JP2003500052A - ヒストン脱アセチル酵素の抑制 - Google Patents
ヒストン脱アセチル酵素の抑制Info
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- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2310/30—Chemical structure
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、ヒストン脱アセチル酵素の発現と酵素活性の抑制、特に、特定のヒストン脱アセチル酵素の抑制に関するものである。この発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物と、この組成物を使用してヒストン脱アセチル酵素を抑制する方法に関するものである。また、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定する方法と、そのようなヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素活性を低減する化合物を特定する方法が開示される。
Description
関連出願
この出願は、1999年3月3日に出願された米国仮特許出願番号第60/132,287号か
らの優先権を主張するものであり、その全体をこの明細書の一部として引用して
いる。
らの優先権を主張するものであり、その全体をこの明細書の一部として引用して
いる。
【０００１】
発明の背景 発明の分野
この発明は、ヒストン脱アセチル酵素（histone deacethylase）の発現および
酵素活性の抑制に関するものである。関連技術の要約 コアヒストンH1-H4の脱アセチル化は、ヒストン脱アセチル酵素と呼ばれる2つ
の関連するファミリーの酵素によって仲介される。ヒストン脱アセチル酵素の1
つのファミリーは、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3を含んでいる。ヒストン脱アセチル
酵素の第2のファミリーは、HDAC-4（以前はHDAC-A）、HDAC-5（以前はHDAC-B）
、HDAC-C、HDAC-DおよびHDAC-Eである。ヒストン脱アセチル酵素の活性は、転写
因子のエンハンサーやプロモータへのアクセス性を調節すると考えられている。
確かに、アセチル化されたヒストンH4の濃縮が、ゲノムの転写沈黙領域で発見さ
れている（Tauntonら、Science 272：408-411, 1996）。
酵素活性の抑制に関するものである。関連技術の要約 コアヒストンH1-H4の脱アセチル化は、ヒストン脱アセチル酵素と呼ばれる2つ
の関連するファミリーの酵素によって仲介される。ヒストン脱アセチル酵素の1
つのファミリーは、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3を含んでいる。ヒストン脱アセチル
酵素の第2のファミリーは、HDAC-4（以前はHDAC-A）、HDAC-5（以前はHDAC-B）
、HDAC-C、HDAC-DおよびHDAC-Eである。ヒストン脱アセチル酵素の活性は、転写
因子のエンハンサーやプロモータへのアクセス性を調節すると考えられている。
確かに、アセチル化されたヒストンH4の濃縮が、ゲノムの転写沈黙領域で発見さ
れている（Tauntonら、Science 272：408-411, 1996）。
【０００２】
機能性ヒストン脱アセチル酵素は、正常細胞および腫瘍細胞の両方の細胞サイ
クルにおける必要条件として挙げられている。トストレプトマイセスから単離さ
れた抗生物質であるトリコスタチンA（TCA）は、ヒストン脱アセチル酵素活性を
抑制し、G1およびG2期において細胞サイクルの進行を阻止することが示されてい
る（Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265：17174-17179, 1990； Yoshidaら、Exp. C
ell Res. 177：122-131, 1988）。トリコスタチンC、トラポキシン、depudecin
、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228（藤沢薬品）および
酪酸塩などの、ヒストン脱アセチル酵素活性の他の抑制因子は、細胞内の細胞サ
イクル進行を同様に抑制することがわかっている（Tauntonら、Science 272：40
8-411, 1996；Kijimaら、J. Biol. Chem. 268(30)：22429-22435, 1993；Kwonら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(7)：3356-61, 1998）。
クルにおける必要条件として挙げられている。トストレプトマイセスから単離さ
れた抗生物質であるトリコスタチンA（TCA）は、ヒストン脱アセチル酵素活性を
抑制し、G1およびG2期において細胞サイクルの進行を阻止することが示されてい
る（Yoshidaら、J. Biol. Chem. 265：17174-17179, 1990； Yoshidaら、Exp. C
ell Res. 177：122-131, 1988）。トリコスタチンC、トラポキシン、depudecin
、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228（藤沢薬品）および
酪酸塩などの、ヒストン脱アセチル酵素活性の他の抑制因子は、細胞内の細胞サ
イクル進行を同様に抑制することがわかっている（Tauntonら、Science 272：40
8-411, 1996；Kijimaら、J. Biol. Chem. 268(30)：22429-22435, 1993；Kwonら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(7)：3356-61, 1998）。
【０００３】
ヒストン脱アセチル酵素の既知の抑制因子はすべて天然生成物であり、すべて
、タンパク質レベルでヒストン脱アセチル酵素の活性を抑制する小型分子である
。さらに、既知のヒストン脱アセチル酵素抑制因子は、特定のヒストン脱アセチ
ル酵素に対しても非特異性であり、いずれのファミリーのヒストン脱アセチル酵
素もすべて多かれ少なかれ同様に抑制する。
、タンパク質レベルでヒストン脱アセチル酵素の活性を抑制する小型分子である
。さらに、既知のヒストン脱アセチル酵素抑制因子は、特定のヒストン脱アセチ
ル酵素に対しても非特異性であり、いずれのファミリーのヒストン脱アセチル酵
素もすべて多かれ少なかれ同様に抑制する。
【０００４】
したがって、ヒストン脱アセチル酵素を遺伝子レベルで抑制するとともに、特
定のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制する試薬を開発する必要が残っている
。これらの試薬を用いて、腫瘍形成に関与する特定のヒストン脱アセチル酵素を
同定し、抑制するために用いる方法を開発する必要もある。
定のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制する試薬を開発する必要が残っている
。これらの試薬を用いて、腫瘍形成に関与する特定のヒストン脱アセチル酵素を
同定し、抑制するために用いる方法を開発する必要もある。
【０００５】
発明の簡単な要約
この発明は、ヒストン脱アセチル酵素を核酸レベルで抑制するとともに、核酸
レベルでの発現を抑制することによって特定のヒストンの発現を抑制するための
方法および試薬を提供する。この発明によって、腫瘍形成に関与する特定のヒス
トン脱アセチル酵素の同定および特異的抑制を行うことができる。
レベルでの発現を抑制することによって特定のヒストンの発現を抑制するための
方法および試薬を提供する。この発明によって、腫瘍形成に関与する特定のヒス
トン脱アセチル酵素の同定および特異的抑制を行うことができる。
【０００６】
したがって第１の態様において、この発明は、ヒストン脱アセチル酵素の発現
を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この態様の１つの実施
形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HD
AC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。他の実施形態において、オリゴヌク
レオチドは2以上のヒストン脱アセチル酵素を抑制するか、オリゴヌクレオチド
は全てのヒストン脱アセチル酵素を抑制する。オリゴヌクレオチドは、好ましく
は、キメラオリゴヌクレオチドまたはハイブリッドオリゴヌクレオチドである。
を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この態様の１つの実施
形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HD
AC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。他の実施形態において、オリゴヌク
レオチドは2以上のヒストン脱アセチル酵素を抑制するか、オリゴヌクレオチド
は全てのヒストン脱アセチル酵素を抑制する。オリゴヌクレオチドは、好ましく
は、キメラオリゴヌクレオチドまたはハイブリッドオリゴヌクレオチドである。
【０００７】
この発明の第１の態様の１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチ
ドは、ヒストン脱アセチル酵素をコード化する核酸分子の転写を抑制する。核酸
分子はゲノムDNA（たとえば遺伝子）、cDNAまたはRNAでもよい。別の実施形態に
おいて、オリゴヌクレオチドはヒストン脱アセチル酵素の翻訳を抑制する。
ドは、ヒストン脱アセチル酵素をコード化する核酸分子の転写を抑制する。核酸
分子はゲノムDNA（たとえば遺伝子）、cDNAまたはRNAでもよい。別の実施形態に
おいて、オリゴヌクレオチドはヒストン脱アセチル酵素の翻訳を抑制する。
【０００８】
この発明の第１の態様の各種実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ホスホロチオネート（phosphorothionate）、ホスホロジチオネート（p
hosphorodithionnate）、アルキルホスホネート（alkylphosphonate）、アルキ
ルホソホノチオネート（alkylphosphonothionate）、ホスホトリエステル（phos
photriester）、ホスホラミデート（phosphoramidate）、シロキサン（siloxane
）、炭酸塩（carbonate）、カルボキシルメチルエステル（carboxylmethylester
）、アセトアミデート（acetamidate）、カルバメート（carbamate）、チオエー
テル（thioether）、架橋ホスホラミデート（bridgd phosphramidate）、架橋メ
チレン ホスホネート（bridged methylene phosphonate）、架橋ホスホロチオネ
ート（bridged phosphorothionate）、およびスルホン インターヌクレオチド結
合（sulfon internucleotide linkage）からなる群より選択される少なくとも1
のインターヌクレオチド結合を有する。またある実施形態においては、オリゴヌ
クレオチドは、リボヌクレオチドまたは2'-O-置換リボヌクレオチド領域および
デオキシリボヌクレオチド領域を有する。
チドは、ホスホロチオネート（phosphorothionate）、ホスホロジチオネート（p
hosphorodithionnate）、アルキルホスホネート（alkylphosphonate）、アルキ
ルホソホノチオネート（alkylphosphonothionate）、ホスホトリエステル（phos
photriester）、ホスホラミデート（phosphoramidate）、シロキサン（siloxane
）、炭酸塩（carbonate）、カルボキシルメチルエステル（carboxylmethylester
）、アセトアミデート（acetamidate）、カルバメート（carbamate）、チオエー
テル（thioether）、架橋ホスホラミデート（bridgd phosphramidate）、架橋メ
チレン ホスホネート（bridged methylene phosphonate）、架橋ホスホロチオネ
ート（bridged phosphorothionate）、およびスルホン インターヌクレオチド結
合（sulfon internucleotide linkage）からなる群より選択される少なくとも1
のインターヌクレオチド結合を有する。またある実施形態においては、オリゴヌ
クレオチドは、リボヌクレオチドまたは2'-O-置換リボヌクレオチド領域および
デオキシリボヌクレオチド領域を有する。
【０００９】
第２の態様において、この発明は、細胞中のヒストン脱アセチル酵素を抑制す
る方法であって、この発明の第１の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細
胞に接触させることを含む方法を提供する。この第２の態様の１つの好ましい実
施形態において、細胞増殖は接触細胞において抑制される。好ましい実施形態に
おいて、細胞は、ヒトを含む動物に存在し、腫瘍成長にある腫瘍細胞である。あ
る好ましい実施形態において、この発明の第２の態様の方法は、ヒストン脱アセ
チル酵素と相互作用し、ヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を低減させるヒスト
ン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子に細胞を接触させることをさらに含む。ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、好ましくは、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドと操作可能に結合されている。
る方法であって、この発明の第１の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細
胞に接触させることを含む方法を提供する。この第２の態様の１つの好ましい実
施形態において、細胞増殖は接触細胞において抑制される。好ましい実施形態に
おいて、細胞は、ヒトを含む動物に存在し、腫瘍成長にある腫瘍細胞である。あ
る好ましい実施形態において、この発明の第２の態様の方法は、ヒストン脱アセ
チル酵素と相互作用し、ヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を低減させるヒスト
ン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子に細胞を接触させることをさらに含む。ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、好ましくは、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドと操作可能に結合されている。
【００１０】
第３の態様において、この発明は、動物の腫瘍細胞成長を抑制する方法であっ
て、その身体に少なくとも1の腫瘍細胞を有する動物に、この発明の第１の態様
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を、製薬的に許容される担体と
ともに、有効治療期間投与することを含む方法を提供する。
て、その身体に少なくとも1の腫瘍細胞を有する動物に、この発明の第１の態様
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を、製薬的に許容される担体と
ともに、有効治療期間投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
この発明の第３の態様の１つの好ましい実施形態において、この方法は、ヒス
トン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素活性を低減させるヒストン脱アセチ
ル酵素タンパク質抑制因子の治療有効量を、製薬的に許容される担体とともに、
治療有効期間、動物に投与することをさらに含む。ヒストン脱アセチル酵素抑制
因子は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されて
いる。
トン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素活性を低減させるヒストン脱アセチ
ル酵素タンパク質抑制因子の治療有効量を、製薬的に許容される担体とともに、
治療有効期間、動物に投与することをさらに含む。ヒストン脱アセチル酵素抑制
因子は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されて
いる。
【００１２】
第４の態様において、この発明は、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法であって、そのヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の
細胞増殖の抑制が、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそ
のヒストン脱アセチル酵素を特定する方法を提供する。ある好ましい実施形態に
おいて、細胞は腫瘍細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。好ましい実
施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、
HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
チル酵素を特定する方法であって、そのヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の
細胞増殖の抑制が、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそ
のヒストン脱アセチル酵素を特定する方法を提供する。ある好ましい実施形態に
おいて、細胞は腫瘍細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。好ましい実
施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、
HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
【００１３】
第５の態様において、この発明は、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、この発明の第４の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル
酵素を候補化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の
低下が、増殖細胞の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン
脱アセチル酵素タンパク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供
する。ある好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それら
の酵素活性を低減する。
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、この発明の第４の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル
酵素を候補化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の
低下が、増殖細胞の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン
脱アセチル酵素タンパク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供
する。ある好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それら
の酵素活性を低減する。
【００１４】
第６の態様において、この発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法であって、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の分化
誘導が、細胞分化に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法を提供する。ある好ましい実施形態において、細胞は腫
瘍細胞である。好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、
HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
チル酵素を特定する方法であって、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の分化
誘導が、細胞分化に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法を提供する。ある好ましい実施形態において、細胞は腫
瘍細胞である。好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、
HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
【００１５】
第７の態様において、この発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、第６の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補
化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定するこ
とを含み、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞分化の
誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タン
パク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供する。ある好ましい
実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒス
トン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減す
る。
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、第６の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補
化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定するこ
とを含み、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞分化の
誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タン
パク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供する。ある好ましい
実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒス
トン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減す
る。
【００１６】
第８の態様において、この発明は、この発明の第５または第７の態様の方法に
よって特定されたヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を提供する。ヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、実質的に純粋であることが好ましい
。
よって特定されたヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を提供する。ヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、実質的に純粋であることが好ましい
。
【００１７】
第９の態様において、この発明は、細胞における細胞増殖を抑制する方法であ
って、ヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼを抑
制するアンチオリゴヌクレオチド、およびDNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子からなる群より選択される、少なくとも2の試薬を細胞に接触させ
ることを含む方法を提供する。1つの実施形態において、接触細胞の細胞成長の
抑制は、単一試薬に接触された細胞の細胞成長より大きい。ある実施形態におい
て、群より選択された各試薬は実質的に純粋である。好ましい実施形態において
、細胞は腫瘍細胞である。またさらに好ましい実施形態において、群より選択さ
れた試薬は、操作可能に結合されている。
って、ヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼを抑
制するアンチオリゴヌクレオチド、およびDNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子からなる群より選択される、少なくとも2の試薬を細胞に接触させ
ることを含む方法を提供する。1つの実施形態において、接触細胞の細胞成長の
抑制は、単一試薬に接触された細胞の細胞成長より大きい。ある実施形態におい
て、群より選択された各試薬は実質的に純粋である。好ましい実施形態において
、細胞は腫瘍細胞である。またさらに好ましい実施形態において、群より選択さ
れた試薬は、操作可能に結合されている。
【００１８】
この発明によれば、腫瘍形成に関与するヒストン脱アセチル酵素を特異的に阻
害することが判明した試薬は、腫瘍形成に罹患した患者の腫瘍細胞成長を抑制す
る治療剤として使用できる。例えば、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制する
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発生する任意の疾病症状（たとえば死）を
軽減するために、製薬的に許容可能な担体（例えば、生理学的無菌の生理食塩水
）とともに、任意の投与経路によって、腫瘍形成（neoplasia）または過形成（h
yperplasia）に罹患した患者に投与される。同様に、ヒストン脱アセチル酵素の
発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子治療発現ベクター（
たとえば複製欠損アデノウィルス）に組み込まれ、このようなベクターを有する
ファージ粒子は、製薬的に許容可能な担体によって、腫瘍形成または過形成成長
の細胞に直接送達される。製薬的に許容可能な担体およびその調合物は周知であ
り、一般に、たとえば、Remington's Pharmaceutical Science（第18版、A. Gen
naro編、Mack Publishing Co., ペンシルバニア州イーストン、1990）に記載さ
れている。
害することが判明した試薬は、腫瘍形成に罹患した患者の腫瘍細胞成長を抑制す
る治療剤として使用できる。例えば、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制する
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発生する任意の疾病症状（たとえば死）を
軽減するために、製薬的に許容可能な担体（例えば、生理学的無菌の生理食塩水
）とともに、任意の投与経路によって、腫瘍形成（neoplasia）または過形成（h
yperplasia）に罹患した患者に投与される。同様に、ヒストン脱アセチル酵素の
発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子治療発現ベクター（
たとえば複製欠損アデノウィルス）に組み込まれ、このようなベクターを有する
ファージ粒子は、製薬的に許容可能な担体によって、腫瘍形成または過形成成長
の細胞に直接送達される。製薬的に許容可能な担体およびその調合物は周知であ
り、一般に、たとえば、Remington's Pharmaceutical Science（第18版、A. Gen
naro編、Mack Publishing Co., ペンシルバニア州イーストン、1990）に記載さ
れている。
【００１９】
好ましい実施形態の詳細な説明
この発明は、ヒストン脱アセチル酵素を核酸レベルで抑制するとともに、核酸
レベルで特定のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するための方法および試薬
を提供する。ここで述べる試薬は核酸レベルでヒストン脱アセチル酵素を抑制す
る（すなわち転写と翻訳を抑制する）ものであり、この試薬は腫瘍形成に関与す
る特定のヒストン脱アセチル酵素を特定することができる。さらに、腫瘍形成症
状を治療および/または軽減するための治療組成物が、腫瘍形成に関与する特別
なヒストン脱アセチル酵素を特異的に阻害するこの発明の試薬を用いて開発され
る。
レベルで特定のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するための方法および試薬
を提供する。ここで述べる試薬は核酸レベルでヒストン脱アセチル酵素を抑制す
る（すなわち転写と翻訳を抑制する）ものであり、この試薬は腫瘍形成に関与す
る特定のヒストン脱アセチル酵素を特定することができる。さらに、腫瘍形成症
状を治療および/または軽減するための治療組成物が、腫瘍形成に関与する特別
なヒストン脱アセチル酵素を特異的に阻害するこの発明の試薬を用いて開発され
る。
【００２０】
この発明による試薬は、分析ツール、および遺伝子ツールを含む治療ツールと
して有用である。この発明は、副作用の発生をより少なくしながら、治療される
症状に合わせて操作および微調整できる方法および組成物も提供する。ここで引
用する特許および科学文献は、当業者が確実に入手可能な知識である。この明細
書で引用した、発行済み特許、出願、およびGenBankデータベース配列を含む参
考文献は、それぞれが具体的および個別に参照されているのと同程度に、この明
細書においてその一部として引用されている。
して有用である。この発明は、副作用の発生をより少なくしながら、治療される
症状に合わせて操作および微調整できる方法および組成物も提供する。ここで引
用する特許および科学文献は、当業者が確実に入手可能な知識である。この明細
書で引用した、発行済み特許、出願、およびGenBankデータベース配列を含む参
考文献は、それぞれが具体的および個別に参照されているのと同程度に、この明
細書においてその一部として引用されている。
【００２１】
第１の態様において、この発明は、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この態様の、ある実施形態におい
て、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC
-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは
2以上のヒストン脱アセチル酵素を阻害するか、オリゴヌクレオチドは全てのヒ
ストン脱アセチル酵素を阻害する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この態様の、ある実施形態におい
て、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC
-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは
2以上のヒストン脱アセチル酵素を阻害するか、オリゴヌクレオチドは全てのヒ
ストン脱アセチル酵素を阻害する。
【００２２】
この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオドは、RNAまたは２本鎖DNAのヒス
トン脱アセチル酵素をコードする領域に相補的である。この発明の目的では、「
オリゴヌクレオチド」という語は、2以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌ
クレオシド、または2'-O-置換リボヌクレオシド残基、またはその任意の組合せ
のポリマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは約8から約50
のヌクレオチド残基、最も好ましくは約12から約30のヌクレオチド残基を有する
。ヌクレオシド残基は、多く知られた任意のインターヌクレオシド結合によって
、相互に結合する。このようなインターヌクレオシド結合としては、これに限定
されるわけではないが、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル
ホスホネート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホラミ
デート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、
カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネー
ト、架橋ホスホロチオアート、スルホンインターヌクレオチド結合が挙げられる
。ある好ましい実施形態において、これらのインターヌクレオシド結合は、ホス
ホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオアートまたはホスホラミデー
ト結合、またはその組合せでもよい。オリゴヌクレオチドという語は、化学修飾
された塩基または糖を有し、および/または、これに限定されるわけではないが
親油基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む追加の置換基を有するポリ
マーを含む。この発明の目的では、「2-O-置換」という語は、ペントース部分の
2'位置を、1-6飽和または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基、あるいは2-
6炭素原子を有する-O-アリールまたはアリル基によって置換することを意味し、
ここでこのようなアルキル、アリールまたはアリル基は、置換されないか、また
はハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキ
シ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシまたはアミノ基と置換され；ある
いはこのような2'置換は、（リボヌクレオシドを生成する）水酸基、アミノまた
はハロ基を有するが、2'-H基は有していない。
トン脱アセチル酵素をコードする領域に相補的である。この発明の目的では、「
オリゴヌクレオチド」という語は、2以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌ
クレオシド、または2'-O-置換リボヌクレオシド残基、またはその任意の組合せ
のポリマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは約8から約50
のヌクレオチド残基、最も好ましくは約12から約30のヌクレオチド残基を有する
。ヌクレオシド残基は、多く知られた任意のインターヌクレオシド結合によって
、相互に結合する。このようなインターヌクレオシド結合としては、これに限定
されるわけではないが、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキル
ホスホネート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホラミ
デート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、
カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネー
ト、架橋ホスホロチオアート、スルホンインターヌクレオチド結合が挙げられる
。ある好ましい実施形態において、これらのインターヌクレオシド結合は、ホス
ホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオアートまたはホスホラミデー
ト結合、またはその組合せでもよい。オリゴヌクレオチドという語は、化学修飾
された塩基または糖を有し、および/または、これに限定されるわけではないが
親油基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む追加の置換基を有するポリ
マーを含む。この発明の目的では、「2-O-置換」という語は、ペントース部分の
2'位置を、1-6飽和または不飽和炭素原子を含む-O-低級アルキル基、あるいは2-
6炭素原子を有する-O-アリールまたはアリル基によって置換することを意味し、
ここでこのようなアルキル、アリールまたはアリル基は、置換されないか、また
はハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキ
シ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシまたはアミノ基と置換され；ある
いはこのような2'置換は、（リボヌクレオシドを生成する）水酸基、アミノまた
はハロ基を有するが、2'-H基は有していない。
【００２３】
この発明の目的では、「相補的」という用語は、生理学的条件下でゲノム領域
、遺伝子またはそのRNA転写体にハイブリダイズする能力を有することを意味す
る。そのようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間の塩基特異性水素結合
の結果であり、塩基スタッキングと同様に、他の様式の水素結合がハイブリダイ
ゼーションにつながるにもかかわらず、Watson-CrickまたはHoogsteen塩基対を
形成することが好ましい。特別の問題として、このようなハイブリダイゼーショ
ンは、転写または翻訳（または両方）のレベルにある、特定の遺伝子発現抑制の
観察から推測できる。
、遺伝子またはそのRNA転写体にハイブリダイズする能力を有することを意味す
る。そのようなハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間の塩基特異性水素結合
の結果であり、塩基スタッキングと同様に、他の様式の水素結合がハイブリダイ
ゼーションにつながるにもかかわらず、Watson-CrickまたはHoogsteen塩基対を
形成することが好ましい。特別の問題として、このようなハイブリダイゼーショ
ンは、転写または翻訳（または両方）のレベルにある、特定の遺伝子発現抑制の
観察から推測できる。
【００２４】
この発明のこの態様で利用される、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオ
チドには、キメラオリゴヌクレオチドとハイブリッドオリゴヌクレオチドが含ま
れる。
チドには、キメラオリゴヌクレオチドとハイブリッドオリゴヌクレオチドが含ま
れる。
【００２５】
この発明の目的では、「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種類以上のインタ
ーヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを指す。このようなキメラオリ
ゴヌクレオチドの好ましい実施形態の1つは、好ましくは約2から約12のヌクレオ
チドを含む、ホスホロチオアート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオアー
ト領域と、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオアート領域からな
るキメラオリゴヌクレオチドである（Pedersonら、米国特許第5,635,377号およ
び第5,366,878号を参照）。このようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジ
エステル、ホスホロチオアートまたはその組合せより選択された、少なくとも3
の連続したインターヌクレオシド結合を含むことが好ましい。
ーヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを指す。このようなキメラオリ
ゴヌクレオチドの好ましい実施形態の1つは、好ましくは約2から約12のヌクレオ
チドを含む、ホスホロチオアート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオアー
ト領域と、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオアート領域からな
るキメラオリゴヌクレオチドである（Pedersonら、米国特許第5,635,377号およ
び第5,366,878号を参照）。このようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジ
エステル、ホスホロチオアートまたはその組合せより選択された、少なくとも3
の連続したインターヌクレオシド結合を含むことが好ましい。
【００２６】
この発明の目的では、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」という語は、1種
類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリ
ッドオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態の1つは、リボヌクレオチドまたは
、好ましくは約2から約12の2'-O-置換リボヌクレオチド領域よりなる、2'-O-置
換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。このよう
なハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも3の連続するデオキシリボヌ
クレオシドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはそ
の組合せも含むことが好ましい（MetelevおよびAgrawal, 米国特許第5,652,355
号を参照）。
類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリ
ッドオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態の1つは、リボヌクレオチドまたは
、好ましくは約2から約12の2'-O-置換リボヌクレオチド領域よりなる、2'-O-置
換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。このよう
なハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも3の連続するデオキシリボヌ
クレオシドを含み、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、またはそ
の組合せも含むことが好ましい（MetelevおよびAgrawal, 米国特許第5,652,355
号を参照）。
【００２７】
この発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド
配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドがヒストン脱アセチル酵素の発現を
抑制する能力を保持している限り、変化することがある。これは、全てこの明細
書に詳細に記述されている、ヒストン脱アセチル酵素をコード化するmRNAの量の
定量化、ヒストン脱アセチル化酵素タンパク質の量の定量化、ヒストン脱アセチ
ル化酵素活性の定量化、またはin vitroまたはin vivoにおける細胞成長アッセ
イにおいて、ヒストン脱アセチル酵素が細胞成長を抑制する能力の定量化によっ
て、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるかどうかを試験するこ
とによってただちに決定される。
配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドがヒストン脱アセチル酵素の発現を
抑制する能力を保持している限り、変化することがある。これは、全てこの明細
書に詳細に記述されている、ヒストン脱アセチル酵素をコード化するmRNAの量の
定量化、ヒストン脱アセチル化酵素タンパク質の量の定量化、ヒストン脱アセチ
ル化酵素活性の定量化、またはin vitroまたはin vivoにおける細胞成長アッセ
イにおいて、ヒストン脱アセチル酵素が細胞成長を抑制する能力の定量化によっ
て、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるかどうかを試験するこ
とによってただちに決定される。
【００２８】
この発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは従来、H-ホスホネー
ト化学反応、ホスホラミデート化学反応、またはH-ホスホネート化学反応および
ホスホラミデート化学反応の組合せ（すなわち一部のサイクルにはH-ホスホネー
ト化学反応、その他のサイクルにはホスホラミデート化学反応）を含む周知の化
学的手法を用いて、適切な固体支持体上で合成される。適切な固体支持体は、制
御孔ガラス（CGP）などの、固体相オリゴヌクレオチド合成に使用されるいずれ
の標準固体支持体でもよい（たとえばPon, R. T., Methods in Molec. Biol. 20
：465-496, 1993）。
ト化学反応、ホスホラミデート化学反応、またはH-ホスホネート化学反応および
ホスホラミデート化学反応の組合せ（すなわち一部のサイクルにはH-ホスホネー
ト化学反応、その他のサイクルにはホスホラミデート化学反応）を含む周知の化
学的手法を用いて、適切な固体支持体上で合成される。適切な固体支持体は、制
御孔ガラス（CGP）などの、固体相オリゴヌクレオチド合成に使用されるいずれ
の標準固体支持体でもよい（たとえばPon, R. T., Methods in Molec. Biol. 20
：465-496, 1993）。
【００２９】
この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各種目的に有用である。
たとえば、実験細胞培養または動物系においてヒストン脱アセチル酵素の活性を
抑制し、そのようなヒストン脱アセチル酵素活性を抑制する効果を評価するため
に用いることによって、ヒストン脱アセチル酵素の生理学的機能の「プローブ」
として使用できる。これは、この発明によるヒストン脱アセチル酵素発現を抑制
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または動物に投与することと、表現
型効果を観察することによって行える。この用途において、この発明によるアン
チセンスオリゴヌクレオチドは、使用しやすいために従来の「遺伝子ノックアウ
ト」手法よりも好ましく、発生または分化の選択された段階でヒストン脱アセチ
ル酵素活性を抑制するのに使用できる。したがって、この発明による方法は、発
生の各種段階におけるヒストン脱アセチル化の役割を試験するためのプローブと
して役立つ。
たとえば、実験細胞培養または動物系においてヒストン脱アセチル酵素の活性を
抑制し、そのようなヒストン脱アセチル酵素活性を抑制する効果を評価するため
に用いることによって、ヒストン脱アセチル酵素の生理学的機能の「プローブ」
として使用できる。これは、この発明によるヒストン脱アセチル酵素発現を抑制
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または動物に投与することと、表現
型効果を観察することによって行える。この用途において、この発明によるアン
チセンスオリゴヌクレオチドは、使用しやすいために従来の「遺伝子ノックアウ
ト」手法よりも好ましく、発生または分化の選択された段階でヒストン脱アセチ
ル酵素活性を抑制するのに使用できる。したがって、この発明による方法は、発
生の各種段階におけるヒストン脱アセチル化の役割を試験するためのプローブと
して役立つ。
【００３０】
この発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒストン脱アセチル
酵素をコード化する核酸分子の転写、またはヒストン脱アセチル酵素をコード化
する核酸分子の翻訳のどちらかを抑制する。ヒストン脱アセチル酵素をコードす
る核酸はRNAまたは２本鎖DNAであり、ヒストン脱アセチル酵素ファミリーメンバ
ー遺伝子のコード配列はもちろんのこと、イントロン配列、5'および3'非翻訳領
域、イントロン-エキソン境界も例外なく含む。ヒト配列としては、Yangら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93(23)：12845-12850, 1996；Furukawaら、Cytogenet
. Cell. Genet. 73(1-2)：130-133, 1996；Yangら、J. Biol. Chem. 272(44)：2
8001-28007, 1997；Betzら、Genomics 52(5)：245-246, 1998；Tauntonら、Scie
nce 272(5260)：408-411, 1996；およびDangondら、Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 242(3)：648-652, 1998）を参照。
酵素をコード化する核酸分子の転写、またはヒストン脱アセチル酵素をコード化
する核酸分子の翻訳のどちらかを抑制する。ヒストン脱アセチル酵素をコードす
る核酸はRNAまたは２本鎖DNAであり、ヒストン脱アセチル酵素ファミリーメンバ
ー遺伝子のコード配列はもちろんのこと、イントロン配列、5'および3'非翻訳領
域、イントロン-エキソン境界も例外なく含む。ヒト配列としては、Yangら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93(23)：12845-12850, 1996；Furukawaら、Cytogenet
. Cell. Genet. 73(1-2)：130-133, 1996；Yangら、J. Biol. Chem. 272(44)：2
8001-28007, 1997；Betzら、Genomics 52(5)：245-246, 1998；Tauntonら、Scie
nce 272(5260)：408-411, 1996；およびDangondら、Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 242(3)：648-652, 1998）を参照。
【００３１】
この発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの特に好ましい非制限的な例は、
ヒストン脱アセチル酵素をコードするRNAまたは２本鎖DNAの領域（たとえばHDAC
-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-E）に対して
相補的である。この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-1、HD
AC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-Dおよび/またはHDAC-Eをコード
するRNAまたは２本鎖DNAの領域に対して相補的である。ヒトHDAC-1の配列は、Ge
nBank Accession No. U50079に見出される（配列番号24のアミノ酸配列；配列番
号25の核酸配列）。ヒトHDAC-2の配列は、GenBank Accession No. U31814に見出
される（配列番号26のアミノ酸配列；配列番号27の核酸配列）。ヒトHDAC-3の配
列は、GenBank Accession No. U75697に見出される（配列番号28のアミノ酸配列
；配列番号29の核酸配列）。ヒトHDAC-4（以前のヒトHDAC-A）の配列は、GenBan
k Accession No. AB006626に見出される（配列番号30のアミノ酸配列；配列番号
31の核酸配列）。ヒトHDAC-5（以前のヒトHDAC-B）の配列は、GenBank Accessio
n No. AB011172に見出される（配列番号32のアミノ酸配列；配列番号33の核酸配
列）。ヒトHDAC-Cの配列は、GenBank Accession No. AC004994に見出される（配
列番号34のアミノ酸配列；配列番号35の核酸配列）。ヒトHDAC-Dの配列は、GenB
ank Accession No. AC004466に見出される（配列番号36の核酸配列）。
ヒストン脱アセチル酵素をコードするRNAまたは２本鎖DNAの領域（たとえばHDAC
-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-E）に対して
相補的である。この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-1、HD
AC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-Dおよび/またはHDAC-Eをコード
するRNAまたは２本鎖DNAの領域に対して相補的である。ヒトHDAC-1の配列は、Ge
nBank Accession No. U50079に見出される（配列番号24のアミノ酸配列；配列番
号25の核酸配列）。ヒトHDAC-2の配列は、GenBank Accession No. U31814に見出
される（配列番号26のアミノ酸配列；配列番号27の核酸配列）。ヒトHDAC-3の配
列は、GenBank Accession No. U75697に見出される（配列番号28のアミノ酸配列
；配列番号29の核酸配列）。ヒトHDAC-4（以前のヒトHDAC-A）の配列は、GenBan
k Accession No. AB006626に見出される（配列番号30のアミノ酸配列；配列番号
31の核酸配列）。ヒトHDAC-5（以前のヒトHDAC-B）の配列は、GenBank Accessio
n No. AB011172に見出される（配列番号32のアミノ酸配列；配列番号33の核酸配
列）。ヒトHDAC-Cの配列は、GenBank Accession No. AC004994に見出される（配
列番号34のアミノ酸配列；配列番号35の核酸配列）。ヒトHDAC-Dの配列は、GenB
ank Accession No. AC004466に見出される（配列番号36の核酸配列）。
【００３２】
ヒト以外の多くの動物種におけるヒストン脱アセチル酵素コード配列も知られ
ている（たとえば、マウスヒストン脱アセチル酵素としては、GenBank Accessio
n No. AF006603、AF006602、およびAF074882を参照）。したがって、この発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト以外の動物からのヒストン脱アセチル
酵素をコードするRNAまたは二重鎖DNAの領域に対して相補的である。特に好まし
いオリゴヌクレオチドは、以下に配列番号1-18として示すヌクレオチド配列を含
む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。さらに別の特に好まし
いオリゴヌクレオチドは、以下に示すヌクレオチド配列の約15〜約26ヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列を有する。最も好ましくは、以下に示すオリゴヌクレオチ
ドがホスホロチオアート主鎖を有し、長さが20〜26のヌクレオチドであり、オリ
ゴヌクレオチドの5'末端にある終端4ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの3'末
端にある終端4ヌクレオチドのその糖残基にそれぞれ、2'-O-メチル基が結合して
いる。
ている（たとえば、マウスヒストン脱アセチル酵素としては、GenBank Accessio
n No. AF006603、AF006602、およびAF074882を参照）。したがって、この発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト以外の動物からのヒストン脱アセチル
酵素をコードするRNAまたは二重鎖DNAの領域に対して相補的である。特に好まし
いオリゴヌクレオチドは、以下に配列番号1-18として示すヌクレオチド配列を含
む約13〜約35ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。さらに別の特に好まし
いオリゴヌクレオチドは、以下に示すヌクレオチド配列の約15〜約26ヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列を有する。最も好ましくは、以下に示すオリゴヌクレオチ
ドがホスホロチオアート主鎖を有し、長さが20〜26のヌクレオチドであり、オリ
ゴヌクレオチドの5'末端にある終端4ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの3'末
端にある終端4ヌクレオチドのその糖残基にそれぞれ、2'-O-メチル基が結合して
いる。
【００３３】
ヒトHDAC-1に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2608）：
5'-GAA ACG TGA GGG ACT CAG CA-3' (配列番号1)。
【００３４】
ヒトHDAC-1およびヒトHDAC-2の両方に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（MG2610）は４つのオリゴヌクレオチドの25/25/25/25混合物である： 5'-CAG CAA ATT ATG GGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号2); 5'-CAG CAA GTT ATG AGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号3); 5'-CAG CAA ATT ATG AGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号4);および 5'-CAG CAA GTT ATG GGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号5)。
ド（MG2610）は４つのオリゴヌクレオチドの25/25/25/25混合物である： 5'-CAG CAA ATT ATG GGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号2); 5'-CAG CAA GTT ATG AGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号3); 5'-CAG CAA ATT ATG AGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号4);および 5'-CAG CAA GTT ATG GGT CAT GCG GAT TC-3'(配列番号5)。
【００３５】
ヒトHDAC-2に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド：
5'-TGC TGC TGC TGC TGC TGC CG-3'(MG2628；配列番号6);
5'-CCT CCT GCT GCT GCT GCT GC-3'(MG2633；配列番号7);
5'-GCT TCC TTT GGT ATC TGT TT-3'(MG2635；配列番号8); および
5'-CTC CTT GAC TGT ACG CCA TG-3'(MG2636；配列番号9)。
【００３６】
この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、周知の製薬的に許容され
る担体または希釈剤のいずれかを用いて随意に調合される（たとえばRemington'
s Pharmaceutical Sciences, 第18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co. ペ
ンシルバニア州イーストン、1990の製薬的に許容可能な調合物の調製を参照）。
る担体または希釈剤のいずれかを用いて随意に調合される（たとえばRemington'
s Pharmaceutical Sciences, 第18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co. ペ
ンシルバニア州イーストン、1990の製薬的に許容可能な調合物の調製を参照）。
【００３７】
第２の態様において、この発明は、細胞中のヒストン脱アセチル酵素を抑制す
る方法であって、細胞にヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンス
オリゴヌクレオチドを接触させることを含む方法を提供する。好ましくは、細胞
増殖は接触細胞において抑制される。したがって、この発明によるアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接触した細胞での細
胞増殖を抑制することにより、良性および悪性腫瘍を含むヒトの疾病に対する治
療手法において有用である。「細胞増殖を抑制する」という表現は、ヒストン脱
アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タ
ンパク質抑制因子（またはその組合せ）が、オリゴヌクレオチドまたはタンパク
質抑制因子と接触した細胞の成長を、接触していない細胞と比べて遅延させる能
力を意味する。細胞増殖のこのような評価は、Coulterセルカウンタ（Coulter、
フロリダ州マイアミ）または血球計を用いて、接触および非接触細胞をカウント
することによって行うことができる。細胞が固形成長している場合（たとえば固
形腫瘍または器官）、細胞増殖のこのような評価は、カリパスで成長を測定し、
接触細胞と非接触細胞の成長サイズを比較することによって行うことができる。
好ましくは、この用語は、非接触細胞の少なくとも50%である細胞増殖の遅延を
包含する。より好ましくは、この用語は、非接触細胞の100%である細胞増殖の遅
延を包含する（すなわち、接触細胞は数もサイズも増加しない）。この用語は、
さらに好ましくは、非接触細胞と比較した場合の、接触細胞の数またはサイズの
減少を包含する。したがって、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌク
レオチド、または接触細胞で細胞増殖を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子は、接触細胞において成長遅延、成長停止、プログラムされた細胞
死（すなわちアポトーシス）、または腫瘍細胞の死を誘導する。
る方法であって、細胞にヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンス
オリゴヌクレオチドを接触させることを含む方法を提供する。好ましくは、細胞
増殖は接触細胞において抑制される。したがって、この発明によるアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに接触した細胞での細
胞増殖を抑制することにより、良性および悪性腫瘍を含むヒトの疾病に対する治
療手法において有用である。「細胞増殖を抑制する」という表現は、ヒストン脱
アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タ
ンパク質抑制因子（またはその組合せ）が、オリゴヌクレオチドまたはタンパク
質抑制因子と接触した細胞の成長を、接触していない細胞と比べて遅延させる能
力を意味する。細胞増殖のこのような評価は、Coulterセルカウンタ（Coulter、
フロリダ州マイアミ）または血球計を用いて、接触および非接触細胞をカウント
することによって行うことができる。細胞が固形成長している場合（たとえば固
形腫瘍または器官）、細胞増殖のこのような評価は、カリパスで成長を測定し、
接触細胞と非接触細胞の成長サイズを比較することによって行うことができる。
好ましくは、この用語は、非接触細胞の少なくとも50%である細胞増殖の遅延を
包含する。より好ましくは、この用語は、非接触細胞の100%である細胞増殖の遅
延を包含する（すなわち、接触細胞は数もサイズも増加しない）。この用語は、
さらに好ましくは、非接触細胞と比較した場合の、接触細胞の数またはサイズの
減少を包含する。したがって、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌク
レオチド、または接触細胞で細胞増殖を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子は、接触細胞において成長遅延、成長停止、プログラムされた細胞
死（すなわちアポトーシス）、または腫瘍細胞の死を誘導する。
【００３８】
逆に、「細胞増殖を誘導する」という表現は、正常（すなわち非腫瘍）細胞に
おける細胞増殖について、ヒストン脱アセチル酵素の存在または酵素活性の要求
事項を表すのに用いる。それゆえ細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素の
過発現は、細胞増殖の増加につながることも、つながらないこともある；しかし
、細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素の抑制は、細胞増殖の抑制につな
がる。
おける細胞増殖について、ヒストン脱アセチル酵素の存在または酵素活性の要求
事項を表すのに用いる。それゆえ細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素の
過発現は、細胞増殖の増加につながることも、つながらないこともある；しかし
、細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素の抑制は、細胞増殖の抑制につな
がる。
【００３９】
「細胞分化を誘導する」という表現は、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンス
オリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子（または
その組合せ）が、非接触細胞と比較して、接触細胞において分化を誘導する能力
を表すのに用いる。したがって腫瘍細胞は、この発明のヒストン脱アセチル酵素
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子（または両方）に接触させた場合、分化を誘導され、結果として、接触細胞
よりも系統的にさらに進化した娘細胞を生成する。
オリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子（または
その組合せ）が、非接触細胞と比較して、接触細胞において分化を誘導する能力
を表すのに用いる。したがって腫瘍細胞は、この発明のヒストン脱アセチル酵素
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子（または両方）に接触させた場合、分化を誘導され、結果として、接触細胞
よりも系統的にさらに進化した娘細胞を生成する。
【００４０】
この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖抑制能力によって
、１群のa-同期成長細胞の同期化が可能となる。たとえば、この発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、in vitroで成長した１群の非腫瘍細胞を、細胞サイ
クルのG1またはG2期において停止させるのに用いる。このような同期化によって
たとえば、遺伝子および/または細胞サイクルのG1またはG2期の間に発現された
遺伝子産物が特定できる。培養細胞のこのような同期化は、トラスフェクション
の有効性が、トランスフェクションされる細胞の特定の細胞サイクル期に依存し
て変化するような新しいトランスフェクションのプロトコルにおいて、その有効
性を試験するのにも有用である。この発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを
使用すると、１群の細胞の同期化が可能となるため、トランスフェクションの有
効性の向上を検出するのに役立つ。
、１群のa-同期成長細胞の同期化が可能となる。たとえば、この発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、in vitroで成長した１群の非腫瘍細胞を、細胞サイ
クルのG1またはG2期において停止させるのに用いる。このような同期化によって
たとえば、遺伝子および/または細胞サイクルのG1またはG2期の間に発現された
遺伝子産物が特定できる。培養細胞のこのような同期化は、トラスフェクション
の有効性が、トランスフェクションされる細胞の特定の細胞サイクル期に依存し
て変化するような新しいトランスフェクションのプロトコルにおいて、その有効
性を試験するのにも有用である。この発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを
使用すると、１群の細胞の同期化が可能となるため、トランスフェクションの有
効性の向上を検出するのに役立つ。
【００４１】
この発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有用性は、この明細
書の別の箇所で詳しく述べられている。
書の別の箇所で詳しく述べられている。
【００４２】
また別の好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオ
リゴヌクレオチドと接触させた細胞は、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子とも接触させる。
リゴヌクレオチドと接触させた細胞は、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制
因子とも接触させる。
【００４３】
この明細書で使用されるように、「ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因
子」は、タンパク質レベルでヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、そのヒスト
ン脱アセチル酵素の活性を低減することのできる活性部分を示す。ヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子には、制限なく、トリコスタチンA、トリコスタ
チンB、トリコスタチンC、depudecin、トラポキシン、酪酸塩、スベロイルアニ
リド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228（藤沢薬品）、アセチルジナリン（el
-Beltaglら、Cancer Res. 53(13)：3008-3014, 1993）が含まれる。ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子は、ヒストン脱アセチル酵素の活性を、関係の
ないタンパク質の活性よりも大幅に低下させる分子である。好ましい実施形態に
おいて、このようなヒストン脱アセチル酵素の活性の低下は少なくとも5倍、さ
らに好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。別の実
施形態において、ヒストン脱アセチル酵素の活性は100倍低下する。ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少な
い酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減する。「全てのヒストン脱アセチ
ル酵素」とは、特定種の動物によるタンパク質の両方のヒストン脱アセチル酵素
ファミリーの全てのメンバーを意味し、制限なく、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HD
AC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eを含み、これらは全てこの明細書で
使用されるように、「関連タンパク質」と見なされる。たとえば、好ましいヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、HDAC-1およびHDAC-2と相互作用し、
それらを抑制するが、HDAC-3とは相互作用せず、抑制しない。さらに好ましくは
、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子はあるヒストン脱アセチル酵素（
たとえばHDAC-2）と相互作用し、その活性を低減するが、もう一方のヒストン脱
アセチル酵素（たとえばHDAC-1およびHDAC-3）とは相互作用せず、その活性を低
減しない。以下で述べるように、好ましいヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑
制因子は、腫瘍形成に関与するヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素
活性を低減するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子である。
子」は、タンパク質レベルでヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、そのヒスト
ン脱アセチル酵素の活性を低減することのできる活性部分を示す。ヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子には、制限なく、トリコスタチンA、トリコスタ
チンB、トリコスタチンC、depudecin、トラポキシン、酪酸塩、スベロイルアニ
リド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228（藤沢薬品）、アセチルジナリン（el
-Beltaglら、Cancer Res. 53(13)：3008-3014, 1993）が含まれる。ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子は、ヒストン脱アセチル酵素の活性を、関係の
ないタンパク質の活性よりも大幅に低下させる分子である。好ましい実施形態に
おいて、このようなヒストン脱アセチル酵素の活性の低下は少なくとも5倍、さ
らに好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。別の実
施形態において、ヒストン脱アセチル酵素の活性は100倍低下する。ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少な
い酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減する。「全てのヒストン脱アセチ
ル酵素」とは、特定種の動物によるタンパク質の両方のヒストン脱アセチル酵素
ファミリーの全てのメンバーを意味し、制限なく、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HD
AC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eを含み、これらは全てこの明細書で
使用されるように、「関連タンパク質」と見なされる。たとえば、好ましいヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、HDAC-1およびHDAC-2と相互作用し、
それらを抑制するが、HDAC-3とは相互作用せず、抑制しない。さらに好ましくは
、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子はあるヒストン脱アセチル酵素（
たとえばHDAC-2）と相互作用し、その活性を低減するが、もう一方のヒストン脱
アセチル酵素（たとえばHDAC-1およびHDAC-3）とは相互作用せず、その活性を低
減しない。以下で述べるように、好ましいヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑
制因子は、腫瘍形成に関与するヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素
活性を低減するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子である。
【００４４】
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドと操作可能に結合されていることが好ましい。上述したように、この発明に
よるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、周知の製薬的に許容可能な担体または
希釈剤を用いて随意に調合される。この調合物は、1また1以上またはそれ以上の
追加のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチド、および/また
は1またはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素タンパク質制御因子をさらに含み
、あるいは他の薬理学的な活性剤を含んでいてもよい。
チドと操作可能に結合されていることが好ましい。上述したように、この発明に
よるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、周知の製薬的に許容可能な担体または
希釈剤を用いて随意に調合される。この調合物は、1また1以上またはそれ以上の
追加のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチド、および/また
は1またはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素タンパク質制御因子をさらに含み
、あるいは他の薬理学的な活性剤を含んでいてもよい。
【００４５】
この発明の特に好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド
はヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子と操作可能に結合される。「操作
可能な結合」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒストン脱アセチル酵素を
コードする核酸の発現を抑制し、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が
ヒストン脱アセチル化酵素活性を抑制できるようにする、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドとヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の間の全ての結合を含
む。この発明の1以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上のヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子と操作可能に結合される。ある特定のヒストン
脱アセチル酵素（たとえばHDAC-2）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、同じヒストン脱アセチル酵素を標的とするヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子と操作可能に結合することが好ましい。好ましい操作可能な結合は
加水分解可能である。加水分解可能な結合は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子と間の共有結合であることが好ま
しい。このような共有結合は、エステラーゼおよび/またはアミダーゼによって
加水分解可能であることが好ましい。このような加水分解可能な結合は当分野で
既知である。リン酸エステルは特に好ましい。
はヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子と操作可能に結合される。「操作
可能な結合」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒストン脱アセチル酵素を
コードする核酸の発現を抑制し、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が
ヒストン脱アセチル化酵素活性を抑制できるようにする、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドとヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の間の全ての結合を含
む。この発明の1以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上のヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子と操作可能に結合される。ある特定のヒストン
脱アセチル酵素（たとえばHDAC-2）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、同じヒストン脱アセチル酵素を標的とするヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子と操作可能に結合することが好ましい。好ましい操作可能な結合は
加水分解可能である。加水分解可能な結合は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子と間の共有結合であることが好ま
しい。このような共有結合は、エステラーゼおよび/またはアミダーゼによって
加水分解可能であることが好ましい。このような加水分解可能な結合は当分野で
既知である。リン酸エステルは特に好ましい。
【００４６】
ある好ましい実施形態において、共有結合は、ヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子を一体的に統合できるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドと
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子とを直接結合してもよい。あるいは
、共有連鎖は拡張構造によってもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の両方を炭水化物、ペプチドまたは脂質
または糖脂質などの担体分子に結合することによって、アンチセンスオリゴヌク
レオチドをヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子に共有結合させても生成
できる。他の好ましい操作可能な結合としては、親油性分子に共有結合され、ひ
いてはリポソームに結合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストン
脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を含むリポソームの生成などの、親油性結合
が挙げられる。このような親油性分子は制限なく、ホスホチジルコリン、コレス
テロール、ホスファチジルエタノールアミン、シアリラックNAc-HDPEなどの合成
ネオ糖脂質を含む。ある好ましい実施形態において、操作可能な結合は物理結合
ではなく、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドがあるリポソームと結合し
、タンパク質作用因子が別のリポソームと結合している場合のように、体内に単
に同時に存在しているだけでもよい。
ク質抑制因子を一体的に統合できるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドと
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子とを直接結合してもよい。あるいは
、共有連鎖は拡張構造によってもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の両方を炭水化物、ペプチドまたは脂質
または糖脂質などの担体分子に結合することによって、アンチセンスオリゴヌク
レオチドをヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子に共有結合させても生成
できる。他の好ましい操作可能な結合としては、親油性分子に共有結合され、ひ
いてはリポソームに結合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストン
脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を含むリポソームの生成などの、親油性結合
が挙げられる。このような親油性分子は制限なく、ホスホチジルコリン、コレス
テロール、ホスファチジルエタノールアミン、シアリラックNAc-HDPEなどの合成
ネオ糖脂質を含む。ある好ましい実施形態において、操作可能な結合は物理結合
ではなく、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドがあるリポソームと結合し
、タンパク質作用因子が別のリポソームと結合している場合のように、体内に単
に同時に存在しているだけでもよい。
【００４７】
第３の態様において、この発明は、動物の腫瘍細胞成長を抑制する方法であっ
て、その身体に少なくとも1の腫瘍細胞を有する動物に、この発明の第１態様の
アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を、製薬的に許容される担体とと
もに、有効治療期間投与することを含む方法を提供する。動物は哺乳類、特に家
畜であることが好ましい。動物はヒトであることがさらに好ましい。
て、その身体に少なくとも1の腫瘍細胞を有する動物に、この発明の第１態様の
アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を、製薬的に許容される担体とと
もに、有効治療期間投与することを含む方法を提供する。動物は哺乳類、特に家
畜であることが好ましい。動物はヒトであることがさらに好ましい。
【００４８】
「腫瘍細胞」という用語は、異常な細胞成長を示す細胞を示す。好ましくは腫
瘍細胞の異常な細胞成長は、増加した細胞成長である。腫瘍細胞は過形成細胞、
in vitroにおいて成長の接触抑制の欠乏を示す細胞、in vivoにおいて転移が不
可能な良性腫瘍細胞、in vivoにおける転移が可能であり、除去試行後も再発の
恐れがある癌細胞である。「腫瘍形成」という用語は、腫瘍成長の発展につなが
る細胞増殖の誘導を示すのに用いられる。
瘍細胞の異常な細胞成長は、増加した細胞成長である。腫瘍細胞は過形成細胞、
in vitroにおいて成長の接触抑制の欠乏を示す細胞、in vivoにおいて転移が不
可能な良性腫瘍細胞、in vivoにおける転移が可能であり、除去試行後も再発の
恐れがある癌細胞である。「腫瘍形成」という用語は、腫瘍成長の発展につなが
る細胞増殖の誘導を示すのに用いられる。
【００４９】
「治療有効量」および「有効治療期間」という用語は、腫瘍細胞成長を低減す
るのに有効な用量、期間での既知の治療を表すのに用いられる。好ましくは、そ
のような投与は非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、または直腸内である
。全身的に投与する場合、治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血
中濃度が約0.1μM〜約10μMに達するように、十分な量を投与することが好まし
い。局所投与の場合、これよりもはるかに低濃度で十分であり、はるかに高濃度
でも許容される。当業者は、より低い有効濃度のヒストン脱アセチル酵素抑制因
子で生じる、このような治療効果は、組織、器官、あるいはこの発明に従って治
療される特定の動物または患者によって大きく変わることを承知しているはずで
ある。
るのに有効な用量、期間での既知の治療を表すのに用いられる。好ましくは、そ
のような投与は非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、または直腸内である
。全身的に投与する場合、治療組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血
中濃度が約0.1μM〜約10μMに達するように、十分な量を投与することが好まし
い。局所投与の場合、これよりもはるかに低濃度で十分であり、はるかに高濃度
でも許容される。当業者は、より低い有効濃度のヒストン脱アセチル酵素抑制因
子で生じる、このような治療効果は、組織、器官、あるいはこの発明に従って治
療される特定の動物または患者によって大きく変わることを承知しているはずで
ある。
【００５０】
好ましい実施形態において、この発明の治療組成物は、約0.01μM〜約20μMの
アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度を達成するために十分な用量で組織
に投与される。特に好ましい実施形態において、治療組成物は、約0.05μM〜約1
5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度を達成するために十分な用量
で投与される。さらに好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの血中濃度は、約0.1μM〜約10μMである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度を達成するために十分な用量で組織
に投与される。特に好ましい実施形態において、治療組成物は、約0.05μM〜約1
5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血中濃度を達成するために十分な用量
で投与される。さらに好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの血中濃度は、約0.1μM〜約10μMである。
【００５１】
局所投与の場合、これよりもはるかに低い濃度が治療的に有効である。好まし
くはアンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴ
ヌクレオチド約0.1g〜約200mgの範囲となる。より好ましい実施形態において、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴヌク
レオチド約1mg〜約20mgの範囲となる。さらに好ましい実施形態において、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴヌクレオ
チド約2mg〜約10mgの範囲となる。特に好ましい実施形態において、ヒストン脱
アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量は、1日に体重1kg当
たり、オリゴヌクレオチド約0.5mgである。
くはアンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴ
ヌクレオチド約0.1g〜約200mgの範囲となる。より好ましい実施形態において、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴヌク
レオチド約1mg〜約20mgの範囲となる。さらに好ましい実施形態において、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの総用量は、1日に体重1kg当たり、オリゴヌクレオ
チド約2mg〜約10mgの範囲となる。特に好ましい実施形態において、ヒストン脱
アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量は、1日に体重1kg当
たり、オリゴヌクレオチド約0.5mgである。
【００５２】
この発明の第３の態様の１つの好ましい実施形態において、この方法は、ヒス
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の治療有効量を、製薬的に許容される担
体とともに、治療有効期間、動物に投与することをさらに含む。ヒストン脱アセ
チル酵素抑制因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されて
いることが好ましい。ヒストン脱アセチル酵素抑制因子とヒストン脱アセチル酵
素アンチセンスオリゴヌクレオチドとの操作可能な結合の方法は、上述されてい
る。
トン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の治療有効量を、製薬的に許容される担
体とともに、治療有効期間、動物に投与することをさらに含む。ヒストン脱アセ
チル酵素抑制因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されて
いることが好ましい。ヒストン脱アセチル酵素抑制因子とヒストン脱アセチル酵
素アンチセンスオリゴヌクレオチドとの操作可能な結合の方法は、上述されてい
る。
【００５３】
この発明のヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を含有する治療組成物
は、約0.01μM〜約10μMのヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の血中濃
度を達成するために十分な用量で全身的に投与される。特に好ましい実施形態に
おいて、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストン脱アセチル酵素タンパク
質抑制因子の血中濃度を達成するように、十分な用量で投与される。さらに好ま
しい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の血中濃度
は約0.1μM〜約7μMである。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度で有効
である。好ましくは、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総用量は1
日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約5mgの範囲となる。さらに
好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総用
量は1日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約4mgの範囲となる。最
も好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総
用量は1日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約1mgの範囲となる。
特に好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の
治療有効相乗量（アンチセンスオリゴヌクレオチドとともに投与した場合）は、
1日に体重1kg当たり0.1mgである。
は、約0.01μM〜約10μMのヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の血中濃
度を達成するために十分な用量で全身的に投与される。特に好ましい実施形態に
おいて、治療組成物は、約0.05μM〜約10μMのヒストン脱アセチル酵素タンパク
質抑制因子の血中濃度を達成するように、十分な用量で投与される。さらに好ま
しい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の血中濃度
は約0.1μM〜約7μMである。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度で有効
である。好ましくは、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総用量は1
日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.01mg〜約5mgの範囲となる。さらに
好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総用
量は1日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約4mgの範囲となる。最
も好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の総
用量は1日に体重1kg当たり、タンパク質作用因子約0.1mg〜約1mgの範囲となる。
特に好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の
治療有効相乗量（アンチセンスオリゴヌクレオチドとともに投与した場合）は、
1日に体重1kg当たり0.1mgである。
【００５４】
この発明のこの態様によって抑制効果が向上するため、所与の抑制効果を得る
ために必要な核酸レベル抑制因子（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）
およびタンパク質レベル抑制因子（すなわちヒストン脱アセチル酵素タンパク質
抑制因子）のどちらかまたは両方の治療有効濃度が、どちらかを個別に使用した
場合に必要な濃度よりも低下する。
ために必要な核酸レベル抑制因子（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）
およびタンパク質レベル抑制因子（すなわちヒストン脱アセチル酵素タンパク質
抑制因子）のどちらかまたは両方の治療有効濃度が、どちらかを個別に使用した
場合に必要な濃度よりも低下する。
【００５５】
さらに当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル
酵素タンパク質抑制因子のどちらかの治療有効相乗量は、他の成分の量を微調整
または変更することによって増減されることを認識するであろう。したがってこ
の発明は、所与の動物種または特定の患者に特異的な特定の緊急事態にあわせて
、投与／治療を調製する方法を提供する。治療有効範囲はたとえば、比較的少な
い量からの開始や、抑制の同時評価によるステップ増加によって経験的に、比較
的容易に決定される。
酵素タンパク質抑制因子のどちらかの治療有効相乗量は、他の成分の量を微調整
または変更することによって増減されることを認識するであろう。したがってこ
の発明は、所与の動物種または特定の患者に特異的な特定の緊急事態にあわせて
、投与／治療を調製する方法を提供する。治療有効範囲はたとえば、比較的少な
い量からの開始や、抑制の同時評価によるステップ増加によって経験的に、比較
的容易に決定される。
【００５６】
第４の態様において、この発明は、特定のヒストン脱アセチル酵素の、腫瘍細
胞の増殖を含む細胞増殖における役割を調査する方法を提供する。この方法では
、対象とする細胞種は、この発明による第５の態様で述べるように、あるヒスト
ン脱アセチル酵素の発現を抑制する量のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触
させると、細胞内のそのヒストン脱アセチル酵素の発現が抑制される。そのヒス
トン脱アセチル酵素の発現が抑制された接触細胞は、細胞増殖の抑制も示し、し
たがってそのヒストン脱アセチル酵素は細胞増殖の誘導に関与している。このシ
ナリオでは、接触細胞が腫瘍細胞であり、接触腫瘍細胞が細胞増殖の抑制を示す
場合、発現を抑制されたヒストン脱アセチル酵素は、腫瘍形成に関与するヒスト
ン脱アセチル酵素である。ヒストン脱アセチル酵素は、好ましくはHDAC-1、HDAC
-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
胞の増殖を含む細胞増殖における役割を調査する方法を提供する。この方法では
、対象とする細胞種は、この発明による第５の態様で述べるように、あるヒスト
ン脱アセチル酵素の発現を抑制する量のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触
させると、細胞内のそのヒストン脱アセチル酵素の発現が抑制される。そのヒス
トン脱アセチル酵素の発現が抑制された接触細胞は、細胞増殖の抑制も示し、し
たがってそのヒストン脱アセチル酵素は細胞増殖の誘導に関与している。このシ
ナリオでは、接触細胞が腫瘍細胞であり、接触腫瘍細胞が細胞増殖の抑制を示す
場合、発現を抑制されたヒストン脱アセチル酵素は、腫瘍形成に関与するヒスト
ン脱アセチル酵素である。ヒストン脱アセチル酵素は、好ましくはHDAC-1、HDAC
-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
【００５７】
したがって、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定するこ
とによって、細胞増殖を抑制し、分化を誘導するためには、その特定のヒストン
脱アセチル酵素のみをアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的とする必要がある
。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらに低い治療有効量によっ
て、細胞増殖を効率的に抑制することができる。さらに、全てのヒストン脱アセ
チル酵素を阻害することの望ましくない副作用は、細胞増殖の誘導に関与する1
（以上）のヒストン脱アセチル酵素を特異的に抑制することによって防止される
。
とによって、細胞増殖を抑制し、分化を誘導するためには、その特定のヒストン
脱アセチル酵素のみをアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的とする必要がある
。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらに低い治療有効量によっ
て、細胞増殖を効率的に抑制することができる。さらに、全てのヒストン脱アセ
チル酵素を阻害することの望ましくない副作用は、細胞増殖の誘導に関与する1
（以上）のヒストン脱アセチル酵素を特異的に抑制することによって防止される
。
【００５８】
細胞増殖に関与するそのようなヒストン脱アセチル酵素が、この発明の第１態
様のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて特定されば、次には、細胞増殖の
誘導に関与しない他のヒストン脱アセチル酵を阻害することなく、細胞増殖の誘
導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特異的に抑制するヒストン脱アセチル酵
素タンパク質抑制因子が導かれる。したがって、第５の態様において、この発明
は、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法を提供する。この方法は、細胞増
殖の誘導に関与すると特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補化合物に接触さ
せ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定することを含む。接触
されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下は、候補化合物を細胞増殖の誘
導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子として特定する。
様のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて特定されば、次には、細胞増殖の
誘導に関与しない他のヒストン脱アセチル酵を阻害することなく、細胞増殖の誘
導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特異的に抑制するヒストン脱アセチル酵
素タンパク質抑制因子が導かれる。したがって、第５の態様において、この発明
は、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法を提供する。この方法は、細胞増
殖の誘導に関与すると特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補化合物に接触さ
せ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定することを含む。接触
されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下は、候補化合物を細胞増殖の誘
導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子として特定する。
【００５９】
ヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の測定は、既知の方法を用いて行える。た
とえば、Yoshidaら（J. Biol. Chem. 265：17174-17179, 1990）は、トリコスタ
チンA処理細胞におけるアセチル化ヒストンの検出によるヒストン脱アセチル酵
素の酵素活性の評価について述べている。Tauntonら（Science 272：408-411, 1
996）は同様に、内在性および組換えHDAC-1を用いて、ヒストン脱アセチル酵素
の酵素活性を測定する方法について述べている。Yoshidaら（J. Biol. Chem. 26
5：17174-17179, 1990）とTauntonら（Science 272：408-411, 1996）はどちら
も、この明細書の一部として引用される。
とえば、Yoshidaら（J. Biol. Chem. 265：17174-17179, 1990）は、トリコスタ
チンA処理細胞におけるアセチル化ヒストンの検出によるヒストン脱アセチル酵
素の酵素活性の評価について述べている。Tauntonら（Science 272：408-411, 1
996）は同様に、内在性および組換えHDAC-1を用いて、ヒストン脱アセチル酵素
の酵素活性を測定する方法について述べている。Yoshidaら（J. Biol. Chem. 26
5：17174-17179, 1990）とTauntonら（Science 272：408-411, 1996）はどちら
も、この明細書の一部として引用される。
【００６０】
細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセ
チル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素より少ない酵素
と相互作用し、それらの酵素活性を低減するヒストン脱アセチル酵素タンパク質
抑制因子であることが好ましい。
チル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒストン脱アセチル酵素より少ない酵素
と相互作用し、それらの酵素活性を低減するヒストン脱アセチル酵素タンパク質
抑制因子であることが好ましい。
【００６１】
第６の態様において、この発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法であって、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の分化
誘導が、細胞分化に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法を提供する。細胞は腫瘍細胞であることが好ましい。好
ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、
HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
チル酵素を特定する方法であって、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の分化
誘導が、細胞分化に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱アセ
チル酵素を特定する方法を提供する。細胞は腫瘍細胞であることが好ましい。好
ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素はHDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、
HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-DまたはHDAC-Eである。
【００６２】
第７の態様において、この発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセ
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、第６の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補
化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定するこ
とを含み、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞分化の
誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タン
パク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供する。ある好ましい
実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒス
トン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減す
る。
チル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法
であって、第６の態様の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補
化合物に接触させ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定するこ
とを含み、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞分化の
誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タン
パク質抑制因子としてその候補化合物を特定する方法を提供する。ある好ましい
実施形態において、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、全てのヒス
トン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減す
る。
【００６３】
第８の態様において、この発明は、第５または第７の態様の方法によって特定
されたヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を提供する。ヒストン脱アセ
チル酵素タンパク質抑制因子は、実質的に純粋であることが好ましい。
されたヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を提供する。ヒストン脱アセ
チル酵素タンパク質抑制因子は、実質的に純粋であることが好ましい。
【００６４】
実質的に精製されたタンパク質は、制限なく、組換えタンパク質の発現、親和
性クロマトグラフィー、抗体ベース親和性生成、高速液体クロマトグラフィー（
HPLC；例えば、Fisher（1980）Laboratory Techniques in BiochemistryおよびM
olecular Biology. WorkおよびBurdon（編）Elsevierを参照）を含む任意の標準
方法によって得られる。好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は少なくと
も80重量%の純度であり、他のタンパク質または天然型有機分子を含まないとい
う点で純粋である。さらに好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は少なく
とも90重量%の純度である。最も好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は
少なくとも95重量%の純度である。
性クロマトグラフィー、抗体ベース親和性生成、高速液体クロマトグラフィー（
HPLC；例えば、Fisher（1980）Laboratory Techniques in BiochemistryおよびM
olecular Biology. WorkおよびBurdon（編）Elsevierを参照）を含む任意の標準
方法によって得られる。好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は少なくと
も80重量%の純度であり、他のタンパク質または天然型有機分子を含まないとい
う点で純粋である。さらに好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は少なく
とも90重量%の純度である。最も好ましくは、実質的に精製されたタンパク質は
少なくとも95重量%の純度である。
【００６５】
第９の態様において、この発明は、細胞における細胞増殖を抑制する方法であ
って、ヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼを抑
制するアンチオリゴヌクレオチド、およびDNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子からなる群より選択される、少なくとも2の試薬を細胞に接触させ
ることを含む方法を提供する。1つの実施形態において、接触細胞の細胞成長の
抑制は、単一試薬に接触された細胞の細胞成長より大きい。ある実施形態におい
て、群より選択された各試薬は実質的に純粋である。好ましい実施形態において
、細胞は腫瘍細胞である。またさらに好ましい実施形態において、群より選択さ
れた試薬は、操作可能に結合されている。
って、ヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼを抑
制するアンチオリゴヌクレオチド、およびDNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子からなる群より選択される、少なくとも2の試薬を細胞に接触させ
ることを含む方法を提供する。1つの実施形態において、接触細胞の細胞成長の
抑制は、単一試薬に接触された細胞の細胞成長より大きい。ある実施形態におい
て、群より選択された各試薬は実質的に純粋である。好ましい実施形態において
、細胞は腫瘍細胞である。またさらに好ましい実施形態において、群より選択さ
れた試薬は、操作可能に結合されている。
【００６６】
DNAメチルトランスフェラーゼを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは
、Szylおよびvon Hofe、米国特許第5,578,716号に記載されており、その内容全
体はこの明細書の一部として引用される。DNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子としては、例外なく、5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ-dC）
、5-フルオロ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン（5-アザ-C）または5,6-
ジヒドロ-5-アザ-シチジンが挙げられる。
、Szylおよびvon Hofe、米国特許第5,578,716号に記載されており、その内容全
体はこの明細書の一部として引用される。DNAメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質抑制因子としては、例外なく、5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ-dC）
、5-フルオロ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン（5-アザ-C）または5,6-
ジヒドロ-5-アザ-シチジンが挙げられる。
【００６７】
以下の例は、この発明の好ましい実施形態をさらに示すためのものであり、発
明を制限するものではない。当業者は、決まった実験方法だけを用いて、この明
細書に記載された特定の物質および手順と同等の物質および手順を数多く認識し
、あるいは確認することができるであろう。このような同等の物質および手順は
この発明の範囲内と見なされ、特許請求の範囲で扱われている。
明を制限するものではない。当業者は、決まった実験方法だけを用いて、この明
細書に記載された特定の物質および手順と同等の物質および手順を数多く認識し
、あるいは確認することができるであろう。このような同等の物質および手順は
この発明の範囲内と見なされ、特許請求の範囲で扱われている。
【００６８】
実施例１ アンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
最も効率よく特定のヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを特定するために、HDAC-1についてはGenBank Accession No. U50079
、HDAC-2についてはGenBank Accession No. U31814で提供される配列に基づいて
、多数のオリゴヌクレオチドを作成した。スクリーニングを行ったオリゴヌクレ
オチドの一部は、1998年10月19日に提出されたBestermanら、米国特許出願第60/
104,804号の表2および表3に記載されており、その開示全体はこの明細書の一部
として引用される。
クレオチドを特定するために、HDAC-1についてはGenBank Accession No. U50079
、HDAC-2についてはGenBank Accession No. U31814で提供される配列に基づいて
、多数のオリゴヌクレオチドを作成した。スクリーニングを行ったオリゴヌクレ
オチドの一部は、1998年10月19日に提出されたBestermanら、米国特許出願第60/
104,804号の表2および表3に記載されており、その開示全体はこの明細書の一部
として引用される。
【００６９】
加えて、HDAC-1とHDAC-2の両方に対して相補的なオリゴヌクレオチドを作成し
た。
た。
【００７０】
これらのオリゴヌクレオチドが標的のヒストン脱アセチル酵素を抑制する能力
をスクリーニングするために、ノーザンブロッティング分析を最初に実施した。
このためにT24ヒト膀胱癌細胞（American Type Culture Collection（ATCC）よ
り購入可、ヴァーニジア州マナッサス）を指示された条件で培養した。オリゴヌ
クレオチドを添加する前に、細胞をPBS（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した。次に
、6.25μg/mlのリポフェクチン トランスフェクション試薬（Gibco-BRL、オンタ
リオ州ミシサーガ）を無血清OPTIMEN培地（GIBCO/BRL）に加え、次にこれを細胞
に添加した。スクリーニングされるオリゴヌクレオチドを細胞の各種ウェルに添
加した（すなわち、1細胞ウェル当たり1オリゴヌクレオチド）。1細胞ウェル当
たりに同じ濃度のオリゴヌクレオチド（たとえば50nM）を用いた。細胞は細胞培
養インキュベータ内で、37℃にて4時間、リポフェクチンとオリゴヌクレオチド
とともにインキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、全血清含有培地に戻し
た。24時間後、細胞を収集し、ノーザンブロッティング分析によってHDAC mRNA
レベルを決定した。
をスクリーニングするために、ノーザンブロッティング分析を最初に実施した。
このためにT24ヒト膀胱癌細胞（American Type Culture Collection（ATCC）よ
り購入可、ヴァーニジア州マナッサス）を指示された条件で培養した。オリゴヌ
クレオチドを添加する前に、細胞をPBS（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した。次に
、6.25μg/mlのリポフェクチン トランスフェクション試薬（Gibco-BRL、オンタ
リオ州ミシサーガ）を無血清OPTIMEN培地（GIBCO/BRL）に加え、次にこれを細胞
に添加した。スクリーニングされるオリゴヌクレオチドを細胞の各種ウェルに添
加した（すなわち、1細胞ウェル当たり1オリゴヌクレオチド）。1細胞ウェル当
たりに同じ濃度のオリゴヌクレオチド（たとえば50nM）を用いた。細胞は細胞培
養インキュベータ内で、37℃にて4時間、リポフェクチンとオリゴヌクレオチド
とともにインキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、全血清含有培地に戻し
た。24時間後、細胞を収集し、ノーザンブロッティング分析によってHDAC mRNA
レベルを決定した。
【００７１】
ノーザンブロットによってmRNAレベルを決定するために、グアニジニウムイソ
チオシアネート標準手順（たとえばAusubelら、Current Protocol in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. 1994）によって、細胞からトー
タルRNAを調製した。ただし細胞性DNAの汚染からRNAを精製するために4℃、2M L
iCl中で一晩沈殿させるステップを追加した。ノーザンブロッティング分析は、
標準手順に従って実施した。HDAC-1とHDAC-2のブローブは、それぞれの既知配列
（たとえばそれぞれ、GenBank Accession No. U50079およびU31814）からのPCR
増幅によって生成された全長cDNAクローンであった。これらのプローブは32P-AT
Pによって放射線標識した。ノーザンブロットはAlpha Imager（Alpha Innovotec
h）を用いてスキャンおよび定量した。
チオシアネート標準手順（たとえばAusubelら、Current Protocol in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. 1994）によって、細胞からトー
タルRNAを調製した。ただし細胞性DNAの汚染からRNAを精製するために4℃、2M L
iCl中で一晩沈殿させるステップを追加した。ノーザンブロッティング分析は、
標準手順に従って実施した。HDAC-1とHDAC-2のブローブは、それぞれの既知配列
（たとえばそれぞれ、GenBank Accession No. U50079およびU31814）からのPCR
増幅によって生成された全長cDNAクローンであった。これらのプローブは32P-AT
Pによって放射線標識した。ノーザンブロットはAlpha Imager（Alpha Innovotec
h）を用いてスキャンおよび定量した。
【００７２】
標的のヒストン脱アセチル酵素のmRNA発現を低減する能力を示した（すなわち
ヒストン脱アセチル酵素mRNAの転写を抑制することのできる）オリゴヌクレオチ
ドは次に、標的のヒストン脱アセチル酵素タンパク質の発現を抑制する能力につ
いてスクリーニングした。これを行うために、上で述べたようにリポフェクチン
を用いて、T24細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。24時間
後、標準手順に従って、細胞を溶解した。全細胞抽出物（50μg）を7〜15%勾配S
DS/PAGEで分解し、PVDF膜（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）に移し
、ウサギポリクローナルHDAC-1およびHDAC-2特異抗体（1:500、Santa Cruz Biot
ech., カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いた。検出は、第2抗ウサギIgG-H
Rペルオキシダーゼ抗体と高度化学発光検出キット（Amersham）を製造者の指示
に従って用いて行った。
ヒストン脱アセチル酵素mRNAの転写を抑制することのできる）オリゴヌクレオチ
ドは次に、標的のヒストン脱アセチル酵素タンパク質の発現を抑制する能力につ
いてスクリーニングした。これを行うために、上で述べたようにリポフェクチン
を用いて、T24細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。24時間
後、標準手順に従って、細胞を溶解した。全細胞抽出物（50μg）を7〜15%勾配S
DS/PAGEで分解し、PVDF膜（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）に移し
、ウサギポリクローナルHDAC-1およびHDAC-2特異抗体（1:500、Santa Cruz Biot
ech., カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いた。検出は、第2抗ウサギIgG-H
Rペルオキシダーゼ抗体と高度化学発光検出キット（Amersham）を製造者の指示
に従って用いて行った。
【００７３】
我々の結果に基づいて、mRNAおよびタンパク質発現ブロッティング分析の両方
によって判定されたように、以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的ヒ
ストン脱アセチル酵素発現抑制に最も有効であることを確認した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは以下のとおりである： HDAC-1の抑制の場合、オリゴヌクレオチドNo.MG2608は以下の配列である： 5'-GAA ACG TGA GGG ACT CAG CA-3' (配列番号10)。
によって判定されたように、以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的ヒ
ストン脱アセチル酵素発現抑制に最も有効であることを確認した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは以下のとおりである： HDAC-1の抑制の場合、オリゴヌクレオチドNo.MG2608は以下の配列である： 5'-GAA ACG TGA GGG ACT CAG CA-3' (配列番号10)。
【００７４】
HDAC-1およびヒトHDAC-2の両方の抑制の場合、オリゴヌクレオチドNo. MG2610
は以下の配列を持つ4つのオリゴヌクレオチドの25/25/25/25混合物である： 5'-CAG CAA ATT ATG GGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号11); 5'-CAG CAA GTT ATG AGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号12); 5'-CAG CAA ATT ATG AGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号13); 5'-CAG CAA GTT ATG GGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号14)。
は以下の配列を持つ4つのオリゴヌクレオチドの25/25/25/25混合物である： 5'-CAG CAA ATT ATG GGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号11); 5'-CAG CAA GTT ATG AGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号12); 5'-CAG CAA ATT ATG AGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号13); 5'-CAG CAA GTT ATG GGT CAT GCG GAU UC-3' (配列番号14)。
【００７５】
HDAC-2の抑制の場合、表１のアンチセンスオリゴヌクレオチドが最も有効であ
ることを示している。
ることを示している。
【００７６】
【表１】
【００７７】
第2世代ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を
評価するために、HDAC-1（MG2608）およびHDAC-1/2（MG2610）のミスマッチ対照
オリゴヌクレオチドを作成した。これらのミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは
、主に4つの5'および3'ヌクレオチドの塩基を置換することによって作成される
。ここでは標的ヒストン脱アセチル酵素をコードする核酸と最も高い親和性が生
じる。 HDAC-1ミスマッチ対照（MG2609）は以下の配列を有する： 5'-CAA UCG TCA GAG ACT CCG AA-3'（配列番号19）。 HDAC-1/2ミスマッチ対照（MG2637）は、以下の配列を有する４つのオリゴヌクレ
オチドの225/25/25/25混合物である： 5'-AAG GAA GTC ATG ATT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号20); 5'-AAG GAA ATC ATG GAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号21); 5'-AAG GAA GTC ATG GAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号22); 5'-AAG GAA ATC ATG AAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号23)。
評価するために、HDAC-1（MG2608）およびHDAC-1/2（MG2610）のミスマッチ対照
オリゴヌクレオチドを作成した。これらのミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは
、主に4つの5'および3'ヌクレオチドの塩基を置換することによって作成される
。ここでは標的ヒストン脱アセチル酵素をコードする核酸と最も高い親和性が生
じる。 HDAC-1ミスマッチ対照（MG2609）は以下の配列を有する： 5'-CAA UCG TCA GAG ACT CCG AA-3'（配列番号19）。 HDAC-1/2ミスマッチ対照（MG2637）は、以下の配列を有する４つのオリゴヌクレ
オチドの225/25/25/25混合物である： 5'-AAG GAA GTC ATG ATT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号20); 5'-AAG GAA ATC ATG GAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号21); 5'-AAG GAA GTC ATG GAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号22); 5'-AAG GAA ATC ATG AAT GAT GCC CAU UG-3' (配列番号23)。
【００７８】
これらのオリゴヌクレオチド（すなわち配列番号10-23を有する）は、第2世代
オリゴヌクレオチドである（すなわち4x4ハイブリッド）。すなわち配列番号10-
23を有するオリゴヌクレオチドは、以下のように化学的に修飾される；Aは2'-デ
オキシリボアデノシンに相当する；Cはデオキシリボリボシチジンに相当する；G
はデオキシリボリボグアノシンに相当する；Tは2'-デオキシリボチミジンに相当
する；Aはリボアデノシンに相当する；Uはウリジンに相当する；Cはリボシチジ
ンに相当する；Gはリボグアノシンに相当する。下線の塩基は2'-メトキシリボー
ス置換ヌクレオチドである。下線のない塩基はデオキシリボースヌクレオシドを
示す。各オリゴヌクレオチドのバックボーン（backbone）は、隣接ヌクレオチド
間のホスホロチオアート結合より構成されていた。
オリゴヌクレオチドである（すなわち4x4ハイブリッド）。すなわち配列番号10-
23を有するオリゴヌクレオチドは、以下のように化学的に修飾される；Aは2'-デ
オキシリボアデノシンに相当する；Cはデオキシリボリボシチジンに相当する；G
はデオキシリボリボグアノシンに相当する；Tは2'-デオキシリボチミジンに相当
する；Aはリボアデノシンに相当する；Uはウリジンに相当する；Cはリボシチジ
ンに相当する；Gはリボグアノシンに相当する。下線の塩基は2'-メトキシリボー
ス置換ヌクレオチドである。下線のない塩基はデオキシリボースヌクレオシドを
示す。各オリゴヌクレオチドのバックボーン（backbone）は、隣接ヌクレオチド
間のホスホロチオアート結合より構成されていた。
【００７９】
HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-D、およびHDAC-Eに相補的な多数のオ
リゴヌクレオチドが次に作成される。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒストン
脱アセチル酵素の既知の核酸配列に基づいている（たとえばHDAC-3の場合、GenB
ank Accession No. U75697）。これらのヒストン脱アセチル酵素の1つに特異的
であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-1、HDAC-1/2およびHDAC-2につ
いて上で述べたように、mRNAおよびタンパク質の発現を抑制する有効性について
スクリーニングする。さらに2以上のヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチ
センスオリゴヌクレオチド（たとえばHDAC-1/3/C-特異的）も、各ヒストン脱ア
セチル酵素に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを混合して作成し、有効
性についてスクリーニングする。
リゴヌクレオチドが次に作成される。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒストン
脱アセチル酵素の既知の核酸配列に基づいている（たとえばHDAC-3の場合、GenB
ank Accession No. U75697）。これらのヒストン脱アセチル酵素の1つに特異的
であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HDAC-1、HDAC-1/2およびHDAC-2につ
いて上で述べたように、mRNAおよびタンパク質の発現を抑制する有効性について
スクリーニングする。さらに2以上のヒストン脱アセチル酵素を抑制するアンチ
センスオリゴヌクレオチド（たとえばHDAC-1/3/C-特異的）も、各ヒストン脱ア
セチル酵素に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを混合して作成し、有効
性についてスクリーニングする。
【００８０】
実施例２ アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒストン脱アセチル酵素mRNA発現の抑制
ヒストン脱アセチル酵素をコード化する核酸に対して特異的なアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの特異性および用量要求事項を判定するために、ヒストン脱ア
セチル酵素mRNA発現に対するこれらのオリゴヌクレオチドの用量依存的抑制を調
べた。
リゴヌクレオチドの特異性および用量要求事項を判定するために、ヒストン脱ア
セチル酵素mRNA発現に対するこれらのオリゴヌクレオチドの用量依存的抑制を調
べた。
【００８１】
これを行うために、リポフェクチンを用いて、T24細胞に10、25、50または100
nMオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした（実施例１で述べたように）
。トランスフェクションの24時間後に細胞を収集し、RNAを調製し、実施例１で
述べたように、放射線標識HDAC-1およびHDAC-2 cDNAをプローブとしてノーザン
ブロッティング分析を実施した。
nMオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした（実施例１で述べたように）
。トランスフェクションの24時間後に細胞を収集し、RNAを調製し、実施例１で
述べたように、放射線標識HDAC-1およびHDAC-2 cDNAをプローブとしてノーザン
ブロッティング分析を実施した。
【００８２】
図１は、50〜100nMにおけるHDAC-1およびHDAC-1/2アンチセンスオリゴヌクレ
オチドの両方による、HDAC-1 mRNA発現の用量依存的抑制を示す。一方、HDAC-2
mRNA発現は、50〜100nMのHDAC-1/2アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2610）
によってのみ抑制されたが、HDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2608）
は効果を持たない。結果を図１に示したこの実験で使用したオリゴヌクレオチド
は、第1世代オリゴヌクレオチドであった（すなわち化学修飾されていない）。
図１の結果を得るために用いたオリゴヌクレオチドは、配列番号1-5を有してい
た。
オチドの両方による、HDAC-1 mRNA発現の用量依存的抑制を示す。一方、HDAC-2
mRNA発現は、50〜100nMのHDAC-1/2アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2610）
によってのみ抑制されたが、HDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2608）
は効果を持たない。結果を図１に示したこの実験で使用したオリゴヌクレオチド
は、第1世代オリゴヌクレオチドであった（すなわち化学修飾されていない）。
図１の結果を得るために用いたオリゴヌクレオチドは、配列番号1-5を有してい
た。
【００８３】
図２は、HDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオチドによる、HDAC-2 mRNAの用量
依存的抑制を示す。4つのHDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2628、MG2
633、MG2635、MG2636）全ては、50〜100nMにおいてHDAC-2 mRNA発現のレベルを
低減することができた。この実験で、MG2628は、HDAC-2mRNA発現の低減に特に有
効であるように思えた。
依存的抑制を示す。4つのHDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオチド（MG2628、MG2
633、MG2635、MG2636）全ては、50〜100nMにおいてHDAC-2 mRNA発現のレベルを
低減することができた。この実験で、MG2628は、HDAC-2mRNA発現の低減に特に有
効であるように思えた。
【００８４】
これらのデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによってヒストン脱アセ
チル酵素を核酸レベルで標的とすることによって、オリゴヌクレオチドへの曝露
24時間後に、mRNA発現の低減が生じることを証明した。
チル酵素を核酸レベルで標的とすることによって、オリゴヌクレオチドへの曝露
24時間後に、mRNA発現の低減が生じることを証明した。
【００８５】
実施例３ 第2世代アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質発現の抑制 ヒストン脱アセチル酵素オリゴヌクレオチドがタンパク質発現を抑制する能力
を判定するために、HDAC-1、HDAC-1/2およびHDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの第2世代アンチセンスオリゴヌクレオチドを作成した。これらの第2世代ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、各隣接ヌクレオチド間のホスホロチ
オアート結合よりなるバックボーンを有していた。さらに、オリゴヌクレオチド
の5'および3'末端の両方にある4つの終端ヌクレオチドは、2'-O-メチル基よりな
る糖残基を有していた。終端ヌクレオチドに対するこのような修飾は、オリゴヌ
クレオチドの標的核酸に対する結合親和性を向上させ、ヌクレアーゼの感受性を
抑制することによってオリゴヌクレオチドの安定性を向上させるのに有用であっ
た。
ク質発現の抑制 ヒストン脱アセチル酵素オリゴヌクレオチドがタンパク質発現を抑制する能力
を判定するために、HDAC-1、HDAC-1/2およびHDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの第2世代アンチセンスオリゴヌクレオチドを作成した。これらの第2世代ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、各隣接ヌクレオチド間のホスホロチ
オアート結合よりなるバックボーンを有していた。さらに、オリゴヌクレオチド
の5'および3'末端の両方にある4つの終端ヌクレオチドは、2'-O-メチル基よりな
る糖残基を有していた。終端ヌクレオチドに対するこのような修飾は、オリゴヌ
クレオチドの標的核酸に対する結合親和性を向上させ、ヌクレアーゼの感受性を
抑制することによってオリゴヌクレオチドの安定性を向上させるのに有用であっ
た。
【００８６】
図３は、第2世代HDAC-2アンチセンスオリゴヌクレオチドがHDAC-2タンパク質
発現を抑制する能力を示す。T24細胞に、実施例１で述べたように、リポフェク
チンを用いて、0、25または50nMのMG2628またはMG2636をトランスフェクション
した。24時間後、同量の同じオリゴヌクレオチドを用いて、細胞に2回目のトラ
ンスフェクションを行った。この24時間後（すなわち最初のトランスフェクショ
ンから48時間後）、細胞タンパク質を調製し、7-15%の勾配SDS-PAGEで分解し、
実施例１で述べたようにウサギポリクローナルHDAC2特異抗体（1:500、Santa Cr
uz Biotech）を用いて、ウェスタンブロット分析にかけた。第2抗ウサギIgG-HR
ペルオキシダーゼ抗体によるブロッティングと、高度化学発光検出キット（Amer
sham）による描出の後、ブロットをストリップし、全てのウェルのローディング
が等しいことを確認するために、アクチンに対して特異的な抗体によって再プロ
ーブした（データは示さない）。
発現を抑制する能力を示す。T24細胞に、実施例１で述べたように、リポフェク
チンを用いて、0、25または50nMのMG2628またはMG2636をトランスフェクション
した。24時間後、同量の同じオリゴヌクレオチドを用いて、細胞に2回目のトラ
ンスフェクションを行った。この24時間後（すなわち最初のトランスフェクショ
ンから48時間後）、細胞タンパク質を調製し、7-15%の勾配SDS-PAGEで分解し、
実施例１で述べたようにウサギポリクローナルHDAC2特異抗体（1:500、Santa Cr
uz Biotech）を用いて、ウェスタンブロット分析にかけた。第2抗ウサギIgG-HR
ペルオキシダーゼ抗体によるブロッティングと、高度化学発光検出キット（Amer
sham）による描出の後、ブロットをストリップし、全てのウェルのローディング
が等しいことを確認するために、アクチンに対して特異的な抗体によって再プロ
ーブした（データは示さない）。
【００８７】
図３に示すように、50μMの第2世代MG2628またはMG2836はHDAC-2タンパク質発
現を抑制することができた。
現を抑制することができた。
【００８８】
図４は、ミスマッチ対照と比較した場合の、HDAC-1/2およびHDAC-1アンチセン
スオリゴヌクレオチドが、HDAC-1およびHDAC-2の両方またはHDAC-1それぞれのタ
ンパク質発現を抑制する特異的能力を示す。T24細胞は上述したように、50nMオ
リゴヌクレオチドを2回トランスフェクションされた。細胞ライセートを2回目の
トランスフェクションの24時間後に調製し、7-15%勾配のSDS-PAGEで溶解し、PDV
F膜に移した。PDVF膜ブロットは最初に抗HDAC-1抗体によってブロットした。ホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識した抗体と高度化学発光による検出
の後、ブロットをストリップし、抗HDAC-2抗体によって再プローブした。検出の
後、ブロットに2度目のストリップを行い、レーンのローディングが等しいこと
を確認するために、アクチン特異抗体によって再プローブした。
スオリゴヌクレオチドが、HDAC-1およびHDAC-2の両方またはHDAC-1それぞれのタ
ンパク質発現を抑制する特異的能力を示す。T24細胞は上述したように、50nMオ
リゴヌクレオチドを2回トランスフェクションされた。細胞ライセートを2回目の
トランスフェクションの24時間後に調製し、7-15%勾配のSDS-PAGEで溶解し、PDV
F膜に移した。PDVF膜ブロットは最初に抗HDAC-1抗体によってブロットした。ホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識した抗体と高度化学発光による検出
の後、ブロットをストリップし、抗HDAC-2抗体によって再プローブした。検出の
後、ブロットに2度目のストリップを行い、レーンのローディングが等しいこと
を確認するために、アクチン特異抗体によって再プローブした。
【００８９】
図４に示すように、HDAC-1およびHDAC-1/2のミスマッチ対照オリゴヌクレオチ
ドはどちらも、それぞれ、HDAC-1またはHDAC-1およびHDAC-2タンパク質発現を抑
制することができなかった。これに対してHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、HDAC-1タンパク質の発現を効率よく低減し、HDAC-1/2アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、HDAC-1およびHDAC-2の両方のタンパク質発現を低減した。
ドはどちらも、それぞれ、HDAC-1またはHDAC-1およびHDAC-2タンパク質発現を抑
制することができなかった。これに対してHDAC-1アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、HDAC-1タンパク質の発現を効率よく低減し、HDAC-1/2アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、HDAC-1およびHDAC-2の両方のタンパク質発現を低減した。
【００９０】
実施例４ 細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素の特定
培養細胞における細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素を特定するため
に、各種のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドをスクリーニングする。
に、各種のヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドをスクリーニングする。
【００９１】
正常（すなわち非腫瘍）細胞の分裂を誘導するヒストン脱アセチル酵素を特定
するには、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを、培養した正常なヒト繊維芽細胞にトランスフェクションする。CaPO4
沈殿、電気穿孔法、DEAD-デキストランを含む任意の標準的トランスフェクショ
ンのプロトコルを制限なく使用できるが、リポフェクチン トランスフェクショ
ン試薬（Gibco-BRL）の使用が好ましい。リポフェクチンとヒストン脱アセチル
酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後、細胞を
各時点においてトリプシン処理により収集し、血球計またはCoulterセルカウン
タを用いてカウントした。偽のトランスフェクション対照細胞（すなわち、リポ
フェクチンと対照の非特異的オリゴヌクレオチドによって処理）も収集およびカ
ウントした。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび偽のトランスフェクション
細胞のどちらも、表現型の変化（たとえばアポトーシスの誘導）について顕微鏡
下で目視検査した。正常細胞にトランスフェクションされた場合に細胞増殖を抑
制することが知られているヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、正常細胞における細胞増殖の誘導に関与するヒストン
脱アセチル酵素を特定する。
するには、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを、培養した正常なヒト繊維芽細胞にトランスフェクションする。CaPO4
沈殿、電気穿孔法、DEAD-デキストランを含む任意の標準的トランスフェクショ
ンのプロトコルを制限なく使用できるが、リポフェクチン トランスフェクショ
ン試薬（Gibco-BRL）の使用が好ましい。リポフェクチンとヒストン脱アセチル
酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの後、細胞を
各時点においてトリプシン処理により収集し、血球計またはCoulterセルカウン
タを用いてカウントした。偽のトランスフェクション対照細胞（すなわち、リポ
フェクチンと対照の非特異的オリゴヌクレオチドによって処理）も収集およびカ
ウントした。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび偽のトランスフェクション
細胞のどちらも、表現型の変化（たとえばアポトーシスの誘導）について顕微鏡
下で目視検査した。正常細胞にトランスフェクションされた場合に細胞増殖を抑
制することが知られているヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、正常細胞における細胞増殖の誘導に関与するヒストン
脱アセチル酵素を特定する。
【００９２】
腫瘍細胞増殖を誘導するヒストン脱アセチル酵素を特定するために、この発明
によるヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドを、T24膀胱癌
細胞にトランスフェクションし、その成長パターンを観測し、非トランスフェク
ション対照細胞の成長パターンと比較する。このために、トランスフェクション
の1日前に、T24細胞（ATCC No.HTB-4）を10cmプレートに4x105細胞/皿の濃度で
播種した。トランスフェクション時に細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し
、6.25μg/mlのリポフェクチン トランスフェクション試薬を含む5mlのOpti-MEM
培地（Gibco-BRL、オンタリオ州ミシサーガ）を添加した。試験を行うアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション培地の0.1mM原液からの望ま
しい濃度まで希釈した。5%CO2インキュベータ内で37℃にて4時間インキュベート
した後、プレートをPBSで洗浄し、10mlの新しい細胞培養培地を加えた。T24細胞
を合計3日間トランスフェクションし、トランスフェクション状態が最適である
ことを確認するために1日おきに分割した。各時点で、トリプシン処理によって
細胞を収集し、1100rpmおよび4℃で5分間遠心分離を行ってペレット化した。細
胞をPBS中に再懸濁し、総細胞数を決定するためにCoulter粒子カウンタでカウン
トした。偽のトランスフェクションT24細胞（リポフェクチンと対照オリゴヌク
レオチドをトランスフェクション）は同様に培養、収集およびカウントした。腫
瘍細胞にトランスフェクションすると細胞増殖を抑制することが知られているヒ
ストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫
瘍細胞における細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定する。
によるヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドを、T24膀胱癌
細胞にトランスフェクションし、その成長パターンを観測し、非トランスフェク
ション対照細胞の成長パターンと比較する。このために、トランスフェクション
の1日前に、T24細胞（ATCC No.HTB-4）を10cmプレートに4x105細胞/皿の濃度で
播種した。トランスフェクション時に細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し
、6.25μg/mlのリポフェクチン トランスフェクション試薬を含む5mlのOpti-MEM
培地（Gibco-BRL、オンタリオ州ミシサーガ）を添加した。試験を行うアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション培地の0.1mM原液からの望ま
しい濃度まで希釈した。5%CO2インキュベータ内で37℃にて4時間インキュベート
した後、プレートをPBSで洗浄し、10mlの新しい細胞培養培地を加えた。T24細胞
を合計3日間トランスフェクションし、トランスフェクション状態が最適である
ことを確認するために1日おきに分割した。各時点で、トリプシン処理によって
細胞を収集し、1100rpmおよび4℃で5分間遠心分離を行ってペレット化した。細
胞をPBS中に再懸濁し、総細胞数を決定するためにCoulter粒子カウンタでカウン
トした。偽のトランスフェクションT24細胞（リポフェクチンと対照オリゴヌク
レオチドをトランスフェクション）は同様に培養、収集およびカウントした。腫
瘍細胞にトランスフェクションすると細胞増殖を抑制することが知られているヒ
ストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫
瘍細胞における細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定する。
【００９３】
正常細胞や腫瘍細胞における多くの各種ヒストン脱アセチル酵素アンチセンス
オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることによって、細胞増殖の誘導に関与
するヒストン脱アセチル酵素はただちに特定される。さらに好ましくは、この発
明のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞の細
胞増殖を抑制するが、正常細胞の細胞増殖を抑制しないヒストン脱アセチル酵素
アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることによって、細胞増殖の誘導に関与
するヒストン脱アセチル酵素はただちに特定される。さらに好ましくは、この発
明のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞の細
胞増殖を抑制するが、正常細胞の細胞増殖を抑制しないヒストン脱アセチル酵素
アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００９４】
実施例５ 細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素活性 を低減させるヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子
細胞増殖の誘導に関与するとして特定される（たとえば実施例４の方法で特定
される）ヒストン脱アセチル酵素は、そのヒストン脱アセチル酵素と相互作用し
、その酵素活性を低減させるように設計される候補化合物の標的として使用でき
る。正の対照として、FR901228（藤沢薬品より入手可能）を使用する。
される）ヒストン脱アセチル酵素は、そのヒストン脱アセチル酵素と相互作用し
、その酵素活性を低減させるように設計される候補化合物の標的として使用でき
る。正の対照として、FR901228（藤沢薬品より入手可能）を使用する。
【００９５】
候補化合物は任意の供給源に由来するものであり、天然型または合成型でもよ
く、天然型または合成型成分を有していてもよい。候補化合物は、例外なく、ト
リコスタチンA、トリコスタチンC、トラポキシン、depudecin、スベロイルアニ
リド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228、酪酸塩を含む、既知のヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子のいずれかに化学的に類似するように設計しても
よい。
く、天然型または合成型成分を有していてもよい。候補化合物は、例外なく、ト
リコスタチンA、トリコスタチンC、トラポキシン、depudecin、スベロイルアニ
リド、ヒドロキサム酸（SAHA）、FR901228、酪酸塩を含む、既知のヒストン脱ア
セチル酵素タンパク質抑制因子のいずれかに化学的に類似するように設計しても
よい。
【００９６】
候補化合物が特定されれば、そのような化合物のプールをヒストン脱アセチル
酵素に添加することができる。そのようなヒストン脱アセチル酵素は、この発明
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞増殖の誘導に関与するヒスト
ン脱アセチル酵素として特定されるヒストン脱アセチル酵素であることが好まし
い。ヒストン脱アセチル酵素はたとえば、その特定のヒストン脱アセチル酵素に
対して特異的な抗体（たとえば、Santa Cruz Biotechより入手可能な抗HDAC-1抗
体）を用いて、または原核または真核細胞におけるヒストン脱アセチル酵素の組
換え作成によって生成できる。ヒストン脱アセチル酵素は、通常ヒストン脱アセ
チル酵素を発現する細胞にも存在することがある。
酵素に添加することができる。そのようなヒストン脱アセチル酵素は、この発明
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞増殖の誘導に関与するヒスト
ン脱アセチル酵素として特定されるヒストン脱アセチル酵素であることが好まし
い。ヒストン脱アセチル酵素はたとえば、その特定のヒストン脱アセチル酵素に
対して特異的な抗体（たとえば、Santa Cruz Biotechより入手可能な抗HDAC-1抗
体）を用いて、または原核または真核細胞におけるヒストン脱アセチル酵素の組
換え作成によって生成できる。ヒストン脱アセチル酵素は、通常ヒストン脱アセ
チル酵素を発現する細胞にも存在することがある。
【００９７】
候補化合物のプールをヒストン脱アセチル酵素に添加し、ヒストン脱アセチル
酵素の酵素活性を測定する。そのようなヒストン脱アセチル酵素抑制活性を示す
候補化合物のプールを再分割して、ヒストン脱アセチル酵素抑制活性を有する1
つの候補化合物が単離されるまで、分割物に試験を行う。いったん候補化合物の
プールがヒストン脱アセチル酵素活性を抑制する能力を有すると特定された場合
は、プールまたは1以上のヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子化合物内
に存在することを確認する各種の方法によって、プールをスクリーニングするこ
とができる。たとえば、ヒストン脱アセチル酵素を有する細胞内で、プールを最
初にスクリーニングする場合、プールは次に精製ヒストン脱アセチル酵素に対し
てスクリーニングされる。
酵素の酵素活性を測定する。そのようなヒストン脱アセチル酵素抑制活性を示す
候補化合物のプールを再分割して、ヒストン脱アセチル酵素抑制活性を有する1
つの候補化合物が単離されるまで、分割物に試験を行う。いったん候補化合物の
プールがヒストン脱アセチル酵素活性を抑制する能力を有すると特定された場合
は、プールまたは1以上のヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子化合物内
に存在することを確認する各種の方法によって、プールをスクリーニングするこ
とができる。たとえば、ヒストン脱アセチル酵素を有する細胞内で、プールを最
初にスクリーニングする場合、プールは次に精製ヒストン脱アセチル酵素に対し
てスクリーニングされる。
【００９８】
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制印にであることが判明した候補化合物
は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素の活性を抑制することが好
ましい。さらに好ましくは、このような候補化合物が、細胞増殖の誘導に関与す
るヒストン脱アセチル酵素のみを抑制する。またさらに好ましくは、ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子として特定される候補化合物は、細胞増殖の誘
導に関与する1つのヒストン脱アセチル酵素のみを抑制する候補化合物である。
さらに好ましくは、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子として特定され
る候補化合物は、腫瘍細胞における細胞増殖の誘導に関与するが、正常細胞にお
ける細胞増殖の誘導には関与しない1つのヒストン脱アセチル酵素のみを抑制す
る候補化合物である。
は、全てのヒストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素の活性を抑制することが好
ましい。さらに好ましくは、このような候補化合物が、細胞増殖の誘導に関与す
るヒストン脱アセチル酵素のみを抑制する。またさらに好ましくは、ヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子として特定される候補化合物は、細胞増殖の誘
導に関与する1つのヒストン脱アセチル酵素のみを抑制する候補化合物である。
さらに好ましくは、ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子として特定され
る候補化合物は、腫瘍細胞における細胞増殖の誘導に関与するが、正常細胞にお
ける細胞増殖の誘導には関与しない1つのヒストン脱アセチル酵素のみを抑制す
る候補化合物である。
【００９９】
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子である候補化合物を特定する別の
方法において、精製されたヒストン脱アセチル酵素を96ウェルマイクロタイター
プレートのウェル底面に付着させる。次に検出可能なマーカー（たとえばビオチ
ン標識）を共有結合させて修飾した候補化合物（またはそのプール）をプレート
に添加する。候補化合物がプレートに結合したヒストン脱アセチル酵素に結合し
ていることは、検出可能なマーカー（たとえばストレプトアビジン標識蛍光体）
を結合した第2試薬を添加し、続いてマイクロタイタープレートリーダー上のプ
レートを分析することによって検出される。そのようにして特定された、ヒスト
ン脱アセチル酵素と相互作用する候補化合物は次に、ヒストン脱アセチル酵素の
酵素活性を抑制する能力についてスクリーニングを行う。
方法において、精製されたヒストン脱アセチル酵素を96ウェルマイクロタイター
プレートのウェル底面に付着させる。次に検出可能なマーカー（たとえばビオチ
ン標識）を共有結合させて修飾した候補化合物（またはそのプール）をプレート
に添加する。候補化合物がプレートに結合したヒストン脱アセチル酵素に結合し
ていることは、検出可能なマーカー（たとえばストレプトアビジン標識蛍光体）
を結合した第2試薬を添加し、続いてマイクロタイタープレートリーダー上のプ
レートを分析することによって検出される。そのようにして特定された、ヒスト
ン脱アセチル酵素と相互作用する候補化合物は次に、ヒストン脱アセチル酵素の
酵素活性を抑制する能力についてスクリーニングを行う。
【０１００】
実施例６ in vivoにおけるヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドの腫
瘍細胞に対する抗腫瘍効果 この実施例の目的は、この発明のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの、ヒストン脱アセチル酵素抑制に対応する疾病治療能力を、動物
、特に哺乳類において示すことである。この実施例はさらに、この発明の方法お
よび組成物が家畜の腫瘍成長を抑制する能力の証拠を提供する。8〜10週齢のメ
スBALB/cヌードマウス（Taconic Labs, ニューヨーク州、グレートバリントン）
のわき腹部分に、事前に条件付された（preconditioned）2×106個のA549ヒト肺
癌細胞を皮下注射した。これらの細胞の事前条件付け（preconditioning）は、
同じ血統のヌードマウスに腫瘍を3回以上、連続して移植することによって行う
。次に約30mgの腫瘍切片を切り取り、Forene麻酔（Abbott Labs., スイス、ジュ
ネーブ）をかけたマウスの左わき腹に皮下移植した。腫瘍の平均体積が100mm3に
達したら、0.1〜6mg/kgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレ
オチド食塩水調製物（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を用いて、毎日、尾部
血管にbolous輸液することによって、マウスに静脈から治療を行う。オリゴヌク
レオチドの最適最終濃度は、標準プロトコルによる用量反応実験によって規定さ
れている。腫瘍体積は、輸液後2日おきに標準方法に従って計算した（たとえばM
eyerら、Int. J. Cancer 43：851-856（1989））。この発明によるオリゴヌクレ
オチドを用いた治療によって、食塩水のみで処置した対照（すなわちオリゴヌク
レオチドなし）または食塩水と対照の非特異的オリゴヌクレオチドで処置した対
照と比較して、腫瘍の重量と体積が減少した。さらに、ヒストン脱アセチル酵素
の活性を測定すれば、食塩水処置対照と比較して大きく低下することが予測され
る。
瘍細胞に対する抗腫瘍効果 この実施例の目的は、この発明のヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの、ヒストン脱アセチル酵素抑制に対応する疾病治療能力を、動物
、特に哺乳類において示すことである。この実施例はさらに、この発明の方法お
よび組成物が家畜の腫瘍成長を抑制する能力の証拠を提供する。8〜10週齢のメ
スBALB/cヌードマウス（Taconic Labs, ニューヨーク州、グレートバリントン）
のわき腹部分に、事前に条件付された（preconditioned）2×106個のA549ヒト肺
癌細胞を皮下注射した。これらの細胞の事前条件付け（preconditioning）は、
同じ血統のヌードマウスに腫瘍を3回以上、連続して移植することによって行う
。次に約30mgの腫瘍切片を切り取り、Forene麻酔（Abbott Labs., スイス、ジュ
ネーブ）をかけたマウスの左わき腹に皮下移植した。腫瘍の平均体積が100mm3に
達したら、0.1〜6mg/kgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレ
オチド食塩水調製物（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を用いて、毎日、尾部
血管にbolous輸液することによって、マウスに静脈から治療を行う。オリゴヌク
レオチドの最適最終濃度は、標準プロトコルによる用量反応実験によって規定さ
れている。腫瘍体積は、輸液後2日おきに標準方法に従って計算した（たとえばM
eyerら、Int. J. Cancer 43：851-856（1989））。この発明によるオリゴヌクレ
オチドを用いた治療によって、食塩水のみで処置した対照（すなわちオリゴヌク
レオチドなし）または食塩水と対照の非特異的オリゴヌクレオチドで処置した対
照と比較して、腫瘍の重量と体積が減少した。さらに、ヒストン脱アセチル酵素
の活性を測定すれば、食塩水処置対照と比較して大きく低下することが予測され
る。
【０１０１】
実施例７ in vivoにおけるヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒ
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の腫瘍細胞に対する抗腫瘍相乗効果 この実施例の目的は、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドとヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の、哺乳類での腫瘍成長を抑制
する能力を示すことである。実施例６で述べたように、移植A549腫瘍（平均体積
100mm3）を有するマウスに対して、約0.1mg〜約30mg/体重1kgのヒストン脱アセ
チル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む食塩水調製物によって毎日処置
を行う。第2グループのマウスは、約0.01mg〜約5mg/体重1kgのヒストン脱アセチ
ル酵素タンパク質抑制因子を含む、製薬的に許容可能な調製物によって毎日処置
する。一部のマウスはヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチド
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の両方を投与される。これらのマ
ウスのうち、1つのグループは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子を尾部血管から静脈注射によって同時に投与さ
れる。別のグループはアンチセンスオリゴヌクレオチドを尾部血管から、ヒスト
ン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を皮下注射によって投与される。また別の
グループは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子の両方を皮下注射によって同時に投与される。マウスの対照グルー
プも同様に作成する。処置を受けない（たとえば食塩水のみ）グループ、ミスマ
ッチアンチセンスオリゴヌクレオチドのみのグループ、ヒストン脱アセチル酵素
活性を抑制しない対照化合物のグループ、ミスマッチアンチセンスオリゴヌクレ
オチドと対照化合物のグループがある。
ストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の腫瘍細胞に対する抗腫瘍相乗効果 この実施例の目的は、ヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドとヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の、哺乳類での腫瘍成長を抑制
する能力を示すことである。実施例６で述べたように、移植A549腫瘍（平均体積
100mm3）を有するマウスに対して、約0.1mg〜約30mg/体重1kgのヒストン脱アセ
チル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む食塩水調製物によって毎日処置
を行う。第2グループのマウスは、約0.01mg〜約5mg/体重1kgのヒストン脱アセチ
ル酵素タンパク質抑制因子を含む、製薬的に許容可能な調製物によって毎日処置
する。一部のマウスはヒストン脱アセチル酵素アンチセンスオリゴヌクレオチド
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の両方を投与される。これらのマ
ウスのうち、1つのグループは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱
アセチル酵素タンパク質抑制因子を尾部血管から静脈注射によって同時に投与さ
れる。別のグループはアンチセンスオリゴヌクレオチドを尾部血管から、ヒスト
ン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を皮下注射によって投与される。また別の
グループは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱アセチル酵素タンパ
ク質抑制因子の両方を皮下注射によって同時に投与される。マウスの対照グルー
プも同様に作成する。処置を受けない（たとえば食塩水のみ）グループ、ミスマ
ッチアンチセンスオリゴヌクレオチドのみのグループ、ヒストン脱アセチル酵素
活性を抑制しない対照化合物のグループ、ミスマッチアンチセンスオリゴヌクレ
オチドと対照化合物のグループがある。
【０１０２】
腫瘍体積はカリパスで測定する。この発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を用いた処置によって、対照と比
較して腫瘍の重量と体積が著しく減少した。アンチセンスオリゴヌクレオチドと
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、同じヒストン脱アセチル酵素の
発現と活性を抑制することが好ましい。
とヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を用いた処置によって、対照と比
較して腫瘍の重量と体積が著しく減少した。アンチセンスオリゴヌクレオチドと
ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子は、同じヒストン脱アセチル酵素の
発現と活性を抑制することが好ましい。
【図１】
図１はノーザンブロッティング分析の図式表示であり、HDAC-1をコードする核
酸、またはHDAC-1およびHDAC-2をコードする核酸の両方に特異的に結合して、そ
れぞれHDAC-1 mRNA、またはHDAC-1 mRNAならびにHDAC-2 mRNAの両方の発現を抑
制する、この発明による代表的かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの用量依
存活性を示す。
酸、またはHDAC-1およびHDAC-2をコードする核酸の両方に特異的に結合して、そ
れぞれHDAC-1 mRNA、またはHDAC-1 mRNAならびにHDAC-2 mRNAの両方の発現を抑
制する、この発明による代表的かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの用量依
存活性を示す。
【図２】
図２はノーザンブロッティング分析の図式表示であり、HDAC-2をコードする核
酸に特異的に結合して、HDAC-2 mRNAの発現を抑制する、この発明による代表的
かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの用量依存活性を示す。
酸に特異的に結合して、HDAC-2 mRNAの発現を抑制する、この発明による代表的
かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの用量依存活性を示す。
【図３】
図３はウェスタンブロッティング分析の図式表示であり、HDAC-2をコードする
核酸に特異的に結合して、HDAC-2タンパク質の発現を抑制する、この発明による
代表的かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの活性を示す。
核酸に特異的に結合して、HDAC-2タンパク質の発現を抑制する、この発明による
代表的かつ非制限的な合成オリゴヌクレオチドの活性を示す。
【図４】
図４はウェスタンブロッティング分析の図式表示であり、HDAC-1をコードする
核酸、またはHDAC-1およびHDAC-2の両方をコードする核酸に特異的に結合して、
それぞれHDAC-1タンパク質、またはHDAC-1タンパク質ならびにHDAC-2タンパク質
の両方の発現を抑制する、この発明による代表的かつ非制限的な合成オリゴヌク
レオチドの活性を示す。ミスマッチの合成オリゴヌクレオチドは負の対照として
使用した。すべてのレーンの負荷が等しいことは、アクチンが同様に発現してい
ることによって証明される。
核酸、またはHDAC-1およびHDAC-2の両方をコードする核酸に特異的に結合して、
それぞれHDAC-1タンパク質、またはHDAC-1タンパク質ならびにHDAC-2タンパク質
の両方の発現を抑制する、この発明による代表的かつ非制限的な合成オリゴヌク
レオチドの活性を示す。ミスマッチの合成オリゴヌクレオチドは負の対照として
使用した。すべてのレーンの負荷が等しいことは、アクチンが同様に発現してい
ることによって証明される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８６
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/34
1/34 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ
，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，
ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ
Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ
，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，
ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ
，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ベスターマン ジェフリー エム．
Ｈ９Ｘ ３Ｖ３ カナダ ケベック バイ
エ ドゥルフェ グレイ クレセント 51
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB01 FB02 FB03 FB07
FB08
4B024 AA01 BA11 BA80 CA04 EA04
HA17
4B050 CC03 DD11 LL01
4B063 QA01 QA18 QR10 QR31 QR72
4C084 AA13 AA17 MA02 NA14 ZB26
4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01
MA02 MA04 NA14 ZB26
Claims (39)
- 【請求項１】 ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ヒストン脱アセチル酵素が、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC
-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-D、およびHDAC-Eからなる群より選択される請求項１
のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 オリゴヌクレオチドが、2以上のヒストン脱アセチル酵素を
抑制する請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが、全てのヒストン脱アセチル酵素を抑
制する請求項３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 オリゴヌクレオチドが、ヒストン脱アセチル酵素をコードす
る核酸分子の転写を抑制する請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 核酸分子が、ゲノムDNA、cDNA、およびRNAからなる群より選
択される請求項５のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが、ヒストン脱アセチル酵素の翻訳を抑
制する請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオネート、ホスホロジチ
オネート、アルキルホスホネート、アルキルホソホノチオネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホラミデート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシルメチルエステル
、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架
橋メチレン ホスホネート、架橋ホスホロチオネート、およびスルホン インター
ヌクレオチド結合からなる群より選択される少なくとも１のインターヌクレオチ
ド結合を有する請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 オリゴヌクレオチドが、キメラオリゴヌクレオチドまたはハ
イブリッドオリゴヌクレオチドである請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたは2'-O-置
換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を有する請求項１
のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】 細胞中のヒストン脱アセチル酵素を抑制する方法であって
、細胞に請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させることを含む方
法。 - 【請求項１２】 接触細胞において細胞増殖が抑制される請求項１１の方法
。 - 【請求項１３】 細胞が、腫瘍細胞である請求項１１の方法。
- 【請求項１４】 腫瘍細胞が、動物中に存在する請求項１３の方法。
- 【請求項１５】 腫瘍細胞が、腫瘍成長にある請求項１４の方法。
- 【請求項１６】 ヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素活性を低
減させるヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子に細胞を接触させることを
さらに含む、請求項１１の方法。 - 【請求項１７】 ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されている請求項１６の方法。 - 【請求項１８】 動物の腫瘍成長を抑制する方法であって、その身体に少な
くとも１の腫瘍細胞を有する動物に、請求項１のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの治療有効量を、製薬的に許容される担体とともに、治療有効期間投与するこ
とを含む方法。 - 【請求項１９】 動物が、哺乳動物である請求項１８の方法。
- 【請求項２０】 哺乳動物が、ヒトである請求項１９の方法。
- 【請求項２１】 動物に、ヒストン脱アセチル酵素と相互作用し、その酵素
活性を低減させるヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子の治療有効量を、
製薬的に許容される担体とともに、治療有効期間投与することをさらに含む、請
求項１８の方法。 - 【請求項２２】 ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドと操作可能に結合されている請求項２１の方法。 - 【請求項２３】 細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定
する方法であって、そのヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンス
オリゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の細胞増殖の抑制
が、細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱ア
セチル酵素を特定する方法。 - 【請求項２４】 細胞が、腫瘍細胞であり、細胞増殖の誘導が腫瘍発生であ
る請求項２３の方法。 - 【請求項２５】 ヒストン脱アセチル酵素が、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HD
AC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-D、およびHDAC-Eからなる群より選択される請求項
２３の方法。 - 【請求項２６】 細胞増殖の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制
するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法であって、請求
項２３の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補化合物に接触さ
せ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定することを含み、接触
されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞増殖の誘導に関与する
ヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子
としてその候補化合物を特定する方法。 - 【請求項２７】 ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が、全てのヒ
ストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減
する請求項２６の方法。 - 【請求項２８】 細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を特定
する方法であって、ヒストン脱アセチル酵素の発現を抑制するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを細胞に接触させることを含み、接触細胞の分化誘導が、細胞分
化に関与するヒストン脱アセチル酵素としてそのヒストン脱アセチル酵素を特定
する方法。 - 【請求項２９】 細胞が、腫瘍細胞である請求項２８の方法。
- 【請求項３０】 ヒストン脱アセチル酵素が、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HD
AC-4、HDAC-5、HDAC-C、HDAC-D、およびHDAC-Eからなる群より選択される請求項
２８の方法。 - 【請求項３１】 細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル酵素を抑制
するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子を特定する方法であって、請求
項２８の方法によって特定されたヒストン脱アセチル酵素を候補化合物に接触さ
せ、接触されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性を測定することを含み、接触
されたヒストン脱アセチル酵素の酵素活性の低下が、細胞分化の誘導に関与する
ヒストン脱アセチル酵素を抑制するヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子
としてその候補化合物を特定する方法。 - 【請求項３２】 ヒストン脱アセチル酵素タンパク質抑制因子が、全てのヒ
ストン脱アセチル酵素よりも少ない酵素と相互作用し、それらの酵素活性を低減
する請求項３１の方法。 - 【請求項３３】 請求項２６または３１の方法によって特定されたヒストン
脱アセチル酵素タンパク質抑制因子。 - 【請求項３４】 実施的に純粋であるヒストン脱アセチル酵素。
- 【請求項３５】 細胞における細胞増殖を抑制する方法であって、ヒストン
脱アセチル酵素を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒストン脱アセチ
ル酵素タンパク質抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼを抑制するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、およびDNAメチルトランスフェラーゼタンパク質抑制
因子からなる群より選択される少なくとも２の試薬を細胞に接触させることを含
む方法。 - 【請求項３６】 接触細胞の細胞成長の抑制が、単一試薬に接触された細胞
の細胞成長より大きい請求項３５の方法。 - 【請求項３７】 群より選択された各試薬が、実質的に純粋である請求項３
５の方法。 - 【請求項３８】 細胞が、腫瘍細胞である請求項３５の方法。
- 【請求項３９】 群より選択された試薬が、操作可能に結合されている請求
項３５の方法。
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|---|---|---|---|
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