KR100688045B1 - 인테그린 αｖ-아단위 발현 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인테그린 α_v 아단위를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가지며 아폽토시스를 유도하는 능력을 지닌 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

아폽토시스, 안티센스 올리고뉴클레오티드

Description

인테그린 αｖ-아단위 발현 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{Antisense oligonucleotides for the inhibition of integrin αv-subunit expression and a pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 인테그린 α_v 아단위를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가지고, 아폽토시스를 유도하는 능력을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

인테그린 α_vβ₃는 가장 잘 알려진 비트로넥틴 수용체이나, 피브로넥틴, 피브리노겐, 오스테오폰틴, 폰 빌리브란트 인자, 트롬보스폰딘, 콜라겐과 같은 접착성 단백질의 RGD를 다양한 정도로 매우 무차별적으로 인지한다[Hynes, Cell 69(1992) 11-12; Horton, Int J. Biochem. Cell Biol. 29(1997) 721-725].

이와 같은 무차별적인 특성에도 불구하고, 인테그린 α_vβ₃는 광범위하게 발현되지는 않는다. 이것은 파골세포에서 주요 인테그린으로서 고도로 발현된다. 파골세포는 골다공증을 유도하는 골 흡수에 주요 기능을 담당한다. 인테그린 α_vβ₃은 오스테오폰틴 또는 골-타액 단백질과 같은 골 단백질에 파골세포가 접착되는 것을 매개하여, 골 흡수를 자극시킨다[Chorev, Biochemistry 37(1995) 367-375]. 모노클로날 항체를 전신으로 투여하거나[Crippes, Endocrinology 137(1996) 918-924] 또는 RGD를 포함하는 뱀 독 단백질 에취스타틴(echistatin)[Fisher, Endocrionology 132(1993) 1411-1413]을 이용할 경우에, 골다공증이 있는 랫트 모델에서 골 흡수를 억제할 수 있다는 것이 개념의 증거로써 보고되었다. 이로써, 골다공증의 치료 또는 예방에 인테그린 α_vβ₃이 유망한 표적이 된다.

인테그린 α_vβ₃는 휴지기 혈관에서 최소로 발현되나, 생체내(in vivo)에서 맥관형성 동안에 상당히 상향 조절된다[Brooks, Eur. J. Cancer, Part A 32A(1996) 2423-2429; Brooks, DN&P 10(1997) 456-461]. 맥관형성은 안질환, 만성 염증, 건선, 상처 치유 및 암과 같은 다양한 병리 상태에서 주요한 역할을 한다. 항체 또는 펩티드 길항제를 이용하여 인테그린 α_vβ₃의 기능을 후속적으로 차단할 경우에, 몇몇 생체내 모델에서 혈관이 형성되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다는 것이 밝혀졌다[Stroemblad, Chem. Biol. 3(1996) 881-885]. 인테그린 α_vβ₃이 이의 리간드에 결합하는 것을 방해함으로써, 증식중인 맥관형성 혈관에 선택적으로 아폽토시스를 유도할 수 있다[Brooks, Cell 79 (1995) 1157-1164; Ruoslahti, Kidney Int. 51(1997) 1413-1417, [Meredith, Trends Cell. Biol. 7(1997) 146-150]. 인테그린 α_vβ₃은 맥관형성 동안에 독특한 기능을 갖는 것으로, 즉, 특정 생존 시그날을 제공하여 맥관 세포의 증식을 촉진하는 것으로 보인다. 이와 같은 기능으로 인하여, 인테그린 α_vβ₃은 종양 및 상기에서 언급한 다른 질환의 치료를 위한 중요한 표적이 될 수 있다. 재발협착증은 인테그린 α_vβ₃를 표적화하여 피할 수도 있는 또 다른 질환중의 하나이다. 평활근 세포(SMC)도 인테그린 α_vβ₃이 발현하는 또 다른 부위이고[Hoshiga, Circ. Res. 77(1995) 1129-1135], 기구(balloon) 카테터 손상은 오스테오폰틴 및 인테그린 α_vβ₃ mRNA 발현을 모두 유도할 수 있다[Panda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(1997) 9308-9313]. 인테그린 α_vβ₃은 SMC의 생존 및 이동을 촉진하는 것으로 보인다[Leavesley, J. Cell. Biol. 121(1993) 163-170][Clyman, Exp. Cell Res. 200(1992) 272-284]. 펩티드 길항제를 이용하여 이들의 활성을 차단시킬 경우에, 신동맥내막의 비후화가 감소되었다[Matsuno, Circulation 90(1994) 2203-2206; Choi, J. Vasc. Surg. 19(1994) 125-134; Yue, Fundam. Clin. Cardiol. 28(1997) 69-83].

인테그린 α_vβ₃에 대한 mAb LM609를 생체내 및 시험관내에서 이용하여, 다양한 질환 모델, 예를 들면 사람의 유방암/SCID 마우스 모델[Brooks, J. Clin. Invest. 96(1995) 1815-1822], 토끼의 각막[Friedlander, Science 270(1995) 1500-1502]에서 맥관형성을 억제하였고, 또한 병아리 융모요막에서의 종양에 의해 유도된 맥관형성[Brooks, Cell 79 (1994) 1157-1164]을 억제하였다. 요약하면, mAb LM609는 기존의 혈관에는 아무런 영향을 주지 않으면서 맥관형성중인 혈관에서는 아폽토시스를 유도하여, 맥관형성을 붕괴시킨다. 또한, 이는 생체내에서 종양의 성장을 방해할 뿐만 아니라, 대부분의 경우에서, 상당한 퇴행을 유도하였다[Brooks, Cell 79 (1994) 1157-1164].

최근 입증된 바에 따르면, 인테그린 α_vβ₃ 및 α_IIbβ₃를 모두 억제하는 mAb c7E3(ReoPro; Centocor/Lilly)가, 완전한 상 Ⅲ 시험에서, 혈관성형술후 폐색 증상 뿐만 아니라 재발협착증과 연관된 후기 증상을 효과적으로 감소시킨다[Topol. Am. J. Cardiol. 75(1995) 27B-33B].

인테그린 α_v 아단위에 대한 항체인 17E6는 인테그린 α_vβ₃, α_v β₅ 및 α_vβ₁와 반응하여, 누드 마우스 종양 모델에서 종양 진행을 강력하게 억제한다[Mitjans, J. Cell. Sci. 108(1995) 2825-2838].

인테그린 α_vβ₃(IC₅₀=49 nM)에 선택적으로 결합할 수 있는 사이클릭 펩티드[사이클로-RGDfV](소문자는 D-아미노산을 나타냄)[Pfaff, J. Biol. Chem. 269(1994) 20233-20238; Wermuth, J. Am. Chem. Soc. 119(1997) 1328-1335] 또한, 병아리 융모요막상에서 종양에 의해 유도되는 맥관형성을 억제하는데 성공적으로 이용된 바 있다[Brooks et al. Cell 79(1994) 1157-1164].

인테그린 α_vβ₃의 기능을 억제할 수 있는 또 다른 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이다[E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543(1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376]. 모두 포스포로티오에이트형인 18-mer 인테그린 α_v 아단위 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 흑색종 세포에서 인테그린 α_v 아단위 합성을 억제할 수 있었다[Nip, J. Clin. Invest. 95(1995) 2096-2103]. 마우스 인테그린 α_v 아단위는 마우스-특이적인 21-mer α_v 안티센스 올리고뉴클레오티드[Martin, P.T., & Sanes, J.R.(1997) Development 124, 3909-3917] 및 마우스 특이적인 43-mer α_v 안티센스 올리고뉴클레오티드[Wada, J., Kumar, A., Liu, Z, Ruoslahti, E., Reichardt, L., Marvaldi, J., & Kanwar, Y.S.(1996) J. Cell Biol. 132, 1161-76]를 이용하여 억제하였다. 상기된 세 가지 올리고뉴클레오티드 중의 하나로 처리하였을 경우에 어떠한 아폽토시스의 유도가 관찰되지 않았다. 세 가지 경우 모두, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모두 포스포로티오에이트형이다. Nip 등은 사람의 비트로넥틴 수용체 α_v 아단위(HSVTNR=사람 인테그린 α_vβ₃; AC M14648)의 뉴클레오티드 41-58에 대해 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 AS-3에 대해 설명한 바 있다. 이 영역에는 HSVNTR의 해독 개시 부위가 포함된다.

"골 전이성 유방 암 세포에서 α_v 인테그린이 아폽토시스를 억제한다"(Townsed et al.; diclosed on the ASBMR Meeting in 1998)의 요약서에는 인테그린 α_v 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과에 대해서는 요약되어 있으나, 이 올리고뉴클레오티드의 특정 서열이나 구조에 대한 설명은 없다.

본 발명의 전반적인 개요는,

a) 인테그린 α_v 아단위(=인테그린 α_v)을 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가지고;

b) 아폽토시스를 유도할 수 있는 능력을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명은,

a) 인테그린 α_v를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가지고;

b) 인테그린 α_v mRNA를 포함하는 세포와의 접촉시, 당해 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제공하는 것이다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체는, 세포와의 접촉시, 아폽토시스를 유도하는 시그날 전달 경로에 관여하는 하나 이상의 단백질의 발현을 조절할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체는, 예를 들면 p21 발현의 증가, bcl-2 발현의 감소 및/또는, 세포로 흡수되는 경우, 세포 접착의 억제를 유도하고; 예를 들면, 파골세포와의 접촉시, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체는 골 흡수의 억제 및/또는 세포의 세포질로부터 핵으로의 p53의 이동을 유도한다.

또한, 본 발명은

a) 인테그린 α_v을 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가지고;

b) 세포와의 접촉시, 특정 기질에 대한 세포의 접착을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제공한다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체는 세포외 매트릭스 단백질, 혈청 단백질, 골 절편, 비트로넥틴, 피브리노겐, 피브로넥틴에 속하는 하나 이상의 단백질을 포함하는 기질에 세포가 접착되는 것을 억제할 수 있다.

본 발명은 또한, 고형 지지체상에 적절하게 보호된 단량체가 축합된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제조하는 방법에 대해 설명한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인테그린 α_v를 발현하는 세포를 선택적으로 제거하는 제제에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인테그린 α_v를 발현하는 세포의 접착을 선택적으로 제거하는 항-접착제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 서열 4 내지 서열 8 또는 서열 12중 하나를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 작제하고 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하는, 인테그린 α_v의 발현을 억제하는 방법을 포함한다.

또한 본 발명은, 인테그린 α_v을 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 작제하고, 세포와 접촉시켜, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하도록 하여, 일정 정도로 인테그린 α_v의 발현을 억제함으로써, 특정 기질 세포의 접착을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 인테그린 α_v를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 작제하고, 세포와 접촉시켜, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하도록 하여, 일정 정도로 인테그린 α_v의 발현을 억제함으로써, 인테그린 α_v를 발현하는 세포를 제거하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 인테그린 α_v을 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 작제하고, 세포와 접촉시켜, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하도록 하여, 일정 정도로 인테그린 α_v의 발현을 억제함으로써, 아폽토시스를 유도하는 하나 이상의 시그날 전달 경로에 관여하는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체 및, 경우에 따라 생리학적으로 허용가능한 부형제 및 적당한 첨가제 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 합성하여, 세포 또는 세포의 프로브와 접촉시켜, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하는지를 결정하는 것을 특징으로 하는 인테그린 α_v를 발현하거나 과발현하는 세포를 동정하기 위한 진단 시약 및/또는 시험 키트, 및 방법에 관한 것이다.

이와 같은 시험 키트 또는 진단 시약은 인테그린 α_v의 발현하거나 과발현하 는 세포를 동정하는데 적합하여야 하고, 시험 키트 또는 진단 시약은

a) 인테그린 α_v를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체; 및

b) 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드를 형성하는지를 감지할 수 있는 시약을 포함한다.

상기 올리고뉴클레오티드(이하 "ON")에 상응하는 핵산의 부분은 그 길이가 5 내지 100개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 8 내지 26개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 10 내지 20개의 뉴클레오티드이다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 5 내지 100개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 8 내지 26개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 10 내지 20개의 뉴클레오티드를 가진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 길이는 18, 16, 14 또는 12개이다.

올리고뉴클레오티드는 인테그린 α_v 아단위를 암호화하는 핵산의 일부와 상응하는 서열을 가진다. 이때 "상응하는"("Corresponds")이란 당해 올리고뉴클레오티드가 이의 염기의 배열에 의해 올리고뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산의 부분과 하이브리드를 형성할 수 있는 것을 말한다. 핵산의 경우, 올리고뉴클레오티드 서열내에 핵산 염기의 순서가 동일하거나(센스 올리고뉴클레오티드) 또는 반대(안티센스 올리고뉴클레오티드)일 수 있다.

또한, 올리고뉴클레오티드는 핵산 서열과 비교시, 하나 이상의 부정합을 가질 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 mRNA, 이본쇄 또는 일본쇄 DNA 또는 cDNA와 각각 하이브리드를 형성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 삼중나선 형성 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 앞타머(aptamer)일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

인테그린 α_v 아단위를 암호화하는 핵산 서열은 인테그린 α_v 아단위 또는 이의 일부인 125kDa 단편 또는 25kDa 단편을 암호화하는 임의의 서열일 수 있다. 핵산은 cDNA, mRNA 또는 유전자 또는 이의 일부일 수 있다. 핵산 서열의 기원은 임의의 동물, 바람직하게는 포유류 동물, 가장 바람직하게는 사람일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 사람의 인테그린 α_v 아단위 cDNA의 각 부분에 상응하거나 이로부터 유도될 수 있다.

사람 인테그린 α_v 아단위 cDNA 서열은 EMBL 또는 NCBI와 같은 유전자-데이타베이스로부터 입수할 수 있다. 사람 인테그린 α_v 아단위 서열, 예를 들면 수탁번호 M14648, J02826 및 M18365의 것을 이용할 수도 있다. 사람 인테그린 α_v 아단위 cDNA의 일부는 문헌[Suzuki et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, p. 8616]에 따라 입수할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 1(표 1)의 부분에 상응한다.

서열 1내에, 두 개 부분의 바람직한 영역이 존재한다: a) 코어 영역 1(서열 2); 서열 1에 도시된 HSVTNR 유전자의 뉴클레오티드 37-60, b) 코어 영역 2(서열 3): 서열 1에 도시된 HSVTNR 유전자의 뉴클레오티드 122-147(코어 영역은 밑줄로 표시). 본 발명의 적절한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 2 또는 서열 3 또는 이의 일부에 상응한다. 코어 영역중 하나에 대한 올리고뉴클레오티드는 그 길이가, 예를 들면 8 내지 26개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 20개의 뉴클레오티드이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 18개 이하의 올리고뉴클레오티드를 가진다.

서열 2: 5'-CGGC GATGGCTTTT CCGCCGCGGC-3'

서열 3: 5'-GTGCCGCGC CTTCAACCTA GACGTGG-3'

올리고뉴클레오티드의 서열을 예시하면 다음과 같다:

서열 4: 3'-GAAGCCGCTACCGAAAAGGC-5'

서열 5: 3'-CGCGTGAAGCCGCTACCG-5'

서열 6: 3'-GCTACCGAAAAGGCGGCG-5'

서열 7: 3'-GCTGCCGAGAGAGCAACG-5'

서열 8: 3'-GCGGAAGTTGGATCTGC-5'

서열 12: 3'-GCGGAAGTTGGACCTGC-5'

본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 6 또는 이의 일부를 갖거나, 이의 올리고뉴클레오티드 서열이 추론될 수 있다(예컨대, 하나 이상의 부정합을 가짐). 본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 6을 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산은 마우스의 인테그린 α_v 아단위의 cDNA이다. cDNA는, 예를 들면 문헌[Wada et al. (1996) J. Cell Biol. 132, p. 1165]에 기술되어 있다. 올리고뉴클레오티드 서열의 예로는 서열 9가 있다.

서열 9: 3'-GCTACCGACGAGGGCCCG-5'

본 발명은 올리고뉴클레오티드 유도체, 예를 들면, 이들의 염, 특히 생리학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 염 및 생리학적으로 허용되는 염은 문헌[Remingtons Pharmaceuticals Science(1995) Mack publishing Company, Easton, PA(page 1418)]에 기술되어 있다. 또한 유도체는 하나 이상의 변형을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다: 예를 들면 특정 뉴클레오시드 위치에서 또는 특정 뉴클레오시드간 브릿지에서, 올리고뉴클레오티드 동족체(예: 폴리아미드 핵산(Polyamid Nucleic Acids(PNA)), 인산 모노에스테르 핵산(PHONA=PMENA), 올리고뉴클레오티드 키메라(예: DNA- 및 PNA-부분, 또는 DNA 및 PHONA-부분으로 구성됨)).

본 발명의 대상은 올리고뉴클레오티드, 특히 사람의 인테그린 α_v 아단위 mRNA(HSVTNR mRNA)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이는 뉴클레아제에 대해 내성을 갖도록 변형되며, 단 이들 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 브릿지(모두 포스포로티오에이트)로 균일하게 변형되지 않고, 이들은 각 처리된 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있다.

예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 "천연 뉴클레오티드"("천연 뉴클레오시드 염기" 포함) 데옥시아데노신 포스페이트, 데옥시구아노신 포스페이트, 데옥시이노신 포스페이트, 데옥시시티딘 포스페이트, 우리딘 포스페이트 및 피리딘 포스페이트로 전적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 경우에 따라 하나 이상의 변형 예컨대, 화학적으로 변형된 부분을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 몇 개의 동일한 및/또는 상이한 변형을 가질 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드에는 올리고뉴클레오티드 동족체 및 올리고뉴클레오티드 키메라가 포함된다.

따라서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 성질을 개선시키기 위해 하나 이상의 화학적으로 변형된 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 변형된다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 변형될 수도 있으며, 단, 모든 포스포디에스테르 브릿지가 포스포티오에이트 브릿지로 대체되는 경우, 단지 이에 한정되지 않는다(올리고뉴클레오티드는 추가로 다른 형태의 변형을 가질 수 있다).

당업자에게 공지된 화학적 변형의 예는 문헌[E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 and "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993 and S.T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36(1996) 107-129]에 기술되어 있다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이며, 각 변형은 다음에 각 언급된 변형으로부터 독립적으로 선택될 수 있다;

a) 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포 디에스테르 브릿지의 변형된 포스포디에스테르 브릿지로의 대체;

b) 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포 디에스테르 브릿지의 데포스포 브릿지로의 대체;

c) 당 포스페이트 주쇄중의 당 포스페이트 분자가 또 다른 단위로의 대체;

d) β-D-2'-데옥시리보스의 변형된 당 라디칼로의 대체;

e) 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 대체;

f) 올리고뉴클레오티드의 성질에 영향을 주는 분자에 올리고뉴클레오티드의 접합;

g) 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에서 3'-3' 및/또는 5'-5' 역위의 도입.

올리고뉴클레오티드의 화학적 변형의 더욱 상세한 예를 들면 다음과 같다:

a) 하나 이상의 인산 디에스테르 브릿지의 변형된 포스포디에스테르 브릿지로의 대체, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR¹R^1'-포스포라미데이트, 보라노포스페이트, 포스페이트-(C₁-C₂₁)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C₆-C₁₂)아릴-((C₁-C₂₁)-O-알킬]에스테르, (C₁-C₈)알킬-포스포네이트 및/또는 (C₆-C₁₂)-아릴포스포네이트 브릿지로의 대체[여기서, R¹과 R^1'는 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₁₈)-알킬, (C₆-C₂₀)-아릴, (C₆-C₁₄)-아릴-(C₁-C₈)-알킬, 바람직하게는 수소, (C₁-C₈)-알킬 및/또는 메톡시에틸, 특히 바람직하게는 수소, (C₁-C₄)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, 또는 R¹과 R^1'은 질소 원자와 함께, O, S 및 N중에서 하나의 이종원자를 추가로 포함할 수 있는 5 내지 6개 원의 헤테로사이클릭 환을 형성한다];

b) 하나 이상의 3'-또는 5'-인산 디에스테르 브릿지(포스포디에스테르 브릿지)의 "디포스포" 브릿지로의 대체[Uhlmann, E. and Peyman, A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press. Totowa 1993, Chapter 16, 355ff)], 예를 들면, 포름아세탈기, 3'-티오포름아세탈기, 메틸하이드록시아민기, 옥심기, 메틸렌디메틸하이드라조기, 디메틸렌술폰기 및/또는 실릴기로의 대체;

c) 당 포스페이트 주쇄중의 하나 이상의 당 포스페이트 단위체의 또다른 단위체로의 대체, 예를 들면, "모르폴리노 유도체" 올리고머[참조: E.P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17(1989) 6129] 및/또는 폴리아미드 핵산("PNA"), [참조: P.E. Nielsen et al., Bloconj. Chem. 5(1994)3], 예컨대, 2-아미노에틸글리신 및/또는 인산 모노에스테르 핵산(포스포모노산 에스테르 핵산; "PHONA")[참조: Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35(1996) 2632-2638 및 EP 0 738 898 A2]를 형성하기에 적합한 단위체로의 대체;

d) 하나 이상의 β-D-2'-디옥시리보스 단위체의 변형된 당 라디칼로의 대체, 예를 들면, β-D-리보스, α-D-2'-디옥시리보스, L-2'-디옥시리보스, 2'-F-2'-디옥시리보스, 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스, 2'-O-(C₂-C₆)알케닐-리보스, 2'-[O-(C₁-C₆)알킬-O-(C₁-C₆)알킬-리보스, 2'-NH₂-2'-디옥시리보스, β-D-실로퓨라노스, α-아라비노퓨라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 및 카보사이클릭[참조: Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114(1992) 8320)] 및/또는 개환 당 동족체[참조: Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223] 및/또는 이환 당 동족체[참조: M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481]로의 대체;

e) 하나 이상의 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 변형 또는 대체, 예를 들면, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-(C₁-C₆)-알킬-우라실, 5-(C₂-C₆)-알케닐-우라실, 5-(C₂-C₆)-알키닐-우라실, 5-(C₁-C₆)-알킬-시토신, 5-(C₂-C₆)-알케닐-시토신, 5-(C₂-C₆)-알키닐-시토신, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신 또는 7-데아자-7-치환된 퓨린으로의 변형 또는 대체;

f) 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드)의 성질[예: 세포침투, 뉴클레아제에 대한 안정성, 표적 핵산(예: HSVTNR 표적 서열)에 대한 친화성 또는 약물역학의 개선]에 영향을 주는 하나 이상의 분자와 올리고뉴클레오티드와의 접합: 변형된 올레고뉴클레오티드가 표적 서열과 하이브리드를 형성하는 경우, 결합 및/또는 가교를 통해, 상기 분자는 표적 핵산 서열을 공격할 수 있다; 예로는, 폴리리신과의 접합체, 피렌, 아크리딘, 페나진 또는 페난티리딘과 같은 삽입제(intercalating agent)와의 접합체, 플루오레세인과 같은 형광성 화합물과의 접합체, 프소랄렌 또는 아지도프로플라빈과 같은 가교제와의 접합체, (C₁₂-C₂₀)-알킬과 같은 지질친화성 분자와의 접합체, 1,2-디헥사데실-락(rac)-글리세롤과 같은 지질과의 접합체, 콜레스테롤 또는 테스토스테론과 같은 스테로이드와의 접합체, 비타민 E와 같은 비타민과의 접합체, 폴리-또는 올리고-에틸렌글리콜과의 접합체, (C₁₂-C₁₈)-알킬 포스페이트 디에스테르와의 접합체, 및/또는 O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)알킬과의 접합체를 들 수 있다; 이들 분자들은 5'말단 및/또는 3'말단 및/또는 서열내, 예컨대, (변형된) 뉴클레오시드 염기에 접합될 수 있다; 화학적 변형의 특정 구체예는 a) 지질분자(예, (C₁₂-C₂₀)-알킬)와 올리고뉴클레오티드의 접합체, b) 콜레스테롤 및/또는 테스토스테론과 같은 스테로이드와 올리고뉴클레오티드의 접합체, c) 폴리- 및/또는 올리고에틸렌글리콜과 올리고뉴클레오티드의 접합체, d) 비타민 E와 올리고뉴클레오티드의 접합체, e) 피렌과 같은 삽입제와 올리고뉴클레오티드의 접합체, f) (C₁₄-C₁₈)-알킬 포스페이트 디에스테르와 올리고뉴클레오티드의 접합체, 및/또는 g) O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)-알킬과 올리고뉴클레오티드의 접합체에 관한 것이다; 올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되었으며, 이는 문헌[Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan in "Antisense Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Chapter 17, p. 303ff, and EP-A 0 552 766]에 기술되어 있다;

g) 본 발명의 다른 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 3' 또는 5'말단에, 3'-3' 및/또는 5'-5' 역위를 나타낼 수 있다: 이런 형태의 화학적 변형은 당업자에게 공지되었으며, 예를 들면 문헌[M. Koga et alm J. Org. Chem. 56(1991) 3757]에서 기술되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 대부분의 경우에 안티센스 올리고뉴클레오티드에 효과 영역으로 공지된 해독 개시 부위(서열 1, 뉴클레오티드 1 내지 60)(표 1 및 2) 부근의 핵산 서열의 일부에 상응한다. 서열 1의 일부에 상응하는 서열을 가지고, 추가로 변형된 다수의 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 그 특징을 조사한다. 놀라운 것은 HSVTNR의 뉴클레오티드 50-67(서열 1, 표 1 및 2의 번호)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(ON 5543로 명명함)가 뉴클레오티드 44-63(ON 5541), 41-58(AS-3, Nip et al.), 및 39-56(ON 5542)에 대한 다른 올리고뉴클레오티드보다 HSVTNR 발현을 더욱 효과적으로 억제한다는 것이다.

ON 5543 서열은 뉴클레오티드 50-67에 상응하고, ON 5541은 뉴클레오티드 44-63에 상응하고, AS-3(Nip et al)는 뉴클레오티드 41-48에 상응하고, ON 5542은 뉴클레오티드 39-56에 상응한다.

올리고뉴클레오티드 ON 5543, ON 5541, ON 5542, AS-3(Nip et al)는 변형된 다. 올리고뉴클레오티드 AS-3는 모두 포스포로티오에이트이며, 모든 포소포디에스테르 브릿지가 포스포티오에이트 브릿지로 대체된다. 다른 올리고뉴클레오티드내에서는 특정 위치만 변형된다. 서열내에 변형 위치를 나타내었다(변형 타입: 포스 포디에스테르 브릿지는 티오포스페이트 브릿지로 대체됨).

서열 4: (ON 5541)

3'-G^*A^*AGC^*C^*GC^*TAC^*C^*GAAAAG ^*G^*C-5'

서열 5: (ON 5542) 안티센스

3'-C^*G^*C^*GT^*GAAG^*C^*CGC^*TA ^*C^*C^*G-5'

서열 6: (ON 5543) 안티센스

3'-G^*C^*T^*AC^*CGAAAAGG^*CGG^*C^*G-5'

*는 포스포로티오에이트 잔기를 나타냄.

발명은 동일한 위치에 변형을 갖으나, 변형 타입이 다른 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

다른 올리고뉴클레오티드를, 상기 올리고뉴클레오티드의 서열 특이성을 결정하는 대조군 올리고뉴클레오티드로서 사용한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 서열 10, 11 및 7을 대조군 올리고뉴클레오티드로 이용한다.

서열 10: ON 5043 (0N 5543의 역위된 대조군)

5'-G^*C^*T^*AC^*CGAAAAGG^*CGG^*C^*G-3'

서열 11: ON 5044 (0N 5543의 센스)

5'-C^*G^*ATGGC^*TT^*TT^*CCGCC^*G^*C-3'

서열 7: ON 5045 (0N 5543의 부정합)

3'-G^*C^*T^*GC^*CGAGAGAG^*CAA^*C^*G-5'

*는 포스포로티오에이트 잔기이고, 서열 7에서 부정합 부분은 밑줄을 침.

안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하였을 경우에, α_v 단백질 수준이 감소되었으나, 다른 단백질 수준은 변화가 없기 때문에 표적 단백질(표적 단백질은 인테그린 α_v 아단위임) 또는 표적 서열(인테그린 α_v 아단위를 암호화하는 핵산)에 특이적인 억제라는 것을 알 수 있다: 기준으로 b₃ 및 액틴 단백질 수준을 측정하는 이유는 이들의 수준에 변화가 없기 때문이다. 따라서, 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 인테그린 α_v 아단위의 발현을 특이적으로 억제한다. 또한, ON 5543의 단축형도 사람의 비트로넥틴 수용체 α_v 아단위의 발현을 각각 차단하거나 억제할 수 있다.

또한, 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 ON 5543가 기존의 연구에서 이용된 모두 포스포로티오에이트화된 것보다 특이성이 더 높은 것으로 나타났다(Nip et al., Martin et al.; Wada et al.).

HSVTNR RNA상의 제 2 영역은 암호화 영역내에서 동정될 수 있으며, 뉴클레오티드 에 대한 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 동정된다. 예를 들면, 뉴클레오티드 128~145(뉴클레오티드 128~145에 상응)을 포함하는 ON 5959는 인테그린 α_v 단백질 합성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이 영역은 사람, 병아리, 마우스, 등 상이한 종간에서 상당한 서열 상동성을 보인다.

사람, 병아리, 마우스 서열의 비교 및 각 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 다음에 나타내었다.

사람 128 5'-CGCCTTCAACCTAGACG-3' 145

갈루스 5'-CGCCTTCAACCTGGACG-3'

마우스 5'-CGCCTTCAACCTGGACG-3'

상응하는 안티센스 서열은 다음과 같다;

서열 12:

3'-GCGGAAGTTGGACCTGC-5'

서열 12: ON 5473 ("보존영역-1" 안티센스)

3'-G^* C ^*GGAAG^* T ^* TGGAC ^* C ^* TG^* C-5'

서열 13: ON 5474 (역위된 대조군)

5'-G^* C ^*GGAAG^* T ^* TGGAC ^* C ^* TG^*C 3'

서열 14: ON 5475 (센스)

5'-C ^*GC ^* CT ^* T ^* CAAC ^* C ^* TGGA^*C^*G 3'

서열 8: ON 5959 ("보존영역-2" 안티센스)

3-G^* C ^*GGAAG^* T ^* TGGAT ^* C ^* TG^* C-5'

밑줄은 5-프로피닐 피리디민, * 포스포티오에이트 브릿지를 나타낸다.

올리고뉴클레오티드 "보존영역-1"는 사람에 대해 한 개의 부정합을 가지나, 마우스 및 병아리에 대해서는 완벽한 서열을 가진다.

올리고뉴클레오티드 "보존영역'2"는 사람에 대해서는 완벽한 서열을 가지나, 마우스 및 병아리에 대해서는 한 개의 G-T 부정합을 가진다.

본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 브릿지의 일부를 포스포로티오에이트 브릿지로 대체하면 제조될 수 있다. 특히, 본 발명은 최소한으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 최소한으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 원리는 문헌[A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377(1996) 67-70 and EP 0 653 439]에 기술되어 있다. 이 경우에, 5' 말단 및/또는 3' 말단에 1-5, 바람직하게는 1-3개 말단 뉴클레오티드 단위가 보호되는데, 예를 들면, 상응하는 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5'말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지를 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지로 대체할 수 있다. 또한, 바람직하게는 하나 이상의 내부 피리미딘 뉴클레오시드를 변형시킨다 . 바람직하게는 내부 피리미딘 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 뉴클레오시드간 브릿지를 포스포로티오에이트 브릿지로 변형시키거나 대체시킨다. 최소한도로 변형된 올리고뉴클레오티드는 특히 유익한 성질을 가지는데, 예를 들면, 최소한으로 변형되어 뉴클레아제에 대한 안정성이 상당히 높은 것으로 나타났다. 또한, 모두 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 이용과 관련된, 이들의 비-안티센스 효과가 상당히 감소되었다(Stein anal. Krieg(1994) Antisense Res. Dev. 4,67). 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 모두-포스포로티오에이트화된 것보다 결합 친화력이 더 높은 것으로 나타났다.

본 발명의 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 1-5의 3' 및/또는 5' 말단이 변형될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 비-말단 피리미딘 뉴클레오시드 및/또는 피리미딘 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5'말단에 위치한 포스포디에스테르 브릿지가 변형될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에는 최소한으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 예를 들면, 최소한으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 다음의 포스포로티오에이트 패턴을 나타낸다;

서열 6: 5'-G^*C^*GGC^*GGAAAAGC^*CA^*T^*C ^*G-3'

서열 8: 5'-C^*GT^*C^*TAGGT^*T^*GAAGG^*C ^*G-3'

(*는 포스포로티오에이트 브릿지를 나타낸다).

이와 같이 최소한으로 변형된 올리고뉴클레오티드에는 뉴클레오시드 염기가 5-프로피닐피리미딘으로 치환된 다른 형태의 변형도 포함된다.

서열 8 : 5'-C ^*GT ^* C ^* TAGGT ^* T ^*GAAGG^* C ^*G-3'

(C:5-프로피닐시토신, T:5-프로피닐우라실, * : 포스포로티오에이트 브릿지)

또 다른 구체예는 DNA 및 2'-O-메틸-RNA로 구성된 키메라 올리고뉴클레오티 드로 구성된다.

서열 6: 5'-G ^* C ^* GGC ^* GG AAAAGC^* CA ^* T ^* C ^* G-3'

서열 8: 5'-C ^* GT ^* C ^*TAGGT^*T ^* GAAGG ^* C ^* G-3

(*는 포스포로티오에이트 브릿지를 말하고, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸-리보뉴클레오시드는 밑줄을 쳤다).

또 다른 적절한 구체예는 예를 들면 DNA 및 RNA로 구성된 키메라 올리고뉴클레오티드로 구성된다.

서열 6: 5'-G^*C^*GGC^*Ggaaaagccatcg-3'

서열 8: 5'-C^*GT^*C^*TAggttgaaggcg-3'

(*는 포스포로티오에이트 브릿지를 의미하고, PNA 부분의 서열은 소문자로 나타내었다)

서열 6: 5'-G ^* C ^* GGC ^* Ggaaaagccatcg-3

서열 8: 5'-C ^* GT ^* C ^* TAggttgaaggcg-3'

(*는 포스포로티오에이트 브릿지를 의미하고, PNA 부분의 서열은 소문자로 나타내었다, 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드(2'-O-메틸리보뉴클레오시드 단위는 밑줄을 쳤다).

또 다른 적절한 구체예는 예를 들면 3' 또는 5' 말단에 헥사데실(C16)잔기를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된다.

서열 6: 5'-C16-G^*C^*GGC^*GGAAAAGC^*CA^*T^*C ^*G-3'

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 특징적인 기능 활성을 나타내는데; 이들은 인테그린 α_v(=인테그린 α_v 아단위) 단백질 합성을 효과적으로 억제시키는데, 이는 대조군 올리고데옥시뉴클레오티드(ON)를 이용한 프로브에 대해 단백질 양을 측정함으로써 설명을 할 수 있다. 또한, 파골세포를 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 처리하면, 투여량에 따라, 파골세포의 접착이 기질-특이적으로 감소되고, 골 흡수가 낮은 수준의 IC₅₀(2x10^-10㎛)으로 억제된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 세포 수축과 일치되는 형태학적 변화의 원인이 되고, 비스-벤지미드를 이용한 DNA 염색으로 관찰된 바와 같이 처리된 세포에서 아폽토시스를 유도하는데, 이는 TUNEL에 의한 초기 단계의 단편화된 DNA가 나타남으로써 확인될 수 있다. 놀라운 것은 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사이클린/사이클린 의존성 키나제 복합 억제제 p21^WAF1/CIP1의 발현을 자극시키고, 세포 생존 유전자 bcl-2의 발현을 억제한다. 대조적으로, 세포 사멸을 촉진하는 유전자 bax의 발현에는 변화가 없다. 이로써 기본적으로 아폽토시스에 대한 세포내 시그날로 알려진 bcl-2/bax 비율이 감소되는 것이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 다양한 암 세포주에서 활성을 가진다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 ON 5543는 유방 암종 MDA-MB231 세포의 세포 접착을 억제하는 반면에, 이에 상응하는 센스 및 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드는 이와 같은 효과를 가지지 못한다. 10nM 내지 1㎛ 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도에서 투여량에 따라 세포 접착이 차단되었다. 놀라운 것은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 처리한 암 세포에서 아폽토시스가 유도된다는 것이 관찰되었으며, 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 종양 치료에 유용하다.

놀라운 것은 인테그린 α_v 아단위 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리시에 상이한 하류 시그날 전달 기작에도 영향을 주는데; 아폽토시스를 유도하는 작용을 하는 기작은 세포 유형에 의존한다(ON의 세포 유형 특이적인 기능 활성).

따라서, 본 발명은 특이적이고 예상치 않은 기능을 가지는 올리고뉴클레오티드에 관한 것인데, 올리고뉴클레오티드를 세포와 접촉시켰을 경우에, 올리고뉴클레오티드는 아폽토시스에 관여하는 하나 이상의 단백질의 발현을 조절한다; 첫째로, 본 발명은 p21 발현을 증가시키는, 특히 p21^WAF1/CIP1발현 증가를 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 둘째로, 본 발명은 bcl-2 발현 감소를 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 셋째로, 본 발명은 bax 발현에 영향을 주지 않는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 bcl-2 발현을 감소시키나, bax 발현에는 영향을 주지않는다. 올리고뉴클레오티드는 bcl-2/bax 비율을 감소시켜 당해 올리고뉴클레오티드는 아폽토시스에 대한 세포내 시그날을 유도한다.

올리고뉴클레오티드는 또 다른 특정한 기능을 가지는데, 본 발명의 또 다른 구체에에서, 올리고뉴클레오티드는 세포 접착의 억제를 유도하는데, 바람직하게 당해 효과는 투여량 의존성이다. 적절한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 고정-의존성 성장을 억제한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 골 흡수의 억제를 유도하고 바람직하게 당해 효과는, 투여량-의존성이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 제조 방법은 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 것이다. 적절하게는 화학적 합성은 올리고뉴클레오티드 합성에 이용되는 표준 방법인데, 예를 들면 실시예 1에서 설명하는 포스포아미디트 방법이다.

본 발명은 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드로서, 아답타머(adaptomer) 또는 리보자임으로서 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 인테그린 α_v 아단위 발현을 억제함으로써, 아폽토시스에 관여하는 하나 이상의 단백질의 발현을 조절하고; 세포에서 아폽토시스를 유도하고; 세포 접착을 억제시키고; 골 흡수를 억제하고; 맥관형성중인 혈관의 아폽토시스를 유도하여 맥관형성 및 혈관형성을 억제하고, 특히 이와 같은 혈관형성이 종양 성장 및 종양 전이와 관련이 있을 경우에 맥관 형성을 억제한다. 따라서, 본 발명은 종양 치료 및 종양 전이를 예방하는데 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 세포와 접촉시켰을 때, 인테그린 α_v 아단위 발현을 억제하는 방법, 아폽토시스에 관여하는 단백질의 발현을 조절하는 방법 및/또는 아폽토시스를 유도하는 방법 및/또는 세포 접착을 억제하는 방법 및/또는 골 흡수를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, α_v 단백질 또는 이의 돌연변이체의 발현을 전부 또는 부분적으로 조절 또는 억제하여, 해독을 전부 또는 부분적으로 억제하는데 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 세포에 접촉시키는 방법 및 세포로 올리고뉴클레오티드를 도입시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 표적이 되는 핵산과 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화시키는 방법 및 인테그린 α_v 표적 핵산의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 약제로서 올리고뉴클레오티드의 용도와 약제를 제조하는데 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 올리고뉴클레오티드를, 인테그린 α_v 아단위의 발현 또는 과발현(발현의 증가)과 연관된 질환의 예방 및 치료에 이용되는 약제에 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드와, 생리학적으로 허용 가능한 부형제, 적절한 첨가제 또는 보조제를 혼합시킴을 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 인테그린 α_v 아단위 또는 이의 과발현이 원인이 되는 병인이거나 이와 관련된 질환을 치료하는데, 이들 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제의 용도 또는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 골다공증의 치료 및 예방; 심혈관 질환 가령, 재발협착증의 치료 및 예방, 종양 성장 및 전이를 억제하여 암을 치료하기 위해 제조된 약제학적 조성물 또는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 전이 또는 암 치료용, 재발협착증 치료용, 암을 치료하는데 이용되는 약제를 제조하거나 종양 전이 및 재발협착증을 예방하는데 올리고뉴클레오티드의 용도 또는 이와 같은 용도의 약제를 제조하는데, 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 현재 암을 치료 또는 종양의 전이 또는 재발협착증을 예방하는데 이용되는 방법등의 공지의 치료 방법과 조합하여, 종양 전이 또는 재발협착증의 예방 또는 암의 치료에 이용하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 방사능 요법 및 공지의 화학치료제 가령, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 5-플로오르우라실, 아드리아마이신, 다우노루비신, 탐옥시펜등과 조합하는 것이다.

본 발명은 또한, 올리고뉴클레오티드 및/또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 보조제 물질로 구성된 약제학적 제제에 관한 것이다.

올리고뉴클레오티드 및/또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염을 동물, 바람직하게는 포유류 가장 바람직하게는 사람에게 투여하는데, 이때 약제 자체만을 투여하거나 국소, 피하, 장관외, 장에 이용할 수 있는 형태의 혼합물과 함께 투여할 수 있는데, 이때 활성 성분으로 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 유효량과 통상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 보조 물질이 투여될 수 있다. 제제는 보통 치료요법적으로 활성을 가진 화합물이 0.1 내지 90중량%로 구성된다. 재발협착증을 치료하기 위해서는 카테터를 이용하여 국소투여하는 것이 바람직하다. 암의 경우에는 주입 및 경구 투여가 바람직하고, 골다공증의 경우에는 구강 투여가 바람직하다.

약제학적 생성물은 공지의 방법(e.g. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA)을 이용하여, 약제학적으로 비활성의 유기 또는 무기 부형제를 이용하여 제조할 수 있다. 락토스, 옥수수 전분, 이의 유도체, 활석, 스테아르산 및 이의 염을 이용하여, 알약, 정제, 코팅된 정제, 경질 젤라틴 캡슐을 제조할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 및 좌약을 만드는데 이용되는 부형제로는 지방, 왁스, 반고형 및 액상 폴리올, 천연 및 경화된 오일등이 있다. 용액 또는 시럽을 만드는데 이용할 수 있는 적절한 부형제로는 물, 슈크로즈, 전화 당, 포도당, 폴리올등이 있다. 주사용액을 제조하는데 적절한 부형제로는 물, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 식물성 오일등이 있다. 마이크로캡슐, 이식물, 로드에 적합한 부형제로는 글리콜산 및 젖산으로된 혼합형 고분자가 있다. 또한, 당업자에 공지된 리포좀 조성물(N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15(1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992) 가령, HVJ 리포좀(Hayashi, Gene Therapy 3(1996) 878)이 적합하다. 경피 투여하기 위해서는 전리요법을 이용한 방법 또는 전기천공을 이용하여 효과적으로 투여할 수 있다. 또한, 리포펙틴 및 유전자 요법에서 이용되는 것과 같은 다른 운반 시스템을 이용해도 된다. 진핵세포 또는 진핵세포의 핵으로 매우 효과적으로 올리고뉴클레오티드를 도입시키는데 이용되는 시스템이 특히 바람직하다.

활성 성분 및 부형제에 추가하여, 약제학적 조제물에는 충진제, 증량제, 분해제, 결합체, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 에멀젼화제, 보존제, 감미제, 염료, 향료, 방향제, 농후제, 희석제, 완충제와 같은 첨가제를 포함하고, 또한, 용매, 용해제 또는 지연 방출 효과를 얻기 위한 물질 및 삼투압을 변형시키기 위한 물질, 피복제 또는 항산화제도 포함할 수 있다. 약제학적 조제물에는 두 개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 또는 이의 생리학적으로 내성을 가진 염과 한 가지 이상의 상이한 치료요법적으로 활성 성분이 포함될 수 있다. 투여량은 각 개인의 경우에 따라 광범위한 범위내에서 조절하여 다양하게 할 수 있다.

본 발명은 비정상적인 세포 증식, 세포 이동, 세포 분화, 맥관형성, 망막 축색 과다 성장, 골 흡수, 식작용, 면역 반응, 시그날 전달, 신생물 세포의 전이와 연관된 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 구성된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이와 같은 약제학적 조성물을 암, 암의 전이, 안과 질환, 만성 염증, 건선, 재발협착증의 치료 및 예방, 상처 치유 지원등에 이용할 수 있다.

기질에 세포가 접착하는 것은 세포외 매트릭스의 성분을 인지하고 결합할 수 있는 특정 수용체, 소위 "세포 접착 분자"의 발현에 요구되는 중요한 과정으로 인식되어왔다(1). 인테그린 수용체는 세포가 세포외 매트릭스에 결합하는 가장 연관성이 있는 세포-표면 단백질이다. α 및 β인테그린 아단위가 치환되어 많은 접착 단백질에 대한 수용체로서 작용하는데, 이들이 세포외 매트릭스와 상호작용에 의해 정확한 세포 성장, 생존, 기능을 할 수 있도록 한다(2)(3). 파골세포는 파골세포의 재접착 활성으로 인하여 세포간 공극내에 미네랄화된 골 매트릭스와 접하는 부분에서 주로 발견되는 골 흡수성, 다핵 세포이다(4). 골 흡수로 파골세포는 골 표면에 부착되어, 단단하게 고정됨으로써 밀봉 막을 형성하게 되고, 이와 같은 특정 접착 부위는 흡수 공극의 조절된 조성물을 유지하는 역할을 한다(5). 세포외 봉해진 공간에서, 단백질 분해 효소 및 수소 이온이 골의 유기 및 무기 성분을 분해한다(6). 파골세포 기능에서 봉해진 막의 조직이 중요하기 때문에, 세포의 접착 성질을 간섭하는 조건이 흡수 활성을 조절한다(7).

파골세포를 포함하는 선별된 세포 유형에 비트로넥틴 수용체(인테그린 α_vb₃)가 존재하는데, 이와 같은 세포에서 상당한 수준으로 발현되어 흡수 활성에 대해 기능적 역할을 하게 된다(8). 수용체는 ~150kDa의 α_v 아단위 및 ~95 내지 115kDa의 β₃아단위로 구성된다(9). 비트로넥틴이외에도, α_vb₃는 골 매트릭스 단백질 오스테오폰틴 및 골 태액 단백질에 존재하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 접착성 서열 모티프를 인지한다(10,11). 많은 α아단위의 경우에, α_v 쇄은 리간드 특이성을 결정하는데 주요 역할을 한다(10,12). β₃ 쇄에 비하여, 4개 이상의 다른 b 아단위(β_1, β_5, β₆ 및 β₈)와 이종이량체를 형성할 수 있고, 종간에 상당히 보존된 부분을 가지는 것으로 알려져 있다(12). 이를 고려하여 볼 때, 이와 같은 정보로 인테그린 α_v 아단위는 세포의 접착성 활성과 연관된 특정 기능을 조절하는 중요한 표적이 될 수 있다.

α_v 매개된 세포 접착을 억제하는 것을 목적으로 하는 전략을 골 질환 증후에 치료요법적 방법을 실시할 수 있을 뿐만 아니라 골 석화증에서 파골세포 활성이 손상된 기작을 인식할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드(ON)는 유전자 발현을 서열-특이적으로 억제한다(13-20). 포스포디에스테르 브릿지화된 ON는 혈청 및 세포내에서 급속하게 분해되는데, 이들의 반감기는 2시간이 안된다(14,15,21,22). 그러나, 자연 발생 포스포디에스테르 브릿지를 화학적으로 변형시킬 경우, 가령, 브릿지를 연결하지 않는 산소를 황으로 대체하면, 뉴클레아제에 대해 세포내 안정성을 증가시킨다(23,24). 또한, 부분적인 포스포오르티오에이트도 표적 단백질의 양이 감소될 때 동일한 효과를 가지고, 포스포로티오에이트화된 분자와 관련된 서열과 무관한 부작용을 감소시키는데 추가 장점을 가지는 것으로 나타났다(25)(19). 이와 같은 연구에서, 부분적으로 포스포로티오에이트화된 α_v-안티센스 ON를 이용하고, 이와 같은 물질이 파골세포 접착을 손상시키고, 골 흡수를 손상시킨다는 결과를 얻었다. 또한, α_v 안티센스 ON 처리하면 토끼의 파골세포에서 시험관내 상태로 아폽토시스를 유도하고, 이와 같은 아폽토시스 과정은 p21^WAF1/CIP1 및 bcl-2 유전자의 변형된 발현과 수반된다는 것이 처음으로 확인되었다.

인테그린-매개된 세포 고정은 여러 세포의 기능을 조절하는데(1-3), α_vb₃ 수용체는 파골세포 활성을 조절하는데 주요한 역할을 하는 것으로 공지된 바 있다(38,39). 놀라운 것은 α_v 인테그린 발현이 안티센스에 의해 특이적으로 억제가 될 경우에, 파골세포 접착 및 골 흡수가 모두 감소되고, p21^WAF1/CIP1 및 bcl-2의 조절과 연관된 기작(bax 유전자는 아님)에 의해 예정된 세포 사멸을 시험관내에서 유도한다는 것을 밝혔다.

접착 손상은 오랫동안 골 흡수를 억제하는 중요한 기작인 것으로 설명된 바 있다. 이 연구에서, α_v 인테그린 아단위 합성이 안티센스 기작에 의해 합성될 때 이와 같은 억제를 관찰할 수 있고, 반면에 b₃ 인테그린 아단위 수준에는 변화가 없었다. 이와 같은 효과는 안티센스 ON 및 표적이 되는 mRNA사이에 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍의 특이성에 기초하는 것으로 이는 세포내에 특정 유전자의 발현을 차단할 수 있는 가능성을 제공하는 것이다(14,19,22,24,40). 다양한 조직 배양 실험 및 최근 몇 가지 생체내 연구에서 이것이 보고된 바 있다(41). 안티센스ON의 작용 기작은 일반적으로 증명하기 어렵지만(14,16,42,43), 이 연구에서 특정 안티센스 효과를 지원할 수 있는 상당히 설득력있는 증거를 수득하였다. 우선, 관찰된 억제는 α_v-안티센스 ON만이 효과가 있는 서열 특이적이라는 것이다. 이는 센스, 역위된 부정합 대조군 ON는 효과가 없기 때문이다. 둘째로, 관찰된 억제는 표적 단백질에 특이적이라는 것이다. 그 이유는 α_v 단백질 수준만이 감소되었고, b₃ 및 액틴의 수준은 변화가 없었다.

이 연구에 이용된 AUG 개시 부위까지 연장된 α_v 안티센스 ON가 사람의 서열 염기 220 및 237 사이에 위치하고, 토끼 유전자와 상보적이다. 이 시약은 기질에 대해 접착을 통하여 국소 농도 효과로 결정한 바와 같이 적어도 높은 효능을 가지는데, 이는 시험관내에서 흑색종 세포 접착을 억제하는 것으로 보고된 AS3 및 AS4 α_v 안티센스 ON보다 휠씬 크다는 것이다(37).

안티센스 DNA 방식을 이용하여 다수의 파골세포 기능을 조절하였다(32,44-47). V-ATPase의 16kD 및 60kD에 대한 ON는 높은 투여량(약 30mM)에서, 랫트 파골세포 골 흡수 및 편재화를 억제하였다(44,45)고 설명하는데, 이는 흡수 파골세포에서 일반적으로 관찰되는 F-액틴이 파괴된다는 것을 현미경으로 볼 수 있다(2,48). 5543 α_v 안티센스 ON은 F-액틴 환 구조에는 명백한 영향을 주지 않았으나(결과는 나타내지 않음), 분명히 예정된 세포 사멸을 유도하였다. 이는 세포가 신속하게 파괴되는 것으로 설명할 수 있다(49,50).

기질에 대한 접착은 세포외 매트릭스에 접착되어 성장하는 세포의 생존에 중요하다고 오랫동안 여겨져왔다(3). 다양한 세포 유형에서 고정-의존성 성장은 기능의 조절 및 유전자 발현 조절로 설명되어왔다(51,52). 고정-의존성에서 고정-독립성 성장으로의 전이는 신생물 형질변환의 특징으로서 정상 세포는 생리학적 거동에 있어서, 기질과 상호작용시에 의존성 성장을 한다. 아폽토시스는 세포 수축, 염색질 응축, 핵 단편화등을 특징으로 하는 상당히 보존된 활성을 가지는 세포 기작이다(49). α_v 안티센스 ON으로 처리한 모든 세포에서 이들 모두를 볼 수 있는데, 이는 기질에 대한 상호작용의 변화가 시험관내에서 파골세포의 크기를 조절한다는 것을 의미한다.

세포 증식 및 세포 사멸간의 균형을 조절하는 여러 유전자에 의해 세포 사멸 프로그램이 조절된다(49,50). 세포는 미소환경에서 제공받은 정보 및 세포 기작에 의해 해석된 정보를 기준으로 아폽토시스를 수행한다. 아폽토시스를 조절하는 세포-표면 수용체 매개된 기작이 종종 특정 유전자의 전사를 조절하는 제 2 메신져의 활성화와 연관된 시그날 전달 시스템으로 작용한다(49,50). 예를 들면, p21^WAF1/CIP1유전자는 사이클린/사이클린-의존성 키나제 CDK를 억제하는 단백질을 암호화한다(53). 맥관형성동안에, α_vb₃의 결합은 p21^WAF1/CIP1의 발현을 억제하고 세포 생존을 자극하기 위한 것으로 설명된 바 있다(54). 우리 연구에 따르면, 우리는 5543 안티센스 ON에 의한 α_v 인테그린 합성이 억제되어, 파골세포 및 파골세포 전구물질이 많은 혼합된 집단에서 p21^WAF1/CIP1발현을 자극한다. 이 유전자는 후기 유사분열 세포로 예측되는 처리되지 않은 파골세포 뿐만 아니라 소수(9%)의 단핵세포에서 분명하게 감지된다. 그러나, 파골세포에서 이의 면역검출이 강화되었고, 동시에 유전자를 발현하는 단핵 세포의 수가 대조군 ON-처리된 배양물에 비하여, α_v 안티센스가 증가되었다는 것을 알 수 있다. p21^WAF1/CIP1에 의해 사이클린-CDK 복합체의 방해로 세포 사이클 전이에 중요한 인산화 반응을 방해하였다. 최근에는 이와 같은 세포 과정 억제제가 말단 분화와 연관이 있는 성장을 억제하는데 연구되었다고 제안된 바 있다(55). 또한, DNA 손상의 효과적인 복구를 유도하거나 아폽토시스를 유도하는(56,57) 과정에서 이 유전자의 가능한 역할에 대한 가설이 제안되었다. 생체내 및 시험관내에서 α_vb₃-매개된 접착동안에 내피 세포에서 p21^WAF1/CIP1단백질의 발현이 억제되고, 섬유아세포-세포외 매트릭스 상호작용의 파괴에 반응하여, 자극을 받는 것으로 밝혀졌다(58). 이와 같은 자료로 세포 생존을 촉진시키기 위해 p21^WAF1/CIP1의 인테그린 의존성 고정 및 조절사이에 직접 연결될 가능성이 있다는 것을 알 수 있다.

세포 생존을 조절하는데 관여하는 여러 유전자가운데, 두 개 접합 변이체 Bcl-2a 및 Bcl-2b를 암호화하는 bcl-2 유전자는 세포 사멸의 음성 조절물질로 알려져 있다(49,50). bcl-2는 비주기 세포의 생존을 연장시키고, 주기 세포의 아폽토시스에 의한 사멸을 방해한다(49,50). 대조적으로, bax 유전자는 사멸을 촉진하는 인자로 작용하는 Bcl-2에 반대되는 역할을 하는 단백질을 암호화한다. Bcl-2는 Bax와 이량체를 형성하는 이의 능력을 기초로한 세포 생존을 강화시키는 것으로 공지되어 있다(49,50); 따라서, bcl-2/bax 비율이 높은 경우에는 세포 생존을 촉진시키고, 반면에 bcl-2/bax 비율이 낮을 경우에는 아폽토시스를 유도한다. 이 연구에서 α_v 의존성 고정이 손상되어 유도되는 파골세포의 예정된 사멸은 bax 수준에서 변화라기 보다는 bcl-2 발현이 급격히 감소된 것과 관계가 있다. 이 과정으로, 파골세포 및 이들의 가상 전구물질에서 아폽토시스를 유도할 수 있는 bcl-2/bax 비율을 분명하게 낮춘다. 이 내용에서, 흥미로운 것은 스트롬블래드(Stromblad et al)(54)이 최근에 설명한 것과 같이, 소의 혈청 알부민 피복된 표면에서 내피 세포가 접착되지 않는 경우에 고정된 항-α_vb₃ 항체에 부착된 세포에 대해 bcl-2의 감소 및 bax의 증가를 유도하는 이들 두 유전자의 발현에 영향을 준다는 것이다. 이와 같은 발견으로 다른 세포 모델에서 α_v 인테그린 의존성 고정 억제는 bcl-2 및 bax 유전자 생성물의 발현에 분명한 영향을 주어서, bcl-2/bax 비율을 감소시킨다.

결론적으로 본 연구는 파골세포의 α_v 인테그린 아단위 mRNA를 안티센스 ON으로 처리할 경우에 높은 특이성 및 성능으로 접착 및 골 흡수를 성공적으로 억제하고, 파골세포 및 이들의 조상물질의 생존에 α_v-의존성 고정이 필수적이라는 것을 보여주었다. α_v-매개된 접착 억제 및 p21^WAF/CIP1 및 bcl-2/bax 비율사이에 명백한 관련은 토끼 파골세포계에 아폽토시스를 촉진하는 과정에 있다는 것을 나타낸다. 이와 같은 방법의 개발로 골 질환의 대체 요법의 길을 열었다.

가장 흔한 악성 종양은 흔히 골격과 관련이 되는데, 예를 들면 진행된 유방 암종이 된다(59). 영국에서는 여성의 7 내지 10%가 유방암이며, 전세계적으로는 여성 악성종양의 1/5정도로, 이들 환자의 절반은 전이성 질환으로 인하여 사망한다(60). 골 전이는 대부분의 1차 종양과 연관이 있는데, 일부 악성 종양은 골격으로 번진다. 특히, 전립선 암 및 유방 암종은 대부분이 골로 전이된다(59,60). 따라서, 관련된 기작을 분명하게 밝히는 것이 새로운 효과적인 치료법 개발에 도움이 되어, 근본적으로 불치의 질환을 예방할 수 있다.

암이 퍼지기 위해서는 1차 종양 부위로부터 세포가 분리되어, 부차적인 정착 위치로 이동, 접착되어야 한다. 많은 연구가들은 여러 세포 접착 분자가 전이에 중요한 역할을 하고, 인테그린은 종양이 퍼지는데 근본적으로 관련이 된다는 것을 보여주었다(61).

인테그린은 세포-세포 및 세포-ECM(ECM=세포외 매트릭스)간의 상호작용에 관련될 뿐만 아니라 세포로 시그날을 보내는데도 관련되어, 세포의 미소 환경을 감지하여, 정상 및 질환이 있는 상태에서 세포 이동, 분화, 생존 및 조직 재구성과 같은 세포 활성에 주요한 역할을 한다(64,65).

유방암 세포주의 경우에, 고유의 부계 배경과 비교하였을 때 종양 상태에서 인테그린의 수준이 상당히 변화되었다. α_v 인테그린, 특히 비트로넥틴(α_vβ₃)의 발현이 상당하고, 유방 암종이 골로 전이되는데 주요 역할을 한다(66). 모노클로날 항체, 펩티드와 같은 다양한 항-접착성 처리 효과를 연구하는데 다양한 유방 암종 세포주를 이용할 수 있으며, 여기에는 MDA-MB 세포주가 포함된다. 메이어(Meyer)와 그의 동료(66)의 연구에서, 이들은 8개의 다른 유방암 세포주에서의 α_v 인테그린 발현을 측정하여, 고유의 α_vβ₃ 비트로넥틴 수용체는 MDA-MB231 세포주에서만 발현되고, 이에 반하여, α_vβ₅는 모든 유방 암 세포에서 발현되고, α_vβ₁이 주로 발현됨을 밝혔다. α_v 아단위는 항-암 치료에 주요 인자가 될 것이다. 비트로넥틴 수용체가 종양 진행에 중요하며, 흑색종 세포형태서 볼 수 있는 것(68,69)과 같이 침투성 표현형(66, 67)의 발현에도 중요한 것으로 보인다. 따라서, 1차 종양 성장 및 전이에서 결정적인 효과를 가지는 유방 암 인테그린 발현 프로파일을 변형시키기 위한 시도가 상당히 주목되고 있다.

유방암에서 α_v 인테그린 아단위의 세포 기능을 억제하도록 고안된 안티센스 ON의 치료요법적 능력이 관찰된다. 인테그린 α_v 아단위에 특이적인 안티센스 ON를 적은 투여량으로 제공받은 MDA-MB231(사람 유방 암종 세포 주) 세포 주의 생리에 대해 광범위한 분석을 통하여, 세포가 ECM(세포외 매트릭스)에 접착되는 것이 효과적으로 억제되었음을 알 수 있다. 이와 같은 항-접착성 효과는 총 α_v 단백질 수준이 감소되어, 예정된 세포 사멸이 활성화되었기 때문이다.

ON 5543는 아폽토시스 비율을 증가시킨다. 기질에 고정되는 것을 방해할 경우에, 세포내 아폽토시스에 대한 시그날을 활성화시키는 것으로 공지되어 있고, α_v 수용체는 이와 같은 과정을 방해하는데 핵심 역할을 한다(74-77). 아폽토시스는 핵의 단편화 및 DNA가 "아폽토시스성 형태"로 패키지되기 전에 전사 과정을 요구하는 활성 과정이 된다(78). 이는 세포의 사멸을 활성화시키는 몇 가지 세포 "스위치"가 있는데, 그중 하나가 p53 단백질로써, 이는 DNA 손상을 감지하여, 사이클린-사이클린 의존성 키나제 복합체의 억제제 p21^WAF1/CIP1의 활성화를 통하여 G₀ →G₁ 세포 주기를 정지시키는 유전자 생성물이다(75,79). 아폽토시스에 대한 다른 시그날은 Bcl-2 및 Bax 유전자 생성물의 상호 변화에 의해 나타난다. Bcl-2/Bax의 비율이 감소될 경우에, Bax 생성물의 사전-아폽토시스가 우선한다. MDA-MB231 세포를 이용한 연구에서, 이와 같은 유전자의 발현이 ON5543에 의해 변경되지는 않았다. 그러나, p53 단백질은 세포질로부터 핵으로 이동하였고, 이는 다른 세포 모델에서 α_v-매개된 접착이 방해된 결과로 일어나는 반응이다(75). MDA-MB231 세포주에 의해 발현되는 p53은 돌연변이형으로(79), 이의 시그날 전달 경로는 아직 완전하게 밝혀지지 않았다.

α_v-인테그린 수용체는 파골세포 생리 및 유방암 세포가 골로 전이되는 것에 모두 관련이 있는 것으로 증명되었다(68,69). 파골세포가 기질에 접착하는 것을 방해하기 위한 다른 수단도 이미 이용된 바 있다. 여기에는 α_vβ₃ 중화 항체, 뱀 독소 디스인테그린 에키스타틴 및 RGD 펩티드가 포함된다(71,72). 다른 연구자들은 최근에 α_vβ₃ 인테그린에 길항작용을 하는 펩티드가 아닌 소분자 유사체(SC-68448)를 이용하면 유리하다는 것을 보인 바 있다(80). RGD 펩티드와 비교하였을 경우에, ON 5543은 α_vβ₃에 상당히 특이적이고, 항체 및 비-펩티드 유사체와는 모순되게, 이는 관련된 β아단위와는 무관하게 모든 α_v 수용체를 차단한다. α_vβ₃ 수용체이외에, 파골세포 및 유방 암종 세포 또한, α_vβ₁ 및 α_vβ₅ 수용체를 발현시킨다(66,71,72). 따라서, α_v 유전자(mRNA)를 표적으로 하는 ON 5543는 전이성 병소에 관련된 세포 유형에 공유되는 기작을 차단시키는데 상당히 효율적이고, 모든 α_v 수용체에 특이적이다.

접착에 대한 효과는 상당히 유사하지만, 파골세포 및 MDA-MB231 세포에서 ON 5543에 의해 활성화되는 아폽토시스 과정을 실시하는 기작은 일부 특정 측면에서 상이한 것으로 보인다. 파골세포는 p21^WAF1/CIP1 발현을 증가시키지만 Bcl02/Bax 비율은 감소시키는 반면에(77), 이들 유전자중에 어느 것도 MDA-MB231 세포에서 변형되지 않았다. 이는 α_v 유전자에 의해 조절되는 아폽토시스에 대한 세포내 시그날이 아마도 다른 세포에 특이성을 나타냄을 지적하는 것이다.

ON 5543에는 p21^WAF1/CIP1 사이클린-사이클린 의존성 키나제 복합체 억제제와는 무관하나, 세포 생존 인자 Bcl-2 및 사전-아폽토시스성 인자 Bax의 p53이 관련된(p53 발현에는 변화가 없으나, 세포질로부터 핵으로 p53가 이동한 것이 관찰됨) 기작과 아폽토시스를 유도한다. 종양 세포와 파골세포의 ECM과 접촉하는 것을 방해하는데 있어서, ON 5543의 효능은 당해 화합물이 전이성 골 질환을 차단할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예

약어

BAS: 소 혈청 알부민

DMEM: 듈베코(Dulbecco's) 변형된 최소 필수 배지.

ECL: 강화된 화학발광

FBS: 태아 소 혈청

ON: 올리고뉴클레오티드

PBS: 인산완충 식염수

TRAP: 타르타르산-내성 산 포스파타제

TUNEL: TdT-매개된 dUTP-바이오틴 닉 및 표지화

방법

시약

세포 배양 배지, 시약 및 혈청은 제조원[Hyclone(Ronfegenstraat, Holland) 또는 Gibco Lifesciences(Inchinnan, UK)]으로부터 구입하였다. 배양 접시 및 멸균 유리 그릇은 제조원[Falcon Becton-Dickinson(Lincoln Park, NJ) 및 Costar Co.(Cambridge, MA)]의 것을 이용하였다. 아폽토시스/DNA 단편화 검출 키트(TUNEL)는 제조원[Chemicon(Tamecula, CA)]의 것이다. 최상 순도 등급의 화학물질은 제조원[Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)]의 것을 이용하였다. 사람의 α_vβ₃, 23C6 모노클로날 항체(26) 및 α_v, 13C2 모노클로날 항체는 본 발명자의 실험실에서 제조하였다. 사람의 α_v 모노클로날 항체(클론 #139) 및 사람의 α_v 폴리클로날 항체(클론 #1264)(27)은 기관[Department of Dermatology, State University of New York at Stony Brook, New York]으로부터 구입하였다. 항-p21^WAF1/CIP1(Ab-5) 및 p53(OPO9) 항체는 제조원[Oncogene Research Calbiochem(Cambridge, MA)]에서 구입하였다. 항-Bcl-2(sc 492), 항-Bax(sc 493), 항-액틴(sc 1616) 및 2차 항체는 제조원[Santa Cruz Biotechnology Inc.(Heidelberg, Germany)]의 것을 이용하였다. ECL 키트는 제조원[Amersham International plc(Little Chalfont, U.K.)]의 것을 이용하였다. 1,25-디하이드록시 비타민 D₃는 제조원[Roche S.P.A.(Milan, Italy)]의 것을 이용하였다.

RT-PCR:

α_v를 상당히 많이 발현시키는 토끼의 비장 및 골수 조직으로부터 tRNA를 수즉하였다. 두 개 인접 프라이머 α_v1 및 α_v3는 198bp(도 1)를 증폭시켰다. 내부 α_v2.1 및 3'α_v3 프라이머는 133bp 밴드를 증폭시켰지만, 이 생성물에는 ATG 개시 부위를 포함되지 않는다. 따라서, 주형으로 α_v1 + α_v3 생성물을 이용하고, 프라이머로 α_v1 및 α_v2를 이용한 PCR을 통하여, 개시 부위 서열을 포함하는 82bp 밴드를 증폭시켰다. 이는 pCR2.1내로 서브클론된 T:A이고, 정방향 및 역방향으로 자동적으로 서열을 조사하였다.

세포;

새로 태어난(4-7일) 뉴질랜드 화이트 토끼로부터 파골세포를 새로 분리하였다(Chamber et al.(30) and Caselli et al. (31)). 세포를 49-90분 동안 기질에 부착할 수 있도록 한 다음, 수분으로 포화된 95% 공기 및 5% CO₂ 대기하에서, 10% FBS, 100IU/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양시켰다. 토끼 파골세포를 골수로부터 시험관내상태에서 분화시켰다. 골수는 장골 및 상기에서 설명한 배양물로부터 흘러나왔다. 24시간 후에, 접착 및 반복적으로 세척시켜, 비-접착된 세포를 제거하고, 전체 접착된 세포 분취물은 10일간 10nM 1,25-디하이드록시 비타민 D₃로 배양시켰다. 배양이 종료될 시점에서, 약하게 트립신으로 처리하여, 오염된 기질 세포를 제거하고, 파골세포의 표현형은 TRAP 활성에 대해 포지티브 염색, 100nM 연어 칼시토닌에 대한 수축, 흡수 구멍 형성등으로 평가하였다.

마우스의 파골세포를 시험관내에서 만들고, 문헌[Tanaka et al.,(32)]에서 설명하는 것과 같이 특징을 조사하였다.

MDA-MB231 사람 유방 암종 세포주는 ICRF 포유류 세포 배양 실험실 및 ETCC에서 얻었다. 세포는 37℃ 5% CO₂, 95% 습식 대기상태에서, 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 100U/㎖ 페니실린, 0.2㎎/㎖ 스트렙토마이신, 0.2% 글리신을 포함하는 Earle 염과 함께 듈베코 변형 최소 필수 배지(DMEM)에서 배양하였다.

MDA-MB231 세포를 ON으로 처리;

ON을 DMEM 원액 용액으로 희석하고, 사용하기 전까지 -20℃에 보관한다. MDA-MB231 세포를 처리하는 과정에는 흡입 강화 리포펙타민(5㎍/㎖) 하에서 실행하였다. 리포펙타민을 적절히 희석시킨 ON와 혼합시키고, 세포에 투여하기 전에 30분간 전배양시킨다.

기질;

파골세포를 유리, 골, 상아질상에 분주하였다. 10% FBS를 포함하는 DMEM를 인공 기질상에서 세포 배양하는 동안에 표준 접착 기질로 이용하였다. 또 다른 방법으로, 유리 커버슬립에 접착성 단백질을 미리 피복시키고, 그 다음 세포는 혈청을 소량 포함하는(1%) DMEM에 배양시켰다. 기질 피복을 위해서, 20% FBS 또는 10㎍/㎖ 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 소섬유 콜라겐을 접착성 기질의 원료로 이용하였다. 웰에는 단백질을 피복시켜, 3시간 또는 4℃에서 하룻밤동안 배양시켰다. 용액은 60% 메탄올로 대체시키고, 웰을 추가 1시간 동안 4℃에 배양시켰다. 메탄올을 흡입에 의해 제거하고, 웰은 30분간 실온에서 50mM Tris-HCl(pH 7.8), 110mM NaCl, 5mM CaCl₂, 1% BSA, 0.1mM 페닐메틸설포닐플로라이드를 포함하는 100㎕ 완충액으로 배양시켰다. 마직막으로, 웰을 0.2% BSA가 보충된 DMEM로 3회 씻어내고, 실험에 바로 이용한다.

ON으로 처리;

ON을 물에 용해시키고, 원액 DMEM로 희석시킨 다음, 사용하기 전까지 -20℃ 에 저장하였다. 세포를 여러 다른 기간동안 적절한 농도의 ON로 배양시켜 파골세포를 처리한다.

FITC-ON 표지된 분석;

FITC-표지된 ON을 합성하여, 세포로 이들이 취해지는 정도와 기질에 접착하는 정도를 모니터한다. 세포는 24시간동안 1㎛ FITC-ON로 배양시켜, 고정시키고, 공촛점 형광 현미경(Leica Tcs-NT system)으로 관찰하였다. 유리 또는 상아질에 접착을 위해, FITC-ON(0.2-20㎛)로 최고 24시간 배양시켰다.

아폽토시스;

상 대비 현미경을 이용하여 세포의 모양을 관찰하였다. DNA의 아데닌-티미딘 부분에 특이적으로 결합하는 비스벤지미드(Bisbenzimide)를 이용하여 핵을 염색시켰다. 세포는 Carnoy 고정제(메탄올-빙초산 3:1)으로 고정시키고, 30분간 0.5㎍/㎖ 비스벤지미드에 배양시키고, 헹군 다음(2x 증류수), 글리세롤-PBS 1:1에 첨가한 다음, 통상의 에피형광 현미경을 통하여 관찰하였다.

단편화된 DNA를 평가하기 위해, TUNEL 방법(34)을 이용한다. 간단하게 설명하면, 세포를 4% 완충된 파라포름알데히드에 고정시키고, 씻어낸 다음(2분, 4x 증류수), TdT 완충액에 실온, 5-10분간 배양시킨다. 완충액을 제거한 후에, 세포를 Tdt- 및 바이오틴-dUPT를 포함하는 완충액에, 37℃ 60분간 배양시킨다. 세포를 TdT를 포함하는 완충액을 이용하여 실온에서 15분간 씻어낸 다음, 2분간, 4x증류수로 씻은 다음, 차단제를 이용하여 차단시키고, 아비딘-결합된 FITC로 30분간 37℃에서 배양시켰다. 세포를 PBS(5min, 3x)로 씻은 다음, 0.5㎍/㎖ 요오드화 프로피디움으로 역염색을 시키고, PBS(3min)로 씻은 다음, 통상의 에피형광 현미경상에 올려놓고 관찰하였다.

통계치;

3회 이상의 별도 실험을 통하여 평균 +SE로 데이터를 나타내었다. 통계학적 분석은 변수에 대한 일방 분석(ANOVA), 스투던트 시험(Student's test), 만-하트네이 시험(Mann-Whitney test)으로 실시하였다. p값이 < 0.05인 경우에 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주한다.

실시예 1; 올리고데옥시뉴클레오티드 합성

α _v ON 서열 및 토끼의 AUG 개시 부위 서열

본 연구에서 이용된 몇 가지 ON 서열을 표 3에 나타내었다. BLAsT 배열 프로그램을 기초로하여, 사람의 비트로넥틴 수용체의 α_v 아단위에 대해 부분적으로 포스포로티오에이트화된 안티센스 ON을 선택하였다(35). α_v 아단위에 대해 공지의 종별 변이체 배열에서 해독 개시 부위 부근에 상당히 상동성이 높은 것으로 나타났다(도 1A). 다음의 연구에는 토끼 파골세포가 이용되었기 때문에, 토끼의 해독 개시 부위는 RT-PCR를 이용하여 결정하였다. 세쌍의 축중 프라이머를 만들어, 복합시키면, 토끼의 서열이 나타난다(도 1B 및 1C). 도 1D에서는 ON 5543 안티센스 서열을 포함하는 토끼의 α_v 서열을 나타낸다. 서열은 상당히 상동성이 높은 데(98.9%), 단, 토끼 α_v에는 사람의 서열에 있는 사이토신과 비교하였을 때 티미딘 염기를 포함하여, 83번 위치에 한 개 염기가 불일치한다(36).

ON은 Applied Biosystems 394 DNA 합성기(Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA) 및 포스포아미디드 화학을 이용하여 합성하였다. 결합후에, Beaucage 시약(28)을 이용하여, 황화시키고, 아세트 무수물 및 N-메틸이미다졸을 이용하여 캡핑시켜, 포스포로티오에이트 연결을 만든다. 고형 지지체로부터 잘라낸 후에, 농축 암모니아로 최종적으로 보호기를 제거한 후에, ON을 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 이용하여 정제하였다. C-5 프로피닐 피리미딘 변형된 ON는 상기에서 설명한 것과 같이 제조하였다(29). 모든 ON를 네가티브 이온 전기분무 질량 분광분석(Fisons Bio-Q)으로 분석하는데, 모든 경우에서 계산된 양을 확인하였다. 표준 아미디트를 대신하여, 올리고뉴클레오티드 합성의 최종 단계에 아신산화 시약으로 헥사데실옥시(시아노에톡시)N,N-디이소프로필 아미노포스판을 이용하여, C16-변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

올리고뉴클레오티드 분석은 다음을 이용하여 실시하였다;

a) 20% 아크릴아미드, 8M 요소, 45㎛ 트리스-붕산염 완충액, pH 7.0에서 분석용 겔 전기영동; 및/또는

b) HPLC 분석; Waters GenPak FAXcolumn, 농도 구배 CH₃CN(400㎖), H₂O(1.6I), NaH₂PO₄(3.1g), NaCl(11.7g), pH6.8(0.1M 및 NaCl) CH₃CN (400㎖) 후, H₂O(1.6I), NaH₂PO₄(3.1g), NaCl(175.3g), pH6.8(1.5M 및 NaCl);

c) 벡크만(Beckmann) 모세관 CAP^TM, U100P 겔 칼럼, 65㎝ 길이, 100㎜ I.D., 윈도우 15㎝(한 말단으로부터), 완충액 140㎛ Tris, 360mM 붕산염, 7M 요소를 이용하여 모세관 전기영동;

d) 네가티브 이온 전기분무 질량 분광도(모든 경우에 예측된 질량 값을 확인한다).

다음은 사람의 HSVTNR mRNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 제조하였다;

비교를 위한 동물 연구를 위해, 마우스의 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하였다

ON 5468 마우스 α_v 안티센스

3' G^*C^*TAC^*CGAC^*GAGGGC^*C^*C^* G 5'

*는 포스포로티오에이트 잔기, C는 프로피닐-dC, T는 프로피닐-dU이다.

실시예 2: ON 5543 안티센스 ON의 흡입 및 α _v 단백질 감소

FITC에 연결된 ON 5543 α_v 안티센스가 파골세포로 흡수되었는지를 검사하기 위해 흡수 연구를 우선 실시하였다. 생체외(EX vivo) 토끼 파골세포를 유리(도.2) 또는 상아질(나타내지 않음)에 분주하고, 형광 ON으로 내화시켜, 상당히 많은 세포내 액포에서 최대수준으로 관찰되었다(도 2); 핵은 일반적으로 흡수 정도가 낮았다.

안티센스 ON이 α_v 인테그린 합성을 감소시키는 지를 검사하기 위해, 10nM 1,25-디하이드록시 비타민 D₃존재 하에 10일간 배양된 접착성 골 골수 분취출로부터 다량의 토끼 파골세포를 시험관내 상태에서 얻었다. 10^-7M 연어 칼시토닌 반응하여, 골 흡수 및 수축시에 TRAP-포지티브 다핵화된 파골세포가 배양 6일째에 나타났고, 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하였다. 그 다음 배양물에 약하게 트립신을 처리하여, 기질 세포 오염 물질을 제거하고, 파골 세포 계 >80%를 포함하는 집단(성숙한 파골세포 및 TRAP-포지티브 가상 단핵 전구물질)은 48시간동안 ON 5543으로 처리하였다.

실시예 3: 면역블롯팅

0.5% Triton X-100 및 프로테아제 억제제를 포함하는 TBS 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.4 and 0.9% NaCl)을 이용하여, 90% 합류 배양물로부터 세포 추출물을 수득하였다. 용해물질은 과정동안에 4℃로 유지시킨다. 용해물질을 10분간 11,000g에서 원심분리시켜, 핵 및 세포 파쇄물을 제거하였고, TCA-침전시켜, Laemmli 완충액에 용해시켰다. 30㎍ 세포 단백질을 SDS-PAGE하고(8% 아크릴아미드 겔 α_v, β₃, 및 액틴의 경우에 8% 아크릴아미드 겔 사용; p21^WAF/CIP1, bcl-2, bax의 경우에는 12% 겔을 사용), 단백질을 니트로셀룰로오즈 필터로 옮긴다.

필터는 그 다음 1차 항체로 4℃ 하룻밤동안 배양시키고, 세척한 후에, 2차 항체가 결합된 양고추냉이 과산화효소를 이용하여, 실온에서 90분간 배양시키고, 세척한 후에, ECL로 감지하였다.

면역블롯팅 분석(도 3A)에서 1㎛ ON 5543 안티센스는 처리되지 않은 배양물 및 대조군 ON으로 처리된 배양물과 비교하였을 때, α_v 단백질 수준을 감소시켰다. 대조적으로, α_v 인테그린 아단위 또는 액틴 발현에서는 큰 변화가 없었다. 문헌[Tanaka et al.(32)]에서 설명하는 것과 같이 시험관내에서 생성된 마우스 파골세포를 이용하였을 경우에도 마우스-특이적인 α_v 안티센스 및 대조군 ON과 비교하였을 때 유사한 결과를 얻었다(데이타는 제공안함).

실시예 4: 세포 접착 측정

파골세포를 13㎜ 직경의 둥근 커브슬립 또는 4x4㎜ 소 골 절단면 또는 코끼리 상아의 상아편(6㎜ 직경)에 분주하고, 여러 시간대에 ON 존재하에서 배양시킨다. 배양이 종료될 시점에, 비-접착 세포를 PBS(3x)로 세척하여 제거하고, 부착된 세포는 3% 파라포름알데히드/PBS에 실온 15분간 고정시킨 후, PBS(3x)로 씻은 후에, TRAP 효소에 대해 염색시켜, 상 대비 현미경으로 관찰하였다. TRAP-포지티브 다핵화된 파골세포가 각 커브슬립 또는 골/상아편에 있는 수를 헤아려 부착을 평가하였다.

ON 5543 α_v 안티센스는 생체외에서 토끼 파골세포가 유리, 골 또는 상아질 편에 접착하는 것을 억제하였고, 골 흡수도 억제하였다. 역가 곡선은 두 개 상으로 되었고, 이는 활성이 2x10^-10㎛(p<0.05, 도.4)의 낮은 농도에서도 나타났다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 상당히 높은 능력은 기질 지지체에 국소 농도의 영향때문인 것으로 본다. 사실, FITC 변형된 ON 5543(FITC 표지된 ON 5543)는 상아질 매트릭스에 신속하게 접착되고, 이는 4시간 경에는 최대에 다다른다(도 5). FITC-ON 5543 부정합 ON이 상아질 및 유리(나타내지 않음)에 접착하는 경우에도 유사한 결과를 얻었다. 유사하게, 유리에 접착은 시간 및 ON 농도(나타내지 않음)에 따라 증가되었다. 그러나, 접착된 FITC-표지된 ON의 상대적인 양은 상아질에서 관찰되는 것보다 약 30배 적었다.

도 6에서는 세 가지 모든 대조군 ON는 5543 안티센스 ON(p<0.0001)에 대한 파골세포 접착 및 흡수를에서 생체외 억제시에 효과가 없다는 것을 알 수 있다(p=ns). 비교 연구에서는 배양물에서 흑색종 세포 접착을 억제하는 것으로 나타난 AS3 α_v 안티센스 ON(20mM, 무(nil)에 대한 접착 53%, 흡수 50% 억제) 및 AS4 α_v 안티센스 ON(20mM, 무(nil)에 대한 접착 48%, 흡수 50% 억제, n=3.8; p<0.001)에 비해 5543 안티센스 ON(20mM, 무(nil)에 대한 접착68%, 흡수 65% 억제)가 훨씬 활성이 큰 것으로 나타났다(37).

실시예 5: 골 흡수 측정

문헌[Prallet al.,(33)]의 설명에 따라 골 흡수를 평가하였다. 파골세포를 골 또는 상아질 편에 분주하고, 24-48시간동안 지속적으로 ON 존재하에서 배양시켰다. 배양이 종료될 시점에, 접착성 TRAP-포지티브 다핵화된 세포를 광 현미경하에서 헤아리고, 0.01% NaOCl에서 2분간 초음파 파쇄에 의해 제거한다. 슬라이스를 2회 증류수로 씻어내고(20분), 1% 톨루딘 블루/1% 붕소산나트륨에서 4분간 염색시키고, 통상의 광 현미경하에서 20x 비율로 관찰하였다. 각 지점에서 5개 이상의 골 절편 또는 상아질 편에 있는 흡수 구멍을 문헌[Prallet et al.,(33)]의 설명에 따라, 3개 시각 카테고리에서 헤아린다. 각 실험에서, 구멍 지역의 인텍스의 평균 기준치(비이클의 경우)를 기준으로 이용하여, 평균 기준 치의 비율로 각 값을 계산한다(31). 또는, 골 흡수는 파골세포당 구멍 수로 헤아리고, 비이클만 있는 경우에 흡수 기준 값에 대해 표준화시킨다.

대조군이 아닌 ON 5543 안티센스로 시험관내 상태에서 발생된 파골세포를 처리한 경우에, 생체외 상태에서 파골세포에서 관찰할 수 있는 것과 등가의 접착 및 흡수 억제를 볼 수 있었다(자료는 제공하지 않음). 이와 같은 분취물은 ON 5543 안티센스 ON을 지속적으로 존재하는 조건에서 분화에 필요한 10일간 배양하였을 경우에, TRAP-포지티브 다핵화된 세포 뿐만 아니라, TRAP-포지티브 가상 파골세포 단핵 전구물질이 상당히 감소되었음을 볼 수 있다. 모든 대조군 ON은 효과가 없었다(도 7). 이와 같은 결과를 볼 때, 안티센스 ON 5543는 파골세포 발생 초기 단계에서 효과가 있고, 이와 같은 세포 집단을 이용한 본 연구에서 분자 분석이 유효하다는 것을 알 수 있다.

실시예 6; 기질 특이성

파골세포에서 ON 5543(약어 5543)의 기질-특이성에 대한 영향을 평가하였다(도 8). 혈청 및 비트로넥틴에 접착시에 농도에 대한 효과를 볼 수 있다(도 8A , B)(20㎛농도에서 63% 억제, p<0.001). 피브리노겐 및 피브로넥틴의 접착 경우에(도 8C, 8D) 24시간 후에 부착된 파골세포의 수의 감소는 적지만, 통계학적으로 유의성이 있었고(p<0.01). 이에 반해 소섬유 콜라겐에 대한 접착에는 영향을 주지 못하였다(도 8E, p=ns). 파골세포 접착에 대한 ON 5543 안티센스의 효과는 기능을 차단한 모노클로날 항체 23C6(사람의 α_vβ₃에 관한 것이나, 토끼 수용체에 대해서도 교차 반응성이 있음)의 것과 비교하였다(도 8F). 23C6의 억제 효과는 혈청 및 비트로넥틴에 분주한 세포에서 가장 두드러지고, 이는 테스트한 모든 매트릭스 단백질에서의 23C6의 것과 나란한 ON 5543에 대한 반응성을 나타내는 것이다.

실시예 7: 아폽토시스의 평가

상 대비 현미경을 이용하여 세포의 형태를 평가하였다. DNA의 아데닌-티미딘 부분에 특이적으로 결합하는 비스벤지미드를 이용하여, 핵을 염색시켰다. 세포는 Carnoy 고정제(메탄올-빙초산 3:1)에 고정시키고, 30분간 0.5㎍/㎖ 비스벤지미드로 배양시키고, 씻어낸 후(2x 증류수), 글리세롤-PBS 1:1에 얹고, 통상의 에피형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.

단편화된 DNA를 평가하기 위해, TUNEL 방법을 이용한다. 간단하게 설명하면, 세포를 4% 완충된 파라포름알데히드에 고정시키고, 씻어낸 다음(2분, 4x 증류수), TdT 완충액에 실온, 5-10분간 배양시킨다. 완충액을 제거한 후에, 세포를 Tdt- 및 바이오틴-dUPT를 포함하는 완충액에, 37℃ 60분간 배양시킨다. 세포를 TdT를 포함하는 완충액을 이용하여 실온에서 15분간 씻어낸 다음, 2분간, 4x증류수로 씻은 다음, 차단제를 이용하여 차단시키고, 아비딘-결합된 FITC로 30분간 37℃에서 배양시켰다. 세포를 PBS(5min, 3x)로 씻은 다음, 0.5㎍/㎖ 요오드화 프로피디움으로 역염색을 시키고, PBS(3min)로 씻은 다음, 통상의 에피형광 현미경상에 올려놓고 관찰하였다.

ON 5543 안티센스 ON-처리된 파골세포 형태학적 변형에서 대조군 ON(도 9A-D)에 비해 세포 퇴축 및 핵은 종종 핵 손상과 일치하는 형태적 변형을 나타내는 것을알 수 있다. 따라서, DNA는 아데닌-티미딘 부분에 특이적으로 결합하는 화합물인 비스벤지미드를 가진다. 안티센스 ON으로 처리한 24시간 후에, 아폽토시스성 몸체로 변형된 것으로 보이는 핵이 나타났다(도 9). 대조군으로 처리된 배양물(도 9F, G)에서는 처리되지 않은 대조군의 핵(도 9E)과 구별할 수 없기 때문에 변형된 것이 없는 것으로 보인다. 아폽토시스를 확인하기 위해, 매우 초기 단계에서 예정된 세포 사멸으로 나타나는 단편화된 DNA의 TUNEL 염색을 실시하였다. ON 5543 ON-처리된 세포(도. 9l)에서, 처리되지 않은 세포 또는 대조군 ON(도 9J)으로 처리한 세포와 비교하였을 때, 아폽토시스성 핵의 수가 증가되었다.

아폽토시스를 유도하는 세포내 기작을 검사하기 위해, α_v 합성을 억제할 경우에 세포 사멸을 촉진하는 것으로 변경된 세포를 조사할 수 있도록 실험 계획을 한다. p21^WAF1/CIP1 단백질을 면역형광으로 감지할 경우에, ON 5543 α_v 안티센스로 처리한 단핵 세포 분취물 및 파골세포에서는 모두 발현이 증가되었으나, 대조군 ON 으로 처리한 경우에는 증가되지 않았다는 것을 알 수 있다(도 10).

또한, 면역블롯팅 분석에서 ON 5543 α_v 안티센스는 Bcl-2를 강력하게 감소하도록 유도하였으나, 이에 반하여, 대조군 ON는 효과가 없다는 것을 알 수 있다. 테스트한 모든 조건에서, Bax 발현에는 변화가 없었다(도 11A). 밀도 분석에 따르면, 5543 α_v 안티센스 ON에서는 bel-2/bax 비율이 약 50% 감소되었으나, 대조군 ON으로 처리한 세포에서는 감소가 없었다(도 11B).

실시예 8: 유방 암종 MDA-MB231 세포에서의 세포 접착 억제 및 아폽토시스 측정

1㎛ 농도에서 안티센스 ON 5543을 상기에서 설명하는 것을 기준으로 암종 세포에서 테스트하였는데, MDA-MB231 세포 접착이 약 40% 억제되었다는 것을 알 수 있는데, 이에 반하여, 센스 및 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드에서는 세포 접착이 감소되지 않았다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 피브리노겐 피복된 웰상에 0.01 내지 1㎛ 농도로 고정된 MBA-MB231 세포에 첨가하였다. 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색시키기 전에 24시간동안 처리되었다. 단편화된 DNA의 TUNEL 염색에서 암 세포의 예정된 세포 사멸이 나타났다.

실시예 9; GCT23 세포의 세포 접착 억제

안티센스 ON 5473(1㎛ 농도)를 상기에서 설명하는 것과 같은 암종 세포에서 테스트하였는데, GCT23 세포 접착이 약 40% 정도 감소됨을 알 수 있었으나, 센스 및 역위된 대조군 올리고뉴클레오티드에서는 세포 접착이 감소되지 않았다.

실시예 10; 여러가지 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드에 의한 세포 접착 억제

ON 5959, ON 5431, ON 5504, ON 5506, ON 5959를 실시예 3, 4에서 설명하는 것과 같이 테스트하였는데, 이들 모두 세포 접착을 억제하는 것으로 나타났다. ON 5506는 MBA-MB231 세포 접착을 80% 억제시켰다.

실시예 11; MDA-MB231 세포를 ON으로 처리

흡수 증진제인 리포펙타민 존재하에서 MDA-MB231 세포를 ON 5543으로 억제하였다. 대조군 실험에서는 5㎍/㎖ 리포펙타민이 가장 효과적이고, 최고 72시간동안 독성 효과없이 처리할 수 있었다(자료는 제공하지 않음).

전체 세포의 면역블롯팅 및 cDNA의 RT-PCR을 이용하여, 안티센스-특이적인 방식으로 α_v mRNA(55%) 및 단백질(65%)이 감소되었음을 확인할 수 있는데, 이는 센스 및 부정합 5543-ON에 의한 효과가 없는 것으로 입증되었다(도 12). 표준 유전자로는, β-액틴을 이용하였는데, 이의 mRNA 및 단백질 발현 수준은 안티센스 처리경우에도 변화가 없어, 추가로 안티센스-특이적이라는 것을 확인할 수 있다.

실시예 12; ECM(세포외 매트릭스)으로의 접착

ECM에 접착을 정량화하기 위해, FCS를 포함하는 성장 배지에 현탁된 MDA-MB231 세포를 α_v 안티센스 ON 5543 및 대조군 ON 존재하에서 플라스틱 웰에 분주하였다. 이때, 접착 기질은 혈청 단백질로부터 기인된 것이다. 본 발명자는 안티센스 ON 5543으로 처리된 배양물에서 세포 접착 억제가 투여량에 따라 달라진다는 것을 확인할 수 있었는데, 최고 억제는 1㎛ 농도에서 58% 감소되었다(도 13). 접착 억제는 시간에 따른 반응이기도 한다. 도 14에서 볼 수 있는 것과 같이 72시간 배양시점에 최대 효과(64%)가 나타남을 알 수 있다. 모든 대조군 ON는 효과가 없었다(도 13 및 14).

안티센스 5543-ON의 효과가 ECM 기질-특이적인 것인지의 의문이 남는다. MDA-MB231 세포를 비트로넥틴-, 피브리노겐-, 피브로넥틴-, 라미닌-피복된 플라스틱상에 분주하였다. 비트로넥틴, 피브리노겐, 피브로넥틴에 대한 접착이 5543의 농도를 증가시키면서 제공하는 경우에(0.1 내지 1㎛), 상당히 감소되었다(피브로넥틴, 피브리노겐, 비트로넥틴의 경우에 각각 최대 감소는 64%, 59%, 65%이다). 대조적으로, 라미닌에 대한 접착에는 영향을 주지 않았다. 대조군으로 이용한 ON5044(1㎛)는 활성이 없었다(도 15).

ECM 단백질 및 제조방법 및 유리 커브슬립의 피복

13㎜ 유리 커브슬립을 70% 에탄올로 씻어내어 깨끗이한다. 4℃에서 하룻밤동안 커브슬립에 250㎕ 단백질 용액(10㎍/㎖ 멸균 PBS)로 피복시킨다. 잔류 단백질 결합 부위는 37℃에서 1시간동안 1% BSA로 포화시켜 차단시킨다. 커브슬립을 PBS로 3회 씻어내고, DMEM으로 1회 씻어낸다. 그 다음 용액을 60% 메탄올로 대체시킨다음, 웰을 4℃에서 1시간동안 추가 배양시킨다. 흡입에 의해 메탄올을 제거하고, 웰은 50mM Tris-HCl(pH7.8), 110mM NaCl, 5mM CaCl₂, 1% BSA, 0.1mM 페닐메틸설포닐플로라이드를 포함하는 100㎕ 완충액으로 실온에서 30분간 배양시킨다. 최종적으로, 0.2% BSA이 보충된 DMEM으로 3회 씻어낸 후에, 실험에 바로 이용한다.

세포 접착 분석

MDA-MB231 세포는 24-다중 웰 플레이트에 분주하고, 여러 다른 시간대에 리포펙타민 존재하에서 ON으로 배양시킨다. 배양 종료시에, 웰을 PBS(3x)로 씻어, 비-접착된 세포를 제거한다. 각 웰은 20% 메탄올로 처리하고(10분), 세포는 0.5% 크리스탈 바이올렛/20% 메탄올로 5분간 씻어낸 후에, 증류수로 씻고, 15분간 대기 건조시킨다. 크리스탈 바이올렛을 100㎕ 0.1N 구연산나트륨/50% 에탄올에 용해시키고, 96-웰 미세역가 플레이트로 옮기고, 540㎚에서 분광학적으로 측정하는데, 이는 부착된 세포에 직비례한다.

실시예 13; MDA-MB231 세포의 아폽토시스

DNA는 핵산의 아데닌-티미딘 부분에 결합하는 물질인 비스벤지미드가 결합되는데, 이는 형태적 변형을 나타내는 것으로 ON 5543으로 처리된 세포의 몇 개 핵에서 돌출된 DNA로 확인할 수 있다. 대조군인 센스 및 부정합 ON으로 처리된 세포에서는 이와 같은 단편이 매우 적거나 전혀 없다. 초기 단계에서 DNA 단편화를 밝히는 특정 방법으로 아폽토시스를 확인하기 위해, TUNEL 염색을 한다. 대부분의 ON 5543으로 처리된 세포에서 핵의 TUNEL이 발견된다(자료는 제공하지 않음). 대조적으로, 대조군으로 이용된 센스 및 부정합 ON으로 처리된 배양물에서는 세포의 작은 부분에만 염색이 나타나기 때문에 이는 우리 배양조건에서 이들 세포주에서 예정된 세포 사멸의 "생리적" 비율을 나타낸다.

아폽토시스는 세포특이적이고, 극도로 이종성인 세포내 시그날에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 아폽토시스에 대한 세포내 시그날에 관련될 가능성이 있는 유전자 패널에 대해 조사하였다. MDA-MB231 세포주는 돌연변이형의 p53 프로-아폽토시스성 인자를 발현시키는 것으로 공지되어 있다(22). 우리 배양물에서 면역블롯팅으로 밝혀진 바에 따르면, ON 5543 및 대조군 ON으로 처리한 후에도 단백질 발현이 변형되지 않았다(도 16). 따라서, 이는 MDA-MB231 세포의 세포질 및 핵에 p53이 분포된 대조군으로 삼은 센스, 부정합 ON-처리된 배양물이다. 대조적으로, ON 5543 처리된 배양물에서는 p53이 거의 핵으로 이동하였다. 그러나, 활성화된 p53에 의해 발현이 변형된 일련의 유전자(Bcl-2, Bax, p21^WAF1/CLP1) 프로파일도 ON 5543 처리에 의해 변화되지 않고 유지되었다(도 17).

참조 문헌

도면의 설명

도 1은 ON 5543("5543") α_v 위치 및 토끼 α_v 개시 부위 서열을 보여준다.

(A) 사람 α_v 뉴클레오티드 위치 서열은 아래서열에 포함된 ON 5543 α_v에 존재한다. 모든 서열 정보는 5'에서 3'말단 방향으로 설명하는데, 서열위치는 EMBL 데이터베이스에서 보인 바와 같이 표지화하였다. 검은 화살표는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타내는데, 이 프라이머는 토끼 α_v 해독 개시 부위의 RT-PCR 클로닝에 사용된다.

(B) α_v 프라이머를 사용하여 수득한 산물을 보여주는 대조군 PCR 반응.

(C) 사람 α_v cDNA 포지티브 대조군과 비교하여, 모든 비장과 골수 RNA 푸울(pool)에서 얻은 토끼 α_v 개시 부위의 RT-PCR. 각 샘플은 한쌍의 프라이머를 이용하여 재증폭하였다(따라서, 각 라인에 이중 산물이 존재한다).

(D) 토끼 개시서열은 5543 α_v ON 서열상에 대문자로 나타내고, 이중으로 밑줄 그었다. 토끼와 사람 α_v cDNA는 83번 위치에 T가 C로 치환되어(이 위치의 프라이머 축중성에 기인), 하나의 염기가 상이하다.

도 2는 토끼 파골세포에서 FITC-5543 α_v 섭취를 보여준다.

생체외 분리된 토끼 파골세포는 혈청-피복된 유리에 정착시키고, 24시간동안 1μM의 FITC 표지된 α_v 5543 안티센스 ON으로 배양하였다.

(A) 세포질내에서, FITC-5543 안티센스 ON의 과립구조로의 분산을 보여주는 다핵화된 파골세포의 평면도; 핵은 네거티브임을 주지한다.

(B) (A)에서 화살표로 지시한 부분을 수평면으로 찍은 파골세포의 측면도; 이것은 안티센스 ON의 과립분산과 핵부재를 보여준다(파골세포가 붙어있는 유리는 점선으로 표시한다). 상아질(dentine)상의 파골세포에서 유사한 결과가 관찰되었다(제시하지 않음). 확대도: X 2000

도 3 -α_v 안티센스 ON은 α_v 단백질 발현을 감소시킨다.

토끼 골수 부착된 세포 분취물은 10nM 1,25-디하이드록시 비타민 D₃으로 10일동안 배양하여, 다수의 TRAP-포지티브 파골세포를 분화시켰다. 배양물은 이후, 1μM α_v 안티센스와 대조군 ON으로 24시간동안 처리하고, 용해시키고, SDS-PAGE(30㎍ 세포 단백질) 처리하고,α_v 와 β₃ 인테그린 아단위체와 액틴을 인식하는 항체로 면역블롯팅하였다. 1차 항체는 1:250으로 희석하였다. 2차 항체는 1:5000으로 희석하였다. 상기 겔에서 α_v 단백질 수준은 음영농도계측 분석으로 정량하고, 액틴과 비교하여 표준화하고, 대조군에 대한 퍼센트와 같은 임의 단위로 표현하였다.

도 4 - 5543 α_v 안티센스 ON은 파골세포 접착과 흡수를 억제한다.

α_v ON은 농도(5x10^-13 내지 100μM)를 증가시키면서, 혈청-피복된 유리(A) 또는 상아질 칩(B)상에 정착된 토끼 파골세포에 첨가하였다. 세포는 TRAP 및/또는 피트 염색이전, 24시간동안 자극하였다(n=8 ±S.E.M., ○ 혈청-피복된 유리에 대한 부착, ● 상아질 칩에 대한 부착, □ 흡수, △ 무(無), ^*, p<0.05; ^**,p<0.01; ^***,p<0.001; ^****,p<0.0005).

도 5는 상아질에 대한 5543 α_v 안티센스 ON의 결합을 보여준다.

(A) 증가하는 농도에서, FITC-결합된 α_v 안티센스 ON과 상아질의 결합은 30분 내지 24시간동안 평가하였다.

(B) 출발시점(0 시간)과 종결시점(24시간)에서 배지에 잔류한 형광을 나타낸다( n=6 ±S.E.M., 시간에 따른 임의의 형광단위, ■ 무(無), □ 0.2μM, ● 2μM, ○ 20μM).

도 6 - 토끼 파골세포 기능에 대해 5543 α_v 안티센스와 대조군 ON을 비교한다.

α_v 안티센스 ON과 3개의 관련 특이 대조군을 이용하여, 연구를 실시하였다. 안티센스 ON, 부정합 ON, 역위 ON, 센스 ON은 생체외 파골세포(0.2 내지 20μM)로 24시간동안 배양하였다.

(A) 혈청-피복된 유리에 대한 부착(유리에 대한 부착 % vs. ON 농도[μM]).

(B) 상아질 디스크에 대한 부착(● 안티센스, ○ 부정합, ■ 역위, □ 센스, △ 무(無), n=3 ±S.E.M., ^*,p<0.001)(골수에 대한 부착% vs. ON 농도[μM]).

(C) 흡수 % vs. 올리고뉴클레오티드 농도[μM].

도 7은 시험관내에서 분화된 파골세포에 대한 5543 α_v 안티센스 ON 효과를 보여준다.

토끼 골수 부착된 세포분취물은 10nM 1,25-디하이드록시 비타민 D₃과 1mM 지정된 ON으로 10일동안 배양하였다. 배양종결시점에서, 세포는 TRAP 효소로 염색하고, TRAP-포지티브 (A)단핵(MNC)세포와 (B)다중핵응집(PNC)세포를 계수하고, 처리되지 않은 배양물에 대한 퍼센트로 표시하였다(a'sense=안티센스 ON, sense=센스 ON, mism=부정합 ON, n=3 ±S.E.M., ^***,p<10^-6).

도 8은 상이한 세포외 매트릭스 단백질에 부착된 생체외 토끼 파골세포에 대한 5543 α_v 안티센스 ON의 투약반응효과를 보여준다.

센스 대조군 ON(20μM 농도에서만 나타남)과 비교조사를 실시하였다. 배양물은 지정된 기질 단백질-피복된 유리에 부착한 후, 24시간동안 처리하였다((A)FBS = 태아 소 혈청, (B)Vn = 비트로넥틴, (C)Fb = 피브리노겐, (D)Fn = 피브로넥틴, (E)섬유성 콜라겐). (F)표는 α_vβ₃ 중화 항체 23C6과 5543 α_v ON 효과를 비교한 것이다. 괄호안에, 무(無)와 비교한 퍼센트 변이를 제시한다(a/s=안티센스 ON(왼쪽으로부터 0μM, 0.2μM, 2μM, 20μM), s=센스 ON(20μM), n=3 ±S.E.M., ^*,p<0.05; ^**,p<0.01; ^***,p<0.001).

도 9는 파골세포 형태와 아폽토시스에 대한 5543 α_v 안티센스 ON 효과를 보여준다.

생체외 토끼 파골세포는 지정된 ON으로 24시간동안 배양하였다. (A-D)는 위상차 현미경 사진이다. 화살표는 축소된 파골세포를 표시한다(확대도: X 1400). (E-H)는 비스벤즈이미드 핵 염색사진이다. 화살표는 아폽토시스 개체를 표시한다(확대도: X 1400). (I-L)은 조각난 DNA의 TUNEL 염색사진이다(확대도: X 700). A,E,J: 대조군(c), B,F,J: 센스 ON(s), C,G,K: 부정합 ON(m), D,H,L: 안티센스 ON(a/s)이다.

도 10 - 5543 α_v 안티센스 ON은 p21^WAF1/CIP1 면역반응성을 자극한다.

처리되지 않은 생체외 토끼 파골세포(A) 및 1mM (B)센스, (C)부정합, (D,E)안티센스 ON으로 48시간 배양한 파골세포를 고정시키고, p21^WAF1/CIP1 단백질을 인식하는 항체로 면역형광 염색하였다. 화살표는 p21^WAF1/CIP1-포지티브 파골세포를 표시한다(확대도: X 1000). (F) 5개이상의 무작위 현미경 필드(목표 20X)에 존재하는 p21^WAF1/CIP1 면역활성 단핵세포와 전체 단핵세포는 대조군 및 안티센스(a'sense)-, 센스-, 부정합(mism)-처리한 배양물에서 계수하고, 전체 세포에 대한 포지티브 세포의 퍼센트를 계산하였다(n=3 ±S.E.M., ^***p<0.0001).

도 11은 bcl-2와 bax 유전자의 발현을 보여준다.

파골세포계통의 세포는 도 3에서와 같이 수득하고, 1mM a_V 안티센스와 대조군 ON으로 48시간동안 처리하였다. 이후, 세포는 용해하고, 웨스턴 블롯팅으로 bcl-2와 bax 단백질 수준을 분석하였다. 이후, bcl-2와 bax 단백질 수준은 액틴 발현에 대한 표준화 직후, 음영농도계측으로 정량하였다. 막대는 절대몰비율이 아닌 음영농도계측 분석하여 측정한 상대적 비율을 나타낸다(c:대조군, s:센스, ON.m: 부정합 ON, a/s: 안티센스 ON).

도 12는 MDA-MB231 세포에서, α_v 인테그린 발현을 분석한 것이다.

90% 컨플루언트된 MDA-MB231 세포 단층은 1μM ON5543으로 72시간동안 처리하였다.

(A) RT-PCR. 0.1㎍ RNA는 역전사시키고, PCR 반응은 α_v와 β-액틴 프라이머쌍으로 실시하였다. 준(semi)정량분석을 위해, 음영농도계측 분석을 실시하였는데, 각 수치는 대조군 세포와 비교한 ON5543-처리한 세포의 α_v/β-액틴 비율로 나타내었다. 실험은 3번 반복하였는데, 유사한 결과를 얻었다.

(B) 면역블롯팅. 15㎍ 단백질은 비-환원 조건하에 SDS-PAGE(7.5% 아크릴아미드 겔) 처리하고, Hybond 니트로셀룰로스 막으로 이전하였다. 필터는 1차 항체(1:200으로 희석)로 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, HRP-접합된 2차 항체(1:5000으로 희석)로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 밴드는 ECL로 검출하고, 음영농도계측법으로 분석하였다. 결과는 대조군 세포와 비교한 ON5543-처리한 세포의 α_v/β-액틴 비율로 나타내었다. 3번의 독립된 실험에서 유사한 결과가 관찰되었다.

도 13은 기질에 대한 MDA-MB231 세포 부착의 농도-의존성 억제를 보여준다.

MDA-MB231 세포는 DMEM에서 횡좌표에 지시한 농도의 ON 5543으로 배양하였다. 배양은 72시간동안 진행시키고, 이후, 배양물은 고정시키고, 광범위하게 세척하여 부유하는 세포를 제거하고, 핵은 크리스털 바이올렛으로 염색하였다. 부착된 세포에 비례할 것으로 추정되는 염색물은 이후, 용해하고, 실시예에서 설명한 바와 같이, 분광광도법으로 색도를 측정하였다. 데이터는 대조군에 대한 퍼센트로 표현한다(평균 ± S.E.M. n = 3, p<0.003, 1 = ON5543; 2 = ON5044; 3 = ON5045).

도 14는 MDA-MB231 세포 부착의 시간-의존성 억제를 보여준다.

MDA-MB231 세포는 1μM ON5543을 함유한 DMEM에 배양하였다. 배양은 횡좌표에 지시한 시간동안 진행시키고, 이후, 세포는 고정시키고, 부착물은 도 13에서 밝힌 바대로 측정하였다. 데이터는 대조군에 대한 퍼센트의 평균 ±S.E.M.이다(n=3, p<0.003. 1=대조군, 2=ON5543; 3= ON5044; 4=ON5045).

도 15는 MDA-MB231 세포와 ECM 기질과의 부착에 대한 α_v 안티센스 ON5543의 효과를 보여준다.

MDA-MB231 세포는 피브로넥틴-(Ⅰ), 피브리노겐-(Ⅱ), 비트로넥틴-(Ⅲ), 라미닌-피복된 웰(Ⅳ)에 분주하고, 0.2% BSA를 함유한 무혈청 DMEM에서 0.01, 0.1 μM ON5543 또는 1μM ON5044로 72시간동안 배양하였다. 이후, 세포는 고정시키고, 부착물은 도 13에서 밝힌 바와 같이 측정하였다. 데이터는 대조군에 대한 퍼센트로 표현한다(평균 ± S.E.M., n=3, p<0.0001; 1=대조군; 2=ON5543(0.01 μM); 3=ON5543(0.1 μM); 4=ON5543(1μM); 5=ON5044 (1μM)).

도 16은 p53 발현과 분포를 분석한 것이다.

90% 컨플루언트된 MDA-MB231 세포 단층은 72시간동안 1μM ON5543으로 처리하였다.

(A) 면역블롯팅

40㎍ 단백질은 비-환원 조건하에 SDS-PAGE(15% 아크릴아미드 겔)처리하고, Hybond 니트로셀룰로스 막으로 이전하였다. 막은 1차 항체(1:200으로 희석)로 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, 2차 HRP-접합된 2차 항체(1:5000으로 희석)로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 밴드는 ECL로 검출하였다.

(B) 면역형광

세포는 고정시키고, 항-p53 항체로 면역염색하고, 통상의 상형광 현미경으로 관찰하였다((a)ON없는 대조군; (b)ON5044; (c)ON5045; (d)ON5543, 확대도: 300X). (a),(b), (c)에서 p53의 세포질과 핵 분포 및 (d)에서 핵 염색을 주지한다.

도 17은 잠재적으로 아폽토시스에 관여하는 유전자의 면역블롯팅을 분석한 것이다.

90% 컨플루언트된 MDA-MB231 세포 단층은 72시간동안 1μM ON5543으로 처리하였다. 80㎍ 단백질은 비-환원조건하에 SDS-PAGE(15% 아크릴아미드 겔) 처리하고, Hybond 니트로셀룰로스 막으로 이전하였다. 필터는 항-bcl2, -bax, -p21, β-액틴(내부 대조군)항체로 검사하였다. 막은 1차 항체(1:2000으로 희석)로 4℃에서 하룻밤동안 배양하고, 2차 HRP-접합된 2차 항체(1:5000으로 희석)로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 밴드는 ECL로 검출하였다.

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Antisense oligonucleotides for the inhibition of integrin alpha v -subunit expression <130> 5-1998-084662-6 <150> EP 98106989.1 <151> 1998-04-17 <160> 14 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 540 <212> DNA <220> <223> double strand; linear; DNA(genomic) <220> <221> exon <222> (1)..(540) <400> 1 ggctaccgct cccggcttgg cgtcccgcgc gcacttcggc gatggctttt ccgccgcggc 60 gacggctgcg cctcggtccc cgcggcctcc cgcttcttct ctcgggactc ctgctacctc 120 tgtgccgcgc cttcaaccta gacgtggaca gtcctgccga gtactctggc cccgagggaa 180 gttacttcgg cttcgccgtg gatttcttcg tgcccagcgc gtcttcccgg atgtttcttc 240 ggctaccgct cccggcttgg cgtcccgcgc gcacttcggc gatggctttt ccgccgcggc 300 ccgatggcga gggccgaacc gcagggcgcg cgtgaagccg ctaccgaaaa ggcggcgccg 360 ccgatggcga gggccgaacc gcagggcgcg cgtgaagccg ctaccgaaaa ggcggcgccg 420 ccgatggcga gggccgaacc gcagggcgcg cgtgaagccg ctaccgaaaa ggcggcgccg 480 ccgatggcga gggccgaacc gcagggcgcg cgtgaagccg ctaccgaaaa ggcggcgccg 540 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; cDNA to mRNA <220> <221> exon <222> (1)..(24) <400> 2 cggcgatggc ttttccgccg cggc 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; cDNA to mRNA <220> <221> exon <222> (1)..(26) <400> 3 gtgccgcgcc ttcaacctag acgtgg 26 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(20) <400> 4 cggaaaagcc atcgccgaag 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(18) <400> 5 gccatcgccg aagtgcgc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(18) <400> 6 gcggcggaaa agccatcg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <400> 7 gcaacgagag agccgtcg 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <400> 8 cgtctaggtt gaaggcg 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(18) <400> 9 gcccgggagc agccatcg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(18) <400> 10 gctaccgaaa aggcggcg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(18) <400> 11 cgatggcttt tccgccgc 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic); ANTISENSE: yes <220> <221> exon <222> (1)..(17) <400> 12 cgtccaggtt gaaggcg 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic) <220> <221> exon <222> (1)..(17) <400> 13 cgtccaggtt gaaggcg 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <220> <223> single strand; linear; DNA(genomic) <220> <221> exon <222> (1)..(17) <400> 14 gcaggtccaa cttccgc 17

Claims (32)

1. 하기 서열 4, 5, 6, 7, 8 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.

   여기서, 서열 4는 3'-GAAGCCGCTACCGAAAAGGC-5'이고

   서열 5는 3'-CGCGTGAAGCCGCTACCG-5'이고

   서열 6은 3'-GCTACCGAAAAGGCGGCG-5'이고

   서열 7은 3'-GCTGCCGAGAGAGCAACG-5'이고

   서열 8은 3'-GCGGAAGTTGGATCTGC-5'이고

   서열 12는 3'-GCGGAAGTTGGACCTGC-5'이다.
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15. 하기 서열 4, 5, 6, 7, 8 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.

    여기서, 서열 4는 3'-G^*A^*AGC^*C^*GC^*TAC^*C^*GAAAAG^*G^*C-5'이고

    서열 5는 3'-C^*G^*C^*GT^*GAAG^*C^*CGC^*TA^*C^*C^*G-5'이고

    서열 6은 3'-G^*C^*T^*AC^*CGAAAAGG^*CGG^*C^*G-5'이고

    서열 7은 3'-G^*C^*T^*GC^*CGAGAGAG^*CAA^*C^*G-5'이고

    서열 8은 3'-G^* C ^*GGAAG^* T ^* TGGAT ^* C ^* TG^* C-5'이고

    서열 12는 3'-G^* C ^*GGAAG^* T ^* TGGAC ^* C ^* TG^* C-5'이다(상기 서열에서 ^* 는 포스포로티오에이트 잔기이고, 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 5-프로피닐 피리미딘이다.)
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18. 고형 지지체상에서 보호된 단량체를 축합함으로써, 제1항 또는 제15항에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법.
19. 제1항 또는 제15항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 인테그린 α_v을 발현하는 세포를 특이적으로 제거하기 위한 제제.
20. 제1항 또는 제15항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 비트로넥틴, 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기질에 대한 인테그린 α_v을 발현하는 세포의 접착을 특이적으로 억제하기 위한 항-접착제.
21. 서열 4 내지 8 또는 서열 12 중 하나를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 작제하고, 이를 인테그린 α_v mRNA에 하이브리드화시켜, 세포 내에서 인테그린 α_v의 발현을 억제하는 방법.
22. 제1항 또는 제15항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 작제하고, 세포에 접촉시켜, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드화함으로써 인테그린 α_v의 발현을 억제하도록 하여, 비트로넥틴, 피브리노겐 및 피브로넥틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기질로의 세포의 접착을 억제하는 방법.
23. 제1항 또는 제15항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 작제하고, 세포에 접촉시켜, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인테그린 α_v mRNA에 하이브리드화함으로써 인테그린 α_v의 발현을 억제하도록 하여, 인테그린 α_v를 발현하는 세포를 제거하는 방법.
24. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 종양 세포 또는 파골세포인 방법.
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27. 제1항 또는 제15항에 따른 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생리학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합시킴을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
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30. 제1항 또는 제15항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 암과 암의 전이의 치료 및 예방, 골다공증의 예방 및 치료, 안구 질환, 만성 염증, 건선 및 재발협착증의 치료, 및 상처 치유의 촉진을 위한 약제학적 조성물.
31. a) 제1항 또는 제15항에 따른 올리고뉴클레오티드를 합성하여 세포 프로브에 접촉시키는 단계; 및

    b) 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인테그린 α_v mRNA와 하이브리드화 하는지를 검출하는 단계를 포함하는, 인테그린 α_v를 발현하거나 과발현하는 세포를 동정하는 방법.
32. 삭제

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