JP2003517830A

JP2003517830A - カロリー制限の効果を模倣するための介入

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Publication number: JP2003517830A
Application number: JP2001546691A
Authority: JP
Inventors: スティーブンアール．スピンドラー，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2003-06-03
Also published as: US20030124540A1; AU2461201A; EP1239885A4; DE60039190D1; EP1239885B1; US20030224360A9; CA2395466A1; WO2001045752A1; EP1239885A1; USRE39436E1

Abstract

(57)【要約】長期カロリー制限は、寿命を延ばす利点を有する。カロリー制限の効果を模倣する介入（処置）（インターベンション）をスクリーニングするための方法が開示されている。コントロール動物とカロリー制限動物との間で発現が実質的に異なる遺伝子の広範な分析は、カロリー制限の間、特定の遺伝子が優先的に発現されることを実証した。同じ発現プロフィールを生じる介入のためのスクリーニングは、寿命を延長する介入を提供する。さらなる局面において、比較的短時間カロリー制限食餌をした試験動物は、長期間カロリー制限食餌をした試験動物と類似の遺伝子発現プロフィールを有することが発見された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）長年、研究者らは、加齢プロセスを遅くし得るかまたは逆転し得る介入（イン
ターベンション）（処置）（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の同定を促進するため
に、加齢のバイオマーカーを同定することを試みてきた。食餌カロリー制限（Ｃ
Ｒ）は、恒温脊椎動物において生活期間を伸長するための十分に記載された唯一
の方法であり、そして癌の発生率を減少するために公知である、最も効果的な手
段である。ＣＲの生理学的結果の多くが６５年前に記載されたが、その作用様式
に関してのコンセンサスは存在しない。結果として、そのようなカロリー制限の
効果を模倣し得る介入を同定する実用的方法は存在しなかった。むしろ、研究者
らは、特定の介入が、生活期間および／または癌の発生率に影響したか否かを決
定するために、試験動物の寿命を待たねばならなかった。

【０００２】（関連技術の記載）哺乳動物は、共通の遺伝子セットを共有するようであるが、それらは広く異な
る生活期間を有する。その生活期間の差異が、特定の遺伝子の配列の差異または
その発現の差異に起因するか否かを知ることは、現在不可能である。しかし、栄
養失調が避けられた場合は、食事カロリー制限（ＣＲ）における長期の減少が、
ほとんどの加齢性生理学的変化を遅らせ、そして試験したすべての種における生
活期間を伸長することが、数十個もの実験室における多年の研究から明らかであ
る（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈら、ＴｈｅＲｅｔａｒｄａｔｉｏｎｏｆＡｇｉｎ
ｇａｎｄＤｉｓｅａｓｅｂｙＤｉｅｔａｒｙＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
（ＣｈａｒｌｅｓＣ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＩ、１９８
８））。これらの研究はまた、ＣＲが、癌発生率を減少するため、そして加齢性
疾患および腫瘍の発症を平均年齢を増加するために、恒温脊椎動物において現在
公知である最も有効な手段であることを示した（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈら（１９８
２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１５：１４１５）。従って、生活期間は、比較的簡単な
食事レジメンを介して伸長され得ることが、明らかであるようである。しかし、
代謝および遺伝子発現に対する短期のカロリー制限の効果に関する研究は存在し
ない。

【０００３】筋肉における遺伝子発現プロフィールの１つの報告が刊行された（Ｌｅｅら（
１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：１３９０）。これらの研究において、筋肉
の遺伝子発現における多くの加齢性変化が、ＣＲにより予防または逆転されるよ
うであった。６５００個の遺伝子の発現プロフィールが、年長の長期ＣＲマウス
およびコントロールマウス、ならびに年少のコントロールマウス間で比較された
。筋肉の遺伝子発現におけるいくつかの加齢性変化が、ＣＲにより全体的にかま
たは部分的に予防されるようであった。

【０００４】（発明の要旨）本発明は、カロリー制限の効果を模倣する短期枠における介入を同定するため
の方法を意図する。このような介入は、増加した生活期間、減少した癌発生率を
もたらし、そして／または加齢性疾患および腫瘍の発症年齢を増加する。

【０００５】好ましい実施形態において、細胞において、カロリー制限の効果を模倣する介
入を同定するための方法が開示され、この方法は、以下の工程：生物学的サンプルを得る工程；その生物学的サンプルを介入に曝す工程；特定の時間待機する工程；加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレ
ベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの変化を評価する工程；お
よびそのレベルにおける１つ以上の変化がまたカロリー制限において生じる場合、
カロリー制限のその効果を模倣する介入としてその介入を同定する工程を包含す
る。

【０００６】その生物学的サンプルは、インビトロであってもインビボであってもよい。好
ましい実施形態において、その生物学的サンプルが細胞を含む。より好ましい実
施形態において、その細胞が哺乳動物から得られる。なおより好ましい実施形態
において、その哺乳動物がマウスである。

【０００７】１つの実施形態において、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レ
ベルまたはタンパク質活性レベルの変化が、シャペロンタンパク質をコードする
遺伝子の遺伝子発現における変化に相当する。好ましい実施形態において、その
シャペロンタンパク質がＧＲＰ７８である。

【０００８】１つの実施形態において、加齢のバイオマーカーがアポトーシスである。別の
実施形態において、そのバイオマーカーが加齢である。別の好ましい実施形態に
おいて、加齢のバイオマーカーが、癌細胞の生成である。別の好ましい実施形態
において、加齢のバイオマーカーは、ストレスタンパク質およびシャペロンの生
成である。別の好ましい実施形態において、加齢のバイオマーカーが、炎症応答
についての遺伝子を誘導する。別の好ましい実施形態において、加齢のバイオマ
ーカーは、膜貫通チャネル／輸送タンパク質を誘導する。別の好ましい実施形態
において、加齢のバイオマーカーは、転写因子についての遺伝子を誘導する。別
の好ましい実施形態において、加齢のバイオマーカーは、アミラーゼ２である。

【０００９】好ましい実施形態において、加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、遺
伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベ
ルの変化が、６週間以内に生じる。より好ましい実施形態において、加齢の１つ
以上のバイオマーカーに関連する、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパ
ク質レベルまたはタンパク質活性レベルの変化が、４週間以内に生じる。なおよ
り好ましい実施形態において、加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、遺
伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベ
ルの変化が、２週間以内に生じる。最も好ましい実施形態において、加齢の１つ
以上のバイオマーカーに関連する、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパ
ク質レベルまたはタンパク質活性レベルの変化が、約２週間以内に生じる。

【００１０】１つの実施形態において、遺伝子発現の変化が遺伝子チップを用いて評価され
る。好ましい実施形態において、その遺伝子チップがストレスタンパク質の遺伝
子およびシャペンについての遺伝子を含む。別の好ましい実施形態において、そ
の遺伝子チップが炎症性応答についての遺伝子を含む。別の好ましい実施形態に
おいて、その遺伝子チップが、アポトーシスに関連する遺伝子を含む。別の好ま
しい実施形態において、その遺伝子チップが、膜貫通チャネル／輸送タンパク質
についての遺伝子を含む。別の好ましい実施形態において、その遺伝子チップが
、転写因子についての遺伝子を含む。別の好ましい実施形態において、その遺伝
子チップが、アミラーゼ２についての遺伝子を含む。

【００１１】別の実施形態において、その生物学的サンプルが試験動物である。好ましい実
施形態において、開示された方法は、参照動物における上記レベルの変化を決定
する工程をさらに含み、ここでこの動物は、長期のＣＲに供された年少または年
長の試験動物である。別の好ましい実施形態において、この試験動物は、長期カ
ロリー制限された動物の特徴を同定することを有する試験動物であり、ここでこ
の参照動物は、約６週間未満のカロリー制限食餌を得ていたより年長の試験動物
であり、そしてその変化は、カロリー制限の効果を模倣する介入としてその介入
を同定する工程において用いられる。より好ましい実施形態において、この参照
動物は、約４週間未満の間カロリー制限食餌を得ていた。なおより好ましい実施
形態において、この参照動物は、約２週間未満の間カロリー制限食餌を得ていた
。

【００１２】好ましい実施形態において、その試験動物はマウスである。好ましい実施形態
において、遺伝子発現における変化が、その試験動物において評価される。

【００１３】なおより好ましい実施形態において、開示された方法は、以下をさらに包含す
る：カロリー制限参照動物から遺伝子発現プロフィールを得る工程；上記試験動物についての遺伝子発現の変化を、このカロリー制限参照動物の遺
伝子発現プロフィールに対して比較する工程；およびこの試験動物の遺伝子発現プロフィールがこのカロリー制限動物の遺伝子発現
プロフィールと統計学的に類似している場合、カロリー制限の効果を模倣する介
入として上記介入を同定する工程。

【００１４】より好ましい実施形態において、試験動物の遺伝子発現プロフィールが、一元
（ｏｎｅ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡとその後のフィッシャー検定（ｐ＜０．０５）に
よって、上記カロリー制限動物の遺伝子発現に統計学的に類似していると決定さ
れる。

【００１５】本発明の別の局面において、試験動物においてカロリー制限の効果を模倣する
介入を同定するためのシステムが開示され、このシステムは、試験動物と、カロ
リー制限の間に変化した発現を有することが既知の遺伝子を含む遺伝子チップと
を備える。好ましい実施形態において、その遺伝子チップが、ストレスタンパク
質／シャペロンの遺伝子、アポトーシスの遺伝子、炎症性応答の遺伝子、膜貫通
チャネルタンパク質／輸送タンパク質の遺伝子、転写因子の遺伝子およびアミラ
ーゼ２の遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む。

【００１６】本発明を要約する目的および先行技術を超えて達成される利点を要約するため
に、本発明の特定の目的および利点を、上記に記載してきた。当然、必ずしもす
べてではないこのような目的または利点が、本発明の任意の特定の実施形態に従
って達成され得ることが、理解されるべきである。従って、例えば、本明細書中
に教示されるような１つの利点または利点群を達成もしくは最適化する様式で、
本明細書中に教示または示唆され得るような他の目的または利点を必ずしも達成
することなく本発明が具体化または実行され得ることを、当業者は理解する。

【００１７】本発明のさらなる局面、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な
説明から明らかになる。

【００１８】（好ましい実施形態の詳細な説明）記載された実施形態は、本発明の好ましい実施形態を表すが、本発明の意図か
ら逸脱することなく、改変物が、当業者に思い浮かぶことが理解されるべきであ
る。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ決定される。

【００１９】長期間のカロリー制限（ＣａｌｏｒｉｅＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）の効果と
しては、血中からの血清タンパク質（グルコース損傷を受けた血清タンパク質を
含む）のクリアランス速度の増加、および遺伝子発現の変化が挙げられる。例え
ば、長期間のカロリー制限は、ストレスタンパク質／シャペロン、アポトーシス
に関与する遺伝子、炎症性応答、膜貫通チャネルおよび輸送体タンパク質、転写
因子などの発現に影響を及ぼす。

【００２０】分子シャペロンは、タンパク質の生合成、折り畳み、プロセシング、および破
壊を補助する。多くのシャペロン遺伝子は、ストレス誘導性である。シャペロン
のサブセットは、異なる生理的ストレッサーによって誘導される。例えば、公知
の内質シャペロンの大部分は、ＥＲ中において不良に折り畳まれた（ｍａｌｆｏ
ｌｄｅｄ）タンパク質または不適切にグリコシル化されたタンパク質を生成する
ストレスによって誘導される。この折り畳まれていないタンパク質応答経路はま
た、ＥＲシャペロンのレベルへとＥＲを通してタンパク質輸送のレベルを調整し
得る。他のシャペロン（例えば、豊富な細胞質シャペロンＨＳＣ７０）は、通常
、構成的に発現されると考えられる。本発明は、一部分において、特定のシャペ
ロン遺伝子が、カロリー制限（このような調節は、インスリンおよびグルカゴン
経路を通して媒介されると考えられる）によってダウンレギュレートされるとい
う知見に基づく。Ｅｒｐ７２，Ｅｒｐ５７，ＧＲＰ１７０，ＧＲＰ７８，ＧＲＰ
９４，ＨＳＣ７０，カルネキシン，およびカルレティキュリンの発現は、特に、
カロリー制限によって影響を受ける。

【００２１】研究されたほぼすべてのＥＲシャペロンの絶食中のｍＲＮＡおよびタンパク質
のレベルが、低カロリーの食餌を慢性的に与えたＣＲマウスの肝臓において、有
意にかつ一貫して低減されることが見出された。ＧＲＰ７８の場合、レベルは、
約６６％減少した。さらに、シャペロンｍＲＮＡレベルの減少は、カロリー消費
の減少に比例した。より低いカロリーが消費されると、シャペロンｍＲＮＡのレ
ベルは、より低くなる。本発明者らは、引き続いて、絶食中のシャペロンｍＲＮ
Ａレベルが、異なるレベルの慢性的カロリー消費に応答して２週間の経過にわた
り変化されることを見出した。１週間あたり、より高いカロリーが消費されると
、シャペロンレベルはより高くなる。シャペロンｍＲＮＡレベルは、カロリー消
費に対してより迅速に応答する。

【００２２】大半のＥＲシャペロンおよび主要な細胞質シャペロンであるＨＳＣ７０につい
てのｍＲＮＡは、毎回の食事に対して、そして消費されたカロリーの数値に対し
て、劇的に応答性である（１．５時間以内）。この誘導の特徴は、それと折り畳
まれていないタンパク質の応答とを識別する。摂食誘導は、腎臓組織および筋肉
組織、ならびに肝臓において観察された。インスリンと組み合わせて、グルカゴ
ンにおける摂食後の変化は、この誘導の重要なメディエイタであることが見出さ
れた。

【００２３】シャペロンｍＲＮＡアバンダンスは、カロリー摂取に対して１．５時間以内に
応答する。インスリンおよびグルカゴンは、この応答に重要であり得る。この摂
食応答は、迅速である。摂食から１．５時間後までに、ＥＲシャペロンｍＲＮＡ
は、その最大の誘導レベルになるか、またはほぼ最大の誘導レベルになる。この
摂食に関連した誘導は、マウスの１つの株にも、１つの種にも限定されない。さ
らに、この応答は、肝臓以外の組織において見出される。従って、これは、イン
ビボにおける種々の細胞型の生理に対して、概して重要な応答である。

【００２４】多くのシャペロンが比較的安定なタンパク質であるので、そのタンパク質レベ
ルは、そのｍＲＮＡよりも、カロリー摂取に対する応答において、より緩徐に変
化する。例えば、ＧＲＰ７８タンパク質は、培養細胞において、２４時間を超え
る半減期を有する。本発明者らは、ＧＲＰ７８タンパク質が、日々のカロリー消
費の平均における変化に応答して数日間のスパンにわたってのみ変化することを
見出した。このように、多くのシャペロンは、摂食に対する急速なｍＲＮＡ応答
を、シャペロンタンパク質レベルにおける長期間の変化へと効率的に統合し得る
。カロリー消費の平均における長期間の差異は、ＥＲおよびいくつかの細胞質シ
ャペロンの両方の肝レベルにおける差異へと導く。

【００２５】ＲＮａｓｅプロテクションアッセイによって、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡは、摂食
に応答して転写的に調節されることが示された。類似のＲＮａｓｅプロテクショ
ンの結果が、慢性的ＣＲマウス由来の肝ＲＮＡを用いて得られた。従って、摂食
およびＣＲの両方が、シャペロン遺伝子の発現を転写的に変更する。

【００２６】プロマイシンは、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの部分的誘導を導いた。シクロヘキシ
ミドによるｍＲＮＡの誘導が、ポリソーム凝集による転写物の安定化に起因する
可能性は低い。シクロヘキシミドは、このようにしていくつかのｍＲＮＡを不活
化および分解から防御するが、プロマイシンは防御しない。むしろ、プロマイシ
ンは、ポリソームの解離によって翻訳を阻害する。従って、低い肝ＧＲＰ７８
ｍＲＮＡレベルの維持は、絶食したマウスにおいてＧＲＰ７８遺伝子発現の不安
定なレプレッサの作用を必要とする可能性が最も高い。翻訳に関するインヒビタ
ーの存在下において、このレプレッサは崩壊して、この遺伝子を抑制から解放し
得る。

【００２７】第２に、摂食と翻訳阻害とが組み合わされた場合に、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの
誘導の増強は存在しなかった。このｍＲＮＡの部分的な誘導が、プロマイシン処
理マウスにおいて見出され、一方、摂食は、インヒビターの非存在下において見
出されたのと同じレベルまで、ｍＲＮＡを誘導した。さらに、シクロヘキシミド
は、同じ程度までｍＲＮＡを誘導した。いかなる特定の機構にも縛られることは
ないが、インヒビターおよび摂食は、共通の経路を通してこの遺伝子を誘導し得
ることが示唆される。

【００２８】第３に、摂食は、プロマイシン処理マウスにおいて完全にＧＲＰ７８ｍＲＮ
Ａを誘導したので、デノボでのタンパク質合成は、摂食応答に必要とされない。
既存のシグナル伝達および調節因子が、この応答を媒介する。第４に、この摂食
応答は、ＥＲを通したタンパク質輸送における食後の増加からは生じ得ない。増
強されたＥＲのデノボでのタンパク質輸送は、シャペロンｍＲＮＡを誘導し得る
。しかし、このような増加は、プロマイシンの存在下では生じなかった。

【００２９】第５に、折り畳まれていないタンパク質および成長因子の応答は、摂食による
シャペロンの誘導には関与しない。シクロヘキシミドは、折り畳まれていないタ
ンパク質および成長因子の応答をブロックする。本発明者らは、シクロヘキシミ
ドの存在下においてＥＲシャペロンｍＲＮＡを誘導し得る摂食以外の唯一の操作
に気付いた。ＧＲＰｍＲＮＡは、培養物中において細胞の低酸素によって誘導
され、そしてこの誘導は、シクロヘキシミド処理とは独立している。摂食と低酸
素の応答とが共通の分子経路を共有するか否かは、現在知られていない。

【００３０】摂食は、グルカゴンを減少させ、かつインスリンレベルを増加させることが周
知である。グルカゴンおよびジブチリル−ｃＡＭＰの両方が、ＧＲＰ７８ｍＲ
ＮＡの摂食誘導を鈍らせた。従って、グルカゴンは、インビボでのＧＲＰ７８発
現の負の調節因子である。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの摂食誘導は、ＳＴＺ糖尿病性
マウスにおいて有意に減少した。いかなる特定の機構にも縛られることはないが
、この結果およびジブチリル−ｃＡＭＰ処理されたＳＴＺ糖尿病性マウスにおけ
る摂食応答の不在は、両方のホルモンの作用がこの応答に必要とされることを示
す。

【００３１】摂食に応答することが公知である他のエフェクターもまた試験した。管腔刺激
物は、胃腸ホルモンの放出を促進し得る。この理由のため、本発明者らは、鉱油
およびセルロースの消化不能な混合物で管腔を満たすことによって、シャペロン
発現を刺激し得るか否かを決定した。小さいが有意な応答が見出された。しかし
、インスリンおよびグルカゴンは、シャペロンｍＲＮＡに対して、はるかに強い
効果を有しており、このことはそれらが、摂食応答を主に担うシグナルであるこ
とを示している。

【００３２】摂食応答は、副腎摘出されたマウスにおいて増強された。これらの結果によっ
て、他の異常なホルモン（おそらく、カテコールアミン）は、摂食に対するシャ
ペロンｍＲＮＡ応答を部分的に鈍らせ得ることが示唆される。しかし、これらの
ホルモンが摂食応答を刺激する機構は、現在知られていない。

【００３３】全体的に、摂食は、試験された主要な細胞質シャペロンであるＨＳＣ７０およ
び大半のＥＲシャペロンについてのｍＲＮＡを、迅速かつ強力に誘導した。摂食
はまた、少なくとも３つの異なる組織においてＥＲシャペロンｍＲＮＡを誘導し
た。摂食およびＣＲは、転写レベルでシャペロンｍＲＮＡのアバンダンスを調節
した。いかなる特定の機構にも縛られることはないが、摂食は、不安定なインヒ
ビターの作用からシャペロン遺伝子発現を解放するようである。インスリンが必
要とされ、そしてグルカゴンおよびｃＡＭＰが摂食応答を媒介した。グルカゴン
レベルにおける食後の変化は、この応答の主要なメディエイタであり得る。糖質
コルチコイドではなく、消化管ホルモンおよび副腎ホルモンもまた、摂食応答に
おいて役割を有する。

【００３４】驚くべきことに、遺伝子発現における変化はまた、短期間のカロリー制限でも
観察された。遺伝子発現におけるこれらの変化は、長期間ＣＲにおいて観察され
る変化と類似している。短期間のカロリー制限は、成熟試験動物を、約２〜６週
間、コントロール食餌の約５０％未満の食餌に切り換えた場合に生じる。好まし
い実施形態では、試験動物は成熟マウスであり、そしてこの成熟マウスは、約３
１ヶ月でカロリー制限した食餌へと切り換えられる。好ましくは、コントロール
食餌の約２０〜４０％未満である中間食餌を、さらなる２週間のＣＲ食餌へと切
り換える前に、約２週間使用する。

【００３５】長期間および短期間のＣＲは両方とも、遺伝子発現に影響を及ぼすことによっ
て、哺乳動物生理に対してその著しい効果を生じさせる。遺伝子発現の全体的パ
ターンに対するカロリー制限の効果を可能な限り広範に同定するために、遺伝子
チップ技術を利用して、肝臓における約１１，０００個のマウス遺伝子の発現に
対する長期間ＣＲおよび短期間ＣＲの効果を特徴付けた。

【００３６】肝臓は、研究のために魅力的な器官である。なぜなら、肝臓は多数の細胞型を
含み、特に、代謝および血糖、腸内神経系のニューロン、血中の免疫系細胞、な
らびに血管の平滑筋細胞の調節を主に担う肝細胞に対するＣＲの効果を評価する
ことを可能にするからである。

【００３７】本発明の方法は、カロリー制限の効果を模擬する介入の同定を含む。本発明に
よって特に意図されるのは、寿命、加齢、および／または加齢に関連した疾患お
よび癌の発症に対して効果を有する介入を同定する方法である。

【００３８】特定の実施形態では、このような方法は、以下の工程を包含する：細胞を得る
工程、その細胞を介入に曝露する工程、およびこの介入が、加齢の１以上の生物
マーカーに関連した遺伝子発現プロフィール、ＲＮＡのレベル、タンパク質、ま
たはタンパク質活性に影響を及ぼすか否かを観察する工程。好ましくは、遺伝子
発現、ＲＮＡ、タンパク質、またはタンパク質活性レベルにおけるこのような変
化は、介入の４週間以内に生じる。より好ましくは、このような変化は、介入の
２週間以内に生じ、そして最も好ましくは、このような変化は、介入の２日間以
内に生じる。このような方法は、長期間ＣＲおよび短期間ＣＲで観察されるプロ
フィールと類似の代謝状態を達成する薬理学的手段または他の手段の同定を可能
にする。

【００３９】本発明の方法は、インビトロアッセイ（遺伝子チップアッセイを含む）ならび
に動物アッセイの使用を包含する。しかし、好ましくは、この方法は生存動物に
おいて実施される。例えば、増強されたシャペロン発現を有するトランスジェニ
ックマウスを使用して、介入が、癌、アポトーシス、および／または寿命を減少
させる能力を測定し得る。あるいは、本発明の方法を使用して、介入が生存動物
中の特定の遺伝子または遺伝子セットについての遺伝子発現を変化させる能力を
単純に測定することによって、カロリー制限を模擬する介入を同定し得る。この
ような方法は、短期間で有効な介入の同定を可能にする。本発明の方法によって
同定された介入は、薬理学的、外科的、または他のものであり得る。コンビナト
リアル化学もまた使用して、多数の薬理学的化合物をスクリーニングし得る。一
般的に、本発明の方法によって同定された介入は、癌、糖尿病、加齢に関連した
疾患、および／または寿命の延長の処置に有効である。

【００４０】記載された実施形態は、本発明の好ましい実施形態を表すが、本発明の意図か
ら逸脱することなく、改変物が、当業者に思い浮かぶことが理解されるべきであ
る。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ決定される。

【００４１】（実施例）（実施例１）（シャペロン研究のための長期間カロリー制限（ＬＴＣＲ）動物および処理）長命Ｆ_１ハイブリッド株であるＣ３Ｂ１０ＲＦ_１の雌性２８ヶ月齢マウスは、
以前に記載されている。マウスを２８ｄで離乳させ、個々に収容し、そして２つ
の食餌のうちの一方に供した。コントロール食餌は、カゼイン（高タンパク質）
，２０７．０ｇ／ｋｇ，ＤＬ−メチオニン，４．０ｇ／ｋｇ，デキストロース一
水和物，３０１．８ｇ／ｋｇ，コーンスターチ，２９０．０ｇ／ｋｇ，セルロー
ス，７０２．ｇ／ｋｇ，ビール酵母，８．０ｇ／ｋｇ，ＨａｒｌａｎＴｅｋｌ
ａｄＶｉｔａｍｉｎＭｉｘ＃４００６０，１０．０ｇ／ｋｇ，Ｈａｒｌａ
ｎＴｅｋｌａｄＡＩＮ−７６ＭｉｎｅｒａｌＭｉｘ＃１７０９１５，
３５．０ｇ／ｋｇ，炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３），３．０ｇ／ｋｇ，酸化マグ
ネシウム（ＭｇＯ），１．０ｇ／ｋｇ，フッ化ナトリウム（ＮａＦ），２．３ｍ
ｇ／ｋｇ，モリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ−２Ｈ_２Ｏ），０．５ｍｇ
／ｋｇから構成された。５０％制限食餌は、カゼイン（高タンパク質），３６２
．０ｇ／ｋｇ，ＤＬ−メチオニン，７．０ｇ／ｋｇ，デキストロース一水和物，
１７２．０３ｇ／ｋｇ，コーンスターチ，１５３．１ｇ／ｋｇ，セルロース，８
３．６ｇ／ｋｇ，ビール酵母，１４．０ｇ／ｋｇ，ＨａｒｌａｎＴｅｋｌａｄ
ＶｉｔａｍｉｎＭｉｘ＃４００６０，１７．５ｇ／ｋｇ，ｈａｒｌａｎ
ＴｅｋｌａｄＡＩＮ−７６ＭｉｎｅｒａｌＭｉｘ＃１７０９１５，６１
．２５ｇ／ｋｇ，炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３），５．２５ｇ／ｋｇ，酸化マグ
ネシウム（ＭｇＯ），１．７５ｇ／ｋｇ，フッ化ナトリウム（ＮａＦ），３．０
ｍｇ／ｋｇ，モリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ−２Ｈ_２Ｏ），０．９
ｍｇ／ｋｇから構成された。離乳から、コントロールマウスは、月曜日〜木曜日
に４．８ｇのコントロール食餌を摂食した。金曜日に、コントロールマウスは、
１３．８ｇのコントロール食餌を摂食した。この摂食レジメンは、４５０ｋＪ／
１週間を与えた。離乳から、５０％カロリー制限（ＣＲ）マウスは、月曜日〜水
曜日に４．６ｇ、金曜日に６．９ｇの制限食餌を摂食した。このレジメンは、２
２５ｋＪ／１週間を与えた。各食餌群は、体重１グラムあたりほぼ等量のタンパ
ク質、コーン油、無機塩類、およびビタミンを受けた。消費された炭水化物の量
は、群間で変動した。これらの研究の３０ｄ前に開始して、コントロールマウス
は、０９００ｈに毎日４．１ｇ（５４．４４ｋＪ）のコントロール食餌を摂食し
た。５０％制限マウスは、０９００ｈに毎日２．３ｇの制限食餌（３２ｋＪ）を
摂食した。この３０ｄの期間、コントロールマウスおよび制限マウスは、代表的
なマウスに必要とされると通常考えられるエネルギーの約１５％および５０％未
満の食餌エネルギーを受けた（ＳｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ＆ＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＡ
ｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ１９７８ＩＤ：５４８０）。すべての食物
が、３０分以内に規定通り消費された。

【００４２】退役した雄性Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ飼育マウスを、ＪａｃｋｓｏｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。研究の３０日前に開始して、マウスに、
月曜日および水曜日に１１ｇ、そして金曜日に１６．６ｇのコントロール食餌を
毎日０９００ｈに摂食させた。絶食−摂食研究では、マウスは、４８時間食物を
枯渇され、０９００ｈに５．５ｇのコントロール食餌を摂食し、そして９０分後
に屠殺された。食物は、３０分間以内に消費された。５０ｍＭのクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ４．５）中のストレプトゾトシン［１０ｍｇ／ｇ体重（ｂ．ｗ．）］
の１週間毎の３回の腹腔内注射によって、糖尿病を誘導した。マウスは、最後の
注射の１週間後に糖尿病であった。３ｍｇ／ｍｌよりも高い血中グルコースレベ
ルを有するマウスのみを使用した。等量のクエン酸ナトリウムを注射されたマウ
スを、ＳＴＺ糖尿病マウスについてのコントロールとして供した。副腎摘出され
たマウスおよび偽性操作された（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）マウスを、Ｊａ
ｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ジブチリルｃＡＭＰ（Ｓ
ｉｇｍａ；１８ｍｇ．１００ｇｂ．ｗ．）およびテオフィリン（Ｓｉｇｍａ；
３ｍｇ／１００ｇｂ．ｗ）、グルカゴン（Ｓｉｇｍａ；３００μｇ／１００ｇ
ｂ．ｗ．）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ；１２５μｇ／１００ｇｂ．ｗ）
、シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ；４ｍｇ．１００ｇｂ．ｗ．）、ならびにプ
ロマイシン（Ｓｉｇｍａ；１０ｍｇ．１００ｇｂ．ｗ．）を、図の説明文に特
定したように、マウスに腹腔内投与した。マウスは、２用量の各薬物または薬物
の組み合わせを受けた。第１の注射は、摂食の３０分前に投与され、そして第２
の注射は、摂食の３０分後に投与された。マウスを、摂食開始の１．５時間後に
屠殺した。薬物注射マウスは、摂食期間にコントロール動物と同様の量の食物を
消費した。すべての動物使用プロトコールは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣ
ａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅの施設動物使用に関する委員会（ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌａｎｉｍａｌｕｓｅｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によっ
て承認された。

【００４３】（実施例２）（シャペロン研究のためのＲＮＡ単離および定量）マウスを屠殺し、そして肝臓、腎臓、および筋肉を取り出した。後肢および背
面からの筋肉を取り出し、そして各動物についてプールした。組織を、液体窒素
中において瞬間凍結した。約０．２ｇの凍結組織を、５５の設定でＴｅｋｍａｒ
Ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ（Ｔｅｋｍａｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｉｔ，ＯＨ）を用
いて、４ｍｌのＴＲＩ試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔ
ｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）中において４０秒間ホモジネートした。Ｒ
ＮＡを、ＴＲＩ試薬供給業者によって記載されたように単離した。ＲＮＡを、Ｆ
ＯＲＭＡｚｏｌ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）中に
再懸濁し、そしてそれぞれ２０および１０μｇのＲＮＡを用いて、ノーザンブロ
ット分析を実施した。ノーザンブロットを用いてＲＮＡを分析し、その完全性を
確認した。ドットブロットを使用して、ｍＲＮＡレベルを定量した（２４；２７
）。特定のｍＲＮＡレベルを、図の説明文に示したように、放射性標識された相
補的ＤＮＡを用いた１８ＳｒＲＮＡおよび／または転写因子Ｓ−ＩＩに対する
ハイブリダイゼーションを使用して、各サンプル中に存在する総ＲＮＡおよび／
またはｍＲＮＡのレベルへと正規化した（１２；２７）。マウスＥＲｐ７２２
．５ｋｂｃＤＮＡを、ｐｃＤ７２−１（１９）からＢａｍＨＩを用いて切り出
した（１９）。１２３５ｂｐのマウスＧＲＰ７５コードフラグメントを、ｐＧ７
ｚ−ＰＢＰ１．８からＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出した（６）。ＧＲＰ７８
ｃＤＮＡの１．５ｋｂのコードフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用
いたｐ３Ｃ５の消化によって生成した（１５）。１．４ｋｂのハムスターＧＲＰ
９４コードフラグメントを、ｐ４Ａ３のＥｃｏＲＩおよびＳａ／Ｋ消化によって
生成した（１５）。ラットカルレティキュリンの６６４ｂｐのコードフラグメン
ト（ヌクレオチド１４８〜８１２）を、ＧＴ１０．Ｕ１からＰＣＲによって生成
した（２３）。マウスＰＤＩの２．４ｋｂ全体のｃＤＮＡを、ＳａｃＩおよびＢ
ａｍＨＩを用いてｐＧＥＭ５９．４から切り出した（１９）。ハムスターＧＲＰ
１７０ｃＤＮＡの１ｋｂコードフラグメントを、ｐＣＲｔｍｌｌからＥｃｏＲ
ＩおよびＸｈｏＩを用いて切り出した（１６）。マウスＥＲｐ５７の１．９ｋｂ
ｃＤＮＡを、ｐＥＲｐ６１からＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｓｔＩを用いて切り出
した（１８）。マウスＨＳＣ７０の１ｋｂｃＤＮＡを、ｐｈｓｃ１．５からＰ
ｓｔＩを用いて切り出した（９）。１．３ｋｂのＰＥＰＣＫコードフラグメント
を、ＳｐｈＩ、次いでＳａｌＩでのｐＧＥＭ５ＺＥＰ（ＧａｎｎｅｒＤ．Ｋ．
博士、ＶａｎｄｅｒｂｉｌｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭ
ｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮから贈呈）の消化によって生成した
。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって単離し、そして^Ｔ７Ｑ
ｌｕｉｃｋＰｒｉｍｅＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造業者の指示に従っ
て使用して放射標識した。

【００４４】（実施例３）（シャペロン研究のためのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ）マウスＧＲＰ７８遺伝子のイントロン３の１１０塩基とエキソン４の１１３塩
基すべてとから作製された２２３塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを、テン
プレートとしてゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって合成し、そしてｐＴ７／Ｔ
３（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）中に挿入した。ＧＲＰ７８遺伝
子のイントロン７とエキソン７との連結領域の２つのプローブを、テンプレート
としてマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって生成した。エキソン７のすべ
てとイントロン７の最初の１１３塩基とを含む２５７塩基のフラグメントを生成
した。エキソン７のすべてとイントロン７の最初の５６塩基とを含む２００塩基
のフラグメントもまた生成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、製
造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって記載されるようにＬｉｇ’ｎＳｃｒｉｂｅキッ
トを用いて、これらのＰＣＲフラグメントに連結した。これらの構築物を、製造
業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって記載されるようにＭＡＸ／Ｓｃｒｉｐｔキットを
用いて、［^３２Ｐ］標識化アンチセンスＲＮＡプローブの合成のためのテンプレ
ートとして使用した。ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを、ＲＰＡＩＩキッ
トを製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって記載されるように用いて実施した。ＧＲ
Ｐ７８プレｍＲＮＡとの２５７塩基ＲＮＡプローブのハイブリダイゼーション
は、エキソン７およびイントロン７の最初の１１３塩基に対応する２５７塩基す
べてを防御した。プレｍＲＮＡに対する２００塩基のＲＮＡプローブのハイブリ
ダイゼーションは、エキソン７のすべておよびイントロン７の最初の５６塩基に
対応する２００塩基を防御した。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡに対するいずれかのプロ
ーブのハイブリダイゼーションは、エキソン７に対して相補的な１４３塩基を防
御した。Ｓ−ＩＩｃＤＮＡの１８５ｂｐおよび２７７ｂｐのｃＤＮＡフラグメ
ントを合成し、そしてｐＴ７／Ｔ３にサブクローニングした（１２）。センスお
よびアンチセンスの転写物に対する［^３２Ｐ］標識化ＲＮＡプローブをインビト
ロで合成し、そしてＲＮａｓｅプロテクションアッセイを実施した。Ｓ−ＩＩ
ｍＲＮＡでのハイブリダイゼーションは、このプローブの１８５塩基または２７
７塩基の領域全体を防御した。センス鎖プローブのみの防御が検出された。ハイ
ブリダイズしたフラグメントの定量を、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定した。

【００４５】（実施例４）（シャペロン研究のための血漿グルコースおよびインスリン）血漿グルコース、インスリン、およびグルカゴンの濃度を、Ｇｌｕｃｏｓｅ［
ＨＫ］１０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），ＲａｔＩｎｓｕｌｉｎ
ＲＩＡａｎｄＧｌｕｃａｇｏｎＲＩＡｋｉｔｓ（ＬｉｎｃｏＲｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を製造業者によって記載されるよう
に使用して決定した。

【００４６】（実施例５：シャペロン研究についての統計分析）図１に示すデータを、５匹のマウスについての、各時点での平均±ＳＤとして
表す。食物欠乏およびその後のマウスへの各食餌群の給餌の効果を、Ｆｉｓｈｅ
ｒ検定に従って一元ＡＮＯＶＡを用いて分析した。この分析によって、個々の時
点での平均が各食餌群内で時間０の平均から異なるか否かを決定した。この分析
によって、各時点でのコントロール群の平均とＣＲ群の平均との間の差もまた決
定した。Ｐ＜０．０５の差を、有意とみなした。値を、平均±ＳＤとして表す。
有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ独立ｔ検定（Ｐ＜０．９５）またはＦｉｓｈｅｒ検定
もしくはＴｕｋｅｙ検定による一元ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０１）のいずれかを用
いて決定した。全ての統計分析を、ＭｉｎｉｔａｂＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｎｉｔａｂ，ＳｔａｔｅＣｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用
いて行った。

【００４７】（実施例６：肝臓シャペロンｍＲＮＡに対するカロリー消費の長期にわたる効
果および急性効果）絶食させたマウスの給餌によって、大量のＧＲＰ７８およびＥＲｐ７２のｍＲ
ＮＡが迅速に誘導された（図１Ａおよび図１Ｂ）。シャペロンｍＲＮＡにおける
大きな増大は、研究した最初の時点である、給餌の１．５時間後に検出された。
ＧＲＰ７８およびＥＲｐ７２のｍＲＮＡの２４時間絶食レベル（０時間）は、Ｃ
Ｒマウスにおいて、より低かった。給餌に対する応答は、コントロールマウスと
ＣＲマウスとで反応速度的に異なっていた。従って、消費された食物の量は、応
答の反応速度に影響を与えた。２４時間全体にわたるＧＲＰ７８およびＥＲｐ７
２のｍＲＮＡの積算レベルもまた、コントロールマウスにおいてよりも、ＣＲに
おいて低かった。ＨＳＣ７０、ＥＲｐ５７、およびカルレティキュリンｍＲＮＡ
に対する給餌の効果を決定した場合、同様の結果が得られた（データは示さず）
。従って、このことは、給餌に対するシャペロン遺伝子発現の共通の応答を表す
。

【００４８】（実施例７：複数組織における、絶食−給餌誘導性の複数シャペロンｍＲＮＡ
）マウスを４８時間絶食させ、そして１．５時間にわたって再度給餌した。肝臓
ＧＲＰ７８のｍＲＮＡは、この時間の後、約３倍誘導された（図２Ａ）。調べた
他のＥＲシャペロンＥＲｐ５７、ＥＲｐ７２、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、ＰＤ
Ｉおよびカルレティキュリン、ならびに最も多量の細胞質シャペロンＨＳＣ７０
についてのｍＲＮＡもまた、給餌によって誘導された（図２Ａ）。ＨＳＣ７０は
、ほぼ３倍誘導された。ミトコンドリアシャペロンＧＲＰ７５における変化は、
この研究において検出されなかった。絶食したマウスおよび給餌したマウスの他
の組織におけるシャペロンレベルを調べることによって、本発明者らは、給餌関
連シャペロン誘導が、少なくとも腎臓および筋肉に広がることを見出した（図２
Ｂ）。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ誘導を図に示す（図２Ｂ）。ＨＳＣ７０ｍＲＮＡ
もまた、これらの組織において誘導された（データは示さず）。示していない研
究では、本発明者らは、肝臓シャペロンｍＲＮＡの同様の誘導がラットにおいて
生じることを見出した。従って、この応答は、他の種によって共有される。

【００４９】（実施例８：ＣＲは、ＧＲＰ７８一次転写産物の量を減少させる）ＲＮａｓｅ保護研究を用いて、食餌カロリー消費における長期にわたる差に対
するＧＲＰ７８ｍＲＮＡおよび一次転写産物の応答性を調査した。これらの研
究のために、ＧＲＰ７８一次転写産物が、転写産物の第３イントロン−第４エキ
ソンの境界を表す２２３塩基のＲＮＡフラグメントを保護するように設計された
プローブを利用した（図３Ａ、レーン１、上のバンド）。ｍＲＮＡは、この遺伝
子の第４エキソンを表す、このプローブの１１３塩基のフラグメントを保護した
（図３Ａ、レーン１、下のバンド）。ずっと少ない２２３塩基および１１３塩基
のＧＲＰ７８前駆体およびｍＲＮＡプローブは、ＣＲマウス由来のＲＮＡによっ
て保護された（図３Ａ、レーン４〜９）。１８５塩基のＳ−ＩＩｍＲＮＡにつ
いてのプローブを、内部コントロールとして各サンプル中に含めた（図３Ａ、レ
ーン３）。Ｓ−ＩＩｍＲＮＡは、ＣＲにも絶食−給餌にも非応答性である（２
５）。図３における非標識バンドは、Ｓ−ＩＩプローブのＲＮａｓｅ耐性アーチ
ファクトを表す（図３Ａ、レーン２）。

【００５０】保護されたプローブの量を定量し、そしてＳ−ＩＩプローブから得られたシグ
ナルに対して正規化した場合、シャペロン前駆体およびｍＲＮＡの量が、ＣＲマ
ウスにおいて同じ程度に減少することが明確になった（図３Ｂ）。イントロン７
とエキソン７との境界領域についてのプローブを用いて同じ結論に達した。従っ
て、ＣＲは、ＧＲＰ７８遺伝子の転写速度またはＧＲＰ７８一次転写産物の安定
性のいずれかを減少させる。このデータは、ＣＲマウスにおけるブロックもしく
は休止されたＧＲＰ７８遺伝子の転写またはｍＲＮＡの安定性の変化と一致しな
い。

【００５１】（実施例９：ＧＲＰ７８一次転写産物の絶食−給餌誘導）ＲＮａｓｅ保護研究をまた用いて、絶食−給餌応答を調査した。給餌の１．５
時間後に単離されたＲＮＡは、一次転写産物のエキソン７−イントロン７の境界
を表す２５７塩基フラグメントを、絶食させたマウスから単離されたＲＮＡより
もずっと多く保護した（図４Ａ、レーン１０〜１２をレーン７〜９に対して比較
する）。エキソン７−イントロン７の境界を表す２００塩基が保護されるプロー
ブを用いて同様の結果が得られた（図４Ａ、レーン１６〜１８をレーン１３〜１
５に対して比較する）。各々の場合、再度給餌したマウスからのＲＮＡもまた、
このｍＲＮＡのエキソン７領域を表す１４３塩基のフラグメントをより多く保護
した（図４Ａ）。２７７ｂｐのＳ−ＩＩｍＲＮＡについてのプローブは、内部
コントロールとして使用されるために各アッセイ中に存在した。

【００５２】これらのデータの定量およびＳ−ＩＩ内部コントロールの正規化によって、ｍ
ＲＮＡおよび前駆体ＲＮＡが給餌することによって本質的に同じ程度まで誘導さ
れることが実証された（図４Ｂおよび図４Ｃ）。この遺伝子の第３イントロン−
第４エキソンの境界について先に記載したプローブを用いて同様の結果が得られ
た（データは示さず）。特定の機構に結び付けられないが、これらのデータは、
同じ分子段階が、カロリー消費における急性変化および長期にわたる変化の両方
に対するシャペロンの遺伝的応答性を調節を担うことを示唆する。この機構は、
転写または一次転写産物の安定性のいずれかの変化を含むようである。

【００５３】（実施例１０：タンパク質合成のインヒビター）絶食−給餌応答に関する生理学的基礎を調査するために、タンパク質合成のイ
ンヒビターを用いて研究を行った。絶食させたマウスを、肝臓における９５％よ
り多くのタンパク質合成を阻害するに十分な用量のシクロヘキシミドまたはピュ
ーロマイシンで処置した。シクロヘキシミドでの処置は、絶食させたマウスにお
いてＧＲＰ７８ｍＲＮＡを強力に誘導した（図５Ａ）。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ
もまた、シクロヘキシミド処置され、再度給餌されたマウスにおいて強力に誘導
された。ピューロマイシン処置は、絶食させたマウスにおいてＧＲＰ７８ｍＲ
ＮＡを中程度に誘導した（図５Ａ）。ピューロマイシン処置マウスの給餌は、ｍ
ＲＮＡを完全に誘導した。従って、給餌による誘導は、デノボのタンパク質合成
を必要としないようである。さらに、これらの結果は、絶食させたマウスにおけ
るより低いシャペロンｍＲＮＡレベルが、急速代謝回転因子の作用に関与し得る
ことを示唆する。

【００５４】ＰＥＰＣＫｍＲＮＡに対するタンパク質合成インヒビターの効果もまた、ポ
ジティブコントロールとして決定した。このｍＲＮＡに対する絶食−給餌および
シクロヘキシミド処置の効果は周知である。予想されたように、絶食はＰＥＰＣ
ＫｍＲＮＡを誘導し、そして給餌はＰＥＰＣＫｍＲＮＡを抑制した（図５Ｂ
）。また、公開されたデータから予想されるように、シクロヘキシミドは、ＰＥ
ＰＣＫｍＲＮＡ安定性に対するその効果によって、絶食させたマウスおよび再
度給餌したマウスの両方においてＰＥＰＣＫｍＲＮＡを増加させた。ＰＥＰＣ
ＫｍＲＮＡレベルに対するこのインヒビターの効果は、このインヒビターがこ
れらの研究において有効であることを示す。

【００５５】（実施例１１：膵臓ホルモンおよびグルコース）絶食−給餌の移行の生理学的な顕著な特徴は、増大した循環インスリンおよび
減少した循環グルカゴンである。図６に示す研究では、絶食させたマウスおよび
再度給餌した偽注射マウスは、それぞれ、８４．４±５．１および１２１．１±
８．０ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度、０．４９１±０．２０３および１．３
±０．２５６ｐｍｏｌ／ｍｌの血清インスリン濃度、そして１４３±２２．４お
よび８１．４±１３．２ｐｇ／ｍｌの血清グルカゴン濃度を有した。

【００５６】これらのホルモンがＧＲＰ７８ｍＲＮＡの食後誘導に関与するか否かを調査
するために、この応答に対するｃＡＭＰ、グルカゴンおよびＳＴＺ誘導性糖尿病
の効果を調べた。ジブチリルｃＡＭＰまたはグルカゴンのいずれかの投与は、給
餌に対するＧＲＰ７８ｍＲＮＡの応答を減少させた（図６Ａ）。ビヒクル単独
は効果がなかった。同様に、ＳＴＺ誘導性糖尿病は、給餌に対する鈍った応答を
もたらしたが、これは、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの絶食レベルを改変しなかった。
ＳＴＺ誘導性糖尿病をｃＡＭＰ投与と組合わせた場合、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの
食後誘導は消去された。ｍＲＮＡは絶食レベルのままであった。何らかの特定の
機構には結び付けられないが、これらの結果は、グルカゴンが、細胞内ｃＡＭＰ
レベルを増大させるように作用して、シャペロン遺伝子の転写を抑制するか、ま
たはおそらくＧＲＰ７８プレ−ＲＮＡの安定性を抑制することを示唆する。さ
らに、これらの結果は、インスリンが、減少した細胞内ｃＡＭＰに対するシャペ
ロン遺伝子の完全な応答性に必要とされることを示唆する。

【００５７】（実施例１２：管腔充填）管腔充填は、いくつかの胃腸管ポリペプチドの放出をもたらし得る。こういう
わけで、本発明者らは、シャペロンｍＲＮＡ応答に対する管腔刺激の役割を調べ
た。絶食させたマウスに、セルロース（マウスの普通の食餌の通常成分）および
鉱油の非栄養性ペーストを再度給餌した。このマウスは最初、混合物を熱心に消
費した。胃の充填を、剖検によって各マウスについて確認した。セルロース−鉱
油消費は、血漿グルコース濃度の変化も、血漿インスリン濃度の変化も、血漿グ
ルカゴン濃度の変化も生じることなく、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡにおいて微量の、
しかし有意な増大を生じた（図６Ｂ）。

【００５８】（実施例１３：副腎ホルモン）ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの食後誘導における副腎ホルモンの役割を調査するため
に、本発明者らは、副腎摘出マウスにおける給餌の効果を調べた（図７）。副腎
摘出も偽手術も、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの絶食レベルに対して何の効果も有さな
かった。しかし、副腎摘出は、ｍＲＮＡの食後誘導の大きさを、再度給餌され、
偽手術されたマウスにおいて見出される大きさの約２倍に増大させた。ＧＲＰ９
４、ＥＲｐ７２、およびＧＲＰ１７０の給餌応答もまた、副腎摘出マウスにおい
て増強された（データは示さず）。従って、この増大は、一般化されたＥＲシャ
ペロン応答である。副腎摘出マウスに対するデキサメタゾンの投与は、飢餓の間
のＧＲＰ７８ｍＲＮＡの基底レベルを有意にではないが、増大させた（図７）
。しかし、デキサメタゾン投与は、この遺伝子の給餌誘導に対して効果を有さな
かった。このことは、デキサメタゾン投与が副腎摘出マウスに存在しないことが
、給餌応答の増強の原因ではないことを示唆する。

【００５９】（実施例１４：短期ＣＲ研究のための試験群の調製）３０ヶ月齢のマウスの３つの群を、これらの研究のために利用した。雄性Ｂ６
Ｃ３Ｆ_１マウスを、記載される（Ｄｈａｈｂｉら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔ
ｏｌ５３Ａ：Ｂ１８０）通りに維持した。マウスを２８日目に離乳し、そして
個々に飼育した。使用した規定食餌の組成は記載されている。これらは、消費さ
れる炭水化物の量のみがＣＲマウスとコントロールマウスとの間で変動するよう
に処方される。コントロールマウスの群に６週齢から、精製された半規定食餌を
給餌した。コントロールマウスは、離乳時から約１０５ｋｃａｌ／週を消費した
。これは、マウスにおける最適な成長、受胎能および生殖能力を支持すると考え
られる食物量よりも約１０％少ない｛ＳｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ｏｎＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ１９７８ＩＤ：５４８０｝。主
観的に、これらのマウスは、太ってもやせても見えなかった。カロリー制限され
たマウスの群（ＣＲマウス）に、これらのマウスがコントロールマウスよりも約
４０％少ないカロリーを消費するように食餌炭水化物を減少させた食餌を給餌し
た。長期ＣＲマウスは、離乳時から約５５ｋｃａｌ／週を消費した。短期ＣＲマ
ウスに、２９ヶ月齢まで１０５ｋｃａｌを給餌した。次いで、これらのマウスに
、８０ｋｃａｌのコントロール食餌を２週間にわたって給餌し、続いて５５ｋｃ
ａｌのＣＲ食餌を２週間にわたって給餌した。これらのマウスに、毎日、午前９
時に給餌した。これらのマウスは水を自由に利用できた。研究のために、マウス
に月曜日の朝に通常の割当ての食物を給餌し、そして全ての食物が４５分以内に
食べられた。これらのマウスを２４時間にわたって絶食させ、そして火曜日の朝
に殺傷した。使用時に、長期のＣＲ、短期のＣＲおよびコントロールマウスはそ
れぞれ、２２．８±１．４、２５．２±０．３および３７．２±２．４ｇの重さ
であった。これらのマウスは、殺傷したときに約３０ヶ月齢であった。

【００６０】マウスを頸椎脱臼によって殺傷し、そして肝臓を迅速に取り出し、そして液体
窒素中で急速に凍結した。約０．２ｇの凍結した肝臓を、４０秒間にわたって、
４ｍｌのＴＲＩＲｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣ
ｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）中で、ＴｅｋｍａｒＴ
ｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ（ＴｅｋｍａｒＣｏ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）
を５５の設定で用いてホモジネートした。ＲＮＡを供給業者によって記載される
通りに単離した。

【００６１】ＧｅｎｅＣｈｉｐオリゴヌクレオチドベースの高密度アレイＲＮＡ発現アッセ
イを、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。ビオチン化し
た、断片化ｃＲＮＡを、Ｍｕ１１ＫｓｕｂＡおよびＭｕ１１ＫｓｕｂＢＧｅｎ
ｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）（
これは、１１，０００より多くの既知マウス遺伝子およびＥＳＴについての標的
を含む）に対してハイブリダイズさせた。このアレイを洗浄し、染色し、そして
走査した。走査した画像の分析およびデータの定量を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析パッケージｖ３．２をデフォールトパラメータの設定で用
いて行った。得られたデータを、グローバルスケーリングによって正規化し、任
意の２つの実験の間の比較を可能にした。

【００６２】全ての対比較の間の倍数変化分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアによ
って行った。転写産物の平均の差はその発現レベルに直接関連するので、任意の
２つのサンプルの間の転写産物の倍数変化の推定値が算出され得る。倍数変化は
、任意の２つの所定のサンプルの間の遺伝子発現の差の指標である。齢の効果を
決定するために、各７ヶ月齢のマウス（ｎ＝３）を、同じ食餌群（コントロール
、ＬＴ−ＣＲ）における各３０ヶ月齢のマウス（ｎ＝３）に対して比較し、合計
９つの対比較を生じた。９つ全ての可能な対比較の平均は、齢の効果についての
倍数変化を決定する。１．８以上（または−１．８以下）の倍数変化のみを、保
持した。ＬＴ−ＣＲの効果を決定するために、各コントロールマウス（ｎ＝３）
を、同じ齢の群（若い、老いた）における各ＬＴ−ＣＲマウス（ｎ＝３）に対し
て比較した。９つ全ての可能な対比較の平均は、食餌の効果についての倍数変化
を決定した。１．８以上（または−１．８以下）の倍数変化のみを、保持した。
２週齢または４週齢でのＳＴ−ＣＲの効果を決定するために、各齢のコントロー
ルマウス（ｎ＝３）を、各ＳＴ−ＣＲマウス（ｎ＝３）に対して、そして各ＳＴ
−ＣＲマウス（ｎ＝３）に対して比較した。各９つの可能な対の比較の平均は、
２週間または４週間におけるＳＴ−ＣＲの効果を決定する。１．８以上（または
−１．８以下）の倍数変化のみを、保持した。

【００６３】（実施例１５：肝臓の遺伝子発現マイクロアレイプロフィールに対する加齢お
よびカロリー制限の効果）（加齢の効果）本発明者らは、長期ＣＲ（ＬＴ−ＣＲ）に供した若いおよび老いた（７ヶ月お
よび３０ヶ月）マウスにおける１１，０００を超える遺伝子の肝臓発現のマイク
ロアレイ分析を行った。本発明者らの研究はまた、非常に短期（２週間または４
週間；ＳＴ−ＣＲ）に供した老いたコントロールマウスの群を含んでいた。本発
明者らは、モニタリングした１１，０００遺伝子のうち４８（０．５％）しか、
コントロールマウスにおいて加齢に伴って変化する発現レベルを示さないことを
見出した。

【００６４】１．齢によって変動した遺伝子のうちの４６％は、遺伝子発現における増大を
示した（表１）。

【００６５】加齢の間に発現が変化（増加または減少）した４８個の遺伝子のうち、２２（
４６％）の発現レベルは、コントロールマウスにおける齢に伴って増大した。こ
れらの遺伝子は、６つのクラスに分類され得る（表１）。ストレスタンパク質／
シャペロン群のいくつかのメンバー（２７％）の発現における増大は、老いたコ
ントロールマウスの肝臓において加齢の間に顕著なストレス応答を示す。この第
２の群は、炎症プロセスに関与する遺伝子から構成される。これは、発現が齢に
伴って増加する全ての遺伝子の３６％に相当する。アポトーシスの重要な調節因
子もまた増加した。このことは、アポトーシスの調節不全が、加齢と関連するこ
とを示唆する。

【００６６】

【表１】２．加齢の間に変化した遺伝子の５４％は、遺伝子発現に減少を示した(表２
）。

【００６７】加齢の間に発現を変化させた４８の遺伝子のうち、２６（５４％）の発現がコ
ントロールマウスにおいて年齢と共に減少した。減少された遺伝子の機能的群の
１つは、逆のレドックス状態に対する細胞防御（グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ様）および生体異物の酸化的代謝（シトクロームｐ４５０、１ａ２）を
含んだ。ＤＮＡ複製および細胞周期に関与する遺伝子の発現の際に観察された減
少は、加齢の間の肝実質細胞増殖能力における減少を示唆する。多くの主要な尿
タンパク質はまた、加齢の間減少した。

【００６８】

【表２】（実施例１６）（ＣＲ効果）（ＬＴ−ＣＲおよびＳＴ−ＣＲは、年齢で発現が変化した４８遺伝子に対する
多様な効果を有する）（１．ＬＴ−ＣＲは、年齢で発現を変化した遺伝子の５８％（４８のうちの２
８）の発現に対する加齢の効果に対抗する）年齢で増加または減少した４８遺伝子の中の２８（５８％）について、ＬＴ−
ＣＲは、変化に対抗した（図８および９）。２８遺伝子のうち１５は、ＬＴ−Ｃ
Ｒによって減少する遺伝子であり（図１）、そして１３は、ＬＴ−ＣＲによって
増加する遺伝子である（図２）。これらの遺伝子は、年齢およびＣＲの両方に応
答するので、経時的年齢ではなく、生理学的年齢によって決定される因子に連鎖
し得る。生理学的年齢に関連した機構によって調節された遺伝子は寿命に連鎖し
、そして加齢の生物マーカーとして有用であり得る。

【００６９】ＳＴ−ＣＲは、それについて年齢に関連した変更がＬＴ−ＣＲによって対抗さ
れる２８遺伝子中の１９（６８％）に対するＬＴ−ＣＲの効果を再現した。１９
遺伝子のこのセットにおいて（ここで、遺伝子発現のパターンは、ＳＴ−および
ＬＴ−ＣＲ群中で高度に相同性であった）、ＣＲは、若々しい遺伝子発現プロフ
ィールを維持しないが、迅速に「緩徐な加齢」プロフィールを誘導する。ＣＲは
、迅速にストレス応答、炎症、ならびに細胞の分化およびアポトーシスに関連し
た遺伝子を変更する。従って、これらの遺伝子の発現プロファイリングは、ＣＲ
模倣薬物および処置を迅速に同定する際に有用であると示されるべきである。

【００７０】（２．ＬＴ−ＣＲは、年齢で発現を変化した遺伝子の４２％（４８のうちの２
０）の発現に影響しなかった）加齢で増加または減少した４８遺伝子の中の残りの２０（４２％）について、
遺伝子発現は、ＬＴ−ＣＲによって変更されなかった（図８および９）。これら
の２０遺伝子のうち７は、年齢で増加したが、ＬＴ−ＣＲによって影響されず（
図８）そして１３は、年齢で増加したが、ＬＴ−ＣＲによっても影響しなかった
（図９）。これらの遺伝子の発現レベルは、ＣＲに独立しているので、生理学的
加齢の速度に依存しないが、時間の経過（経時的な年齢）に依存しないことを、
これらの結果は示す。

【００７１】ＳＴ−ＣＲは実際に、経時的な年齢のみに対して応答性であるような２０遺伝
子中の１２の発現に影響した。ＳＴ−ＣＲに応答する１２の半数以上の遺伝子が
、分子シャペロンおよびストレス応答タンパク質、またはＤＮＡ増幅に関与する
遺伝子である。これらの群の両方は、栄養的に制御され、そして、代謝変更に迅
速に応答することが公知である。

【００７２】（３．加齢の間に３６遺伝子の発現は変化しなかったが、ＳＴ−ＣＲおよび／
またはＬＴ−ＣＲに対して応答性ではなかった（表３））上記報告されるように、１１，０００個のスクリーニングされた遺伝子の０．
５０％のみが、コントロールマウスの肝臓における加齢の間に差次的に発現され
た。従って、広大な大多数の遺伝子の発現は、加齢の間に変化しないままであっ
た。しかし、ＬＴ−ＣＲは、高齢および若年のマウスにおけるこれらの遺伝子の
３６の発現を差次的に変更した（図１０）。３６遺伝子は、鍵となる代謝遺伝子
、ストレス応答タンパク質の遺伝子、ならびに炎症および炎症性応答に関与する
遺伝子を含む。これらの多様な遺伝子群に対するＣＲの年齢に独立した効果は、
ＬＴ−ＣＲの寿命および健康延長効果を媒介する際に関与し得る。

【００７３】ＳＴ−ＣＲは、３６遺伝子の１４（３９％）に対してＬＴ−ＣＲの効果を再現
した（図１０）。従って、これらの遺伝子の３９％は、ＳＴ−ＣＲのたった４週
間後に、ＬＴ−ＣＲの効果を模倣する。これらの結果は、このクラスの遺伝子に
おけるＬＴ−ＣＲによって誘導された遺伝的再プログラミングの有意な部分が、
迅速に再現されることを示す。

【００７４】（表３）（その発現が加齢によって変化しなかった遺伝子の群（１．８倍未満））（長期および短期ＣＲは、それらの遺伝子発現を増加するかまたは減少する）（ＣＲが影響する「初期増加または減少」は、若い年齢において明らかであり
、そして「後期増加または減少」は高齢で明らかである）

【００７５】

【表３】（４．遺伝子発現におけるＬＴ−ＣＲの主要な影響を生じるＳＴ−ＣＲ）ＣＲの影響において最も重要であると一般に考えられる遺伝子の内、年齢によ
って発現を変化する遺伝子について、ＳＴ−ＣＲは、ＬＴ−ＣＲによって誘導さ
れる４８個の変化の内３１個（６５％）に影響を生じた。従って、この重要なク
ラスの遺伝子において、ＳＴ−ＣＲは、ＬＴ−ＣＲの影響をすみやかに生じた。

【００７６】全ての遺伝子（年齢によって発現を変化しない遺伝子を含む）の内、８４個の
遺伝子に対して４５個（５４％）が、同じ方法および同じ程度でＬＴ−ＣＲおよ
びＳＴ−ＣＲの両方に対して応答性であった。これらの結果は、長期間の食事の
影響が遺伝子発現における変化に起因し得る主要な影響が、非常に短い期間のＣ
Ｒによって速やかに生じていることを示す。

【００７７】（５．ＬＴ−ＣＲまたは加齢によって変化しない６０個の遺伝子の発現を変え
るＳＴ−ＣＲ）ＳＴ−ＣＲのみに応答する６０個の遺伝子の内、３３個は増加し（表４）、そ
して２７個は、減少した（表５）。これらの遺伝子は、ストレスタンパク質、代
謝酵素、および細胞増殖媒介物をコードする。これらのクラスの遺伝子のそれぞ
れは、速やかにカロリー摂取に対して応答することが公知である。肝臓は、全体
として生体のエネルギー要求を変える環境刺激に対する適応応答において重大な
役割を果たす。ＳＴ−ＣＲに対するこの肝応答は、新たな減少した栄養摂取に対
する適応に要求される種々の肝臓機能の調節を含み得る。

【００７８】これらの遺伝子は、ＣＲによる寿命の延長において重要であり得ないが、これ
らは、食物を摂取する状態（制御）からカロリー的に制限された状態への成功し
た生理学的な変遷（肝臓においてストレス応答を含むような変遷）に対して重要
であり得る。

【００７９】

【表４】

【００８０】

【表５】（６．ＬＴ−ＣＲは３０の遺伝子の発現を若齢または老齢(高齢）のいずれか
の時に排他的に変化させるが、両方ともの年齢において変化しない）若齢または老齢(高齢）のマウスのいずれかにおいてＣＲに応答するが、両方
ともの年齢のグループ(群）において応答しない３０の遺伝子が存在した。これ
らの遺伝子に関して、ＬＴ−ＣＲは１９の発現を増大させ（表６）、そして１１
の発現を減少させた（表７）。

【００８１】この遺伝子グループ(群）は、固有で興味深い。というのも若齢のマウスにお
ける発現の変化（増大または減少）を誘導するＬＴ−ＣＲは、老齢のマウスでは
観察されなかったからである。これらのＣＲの効果は、上述された他の３つの遺
伝子グループで観察された効果（図８〜１０）と対照的である。これらのグルー
プにおいて、若齢のマウスで観察されたＬＴ−ＣＲの効果は、常に老齢のマウス
において見出された。

【００８２】ＳＴ−ＣＲは、老齢のＬＴ−ＣＲマウスにおける発現を変化させた遺伝子の中
の７／１２の遺伝子（５８％）で同様の効果を再現した。これらの中で、６／８
の遺伝子（７５％）は発現を増大させ（表６）、そして１／４（２５％）は発現
を減少させた（表７）。したがって、ＳＴ−ＣＲはまた、老齢のマウスにおける
これらの変化の大部分を再現した。

【００８３】（全体的な結論）該して、ＳＴ−ＣＲの２週〜４週のみが、老齢のマウスにおけるＬＴ−ＣＲに
より誘導された変化のほぼ６５％を再現した。これらの結果は、ＳＴ−ＣＲは、
ＬＴ−ＣＲにより誘導される遺伝子発現の変化の大部分について、薬物の効果お
よび処置の効果を迅速に評価するために用いられ得ることを強く示す。

【００８４】

【表６】

【００８５】

【表７】（実施例１７）（ＳＴＺ糖尿病マウスにおける遺伝子発現）ストレプトゾタシン（ＳＴＺ）は糖尿病を誘発する。ＳＴＺでの３回の処置を
うけるマウスは、約４週間で糖尿病となった。糖尿病は、インスリンレベルをほ
ぼゼロに低下する。ＣＲは、それがインスリンレベルを低下するという点で類似
の効果を有するが、ＳＴＺ処理動物におけるほど低くない。また、ＣＲは、寿命
を延長するが。ＳＴＺは、反対の効果を有しており、寿命を縮める。

【００８６】図１１は、各々の可能性のあるマウス対についての全体的遺伝子発現の相関係
数の対比較を示す。この結果は、肝臓遺伝子発現が、若年ＣＲと、若年コントロ
ールと、ＳＴＺ糖尿病マウスとの間で非常に異なることを示す。結果として、重
篤な糖尿病で見出された病理経路におけるインスリンの低下は、ＣＲで観察され
た遺伝子発現プロフィールまたは寿命効果を生じるのに不十分である。

【００８７】（実施例１８）（アミノグアニジン処理マウスにおける遺伝子発現）アミノグアニジンは、グルコースのアルデヒド形態によって開始されたタンパ
ク質の架橋を阻害することによって加齢を遅らせると考えられる。しかし、アミ
ノグアニジンを給餌されたマウスは、寿命に対する効果がほとんどないか、また
は全くなかった。しかし、遺伝子発現の大きい効果を観察した（図１２）。アミ
ノグアニジン処理マウスの遺伝子発現は、高齢ＣＲおよび高齢コントロールのい
ずれとも相関しなかった。結論として、アミノグアニジンは、マウスの加齢にほ
とんど効果がないが、遺伝子発現における大きな差異が観察される。これらの効
果は、ＣＲの効果と同様ではなく、そしてこれは、マウスの寿命に対する強力な
効果がないことと一致する。

【００８８】（実施例１９）どの特定の介入がマウスにおけるカロリー制限を模倣するかを決定するため、
以下のグループ(群）のマウスを準備する。

【００８９】第１グループ：コントロール第２グループ：トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（提案された合
成的なカロリー制限模倣薬物であって、ラットおよびマウスにおいてインスリン
レベルを減少し、血圧およびトリグリセリドを低下し、フリーラジカルを阻害し
、ミトコンドリア量を増大し、そしてげっ歯類において食物取り込みを変化させ
ないようである）：１０ヶ月で処置開始第３グループ：ＩＧＦ−１（自然に提案されるカロリー制限模倣ホルモンであ
って、インスリンとグルコースの両方のレベルを低下し、加齢の基礎的機構に直
接関与し得；免疫、筋肉、および他の系に対して若返り（再活性化）効果を有す
る）：１２ヶ月で処置開始第４グループ：ＡＬＴ−７１１（または他のＡＧＥ（加齢）停止剤：提案され
たカロリー制限模倣物であり、グルコースレベルを減少するのではなく、グルコ
ースレベルの上昇の効果が生じた場合、またはそれが生じた後、その効果を逆転
することにより作用する）：１８ヶ月で処置開始全てのグループにおける動物は、この研究を通じて、同じ、既知量の食物を摂
った。

【００９０】トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびＩＧＦ−１の用量は、若
年または好ましくはカロリー制限動物の範囲に、グルコースおよびインスリンレ
ベルを設定するように選択する。グルコースおよびインスリンを測定するが、コ
ントロールおよびＡＬＴ−７１１グループ中ではコントロールしない。トログリ
タゾンを、食餌の０．２％の用量（他の目的のためのトログリタゾンについての
標準）で供給する。同様に、ＡＬＴ−７１１は、この食餌中には組み込まれない
。低レベル（非毒性）のＡＬＴ−７１１を用い、経時保持する。

【００９１】ＩＧＦ−１は、連続的送達方法がアレンジされ得る限り、注射によって（最低
１週間あたり３回）供給されると仮定される。この好ましい投薬方法は、定常の
ＩＧＦ−１レベルを得るための、分裂していないＩＧＦ−１分泌細胞の移植であ
り、可能ならば、これを行う。これが可能でない場合、ＩＧＦ−１をＧｅｎｅｎ
ｔｅｃｈまたは別の製造業者からの寄贈として得る。注射の他の可能性のある代
替法は、浸透ミニポンプ；皮下徐放性リザーバーへのＩＧＦ−１の注入；Ｃｅｌ
ｔｒｉｘによって用いられるミニポンプ手段によるインフュージョン（注入）；
身体への緩徐放出を可能にする皮膚パッチの使用である。

【００９２】各々の長寿試験（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ−ｔｅｓｔｉｎｇ）群（ＬＴＧ）には６
０匹の動物を有する。各ＬＴＧは、平均して、４０匹の同様に処理した動物の別
のセットを伴う。このセットは、固定年齢でのこの動物の状態の生物化学アッセ
イおよび組織化学的資料を可能にするための屠殺のために備えられる（屠殺グル
ープ、ＳＧ）。ＩＧＦ−１およびトリグリタゾングループの場合、下記のように
、平均ＳＧサイズを４０匹残せるような様式で、いくつかの動物をパイロット用
量決定試験に割り当てる。用量確認に割り当てられたグループは、パイロット用
量グループまたはＰＤＧと呼ばれる。

【００９３】トログリタゾンについて、３回のトログリタゾン食餌の各々の約２ヶ月の供給
（それぞれ、０．１％、０．２％または０．３％のトログリタゾンを含有する）
を最初に指示した。メインの０．２％トログリタゾン用量を、この用量に適切な
トログリタゾングループを行う前に、小規模パイロットのマウス集団で試験する
。０．２％トログリタゾンは、０．２％トログリタゾンに対して２週間後、循環
中のインスリンの予期された変化を生じると見出されない場合、この食餌を、そ
の時点でより適切な用量の食餌に変え、そして第二の小規模パイロットのマウス
集団で確認する。

【００９４】同様に、同じ動物をＩＧＦ−１注射パイロット実験に用い、適切な開始用量を
決定する。

【００９５】１２月齢で：ＳＧグループあたり３匹の動物を屠殺して、引き続く全ての結果
に対して比較されるべき１２匹の動物の共通のベースライングループを得る。全
ての引き続くデータは、このプールされた群の結果に対して比較され得る。

【００９６】１２．５月齢で：最も評価された用量のＩＧＦ−１を考慮して、７匹のマウス
でＩＧＦ−１ＰＤＧを開始する。インスリンおよびグルコースレベルの決定の
ため２週間後に屠殺する。１３月齢でＩＧＦ−１の用量の確認試験／第二試験を
開始し、この第二のＰＤＧを１３ヶ月、３週齢で屠殺する。インスリンおよびグ
ルコースのためのアッセイを想定することを、１週間で完了し得る。このレジメ
ンによって、１４月齢まえにＬＴＧの最終用量が決定されることが可能になる。
同様に、１２．５月齢で、７匹のマウスを０．２％トログリタゾン食餌にいれる
。２週間後、屠殺して、インスリンおよびグルコースについてアッセイする。１
３月、１週で調節用量または確認用量グループを開始し、２週後に屠殺する。

【００９７】１４月齢で：トログリタゾンおよびＩＧＦ−１を、各々について実験的に決定
されたまたは至適と評価された用量で開始する。

【００９８】１６ヶ月齢で：グルコース、インスリンおよび本研究に関与する他の全ての終
点の決定のために、ＩＧＦ−１およびトログリタゾンＳＧからの６匹の動物を屠
殺する。必要な場合、ＩＧＦ−１の用量を再度（ＬＴＧおよびＩＧＦ−１ＳＧ
の未使用部分の両方において）調節するか、および／または改変したトログリタ
ゾン含量を有する食餌を準備する。コントロールとして、ＳＧおよびＡＬＴ−１
１グループから各３匹の動物を屠殺し、そしてプールして、ＩＧＦ−１およびト
ログリタゾングループに対して比較するための６匹の動物の共通のグループを作
成する。

【００９９】１８ヶ月齢で：１５ヶ月と同様に、ただしＩＧＦ−１およびトログリタゾンに
ついては７マウス／ＳＧを用い、そしてコントロールおよびＡＬＴ−７１１グル
ープについては４／マウス／ＳＧを用いる。このサンプリングの直後に、ＡＬＴ
−７１１に対しＡＬＴ−７１１グループを開始する。

【０１００】約２７ヶ月（２４〜３０ヶ月）で：サンプルは全て生存しているＳＧマウスを
保持している。

【０１０１】処置１、２、３、および４について屠殺グループにおけるマウスの最初の総数
は、それぞれ３０、５０、５０、および３０である。これらのグループのいずれ
かにおいて死亡がなければ、最終サンプリングの時点で各ＳＧにおいて２０匹の
動物が残る。しかし、本発明者らが、この数の１／３しか生存しないと仮定すれ
ば、サンプリングされる動物は、最終サンプリング時点で、約７匹の動物、また
は統計学的に有意差のために必要なほぼ最小数が残る。２７ヶ月での平均生存率
は７３％を超える場合、より大きい年齢については２７ヶ月終点は延期され得る
。

【０１０２】他の生物化学マーカーに加えて、アッセイは以下を含み得る：心臓および胸腺の容積および組織学；自己抗体力価；Ｔ細胞およびＢ細胞の特徴；屠殺時点での膀胱尿中のタンパク質またはアルブミンの濃度分子グリケーション（グリコシル化）係数；タンパク質カルボニル含量または他のフリーラジカル／酸化係数；ならびに特に、前立腺および乳房の新生物の頻度。

【図面の簡単な説明】

本発明のこれらの特徴および他の特徴が、好ましい実施形態の図面を参照して
ここに記載され、この好ましい実施形態は、本発明を例示することが意図される
が、本発明を限定することは意図されない。

【図１】図１は、肝臓ＧＲＰ７８およびＥＲｐ７２のｍＲＮＡに対する食餌の効果であ
る。給餌後０時間、１．５時間、５時間および１２時間にて、各食餌群からの５
匹のマウスを屠殺した。２４時間の絶食後のそれらの重量は、ＣＲについて２２
．９６±１．４９ｇであり、コントロールマウスについては３７．１２±１．１
９ｇであった。コントロールからのＧＲＰ７８ｍＲＮＡ（Ａ）およびＥＲｐ７
２ＲＮＡ（Ｂ）（黒丸）およびＣＲマウスからのＧＲＰ７８ｍＲＮＡ（Ａ）
およびＥＲｐ７２ＲＮＡ（Ｂ）（白丸）は、ドットブロットを使用して定量し
た。ＲＮＡローディングおよびトランスファーを、１８ＳリボソームＲＮＡおよ
びＳ−ＩＩｍＲＮＡについての連続プロービングから得たデータを用いて正規
化した。同様の結果を、両方のコントロールプローブを用いて得た。毎日１回３
０日間給餌した、ＣＲマウスおよびコントロールマウスを、２４時間絶食させ、
そして屠殺するか（ｎ＝５、０時点）、または特定の時点で再給餌しそして屠殺
した（各時点についてｎ＝５）。＋は、各時点でのＣＲとコントロールとの間の
差のＰ＜０．０１有意性を示す。＊は、各食餌群内での０時点からの差異のＰ＜
０．０１有意性を示す。０時点および２４時間は、同じデータセットである。

【図２】図２は、シャペロン食餌応答の遺伝子および組織特異性である。Ａ．食餌に応
答性であるシャペロン遺伝子のドメインを、４８時間絶食したマウスからのＲＮ
Ａを用いる（ｎ＝６；白棒）かまたは４８時間絶食し、再給餌しそして１．５時
間後に屠殺したマウスからのＲＮＡを用いて（ｎ＝６；黒棒）、肝臓シャペロン
ｍＲＮＡ量を定量することによって決定した。これらのｍＲＮＡは、ドットブロ
ッティングおよびノーザンブロッティングによって定量した。いずれの技術を用
いて得られた結果においても有意な差異は存在しなかった。ドットブロッティン
グの結果を示す。Ｂ．２４時間絶食したマウス（ｎ＝４）からの肝臓、腎臓およ
び筋肉のＧＲＰ７８ｍＲＮＡ、ならびに２４時間絶食した給餌後１．５時間後
のマウス（ｎ＝５）からの肝臓、腎臓および筋肉のＧＲＰ７８ｍＲＮＡ。これ
らのデータは、パネルＡにおいて使用したのと異なるマウスから得た。その結果
の統計学的有意性を示す（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜
０．００１）。

【図３】図３は、肝臓前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）およびＧＲＰ７８ｍＲＮ
Ａの量に対するＣＲの効果。Ａ．ＣＲマウスおよびコントロールマウスにおける
、前駆体ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡのＲＮアーゼプロテクション。肝臓ＲＮＡを、
コントロールマウスおよびＣＲマウスから精製し、そしてＧＲＰ７８遺伝子の３
番目のイントロンと４番目のエキソンとの境界に広がる転写物についてのＲＮＡ
プローブを用いてハイブリダイズした。前駆体ｍＲＮＡは、そのプローブ（標識
ＧＲＰ７８前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ））の２２３塩基領域を保護し
たが、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡは、１１３塩基フラグメントを保護した（図におい
てそのように示される）。Ｓ−ＩＩｍＲＮＡコード配列についてのプローブを
、内部コントロールとして各反応に含めた。それは、図においてＳ−ＩＩｍＲ
ＮＡで１８５塩基フラグメントを保護した。レーン１は、ＧＲＰ７８プローブお
よびマウス肝臓ＲＮＡにより生成された、保護されたフラグメントを示す。レー
ン２は、酵母の総ＲＮＡにハイブリダイズしたＳ−ＩＩプローブにより生成され
たフラグメントを示す。レーン３は、マウス肝臓ＮＲＡにハイブリダイズしたＳ
−ＩＩプローブにより生成された結果を示す。レーン４、６および９は、コント
ロールマウスからの肝臓ＲＮＡによって生成された結果を示す。レーン５、７お
よび９は、ＣＲマウスからのＲＮＡを用いた結果を示す。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ
（Ｂ）およびＧＲＰ７８前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（Ｃ）を示す、保
護されたフラグメントの量の定量。上記に示されたような研究を、６匹のＣＲマ
ウスおよび６匹のコントロールマウスからの肝臓ＲＮＡを使用して実行した。保
護されたフラグメントの輝度を、リン光画像化機（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅ
ｒ）を用いて定量した。その前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）フラグメント
およびｍＲＮＡフラグメントの輝度を、Ｓ−ＩＩｍＲＮＡを示す保護されたフ
ラグメントの輝度に対して正規化した。統計学的有意性を、図２に対する説明文
におけるように示す。

【図４】図４は、肝臓ＧＲＰ７８ｍＲＮＡおよびＧＲＰ７８前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ
−ｍＲＮＡ）の量に対する食餌の効果。Ａ．４８時間絶食後（ｎ＝５）のマウス
または４８時間絶食した給餌１．５時間後のマウス（ｎ＝５）のマウスにおける
、肝臓ＧＲＰ７８前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）およびＧＲＰ７８ｍＲ
ＮＡについてのプローブのＲＮアーゼプロテクション。肝臓から精製したＲＮＡ
を、２５７塩基保護フラグメントを生じたＧＲＰ７８遺伝子のエキソン７とイン
トロン７との境界を含む一次保護フラグメントについてのプローブ（標識Ｓ−Ｉ
Ｉ＋ＧＲ７８；レーン７〜１２）またはエキソン７とイントロン７との境界に広
がる一次転写物についてのプローブ（図において示されるように、これは、２０
０ヌクレオチドフラグメントを保護した（標識Ｓ−ＩＩ＋ｔＧＲＰ７８、レーン
１３〜１８））のいずれかに対してハイブリダイズした。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ
は、図に示されるように、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡを示す１４３ヌクレオチドを生
じた。Ｓ−ＩＩｍＲＮＡコード配列についてのプローブを、内部コントロール
として各反応に含めた。このプローブを用いて、Ｓ−ＩＩｍＲＮＡは、２７７
ヌクレオチドフラグメントを保護した（図における標識Ｓ−ＩＩｍＲＮＡ）。
レーン１、ＲＮＡマーカー。レーン２〜６、示されるプローブと酵母ｔＲＮＡと
のハイブリダイゼーション。レーン７〜１２、ＧＲＰ７８およびＳ−ＩＩプロー
ブと、絶食マウス（レーン７〜９）および再給餌マウス（レーン１０〜１２から
のＲＮＡとのハイブリダイゼーション。レーン１３〜１８、ＧＲＰ７８およびＳ
−ＩＩプローブと、絶食マウス（レーン１３〜１５）および再給餌マウス（レー
ン１６〜１８）からのＲＮＡとのハイブリダイゼーション。ＧＲＰ７８ｍＲＮ
Ａ（Ｂ）およびＧＲＰ７８前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（Ｃ）を示す、
保護されたフラグメントの量の定量。上記に示されたような研究を、６匹のＣＲ
マウスおよび６匹のコントロールマウスからの肝臓ＲＮＡを使用して実行した。
保護されたフラグメントの輝度を、上記図３において示したように定量しそして
正規化した。統計学的有意性を、図２に対する説明文におけるように示す。

【図５】図５は、ＧＲＰ７８（Ａ）およびＰＥＰＣＫ（Ｂ）ｍＲＮＡの食餌応答に対す
るタンパク質合成インヒビターの効果。４８時間絶食したマウスに、ビヒクルを
腹腔内注射し、そして１時間後にビヒクルを２回目の腹腔内注射した（絶食＋擬
似（Ｓｈａｍ）；ｎ＝６）。４８時間絶食したマウスに、給餌の３０分前および
３０分後に、ビヒクルを腹腔内注射した（再給餌（Ｒｅｆｅｄ）＋擬似、ｎ＝６
）。４８時間絶食したマウスにシクロヘキシミドを腹腔内注射し、そして１時間
後にシクロヘキシミドを２回目の腹腔内注射した（絶食（Ｆａｓｔｅｄ）＋シク
ロヘキシミド；ｎ＝６）。４８時間絶食したマウスに、給餌の３０分前および３
０分後にシクロヘキシミドを腹腔内注射した（再給餌＋シクロヘキシミド；ｎ＝
６）。４８時間絶食したマウスに、プロマイシンを腹腔内注射し、１時間後にプ
ロマイシンを２回目の腹腔内注射した（絶食＋プロマイシン；ｎ＝６）。４８時
間絶食したマウスに、給餌の３０分前および３０分後に、プロマイシンを腹腔内
注射した（再給餌＋プロマイシン；ｎ＝６）。ＧＲＰ７８ｍＲＮＡおよびＰＥ
ＰＣＫｍＲＮＡの量を、精製した肝臓ＲＮＡを使用して決定した。共通の上付
き文字がない棒は、有意に異なる（Ｐ＜０．００５）。

【図６】図６は、インスリン、ジブチリル−ｃＡＭＰ、グルカゴン、および鉱油および
セルロースの摂取による、絶食−給餌応答の調節。Ａ．６匹のマウスの群を、４
８時間絶食し、そして以下のように処理した：（絶食＋擬似）マウスに、ビヒク
ルを注射しそして１時間後にビヒクルを２回目注射した；（給餌＋擬似）マウス
に、給餌の３０分前および３０分後に、ビヒクルを擬似注射した；（給餌＋ｃＡ
ＭＰ）マウスに、ジブチリル−ｃＡＭＰおよびテオフィリンを、給餌の３０分前
および３０分後に注射した；（給餌＋グルカゴン）マウスに、給餌の３０分前お
よび３０分後に、グルカゴンを注射した；（絶食糖尿病＋擬似）以前にＳＴＺを
用いて糖尿病にしたマウスに、ビヒクル注射し、１時間後に２回目のビヒクル注
射した；（給餌糖尿病＋擬似）ＳＴＺ−糖尿病マウスに、給餌の３０分前および
３０分後に擬似注射した；（給餌糖尿病＋ｃＡＭＰ）糖尿病マウスに、給餌の３
０分前および３０分後にジブチリル−ｃＡＭＰおよびテオフィリンを注射した。
すべてのマウスを、その最後の注射の１時間後に屠殺した。総ＲＮＡを肝臓から
単離し、そしてドットブロット分析に供した。共通の上付き文字のない棒は、有
意に異なる（Ｐ＜０．００５）。Ｂ．肝臓ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ量に対する鉱油
およびセルロース摂取の効果。６匹のマウスの群を、４８時間絶食し、そして以
下のように処理した：（絶食）マウスを４８時間後絶食させて屠殺した；（給餌
）マウスを４８時間絶食させ、そして１．５時間後に屠殺した；（絶食＋セルロ
ース）４８時間絶食したマウスに、セルロースと鉱油との混合物を給餌し、そし
て１．５時間後に屠殺した。有意性を、図５に対する説明文におけるように示す
。

【図７】図７は、肝臓ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現および調節に対する、副腎摘出およ
びデキサメタゾン投与の効果。６匹のマウスの群を、４８時間絶食し、そして以
下のように処理した：（絶食＋擬似）擬似手術したマウスに、屠殺する７．５時
間前および１．５時間前にビヒクルを腹腔内注射した；（給餌＋擬似）擬似手術
したマウスに、給餌の６時間前および３０分後にビヒクルを腹腔内注射し、最後
の注射の１時間後にマウスを屠殺した；（副腎摘出（Ａｄｘ）絶食＋擬似）副腎
摘出マウスに、屠殺する７．５時間前および１．５時間前にビヒクルを腹腔内注
射した；（副腎摘出給餌＋擬似）副腎摘出マウスに、給餌の６時間前および３
０分後にビヒクルを腹腔内注射し、最後の注射の１時間後にマウスを屠殺した；
（副腎摘出絶食＋デキサメタゾン（Ｄｅｘ））副腎摘出マウスに、屠殺する７
．５時間前および１．５時間前にデキサメタゾンを腹腔内注射した；（副腎摘出
給餌＋デキサメタゾン）副腎摘出マウスに、給餌の６時間前および３０分後に
デキサメタゾンを腹腔内注射し、最後の注射の１時間後にマウスを屠殺した。有
意性を、図５に対する説明文におけるように示す。

【図８】図８は、年齢とともに増加した、２２個の遺伝子に対するＣＲの効果。上の線
は、ＬＴ−ＣＲにより影響されなかった７個の遺伝子を示す。中の線は、ＬＴ−
ＣＲにより年長において減少した９個の遺伝子を示す。下の線は、ＬＴ−ＣＲに
より年少および年長において減少した６個の遺伝子を示す。

【図９】図９は、年齢とともに減少した、２６個の遺伝子に対するＣＲの効果。上の線
は、ＬＴ−ＣＲにより年少および年長において増加した３個の遺伝子を示す。中
の線は、ＬＴ−ＣＲにより年長において増加した１０個の遺伝子を示す。下の線
は、ＬＴ−ＣＲにより影響されなかった１３個の遺伝子を示す。

【図１０】図１０は、年齢とともに変化しなかった、３６個の遺伝子に対するＣＲの効果
。一番上の線は、ＬＴ−ＣＲにより年少および年長において増加した５個の遺伝
子を示す。上から２番目の線は、ＬＴ−ＣＲにより年長において増加した８個の
遺伝子を示す。上から３番目の線は、ＬＴ−ＣＲにより年長において減少した１
０個の遺伝子を示す。一番下の線は、ＬＴ−ＣＲにより年少および年長において
減少した１３個の遺伝子を示す。

【図１１】図１１は、可能なマウス対各々についての全体的遺伝子発現相関係数の対合比
較の平均である。

【図１２】図１２可能なマウス対各々についての全体的遺伝子発現相関係数の対合比較の
平均である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ａ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 35/00 35/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 ＡＣ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA02 CA12 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA20 QQ02 QQ08 QQ43 QQ53 QQ79 QR55 QR72 QR77 QR82 QR90 QS34 4C084 AA17 NA14 ZB26 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞において、カロリー制限の効果を模倣する介入を同定す
るための方法であって、以下：生物学的サンプルを得る工程；該生物学的サンプルを介入に曝す工程；特定の時間待機する工程；加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレ
ベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの変化を評価する工程；お
よび該レベルにおける１つ以上の変化がまたカロリー制限において生じる場合、カ
ロリー制限の該効果を模倣する介入として該介入を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記生物学的サンプルが細胞を含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】前記細胞が哺乳動物から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記哺乳動物がマウスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベル
またはタンパク質活性レベルの前記変化が、シャペロンタンパク質をコードする
遺伝子の遺伝子発現における変化に相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】シャペロンタンパク質をコードする前記遺伝子がＧＲＰ７８
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記バイオマーカーがアポトーシスである、請求項１に記載
の方法。
【請求項８】前記バイオマーカーが加齢である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】加齢の前記バイオマーカーが癌細胞の産生である、請求項８
に記載の方法。
【請求項１０】加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、前記遺伝子
発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの
前記変化が、６週間以内に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、前記遺伝子
発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの
前記変化が、４週間以内に生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、前記遺伝子
発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの
前記変化が、２週間以内に生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】加齢の１つ以上のバイオマーカーに関連する、前記遺伝子
発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性レベルの
前記変化が、約２日以内に生じる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】遺伝子発現の変化が、遺伝子チップを用いて評価される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記遺伝子チップが、ストレスタンパク質の遺伝子を含む
、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記遺伝子チップが、炎症性反応に関連する遺伝子を含む
、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記遺伝子チップが、アポトーシスに関連する遺伝子を含
む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】前記遺伝子チップが、転写因子、膜貫通チャネルタンパク
質、および輸送タンパク質からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項１４
に記載の方法。
【請求項１９】前記生物学的サンプルが、試験動物である、請求項１に記
載の方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法であってさらに、長期カロリー制
限動物の特徴を同定する工程を有する、参照動物における前記レベルの変化を決
定する工程を含み、ここで該参照動物は、約６週間未満のカロリー制限食餌を摂
っており、そして該変化は、カロリー制限の効果を模倣する介入として該介入を
同定する該工程において用いられる、方法。
【請求項２１】前記参照動物が約４週間未満のカロリー制限食餌を摂って
いた、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記参照動物が約２週間未満のカロリー制限食餌を摂って
いた、請求項２４に記載の方法。
【請求項２３】前記試験動物がマウスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】遺伝子発現の変化が前記試験動物において評価される、請
求項１９に記載の方法。
【請求項２５】請求項１９に記載の方法であって、さらに以下：カロリー制限参照動物から遺伝子発現プロフィールを得る工程；前記試験動物についての遺伝子発現の変化を、該カロリー制限参照動物の遺伝
子発現プロフィールに対して比較する工程；および該試験動物の遺伝子発現プロフィールが該カロリー制限動物の遺伝子発現プロ
フィールと統計学的に類似している場合、カロリー制限の効果を模倣する介入と
して前記介入を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】前記試験動物の遺伝子発現プロフィールが、一元分散分析
（ＡＮＯＶＡ）とその後のフィッシャー検定（ｐ＜０．０５）によって、前記カ
ロリー制限動物の遺伝子発現に統計学的に類似していると確認される、請求項２
８に記載の方法。
【請求項２７】試験動物においてカロリー制限の効果を模倣する介入を同
定するためのシステムであって、該システムは、試験動物、およびカロリー制限
の間に変化した発現を有することが既知の遺伝子を含む遺伝子チップを備える、
システム。
【請求項２８】請求項２７に記載のシステムであって、前記遺伝子チップ
が、ストレスタンパク質、炎症性反応、アポトーシス、シャペロンタンパク質、
転写因子、膜貫通チャネルタンパク質および輸送タンパク質の遺伝子からなる群
より選択される遺伝子を含む、システム。