次の日に交換し、
培養培地中100ng.mlから10pg/mlに希釈された野生型又はミュータントＶＥＧＦ
ファミリータンパクを、接種された細胞上に２連で重ねる。37℃で５日のインキ
ュベーション後、該細胞をトリプシンで解離し、Coulterカウンターを用いて定
量する。本アッセイの例はKeyt, et al., J. Biol., Chem., 271(10):5638-5646
(1996)に見られる。ＶＥＧＦマイトジェン活性 標的細胞のマイトジェン活性に対するミュータントＰＤＧＦファミリータンパ
クの影響は、これらタンパクの生物活性を測定し野生型分子と比較するための付
加的なアッセイである。マイトジェンアッセイはMizazono et al., J. Biol. Ch
em., 262:4098-4103 (1987)に示されるように行う。手短に言えば、ウェル当た
り1×104細胞のヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞を、ＢＴＳから24ウェルプレ
ート内の皮増殖培地に接種する。該細胞を37℃で一晩付着させる。培地を5%の子
ウシ胎児血清及び1.5μMのチミジンを加えた内皮基礎培地（ＢＴＳ）で置換し、
野生型又はミュータントＶＥＧＦファミリータンパクを24時間後に添加する。イ
ンキュベーションを更に18時間続け、その後1μCi [3H]−メチルチミジン（56.7
Ci/mmol, NEN, Boston, MA）を加える。細胞を37℃で更に6時間放置する。細胞
単層をメタノールで固定し、5%のトリクロロ酢酸で洗浄し、0.3MのNaOHに溶解し
、液体シンチレーションで計数する。[3H]−メチルチミジン取り込みのレベルを
、野生型またはミュータントＶＥＧＦファミリータンパクで処理した細胞群間で
比較する。本アッセイの例はFiebich, et al., Eur. J. Biochem. 211:19-26 (1
993)に見られる。
【０４６０】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクレベルが１／２
に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク
の半減期は、限定されないが、例えば、抗−ＰＤＧＦファミリータンパク抗体を
用いてミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの投与後一定期間後に採取した
サンプルにおけるミュータントＰＤＧＦファミリータンパクレベルを測定するイ
ムノアッセイ、又は放射線ラベルしたミュータントＰＤＧＦファミリータンパク
の投与後採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＰＤＧＦファ
ミリータンパクの検出等、一定期間後の対象物からのサンプルにおけるＰＤＧＦ
ファミリータンパクレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定できる
。
【０４６１】 他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる
。
【０４６２】 診断的及び治療的使用 本発明は、本発明の治療化合物（ここでは“治療薬”（"Therapeutic"）とい
う）の投与による各種疾患及び障害の治療又は予防を提供する。そのような治療
薬は次のものを含む：ミュータントサブユニット及びワイルドタイプ又はミュー
タントサブユニットの何れか一方を有するPDGFファミリータンパクヘテロダイマ
ー；ミュータントサブユニット及びミュータント又はワイルドタイプサブユニッ
トの何れか一方を有し、全部又は一部がもう一つのCKGFタンパクと共有結合的に
結合するPDGFファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントサブユニット及
びワイルドタイプサブユニットを有し、ミュータントサブユニットは単鎖アナロ
グを形成するために共有結合的に結合し、ミュータントサブユニット及びワイル
ドタイプ又はミュータントサブユニット並びにCKGFタンパク又はフラグメントが
、単鎖アナログ、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメント（すなわち、上記
したように）並びに本発明のミュータントPDGFファミリータンパクヘテロダイマ
ーをエンコードする核酸及び誘導体、アナログ及びそのフラグメント中で共有結
合的に結合するPDGFファミリープロテインヘテロダイマーを含む。
【０４６３】 治療薬が投与される対象は、好適には動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワト
リ、ネコ、イヌなどを含むがこれに限定されず、好適には哺乳類である。好適な
例としては対象はヒトである。一般に、対象の種と同種を起源とする種の生産物
の投与が好ましい。従って、好ましい例において、ヒトミュータント及び／又は
修飾されたPDGFファミリータンパクヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、
又は核酸は、ヒト患者に治療的又は予防的又は診断的に投与される。
【０４６４】 好ましい側面において、本発明の治療薬は実質的に精製されている。
【０４６５】 タンパクのPDGFファミリーは、細胞成長を刺激する活動的な役割を果たす。PD
GFのアイソフォームは、創傷治癒において重要な役割を果たす。この創傷治癒機
能は、本発明の方法によって増強され得る。PDGFファミリープロテインが、通常
又は所望のレベルと比較して欠乏又は減少する障害は、本発明のミュータントPD
GFファミリープロテインヘテロダイマー又はPDGFファミリープロテインアナログ
の投与によって治療又は予防される。PDGFファミリープロテインレセプターが通
常のレベルと比較して欠乏又は減少する、あるいはワイルドタイプPDGFファミリ
ープロテインに対して通常のPDGFファミリープロテインレセプターより非応答性
又は低応答性である障害は、ミュータントPDGFファミリープロテインヘテロダイ
マー又はPDGFファミリープロテインアナログの投与によってもまた治療され得る
。ミュータントPDGFファミリープロテインヘテロダイマー及びPDGFファミリープ
ロテインアナログのアンタゴニストとしての使用は本発明によって意図される。
【０４６６】 具体例において、生物活性を有するミュータントPDGFファミリータンパクヘテ
ロダイマー又はPDGFファミリータンパクアナログは、創傷治癒の促進を含む多く
の細胞成長及び発生状況を治療するために、予防的を含む治療的に投与される。
【０４６７】 PDGFファミリータンパク又は機能あるいはPDGFファミリータンパクレセプター
及び機能の欠乏又は減少は、容易に、すなわち患者組織サンプルを（すなわち生
検組織から）得ること及びそれをインビトロで、、、PDGFファミリータンパク又
はPDGFファミリータンパクレセプターの発現したRNAまたはタンパクの構造及び
／又は活性、、、RNA又はタンパクレベルでアッセイすることによって、検出さ
れ得る。このようにして、当分野で標準的な多くの方法は使用され得、ここで、
PDGFファミリータンパク又はPDGFファミリータンパクレセプタータンパクを検出
及び／又は可視化するための免疫アッセイ（すなわち、ウエスタンブロット、後
にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う免疫沈降、免
疫細胞化学、その他）、及び／又はPDGFファミリータンパク又はPDGFファミリー
タンパクレセプターmRNAの検出及び／又は可視化によって、PDGFファミリータン
パク又はPDGFファミリータンパクレセプター発現を検出するハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ（すなわち、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハ
イブリダイゼーション、その他）、その他が含まれるがこれらに限定されない。
【０４６８】 ヒト神経成長因子モノマーのミュータント ヒト神経成長因子モノマーは、図10（SEQ ID No:9）に示されるように120個の
アミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1、2、3
、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿
入を包含する、ヒト神経成長因子モノマーのミュータントを意図する。さらに、
本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒト神経成長因子
モノマーを意図する。
【０４６９】 本発明は、図10（SEQ ID NO:9）に表されるように、ミュータント神経成長因
子モノマーに、16位から57位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又
はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換
は次のものを包含する：D16X、S17X、V18X、S19X、V20X、W21X、V22X、G23X、D2
4X、K25X、T26X、T27X、A28X、T29X、D30X、I31X、K32X、G33X、K34X、E35X、V3
6X、M37X、V38X、L39X、G40X、E41X、V42X、N43X、N44X、I45X、N46X、S47X、V4
8X、F49X、K50X、Q51X、Y52X、F53X、F54X、E55X、T56X、及びK57X、ここで“X
”はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変化
させる。
【０４７０】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。神経成長因子モノマーのL1ループに塩基性残基を導入す
る時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。神経成長因子モノ
マーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の１つ以上を含
む：D16B、D24B、D30B、E35B、E41B及びE55B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残
基である。
【０４７１】 神経成長因子モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入す
ることもまた意図される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に
対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより負の状
態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を含む：
K25Z、K32Z、K34Z、K50Z及びK57Z、ここで、“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０４７２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D16U、D24U、K25U、D30U、K32U、K34U、E35U、E41U、K50U、E55U、及びK57Uにお
いて導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０４７３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンル
ープアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含
むミュータント神経成長因子モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基
を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S17Z、V18Z、S1
9Z、V20Z、W21Z、V22Z、G23Z、T26Z、T27Z、A28Z、T29Z、I31Z、G33Z、V36Z、M3
7Z、V38Z、L39Z、G40Z、V42Z、N43Z、N44Z、I45Z、N46Z、S47Z、V48Z、F49Z、Q5
1Z、Y52Z、F53Z、F54Z、T56Z、S17B、V18B、S19B、V20B、W21B、V22B、G23B、T2
6B、T27B、A28B、T29B、I31B、G33B、V36B、M37B、V38B、L39B、G40B、V42B、N4
3B、N44B、I45B、N46B、S47B、V48B、F49B、Q51B、Y52B、F53B、F54B、及びT56B
、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０４７４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント神経成長因子モノ
マーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図10(SEQ ID NO
:9)に描かれているように、L3ヘアピンループの81位〜107位の間で境界位置を含
め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次を含む：T81X、T82X、T83X、H84X、T85X、F86X、V87X、K88X、A8
9X、M90X、L91X、T92X、D93X、G94X、K95X、Q96X、A97X、A98X、W99X、R100X、F
101X、I102X、R103X、I104X、D105X、T106X、及びA107X、ここで“X”はあらゆ
るアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０４７５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を、酸性アミノ酸残基が存在する神経成長因子L3ヘアピンループアミノ酸配
列に導入することを含む。例えば、神経成長因子モノマーのL3ループに塩基性残
基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。
塩基性残基が神経成長因子モノマーに導入されるミューテイションを変える静電
荷の具体例は次の1つ以上を含む：D93B及びD105B、ここで“B”は塩基性アミノ
酸残基である。
【０４７６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を神経成長因子L3ヘアピンループのアミ
ノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上
記の81〜107の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸
に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、H84Z、K88Z、K95Z、R100
Z及びR103Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０４７７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はH84U、K88U、D93U、K95U、R100U、R103U及びD105Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０４７８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータント神経成長因子モノマーが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた
残基に変えるミューテイションの例は、T81Z、T82Z、T83Z、T85Z、F86Z、V87Z、
A89Z、M90Z、L91Z、T92Z、G94Z、Q96Z、A97Z、A98Z、W99Z、F101Z、I102Z、I104
Z、T106Z、A107Z、T81B、T82B、T83B、T85B、F86B、V87B、A89B、M90B、L91B、T
92B、G94B、Q96B、A97B、A98B、W99B、F101B、I102B、I104B、T106B、及びA107B
を含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０４７９】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、神経成長因子モノマーを
意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる神
経成長因子モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体タンパクに対
するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、神経成長因子モノマーの1位〜14位、59位〜7
9位、及び109位〜120位からなる群から選択される位置で見出される。
【０４８０】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、S1J、S2J、S3J、H4J、P5J、I6J、F7J、H8J、R9J、G10J、E11J、D12J、S13J、V
14J、R59J、D60J、P61J、N62J、P63J、V64J、D65J、S66J、G67J、C68J、R69J、G
70J、I71J、D72J、S73J、K74J、H75J、W76J、N77J、S78J、Y79J、V109J、C110J
、V111J、L112J、S113J、R114J、K115J、A116J、V117J、R118J、R119J、及びA12
0Jを含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、神経成長
因子のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータント神経成長因子モノマーを
含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相
互作用が増加する。
【０４８１】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くの神経成長因子モノマー
についても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシス
チンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合した
神経成長因子モノマーを含む。
【０４８２】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖神経成長因子アナログを含むミュータント神経成長因子ヘテロダイマーは
機能上活性であり、すなわち、神経成長因子レセプター結合、神経成長因子レセ
プターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプ神経成長因子に関
連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータント
神経成長因子ヘテロダイマー又は単鎖神経成長因子アナログは、好ましくはワイ
ルドタイプ神経成長因子より大きいアフィニティーを有する神経成長因子レセプ
ターに結合することができる。また、そのようなミュータント神経成長因子ヘテ
ロダイマー又は単鎖神経成長因子アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好
ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニッ
ト又は単鎖神経成長因子アナログを含むミュータント神経成長因子ヘテロダイマ
ーは、ワイルドタイプ神経成長因子より大きいインビトロ生物活性及び/又はイ
ンビボ生物活性を有し、ワイルドタイプ神経成長因子より長い血清半減期を有す
る。本発明のミュータント神経成長因子ヘテロダイマー及び単鎖神経成長因子ア
ナログは、該技術において知られている手順により、望まれる活性に対してテス
トされることができる。
【０４８３】 ヒト脳神経由来神経栄養因子のミュータント ヒト脳神経由来神経栄養因子モノマーは、図11（SEQ ID No:10）に示されるよ
うに119個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場
合、1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換
、欠失又は挿入を包含する、ヒト脳神経由来神経栄養因子モノマーのミュータン
トを意図する。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュー
タントヒト脳神経由来神経栄養因子モノマーを意図する。
【０４８４】 本発明は、図11（SEQ ID NO:10）に表されるように、脳神経由来神経栄養因子
モノマーに、14位から57位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又は
それ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換は
次のものを包含する：D14X、S15X、I16X、S17X、E18X、W19X、V20X、T21X、A22X
、A23X、D24X、K25X、K26X、T27X、A28X、V29X、D30X、M31X、S32X、G33X、G34X
、T35X、V36X、T37X、V38X、L39X、E40X、K41X、V42X、S43X、P44X、V45X、K46X
、G47X、Q48X、L49X、K50X、Q51X、Y52X、F53X、Y54X、E55X、T56X、及びK57X。
“X”はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を
変化させる。
【０４８５】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。脳神経由来神経栄養因子モノマーのL1ループに塩基性残
基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。脳神経
由来神経栄養因子モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体
例は次の１つ以上を含む：D14B、E18B、D24B、D30B、E40B、E55B及びE57B、ここ
で“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０４８６】 脳神経由来神経栄養因子モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残
基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性を
より負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以
上を含む：K25Z、K26Z、K41Z、K46Z、K50Z及びK57Z、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸残基である。
【０４８７】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D14U、E18U、D24U、K25U、K26U、D30U、E40U、K41U、K46U、K50U、E55U、及びK5
7Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０４８８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンル
ープアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含
むミュータント脳神経由来神経栄養因子モノマータンパクが提供される。中性ア
ミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S15Z
、I16Z 、S17Z、W19Z、V20Z、T21Z、A22Z、A23Z、T27Z、A28Z、V29Z、M31Z、S32
Z、G33Z、G34Z、T35Z、V36Z、T37Z、V38Z、L39Z、V42Z、S43Z、P44Z、V45Z、G47
Z、Q48Z、L49Z、Q51Z、Y52Z、F53Z、Y54Z、T56Z、S15B、I16B、S17B、W19B、V20
B、T21B、A22B、A23B、T27B、A28B、V29B、M31B、S32B、G33B、G34B、T35B、V36
B、T37B、V38B、L39B、V42B、S43B、P44B、V45B、G47B、Q48B、L49B、Q51B、Y52
B、F53B、Y54B、及びT56B、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性
アミノ酸である。
【０４８９】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント脳神経由来神経栄
養因子モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図11
(SEQ ID NO:10)に描かれているように、L3ヘアピンループの81位〜108位の間で
境界位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を
有する。該アミノ酸置換は次を含む：R81X、T82X、T83X、Q84X、S85X、Y86X、V8
7X、R88X、A89X、M90X、L91X、T92X、D93X、S94X、K95X、K96X、R97X、I98X、G9
9X、W100X、R101X、F102X、I103X、R104X、I105X、D106X、T107X、及びS108X、
ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を
変える。
【０４９０】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を、脳神経由来神経栄養因子L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入すること
を含む。例えば、脳神経由来神経栄養因子モノマーのL3ループに塩基性残基を導
入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性
残基が脳神経由来神経栄養因子モノマーに導入されるミューテイションを変える
静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D93B及びD106B、ここで“B”は塩基性ア
ミノ酸残基である。
【０４９１】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を脳神経由来神経栄養因子L3ヘアピンル
ープのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性ア
ミノ酸は上記の81〜108の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸
性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R81Z、R88Z、
K95Z、K96Z、R97Z、R101Z及びR104Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基で
ある。
【０４９２】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR81U、R88U、D93B、K95U、K96U、R97U、R101U及びR1
04Zで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０４９３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータント脳神経由来神経栄養因子タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電
荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T82Z、T83Z、Q84Z、S85Z、Y8
6Z、V87Z、A89Z、M90Z、L91Z、T92Z、S94Z、I98Z、G99Z、W100Z、F102Z、I103Z
、I105Z、T107Z、S108Z、C109Z、V110Z、T82B、T83B、Q84B、S85B、Y86B、V87B
、A89B、M90B、L91B、T92B、S94B、I98B、G99B、W100B、F102B、I103B、I105B、
T107B、S108B、及びV110Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩
基性アミノ酸である。
【０４９４】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、脳神経由来神経栄養因子
モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に
含まれる脳神経由来神経栄養因子モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び
、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用
を増加させるように働く。これらのミューテイションは、脳神経由来神経栄養因
子モノマーの1位〜12位、59位〜79位、及び110位〜119位からなる群から選択さ
れる位置で見出される。
【０４９５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、H1J、S2J、D3J、P4J、A5J、R6J、R7J、G8J、E9J、L10J、S11J、V12J、N59J、P
60J、M61J、G62J、Y63J、T64J、K65J、E66J、G67J、C68J、R69J、G70J、I71J、D
72J、K73J、R74J、H75J、W76J、N77J、S78J、Q79J、V110J、C111J、I112J、L113
J、T114J、I115J、K116J、R117J、G118J、及びE119Jを含む。可変の“J”はあら
ゆるアミノ酸であり、その導入の結果、脳神経由来神経栄養因子のL1及びL3βヘ
アピンループ構造と、ミュータント脳神経由来神経栄養因子モノマーを含む二量
体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が
増加する。
【０４９６】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くの脳神経由来神経栄養因
子モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう
1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクション
に結合した脳神経由来神経栄養因子モノマーを含む。
【０４９７】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖脳神経由来神経栄養因子アナログを含むミュータント脳神経由来神経栄養
因子ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、脳神経由来神経栄養因子レ
セプター結合、脳神経由来神経栄養因子レセプターシグナル伝達、及び細胞外分
泌のようなワイルドタイプ脳神経由来神経栄養因子に関連する、1つ以上の機能
的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータント脳神経由来神経栄養因子
ヘテロダイマー又は単鎖脳神経由来神経栄養因子アナログは、好ましくはワイル
ドタイプ脳神経由来神経栄養因子より大きいアフィニティーを有する脳神経由来
神経栄養因子レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータン
ト脳神経由来神経栄養因子ヘテロダイマー又は単鎖脳神経由来神経栄養因子アナ
ログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、
少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖脳神経由来神経栄養因子ア
ナログを含むミュータント脳神経由来神経栄養因子ヘテロダイマーは、ワイルド
タイプ脳神経由来神経栄養因子より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビ
ボ生物活性を有し、ワイルドタイプ脳神経由来神経栄養因子より長い血清半減期
を有する。本発明のミュータント脳神経由来神経栄養因子ヘテロダイマー及び単
鎖脳神経由来神経栄養因子アナログは、該技術において知られている手順により
、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０４９８】 ヒトニュートロフィン-3モノマーのミュータント ヒトニュートロフィン-3モノマーは、図12（SEQ ID No:11）に示されるように
119個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1
、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失
又は挿入を包含する、ヒトニュートロフィン-3モノマーのミュータントを意図す
る。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒト
ニュートロフィン-3モノマーを意図する。
【０４９９】 本発明は、図12（SEQ ID NO:11）に表されるように、ミュータントニュートロ
フィン-3モノマーに、15位から56位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除い
て、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミ
ノ酸置換は次のものを包含する：D15X、S16X、E17X、S18X、L19X、W20X、V21X、
T22X、D23X、K24X、S25X、S26X、A27X、I28X、D29X、I30X、R31X、G32X、H33X、
Q34X、V35X、T36X、V37X、L38X、G39X、E40X、I41X、G42X、K43X、T44X、N45X、
S46X、P47X、V48X、K49X、Q50X、Y51X、F52X、Y53X、E54X、T55X、及びR56X。“
X”はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変
化させる。
【０５００】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。ヒトニュートロフィン-3モノマーのL1ループに塩基性残
基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトニ
ュートロフィン-3モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体
例は次の１つ以上を含む：D15B、E17B、D23B、D29B、E40B及びE54B、ここで“B
”は塩基性アミノ酸残基である。
【０５０１】 ヒトニュートロフィン-3モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残
基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性を
より負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以
上を含む：K24Z、R31Z、H33Z、K43Z、K49Z及びR56Z、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸残基である。
【０５０２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D15U、E17U、D23U、K24U、D29U、R31U、H33U、E40U、K43U、K49U、E54U、及びR5
6Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５０３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンル
ープアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含
むミュータントニュートロフィン-3が提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S16Z、S18Z、L19Z、W20Z、
V21Z、T22Z、S25Z、S26Z、A27Z、I28Z、I30Z、G32Z、Q34Z、V35Z、T36Z、V37Z、
L38Z、G39Z、I41Z、G42Z、T44Z、N45Z、S46Z、P47Z、V48Z、Q50Z、Y51Z、F52Z、
Y53Z、T55Z、R56Z、S16B、S18B、L19B、W20B、V21B、T22B、S25B、S26B、A27B、
I28B、I30B、G32B、Q34B、V35B、T36B、V37B、L38B、G39B、I41B、G42B、T44B、
N45B、S46B、P47B、V48B、Q50B、Y51B、F52B、Y53B、及びT55B、ここで、“Z”
は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５０４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントニュートロフィン
-3モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図12(SEQ ID NO:11)に描かれているように、L3ヘアピンループの80位〜107位の間で境界
位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有す
る。該アミノ酸置換は次を含む：K80X、T81X、S82X、Q83X、T84X、Y85X、V86X、
R87X、A88X、S89X、L90X、T91X、E92X、N93X、N94X、K95X、L96X、V97X、G98X、
W99X、R100X、W101X、I102X、R103X、I104X、D105X、T106X、及びS107X、ここで
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える
。
【０５０５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を、ニュートロフィン-3 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを
含む。例えば、ニュートロフィン-3モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する
時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基が
ニュートロフィン-3モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具
体例は次の1つ以上を含む：E92B及びD105B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基
である。
【０５０６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をニュートロフィン-3 L3ヘアピンルー
プのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミ
ノ酸は上記の80〜107の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K80Z、R87Z、N9
3Z、K95Z、L96Z、R100Z及びR103Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基であ
る。
【０５０７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK80U、R87U、E92U、K95U、R100U、R103U及びD105Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５０８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントニュートロフィン-3タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T81Z、S82Z、Q83Z、T84Z、Y85Z、
V86Z、A88Z、S89Z、L90Z、T91Z、N93Z、N94Z、L96Z、V97Z、G98Z、W99Z、W101Z
、I102Z、I104Z、T106Z、S107Z、T81B、S82B、Q83B、T84B、Y85B、V86B、A88B、
S89B、L90B、T91B、N93B、N94B、L96B、V97B、G98B、W99B、W101B、I102B、I104
B、T106B、及びS107Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性
アミノ酸である。
【０５０９】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ニュートロフィン-3モノ
マーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含ま
れるニュートロフィン-3モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体
タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加さ
せるように働く。これらのミューテイションは、ニュートロフィン-3モノマーの
1位〜13位、58位〜78位、及び109位〜119位からなる群から選択される位置で見
出される。
【０５１０】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、Y1J、A2J、E3J、H4J、K5J、S6J、H7J、R8J、G9J、E10J、Y11J、S12J、V13J、K
58J、E59J、A60J、R61J、P62J、V63J、K64J、N65J、G66J、C67J、R68J、G69J、I
70J、D71J、D72J、R73J、H74J、W75J、N76J、S77J、Q78J、V109J、C110J、A111J
、L112J、S113J、R114J、K115J、I116J、G117J、R118J、及びT119Jを含む。可変
の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ニュートロフィン-3のL1
及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントニュートロフィン-3モノマーを含
む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互
作用が増加する。
【０５１１】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのニュートロフィン-3モ
ノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つ
のシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結
合したニュートロフィン-3モノマーを含む。
【０５１２】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ニュートロフィン-3アナログを含むミュータントニュートロフィン-3ヘテ
ロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ニュートロフィン-3レセプター結合
、ニュートロフィン-3レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイル
ドタイプニュートロフィン-3に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことがで
きる。好ましくは、ミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマー又は単鎖ニ
ュートロフィン-3アナログは、好ましくはワイルドタイプニュートロフィン-3よ
り大きいアフィニティーを有するニュートロフィン-3レセプターに結合すること
ができる。また、そのようなミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマー又
は単鎖ニュートロフィン-3アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい
。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は
単鎖ニュートロフィン-3アナログを含むミュータントニュートロフィン-3ヘテロ
ダイマーは、ワイルドタイプニュートロフィン-3より大きいインビトロ生物活性
及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプニュートロフィン-3より長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマ
ー及び単鎖ニュートロフィン-3アナログは、該技術において知られている手順に
より、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５１３】 ヒトニュートロフィン-4モノマーのミュータント ヒトニュートロフィン-4モノマーは、図13（SEQ ID No:12）に示されるように
130個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1
、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失
又は挿入を包含する、ヒトニュートロフィン-4モノマーのミュータントを意図す
る。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒト
ニュートロフィン-4モノマーを意図する。
【０５１４】 本発明は、図13（SEQ ID NO:12）に表されるように、ミュータントニュートロ
フィン-4モノマーに、18位から60位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除い
て、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミ
ノ酸置換は次のものを包含する：D18X、A19X、V20X、S21X、G22X、W23X、V24X、
T25X、D26X、R27X、R28X、T29X、A30X、V31X、D32X、L33X、R34X、G35X、R36X、
E37X、V38X、E39X、V40X、L41X、G42X、E43X、V44X、P45X、A46X、A47X、G48X、
G49X、S50X、P51X、L52X、R53X、Q54X、Y55X、F56X、F57X、E58X、T59X、及びR6
0X。“X”はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特
性を変化させる。
【０５１５】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。ニュートロフィン-4モノマーのL1ループに塩基性残基を
導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ニュートロ
フィン-4モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の
１つ以上を含む：D18B、D26B、D32B、E37B、E39B、E43B及びE58B、ここで“B”
は塩基性アミノ酸残基である。
【０５１６】 ニュートロフィン-4モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を
導入することもまた意図される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミ
ノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより
負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を
含む：R27Z、R28Z、R34Z、R36Z、R53Z及びR60Z、ここで、“Z”は酸性アミノ酸
残基である。
【０５１７】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D18U、D26U、R27U、R28U、D32U、R34U、R36U、E37U、E39U、E43U、R53U、E58U、
及びR60Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５１８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンル
ープアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含
むミュータントニュートロフィン-4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を
電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：A19Z、V20Z、S21Z
、G22Z、W23Z、V24Z、T25Z、T29Z、A30Z、V31Z、L33Z、G35Z、V38Z、V40Z、L41Z
、G42Z、V44Z、P45Z、A46Z、A47Z、G48Z、G49Z、S50Z、P51Z、L52Z、Q54Z、Y55Z
、F56Z、F57Z、T59Z、A19B、V20B、S21B、G22B、W23B、V24B、T25B、T29B、A30B
、V31B、L33B、G35B、V38B、V40B、L41B、G42B、V44B、P45B、A46B、A47B、G48B
、G49B、S50B、P51B、L52B、Q54B、Y55B、F56B、F57B、及びT59B、ここで、“Z
”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５１９】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントニュートロフィン
-4モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図13(SEQ ID NO:12)に描かれているように、L3ヘアピンループの91位〜118位の間で境界
位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有す
る。該アミノ酸置換は次を含む：K91X、A92X、K93X、Q94X、S95X、Y96X、V97X、
R98X、A99X、L100X、T101X、A102X、D103X、A104X、Q105X、G106X、R107X、V108
X、G109X、W110X、R111X、W112X、I113X、R114X、I115X、D116X、T117X、及びA1
18X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特
性を変える。
【０５２０】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を、酸性残基が存在するニュートロフィン-4 L3ヘアピンループアミノ酸配
列に導入することを含む。例えば、ニュートロフィン-4モノマーのL3ループに塩
基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応
する。塩基性残基がニュートロフィン-4モノマーに導入されるミューテイション
を変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D103B及びD116B、ここで“B”は
塩基性アミノ酸残基である。
【０５２１】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をニュートロフィン-4 L3ヘアピンルー
プのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミ
ノ酸は上記の91〜118の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K91Z、K93Z、Q9
4Z、R98Z、A104Z、Q105Z、G106Z、R107Z、V108Z、R111Z及びR114Zを含み、ここ
で“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０５２２】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK91U、K93U、R98U、D103U、R107U、R111U、R114U及
びD116Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５２３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントニュートロフィン-4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、A92Z、Q94Z、S95Z、Y96Z、V97Z、
A99Z、L100Z、T101Z、A102Z、A104Z、Q105Z、G106Z、V108Z、G109Z、W110Z、W11
2Z、I113Z、I115Z、T117Z、A118Z、A92B、Q94B、S95B、Y96B、V97B、A99B、L100
B、T101B、A102B、A104B、Q105B、G106B、V108B、G109B、W110B、W112B、I113B
、I115B、T117B、及びA118Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は
塩基性アミノ酸である。
【０５２４】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ニュートロフィン-4モノ
マーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含ま
れるニュートロフィン-4モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体
タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加さ
せるように働く。これらのミューテイションは、ニュートロフィン-4モノマーの
1位〜16位、62位〜89位、及び120位〜130位からなる群から選択される位置で見
出される。
【０５２５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、G1J、V2J、S3J、E4J、T5J、A6J、P7J、A8J、S9J、R10J、R11J、G12J、E13J、L
14J、A15J、V16J、K62J、A63J、D64J、N65J、A66J、E67J、E68J、G69J、G70J、P
71J、G72J、A73J、G74J、G75J、G76J、G77J、C78J、R79J、G80J、V81J、D82J、R
83J、R84J、H85J、W86J、V87J、S88J、E89J、V120J、C121J、T122J、L123J、L12
4J、S125J、R126J、T127J、G128J、R129J、及びA130Jを含む。可変の“J”はあ
らゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ニュートロフィン-4のL1及びL3βヘア
ピンループ構造と、ミュータントニュートロフィン-4モノマーを含む二量体タン
パクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加す
る。
【０５２６】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのニュートロフィン-4モ
ノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つ
のシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結
合したニュートロフィン-4モノマーを含む。
【０５２７】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ニュートロフィン-4アナログを含むミュータントニュートロフィン-4ヘテ
ロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ニュートロフィン-4レセプター結合
、ニュートロフィン-4レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイル
ドタイプニュートロフィン-4に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことがで
きる。好ましくは、ミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマー又は単鎖ニ
ュートロフィン-4アナログは、好ましくはワイルドタイプニュートロフィン-4よ
り大きいアフィニティーを有するニュートロフィン-4レセプターに結合すること
ができる。また、そのようなミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマー又
は単鎖ニュートロフィン-4アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい
。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は
単鎖ニュートロフィン-4アナログを含むミュータントニュートロフィン-4ヘテロ
ダイマーは、ワイルドタイプニュートロフィン-4より大きいインビトロ生物活性
及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプニュートロフィン-4より長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマ
ー及び単鎖ニュートロフィン-4アナログは、該技術において知られている手順に
より、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５２８】 ミュータントニュートロトロフィン（Neutrotrophin）ファミリータンパク 及びアナログをエンコードするポリヌクレオチド 本発明はまた、本発明のヒトニューロトロフィンファミリータンパク及びニュ
ーロトロフィンファミリータンパクアナログのミュータントサブユニットをコー
ドする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠
失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによってワイルドタイ
プタンパクと比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせてい
る、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することの
ない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合され
ている場合には、核酸分子の３’末端が他の核酸分子の５’（又はペプチドリン
カーをエンコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト
無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０５２９】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための
同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施にお
いて使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を
配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換された、このようなサイレ
ント変化を生ずる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含
むヌクレオチド配列を含む。
【０５３０】 一つの実施態様では、本発明は、ミュータントニューロトロフィンファミリー
タンパクサブユニットをエンコードする配列を含む核酸分子を提供し、該ミュー
タントニューロトロフィンサブユニットは一個又は複数のアミノ酸置換を含み、
好ましくは標的タンパク質のβヘアピンL1及び／又はL3ループ又はその近傍に位
置する。本発明はまた、L1及び／又はL3ループの外側にアミノ酸置換を有し、こ
れによりこれらのループとニューロトロフィンファミリータンパクダイマーの同
族レセプターとの間の静電相互作用が高められた、ミュータントニューロトロフ
ィンファミリータンパクサブユニットをエンコードする核酸分子を提供する。本
発明は更に、好ましくはニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットの
βヘアピンL1及び／又はL3ループ又はその近傍に位置し、及び／又はCKGFタンパ
クに共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントニューロト
ロフィンファミリータンパクサブユニットをエンコードする配列を含む核酸分子
を提供する。
【０５３１】 更に別の実施態様として、本発明は、ニューロトロフィンファミリータンパク
アナログをエンコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数の
アミノ酸置換を含むミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユ
ニットのコード領域は、ワイルドタイプサブユニット又は別の突然変異モノマー
サブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合してい
る。更に、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクモノマーのカル
ボキシル末端が、別のCKGFタンパクのアミノ末端に結合している、単鎖ニューロ
トロフィンファミリータンパクアナログをエンコードする核酸分子も提供する。
更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ニューロトロフィンファミリータン
パクアナログをエンコードし、ここでミュータントニューロトロフィンファミリ
ータンパクモノマーのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端のような別のCKGFタ
ンパクのアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末
端はシグナルペプチドのないミュータントニューロトロフィンファミリータンパ
クモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０５３２】 本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ニューロト
ロフィンファミリータンパクのモノマーサブユニットをエンコードする核酸配列
どうしを公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させるこ
とによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペ
プチドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製でき
る。
【０５３３】 ミュータント神経成長因子サブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントニューロトロフィンファミリータンパク、ミュータント
ニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンフ
ァミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの
作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータ
ントサブユニット又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログは、これ
に限定はされないが例えばミュータントニューロトロフィンファミリータンパク
サブユニット及び別のCKGF、全部又は一部が二つのミュータント神経成長サブユ
ニットを含む融合タンパクである。一つの実施態様として、この様な融合タンパ
クは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素
類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント
又はワイルドタイプサブユニットをエンコードする核酸の組み替え発現によって
作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、
所望のアミノ酸配列をエンコードする適切な核酸配列どうしを公知の方法で互い
に連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することが
できる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使
用のようなタンパク合成方法によって作製できる。いかなる異種タンパクコード
配列と融合した、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニ
ットの一部を含むキメラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましく
は二つのミュータントとの間にペプチドリンカーを介して、別のミュータントニ
ューロトロフィンファミリータンパクサブユニットと融合したミュータントニュ
ーロトロフィンファミリータンパクサブユニットを含む単鎖アナログに関するも
のである。
【０５３４】 ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットの 構造及び機能解析 ここに示すのは、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユ
ニット、ミュータントヘテロダイマー及びニューロトロフィンファミリータンパ
クアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の
解析方法である。
【０５３５】 ひとたびミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットが
確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及
びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的
な方法、又はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製す
ることができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法を
含む）を用いて評価できる。
【０５３６】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントニューロトロフィンファミ
リータンパクサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸
配列は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標
準的な方法によって決定できる。
【０５３７】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。
親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域を
コードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０５３８】 二次的な構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる
。
【０５３９】 他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engs
tom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及びコンピューターモデリング
（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Mole
cular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。BLAST、CHAR
MMリリース21.2（コンベックス用）、及びQUANTA v.3.3（Molecular Simulatio
ns, Inc., York, 英国)等の当業界で利用できるコンピューターソフトウェアプ
ログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析
、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０５４０】 ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット、ミュータ
ントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィ
ンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメン
トの機能的活性は、各種の公知の方法で分析することができる。
【０５４１】 例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントニューロトロフィンファ
ミリータンパクについて、抗体に結合するためにワイルドタイプニューロトロフ
ィンファミリータンパク又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評価す
る場合には、公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されないが
、これにはラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、“サン
ドウィッチ”イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、
イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベル
を用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッ
セイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、蛍光
イムノアッセイ、プロテインＡアッセイ、及び電気泳動イムノアッセイ等の方法
を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次
抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体
又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出すること
により認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術においては多く
の手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０５４２】 ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット、ミュータ
ントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィ
ンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメン
トのニューロトロフィンファミリータンパクレセプターへの結合は、限定されな
いが、例えば放射ラベルされた別の種、例えばウシニューロトロフィンファミリ
ータンパク、のニューロトロフィンファミリータンパクのニューロトロフィンフ
ァミリータンパクレセプターからの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術
分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントニューロトロフィンファミ
リータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログ
、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、ミュータ
ントニューロトロフィンタンパクの機能を検出する公知の各種バイオアッセイに
よって測定することができる。例えば、自己リン酸化研究、架橋研究及びリガン
ド結合研究は、公知であり、本発明のミュータントニューロトロフィンファミリ
ータンパク機能的態様を評価するために使用される。更に、試験細胞の集団にお
いて表現型の変更を誘導する、ミュータント及びワイルドタイプの活性を比較す
るバイオアッセイ。
【０５４３】 自己リン酸化 ミュータントニューロトロフィンタンパクが生物学的活性を示すか否かを測定
するため、興味深いニューロトロフィンタンパクのレセプター分子を作成する。
あるアッセイシステムにおいて、trkCのcDNAを生産させ、発現ベクター中でサブ
クローニングし、形質移入しNIH 3T3線維芽細胞中で安定に発現する、ここで細
胞はあらゆるtrkファミリープロテインを正常に発現しない。形質移入したレセ
プターの発現は、その分野で知られた標準的な技術を用いて確認される。（Tsou
lfas et al., Neuron, 10: 975-990 (1993)参照。） 形質移入処置に次いで、修飾されたNIH 3T3細胞の、本発明のミュータントニ
ューロトロフィンタンパクに応答する能力について試験する。形質移入した線維
芽細胞を、様々な量の精製、部分精製又は粗組み換えミュータントニューロトロ
フィンに継続的にさらし、結果を評価する。あるアッセイにおいて、濃度約0〜1
000ng/mlの範囲にわたってミュータントNT-3タンパクは、試験細胞から生物学的
応答を誘発するに十分な時間の間、trkC発現細胞系に適用される。ある試験にお
いて、この時間は概ね5分間である。ミュータントプロテインにさらし、次いで
細胞を溶解し、全てのTrkファミリーレセプターの高度に保存されたC末端を認識
する抗血清で溶菌液を免疫沈降させる。そのような抗体の一例はうさぎ抗血清44
3である。（Soppet, et al., Cell 1991 May 31 65:5 895-903参照）。ゲル電気
泳動及びニトロセルロースへ転移の後、フィルターを、リン酸化チロシン残基の
存在を検出するために他の抗体でプローブする。モノクローナル抗体4G10はその
ようなリン酸化残基に特異なモノクローナル抗体である。（Kaplan et al., Tso
ulfas et al. 参照。）。TrkCチロシン残基のリン酸化はレセプターの触媒作用
的な活性を示し、試験したミュータントニューロトロフィンタンパクの機能性も
また示す。
【０５４４】 架橋アフィニティー 化学的な架橋実験は本発明の各種ミュータントニューロトロフィンタンパクと
の結合親和性を測定することにより行われる。この技術の一例は、細胞系を発現
するニューロトロフィンレセプターから単離した細胞膜の調製を包含する。これ
ら膜を125I-標識化ニューロトロフィン、ミュータント又はワイルドタイプ形態
のどちらか一方とインキュベートし、次いでEDACのような化学的な架橋剤で処理
する。次いで細胞膜に存在するニューロトロフィンレセプターを精製し、結合及
び架橋したニューロトロフィンの存在を測定する。例えば、抗血清443は細胞溶
液からTrkレセプターを免疫沈降するために使用され得る。次いで、免疫沈降し
た材料をポリアクリルアミドゲルに使用し、標準的な技術を用いてオートラジオ
グラフを作成する。標識化リガンドと結合及び架橋したレセプターのみがオート
ラジオグラフに検出されるであろう。該アッセイは、各々同族のレセプターと結
合することが可能なミュータントニューロトロフィンタンパクを決定する簡便な
方法を提供する。
【０５４５】 リガンド結合速度 放射標識化ミュータントニューロトロフィンタンパクを用いる平衡結合実験は
ニューロトロフィンレセプターを発現する細胞のリガンド結合速度を測定するこ
とにより行われる。そのような方法論の一例は、L1又はL3ループのどちらか一方
あるいは両方におけるミューテイションを変える少なくとも一つの静電荷を含む
ミュータントNT-3プロテインのグループを利用する。これらプロテインは放射標
識され、本研究においてリガンドである。
【０５４６】 ミュータントニューロトロフィンタンパクを、ここに記載の方法に従って調製
及び精製する。ミュータントニューロトロフィンタンパクの精製された調製物を
当分野でよく知られた標準的な技術に従って放射標識化する。図示するように、
ミュータントニューロトロフィンタンパクを、エンチモビード（Enzymobead）放
射ヨウ素標識試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）手順の改法を用いたラクトペルオ
キシダーゼ処理により125Iで標識化する。通常、2μg量のリガンドを、2500〜35
00cpm/fmolの比活性でヨウ素化する。125I-標識化因子を4℃で保存し、調製から
2週間以内に使用する。ヨウ素化手順がリガンドに損傷を与えないことを確認す
るために結合の研究が行われるが、その前に、放射標識化ミュータントニューロ
トロフィンタンパクの生物活性はしばしばテストされる。
【０５４７】 行われた実験のあるシリーズは、ヨウ素化リガンドの固定濃度の利用及び膜調
製を含む。これらの置換研究において、非標識化ワイルドタイプニューロトロフ
ィンは、特定の濃度及び様々な濃度で、タンパクの結合特性に依存して、標識化
ミュータントニューロトロフィンを置換する。半分の標識化プロテインが置換さ
れる濃度は、阻害定数又はIC50として知られている。ミュータントニューロトロ
フィンプロテインのIC50を計算し、ワイルドタイププロテインの値と比較するこ
とにより、本発明のミューテイションがミュータントリガンドプロテインによっ
てレセプターとの親和性が増強される結果となることを確認することが可能であ
る。
【０５４８】 このタイプの実験から集められたデータはスキャッチャードプロットの作成を
可能にもし、これから、ミュータントニューロトロフィンプロテインの分離定数
が測定され得る。さらに、この値はミュータントニューロトロフィンリガンドの
そのレセプターに対する親和性を示し、測定された値は、ミューテイション又は
ミューテイション併用の価値を評価するために、ワイルドタイプの値と比較され
得る。
【０５４９】 PC12細胞生物アッセイ PC12細胞を、当分野でよく知られた標準的な技術を用いて、過渡的にニューロ
トロフィンレセプター発現ベクターで形質移入する。発現ベクターは、対象のワ
イルドタイプニューロトロフィンプロテインに対する活性でニューロトロフィン
レセプターをエンコードする。このレセプターは、ワイルドタイププロテインの
それと比較してミュータントプロテインの生物学的活性に対する、対象のワイル
ドタイプニュートロとフィンタンパクのアミノ酸配列に導入された、有効ミュー
テイションを測定するために使用される。例えば、PC12バイオアッセイは、NGF
分析（Patterson & Childs, Endocrinology, 135:1697-1704(1994)）；BDNF（Su
ter, et al., J. Neuroscience, 12:306-318(1992)）；NT-3（Tsoulfas, et al.
, Neuron, 10:975-990(1993)）；及びNT-4（Tsoulfas, et al., Neuron, 10:975
-990(1993)）に適用される。
【０５５０】 ワイルドタイプ及びミュータントニューロトロフィンタンパク生物活性を比較
して、PC12細胞は、コラーゲンコートディッシュで生育され、緩やかな粉砕によ
りPC12成長培地中に再懸濁され、10cmコラーゲンコートディッシュ上に10%〜20%
密度で播種される。次の日、セルをDMEMで4回洗浄し、5mlのDMEM、3μg/mlイン
シュリン、100μgのリポフェクチン（Lipofectin）（GIBCO-BRL, Gaithersburg,
MD）及び50μgのニューロトロフィン含有発現ベクターで洗浄する。8時間後に
リポフェクチン混合物は新鮮なPC12培地で置き換えられる。次の日、細胞を、10
ng/mlのニューロトロフィンミュータントプロテイン又はワイルドタイプタンパ
クを含み又は含まないPC12培地を与える。この処理の3日後、プレート上で、細
胞直径長＞2である神経突起プロセスを示す細胞を計測する。計測は、＞1000ラ
ンダム1.2mm2フィールドをカウントすることにより行う。結果は、100/計測され
たフィールド数により乗算された神経突起関連細胞の数として報告される。神経
突起誘導は、ミュータントタンパクとワイルドタイプニューロトロフィンたんぱ
くとの間で比較される。
【０５５１】 プロテインの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクの濃度が二分
の一になるのに要する時間を示す。ミュータントニューロトロフィンファミリー
タンパクの半減期は、ある期間にわたってサンプル中のニューロトロフィンファ
ミリータンパクレベルを測定するあらゆる方法によって決定されうる。例えば、
限定されないが、抗ニューロトロフィンファミリータンパク抗体を用いて、ミュ
ータントニューロトロフィンファミリータンパクの投与後の期間にサンプル中の
ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクレベルを測定する免疫測定
又は放射標識化ミュータントニューロトロフィンファミリープロテインの投与後
、被検物からのサンプル中の放射標識化ミュータントニューロトロフィンファミ
リータンパクの検出である。
【０５５２】 他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０５５３】 診断的及び治療的使用 本発明は、本発明の治療化合物（ここでは“治療薬”（"Therapeutic"）とい
う）の投与による各種疾患及び障害の治療又は予防を提供する。そのような治療
薬は、ミュータントαサブユニット及びミュータント又はワイルドタイプβサブ
ユニットの何れか一方を有するニューロトロフィンファミリータンパク；ミュー
タントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを有し、全部又は一部が
hLHのβサブユニットのCTEPのようなもう一つのCKGFタンパクと共有結合的に結
合するニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントα
サブユニット及びミュータントβサブユニットを有し、ミュータントαサブユニ
ット及びミュータントβサブユニットは単鎖アナログを形成するために共有結合
的に結合し、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット並び
にCKGFタンパク又はフラグメントは、単鎖アナログ、他の誘導体、アナログ及び
そのフラグメント（すなわち、上記したように）並びに本発明のミュータントニ
ューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマーをエンコードする核酸及び
誘導体、アナログ及びそのフラグメント中で共有結合的に結合するニューロトロ
フィンファミリープロテインヘテロダイマーを含む。
【０５５４】 治療薬が投与される対象は、好適には動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワト
リ、ネコ、イヌなどを含むがこれに限定されず、好適には哺乳類である。好適な
例としては対象はヒトである。一般に、対象の種と同種を起源とする種の生産物
の投与が好ましい。従って、好ましい例において、ヒトミュータント及び／又は
修飾ニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、誘導体若しくはア
ナログ、又は核酸は、ヒト患者に治療的又は予防的又は診断的に投与される。
【０５５５】 好ましい側面において、本発明の治療薬は実質的に精製されている。
【０５５６】 神経変性の疾患又は障害として明白な多くの障害が本発明の方法によって治療
され得る。ニューロトロフィンファミリータンパクが通常又は所望のレベルと比
較して欠乏又は減少する神経変性疾患は、本発明のミュータントニューロトロフ
ィンファミリータンパクへテロダイマー又はニューロトロフィンファミリータン
パクアナログの投与によって治療又は予防される。これら疾患又は障害の例はパ
ーキンソン病及びアルツハイマー病を含む。ニューロトロフィンファミリータン
パクレセプターが、通常レベルと比較して欠乏又は減少する、又は通常のニュー
ロトロフィンファミリータンパクレセプターよりワイルドタイプニューロトロフ
ィンファミリータンパクに対して非応答性若しくは低応答性である、障害もまた
ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー又はニュー
ロトロフィンファミリータンパクアナログの投与によって治療され得る。ミュー
タントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー及びニューロトロ
フィンファミリータンパクアナログのアンタゴニストとしての使用は本発明によ
って意図される。
【０５５７】 具体例において、生物活性を持つミュータントニューロトロフィンファミリー
タンパクヘテロダイマー又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログは
、血管形成を促進するために、予防的を含めて治療的に投与される。例えば、VE
GF、PDGF及びTGF-βは、全て内皮性の分裂促進因子である。血管形成が促進され
る状況において、増強された生物活性を有するミュータントPDGFファミリープロ
テインの施用は有利であろう。
【０５５８】 他の例において、PDGFファミリーレセプターアンタゴニストの施用は血管形成
を阻害するであろう。血管形成阻害は、当業者が新規又は増強された血管新生を
阻害したい条件では有用である。そのような状況の例は、次のものを含む：腫瘍
、ここで腫瘍成長は血管形成活性の増強された速度に対応する；目のガラス体液
に対する新血管新生である糖尿病性網膜症；長期月経出血；不妊症及び血管腫。
【０５５９】 ニューロトロフィンファミリータンパクタンパク又は機能、あるいはニューロ
トロフィンファミリータンパクレセプタータンパク及び機能の欠乏又は減少は、
容易に、即ち患者組織サンプル（即ち、生検組織）を得ること及びそれをインビ
トロでRNA又はタンパクレベルでアッセイすることによって、検出され得る。ニ
ューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパ
クレセプターの発現したRNAまたはタンパクの構造及び／又は活性 このようにして、当分野で標準的な多くの方法は使用され得、ここで、ニューロ
トロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセ
プタータンパクを検出及び／又は可視化するための免疫アッセイ（すなわち、ウ
エスタンブロット、後にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行う免疫沈降、免疫細胞化学、その他）、及び／又はニューロトロフィンフ
ァミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセプター発現を
、ニューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータ
ンパクレセプターmRNAの検出及び／又は可視化によるハイブリダイゼーションア
ッセイ（すなわち、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリ
ダイゼーション、その他）、その他が含まれるがこれらに限定されない。
【０５６０】 TGF-βタンパクファミリーのミュータント 上記のように、TGF-βタンパクファミリーはタンパクサブファミリーを多数を
包含する。TGF-βタンパクファミリーのミュータントを以下に述べる。 ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーのミュータント ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーは、図14(SEQ ID No: 13)に示
されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノ
マーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のア
ミノ酸置換、削除又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノ
マーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパク
に結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーを意図
している。
【０５６１】 本発明は図14(SEQ ID NO: 13)に表されているように、ミュータントトランス
フォーミング成長因子β1モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40
位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、R25X、K26X、D27X、L28X、G29X
、W30X、K31X、W32X、I33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びH40X。
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変え
る。
【０５６２】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、トランスフォー
ミング成長因子β1モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”
は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β1モ
ノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次
の1つ以上を含む：D23B、D27B、及びE35B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基で
ある。
【０５６３】 トランスフォーミング成長因子β1モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性
アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“
X”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループ
の静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は
、次の1つ以上を含む：R25Z、K26Z、K31Z、H34Z、K37Z、及びH40Z、ここで“Z”
は酸性アミノ酸残基である。
【０５６４】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D23U、R25U、K26U、D27U、K31U、H34U、E35U、K37U、及びH40Uにおいて導入され
ることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５６５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマータンパクが提供される。
中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む
：Y21Z、I22Z、F24Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、I33Z、P36Z、G38Z、Y39Z、Y21B
、I22B、F24B、L28B、G29B、W30B、W32B、I33B、P36B、G38B、及びY39B、ここで
“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５６６】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミ
ング成長因子β1モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパ
クは、図14(SEQ ID NO: 13)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピ
ンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は
挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：A82X、L83X、E84X、P85X、L86X、P8
7X、I88X、V89X、Y90X、Y91X、V92X、G93X、R94X、K95X、P96X、K97X、V98X、E9
9X、Q100X、L101X、及びS102X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５６７】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をトランスフォーミング成長因子β1L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入
することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β1モノマーのL3ルー
プに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基
に対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β1モノマーに導入さ
れるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E84B及びE
99B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０５６８】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β1L3ヘ
アピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上
の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の
“X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R94
Z、K95Z、及びK97Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０５６９】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はE84U、R94U、K95U、K97U、及びE99Uで導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５７０】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントトランスフォーミング成長因子β1タンパクは提供される。中性アミノ
酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、A82Z、L83Z、P85Z
、L86Z、P87Z、I88Z、V89Z、Y90Z、Y91Z、V92Z、G93Z、P96Z、V98Z、Q100Z、L10
1Z、S102Z、A82B、L83B、P85B、L86B、P87B、I88B、V89B、Y90B、Y91B、V92B、G
93B、P96B、V98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５７１】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミング成
長因子β1モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二
量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β1モノマーのβヘアピンル
ープ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプ
ター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、
トランスフォーミング成長因子β1モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103
位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５７２】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０５７３】
【化１０】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフ
ォーミング成長因子β1のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントト
ランスフォーミング成長因子β1モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィ
ニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０５７４】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング
成長因子β1モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形
態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフ
ラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β1モノマーを含む。
【０５７５】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であ
り、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグ
ナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- に関連する、1つ以上の官能
活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又は
単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニティ
ーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュー
タントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こす
ことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサ
ブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは、
ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性
を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュータ
ントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られてい
る処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５７６】 ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーのミュータント ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーは、図15(SEQ ID No: 14)に示
されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノ
マーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のア
ミノ酸置換、削除又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノ
マーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパク
に結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーを意図
している。
【０５７７】 本発明は図15(SEQ ID NO: 14)に描かれているように、ミュータントトランス
フォーミング成長因子β1モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40
位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、K25X、R26X、D27X、L28X、G29X
、W30X、K31X、W32X、I33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びN40X。
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変え
る。
【０５７８】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β2モ
ノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β2モノマーへ塩基性残基
が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D
23B、D27B、及びE35B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０５７９】 トランスフォーミング成長因子β2モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性
アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“
X”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループ
の静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は
、次の1つ以上を含む：K25Z、R26Z、K31Z、H34Z、及びK37Z、ここで“Z”は酸性
アミノ酸残基である。
【０５８０】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D23U、K25U、R26U、D27U、K31U、H34U、E35U、及びK37Uにおいて導入されること
ができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５８１】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含む、ミ
ュータントトランスフォーミング成長因子β2モノマータンパクが提供される。
中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む
：Y21Z、I22Z、F24Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、I33Z、P36Z、G38Z、Y39Z、N40Z
、Y21B、I22B、F24B、L28B、G29B、W30B、W32B、I33B、P36B、G38B、Y39B、及び
N40B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５８２】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミ
ング成長因子β2モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパ
クは、図15(SEQ ID NO: 14)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピ
ンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は
挿入を有する。該アミノ酸置換はD82X、L83X、E84X、P85X、L86X、T87X、I88X、
L89X、Y90X、Y91X、I92X、G93X、K94X、T95X、P96X、K97X、I98X、E99X、Q100X
、L101X、及びS102Xを含み、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その
置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５８３】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をトランスフォーミング成長因子β2L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入
することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β2モノマーのL3ルー
プに塩基性残基を導入する時、上記配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に
対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β2モノマーに導入され
るミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D82B、E84B
、及びE99B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０５８４】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β2L3ヘ
アピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上
の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の
“X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K94
Z及びK97Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０５８５】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はD82U、E84U、K94U、K97U、及びE99Uで導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５８６】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントトランスフォーミング成長因子β2タンパクは提供される。中性アミノ
酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L83Z、P85Z、L86Z
、T87Z、I88Z、L89Z、Y90Z、Y91Z、I92Z、G93Z、T95Z、P96Z、I98Z、Q100Z、L10
1Z、S102Z、L83B、P85B、L86B、T87B、I88B、L89B、Y90B、Y91B、I92B、G93B、T
95B、P96B、I98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０５８７】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミン
グ成長因子β2モノマーも意図している。これらの構造的変化は、言いかえると
、二量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β2モノマーのβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、トランスフォーミング成長因子β2モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び
103位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５８８】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０５８９】
【化１１】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフ
ォーミング成長因子β2のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントト
ランスフォーミング成長因子β2モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィ
ニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０５９０】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング
成長因子β2モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形
態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフ
ラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β2モノマーを含む。
【０５９１】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であ
り、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグ
ナル、及び細胞外分泌のような、ワイルドタイプTGF- と関連する、1つ以上の官
能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又
は単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニテ
ィーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュ
ータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こ
すことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータント
サブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは
、ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活
性を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュー
タントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られて
いる処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５９２】 ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーのミュータント ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーは、図16(SEQ ID No: 15)に示
されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノ
マーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のア
ミノ酸置換、削除又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノ
マーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパク
に結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーを意図
している。
【０５９３】 本発明は図16(SEQ ID No: 15)に表されているように、ミュータントトランス
フォーミング成長因子β3モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40
位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、R25X、Q26X、D27X、L28X、G29X
、W30X、K31X、W32X、V33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びY40X。
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変え
る。
【０５９４】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β3モ
ノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β3モノマーへ塩基性残基
が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D
23B、D27B、及びE35B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０５９５】 トランスフォーミング成長因子β3モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性
アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“
X”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループ
の静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は
、次の1つ以上を含む：R25Z、K31Z、H34Z、及びK37Z、ここで“Z”は酸性アミノ
酸残基である。
【０５９６】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D23U、R25U、D27U、K31U、H34U、E35U、及びK37Uにおいて導入されることができ
、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０５９７】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントトランスフォーミング成長因子β3モノマータンパクが提供される。
中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む
：Y21Z、I22Z、F24Z、Q26Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、V33Z、P36Z、G38Z、Y39Z
、Y40Z、Y21B、I22B、F24B、Q26B、L28B、G29B、W30B、W32B、V33B、P36B、G38B
、Y39B、及びY40B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸で
ある。
【０５９８】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミ
ング成長因子β3モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパ
クは、図16(SEQ ID No: 15)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピ
ンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は
挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：D82X、L83X、E84X、P85X、L86X、T8
7X、I88X、L89X、Y90X、Y91X、V92X、G93X、R94X、T95X、P96X、K97X、V98X、E9
9X、Q100X、L101X、及びS102X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５９９】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をトランスフォーミング成長因子β3L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入
することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β3モノマーのL3ルー
プに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基
に対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β3モノマーに導入さ
れるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D82B、E84
B及びE99B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６００】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β3L3ヘ
アピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上
の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の
“X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R94
Z及びK97Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６０１】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はE82U、E84U、R94U、K97U、及びE99Uで導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６０２】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントトランスフォーミング成長因子β1タンパクは提供される。中性アミノ
酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L83Z、P85Z、L86Z
、T87Z、I88Z、L89Z、Y90Z、Y91Z、V92Z、G93Z、T95Z、P96Z、V98Z、Q100Z、L10
1Z、S102Z、L83B、P85B、L86B、T87B、I88B、L89B、Y90B、Y91B、V92B、G93B、T
95B、P96B、V98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０６０３】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミング成
長因子β3モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二
量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β3モノマーのβヘアピンル
ープ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプ
ター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、
トランスフォーミング成長因子β3モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103
位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６０４】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６０５】
【化１２】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフ
ォーミング成長因子β1のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントト
ランスフォーミング成長因子β3モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィ
ニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６０６】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング
成長因子β3モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形
態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフ
ラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β3モノマーを含む。
【０６０７】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であ
り、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグ
ナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- に関連する、1つ以上の官能
活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又は
単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニティ
ーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュー
タントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こす
ことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサ
ブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは、
ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性
を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュータ
ントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られてい
る処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６０８】 ヒトトランスフォーミング成長因子-β4 (TGF-β4)/ebafサブユニット ヒトトランスフォーミング成長因子-β4 (TGF-β4)/ebafサブユニットは、図1
7(SEQ ID No: 16)に示されるように、370個のアミノ酸を含んでいる。本発明は
、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残
基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は挿入を含む、TGF- 4のミュータント
を意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータ
ントTGF- 4を意図している。
【０６０９】 本発明は図17(SEQ ID NO: 16)に表されているように、ミュータントTGF- 4に
、Cys残基を除いて、境界を含めて267位〜287位間に、1つ以上のアミノ酸置換を
有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y267X、I268X
、D269X、L270X、Q271X、G272X、M273X、K274X、W275X、A276X、K277X、N278X、
W279X、V280X、L281 X、E282X、P283X、P284X、G285X、F286X、及びL287X。“X
”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える。
【０６１０】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、TGF- 4のL1ルー
プに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだ
ろう。TGF- 4へ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体
例は次の1つ以上を含む：D269B及びE282B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基で
ある。
【０６１１】 TGF- 4配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟
考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応する。これ
らのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるよ
うに働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：K274Z及びK277
Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６１２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D269U、K274U、K277U、及びE282Uにおいて導入されることができ、ここで“U”
は中性アミノ酸である。
【０６１３】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントTGF- 4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基
に変えるミューテイションの例は次を含む：Y267Z、I268Z、L270Z、Q271Z、G272
Z、M273Z、W275Z、A276Z、N278Z、W279Z、V280Z、L281Z、P283Z、P284Z、G285Z
、F286Z、L287Z、Y267B、I268B、L270B、Q271B、G272B、M273B、W275B、A276B、
N278B、W279B、V280B、L281B、P283B、P284B、G285B、F286B、及びL287B、ここ
で“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０６１４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントTGF- 4についても
述べられる。これらのミュータントタンパクは、図17(SEQ ID NO: 16)に描かれ
ているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて318位〜337
位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は
次を含む：E318X、T319X、A320X、S321X、L322X、P323X、M324X、I325X、V326X
、S327X、I328X、K329X、E330X、G331X、G332X、R333X、T334X、R335X、P336X、
及びQ337X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの
静電特性を変える。
【０６１５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をTGF- 4 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、T
GF- 4のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性
アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がTGF- 4に導入されるミューテイションを
変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E318B及びE330B、ここで“B”は塩
基性アミノ酸残基である。
【０６１６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をTGF- 4 L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の318
〜337の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応
する。そのようなミューテイションの具体例は、K329Z、R333Z、及びR335Zを含
み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６１７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はE318U、K329U、E330U、R333U、及びR335Uで導入され
ることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６１８】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントTGF- 4タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、T319Z、A320Z、S321Z、L322Z、P323Z、M324Z、
I325Z、V326Z、S327Z、I328Z、G331Z、G332Z、T334Z、R335Z、P336Z、Q337Z、T3
19B、A320B、S321B、L322B、P323B、M324B、I325B、V326B、S327B、I328B、G331
B、G332B、T334B、R335B、P336B、及びQ337Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０６１９】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、TGF- 4を意図している。
これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるTGF- 4のβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、TGF- 4の1位〜266位、288位〜317位、及び338位〜370位からなる群から選択
される位置で見出される。
【０６２０】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６２１】
【化１３】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、TGF- 4のL1
及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントTGF- 4を含む二量体タンパクに
対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６２２】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのミュータントTGF- 4サ
ブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう
1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクション
に結合したミュータントTGF- 4を含む。
【０６２３】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖TGF- 4サブユニットアナログを含むミュータントTGF- 4ヘテロダイマーは
機能上活性であり、すなわち、TGF- 4レセプター結合、TGF- 4タンパクファミリ
ーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- 4に関連す
る、1つ以上の官能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- 4
ヘテロダイマー又は単鎖TGF- 4アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- 4よ
り大きいアフィニティーを有するTGF- 4レセプターに結合することができる。ま
た、そのようなミュータントTGF- 4ヘテロダイマー又は単鎖TGF- 4アナログがシ
グナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくと
も1つのミュータントサブユニット又は単鎖TGF- 4アナログを含むミュータントT
GF- 4ヘテロダイマーは、ワイルドタイプTGF- 4より大きいインビトロ生物活性
及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプTGF- 4より長い血清半減期
を有する。本発明のミュータントTGF- 4ヘテロダイマー及び単鎖TGF- 4アナログ
は、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされ
ることができる。
【０６２４】 ヒトNeurturinのミュータント ヒトNeurturinタンパクは、図18(SEQ ID No: 17)に示されるように、197個の
アミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2
、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は挿
入を含む、ヒトNeurturinタンパクのミュータントを意図している。さらに、本
発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトNeurturinタンパクを
意図している。
【０６２５】 本発明は図18(SEQ ID NO: 17)に表されているように、ミュータントNeurturin
タンパクに、Cys残基を除いて、境界を含めて104位〜129位間に、1つ以上のアミ
ノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：G1
04X、L105X、R106X、E107X、L108X、E109X、V110X、R111X、V112X、S113X、E114
X、L115X、G116X、L117X、G118X、Y119X、A120X、S121X、D122X、E123X、T124X
、V125X、L126X、F127X、R128X、及びY129X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であ
り、その置換でヘアループの静電特性を変える。
【０６２６】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、Neurturinタン
パクのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基
に対応するだろう。Neurturinタンパクへ塩基性残基が導入されるミューテイシ
ョンを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E107B、E109B、E114B、D122
B、及びE123B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６２７】 Neurturinタンパク配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入する
こともまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対
応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状
態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR106Z、R111Z、及
びR128Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６２８】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R106U、E107U、E109U、R111U、E114U、D122U、E123U、及びR128Uにおいて導入さ
れることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６２９】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントNeurturinタンパクタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷
を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：G104Z、L105Z、L108Z
、V110Z、V112Z、S113Z、L115Z、G116Z、L117Z、G118Z、Y119Z、A120Z、S121Z、
T124Z、V125Z、L126Z、F127Z、Y129Z、G104B、L105B、L108B、V110B、V112B、S1
13B、L115B、G116B、L117B、G118B、Y119B、A120B、S121B、T124B、V125B、L126
B、F127B、及びY129B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ
酸である。
【０６３０】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントNeurturinタンパ
クについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図18(SEQ ID NO:
17)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて
166位〜193位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：R166X、P167X、T168X、A169X、Y170X、E171X、D172X、E17
3X、V174X、S175X、F176X、L177X、D178X、A179X、H180X、S181X、R182X、Y183X
、H184X、T185X、V186X、H187X、E188X、L189X、S190X、A191X、R192X、及びE19
3X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特
性を変える。
【０６３１】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をNeurturinタンパクL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、NeurturinタンパクのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がNeurturinタン
パクに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含
む：E171B、D172B、E173B、E188B、及びE193B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残
基である。
【０６３２】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をNeurturinタンパクL3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の166〜3193の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R166Z、H180Z、R1
82Z、H184Z、H187Z、及びR192Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である
。
【０６３３】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR166U、E171U、D172U、E173U、H180U、R182U、H184U
、H187U、E188U、R192U、及びE193Uで導入されることができ、ここで“U”は中
性アミノ酸である。
【０６３４】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントNeurturinタンパクタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、P167Z、T168Z、A169Z、Y170Z、V1
74Z、S175Z、F176Z、L177Z、A179Z、S181Z、Y183Z、T185Z、V186Z、L189Z、S190
Z、A191Z、P167B、T168B、A169B、Y170B、V174B、S175B、F176B、L177B、A179B
、S181B、Y183B、T185B、V186B、L189B、S190B、及びA191Bを含み、ここで、“Z
”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０６３５】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、Neurturinタンパクを意
図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるNeur
turinタンパクのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。
これらのミューテイションは、Neurturinタンパクの1位〜103位、130位〜165位
、及び194位〜197位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６３６】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６３７】
【化１４】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、Neurturinタ
ンパクのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントNeurturinタンパク
モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の
静電相互作用が増加する。
【０６３８】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのNeurturinタンパクに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したNe
urturinタンパクを含む。
【０６３９】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖Neurturinタンパクアナログを含むミュータントNeurturinタンパクヘテロ
ダイマーは機能上活性であり、すなわち、Neurturinタンパクレセプター結合、N
eurturinタンパクタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のよ
うなワイルドタイプNeurturinタンパクに関連する、1つ以上の官能活性を示すこ
とができる。好ましくは、ミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマー又は
単鎖Neurturinタンパクアナログは、好ましくはワイルドタイプNeurturinタンパ
クより大きいアフィニティーを有するNeurturinタンパクレセプターに結合する
ことができる。また、そのようなミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマ
ー又は単鎖Neurturinタンパクアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ま
しい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット
又は単鎖Neurturinタンパクアナログを含むミュータントNeurturinタンパクヘテ
ロダイマーは、ワイルドタイプNeurturinタンパクより大きいインビトロ生物活
性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプNeurturinタンパクより長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマ
ー及び単鎖Neurturinタンパクアナログは、該技術において知られている処置に
より、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６４０】 ヒトインヒビンAタンパクのミュータント ヒトインヒビンAタンパクは、図19(SEQ ID No: 18)に示されるように、366個
のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1
、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は
挿入を含む、ヒトインヒビンAタンパクのミュータントを意図している。さらに
、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトインヒビンAタン
パクを意図している。
【０６４１】 本発明は図19(SEQ ID NO: 18)に表されているように、ミュータントインヒビ
ンAタンパクに、Cys残基を除いて、境界を含めて266位〜286位間に、1つ以上の
アミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む
：A266X、L267X、N268X、I269X、S270X、F271X、Q272X、E273X、L274X、G275X、
W276X、E277X、R278X、W279X、I280X、V281X、Y282X、P283X、P284X、S285X、及
びF286X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特
性を変える。
【０６４２】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、インヒビンAタ
ンパクのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に対応するだろう。インヒビンAタンパクへ塩基性残基が導入されるミューテ
イションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E273B及びE277B、ここ
で“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６４３】 インヒビンAタンパク配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入す
ることもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に
対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の
状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR278Z の1つ以
上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６４４】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
E273U、E277U、及びR278Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性ア
ミノ酸である。
【０６４５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントインヒビンAタンパクタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電
荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：A266Z、L267Z、N268
Z、I269Z、S270Z、F271Z、Q272Z、L274Z、G275Z、W276Z、W279Z、I280Z、V281Z
、Y282Z、P283Z、P284Z、S285Z、F286Z、A266B、L267B、N268B、I269B、S270B、
F271B、Q272B、L274B、G275B、W276B、W279B、I280B、V281B、Y282B、P283B、P2
84B、S285B、及びF286B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミ
ノ酸である。
【０６４６】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントインヒビンAタン
パクについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図19(SEQ ID NO
: 18)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含め
て332位〜359位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次を含む：P332X、G333X、T334X、M335X、R336X、P337X、L338X、H
339X、V340X、R341X、T342X、T343X、S344X、D345X、G346X、G347X、Y348X、S34
9X、F350X、K351X、Y352X、E353X、T354X、V355X、P356X、N357X、L358X、及びL
359X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電
特性を変える。
【０６４７】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をインヒビンAタンパクL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含
む。例えば、インヒビンAタンパクのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記
の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がインヒビ
ンAタンパクに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以
上を含む：D345B及びE353B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６４８】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をインヒビンAタンパクL3ヘアピンループ
のアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ
酸は上記の332〜359の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R336Z、H339Z、
R341Z、及びK351Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６４９】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR336U、H339U、R341U、D345U、K351U、及びE353Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６５０】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントインヒビンAタンパクタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷
を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、P332Z、G333Z、T334Z、M335Z、
P337Z、L338Z、V340Z、T342Z、T343Z、S344Z、G346Z、G347Z、Y348Z、S349Z、F3
50Z、Y352Z、T354Z、V355Z、P356Z、N357Z、L358Z、L359Z、P332B、G333B、T334
B、M335B、P337B、L338B、V340B、T342B、T343B、S344B、G346B、G347B、Y348B
、S349B、F350B、Y352B、T354B、V355B、P356B、N357B、L358B、及びL359Bを含
み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０６５１】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、インヒビンAタンパクを
意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるイ
ンヒビンAタンパクのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対
するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、インヒビンAタンパクの1位〜265位、287位〜
331位、及び360位〜366位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６５２】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６５３】
【化１５】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、インヒビンA
タンパクのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントインヒビンAタン
パクモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター
間の静電相互作用が増加する。
【０６５４】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのインヒビンAタンパク
についても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシス
チンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合した
インヒビンAタンパクを含む。
【０６５５】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖インヒビンAタンパクアナログを含むミュータントインヒビンAタンパクヘ
テロダイマーは機能上活性であり、すなわち、インヒビンAタンパクレセプター
結合、インヒビンAタンパクタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞
外分泌のようなワイルドタイプインヒビンAタンパクに関連する、1つ以上の官能
活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントインヒビンAタンパクヘテ
ロダイマー又は単鎖インヒビンAタンパクアナログは、好ましくはワイルドタイ
プインヒビンAタンパクより大きいアフィニティーを有するインヒビンAタンパク
レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントインヒビン
Aタンパクヘテロダイマー又は単鎖インヒビンAタンパクアナログがシグナル伝達
を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミ
ュータントサブユニット又は単鎖インヒビンAタンパクアナログを含むミュータ
ントインヒビンAタンパクヘテロダイマーは、ワイルドタイプインヒビンAタンパ
クより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルド
タイプインヒビンAタンパクより長い血清半減期を有する。本発明のミュータン
トインヒビンAタンパクヘテロダイマー及び単鎖インヒビンAタンパクアナログは
、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされる
ことができる。
【０６５６】 ヒトインヒビンAサブユニットのミュータント ヒトヒトインヒビンAサブユニットは、図20(SEQ ID No: 19)に示されるように
、426個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較し
た時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、
削除又は挿入を含む、ヒトヒトインヒビンAサブユニットのミュータントを意図
している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒ
トヒトインヒビンAサブユニットを意図している。
【０６５７】 本発明は図20 (SEQ ID NO: 19)に表されているように、ミュータントヒトイン
ヒビンAサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて326位〜346位間に、1
つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は
次を含む：F326X、F327X、V328X、S329X、F330X、K331X、D332X、I333X、G334X
、W335X、N336X、D337X、W338X、I339X、I340X、A341X、P342X、S343X、G344X、
Y345X、及びH346X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアルー
プの静電特性を変える。
【０６５８】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトインヒビン
AサブユニットのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミ
ノ酸残基に対応するだろう。ヒトインヒビンAサブユニットへ塩基性残基が導入
されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D332B及
びD337B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６５９】 ヒトインヒビンAサブユニット配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基
を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性を
より負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のK331Z
及びH346Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６６０】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
K331U、D332U、D337Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ
酸である。
【０６６１】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトインヒビンAサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸
残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、F326Z、F327Z、V328
Z、S329Z、F330Z、I333Z、G334Z、W335Z、N336Z、W338Z、I339Z、I340Z、A341Z
、P342Z、S343Z、G344Z、Y345Z、F326B、F327B、V328B、S329B、F330B、I333B、
G334B、W335B、N336B、W338B、I339B、I340B、A341B、P342B、S343B、G344B、及
びY345Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸で
ある。
【０６６２】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトインヒビンA
サブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図20 (
SEQ ID NO: 19)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの
境界を含めて395位〜419位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有
する。該アミノ酸置換は次を含む：K395X、L396X、R397X、P398X、M399X、S400X
、M401X、L402X、Y403X、Y404X、D405X、D406X、G407X、Q408X、N409X、I410X、
I411X、K412X、K413X、D414X、I415X、Q416X、N417X、M418X、及びI419X、ここ
で“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変え
る。
【０６６３】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトインヒビンAサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入する
ことを含む。例えば、ヒトインヒビンAサブユニットのL3ループに塩基性残基を
導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基
性残基がヒトインヒビンAサブユニットに導入されるミューテイションを変える
静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D405B、D406B、及びD414B、ここで“B”
は塩基性アミノ酸残基である。
【０６６４】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトインヒビンAサブユニットL3ヘアピ
ンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸
性アミノ酸は上記の395〜419の配列に導入されることができ、ここで可変の“X
”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K395Z
、R397Z、K412Z、及びK413Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６６５】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK395U、R397U、D405、D406、K412U、K413U、及びD41
4Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６６６】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトインヒビンAサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L396Z、P398Z、M399Z
、S400Z、M401Z、L402Z、Y403Z、Y404Z、G407Z、P408Z、N409Z、I410Z、I411Z、
I415Z、Q416Z、N417Z、M418Z、I419Z、L396B、P398B、M399B、S400B、M401B、L4
02B、Y403B、Y404B、G407B、P408B、N409B、I410B、I411B、I415B、Q416B、N417
B、M418B、及びI419Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性
アミノ酸である。
【０６６７】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトインヒビンAサブユ
ニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含
まれるヒトインヒビンAサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二
量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増
加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトインヒビンAサブユニ
ットモノマーの1位〜325位、347位〜394位、及び420位〜426位からなる群から選
択される位置で見出される。
【０６６８】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６６９】
【化１６】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトインヒ
ビンAサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトイ
ンヒビンAサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティー
を有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６７０】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトインヒビンAサブ
ユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1
つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに
結合したヒトインヒビンAサブユニットを含む。
【０６７１】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトインヒビ
ンAサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトインヒビ
ンAサブユニットレセプター結合、ヒトインヒビンAサブユニットタンパクファミ
リーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒトインヒビ
ンAサブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すことができる。好ましく
は、ミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトイ
ンヒビンAサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトインヒビンA
サブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトインヒビンAサブユニット
レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒトインヒ
ビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナロ
グがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少
なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトインヒビンAサブユニット
アナログを含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマーは、
ワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニットより大きいインビトロ生物活性及
び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニット
より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトインヒビンAサブユニ
ットヘテロダイマー及び単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログは、該技術
において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることがで
きる。
【０６７２】 ヒトヒトインヒビンBサブユニットのミュータント ヒトヒトインヒビンBサブユニットは、図21(SEQ ID No: 20)に示されるように
、407個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較し
た時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、
削除又は挿入を含む、ヒトヒトインヒビンBサブユニットのミュータントを意図
している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒ
トヒトインヒビンBサブユニットを意図している。
【０６７３】 本発明は図21 (SEQ ID NO: 20)に表されているように、ミュータントヒトイン
ヒビンBサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて308位〜328位間に、1
つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は
次を含む：F308X、F309X、I310X、D311X、F312X、R313X、L314X、I315X、G316X
、W317X、N318X、D319X、W320X、I321X、I322X、A323X、P324X、T325X、G326X、
Y327X、及びY328X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアルー
プの静電特性を変える。
【０６７４】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトインヒビン
BサブユニットのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミ
ノ酸残基に対応するだろう。ヒトインヒビンBサブユニットへ塩基性残基が導入
されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D311B及
びD319B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６７５】 ヒトインヒビンBサブユニット配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基
を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性を
より負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR313Z
の1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６７６】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D311U、R313U、及びD319Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性ア
ミノ酸である。
【０６７７】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトインヒビンBサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸
残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F308Z、F30
9Z、I310Z、F312Z、L314Z、I315Z、G316Z、W317Z、N318Z、W320Z、I321Z、I322Z
、A323Z、P324Z、T325Z、G326Z、Y327Z、Y328Z、F308B、F309B、I310B、F312B、
L314B、I315B、G316B、W317B、N318B、W320B、I321B、I322B、A323B、P324B、T3
25B、G326B、Y327B、及びY328B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０６７８】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトインヒビンB
サブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図21 (
SEQ ID NO: 20)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの
境界を含めて376位〜400位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有
する。該アミノ酸置換は次を含む：K376X、L377X、S378X、T379X、M380X、S381X
、M382X、L383X、Y384X、F385X、D386X、D387X、E388X、Y389X、N390X、I391X、
V392X、K393X、R394X、D395X、V396X、P397X、N398X、M399X、及びI400X、ここ
で“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変え
る。
【０６７９】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトインヒビンAサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入する
ことを含む。例えば、ヒトインヒビンBサブユニットのL3ループに塩基性残基を
導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基
性残基がヒトインヒビンBサブユニットに導入されるミューテイションを変える
静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D386B、D387B、E388B、及びD395B、ここ
で“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６８０】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトインヒビンBサブユニットL3ヘアピ
ンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸
性アミノ酸は上記の376〜400の配列に導入されることができ、ここで可変の“X
”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K376Z
、K393Z、及びK394Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６８１】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK376U、D386U、D387U、E388U、K393U、R394U、及びD
395Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６８２】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトインヒビンBサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L377Z、S378Z、T379Z
、M380Z、S381Z、M382Z、L383Z、Y384Z、F385Z、Y389Z、N390Z、I391Z、V392Z、
V396Z、P397Z、N398Z、M399Z、I400Z、L377B、S378B、T379B、M380B、S381B、M3
82B、L383B、Y384B、F385B、Y389B、N390B、I391B、V392B、V396B、P397B、N398
B、M399B、及びI400Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性
アミノ酸である。
【０６８３】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトインヒビンBサブユ
ニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含
まれるヒトインヒビンBサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二
量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増
加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトインヒビンBサブユニ
ットモノマーの1位〜307位、329位〜375位、及び401位〜407位からなる群から選
択される位置で見出される。
【０６８４】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０６８５】
【化１７】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトインヒ
ビンBサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトイ
ンヒビンBサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティー
を有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６８６】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトインヒビンBサブ
ユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1
つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに
結合したヒトインヒビンBサブユニットを含む。
【０６８７】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトインヒビンBアナログを含むミュータントヒトインヒビンBヘテロダイ
マーは機能上活性であり、すなわち、ヒトインヒビンBレセプター結合、ヒトイ
ンヒビンBタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワ
イルドタイプヒトインヒビンBに関連する、1つ以上の官能活性を示すことができ
る。好ましくは、ミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー又は単鎖ヒトイ
ンヒビンBアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトインヒビンBより大きいア
フィニティーを有するヒトインヒビンBレセプターに結合することができる。ま
た、そのようなミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー又は単鎖ヒトイン
ヒビンBアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは
、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトインヒビ
ンBアナログを含むミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマーは、ワイルドタ
イプヒトインヒビンBより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性
を有し、ワイルドタイプヒトインヒビンBより長い血清半減期を有する。本発明
のミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー及び単鎖ヒトインヒビンBアナロ
グは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストさ
れることができる。
【０６８８】 ヒトアクティビンAサブユニットのミュータント ヒトアクティビンAサブユニットは、図22(SEQ ID No: 21)に示されるように、
426個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した
時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削
除又は挿入を含む、ヒトアクティビンAサブユニットのミュータントを意図して
いる。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトア
クティビンAサブユニットを意図している。
【０６８９】 本発明は図22(SEQ ID NO: 21)に表されているように、ミュータントヒトアク
ティビンAサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて326位〜346位間に、
1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換
は次を含む：F326X、F327X、V328X、S329X、F330X、K331X、D332X、I333X、G334
X、W335X、N336X、D337X、W338X、I339X、I340X、A341X、P342X、S343X、G344X
、Y345X、及びH346X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアル
ープの静電特性を変える。
【０６９０】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトアクティビ
ンAサブユニットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は
塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトアクティビンAサブユニットモノマ
ーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1
つ以上を含む：K331B及びH346B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６９１】 ヒトアクティビンAサブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性ア
ミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X
”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの
静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、
次の1つ以上を含む：D332Z及びD337Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６９２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
K331U、D332U、D337U、及びH346Uにおいて導入されることができ、ここで“U”
は中性アミノ酸である。
【０６９３】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトアクティビンAサブユニットモノマータンパクが提供される。中
性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：
F326Z、F327Z、V328Z、S329Z、F330Z、I333Z、G334Z、W335Z、N336Z、W338Z、I3
39Z、I340Z、A341Z、P342Z、S343Z、G344Z、Y345Z、F326B、F327B、V328B、S329
B、F330B、I333B、G334B、W335B、N336B、W338B、I339B、I340B、A341B、P342B
、S343B、G344B、及びY345B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性
アミノ酸である。
【０６９４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトアクティビン
Aサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図22(
SEQ ID NO: 21)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの
境界を含めて395位〜419位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有
する。該アミノ酸置換は次を含む：K395X、L396X、R397X、P398X、M399X、S400X
、M401X、L402X、Y403X、Y404X、D405X、D406X、G407X、Q408X、N409X、I410X、
I411X、K412X、K413X、D414X、I415X、Q416X、N417X、M418X、及びI419X、ここ
で“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変え
る。
【０６９５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトアクティビンAサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入す
ることを含む。例えば、ヒトアクティビンAサブユニットのL3ループに塩基性残
基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。
塩基性残基がヒトアクティビンAサブユニットに導入されるミューテイションを
変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D405B、D406B、及びD414B、ここで
“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０６９６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトアクティビンAサブユニットL3ヘア
ピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の
酸性アミノ酸は上記の395〜419の配列に導入されることができ、ここで可変の“
X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K395Z
、R397Z、K412Z、及びK413Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０６９７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK395U、R397U、D405U、D406U、K412U、K413U、及びD
414Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０６９８】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトアクティビンAサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸
残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L396Z、P398Z、M399
Z、S400Z、M401Z、L402Z、Y403Z、Y404Z、G407Z、Q408Z、N409Z、I410Z、I411Z
、I415Z、Q416Z、N417Z、M418Z、I419Z、L396B、P398B、M399B、S400B、M401B、
L402B、Y403B、Y404B、G407B、Q408B、N409B、I410B、I411B、I415B、Q416B、N4
17B、M418B、及びI419Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０６９９】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトアクティビンAサブ
ユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に
含まれるヒトアクティビンAサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び
、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用
を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトアクティビンAサ
ブユニットモノマーの1位〜325位、347位〜394位、及び420位〜426位からなる群
から選択される位置で見出される。
【０７００】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７０１】
【化１８】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトアクテ
ィビンAサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒト
アクティビンAサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニテ
ィーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０７０２】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトアクティビンAサ
ブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう
1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合し
たヒトアクティビンAサブユニットを含む。
【０７０３】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクテ
ィビンAサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトアク
ティビンAサブユニットレセプター結合、ヒトアクティビンAサブユニットタンパ
クファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒト
アクティビンAサブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すことができる
。好ましくは、ミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー又
は単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプ
ヒトアクティビンAサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトアクテ
ィビンAサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミ
ュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクテ
ィビンAサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最
も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖
ヒトアクティビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンA
サブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトアクティビンAサブユニッ
トより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルド
タイプヒトアクティビンAサブユニットより長い血清半減期を有する。本発明の
ミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトアク
ティビンAサブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、
望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７０４】 ヒトアクティビンBサブユニットのミュータント ヒトアクティビンBサブユニットは、図23(SEQ ID No: 22)に示されるように、
407個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した
時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削
除又は挿入を含む、ヒトアクティビンBサブユニットのミュータントを意図して
いる。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトア
クティビンBサブユニットを意図している。
【０７０５】 本発明は図23(SEQ ID NO: 22)に表されているように、ミュータントヒトアク
ティビンBサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて308位〜328位間に、
1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換
は次を含む：F308X、F309X、I310X、D311X、F312X、R313X、L314X、I315X、G316
X、W317X、N318X、D319X、W320X、I321X、I322X、A323X、P324X、T325X、G326X
、Y327X、及びY328X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアル
ープの静電特性を変える。
【０７０６】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトアクティビ
ンBサブユニットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は
塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトアクティビンBサブユニットモノマ
ーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1
つ以上を含む：D311B及びD319B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７０７】 ヒトアクティビンBサブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性ア
ミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X
”は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの
静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、
R313Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７０８】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D311U、R313U、及びD319Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性ア
ミノ酸である。
【０７０９】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトアクティビンBサブユニットモノマータンパクが提供される。中
性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：
F308Z、F309Z、I310Z、F312Z、L314Z、I315Z、G316Z、W317Z、N318Z、W320Z、I3
21Z、I322Z、A323Z、P324Z、T325Z、G326Z、Y327Z、Y328Z、F308B、F309B、I310
B、F312B、L314B、I315B、G316B、W317B、N318B、W320B、I321B、I322B、A323B
、P324B、T325B、G326B、Y327B、及びY328B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び
“B”は塩基性アミノ酸である。
【０７１０】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトアクティビン
Bサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図23(
SEQ ID NO: 22)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの
境界を含めて376位〜400位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有
する。該アミノ酸置換は次を含む：K376X、L377X、S378X、T379X、M380X、S381X
、M382X、L383X、Y384X、F385X、D386X、D387X、E388X、Y389X、N390X、I391X、
V392X、K393X、R394X、D395X、V396X、P397X、N398X、M399X、及びI400X、ここ
で“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変え
る。
【０７１１】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトアクティビンBサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入す
ることを含む。例えば、ヒトアクティビンBサブユニットのL3ループに塩基性残
基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。
塩基性残基がヒトアクティビンBサブユニットに導入されるミューテイションを
変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D386B、D387B、E388B、及びD395B
、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７１２】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトアクティビンBサブユニットL3ヘア
ピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の
酸性アミノ酸は上記の376〜400の配列に導入されることができ、ここで可変の“
X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K376Z
、K393Z、及びR394Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７１３】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK376U、D386U、D387U、E388U、K393U、R394U、及びD
395Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７１４】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトアクティビンBサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸
残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L377Z、S378Z、T279
Z、M380Z、S381Z、M382Z、L383Z、Y384Z、F385Z、Y389Z、N390Z、I391Z、V392Z
、V396Z、P397Z、N398Z、M399Z、I400Z、L377B、S378B、T279B、M380B、S381B、
M382B、L383B、Y384B、F385B、Y389B、N390B、I391B、V392B、V396B、P397B、N3
98B、M399B、及びI400Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０７１５】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトアクティビンBサブ
ユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に
含まれるヒトアクティビンBサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び
、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用
を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトアクティビンBサ
ブユニットモノマーの1位〜307位、329位〜375位、及び401位〜407位からなる群
から選択される位置で見出される。
【０７１６】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７１７】
【化１９】 を含み、ここでJは、前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリータンパ
クの前記βヘアピン構造及び前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を結果と
して増加させるあらゆるアミノ酸である。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であ
り、その導入の結果、ヒトアクティビンBサブユニットのL1及びL3βヘアピンル
ープ構造、及びミュータントヒトアクティビンBサブユニットモノマーを含む二
量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増
加する。
【０７１８】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトアクティビンBサ
ブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう
1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合し
たヒトアクティビンBサブユニットを含む。
【０７１９】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクテ
ィビンBサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトアク
ティビンBサブユニットレセプター結合、ヒトアクティビンBサブユニットタンパ
クファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒト
アクティビンBサブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すことができる
。好ましくは、ミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー又
は単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプ
ヒトアクティビンBサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトアクテ
ィビンBサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミ
ュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクテ
ィビンBサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最
も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖
ヒトアクティビンBサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンB
サブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトアクティビンBサブユニッ
トより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルド
タイプヒトアクティビンBサブユニットより長い血清半減期を有する。本発明の
ミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトアク
ティビンBサブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、
望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７２０】 ミュラー阻害物質のミュータント ミュラー阻害物質は、図24(SEQ ID No: 23)に示されるように、560個のアミノ
酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4
、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は挿入を含
む、ミュラー阻害物質のミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1
つのCKGFタンパクに結合したミュータントミュラー阻害物質を意図している。
【０７２１】 本発明は図24(SEQ ID NO: 23)に表されているように、ミュータントミュラー
阻害物質に、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ
酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：R465
X、E466X、L467X、S468X、V469X、D470X、L471X、R472X、A473X、E474X、R475X
、S476X、V477X、L478X、I479X、P480X、E481X、T482X、Y483X、及び484X。“X
”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える。
【０７２２】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ミュラー阻害物
質モノマー(substancemonomer)のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“
X”は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ミュラー阻害物質モノマーへ塩基
性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を
含む：E466B、D470B、E474B、及びE481B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基で
ある。
【０７２３】 ミュラー阻害物質モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導
入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ
酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより
負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を
含む：R465、R472、及びR475、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７２４】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R465U、E466U、D470U、R472U、E474U、R475U、及びE481Uにおいて導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７２５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントミュラー阻害物質モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基
を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：L467Z、S468Z、
V469Z、L471Z、A473Z、S476Z、V477Z、L478Z、I479Z、P480Z、T482Z、Y483Z、Q4
84Z、L467B、S468B、V469B、L471B、A473B、S476B、V477B、L478B、I479B、P480
B、T482B、Y483B、及びQ484B、ここで “Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０７２６】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントミュラー阻害物質
についても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図24(SEQ ID NO: 23
)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて53
0位〜553位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ
酸置換は次を含む：A530X、Y531X、A532X、G533X、K534X、L535X、L536X、I537X
、S538X、L539X、S540X、E541X、E542X、R543X、I544X、S545X、A546X、H547X、
H548X、V549X、P550X、N551X、M552X、及びV553X、ここで“X”はあらゆるアミ
ノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７２７】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をミュラー阻害物質L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。
例えば、ミュラー阻害物質のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の
可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がミュラー阻害物質
に導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E
541B及びE542B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７２８】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をミュラー阻害物質L3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の530〜553の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K534Z、R543Z、H5
47Z、及びH548Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７２９】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK534U、E541U、E542U、R543U、H547U、及びH548Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７３０】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントミュラー阻害物質タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は、A530Z、Y531Z、A532Z、G533Z、L535
Z、L536Z、I537Z、S538Z、L539Z、S540Z、I544Z、S545Z、A546Z、V549Z、P550Z
、N551Z、M552Z、V553Z、A530B、Y531B、A532B、G533B、L535B、L536B、I537B、
S538B、L539B、S540B、I544B、S545B、A546B、V549B、P550B、N551B、M552B、及
びV553Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸であ
る。
【０７３１】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ミュラー阻害物質を意図
している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるミュラ
ー阻害物質のβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフ
ィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これ
らのミューテイションは、ミュラー阻害物質モノマーの1位〜464位、485位〜529
位、及び554位〜560位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７３２】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７３３】
【化２０】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ミュラー阻
害物質のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントミュラー阻害物質モ
ノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静
電相互作用が増加する。
【０７３４】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのミュラー阻害物質につ
いても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチン
ノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したミュラー阻害
物質を含む。
【０７３５】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ミュラー阻害物質アナログを含むミュータントミュラー阻害物質ヘテロダ
イマーは機能上活性であり、すなわち、ミュラー阻害物質レセプター結合、ミュ
ラー阻害物質タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のような
ワイルドタイプミュラー阻害物質に関連する、1つ以上の官能活性を示すことが
できる。好ましくは、ミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー又は単鎖ミ
ュラー阻害物質アナログは、好ましくはワイルドタイプミュラー阻害物質より大
きいアフィニティーを有するミュラー阻害物質レセプターに結合することができ
る。また、そのようなミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー又は単鎖ミ
ュラー阻害物質アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ま
しくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ミュラ
ー阻害物質アナログを含むミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマーは、ワ
イルドタイプミュラー阻害物質より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビ
ボ生物活性を有し、ワイルドタイプミュラー阻害物質より長い血清半減期を有す
る。本発明のミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー及び単鎖ミュラー阻
害物質アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対
してテストされることができる。
【０７３６】 ヒト骨形態形成タンパク-2 (BMP-2)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-2 (BMP-2)サブユニットは、図25(SEQ ID No: 24)に
示されるように、396個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモ
ノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数の
アミノ酸置換、削除又は挿入を含む、BMP-2サブユニットのミュータントを意図
している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP
-2サブユニットを意図している。
【０７３７】 本発明は図25(SEQ ID NO: 24)に表されているように、ミュータントBMP-2サブ
ユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて302位〜321位間に、1つ以上のアミ
ノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y3
02X、V303X、D304X、F305X、S306X、D307X、V308X、G309X、W310X、N311X、D312
X、W313X、I314X、V315X、A316X、P317X、P318X、G319X、Y320X、及びH321X。“
X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える
。
【０７３８】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-2サブユニ
ットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミ
ノ酸残基に対応するだろう。BMP-2サブユニットモノマーへ塩基性残基が導入さ
れるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D304B、D3
07B、及びD312B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７３９】 BMP-2サブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を
導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミ
ノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をよ
り負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上
を含む：H321Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７４０】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D304U、D307U、D312U、及びH321U導入されることができ、ここで“U”は中性ア
ミノ酸である。
【０７４１】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-2サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y302Z、V303Z
、F305Z、S306Z、V308Z、G309Z、W310Z、N311Z、W313Z、I314Z、V315Z、A316Z、
P317Z、P318Z、G319Z、Y320Z、Y302B、V303B、F305B、S306B、V308B、G309B、W3
10B、N311B、W313B、I314B、V315B、A316B、P317B、P318B、G319B、及びY320B、
ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０７４２】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-2サブユニッ
トについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図25(SEQ ID NO:
24)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて
365位〜389位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：E365X、L366X、S367X、A368X、I369X、S370X、M371X、L37
2X、Y373X、L374X、D375X、E376X、N377X、E378X、K379X、V380X、V381X、L382X
、K383X、N384X、Y385X、Q386X、D387X、M388X、及びV389X、ここで“X”はあら
ゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７４３】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-2サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、BMP-2サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がBMP-2サブユニ
ットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含
む：E365B、D375B、E376B、E378B、及びD387、ここで“B”は塩基性アミノ酸残
基である。
【０７４４】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-2サブユニットL3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の365〜389の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K379Z及びK383Zを
含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７４５】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はE365U D375U、E376U E378U、K379U K383U及びD387U
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７４６】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-2サブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L366Z、S367Z、A368Z、I369Z、S3
70Z、M371Z、L372Z、Y373Z、L374Z、N377Z、V380Z、V381Z、L382Z、N384Z、Y385
Z、Q386Z、M388Z、V389Z、L366B、S367B、A368B、I369B、S370B、M371B、L372B
、Y373B、L374B、N377B、V380B、V381B、L382B、N384B、Y385B、Q386B、M388B、
及びV389Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸で
ある。
【０７４７】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-2サブユニットを意
図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-
2サブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。
これらのミューテイションは、BMP-2サブユニットモノマーの1〜301、322〜364
、及び390〜396からなる群から選択される位置で見出される。
【０７４８】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７４９】
【化２１】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-2サブユ
ニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントBMP-2サブユニット
モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の
静電相互作用が増加する。
【０７５０】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-2サブユニットに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-2サブ
ユニットを含む。
【０７５１】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖BMP-2サブユニットアナログを含むミュータントBMP-2サブユニットヘテロ
ダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-2サブユニットレセプター結合、B
MP-2サブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のよ
うなワイルドタイプBMP-2サブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すこ
とができる。好ましくは、ミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマー又は
単鎖BMP-2サブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-2サブユニッ
トより大きいアフィニティーを有するBMP-2サブユニットレセプターに結合する
ことができる。また、そのようなミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマ
ー又は単鎖BMP-2サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ま
しい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット
又は単鎖BMP-2サブユニットアナログを含むミュータントBMP-2サブユニットヘテ
ロダイマーは、ワイルドタイプBMP-2サブユニットより大きいインビトロ生物活
性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-2サブユニットより長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマ
ー及び単鎖BMP-2サブユニットアナログは、該技術において知られている処置に
より、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７５２】 ヒト骨形態形成タンパク-3(BMP-3)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-3(BMP-3)サブユニットは、図26(SEQ ID No: 25)に示
されるように、472個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノ
マーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数の
アミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、BMP-3のミュータントを意図している。
さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-3を意
図している。
【０７５３】 本発明は、図26(SEQ ID NO: 25)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて373位〜395位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP
-3L1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：R373, Y374X, L37
5X, K376X, V377X, D378X, F379X, A380X, D381X, I382X, G383X, W384X, S385X
, E386X, I387X, I388X, S389X, P390X, K391X, S392X, F393X, 及びD394X。“X
”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変え
る。
【０７５４】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-3モノマーのL1ルー
プに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する
だろう。BMP-3モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静
電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：D378B、D381B、E386B、及びD395B、ここ
で“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７５５】 BMP-3配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意
図している。この態様において、可変の“X”は酸性アミノ酸に相当する。これ
らのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるよ
うに働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R373Z、K376Z
、及びK392Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７５６】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R373U、K376U、D378U、D381U、E386U、K392U、及びD395Uにおいて導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７５７】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-3モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y374Z, L375Z, V377Z, F37
9Z, A380Z, I382Z, G383Z, W384Z, S385Z, W387Z, I388Z, I389Z, S390Z, P391Z
, S393Z, F394Z, Y374B, L375B, V377B, F379B, A380B, I382B, G383B, W384B,
S385B, W387B, I388B, I389B, S390B, P391B, S393B, 及び F394B。ここで、“Z
”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０７５８】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-3についても
述べる。これらのミュータントタンパクは、図26(SEQ ID NO: 25)に描かれてい
るように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて441位〜465位間
に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を
含む：K441X, M442X, S443X, S444X, L445X, S446X, I447X, L448X, F449X, F45
0X, D451X, E452X, N453X, K454X, N455X, V456X, V457X, L458X, K459X, V460X
, Y461X, P462X, N463X, M464X, 及び T465X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸
残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７５９】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-3L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、BMP
-3のL3ループに塩基性残基を導入するとき、上記配列の可変の“X”は塩基性ア
ミノ酸残基に相当する。塩基性残基がBMP-3に導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D451B及びE452B、ここで“B”は塩基
性アミノ酸残基である。
【０７６０】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-3L3ヘアピンループのアミノ酸配列
に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の441〜
465位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に相当
する。そのようなミューテイションの具体例は、K441Z、K454Z及びK459Zを含み
、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７６１】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K441U、D451U、E452U、K454U、及びK459Uで導入さ
れることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７６２】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-3タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、M442Z, S443Z, S444Z, L445Z, S446Z, I447Z,
L448Z, F449Z, F450Z, N453Z, N455Z, V456Z, V457Z, L458Z, V460Z, Y461Z, P4
62Z, N463Z, M464Z, T465Z, M442B, S443B, S444B, L445B, S446B, I447B, L448
B, F449B, F450B, N453B, N455B, V456B, V457B, L458B, V460B, Y461B, P462B,
N463B, M464B,及び T465Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩
基性アミノ酸である。
【０７６３】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-3を意図してい
る。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-3のβヘ
アピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプターとの間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイシ
ョンは、BMP-3の1位〜372位、396位〜440位、及び466位〜472位からなる群から
選択される位置で見出される。
【０７６４】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７６５】
【化２２】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-3のL1及
びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-3モノマーを含む二量体タンパ
クに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する
。
【０７６６】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-3についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-3を含む。
【０７６７】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-3アナログを含むミュータントBMP-3ヘテロダイマーは機能上活性
であり、すなわち、BMP-3レセプター結合、BMP-3タンパクファミリーレセプター
シグナル及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-3に関連する、1つ以上の機
能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-3ヘテロダイマー
又は単鎖BMP-3アナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-3より大きいアフィニ
ティーを有するBMP-3レセプターに結合することができる。また、そのようなミ
ュータントBMP-3ヘテロダイマー又は単鎖BMP-3アナログがシグナル伝達を引き起
こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータン
トサブユニット又は単鎖BMP-3アナログを含むミュータントBMP-3ヘテロダイマー
は、ワイルドタイプBMP-3より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物
活性を有し、ワイルドタイプBMP-3より長い血清半減期を有する。本発明のミュ
ータントBMP-3ヘテロダイマー及び単鎖BMP-3アナログは、当該技術において知ら
れている工程により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７６８】 ヒト骨形態形成タンパク-3b(BMP-3b)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-3b(BMP-3b )サブユニットは、図27(SEQ ID No: 26)
に示されるように、478個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプ
モノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複
数のアミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、BMP-3bサブユニットのミュータント
を意図している。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュー
タントBMP-3bサブユニットを意図している。
【０７６９】 本発明は、図27(SEQ ID NO: 26)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて379位〜402位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP
-3bサブユニットL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：R37
9X, Y380X, L381X, K382X, V383X, D384X, F385X, A386X, D387X, I388X, G389X
, W390X, N391X, E392X, W393X, I394X, I395X, S396X, P397X, K398X, S399X,
F400X, D401X, 及びA402X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘ
アピンループの静電特性を変える。
【０７７０】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-3bサブユニットモノ
マーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に相当するだろう。BMP-3bサブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミ
ューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：D384B、D387B
、E392B、及びD401、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７７１】 BMP-3bサブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を
導入することもまた意図している。この態様において、可変の“X”は酸性アミ
ノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をよ
り負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上
を含む：R379Z、K382Z、及びK398Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７７２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R379U、K382U、D384U、D387U、E392U、K398U、及びD401Uにおいて導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７７３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-3bサブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y380Z, L381Z
, V383Z, F385Z, A386Z, I388Z, G389Z, W390Z, N391Z, W393Z, I394Z, I395Z,
S396Z, P397Z, S399Z, F400Z, A402Z, Y380B, L381B, V383B, F385B, A386B, I3
88B, G389B, W390B, N391B, W393B, I394B, I395B, S396B, P397B, S399B, F400
B, 及びA402B、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸であ
る。
【０７７４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-3bサブユニッ
トについても述べる。これらのミュータントタンパクは、図27(SEQ ID NO: 26)
に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて447
位〜471位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミノ酸
置換は次を含む：K447X, M448X, N449X, S450X, L451X, G452X, V453X, L454X,
F455X, L456X, D457X, E458X, N459X, R460X, N461X, V462X, V463X, L464X, K4
65X, V466X, Y467X, P468X, N469X, M470X, 及びS471X、ここで“X”はあらゆる
アミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７７５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-3bサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、BMP-3bサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入するとき、上記配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基がBMP-3bサブユ
ニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を
含む：D457B及びE458B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７７６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-3bサブユニットL3ヘアピンループ
のアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ
酸は上記の447〜471位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸
性アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体例は、K447Z、R460Z
、及びK465Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７７７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K447U、D457U、E458U、R460U、及びK465に導入さ
れることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７７８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-3bサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、M448Z, N449Z, S450Z, L451Z, G4
52Z, V453Z, L454Z, F455Z, L456Z, N459Z, N461Z, V462Z, V463Z, L464Z, V466
Z, Y467Z, P468Z, N469Z, M470Z, S471Z, M448B, N449B, S450B, L451B, G452B,
V453B, L454B, F455B, L456B, N459B, N461B, V462B, V463B, L464B, V466B, Y
467B, P468B, N469B, M470B, 及びS471Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸
及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０７７９】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-3bサブユニット
を意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる
BMP-3bサブユニットのβヘアピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、BMP-3bサブユニットモノマーの1位〜378位、
403位〜446位、及び472位〜478位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７８０】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７８１】
【化２３】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-3bサブ
ユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-3bサブユニット
モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの
間の静電相互作用が増加する。
【０７８２】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-3bサブユニットに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-3bサブ
ユニットを含む。
【０７８３】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-3bサブユニットアナログを含むミュータントBMP-3bサブユニット
ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-3bサブユニットレセプター
結合、BMP-3bサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル及び細胞外分
泌のようなワイルドタイプBMP-3bサブユニットに関連する、1つ以上の機能的活
性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-3bサブユニットヘテロダ
イマー又は単鎖BMP-3bサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-
3bサブユニットより大きいアフィニティーを有するBMP-3bサブユニットレセプタ
ーに結合することができる。また、そのようなミュータントBMP-3bサブユニット
ヘテロダイマー又は単鎖BMP-3bサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こ
すことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータント
サブユニット又は単鎖BMP-3bサブユニットアナログを含むミュータントBMP-3bサ
ブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプBMP-3bサブユニットより大きいイ
ンビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-3bサ
ブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-3bサブユニ
ットヘテロダイマー及び単鎖BMP-3bサブユニットアナログは、当該技術において
知られている工程により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７８４】 ヒト骨形態形成タンパク-4(BMP-4)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-4(BMP-4 )サブユニットは、図28(SEQ ID No: 27)に
示されるように、408個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモ
ノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数
のアミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、BMP-4サブユニットのミュータントを
意図している。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータ
ントBMP-4サブユニットを意図している。
【０７８５】 本発明は、図28(SEQ ID NO: 27)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて312位〜33位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP-
4サブユニットL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：S312X
, L313X, Y314X, V315X, D316X, F317X, S318X, D139X, V320X, G321X, W322X,
N323X, D324X, W325X, I326X, V327X, A328X, P329X, P330X, G331X, Y332X, 及
びQ333X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静
電特性を変える。
【０７８６】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-4サブユニットモノ
マーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に相当するだろう。BMP-4サブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミ
ューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：D316B、D319B
、及びD324B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０７８７】 本発明はまた、L1ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、電荷を帯びた
残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記の
L1配列に導入されることができる。また、例えば、1つ以上の中性残基は、D316U
、D319U、及びD324Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸であ
る。
【０７８８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-4サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S312Z, L313Z
, Y314Z, V315Z, F317Z, S318Z, V320Z, G321Z, W322Z, N323Z, W325Z, I326Z,
V327Z, A328Z, P329Z, P330Z, G331Z, Y332Z, Q333Z, S312B, L313B, Y314B, V3
15B, F317B, S318B, V320B, G321B, W322B, N323B, W325B, I326B, V327B, A328
B, P329B, P330B, G331B, Y332B, 及びQ333B。ここで、“Z”は酸性アミノ酸、
及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０７８９】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-4サブユニッ
トについても述べる。これらのミュータントタンパクは、図28(SEQ ID NO: 27)
に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて377
位〜401位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミノ酸
置換は次を含む：E377X, L378X, S379X, A380X, I381X, S382X, M383X, L384X,
Y385X, L386X, D387X, E388X, Y389X, D390X, K391X, V392X, V393X, L394X, K3
95X, N396X, Y397X, Q398X, E399X, M400X, 及びV401X、ここで“X”はあらゆる
アミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７９０】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-4サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、BMP-4サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入するとき、上記配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基がBMP-4サブユニ
ットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含
む：E377B、D387B、E388B、D390B、及びE399B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残
基である。
【０７９１】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-4サブユニットL3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の377〜401位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体例は、K391Z及びK395Z
を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０７９２】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、E377U、D387U、E388U、D390U、K391U、K395U、及
びE399Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０７９３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-4サブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L378Z, S379Z, A380Z, I38IZ, S3
82Z, M383Z, L384Z, Y385Z, L386Z, Y389Z, V392Z, V393Z, L394Z, N396Z, Y397
Z, Q398Z, M400Z, V401Z, L378B, S379B, A380B, I381B, S382B, M383B, L384B,
Y385B, L386B, Y389B, V392B, V393B, L394B, N396B, Y397B, Q398B, M400B,
及びV401Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸で
ある。
【０７９４】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-4サブユニット
を意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる
BMP-4サブユニットのβヘアピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、BMP-4サブユニットモノマーの1位〜311位、3
34位〜376位、及び402位〜408位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７９５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０７９６】
【化２４】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-4サブユ
ニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-4サブユニットモ
ノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間
の静電相互作用が増加する。
【０７９７】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-4サブユニットに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-4サブ
ユニットを含む。
【０７９８】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-4サブユニットアナログを含むミュータントBMP-4サブユニットヘ
テロダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-4サブユニットレセプター結
合、BMP-4サブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル及び細胞外分泌
のようなワイルドタイプBMP-4サブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を
示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-4サブユニットヘテロダイマ
ー又は単鎖BMP-4サブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-4サブ
ユニットより大きいアフィニティーを有するBMP-4サブユニットレセプターに結
合することができる。また、そのようなミュータントBMP-4サブユニットヘテロ
ダイマー又は単鎖BMP-4サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすこと
も好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユ
ニット又は単鎖BMP-4サブユニットアナログを含むミュータントBMP-4サブユニッ
トヘテロダイマーは、ワイルドタイプBMP-4サブユニットより大きいインビトロ
生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-4サブユニット
より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-4サブユニットヘテロ
ダイマー及び単鎖BMP-4サブユニットアナログは、当該技術において知られてい
る工程により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７９９】 ヒト骨形態形成タンパク-5(BMP-5)前駆体サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-5(BMP-5 )前駆体サブユニットは、図29(SEQ ID No:
28)に示されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイ
プモノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は
複数のアミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、BMP-5前駆体サブユニットのミュ
ータントを意図している。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合し
たミュータントBMP-5前駆体サブユニットを意図している。
【０８００】 本発明は、図29(SEQ ID NO: 28)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて357位〜378位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP
-5前駆体サブユニットL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む
：E357X, L358X, Y359X, V360X, S361X, F362X, R363X, D364X, L365X, G366X,
W367X, Q368X, D369X, W370X, I371X, I372X, A373X, P374X, E375X, G376X, Y3
77X, 及びA378X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンル
ープの静電特性を変える。
【０８０１】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-5前駆体サブユニッ
トモノマーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミ
ノ酸残基に相当するだろう。BMP-5前駆体サブユニットモノマーへ塩基性残基が
導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：E
357B、D364B、D369B、及びE375B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８０２】 BMP-5前駆体サブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸
残基を導入することもまた意図している。この態様において、可変の“X”は酸
性アミノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特
性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、R363Z
を含む、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８０３】 本発明はまた、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を、電荷を帯びた残
基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例え
ば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記のL1
配列に導入されることができる。また、例えば、1つ以上の中性残基は、E357U、
R363U、D364U、D369U、及びE375Uに導入されることができ、ここで“U”は中性
アミノ酸である。
【０８０４】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-5前駆体サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミ
ノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：L358Z,
Y359Z, V360Z, S361Z, F362Z, L365Z, G366Z, W367Z, Q368Z, W370Z, I371Z, I
372Z, A373Z, P374Z, G376Z, Y377Z, A378Z, L358B, Y359B, V360B, S361B, F36
2B, L365B, G366B, W367B, Q368B, W370B, I371B, I372B, A373B, P374B, G376B
, Y377B, 及びA378B。ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ
酸である。
【０８０５】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-5前駆体サブ
ユニットについても述べる。これらのミュータントタンパクは、図29(SEQ ID NO
: 28)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含め
て423位〜447位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次を含む：K423X, L424X, N425X, A426X, I427X, S428X, V429X, L
430X, Y431X, F432X, D433X, D434X, S435X, S436X, N437X, V438X, I439X, L44
0X, K441X, K442X, Y443X, R444X, N445X, M446X, 及びV447X、ここで“X”はあ
らゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０８０６】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-5前駆体サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入すること
を含む。例えば、BMP-5前駆体サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する
とき、上記配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基がB
MP-5前駆体サブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例
は次の1つ以上を含む：D433B及びD434B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基であ
る。
【０８０７】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-5前駆体サブユニットL3ヘアピンル
ープのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性ア
ミノ酸は上記の423〜447位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”
は酸性アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体例は、K423Z、K
441Z、K442Z、及びR444Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８０８】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K423U、D433U、D434U、K441U、K442U、及びR444U
で導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８０９】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-5前駆体サブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を
電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L424Z, N425Z, A426Z, I42
7Z, S428Z, V429Z, L430Z, Y431Z, F432Z, S435Z, S436Z, N437Z, V438Z, I439Z
, L440Z, Y443Z, R444Z, N445Z, M446Z, V447Z, L424B, N425B, A426B, I427B,
S428B, V429B, L430B, Y431B, F432B, S435B, S436B, N437B, V438B, I439B, L4
40B, Y443B, N445B, M446B, 及びV447Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及
び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８１０】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-5前駆体サブユ
ニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含
まれるBMP-5前駆体サブユニットのβヘアピンループ構造の領域と、二量体タン
パクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用を増加さ
せるように働く。これらのミューテイションは、BMP-5前駆体サブユニットモノ
マーの1位〜356位、379位〜422位、及び448位〜454位からなる群から選択される
位置で見出される。
【０８１１】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８１２】
【化２５】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-5前駆体
サブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-5前駆体サ
ブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセ
プターとの間の静電相互作用が増加する。
【０８１３】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-5前駆体サブユニ
ットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つの
シスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-
5前駆体サブユニットを含む。
【０８１４】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-5前駆体サブユニットアナログを含むミュータントBMP-5前駆体サ
ブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-5前駆体サブユ
ニットレセプター結合、BMP-5前駆体サブユニットタンパクファミリーレセプタ
ーシグナル及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-5前駆体サブユニットに
関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータン
トBMP-5前駆体サブユニットヘテロダイマー又は単鎖BMP-5前駆体サブユニットア
ナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-5前駆体サブユニットより大きいアフ
ィニティーを有するBMP-5前駆体サブユニットレセプターに結合することができ
る。また、そのようなミュータントBMP-5前駆体サブユニットヘテロダイマー又
は単鎖BMP-5前駆体サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好
ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-5前駆体サブユニットアナログを含むミュータントBMP-5前駆体サ
ブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプBMP-5前駆体サブユニットより大
きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP
-5前駆体サブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-
5前駆体サブユニットヘテロダイマー及び単鎖BMP-5前駆体サブユニットアナログ
は、当該技術において知られている工程により、望まれる活性に対してテストさ
れることができる。
【０８１５】 ヒト骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーのミュータント ヒトは、図30(SEQ ID No: 29)に示されるように、111個のアミノ酸を含んでい
る。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより
多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、ヒト
骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーのミュータントを意図している。
さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒト骨形態
形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーを意図している。
【０８１６】 本発明は、図30(SEQ ID NO: 29)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントヒト
骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーL1ヘアピンループを提供する。該
アミノ酸置換は次を含む：Y21X, V22X, S23X, F24X, Q25X, D26X, L27X, G28X,
W29X, Q30X, W31X, I32X, I33X, A34X, P35X, K36X, G37X, Y38X, A39X, 及びA4
0X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特
性を変える。
【０８１７】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマー
のL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に
相当するだろう。骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーへ塩基性残基がD
26Bで導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例、ここで“B”は塩基
性アミノ酸残基である。
【０８１８】 骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマー配列に塩基性残基が存在する酸
性アミノ酸残基を導入することもまた意図している。この態様において、可変の
“X”は酸性アミノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンルー
プの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例
はK36Zであり、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８１９】 本発明はまた、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を、電荷を帯びた残
基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例え
ば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記のL1
配列に導入されることができる。また、例えば、1つ以上の中性残基は、D26U及
びK36Uに導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８２０】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータント骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマータンパクが提供される
。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含
む：Y21Z, V22Z, S23Z, F24Z, Q25Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I3
3Z, A34Z, P35Z, G37Z, Y38Z, A39Z, A40Z, Y21B, V22B, S23B, F24B, Q25B, L2
7B, G28B, W29B, Q30B, W31B, I32B, I33B, A34B, P35B, G37B, Y38B, A39B, 及
びA40B、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８２１】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント転換成長因子β3
モノマーについても述べる。これらのミュータントタンパクは、図30(SEQ ID NO
: 29)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含め
て81位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：K81X, L82X, N83X, A84X, I85X, S86X, V87X, L88X, Y89X
, F90X, D91X, D92X, N93X, S94X, N95X, V96X, I97X, K98X, K99X, Y100X, R10
1X, 及びN102X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ルー
プの静電特性を変える。
【０８２２】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を転換成長因子β1L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。
例えば、転換成長因子β3モノマーのL3ループに塩基性残基を導入するとき、上
記配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基が骨形態形
成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーに導入されるミューテイションを変える静
電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D91B及びD92B、ここで“B”は塩基性アミノ
酸残基である。
【０８２３】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子L3
ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以
上の酸性アミノ酸は上記の81〜102位の配列に導入されることができ、ここで可
変の“X”は酸性アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体例は
、K81Z、K98Z、K99Z、及びR101Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である
。
【０８２４】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K81U、D91U、D92U、K98U、K99U、及びR101Uで導入
されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８２５】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータント転換成長因子β1タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は、L82Z, N83Z, A84Z, I85Z, S86Z, V8
7Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V96Z, I97Z, Y100Z, N102Z, L82B,
N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B, Y89B, F90B, N93B, S94B, N95B, V96B,
I97B, Y100B, 及びN102Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０８２６】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、転換成長因子β3モ
ノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含
まれる骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーのβヘアピンループ構造の
領域と、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静
電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、骨形態形成
タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103位〜111位
からなる群から選択される位置で見出される。
【０８２７】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８２８】
【化２６】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、骨形態形成
タンパク-6/Vgr1成長因子のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータント骨
形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーを含む二量体タンパクに対するアフ
ィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０８２９】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くの骨形態形成タンパク-6
/Vgr1成長因子モノマーについても意図している。これらのモディファイされた
形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーの
フラクションに結合した骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子モノマーを含む。
【０８３０】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子アナログを含むミュータント骨
形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわ
ち、骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子レセプター結合、骨形態形成タンパク-
6/Vgr1成長因子レセプターシグナル及び細胞外分泌のようなワイルドタイプ骨形
態形成タンパク-6/Vgr1成長因子に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことが
できる。好ましくは、ミュータント骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子ヘテロ
ダイマー又は単鎖骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子アナログは、好ましくは
ワイルドタイプ骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子より大きいアフィニティー
を有する骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子レセプターに結合することができ
る。また、そのようなミュータント骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子ヘテロ
ダイマー又は単鎖骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子アナログがシグナル伝達
を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミ
ュータントサブユニット又は単鎖骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子アナログ
を含むミュータント骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子ヘテロダイマーは、ワ
イルドタイプ骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因子より大きいインビトロ生物活
性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプ骨形態形成タンパク-6/Vg
r1成長因子より長い血清半減期を有する。本発明のミュータント骨形態形成タン
パク-6/Vgr1成長因子ヘテロダイマー及び単鎖骨形態形成タンパク-6/Vgr1成長因
子アナログは、当該技術において知られている工程により、望まれる活性に対し
てテストされることができる。
【０８３１】 ヒト骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーのミュータント ヒトは、図31(SEQ ID No: 30)に示されるように、111個のアミノ酸を含んでい
る。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより
多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸残基の置換、削除又は挿入を含む、
ヒト骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーのミュータントを意図し
ている。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒ
ト骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーを意図している。
【０８３２】 本発明は、図31(SEQ ID NO: 30)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータント骨形
態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーL1ヘアピンループを提供する。該
アミノ酸置換は次を含む：Y21X, V22X, S23X, F24X, R25X, D26X, L27X, G28X,
W29X, Q30X, W31X, I32X, I33X, A34X, P35X, E36X, G37X, Y38X, A39X, 及びA4
0X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特
性を変える。
【０８３３】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノ
マーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に相当するだろう。骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーへ塩基
性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上
を含む：D26B及びE36B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８３４】 骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマー配列に塩基性残基が存在す
る酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図している。この態様において、可
変の“X”は酸性アミノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピン
ループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換
の例はR25Zであり、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８３５】 本発明はまた、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を、電荷を帯びた残
基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例え
ば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記のL1
配列に導入されることができる。また、例えば、1つ以上の中性残基は、R25U、D
26U及びE36Uに導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８３６】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマータンパクが提供さ
れる。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次
を含む：Y21Z, V22Z, S23Z, F24Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I33Z
, A34Z, P35Z, G37Z, Y38Z, A39Z, 及びA40Z、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、
及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８３７】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント骨形態形成-7/骨
形成タンパク-1モノマーについても述べる。これらのミュータントタンパクは、
図31(SEQ ID NO: 30)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンルー
プの境界を含めて81位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を
有する。該アミノ酸置換は次を含む：Q81X, L82X, N83X, A84X, I85X, S86X, V8
7X, L88X, Y89X, F90X, D91X, D92X, S93X, S94X, N95X, V96X, I97X, K98X, K9
9X, Y100X, R101X, 及びN102X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換はL3ループの静電特性を変える。
【０８３８】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基を転換成長因子β1L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。
例えば、転換成長因子β3モノマーのL3ループに塩基性残基を導入するとき、上
記配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基が骨形態形
成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーに導入されるミューテイションを変え
る静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D91B及びD92B、ここで“B”は塩基性ア
ミノ酸残基である。
【０８３９】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク
-1L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1
つ以上の酸性アミノ酸は上記の81〜102位の配列に導入されることができ、ここ
で可変の“X”は酸性アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体
例は、K98Z、K99Z、及びR101Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８４０】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、D91U、D92U、K98U、K99U、及びR101Uで導入される
ことができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８４１】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーが提供される。中性
アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、Q81Z, L82Z
, N83Z, A84Z, I85Z, S86Z, V87Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V96Z
, I97Z, Y100Z, N102B, Q81B, L82B, N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B, Y8
9B, F90B, N93B, S94B, N95B, V96B, I97B, Y100B, 及びN102Bを含み、ここで、
“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８４２】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、骨形態形成タンパク
-7/骨形成タンパク-1モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いか
えると、二量体分子に含まれる骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマ
ーのβヘアピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対するアフィニティーを
有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミュ
ーテイションは、骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーの1位〜20位
、41位〜81位、及び103位〜111位からなる群から選択される位置で見出される。
【０８４３】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８４４】
【化２７】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、骨形態形成
タンパク-7/骨形成タンパク-1のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータン
ト骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマーを含む二量体タンパクに対
するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０８４５】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くの骨形態形成タンパク-7
/骨形成タンパク-1モノマーについても意図している。これらのモディファイさ
れた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマ
ーのフラクションに結合した骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1モノマー
を含む。
【０８４６】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子アナログを含むミ
ュータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子ヘテロダイマーは
機能上活性であり、すなわち、骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因
子レセプター結合、骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子レセプタ
ーシグナル及び細胞外分泌のようなワイルドタイプ骨形態形成タンパク-7/骨形
成タンパク-1成長因子に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。
好ましくは、ミュータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子ヘ
テロダイマー又は単鎖骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子アナロ
グは、好ましくはワイルドタイプ骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長
因子より大きいアフィニティーを有する骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-
1成長因子レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータント
骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子ヘテロダイマー又は単鎖骨形
態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子アナログがシグナル伝達を引き起
こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータン
トサブユニット又は単鎖骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子アナ
ログを含むミュータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子ヘテ
ロダイマーは、ワイルドタイプ骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因
子より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルド
タイプ骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子より長い血清半減期を
有する。本発明のミュータント骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因
子ヘテロダイマー及び単鎖骨形態形成タンパク-7/骨形成タンパク-1成長因子ア
ナログは、当該技術において知られている工程により、望まれる活性に対してテ
ストされることができる。
【０８４７】 ヒト骨形態形成タンパク-8(BMP-8)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-8(BMP-8)サブユニットは、図32(SEQ ID No: 31)に示
されるように、402個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノ
マーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数の
アミノ酸の置換、削除又は挿入を含む、BMP-8サブユニットのミュータントを意
図している。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータン
トBMP-8サブユニットを意図している。
【０８４８】 本発明は、図32(SEQ ID NO: 31)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて305位〜326位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP
-8サブユニットL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：E305
X, L306X, Y307X, V308X, S309X, F310X, Q311X, D312X, L313X, G314X, W315X,
L316X, D317X, W318X, V319X, I320X, A321X, P322X, Q323X, G324X, Y325X,
及びS326X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの
静電特性を変える。
【０８４９】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-8サブユニットモノ
マーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残
基に相当するだろう。BMP-8サブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミ
ューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：D332B及びD337
B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８５０】 BMP-8サブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を
導入することもまた意図している。この態様において、可変の“X”は酸性アミ
ノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をよ
り負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上
を含む：K331Z及びH346Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８５１】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
K331U、D332U、D337U、及びH346Uにおいて導入されることができ、ここで“U”
は中性アミノ酸である。
【０８５２】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-8サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F326Z, F327Z
, V328Z, S329Z, F330Z, I333Z, G334Z, W335Z, N336Z, W338Z, I339Z, I340Z,
A341Z, P342Z, S343Z, G344Z, Y345Z, F326B, F327B, V328B, S329B, F330B, I3
33B, G334B, W335B, N336B, W338B, I339B, I340B, A341B, P342B, S343B, G344
B, 及びY345B、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸であ
る。
【０８５３】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-8サブユニッ
トについても述べる。これらのミュータントタンパクは、図32(SEQ ID NO: 31)
に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて371
位〜395位間に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミノ酸
置換は次を含む：K371X, L372X, S373X, A374X, T375X, S376X, V377X, L378X,
Y379X, Y380X, D381X, S382X, S383X, N384X, N385X, V386X, I387X, L388X, R3
89X, K390X, H391X, R392X, N393X, M394X, 及びV395X、ここで“X”はあらゆる
アミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０８５４】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-8サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、BMP-8サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入するとき、上記配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基がBMP-8サブユニ
ットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含
む：D405B、D406B、及びD414B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８５５】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-8サブユニットL3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の395〜419位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に相当する。そのようなミューテイションの具体例は、K395Z、K412Z及
びK413Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８５６】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K395U、D405U、D406U、K412U、K413U、及びD414U
で導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８５７】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-8サブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L396Z, R397Z, P398Z, M399Z, S4
00Z, M401Z, L402Z, Y403Z, Y404Z, G407Z, Q408Z, N409Z, I410Z, I411Z, I415
Z, Q416Z, N417Z, M418Z, I419Z, L396B, R397B, P398B, M399B, S400B, M401B,
L402B, Y403B, Y404B, G407B, Q408B, N409B, I410B, I411B, I415B, Q416B, N
417B, M418B, 及びI419Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０８５８】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-8サブユニット
を意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる
BMP-8サブユニットのβヘアピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、BMP-8サブユニットモノマーの1位〜325位、3
47位〜394位、及び420位〜426位からなる群から選択される位置で見出される。
【０８５９】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８６０】
【化２８】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-8サブユ
ニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-8サブユニットモ
ノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間
の静電相互作用が増加する。
【０８６１】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-8サブユニットに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-8サブ
ユニットを含む。
【０８６２】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-8サブユニットアナログを含むミュータントBMP-8サブユニットヘ
テロダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-8サブユニットレセプター結
合、BMP-8サブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル及び細胞外分泌
のようなワイルドタイプBMP-8サブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を
示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-8サブユニットヘテロダイマ
ー又は単鎖BMP-8サブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-8サブ
ユニットより大きいアフィニティーを有するBMP-8サブユニットレセプターに結
合することができる。また、そのようなミュータントBMP-8サブユニットヘテロ
ダイマー又は単鎖BMP-8サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすこと
も好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユ
ニット又は単鎖BMP-8サブユニットアナログを含むミュータントBMP-8サブユニッ
トヘテロダイマーは、ワイルドタイプBMP-8サブユニットより大きいインビトロ
生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-8サブユニット
より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-8サブユニットヘテロ
ダイマー及び単鎖BMP-8サブユニットアナログは、当該技術において知られてい
る工程により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０８６３】 ヒト骨形態形成タンパク-10(BMP-10)サブユニットのミュータント ヒト骨形態形成タンパク-10(BMP-10)は、図33(SEQ ID No: 32)に示されるよう
に、424個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較
したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸の
置換、削除又は挿入を含む、BMP-10のミュータントを意図している。さらに、本
発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-10を意図している
。
【０８６４】 本発明は、図33(SEQ ID NO: 32)に表されているように、Cys残基を除いて、境
界を含めて327位〜353位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP
-10L1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：P327X, L328X, Y
329X, I330X, D331X, F332X, K333X, E334X, I335X, G336X, W337X, D338X, S33
9X, W340X, I341X, I342X, A343X, P344X, P345X, G346X, Y347X, E348X, A349X
, Y350X, E351X, C352X, 及びR353X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０８６５】 本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミ
ノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-10モノマーのL1ルー
プに塩基性残基を導入するとき、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に相当する
だろう。BMP-10へ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具
体例は、次の1つ以上を含む：D331B、E334B、D338B、E348B、及びE351B、ここで
“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８６６】 BMP-10モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入すること
もまた意図している。この態様において、可変の“X”は酸性アミノ酸に相当す
る。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ
変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：K333Z
及びR353Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８６７】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に相当する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D331U、K333U、E334U、D338U、E348U、E351U、及びR353Uにおいて導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８６８】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-10モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：P327Z, L328Z, Y329Z, I33
0Z, F332Z, I335Z, G336Z, W337Z, S339Z, W340Z, I341Z, I342Z, A343Z, P344Z
, P345Z, G346Z, Y347Z, A349Z, Y350Z, C352Z, P327B, L328B, Y329B, I330B,
F332B, I335B, G336B, W337B, S339B, W340B, I341B, I342B, A343B, P344B, P3
45B, G346B, Y347B, A349B, Y350B, 及びC352B、ここで、“Z”は酸性アミノ酸
、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８６９】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-10についても
述べる。これらのミュータントタンパクは、図33(SEQ ID NO: 32)に描かれてい
るように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて327位〜353位間
に、1つ以上のアミノ酸の置換、削除又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を
含む：K393X, L394X, E395X, P396X, I397X, S398X, I399X, L400X, Y401X, L40
2X, D403X, K404X, G405X, V406X, V407X, T408X, Y409X, K410X, F411X, K412X
, Y413X, E414X, G415X, 及びM416X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であ
り、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０８７０】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-10L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、BM
P-10のL3ループに塩基性残基を導入するとき、上記の配列の可変の“X”は塩基
性アミノ酸残基に相当する。塩基性残基がBMP-10に導入されるミューテイション
を変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E395B、D403B、及びE414B、ここ
で“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８７１】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-10L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の393
〜416位の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に相
当する。そのようなミューテイションの具体例は、K393Z、K404Z、K410Z、及びK
412Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８７２】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に相当する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、K393U、E395U、D403U、K404U、K410U、K412U、及
びE414Uに導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８７３】 非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-10タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、L394Z, P396Z, I397Z, S398Z, I399Z, L400Z,
Y401Z, L402Z, G405Z, V406Z, V407Z, T408Z, Y409Z, F411Z, Y413Z, G415Z, M4
16Z, L394B, P396B, I397B, S398B, I399B, L400B, Y401B, L402B, G405B, V406
B, V407B, T408B, Y409B, F411B, Y413B, G415B, 及びM416Bを含み、ここで、“
Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８７４】 本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造
又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-10を意図してい
る。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-10のβヘ
アピンループ構造の領域と、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプターとの間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイシ
ョンは、BMP-10の1位〜326位、354位〜392位、及び417位〜424位からなる群から
選択される位置で見出される。
【０８７５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８７６】
【化２９】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-10のL1
及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントBMP-10モノマーを含む二量体タン
パクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加す
る。
【０８７７】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-10についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-10を含む。
【０８７８】 具体的態様において、少なくとも1つの上記のようなミュータントサブユニッ
ト又は単鎖BMP-10アナログを含むミュータントBMP-10ヘテロダイマーは機能上活
性であり、すなわち、BMP-10レセプター結合、BMP-10タンパクファミリーレセプ
ターシグナル及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-10に関連する、1つ以
上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-10ヘテロダ
イマー又は単鎖BMP-10アナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-10より大きい
アフィニティーを有するBMP-10レセプターに結合することができる。また、その
ようなミュータントBMP-10ヘテロダイマー又は単鎖BMP-10アナログがシグナル伝
達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つの
ミュータントサブユニット又は単鎖BMP-10アナログを含むミュータントBMP-10ヘ
テロダイマーは、ワイルドタイプBMP-10より大きいインビトロ生物活性及び/又
はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-10より長い血清半減期を有する
。本発明のミュータントBMP-10ヘテロダイマー及び単鎖BMP-10アナログは、当該
技術において知られている工程により、望まれる活性に対してテストされること
ができる。 ヒト骨形態形成タンパク-11 (BMP-11)のミュータント ヒト骨形態形成タンパク-11 (BMP-11)は、図34(SEQ ID No: 33)に示されるよ
うに、407個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比
較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置
換、削除又は挿入を含む、BMP-11のミュータントを意図している。さらに、本発
明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-11を意図している。
【０８７９】 本発明は図34(SEQ ID NO: 33)に表されているように、ミュータントBMP-11に
、Cys残基を除いて、境界を含めて318位〜337位間に、1つ以上のアミノ酸置換を
有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：L318X、T319X
、V320X、D321X、F322X、E323X、A324X、F325X、G326X、W327X、D328X、W329X、
I330X、I331X、A332X、P333X、K334X、R335X、Y336X、及びK337X。“X”はあら
ゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える。
【０８８０】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-11モノマー
のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対
応するだろう。BMP-11モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D321B、E323B、及びD328B、ここで“
B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０８８１】 BMP-11モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入すること
もまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応す
る。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ
変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のK334Z、R335Z、及びK3
37Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８８２】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D321U、E323U、D328U、K334U、R335U、及びK337Uにおいて導入されることができ
、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８８３】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-11モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例はL318Z、T319Z、V320Z、F322Z、A324Z
、F325Z、G326Z、W327Z、W329Z、I330Z、I331Z、A332Z、P333Z、Y336Z、L318B、
T319B、V320B、F322B、A324B、F325B、G326B、W327B、W329B、I330B、I331B、A3
32B、P333B、及びY336Bを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０８８４】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-11についても
述べられる。これらのミュータントタンパクは、図34(SEQ ID NO: 33)に描かれ
ているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて376位〜400
位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は
次を含む：K376X、M377X、S378X、P379X、I380X、N381X、M382X、L383X、Y384X
、F385X、N386X、D387X、K388X、Q389X、Q390X、I391X、I392X、Y393X、G394X、
K395X、I396X、P397X、G398X、M399X、及びV400X、ここで“X”はあらゆるアミ
ノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０８８５】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-11L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、BM
P-11のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性
アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がBMP-11に導入されるミューテイションを
変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D387B、ここで“B”は塩基性アミ
ノ酸残基である。
【０８８６】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-11L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の376
〜400の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応
する。そのようなミューテイションの具体例は、K376Z、K388Z、及びK395Zを含
み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８８７】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK376U、D387U、K388U、及びK395Uで導入されること
ができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０８８８】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-11タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、M377Z、S378Z、P379Z、I380Z、N381Z、M382Z、
L383Z、Y384Z、F385Z、N386Z、Q389Z、Q390Z、I391Z、I392Z、Y393Z、G394Z、I3
96Z、P397Z、G398Z、M399Z、V400Z、M377B、S378B、P379B、I380B、N381B、M382
B、L383B、Y384B、F385B、N386B、Q389B、Q390B、I391B、I392B、Y393B、G394B
、I396B、P397B、G398B、M399B、及びV400Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ
酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０８８９】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-11を意図している。
これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-11のβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、BMP-11モノマーの1位〜317位、338位〜375位、及び401位〜407位からなる群
から選択される位置で見出される。
【０８９０】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０８９１】
【化３０】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-11のL1
及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントBMP-11モノマーを含む二量体タ
ンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する
。
【０８９２】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-11についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-11を含む。
【０８９３】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖BMP-11アナログを含むミュータントBMP-11ヘテロダイマーは機能上活性で
あり、すなわち、BMP-11レセプター結合、BMP-11タンパクファミリーレセプター
シグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-11に関連する、1つ以上
の官能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-11ヘテロダイマ
ー又は単鎖BMP-11アナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-11より大きいアフ
ィニティーを有するBMP-11レセプターに結合することができる。また、そのよう
なミュータントBMP-11ヘテロダイマー又は単鎖BMP-11アナログがシグナル伝達を
引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュ
ータントサブユニット又は単鎖BMP-11アナログを含むミュータントBMP-11ヘテロ
ダイマーは、ワイルドタイプBMP-11より大きいインビトロ生物活性及び/又はイ
ンビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-11より長い血清半減期を有する。本
発明のミュータントBMP-11ヘテロダイマー及び単鎖BMP-11アナログは、該技術に
おいて知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができ
る。
【０８９４】 ヒト骨形態形成タンパク-15 (BMP-15)のミュータント ヒト骨形態形成タンパク-15(BMP-15)は、図35(SEQ ID No: 34)に示されるよう
に、392個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較
した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換
、削除又は挿入を含む、BMP-15のミュータントを意図している。さらに、本発明
はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-15を意図している。
【０８９５】 本発明は図35(SEQ ID NO: 34)に表されているように、ミュータントBMP-15に
、Cys残基を除いて、境界を含めて295位〜316位間に、1つ以上のアミノ酸置換を
有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：P295X、F296X
、Q297X、I298X、S299X、F300X、R301X、Q302X、L303X、G304X、W305X、D306X、
H307X、W308X、I309X、I310X、A311X、P312X、P313X、F314X、Y315X、及びT316X
。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変
える。
【０８９６】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-15モノマー
のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対
応するだろう。BMP-15モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D306B、ここで“B”は塩基性アミノ
酸残基である。
【０８９７】 BMP-15モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入すること
もまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応す
る。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ
変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R301Z
及びH307Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０８９８】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R301U、D306U、及びH307Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中性ア
ミノ酸である。
【０８９９】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントBMP-15モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：P295Z、F296Z、Q297Z、I29
8Z、S299Z、F300Z、Q302Z、L303Z、G304Z、W305Z、W308Z、I309Z、I310Z、A311Z
、P312Z、P313Z、F314Z、Y315Z、T316Z、P295B、F296B、Q297B、I298B、S299B、
F300B、Q302B、L303B、G304B、W305B、W308B、I309B、I310B、A311B、P312B、P3
13B、F314B、Y315B、及びT316B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基
性アミノ酸である。
【０９００】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-15についても
述べられる。これらのミュータントタンパクは、図35(SEQ ID NO: 34)に描かれ
ているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて361位〜385
位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は
次を含む：K361X、Y362X、V363X、P364X、I365X、S366X、V367X、L368X、M369X
、I370X、E371X、A372X、N373X、G374X、S375X、I376X、L377X、Y378X、K379X、
E380X、Y381X、E382X、G383X、M384X、及びI385X、ここで“X”はあらゆるアミ
ノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９０１】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をBMP-15L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、BM
P-15のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性
アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がBMP-15に導入されるミューテイションを
変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E371B、E380B、及びE382B、ここで
“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９０２】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-15L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の361
〜385の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応
する。そのようなミューテイションの具体例は、K361Z及びK379Zを含み、ここで
“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９０３】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK361U、E371U、K379U、E380U、及びE382Uで導入され
ることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９０４】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントBMP-15タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、Y362Z、V363Z、P364Z、I365Z、S366Z、V367Z、
L368Z、M369Z、I370Z、A372Z、N373Z、G374Z、S375Z、I376Z、L377Z、Y378Z、Y3
81Z、G383Z、M384Z、I385Z、Y362B、V363B、P364B、I365B、S366B、V367B、L368
B、M369B、I370B、A372B、N373B、G374B、S375B、I376B、L377B、Y378B、Y381B
、G383B、M384B、及びI385Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は
塩基性アミノ酸である。
【０９０５】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-15を意図している。
これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-15のβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、BMP-15モノマーの1位〜294位、317位〜360位、及び386位〜392位からなる群
から選択される位置で見出される。
【０９０６】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９０７】
【化３１】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-15のL1
及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントBMP-15モノマーを含む二量体タ
ンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する
。
【０９０８】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-15についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-15を含む。
【０９０９】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖BMP-15アナログを含むミュータントBMP-15ヘテロダイマーは機能上活性で
あり、すなわち、BMP-15レセプター結合、BMP-15タンパクファミリーレセプター
シグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-15に関連する、1つ以上
の官能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-15ヘテロダイマ
ー又は単鎖BMP-15アナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-15より大きいアフ
ィニティーを有するBMP-15レセプターに結合することができる。また、そのよう
なミュータントBMP-15ヘテロダイマー又は単鎖BMP-15アナログがシグナル伝達を
引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュ
ータントサブユニット又は単鎖BMP-15アナログを含むミュータントBMP-15ヘテロ
ダイマーは、ワイルドタイプBMP-15より大きいインビトロ生物活性及び/又はイ
ンビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-15より長い血清半減期を有する。本
発明のミュータントBMP-15ヘテロダイマー及び単鎖BMP-15アナログは、該技術に
おいて知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができ
る。
【０９１０】 ヒトノリエ病タンパクのミュータント ヒトノリエ病タンパク(NDP)は、図36(SEQ ID No: 35)に示されるように、133
個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、
1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又
は挿入を含む、NDPのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つの
CKGFタンパクに結合したミュータントNDPを意図している。
【０９１１】 本発明は図36(SEQ ID NO: 35)に表されているように、ミュータントNDPに、Cy
s残基を除いて、境界を含めて43位〜62位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有する
L1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：H43X、Y44X、V45X、
D46X、S47X、I48X、S49X、H50X、P51X、L52X、Y53X、K54X、C55X、S56X、S57X、
K58X、M59X、V60X、L61X、及びL62X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換でヘアループの静電特性を変える。
【０９１２】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、NDPモノマーのL
1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応す
るだろう。NDPモノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静
電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D46B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基で
ある。
【０９１３】 NDPモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することも
また熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応する
。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変
えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：H43Z、H
50Z、K54Z、及びK58Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９１４】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
H43U、D46U、H50U、K54U、及びK58Uにおいて導入されることができ、ここで“U
”は中性アミノ酸である。
【０９１５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントNDPモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯び
た残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y44Z、V45Z、S47Z、I48Z、S4
9Z、P51Z、L52Z、Y53Z、C55Z、S56Z、S57Z、M59Z、V60Z、L61Z、L62Z、Y44B、V4
5B、S47B、I48B、S49B、P51B、L52B、Y53B、C55B、S56B、S57B、M59B、V60B、L6
1B、及びL62B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である
。
【０９１６】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントNDPについても述
べられる。これらのミュータントタンパクは、図36(SEQ ID NO: 35)に描かれて
いるように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて100位〜123位
間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次
を含む：T100X、S101X、K102X、L103X、K104X、A105X、L106X、R107X、L108X、R
109X、C110X、S111X、G112X、G113X、M114X、R115X、L116X、T117X、A118X、T11
9X、Y120X、R121X、Y122X、及びI123X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基で
あり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９１７】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をNDP L3ヘアピンループのアミノ酸配列
に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の100〜
123の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応す
る。そのようなミューテイションの具体例は、K102Z、K104Z、R107Z、R109Z、R1
15Z、及びR121Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９１８】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK102U、K104U、R107U、R109U、R115U、及びR121Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９１９】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントNDPタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変
えるミューテイションの例は、T100Z、S101Z、L103Z、A105Z、L106Z、L108Z、C1
10Z、S111Z、G112Z、G113Z、M114Z、L116Z、T117Z、A118Z、T119Z、Y120Z、Y122
Z、I123Z、T100B、S101B、L103B、A105B、L106B、L108B、C110B、S111B、G112B
、G113B、M114B、L116B、T117B、A118B、T119B、Y120B、Y122B、及び I123Bを含
み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９２０】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、NDPを意図している。こ
れらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるNDPのβヘアピンル
ープ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプ
ター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、
NDPモノマーの1位〜42位、63位〜99位、及び124位〜133位からなる群から選択さ
れる位置で見出される。
【０９２１】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９２２】
【化３２】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、NDPのL1及び
L3βヘアピンループ構造、及びミュータントNDPモノマーを含む二量体タンパク
に対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０９２３】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのNDPについても意図し
ている。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因
子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したNDPを含む。
【０９２４】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖NDPアナログを含むミュータントNDPヘテロダイマーは機能上活性であり、
すなわち、NDPレセプター結合、NDPタンパクファミリーレセプターシグナル、及
び細胞外分泌のようなワイルドタイプNDPに関連する、1つ以上の官能活性を示す
ことができる。好ましくは、ミュータントNDPヘテロダイマー又は単鎖NDPアナロ
グは、好ましくはワイルドタイプNDPより大きいアフィニティーを有するNDPレセ
プターに結合することができる。また、そのようなミュータントNDPヘテロダイ
マー又は単鎖NDPアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好
ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖NDPア
ナログを含むミュータントNDPヘテロダイマーは、ワイルドタイプNDPより大きい
インビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプNDPより
長い血清半減期を有する。本発明のミュータントNDPヘテロダイマー及び単鎖NDP
アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテ
ストされることができる。
【０９２５】 ヒト成長分化因子-1(GDF-1)のミュータント ヒト成長分化因子-1(GDF-1)は、図37(SEQ ID No: 36)に示されるように、372
個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、
1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又
は挿入を含む、GDF-1のミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つ
のCKGFタンパクに結合したミュータントGDF-1を意図している。
【０９２６】 本発明は図37(SEQ ID NO: 36)に表されているように、ミュータントGDF-1に、
Cys残基を除いて、境界を含めて271位〜292位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有
するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換はR271X、L272X、Y273X、V27
4X、S275X、F276X、R277X、E278X、V279X、G280X、W281X、H282X、R283X、W284X
、V285X、I286X、A287X、P288X、R289X、G290X、F291X、及びL292Xを含む。“X
”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える。
【０９２７】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、GDF-1モノマー
のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対
応するだろう。GDF-1モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例はE278Bを含み、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９２８】 GDF-1モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入すること
もまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応す
る。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ
変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR271Z、R277Z、H282Z
、R283Z、及びR289Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９２９】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R271U、R277U、E278U、H282U、R283U、及びR289Uにおいて導入されることができ
、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９３０】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントGDF-1モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：L272Z、Y273Z、V274Z、S27
5Z、F276Z、V279Z、G280Z、W281Z、W284Z、V285Z、I286Z、A287Z、P288Z、G290Z
、F291Z、L292Z、L272B、Y273B、V274B、S275B、F276B、V279B、G280B、W281B、
W284B、V285B、I286B、A287B、P288B、G290B、F291B、及びL292B、ここで“Z”
は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９３１】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントGDF-1についても
述べられる。これらのミュータントタンパクは、図37(SEQ ID NO: 36)に描かれ
ているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて341位〜365
位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は
次を含む：R341X、L342X、S343X、P344X、I345X、S346X、V347X、L348X、F349X
、F350X、D351X、N352X、S353X、D354X、N355X、V356X、V357X、L358X、R359X、
Q360X、Y361X、E362X、D363X、M364X、及びV365X、ここで“X”はあらゆるアミ
ノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９３２】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をGDF-1 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、GD
F-1のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性ア
ミノ酸残基に対応する。塩基性残基がGDF-1に導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D351B、D354B、E362B、及びD363B、
ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９３３】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をGDF-1 L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の341
〜365の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応
する。そのようなミューテイションの具体例は、R341Z及びR359Zを含み、ここで
“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９３４】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR341 U、D351U、D354U、R359U、E362U、及びD363Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９３５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントGDF-1タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、L342Z、S343Z、P344Z、I345Z、S346Z、V347Z、
L348Z、F349Z、F350Z、N352Z、S353Z、N355Z、V356Z、V357Z、L358Z、Q360Z、Y3
61Z、M36Z、V365Z、L342B、S343B、P344B、I345B、S346B、V347B、L348B、F349B
、F350B、N352B、S353B、N355B、V356B、V357B、L358B、Q360B、Y361B、M36B、
及びV365Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸で
ある。
【０９３６】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、GDF-1を意図している。
これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるGDF-1のβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、GDF-1の1〜270、293〜340、及び366〜372からなる群から選択される位置で
見出される。
【０９３７】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９３８】
【化３３】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、GDF-1のL1及
びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントGDF-1モノマーを含む二量体タン
パクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０９３９】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのGDF-1についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したGDF-1を含む。
【０９４０】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖GDF-1アナログを含むミュータントGDF-1ヘテロダイマーは機能上活性であ
り、すなわち、GDF-1レセプター結合、GDF-1タンパクファミリーレセプターシグ
ナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプGDF-1に関連する、1つ以上の官能
活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントGDF-1ヘテロダイマー又は
単鎖GDF-1アナログは、好ましくはワイルドタイプGDF-1より大きいアフィニティ
ーを有するGDF-1レセプターに結合することができる。また、そのようなミュー
タントGDF-1ヘテロダイマー又は単鎖GDF-1アナログがシグナル伝達を引き起こす
ことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサ
ブユニット又は単鎖GDF-1アナログを含むミュータントGDF-1ヘテロダイマーは、
ワイルドタイプGDF-1より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性
を有し、ワイルドタイプGDF-1より長い血清半減期を有する。本発明のミュータ
ントGDF-1ヘテロダイマー及び単鎖GDF-1アナログは、該技術において知られてい
る処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０９４１】 ヒト成長分化因子-5前駆体(GDF-5前駆体)のミュータント ヒト成長分化因子-5前駆体(GDF-5前駆体)は、図38(SEQ ID No: 37)に示される
ように、501個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプGDF-5と比較
した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換
、削除又は挿入を含む、GDF-5前駆体のミュータントを意図している。さらに、
本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントGDF-5前駆体を意図して
いる。
【０９４２】 本発明は図38(SEQ ID NO: 37)に表されているように、ミュータントGDF-5前駆
体に、Cys残基を除いて、境界を含めて404位〜425位間に、1つ以上のアミノ酸置
換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：A404X、L
405X、H406X、V407X、N408X、F409X、K410X、D411X、M412X、G413X、W414X、D41
5X、D416X、W417X、I418X、I419X、A420X、P421X、L422X、E423X、Y424X、及びE
425X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性
を変える。
【０９４３】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、GDF-5前駆体のL
1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応す
るだろう。GDF-5前駆体配列へ塩基性残基が導入されるミューテイションを変え
る静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D411 B、D415B、D416B、E423B、及びE4
25B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９４４】 GDF-5前駆体配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することも
また熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応する
。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変
えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のH406Z及びK410Zの1つ以
上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９４５】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
H406U、K410U、D411U、D415U、D416U、E423U、及びE425Uにおいて導入されるこ
とができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９４６】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントGDF-5前駆体タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯び
た残基に変えるミューテイションの例は次を含む：A404Z、L405Z、V407Z、N408Z
、F409Z、M412Z、G413Z、W414Z、W417Z、I418Z、I419Z、A420Z、P421Z、L422Z、
Y424Z、A404B、L405B、V407B、N408B、F409B、M412B、G413B、W414B、W417B、I4
18B、I419B、A420B、P421B、L422B、及びY424B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、
及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９４７】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントGDF-5前駆体につ
いても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図38(SEQ ID NO: 37)に
描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて470位
〜494位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置
換は次を含む：T469X、R470X、L471X、S472X、P473X、I474X、S475X、I476X、L4
77X、F478X、I479X、D480X、S481X、A482X、N483X、N484X、V485X、V486X、Y487
X、K488X、Q489X、Y490X、E491X、D492X、M493X、及びV494X、ここで“X”はあ
らゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９４８】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をGDF-5前駆体L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例え
ば、GDF-5前駆体のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X
”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がGDF-5前駆体に導入されるミ
ューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D480B、E491B、
及びD492B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９４９】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をGDF-5前駆体L3ヘアピンループのアミノ
酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記
の470〜494の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸
に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R470Z及びK488Zを含み、
ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９５０】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR470U、D480U、K488U、E491U、及びD492Uで導入され
ることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９５１】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントGDF-5前駆体タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた
残基に変えるミューテイションの例は、L471Z、S472Z、P473Z、I474Z、S475Z、I
476Z、L477Z、F478Z、I479Z、S481Z、A482Z、N483Z、N484Z、V485Z、V486Z、Y48
7Z、Q489Z、Y490Z、M493Z、V494Z、L471B、S472B、P473B、I474B、S475B、I476B
、L477B、F478B、I479B、S481B、A482B、N483B、N484B、V485B、V486B、Y487B、
Q489B、Y490B、M493B、及びV494Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B
”は塩基性アミノ酸である。
【０９５２】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、GDF-5前駆体を意図して
いる。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるGDF-5前駆
体のβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティ
ーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミュ
ーテイションは、GDF-5前駆体の1〜403、426〜469、及び495〜501からなる群か
ら選択される位置で見出される。
【０９５３】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９５４】
【化３４】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、GDF-5前駆体
のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントGDF-5前駆体を含む二量体
タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加す
る。
【０９５５】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのGDF-5前駆体について
も意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノッ
ト成長因子又はそのような のフラクションに結合したGDF-5前駆体を含む。
【０９５６】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖GDF-5前駆体アナログを含むミュータントGDF-5前駆体ヘテロダイマーは機
能上活性であり、すなわち、GDF-5前駆体レセプター結合、GDF-5前駆体タンパク
ファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプGDF-5
前駆体に関連する、1つ以上の官能活性を示すことができる。好ましくは、ミュ
ータントGDF-5前駆体ヘテロダイマー又は単鎖GDF-5前駆体アナログは、好ましく
はワイルドタイプGDF-5前駆体より大きいアフィニティーを有するGDF-5前駆体レ
セプターに結合することができる。また、そのようなミュータントGDF-5前駆体
ヘテロダイマー又は単鎖GDF-5前駆体アナログがシグナル伝達を引き起こすこと
も好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユ
ニット又は単鎖GDF-5前駆体アナログを含むミュータントGDF-5前駆体ヘテロダイ
マーは、ワイルドタイプGDF-5前駆体より大きいインビトロ生物活性及び/又はイ
ンビボ生物活性を有し、ワイルドタイプGDF-5前駆体より長い血清半減期を有す
る。本発明のミュータントGDF-5前駆体ヘテロダイマー及び単鎖GDF-5前駆体アナ
ログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテスト
されることができる。
【０９５７】 ヒト成長分化因子-8(GDF-8)サブユニットのミュータント ヒト成長分化因子-8(GDF-8)サブユニットは、図39(SEQ ID No: 38)に示される
ように、375個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと
比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸
置換、削除又は挿入を含む、GDF-8サブユニットのミュータントを意図している
。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントGDF-8サブユ
ニットを意図している。
【０９５８】 本発明は図39(SEQ ID NO: 38)に表されているように、ミュータントGDF-8サブ
ユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて286位〜305位間に、1つ以上のアミ
ノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：L2
86X、T287X、V288X、D289X、F290X、E291X、A292X、F293X、G294X、W295X、D296
X、W297X、I298X、I299X、A300X、P301X、K302X、R303X、Y304X、及びK305X。“
X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変える
。
【０９５９】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、GDF-8サブユニ
ットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミ
ノ酸残基に対応するだろう。GDF-8サブユニットモノマーへ塩基性残基が導入さ
れるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D289B、E2
91B、及びD296B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９６０】 GDF-8サブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を
導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミ
ノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をよ
り負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のK302Z、R
303Z、及びK305Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９６１】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D289U、E291 U、D296U、K302U、R303U、及びK305Uにおいて導入されることがで
き、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９６２】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントGDF-8サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残
基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：L286Z、T287Z
、V288Z、F290Z、A292Z、F293Z、G294Z、W295Z、W297Z、I298Z、I299Z、A300Z、
P301Z、Y304Z、L286B、T287B、V288B、F290B、A292B、F293B、G294B、W295B、W2
97B、I298B、I299B、A300B、P301B、及びY304B、ここで“Z”は酸性アミノ酸、
及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９６３】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントGDF-8サブユニッ
トについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図39(SEQ ID NO:
38)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて
344位〜368位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミ
ノ酸置換は次を含む：K344X、M345X、S346X、P347X、I348X、N349X、M350X、L35
1X、Y352X、F353X、N354X、G355X、K356X、E357X、Q358X、I359X、I360X、Y361X
、G362X、K363X、I364X、P365X、A366X、M367X、及びV368X、ここで“X”はあら
ゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９６４】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をGDF-8サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む
。例えば、GDF-8サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配
列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がGDF-8サブユニ
ットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例はE357Bを含み、こ
こで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９６５】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をGDF-8サブユニットL3ヘアピンループの
アミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸
は上記の344及び368の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性
アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K344Z、K356Z、
及びK363Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９６６】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK344U、K356U、E357U、及びK363U導入されることが
でき、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９６７】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントGDF-8サブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を
帯びた残基に変えるミューテイションの例は、M345Z、S346Z、P347Z、I348Z、N3
49Z、M350Z、L351Z、Y352Z、F353Z、N354Z、G355Z、Q358Z、I359Z、I360Z、Y361
Z、G362Z、I364Z、P365Z、A366Z、M367Z、V368Z、M345B、S346B、P347B、I348B
、N349B、M350B、L351B、Y352B、F353B、N354B、G355B、Q358B、I359B、I360B、
Y361B、G362B、I364B、P365B、A366B、M367B、及びV368Bを含み、ここで、“Z”
は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９６８】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、GDF-8サブユニットを意
図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるGDF-
8サブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対する
アフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。
これらのミューテイションは、GDF-8サブユニットモノマーの1位〜285位、306位
〜343位、及び369位〜375位からなる群から選択される位置で見出される。
【０９６９】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９７０】
【化３５】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、GDF-8サブユ
ニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントGDF-8サブユニット
モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の
静電相互作用が増加する。
【０９７１】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのGDF-8サブユニットに
ついても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチ
ンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したGDF-8サブ
ユニットを含む。
【０９７２】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖GDF-8サブユニットアナログを含むミュータントGDF-8サブユニットヘテロ
ダイマーは機能上活性であり、すなわち、GDF-8サブユニットレセプター結合、G
DF-8サブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のよ
うなワイルドタイプGDF-8サブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すこ
とができる。好ましくは、ミュータントGDF-8サブユニットヘテロダイマー又は
単鎖GDF-8サブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプGDF-8サブユニッ
トより大きいアフィニティーを有するGDF-8サブユニットレセプターに結合する
ことができる。また、そのようなミュータントGDF-8サブユニットヘテロダイマ
ー又は単鎖GDF-8サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ま
しい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット
又は単鎖GDF-8サブユニットアナログを含むミュータントGDF-8サブユニットヘテ
ロダイマーは、ワイルドタイプGDF-8サブユニットより大きいインビトロ生物活
性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプGDF-8サブユニットより長
い血清半減期を有する。本発明のミュータントGDF-8サブユニットヘテロダイマ
ー及び単鎖GDF-8サブユニットアナログは、該技術において知られている処置に
より、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０９７３】 ヒト成長分化因子-9(GDF-9)サブユニットのミュータント ヒト成長分化因子-9(GDF-9)サブユニットは、図40(SEQ ID No: 39)に示される
ように、454個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと
比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸
置換、削除又は挿入を含む、GDF-9のミュータントを意図している。さらに、本
発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントGDF-9を意図している。
【０９７４】 本発明は図40(SEQ ID NO: 39)に表されているように、ミュータントGDF-9に、
Cys残基を除いて、境界を含めて357位〜378位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有
するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：D357X、F358X、
R359X、L360X、S361X、F362X、S363X、Q364X、L365X、K366X、W367X、D368X、N3
69X、W370X、I371X、V372X、A373X、P374X、H375X、R376X、Y377X、及びN378X。
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変え
る。
【０９７５】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、GDF-9モノマー
のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対
応するだろう。GDF-9モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D357B及びD368B、ここで“B”は塩基
性アミノ酸残基である。
【０９７６】 GDF-9モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入すること
もまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応す
る。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ
変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR359Z、K366Z、H375Z
、及びR376Zの1つ以上を含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９７７】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
D357U、R359U、K366U、D368U、H375U、及びR376Uにおいて導入されることができ
、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９７８】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントGDF-9モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯
びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F358Z、L360Z、S361Z、F36
2Z、S363Z、Q364Z、L365Z、W367Z、N369Z、W370Z、I371Z、V372Z、A373Z、P374Z
、Y377Z、N378Z、F358B、L360B、S361B、F362B、S363B、Q364B、L365B、W367B、
N369B、W370B、I371B、V372B、A373B、P374B、Y377B、及びN378B、ここで“Z”
は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９７９】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントGDF-9についても
述べられる。これらのミュータントタンパクは、図40(SEQ ID NO: 39)に描かれ
ているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて423位〜447
位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は
次を含む：K423X、Y424X、S425X、P426X、L427X、S428X、V429X、L430X、T431X
、I432X、E433X、P434X、X、D435X、G436X、S437X、I438X、A439X、Y440X、K441
X、E442X、Y443X、E444X、D445X、M446X、及びI447X、ここで“X”はあらゆるア
ミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９８０】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をGDF-9 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、GD
F-9のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性ア
ミノ酸残基に対応する。塩基性残基がGDF-9に導入されるミューテイションを変
える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E433B、D435B、E442B、及びE444B、
ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９８１】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をGDF-9 L3ヘアピンループのアミノ酸配
列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の423
〜447の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応
する。そのようなミューテイションの具体例は、K423Z及びK441Zを含み、ここで
“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９８２】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はK423U、E433U、D435U、K441 U、E442U、E444U、及び
D445U導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９８３】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントGDF-9タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に
変えるミューテイションの例は、Y424Z、S425Z、P426Z、L427Z、S428Z、V429Z、
L430Z、T431Z、I432Z、P434Z、G436Z、S437Z、I438Z、A439Z、Y440Z、Y443Z、M4
46Z、I447Z、Y424B、S425B、P426B、L427B、S428B、V429B、L430B、T431B、I432
B、P434B、G436B、S437B、I438B、A439B、Y440B、Y443B、M446B、及びI447Bを含
み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９８４】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、GDF-9を意図している。
これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるGDF-9のβヘアピ
ンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレ
セプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイション
は、GDF-9モノマーの1位〜356位、379位〜422位、及び448位〜454位からなる群
から選択される位置で見出される。
【０９８５】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【０９８６】
【化３６】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、GDF-9のL1及
びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントGDF-9モノマーを含む二量体タン
パクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０９８７】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのGDF-9についても意図
している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長
因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したGDF-9を含む。
【０９８８】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖GDF-9アナログを含むミュータントGDF-9ヘテロダイマーは機能上活性であ
り、すなわち、GDF-9レセプター結合、GDF-9タンパクファミリーレセプターシグ
ナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプGDF-9に関連する、1つ以上の官能
活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントGDF-9ヘテロダイマー又は
単鎖GDF-9アナログは、好ましくはワイルドタイプGDF-9より大きいアフィニティ
ーを有するGDF-9レセプターに結合することができる。また、そのようなミュー
タントGDF-9ヘテロダイマー又は単鎖GDF-9アナログがシグナル伝達を引き起こす
ことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサ
ブユニット又は単鎖GDF-9アナログを含むミュータントGDF-9ヘテロダイマーは、
ワイルドタイプGDF-9より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性
を有し、ワイルドタイプGDF-9より長い血清半減期を有する。本発明のミュータ
ントGDF-9ヘテロダイマー及び単鎖GDF-9アナログは、該技術において知られてい
る処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０９８９】 ヒトアーテミン(artemin)/グリア細胞由来の神経栄養因子(GDNF)のミュータン ト ヒトアーテミン(artemin)/グリア細胞由来の神経栄養因子(GDNF)は、図41(SEQ ID No: 40)に示されるように、337個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイ
ルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1
つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は挿入を含む、ヒトアーテミン(GDNF)のミュ
ータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合した
ミュータントヒトアーテミン(GDNF)を意図している。
【０９９０】 本発明は図41(SEQ ID NO: 40)に表されているように、ミュータントヒトアー
テミン(GDNF)に、Cys残基を除いて、境界を含めて144位〜163位間に、1つ以上の
アミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む
：S144X、Q145X、L146X、V147X、P148X、V149X、R150X、A151X、L152X、G153X、
L154X、G155X、H156X、R157X、S158X、D159X、E160X、L161X、V162X、及びR163X
。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアループの静電特性を変
える。
【０９９１】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトアーテミン
(GDNF)モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性ア
ミノ酸残基に対応するだろう。ヒトアーテミン(GDNF)モノマーへ塩基性残基が導
入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D159B
及びE160B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【０９９２】 ヒトアーテミン(GDNF)モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基
を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性ア
ミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性を
より負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以
上を含む：R150Z、H156Z、R157Z、及びR163Z、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基
である。
【０９９３】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
R150U、H156U、R157U、D159U、E160U、及び R163Uにおいて導入されることがで
き、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９９４】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトアーテミン(GDNF)モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸
残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S144Z、Q14
5Z、L146Z、V147Z、P148Z、V149Z、A151Z、L152Z、G153Z、L154Z、G155Z、S518Z
、L161Z、V162Z、S144B、Q145B、L146B、V147B、P148B、V149B、A151B、L152B、
G153B、L154B、G155B、S518B、L161B、及びV162B、ここで“Z”は酸性アミノ酸
、及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【０９９５】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトアーテミン(G
DNF)についても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図41(SEQ ID NO
: 40)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含め
て209位〜229位間に、1つ以上のアミノ酸置換、削除、又は挿入を有する。該ア
ミノ酸置換は次を含む：R209X、Y210X、E211X、A212X、V213X、S214X、F215X、M
216X、D217X、V218X、N219X、S220X、T221X、W222X、R223X、T224X、V225X、D22
6X、R227X、L228X、及びS229X、ここで“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、そ
の置換はL3ループの静電特性を変える。
【０９９６】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトアーテミン(GDNF)L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含
む。例えば、ヒトアーテミン(GDNF)のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記
の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がヒトアー
テミン(GDNF)に導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ
以上を含む：E211B、D217B、及びD226B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基であ
る。
【０９９７】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトアーテミン(GDNF) L3ヘアピンルー
プのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミ
ノ酸は上記の209〜229の配列に導入されることができ、ここで可変の“X”は酸
性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R209Z、R223Z
、及びR227Zを含み、ここで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【０９９８】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基はR209U、E211U、D217U、R223U、D226U、及びR227Uで
導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【０９９９】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトアーテミン(GDNF)タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷
を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、Y210Z、A212Z、V213Z、S214Z、
F215Z、M216Z、V218Z、N219Z、S220Z、T221Z、W222Z、T224Z、V225Z、L228Z、S2
29Z、Y210B、A212B、V213B、S214B、F215B、M216B、V218B、N219B、S220B、T221
B、W222B、T224B、V225B、L228B、及びS229Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミ
ノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【１０００】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトアーテミン(GDNF)を
意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるヒ
トアーテミン(GDNF)のβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対
するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、ヒトアーテミン(GDNF)モノマーの1位〜143位
、164位〜208位、及び230位〜237位からなる群から選択される位置で見出される
。
【１００１】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【１００２】
【化３７】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトアーテ
ミン(GDNF)のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトアーテミン
(GDNF)モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプタ
ー間の静電相互作用が増加する。
【１００３】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトアーテミン(GDNF)
についても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシス
チンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合した
ヒトアーテミン(GDNF)を含む。
【１００４】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトアーテミン(GDNF)アナログを含むミュータントヒトアーテミン(GDNF)
ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトアーテミン(GDNF)レセプタ
ー結合、ヒトアーテミン(GDNF)タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細
胞外分泌のようなワイルドタイプヒトアーテミン(GDNF)に関連する、1つ以上の
官能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒトアーテミン(GDNF)
ヘテロダイマー又は単鎖ヒトアーテミン(GDNF)アナログは、好ましくはワイルド
タイプヒトアーテミン(GDNF)より大きいアフィニティーを有するヒトアーテミン
(GDNF)レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒト
アーテミン(GDNF)ヘテロダイマー又は単鎖ヒトアーテミン(GDNF)アナログがシグ
ナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも
1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトアーテミン(GDNF)アナログを含む
ミュータントヒトアーテミン(GDNF)ヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトアー
テミン(GDNF)より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し
、ワイルドタイプヒトアーテミン(GDNF)より長い血清半減期を有する。本発明の
ミュータントヒトアーテミン(GDNF)ヘテロダイマー及び単鎖ヒトアーテミン(GDN
F)アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対して
テストされることができる。
【１００５】 ヒトグリア細胞由来の因子(GDNF)/パーセフィン(Persephin)サブユニットのミ ュータント ヒトグリア細胞由来の神経栄養因子 (GDNF)/パーセフィン(Persephin)サブユ
ニットは、図42(SEQ ID No: 41)に示されるように、156個のアミノ酸を含んでい
る。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多
いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、削除又は挿入を含む、ヒトグリ
ア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットのミュータントを意図して
いる。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトグ
リア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットを意図している。
【１００６】 本発明は図42(SEQ ID NO: 41)に表されているように、ミュータントヒトグリ
ア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットに、Cys残基を除いて、境
界を含めて70位〜89位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループ
を提供する。該アミノ酸置換は次を含む：S70X、L71X、T72X、L73X、S74X、V75X
、A76X、E77X、L78X、G79X、L80X、G81X、Y82X、A83X、S84X、E85X、E86X、K87X
、V88X、及びI89X。“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアルー
プの静電特性を変える。
【１００７】 本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩
基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトグリア細胞
由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットモノマー(subunitmonomer)のL1ル
ープに塩基性残基を導入する時、可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する
だろう。ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットモノマー
(subunitmonomer)へ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の
具体例は次の1つ以上を含む：E77B、E85B、及びE86B、ここで“B”は塩基性アミ
ノ酸残基である。
【１００８】 ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットモノマー(subun
itmonomer)配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた
熟考される。この具体例において、可変の“X”は酸性アミノ酸に対応する。こ
れらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変える
ように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：K87Z、ここ
で“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【１００９】 本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘ
アピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例
えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸に対応する上記の
L1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基は
E77U、E85U、E86U、及びK87Uにおいて導入されることができ、ここで“U”は中
性アミノ酸である。
【１０１０】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミ
ュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットモノマ
ー(subunitmonomer)タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残
基に変えるミューテイションの例はS70Z、L71Z、T72Z、L73Z、S74Z、V75Z、A76Z
、L78Z、G79Z、L80Z、G81Z、Y82Z、A83Z、S84Z、V88Z、I89Z、S70B、L71B、T72B
、L73B、S74B、V75B、A76B、L78B、G79B、L80B、G81B、Y82B、A83B、S84B、V88B
、及びI89Bを含み、ここで、“Z”は酸性アミノ酸、及び“B”は塩基性アミノ酸
である。
【１０１１】 L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトグリア細胞由
来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットについても述べられる。これらのミ
ュータントタンパクは、図42(SEQ ID NO: 41)に描かれているように、Cys残基を
除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて128位〜148位間に、1つ以上のアミノ
酸置換、削除、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：R128X、Y129X、
T130X、D131X、V132X、A133X、F134X、L135X、D136X、D137X、R138X、H139X、R1
40X、W141X、Q142X、R143X、L144X、P145X、Q146X、L147X、及びS148X、ここで
“X”はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える
。
【１０１２】 L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸
残基をヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットL3(subunit
L3)ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ヒトグリア細
胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入
する時、上記の配列の可変の“X”は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残
基がヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットに導入される
ミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D131B、D136B
、及びD137B、ここで“B”は塩基性アミノ酸残基である。
【１０１３】 本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パ
ーセフィンサブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図
している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の128〜148の配列に導入され
ることができ、ここで可変の“X”は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミュ
ーテイションの具体例は、R128Z、R138Z、H139Z、R140Z、及びR143Zを含み、こ
こで“Z”は酸性アミノ酸残基である。
【１０１４】 本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲にお
いて電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても
意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の“X”が中性アミノ酸
に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例
えば、1つ以上の中性残基は、R128U、D131U、D136U、D137U、R138U、H139U、R14
0U、及びR143Uで導入されることができ、ここで“U”は中性アミノ酸である。
【１０１５】 非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンルー
プアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュ
ータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットタンパク
(subunitprotein)は提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える
ミューテイションの例は、Y129Z、T130Z、V132Z、A133Z、F134Z、L135Z、W141Z
、Q142Z、L144Z、P145Z、Q146Z、L147Z、S148Z、Y129B、T130B、V132B、A133B、
F134B、L135B、W141B、Q142B、L144B、P145B、Q146B、L147B、及びS148Bを含み
、ここで、“Z”は酸性アミノ酸及び“B”は塩基性アミノ酸である。
【１０１６】 本発明はまた、βヘアピンループの他に、それらのヘアピンループの構造又は
コンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトグリア細胞由来の因
子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットを意図している。これらの構造的変化は、
言いかえると、二量体分子に含まれるヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセ
フィンサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対
するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働
く。これらのミューテイションは、ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフ
ィンサブユニットモノマー(subunitmonomer)の1位〜69位、90位〜127位、及び14
9位〜156位からなる群から選択される位置で見出される。
【１０１７】 βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は
、
【１０１８】
【化３８】 を含む。可変の“J”はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトグリア
細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ
構造、及びミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユ
ニットモノマー(subunitmonomer)を含む二量体タンパクに対するアフィニティー
を有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【１０１９】 本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトグリア細胞由来の
因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットについても意図している。これらのモデ
ィファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのよ
うなモノマーのフラクションに結合したヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パー
セフィンサブユニットを含む。
【１０２０】 具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のよう
な単鎖ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットアナログを
含むミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニット
ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトグリア細胞由来の因子 (GD
NF)/パーセフィンサブユニットレセプター結合、ヒトグリア細胞由来の因子 (GD
NF)/パーセフィンサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細
胞外分泌のようなワイルドタイプヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィ
ンサブユニットに関連する、1つ以上の官能活性を示すことができる。好ましく
は、ミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニット
ヘテロダイマー又は単鎖ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユ
ニットアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF
)/パーセフィンサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトグリア細胞
由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットレセプターに結合することができ
る。また、そのようなミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフ
ィンサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パ
ーセフィンサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。
最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単
鎖ヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットアナログを含む
ミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットヘテ
ロダイマーは、ワイルドタイプヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィン
サブユニットより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し
、ワイルドタイプヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニット
より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトグリア細胞由来の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトグリア細胞由来
の因子 (GDNF)/パーセフィンサブユニットアナログは、該技術において知られて
いる処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。ミュータント腫瘍成長因子βファミリータンパク及びアナログをコードするポリ ヌクレオチド 本発明はまた、本発明のヒト腫瘍成長因子β（TGF）ファミリータンパクおよ
びTGFファミリータンパクアナログをコードする配列を含む核酸分子であって、
その配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組
み合わせを含み、これによって野生型タンパクと比べて一個又は複数のアミノ酸
付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリー
ディングフレームを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここ
では、２個のコード領域が融合されている場合には、核酸分子の３’末端が他の
核酸分子の５’（又はペプチドリンカーをエンコードする核酸を介して）末端に
連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他
に進行する。
【１０２１】 遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための
同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施にお
いて使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を
配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変
化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌク
レオチド配列を含む。
【１０２２】 １実施形態においては、本発明は、TGFファミリータンパクサブユニットをコ
ードする配列を含む核酸分子であって、該TGFファミリータンパクサブユニット
が、好ましくは標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその
近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含む核酸分子を提供する。本発明
はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこ
れらのループとTGFファミリータンパクダイマーの同族体レセプターとの間の静
電相互作用が高められた、ミュータントTGFファミリータンパクサブユニットを
コードする核酸分子をも提供する。本発明は更に、好ましくはTGFファミリータ
ンパクサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置
し、及び／又は別のCKGFタンパクに共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換
を含むミュータントTGFファミリータンパクサブユニットをコードする配列を含
む核酸分子を提供する。
【１０２３】 更に別の実施形態において、本発明は、TGFファミリータンパクアナログをコ
ードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含
むミュータントTGFファミリータンパクサブユニットのコード領域は、野生型サ
ブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマ
ーユニットのコード領域と融合している。更に本発明は、ミュータントTGFファ
ミリータンパクサブユニットモノマーのカルボキシル末端が、別のCKGFタンパク
のアミノ末端に結合している、単鎖TGFファミリータンパクサブユニットアナロ
グをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様においては、該核酸分子
は単鎖TGFファミリータンパクサブユニットアナログをコードし、ここでミュー
タントTGFファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端
のような別のCKGFタンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸
配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントTGFファミリー
タンパクモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【１０２４】 本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、TGFファミ
リータンパクのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを公知の方法
で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製する
ことができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザ
ーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。ミュータントTGFファミリータンパクサブユニット及びアナログの作製 本発明のミュータントTGFファミリータンパク、ミュータントTGFファミリータ
ンパクヘテロダイマー、TGFファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これ
らの誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的
な実施形態としては、ミュータントサブユニット又はTGFファミリータンパクア
ナログは融合タンパクであり、これに限定はされないが例えばミュータントTGF
ファミリータンパクサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパク質又はそのフラグメ
ントを含むか、或いは二つのミュータント神経成長サブユニットを含む。一つの
実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないがリ
シン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列に
フレーム内で結合した、ミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸
の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディ
ングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうし
を公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによ
って作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチド
シンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によって作製できる。ミュータ
ントα及び／又はβサブユニットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード
配列と融合したミュータントTGFファミリータンパクサブユニット部分を含むキ
メラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施形態は、好ましくは二つのミュータン
ト間にペプチドリンカーを介して、別のミュータントTGFファミリータンパクサ
ブユニットと融合したミュータントTGFファミリータンパクサブユニットを含む
単鎖アナログに関するものである。ミュータントTGFファミリータンパクサブユニットの構造及び機能解析 ここに示すのは、ミュータントTGFファミリータンパクサブユニット、ミュー
タントヘテロダイマー及びTGFファミリータンパクアナログの構造決定方法、及
び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解析方法である。
【１０２５】 ひとたびミュータントTGFファミリータンパクサブユニットが確認されれば、
クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズ排除カ
ラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタ
ンパク精製のためのどのような他の標準的な方法によっても、単離及び精製する
ことができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）
を用いて評価できる。
【１０２６】 或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントTGFファミリータンパクサ
ブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば
自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によ
って決定できる。
【１０２７】 ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特徴付けることができる。親
水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコ
ードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【１０２８】 二次的な構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）
も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる
。
【１０２９】 他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engs
tom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)及びコンピューターモデリング
（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Mole
cular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ
、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ ｖ．
３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国)等の当業界で利用できるコ
ンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、
構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【１０３０】 ミュータントTGFファミリータンパクサブユニット、ミュータントTGFファミリ
ータンパクヘテロダイマー、TGFファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、
これらの誘導体及びフラグメントも、各種の公知の方法で分析することができる
。
【１０３１】 例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントTGFファミリータンパク
について、抗体に結合するために野生型TGFファミリータンパク又はそのサブユ
ニットと結合又は競合する能力を評価する場合には、公知の各種イムノアッセイ
法を用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、イム
ノ放射線アッセイ、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、インジツ（in sit
u）イムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素又は放射線同位体ラベルを用
いた）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセ
イ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、蛍光抗体アッセイ、タンパクＡア
ッセイ、及び電気泳動イムノアッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッ
セイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することによ
り検出できる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特
に二次結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセ
イで結合性を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは
本発明の範囲に含まれる。
【１０３２】 ミュータントTGFファミリータンパクサブユニット、ミュータントTGFファミリ
ータンパクヘテロダイマー、TGFファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、
これらの誘導体及びフラグメントのTGFファミリータンパクレセプターへの結合
は、限定されないが、例えばTGFファミリータンパクレセプターからウシTGFファ
ミリータンパクのような他の種の放射線TGFファミリータンパクへの置換に基づ
くインビトロアッセイ等、該技術分野で周知の方法によって決定できる。ミュー
タントTGFファミリータンパクヘテロダイマー、TGFファミリータンパクアナログ
、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、ミュータ
ントTGFタンパクの機能を決定するために当業者に知られている種々のバイオア
ッセイにより測定できる。例えば上記説明したアンドロゲン代謝バイオアッセイ
も、ミュータントTGF-βタンパクを定めるために用いることができる。TGF-βラジオレセプターアッセイ 変異型TGF-βタンパクの生物活性と野生型タンパクの生物活性とを比較するた
めに、TGF-βラジオレセプターアッセイを行った。測定は、以前にTaylorらによ
ってBiochim.Biophys.Acta,442:324〜330（1976）において説明されているよう
にしてAKR-2B（clone 84A）細胞を用いて行った。簡単に説明すると、変異型及
び野生型TGF-βタンパクは、FrolikらによりJ.Biol.Chem.,259:10995-11000(198
4)において説明されている修正クロラミン-T法を用いて放射標識した（比活性＝
2.3×108cpm／μg）。非特異的結合性はラベルしていないTGF-β野生型タンパク
を150倍過剰に存在させた状態で測定した。ソフトアガーアッセイ ソフトアガーアッセイは、野生型分子との比較における変異型TGFファミリー
タンパクの生物活性を評価する目的で、AKR-2B（clone 84A）細胞のソフトアガ
ーにおけるコロニーの成長を刺激するため、変異型又は野生型TGF-βタンパクを
含む培地の濃縮物を用いて行った。コロニーは２週間成長させ、直径が50μmよ
り大きいコロニーの数を、Bausch and Lomb Omnicon（Rochester,NY）コロニ
ーカウンターを用いて測定した。形質転換していないAKR-2B（clone 84A）細胞
は、MosesらによりCancer Res.,38:2807〜2812（1978）において説明されてい
る胚性間充織細胞由来のマウス繊維芽細胞系列からのものである。これらの細胞
はソフトアガーアッセイおよびラジオレセプターアッセイの双方におけるインジ
ケーターとして用いた。[3H]チミジン取り込みアッセイ チミジン取り込みアッセイは、以前にShipleyらによりCan Res.,44:710〜716
（1984）において説明されているようにして行う。このアッセイは、種々の再刺
激条件下で、血清欠乏状態の休止AKR-2B細胞を用いて行う。これらの条件は、[3 H]チミジンおよび種々の野生型及び変異型TGF-βタンパクの存在下でAKR-2B細胞
を増殖させることを含む。ラベルした塩基の取り込みは、この技術分野で周知の
標準テクニックを用いて測定し、TGF-β刺激の結果のDNA合成を反映する。内皮細胞の成長 ウシ肺胞動脈内皮細胞は、メディウム199および5％FBS（GIBCO）、5％ Nu-se
rum（Collaborative Research, Inc., Lexington, MA）、1％ Ｌ−グルタ
ミン、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したDu
lbeccoの修飾エッセンシャル培地を1:1で混合した基本培地中で、以前にRyanら
によりTissue Cell,10:535〜554（1984）において説明され、またMeyrickらに
よりJ.Cell.Physiol.,138：165〜174（1988）において説明されている方法を用
いて増殖させる。細胞は、形態、アンジオテンシン転換酵素活性の存在、アセチ
ル化された低密度リポプロテインの結合性および因子VIII関連抗原の存
在により内皮細胞であることを証明する。アッセイにおいては、５〜２０継代培
養した細胞を用いる。
【１０３３】 内皮細胞は穏和なトリプシン処理により除去され、24ウェルプレートを用いて
、10％FBSを含むmedium199中に、１ウェル当たり5,000〜10,000個の密度で播種
される。24時間後、培地を除去し、細胞に実験培地を加える。実験培地は野生型
及び変異型TGF-βタンパクを種々の濃度で含む。ウェル内のトリプシン処理後の
細胞をCourterカウンターを用いてカウントする。細胞数は、実験培地を添加す
る前および２または３日間隔で測定する。細胞数を、野生型及び変異型TGF-β刺
激サンプル間で比較する。ニューチュリン（Neurturin）バイオアッセイシステム ニューチュリン（Neurturin）は神経および連結された神経の形成とグリアプ
ロセスを促進することが知られている。以下に説明するアッセイは、本発明によ
り説明される変異型ニューチュリンタンパクの生物活性を分析するために、野生
型ニューチュリンのこの生物活性および他の生物活性を利用する。このアッセイ
は、グリア細胞由来の神経栄養性ファクター（GDNF）ミュータントの生物活性の
分析にも利用できる。
【１０３４】 １実施形態において、ニューチュリンバイオアッセイは、主な培養細胞を野生
型ニューチュリンタンパクまたは本発明の変異型ニューチュリンタンパクで処理
すること、および、これらのタンパクの細胞増殖への影響を測定することからな
る。主な培養系は、HeuckerothらによりDev.Biol.,200:116〜129（1998）におい
て説明されている方法に従って調製する。
【１０３５】 簡潔に説明すると、妊娠したSpraque-Dawleyラットから胎児を得て、小腸及び
大腸を含み、胃および膵臓は含まない胎児腸サンプルを胎児から摘出する。次い
で、腸サンプルをディスパーゼ（dispase）（1mg/ml）およびコラゲナーゼ（1mg
/ml）で消化する。シングルセル懸濁液は磨いたガラスピペットを用いて粉砕す
ることにより得られる。粉砕した細胞を37℃で10分間培養し、次いで、死細胞を
破壊するために、穏和にミキシングすることにより集める。細胞懸濁液はナイロ
ンメッシュを通すことにより濾過し、トリパンブルー染色細胞を血球計測器によ
り計測する。次いで、細胞を50％DME、50％ F12、ウシインスリン(5μg/ml)、
ラットトランスフェリン(10μg/ml)、20nMプロゲステロン、セレン酸ナトリウム
（Na2SeO3, 30nM）、プトレシンジヒドロクロライド(100μM)、ウシ血清アルブ
ミン分画Ｖ(1mg/ml)およびフェチュイン(0.1mg/ml)を含む修正N2培地中で成長さ
せる。培養細胞は、ポリ-D-リジン（0.1mg/ml）に次いでマウスラミニン(20μg/
ml)をコートした８ウェルチャンバースライド上で成長させる。次いで、スライ
ドを10％胎児ウシ血清を含むL15培地で洗浄し、乾燥させた。典型的には、８ウ
ェルチャンバースライドの１ウェル(1cm2)当たりに、10,000個のトリパンブルー
排除された細胞を播種する。細胞を確実に均一に分配するように気を付ける。Br
du/Ret 二重ラベリング試験のために、ウェル当たり30,000個のトリパンブルー
排除細胞を入れ、未処理の培地およびパーセフィン（persephin）処理した培地
中にRet発現細胞を、少なくともウェル当たり100個まで増加させる。30分間かけ
て細胞をスライドに付着させた後、200μlの培地を野生型または変異型ニュー
チュリンタンパクとともに加える。細胞は、5%のCO2を含む加湿した組織培養器
内で37℃で成長させる。培地は、半分を除去して新しい培地を加えることにより
、2〜3日ごとに入れ替える。細胞数は、DAB染色したスライド上で、カウンティ
ンググリッドを用い、２０倍の倍率の対物レンズの下で目視により計測する。ス
ライドは、数値でコードされているため、各計測細胞の処理条件は分からない。
各ウェル内の全ての免疫染色された細胞を数えた。ウェル当たりのRetポジティ
ブ細胞の割合を決定するために、８ウェルテャンバースライドの各ウェル内の、
全てのRet発現細胞数および全細胞数を計測する。ブロモデオキシウリジン／Ret二重蛍光抗体法 ラット腸由来の細胞を、上記説明したようにして８ウェルチャンバープレート
上に播種する。接種後、3、24、48、72時間後または5日後に、培養細胞にブロモ
デオキシウリジン（最終濃度10μmol/l）を添加する。ブロモデオキシウリジン
に曝してから26時間後に、培養系をPBSで3回洗浄し、固定する（70%エタノール
、30％ 50mMグリシン、pH2、-20℃で20分間の条件）。Ret蛍光抗体シグナルを
、Ret抗体とともに4℃で終夜培養し、次いで、ビオチンに結合させたヤギの抗ウ
サギ二次抗体とともに培養し、さらにTSA間接キットを製造者の指示に従って用
いてシグナルを増幅させることにより検出する。ブロモデオキシウリジン(Brdu)
の取り込みは、マウス抗ブロモデオキシウリジン一次抗体およびヤギの抗マウス
Cy3二次抗体とともに同じスライド上で検出する。C-Ret発現細胞へのBrduの取り
込みを検出するために、Retをフルオレセイン イソシアネート（FITC）シグナ
ルとして検出する。各Ret発現細胞について、26時間標識期間中にBrduを取り込
んだRet＋細胞の割合を計算するために、核のCy3染色性を決定する。ウェル当た
り100個の細胞を調べる。ブロモデオキシウリジン／GFAP二重蛍光抗体法 培養系の細胞は、要素を追加して若しくは追加せず、又は100ng/mlのGDNF、ニ
ューチュリン又はパーセフィンとともに８ウェルチャンバースライド中で5日間
成長させる。培地は、48〜72時間後に培地の半分を除去し、新しい培地を加える
ことにより入れ替える。培養開始5日目に、Brdu（最終濃度10μmol/l）を添加し
、固定（70％エタノール／30％ 50mMグリシン、pH2、20℃で20分間の条件）の
前にさらに26時間培養する。製造者の指示に従いTSA間接キットを用いることに
より増幅した後、GFAP染色を検出する。GFAP発現細胞上に沈殿したビオチンを検
出するために、ストレプトアビジン−FITCを用いる。Cy3結合二次抗体を用いて
、Brduの取り込みを検出する。細胞について、最初に、蛍光顕微鏡の下でGFAPの
発現を調べる。GFAP発現細胞へのBrduの取り込みは、各条件（ウェル当たり100
細胞、8ウェル、２回実験）につき合計800個の細胞について決定する。ビスベンズイミド／Ret二重染色および凝縮された核の定量 腸の神経培養細胞を、上記説明したようにして100ng/mlのGDNFの存在下または
非存在下で、72時間成長させる。次いで、細胞を、25℃で30分間、4％パラホル
ムアルデヒドを含むPBSで処理することにより固定する。スライドは、上記説明
したようにして、Ret抗体とともに培養し、次いでCy3結合二次抗体とともに培養
する。PBSで洗浄した後、スライドを、1μg/mlの2'-(4-ヒドロキシフェニル)-5-
(4-メチル-1-ピペラジニル)-2,5-ビ-1H-ビスベンズイミダゾール トリヒドロク
ロライド ペンタヒドレイト（ビスベンズイミド、Hoecht 33258,Molecular P
robes, Eugene OR）を含むPBSとともに、25℃で1時間培養する。スライドは、
PBSで洗浄し、載置し、Ret発現細胞を同定するためにCy3フルオレセインを調べ
、核のビスベンズイミド染色を見るために紫外線を照射して調べる。GDNF存在下
又は非存在下で、ハイパワーフィールドをランダムに選択したRet発現細胞につ
いて、染色細胞の核凝縮性を調べる。これらの各アッセイの例は、Heuckerothら
によりDev.Biol.,200:116〜129（1998）において説明されている。インヒビンおよびアクチビン TGF-βファミリーは、タンパクのインヒビンファミリー（例えばインヒビンA
およびインヒビンB）およびアクチビンファミリー（例えばアクチビンA、アクチ
ビンB、アクチビンABおよびアクチビンBB）を包含する。最初の培養におけるTGF
ヒト陰嚢皮膚繊維芽細胞を、５αレダクターゼ（5αR）の強力な誘導剤であるTG
F-βタンパクの生物活性を測定するために用いる。インヒビンおよびアクチビン
もまた5αRの誘導剤であるため、このシステムは、インヒビンおよびアクチビン
の生物活性を測定するためにも用いられる。
【１０３６】 アッセイを行うために、両方の精管を切除した健康な男性からヒト陰嚢皮膚を
得る。ヒト陰嚢皮膚の生検標本は、皮下脂肪を除去して清浄にされ、約1mm立方
に細かく刻まれ、100mm ファルコンディッシュ（Falcon dish）上に広げられ
る。10％ウシ胎仔血清、100 units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマ
イシンを含み、NaHCO3および25mM HEPESでバッファーライズされたRPM1 1640
培地が各ディッシュに加えられ、Stericult 200 Forma Scientific インキ
ュベーター（Marietta, OH）内で、5％CO2を含む加湿雰囲気中で、37℃で培養
される。細胞が集密的（コンフルーエント）に達したとき、細胞はトリプシン解
離の後に継代培養され、これらの細胞は6ウェルディッシュに播種され、5α-レ
ダクターゼ活性の測定のために3〜7回継代培養される。
【１０３７】 アッセイに先立ち、細胞（ウェル当たり200,000細胞）は、0.2％BSAを含むRPM
I-1640培地中で48時間血清欠乏により休止状態にされる。次いで、細胞は、0.2
％BSAを含む血清枯渇RPMI培地中で、野生型または変異型インヒビンまたはアク
チビンおよびDHTにより、2日間処理される。48時間後に培地が除去され、細胞は
再び、[3H]テストステロンを含有する（200,000cpm、4.8pmol）血清フリーの培
地とともに、5％CO2インキュベーター中で、37℃で、4時間培養される。培養の
終了時に細胞は急速に氷冷され、培地はジエチルエーテルおよびモニターの回収
のための14Cスタンダードを含む氷冷された試験管に移される。各ウェルは1mlリ
ン酸バッファー生理食塩水(PBS)で洗浄され、洗浄液は抽出のために培地に添加
される。[3H]DHTの分離はセライトおよびペーパークロマトグラフィーにより行
われる。結果は、2×105細胞当たり4時間内に何％転換されたかで表される。各
ウェルの細胞数は、テスト物質で2日間処理する前および処理した後に、一部を
血球計測器で測定することにより数えられる。
【１０３８】 3αレダクターゼ活性はまたインヒビンおよびアクチビンの生物活性の測定と
同様にして測定できる。3αレダクターゼの酵素活性は、[3H]DHT を14Cスタンダ
ードとともに添加する（200,000cpm）ことを除き、5αR活性と同様の方法で測定
する。[3H]DHTおよび[3H]アンドロスタン-3,17-ジオール（3α-ジオール）は、
セライトおよびペーパークロマトグラフィーにより精製する。
【１０３９】 細胞(105)は、0.2％ BSAを含む血清フリーのRPMI培地中で、48時間培養する
。次いで、これらは、上記説明したようにして2.4×10-9Ｍ濃度の変異型および
野生型のアクチビンおよびインヒビンで48時間処理し、さらに[3H]チミジン（ウ
ェル当たり1μCi）とともに培養する。6時間後に、細胞は1mlPBSで2回洗浄され
、10％氷冷トリクロロ酢酸溶液で2回洗浄され、さらにPBSで洗浄する。次いで、
細胞は1％ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.3N NaOHで溶解する。次いで、一部
をシンチレーションカウンターでカウントする。野生型および変異型タンパクに
より生み出されるレダクターゼ活性のレベルは、測定され、変異型タンパクの生
物活性の評価のために比較される。このアッセイシステムの例は、Antonipillai
らによりMole.Cell.Endo.,107:99〜104(1995)において説明されている。ミュラー管阻害物質：MIS ミュラー管阻害物質（MIS）は、ミュラー管の退縮を引き起こし、男性の胚形
成の間に、女性の内部生殖構造の素質を引き起こす性腺ホルモンである。MISは
、成長および分化の調節に伴うTGF-βファミリータンパクの一つである。MIS器官培養アッセイシステム 器官培養アッセイシステムは、14.5週齢の雌ラットの胚性尿性器の隆起を変異
型被検MISタンパクとともに培養する、勾配を付けたバイオアッセイを確立する
ために行われる。形態学的な比較の目的で、MISの影響を増大させるとともに、
ウォルフィアン管の成長を刺激するために、培地にテストステロンを10〜9M添加
する。加湿した5％CO2中で72時間培養した後、標本は細断され、ヘマトキシリン
−エオシン染色された。ミュラー管の退縮は、少なくとも二人の独立した観察者
により、0（退縮なし）から5（完全退縮）まで階級付けされる。器官培養バイオ
アッセイは、完全に管を退縮させるのに、1.5〜2μg/mlの組み換えholoMISを要
求する。管の退縮の量を、野生型MISタンパクと本発明において開示されている
変異型MISタンパクとの間で比較する。このアッセイの例は、DonahoeらによりJ.
Surg.Res.,23:141〜148(1977)において説明されている。MIS顆粒層−黄体細胞の増殖阻害アッセイ MIS暴露の阻害効果を測定するために、顆粒層−黄体細胞が用いられる。この
アッセイにおいては、in vitro受精／胚性移転のために卵子想起を実施中の、
管性（tubal factor）不妊症の40才以下の女性の排卵前の小胞から顆粒層−黄
体細胞が経膣的に採取される。小胞の発達は、合計5日間の小胞層の初期3〜5日
にクロミフェンクエン酸塩（50〜100mg/day）により開始される。処理5日目に、
3個以上の小胞が直径20mm以上になり、血清エストラジオールのレベルが小胞当
たり200pgになるまで、150または225IUのヒト閉経期のゴナドトロピンを筋肉投
与する。卵母細胞の想起前34時間に、ヒト絨毛膜のゴナドトロピン(hCG)を5,000
IU各患者に投与する。
【１０４０】 卵母細胞は目視で同定され、精液注入および培養のために分離される。残りの
小胞の内容物を室温で10分間600gで遠心分離し、上清を捨てる。ペレット中の顆
粒層−黄体細胞は集められ、バイオアッセイおよびイムノアッセイによりMISフ
リーであることが定められた10％ウシ胎仔血清（FFCS, Metrix Co., Dubuque
, NY）を含むHam's F-10の2mlで2回洗浄され、5％CO2中で37℃で30分間、0.1
％コラゲナーゼおよびディスパーゼを含むHam's F-10の2mlとともに振盪させる
ことにより分散させる。600gで10分間の遠心分離の後、培養培地の1ml中に再分
散させた細胞は、50%パーコール(Sigma Chemical Co.,St. Louis,MO)の5ml上
に積層され、赤血球の除去のため300gで30分間遠心分離される。精製された顆粒
層−黄体細胞は、界面から吸引され、1回洗浄され、再分散され、血球計測器で
計数される。細胞生育能力は、トリパンブルー（0.4%）の排除により決定する場
合に95%より高いはずである。
【１０４１】 MISフリーの10%FFCS、2mmol L-グルタミン（Sigma）、2.5μg/ml フンジゾ
ン（Fungizone）(GIBCO)、100IU ペニシリンおよび100μg/ml 硫酸ストレプト
マイシン（Sigma）のHam's F-10からなる培養培地の1mlとともに、24ウェルデ
ィッシュの3枚に、ウェル当たり約30,000個の目で見える顆粒層−黄体細胞を播
種する。細胞は、95％空気および5%CO2の雰囲気中で37℃で培養する。
【１０４２】 アッセイの開始前に、顆粒層−黄体細胞を、MISフリーの10%FFCSを添加したHa
m's F-10中で37℃で4日間培養する。この場合、卵母細胞想起34時間前に患者に
投与されるhCGの効果を最小化するために48時間毎に培地を換える。その後、培
地を含む対照または被検物質を細胞に添加する。被検物質は、MISフリーの10%FF
CSを添加したHam's F-10中に最終濃度0.2、2または20ng/mlになるように希釈さ
れた野生型および変異型MISタンパクである。成長モデュレーターであるEGFもま
た、MISフリーの10%FFCSを添加したHam's F-10中に最終濃度0.2、2または20ng/
mlになるように希釈される。20ng/mlのEGFは、培地への添加の直前に0.2、2また
は20ng/ml濃度で、野生型及び変異型MISと混合される。細胞は三つのサブグルー
プに分けられ、１グループがホルモンの各濃度に対応する。コントロール培地は
、MIS添加なしの希釈液である。
【１０４３】 アッセイにおいては、２または３の被検者からの二つの細胞プールが用いられ
る。培養開始4日目において、各12ウェルからなる三つのサブグループが、EGF存
在下または非存在下に0.2、2および20ng/ml のMIS含有培地中で培養された。培
地は48時間毎に交換し、消耗した培地は分析のために保存した。各グループから
3ウェルが、培養4,8,12および16日目の細胞数またはDNA量の測定のために用いら
れる。加えて、培養開始4日目において、テストされる変異型MIS蛋白の数により
決定される、12ウェルのサブグループのいくつかが、0.2、2または20ng/ml の変
異型MISタンパクとともにEGF20ng/ml中で培養される。
【１０４４】 各ウェルの成長量は、細胞のDNAアッセイにより決定された。DNA量は、Hoechs
t 33258染料(Sigma)を用いて蛍光光度法で決定される。アッセイバッファー（2
.0mol NaCl、0.05mol Na2HPO4および2mmol エチレンジアミンテトラアセテー
ト）中に集められた細胞は、ディスポーザブル試験管（10×75mm、VWR, San F
rancisco）に移される。DNA標準品は、1)2mol エチレンジアミンテトラアセテ
ートを含むDPBS中のウシ胸腺DNA、2)既知の濃度のヒト精子から調製される。DNA
ストック溶液は、アッセイバッファー中で希釈され、0〜2500ngが、マイクロ遠
心管に入れられ、細胞と同じようにして、各アッセイについて、ＤNA(ng)対細胞
数（精子標準品）の標準線が作成される。各試験管に1ml染料（アッセイバッフ
ァー中に100ng/ml）が添加され、細胞は室温下、暗所で2時間培養される。蛍光
が、最大励起360nmおよび最大発光492nmにおいて、蛍光計（モデルA-4、Farrand Optical, New York,NY）を用いて測定される。アッセイは、10〜1000ng（
103〜105細胞）の範囲で直線的なはずである。この例が、KimらによりJ.Clin.En
docrinol.Metab.,75:911〜917（1992）において説明されている。BMP 骨形態発生タンパク(BMP)ファミリーは、TGF-βスーパーファミリータンパク
の仲間である。BMPファミリーに属するタンパクは、神経直系分化およびアドレ
ナリン作用の獲得を含む神経堤前駆体の分化のいくつかの局面に関わっている。
本発明は、生物活性を変化させるために種々のBMPファミリーのタンパクに多く
の変異を起こさせて、このファミリータンパクの野生型と比較することを企図し
ている。
【１０４５】 種々のBMPファミリータンパクのどの変異が生物活性を増大させることになる
かを当業者に決定させる、多くのバイオアッセイが知られている。このようなア
ッセイシステムのひとつは、BMP刺激に反応したグリア細胞の前駆細胞（O-2As）
の星状細胞への分化を測定するものである。血清フリーの培地中で培養する場合
、O-2A前駆細胞は進行性乏突起膠細胞に分化するが（イムノケミカルアッセイに
おいて、ガラクトセレブロシドを測定する。）、BMPs含有培地中ではアストログ
リア細胞に分化する（細胞マーカーであるグリア原繊維酸性タンパク（GFAP）の
出現により測定する。）。従って、本発明の１実施形態において、前駆細胞系列
O-2Aの表現型を示す細胞マーカーの出現は、O-2A細胞分化の変異型および野生型
タンパクの生物活性を比較するために測定される。
【１０４６】 この比較を行うため、生後2日のラットの皮質サンプルからO-2A細胞の培養を
得る。皮質サンプルは、10%FBS、グルコース（6mg/ml）およびグルタミン（2mM
）を補填したDMEM/F12 1:1中で繰り返し機械的に粉砕され、次いで60μM Nyte
xフィルターで濾過される。次いで、細胞はペレット状にされ、再分散され、ポ
リDリジン（PDL,1時間に20μg/ml）をコートしたT75フラスコ上に、フラスコ当
たり1.5脳で、播種される。培養は週に2回栄養を与えられ、集密的（コンフルー
エント）に達した1日後に（in vitroで合計９〜１０日）、小グリア細胞の除去
のために、フラスコは250rpmで3時間振盪され、再び栄養を与えられ、次いで、O
-2Asの除去のため、300rpmで終夜振盪される。集められたO-2Asは、60μM Nyte
xフィルターを通すことによりさらに精製され、混入している小グリア細胞を除
去するため、コートしていないプラスチックディッシュ上に2時間再播種される
。次いで、細胞はペレット化され、血清フリーの培地（SFM）中に再分散され、
計数され、PDL-コートした24ウェルプレートにウェル当たり104細胞播種される
。SDMは、グルコース（6ng/ml）、グルタミン(2mM)、BSA（0.1mg/ml）、トラン
スフェリン（50μg/ml）、トリヨードサイロニン(30nM)、ハイドロコルチゾン（
20nM)、プロゲステロン（20nM)、ビオチン（10nM)、セレン(30nM)、インスリン
（5μg/ml）を含むDMEM/F12（1:1）からなる。実験操作の48時間前に、bFGF（2.
5ng/ml）およびPDGF AA（2.5ng/ml）が添加される。細胞は、5%CO2の加湿イン
キュベーター中で37℃で維持される。対照培養は2日毎に栄養を与えられ、BMP処
理培養には、4日毎に新しい培地および成長因子（growth factor）が供給され
る。アッセイの始めに分析されるO-2A培地は、少なくとも95%の、O-2A関連抗体G
D3（J.Goldman,Columbia University）、A2B5およびO4（S.Pfeiffer,Universit
y of Connecticut）に対して免疫的に活性な細胞を含んでいなければならない
。抗ガラクトセレブロシド(GC)抗体GC/01はまたS.Pfeiffer,University of Co
nnecticutにより作製される。これらの抗体について議論するために、Raff et a
l.,Science,243:1450-1455(1989)および Levison and Goldman, Neuron, 10
:201-212(1993)を参照せよ。
【１０４７】 各細胞マーカーの存在または非存在は、標準イムノケミカル手法を用いて決定
する。例えば、所定時間にSFMを除去して、細胞は氷冷した無水メタノールで10
分間固定される。抗O-2AまたはGC抗体のために、細胞は4℃で30分間抗体ととも
に培養される。0.3%H2O2で20分間、ブロッキング血清（5%ヤギ血清）で30分間処
理した後、細胞の抗原に対する一次抗体が、室温で2時間アプライされる。適正
にビオチン化された二次抗体（Vector Laboratories, Burlingane, CA）が、
1:200希釈で30分間アプライされ、次いでABC試薬(Vector)が1時間アプライされ
る。パーオキシダーゼ反応は、0.01% H2O2を含むpH7.6の50mM Tris中で0.5mg/m
lジアミノベンゼンを基質として用いて5分間標識することにより可視化して行わ
れる。ブロッキング血清工程を除き、全工程は、その後にpH7.4 PBS洗浄が行わ
れる。
【１０４８】 ウェル当たりの細胞数は、全培養ウェルの4分の1を占める代表的な視野を数え
、4を掛けることにより計算される。GFAP野生型または変異型BMP刺激の結果のウ
ェル当たりのGFAP免疫反応性細胞の数は、野生型タンパクと比較した変異型タン
パクの生物活性を決定するために比較される。このアッセイの例は、Mabieらに
よりNeurosci.,4112〜4120(1997)において説明されている。
【１０４９】 他の実施形態においては、ヒト骨髄の骨前駆細胞は、分化を刺激するために、
BMP野生型および変異型タンパクで処理される。この処理は、処理された骨前駆
細胞のDNA合成をも阻害する。骨前駆細胞へのBMPタンパクの影響は、DNA合成に
よって反映される細胞の成長を測定することによって決定される。また、細胞の
分化は、アルカリフォスファターゼ活性、オステオカルシン合成、オステオネク
チン合成および1,25(DH)2D3ヒト上皮小体ホルモンへのタイプＩコラーゲンの応
答性を測定することによって決定される。
【１０５０】 様々な野生型および変異型BMPタンパクの効果を分析するために、外傷後に股
関節部の人工器具手術を行っている正常なドナー(20〜30才)から、腸骨吸引によ
りヒト骨髄を得る。細胞は、16、18および21ゲージの針をつけた注射器に連続的
に通すことにより、シングルサスペンジョンに分離される。ついで、細胞は計数
され、35mmディッシュ中の10%(v/v)FCSを添加したBGJb培地(GIBCO,Grand Islan
d,NY)上に105個/cm2で播種され、95%(v/v)空気および5%(v/v)CO2の加湿雰囲気中
で、37℃で培養される。3日後に最初の培地を換え、それから培地を2日毎に換え
る。3週間後にコンフルーエントに達し、細胞は制限希釈およびその次の継代培
養によりクローン化され、細胞間アルカリフォスファターゼ活性が最高に達する
。
【１０５１】 コンフルーエント状態において、培地は、0.2%(e/v)BSAを含む新しいBGJb培地
に24時間置き換えられる。それから、野生型および変異型BMP希釈液（1,2.5,お
よび10ng/ml）が各ウェルに加えられる。対照は、5mM HClおよび0.2%(w/v)BSA
を用いることにより評価される。細胞は上記説明したようにして3日間処理され
る。
【１０５２】 細胞の増殖へのBMPタンパクの影響は、DNA合成および細胞増殖を調べることに
より決定される。DNA合成は、Hauscka,et al.,J.Biol.Chem.,261:12665〜12674
(1986)の方法に従い、[3H]-チミジンの取り込みにより決定される。簡単に説明
すると、ヒト骨髄由来の細胞を、96ウェルプレート中でコンフルーエント(104個
/cm2)にまで成長させる。細胞は24時間FCS欠乏状態であり、次いで種々のBMP溶
液で処理される。培養期間の終わりの前24時間の時点で、細胞は、0.2%(w/v)BSA
含有培地中で[3H]-チミジン（5μCi/ml）とともに培養される。トリクロロ酢酸
で沈殿する材料は、0.2mlの0.3Ｎ NaOH中で溶解され、材料の放射活性が液体シ
ンチレーションカウンターで決定される。増殖分析は、骨髄間質細胞を5×103個
/ cm2で、2.5ng/mlの野生型または変異型BMPタンパクを含む溶液とともに播種す
ることにより行う。ウェル当たりの細胞数は、種々の時（1,2,3および6日）に計
算され、変異型タンパクの生物活性を決定するために、野生型BMP含有ウェル中
の細胞数が変異型BMP含有ウェル中に含まれる細胞数と比較される。
【１０５３】 種々のBMP溶液により誘導される細胞分化は、アルカリフォスファターゼ活性
、オステオカルシン合成およびオステオネクチン合成によって測定される。アル
カリフォスファターゼ活性の測定のために、細胞は、MajeskaらによりJ.Biol.Ch
em.,257:866〜872(1989)において説明されているようにして粉砕され、超音波破
砕される。オステオカルシン合成へのBMP暴露の影響は、ウシのオステオカルシ
ンでウサギを免疫して得られる抗体を用いた特異的ラジオイムノアッセイによっ
て測定される。アッセイの検出限界は1ng/mlである。続いて、2.5および10ng/ml
濃度で被検BMP溶液に、および10-8M濃度で1,25(OH)2D3に、それぞれ3日間暴露し
た後、細胞層はPBS中で粉砕される。次いで、細胞は超音波破砕され、タンパク
は50%(v/v)硫酸アンモニウムで沈殿される。次いで、細胞層のおよび培養培地中
に分泌されたオステオカルシンは、ラジオイムノアッセイにより決定される。変
異型タンパクの生物活性を決定するために、オステオカルシンの濃度が、野生型
BMP含有ウェルおよび変異型BMP含有ウェルについて決定される。
【１０５４】 BMP刺激により誘導されるオステオカルシン合成は、チャンバースライド中に1
04個/ cm2になるように細胞を播種し、それらを8日間成長させることにより測定
される。コンフルーエント状態において、細胞は、2.5および10ng/ml濃度の、生
物活性を調べられる種々のBMP溶液で3日間処理される。BMPタンパクを溶解する
のに用いた同量のバッファーで3日間処理された細胞を用いて、対照が行われる
。それから、培地は集められ、細胞層は100％メタノールで10分間4℃で固定され
、pH7.4の0.1M PBS中で1/200に希釈された、ウシのオステオネクチン特異的な
ポリクロナール抗体で26℃で終夜培養される。固定されたイムノグロブリンは、
ウェル当たり105cpmに希釈された[125I]タンパクA(1μCi/μg)を用いることによ
り現れる。徹底的に洗浄した後、10ウェル中の放射活性がγカウンターにより決
定される。変異型タンパクの生物活性を決定するために、野生型BMP含有ウェル
および変異型ＢＭＰ含有ウェルについて、オステオネクチン濃度が決定される。
このアッセイの例は、AmedeeらによりDifferentiation,58:157〜164(1994)にお
いて説明されている。
【１０５５】 他の実施形態においては、細胞の成長へのBMPの適用の効果は、本発明におい
て説明されているBMP変異体の、対応する野生型と比較した生物活性を決定する
ために用いられる。野生型および変異型タンパクの生物活性を比較するために、
雄のWistarラットに歯槽の骨および歯周靭帯を通る傷を作る。欠陥は、コラーゲ
ンインプラントまたは、コラーゲンおよび野生型または変異型のBMPタンパクに
よって埋められる。対照は、左側が埋められていない。各傷タイプに対する手術
の後、2,5,10,21および60日目に経時的に3匹づつ動物を殺した。歯周組織におけ
る細胞の増殖およびクローンの成長は、殺す1時間前に[3H]-チミジンでラベルし
、続いてラジオオートグラフィーにより評価する。柔軟なおよび鉱化した結合組
織細胞ポピュレーションの細胞分化は、αスムース筋肉アクチン、オステオポン
チンおよび骨唾液タンパクの免疫組織化学染色によって決定される。全ての技術
は当業者に周知である。野生型BMP-7は、21日間でアバンダント骨形成を誘導す
ることが知られており、変異型BMP-7タンパクにより生み出される骨成長量は、
変異型タンパクの生物活性が増大しているか否かを決定するため、野生型の骨成
長のレベルと比較される。細胞増殖およびαスムース筋肉アクチン染色パターン
も、変異型BMPタンパクの生物活性を決定するために評価される。このアッセイ
の例は、RajsjankarらによりCell Tissue Res.,294:475〜483（1998）におい
て説明されている。
【１０５６】 他の実施形態においては、肝細胞に結合するBMP-9が、野生型および変異型のB
MP-9タンパクの生物活性を比較するために用いられる。BMP-9の結合性を調べる
ために、HepG2細胞が、ゼランチン化された6ウェルプレート上の、10%の熱不活
化FCS含有Dulbecco's修正Eagle's培地（DMEM）中でコンフルーエントになるまで
育てられる。細胞は、2ng/mlの[125I]ラベルした野生型または変異型BMP-9とと
もに培養され、結合バッファー（136.9mM NaCl、5.37mM KCl、1.26mM CaCl2
、0.64mM MgSO4、0.34ｍM Na2HPO4、0.44ｍM KH2PO4、0.49mM MgCl2、25mM HEPESおよび0.5%BSA、pH7.4）中で、4℃で20時間かけて放射ラベルしていない
野生型BMP-9の濃度を増加させ、続いて結合バッファー中で37℃で1時間プレイン
キュベートする。細胞は、氷冷した結合バッファーで2回洗浄され、結合したBMP
-9は抽出および定量される。野生型および変異型BMP-9の量が比較される。
【１０５７】 野生型および変異型BMP-9タンパクへの暴露により誘導される細胞増殖は、Hep
G2細胞を96ウェルプレート上にウェル当たり105個播種し、細胞周期を同期させ
るために、DMEM/0.1% FCS中で48時間プレートを培養することにより決定される
。次いで、コンフルーエントな細胞は、0.1% FCSの存在下、変異型または野生
型BMP-9の存在下または非存在下で、24時間処理される。[3H]-チミジン取り込み
アッセイにおいては、[3H]-チミジンが処理期間の最後4時間に含まれ、細胞DNA
が96ウェルプレートセルハーベスターに集められる。[3H]-チミジン取り込みは
、液体シンチレーションカウンターにより測定する。細胞計数アッセイは、細胞
をトリプシン処理し、血球計測器を用いて計数する。
【１０５８】 原発性ラット肝細胞は、コラーゲンを塗布したプレート上の血清フリーの培地
中にサブコンフルーエントになるように（5000〜10000個/cm2）播種され、野生
型または変異型BMP-9とともに36時間処理される。[3H]-チミジンは処理期間を通
して含まれ、取り込まれた[3H]-チミジンは、当業者に周知の技術を用いて定量
される。このアッセイの例は、SongらによりEndocrinology,136:4293〜4297（19
95）において説明されている。上皮細胞の増殖のGDF間接阻害 BDFファミリータンパクの生物活性を試験するためのひとつのアッセイは、細
胞クローンの増殖アッセイである。これらのアッセイにおいて、細胞成長、増殖
およびmRNA生産はGDF刺激に対する応答において測定される。このアッセイにお
いては、細胞活性を刺激する変異型GDFタンパクの能力が測定され、被検細胞を
刺激する対応する野生型GDFファミリータンパクの能力と比較される。当業者の
一人は、GDFファミリータンパク中のどの変異が野生型タンパクに比べて生物活
性を増大させ、または減少させるかを決定するのにこのアッセイを用いることが
できるであろう。このようなアッセイの例が、YouらによりInvest.Ophthalmol.V
is.Sci.,40(2):296〜311(1999)において説明されている。
【１０５９】 タンパクの半減期は、タンパク安定性の指標であり、タンパク濃度が2分の1に
減少するのに必要な時間を示している。変異型TGFファミリータンパクの半減期
は、対象からのサンプルにおけるTGFファミリータンパクのレベルを経時的に測
定するどのような方法によっても決定できる。例えば、それには限定されないが
、変異型TGFファミリータンパクの投与後、経時的に採取したサンプルにおける
変異型TGFファミリータンパクのレベルを測定するために、抗TGFファミリータン
パク抗体を用いるイムノアッセイ、または放射標識した変異型TGFファミリータ
ンパクの投与後、対象から採取したサンプル中の放射ラベルされた変異型TGFフ
ァミリータンパクを検出する方法がある。
【１０６０】 他の方法は、当業者に知られており、これらは本発明の範囲内である。診断および治療における使用 本発明は、本発明の治療用化合物（ここでは“治療剤”という）の投与による
各種の疾患および障害の治療または予防を提供する。このような治療剤は以下の
ものを含む；すなわち、ミュータントαサブユニットおよびミュータントまたは
野生型いずれかのβサブユニットを有するTGFファミリータンパクヘテロダイマ
ー；ミュータントαサブユニットおよびミュータントβサブユニットを有し、hL
HのβサブユニットのCTEPのような他のCKGFタンパクに、全体として又は一部で
共有結合しているTGFファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントαサブ
ユニットおよびミュータントβサブユニットを有するTGFファミリータンパクヘ
テロダイマーであって、そのミュータントαサブユニットおよびミュータントβ
サブユニットは単鎖アナログを形成するために共有結合し、ミュータントαサブ
ユニット、ミュータントβサブユニットおよびCKGFタンパクまたはそのフラグメ
ントが単鎖アナログに共有結合したTGFファミリータンパクヘテロダイマー、他
の誘導体、アナログおよびそのフラグメント（例えば上記説明したような）、本
発明のミュータントTGFファミリータンパクヘテロダイマー、誘導体、アナログ
およびそのフラグメントをコードする核酸に共有結合しているTGFファミリータ
ンパクヘテロダイマーを含むもの。
【１０６１】 該治療剤を投与する対象は、それには限定されないが、好ましくは、例えばウ
シ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含む動物であり、好ましくは哺乳
動物である。好ましい実施形態においては、対象はヒトである。一般的には、対
象の種と同じ種に由来する生産物の投与が好ましい。従って、好ましい実施例に
おいては、ヒトのミュータントおよび／または修飾されたTGFファミリータンパ
クヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログまたは核酸が、治療、予防または診
断のために、ヒトの患者に投与される。
【１０６２】 好ましくは、本発明の治療剤は実質的に精製されたものである。
【１０６３】 好ましい実施形態において、変異型PDGFファミリータンパクヘテロダイマーま
たは生物活性を有するPDGFファミリータンパクアナログは、治療のために投与さ
れる。これには、多くの細胞の成長および発育条件を予防的に治療することおよ
び傷の快復を促進することが含まれる。例えば、本発明のミュータントTGF-βタ
ンパクは、上皮細胞および腫瘍細胞の増殖を阻害するであろう。
【１０６４】 PDGFファミリータンパク若しくは機能、または、PDGFファミリータンパクレセ
プターおよび機能の欠如または減少は、例えば、患者の組織サンプルを得て（例
えば生検組織から）、RNA若しくはタンパクレベル、PDGFファミリータンパクま
たはPDGFファミリータンパクレセプターを発現したRNAまたはタンパクの構造お
よび／または活性をインビトロでアッセイすることにより、容易に検出できる。
このようにこの分野で標準的な多くの方法を採用できる。それには限定されない
が、PDGFファミリータンパクまたはPDGFファミリータンパクレセプタータンパク
を検出および／または可視化するためのイムノアッセイ（例えばウェスタンブロ
ット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈
殿、免疫細胞化学など）および／または、PDGFファミリータンパクまたはPDGFフ
ァミリータンパクレセプターmRNAを検出または／および可視化することによりPD
GFファミリータンパクまたはPDGFファミリータンパクレセプタータンパクの発現
を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドット
ブロット、in situハイブリダイゼーションなど）などを利用できる。
【１０６５】 不妊症または性的機能不全として症状発現する多くの障害は、本発明の方法に
より治療することができる。TGFファミリータンパクが欠如または正常若しくは
望ましいレベルに比べて減少している機能不全は、本発明のミュータントTGFフ
ァミリータンパクヘテロダイマーまたはTGFファミリータンパクアナログの投与
により治療または予防される。TGFファミリータンパクレセプターの欠如、また
は正常レベルに比べた減少、無応答、または正常TGFファミリータンパクレセプ
ターの野生型TGFファミリータンパクへの応答性に比べた応答性減少といった機
能不全も、ミュータントTGFファミリータンパクヘテロダイマーまたはTGFファミ
リータンパクアナログの投与により治療できる。アンタゴニストとして使用する
ミュータントTGFファミリータンパクヘテロダイマーおよびTGFファミリータンパ
クアナログは、本発明により意図される。
【１０６６】 好ましい実施形態において、変異型TGFファミリータンパクヘテロダイマーま
たは生物活性を有するTGFファミリータンパクアナログは、排卵の機能不全、黄
体期の欠如、原因不明の不妊症、期間限定受胎および援助される生殖の予防的な
治療を含め、治療のために投与される。
【１０６７】 TGFファミリータンパクもしくは機能、TGFファミリータンパクレセプタータン
パクおよび機能の欠如または減少は、例えば患者の組織サンプルを得て（例えば
生検組織）、RNA若しくはタンパクレベル、PDGFファミリータンパクまたはPDGF
ファミリータンパクレセプターを発現したRNAまたはタンパクの構造および／ま
たは活性をインビトロでアッセイすることにより、容易に検出できる。従って、
この分野で標準的な多くの方法を利用できる。それには限定されないが、PDGFフ
ァミリータンパクまたはPDGFファミリータンパクレセプタータンパクを検出およ
び／または可視化するためのイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈降、免疫細
胞化学など）および／または、PDGFファミリータンパクまたはPDGFファミリータ
ンパクレセプターmRNAを検出または／および可視化することにより、PDGFファミ
リータンパクまたはPDGFファミリータンパクレセプタータンパクの発現を検出す
るためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブ
ロット、in situハイブリダイゼーションなど）などを利用できる。実験 以下の実験は、CKGFの種々のサブユニットを変異させることによりホルモンの
生物活性を効果的に向上させることができることを示している。説明を容易にす
るために、TSHおよびｈCGに特異的な糖タンパクの共通のα−サブユニットおよ
びβ―サブユニットを変異させ、変異ヘテロダイマーとして発現させ、これらの
ヘテロダイマーの生物活性を調べた。本発明においては、変異型タンパクは対応
する野生型タンパクとポリペプチド配列が異なっていることが分かる。以下、CK
GF変異体が修飾された生物活性を示すことを確かめる手順を導くのに用いる材料
および方法を説明する。材料 制限酵素、DNAマーカーその他の分子生物学的試薬は、Gibco BRL（Gaithersb
urg, MD）またはBoehringer Mannheim（Indianapolis, MA）から購入した。
細胞培養用培地、ウシ胎仔血清、リポフェクトアミン試薬は、New England Bi
olabs（Beverly, MA）から購入した。ｐｃDNA I/Neoベクター（Invitrogen,
San Diego, CA）のBamHI/Xhol切断部位にサブクローニングされた全長ヒトαc
DNA（840ｂｐ）およびｈCG-β遺伝子はT.H.Ji(University of Wyoming, Lara
mie, WY)から入手した。野生型タンパク配列をコードするαcDNA配列をSEQ ID No.1に示す。野生型タンパク配列をコードするｈCG-βポリヌクレオチドをSEQ ID No.４に示す。第一のイントロンを含まず、翻訳されない最初のエクソン
を含むｈTSH-βミニ遺伝子および正式な翻訳開始部位は本発明者により構築され
、SEQ ID No.２に示すタンパクをコードした。ホルモン標準品として用いた組
変えヒトTSHはGenzyme(Framingham, MA)から購入した。ヒトTSHレセプター（CH
O-ｈTSHR clone JP09およびclone JP26）を安定的に発現するChinese Hamst
er Ovary（CHO）細胞は、G.Vassart(University of Brussels, Brussels,
Belgium)から供給された。40〜60μCi/μｇの比活性になるように放射標識され
た125I-ｃAMP、、125I-ヒトTSH および125I-ウシTSHは、Hazleton Biologicals
(Vienｎa, VA)から入手した。方法 位置指定突然変異導入法 ヒトαサブユニットcDNA、ヒトTSHミニ遺伝子およびｈCG-βサブユニットｃDN
Aの位置指定突然変異導入は、SarkarらがBio Techniques 8：404（1990）にお
いて説明している、PCRを基礎とするメガプリンター法を用いて行った。ポリヌ
クレオチドの増幅は、VENT DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs）を用
いて最適化した。増幅プロダクトはBamHIおよびXholにより切断され、BamHI/Xho
lフラグメントを切り離したpcDNA I/Neoベクター（Invirogen）に連結した。MC
1061/ｐ3 E.coli宿主細胞はULTRACOMP E.coli Transformation Kit(Invitro
gen)を用いて形質転換した。多様なプラスミドDNAを調整するのにQIAPREP ８
プラスミドキット（Qiagen）を用いた。さらなる変異のための鋳型として、単独
のまたは複数の変異を有する変異サブユニットを含む多量のプラスミドを精製す
るために、Qiagen MegaおよびMaxi 精製プロトコールを用いた。CTEPと融合し
た変異型TSH-βサブユニットの構築は、JoshiらによりEndocrinology 136：383
9（1995）において説明されている。標準ジデオキシチェーンターミネーター法
を用いて2本鎖DNA配列を決定することにより、変異を確かめた。組換えホルモンの発現 CHO-K1細胞（ATCC, Rockville, MD）はグルタミン、10％FBS、ペニシリン（
50 units/ｍｌ）およびストレプトマイシン（50 μｇ/ｍｌ）を含むHam's F-
12培地中で維持した。製造者の指示通りにリポフェクタミン（Gibco BRL）を用
いることにより、プレート（100ｍｍカルチャーディッシュ）中の細胞に、ｐｃD
NA I/Neoベクターに連結した野生型または変異型のα-サブユニットｃDNAと、
ｐ（LB）CMVベクターまたはｈCG-β ｃDNA挿入を含むｐｃDNA I/Neoベクター
に連結した変異型ｈTSH-βミニ遺伝子とを共感染（共形質転換）させた。24時間
後に、形質転換した細胞をCHO-serum free medium（CHO-SFM-II, Gibco BR
L）に移した。形質転換して72時間後に、遺伝子挿入していない発現プラスミド
を用いたmock感染からの対照培地を含む培地を集め、濃縮し、遠心分離した。組
換えホルモンを含む培養上清の一部を-20℃で保存し、ホルモンアッセイの前に
一度だけ融解した。野生型および変異型ｈTSHは標準バイオアッセイおよびイム
ノアッセイにより定量し、確かめた。野生型および変異型ｈCGの濃度は、商業的
に入手したケミルミネセンスアッセイ キット（Nichols Institute, San Ju
an Capistrano, CA）およびｈCGラジオイムノアッセイ キット（ICN, Costa
Mesa, CA）を用いて測定した。哺乳類細胞におけるｃAMPの刺激 ヒトTSHレセプター ｈTSHレセプターcDNA発現ベクター（JP09またはJP26）により安定的に形質転換
したCHO-K1細胞を増殖させ、野生型および変異型TSHの連続希釈品とともに培養
した。培養培地中に放出されたcAMPはラジオイムノアッセイにより測定した。同
量の全培地タンパクをネガティブコントロールとして用いた。MA-10細胞におけるプロゲステロンの生産 AscoliらによりEndocrinol.108：88（1981）において説明されているようにし
て、形質転換されたマウスLeydig細胞（MA-10）を96ウェルプレートを用いて、
アッセイ用培地中で、野生型および変異型hCGとともに6時間培養した。培地中に
放出されたプロゲステロンは、CT PROGESTERONE KIT（ICN, Costa Mesa, C
A）を用いてラジオイムノアッセイにより定量した。結果 この実験の結果は、以下の結論を支持している。すなわち、本発明に従い変異
させたCKGFは、対応する野生型CKGFsと比べて生物活性が向上した。特に、上記
説明した手順における典型的な糖蛋白サブユニット中の単独または多数の変異は
、CKGF構造中に取り込まれ、その結果、活性が向上した組換え分子が得られた。
このことは、幾つかの異なる変異およびその組み合わせにおいて同様であり、本
発明の主な基本事項を説明している。
【１０６８】 第１例では、共通のヒトα-サブユニットのαL1ループ中の変異により、変異
型α−サブユニットおよび野生型TSH-βサブユニットを含むヘテロダイマーのホ
ルモン活性が増加した。この場合、SEQ ID NO.1の配列の２２の位置に通常存
在するグリシン残基がアルギニン残基により置換された（αG22R）。変異型αG2
2R/TSH-βホルモンはTSHレセプターに結合し、野生型TSHに比べて高いレベルの
サイクリックAMPの生産を刺激した。
【１０６９】 第２および第３例では、４つの異なる変異（αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K）
が同じα-サブユニットの構造中に導入され、変異型α4Kサブユニットを形成し
た。α4Kサブユニットを、野生型ヒトTSH-βサブユニットまたはhCGのCTEPと融
合したヒトTSH-βサブユニットと組み合わせて発現させた場合、その結果得られ
る変異型ヘテロダイマーは、実質的に変異型ヘテロダイマーの構造を変えること
なく、実用的な量の組換え体を供給するのに十分なレベルで生産された。さらに
、表３の結果は、α４KサブユニットまたはTSH-β-CTEP融合体と組み合わせたα
４Kを取り込んだTSHホルモンが、効果的に回復したことを示している（第３表に
おいて、100％発現は、1ｍｌ当たり47ngの野生型TSHに対応する）。TSH-β-CTEP
融合体中のCTEP成分の存在により、このタンパク融合体を含む変異型ヘテロダイ
マーの半減期が延び、安定性が向上した。図６の結果に示すように、α4K/TSH-
βおよびα4K/TSH-β-CTEP変異型ホルモンの双方が、サイクリックAMPの生産を
、野生型TSHによるより高いレベルに刺激した。これは、野生型および変異型ヘ
テロダイマーのTSHRへの結合能力を、形質転換されたTSHRを安定して発現するCH
O-JP09におけるサイクリックAMPの生産の刺激により評価することにより、決定
したものである。α4K/TSH-β-CTEPヘテロダイマーは、野生型のTSHに比べて、
能力が200倍に増加し、Vmaxが1.5倍（図6参照）に増加した。CTEPの含有により
α4K/TSH-β-CTEPヘテロダイマーのin vivoでの半減期が延長することが期待さ
れるが、驚くべきことに、CTEPの含有により、in vitro活性をもα4K/TSH-β野
生型ヘテロダイマーよりさらに3〜4倍増加した。これにより、変異型TSHの生物
活性を有利に増加させる変異は、分子の循環半減期を延長させて、優れたin vi
troおよびin vivo特性を有する変異型ホルモンを生み出す修飾を兼ね備えるこ
とができることが分かる。
【１０７０】
【表４】 追加した実験において、共通するヒトα-サブユニットのβヘアピン L3ルー
プ中の変異はまた、ホルモン活性を増加させた。変異のひとつは、81の位置のア
ラニン残基をリジン残基で置換したものだった（αA81K）。他の変異は、66の位
置のアスパラギン残基をリジン残基で置換したものだった（αN66K）。各変異型
ヒトα-サブユニットは、野生型ヒトTSH-βサブユニットと共同してCHO-K1細胞
で一時的に発現し、変異型TSHヘテロダイマーを生産した。これらの変異型TSHヘ
テロダイマーの各について、ヒトTSHレセプターを発現するCHO-JP09細胞を用い
て生物活性を測定した。この結果から、両変異型ホルモンは、野生型ホルモンよ
り高レベルのcAMPの生産を刺激したことが分かる。αサブユニット中のアラニン
８１のリジンへの置換（αA81K）は、他の相同的配列には存在しないリジン残基
のβヘアピンループへの導入の最初の例である。
【１０７１】 第６の例においては、ヒトTSHβサブユニットのβヘアピンL1ループ近傍の変
異は、この変異型サブユニットを含むヘテロダイマーのホルモン活性を増加させ
た。変異は、位置６のグルタミン酸残基のアスパラギン残基への置換であり（β
E6N）、βヘアピンL1ループの周縁部のマイナスチャージした残基を除去するも
のであった。変異型ヒトTSH-βサブユニットは、CHO-K1細胞中で、野生型ヒト共
通αサブユニットと協同して一時的に発現し、変異型TSHヘテロダイマーを生産
した。次いで、変異型TSHヘテロダイマーについて、TSHレセプターを発現するCH
O-JP09細胞を用いて生物活性を測定した。この変異型TSHホルモンはレセプター
に結合し、野生型TSHに比べて高レベルのcAMPの生産を誘導した。
【１０７２】 第７および第８例においては、hCG-βサブユニットのβヘアピンL3ループ中の
二つの新しい変異は、αサブユニットと協同して発現した場合、その結果得られ
る変異型hCGホルモンの生物活性を増加させた。一つの変異は、位置75のグリシ
ン残基のアルギニン残基への置換であった（hCG−βＧ75R）。他方の変異は、位
置77のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換であった（hCG−βN77D
）。各変異型hCGβサブユニットは、野生型共通α-サブユニットとともにCHO-K1
細胞中で一時的に発現し、変異型hCGヘテロダイマーを生産した。次いで、hCG刺
激によりプロゲステロンを生産するマウスLeydig細胞系列（MA-10）を用いて、
各変異型hCGヘテロダイマーの生物活性を測定した。両変異型hCGホルモンは、野
生型hCGより高レベルでcAMP生産およびプロゲステロン生産を誘導した。ヒトhCG
βサブユニット中のアスパラギン77のアスパラギン酸への置換（hCG−βN77D）
は、βヘアピンループ周縁へのネガティブチャージした残基の導入が配列アライ
ンメントに基づき、ホルモンの結合性および活性を増加させた最初の例である。
【１０７３】 上記の結果は、ここで有利に提供されている示唆に従った、CKGFsの変異は、
生物活性が向上したCKGFsを作成し用いるのに通常有利に用い得ることを示した
。
【１０７４】 本発明の所定のバリエーションは、それ自体当業者に示唆されることが認識さ
れる。以下の詳細な説明は図面によって明確に理解でき、本発明の精神および範
囲は添付したクレームを参照することにより解釈される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 シスチンノットおよびβヘアピンループ、L1およびL3を示すシスチンノット因
子の２次元的図解である。
【図２】 ヒト糖タンパク質ホルモン共通αサブユニットのアミノ酸配列(配列番号１)を
示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、8-30位および61-85位)はそれぞ
れ、配列の上または下の実線で示される。
【図３】 ヒトTSHβサブユニットのアミノ酸配列(配列番号２)を示す。βヘアピンL1お
よびL3ループ(それぞれ、1-30位および53-87位)はそれぞれ、配列の上または下
の実線で示される。
【図４】 ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号３)
を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、8-33位および58-87位)はそれ
ぞれ、配列の上または下の実線で示される。配列の上または下の数は、突然変異
が好ましいアミノ酸位置を示す。
【図５】 ヒト黄体化ホルモン(hLH)βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号４)を示す
。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、8-33位および58-87位)はそれぞれ、
配列の上または下の実線で示される。
【図６】 ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)のアミノ酸配列(配列番号５)を示す。βヘアピンL
1およびL3ループ(それぞれ、4-7位および65-81位)はそれぞれ、配列の上または
下の実線で示される。
【図７】 ヒト血小板由来成長因子A鎖(PDGF A鎖)のアミノ酸配列(配列番号６)を示す。
βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、11-36位および58-88位)はそれぞれ、配
列の上または下の実線で示される。
【図８】 ヒト血小板由来成長因子B鎖(PDGF B鎖)のアミノ酸配列(配列番号7)を示す。β
ヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、17-42位および64-94位)はそれぞれ、配列
の上または下の実線で示される。
【図９】 ヒト神経血管内皮成長因子(VEGF)のアミノ酸配列(配列番号8)を示す。βヘア
ピンL1およびL3ループ(それぞれ、27-50位および73-99位)はそれぞれ、配列の上
または下の実線で示される。
【図１０】 ヒト神経成長因子(ＮGF)のアミノ酸配列(配列番号９)を示す。βヘアピンL1お
よびL3ループ(それぞれ、16-57位および81-107位)はそれぞれ、配列の上または
下の実線で示される。
【図１１】 ヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)のアミノ酸配列(配列番号１０)を示す。βヘア
ピンL1およびL3ループ(それぞれ、14-57位および81-108位)はそれぞれ、配列の
上または下の実線で示される。
【図１２】 ヒトニューロトロフィン-3(NT-3)のアミノ酸配列(配列番号１１)を示す。βヘ
アピンL1およびL3ループ(それぞれ、15-56位および80-107位)はそれぞれ、配列
の上または下の実線で示される。
【図１３】 ヒトニューロトロフィン-4(NT-4)のアミノ酸配列(配列番号１２)を示す。βヘ
アピンL1およびL3ループ(それぞれ、18-60位および91-118位)はそれぞれ、配列
の上または下の実線で示される。
【図１４】 ヒトトランスフォーミング成長因子B-1(TGF-B1)のアミノ酸配列(配列番号１３
)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、21-40位および82-102位)はそ
れぞれ、配列の上または下の実線で示される。
【図１５】 ヒトトランスフォーミング成長因子B-2(TGF-B2)のアミノ酸配列(配列番号１４
)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、21-40位および82-102位)はそ
れぞれ、配列の上または下の実線で示される。
【図１６】 ヒトトランスフォーミング成長因子B-3(TGF-B3)のアミノ酸配列(配列番号１５
)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、21-40位および82-102位)はそ
れぞれ、配列の上または下の実線で示される。
【図１７】 ヒトトランスフォーミング成長因子B-4(TGF-B4)のアミノ酸配列(配列番号１６
)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、267-287位および319-337位)
はそれぞれ、配列の上または下の実線で示される。
【図１８】 ヒトニュールチュリンのアミノ酸配列(配列番号１７)を示す。βヘアピンL1お
よびL3ループ(それぞれ、104-129位および166-193位)はそれぞれ、配列の下の実
線で示される。
【図１９】 インヒビンαのアミノ酸配列(配列番号１８)を示す。βヘアピンL1およびL3ル
ープ(それぞれ、266-286位および332-359位)はそれぞれ、配列の下の実線で示さ
れる。
【図２０】 インヒビンA βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号１９)を示す。βヘアピ
ンL1およびL3ループ(それぞれ、326-346位および395-419位)はそれぞれ、配列の
下の実線で示される。
【図２１】 ヒトインヒビンB βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号２０)を示す。βヘ
アピンL1およびL3ループ(それぞれ、307-328位および376-400位)はそれぞれ、配
列の下の実線で示される。
【図２２】 ヒトアクチビンAサブユニットのアミノ酸配列(配列番号２１)を示す。βヘア
ピンL1およびL3ループ(それぞれ、326-346位および395-419位)はそれぞれ、配列
の下の実線で示される。
【図２３】 ヒトアクチビンBサブユニットのアミノ酸配列(配列番号２２)を示す。βヘア
ピンL1およびL3ループ(それぞれ、308-328位および376-400位)はそれぞれ、配列
の下の実線で示される。
【図２４】 ヒトMullerian阻害物質(MIS)のアミノ酸配列(配列番号２３)を示す。βヘアピ
ンL1およびL3ループ(それぞれ、465-484位および530-553位)はそれぞれ、配列の
下の実線で示される。
【図２５】 ヒト骨形態形成タンパク質-2(BMP-2)のアミノ酸配列(配列番号２４)を示す。
βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、302-321位および365-389位)はそれぞれ
、配列の下の実線で示される。
【図２６】 ヒト骨形態形成タンパク質-3(BMP-3)のアミノ酸配列(配列番号２５)を示す。
βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、373-395位および441-465位)はそれぞれ
、配列の下の実線で示される。
【図２７】 ヒト骨形態形成タンパク質-3b(BMP-3b)のアミノ酸配列(配列番号２６)を示す
。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、379-402位および447-471位)はそれぞ
れ、配列の下の実線で示される。
【図２８】 ヒト骨形態形成タンパク質-4(BMP-4)のアミノ酸配列(配列番号２7)を示す。β
ヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、312-333位および377-401位)はそれぞれ、
配列の下の実線で示される。
【図２９】 ヒト骨形態形成タンパク質-5前駆体(BMP-5)のアミノ酸配列(配列番号２８)を
示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、357-378位および423-447位)はそ
れぞれ、配列の下の実線で示される。
【図３０】 ヒト骨形態形成タンパク質-6/Vgrl(BMR-6)のアミノ酸配列(配列番号２９)を示
す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、21-40位および81-102位)はそれぞ
れ、配列の上の実線で示される。
【図３１】 ヒト骨形態形成タンパク質-7/骨形成タンパク質(OP)-1(BMR-7)のアミノ酸配列
(配列番号３０)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、21-40位および
81-102位)はそれぞれ、配列の上の実線で示される。
【図３２】 ヒト骨形態形成タンパク質-8/骨形成タンパク質(OP)-2(BMR-8)のアミノ酸配列
(配列番号３１)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、305-326位およ
び371-395位)はそれぞれ、配列の下の実線で示される。
【図３３】 ヒト骨形態形成タンパク質-10(BMR-10)のアミノ酸配列(配列番号３２)を示す
。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、327-353位および393-416位)はそれぞ
れ、配列の下の実線で示される。
【図３４】 ヒト骨形態形成タンパク質-11(BMR-11)のアミノ酸配列(配列番号３３)を示す
。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、318-337位および376-400位)はそれぞ
れ、配列の上の実線で示される。
【図３５】 ヒト骨形態形成タンパク質-15(BMR-15)のアミノ酸配列(配列番号３４)を示す
。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、295-316位および361-385位)はそれぞ
れ、配列の下の実線で示される。
【図３６】 ノリエ病タンパク質(NDP)のアミノ酸配列(配列番号３５)を示す。βヘアピンL
1およびL3ループ(それぞれ、43-62位および100-123位)はそれぞれ、配列の上ま
たは下の実線で示される。
【図３７】 ヒト成長分化因子-1(GDF-1)のアミノ酸配列(配列番号３６)を示す。βヘアピ
ンL1およびL3ループ(それぞれ、271-292位および341-365位)はそれぞれ、配列の
下の実線で示される。
【図３８】 ヒト成長分化因子-5前駆体(GDF-5)のアミノ酸配列(配列番号３７)を示す。β
ヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、404-425位および470-494位)はそれぞれ、
配列の下の実線で示される。
【図３９】 ヒト成長分化因子-8(GDF-8)のアミノ酸配列(配列番号３８)を示す。βヘアピ
ンL1およびL3ループ(それぞれ、286-305位および344-368位)はそれぞれ、配列の
上または下の実線で示される。
【図４０】 ヒト成長分化因子-9(GDF-9)のアミノ酸配列(配列番号３９)を示す。βヘアピ
ンL1およびL3ループ(それぞれ、357-378位および423-447位)はそれぞれ、配列の
下の実線で示される。
【図４１】 ヒトグリア由来因子アルテミン(Artemin)(GDNF)のアミノ酸配列(配列番号４０
)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、144-163位および209-229位)
はそれぞれ、配列の下の実線で示される。
【図４２】 ヒトグリア由来因子ペルセフィン(persephin)(GDNF)のアミノ酸配列(配列番号
４１)を示す。βヘアピンL1およびL3ループ(それぞれ、70-89位および128-148位
)はそれぞれ、配列の下の実線で示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/14 Ｃ０７Ｋ 14/49 ４Ｈ０４５ 35/00 14/495 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/59 14/49 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 14/495 33/50 Ｚ 14/59 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/38 33/50 49/02 Ｃ Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 DA12 DA13 DA36 4B024 AA01 BA80 CA04 CA05 DA02 EA04 GA11 GA25 HA01 4C084 AA02 AA07 BA02 BA34 BA44 DB49 NA14 ZB26 ZC06 4C085 HH03 KA29 KB18 KB82 KB95 LL15 LL18 4C086 AA01 HA09 MA02 MA04 NA14 ZB26 ZC06 4H045 AA10 AA30 BA10 DA21 DA30 DA31 EA20 FA72 FA74

Claims (683)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットの２２位のアミノ酸
    置換を含むミュータントαサブユニット。
  2. 【請求項２】２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項１のミュータント
    αサブユニット。
  3. 【請求項３】精製されている請求項１のミュータントαサブユニット。
  4. 【請求項４】図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットの位置 11-21のアミ
    ノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における１以上のアミノ酸置換をさらに
    含む請求項１のミュータントαサブユニット。
  5. 【請求項５】図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の位
    置11, 13, 14, 16, 17及び20の中から選ばれるアミノ酸残基における１以上のア
    ミノ酸置換を含む請求項４のミュータントαサブユニット。
  6. 【請求項６】αサブユニットのβヘアピンL1ループ中での１以上のアミノ酸置換
    をさらに含む請求項１のミュータントαサブユニット.
  7. 【請求項７】１以上のアミノ酸置換がアルギニン及びリシンからなる群から選ば
    れるアミノ酸である請求項４又は６のミュータントαサブユニット
  8. 【請求項８】１以上のアミノ酸置換がαT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R
    及びαQ20Kからなる群から選ばれる請求項４のヒトαサブユニット
  9. 【請求項９】唯一の突然変異が図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットの
    アミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換であるミュータントαサブユニット。
  10. 【請求項１０】２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項９のミュータン
    トαサブユニット。
  11. 【請求項１１】精製されている請求項１のミュータントαサブユニット。
  12. 【請求項１２】図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の
    ２２位のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニット及びβサブユニットを
    含み、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーの生物活性が野生型ＴＳＨヘテロダイ
    マーの生物活性よりも大きい、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  13. 【請求項１３】２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項１２のミュータ
    ントＴＳＨヘテロダイマー。
  14. 【請求項１４】精製されている請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー
    。
  15. 【請求項１５】βサブユニットがヒトβサブユニットである請求項１２のミュー
    タントＴＳＨヘテロダイマー。
  16. 【請求項１６】図２（配列番号:1)に示されるαサブユニットの位置 11-21のア
    ミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における１以上のアミノ酸置換をさら
    に含む請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  17. 【請求項１７】１以上のアミノ酸置換がαサブユニットのアミノ酸配列の位置11
    , 13, 14, 16, 17及び20の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項１２のミ
    ュータントＴＳＨ。
  18. 【請求項１８】αサブユニットのβヘアピンL1ループ中での１以上のアミノ酸置
    換をさらに含む請求項１２のミュータントＴＳＨ。
  19. 【請求項１９】１以上の置換がアルギニン及びリシンからなる群から選ばれるア
    ミノ酸である請求項１６又は１８のミュータントＴＳＨ。
  20. 【請求項２０】１以上の置換がαT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R及びα
    Q20Kである請求項１６のミュータントＴＳＨ。
  21. 【請求項２１】唯一の突然変異が図２（配列番号:1)に示されるαサブユニット
    のアミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換であるミュータントＴＳＨヘテロダイマ
    ー。
  22. 【請求項２２】２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項２１のミュータ
    ントＴＳＨ。
  23. 【請求項２３】精製されている請求項２１のミュータントＴＳＨ。
  24. 【請求項２４】(a)ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端伸長ペプチド
    のアミノ末端にそのカルボキシ末端でペプチド結合により結合したTSH βサブユ
    ニット; 及び (b) αサブユニットを含み、少なくともTSH βサブユニット又はT
    SH αサブユニットが少なくとも１つのアミノ酸置換を含み及び、ミュータント
    ＴＳＨヘテロダイマーの生物活性が野生型ＴＳＨヘテロダイマーの生物活性より
    も大きいαサブユニットを含むミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  25. 【請求項２５】１以上のアミノ酸置換が、図２（配列番号:1)に示されるヒトα
    サブユニットのアミノ酸配列の位置 11-21の中から選ばれるアミノ酸残基中にあ
    る請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  26. 【請求項２６】１以上のアミノ酸置換が、図２（配列番号:２)に示されるTSH β
    サブユニットのアミノ酸配列の位置 58-69の中から選ばれるアミノ酸残基中にあ
    る請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  27. 【請求項２７】少なくとも１つのアミノ酸置換がβI58R, βE63R及びβL69Rから
    なる群から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項２６のミュータントＴＳＨヘテ
    ロダイマー。
  28. 【請求項２８】ミュータントヒトαサブユニットは図２（配列番号:1)に示され
    るヒトαサブユニットの位置 11-21のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残
    基における少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ミュータントヒトTSH βサブ
    ユニットは図３（配列番号:２)に示されるヒトTSH βサブユニットの位置 58-69
    のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における少なくとも１つのアミノ
    酸置換を含む、ミュータントヒトαサブユニット及びミュータントヒトTSH βミ
    ュータントサブユニットを含む請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー
    。
  29. 【請求項２９】請求項のヒトTSHヘテロダイマーのミュータントである請求項２
    ４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
  30. 【請求項３０】少なくとも１つのサブユニットがそのアミノ酸配列中に少なくと
    も１つのアミノ酸置換を含み、及び前記ＴＳＨアナローグの生物活性が野生型Ｔ
    ＳＨβサブユニットに共有結合した野生型αサブユニットを含むＴＳＨアナロー
    グの生物活性よりも大きいTSH βサブユニットに共有結合しているαサブユニッ
    トを含むTSHアナローグ。
  31. 【請求項３１】少なくとも１つのアミノ酸置換が図２（配列番号:1)に示される
    αサブユニットの位置 11-22のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基中に
    ある請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  32. 【請求項３２】少なくとも１つのアミノ酸置換が、図３（配列番号:２)に示され
    るヒトTSH βサブユニットのアミノ酸配列の位置 58-69の中から選ばれるアミノ
    酸残基中にある請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  33. 【請求項３３】αサブユニット及びβTSHサブユニットの両方が１以上のアミノ
    酸置換を含む請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  34. 【請求項３４】αサブユニット及びβTSHサブユニットの両方がL1及びL3サブユ
    ニット中に１以上のアミノ酸置換を含む請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  35. 【請求項３５】αサブユニットが図２（配列番号:1)に示されるヒトαサブユニ
    ットの位置 11-22のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基中の少なくとも
    １つのアミノ酸置換を有し、及びTSH βサブユニットは図３（配列番号:２)に示
    されるヒトTSH βサブユニットの位置 58-69のアミノ酸配列の中から選ばれる少
    なくとも１つのアミノ酸置換を有する請求項３３のＴＳＨアナローグ。
  36. 【請求項３６】TSH βサブユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシ
    末端伸長ペプチドのアミノ末端にカルボキシ末端でペプチド結合により結合され
    、カルボキシ末端伸長ペプチドのカルボキシ末端がαサブユニットのアミノ末端
    にペプチド結合により結合されている請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  37. 【請求項３７】TSH βサブユニットがαサブユニットのアミノ末端にカルボキシ
    末端でペプチド結合により結合されている請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  38. 【請求項３８】ミュータントＴＳＨヘテロダイマーのin vivoにおける循環中の
    ホルモンの半減期が野生型ＴＳＨより大きい請求項２４のミュータントＴＳＨヘ
    テロダイマー。
  39. 【請求項３９】ミュータントＴＳＨアナローグのin vivoにおける循環中のホル
    モンの半減期が野生型ＴＳＨより大きい請求項３０のＴＳＨアナローグ。
  40. 【請求項４０】請求項１のミュータントαサブユニットをコードするヌクレオチ
    ド配列を含む核酸。
  41. 【請求項４１】αサブユニットがペプチド結合によりβサブユニットに結合して
    いる請求項３０のＴＳＨアナローグをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  42. 【請求項４２】治療又は予防が要望されている被験者に甲状腺機能低下症を治療
    又は予防するための十分量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを
    投与することを含む甲状腺機能低下症を治療又は予防する方法。
  43. 【請求項４３】治療又は予防が要望されている被験者に甲状腺機能低下症を治療
    又は予防するための十分量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与することを含
    む甲状腺機能低下症を治療又は予防する方法。
  44. 【請求項４４】そのような治療又は予防が要望されている被験者にヨウ素取り込
    みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを
    投与し、次いで前記被験者に甲状腺癌を治療するのに十分な量の放射標識された
    ヨウ素を投与することを含む甲状腺癌を治療する方法。
  45. 【請求項４５】そのような治療又は予防が要望されている被験者にヨウ素取り込
    みを刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与し、次いで前
    記被験者に甲状腺癌を治療するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与する
    ことを含む甲状腺癌を治療する方法。
  46. 【請求項４６】被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分
    な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び甲状腺癌を診断する
    のに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識され
    たヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける甲状
    腺疾患を有しない被験者に対する増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す
    、甲状腺癌の診断方法。
  47. 【請求項４７】非癌性甲状腺細胞を欠く被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り
    込みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー
    及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；
    および前記放射標識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素
    の取り込みにおける増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の
    診断方法。
  48. 【請求項４８】第１の被験者にin vivoでサイログロブリンの放出を刺激するの
    に十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを投与し及び前記
    第１の被験者のサイログロブリンのレベルを測定することを含み、甲状腺癌を有
    しない第２の被験者のサンプル中のサイログロブリンレベルに対するサイログロ
    ブリンレベルの増加は前記第１の被験者が甲状腺癌を有することを示す甲状腺癌
    の診断方法。
  49. 【請求項４９】被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分
    な量の請求項３０のＴＳＨアナローグ及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放
    射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識されたヨウ素を検出す
    ることを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける甲状腺疾患を有しない
    被験者に対する増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断
    方法。
  50. 【請求項５０】非癌性甲状腺細胞を欠く被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り
    込みを刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグ及び甲状腺癌を診
    断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標
    識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおけ
    る増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断方法。
  51. 【請求項５１】第１の被験者にin vivoでサイログロブリンの放出を刺激するの
    に十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与し及び前記第１の被験者のサ
    イログロブリンのレベルを測定することを含み、甲状腺癌を有しない第２の被験
    者のサンプル中のサイログロブリンレベルに対するサイログロブリンレベルの増
    加は前記第１の被験者が甲状腺癌を有することを示す甲状腺癌の診断方法。
  52. 【請求項５２】培養細胞又はＴＳＨ受容体を含む単離された膜を第１の被験者か
    らの抗体を推定的に含むサンプル及び診断的に十分な量の放射標識された請求項
    ２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーと接触させること；及び放射標識され
    たミュータントＴＳＨの培養細胞又は単離された膜に対する結合を測定すること
    を含み、前記サンプルの非存在下または前記疾患又は障害を有しない第２の被験
    者のサンプルの存在下での結合に対する放射標識されたＴＳＨの結合の減少が前
    記第１の被験者における前記の疾患又は障害の存在を示す、ＴＳＨ受容体に対す
    る抗体の存在により特徴付けられる疾患又は障害の診断又はスクリーニング方法
    。
  53. 【請求項５３】疾患又は障害がグレーヴズ病である請求項５２の方法。
  54. 【請求項５４】培養細胞又はＴＳＨ受容体を含む単離された膜を第１の被験者か
    らの抗体を推定的に含むサンプル及び診断的に十分な量の放射標識された請求項
    ３０のＴＳＨアナローグと接触させること；及び放射標識されたミュータントＴ
    ＳＨの培養細胞又は単離された膜に対する結合を測定することを含み、前記サン
    プルの非存在下または前記疾患又は障害を有しない第２の被験者のサンプルの存
    在下での結合に対する放射標識されたＴＳＨの結合の減少が前記第１の被験者に
    おける前記の疾患又は障害の存在を示す、ＴＳＨ受容体に対する抗体の存在によ
    り特徴付けられる疾患又は障害の診断又はスクリーニング方法。
  55. 【請求項５５】疾患又は障害がグレーヴズ病である請求項５２の方法。
  56. 【請求項５６】請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマーの治療的有効量
    ；及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  57. 【請求項５７】請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーの治療的有効量
    ；及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  58. 【請求項５８】請求項３０のＴＳＨアナローグの治療的有効量；及び薬学的に許
    容される担体を含む薬学的組成物。
  59. 【請求項５９】甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請
    求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー；及び薬学的に許容される担体を
    含む診断的組成物。
  60. 【請求項６０】甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請
    求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー；及び薬学的に許容される担体を
    含む診断的組成物。
  61. 【請求項６１】甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請
    求項３０のＴＳＨアナローグ；及び薬学的に許容される担体を含む診断的組成物
    。
  62. 【請求項６２】請求項１２または２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー ま
    たは請求項３０のＴＳＨアナローグの治療的有効量を１以上の容器に含むキット
    。
  63. 【請求項６３】請求項１２または２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー ま
    たは請求項３０のＴＳＨアナローグの診断的有効量を１以上の容器に含むキット
    。
  64. 【請求項６４】単離された請求項４０又は４１の核酸。
  65. 【請求項６５】ＴＳＨが精製されている請求項５６，５７または５８の組成物。
  66. 【請求項６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異をβヘアピンル
    ープ構造に含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリーをもたらす糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  67. 【請求項６７】蛋白質がヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(CG)βサブユニットである
    請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  68. 【請求項６８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L1βヘアピ
    ンループ中の位置 1-37からなる群から選ばれる位置である請求項６７のヒト糖
    蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  69. 【請求項６９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1B, P4B,
    L5B, P7B, R8B, R10B, P11B, I12B, N13B, A14B, T15B, L16B, A17B, V18B, G22
    B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, I33B, A35B, G36B及びY
    37B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの塩基性残基を導入する突然変異を含む、請求項６８のヒト糖蛋白ホルモン
    ファミリー蛋白質。
  70. 【請求項７０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-87
    からなる群から選ばれる位置でのL3βヘアピンループ中にある請求項６７のヒト
    糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  71. 【請求項７１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58B, Y59B
    , V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B
    , G79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｂは塩
    基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基
    を導入する突然変異を含む、請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質
    。
  72. 【請求項７２】サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連
    結されている請求項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  73. 【請求項７３】蛋白質がヒト黄体形成ホルモン(LH)βサブユニットである請求項
    ６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  74. 【請求項７４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 1-33
    からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項７３のヒ
    ト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  75. 【請求項７５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、W8B, P11B,
    I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V18B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B,
    V29B, N30B, T31B, T32B, 及び I33B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請
    求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  76. 【請求項７６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-87
    からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項７３のヒ
    ト 糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  77. 【請求項７７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58B, Y59B
    , V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B
    , G79B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中
    Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基
    性残基を導入する突然変異を含む請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋
    白質。
  78. 【請求項７８】サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連
    結されている請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  79. 【請求項７９】蛋白質がヒト卵胞刺激ホルモン (FSH)βサブユニットである請求
    項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  80. 【請求項８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 4-27
    からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項７９のヒ
    ト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  81. 【請求項８１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L5B, T6B,
    N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, F19B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26
    B, 及び W27B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホ
    ルモンファミリー蛋白質。
  82. 【請求項８２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 65-81
    からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項７９のヒ
    ト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  83. 【請求項８３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A65B, A68B
    , S70B, L71B, Y72B, T73B, Y74B, P75B, V76B, A77B, T78B, 及び Q79B（式中
    Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基
    性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋
    白質。
  84. 【請求項８４】サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連
    結されている請求項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  85. 【請求項８５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異をβヘアピンル
    ープ構造に含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒト血小板由来
    増殖因子ファミリー蛋白質をもたらすヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質
    。
  86. 【請求項８６】蛋白質がヒト血小板由来増殖因子-Aモノマーである請求項８５の
    ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  87. 【請求項８７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 11-36
    からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項８６のヒ
    ト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  88. 【請求項８８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E18B 及び
    D25B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因
    子ファミリー蛋白質。
  89. 【請求項８９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K11Z, R13Z
    , 及び R21Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増
    殖因子ファミリー蛋白質。
  90. 【請求項９０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K11U, R13U
    , E18U, R21U, 及び D25U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト
    血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  91. 【請求項９１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T12Z, T14Z
    , V15Z, I16Z, Y17Z, I19Z, P20Z, S22Z, Q23Z, V24Z, P26Z, T27Z, S28Z, A29Z
    , N30Z, F31Z, L32Z, I33Z, W34Z, P35Z, P36Z, T12B, T14B, V15B, I16B, Y17B
    , I19B, P20B, S22B, Q23B, V24B, P26B, T27B, S28B, A29B, N30B, F31B, L32B
    , I33B, W34B, P35B, 及び P36B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは
    塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残
    基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋
    白質。
  92. 【請求項９２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-88
    からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項８６のヒ
    ト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  93. 【請求項９３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E70B, E80B
    , E86B及びE87B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板
    由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  94. 【請求項９４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R58Z, H60Z
    , H61Z, R62Z, K65Z, K68Z, R73Z, K74Z, K75Z, K77Z, K79Z, R84Z, 及び H88Z
    （式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    酸性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミ
    リー蛋白質。
  95. 【請求項９５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R58U, H60U
    , H61U, R62U, K65U, K68U, E70U, R73U, K74U, K75U, K77U, K79U, E80U, R84U
    , E86U, E87U, 及び H88U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト
    血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  96. 【請求項９６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、V59Z, S63Z
    , V64Z, V66Z, A67Z, V69Z, Y71Z, V72Z, P76Z, L78Z, V81Z, Q82Z, V83Z, L85Z
    , V59B, S63B, V64B, V66B, A67B, V69B, Y71B, V72B, P76B, L78B, V81B, Q82B
    , V83B, 及び L85B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  97. 【請求項９７】ヒト血小板由来増殖因子-Aモノマーがもう１つのシスチンノット
    成長因子モノマーに連結されている請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミ
    リー蛋白質。
  98. 【請求項９８】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それ
    により前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来増
    殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピンループ構造と前記ヒト血小板由来増殖
    因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大を
    もたらす請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  99. 【請求項９９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-9, 3
    8-57, 及び 89-125からなる群から選ばれる位置である請求項９８のヒト血小板
    由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  100. 【請求項１００】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、S1J, I2J
    , E3J, E4J, A5J, V6J, P7J, A8J, V9J, V38J, E39J, V40J, K41J, R42J, C43J,
    T44J, G45J, C46J, C47J, N48J, T49J, S50J, S51J, V52J, K53JJ, C54J, Q55J
    , P56J, S57J, L89J, E90J, C91J, A92J, C93J, A94J, T95J, T96J, S97J, L98J
    , N99J, P100J, D101J, Y102J, R103J, E104J, E105J, D106J, T107J, G108J, R
    109J, P110J, R111J, E112J, S113J, G114J, K115J, K116J, R117J, K118,J, R1
    19J, K120J, R121J, L122J, K123J, P124J, 及び T125J（式中Ｊは任意のアミノ
    酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーション
    を変更する突然変異を含み、それは前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白
    質の前記βヘアピンループ構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質
    に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項９８の
    ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  101. 【請求項１０１】前記蛋白質はヒト血小板由来増殖因子-Bモノマーである請求項
    ８５のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  102. 【請求項１０２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 17-
    42からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１０１
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  103. 【請求項１０３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E21B, E2
    4B, 及び D31B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２のヒト血小
    板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  104. 【請求項１０４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K17Z, R1
    9Z, R27Z, R28Z, 及び R32Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  105. 【請求項１０５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K17U, R1
    9U, E21U, E24U, R27U, R28U, D31U, 及び R32U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項１０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  106. 【請求項１０６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T18Z, T2
    0Z, V22Z, F23Z, I25Z, S26Z, L29Z, I30Z, T33Z, N34Z, A35Z, N36Z, F37Z, L3
    8Z, V39Z, W40Z, P41Z, P42Z, T18B, T20B, V22B, F23B, I25B, S26B, L29B, I3
    0B, T33B, N34B, A35B, N36B, F37B, L38B, V39B, W40B, P41B, 及び P42B（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１
    ０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  107. 【請求項１０７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 64-
    94からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１０１
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  108. 【請求項１０８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E76B, E9
    2B, 及び D93B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小
    板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  109. 【請求項１０９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R68Z, R7
    3Z, K74Z, R79Z, K80Z, K81Z, K85Z, K86Z, 及び H94Z（式中Ｚは酸性アミノ酸
    残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突
    然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  110. 【請求項１１０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R68U, R7
    3U, K74U, E76U, R79U, K80U, K81U, K85U, K86U, E92U, D93U, 及び H94U（式
    中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性
    残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリ
    ー蛋白質。
  111. 【請求項１１１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Q64Z, V6
    5Z, Q66Z, L67Z, P69Z, V70Z, Q71Z, V72Z, I75Z, I77Z, V78Z, P82Z, I83Z, F8
    4Z, A87Z, T88Z, V89Z, T90Z, L91Z, Q64B, V65B, Q66B, L67B, P69B, V70B, Q7
    1B, V72B, I75B, I77B, V78B, P82B, I83B, F84B, A87B, T88B, V89B, T90B, 及
    び L91B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  112. 【請求項１１２】ヒト血小板由来増殖因子-Bモノマーはもう１つのシスチンノッ
    ト成長因子モノマーに連結されている請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子フ
    ァミリー蛋白質。
  113. 【請求項１１３】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来
    増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子
    ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもた
    らす請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  114. 【請求項１１４】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-15
    , 44-63, 及び 95-160からなる群から選ばれる位置である請求項１１３のヒト血
    小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  115. 【請求項１１５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1J, L2J
    , G3J, S4J, L5J, T6J, I7J, A8J, E9J, P10J, A11J, M12J, I13J, A14J, E15J,
    V44J, E45J, V46J, Q47J, R48J, C49J, S50J, G51J, C52J, C53J, N54J, N55J,
    R56J, N57J, V58J, Q59J, C60J, R61J, P62J, T63J, L95J, A96J, C97J, K98J,
    C99J, E100J, T101J, V102J, A103J, A104J, A105J, R106J, P107J, V108J, T1
    09J, R110J, S111J, P112J, G113J, G114J, S115J, Q116J, E117J, Q118J, R119
    J, A120J, K121J, T122J, P123J, Q124J, T125J, R126J, V127J, T128J, I129J,
    R130J, T131J, V132J, R133J, V134J, R135J, R136J, P137J, P138J, K139J, G
    140J, K141J, H142J, R143J, K144J, F145J, K146J, H147J, T148J, H149J, D15
    0J, K151J, T152J, A153J, L154J, K155J, E156J, T157J, L158J, G159J, 及び
    A160J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト血小
    板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピンループ構造と前記ヒト血小板
    由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用
    の増大をもたらす請求項１１３のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  116. 【請求項１１６】前記蛋白質はヒト血管内皮成長因子モノマーである請求項８５
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  117. 【請求項１１７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 27-
    50からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１１６
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  118. 【請求項１１８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E30B, D3
    4B, E38B, D41B, E42B, 及び E44B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求
    項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  119. 【請求項１１９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H27Z 及
    び K48Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増
    殖因子ファミリー蛋白質。
  120. 【請求項１２０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H27U, E3
    0U, D34U, E38U, D41U, E42U, E44U, 及び K48U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  121. 【請求項１２１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P28Z, I2
    9Z, T31Z, L32Z, V33Z, I35Z, F36Z, Q37Z, Y39Z, P40Z, I43Z, Y45Z, I46Z, F4
    7Z, P49Z, S50Z, P28B, I29B, T31B, L32B, V33B, I35B, F36B, Q37B, Y39B, P4
    0B, I43B, Y45B, I46B, F47B, P49B, 及び S50B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基で
    あり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１
    つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖
    因子ファミリー蛋白質。
  122. 【請求項１２２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 73-
    99からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１１６
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  123. 【請求項１２３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E73B 及
    び E93B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１２２のヒト血小板由来
    増殖因子ファミリー蛋白質。
  124. 【請求項１２４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R82Z, K8
    4Z, H86Z, H90Z, 及び H99Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１２２
    のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  125. 【請求項１２５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E73U, R8
    2U, K84U, H86U, H90U, E93B, 及び H99U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  126. 【請求項１２６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S74Z, N7
    5Z, I76Z, T77Z, M78Z, Q79Z, I80Z, M81Z, I83Z, P85Z, Q87Z, G88Z, Q89Z, I9
    1Z, G92Z, M94Z, S95Z, F96Z, L97Z, Q98Z, S74B, N75B, I76B, T77B, M78B, Q7
    9B, I80B, M81B, I83B, P85B, Q87B, G88B, Q89B, I91B, G92B, M94B, S95B, F9
    6B, L97B, 及び Q98B （式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求
    項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  127. 【請求項１２７】ヒト血管内皮成長因子モノマーはもう１つのシスチンノット成
    長因子モノマーに連結されている請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミ
    リー蛋白質。
  128. 【請求項１２８】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来
    増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子
    ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもた
    らす請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  129. 【請求項１２９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-25
    , 51-72, 及び 100-189からなる群から選ばれる位置である請求項１２８のヒト
    血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
  130. 【請求項１３０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, P2J
    , M3J, A4J, E5J, G6J, G7J, G8J, Q9J, N10J, H11J, H12J, E13J, V14J, V15J,
    K16J, F17J, M18J, D19J, V20J, Y21J, Q22J, R23J, S24J, Y25J, V52J, P53J,
    L54J, M55J, R56J, C57J, G58J, G59J, C60J, C61J, N62J, D63J, E64J, G65J,
    L66J, E67J, C68J, V69J, P70J, T71J, E72J, N100J, K101J, C102J, E103J, C
    104J, R105J, P106J, K107J, K108J, D109J, R110J, A111J, R112J, Q113J, E11
    4J, K115J, K116J, S117J, V118J, R119J, G120J, K121J, G122J, K123J, G124J
    , Q125J, K126J, R127J, K128J, R129J, K130J, K131J, S132J, R133J, Y134J,
    K135J, S136J, W137J, S138J, V139J, P140J, C141J, G142J, P143J, C144J, S1
    45J, E146J, R147J, R148J, K149J, H150J, L151J, F152J, V153J, Q154J, D155
    J, P156J, Q157J, T158J, C159J, K160J, C161J, S162J, C163J, K164J, N165J,
    T166J, D167J, S168J, R169J, C170J, K171J, A172J, R173J, Q174J, L175J, E
    176J, L177J, N178J, E179J, R180J, T181J, C182J, R183J, C184J, D185J, K18
    6J, P187J, R188J, 及び R189J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含
    み、それは前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造
    と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間
    の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１２９のヒト血小板由来増殖因子ファ
    ミリー蛋白質。
  131. 【請求項１３１】βヘアピンループ構造に少なくとも１つの静電的電荷を変更す
    る突然変異を含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒトニュート
    ロフィンファミリー蛋白質をもたらすヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  132. 【請求項１３２】蛋白質はヒト神経成長因子モノマーである請求項１３１のヒト
    ニュートロフィンファミリー蛋白質。
  133. 【請求項１３３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 16-
    57からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１３２
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  134. 【請求項１３４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D16B, D2
    4B, D30B, E35B, E41B, E55B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１３
    ３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  135. 【請求項１３５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K25Z, K3
    2Z, K34Z, K50Z, 及び K57Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１３３
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  136. 【請求項１３６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D16U, D2
    4U, K25U, D30U, K32U, K34U, E35U, E41U, K50U, E55U, 及び K57U（式中Ｕは
    中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を
    導入する突然変異を含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質
    。
  137. 【請求項１３７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S17Z, V1
    8Z, S19Z, V20Z, W21Z, V22Z, G23Z, T26Z, T27Z, A28Z, T29Z, I31Z, G33Z, V3
    6Z, M37Z, V38Z, L39Z, G40Z, V42Z, N43Z, N44Z, I45Z, N46Z, S47Z, V48Z, F4
    9Z, Q51Z, Y52Z, F53Z, F54Z, T56Z, S17B, V18B, S19B, V20B, W21B, V22B, G2
    3B, T26B, T27B, A28B, T29B, I31B, G33B, V36B, M37B, V38B, L39B, G40B, V4
    2B, N43B, N44B, I45B, N46B, S47B, V48B, F49B, Q51B, Y52B, F53B, F54B, 及
    び T56B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  138. 【請求項１３８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 81-
    107からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１３２
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  139. 【請求項１３９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D93B 及
    び D105B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  140. 【請求項１４０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H84Z, K8
    8Z, K95Z, R100Z, 及び R103Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１３
    ８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  141. 【請求項１４１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H84U, K8
    8U, D93U, K95U, R100U, R103U, 及び D105U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む
    請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  142. 【請求項１４２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T81Z, T8
    2Z, T83Z, T85Z, F86Z, V87Z, A89Z, M90Z, L91Z, T92Z, G94Z, Q96Z, A97Z, A9
    8Z, W99Z, F101Z, I102Z, I104Z, T106Z, A107Z, T81B, T82B, T83B, T85B, F86
    B, V87B, A89B, M90B, L91B, T92B, G94B, Q96B, A97B, A98B, W99B, F101B, I1
    02B, I104B, T106B, 及び A107B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは
    塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残
    基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋
    白質。
  143. 【請求項１４３】ヒトニュートロフィンモノマーはもう１つのシスチンノット成
    長因子モノマーに連結されている請求項１３２のヒトニュートロフィンファミリ
    ー蛋白質。
  144. 【請求項１４４】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質と前記ニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有
    する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１３２のヒトニュー
    トロフィンファミリー蛋白質。
  145. 【請求項１４５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-14
    , 59-79, 及び 109-120からなる群から選ばれる位置である請求項１４４のヒト
    ニュートロフィンファミリー蛋白質。
  146. 【請求項１４６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、S1J, S2J
    , S3J, H4J, P5J, I6J, F7J, H8J, R9J, G10J, E11J, D12J, S13J, V14J, R59J,
    D60J, P61J, N62J, P63J, V64J, D65J, S66J, G67J, C68J, R69J, G70J, I71J,
    D72J, S73J, K74J, H75J, W76J, N77J, S78J, Y79J, V109J, C110J, V111J, L1
    12J, S113J, R114J, K115J, A116J, V117J, R118J, R119J, 及び A120J（式中Ｊ
    は任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフ
    ォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンフ
    ァミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋
    白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１
    ４５のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  147. 【請求項１４７】蛋白質がヒト脳由来成長因子モノマーである請求項１３１のヒ
    トニュートロフィンファミリー蛋白質。
  148. 【請求項１４８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 14-
    57からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１４７
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  149. 【請求項１４９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D14B, E1
    8B, D24B, D30B, E40B, 及び E55B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求
    項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  150. 【請求項１５０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K25Z, K2
    6Z, K41Z, K46Z, K50Z, 及び K57Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項
    １４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  151. 【請求項１５１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D14U, E1
    8U, D24U, K25U, K26U, D30U, E40U, K41U, K46U, K50U, E55U, 及び K57U（式
    中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性
    残基を導入する突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー
    蛋白質。
  152. 【請求項１５２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S15Z, I1
    6Z, S17Z, W19Z, V20Z, T21Z, A22Z, A23Z, T27Z, A28Z, V29Z, M31Z, S32Z, G3
    3Z, G34Z, T35Z, V36Z, T37Z, V38Z, L39Z, V42Z, S43Z, P44Z, V45Z, G47Z, Q4
    8Z, L49Z, Q51Z, Y52Z, F53Z, Y54Z, T56Z, S15B, I16B, S17B, W19B, V20B, T2
    1B, A22B, A23B, T27B, A28B, V29B, M31B, S32B, G33B, G34B, T35B, V36B, T3
    7B, V38B, L39B, V42B, S43B, P44B, V45B, G47B, Q48B, L49B, Q51B, Y52B, F5
    3B, Y54B, 及び T56B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミ
    ノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入す
    る突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  153. 【請求項１５３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-1
    08からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１４７
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  154. 【請求項１５４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D93B, 及
    び D106B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  155. 【請求項１５５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R81Z, R8
    8Z, K95Z, K96Z, R97Z, R101Z, R104Z, 及び D106B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基
    である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変
    異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  156. 【請求項１５６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R81U, R8
    8U, D93B, K95U, K96U, R97U, R101U, R104Z, 及び D106U（式中Ｕは中性アミノ
    酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突
    然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  157. 【請求項１５７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T82Z, T8
    3Z, Q84Z, S85Z, Y86Z, V87Z, A89Z, M90Z, L91Z, T92Z, S94Z, I98Z, G99Z, W1
    00Z, F102Z, I103Z, I105Z, T107Z, S108Z, C109Z, V110Z, T82B, T83B, Q84B,
    S85B, Y86B, V87B, A89B, M90B, L91B, T92B, S94B, I98B, G99B, W100B, F102B
    , I103B, I105B, T107B, S108B, C109B, 及び V110B（式中Ｚは酸性アミノ酸残
    基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  158. 【請求項１５８】ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチ
    ンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１４７のヒトニュートロフィ
    ンファミリー蛋白質。
  159. 【請求項１５９】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項１４７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  160. 【請求項１６０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-12
    , 59-79, 及び 110-119からなる群から選ばれる位置である請求項１５９のヒト
    ニュートロフィンファミリー蛋白質。
  161. 【請求項１６１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、H1J, S2J
    , D3J, P4J, A5J, R6J, R7J, G8J, E9J, L10J, S11J, V12J, N59J, P60J, M61J,
    G62J, Y63J, T64J, K65J, E66J, G67J, C68J, R69J, G70J, I71J, D72J, K73J,
    R74J, H75J, W76J, N77J, S78J, Q79J, V110J, C111J, I112J, L113J, T114J,
    I115J, K116J, R117J, G118J, 及び E119J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突
    然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘア
    ピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体
    との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１６０のヒトニュートロフィン
    ファミリー蛋白質。
  162. 【請求項１６２】蛋白質はヒトニューロトロフィン-3モノマーである請求項１３
    １のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  163. 【請求項１６３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置15-5
    6からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１６２の
    ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  164. 【請求項１６４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D15B, E1
    7B, D23B, D29B, E40B, 及び E54B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求
    項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  165. 【請求項１６５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K24Z, R3
    1Z, H33Z, K43Z, K49Z, 及び R56Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項
    １６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  166. 【請求項１６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D15U, E1
    7U, D23U, K24U, D29U, R31U, E40U, K43U, K49U, E54U, 及び R56U（式中Ｕは
    中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を
    導入する突然変異を含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質
    。
  167. 【請求項１６７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S16Z, S1
    8Z, L19Z, W20Z, V21Z, T22Z, S25Z, S26Z, A27Z, I28Z, I30Z, G32Z, Q34Z, V3
    5Z, T36Z, V37Z, L38Z, G39Z, I41Z, G42Z, T44Z, N45Z, S46Z, P47Z, V48Z, Q5
    0Z, Y51Z, F52Z, Y53Z, T55Z, R56Z, S16B, S18B, L19B, W20B, V21B, T22B, S2
    5B, S26B, A27B, I28B, I30B, G32B, Q34B, V35B, T36B, V37B, L38B, G39B, I4
    1B, G42B, T44B, N45B, S46B, P47B, V48B, Q50B, Y51B, F52B, Y53B, T55B, 及
    び R56B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  168. 【請求項１６８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置80-1
    07からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１６２
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  169. 【請求項１６９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E92B, 及
    び D105B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  170. 【請求項１７０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K80Z, R8
    7Z, K95Z, R100Z, 及び R103Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１６
    ８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  171. 【請求項１７１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K80U, R8
    7U, E92U, K95U, R100U, R103U, 及び D105U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む
    請求項１６８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  172. 【請求項１７２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T81Z, S8
    2Z, Q83Z, T84Z, Y85Z, V86Z, A88Z, S89Z, L90Z, T91Z, N93Z, N94Z, L96Z, V9
    7Z, G98Z, W99Z, W101Z, I102Z, I104Z, T106Z, S107Z, T81B, S82B, Q83B, T84
    B, Y85B, V86B, A88B, S89B, L90B, T91B, N93B, N94B, L96B, V97B, G98B, W99
    B, W101B, I102B, I104B, T106B, 及び S107B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であ
    り、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    の荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロフィン
    ファミリー蛋白質。
  173. 【請求項１７３】ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチ
    ンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１６２のヒトニュートロフィ
    ンファミリー蛋白質。
  174. 【請求項１７４】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項１６２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  175. 【請求項１７５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-13
    , 58-78, 及び 109-119からなる群から選ばれる位置である請求項１７４のヒト
    ニュートロフィンファミリー蛋白質。
  176. 【請求項１７６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、Y1J, A2J
    , E3J, H4J, K5J, S6J, H7J, R8J, G9J, E10J, Y11J, S12J, V13J, K58J, E59J,
    A60J, R61J, P62J, V63J, K64J, N65J, G66J, C67J, R68J, 669J, I70J, D71J,
    D72J, R73J, H74J, W75J, N76J, S77J, Q78J, V109J, C110J, A111J, L112J, S
    113J, R114J, K115J, I116J, G117J, R118J, 及び T119J（式中Ｊは任意のアミ
    ノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーショ
    ンを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白
    質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性
    を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１７５のヒトニ
    ュートロフィンファミリー蛋白質。
  177. 【請求項１７７】蛋白質はヒトニューロトロフィン-4モノマーである請求項１３
    １のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  178. 【請求項１７８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置18-6
    0からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１７７の
    ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  179. 【請求項１７９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D18B, D2
    0B, D32B, E37B, E39B, E43B, 及び E58B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含
    む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  180. 【請求項１８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R27Z, R2
    8Z, R34Z, R36Z, R53Z, 及び R60Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項
    １７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  181. 【請求項１８１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D18U, D2
    6U, R27U, R28U, D32U, R34U, R36U, E37U, E39U, E43U, R53U, E58U, 及び R60
    U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    の中性残基を導入する突然変異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファ
    ミリー蛋白質。
  182. 【請求項１８２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A19Z, V2
    0Z, S21Z, G22Z, W23Z, V24Z, T25Z, T29Z, A30Z, V31Z, L33Z, G35Z, V38Z, V4
    0Z, L41Z, G42Z, V44Z, P45Z, A46Z, A47Z, G48Z, G49Z, S50Z, P51Z, L52Z, Q5
    4Z, Y55Z, F56Z, F57Z, T59Z, A19B, V20B, S21B, G22B, W23B, V24B, T25B, T2
    9B, A30B, V31B, L33B, G35B, V38B, V40B, L41B, G42B, V44B, P45B, A46B, A4
    7B, G48B, G49B, S50B, P51B, L52B, Q54B, Y55B, F56B, F57B, 及び T59B（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１
    ７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  183. 【請求項１８３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置91-1
    18からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１７７
    のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  184. 【請求項１８４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D103B 及
    び D116B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  185. 【請求項１８５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K91Z, K9
    3Z, R98Z, R107Z, R111Z, 及び R114Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求
    項１８３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  186. 【請求項１８６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K91U, K9
    3U, R98U, D103U, R107U, R111U, R114U, 及び D116U（式中Ｕは中性アミノ酸残
    基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変
    異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  187. 【請求項１８７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A92Z, Q9
    4Z, S95Z, Y96Z, V97Z, A99Z, L100Z, T101Z, A102Z, A104Z, Q105Z, G106Z, V1
    08Z, G109Z, W110Z, W112Z, I113Z, I115Z, T117Z, A118Z, A92B, Q94B, S95B,
    Y96B, V97B, A99B, L100B, T101B, A102B, A104B, Q105B, G106B, V108B, G109B
    , W110B, W112B, I113B, I115B, T117B, 及び A118B（式中Ｚは酸性アミノ酸残
    基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質。
  188. 【請求項１８８】ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチ
    ンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１７７のヒトニュートロフィ
    ンファミリー蛋白質。
  189. 【請求項１８９】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロ
    フィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項１７７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
  190. 【請求項１９０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-16
    , 62-89, 及び 120-130からなる群から選ばれる位置である請求項１７７のヒト
    ニュートロフィンファミリー蛋白質。
  191. 【請求項１９１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、G1J, V2J
    , S3J, E4J, T5J, A6J, P7J, A8J, S9J, R10J, R11J, G12J, E13J, L14J, A15J,
    V16J, K62J, A63J, D64J, N65J, A66J, E67J, E68J, G69J, G70J, P71J, G72J,
    A73J, G74J, G75J, G76J, G77J, C78J, R79J, G80J, V81J, D82J, R83J, R84J,
    H85J, W86J, V87J, S88J, E89J, V120J, C121J, T122J, L123J, L124J, S125J,
    R126J, T127J, G128J, R129J, 及び A130J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する
    突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘ
    アピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容
    体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１９０のヒトニュートロフィ
    ンファミリー蛋白質。
  192. 【請求項１９２】βヘアピンループ構造に少なくとも１つの静電的電荷を変更す
    る突然変異を含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質をもたらすヒトトランスフォーミング成
    長因子ファミリー蛋白質。
  193. 【請求項１９３】蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子β１モノマーであ
    る請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  194. 【請求項１９４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 21-
    40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１９３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  195. 【請求項１９５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D2
    7B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  196. 【請求項１９６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR25Z, K26Z
    , K31Z, H34Z, K37Z, 及び H40Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１
    ９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  197. 【請求項１９７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, R2
    5U, K26U, D27U, K31U, H34U, E35U, K37U, 及び H40U（式中Ｕは中性アミノ酸
    残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然
    変異を含む請求項１９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    。
  198. 【請求項１９８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I2
    2Z, F24Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, I33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, Y21B, I22B, F2
    4B, L28B, G29B, W30B, W32B, I33B, P36B, G38B, 及び Y39B（式中Ｚは酸性ア
    ミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  199. 【請求項１９９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-1
    02からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１９３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  200. 【請求項２００】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E84B 及
    び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  201. 【請求項２０１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR94Z, K95Z
    , 及び K97Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  202. 【請求項２０２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E84U, R9
    4U, K95U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  203. 【請求項２０３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A82Z, L8
    3Z, P85Z, L86Z, P87Z, I88Z, V89Z, Y90Z, Y91Z, V92Z, G93Z, P96Z, V98Z, Q1
    00Z, L101Z, S102Z, A82B, L83B, P85B, L86B, P87B, I88B, V89B, Y90B, Y91B,
    V92B, G93B, P96B, V98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸
    残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  204. 【請求項２０４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１９３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  205. 【請求項２０５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項１９３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  206. 【請求項２０６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20
    , 41-81, 及び 103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２０５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  207. 【請求項２０７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J
    , D3J, T4J, N5J, Y6J, C7J, F8J, S9J, S10J, T11J, E12J, K13J, N14J, C15J,
    C16J, V17J, R18J, Q19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, L45J, G46J, P47J,
    C48J, P49J, Y50J, I51J, W52J, S53J, L54J, D55J, T56J, Q57J, Y58J, S59J,
    K60J, V61J, L62J, A63J, L64J, Y65J, N66J, Q67J, H68J, N69J, P70J, G71J,
    A72J, S73J, A74J, A75J, P76J, C77J, C78J, V79J, P80J, Q81J, N103J, M104
    J, I105J, V106J, R107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊは
    任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォ
    ーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項２０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  208. 【請求項２０８】蛋白質はヒトヒトトランスフォーミング成長因子β２モノマー
    である請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  209. 【請求項２０９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-4
    0からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２０８の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  210. 【請求項２１０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D2
    7B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２０９のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  211. 【請求項２１１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK25Z, R26Z
    , K31Z, H34Z, E35Z, 及び K37Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２
    ０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  212. 【請求項２１２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, K2
    5U, R26U, D27U, K31U, H34U, 及び K37U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項２０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  213. 【請求項２１３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I2
    2Z, F24Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, I33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, N40Z, Y21B, I2
    2B, F24B, L28B, G29B, W30B, W32B, I33B, P36B, G38B, Y39B, 及び N40B（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２
    ０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  214. 【請求項２１４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-1
    02からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２０８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  215. 【請求項２１５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82B, E8
    4B, 及び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  216. 【請求項２１６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK94Z 及び
    K87Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランスフォーミ
    ング成長因子ファミリー蛋白質。
  217. 【請求項２１７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82U, E8
    4U, K94U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  218. 【請求項２１８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L83Z, P8
    5Z, L86Z, T87Z, I88Z, L89Z, Y90Z, Y91Z, I92Z, G93Z, T95Z, P96Z, I98Z, Q1
    00Z, L101Z, S102Z, L83B, P85B, L86B, T87B, I88B, L89B, Y90B, Y91B, I92B,
    G93B, T95B, P96B, I98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸
    残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  219. 【請求項２１９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２０８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  220. 【請求項２２０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２０８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  221. 【請求項２２１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20
    , 41-81及び103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２２０のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  222. 【請求項２２２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J
    , D3J, A4J, A5J, Y6J, C7J, F8J, R9J, N10J, V11J, Q12J, D13J, N14J, C15J,
    C16J, L17J, R18J, P19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, A45J, G46J, A47J,
    C48J, P49J, Y50J, L51J, W52J, S53J, S54J, D55J, T56J, Q57J, H58J, S59J,
    R60J, V61J, L62J, S63J, L64J, Y65J, N66J, T67J, I68J, N69J, P70J, E71J,
    A72J, S73J, A74J, S75J, P76J, C77J, C78J, V79J, S80J, Q81J, N103J, M104
    J, I105J, V106J, K107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊは
    任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォ
    ーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項２２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  223. 【請求項２２３】蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子β３モノマーであ
    る請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  224. 【請求項２２４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-4
    0からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２２３の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  225. 【請求項２２５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D2
    7B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２２４のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  226. 【請求項２２６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR25Z, K31Z
    , H34Z, 及び K37Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  227. 【請求項２２７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, R2
    5U, D27U, K31U, H34U, E35U, 及び K37U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  228. 【請求項２２８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I2
    2Z, F24Z, Q26Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, V33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, Y40Z, Y2
    1B, I22B, F24B, Q26B, L28B, G29B, W30B, W32B, V33B, P36B, G38B, Y39B, 及
    び Y40B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  229. 【請求項２２９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-1
    02からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２２３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  230. 【請求項２３０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82B, E8
    4B, 及び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  231. 【請求項２３１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR94Z 及び
    K97Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランスフォーミ
    ング成長因子ファミリー蛋白質。
  232. 【請求項２３２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82U, E8
    4U, R94U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  233. 【請求項２３３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L83Z, P8
    5Z, L86Z, T87Z, I88Z, L89Z, Y90Z, Y91Z, V92Z, G93Z, T95Z, P96Z, V98Z, Q1
    00Z, L101Z, S102Z, L83B, P85B, L86B, T87B, I88B, L89B, Y90B, Y91B, V92B,
    G93B, T95B, P96B, V98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸
    残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  234. 【請求項２３４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２２３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  235. 【請求項２３５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２２３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  236. 【請求項２３６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20
    , 41-81, 及び 103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２３５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  237. 【請求項２３７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J
    , D3J, T4J, N5J, Y6J, C7J, F8J, R9J, N10J, L11J, E12J, E13J, N14J, C15J,
    C16J, V17J, R18J, P19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, S45J, G46J, P47J,
    C48J, P49J, Y50J, L51J, R52J, S53J, A54J, D55J, T56J, T57J, H58J, S59J,
    T60J, V61J, L62J, G63J, L64J, Y665J, N66J, T67J, L68J, N69J, P70J, E71J
    , A72J, S73J, A74J, S75J, P76J, C77J, C78J, V79J, P80J, Q81J, N103J, M10
    4J, V105J, V106J, K107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊ
    は任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフ
    ォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミ
    ング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用
    の増大をもたらす請求項２３６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
    蛋白質。
  238. 【請求項２３８】蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子(TGF)-β4/ebafサ
    ブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
    蛋白質。
  239. 【請求項２３９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置267-
    287からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２３８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  240. 【請求項２４０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D269B 及
    び E282B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  241. 【請求項２４１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK274Z 及び
    K277Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  242. 【請求項２４２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D269U, K
    274U, K277U, 及び E282（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  243. 【請求項２４３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y267Z, I
    268Z, L270Z, Q271Z, G272Z, M273Z, W275Z, A276Z, N278Z, W279Z, V280Z, L28
    1Z, P283Z, P284Z, G285Z, F286Z, L287Z, Y267B, I268B, L270B, Q271B, G272B
    , M273B, W275B, A276B, N278B, W279B, V280B, L281B, P283B, P284B, G285B,
    F286B, 及び L287B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  244. 【請求項２４４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置318
    〜337からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２３
    ８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  245. 【請求項２４５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E318B 及
    び E330B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  246. 【請求項２４６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK329Z, R33
    3Z, 及び R335Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  247. 【請求項２４７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E318U, K
    329U, E330U, 及び R333U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  248. 【請求項２４８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T319Z, A
    320Z, S321Z, L322Z, P323Z, M324Z, I325Z, V328Z, S327Z, I328Z, G331Z, G33
    2Z, T334Z, P336Z, Q337Z, T319B, A320B, S321B, L322B, P323B, M324B, I325B
    , V326B, S327B, I328B, G331B, G332B, T334B, P336B, 及び Q337B（式中Ｚは
    酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２４４の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  249. 【請求項２４９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２３８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  250. 【請求項２５０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２３８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  251. 【請求項２５１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-26
    6, 288-317及び338-370からなる群から選ばれる位置である請求項２５０のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  252. 【請求項２５２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, W2J
    , P3J, L4J, W5J, L6J, C7J, W8J, A9J, L10J, W11J, V12J, L13J, P14J, L15J,
    A16J, G17J, P18J, G19J, A20J, A21J, L22J, T23J, E24J, E25J, Q26J, L27J,
    L28J, A29J, S30J, L31J, L32J, R33J, Q34J, L35J, Q36J, L37J, S38J, E39J,
    V40J, P41J, V42J, L43J, D44J, R45J, A46J, D47J, M48J, E49J, K50J, L51J,
    V52J, I53J, P54J, A55J, H56J, V57J, R58J, A59J, Q60J, Y61J, V62J, V63J,
    L64J, L65J, R66J, R67J, D68J, G69J, D70J, R71J, S72J, R73J, G74J, K75J,
    R76J, F77J, S78J, Q79J, S80J, F81J, R82J, E83J, V84J, A85J, G86J, R87J,
    F88J, L89J, A90J, S91J, E92J, A93J, S94J, T95J, H96J, L97J, L98J, V99J,
    F100J, G101J, M102J, E103J, Q104J, R105J, L106J, P107J, P108J, N109J, S
    110J, E111J, L112J, V113J, Q114J, A115J, V116I, L117J, R118J, L119J, F12
    0J, Q121J, E122J, P123J, V124J, P125J, Q126J, G127J, A128J, L129J, H130J
    , R131J, H132J, G133J, R134J, L135J, S136J, P137J, A138J, A139J, P140J,
    K141J, A142J, R143J, V144J, T145J, V146J, E147J, W148J, L149J, V150, R15
    1J, D152J, D153J, G154J, S155J, N156J, R157J, T158J, S159J, L160J, I161J
    , D162J, S163J, R164J, L165J, V166J, S167J, V168J, H169J, E170J, S171J,
    G172J, W173J, K174J, A175J, F176J, D177J, V178J, T179J, E180J, A181J, V1
    82J, N183J, F184J, W185J, Q186J, Q187J, L188J, S189J, R190J, P191J, P192
    J, E193J, P194J, L195J, L196J, V197J, Q198J, V199J, S200J, V201J, Q202J,
    R203J, E204J, H205J, L206J, G207J, P208J, L209J, A210J, S211J, G212J, A
    213J, H214J, K215J, L216J, V217J, R218J, F219J, A220J, S221J, Q222J, G22
    3J, A224J, P225J, A226J, G227J, L228J, G229J, E230J, P231J, Q232J, L233J
    , E234J, L235J, H236J, T237J, L238J, D239J, L240J, R241J, D242J, Y243J,
    G244J, A245J, Q246J, G247J, D248J, C249J, D250J, P251J, E252J, A253J, P2
    54J, M255J, T256J, E257J, G258J, T259J, R260J, C261J, C262J, R263J, Q264
    J, E265J, M266J, A288J, Y289J, E290J, C291J, V292J, G293J, T294J, C295J,
    Q296J, Q297J, P298J, P299J, E300J, A301J, L302J, A303J, F304J, N305J, W
    306J, P307J, F308J, L309J, G310J, P311J, R312J, Q313J, C314J, I315J, A31
    6J, S317J, V338J, V339J, S340J, L341J, P342J, N343J, M344J, R345J, V346J
    , Q347J, K348J, C349J, S350J, C351J, A352J, S353J, D354J, G355J, A356J,
    L357J, V358J, P359J, R360J, R361J, L362J, Q363J, H364J, R365J, P366J, W3
    67J, C368J, I369J, 及び H370J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を
    含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記β
    ヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和
    性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２５１のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  253. 【請求項２５３】蛋白質はヒトニュールツリン(neurturin)である請求項１９２
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  254. 【請求項２５４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置104-
    129からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２５３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  255. 【請求項２５５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E107B, E
    109B, E114B, D122B, 及び E123B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ２５４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  256. 【請求項２５６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR106Z, R11
    1Z, 及び R128Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  257. 【請求項２５７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R106U, E
    107U, E109U, R111U, E114U, D122U, E123U, 及び R128U（式中Ｕは中性アミノ
    酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突
    然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白
    質。
  258. 【請求項２５８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、G104Z, L
    105Z, L108Z, V110Z, V112Z, S113Z, L11SZ, G116Z, L117Z, G118Z, Y119Z, A12
    0Z, S121Z, T124Z, V125Z, L126Z, F127Z, Y129Z, G104B, L105B, L108B, V110B
    , V112B, S113B, L115B, G116B, L117B, G118B, Y119B, A120B, S121B, T124B,
    V125B, L126B, F127B, 及び Y129B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  259. 【請求項２５９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置167-
    191からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２５３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  260. 【請求項２６０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E171B, D
    172B, E173B, D178B, 及び E188B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  261. 【請求項２６１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH180Z, R18
    2Z, H184Z, 及び H187Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  262. 【請求項２６２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R166U, E
    171U, D172U, E173U, D178U, H180U, R182U, H184U, H187U, E188U, 及び R192U
    （式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    中性残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒトトランスフォーミング成
    長因子ファミリー蛋白質。
  263. 【請求項２６３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P167Z, T
    168Z, A169Z, Y170Z, V174Z, S175Z, F176Z, L177Z, A179Z, S181Z, Y183Z, T18
    5Z, V186Z, L189Z, S190Z, A191Z, P167B, T168B, A169B, Y170B, V174B, S175B
    , F176B, L177G, A179B, S181B, Y183B, T185B, V186B, L189B, S190B, 及び A1
    91B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む
    請求項２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  264. 【請求項２６４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２５３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  265. 【請求項２６５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２５３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  266. 【請求項２６６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-10
    3, 130-165及び194-197からなる群から選ばれる位置である請求項２６５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  267. 【請求項２６７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1I, Q2J
    , R3J, W4J, K5J, A6J, A7J, A8J, L9J, A10J, S11J, V12J, L13J, C14J, S15J,
    S16J, V17J, L18J, S19J, I20J, W21J, M22J, C23J, R24J, E25J, G26J, L27J,
    L28J, L29J, S30J, H31J, R32J, L33J, G34J, P35J, A36J, L37J, V38J, P39J,
    L40J, H41J, R42J, L43J, P44J, R45J, T46J, L47J, D48J, A49J, R50J, I51J,
    A52J, R53J, L54J, A55J, Q56J, Y57J, R58J, A59J, L60J, L61J, Q62J, G63J,
    A64J, P65J, D66J, A67J, M68J, E69J, L70J, R71J, E72J, L73J, T74J, P75J,
    W76J, A77J, G78J, R79J, P80J, P81J, G82J, P83J, R84J, R85J, R86J, A87J,
    G88J, P89J, R90J, R91J, R92J, R93J, A94J, R95J, A96J, R97J, L98J, G99J,
    A100J, R101J, P102J, C103J, C130J, A131J, G132J, A133J, C134J, E135J, A
    136J, A137J, A138J, R139J, V140J, Y141J, D142J, L143J, G144J, L145J, R14
    6J, R147J, L148J, R149J, Q150J, R151J, R152J, R153J, L154J, R155J, R156J
    , E157J, R158J, V159J, R160J, A161J, Q162J, P163J, C164J, C165J, C194J,
    A195J, C196J, 及び V197J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、
    それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピ
    ン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有
    する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２６６のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  268. 【請求項２６８】蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) A αサブユニットである請
    求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  269. 【請求項２６９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置266-
    286からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２６８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  270. 【請求項２７０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E273B及
    びE277B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  271. 【請求項２７１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR278Z（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸
    性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  272. 【請求項２７２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E273U, E
    277U, 及び R278U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  273. 【請求項２７３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A266Z, L
    267Z, N268Z, I269Z, S270Z, F271Z, Q272Z, L274Z, G275Z, W276Z, W279Z, I28
    0Z, V281Z, Y282Z, P283Z, P284Z, S285Z, F286Z, A266B, L267B, N268B, I269B
    , S270B, F271B, Q272B, L274B, G275B, W276B, W279B, I280B, V281B, Y282B,
    P283B, P284B, S285B, 及び F286B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  274. 【請求項２７４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置332-
    359からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２６８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  275. 【請求項２７５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D345B 及
    び E353B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  276. 【請求項２７６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR336Z, H33
    9Z, R341Z, 及び K351Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  277. 【請求項２７７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R336U, H
    339U, R341U, D345U, K351U, 及び E353U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  278. 【請求項２７８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P332Z, G
    333Z, T334Z, M335Z, P337Z, L338Z, V340Z, T342Z, T343Z, S344Z, G346Z, G34
    7Z, Y348Z, S349Z, F350Z, Y352Z, T354Z, V355Z, P356Z, N357Z, L358Z, L359Z
    , P332B, G333B, T334B, M335B, P337B, L338B, V340B, T342B, T343B, S344B,
    G346B, G347B, Y348B, S349B, F350B, Y352B, T354B, V355B, P356B, N357B, L3
    58B, 及び L359B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸
    である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突
    然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白
    質。
  279. 【請求項２７９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２６８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  280. 【請求項２８０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２６８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  281. 【請求項２８１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-26
    5, 287-33J及び360-366からなる群から選ばれる位置である請求項２８０のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  282. 【請求項２８２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, V2J
    , L3J, H4J, L5J, L6J, L7J, F8J, L9J, L10J, L11J, T12J, P13J, Q14J, G15J,
    G16J, H17J, S18J, C19J, Q20J, G21J, L22J, E23J, L24J, A25J, R26J, E27J,
    L28J, V29J, L30J, A31J, K32J, V33J, R34J, A35J, L36J, F37J, L38J, D39J,
    A40J, L41J, G42J, P43J, P44J, A45J, V46J, T47J, R48J, E49J, G50J, G51J,
    D52J, P53J, G54J, V55J, R56J, R57J, L58J, P59J, R60J, R61J, H62J, A63J,
    L64J, G65J, G66J, F67J, T68J, H69J, R70J, G71J, S72J, E73J, P74J, E75J,
    E76J, E77J, E78J, D79J, V80J, S81J, Q82J, A83J, I84J, L85J, F86J, P87J,
    A88J, T89J, D90J, A91J, S92J, C93J, E94J, D95J, K96J, S97J, A98J, A99J,
    R100J, G101J, L102J, A103J, Q104J, E105J, A106J, E107J, E108J, G109J, L
    110J, F111J, R112J, Y113J, M114J, F115J, R116J, P117J, S118J, Q119J, H12
    0J, T121J, R122J, S123J, R124J, Q125J, V126J, T127J, S128J, A129J, Q130J
    , L131J, W132J, F133J, H134J, T135J, G136J, L137J, D138J, R139J, Q140J,
    G141J, T142J, A143J, A144J, S145J, N146J, S147J, S148J, E149J, P150J, L1
    51J, L152J, G153J, L154J, L155J, A156J, L157J, S158J, P159J, G160J, G161
    J, P162J, V163J, A164J, V165J, P166J, M167J, S168J, L169J, G170J, H171J,
    A172J, P173J, P174J, H175J, W176J, A177J, V178J, L179J, Hl80J, L181J, A
    182J, T183J, S184J, A185J, L186J, S187J, L188J, L189J, T190J, H191J, P19
    2J, V193J, L194J, V195J, L196J, L197J, L198J, R199J, C200J, P201J, L202J
    , C203J, T204J, C205J, S206J, A207J, R208J, P209J, E210J, A211J, T212J,
    P213J, F214J, L215J, V216J, A217J, H218J, T219J, R220J, T221J, R222J, P2
    23J, P224J, S225J, G226J, G227J, E228J, R229J, A230J, R231J, R232J, S233
    J, T234J, P235J, L236J, M237J, S238J, W239J, P240J, W241J, S242J, P243J,
    S244J, A245J, L246J, R247J, L248J, L249J, Q250J, R251J, P252J, P253J, E
    254J, E255J, P256J, A257J, A258J, H259J, A260J, N261J, C262J, H263J, R26
    4J, V265J, I287J, F288J, H289J, Y290J, C291J, H292J, G293J, G294J, C295J
    , G296J, L297J, H298J, I299J, P300J, P301J, N302J, L303J, S304J, L305J,
    P306J, V307J, P308J, G309J, A310J, P311J, P312J, T313J, P314J, A315J, Q3
    16J, P317J, Y318J, S319J, L320J, L321J, P322J, G323J, A324J, Q325J, P326
    J, C327J, C328J, A329J, A330J, L331J, T360J, Q361J, H362J, C363J, A364J,
    C365J, 及び l366J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは
    前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造
    と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受
    容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２８１のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  283. 【請求項２８３】蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) A βサブユニットである請
    求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  284. 【請求項２８４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置326-
    346からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２８３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  285. 【請求項２８５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D332B 及
    び D337B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  286. 【請求項２８６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK331Z 及び
    H346Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  287. 【請求項２８７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K331U, D
    332U, D337U, 及び H346U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  288. 【請求項２８８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F326Z, F
    327Z, V328Z, S329Z, F330Z, I333Z, G334Z, W335Z, N336Z, W338Z, I339Z, I34
    0Z, A341Z, P342Z, S343Z, G344Z, Y345Z, F326B, F327B, V328B, S329B, F330B
    , I333B, G334B, W335B, N336B, W338B, I339B, I340B, A341B, P342B, S343B,
    G344B, 及び Y345B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  289. 【請求項２８９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置395-
    419からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２８３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  290. 【請求項２９０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D405B, D
    406B, 及び D414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  291. 【請求項２９１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK395Z, R39
    7Z, K412Z, 及び K413Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  292. 【請求項２９２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K395U, R
    397U, D405, D406, K412U, K413U, 及び D414U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  293. 【請求項２９３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L396Z, P
    398Z, M399Z, S400Z, M401Z, L402Z, Y403Z, Y404Z, G407Z, P408Z, N409Z, I41
    0Z, I411Z, I415Z, Q416Z, N417Z, M418Z, I419Z, L396B, P398B, M399B, S400B
    , M401B, L402B, Y403B, Y404B, G407B, P408B, N409B, I410B,I411B,I415B, Q4
    16B, N417B, M418B, 及び I419B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは
    塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残
    基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトトランスフォーミング成長因子
    ファミリー蛋白質。
  294. 【請求項２９４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２８３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  295. 【請求項２９５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２８３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  296. 【請求項２９６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-32
    5, 347-394, 及び 420-426からなる群から選ばれる位置である請求項２９５のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  297. 【請求項２９７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, P2J
    , L3J, L4J, W5J, L6J, R7J, G8J, F9J, L10J, Lh1J, A12J, S13J, C14J, W15J,
    I16J, I17J, V18J, R19J, S20J, S21J, P22J, T23J, P24J, G25J, S26J, E27J,
    G28J, H29J, S30J, A31J, A32J, P33J, D34J, C35J, P36J, S37J, C38J, A39J,
    L40J, A41J, A42J, L43J, P44J, K45J, D46J, V47J, P48J, N49J, S50J, Q51J,
    P52J, E53J, M54J, V55J, E56J, A57J, V58J, K59J, K60J, H61J, I62J, L63J,
    N64J, M65J, L66J, H67J, L68J, K69J, K70J, R71J, P72J, D73J, V74J, T75J,
    Q76J, P77J, V78J, P79J, K80J, A81J, A82J, L83J, L84J, N85J, A86J, I87J,
    R88J, K89J, L90J, H91J, V92J, G93J, K94J, V95J, G96J, E97J, N98J, G99J,
    Y100J, V101J, E102J, I103J, E104J, D105J, D106J, I107J, G108J, R109J, R
    110J, A111J, E112J, M113J, N114J, E115J, L116J, M117J, E118J, Q119J, T12
    0J, S121J, E122J, I123J, I124J, T125J, F126J, A127J, E128J, S129J, G130J
    , T131J, A132J, R133J, K134J, T135J, L136J, H137J, F138J, E139J, I140J,
    S141J, K142J, E143J, G144J, S145J, D146J, L147J, S148J, V149J, V150J, E1
    51J, R152J, A153J, E154J, V155J, W156J, L157J, F158J, L159J, K160J, V161
    J, P162J, K163J, A164J, N165J, R166J, T167J, R168J, T169J, K170J, V171J,
    T172J, I173J, R174J, L175J, F176J, Q177J, Q178J, Q179J, K180J, H181J, P
    182J, Q183J, G184J, S185J, L186J, D187J, T188J, G189J, E190J, E191J, A19
    2J, E193J, E194J, V195J, G196J, L197J, K198J, G199J, E200J, R201J, S202J
    , E203J, L204J, L205J, L206J, S207J, E208J, K209J, V210J, V211J, D212J,
    A213J, R214J, K215J, S216J, T217J, W218J, H219J, V220J, F221J, P222J, V2
    23J, S224J, S225J, S226J, I227J, Q228J, R229J, L230J, L231J, D232J, Q233
    J, G234J, K235J, S236J, S237J, L238J, D239J, V240J, R241J, I242J, A243J,
    C244J, E245J, Q246J, C247J, Q248J, E249J, S250J, G251J, A252J, S253J, L
    254J, V255J, 1256J, L257J, G258J, K259J, K260J, K261J, K262J, K263J, E26
    4J, E265J, E266J, G267J, E268J, G269J, K270J, K271J, K272J, G273J, G274J
    , G275J, E276J, G277J, G278J, A279J, G280J, A281J, D282J, E283J, E284J,
    K285J, E286J, Q287J, S288J, H289J, R290J, P291J, F292J, L293J, M294J, L2
    95J, Q296J, A297J, R298J, Q299J, S300J, E301J, D302J, H303J, P304J, H305
    J, R306J, R307J, R308J, R309J, R310J, G311J, L312J, E313J, C314J, D315J,
    G316J, K317J, V318J, N319J, I320J, C321J, C322KJ, 323J, K324J, Q325J, A
    347J, N348J, Y349J, C350J, E351J, G352J, E353J, C354J, P355J, S356J, H35
    7J, I358J, A359J, G360J, T361J, S362J, G363J, S364J, S365J, L366J, S367J
    , F368J, H369J, S370J, T371J, V372J, I373J, N374J, H375J, Y376J, R377J,
    M378J, R379GJ, 380J, H381J, S382J, P383J, F384J, A385J, N386J, L387J, K3
    88J, S389J, C390J, C391J, V392J, P393J, T394J, V420J, E421J, E422J, C423
    J, G424J, C425J, 及び S426J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含
    み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘ
    アピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性
    を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２９６のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  298. 【請求項２９８】蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) B βサブユニットである請
    求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  299. 【請求項２９９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置308-
    328からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２９８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  300. 【請求項３００】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311B及
    びD319B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  301. 【請求項３０１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR313Z（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸
    性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  302. 【請求項３０２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311U, R
    313U, 及びD319U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  303. 【請求項３０３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F308Z, F
    309Z, I310Z, F312Z, L314Z, I315Z, G316Z, W317Z, N318Z, W320Z, I321Z, I32
    2Z, A323Z, P324Z, T325Z, G326Z, Y327Z, Y328Z, F308B, F309B, I310B, F312B
    , L314B, I315B, G31GB, W317B, N318B, W320B, I321B, I322B, A323B, P324B, T325B, G326B, Y327B, 及び Y328B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  304. 【請求項３０４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-
    400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２９８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  305. 【請求項３０５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D386B, D
    387B, E388B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  306. 【請求項３０６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K39
    3Z, 及び K394Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  307. 【請求項３０７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D
    386U, D387U, E388U, K393U, R394U, 及び D395U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  308. 【請求項３０８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L377Z, S
    378Z, T379Z, M380Z, S381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, Y389Z, N390Z, I39
    1Z, V392Z, V396Z, P397Z, N398Z, M399Z, I400Z, L377B, S378B, T379B, M380B
    , S381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, Y389B, N390B, I391B, V392B, V396B,
    P397B, N398B, M399B, 及び I400B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  309. 【請求項３０９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２９８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  310. 【請求項３１０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項２９８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  311. 【請求項３１１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-30
    7, 329-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項３１０のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  312. 【請求項３１２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, D2J
    , G3J, L4J, P5J, G6J, R7J, A8J, L9J, G10J, A11J, A12J, C13J, L14J, L15J,
    L16J, L17J, A18J, A19J, G20J, W21J, L22J, G23J, P24J, E25J, A26J, W27J,
    G28J, S29J, P30J, T31J, P32J, P33J, P34J, T35J, P36J, A37J, A38J, P39J,
    P40J, P41J, P42J, P43J, P44J, P45J, G46J, S47J, P48J, G49J, G50J, S51J,
    Q52J, D53J, T54J, C55J, T56J, S57J, C58J, G59J, G60J, F61J, R62J, R63J,
    P64J, E65J, E66J, L67J, G68J, R69J, V70J, D71J, G72J, D73J, F74J, L75J,
    E76J, A77J, V78J, K79J, R80J, H81J, I82J, L83J, S84J, R85J, L86J, Q87J,
    M88J, R89J, G90J, R91J, P92J, N93J, I94J, T95J, H96J, A97J, V98J, P99J,
    K100J, A101J, A102J, M103J, V104J, T105J, A106J, L107J, R108J, K109J, L
    110J, H111J, A112J, G113J, K114J, V115J, R116J, E117J, D118J, G119J, R12
    0J, V121J, E122J, I123J, P124J, H125J, L126J, D127J, G128J, H129J, A130J
    , S131J, P132J, G133J, A134J, D135J, G136J, Q137J, E138J, R139J, V140J,
    S141J, E142J, I143J, I144J, S145J, F146J, A147J, E148J, T149J, D150J, G1
    51J, L152J, A153J, S154J, S155J, R156J, V157J, R158J, L159J, Y160J, F161
    J, F162J, I163J, S164J, N165J, E166J, G167J, N168J, Q169J, N170J, L171J,
    F172J, V173J, V174J, Q175J, A176J, S177J, L178J, W179J, L180J, Y181J, L
    182J, K183J, L184J, L185J, P186J, Y187J, V188J, L189J, E190J, K191J, G19
    2J, S193J, R194J, R195J, K196J, V197J, R198J, V199J, K200J, V201J, Y202J
    , F203J, Q204J, E205J, Q206J, G207J, H208J, G209J, D210J, R211J, W212J,
    N213J, M214J, V215J, E216J, K217J, R218J, V219J, D220J, L221J, K222J, R2
    23J, S224J, G225J, W226J, H227J, T228J, F229J, P230J, L231J, T232J, E233
    J, A234J, I235J, Q236J, A237J, L238J, F239J, E240J, R241J, G242J, E243J,
    R244J, R245J, L246J, N247J, L248J, D249J, V250J, Q251J, C252J, D253J, S
    254J, C255J, Q256J, E257J, L258J, A259J, V260J, V261J, P262J, V263J, F26
    4J, V265J, D266J, P267J, G268J, E269J, E270J, S271J, H272J, R273J, P274J
    , F275J, V276J, V277J, V278J, Q279J, A280J, R281J, L282J, G283J, D284J,
    S285J, R286J, H287J, R288J, I289J, R290J, K291J, R292J, G293J, L294EJ, 2
    95CJ, 296J, D297J, G298J, R299J, T300J, N301J, L302J, C303J, C304J, R305
    J, Q306J, Q307J, G329J, N330J, Y331J, C332J, E333J, G334J, S335J, C336J,
    P337J, A338J, Y339J, L340J, A341J, G342J, V343J, P344J, G345J, S346J, A
    347J, S348J, S349J, F350J, H351J, T352J, A353J, V354J, V355J, N356J, Q35
    7J, Y358J, R359J, M360J, R361J, G362J, L363J, N364J, P365J, G366J, T367J
    , V368J, N369J, S370J, C371J, C372J, I373J, P374J, T375J, V401J, E402J,
    E403J, C404J, G405J, C406J, 及び A407J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突
    然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白
    質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３１
    １のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  313. 【請求項３１３】蛋白質はヒトアクチビン(activin) A サブユニットである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  314. 【請求項３１４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置326-
    346からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３１３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  315. 【請求項３１５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D332B 及
    び D337B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  316. 【請求項３１６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK331Z 及び
    H346Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  317. 【請求項３１７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K331U, D
    332U, D337U, 及び H346U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  318. 【請求項３１８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F326Z, F
    327Z, V328Z, S329Z, F330Z, I333Z, G334Z, W335Z, N336Z, W338Z, I339Z, I34
    0Z, A341Z, P342Z, S343Z, G344Z, Y345Z, F326B, F327B, V328B, S329B, F330B
    , I333B, G334B, W335B, N336B, W338B, I339B, I340B, A341B, P342B, S343B,
    G344B, 及び Y345B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  319. 【請求項３１９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置395-
    419からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３１３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  320. 【請求項３２０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D405B, D
    406B, 及び D414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  321. 【請求項３２１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK395Z, R39
    7Z, K412Z, 及び K413Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  322. 【請求項３２２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K395U, R
    397U, D405U, D406U, K412U, K413U, 及び D414U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  323. 【請求項３２３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L396Z, P
    398Z, M399Z, S400Z, M401Z, L402Z, Y403Z, Y404Z, G407Z, Q408Z, N409Z, I41
    0Z, I411Z, I415Z, Q416Z, N417Z, M418Z, I419Z, L396B, P398B, M399B, S400B
    , M401B, L402B, Y403B, Y404B, G407B, Q408B, N409B, I410B, I411B, I415B,
    Q416B, N417B, M418B, 及び I419B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  324. 【請求項３２４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３１３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  325. 【請求項３２５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３１３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  326. 【請求項３２６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-32
    5, 347-394及び420-426からなる群から選ばれる位置である請求項３２５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  327. 【請求項３２７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, P2J
    , L3J, L4J, W5J, L6J, R7J, G8J, F9J, L10J, L11J, A12J, S13J, C14J, W15J,
    I16J, I17J, V18J, R19J, S20J, S21J, P22J, T23J, P24J, G25J, S26J, E27J,
    G28J, H29J, S30J, A31J, A32J, P33J, D34J, C35J, P36J, S37J, C38J, A39J,
    L40J, A41J, A42J, L43J, P44J, K45J, D46J, V47J, P48J, N49J, S50J, Q51J,
    P52J, E53J, M54J, V55J, E56J, A57J, V58J, K59J, K60J, H61J, I62J, L63J,
    N64J, M65J, L66J, H67J, L68J, K69J, K70J, R71J, P72J, D73J, V74J, T75J,
    Q76J, P77J, V78J, P79J, K80J, A81J, A82J, L83J, L84J, N85J, A86J, I87J,
    R88J, K89J, L90J, H91J, V92J, G93J, K94J, V95J, G96J, E97J, N98J, G99J,
    Y100J, V101J, E102J, I103J, E104J, D105J, D106J, I107J, G108J, R109J, R
    110J, A111J, E112J, M113J, N114J, E115J, L116J, M117J, E118J, Q119J, T12
    0J, S121J, E122J, I123J, I124J, T125J, F126J, A127J, E128J, S129J, G130J
    , T131J, A132J, R133J, K134J, T135J, L136J, H137J, F138J, E139J, I140J,
    S141J, K142J, E143J, G144J, S145J, D146J, L147J, S148J, V149J, V150J, E1
    51J, R152J, A153J, E154J, V155J, W156J, L157J, F158J, L159J, K160J, V161
    J, P162J, K163J, A164J, N165J, R166J, T167J, R168J, T169J, K170J, V171J,
    T172J, I173J, R174J, L175J, F176J, Q177J, Q178J, Q179J, K180J, H181J, P
    182J, Q183J, G184J, S185J, L186J, D187J, T188J, G189J, E190J, E191J, A19
    2J, E193J, E194J, V195J, G196J, L197J, K198J, G199J, E200J, R201J, S202J
    , E203J, L204J, L205J, L206J, S207J, E208J, K209J, V210J, V211J, D212J,
    A213J, R214J, K215J, S216J, T217J, W218J, H219J, V220J, F221J, P222J, V2
    23J, S224J, S225J, S226J, I227J, Q228J, R229J, L230J, L231J, D232J, Q233
    J, G234J, K235J, S236J, S237J, L238J, D239J, V240J, R241J, I242J, A243J,
    C244J, E245J, Q246J, C247J, Q248J, E249J, S250J, G251J, A252J, S253J, L
    254J, V255J, L256J, L257J, G258J, K259J, K260J, K261J, K262J, K263J, E26
    4J, E265J, E266J, G267J, E268J, G269J, K270J, K271J, K272J, G273J, G274J
    , G275J, E276J, G277J, G278J, A279J, G280J, A281J, D282J, E283J, E284J,
    K285J, E286J, Q287J, S288J, H289J, R290J, P291J, F292J, L293J, M294J, L2
    95J, Q296J, A297J, R298J, Q299J, S300J, E301J, D302J, H303J, P304J, H305
    J, R306J, R307J, R308J, R309J, R310J, G311J, L312J, E313J, C314J, D315J,
    G316J, K317J, V318J, N319J, I320J, C321J, C322J, K323J, K324J, Q325J, A
    347J, N348J, Y349J, C350J, E351J, G352J, E353J, C354J, P355J, S356J, H35
    7J, I358J, A359J, G360J, T361J, S362J, G363J, S364J, S365J, L366J, S367J
    , F368J, H369J, S370J, T371J, V372J, I373J, N374J, H375J, Y376J, R377J,
    M378J, R379J, G380J, H381J, S382J, P383J, F384J, A385J, N386J, L387J, K3
    88J, S389J, C390J, C391J, V392J, P393J, T394J, V420J, E421J, E422J, C423
    J, G424J, C425J, 及び S426J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含
    み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘ
    アピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性
    を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３２６のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  328. 【請求項３２８】蛋白質はヒトアクチビン(activin) B サブユニットである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  329. 【請求項３２９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置308-
    328からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３２８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  330. 【請求項３３０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311B及
    びD319B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  331. 【請求項３３１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR313Z（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸
    性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  332. 【請求項３３２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311U, R
    31 3U及びD319U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  333. 【請求項３３３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F308Z, F
    309Z, I310Z, F312Z, L314Z, I315Z, G316Z, W317Z, N318Z, W320Z, I321Z, I32
    2Z, A323Z, P324Z, T325Z, G326Z, Y327Z, Y328Z, F308B, F309B, I310B, F312B
    , L314B, I315B, G316B, W317B, N318B, W320B, I321B, I322B, A323B, P324B,
    T325B, G326B, Y327B, 及び Y328B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  334. 【請求項３３４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-
    400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３２８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  335. 【請求項３３５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D386B, D
    387B, E388B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  336. 【請求項３３６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K39
    3Z及びR394Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  337. 【請求項３３７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D
    386U, D387U, E388U, K393U, R394U及びD395U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  338. 【請求項３３８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L377Z, S
    378Z, T279Z, M380Z, S381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, Y389Z, N390Z, I39
    1Z, V392Z, V396Z, P397Z, N398Z, M399Z, I400Z, L377B, S378B, T279B, M380B
    , S381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, Y389B, N390B, I391B, V392B, V396B,
    P397B, N398B, M399B及びI400B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩
    基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基
    を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  339. 【請求項３３９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３２８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  340. 【請求項３４０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３２８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  341. 【請求項３４１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-30
    7, 329-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項３４０のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  342. 【請求項３４２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, D2J
    , G3J, L4J, P5J, G6J, R7J, A8J, L9J, G10J, A11J, A12J, C13J, L14J, L15J,
    L16J, L17J, A18J, A19J, G20J, W21J, L22J, G23J, P24J, E25J, A26J, W27J,
    G28J, S29J, P30J, T31J, P32J, P33J, P34J, T35J, P36J, A37J, A38J, P39J,
    P40J, P41J, P42J, P43J, P44J, P45J, G46J, S47J, P48J, G49J, G50J, S51J,
    Q52J, D53J, T54J, C55J, T56J, S57J, C58J, G59J, G60J, F61J, R62J, R63J,
    P64J, E65J, E66J, L67J, G68J, R69J, V70J, D71J, G72J, D73J, F74J, L75J,
    E76J, A77J, V78J, K79J, R80J, H81J, I82J, L83J, S84J, R85J, L86J, Q87J,
    M88J, R89J, G90J, R91J, P92J, N93J, I94J, T95J, H96J, A97J, V98J, P99J,
    K100J, A101J, A102J, M103J, V104J, T105J, A106J, L107J, R108J, K109J, L
    110J, H111J, A112J, G113J, K114J, V115J, R116J, E117J, D118J, G119J, R12
    0J, V121J, E122J, I123J, P124J, H125J, L126J, D127J, G128J, H129J, A130J
    , S131J, P132J, G133J, A134J, D135J, G136J, Q137J, E138J, R139J, V140J,
    S141J, E142J, I143J, I144J, S145J, F146J, A147J, E148J, T149J, D150J, G1
    51J, L152J, A153J, S154J, S155J, R156J, V157J, R158J, L159J, Y160J, F161
    J, F162J, I163J, S164J, N165J, E166J, G167J, N168J, Q169J, N170J, L171J,
    F172J, V173J, V174J, Q175J, A176J, S177J, L178J, W179J, L180J, Y181J, L
    182J, K183J, L184J, L185J, P186J, Y187J, V188J, L189J, E190J, K191J, G19
    2J, S193J, R194J, R195J, K196J, V197J, R198J, V199J, K200J, V201J, Y202J
    , F203J, Q204J, E205J, Q206J, G207J, H208J, G209J, D210J, R211J, W212J,
    N213J, M214J, V215J, E216J, K217J, R218J, V219J, D220J, L221J, K222J, R2
    23J, S224J, G225J, W226J, H227J, T228J, F229J, P230J, L231J, T232J, E233
    J, A234J, I235J, Q236J, A237J, L238J, F239J, E240J, R241J, G242J, E243J,
    R244J, R245J, L246J, N247J, L248J, D249J, V250J, Q251J, C252J, D253J, S
    254J, C255J, Q256J, E257J, L258J, A259J, V260J, V261J, P262J, V263J, F26
    4J, V265J, D266J, P267J, G268J, E269J, E270J, S271J, H272J, R273J, P274J
    , F275J, V276J, V277J, V278J, Q279J, A280J, R281J, L282J, G283J, D284J,
    S285J, R286J, H287J, R288J, I289J, R290J, K291J, R292J, G293J, L294J, E2
    95J, C296J, D297J, G298J, R299J, T300J, N301J, L302J, C303J, C304J, R305
    J, Q306J, Q307J, G329J, N330J, Y331J, C332J, E333J, G334J, S335J, C336J,
    P337J, A338J, Y339J, L340J, A341J, G342J, V343J, P344J, G345J, S346J, A
    347J, S348J, S349J, F350J, H351J, T352J, A353J, V354J, V35J, 5N356J, Q35
    7J, Y358J, R359J, M360J, R361J, G362J, L363J, N364J, P365J, G366J, T367J
    , V368J, N369J, S370J, C371J, C372J, J373J, P374J, T375VJ, 401J, E402J,
    E403J, C404J, G405J, C406J, 及び A407J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突
    然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白
    質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３４
    １のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  343. 【請求項３４３】蛋白質はヒトミュラー管抑制物質(MIS)サブユニットである請
    求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  344. 【請求項３４４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置465-
    484からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３４３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  345. 【請求項３４５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E466B, D
    470B, E474B及びE481B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  346. 【請求項３４６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR465, R472
    及びR475（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  347. 【請求項３４７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R465U, E
    466U, D470U, R472U, E474U, R475U及びE481U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  348. 【請求項３４８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L467Z, S
    468Z, V469Z, L471Z, A473Z, S476Z, V477Z, L478Z, I479Z, P480Z, T482Z, Y48
    3Z, Q484Z, L467B, S468B, V469B, L471B, A473B, S476B, V477B, L478B, I479B
    , P480B, T482B, Y483B及びQ484B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは
    塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残
    基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子
    ファミリー蛋白質。
  349. 【請求項３４９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置530-
    553からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３４３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  350. 【請求項３５０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E541B及
    びE542B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  351. 【請求項３５１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK534Z, R54
    3Z, H547Z, 及び H548Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  352. 【請求項３５２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K534U, E
    541U, E542U, R543U, H547U及びH548U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ３４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  353. 【請求項３５３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A530Z, Y
    531Z, A532Z, G533Z, L535Z, L536Z, I537Z, S538Z, L539Z, S540Z, I544Z, S54
    5Z, A546Z, V549Z, P550Z, N551Z, M552Z, V553Z, A530B, Y531B, A532B, G533B
    , L535B, L536B, I537B, S538B, L539B, S540B, I544B, S545B, A546B, V549B,
    P550B, N551B, M552B, 及び V553B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  354. 【請求項３５４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３４３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  355. 【請求項３５５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３４３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  356. 【請求項３５６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-46
    4, 485-529及び554-560からなる群から選ばれる位置である請求項３５５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  357. 【請求項３５７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, R2J
    , D3J, L4J, P5J, L6J, T7J, S8J, L9J, A10J, L11J, V12J, L13J, S14J, A15J,
    L16J, G17J, A18J, L19J, L20J, G21J, T22J, E23J, A24J, L25J, R26J, A27J,
    E28J, E29J, P30J, A31J, V32J, G33J, T34J, S35J, G36J, L37J, I38J, F39J,
    R40J, E41J, D42J, L43J, D44J, W45J, P46J, P47J, G48J, I49J, P50J, Q51J,
    E52J, P53J, L54J, C55J, L56J, V57J, A58J, L59J, G60J, G61J, D62J, S63J,
    N64J, G65J, S66J, S67J, S68J, P69J, L70J, R71J, V72J, V73J, G74J, A75J,
    L76J, S77J, A78J, Y79J, E80J, Q81J, A82J, F83J, L84J, G85J, A86J, V87J,
    Q88J, R89J, A90J, R91J, W92J, G93J, P94J, R95J, D96J, L97J, A98J, T99J,
    F100J, G101J, V102J, C103J, N104J, T105J, G106J, D107J, R108J, Q109J, A
    110J, A111J, L112J, P113J, S114J, L115J, R116J, R117J, L118J, G119J, A12
    0J, W121J, L122J, R123J, D124J, P125J, G126J, G127J, Q128J, R129J, L130J
    , V131J, V132J, L133J, H134J, L135J, E136J, E137J, V138J, T139J, W140J,
    E141J, P142J, T143J, P144J, S145J, L146J, R147J, F148J, Q149J, E150J, P1
    51J, P152J, P153J, G154J, G155J, A156J, G157J, P158J, P159J, E160J, L161
    J, A162J, L163J, L164J, V165J, L166J, Y167J, P168J, G169J, P170J, G171J,
    P172J, E173J, V174J, T175J, V176J, T177J, R178J, A179J, G180J, L181J, P
    182J, G183J, A184J, Q185J, S186J, L187J, C188J, P189J, S190J, R191J, D19
    2J, T193J, R194J, Y195J, L196J, V197J, L198J, A199J, V200J, D201J, R202J
    , P203J, A204J, G205J, A206J, W207J, R208J, G209J, S210J, G211J, L212J,
    A213J, L214J, T215J, L216J, Q217J, P218J, R219J, G220J, E221J, D222J, S2
    23J, R224J, L225J, S226J, T227J, A228J, R229J, L230J, Q231J, A232J, L233
    J, L234J, F235J, G236J, D237J, D238J, H239J, R240J, C241J, F242J, T243J,
    R244J, M245J, T246J, P247J, A248J, L249J, L250J, L251J, L252J, P253J, R
    254J, S255J, E256J, P257J, A258J, P259J, L260J, P261J, A262J, H263J, G26
    4J, Q265J, L266J, D267J, T268J, V269J, P270J, F271J, P272J, P273J, P274J
    , R275J, P276J, S277J, A278J, E279J, L280J, E281J, E282J, S283J, P284J,
    P285J, S286J, A287J, D288J, P289J, F290J, L291J, E292J, T293J, L294J, T2
    95J, R296J, L297J, V298J, R299J, A300J, L301J, R302J, V303J, P304J, P305
    J, A306J, R307J, A308J, S309J, A310J, P311J, R312J, L313J, A314J, L315J,
    D316J, P317J, D318J, A319J, L320J, A321J, G322J, F323J, P324J, Q325J, G
    326J, L327J, V328J, N329J, L330J, S331J, D332J, P333J, A334J, A335J, L33
    6J, E337J, R338J, L339J, L340J, D341J, G342J, E343J, E344J, P345J, L346J
    , L347J, L348J, L349J, L350J, R351J, P352J, T353J, A354J, A355J, T356J,
    T357J, G358J, D359J, P360J, A361J, P362J, L363J, H364J, D365J, P366J, T3
    67J, S368J, A369J, P370J, W371J, A372J, T373J, A374J, L375J, A376J, R377
    J, R378J, V379J, A380J, A381J, E382J, L383J, Q384J, A385J, A386J, A387J,
    A388J, E389J, L390J, R391J, S392J, L393J, P394J, G395J, L396J, P397J, P
    398J, A399J, T400J, A401J, P402J, L403J, L404J, A405J, R406J, L407J, L40
    8J, A409J, L410J, C411J, P412J, G413J, G414J, P415J, G416J, G417J, L418J
    , G419J, D420J, P421J, L422J, R423J, A424J, L425J, L426J, L427J, L428J,
    K429J, A430J, L431J, Q432J, G433J, L434J, R435J, V436J, E437J, W438J, R4
    39J, G440J, R441J, D442J, P443J, R444J, G445J, P446J, G447J, R448J, A449
    J, Q450J, R451J, S452J, A453J, G454J, A455J, T456J, A457J, A458J, D459J,
    G460J, P461J, C462J, A463J, L464J, A485J, N486J, N487J, C488J, Q489J, G
    490J, V491J, C492J, G493J, W494J, P495J, Q496J, S497J, D498J, R499J, N50
    0J, P501J, R502J, Y503J, G504J, N505J, H506J, V507J, V508J, L509J, L510J
    , L511J, K512J, M513J, Q514J, A515J, R516J, G517J, A518J, A519J, L520J,
    A521J, R522J, P523J, P524J, C525J, C526J, V527J, P528J, T529J, A554J, T5
    55J, E556J, C557J, G558J, C559J, 及び R560J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基
    である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更
    する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
    蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項３５６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  358. 【請求項３５８】蛋白質はヒト骨形成因子-2 (BMP-2)サブユニットである請求項
    １９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  359. 【請求項３５９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置302-
    321からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３５８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  360. 【請求項３６０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D304B, D
    307B, 及び D312B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  361. 【請求項３６１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH321Z（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸
    性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  362. 【請求項３６２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D304U, D
    307U, D312U及びH321U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  363. 【請求項３６３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y302Z, V
    303Z, F305Z, S306Z, V308Z, G309Z, W310Z, N311Z, W313Z, I314Z, V315Z, A31
    6Z, P317Z, P318Z, G319Z, Y320Z, Y302B, V303B, F305B, S308B, V308B, G309B
    , W310B, N311B, W313B, I314B, V315B, A316B, P317B, P318B, G319B, 及び Y3
    20B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む
    請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  364. 【請求項３６４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置365-
    389からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３５８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  365. 【請求項３６５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E365B, D
    375B, E376B, E378B及びD387B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３
    ６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  366. 【請求項３６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK379Z 及び K383Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  367. 【請求項３６７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E365U D3
    75U, E376U E378U, K379U K383U及びD387U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  368. 【請求項３６８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L366Z, S
    367Z, A368Z, I369Z, S370Z, M371Z, L372Z, Y373Z, L374Z, N377Z, V380Z, V38
    1Z, L382Z, N384Z, Y385Z, Q386Z, M388Z, V389Z, L366B, S367B, A368B, I369B
    , S370B, M371B, L372B, Y373B, L374B, N377B, V380B, V381B, L382B, N384B,
    Y385B, Q386B, M388B及びV389B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩
    基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基
    を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  369. 【請求項３６９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３５８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  370. 【請求項３７０】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３５８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  371. 【請求項３７１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-30
    1, 322-364及び390-396からなる群から選ばれる位置である請求項３７０のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  372. 【請求項３７２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, V2J
    , A3J, G4J, T5J, R6J, C7J, L8J, L9J, A10J, L11J, L12J, L13J, P14J, Q15J,
    V16J, L17J, L18J, G19J, G20J, A21J, A22J, G23J, L24J, V25J, P26J, E27J,
    L28J, G29J, R30J, R31J, K32J, F33J, A34J, A35J, A36J, S37J, S38J, G39J,
    R40J, P41J, S42J, S43J, Q44J, P45J, S46J, D47J, E48J, V49J, L50J, S51J,
    E52J, F53J, E54J, L55J, R56J, L57J, L58J, S59J, M60J, F61J, G62J, L63J,
    K64J, Q65J, R66J, P67J, T68J, P69J, S70J, R71J, D72J, A73J, V74J, V75J,
    P76J, P77J, Y78J, M79J, L80J, D81J, L82J, Y83J, R84J, R85J, H86J, S87J,
    G88J, Q89J, P90J, G91J, S92J, P93J, A94J, P95J, D96J, H97J, R98J, L99J,
    E100J, R101J, A102J, A103J, S104J, R105J, A106J, N107J, T108J, V109J, R
    110J, S111J, F112J, H113J, H114J, E115J, E116J, S117J, L118J, E119J, E12
    0J, L121J, P122J, E123J, T124J, S125J, G126J, K127J, T128J, T129J, R130J
    , R131J, F132J, F133J, F134J, N135J, L136J, S137J, S138J, I139J, P140J,
    T141J, E142J, E143J, F144J, I145J, T146J, S147J, A148J, E149J, L150J, Q1
    51J, V152J, F153J, R154J, E155J, Q156J, M157J, Q158J, D159J, A160J, L161
    J, G162J, N163J, N164J, S165J, S166J, F167J, H168J, H169J, R170J, I171J,
    N172J, I173J, Y174J, E175J, I176J, I177J, K178J, P179J, A180J, T181J, A
    182J, N183J, S184J, K185J, F186J, P187J, V188J, T189J, R190J, L191J, L19
    2J, D193J, T194J, R195J, L196J, V197J, N198J, Q199J, N200J, A201J, S202J
    , R203J, W204J, E205J, S206J, F207J, D208J, V209J, T210J, P211J, A212J,
    V213J, M214J, R215J, W216J, T217J, A218J, Q219J, G220J, H221J, A222J, N2
    23J, H224J, G225J, F226J, V227J, V228J, E229J, V230J, A231J, H232J, L233
    J, E234J, E235J, K236J, Q237J, G238J, V239J, S240J, K241J, R242J, H243J,
    V244J, R245J, I256J, S247J, R248J, S249J, L250J, H251J, Q252J, D253J, E
    254J, H255J, S256J, W257J, S258J, Q259J, I260J, R261J, P262J, L263J, L26
    4J, V265J, T266J, F267J, G268J, H269J, D270J, G271J, K272J, G273J, H274J
    , P275J, L276J, H277J, K278J, R279J, E280J, K281J, R282J, Q283J, A284J,
    K285J, H286J, K287J, Q288J, R289J, K290J, R291J, L292J, K293J, S294J, S2
    95J, C296J, K297J, R298J, H299J, P300J, L301J, A322J, F323J, Y324J, C325
    J, H326J, G327J, E328J, C329J, P330J, F331J, P332J, L333J, A334J, D335J,
    H336J, L337J, N338J, S339J, T340J, N341J, H342J, A343J, I344J, V345J, Q
    346J, T347J, L348J, V349J, N350J, S351J, V352J, N353J, S354J, K355J, I35
    6J, P357J, K358J, A359J, C360J, C361J, V362J, P363J, T364J, V390.J, E391
    J, G392J, C393J, G394J, C395J及びR396J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突
    然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白
    質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３７
    １のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  373. 【請求項３７３】蛋白質はヒト骨形成因子-3 (BMP-3)サブユニットである請求項
    １９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  374. 【請求項３７４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置373-
    395からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３７３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  375. 【請求項３７５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D378B, D
    381B, E386B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  376. 【請求項３７６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR373Z, K37
    6Z及びK392Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  377. 【請求項３７７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R373U, K
    376U, D378U, D381U, E386U, K392U及びD395U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  378. 【請求項３７８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y374Z, L
    375Z, V377Z, F379Z, A380Z, I382Z, G383Z, W384Z, S385Z, W387Z, I388Z, I38
    9Z, S390Z, P391Z, S393Z, F394Z, Y374B, L375B, V377B, F379B, A380B, I382B
    , G383B, W384B, S385B, W387B, I388B, I389B, S390B, P391B, S393B, 及び F3
    94B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む
    請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  379. 【請求項３７９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置441-
    465からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３７３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  380. 【請求項３８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D451B及
    びE452B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  381. 【請求項３８１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK441Z, K45
    4Z 及び K459Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  382. 【請求項３８２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K441U, D
    451U, E452U, K454U及びK459U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  383. 【請求項３８３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M442Z, S
    443Z, S444Z, L445Z, S446Z, I447Z, L448Z, F449Z, F450Z, N453Z, N455Z, V45
    6Z, V457Z, L458Z, V460Z, Y461Z, P462Z, N463Z, M464Z, T465Z, M442B, S443B
    , S444B, L445B, S446B, I447B, L448B, F449B, F450B, N453B, N455B, V456B,
    V457B, L458B, V460B, Y461B, P462B, N463B, M464B及びT465B（式中Ｚは酸性ア
    ミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  384. 【請求項３８４】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３７３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  385. 【請求項３８５】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３７３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  386. 【請求項３８６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-37
    2, 396-440及び466-472からなる群から選ばれる位置である請求項３８５のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  387. 【請求項３８７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がMlJ, A2J,
    G3J, A4J, S5J, R6J, L7J, L8J, F9J, L10J, W11J, L12J, G13J, C14J, F15J, C
    16J, V17J, S18J, L19J, A20J, Q21J, G22J, E23J, R24J, P25J, K26J, P27J, P
    28J, F29J, P30J, E31J, L32J, R33J, K34J, A35J, V36J, P37J, G38J, D39J, R
    40J, T41J, A42J, G43J, G44J, G45J, P46J, D47J, S48J, E49J, L50J, Q51J, P
    52J, Q53J, D54J, K55J, V56J, S57J, E58J, H59J, M60J, L61J, R62J, L63J, Y
    64J, D65J, R66J, Y67J, S68J, T69J, V70J, Q71J, A72J, A73J, R74J, T75J, P
    76J, G77J, S78J, L79J, E80J, G81J, G82J, S83J, Q84J, P85J, W86J, R87J, P
    88J, R89J, L90J, L91J, R92J, E93J, G94J, N95J, T96J, V97J, R98J, S99J, F
    100J, R101J, A102J, A103J, A104J, A105J, E106J, T107J, L108J, E109J, R11
    0J, K111J, G112J, L113J, Y114J, I115J, F116J, N117J, L118J, T119J, S120J
    , L121J, T122J, K123J, S124J, E125J, N126J, I127J, L128J, S129J, A130J,
    T131J, L132J, Y133J, F134J, C135J, I136J, G137J, E138J, L139J, G140J, N1
    41J, I142J, S143J, L144J, S145J, C146J, P147J, V148J, S149J, G150J, G151
    J, C152J, S153J, H154J, H155J, A156J, Q157J, R158J, K159J, H160J, I161J,
    Q162J, I163J, D164J, L165J, S166J, A167J, W168J, T169J, L170J, K171J, F
    172J, S173J, R174J, N175J, Q176J, S177J, Q178J, L179J, L180J, G181J, H18
    2J, L183J, S184J, V185J, D186J, M187J, A188J, K189J, S190J, H191J, R192J
    , D193J, I194J, M195J, S196J, W197J, L198J, S199J, K200J, D201J, I202J,
    T203J, Q204J, F205J, L206J, R207J, K208J, A209J, K210J, E211J, N212J, E2
    13J, E214J, F215J, L216J, I217J, G218J, F219J, N220J, I221J, T222J, S223
    J, K224J, G225J, R226J, Q227J, L228J, P229J, K230J, R231J, R232J, L233J,
    P234J, F235J, P236J, E237J, P238J, Y239J, I240J, L241J, V242J, Y243J, A
    244J, N245J, D246J, A247J, A248J, I249J, S250J, E251J, P252J, E253J, S25
    4J, V255J, V256J, S257J, S258J, L259J, Q260J, G261J, H262J, R263J, N264J
    , F265J, P266J, T267J, G268J, T269J, V270J, P271J, K272J, W273J, D274J,
    S275J, H276J, I277J, R278J, A279J, A280J, L281J, S282J, I283J, E284J, R2
    85J, R286J, K287J, K288J, R289J, S290J, T291J, G292J, V293J, L294J, L295
    J, P296J, L297J, Q298J, N299J, N300J, E301J, L302J, P303J, G304J, A305J,
    E306J, Y307J, Q308J, Y309J, K310J, K311J, D312J, E313J, V314J, W315J, E
    316J, E317J, R318J, K319J, P320J, Y321J, K322J, T323J, L324J, Q325J, A32
    6J, Q327J, A328J, P329J, E330J, K331J, S332J, K333J, N334J, K335J, K336J
    , K337J, Q338J, R339J, K340J, G341J, P342J, H343J, R344J, K345J, S346J,
    Q347J, T348J, L349J, Q350J, F351J, D352J, E353J, Q354J, T355J, L356J, K3
    57J, K358J, A359J, R360J, R361J, K362J, Q363J, W364J, I365J, E366J, P367
    J, R368J, N369J, C370J, A371J, R372J, A396J, Y397J, Y398J, C399J, S400J,
    G401J, A402J, C403J, Q404J, F405J, P406J, M407J, P408J, K409J, S410J, L
    411J, K412J, P413J, S414J, N415J, H416J, A417J, T418J, I419J, Q420J, S42
    1J, I422J, V423J, R424J, A425J, V426J, G427J, V428J, V429J, P430J, G431J
    , I432J, P433J, E434J, P435J, C436J, C437J, V438J, P439J, E440J, V466J,
    E467J, S468J, C469J, A470J, C471J, 及び R472J（式中Ｊは任意のアミノ酸残
    基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変
    更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリ
    ー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミ
    リー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請
    求項３８６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  388. 【請求項３８８】蛋白質はヒト骨形成因子(BMP-3b)サブユニットである請求項１
    ９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  389. 【請求項３８９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置379-
    402からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３８８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  390. 【請求項３９０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D384B, D
    387B, E392B, 及び D401（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３８９の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  391. 【請求項３９１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR379Z, K38
    2Z及びK398Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３８９のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  392. 【請求項３９２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R379U, K
    382U, D384U, D387U, E392U, K398U及びD401U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  393. 【請求項３９３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y380Z, L
    381Z, V383Z, F385Z, A386Z, I388Z, G389Z, W390Z, N391Z, W393Z, I394Z, I39
    5Z, S396Z, P397Z, S399Z, F400Z, A402Z, Y380B, L381B, V383B, F385B, A386B
    , I388B, G389B, W390B, N391B, W393B, I394B, I395B, S396B, P397B, S399B,
    F400B及びA402B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸で
    ある。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然
    変異を含む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    。
  394. 【請求項３９４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置447-
    471からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３８８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  395. 【請求項３９５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D457B 及
    び E458B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  396. 【請求項３９６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK447Z, R46
    0Z, 及び K465Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  397. 【請求項３９７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K447U, D
    457U, E458U, R460U, 及び K465（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３９
    ４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  398. 【請求項３９８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M448Z, N
    449Z, S450Z, L451Z, G452Z, V453Z, L454Z, F455Z, L456Z, N459Z, N461Z, V46
    2Z, V463Z, L464Z, V466Z, Y467Z, P468Z, N469Z, M470Z, S471Z, M448B, N449B
    , S450B, L451B, G452B, V453B, L454B, F455B, L456B, N459B, N461B, V462B,
    V463B, L464B, V466B, Y467B, P468B, N469B, M470B, 及び S471B（式中Ｚは酸
    性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  399. 【請求項３９９】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３８８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  400. 【請求項４００】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項３８８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  401. 【請求項４０１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-37
    8, 403-446及び472-478からなる群から選ばれる位置である請求項４００のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  402. 【請求項４０２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J,
    H3J, V4J, P5J, A6J, R7J, T8J, S9J, P10J, G11J, P12J, G13J, P14J, Q15J, L
    16J, L17J, L18J, L19J, L20J, L21J, P22J, L23J, F24J, L25J, L26J, L27J, L
    28J, R29J, D30J, V31J, A32J, G33J, S34J, H35J, R36J, A37J, P38J, A39J, W
    40J, S41J, A42J, L43J, P44J, A45J, A46J, A47J, D48J, G49J, L50J, Q51J, G
    52J, D53J, R54J, D55J, L56J, Q57J, R58J, H59J, P60J, G61J, D62J, A63J, A
    64J, A65J, T66J, L67J, G68J, P69J, S70J, A71J, Q72J, D73J, M74J, V75J, A
    76J, V77J, H78J, M79J, H80J, R81J, L82J, Y83J, E84J, K85J, Y86J, S87J, R
    88J, Q89J, G90J, A91J, R92J, P93J, G94J, G95J, G96J, N97J, T98J, V99J, R
    100J, S101J, F102J, R103J, A104J, R105J, L106J, E107J, V108J, V109J, D11
    0J, Q111J, K112J, A113J, V114J, Y115J, F116J, F117J, N118J, L119J, T120J
    , S121J, M122J, Q123J, D124J, S125J, E126J, M127J, I128J, L129J, T130J,
    A131J, T132J, F133J, H134J, F135J, Y136J, S137J, E138J, P139J, P140J, R1
    41J, W142J, P143J, R144J, A145J, L146J, E147J, V148J, L149J, C150J, K151
    J, P152J, R153J, A154J, K155J, N156J, A157J, S158J, G159J, R160J, P161J,
    L162J, P163J, L164J, G165J, P166J, P167J, T168J, R169J, Q170J, H171J, L
    172J, L173J, F174J, R175J, S176J, L177J, S178J, Q179J, N180J, T181J, A18
    2J, T183J, Q184J, G185J, L186J, L187J, R188J, G189J, A190J, M191J, A192J
    , L193J, A194J, P195J, P196J, P197J, R198J, G199J, L200J, W201J, Q202J,
    A203J, K204J, D205J, I206J, S207J, P208J, I209J, V210J, K211J, A212J, A2
    13J, R214J, R215J, D216J, G217J, E218J, L219J, L220J, L221J, S222J, A223
    J, Q224J, L225J, D226J, S227J, E228J, E229J, R230J, D231J, P232J, G233J,
    V234J, P235J, R236J, P237J, S238J, P239J, Y240J, A241J, P242J, Y243J, 1
    244J, L245J, V246J, Y247J, A248J, N249J, D250J, L251J, A252J, I253J, S25
    4J, E255J, P256J, N257J, S258J, V259J, A260J, V261J, T262J, L263J, Q264J
    , R265J, Y266J, D267J, P268J, F269J, P270J, A271J, G272J, D273J, P274J,
    E275J, P276J, R277J, A278J, A279PJ, 280J, N281J, N282J, S283J, A284J, D2
    85J, P286J, R287J, V288J, R289J, R290J, A291J, A292J, Q293J, A294J, T295
    J, G296J, P297J, L298J, Q299J, D300J, N301J, E302J, L303J, P304J, G305J,
    L306J, D307J, E308J, R309J, P310J, P311J, R312J, A313J, H314J, A315J, Q
    316J, H317J, F318J, H319J, K320J, H321J, Q322J, L323J, W324J, P325J, S32
    6J, P327J, F328J, R329J, A330J, L331J, K332J, P333J, R334J, P335J, G336
    J, R337J, K338J, D339J, R340J, R341J, K342J, K343J, G344J, Q345J, E346J,
    V347J, F348J, M349J, A350J, A351J, S352J, Q353J, V354J, L355J, D356J, F
    357J, D358J, E359J, K360J, T361J, M362J, Q363J, K364J, A365J, R366J, R36
    7J, K368J, Q369J, W370J, D371J, E372J, P373J, R374J, V375J, C376J, S377J
    , R378J, Y403J, Y404J, C405J, A406J, G407J, A408J, C409J, E410J, F411J,
    P412J, M413J, P414J, K415J, I416J, V417J, R418J, P419J, S420J, N421J, H4
    22J, A423J, T424J, I425J, Q426J, S427J, I428J, V429J, R430J, A431J, V432
    J, G433J, I434J, I435J, P436J, G437J, I438J, P439J, E440J, P441J, C442J,
    C443J, V444J, P445J, D446J, V472J, D473J, T474J, C475J, A476J, C477J,
    及び R478J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との
    間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４０１のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  403. 【請求項４０３】蛋白質はヒト骨形成因子(BMP-4)サブユニットである請求項１
    ９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  404. 【請求項４０４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置312-
    333からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４０３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  405. 【請求項４０５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D316B, D
    31 9B及びD324B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  406. 【請求項４０６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D316U, D
    319U及びD324U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  407. 【請求項４０７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S312Z, L
    313Z, Y314Z, V315Z, F317Z, S318Z, V320Z, G321Z, W322Z, N323Z, W325Z, I32
    6Z, V327Z, A328Z, P329Z, P330Z, G331Z, Y332Z, Q333Z, S312B, L313B, Y314B
    , V315B, F317B, S318B, V320B, G321B, W322B, N323B, W325B, I326B, V327B,
    A328B, P329B, P33GB, G331B, Y332B, 及び Q333B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基
    であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  408. 【請求項４０８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置377-
    401からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４０３
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  409. 【請求項４０９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E377B, D
    387B, E388B, D390B, 及び E399B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  410. 【請求項４１０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK391Z 及び K395Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  411. 【請求項４１１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E377U, D
    387U, E388U, D390U, K391U, K395U及びE399U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  412. 【請求項４１２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L378Z, S
    379Z, A380Z, I381Z, S382Z, M383Z, L384Z, Y385Z, L386Z, Y389Z, V392Z, V39
    3Z, L394Z, N396Z, Y397Z, Q398Z, M400Z, V401Z, L378B, S379B, A380B, I381B
    , S382B, M383B, L384B, Y385B, L386B, Y389B, V392B, V393B, L394B, N396B,
    Y397B, Q398B, M400B, 及び V401B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  413. 【請求項４１３】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４０３のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  414. 【請求項４１４】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４０３のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  415. 【請求項４１５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-31
    1, 334-376及び402-408からなる群から選ばれる位置である請求項４１４のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  416. 【請求項４１６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, I2J,
    P3J, G4J, N5J, R6J, M7J, L8J, M9J, V10J, V11J, L12J, L13J, C14J, Q15J, V
    16J, L17J, L18J, G19J, G20J, A21J, S22J, H23J, A24J, S25J, L26J, I27J, P
    28J, E29J, T30J, G31J, K32J, K33J, K34J, V35J, A36J, E37J, I38J, Q39J, G
    40J, H41J, A42J, G43J, G44J, R45J, R46J, S47J, G48J, Q49J, S50J, H51J, E
    52J, L53J, L54J, R55J, D56J, F57J, E58J, A59J, T60J, L61J, L62J, Q63J, M
    64J, F65J, G66J, L67J, R68J, RG9J, R70J, P71J, Q72J, P73J, S74J, K75J, S
    76J, A77J, V78J, I79J, P80J, D81J, Y82J, M83J, R84J, D85J, L86J, Y87J, R
    88J, L89J, Q90J, S91J, G92J, E93J, E94J, E95J, E96J, E97J, Q98J, I99J, H
    100J, S101J, T102J, G103J, L104J, E105J, Y106J, P107J, E108J, R109J, P11
    0J, A111J, S112J, R113J, A114J, N115J, T116J, V117J, R118J, S119J, F120J
    , H121J, H122J, E123J, E124J, H125J, L126J, E127J, N128J, I129J, P130J,
    G131J, T132J, S133J, E134J, N135J, S136J, A137J, F138J, R139J, F140J, L1
    41J, F142J, N143J, L144J, S145J, S146J, I147J, P148J, E149J, N150J, E151
    J, A152J, I153J, S154J, S155J, A156J, E157J, L158J, R159J, L160J, F161J,
    R162J, E163J, Q164J, V165J, D166J, Q167J, G168J, P169J, D107J, W171J, E
    172J, R173J, G174J, F175J, H176J, R177J, I178J, N179J, I180J, Y181J, E18
    2J, V183J, M184J, K185J, P186J, P187J, A188J, E189J, V190J, V191J, P192J
    , G193J, H194J, L195J, I196J, T197J, R198J, L199J, L200J, D201J, T202J,
    R203J, L204J, V205J, H206J, H207J, N208J, V209J, T210J, R211J, W212J, E2
    13J, T214J, F215J, D216J, V217J, S218J, P219J, A220J, V221J, L222J, R223
    J, W224J, T225J, R226J, E227J, K228J, Q229J, P230J, N231J, Y232J, G233J,
    L234J, A235J, I236J, E237J, V238J, T239J, H240J, L241J, H242J, Q243J, T
    244J, R245J, T246J, H247J, Q248J, G249J, Q250J, H251J, V252J, R253J, I25
    4J, S255J, R256J, S257J, L258J, P259J, Q260J, G261J, S262J, G263J, N264J
    , W265J, A266J, Q267J, L268J, R269J, P270J, L271J, L272J, V273J, T274J,
    F275J, G276J, H277J, D278J, G279J, R280J, G281J, H282J, A283J, L284J, T2
    85J, R286J, R287J, R288J, R289J, A290J, K291J, R292J, S293J, P294J, K295
    J, H296J, H297J, S298J, Q299J, R300J, A301J, R302J, K303J, K304J, N305J,
    K306J, N307J, C308J, R309J, R310J, H311J, A334J, F335J, Y336J, C337J, H
    338J, G339J, D340J, C341J, P342J, F343J, P344J, L345J, A346J, D347J, H34
    8J, L349J, N350J, S351J, T352J, N353J, H354J, A355J, I356J, V357J, Q358J
    , T359J, L360J, V361J, N362J, S363J, V364J, N365J, S366J, S367J, I368J,
    P369J, K370J, A371J, C372J, C373J, V374J, P375J, T376J, V402J, E403J, G4
    04J, C405J, G406J, C407J, 及び R408J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然
    変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の
    前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４１５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  417. 【請求項４１７】蛋白質はヒト骨形成因子-5(BMP-5)サブユニットである請求項
    １９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  418. 【請求項４１８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置357-
    378からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４１７
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  419. 【請求項４１９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357B, D
    364B, D369B及びE375B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  420. 【請求項４２０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR363Z（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸
    性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  421. 【請求項４２１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357U, R
    363U, D364U, D369U及びE375U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  422. 【請求項４２２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L358Z, Y
    359Z, V360Z, S361Z, F362Z, L365Z, G366Z, W367Z, Q368Z, W370Z, I371Z, I37
    2Z, A373Z, P374Z, G376Z, Y377Z, A378Z, L358B, Y359B, V360B, S361B, F362B
    , L365B, G366B, W367B, Q368B, W370B, I371B, I372B, A373B, P374B, G376B,
    Y377B, 及び A378B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  423. 【請求項４２３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置423-
    447からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４１７
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  424. 【請求項４２４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D433B及
    びD434B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  425. 【請求項４２５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK423Z, K44
    1Z, K442Z, 及び R444Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  426. 【請求項４２６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K423U, D
    433U, D434U, K441U, K442U及びR444U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ４２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  427. 【請求項４２７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L424Z, N
    425Z, A426Z, I427Z, S428Z, V429Z, L430Z, Y431Z, F432Z, S435Z, S436Z, N43
    7Z, V438Z, I439Z, L440Z, Y443Z, N445Z, M446Z, V447Z, L424B, N425B, A426B
    , I427B, S428B, V429B, L430B, Y431B, F432B, S435B, S436B, N437B, V438B,
    I439B, L440B, Y443B, R444B, N445B, M446B, 及び V447B（式中Ｚは酸性アミノ
    酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  428. 【請求項４２８】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４１７のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  429. 【請求項４２９】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４１７のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  430. 【請求項４３０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-35
    6, 379-422及び448-454からなる群から選ばれる位置である請求項４２９のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  431. 【請求項４３１】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, H2J,
    L3J, T4J, V5J, F6J, L7J, L8J, K9J, G10J, I11J, V12J, G13J, F14J, L15J, W
    16J, S17J, C18J, W19J, V20J, L21J, V22J, G23J, Y24J, A25J, K26J, G27J, G
    28J, L29J, G30J, D31J, N32J, H33J, V34J, H35J, S36J, S37J, F38J, I39J, Y
    40J, R41J, R42J, L43J, R44J, N45J, H46J, E47J, R48J, R49J, E50J, I51J, Q
    52J, R53J, E54J, I55J, L56J, S57J, I58J, L59J, G60J, L61J, P62J, H63J, R
    64J, P65J, R66J, P67J, F68J, S69J, P70J, G71J, K72J, Q73J, A74J, S75J, S
    76J, A77J, P78J, L79J, F80J, M81J, L82J, D83J, L84J, Y85J, N86J, A87J, M
    88J, T89J, N90J, E91J, E92J, N93J, P94J, E95J, E96J, S97J, E98J, Y99J, S
    100J, V101J, R102J, A103J, S104J, L105J, A106J, E107J, E108J, T109J, R11
    0J, G111J, A112J, R113J, K114J, G115J, Y116J, P117J, A118J, S119J, P120J
    , N121J, G122J, Y123J, P124J, R125J, R126J, I127J, Q128J, L129J, S130J,
    R131J, T132J, T133J, P134J, L135J, T136J, T137J, Q138J, S139J, P140J, P1
    41J, L142J, A143J, S144J, L145J, H146J, D147J, T148J, N149J, F150J, L151
    J, N152J, D153J, A154J, D155J, M156J, V157J, M158J, S159J, F160J, V161J,
    N162J, L163J, V164J, E165J, R166J, D167J, K168J, D169J, F170J, S171J, H
    172J, Q173J, R174J, R175J, H176J, Y177J, K178J, E179J, F180J, R181J, F18
    2J, D183J, L184J, T185J, Q186J, I187J, P188J, H189J, G190J, E191J, A192J
    , V193J, T194J, A195J, A196J, E197J, F198J, R199J, I200J, Y201J, K202J,
    D203J, R204J, S205J, N206J, N207J, R208J, F209J, E210J, N211J, E212J, T2
    13J, I214J, K215J, I216J, S217J, I218J, Y219J, Q220J, I221J, I222J, K223
    J, E224J, Y225J, T226J, N227J, R228J, D229J, A230J, D231J, L232J, F233J,
    L234J, L235J, D236J, T237J, R238J, K239J, A240J, Q241J, A242J, L243J, D
    244J, V245J, G246J, W247J, L248J, V249J, F250J, D251J, I252J, T253J, V25
    4J, T255J, S256J, N257J, H258J, W259J, V260J, I261J, N262J, P263J, Q264J
    , N265J, N266J, L267J, G268J, L269J, Q270J, L271J, C272J, A273J, E274J,
    T275J, G276J, D277J, G278J, R279J, S280J, I281J, N282J, V283J, K284J, S2
    85J, A286J, G287J, L288J, V289J, G290J, R291J, Q292J, G293J, P294J, Q295
    J, S296J, K297J, Q298J, P299J, F300J, M301J, V302J, A303J, F304J, F305J,
    K306J, A307J, S308J, E309J, V310J, L311J, L312J, R313J, S314J, V315J, R
    316J, A317J, A318J, N319J, K320J, R321J, K322J, N323J, Q324J, N325J, R32
    6J, N327J, K328J, S329J, S330J, S331J, H332J, Q333J, D334J, S335J, S336J
    , R337J, M338J, S339J, S340J, V341J, G342J, D343J, Y344J, N345J, T346J,
    S347J, E348J, Q349J, K350J, Q351J, A352J, C353J, K354J, K355J, H356J, A3
    79J, F380J, Y381J, C382J, D383J, G384J, E385J, C386J, S387J, F388J, P389
    J, L390J, N391J, A392J, H393J, M394J, N395J, A396J, T397J, N398J, H399J,
    A400J, I401J, V402J, Q403J, T404J, L405J, V406J, H407J, L408J, M409J, F
    410J, P411J, D412J, H413J, V414J, P415J, K416J, P417J, C418J, C419J, A42
    0J, P421J, T422J, V448J, R449J, S450J, C451J, G452J, C453J, 及び H454J（
    式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    コンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相
    互作用の増大をもたらす請求項４３０のヒトトランスフォーミング成長因子ファ
    ミリー蛋白質。
  432. 【請求項４３２】蛋白質はヒト骨形成因子-6/Vgrl成長因子モノマーである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  433. 【請求項４３３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-4
    0からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４３２の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  434. 【請求項４３４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26B（式
    中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
    基性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成
    長因子ファミリー蛋白質。
  435. 【請求項４３５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK36Z（式中
    Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性
    残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  436. 【請求項４３６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26U 及
    び K36U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  437. 【請求項４３７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, V2
    2Z, S23Z, F24Z, Q25Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I33Z, A34Z, P3
    5Z, G37Z, Y38Z, A39Z, A40Z, Y21B, V22B, S23B, F24B, Q25B, L27B, G28B, W2
    9B, Q30B, W31B, I32B, I33B, A34B, P35B, 637B, Y38B, A39B, 及び A40B（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４
    ３３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  438. 【請求項４３８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-1
    02からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４３２
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  439. 【請求項４３９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91B 及
    び D92B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  440. 【請求項４４０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK81Z, K98Z
    , K99Z及びR101Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  441. 【請求項４４１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K81U, D9
    1U, D92U, K98U, K99U及びR101U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４３
    ８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  442. 【請求項４４２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L82Z, N8
    3Z, A84Z, I85Z, S86Z, V87Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V96Z, I9
    7Z, Y100Z, N102Z L82B, N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B, Y89B, F90B, N
    93B, S94B, N95B, V96B, I97B, Y100B, 及び N102B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基
    であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  443. 【請求項４４３】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４３２のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  444. 【請求項４４４】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４３２のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  445. 【請求項４４５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20
    , 41-80及び103-111からなる群から選ばれる位置である請求項４４４のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  446. 【請求項４４６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がS1J, S2J,
    A3J, S4J, D5J, Y6J, N7J, S8J, S9J, E10J, L11J, K12J, T13J, A14J, C15J, R
    16J, K17J, H18J, E19J, L20J, N41J, Y42J, C43J, D44J, G45J, E46J, C47J, S
    48J, P49J, P50J, L51J, N52J, A53J, H54J, T55J, N56J, H57J, A58J, I59J, V
    60J, Q61J, T62J, L63J, V64J, H65J, L66J, M67J, N68J, P69J, E70J, Y71J, V
    72J, P73J, K74J, P75J, C76J, C77J, A78J, P79J, T80J, M103J, V104J, V105J
    , R106J, A107J, C108J, G109J, C110J, 及び H111J（式中Ｊは任意のアミノ酸
    残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを
    変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミ
    リー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファ
    ミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす
    請求項４４５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  447. 【請求項４４７】蛋白質はヒト骨形成因子-7/骨形成性蛋白質-1因子モノマーで
    ある請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  448. 【請求項４４８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-4
    0からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４４７の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  449. 【請求項４４９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26B 及
    び E36B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  450. 【請求項４５０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R25U, D2
    6U 及びE36U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４４８のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  451. 【請求項４５１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y2IZ, V2
    2Z, S23Z, F24Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I33Z, A34Z, P35Z, G3
    7Z, Y38Z, A39Z, A40B, Y21B, V22B, S23B, F24B, L27B, G28B, W29B, Q30B, W3
    1B, I32B, I33B, A34B, P35B, G37B, Y38B, A39B, 及び A40B（式中Ｚは酸性ア
    ミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４４８のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  452. 【請求項４５２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-1
    02からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４４７
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  453. 【請求項４５３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91B及び
    D92B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  454. 【請求項４５４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK98Z, K99Z
    及びR101Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  455. 【請求項４５５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91U, D9
    2U, K98U, K99U及びR101U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  456. 【請求項４５６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Q81Z, L8
    2Z, N83Z, A84Z, I85Z, S86Z, V87Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V9
    6Z, I97Z, Y100Z, N102Z, Q81B, L82B, N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B,
    Y89B, F90B, N93B, S84B, N95B, V96B, I97B, Y100B, 及び N102B（式中Ｚは酸
    性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  457. 【請求項４５７】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４４７のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  458. 【請求項４５８】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４４７のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  459. 【請求項４５９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20
    , 41-80及び103-111からなる群から選ばれる位置である請求項４５８のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  460. 【請求項４６０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA1J, N2J,
    V3J, A4J, E5J, N6J, S7J, S8J, S9J, D10J, Q11J, R12J, Q13J, A14J, C15J, K
    16J, K17J, H18J, E19J, L20J, Y41J, Y42J, C43J, E44J, G45J, E46J, C47J, A
    48J, F49J, P50J, L51J, N52J, S53J, A54J, T55J, N56J, H57J, A58J, I59J, V
    60J, Q61J, T62J, L63J, V64J, H65J, F66J, I67J, N68J, P69J, E70J, T71J, V
    72J, P73J, K74J, P75J, C76J, C77J, A78J, P79J, T80J, M103J, V104J, V105J
    , R106J, A107J, C108J, G109J, C110J, 及び H111J（式中Ｊは任意のアミノ酸
    残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを
    変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミ
    リー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファ
    ミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす
    請求項４５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  461. 【請求項４６１】蛋白質はヒト骨形成因子-8/ヒト骨形成性蛋白質-２(OP-2)サブ
    ユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  462. 【請求項４６２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置305-
    326からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４６２
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  463. 【請求項４６３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E305B, D
    312B, 及び D317B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４６２のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  464. 【請求項４６４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E305U, D
    312U, 及び D317U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４６２のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  465. 【請求項４６５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L306Z, Y
    307Z, V308Z, S309Z, F310Z, Q311Z, L313Z, G314Z, W315Z, L316Z, W318Z, V31
    9Z, I320Z, A321Z, P322Z, Q323Z, G324Z, Y325Z, S326Z, L306B, Y307B, V308B
    , S309B, F310B, Q311B, L313B, G314B, W315B, L316B, W318B, V319B, I320B,
    A321B, P322B, Q323B, G324B, Y325B及びS326B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であ
    り、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    の荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４６３のヒトトランスフォーミ
    ング成長因子ファミリー蛋白質。
  466. 【請求項４６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置371-
    395からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４６１
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  467. 【請求項４６７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D381B（
    式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  468. 【請求項４６８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK371Z, R38
    9Z, K390Z, H391Z及びR392Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４６６
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  469. 【請求項４６９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K371U, D
    381U, R389U, K390U, H391U及びR392U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ４６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  470. 【請求項４７０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L372Z, S
    373Z, A374Z, T375Z, S376Z, V377Z, L378Z, Y379Z, Y380Z, S382Z, S383Z, N38
    4Z, N385Z, V386Z, I387Z, L388Z, N393Z, M394Z, V395Z, L372B, S373B, A374B
    , T375B, S376B, V377B, L378B, Y379B, Y380B, S382B, S383B, N384B, N385B,
    V386B, I387B, L388B, N393B, M394B, 及び V395B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基
    であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  471. 【請求項４７１】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４６１のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  472. 【請求項４７２】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４６１のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  473. 【請求項４７３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-30
    4, 327-370及び396-402からなる群から選ばれる位置である請求項４７２のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  474. 【請求項４７４】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, T2J,
    A3J, L4J, P5J, G6J, P7J, L8J, W9J, L10J, L11J, G12J, L13J, A14J, L15J, C
    16J, A17J, L18J, G19J, G20J, G21J, G22J, P23J, G24J, L25J, R26J, P27J, P
    28J, P29J, G30J, C31J, P32J, Q33J, R34J, R35J, L36J, G37J, A38J, R39J, E
    40J, R41J, R42J, D43J, V44J, Q45J, R46J, E47J, I48J, L49J, A50J, V51J, L
    52J, G53J, L54J, P55J, G56J, R57J, P58J, R59J, P60J, R61J, A62J, P63J, P
    64J, A65J, A66J, S67J, R68J, L69J, P70J, A71J, S72J, A73J, P74J, L75J, F
    76J, M77J, L78J, D79J, L80J, Y81J, H82J, A83J, M84J, A85J, G86J, D87J, D
    88J, D89J, E90J, D91J, G92J, A93J, P94J, A95J, E96J, R97J, R98J, L99J, G
    100J, R101J, A102J, D103J, L104J, V105J, M106J, S107J, F108J, V109J, N11
    0J, M111J, V112J, E113J, R114J, D115J, R116J, A117J, L118J, G119J, H120J
    , Q121J, E122J, P123J, H124J, W125J, K126J, E127J, F128J, R129J, F130J,
    D131J, L132J, T133J, Q134J, I135J, P136J, A137J, G138J, E139J, A140J, V1
    41J, T142J, A143J, A144J, E145J, F146J, R147J, I148J, Y149J, K150J, V151
    J, P152J, S153J, I154J, H155I, L156J, L157J, N158J, R159J, T160J, L161J,
    H162J, V163J, S164J, M165J, F166J, Q167J, V168J, V169J, Q170J, E171J, Q
    172J, S173J, N174J, R175J, E176J, S177J, D178J, L179J, F180J, F181J, L18
    2J, D183J, L184J, Q185J, T186J, L187J, R188J, A189J, G190J, D191J, E192J
    , G193J, W194J, L195J, V196J, L197J, D198J, V199J, T200J, A201J, A202J,
    S203J, D204J, C205J, W206J, L207J, L208J, K209J, R210J, H211J, K212J, D2
    13J, L214J, G215J, L216J, R217J, L218J, Y219J, V220J, E221J, T222J, E223
    J, D224J, G225J, H226J, S227J, V228J, D229J, P230J, G231J, L232J, A233J,
    G234J, L235J, L236J, G237J, Q238J, R239J, A240J, P241J, R242J, S243J, Q
    244J, Q245J, P246J, F247J, V248J, V249J, T250J, F251J, F252J, R253J, A25
    4J, S255J, P256J, S257J, P258J, I259J, R260J, T261J, P262J, R263J, A264J
    , V265J, R266J, P267J, L268J, R269J, R270J, R271J, Q272J, P273J, K274J,
    K275J, S276J, N277J, E278J, L279J, P280J, Q281J, A282J, N283J, R284J, L2
    85J, P286J, G287J, I288J, F289J, D290J, D291J, V292J, H293J, G294J, S295
    J, H296J, G297J, R298J, Q299J, V300J, C301J, R302J, R303J, H304J, A327J,
    Y328J, Y329J, C330J, E331J, G332J, E333J, C334J, S335J, F336J, P337J, L
    338J, D339J, S340J, C341J, M342J, N343J, A344J, T345J, N346J, H347J, A34
    8J, I349J, L350J, Q351J, S352J, L353J, V354J, H355J, L356J, M357J, K358J
    , P359J, N360J, A361J, V362J, P363J, K364J, A365J, C366J, C367J, A368J,
    P369J, T370J, V396J, K397J, A398J, C399J, G400J, C401J, 及び H402J（式中
    Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコン
    フォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミ
    ング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作
    用の増大をもたらす請求項４５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリ
    ー蛋白質。
  475. 【請求項４７５】蛋白質はヒト骨形成因子-10 (BMP-10)サブユニットである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  476. 【請求項４７６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置327-
    353からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４７５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  477. 【請求項４７７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D331B, E
    334B, D338B, E348B及びE351B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４
    ７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  478. 【請求項４７８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK333Z 及び
    R353Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  479. 【請求項４７９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D331U, K
    333U, E334U, D338U, E348U, E351U及び R353U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項４７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  480. 【請求項４８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P327Z, L
    328Z, Y329Z, I330Z, F332Z, I335Z, G336Z, W337Z, S339Z, W340Z, I341Z, I34
    2Z, A343Z, P344Z, P345Z, G346Z, Y347Z, A349Z, Y350Z, C352Z, P327B, L328B
    , Y329B, I330B, F332B, I335B, G336B, W337B, S339B, W340B, I341B, I342B,
    A343B, P344B, P345B, G346B, Y347B, A349B, Y350B, 及び C352B（式中Ｚは酸
    性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  481. 【請求項４８１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置393-
    416からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４７５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  482. 【請求項４８２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E395B, D
    403B及びE414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  483. 【請求項４８３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK393Z, K40
    4Z, K410Z及びK412Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  484. 【請求項４８４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K393U, E
    395U, D403U, K404U, K410U, K412U及びE414U（式中Ｕは中性アミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含
    む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  485. 【請求項４８５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L394Z, P
    396Z, I397Z, S398Z, I399Z, L400Z, Y401Z, L402Z, G405Z, V406Z, V407Z, T40
    8Z, Y409Z, F411Z, Y413Z, G415Z, M416Z, L394B, P396B, I397B, S398B, I399B
    , L400B, Y401B, L402B, G405B, V406B, V407B, T408B, Y409B, F411B, Y413B,
    G415B, 及び M416B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ
    酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する
    突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  486. 【請求項４８６】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４７５のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  487. 【請求項４８７】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４７５のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  488. 【請求項４８８】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-32
    6, 354-392及び417-424からなる群から選ばれる位置である請求項４８７のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  489. 【請求項４８９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, G2J,
    S3J, L4J, V5J, L6J, T7J, L8J, C9J, A10J, L11J, F12J, C13J, L14J, A15J, A
    16J, Y17J, L18J, V19J, S20J, G21J, S22J, P23J, I24J, M25J, N26J, L27J, E
    28J, Q29J, S30J, P31J, L32J, E33J, E34J, D35J, M36J, S37J, L38J, F39J, G
    40J, D41J, V42J, F43J, S44J, E45J, Q46J, D47J, G48J, V49J, D50J, F51J, N
    52J, T53J, L54J, L55J, Q56J, S57J, M58J, K59J, D60J, E61J, F62J, L63J, K
    64J, T65J, L66J, N67J, L68J, S69J, D70J, I71J, P72J, T73J, Q74J, D75J, S
    76J, A7J, K78J, V79J, D80J, P81J, P82J, E83J, Y84J, M85J, L86J, E87J, L8
    8J, Y89J, N90J, K91J, F92J, A93J, T94J, D95J, R96J, T9J, S98J, M99J, P10
    0J, S101J, A102J, N103J, I104J, I105J, R106J, S107J, F108J, K109J, N110J
    , E111J, D112J, L113J, F114J, S115J, Q116J, P117J, V118J, S119J, F120J,
    N121J, G122J, L123J, R124J, K125J, Y126J, P127J, L128J, L129J, F130J, N1
    31J, V132J, S133J, I134J, P135J, H136J, H137J, E138J, E139J, V140J, I141
    J, M142J, A143J, E144J, L145J, R146J, L147J, Y148J, T149J, L150J, V151J,
    Q152J, R153J, D154J, R155J, M156J, I157J, Y158J, D159J, G160J, V161J, D
    162J, R163J, K164J, I165J, T166J, I167J, F168J, E169J, V170J, L171J, E17
    2J, S173J, K174J, G175J, D176J, N177J, E178J, G179J, E180J, R181J, N182J
    , M183J, L184J, V185J, L186J, V187J, S188J, G189J, E190J, I191J, Y192J,
    G193J, T194J, N195J, S196J, E197J, W198J, E199J, T200J, F201J, D202J, V2
    03J, T204J, D205J, A206J, I207J, R208J, R209J, W210J, Q211J, K212J, S213
    J, G214J, S215J, S216J, T217J, H218J, Q219J, L220J, E221J, V222J, H223J,
    I224J, E225J, S226J, K227J, H228J, D229J, E230J, A231J, E232J, D233J, A
    234J, S235J, S236J, G237J, R238J, L239J, E240J, I241J, D242J, T243J, S24
    4J, A245J, Q246J, N247J, K248J, H249J, N250J, P251J, L252J, L253J, I254J
    , V255J, F256J, S257J, D258J, D259J, Q260J, S261J, S262J, D263J, K264J,
    E265J, R266J, K267J, E268J, E269J, L270J, N271J, E272J, M273J, I274J, S2
    75J, H276J, E277J, Q278J, L279J, P280J, E281J, L282J, D283J, N284J, L285
    J, G286J, L287J, D288J, S289J, F290J, S291J, S292J, G293J, P294J, G295J,
    E296J, E297J, A298J, L299J, L300J, Q301J, M302J, R303J, S304J, N305J, I
    306J, I307J, Y308J, D309J, S310J, T311J, A312J, R313J, I314J, R315J, R31
    6J, N317J, A318J, K319J, G320J, N321J, Y322J, C323J, K324J, R325J, T326J
    , G354J, V355J, C356J, N357J, Y358J, P359J, L360J, A361J, E362J, H363J,
    L364J, T365J, P366J, T367J, K368J, H369J, A370J, I371J, I372J, Q373J, A3
    74J, L375J, V376J, H377J, L378J, K379J, N380J, S381J, Q382J, K383J, A384
    J, S385J, K386J, A387J, C388J, C389J, V390J, P391J, T392J, A417J, V418J,
    S419J, E420J, C421J, G422J, C423J, 及び R424J（式中Ｊは任意のアミノ酸残
    基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変
    更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリ
    ー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミ
    リー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請
    求項４８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  490. 【請求項４９０】蛋白質はヒト骨形成因子-11 (BMP-11)サブユニットである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  491. 【請求項４９１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置318-
    337からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４９０
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  492. 【請求項４９２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D321B, E
    323B及びD328B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  493. 【請求項４９３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK334Z, R33
    5Z及びK337Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  494. 【請求項４９４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D321U, E
    323U, D328U, K334U, R335U及びK337U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ４９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  495. 【請求項４９５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L318Z, T
    319Z, V320Z, F322Z, A324Z, F325Z, G326Z, W327Z, W329Z, I330Z, I331Z, A33
    2Z, P333Z, Y336Z, L318B, T319B, V320B, F322B, A324B, F325B, G326B, W327B
    , W329B, I330B, I331B, A332B, P333B及びY336B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基で
    あり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１
    つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  496. 【請求項４９６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-
    400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４９０
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  497. 【請求項４９７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D387B（
    式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  498. 【請求項４９８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K38
    8Z及びK395Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  499. 【請求項４９９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D
    387U, K388U及びK395（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４９６のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  500. 【請求項５００】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M377Z, S
    378Z, P379Z, I380Z, N381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, N386Z, Q389Z, Q39
    0Z, I391Z, I392Z, Y393Z, G394Z, I396Z, P397Z, G398Z, M399Z, V400Z, M377B
    , S378B, P379B, I380B, N381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, N386B, Q389B,
    Q390B, I391B, I392B, Y393B, G394B, I396B, P397B, G398B, M399B, 及び V400
    B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請
    求項４９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  501. 【請求項５０１】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４９０のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  502. 【請求項５０２】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項４９０のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  503. 【請求項５０３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-31
    7, 338-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項５０２のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  504. 【請求項５０４】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, V2J,
    L3J, A4J, A5J, P6J, L7J, L8J, L9J, G10J, F11J, L12J, L23J, L24J, A25J, L
    26J, E27J, L28J, R19J, P20J, R21J, G22J, E23J, A24J, A25J, E26J, G27J, P
    28J, A29J, A30J, A31J, A32J, A33J, A34J, A35J, A36J, A37J, A38J, A39J, A
    40J, A41J, G42J, V43J, G44J, G45J, E46J, R47J, S48J, S49J, R50J, P51J, A
    52J, P53J, S54J, V55J, A56J, P57J, E58J, P59J, D60J, G61J, C62J, P63J, V
    64J, C65J, V66J, W67J, R68J, Q69J, H70J, S71J, R72J, E73J, L74J, R75J, L
    76J, E77J, S78J, I79J, K80J, S81J, Q82J, I83J, L84J, S85J, K86J, L87J, R
    88J, L89J, K90J, E91J, A92J, P93J, N94J, I95J, S96J, R97J, E98J, V99J, V
    100J, K101J, Q102J, L103J, L104J, P105J, K106J, A107J, P108J, P109J, L11
    0J, Q111J, Q112J, I113J, L114J, D115J, L116J, H117J, D118J, F119J, Q120J
    , G121J, D122J, A123J, L124J, Q125J, P126J, E127J, D128J, F129J, L130J,
    E131J, E132J, D133J, E134J, Y135J, H136J, A137J, T138J, T139J, E140J, T1
    41J, V142J, I143J, S144J, M145J, A146J, Q147J, E148J, T149J, D150J, P151
    J, A152J, V153J, Q154J, T155J, D156J, G157J, S158J, P159J, L160J, C161J,
    C162J, H163J, F164J, H165J, F166J, S167J, P168J, K169J, V170J, M171J, F
    172J, T173J, K174J, V175J, L176J, K177J, A178J, Q179J, L180J, W181J, V18
    2J, Y183J, L184J, R185J, P186J, V187J, P188J, R189J, P190J, A191J, T192J
    , V193J, Y194J, L195J, Q196J, I197J, L198J, R199J, L200J, K201J, P202J,
    L203J, T204J, G205J, E206J, G207J, T208J, A209J, G210J, G211J, G212J, G2
    13J, G214J, G215J, R216J, R217J, H218J, I219J, R220J, I221J, R222J, S223
    J, L224J, K225J, I226J, E227J, L228J, H229J, S230J, R231J, S232J, G233J,
    H234J, W235J, Q236J, S237J, I238J, D239J, F240J, K241J, Q242J, V243J, L
    244J, H245J, S246J, W247J, F248J, R249J, Q250J, P251J, Q252J, S253J, N25
    4J, W255J, G256J, I257J, E258J, I259J, N260J, A261J, F262J, D263J, P264J
    , S265J, G266J, T267J, D268J, L269J, A270J, V271J, T272J, S273J, L274J,
    G275J, P276J, G277J, A278J, E279J, G280J, L281J, H282J, P283J, F284J, M2
    85J, E286J, L287J, R288J, V289J, L290J, E291J, N292J, T293J, K294J, R295
    J, S296J, R297J, R298J, N299J, L300J, G301J, L302J, D303J, C304J, D305J,
    E306J, H307J, S308J, S309J, E310J, S311J, R312J, C313J, C314J, R315J, Y
    316J, P317J, A338J, N339J, Y340J, C341J, S342J, G343J, Q344J, C345J, E34
    6J, Y347J, M348J, F349J, M350J, Q351J, K352J, Y353J, P354J, H355J, T356J
    , H357J, L358J, V359J, Q360J, Q361J, A362J, N363J, P364J, R365J, G366J,
    S367J, A368J, G369J, P370J, C371J, C372J, T373J, P374J, T375J, V401J, D4
    02J, R403J, C404J, G405J, C406J, 及び S407J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基
    である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更
    する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
    蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項５０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  505. 【請求項５０５】蛋白質はヒト骨形成因子-15 (BMP-15)サブユニットである請求
    項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  506. 【請求項５０６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置295-
    316からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５０５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  507. 【請求項５０７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D306B（
    式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  508. 【請求項５０８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR301Z 及び H307Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  509. 【請求項５０９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R301U, D
    306U及びH307U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  510. 【請求項５１０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P295Z, F
    296Z, Q297Z, I298Z, S299Z, F300Z, Q302Z, L303Z, G304Z, W305Z, W308Z, I30
    9Z, I310Z, A311Z, P312Z, P313Z, F314Z, Y315Z, T316Z, P295B, F296B, Q297B
    , I298B, S299B, F300B, Q302B, L303B, G304B, W305B, W308B, I309B, I310B,
    A311B, P312B, P313B, F314B, Y315B, 及び T316B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基
    であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  511. 【請求項５１１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置361-
    385からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５０５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  512. 【請求項５１２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E371B, E
    380B及びE382B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  513. 【請求項５１３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK361Z 及び K379Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  514. 【請求項５１４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K361U, E
    371U, K379U, E380U及びE382U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  515. 【請求項５１５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y362Z, V
    363Z, P364Z, I365Z, S366Z, V367Z, L368Z, M369Z, I370Z, A372Z, N373Z, G37
    4Z, S375Z, I376Z, L377Z, Y378Z, Y381Z, G383Z, M384Z, I385Z, Y362B, V363B
    , P364B, I365B, S366B, V367B, L368B, M369B, I370B, A372B, N373B, G374B,
    S375B, I376B, L377B, Y378B, Y381B, G383B, M384B及びI385B（式中Ｚは酸性ア
    ミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  516. 【請求項５１６】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５０５のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  517. 【請求項５１７】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５０５のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  518. 【請求項５１８】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-29
    4, 317-360及び386-392からなる群から選ばれる位置である請求項５１７のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  519. 【請求項５１９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, V2J,
    L3J, L4J, S5J, I6J, L7J, R8J, I9J, L10J, F11J, L12J, C13J, E14J, L15J, V
    16J, L17J, F18J, M19J, E20J, H21J, R22J, A23J, Q24J, M25J, A26J, E27J, G
    28J, G29J, Q30J, S31J, F32J, I33J, A34J, L35J, L36J, A37J, E38J, A39J, P
    40J, T41J, L42J, P43J, L44J, I45J, E46J, E47J, M48J, L49J, E50J, E51J, S
    52J, P53J, G54J, E55J, Q56J, P57J, R58J, K59J, P60J, R61J, L62J, L63J, G
    64J, H65J, S66J, L67J, R68J, Y69J, M70J, L71J, E72J, L73J, Y74J, R75J, R
    76J, S77J, A78J, D79J, S80J, H81J, G82J, H83J, P84J, R85J, E86J, N87J, R
    88J, T89J, I90J, G91J, A92J, T93J, M94J, V95J, R96J, L97J, V98J, K99J, P
    100J, L101J, T102J, S103J, V104J, A105J, R106J, P107J, H108J, R109J, G11
    0J, T111J, W112J, H113J, I114J, Q115J, I116J, L117J, G118J, F119J, P120J
    , L121J, R122J, P123J, N124J, R125J, G126J, L127J, Y128J, Q129J, L130J,
    V131J, R132J, A133J, T134J, V135J, V136J, Y137J, R138J, H139J, H140J, L1
    41J, Q142J, L143J, T144J, R145J, F146J, N147J, L148J, S149J, C150J, H151
    J, V152J, E153J, P154J, W155J, V156J, Q157J, K158J, N159J, P160J, T161J,
    N162J, H163J, F164J, P165J, S166J, S167J, E168J, G169J, D170J, S171J, S
    172J, K173J, P174J, S175J, L176J, M177J, S178J, N179J, A180J, W181J, K18
    2J, E183J, M184J, D185J, I186J, T187J, Q188J, L189J, V190J, Q191J, Q192J
    , R193J, F194J, W195J, N196J, N197J, K198J, G199J, H200J, R201J, I202J,
    L203J, R204J, L205J, R206J, F207J, M208J, C209J, Q210J, Q211J, Q212J, K2
    13J, D214J, S215J, G216J, G217J, L218J, E219J, L220J, W221J, H222J, G223
    TJ, 224J, S225J, S226J, L227J, D228J, I229J, A230J, F231J, L232J, L233J,
    L234J, Y235J, F236J, N237J, D238J, T239J, H240J, K241J, S242J, I243J, R
    244J, K245J, A246J, K247J, F248J, L249J, P250J, R251J, G252J, M253J, E25
    4J, E255J, F256J, M257J, E258J, R259J, E260J, S261J, L262J, L264J, R264J
    , R265J, T266J, R267J, Q268J, A269J, D270J, G271J, I272J, S273J, A274J,
    E275J, V276J, T277J, A278J, S279J, S280J, S281J, K282J, H283J, S284J, G2
    85J, P286J, E287J, N288J, N289J, Q290J, C291J, S292J, L293J, H294J, P317
    J, N318J, Y319J, C320J, K321J, G322J, T323J, C324J, L325J, R326J, V327J,
    L328J, R329J, D330J, G331J, L332J, N333J, S334J, P335J, N336J, H337J, A
    338J, I339J, I340J, Q341J, N342J, L343J, I344J, N345J, Q346J, L347J, V34
    8J, D349J, Q350J, S351J, V352J, P353J, R354J, P355J, S356J, C357J, V358J
    , P359J, Y360J, A386J, E387J, S388J, C389J, T390J, C391J, 及び R392J（式
    中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコ
    ンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互
    作用の増大をもたらす請求項５１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミ
    リー蛋白質。
  520. 【請求項５２０】蛋白質はヒトノリエ病蛋白質サブユニットである請求項１９２
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  521. 【請求項５２１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置43-6
    2からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５０５の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  522. 【請求項５２２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D46B（式
    中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
    基性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング成
    長因子ファミリー蛋白質。
  523. 【請求項５２３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH43Z, H50Z
    , K54Z, 及び K58Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  524. 【請求項５２４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H43U, D4
    6U, H50U, K54U, 及び K58U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５２１の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  525. 【請求項５２５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y44Z, V4
    5Z, S47Z, I48Z, S49Z, P51Z, L52Z, Y53Z, C55Z, S56Z, S57Z, M59Z, V60Z, L6
    1Z, L62Z, Y44B, V45B, S47B, I48B, S49B, P51B, L52B, Y53B, C55B, S56B, S5
    7B, M59B, V60B, L61B, 及び L62B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  526. 【請求項５２６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置100-
    123からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５２０
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  527. 【請求項５２７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK102Z, K10
    4Z, R107Z, R109Z, R115Z, 及び R121Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請
    求項５２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  528. 【請求項５２８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K102U, K
    104U, R107U, R109U, R115U及びR131U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ５２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  529. 【請求項５２９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T100Z, S
    101Z, L103Z, A105Z, L106Z, L108Z, C110Z, S111Z, G112Z, G113Z, M114Z, L11
    6Z, T117Z, A118Z, T119Z, Y120Z, Y122Z, I123Z, T100B, S101B, L103B, A105B
    , L106B, L108B, C110B, S111B, G112B, G113B, M114B, L116B, T117B, A118B,
    T119B, Y120B, Y122B, 及び I123B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項５２６のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  530. 【請求項５３０】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５２０のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  531. 【請求項５３１】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５２０のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  532. 【請求項５３２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-42
    , 63-99, 124-133からなる群から選ばれる位置である請求項５３１のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  533. 【請求項５３３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, R2J,
    K3J, H4J, V5J, L6J, A7J, A8J, S9J, F10J, S11J, M12J, L13J, S14J, L15J, L
    16J, V17J, I18J, M19J, G20J, D21J, T22J, D23J, S24J, K25J, T26J, D27J, S
    28J, S29J, F30J, I31J, M32J, D33J, S34J, D35J, P36J, R37J, R38J, C39J, M
    40J, R41J, H42J, A63J, R64J, C65J, E66J, G67J, H68J, C69J, S70J, Q71J, A
    72J, S73J, R74J, S75J, E76J, P77J, L78J, V79J, S80J, F81J, S82J, T83J, V
    84J, L85J, K86J, Q87J, P88J, F89J, R90J, S91J, S92J, C93J, H94J, C95J, C
    96J, R97J, P98J, Q99J, L124J, S125J, C126J, H127J, C128J, E129J, E130J,
    C131J, N132J, 及び S133J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、
    それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピ
    ン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有
    する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５３２のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  534. 【請求項５３４】蛋白質はヒト成長分化因子-1（human growth differentiation
    factor-1）(GDF-1)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質。
  535. 【請求項５３５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置271-
    292からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５３４
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  536. 【請求項５３６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E278B（
    式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５３５のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  537. 【請求項５３７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR271Z, R27
    7Z, H282Z, R283Z, 及び R289Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５２
    １のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  538. 【請求項５３８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R271U, R
    277U, E278U, H282U, R283U及びR289U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  539. 【請求項５３９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L272Z, Y
    273Z, V274Z, S275Z, F276Z, V279Z, G280Z, W281Z, W284Z, V285Z, I286Z, A28
    7Z, P288Z, G290Z, F291Z, L292Z, L272B, Y273B, V274B, S275B, F276B, V279B
    , G280B, W281B, W284B, V285B, I286B, A287B, P288B, G290B, F291B, 及び L2
    92B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む
    請求項５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  540. 【請求項５４０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置341-
    365からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５２０
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  541. 【請求項５４１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D351B, D
    354B, E362B, 及び D363B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５４０
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  542. 【請求項５４２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR341Z 及び R359Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  543. 【請求項５４３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R341U, D
    351U, D354U, R359U, E362U, 及び D363U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項５４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  544. 【請求項５４４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L342Z, S
    343Z, P344Z, I345Z, S346Z, V347Z, L348Z, F349Z, F350Z, N352Z, S353Z, N35
    5Z, V356Z, V357Z, L358Z, Q360Z, Y361Z, M36Z, V365Z, L342B, S343B, P344B,
    I345B, S346B, V347B, L348B, F349B, F350B, N352B, S353B, N355B, V356B, V
    357B, L358B, Q360B, Y361B, M36B, 及び V365B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基で
    あり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１
    つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５４０のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  545. 【請求項５４５】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５３４のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  546. 【請求項５４６】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５３４のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  547. 【請求項５４７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-27
    0, 293-340及び366-372からなる群から選ばれる位置である請求項５４６のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  548. 【請求項５４８】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, P2J,
    P3J, P4J, Q5J, Q6J, G7J, P8J, C9J, G10J, H11J, H12J, L13J, L14J, L15J, L
    16J, L17J, A18J, L19J, L20J, L21J, P22J, S23J, L24J, P25J, L26J, T27J, R
    28J, A29J, P30J, V31J, P32J, P33J, G34J, P35J, A36J, A37J, A38J, L39J, L
    40J, Q41J, A42J, L43J, G44J, L45J, R46J, D47J, E48J, P49J, Q50J, G51J, A
    52J, P53J, R54J, L55J, R56J, P57J, V58J, P59J, P60J, V61J, M62J, W63J, R
    64J, L65J, F66J, R67J, R68J, R69J, D70J, P71J, Q72J, E73J, T74J, R75J, S
    76J, G77J, S78J, R79J, R80J, T81J, S82J, P83J, G84J, V85J, T86J, L87J, Q
    88J, P89J, C90J, H91J, V92J, E93J, E94J, L95J, G96J, V97J, A98J, G9J, N1
    00J, I101J, V102J, R103J, H104J, I105J, P106J, D107J, R108J, G109J, A110
    J, P111J, T112J, R113J, A114J, S115J, E116J, P117J, V118J, S119J, A120J,
    A121J, G122J, H123J, C12J, P125J, E126J, W127J, T128J, V129J, V130J, F1
    31J, D132J, L133J, S134J, A135J, V136J, E137J, P138J, A139J, E140J, R141
    J, P142J, S143J, R144J, A145J, R146J, L147J, E148J, L149J, R150J, F151J,
    A152J, A153J, A154J, A155J, A156J, A157J, A158J, P159J, E160J, G161J, G
    162J, W163J, E164J, L165J, S166J, V167J, A168J, Q169J, A170J, G171J, Q17
    2J, G173J, A174J, G175J, A176J, D177J, P178J, G179J, P180J, V181J, L182J
    , L183J, R184J, Q185J, L186J, V187J, P188J, A189J, L190J, G191J, P192J,
    P193J, V194J, R195J, A196J, E197J, L198J, L199J, G200J, A201J, A202J, W2
    03J, A204J, R205J, N206J, A207J, S208J, W209J, P210J, R211J, S212J, L213
    J, R214J, L215J, A216J, L217J, A218J, L219J, R220J, P221J, R222J, A223J,
    P224J, A225J, A226J, C227J, A228J, R229J, L230J, A231J, E232J, A233J, S
    234J, L235J, L236J, L237J, V238J, T239J, L240J, D241J, P242J, R243J, L24
    4J, C245J, H246J, P247J, L248J, A249J, R250J, P251J, R252J, R253J, D254J
    , A255J, E256J, P257J, V258J, L52J, G260J, G261J, G262J, P263J, G264J, G
    265J, A266J, C267J, R268J, A269J, R270J, A293J, N294J, Y295J, C296J, Q29
    7J, C296J, Q299J, C300J, A301J, L302J, P303J, V304J, A305J, L306J, S307J
    , G308J, S309J, G310J, G311J, P312J, P313J, A314J, L315J, N316J, H317J,
    A318J, V319J, L320J, R321J, A322J, L323J, M324J, H325J, A326J, A327J, A3
    28J, P329J, G330J, A331J, A332J, D333J, L334J, P335J, C336J, C337J, V338
    J, P339J, A340J, V366J, D367J, E368J, C369J, G370J, C371J, 及び R372J（
    式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    コンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォ
    ーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相
    互作用の増大をもたらす請求項５４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファ
    ミリー蛋白質。
  549. 【請求項５４９】蛋白質はヒト成長分化因子-5（human growth differentiation
    factor-5）(GDF-5)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質。
  550. 【請求項５５０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置404-
    425からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５４９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  551. 【請求項５５１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D411B, D
    415B, D416B, E423B及びE425（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５５
    ０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  552. 【請求項５５２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH406Z 及び
    K410Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５５０のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  553. 【請求項５５３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H406U, K
    410U, D411U, D415U, D416U, E423U, 及び E425U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項５５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  554. 【請求項５５４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A404Z, L
    405Z, V407Z, N408Z, F409Z, M412Z, G413Z, W414Z, W417Z, I418Z, I419Z, A42
    0Z, P421Z, L422Z, Y424Z, A404B, L405B, V407B, N408B, F409B, M412B, G413B
    , W414B, W417B, I418B, I419B, A420B, P421B, L422B, 及び Y424B（式中Ｚは
    酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５５０の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  555. 【請求項５５５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置470-
    494からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５４９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  556. 【請求項５５６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D480B, E
    491B, 及び D492B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  557. 【請求項５５７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR470Z 及び K488Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  558. 【請求項５５８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R470U, D
    480U, K488U, E491U, 及び D492U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５５
    ５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  559. 【請求項５５９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L471Z, S
    472Z, P473Z, I474Z, S475Z, I476Z, L477Z, F478Z, I479Z, S481Z, A482Z, N48
    3Z, N484Z, V485Z, V486Z, Y487Z, Q489Z, Y490Z, M493Z, V494Z, L471B, S472B
    , P473B, I474B, S475B, I476B, L477B, F478B, I479B, S481B, A482B, N483B,
    N484B, V485B, V486B, Y487B, Q489B, Y490B, M493B, 及び V494B（式中Ｚは酸
    性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  560. 【請求項５６０】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５４９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  561. 【請求項５６１】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５４９のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  562. 【請求項５６２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-40
    3, 426-469及び495-501からなる群から選ばれる位置である請求項５６１のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  563. 【請求項５６３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, R2J,
    L3J, P4J, K5J, L6J, L7J, T8J, F9J, L10J, L11J, W12J, Y13J, L14J, A15J, W
    16J, L17J, D18J, L19J, E20J, F21J, I22J, C23J, T24J, V25J, L26J, G27J, A
    28J, P29J, D30J, L31J, G32J, Q33J, R34J, P35J, Q36J, G37J, S38J, R39J, P
    40J, G41J, L42J, A43J, K44J, A45J, E46J, A47J, K48J, E49J, R50J, P51J, P
    52J, L53J, A54J, R55J, N56J, V57J, F58J, R59J, P60J, G61J, G62J, H63J, S
    64J, Y65J, G66J, G67J, G68J, A69J, T70J, N71J, A72J, N73J, A74J, R75J, A
    76J, K77J, G78J, G79J, T80J, G81J, Q82J, T83J, G84J, G85J, L86J, T87J, Q
    88J, P89J, K90J, K91J, D92J, E93J, P94J, K95J, K96J, L97J, P98J, P99J, R
    100J, P101J, G102J, G103J, P104J, E105J, P106J, K107J, P108J, G109J, H11
    0J, P111J, P112J, Q113J, T114J, R115J, Q116J, A117J, T118J, A119J, R120J
    , T121J, V122J, T123J, P124J, K125J, G126J, Q127J, L128J, P129J, G130J,
    G131J, K132J, A133J, P134J, P135J, K136J, A137J, G138J, S139J, V140J, P1
    41J, S142J, S143J, F144J, L145J, L146J, K147J, K148J, A149J, R150J, E151
    J, P152J, G153J, P154J, P155J, R156J, E157J, P158J, K159J, E160J, P161J,
    F162J, R163J, P164J, P165J, P166J, I167J, T168J, P169J, H170J, E171J, Y
    172J, M173J, L174J, S175J, L176J, Y177J, R178J, T179J, L180J, S181J, D18
    2J, A183J, D184J, R185J, K186J, G187J, G188J, N189J, S190J, S191J, V192J
    , K193J, L194J, E195J, A196J, G197J, L198J, A199J, N200J, T201J, I202J,
    T203J, S204J, F205J, I206J, D207J, K208J, G209J, Q210J, D211J, D212J, R2
    13J, G214J, P215J, V216, V217J, R218J, K219J, Q220J, R221J, Y222J, V223J
    , F224J, D225J, I226J, S227J, A228J, L229J, E230J, K231J, D232J, G233J,
    L234J, L235J, G236J, A237J, E238J, L239J, R240J, I241J, L242J, R243J, K2
    44J, K245J, P246J, S247J, D248J, T249J, A250J, K251J, P252J, A253J, V254
    J, P255J, R256J, S257J, R258J, R259J, A260J, A261J, Q262J, L263J, K264J,
    L265J, S266J, S267J, C268J, P269J, S270J, G271J, R272J, Q273J, P274J, A
    275J, A276J, L277J, L278J, D279J, V280J, R281J, S282J, V283J, P284J, G28
    5J, L286J, Q287J, G288J, S289J, G290J, W291J, E292J, V293J, F294J, D295J
    , I296J, W297J, K298J, L299J, F300J, R301J, N302J, F303J, K304J, N305J,
    S306J, A307J, Q308J, L309J, C310J, L311J, E312J, L313J, E314J, A315J, W3
    16J, E317J, R318J, G319J, R320J, T321J, V322J, D323J, L324J, R325J, G326
    J, L327J, G328J, F329J, D330J, R331J, A332J, A333J, R334J, Q33J, 5J, V33
    6J, H337J, E338J, K339J, A340J, L341J, F342J, L343J, V344J, F345J, G346J
    , R347J, T348J, K349J, K350J, R351J, D352J, L353J, F354J, F355J, N356J,
    E357J, I358J, K359J, A360J, R361J, S362J, G363J, Q364J, D365J, D366J, K3
    67J, T368J, V369J, Y370J, E371J, Y372J, L373J, F374J, S375J, Q376J, R377
    J, R378J, K379J, R380J, R381J, A382J, P383J, S384J, A385J, T386J, R387J,
    Q388J, G389J, K390J, R391J, P392J, S393J, K394J, N395J, L396J, K397J, A
    398J, R399J, C400J, S401J, R402J, K403J, A426J, F427J, H428J, C429J, E43
    0J, G431J, L432J, C433J, E434J, F435J, P436J, L437J, R438J, S439J, H440J
    , L441J, E442J, P443J, T444J, N445J, H446J, A447J, V448J, I449J, Q450J,
    T451J, L452J, M453J, N454J, S455J, M456J, D457J, P458J, E459J, S460J, T4
    61J, P462J, P463J, T464J, C465J, C466J, V467J, P468J, T469J, V495J, E496
    J, S497J, C498J, G499J, C500J, 及び R501J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更す
    る突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー
    蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項
    ５６２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  564. 【請求項５６４】蛋白質はヒト成長分化因子-8（human growth differentiation
    factor-8）(GDF)-8サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質。
  565. 【請求項５６５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置286-
    305からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５６４
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  566. 【請求項５６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D289B, E
    291B, 及び D296（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  567. 【請求項５６７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK302, R303
    , 及びK305（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  568. 【請求項５６８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D289U, E
    291U, D296U, K302U, R303U及びK305U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ５６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  569. 【請求項５６９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L286Z, T
    287Z, V288Z, F290Z, A292Z, F293Z, G294Z, W295Z, W297Z, I298Z, I299Z, A30
    0Z, P301Z, Y304Z, L286B, T287B, V288B, F290B, A292B, F293B, G294B, W295B
    , W297B, I298B, I299B, A300B, P301B, 及び Y304B（式中Ｚは酸性アミノ酸残
    基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  570. 【請求項５７０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置344-
    368からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５６４
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  571. 【請求項５７１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357B（
    式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの
    塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質。
  572. 【請求項５７２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK344Z, K35
    6Z, 及び K363Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  573. 【請求項５７３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K344U, K
    356U, E357U, 及び K363U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  574. 【請求項５７４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M345Z, S
    346Z, P347Z, I348Z, N349Z, M350Z, L351Z, Y352Z, F353Z, N354Z, G355Z, Q35
    8Z, I359Z, I360Z, Y361Z, G362Z, I364Z, P365Z, A366Z, M367Z, V368Z, M345B
    , S346B, P347B, I348B, N349B, M350B, L351B, Y352B, F353B, N354B, G355B,
    Q358B, I359B, I360B, Y361B, G362B, I364B, P365B, A366B, M367B, 及び V368
    B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請
    求項５７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  575. 【請求項５７５】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５６４のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  576. 【請求項５７６】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５６４のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  577. 【請求項５７７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-28
    5, 306-343及び369-375からなる群から選ばれる位置である請求項５７６のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  578. 【請求項５７８】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, Q2J,
    K3J, L4J, Q5J, L6J, C7J, V8J, Y9J, I10J, Y11J, L12J, F13J, M14J, L15J, I
    16J, V17J, A18J, G19J, P20J, V21J, D22J, L23J, N24J, E25J, N26J, S27J, E
    28J, Q29J, K30J, E31J, N32J, V33J, E34J, K35J, E36J, G37J, L38J, C39J, N
    40J, A41J, C42J, T43J, W44J, R45J, Q46J, N47J, T48J, K49J, S50J, S51J, R
    52J, I53J, E54J, A55J, I56J, K57J, I58J, Q59J, I60J, L61J, S62J, K63J, L
    64J, R65J, L66J, E67J, T68J, A69J, P70J, N71J, I72J, S73J, K74J, D75J, V
    76J, I77J, R78J, Q79J, L80J, L81J, P82J, K83J, A84J, P85J, P86J, L87J, R
    88J, E89J, L90J, I91J, D92J, Q93J, Y94J, D95J, V96J, Q97J, R98J, D99J, D
    100J, S101J, S102J, D103J, G104J, S105J, L106J, E107J, D108J, D109J, D11
    0J, Y111J, H112J, A113J, T114J, T115J, E116J, T117J, I118J, I119J, T120J
    , M121J, P122J, T123J, E124J, S125J, D126J, F127J, L128J, M129J, Q130J,
    V131J, D132J, G133J, K134J, P135J, K136J, C137J, C138J, F139J, F140J, K1
    41J, F142J, S143J, S144J, K145J, I146J, Q147J, Y148J, N149J, K150J, V151
    J, V152J, K153J, A154J, Q155J, L156J, W157J, I158J, Y159J, L160J, R161J,
    P162J, V163J, E164J, T165J, P166J, T167J, T168J, V169J, F170J, V171J, Q
    172J, I173J, L174J, R175J, L176J, I177J, K178J, P179J, M180J, K181J, D18
    2J, G183J, T184J, R185J, Y186J, T187J, G188J, I189J, R190J, S191J, L192J
    , K193J, L194J, D195J, M196J, N197J, P198J, G199J, T200J, G201J, I202J,
    W203J, Q204J, S205J, I206J, D207J, V208J, K209J, T210J, V211J, L212J, Q2
    13J, N214J, W215J, L216J, K217J, Q218J, P219J, E220J, S221J, N222J, L223
    J, G224J, I225J, E226J, I227J, K228J, A229J, L230J, D231J, E232J, N233J,
    G234J, H235J, D236J, L237J, A238J, V239J, T240J, F241J, P242J, G243J, P
    244J, G245J, E246J, D247J, G248J, L249J, N250J, P251J, F252J, L253J, E25
    4J, V255J, K256J, V257J, T258J, D259J, T260J, P261J, K262J, R263J, S264J
    , R265J, R266J, D267J, F268J, G269J, L270J, D271J, C272J, D273J, E274J,
    H275J, S276J, T277J, E278J, S279J, R280J, C281J, C282J, R283J, Y284J, P2
    85J, A306J, N307J, Y308J, C309J, S310J, G311J, E312J, C313J, E314J, F315
    J, V31GJ, F317J, L318J, Q319J, K320J, Y321J, P322J, H323J, T324J, H325J,
    L326J, V327J, H328J, Q329J, A330J, N331J, P332J, R333J, G334J, S335J, A
    336J, G337J, P338J, C339J, C340J, T341J, P342J, T343J, V369J, D370J, R37
    1J, C372J, G373J, C374J, 及び S375J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然
    変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の
    前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質
    に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５７８
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  579. 【請求項５７９】蛋白質はヒト成長分化因子-8（human growth differentiation
    factor-9）(GDF-9)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質。
  580. 【請求項５８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置357-
    378からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５７９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  581. 【請求項５８１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D357B及
    びD368B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  582. 【請求項５８２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR359Z, K36
    6Z, H375Z及びR376Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  583. 【請求項５８３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D357U, R
    359U, K366U, D368U, H375U及びR376U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  584. 【請求項５８４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F358Z, L
    360Z, S361Z, F362Z, S363Z, Q364Z, L365Z, W367Z, N369Z, W370Z, I371Z, V37
    2Z, A373Z, P374Z, Y377Z, N378Z, F358B, L360B, S361B, F362B, S363B, Q364B
    , L365B, W367B, N389B, W370B, I371B, V372B, A373B, P374B, Y377B, 及び N3
    78B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む
    請求項５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  585. 【請求項５８５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置423-
    427からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５７９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  586. 【請求項５８６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E433B, D
    435B, E442B, E444B及びD445B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５
    ８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  587. 【請求項５８７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK423Z 及び
    K441Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  588. 【請求項５８８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K423U, E
    433U, D435U, K441U, E442U, E444U, 及び D445U（式中Ｕは中性アミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を
    含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  589. 【請求項５８９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y424Z, S
    425Z, P426Z, L427Z, S428Z, V429Z, L430Z, T431Z, I432Z, P434Z, G436Z, S43
    7Z, I438Z, A439Z, Y440Z, Y443Z, M446Z, I447Z, Y424B, S425B, P428B, L427B
    , S428B, V429B, L430B, T431B, I432B, P434B, G436B, S437B, I438B, A439B,
    Y440B, Y443B, M446B, 及び I447B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  590. 【請求項５９０】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５７９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  591. 【請求項５９１】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５７９のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  592. 【請求項５９２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-35
    6, 379-422及び448-454からなる群から選ばれる位置である請求項５９１のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  593. 【請求項５９３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J,
    R3J, P4J, N5J, K6J, F7J, L8J, L9J, W10J, F11J, C12J, C13J, F14J, A15J, W
    16J, L17J, C18J, F19J, P20J, I21J, S22J, L23J, G24J, S25J, Q26J, A27J, S
    28J, G29J, G30J, E31J, A32J, Q33J, I34J, A35J, A36J, S37J, A38J, E39J, L
    40J, E41J, S42J, G43J, A44J, M45J, P46J, W47J, S48J, L49J, L50J, Q51J, H
    52J, I53J, D54J, E55J, R56J, D57J, R58J, A59J, G60J, L61J, L62J, P63J, A
    64J, L65J, F66J, K67J, V68J, L69J, S70J, V71J, G72J, R73J, G74J, G75J, S
    76J, P77J, R78J, L79J, Q80J, P81J, D82J, S83J, R84J, A85J, L86J, H87J, Y
    88J, M89J, K90J, K91J, L92J, Y93J, K94J, T95J, Y96J, A97J, T98J, K99J, E
    l00J, G101J, I102J, P103J, K104J, S105J, N106J, R107J, S108J, H109J, L11
    0J, Y111J, N112J, T113J, V114J, R115J, L116J, F117J, T118J, P119J, C120J
    , T121J, R122J, H123J, K124J, Q125J, A126J, P127J, G128J, D129J, Q130J,
    V131J, T132J, G133J, I134J, L135J, P136J, S137J, V138J, E139J, L140J, L1
    41J, F142J, N143J, L144J, D145J, R146J, I147J, T148J, T149J, V150J, E15
    1J, H152J, L153J, L154J, K155J, S156J, V157J, L158J, L159J, Y160J, N161J
    , I162J, N163J, N164J, S165J, V166J, S167J, F168J, S169J, S170J, A171J,
    V172J, K173J, C174J, V175J, C176J, N177J, L178J, M179J, I180J, K181J, E1
    82J, P183J, K184J, S185J, S186J, S187J, R188J, T189J, L190J, G191J, R192
    J, A193J, P194J, Y195J, S196J, F197J, T198J, F199J, N200J, S201J, Q202J,
    F203J, E204J, F205J, G206J, K207J, K208J, H209J, K210J, W211J, I212J, Q
    213J, I214J, D215J, V216J, T217J, S218J, L219J, L220J, Q221J, P222J, L22
    3J, V224AJ, 225J, S226J, N227J, K228J, R229J, S230J, I231J, H232J, M233J
    , S234J, I235J, N236J, F237J, T238J, C239J, M240J, K241J, D242J, Q243J,
    L244J, E245J, H246J, P247J, S248J, A249J, Q250J, N251J, G252J, L253J, F2
    54J, N255J, M256J, T257J, L258VJ, 259J, S260J, P261J, S262J, L263J, I264
    J, L265J, Y266J, L267J, N268J, D269J, T270J, S271J, A272J, Q273J, A274J,
    Y275J, H276J, S277J, W278J, Y279J, S280J, L281J, H282J, Y283J, K284J, R
    285J, R286J, P287J, S288J, Q289J, G290J, P291J, D292J, Q293J, E294J, R29
    5J, S296J, L297J, S298J, A299J, Y300J, P301J, V302J, G303J, E304J, E305J
    , A306J, A307J, E308J, D309J, G310J, R311J, S312J, S313J, H314J, H315J,
    R316J, H317J, R318J, R319J, G320J, Q321J, E322J, T323J, V324J, S325J, S3
    26J, E327J, L328J, K329J, K330J, P331J, L332J, G333J, P334J, A335J, S336
    J, F337J, N338J, L339J, S340J, E341J, Y342J, F343J, R344J, Q345J, F346J,
    L347J, L348J, P349J, Q350J, N351J, E352J, C353J, E354J, L355J, H356J, P
    379J, R380J, Y381J, C382J, K383J, G384J, D385J, C386J, P387J, R388J, A38
    9J, V390J, G391J, H392J, R393J, Y394J, G395J, S396J, P397J, V398J, H399J
    , T400J, M401J, V402J, Q403J, N404J, I405J, I406J, Y407J, E408J, K409J,
    L410J, D411J, S412J, S413J, V414J, P415J, R416J, P417J, S418J, C419J, V
    420J, P421J, A422J, A448J, T449J, K450J, C451J, T452J, C453J, 及び R454J
    （式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    のコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５７８のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  594. 【請求項５９４】蛋白質はヒトアルテミン(artemin)(GDNF)サブユニットである
    請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  595. 【請求項５９５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置144-
    163からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５９４
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  596. 【請求項５９６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D159B及
    びE160B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  597. 【請求項５９７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR150Z, H15
    6Z, R157Z, 及び R163Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から
    選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  598. 【請求項５９８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R150U, H
    156U, R157U, D159U, E160U, 及び R163U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項５９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  599. 【請求項５９９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S144Z, Q
    145Z, L146Z, V147Z, P148Z, V149Z, A151Z, L152Z, G153Z, L154Z, G155Z, S51
    8Z, L161Z, V162Z, S144B, Q145B, L146B, V147B, P148B, V149B, A151B, L152B
    , G153B, L154B, G155B, S518B, L161B, 及び V162B（式中Ｚは酸性アミノ酸残
    基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  600. 【請求項６００】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置209-
    229からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５９４
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  601. 【請求項６０１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E211B, D
    217B, 及び D226B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  602. 【請求項６０２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR209Z, R22
    3Z, 及び R227Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  603. 【請求項６０３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R209U, E
    211U, D217U, R223U, D226U, 及び R227U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項６００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  604. 【請求項６０４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y210Z, A
    212Z, V213Z, S214Z, F215Z, M216Z, V218Z, N219Z, S220Z, T221Z, W222Z, T22
    4Z, V225Z, L228Z, S229Z, Y210B, A212B, V213B, S214B, F215B, M216B, V218B
    , N219B, S220B, T221B, W222B, T224B, V225B, L228B, 及び S229B（式中Ｚは
    酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６００の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  605. 【請求項６０５】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５９４のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  606. 【請求項６０６】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項５９４のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  607. 【請求項６０７】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-14
    3, 164-208及び230-237からなる群から選ばれる位置である請求項６０６のヒト
    トランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  608. 【請求項６０８】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, P2J,
    G3J, L4J, I5J, S6J, A7J, R8J, G9J, Q10J, P11J, L12J, L13J, E14J, V15J, L
    16J, P17J, P18J, Q19J, A20J, H21J, L22J, G23J, A24J, L25J, F26J, L27J, P
    28J, E29J, A30J, P31J, L32J, G33J, L34J, S35J, A36J, Q37J, P38J, A39J, L
    40J, W41J, P42J, T43J, L44J, A45J, A46J, L47J, A48J, L49J, L50J, S51J, S
    52J, V53J, A54J, E55J, A56J, S57J, L58J, G59J, S60J, A61J, P62J, R63J, S
    64J, P65J, A66J, P67J, R68J, E69J, G70J, P71J, P72J, P73J, V74J, L75J, A
    76J, S77J, P78J, A79J, G80J, H81J, L82J, P83J, G84J, G85J, R86J, T87J, A
    88J, R89J, W90J, C91J, S92J, G93J, R94J, A95J, R96J, R97J, P98J, P99J, P
    100J, Q101J, P102J, S103J, R104J, P105J, A106J, P107J, P108J, P109J, P11
    0J, A111J, P112J, P113J, S114J, A115J, L116J, P117J, R118J, G119J, G120J
    , R121J, A122J, A123J, R124J, A125J, G126J, G127J, P128J, G129J, S130J,
    R131J, A132J, R133J, A134J, A135J, G136J, A137J, R138J, G139J, C140J, R1
    41J, L142J, R143J, F164J, R165J, F166J, C167J, S168J, G169J, S170J, C171
    J, R172J, R173J, A174J, R175J, S176J, P177J, H178J, D179J, L180J, S181J,
    L182J, A183J, S184J, L185J, L186J, G187J, A188J, G189J, A190J, L191J, R
    192J, P193J, P194J, P195J, G196J, S197J, R198J, P199J, V200J, S201J, Q20
    2J, P203J, C204J, C205J, R206J, P207J, T208J, A230J, T231J, A232J, C233J
    , G234J, C235J, L236J, 及び G237J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変
    異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前
    記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に
    親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６０７の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  609. 【請求項６０９】蛋白質はヒトグリア細胞由来因子(human glial cell derived
    factor)(GDNF)/ペルセフィン(Persephin)サブユニットである請求項１９２のヒ
    トトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  610. 【請求項６１０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置70-8
    9からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６０９の
    ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  611. 【請求項６１１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77B, E8
    5B及びE86B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  612. 【請求項６１２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK87Z（式中
    Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性
    残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォーミング成長因
    子ファミリー蛋白質。
  613. 【請求項６１３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77U, E8
    5U, E86U及びK87U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトラン
    スフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  614. 【請求項６１４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S70Z, L7
    1Z, T72Z, L73Z, S74Z, V75Z, A76Z, L78Z, G79Z, L80Z, G81Z, Y82Z, A83Z, S8
    4Z, V88Z, I89Z, S70B, L71B, T72B, L73B, S74B, V75B, A76B, L78B, G79B, L8
    0B, G81B, Y82B, A83B, S84B, V88B, 及び I89B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基で
    あり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１
    つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォー
    ミング成長因子ファミリー蛋白質。
  615. 【請求項６１５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置128-
    148からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６０９
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  616. 【請求項６１６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D131B, D
    136B及びD137B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトラ
    ンスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  617. 【請求項６１７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR128Z, R13
    8Z, H139Z, R140Z及びR143Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６１５
    のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  618. 【請求項６１８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R128U, D
    131U, D136U, D137U, R138U, H139U, R140U及びR143U（式中Ｕは中性アミノ酸残
    基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変
    異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  619. 【請求項６１９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y129Z, T
    130Z, V132Z, A133Z, F134Z, L135Z, W141Z, Q142Z, L144Z, P145Z, Q146Z, L14
    7Z, S148Z, Y129B, T130B, V132B, A133B, F134B, L135B, W141B, Q142B, L144B
    , P145B, Q146B, L147B, 及び S148B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及び
    Ｂは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電し
    た残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長
    因子ファミリー蛋白質。
  620. 【請求項６２０】ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう
    １つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項６０９のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  621. 【請求項６２１】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフ
    ォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランス
    フォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的
    相互作用の増大をもたらす請求項６０９のヒトトランスフォーミング成長因子フ
    ァミリー蛋白質。
  622. 【請求項６２２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-69
    , 90-127及び149-156からなる群から選ばれる位置である請求項６２１のヒトト
    ランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
  623. 【請求項６２３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J,
    V3J, G4J, K5J, F6J, L7J, L8J, G9J, S10J, L11J, L12J, L13J, L14J, S15J, L
    16J, Q17J, L18J, G19J, Q20J, G21J, W22J, G23J, P24J, D25J, A26J, R27J, G
    28J, V29J, P30J, V31J, A32J, D33J, G34J, E35J, F36J, S37J, S38J, E39J, Q
    40J, V41J, A42J, K43J, A44J, G45J, G46J, T47J, W48J, L49J, G50J, T51J, H
    52J, R53J, P54J, L55J, A56J, R57J, L58J, R59J, R60J, A61J, L62J, S63J, G
    64J, P65J, C66J, Q67J, L68J, W69J, F90J, R91J, Y92J, C93J, A94J, G95J, S
    96J, C97J, P98J, R99J, G100J, A101J, R102J, T103J, Q104J, H105J, G106J,
    L107J, A108J, L109J, A110J, R111J, L112J, Q113J, G114J, Q115J, G116J, R1
    17J, A118J, H119J, G120J, G121J, P122J, C123J, C124J, R125J, P126J, T127
    J, A149J, A150J, A151J, C152J, G153J, C154J, G155J, 及び G156J（式中Ｊは
    任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォ
    ーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング
    成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミン
    グ成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項６２２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋
    白質。
  624. 【請求項６２４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E3B, E19
    B, 及びE21B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホ
    ルモンファミリー蛋白質。
  625. 【請求項６２５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K2Z, K6Z
    , K8Z, K10Z及びK20Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質。
  626. 【請求項６２６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K2U, E3U
    , R6U, R8U, R10U, E19U, K20U 及び E21U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  627. 【請求項６２７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1Z, P4Z
    , L5Z, P7Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, T15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G22Z, C
    23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, C34Z, A
    35Z, G36Z, Y37Z, S1B, P4B, L5B, P7B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, T15B,
    L16B, A17B, V18B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B,
    T31B, T32B, I33B, C34B, A35B, G36B及びY37B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であ
    り、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    の荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファ
    ミリー蛋白質。
  628. 【請求項６２８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D61B 及
    び E65B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋白ホルモ
    ンファミリー蛋白質。
  629. 【請求項６２９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60Z, R6
    3Z, R68Z, 及び R73Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質。
  630. 【請求項６３０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60U, D6
    1U, R63U, E65U, R68U, 及び R74U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からな
    る群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項７
    ０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  631. 【請求項６３１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58Z, Y5
    9Z, V62Z, F64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, N7
    7Z, P78Z, V79Z, V80Z, S81Z, Y82Z, A83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, N58B, Y5
    9B, V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, N7
    7B, P78B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式
    中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７
    ０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  632. 【請求項６３２】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  633. 【請求項６３３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置38-5
    7及び88-140からなる群から選ばれる位置である請求項６３２のヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質。
  634. 【請求項６３４】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がC38J, P39J
    , T40J, M41J, T42J, R43J, V44J, L45J, Q46J, G47J, V48J, L49J, P50J, A51J
    , L52J, P53J, Q54J, V55J, V56J, C57J, C88J, Q89J, C90J, A91J, L92J, C93J
    , R94J, R95J, S96J, T97J, T98J, D99J, C100J, G101J, G102J, P103J, K104J,
    D105J, H106J, P107J, L108J, T109J, C110J, D111J, D112J, P113J, R114J, F
    115J, Q116J, D117J, S118J, S119J, S120J, Sl21J, K122J, A123J, P124J, P12
    5J, P126J, S127J, L128J, P129J, S130J, P131J, S132J, R133J, L134J, P135J
    , G136J, P137J, S138J, D139J, 及び T140J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基であ
    る）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する
    突然変異を含み、それは 前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項６３３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  635. 【請求項６３５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E3B, E19
    B, 及び E21B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホ
    ルモンファミリー蛋白質。
  636. 【請求項６３６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R2Z, R6Z
    , H10Z, 及び K20Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  637. 【請求項６３７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R2U, E3U
    , R6U, E19U, K20U 及び E21U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項７４の
    ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  638. 【請求項６３８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1Z, P4Z
    , L5Z, P7Z, W8Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, I15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G2
    2Z, C23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, S1
    B, P4B, L5B, P7B, W8B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V1
    8B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, 及
    び I33B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  639. 【請求項６３９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D61B, E6
    5B, 及び D77B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  640. 【請求項６４０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60Z, R6
    3Z, R68Z, 及び R74Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ば
    れる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質。
  641. 【請求項６４１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60U, D6
    1U, R63U, E65U, R68U, R74U, 及び D77U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請
    求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  642. 【請求項６４２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T58Z, Y5
    9Z, V62Z, I64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, P7
    8Z, V79Z, V80Z, S81Z, F82Z, P83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, T58B, Y59B, V6
    2B, I64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, P78B, V7
    9B, V80B, S81B, F82B, P83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｚは酸性ア
    ミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質。
  643. 【請求項６４３】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  644. 【請求項６４４】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置34-5
    7及び88-121からなる群から選ばれる位置である請求項６３２のヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質。
  645. 【請求項６４５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA35J, G36J
    , Y37J, C38J, P39J, T40J, M41J, M42J, R43J, V44J, L45J, Q46J, A47J, V48J
    , L49J, P50J, P51J, L52J, P53J, Q54J, V55J, V56J, C57J, C88J, R89J, C90J
    , G91J, P92J, C93J, R94J, R95J, S96J, T97J, S98J, D99J, C100J, G101J, G1
    02J, P103J, K104J, D105J, H106J, P107.J, L108J, T109J, C110J, D111J, H11
    2J, P113J, Q114J, L115J, S116J, G117J, L118J,J, L119J, F120J, 及び L121J
    （式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つ
    のコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項６４４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  646. 【請求項６４６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E4B, El3
    B, El5B及びEl6B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質。
  647. 【請求項６４７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K14Z 及
    び R18Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくと
    も１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンフ
    ァミリー蛋白質。
  648. 【請求項６４８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E4U, E13
    U, K14U, E15U, E16U 及び Rl8U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８０
    のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  649. 【請求項６４９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L5Z, T6Z
    , N7Z, I8Z, T9Z, I10Z, A11Z, I12Z, C17Z, F19Z, C20Z, I21Z, S22Z, I23Z, N
    24Z, T25Z, T26Z, W27Z, L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, C17B,
    F19B, C20B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B, 及び W27B（式中Ｚは酸性
    アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれ
    る少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖
    蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  650. 【請求項６５０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D69B（式
    中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
    基性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー
    蛋白質。
  651. 【請求項６５１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H66Z, H6
    7Z, 及び H81Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質。
  652. 【請求項６５２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H66U, H6
    7U, D69U及びH81U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる
    少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホ
    ルモンファミリー蛋白質。
  653. 【請求項６５３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A66Z, H6
    7Z, H68Z, A69Z, D70Z, S71Z, L72Z, Y73Z, T74Z, Y75Z, P76Z, V77Z, A78Z, T7
    9Z, Q80Z, A66B, H67B, H68B, A69B, D70B, S71B, L72B, Y73B, T74B, Y75B, P7
    6B, V77B, A78B, T79B, 及び Q80B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢ
    は塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した
    残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白
    質。
  654. 【請求項６５４】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  655. 【請求項６５５】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-3, 28-64及び82-109からなる群から選ばれる位置である請求項６５４のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  656. 【請求項６５６】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がN1J, S2J,
    C3J, A29J, G30J, Y31J, C32J, Y33J, T34J, R35J, D36J, L37J, V38J, Y39J, K
    40J, D41J, P42J, A43J, R44J, P45J, K46J, i47J, t48J, C49J, T50J, F51J, K
    52J, E53J, L54J, V55J, Y56J, E57J, T58J, V59J, R60J, V61J, P62J, G63J, C
    64J, C82J, G83J, K84J, C85J, D86J, S87J, D88J, S89J, T90J, D91J, C92J, T
    93J, V94J, R95J, G96J, L97J, G98J, P99J, S100J, Y101J, C102J, S103J, F10
    4J, G105J, E106J, M107J, K108J, 及び E109J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更す
    る突然変異を含み、それは 前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項６５５のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  657. 【請求項６５７】蛋白質は甲状腺刺激ホルモン(TSH)βサブユニットである請求
    項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  658. 【請求項６５８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置1-30
    からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６５７の
    ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  659. 【請求項６５９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E6B, E12
    B, 及びE15B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少
    なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  660. 【請求項６６０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H10Z, R1
    3Z, 及びR14Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質。
  661. 【請求項６６１】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E6U, H10
    U, E12U, R13U, R14U 及び E15U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる
    群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６５
    ８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  662. 【請求項６６２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、I1Z, C2Z
    , I3Z, P4Z, T5Z, Y7Z, T8Z, M9Z, I11Z, C16Z, A17Z, Y18Z, C19Z, L20Z, T21Z
    , I22Z, N23Z, T24Z, T25Z, I26Z, C27Z, A28Z, G29Z, Y30Z, I1B, C2B, I3B, P
    4B, T5B, Y7B, T8B, M9B, I11B, C16B, A17B, Y18B, C19B, L20B, T21B, I22B,
    N23B, T24B, T25B, I26B, C27B, A28B, G29B, 及び Y30B（式中Ｚは酸性アミノ
    酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少な
    くとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  663. 【請求項６６３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置53-8
    7からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６５７の
    ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  664. 【請求項６６４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D56B 及
    び D69B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なく
    とも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質。
  665. 【請求項６６５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R55Z, R6
    0Z, H70Z, K84Z及びK87Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト
    糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  666. 【請求項６６６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R55U, D5
    6U, R60U, E63U, H70U, K84U及びK87U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）から
    なる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項
    ６６３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  667. 【請求項６６７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T53Z, Y5
    4Z, F57Z, I58Z, Y59Z, T61Z, V62Z, I64Z, P65Z, G66Z, C67Z, P68Z, L69Z, V7
    1Z, A72Z, P73Z, Y74Z, F75Z, S76Z, Y77Z, P78Z, V79Z, A80Z, L81Z, S82Z, C8
    3Z, C85Z, G86Z, T53B, Y54B, F57B, I58B, Y59B, T61B, V62B, I64B, P65B, G6
    6B, C67B, P68B, L69B, V71B, A72B, P73B, Y74B, F75B, S76B, Y77B, P78B, V7
    9B, A80B, L81B, S82B, C83B, C85B, 及び G86B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基で
    あり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１
    つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホルモン
    ファミリー蛋白質。
  668. 【請求項６６８】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  669. 【請求項６６９】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置31-5
    2 及び 88-118からなる群から選ばれる位置である請求項６６８のヒト糖蛋白ホ
    ルモンファミリー蛋白質。
  670. 【請求項６７０】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がC31J, M32J
    , T33J, R34J, D35J, I36J, N37J, G38J, K39J, L40J, F41J, L42J, P43J, K44J
    , Y45J, A46J, L47J, S48J, Q49J, D50J, V51J, C52J, C88J, N89J, T90J, D91J
    , Y92J, S93J, D94J, C95J, I96J, H97J, E98J, A99J, I100J, K101J, T102J, N
    103J, Y104J, C105J, T106J, K107J, P108J, Q109J, K110J, S111J, Y112J, L11
    3J, V114J, G115J, F116J, S117J, 及び V118J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基で
    ある）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更す
    る突然変異を含み、それは 前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋
    白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の
    増大をもたらす請求項６５５のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  671. 【請求項６７１】蛋白質はヒト糖蛋白質αサブユニットである請求項６６のヒト
    糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  672. 【請求項６７２】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置8-30
    からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６７１の
    ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  673. 【請求項６７３】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E9B及びE
    14B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６７２のヒト糖蛋白ホルモン
    ファミリー蛋白質。
  674. 【請求項６７４】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E9U 及び E14U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも
    １つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６７２のヒト糖蛋白ホルモンフ
    ァミリー蛋白質。
  675. 【請求項６７５】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P8Z, C10
    Z, T11Z, L12Z, Q13Z, N15Z, P16Z, F17Z, F18Z, S19Z, Q20Z, P21Z, G22Z, A23
    Z, P24Z, I25Z, L26Z, Q27Z, C28Z, M29Z, G30Z, P8B, C10B, T11B, L12B, Q13B
    , N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, P21B, G22B, A23B, P24B, I25B, L26B
    , Q27B, C28B, M29B, 及び G30B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは
    塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残
    基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白
    質。
  676. 【請求項６７６】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置61-8
    5からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６７１の
    ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  677. 【請求項６７７】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77B（式
    中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩
    基性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質。
  678. 【請求項６７８】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K63Z, R6
    7Z, K75Z, H79Z及びH83Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選
    ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト
    糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  679. 【請求項６７９】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K63U, R6
    7U, K75U, E77U, H79U及びH83U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群
    から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６
    のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  680. 【請求項６８０】少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、V61Z, A6
    2Z, S64Z, Y65Z, N66Z, V68Z, T69Z, V70Z, M71Z, G72Z, G73Z, F74Z, V76Z, N7
    8Z, T80Z, A81Z, C82Z, C84Z, S85Z, V61B, A62B, S64B, Y65B, N66B, V68B, T6
    9B, V70B, M71B, G72B, G73B, F74B, V76B, N78B, T80B, A81B, C82B, C84B, 及
    び S85B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。
    ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を
    含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  681. 【請求項６８１】前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、そ
    れにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホル
    モンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリ
    ー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求
    項６７１のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
  682. 【請求項６８２】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-7, 31-60及び86-92からなる群から選ばれる位置である請求項６８１のヒト糖蛋白
    ホルモンファミリー蛋白質。
  683. 【請求項６８３】前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA1J, P2J,
    D3J, V4J, Q5J, D6J, C7J, C31J, C32J, F33J, S34J, R35J, A36J, Y37J, P38J,
    T39J, P40J, L41J, R42J, S43J, K44J, K45J, T46J, M47J, L48J, V49J, Q50J,
    K51J, N52J, V53J, T54J, S55J, E56J, S57J, T58J, C59J, C60J, T86J, C87J,
    Y88J, Y89J, H90J, K91J, 及び S92J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）か
    らなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変
    異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構
    造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の
    静電的相互作用の増大をもたらす請求項６８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー
    蛋白質。
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