JP2003523767A

JP2003523767A - 脂肪組織由来の間質細胞から生成した多能性幹細胞およびその用途

Info

Publication number: JP2003523767A
Application number: JP2001562675A
Authority: JP
Inventors: ウイルキツソン，ウイリアム・オー; ギンブル，ジエフリー
Original assignee: アーテイセル・サイエンスイーズ・インコーポレイテツド
Priority date: 2000-02-26
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2003-08-12
Also published as: CA2400485A1; WO2001062901A3; AU2001238695B2; IL151228A; DK1261694T3; EP1261694B1; AU3869501A; DE60132429D1; ES2300320T3; WO2001062901A2; PT1261694E; SG134168A1; ATE384124T1; US20060228341A1; CA2400485C; EP1261694A2; US20010033834A1; DE60132429T2; US7078230B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、脂肪組織由来の間質細胞から生成した多能性幹細胞およびその用途の領域におけるものである。特に本発明は、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝細胞の少なくとも１つの表現型を発現するように誘導された単離された脂肪組織由来間質細胞を含む。本発明はまた、脂肪細胞表現型マーカーが存在しないように分化した単離された脂肪細胞組織由来の間質細胞を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】従前の出願本出願は、２０００年２月２６日出願の米国出願第６０／１８５，３３８号に
よる優先権を主張する。

【０００２】発明の技術分野本発明は、脂肪組織由来の間質細胞から生成した多能性幹細胞およびその用途
の領域におけるものである。特に本発明は、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細
胞または肝細胞のうち少なくとも１つの表現型を発現するように誘導された単離
された脂肪組織由来間質細胞を含む。本発明はまた、脂肪細胞表現型マーカーが
存在しないように分化した単離された脂肪細胞組織由来の間質細胞を含む。

【０００３】発明の背景幹細胞は以下の基準を満たさなければならない。（１）クローン幹細胞集団の
自己増殖能力、（２）クローン幹細胞集団のインビトロにおける新たな最終分化
細胞形生成能力、（３）自己の天然細胞が欠失した動物中に移植したときに、欠
損した最終的に分化した細胞集団をクローン幹細胞集団が置換し得る能力。

【０００４】ヒトの発生における新生児期は、多数の分化経路に沿って発生する潜在能力を
備えた「幹」細胞の存在によって特徴付けられる。これらの細胞の最終分化は、
器官形成および組織構築を調整するサイトカインおよびホルモンの指示により決
定される。ネズミ胚幹細胞（ＥＳ）細胞が単離されインビトロおよびインビボで
の研究が広範囲になされてきた。研究者たちは、インビトロで外因性刺激を与え
ることにより、多数の系統経路に沿ってＥＳ細胞の分化を誘導してきた。こうし
た経路には、神経細胞、Ｂリンパ球系細胞、および脂肪細胞が含まれる（Ｄａｎ
ｉ他（１９９７）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１０：１２７９；Ｒｅｍｏｎｃｏｕ
ｒｔ他（１９９８）ＭｅｃｈＤｅｖ７９：１８５；Ｏ’Ｓｈｅａ、Ｓ．（１
９９９）Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２５７：３２、１９９９）。ＥＳ細胞をインビボで
相同組換え技術によって操作し、遺伝子特異的ヌル、すなわち、「ノックアウト
」マウスを作製した（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４５：１２３４）。特定遺伝子の欠損したＥＳ細胞クローンを単離した後、こ
れらを受精したネズミ接合体に移植する。この単離ＥＳ細胞の子孫は、どのよう
なそしてすべてのネズミ組織中に、互いに協調して発達していくことができる。

【０００５】多能性幹細胞は成体生物に存在する。最もよく特徴付けられた「幹細胞」の例
は、骨髄や末梢血から単離された造血前駆細胞である。Ｔｒｅｎｔｉｎとその同
僚によってなされた発生の研究（Ｔｒｅｎｔｉｎ（１９６５）Ｃａｒｄｉｏｖａ
ｓｃ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔ．Ｂｕｌｌ４：３８；Ｔｉｌｌ＆ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ
（１９６１）Ｒａｄ．Ｒｅｓ．１４：２１３）において、致死量の放射線を照射
したマウスについて検討された。こうした動物は、治療を施さない場合、循環血
液細胞を補充できないために死亡した。しかし、骨髄細胞を同系ドナーの動物か
ら移植することにより、これらの宿主動物は救命された。このドナー細胞は、循
環血液細胞のすべてを再配備する能力を有していた。多数の優れた研究により、
有限個の未分化造血幹細胞を与えることによって宿主動物中で８種類またはそれ
以上の異なる血液細胞系統が再生できることが、示された。この研究は、癌や先
天性代謝異常の治療法として広く受け入れられている骨髄移植の基礎となるもの
である。このように、造血幹細胞は一生を通じて正常なヒト骨髄中に存在し続け
、新生児期に限定されるものではない。

【０００６】造血前駆細胞は骨髄微細環境に限定されないであろうという新たな刺激的なニ
ュースがある。カルガリー大学の研究者たちは、神経細胞系統の経路に沿って通
常分化する神経幹細胞について検討した。これらの細胞を致死量の放射線を照射
した宿主に移植したところ、研究者たちは、新たに生じた骨髄細胞およびリンパ
球細胞中にドナー細胞マーカーの存在を検出した（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ（１９９９
）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３：５３４）。また、ベイロー医科大学の研究者たちは
、ネズミの骨格筋から分離した衛星細胞を用いて同様の研究を行った（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ他（１９９９）ＰＮＡＳ９６：１４４８２）。これらの筋肉由来細胞を
致死量の放射線を照射した宿主に移植したところ、研究者たちは、すべての血液
細胞系統中に筋肉遺伝子マーカーの存在を検出した。これらの研究を併せ考えれ
ば、神経組織および筋肉組織は造血細胞に分化し得る幹細胞を含んでいることに
なる。このことは、脊髄以外の部位から造血前駆細胞の再生源を得て、ヒトの疾
病治療に用い得ることを示唆している（Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ他（１９９９）
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ１６：６６１：Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ他（１９９９
）ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ２２：３４８；Ｓｖｅｎｄｓｏｎ＆Ｓ
ｍｉｔｈ（１９９９）ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ２２：３５７）。

【０００７】神経細胞や筋肉細胞が照射された骨髄を再生する能力を有するのと同様に、骨
髄由来細胞は他の器官部位に住みつくことができる。肝臓が損傷された動物に骨
髄由来の造血細胞および間質細胞を移植すると、これらの細胞は宿主動物中で肝
臓の卵形細胞を再生することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅ他（１９９９）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２８４：１１６８）。同様に、標識した骨髄間質細胞を新生児マウスの
側脳室に埋め込むと、これらは成熟星状細胞に分化することができた（Ｋｏｐｅ
ｎ他（１９９９）ＰＮＡＳ９６：１０７１１）。実際、骨髄間質細胞をマウス
の腹腔内に移植すると、これらは、宿主動物の器官（たとえば、脾臓、肺、骨髄
、骨、軟骨および皮膚）を通して検出された（Ｐｅｒｅｉｒａ他（１９９８）Ｐ
ＮＡＳ９５：ｐ１１４２、１９９８）。これらの研究は、骨髄間質細胞が本
来の起源である皮膚とは異なる系統に分化する能力があることを示唆している（
Ｋｏｐｅｎ他（１９９９）ＰＮＡＳ９６：１０７１１）。

【０００８】１個のドナー細胞から生物全体を発生させる最近の例は、この仮説と一致する
。たとえば、「ドリー」の実験は、羊の乳腺から分離した細胞が１匹の成熟羊に
なり得ることを示している。ネズミに関する同様な研究では、卵巣の黄体から得
た細胞が１匹の成熟マウスになり得ることを示している。これらの研究は、いず
れかのタイプおよびすべてのタイプに分化する能力を備えた幹細胞が成体器官中
に存在し続けていることを示唆している。したがって、「胚性」幹細胞は個体の
一生を通じて保持されている可能性がある。

【０００９】成体骨髄微細環境はこうした仮説的な幹細胞の源としての可能性を有している
。成体骨髄から分離した細胞は、間質細胞、間質幹細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ：
ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）、間葉線維芽細胞、網状内皮細
胞、およびＷｅｓｔｅｒｎ−Ｂａｉｎｔｏｎ細胞などの様々な名称で呼ばれる（
（Ｇｉｍｂｌｅ他（１９９６）Ｂｏｎｅ１９：４２１，１９９６）。インビト
ロでの研究は、これらの細胞が多数の間葉性すなわち中胚葉系統、たとえば、脂
肪細胞（Ｇｉｍｂｌｅ他（１９９０）ＥｕｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２０：３７
９）、軟骨細胞（Ｂｒｕｄｅｒ他（１９９４）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．
５６：２８３）、造血支持細胞（Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｉ他（１９８８）Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：８６３）、骨格筋筋細胞（Ｐｒｏｃｋｏｐ（１９
９８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＳｕｐｐｌ．３０−３１：２８４−５）
、平滑筋筋細胞（Ｃｈａｒｂｏｒｄ）および骨芽細胞（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ他（
１９９２）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．９９：１３１；Ｄｏｒｈｅｉｍ他（１９９
３）Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１５４：３１７）を含むが、これらに限定
されない系統に沿って分化し得ることを示している。さらに骨髄間質細胞は星状
細胞（Ｋｏｐｅｎ他（１９９９）ＰＮＡＳ９６：１０７１１）および肝臓卵形
細胞（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ他（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：１１６８）に
分化する能力を示す。これらの知見に基づいて、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織、肝
臓、神経その他の組織の再生のための間質幹細胞源として骨髄が提案されてきた
。しかし、骨髄間質細胞を抽出するには高度のリスクが伴い患者にとっても不快
である。

【００１０】一方、成人の髄外脂肪組織由来の間質細胞は、リスクおよび患者にとっての不
快感を最小限にして日常的操作で搾取し得る間質細胞源の代表である。病理学的
証拠によれば、脂肪細胞由来の間質細胞が多数の系統の経路に沿って分化する能
力を有することが示唆される。最も広く見られる軟質組織腫瘍である脂肪肉腫は
脂肪細胞様の細胞から発生する。起源が様々な軟質組織腫瘍は比較的広く見られ
る。これらの腫瘍は、脂肪組織、筋肉（平滑筋や骨格筋）、軟骨および／または
骨の要素を含む。進行性骨異形成として知られる稀な症状の患者では、その原因
は不明であるが、皮下の脂肪細胞が骨を形成する。

【００１１】最近の研究は、骨髄由来間質細胞の、インビトロでの神経分化を経る特異的能
力を示している（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ他（２０００）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈ６１：３６４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２００
０）ＥｘｐＮｅｕｒｏｌｏｇｙ１６４：２４７）。これらの研究において、
骨髄間質細胞を抗酸化剤、表皮成長因子（ＥＧＦまたは脳由来神経栄養性因子（
ＢＤＮＦ）での処理は、神経細胞の分化と合致する細胞の形態学的変化、すなわ
ち、成長円錐および糸状仮足で終る長細胞の伸長プロセスを誘導する（Ｗｏｏｄ
ｂｕｒｙ他（２０００）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ６
１：３６４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ
ｏｇｙ１６４：２４７）。さらにこれらの物質は、ネスチン、ニューロン特異
的エノラーゼ（ＮＳＥ）、神経細線維Ｍ（ＮＦ−Ｍ）、ノイＮ（ＮｅｕＮ）およ
び神経成長因子受容体ｔｒｋＡなどの神経細胞特異的タンパク質の発現を誘導す
る（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ他（２０００）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅ
ａｒｃｈ６１：３６４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）Ｅｘｐ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ１６４：２４７）。

【００１２】Ｏｓｉｒｉｓに対し与えられた米国特許第５，４８６，３５９号は、１種以上
のタイプの結合組織細胞に分化することができる単離された均一なヒト間葉幹細
胞集団を対象とする。この特許は、これらの細胞を単離し、精製し、培養すなわ
ちインビトロで、大幅に複製する方法を開示している。

【００１３】ＣａｓｅＷｅｓｔｅｒｎおよびＯｓｉｒｉｓに対し与えられた米国特許第５
，９４２，２２５号は、単離したヒト間葉幹細胞が１種類の特定の間葉性系統に
系統指向的分化するように誘導する組成物について記載したもので、この組成物
は、ヒト間葉幹細胞、および間葉幹細胞の１種類の特定の系統への分化を誘導す
る１種または複数の生体活性因子を含む。

【００１４】ＣａｓｅＷｅｓｔｅｒｎに対し与えられた米国特許第５，７３６，３９６号
は、単離したヒト間葉幹細胞のエクスビボにおける系統指向的分化の誘導方法を
記載したもので、ヒト間葉幹細胞を生体活性因子と接触させ、それによってそれ
を１種類の特定の間葉性系統にエクスビボで分化を誘導する。この特許はまた、
特定の間葉細胞系統の間葉細胞を必要とする個体を治療する方法であって、そう
した治療を必要とする個体に、生物活性因子との接触によってエクスビボで分化
を誘導し、これによりこのような細胞を単一の特定の間葉細胞系統にエクスビボ
で分化を誘導した、単離されたヒト間葉幹細胞を含む組成物を投与することを含
む方法も記載している。

【００１５】ＣａｓｅＷｅｓｔｅｒｎに対し与えられた米国特許第５，９０８，７８４号
は、ヒト間葉性前駆細胞のインビトロでの軟骨形成のための、およびそれから得
られるヒト軟骨細胞のインビトロでの形成のための組成物を開示し、この組成物
は、細胞ペレットとして緊密な状態に濃縮した、単離したヒト間葉性幹細胞およ
びこれと接触させる少なくとも１種類の軟骨誘導剤を含む。この特許はまた、間
葉性幹細胞にインビボで軟骨誘導剤を接触させることによる、細胞ペレットとし
て緊密な状態に濃縮したヒト間葉性幹細胞における軟骨誘導方法を記載している
。

【００１６】ＡｄｖａｎｃｅｄＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に対し与えら
れた米国特許第５，９０２，７４１号は、インビトロで調製された生軟骨組織を
開示するものであり、これは、軟骨形成性間質細胞および間質細胞によって天然
状態で分泌された結合組織タンパク質を含み、立体構造を生体適合性非生体材料
で形成し、この間質細胞で橋掛けされた空隙を有する３次元の構造に間質細胞を
取り付け実質的にこれで包んだものである。この特許はまた、細胞を軟骨に増殖
、分化させるのに適した重合性担体内に間葉性幹細胞を含む新たな軟骨を成長さ
せるための組成物を開示する。

【００１７】ＡｄｖａｎｃｅｄＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に対し与えら
れた米国特許第５，８６３，５３１号は、インビトロで調製された管状の生間質
組織を開示するものであり、これは、間質細胞および間質細胞によって天然状態
で分泌された結合組織タンパク質を含み、生体適合性非生体材料で形成した、間
質細胞で橋掛けされた空隙を有する３次元管状の構造に間質細胞を取り付け実質
的にこれで包んだものである。

【００１８】Ｏｓｉｒｉｓに対し与えられた米国特許第５，８１１，０９４号は、ヒト骨髄
から回収したヒト間葉性幹細胞を含み実質的に血液細胞を含まない細胞調製物を
個体に投与することにより、結合組織を必要とする個体においてこれを生産する
ことを含む、結合組織の製造方法を記載する。

【００１９】米国特許第６，０３０，８３６号は、ヒト間葉幹細胞を造血幹細胞と、少なく
とも造血幹細胞の一部がその表現型を維持するようにインビトロで同時培養する
ことを含むヒト造血幹細胞の維持方法について記載している。

【００２０】米国特許第６，１０３，５２２号は、ヒト造血前駆細胞とインビトロで組み合
わせて培養する照射された不死化間質細胞系について記載している。

【００２１】ＷＯ９６０２６６２Ａ１および米国特許第５，８７９，９４０は、造血能力
を維持するヒト骨髄間質細胞について記載している。

【００２２】Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ対し与えられた米国特許第５，８２７，７３５号は、多核
筋形成細胞系統に方向付けされた細胞を実質的に含まず、主として星形である精
製された多能性間質幹細胞について記載しており、ここで、間質細胞は、１０％
ウシ胎児血清を含む組織培養培地中、筋肉形態形成タンパク質と接触させたとき
に主として線維芽細胞を形成し、１０％ウシ胎児血清を含む組織培養培地中で、
筋肉形態形成タンパク質および瘢痕阻止因子と接触させたときに、自発収縮する
分岐した多核構造を主として形成する。

【００２３】ＷＯ９９／９４３２８は、中枢神経系の治療における間質幹細胞の使用および
骨髄間質細胞の分化を方向付ける方法について記載している。

【００２４】Ｏｓｉｒｉｓに対するＷＯ９８／２０７３１は、骨髄巨核球前駆体組成物およ
び骨髄巨核球を単離することによる単離された骨髄巨核球と結合したＭＳＣの単
離方法について記載している。

【００２５】Ｏｓｉｒｉｓに対するＷＯ９９／６１５８７は、ヒトＣＤ４５および／または
線維芽細胞および間葉性幹細胞について記載している。

【００２６】ピッツバーグ大学およびカリフォルニア大学評議会に対するＷＯ００／５３７
９５は、脂肪細胞由来幹細胞および脂肪細胞と赤血球を実質的に含まない格子お
よび結合組織幹細胞のクローン集団について記載している。この細胞は、単独で
、または生体適合性組成物内において、インビボおよびインビトロの両方で分化
組織および構造を生成するのに用いることができる。さらに、この細胞を増殖さ
せ培養することによりホルモンを生産することができ、また、他の細胞集団の生
育を支持し増殖させるための馴らし培地が得られる。別の態様では、ＷＯ００／
５３７９５では、細胞外マトリクス成分を含み実質的に細胞を含まない脂肪由来
格子により脂肪組織を形成する。この格子は、インビボ、インビトロのいずれで
も、細胞の成長および分化を促進して原基（ａｎａｌｇｅｎ）または成熟組織ま
たは構造とするための基質として用いることができる。ＷＯ００／５３７９５は
、その優先権書類に、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝細胞のうち
少なくとも１つの表現型を発現するように誘導された脂肪組織由来間質細胞を開
示していないし、脂肪細胞表現型マーカーが存在しないように脱分化した単離さ
れた脂肪細胞由来間質細胞を開示していない。

【００２７】ＷＯ９９／２８４４４は、脂肪組織から得た間質細胞を骨芽細胞特性を有する
細胞に分化させる方法および組成物、並びに患者の骨構造を改良する方法につい
て記載している。

【００２８】ＷＯ００／４４８８２は、脂肪組織から得られた間質細胞を完全に機能的な多
能性幹細胞（造血細胞系統または血液細胞系統、神経細胞系統、上皮細胞系統に
よって証明される）に誘導する方法および組成物並びにその使用を開示する。

【００２９】本発明の目的は、新規な細胞、および、治療処置方法、診断方法、他の医学的
用途、並びに他の目的、たとえば、所望の物質の細胞による生産を目的とする。

【００３０】発明の要旨本発明は、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝細胞のうち少なくと
も１つの特徴を発現するように誘導された単離された脂肪組織由来間質細胞を含
む。これらの細胞は、自家移植または同種移植による治療を必要とする宿主の治
療または診断の目的で使用することができる。細胞はたとえば、製薬上許容でき
る担体、たとえば、リン酸緩衝食塩水に含ませて標的領域に投与することができ
る。あるいは、細胞をマトリクス、格子、または２次元もしくは３次元構造を与
える他の材料に含ませて、固定型構造、たとえば、インプラントや移植物を形成
するようにして投与することもできる。３次元の構造は生体分解性または生体非
分解性のいずれでもよい。これらの細胞を投与するのに用いることができる生体
分解性材料の例としては、アルギン酸塩、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリラ
クチド−ｃｏ−グリコリド、プロテオグリカン、グリコプロテイン、ヒアルロン
、フィブロネクチン、およびコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。必要で
あれば、サイトカイン、成長因子、化学的誘導剤、生物学的薬剤、化学療法剤、
ホルモン、他の細胞、タンパク質、炭水化物、ペプチドまたは核酸などの他の薬
剤と組み合わせて細胞を投与することもできる。

【００３１】本発明の好ましい態様では、間質細胞は、皮膚、乳腺、性腺、または大網脂肪
組織に由来し、造血または血液細胞系統、神経（神経系）細胞系統、星状膠細胞
系統、肝細胞または上皮細胞細胞系統に部分的または完全に分化できる、完全に
機能する多能性幹細胞に脱分化させさせたものである。本発明はまた、誘導され
た脂肪組織由来細胞を、治療に（たとえば、組織の修復、再生、再構築、増強ま
たは診断）、あるいは所望の物質を生産するバイオリアクターとして、さらに、
遺伝子工学および組織工学において用いる方法を提供する。

【００３２】本発明は成人ヒト髄外脂肪組織由来間質幹細胞を分離し、特徴付けし、非間葉
細胞系統（造血細胞および神経細胞を含むがこれらに限定されない）にそって分
化させるための方法および組成物を提供し、また、いくつかのヒトおよび動物の
状態や疾患の治療のための多能性幹細胞としての使用を概説する。

【００３３】本発明の別の態様では、非脂肪組織由来細胞例えば、神経細胞、星状膠細胞、
造血前駆細胞または肝細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように脂肪組織由
来間質細胞を誘導する方法が提供され、これは、単離された脂肪組織由来間質細
胞を化学的に規定された培地（血清、成長因子、ホルモン、サイトカイン、血清
因子、胚エキス、好ましくは非ヒト胚エキス、および／または特定の細胞系統分
化を誘導するための化学物質を含んでもよい）で培養することを含む。

【００３４】本発明の方法および組成物は、ヒトの疾病状態（血液疾患、癌、中枢神経の疾
患および外傷、末梢神経の疾患および外傷、肝臓の疾患および外傷などを含むが
、これに限定されない）の治療のための自家移植および同種移植に用いることが
できる。

【００３５】さらに、本発明の細胞は、治療的な遺伝子産物を発現させるために遺伝子工学
的に修飾することもできる。脂肪由来細胞は、たとえば、外来性遺伝子を発現す
るように、または、内因性遺伝子の発現を抑制するように修飾することができる
。この実施形態によれば、細胞を導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝子転移ベクタ
ーに暴露して、核酸が細胞内で導入遺伝子が発現する適当な条件下で細胞に導入
されるようにする。導入遺伝子は、一般的には発現カセットであり、適当なプロ
モーターに機能可能に結合させたコード領域のポリヌクレオチドを含む。このコ
ード領域のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするものでもよいが、アン
チセンスＲＮＡやリボザイムなどの生物学的に活性なＲＮＡをコードするもので
もよい。

【００３６】発明の詳細な説明本発明は、脂肪組織由来間質細胞を、非脂肪組織に由来する細胞、好ましくは
神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝細胞の少なくとも１つの特徴を発
現するように誘導する方法および組成物を提供する。本発明の方法により生産さ
れる細胞は、多数の組織細胞系統の特徴を有する部分的または完全に分化した機
能的細胞源を提供することができ、研究、移植および動物の疾病、好ましくは人
間の疾病の治療、組織の修復や改善のための組織工学産物の開発に有用である。

【００３７】脂肪組織は、多能性間質幹細胞源として骨髄細胞に代わり得るものである。脂
肪組織はアクセスが容易であり、多くの個体中に豊富に存在する。肥満は米国で
は異常発生的な割合で見られる症状であり、成人の５０％以上が、身長と体重に
基づく推奨体重係数（ＢＭＩ）を超過している。脂肪細胞は、外来でも脂肪吸引
によって採取することができる。脂肪吸引は美容効果を有する比較的非侵襲的な
処置であり、ほとんど大多数の患者にとって許容できるものである。脂肪細胞は
補充可能な細胞集団であることが研究により十分に確認されている。脂肪吸引ま
たは他の処置による外科的除去を行った後でも、個体内において時間の経過とと
もに同じ部位に脂肪細胞が再生されるのが普通である。このことは、脂肪組織は
、新しい脂肪細胞を生産できる細胞を含むことを示唆する。

【００３８】本発明の１つの実施形態では、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝
細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導された脂肪組織由来間質細胞
が提供される。所望の細胞の表現型マーカーは当業者にはよく知られており、文
献にも多数の記載例がある。表現型マーカーは次々に開示されているし、過大な
実験を行わなくとも同定することができる。これらのマーカーのいずれを用いて
も、脂肪細胞が分化状態に誘導されたかを確認することができる。細胞系統に特
異的な表現型の特徴は細胞表面タンパク質、細胞骨格タンパク質、細胞形態学お
よび分泌産物を含み得る。神経細胞に特徴的なものとしては、ＮｅｕＮ、ＮＦ−
Ｍ、ＮＳＥネスチンおよびｔｒｋＡなどの神経マーカーの発現が含まれる。血液
特異的マーカーには、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ３３
、ＣＤ３４、ＴＣＲなどの存在が含まれる。当業者は、熱量分析、蛍光分析、免
疫化学的分析、ポリメラーゼチェーンリアクション、化学的または放射化学的方
法により、細胞系統特異的マーカーの存在または不存在を容易に確認することが
できることを認めるであろう。

【００３９】別の実施形態では、本発明は、非脂肪組織に由来する特徴、たとえば、神経細
胞、星状膠細胞、造血前駆細胞または肝細胞の少なくとも１つの特徴を発現する
ように誘導し得る、脱分化されおよび単離された脂肪組織由来間質細胞を提供す
る。脱分化した脂肪組織由来間質細胞は、脂肪細胞マーカーの存在により識別す
ることができる。他の実施形態では、製薬上許容できる担体と組み合わせて、治
療（組織の修復、再生、再構築または増強が含まれるが、これらに限定されない
）に用い得る脱分化した脂肪細胞を提供するこができる。脂肪組織由来間質細胞
は、本願に開示する方法により培養して、脱分化した間質細胞が次いで脂肪組織
由来細胞以外の細胞の特徴を発現するように誘導することができる。脱分化した
脂肪細胞を非内因性遺伝子配列を含むように修飾して所望のタンパク質またはペ
プチドを生産するように誘導することもできる。また、別の実施形態では、脱分
化した脂肪細胞を、所望の治療効果をあげるために、２次元または３次元の構造
物を用いて宿主に投与することができる。

【００４０】本発明の別の実施形態においては、脂肪組織由来間質細胞を神経細胞、星状膠
細胞、造血前駆細胞、肝細胞または他の細胞系統の特徴を有する細胞に分化させ
る方法であって、単離した脂肪組織由来間質細胞を所望の密度（約１，０００〜
５００，０００細胞／ｃｍ^２の密度が含まれるがこれに限定されない）で接種し
、細胞を少なくとも、成長因子、ホルモン、サイトカインおよび血清因子からな
る群から選択される少なくとも１種類の化合物、並びに場合により胚エキス、好
ましくは非ヒト胚エキスを含む化学的に規定された培地で培養することを含む方
法が提供される。別の実施形態では、血清は含まないが化学的薬剤、たとえば、
２−メルカプトエタノールなどの酸化剤の存在下に分化される。

【００４１】別の実施形態では、非間質細胞系統の少なくとも１つの特徴を発現する単離さ
れた脂肪組織由来間質細胞の誘導方法であって、単離した脂肪組織由来間質細胞
を有用な密度（約１，０００〜５００，０００細胞／ｃｍ^２の密度が含まれるが
これに限定されない）で接種し、細胞を少なくとも、成長因子、ホルモン、サイ
トカインおよび血清因子からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物、
並びに場合により胚エキス、好ましくは非ヒト胚エキスを含む化学的に規定され
た培地で培養することを含む方法が提供される。

【００４２】さらに別の実施形態では、本発明は、本発明に従って生産された脂肪細胞由来
の分化細胞、多能性幹細胞および非間葉性細胞系統に分化した細胞を提供する。
こうした細胞は自家移植および同種移植に有用である。

【００４３】１つの実施形態では、部位は中枢神経組織であり、所望の特徴または表現型は
神経細胞性のものである。第２の好ましい実施形態では、部位は中枢神経組織で
あり、所望の特徴または表現型は星状膠細胞性のものである。別の好ましい実施
形態では、部位は静脈内であり、所望の特徴または表現型は造血性である。さら
に別に実施形態では、部位は肝系であり、特に肝臓であり、所望の特徴または表
現型は肝細胞性のものである。好ましくは対象は哺乳類であり、より好ましい対
象はヒトである。

【００４４】さらに別の実施形態では、本発明は、患者において造血能力を改善する方法で
あって、本発明の細胞を患者に移植することを含む。好ましくは移植は静脈内注
入による。１つの実施形態では、細胞は、少なくとも１つの核酸配列によって一
時的または安定的にトランスフェクトされたものである。少なくとも１つの導入
すべき所望の核酸配列を含むウイルスまたは他のビヒクルによってトランスフェ
クションを媒介することができる。

【００４５】本発明の方法で有用な脂肪組織由来間質細胞は、当業者には知られた様々な方
法で単離することができる。たとえば、こうした方法は米国特許第６，１５３，
４３２号に記載されており、その全体が本願に組み込まれる。好ましい方法では
、脂肪組織は哺乳類の対象、好ましくは人間の患者から単離される。好ましい脂
肪組織源は、大網脂肪細胞である。人間では、脂肪細胞は典型的には脂肪吸引に
より単離される。本発明の細胞が人間の患者に移植されるべきときは、脂肪組織
は同じ患者から単離して自家移植とすることが好ましい。あるいは、投与する組
織は同種異質遺伝子型（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）でもよい。

【００４６】脂肪細胞由来間質細胞を単離する１つの方法においては、脂肪組織を、０．０
１％〜０．５％、好ましくは０．０４％〜０．２％、最も好ましくは約０．１％
のコラーゲナーゼ、０．０１％〜０．５％、好ましくは０．０４％、最も好まし
くは約０．２％のトリプシンおよび／または０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ
のヂスパーゼ、または有効量のヒアルロナーゼもしくはＤＮアーゼおよび約０．
０１〜約２．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜約１．０ｍＭ、最も好ましくは０．
５３ｍＭの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で、２５〜５０℃、好ま
しくは３３〜４０℃、最も好ましくは３７℃で、１０分〜３時間、好ましくは３
０分〜１時間、最も好ましくは４５分間処理する。細胞を、２０ミクロンから８
００ミクロン、より好ましくは４０ミクロンから４００ミクロン、最も好ましく
は７０ミクロンのナイロンまたはチーズクロスメッシュフィルタに通す。次いで
細胞を培地のまま直接、あるいは、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌもしくは
他の顆粒勾配を用い、微分遠心分離にかける。細胞は、１００〜３０００×ｇ、
より好ましくは２００〜１５００×ｇ、最も好ましくは５００×ｇ、１分〜１時
間、より好ましくは２〜１５分間、最も好ましくは５分間、４〜５０℃、好まし
くは２０〜４０℃、より好ましくは約２５℃で遠心分離する。

【００４７】本発明は、神経細胞、星状膠細胞、造血前駆細胞、肝細胞または他の細胞系統
の特徴を有する細胞に分化させるための脂肪組織由来間質細胞の処理を含む。本
発明は、操作に関する何らかの理論に限定されるものではないが、２次元または
３次元の微細環境において血清、胚エキス、好ましくは非ヒト胚エキス、精製さ
れたまたは組替え成長因子、サイトカイン、ホルモン、および／または化学的薬
剤を含む媒体で脂肪前駆細胞を処理することにより分化が誘導されると考えられ
る。

【００４８】本発明の方法において有用な培地の例（但し、これらに限定されない）として
は、最少必須イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地、ＡＤＣ−１、ＬＰＭ（ウシ血清アル
ブミンを含まない）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣ
ＣＭ２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＧＪ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎの修
正のあるものおよびないもの）、バーゼルイーグル培地（ＢａｓａｌＭｅｄｉ
ｕｍＥａｇｌｅ）（ＢＭＥ−（Ｅａｒｌｅ）塩ベースが添加されたもの））、
ダベルコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）修正イーグル培地（ＤＭＥＭ−血清なし）、山根
（Ｙａｍａｎｅ）、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴウ（Ｇｌａｓｇｏｗ）修正イーグ
ル培地（ＧＭＥＭ）、ライボヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ−１５培地、マ
ッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、Ｍ１９９培地（Ｍ１９９Ｅ−Ｅａｒｌｅ塩に基
づくもの）、Ｍ１９９培地（Ｍ１９９Ｈ−Ｈａｎｋ塩に基づくもの）、最少必須
イーグル培地（ＭＥＭ−Ｅ−Ｅａｒｌｅ塩に基づくもの）、最少必須イーグル培
地（ＭＥＭ−Ｈ−Ｈａｎｋ塩に基づくもの）および最少必須イーグル培地（ＭＥ
Ｍ−ＮＡＡ非必須アミノ酸を含むもの）、また、他の多数の培地、たとえば、１
９９培地、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、Ｎ
ＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ’Ｇ、Ｎｅｕｍａｎ＆Ｔｙｔｅｌｌ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＭＣＤＢ３
０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４
１１、ＭＤＢＣ１５３。本発明で用いるのに好ましい培地はＤＭＥＭである。
これらのまた他の有用な培地はギブコ（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ
，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）やバイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＢｅｔＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）などから入
手できる。これらの多数の培地については、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅＬＶＩＩＩ， “ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ”，ｐ
ｐ．６２−７２（ＷｉｌｌｉａｍＢ．ＪａｋｏｂｙおよびＩｒａＨ．Ｐａｓ
ｔａｎ編、出版元ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に詳細にまとめら
れている。

【００４９】さらに本発明の方法で用いられる培地としては、少なくとも１％〜約３０％、
好ましくは少なくとも約５％〜約１５％、最も好ましくは約１０％のウシまたは
他の種の胎児血清を含むがこれに限定されない。ニワトリまたは他の種の胚エキ
スが少なくとも１％〜約３０％、好ましくは少なくとも約５％〜約１５％、最も
好ましくは約１０％の濃度で存在していてもよい。

【００５０】「成長因子、サイトカイン、ホルモン」は、以下の因子を含むがこれらに限定
されない。すなわち、成長ホルモン、エリスロポエチン、スロンボポイエチン、
インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファー
ジコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリン
、リガンド、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成
長因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子、および骨形
態形成タンパク質であり、ピコグラム／ｍｌからミリグラム／ｍｌのレベルの濃
度である。こうした濃度では、本発明で有用な成長因子、サイトカインおよびホ
ルモンは、脂肪細胞由来間質細胞から、コロニー形成因子（ＣＦＵ）分析で、最
大約１００％の血液細胞（リンパ球様細胞、赤血球芽細胞、ミエロイドおよび血
小板細胞系統）を誘導することができる（Ｍｏｏｒｅ他（１９７３）Ｊ．Ｎａｔ
ｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．５０：６０３−６２３；Ｌｅｅ他（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３８７５−３８８３；Ｍｅｄｉｎａ他（２９９３）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１５０７−１５１５）。

【００５１】さらに別の追加成分を培地に添加し得ることも理解される。こうした成分とし
ては、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、および当業者に知られてい
る他の成分が挙げられる。さらに、分化プロセスを促進する成分を添加してもよ
い。

【００５２】「化学的薬剤」は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）または２−メル
カプトエタノールなどの抗酸化剤、ステロイド、レチノイドおよび他の脂肪細胞
由来間質細胞の分化を誘導する化学物質または薬剤を含むがこれらに限定されな
い。

【００５３】得られた分化細胞の「特徴づけ」は、表面、細胞内タンパク質、遺伝子、およ
び／または特定の終端分化状態への間質細胞の系統関与を示す他のマーカーの識
別を指す。これらの方法は、以下の方法を含むがこれらに限定されない。（ａ）
第２蛍光タグ付タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いた細胞表面タンパク
質の免疫蛍光法による検出（フローサイトメトリック法を含む）、（ｂ）第２蛍
光タグ付タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いた細胞内タンパク質の免疫
蛍光法による検出（フローサイトメトリック法を含む）、（ｃ）ポリメラーゼチ
ェーンリアクション、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および／または
ノーザンブロット分析による細胞遺伝子の検出。

【００５４】部分的または最終的に分化した細胞は、表面、細胞内タンパク質、遺伝子、お
よび／または特定の終端分化状態への間質細胞の系統関与を示す他のマーカーの
識別により同定することができる。これらの方法は、以下の方法を含むがこれら
に限定されない。（ａ）アルカリホスファターゼ、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、イン
テグリンベータ１またはオステオポンチンなどの脂肪細胞由来間質細胞表面タン
パク質のフローサイトメトリーなどの免疫蛍光分析またはｉｎｓｉｔｕ免疫染
色による細胞表面タンパク質の検出（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ他（１９９４）Ｂｌｏｏ
ｄ８４：４１６４−４１７３）、（ｂ）ペルオキシソームプロリフェレーター
で活性化された受容体、レイチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体またはＣｂｆ
ａ１などに対する特異的モノクローナル抗体を用いた脂肪組織由来間質細胞タン
パク質のフローサイトメトリーなどの免疫蛍光分析またはｉｎｓｉｔｕ免疫染
色による細胞内タンパク質の検出、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応、ｉｎｓｉｔ
ｕハイブリダイゼーション、および／または他のブロット分析による、細胞系統
選択的ｍＲＮＡ発現、たとえば、オステオカルシン、ＰＰＡＲガンマ、レプチン
、Ｃｂｆａ１、インターロイキン、オステオプロテグリンリガンドおよび／また
はマクロファージコロニー刺激因子、白血球マーカーおよび成長因子の検出（Ｇ
ｉｍｂｌｅ他（１９８９）Ｂｌｏｏｄ７４：３０３−３１１参照）。

【００５５】細胞は広く多様な方法で宿主に投与することができる。好ましい投与形態は、
経口、腹腔内、静脈内、皮内、硬膜外、脊椎内、胸骨内、関節内、滑膜内、鞘内
、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻内、皮下、眼窩内、包内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕ
ｌａｒ）、局所、経皮パッチ、坐薬を含む経直腸、膣または尿道投与、経皮、鼻
スプレー、外科的埋込み、内部外科ペイント（ｉｎｔｅｒｎａｌｓｕｒｇｉｃ
ａｌｐａｉｎｔ）、注入ポンプ、またはカテーテルによるものである。１つの
実施形態では、薬剤および担体は直接組織注射またはボーラス、インプラント、
微粒子、微小球、ナノ粒子またはナノ球体などの徐放性処方で投与される。

【００５６】本発明により分化した細胞の存在は、様々な技術により検出することのできる
対象であり、たとえば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ｉｎｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション、および／または他の組織学的または細胞生物学的手法
が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、Ｋｏｐｅｎ他（１９９９）
ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ９６：１０７１１−１０７１６参照。

【００５７】これらの細胞は、いずれかのクラスの造血細胞の欠損した宿主、疾病状態にあ
り血液、骨髄の除去、幹細胞の分離および幹細胞の再移植（ｒｅｅｎｇｒａｆｔ
ｍｅｎｔ）前の薬剤処理や照射によって治療可能な宿主における造血システムの
再生、様々な血液細胞の生産、幹細胞の自己再生に関係する成長因子の検出およ
び評価、および造血細胞系統の発生および造血細胞の発生に関係する因子の分析
に用いることができる。

【００５８】本発明の造血細胞は、様々な疾患の治療に用いることができる。特に血液、骨
髄、幹細胞などに関係する疾患が対象となる。形質転換された細胞をＨＩＶ感染
の治療および予防に用いることもできる。

【００５９】本発明で開示された細胞の注入により治療され得る疾患には、以下のものが含
まれる（但し、これらに限定されない）。正常な血液細胞の産生および成熟の不
全または異常に起因する疾病（すなわち、再生不良性貧血および高増殖性幹細胞
疾患）；造血器官における新生物性悪性疾病（たとえば、白血病およびリンパ腫
）；非造血起源の広い範囲にわたる悪性充実性腫瘍；自己免疫性疾患症状；およ
び遺伝性疾患。こうした疾患には、以下のものが含まれる（但し、これらに限定
されない）。正常な血液細胞の産生および成熟の不全または異常に起因する疾病
、高増殖性幹細胞疾患、たとえば、薬剤、放射線または感染による、あるいは特
発性の、再生不良性貧血、汎血球減少症、無顆粒球症、血小板減少症、赤血球形
成不全、ブラックファン−ダイヤモンド（Ｂｌａｃｋｆａｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ）
症候群；造血器官の悪性腫瘍、たとえば、急性リンパ芽球（リンパ球）性白血病
、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性脊髄硬
化症、多発性骨髄腫、真性赤血球増加、原因不明の脊髄異形成（ｍｙｅｌｏｍｅ
ｔａｐｌａｓｉａ）、ワルデンストレーム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ）マクログ
ロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫；悪性充実性腫瘍（たと
えば、悪性黒色腫、胃癌、卵巣癌、乳癌、小細胞性肺癌、網膜芽細胞腫、睾丸癌
、膠芽腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、リンパ腫）による患者
の免疫抑制；自己免疫疾患、たとえば、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、慢性肝
炎、多発性硬化症、全身エリテマトーデス；遺伝性（先天的）疾患、たとえば、
貧血、家族性再生不良、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症、
ホルムアミノ転移酵素欠損症、レッシュナイハン症候群、先天性赤血球生成不全
（ｄｙｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ）症候群Ｉ〜ＩＶ、Ｃｈｗａｃｈｍａｎ
ｎ−Ｄｉａｍｏｎｄ症候群、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症、ホルムアミノ転移酵
素欠損症、レッシュナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症
、先天性ストマトサイト増多症、先天性Ｒｈ空疾病、発作的な夜行性血色素尿、
Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−ｐｈｈｏｓｐｈａｔｅ脱水素酵素）変種１、２、３
、ピルビン酸塩キナーゼ欠損症、先天性エリトロポイエチン感受性欠損症、鎌状
赤血球疾病および特性、サラセミアアルファ、ベータ、ガンマ、ｍｅｔ−ヘモグ
ロビン血症、先天性免疫疾患、重度の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、裸リンパ細
胞症候群、イオノフォア反応複合免疫不全、キャッピング異常を伴う複合免疫不
全、ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、顆粒細胞アクチン欠損症、幼児性無顆
粒球症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、コッツマン（Ｋｏｓｔｍ
ａｎｎ）症候群、網膜系発育不全、先天性白血球機能障害症候群；また他の疾患
、たとえば、骨粗鬆症、脊髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全、１次
または２次免疫不全を引き起こす感染性疾患、細菌感染症（たとえば、ブルセラ
症、リステリア症、結核、ハンセン病）、寄生中感染症（例えばマラリア、皮膚
リーシュマニア症）、真菌感染症、リンパ球集団内の割合のアンバランスまたは
老化に起因する免疫機能低下に関わる疾病、食細胞疾患、コッツマン（Ｋｏｓｔ
ｍａｎｎ）無顆粒球症、慢性肉芽腫、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｃｈｉ症候群、
好中球アクチン欠損症、好中球膜ＧＰ−１８０欠損症、代謝蓄積疾病、ムコ多糖
症、ムコリピドーシス、免疫機構に関わる様々な疾患、ウィスコットアルドリッ
チ症候群、アルファ１−アンチリプシン（ａｎｔｉｒｙｐｓｉｎ）欠損症など。

【００６０】疾病または病的状態は、神経組織変成疾病、肝変性性疾病、腎変性性疾病、脊
髄損傷、頭外傷または外科手術、組織、器官あるいは腺退化を引き起こすウィル
ス感染などを含む。そのような神経組織変成の疾病には以下のものが含まれる（
但し、これらに限定されない）。ＡＩＤＳ痴呆合併症；脱髄性疾病、たとえば、
多発性硬化症および急性転移酵素骨髄炎；錐体路外と小脳の障害、たとえば、エ
コルティコスピナル（ｅｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ）システムの傷害；基底核
または小脳の障害；運動過剰の運動障害、たとえば、ハンチントン舞踏病および
老齢の舞踏病；ＣＮＳドーパミン受容体ブロック薬によって引き起こされる運動
障害；パーキンソン病などの運動機能減退性の運動障害；進行性核上麻痺；小脳
の構造の傷害；脊椎小脳変性、たとえば、脊椎機能傷害、フリートライヒ運動失
調、小脳の皮質の退化、多発性全身退化（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ、Ｔ
ｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒおよびマシャド＝ジョーゼフ（Ｍａｃｈａｄ
ｏ−Ｊｏｓｅｐｈ））、ルフサム（Ｒｕｆｓｕｍ）病、無βリポタンパク血症、
機能傷害、毛細管拡張症などのような全身性障害；ミトコンドリア性多発性全身
障害；脱髄核疾患、たとえば、多発性硬化症、急性交差骨髄炎；運動単位疾患、
たとえば、神経性の筋萎縮症（前部角細胞退化、たとえば、筋萎縮性側索硬化症
、幼児性脊椎筋萎縮症および若年性脊椎筋萎縮症）；アルツハイマー病；壮年期
のダウン症候群；ＤｉｆｆｕｓｅＬｅｗｙ身体病；Ｌｅｗｙ身体タイプの老齢
のＤｅｍｅｔｉａ；Ｗｅｒｎｉｃｋｅ−Ｋｏｒｓａｋｏｆｆ症候群；慢性アルコ
ール中毒；クロイツフェルトヤーコプ病；亜急性硬化性汎脳炎ｈａｌｌｅｒｒｏ
ｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ疾病；またボクサー痴呆。たとえば、Ｂｅｒｋｏｗ他編（
１９８７）、メルク・マニュアル（第１５版）（ＭｅｒｃｋａｎｄＣｏ．，
Ｒａｈｗａｙ（Ｎ．Ｊ．）参照。なお、その全体が言及によって本願に組み込ま
れる。

【００６１】他の実施形態では、この脂肪細胞由来細胞は遺伝子操作により、たとえば、外
来性遺伝子を発現するように、または内因性遺伝子を発現抑制するように、修飾
することができる。この態様によれば、細胞を導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝
子転移ベクターに暴露して、核酸が適当な条件下に細胞に導入されて細胞内で導
入遺伝子が発現するようにする。導入遺伝子は、一般的には発現カセットであり
、適当なプロモーターに機能可能に結合させたコード領域のポリヌクレオチドを
含む。このコード領域のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするものでも
よいが、アンチセンスＲＮＡやリボザイムなどの生物学的に活性なＲＮＡをコー
ドするものでもよい。したがって、このコード領域のポリヌクレオチドは、たと
えば、毒に対する抵抗性、ホルモン（たとえば、ペプチド性成長ホルモン、ホル
モン放出因子、性ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、インターフェロン、インタ
ーロイキンおよびリンフォカインなどのサイトカイン）、細胞接着分子やホルモ
ン受容体などの細胞表面に結合した細胞内信号伝達部分、および所与の分化細胞
系統を促進する因子などを担う遺伝子、または他の配列の知られた導入遺伝子を
コードするものでもよい。

【００６２】導入遺伝子を含む発現カセットは、細胞に導入遺伝子を送達するのに適した遺
伝子ベクターに組み入れられる必要がある。最終用途として何を望むかにもよる
が、どのようなベクターも細胞を遺伝的に修飾するのに用いることができる（た
とえば、プラスミド、裸のＤＮＡ、アデノウイルス、アデノ類縁ウィルス、疱疹
ウイルス、レンチウイルス、パピローマウィルスなどのウィルス、レトロウイル
スなど）。このようなベクター内に所望の表現カセットを構築する任意の方法も
使用できるが、その多くは、直接クローニング、相同的組換えなど当業者にはよ
く知られている。どのベクターが望まれるかにより、ベクターを細胞内に導入す
るのに用いる方法（それ自体は、一般に当業者に知られている）が概ね決まる。
適当な手法には、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃、エレ
クトロポレーションおよびウイルスのベクターによる感染が含まれる。

【００６３】本発明で記載する細胞は、組織工学で知られている方法と組み合わせて用いる
ことができる。こうした方法としては、発明の背景欄で引用した特許および刊行
物に記載したもの（米国特許第５，９０２，７４１号および第５，８６３，５３
１号（ＡｄｖａｎｃｅｄＴｉｓｓｕｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む
）のほか、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：米国特許第６，１
３９，５７４号、Ｖａｃａｎｔｉ他（２０００年１０月３１日）Ｖａｓｃｕｌａ
ｒｉｚｅｄＴｉｓｓｕｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＭａｔｒｉｃｅｓＦ
ｏｒｍｅｄＢｙＳｏｌｉｄＦｒｅｅＦｏｒｍＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；米国特許第５，７５９，８３０号、Ｖａｃａｎｔｉ他
（１９９８年６月２日）Ｔｈｒｅｅ−ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＦｉｂｒｏｕｓ
ＳｃａｆｆｏｌｄＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＡｔｔａｃｈｅｄＣｅｌｌｓ
ＦｏｒＰｒｏｄｕｃｉｎｇＶａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄＴｉｓｓｕｅイン
ビボ；米国特許第５，７４１，６８５号、Ｖａｃａｎｔｉ，（１９９８年４月２
１日）ＰａｒｅｎｃｈｙｍａｌＣｅｌｌｓＰａｃｋａｇｅｄＩｎＩｍｍ
ｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅＴｉｓｓｕｅＦｏｒＩｍｐｌａｎｔａｔｉｏ
ｎ；米国特許第５，７３６，３７２号、Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９８年４月７日
）ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｏｌｙｍｅｒｉｃ
ＦｉｂｒｏｕｓＭａｔｒｉｘＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＣｈｏｎｄｒｏｃｙｔ
ｅＦｏｒインビボＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＯｆＡＣａｒｔｉｌａｇｉ
ｎｏｕｓＳｔｒｕｃｔｕｒｅ；米国特許第５，８０４，１７８号、Ｖａｃａｎ
ｔｉ他（１９９８年９月８日）ＩｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎＯｆＣｅｌｌ−Ｍ
ａｔｒｉｘＳｔｒｕｃｔｕｒｅＡｄｊａｃｅｎｔＭｅｓｅｎｔｅｒｙ，Ｏ
ｍｅｎｔｕｍＯｒＰｅｒｉｔｏｎｅｕｍＴｉｓｓｕｅ；米国特許第５，７
７０，４１７号、Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９８年６月２３日）Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉ
ｍｅｎｓｉｏｎａｌＦｉｂｒｏｕｓＳｃａｆｆｏｌｄＣｏｎｔａｉｎｉｎ
ｇＡｔｔａｃｈｅｄＣｅｌｌｓＦｏｒＰｒｏｄｕｃｉｎｇＶａｓｃｕ
ｌａｒｉｚｅｄＴｉｓｓｕｅインビボ；米国特許第５，７７０，１９３号、
Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９８年６月２３日）ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＴ
ｈｒｅｅ−ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＦｉｂｒｏｕｓＳｃａｆｆｏｌｄＦｏ
ｒＡｔｔａｃｈｉｎｇＣｅｌｌｓＴｏＰｒｏｄｕｃｅＶａｓｃｕｌａ
ｒｉｚｅｄＴｉｓｓｕｅインビボ；米国特許第５，７０９，８５４号、Ｇｒ
ｉｆｆｉｔｈ−Ｃｉｍａ他（１９９８年１月２０日）ＴｉｓｓｕｅＦｏｒｍａ
ｔｉｏｎＢｙＩｎｊｅｃｔｉｎｇＡＣｅｌｌ−ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＳ
ｏｌｕｔｉｏｎＴｈａｔＧｅｌｓインビボ；米国特許第５，５１６，５３
２号、Ａｔａｌａ他（１９９８年５月１４日）ＩｎｊｅｃｔａｂｌｅＮｏｎ−
ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃＣａｒｔｉｌａｇｅＡｎｄＢｏｎｅＰｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ；米国特許第５，８５５，６１０号、Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９９
年１月５日）ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＯｆＳｔｒｏｎｇ，Ｐｌｉａｂｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅｓ；米国特許第５，０４１，１３８，Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９１
年８月２０日）ＮｅｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓＯｆＣａｒｔｉｌａｇｅ
インビボＦｒｏｍＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ；米国特許第６，０２７，７
４４号、Ｖａｃａｎｔｉ他（２０００年２月２２日）ＧｕｉｄｅｄＤｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔａｎｄＳｕｐｐｏｒｔＯｆＨｙｄｒｏｇｅｌ−Ｃｅｌｌ
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ；米国特許第６，１２３，７２７号、Ｖａｃａｎｔｉ
他（２０００年９月２６日）ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｅｎｄｏ
ｎｓＡｎｄＬｉｇａｍｅｎｔ；米国特許第５，５３６，６５６号、Ｋｅｍｐ
他（１９９６年７月１６日）ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＯｆＴｉｓｓｕｅＥ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔｓＢｙＣｏｎｔｒａｃｔｉｏｎＯｆＡＣｏｌｌａ
ｇｅｎＧｅｌＬａｙｅｒｅｄＯｎＡＣｏｌｌａｇｅｎＧｅｌ；米国
特許第５，１４４，０１６号、Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ他（１９９２年９月１日
）ＡｌｇｉｎａｔｅＧｅｌｓ；米国特許第５，９４４，７５４，Ｖａｃａｎｔ
ｉ（１９９９年８月３１日）ＴｉｓｓｕｅＲｅ−ＳｕｒｆａｃｉｎｇＷｉｔ
ｈＨｙｄｒｏｇｅｌ−ＣｅｌｌＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ；米国特許第５，
７２３，３３１号、Ｔｕｂｏ他（１９９８年３月３日）ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｄ
ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＦｏｒＴｈｅＲｅｐａｉｒＯｆＡｒｔｉ
ｃｕｌａｒＣａｒｔｉｌａｇｅＤｅｆｅｃｔｓＩｎＭａｍｍａｌｓ；米
国特許第６，１４３，５０１号、Ｓｉｔｔｉｎｇｅｒ他（２０００年１１月７日
）ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＴｉｓｓｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＦｏｒＴｈｅ
ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡｎｄＴｈｅＵｓｅＴｈｅｒｅｏｆ．以下、実施例によって本発明をより完全に説明する。しかし、本発明は多くの
様々な形態で実施し得るものであり、ここに説明する実施形態に限定されると解
してはならない。むしろ、これらの実施形態は本願の開示を徹底的かつ完全にし
、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるためのものである。

【００６４】実施例実施例１−脂肪組織由来間質細胞による造血細胞への関与Ａ．間質細胞は、米国特許出願第０９／２４０，０２９号（出願日：１９９９年
１月２９日。その内容は本願に言及により組み込まれる）に記載された方法に従
って単離し、上記の成長培地に変更を加えたものを用いた。簡単に言えば、Ｒｏ
ｄｂｅｌｌおよびＨａｕｎｅｒ（Ｒｏｄｂｅｌｌ（１９６７）および（１９７４
）；前掲Ｈａｕｎｅｒ）記載の操作による脂肪吸引手術によりヒト前脂肪細胞を
脂肪組織から取り出した。間質血管画分から得た脂肪前駆細胞を１０％ウシ胎児
血清、５％ニワトリ胚エキスおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコース）培
地に再懸濁させ２５，０００細胞／ウエルの割合で９６ウエルプレート（１５０
μｌ／ウエル）の各ウエルに接種した。次いで、細胞を３７％Ｃ５％ＣＯ_２インキュベーターに装入し、一夜置いた。最初の接種後５日間、細胞を初代培養
として培養した。細胞の分化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ消化に
より収穫する。

【００６５】骨髄再配備（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）アッセイに基づいて、ヒト脂肪組織
由来間質細胞の造血細胞への分化を試験する。免疫不全ＳＣＩＤまたはヌード／
ベージュマウスに１１Ｇｙの致死量ガンマ線照射を分割して行ない、酸性水およ
び加熱滅菌餌の食餌で維持する。同じ動物の骨髄から造血細胞を移植あたりおよ
そ１０^７細胞単離する。マウス起源の造血細胞（１０^７個の骨髄由来細胞）また
はヒト起源間質細胞（１０^６個の脂肪細胞由来細胞）を致死量照射の１６時間後
に尾静脈または後眼窩静脈から注入する。あるいは、ヒト間質細胞をマウス造血
細胞と１：１０の割合で混合し、致死量未満の照射を行なった宿主動物に移植し
て競合再配備アッセイを行なう。動物にはメトキシフラン麻酔下に輸注した。移
植後６〜１２週間で、被移植動物から血液を採取し、ヒト造血細胞マーカーに対
する特異的モノクローナル抗体（Ｔｈｙ１（Ｔ細胞マーカー）、Ｂ２２０（Ｂ細
胞マーカー）、Ｍａｃ１（マクロファージマーカー）およびＨＬＡ（Ｈ−２Ｋ，
ヒトマーカー）を含むが、これに限定されない）を用いたフローサイトメトリー
分析にかける。全末梢造血細胞におけるヒト起源対マウス起源のパーセンテージ
を測定する。同様の検討により、被移植マウスの骨髄および脾臓を採取し、イン
ビトロでのクロノジェニックアッセイにかけて特異的造血細胞系統を調べる。こ
れらの検討は、メチルセルロースベースアッセイを利用する。特異的細胞系統方
向付けについて比較可能な免疫蛍光法を用いて細胞を分析する。

【００６６】Ｂ．ヒトの患者個体に由来するヒト脂肪細胞組織を脂肪吸引によって単離し、上
記の方法に従ってインビトロで脂肪細胞由来間質細胞を単離する。細胞は１０％
ウシ胎児血清、５％ニワトリ胚エキスおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコ
ース）培地への最初の接種後５日間３７℃で初代培養として培養する。細胞を分
化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により収穫する。

【００６７】細胞は、造血細胞疾患に罹患している患者に大量化学療法の後などに直ちに用
いるか、あるいは、患者もしくは組織適合性被移植者が医療上緊急に必要とする
場合に備えて将来の使用のために冷凍保存する。間質細胞は、骨髄機能や免疫能
力を著しく低下させる化学療法や放射線照射などの後に、被移植者に自家移植ま
たは同種移植で注入する。間質幹細胞は、移植後、どのような経過を辿るかを医
師が把握できるように蛍光標識でマークする。加速された骨髄回復の証拠は、末
梢血流中において新たに形成された造血細胞（リンパ様細胞、ミエロイド細胞、
赤血球細胞、および血小板）がフローサイトメトリー法で検出されるかに基づい
て監視する。

【００６８】実施例２−脂肪組織由来間質細胞による星状膠細胞への方向付けＡ．上記の方法に従って間質細胞をヒト脂肪細胞から単離する。細胞は培地（１
０％ウシ胎児血清、５％ニワトリ胚エキスおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グ
ルコース）培地を含むが、これに限定されない）への最初の接種後５日間３７℃
で初代培養として培養する。細胞の分化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤ
ＴＡ消化により収穫する。

【００６９】細胞を免疫不全マウスまたはラットの中枢神経系に移植する。ヌード／ベージ
ュもしくはＳＣＩＤマウスまたはヌードラットを３％ハロタンを含む酸素を用い
て密閉チャンバー内で麻酔する。６ｍｇ／ｋｇのキシロジンまたは６０ｍｇ／ｋ
ｇケタミンの筋肉内注射で麻酔を維持する。動物をクリーンフィルールド内のス
テロタクシック（ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ）装置に移す。ブレグマの外側２ｍｍの
ところで頭蓋に２〜５ｍｍの切り込みを入れる。ブレグマの外側３ｍｍの骨に歯
科用ドリルで刻み目穴を開ける。およそ１０μｌの細胞懸濁液（１μｌあたり１
０，０００細胞）を３０分かけて線条内に脳表面から４〜５ｍｍの深さとなるよ
うにゆっくり注入する。傷を縫合し動物の経過を１０週間追う。キシロジンおよ
びケタミンで深麻酔後、氷冷ＰＢＳ、３％の緩衝液を含むパラホルムアルデヒド
、次いで１０％のショ糖を用いて心臓内注射して動物を安楽死させる。免疫組織
化学的およびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりに脳を調べ、ヒト遺
伝子マーカー（Ａｌｕ断片）および細胞系統特異的マーカーの有無を調べる。ヒ
ト細胞の生存、分化および移動の証拠をこの方法により測定する。蛍光染料によ
る細胞標識または細胞の遺伝子操作後のウイルス剤の埋め込みを利用した変更も
考えることができる。

【００７０】Ｂ．ヒトの患者個体に由来するヒト脂肪細胞組織を、上記の方法に従って、単離
し、組織適合性の被移植者に自家移植または同種移植する。細胞は培地（１０％
ウシ胎児血清、５％ニワトリ胚エキスおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコ
ース）培地を含むが、これに限定されない）への最初の接種後５日間３７℃で初
代培養として培養する。細胞の分化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ
消化により収穫する。

【００７１】生命にかかわる病気および／または衰弱性中枢神経疾患または疾病、たとえば
頭蓋静脈におけるアクシデント（発作）の後、パーキンソン病、アルツハイマー
病の患者の中枢神経系に間質細胞を導入する。細胞は神経外科的方法を用いて脳
の罹患領域の線条体に注入する。可能な場合には、放射線ガイドによる最小侵襲
法を用いる。手術後、移植に続く中枢神経系の認識および代謝機能の経過が改善
の裏付けとなる。パーキンソン病の場合はドーパミン代謝酵素など、ＣＮＳ機能
を改善するように設計された酵素をコードする遺伝子で細胞を遺伝子操作し具体
的疾患に適したものを用いる。

【００７２】実施例３−脂肪組織由来間質細胞による神経細胞への関与外傷性の神経損傷における改善された修復性および機能回復人間の患者個体に由来するヒト脂肪細胞組織を、上記の方法に従って、単離し
、組織適合的な被移植者に自家移植または同種移植する。細胞は１０％ウシ胎児
血清、１０％新生子牛血清、ヌクレオシドストック、０．１ｍＭ２−メルカプト
エタノール、１０００単位／ｍｌの白血球阻止因子および抗生物質を含み、１ｍ
Ｍグルタミンを含むがピルビン酸塩は含まないＤＭＥＭ（高グルコース）からな
る培地（これに限定されない）への最初の接種後５日間３７℃で初代培養として
培養する。

【００７３】細胞の分化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により収穫する。
次いで、細胞を０．１％滅菌ゼラチン液で被覆した組織培養用プラスチック基板
上に接種する。分化／埋め込みに先立ち、細胞を迅速成長期において０．２５％
トリプシンおよび１ｍＭＥＤＴＡ消化および磨砕により収穫する。細胞は、単
一細胞および細胞集団を含む懸濁液として収穫する。細胞を直径１００ｍｍのバ
クテリア用（非組織培養用）皿上、１０％ウシ胎児血清、１０％新生子牛血清お
よびヌクレオシドストック（対照培地）を含むＤＭＥＭ（高グルコース、１ｍＭ
グルタミンを含むがピルビン酸塩は含まない）培地１０ｍｌに小分けする。細胞
培養物を２日間維持し、この間、細胞凝集物を形成する。このとき、培地を本の
対照培地で置換する。さらに２日培養した後（継代後４日目）、オールトランス
型レチノイン酸を１０^−９Ｍ〜１０^−６Ｍ、最も好ましくは５×１０^−７Ｍの濃
度で加えた対照培地を細胞に加える。６日目に細胞をオールトランス型レチノイ
ン酸を加えた培地で維持する。継代後８日目において、細胞は、評価、および脊
椎または末梢神経の外傷による損傷モデルの治療に用いるのに適した状態となる
。

【００７４】細胞のインビトロでの評価は、細胞をバクテリア培養皿から標準組織培養皿（
接着用の基質となる）に移すことによって行なわれる。細胞をプラスチックに接
着させ、その形態（神経細胞に分化したプロファイルに一致するか）、神経細胞
に随伴するタンパク質（クラスＩＩＩベータチューブリン、神経細線維のＭサブ
ユニット、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧｌｕＲ１〜４およびＧｌｕＲ６クラス
のグルタミン酸塩受容体サブユニット、グリア線維性酸性タンパク質、ミエリン
塩基性蛋白質および脳因子１（Ｂａｉｎ他（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏ
ｌ．１６８：３４２−３５７）を含むが、これらに限定されない）の発現に基づ
いて評価する。

【００７５】細胞のインビボでの評価は、細胞凝集物を空洞（ｓｙｒｉｎｘ）中に移植する
ことによって行なう。この空洞は、ラットにおいて胸部脊髄障害を実験的に誘導
し、その周囲に形成するものである（ＭｃＤｏｎａｌｄ他（１９９９）Ｎａｔｕ
ｒｅＭｅｄ．５（１２）：１４１０−１４１２）。胸部脊髄障害（第９〜１０
胸椎）は、直径２．５ｍｍの１０ｇロッドを２５ｍｍ落下することによりＬｏｎ
ｇ−Ｅｖａｎｓラットに形成する。傷害後９日目に、脂肪組織由来間質細胞凝集
物（およそ１０^−６細胞）を顕微定位システムを用いて胸部脊髄傷害の空洞内に
注入することにより移植する。擬似手術対照には同量の培地のみ（細胞を含まな
い）を注入する。ラットには移植日からシクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ）を与
えて拒絶反応を防ぐ。移植後６週間にわたって、ラットにおける後肢運動機能を
Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−ＢｒｅｅｓｎａｈａｎＬｏｃｏｍｏｔｏｒＲ
ａｔｉｎｇＳｃａｌｅに基づいて評価し、間質細胞移植体と擬似手術対照とで
回復度を機能的に比較する。研究終了時（６週間目）に、動物を犠牲にし、ヒト
ＡｌｕＤＮＡのｉｎｓｉｔｕ検出に基づいてヒト脂肪細胞間質細胞の証拠があ
るかどうか、組織を組織学的に調べる。細胞分化は、乏突起神経膠細胞特異的マ
ーカー（腺腫様ポリープ症ｃｏｌｉ遺伝子産物ＡＰＣＣＣ−１を含むがこれに
限定されない）、星状細胞特異的マーカー（グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦ
ＡＰ）を含むがこれに限定されない）および神経細胞特異的マーカー（腺腫様ポ
リープ症ｃｏｌｉ遺伝子産物ＡＰＣＣＣ−１を含むがこれに限定されない）特
異的マーカー（ＮｅｕＮ）の抗体検出により測定する。ＡｌｕＤＮＡの分化特異
的マーカーとの同時定位（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が間質細胞分化の証
拠となる。

【００７６】あるいは、単離した脂肪細胞組織由来間質細胞を培地（１０％ウシ胎児血清、
５％ニワトリ胚エキスおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコース）培地を含
むが、これに限定されない）への最初の接種後５日間３７℃で初代培養として培
養する。細胞の分化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により収穫
する。

【００７７】インビトロアッセイに基づきヒト脂肪細胞由来間質細胞について神経細胞とし
ての分化を試験する。ヒト脂肪細胞由来間質細胞を８，０００細胞／ｃｍ^２の密
度で２０％ウシ胎児血清および抗生物質を加えたＤＭＥＭ中２４時間培養する。
次いで、ウシ胎児血清含有量が０％であるＤＭＥＭに２０μＭ〜２００μＭの濃
度で加えたＢＨＡなどの抗酸化剤で細胞を５時間から５日間処理する。細胞を固
定し、神経細胞の分化を（ａ）形態学的基準、（ｂ）免疫組織学的、免疫蛍光的
またはフローサイトメトリーによる基準、（ｃ）免疫ブロットによる基準および
／または（ｄ）ポリメラーゼチェーンリアクションまたは選択したｍＲＮＡのノ
ーザンブロット分析により調べる。細胞は以下の神経マーカーのサブユニット、
ＮｅｕＮ、ＮＦ−Ｍ、ＮＳＥ、ネツチンおよびｔｒｋＡの発現について抗体また
はオリゴヌクレオチド試薬を用いて評価する。分化の形態学的判断基準として、
成長円錐様末端および糸状仮足伸延部に達する膜状、プロセス様細胞伸長を備え
た収縮多極性細胞体の形成、こうした細胞の神経信号伝達と一致する作用電圧を
生成し維持する能力、並びに既知の神経伝達物質（たとえばグルタミン酸塩）の
受容体およびその取込みシステムの発現の能力が挙げられる。

【００７８】実施例４−脂肪組織由来間質細胞による肝細胞への方向付けＡ．ヒト脂肪細胞組織を“ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｆｏｒｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｒｅ
ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｔｏＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ”（出願番号第０９／
２４０，０２９号、出願日１９９９年１月２９日）に記載の方法にしたがい、上
に挙げた修正を用いて単離する。細胞は培地（１０％ウシ胎児血清、５％新生子
牛血清、ヌクレオシドストック、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００
０単位／ｍｌの白血球阻止因子および抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコース、
１ｍＭグルタミンを含むがピルビン酸塩は含まない）培地を含むが、これに限定
されない）への最初の接種後５日間３７℃で初代培養として培養する。細胞の分
化／埋め込みに先立ち、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により収穫する。

【００７９】マウス主要尿タンパク質−ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター
融合遺伝子についての導入遺伝子を担持する免疫不全性ヌードマウスに、脂肪組
織由来間質細胞を移植する（ＷｅｇｌａｒｚＴＣ，ＤｅｇｅｎＪＬ，Ｓａｎ
ｄｇｒｅｎＥＰ２０００Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎｉｎｔｏｄｉｓｅａｓｅｄｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒ：ｋｉｎｅｔ
ｉｃｓｏｆｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ
ｃａｐａｃｉｔｙｏｆｔｅｔｒａｐｌｏｉｄａｎｄｏｃｔａｐｌｏｉｄ
ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＡｍＪ．Ｐａｔｈｏｌ１５７：１９６３−１９
７４）。これらの動物は、肝臓の進行性変性を示す。間質細胞は、動物モデルに
脾臓中、腹腔内および／または静脈内注入により導入する。対照群および実験群
を代表する動物を４カ月間にわたって間を置いて犠牲にする。肝臓再生の証拠を
、肝臓組織の組織学的および分子生物学的分析に基づいて評価する。免疫組織化
学的および分子生物学的（Ａｌｕ染色）法は、再生肝臓におけるヒト細胞の存在
を裏付ける。

【００８０】Ｂ．ヒト脂肪細胞組織を“ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｆｏｒｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｒｅ
ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｔｏＡｄｉｐｏｃｙｔｅｓ”（出願番号第０９／
２４０，０２９号、出願日１９９９年１月２９日）に記載の方法にしたがい、上
に挙げた修正を用いて単離する。組織適合性の被移植者に自家移植または同種移
植する。細胞は培地（１０％ウシ胎児血清、５％新生子牛血清、ヌクレオシドス
トック、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０００単位／ｍｌの白血球阻
止因子および抗生物質を含むＤＭＥＭ（高グルコース、１ｍＭグルタミンを含む
がピルビン酸塩は含まない）培地を含むが、これに限定されない）への最初の接
種後５日間３７℃で初代次培養として培養する。細胞の分化／埋め込みに先立ち
、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により収穫する。単離し、組織適合性の被移植者に
自家移植または同種移植する。

【００８１】間質細胞は、何らかの原因による進行性肝疾患、ウイルス感染の結果、毒物の
消化、または生来的な代謝異常を罹患している患者の脾臓、循環系、および／ま
たは腹膜に導入する。可能な場合には、放射線ガイドによる最小侵襲法を用いる
。手術後、移植に続く中枢神経系の認識及び代謝機能の経過を診て改善を記録す
る。肝機能を改善するように設計された酵素をコードする遺伝子で細胞を遺伝子
操作し具体的疾患に適したものを用いる。

【００８２】本発明の数多くの変更や他の実施形態は、本発明が属する分野における通常の
知識を有する者であれば、上記の記載や添付図面を参考にして想到し得るもので
ある。したがって、本発明は、ここに開示した具体的な実施形態に限定されるも
のではなく、本発明の範囲内において変形や他の実施形態が含まれると理解する
べきである。また、本発明では具体的な用語を用いているが、それらは一般的あ
るいは記述的意味で用いており、限定を目的とするものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 7/00 7/00 25/00 25/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｎ 5/10 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ギンブル，ジエフリーアメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27516、チヤペル・ヒル、グレンモア・ロード・216 Ｆターム(参考） 4B065 AA91X AA93X AB01 BB19 BB23 BC13 BD42 CA44 4C084 AA13 ZA012 ZA512 ZA752 4C087 AA01 AA02 BB44 BB45 BB52 ZA01 ZA51 ZA75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導され
た単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項２】星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導さ
れた単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項３】造血前駆細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導
された単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４】肝細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導された
単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項５】脂肪表現型マーカーが存在しないように脱分化した単離され
た脂肪細胞組織由来間質細胞。
【請求項６】神経細胞、星状膠細胞、または造血前駆細胞、または肝細胞
の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導され、少なくとも１個の非内因性
核酸配列が細胞内に導入された、単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項７】神経細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導され
た単離された脂肪組織由来間質細胞を投与することを含む宿主における神経疾患
の治療方法。
【請求項８】星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導さ
れた単離された脂肪組織由来間質細胞を投与することを含む宿主における神経疾
患の治療方法。
【請求項９】肝細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導された
単離された脂肪組織由来間質細胞を患者の肝システムに投与することを含む患者
における肝機能の改善方法。
【請求項１０】造血前駆細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘
導された単離された脂肪組織由来間質細胞を患者の造血システムに投与すること
を含む患者における造血機能の改善方法。
【請求項１１】前記脂肪組織由来間質細胞を接種すること、および前記細
胞を血清および胚エキスを含む培地中で培養することを含む単離された脂肪組織
由来間質細胞の分化方法。
【請求項１２】前記脂肪組織由来間質細胞を約１，０００〜５００，００
０細胞／ｃｍ^２の密度で接種すること、および前記細胞を、ｉ）血清、ｉｉ）成長因子、ホルモン、サイトカインおよび血清
因子からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物、およびｉｉｉ）場合
により胚エキス、を含む培地中で培養することを含む単離された脂肪組織由来間質細胞の分化方法。
【請求項１３】前記脂肪組織由来間質細胞を接種すること、および前記細胞を、ｉ）血清、ｉｉ）成長因子、ホルモン、サイトカインおよび血清
因子からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物、およびｉｉｉ）胚エ
キス、を含む培地中で培養することを含む単離された脂肪組織由来間質細胞の非間葉性細胞系統への分化方法。
【請求項１４】前記脂肪細胞由来間質細胞がヒト細胞である請求項７、８
または９に記載の方法。
【請求項１５】前記脂肪細胞由来間質細胞が大網脂肪組織から単離される
請求項７、８または９に記載の方法。
【請求項１６】前記血清がウシ胎児血清である請求項７、８または９に記
載の方法。
【請求項１７】前記ウシ胎児血清が培地中に約１〜３０％の濃度で存在す
る請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】前記ウシ胎児血清が培地中に約３〜１０％の濃度で存在す
る請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】前記培地が約１〜３０％のニワトリの胚エキスを含む請求
項７、８または９に記載の方法。
【請求項２０】前記ニワトリの胚エキスの濃度が約５〜１５％である請求
項１５に記載の方法。
【請求項２１】前記成長因子が、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、
ＢＤＮＦ、骨形態形成タンパク質、毛様神経栄養因子、ＰＤＧＦ、ＨＢＧＦ、Ｉ
ＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ
−７、エリスロポエチン、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子およびミドカインか
らなる群より選択される請求項７または８に記載の方法。
【請求項２２】前記ホルモンが、成長ホルモン、インスリンおよびインス
リン様成長因子からなる群より選択される請求項７または８に記載の方法。
【請求項２３】前記非間葉性細胞系統が、造血細胞および神経細胞からな
る群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項２４】前記接種した細胞を哺乳類の対象に導入することをさらに
含む請求項９に記載の方法。
【請求項２５】前記脂肪由来間質細胞が前記対象から単離される請求項２
０に記載の方法。
【請求項２６】請求項７または８に記載の方法によって産生される多能性
幹細胞。
【請求項２７】請求項１９または２０に記載の方法によって産生される造
血細胞。
【請求項２８】請求項１９または２０に記載の方法によって産生される神
経細胞。
【請求項２９】脂肪細胞由来間質細胞から生成される多能性幹細胞。
【請求項３０】非間葉性細胞系統の分化細胞を対象に提供する方法であっ
て、ａ）前記単離された脂肪組織由来間質細胞を１，０００〜５００，０００細胞
／ｃｍ^２の密度で接種し、血清および胚エキスを含む培地中で培養すること、ｂ）所望のタイプの細胞が正常な対象における対応する部位に通常存在するよ
うに、ステップ（ａ）で得られた細胞を前記対象に導入することを含む方法。
【請求項３１】前記部位がＣＮＳ組織であり、前記分化細胞のタイプが神
経細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】前記細胞のタイプが星状膠細胞である請求項２７に記載の
方法。
【請求項３３】前記部位が静脈内であり、前記分化細胞のタイプが造血細
胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】前記対象が哺乳類である請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】前記対象がヒトである請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】請求項１７の細胞を前記患者に投与することを含む患者に
おける造血機能を改善する方法。
【請求項３７】前記移植が静脈内注入である請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】前記細胞が、少なくとも１つの核酸配列によって一時的ま
たは安定にトランスフェクトされたものである請求項２２に記載の細胞。
【請求項３９】前記細胞が、前記細胞に導入すべき少なくとも１つの所望
の核酸配列を含むウイルスまたは他のビヒクルに感染している請求項２２に記載
の細胞。
【請求項４０】非脂肪組織に由来する少なくとも１つの特徴を発現するよ
うに誘導し得る、脱分化されおよび単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４１】神経細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導さ
れた単離された脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４２】星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導
された脂肪組織由来間質細胞を製薬上許容できる担体と組み合わせて含む組成物
。
【請求項４３】造血前駆細胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘
導された脂肪組織由来間質細胞を製薬上許容できる担体と組み合わせて含む組成
物。
【請求項４４】神経細胞、星状膠細胞、または造血前駆細胞、または肝細
胞の少なくとも１つの特徴を発現するように誘導された、少なくとも１個の非内
因性核酸配列が細胞内に導入された脂肪組織由来間質細胞を製薬上許容できる担
体と組み合わせて含む組成物。
【請求項４５】宿主に埋め込むための２次元または３次元の適切な構造物
内の、少なくとも１つの神経細胞の特徴を発現するように誘導された単離された
脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４６】宿主に埋め込むための２次元または３次元の適切な構造物
内の、少なくとも１つの星状膠細胞の特徴を発現するように誘導された単離され
た脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４７】宿主に埋め込むための２次元または３次元の適切な構造物
内の、少なくとも１つの造血細胞の特徴を発現するように誘導された単離された
脂肪組織由来間質細胞。
【請求項４８】宿主に埋め込むための２次元または３次元の適切な構造物
内の、少なくとも１つの肝細胞の特徴を発現するように誘導された単離された脂
肪組織由来間質細胞。