JP2003230380A - 核酸の精製方法および当該方法に用いる核酸抽出用溶液ならびに核酸精製用試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安価に克つ簡便な方法で核酸を含有する試料
から核酸を高効率に精製するための方法を提供するこ
と。 【解決手段】 カオトロピック物質を含有する核酸抽出
用溶液中で、シリカを含む核酸結合用固相担体へ核酸を
含有する試料を保持させる工程、該核酸を保持した該固
相担体を該核酸抽出用溶液から分離する固液分離工程、
および該固相担体から該核酸を遊離させる工程を有す
る、核酸の精製方法において、上記核酸抽出用溶液が
０．２Ｍ以上の濃度のアルカリ金属イオンおよび／また
はアルカリ土類金属イオンをさらに含むものであること
を特徴とする、核酸の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、所望の核酸を含有
する試料から核酸のみを抽出または精製することを目的
とした、核酸を保持することのできる、シリカを含む核
酸結合用固相担体に核酸を保持させ該固相担体を分離し
た後、該固相担体から核酸を遊離する方法、そのための
核酸抽出用溶液、試薬キットに関する。また、本発明は
シリカおよび磁気応答粒子を含有する核酸結合用磁性担
体ならびに磁場を利用する上記方法に関する。本発明に
よれば、従来の方法よりも効率的に核酸を精製すること
が可能となる。そのため、本発明の方法を採ることによ
り、核酸の調製を小スケールで効率良くおこなうことも
可能となる。

【０００２】

【従来の技術】核酸を含有する細胞等といった生物材料
からの核酸の抽出精製は、遺伝子工学や臨床診断の分野
では重要なステップである。例えば、ある遺伝子につい
て解析しようとする場合、まず、その遺伝子を保持する
細胞等の生物材料からＤＮＡやＲＮＡといった核酸を抽
出することが必要である。また、細菌やウイルスといっ
た感染体の検出のためのＤＮＡ／ＲＮＡ診断において
も、血液等の生物材料から細菌やウイルスの核酸を抽出
した後、検出することが必要である。

【０００３】一般に、生物材料に含まれるＤＮＡやＲＮ
Ａといった核酸は、遊離した状態で存在するわけでな
く、蛋白質、脂質、糖から構成される細胞膜や細胞壁等
の殻の中に存在し、ほとんどの場合、核酸自身も蛋白質
との複合体を形成している。したがって、生物材料から
核酸を抽出精製する場合には、まず超音波や熱による物
理的破砕処理やプロテアーゼによる酵素処理、界面活性
剤や変性剤による処理等を施すことにより核酸を遊離さ
せ、さらに、フェノール等の有機溶媒による抽出操作や
超遠心分離、イオン交換体等の担体を使用したカラムク
ロマトグラフィー等により、破砕物から核酸を精製する
必要がある。これらの手法は、核酸や出発材料、さらに
は抽出した核酸の用途に応じて組み合わされ、それぞれ
最適化されて用いられている［Molecular cloning: A L
aboratory manual, 2nd ed. (ColdSpring Harbor Labor
atory Press, 1989) ］。

【０００４】しかし、これらの方法は遠心分離など煩雑
な工程を含むため非常に手間がかかる作業である。さら
に、これらの方法により抽出された核酸サンプル中に
は、その後の解析にとって弊害となる蛋白質などの夾雑
物質が多く含まれている。そのため、純度よく核酸を得
るためには、これらの抽出操作を行った後に塩化セシウ
ムによる密度勾配を利用した超遠心分離操作やフェノー
ル／クロロホルム抽出に代表されるような煩雑で、かつ
長時間を要する蛋白質除去操作を行う必要がある。

【０００５】一方、簡便な核酸抽出法としてシリカを核
酸結合性固相担体として使用する方法がある（特開平２
−２８９５９６号公報）。この方法は、バクテリアなど
の生物材料から核酸を一段階で抽出することが可能なう
え、溶出液として水またはＴＥバッファーなど低濃度の
バッファーを使用するため、特別な脱塩濃縮操作が不要
で、抽出した核酸を直ちに後の解析に使用することがで
きるという利点がある。しかしながら、本方法でシリカ
から溶出させて得られた核酸は濃度が低く、収量におい
ても満足できるものではなかった。従って、小量の核酸
で分析が可能なポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）などには適用できるが、サザンハイブリダイ
ゼーションやノーザン・ブロットなどの分析には大スケ
ール化とその後の濃縮工程という煩雑な操作を必要とし
た。更に簡便性を高めた核酸抽出方法として核酸結合用
磁性担体を使用する核酸単離方法があり、例えば核酸が
共有結合し得る重合性シラン被膜により覆われた超常磁
性酸化鉄核を有する磁気応答粒子を利用することが知ら
れている（特開昭６０−１５６４号公報）。しかしなが
ら、本方法も溶出させて得られた核酸の濃度、収量にお
ける不満を解消できるものではなかった。

【０００６】以上のように、非特異的に多量の核酸を簡
便に抽出精製するには、種々の問題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このような理由から、
安価で簡便に多量の核酸を抽出精製できる方法が求めら
れていた。すなわち本発明の目的は、安価に克つ簡便な
方法で核酸を含有する試料から核酸を効率よく精製する
ための方法、およびそのための核酸抽出用溶液や、試薬
キットを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】これまで、核酸は、カオ
トロピック物質によりシリカを含む核酸結合用固相担体
へ保持されると考えられてきたため、核酸の収量が低い
理由は該固相担体の核酸保持能が低いことによるものと
思われていた。従って、該固相担体の材質、粒形、表面
積などに種々の改良が施されてきた（特開平２−２８９
５９６号公報、特公平７−１３０７７号公報、特開平９
−１２９２９号公報）。しかしながら、我々は種々の検
討をおこない、所定の濃度のアルカリ金属イオンまたは
アルカリ土類金属イオンを含む核酸抽出用溶液を用いる
ことで、上述した固相担体が核酸をより強固に保持でき
ることを見出し、核酸を含有する試料から核酸を高効率
に精製することを可能とした。

【０００９】すなわち本発明は、以下の構成からなる。 （１）カオトロピック物質を含有する核酸抽出用溶液中
で、シリカを含む核酸結合用固相担体へ核酸を含有する
試料を保持させる工程、該核酸を保持した該固相担体を
該核酸抽出用溶液から分離する固液分離工程、および該
固相担体から該核酸を遊離させる工程を有する、核酸の
精製方法において、上記核酸抽出用溶液が０．２Ｍ以上
の濃度のアルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土
類金属イオンをさらに含むものであることを特徴とす
る、核酸の精製方法。 （２）上記核酸抽出用溶液が１．０Ｍ以下の濃度のアル
カリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金属イオン
を含むものであることを特徴とする、（１）に記載の核
酸の精製方法。 （３）上記アルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ
土類金属イオンが、ナトリウムイオン、リチウムイオン
のいずれか一方、または両者の混合物であることを特徴
とする、（１）または（２）のいずれかに記載の核酸の
精製方法。 （４）上記シリカを含む核酸結合用固相担体が、さらに
強磁性金属酸化物を含むものであることを特徴とする、
（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸の精製方法。 （５）少なくとも、カオトロピック物質と、０．２Ｍ以
上のアルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金
属イオンとを有する水溶液である、核酸抽出用溶液。 （６）上記アルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ
土類金属イオンが、ナトリウムイオン、リチウムイオン
のいずれか一方、または両者の混合物であることを特徴
とする、（５）に記載の核酸抽出用溶液。 （７）（５）または（６）のいずれかに記載の核酸抽出
用溶液と、シリカを含む核酸結合用固相担体と、カオト
ロピック物質ならびにアルカリ金属イオンおよび／また
はアルカリ土類金属イオンを洗い流し得る洗浄液と、核
酸を溶解し得る遊離液とを少なくとも有する、核酸精製
用試薬キット。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の核酸の精製方法は、０．
２Ｍ以上の濃度のアルカリ金属イオンおよび／またはア
ルカリ土類金属イオンと、カオトロピック物質とを少な
くとも有する核酸抽出用溶液を使用することを特徴とす
るものである。本明細書において、以下、「アルカリ
（土類）金属イオン」という記載は、「アルカリ金属イ
オンおよび／またはアルカリ土類金属イオン」を意味
し、「固相担体」という記載は、「シリカを含む核酸結
合用固相担体」を意味するものとして用いる。

【００１１】本発明の方法において用いるアルカリ（土
類）金属イオンの種類や性状等は特に問わないが、核酸
や固相担体の性状を損ない難い点や不溶性化合物を生成
し難い点から、アルカリ金属イオンであるのが好まし
く、ナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオ
ンがより好ましい。これらのイオンを有する化合物とし
ては、塩化物、フッ化物、ヨウ化物等が例示されるが、
入手が容易である点や核酸等への悪影響が少ない点、溶
解し易い点、安全性が高く安価な点から、塩化物が好ま
しく、添加する物質の具体例としては、塩化ナトリウ
ム、塩化リチウムなどが挙げられる。

【００１２】使用時の核酸抽出用溶液におけるアルカリ
（土類）金属イオンの濃度は、核酸を固相担体へ強固に
保持させる点から、少なくとも０．２Ｍ以上、好ましく
は、０．４Ｍ以上、さらに好ましくは、０．６Ｍ以上で
ある。一方、核酸抽出用溶液からの当該アルカリ（土
類）金属イオンを含む物質の析出を防ぐ観点からは、上
記アルカリ（土類）金属イオンの濃度は、１．０Ｍ以下
が好ましく、０．９Ｍ以下がさらに好ましい。さらに詳
しくは、上記アルカリ（土類）金属イオンがリチウムイ
オンである場合には、０．２〜０．９Ｍが好ましく、
０．６〜０．９Ｍがより好ましい。また、上記アルカリ
（土類）金属イオンがナトリウムイオンである場合に
は、０．４〜０．９Ｍが好ましく、０．６〜０．９Ｍが
より好ましい。

【００１３】アルカリ（土類）金属イオンを用いること
で、後述する固相担体が核酸をより強く保持し得るの
は、以下の作用によるものと考えられる。固相担体はシ
リカに由来する酸素原子を有し、一方、核酸はリン酸基
等に由来する酸素原子を有する。これら、酸素原子は、
負の電荷を有していると考えられる。ここで、上記アル
カリ（土類）金属イオンの存在により、固相担体の酸素
原子と核酸の酸素原子との間に、該アルカリ（土類）金
属イオンを介した静電的な引力が新たに生じる。したが
って、従来の水素結合のみに基く場合の引力よりも、本
発明において生じる引力（すなわち、上記静電的な引力
と水素結合による引力との合計）の方がより強いため、
本発明においては、固相担体がより強固に核酸を保持す
るものと考えられる。

【００１４】本発明で使用する核酸抽出用溶液のカオト
ロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジン
（イソ）チオシアン酸塩、尿素等が例示される。それら
は組合せて使用してもよい。カオトロピック物質の濃度
は、約１〜１０モル／ｌ程度が好ましい。また、本発明
で使用する核酸抽出用溶液は、通常、バッファーになっ
ており、当該バッファーとしては、例えば、ＥＤＴＡ、
トリス塩酸等を含有するバッファー等が挙げられる。本
発明における好ましい核酸抽出用溶液は、例えば、グア
ニジンチオシアン酸塩、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ト
リス／塩酸緩衝液等をベースとして調製される。

【００１５】本発明で使用する核酸抽出用溶液には、上
記のほかに、さらに、特定の核酸の選択的抽出を目的と
した有機溶媒や余分な金属塩の除去を目的としたキレー
ト剤等を含んでいてもよい。

【００１６】本発明では、上述してきたような核酸抽出
用溶液を用いて、核酸を含有する試料を固相担体へ保持
させる工程、該核酸を保持した該固相担体を該核酸抽出
用溶液から分離する固液分離工程、および該固相担体か
ら該核酸を遊離させる工程を経て、核酸を抽出する。

【００１７】本発明の方法に使用する核酸を含有する試
料は、蛋白質、膜、ＤＮＡまたはＲＮＡ、低分子量核酸
などを含む生物材料である。このような生物材料として
は、蛋白質、膜、ＤＮＡまたはＲＮＡ、低分子量核酸な
どを含むバクテリオファージ、ウイルス、細菌あるいは
これらの組み合わせが例示される。また、精製する目的
のために、この核酸がプラスミドまたは増幅産物中の核
酸であってもよい。

【００１８】本発明の方法において使用する固相担体
（シリカを含む核酸結合用固相担体）は、核酸を保持
（結合あるいは吸着）し得る固相担体であって、シリカ
を含有するものであればどのような形状や組成であって
も問題は無い。具体的な固相担体としては、シリカ粒子
やポリマー担体をシリカで被覆したもの、強磁性金属酸
化物（例えば、マグヘマイト、マグネタイト、マンガン
亜鉛フェライト等）をシリカで被覆した磁性シリカ粒子
などを挙げることができる。このなかで好ましくは、磁
性シリカ粒子等を挙げることができる。このような固相
担体は、従来公知の適宜の方法によって作製することが
できる。後述の実施例には、磁性シリカ粒子の作製例を
記載している。

【００１９】固相担体は、粉末状態で以下の工程に供し
てもよいが、固相担体の分散性を向上させる観点から、
予め固相担体を滅菌水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、トリシン緩衝液等、好ましくは滅菌水に分散させて
なる分散液を調製して、当該分散液を下記工程に供する
のが好ましい。当該分散液には、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、エタノー
ルその他の有機溶媒等がさらに含まれていてもよい。当
該分散液の固形分濃度は、特に限定はないが、核酸回収
量、集磁性の点から、０．１ｇ／ｍｌ以上が好ましく、
分散性、保存性の点から、１．０ｇ／ｍｌ以下が好まし
い。

【００２０】核酸抽出用溶液中で、核酸を含有する試料
を固相担体へ保持させる工程は、上記試料と上記固相担
体とを核酸抽出用溶液に添加した後、該試料と固相担体
とが接触する程度に両者を混合することができれば特に
方法は問わない。混合は、例えば、チューブを軽く転倒
攪拌あるいは振盪することによる程度で十分であり、例
えば市販のボルテックスミキサー等を用いて行うことも
できる。

【００２１】当該工程における、固相担体の量（当該工
程系の体積あたりの固相担体の重量）としては、核酸を
なるべく多く保持させる点、磁石により担体を回収し易
くする点等から、０．００４ｇ／ｍｌ以上が好ましく、
０．００８ｇ／ｍｌ以上がより好ましく、一方、担体か
ら核酸を遊離し易くする点、固相担体の分散性を確保す
る点等から、０．０４ｇ／ｍｌ以下が好ましく、０．０
２ｇ／ｍｌ以下がより好ましい。

【００２２】固液分離工程は、核酸を保持した固相担体
を核酸抽出用溶液から分離する工程であり、遠心分離や
フィルター分離等によって行われ得るが、磁性粒子を固
相担体として用いる場合には磁場、すなわち磁石を用い
て行われ得る。この磁石は、例えば、磁束密度が約３０
０ガウスの磁石が用いられ得る。具体的には、核酸を含
有する試料および核酸抽出用溶液を収容したチューブの
側壁に磁石を近づけ、核酸を保持した固相担体をチュー
ブ側壁に集め、核酸抽出用溶液中から固相担体を分離す
る方法等が挙げられる。このように磁場を用いた固液分
離は、工程の系外に磁場を制御して発生させる手段を設
けるだけで実現でき、装置の小型化や、連続的な処理、
自動化処理を容易にする点で優れている。

【００２３】核酸を保持した固相担体から核酸を遊離さ
せる工程は、核酸を保持した固相担体を、上記カオトロ
ピック物質およびアルカリ（土類）金属イオンを洗い流
し得る洗浄液で数回洗浄した後、固相担体を乾燥し、そ
の後、ＴＥ緩衝液などの低イオン濃度の溶液や滅菌水な
どといった核酸を溶解し得る遊離液を添加することによ
り固相担体に保持された核酸を遊離液へ遊離し、核酸を
最終的に回収することができる。

【００２４】本発明に用いる洗浄液としては、カオトロ
ピック物質およびアルカリ（土類）金属イオンを溶解す
ることができる液体であれば特に制限はなく、アセト
ン、ブタノール、水で希釈したアルコール等が例示され
るが、価格と安全性の点から、イソプロパノール、７０
％アルコール等が好ましい。また、本発明に用いる遊離
液としては、核酸を溶解することができる液体であれば
特に制限はなく、トリス塩酸緩衝液、ＴＥ緩衝液、水等
が例示されるが、利便性の点から、ＴＥ緩衝液（２０ｍ
Ｍトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、滅菌
水等が好ましい。

【００２５】上述したような本発明の精製方法によれ
ば、生物材料から所望の核酸を高収率で取得することが
でき、これにより、生物材料から所望の核酸を簡便克つ
安価に取得することができる。さらに、上述のように核
酸を高収率で取得する方法の実施に用い得る、核酸抽出
用溶液や、該核酸抽出用溶液と上述した固相担体と洗浄
液と遊離液とを有する、核酸精製用試薬キットもまた本
発明の実施の一態様である。

【００２６】本発明の核酸抽出用溶液は、上述してきた
カオトロピック物質と、０．２Ｍ以上のアルカリ（土
類）金属イオンとを少なくとも有する水溶液である。好
ましくは、上記アルカリ（土類）金属イオンは、ナトリ
ウムイオン、リチウムイオンのいずれか一方、またはそ
の混合物である。核酸抽出用溶液は、保管時の省スペー
ス化、輸送の簡便化等の点から、用時に滅菌水等で４〜
６倍程度に希釈して上記核酸抽出用溶液として用いられ
るよう、予め高濃度で調製されていてもよい。

【００２７】本発明の核酸精製用試薬キットは、それぞ
れ上述した核酸抽出用溶液と固相担体と洗浄液と遊離液
とを少なくとも有しており、例えば、各々別容器に収容
されて、用時に上述した所定の順序で希釈、添加等され
るように供される。固相担体は、粉末のままであって
も、上述した分散液の形態であってもよい。当該キット
により、核酸を精製する際に、様々な試薬等を各々準
備、調製する手間を省き、迅速に、必要な量だけ用いて
本発明の方法を実施することができる。

【００２８】本発明の実施により、従来の技術では高収
率に精製することが困難であった核酸の簡便な調製が可
能となり得る。また、種々の核酸の解析方法への材料供
給において効率よく目的の核酸を調製することが可能と
なる。

【００２９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとするが、本
発明はこれに限定されるものではない。

【００３０】［実施例１〜７、比較例１］固相担体（シ
リカを含む核酸結合用固相担体）として磁性シリカ粒子
を用いた。本磁性シリカ粒子は、強磁性金属酸化物とし
て酸化鉄（マグネタイト）を用い、これをシリカで被覆
したものであって、以下のように合成したものである。

【００３１】＜マグネタイト粒子の合成＞１００ｇの硫
酸第一鉄（ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）を１０００ｃｃの純水
に溶解した。この硫酸第一鉄と等倍モルになるように、
２８．８ｇの水酸化ナトリウムを５００ｃｃの純水に溶
解した。次に硫酸第一鉄水溶液を攪拌しつつ、そこへ１
時間かけて水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、水酸化第
一鉄の沈殿物を生成させた。滴下終了後、攪拌しなが
ら、水酸化第一鉄の沈殿物を含む懸濁液の温度を８５℃
まで昇温した。懸濁液の温度が８５℃に達した後、２０
０ｌ／ｈｒの流量で、エアーポンプを使用して空気を吹
き込みながら、８時間酸化して、マグネタイト粒子を生
成させた。このマグネタイト粒子は、ほぼ球形で、平均
粒子サイズ（同体積の球の直径に相当）は、０．２８μ
ｍであった。

【００３２】なおマグネタイト粒子の平均粒子サイズ
は、透過型電子顕微鏡写真上、３００個の粒子サイズを
測定し、その数平均粒子サイズから求めた。

【００３３】＜シリカ被覆処理＞上記マグネタイト粒子
懸濁液を、純水を用いて十分に水洗した後、乾燥させる
ことなく、懸濁液の全重量が４６８ｇになるように純水
を加えた。この懸濁液に、７０ｇのケイ酸ナトリウムを
溶解した。この懸濁液とは別に調製した、界面活性剤と
して２２．５ｇのソルビタンモノラウレートを溶解した
１５００ｃｃのヘキサン溶液を、上記懸濁液へ投入して
混合液とした。この混合液をホモミキサー（特殊機化工
業社製）を使用して、１０分間攪拌分散し、エマルジョ
ン分散液を作製した。次に、１０００ｇの硫酸アンモニ
ウムを４５００ｃｃの純水に溶解した。この硫酸アンモ
ニウム溶液を攪拌しつつ、そこへ上記エマルジョン分散
液を、約１時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに２
時間攪拌することで中和反応を行った。この硫酸アンモ
ニウムによる中和反応により、マグネタイト粒子を包含
するようにシリカが析出して、被膜が形成された。得ら
れたシリカ被覆マグネタイト粒子３００個の平均粒子サ
イズは、５．２μｍであった。

【００３４】上記の方法で合成した磁性シリカ粒子（シ
リカ被覆マグネタイト粒子）を用いた核酸の精製は、以
下の方法で行った。先ず磁性シリカ粒子を、０．２ｇ／
ｍｌになるように減菌水に分散させて、磁性シリカ粒子
の分散液とした。核酸を単離するための生物試料として
は、大腸菌（Escherichia coli JM109（東洋紡績、宝酒
造、インビトロジェンなどより販売されている)）を３
ｍＬ ＭＭＩ培地（１２．５ｇバクトトリプトン、２５
ｇバクトイーストエキストラクト、８．５ｇ ＮａＣ
ｌ、２０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、４ｍ
ｌグリセロールを８００ｍｌの精製水に溶解しＮａＯＨ
でｐＨ７．２に調製後１リットルにメスアップしオート
クレーブ滅菌する）／試験管にて３７℃、２０時間培養
した菌体を用いた。核酸抽出用溶液としては、カオトロ
ピック物質を含むバッファーとして、４２ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（シグマ社）を含む５．８Ｍグアニジン塩酸
塩（ナカライテスク社）（ｐＨ７．５）を用い、そこ
に、アルカリ（土類）金属イオンを生成する物質として
後述の表１に記載の濃度となるように、ＮａＣｌ又はＬ
ｉＣｌを溶解した溶液を用いた。洗浄液には、カオトロ
ピック物質を含むバッファーとして、４２ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（シグマ社）を含む５．８Ｍグアニジン塩酸
塩（ナカライテスク社）（ｐＨ７．５）を使用した。高
濃度の塩を除去するために７０％エタノール溶液を使用
し、磁性シリカ粒子に結合した核酸を回収するための遊
離液として滅菌水を使用した。

【００３５】具体的な操作としては、 （１）菌体濁度（ＯＤ６６０）を測定し、１．５ｃｃ用
エッペンドルフチューブにてＯＤ６６０；１０の菌体を
遠心分離により調製した。次に上記核酸抽出用溶液１２
００μｌを注入し、混合した。 （２）その後、上記磁性シリカ粒子の分散液４０μｌを
加えた。 （３）約１分毎に混合しながら、室温で５分間放置し
た。 （４）１．５ｃｃ用エッペンドルフチューブの形状に合
った磁石スタンドに、上記チューブを設置することによ
り、磁性シリカ粒子を磁石側のチューブ側に集めた。 （５）フィルターチップで溶液を吸引し、排出した。 （６）チューブを磁石スタンドから取りはずし、グアニ
ジン塩酸塩を含む洗浄液を１ｃｃ注入した。 （７）磁性シリカ粒子と上記洗浄液とを十分に混合した
後、再度磁石スタンドに設置し、上記と同様にして溶液
を廃棄した。 （８）１ｃｃの７０％エタノールで上記と同様の方法に
より、核酸を保持した磁性シリカ粒子を洗浄し、高濃度
のグアニジン塩酸塩を取り除いた。 （９）約５６℃のヒートブロックに上記チューブを設置
し、約１０分間放置してチューブ内、および磁性シリカ
粒子内のエタノールを完全に蒸発させて除去した。 （１０）このように洗浄した（核酸を保持した）磁性シ
リカ粒子に、１００μｌの減菌水を加え、約５６℃のヒ
ートブロックに上記チューブを設置し、２分毎に混合操
作しながら１０分間放置した。次に、磁石スタンドに設
置し、回収する溶液をフィルターチップで吸引し、別の
新しいチューブに移した。通常、核酸の回収量は７０μ
ｌ程度である。核酸を保存する場合は、−７０℃で行っ
た。

【００３６】上記の操作は、（１）〜（３）が核酸を固
相担体に保持させる工程、（４）〜（５）が固液分離工
程、（６）〜（１０）が固相担体から核酸を遊離させる
工程に各々相当する。

【００３７】得られた核酸（大腸菌の染色体ＤＮＡ）の
回収量を電気泳動によって確認した結果を、図１に示
す。図１においてはＮａＣｌ又はＬｉＣｌの量を最終濃
度で０〜８３３ｍＭの間で変えて核酸収量を測定した。
表１には、図１の電気泳動の核酸に相当するバンドの濃
さを数値として表現した（使用ソフト：Ｇｅｌ−Ｐｒｏ
Ａｎａｌｙｚｅｒ（プラネトロン））。

【００３８】図１において、１レーンは実施例１の核酸
抽出精製結果を、２レーンは実施例２の核酸抽出精製結
果を、３レーンは実施例３の核酸抽出精製結果を、４レ
ーンは実施例４の核酸抽出精製結果を、５レーンは実施
例５の核酸抽出精製結果を、６レーンは実施例６の核酸
抽出精製結果を、７レーンは実施例７の核酸抽出精製結
果を、Ｃレーンは比較例１の核酸抽出精製結果を、Ｍレ
ーンはλ／ＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカーをそれぞれ表
す。

【００３９】

【表１】

【００４０】図１および表１において明らかなように、
アルカリ（土類）金属イオン（ＮａＣｌ又はＬｉＣｌ）
を核酸抽出用溶液に含まない比較例１に比して、実施例
では核酸収量が増加した。本発明の方法と従来方法の手
順の違いは、核酸抽出用溶液にアルカリ（土類）金属イ
オンを所定濃度以上添加する点のみである。結果とし
て、核酸を含有する試料から核酸を精製するための方法
としての本発明の有用性が示された。

【００４１】なお、本実施例では磁性体粒子を用いてい
るため、固液分離は遠心分離をおこなわずとも磁石を用
いて非常に簡便に実施することができる。磁石を用いた
磁性体粒子の固液分離システムは自動化も容易であり、
実際、自動化装置が既に開発、販売されている（例え
ば、MFX-2000、MFX-6000、MFX-9600（東洋紡績製）
等）。従って、これらの装置と本発明との方法を組合せ
ることにより、核酸を高収率にハイスループット精製す
ることも容易に実現できる。

【００４２】

【発明の効果】本発明により、従来技術による方法に比
べ、核酸をより強固に固相担体に保持させることによ
り、核酸の抽出精製の高効率化が可能となる。これによ
り、安価に、かつ簡便な方法で核酸を含有する試料から
核酸を精製することが可能となる。また、本方法の優位
性を活かして、核酸の抽出精製の自動化、ハイスループ
ット化、μ−ＴＡＳへの応用が期待できる。また、核酸
精製溶液、および該溶液を有する核酸精製用試薬キット
を用いることにより、本発明の方法の実施の際に、様々
な試薬等を各々準備、調製する手間を省くことができる
ので、迅速に、かつ簡便に、必要な量だけ用いて本発明
の方法を実施することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】各実施例、比較例によって得られた核酸の回収
量を電気泳動によって確認した結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岸本 幹雄 大阪府茨木市丑寅一丁目１番88号 日立マ クセル株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA03 4C057 AA10 BB02 CC03 MM04

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カオトロピック物質を含有する核酸抽出
   用溶液中で、シリカを含む核酸結合用固相担体へ核酸を
   含有する試料を保持させる工程、該核酸を保持した該固
   相担体を該核酸抽出用溶液から分離する固液分離工程、
   および該固相担体から該核酸を遊離させる工程を有す
   る、核酸の精製方法において、 上記核酸抽出用溶液が０．２Ｍ以上の濃度のアルカリ金
   属イオンおよび／またはアルカリ土類金属イオンをさら
   に含むものであることを特徴とする、核酸の精製方法。
2. 【請求項２】 上記核酸抽出用溶液が１．０Ｍ以下の濃
   度のアルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金
   属イオンを含むものであることを特徴とする、請求項１
   に記載の核酸の精製方法。
3. 【請求項３】 上記アルカリ金属イオンおよび／または
   アルカリ土類金属イオンが、ナトリウムイオン、リチウ
   ムイオンのいずれか一方、または両者の混合物であるこ
   とを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の
   核酸の精製方法。
4. 【請求項４】 上記シリカを含む核酸結合用固相担体
   が、さらに強磁性金属酸化物を含むものであることを特
   徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の精製
   方法。
5. 【請求項５】 少なくとも、カオトロピック物質と、
   ０．２Ｍ以上のアルカリ金属イオンおよび／またはアル
   カリ土類金属イオンとを有する水溶液である、核酸抽出
   用溶液。
6. 【請求項６】 上記アルカリ金属イオンおよび／または
   アルカリ土類金属イオンが、ナトリウムイオン、リチウ
   ムイオンのいずれか一方、または両者の混合物であるこ
   とを特徴とする、請求項５に記載の核酸抽出用溶液。
7. 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の核
   酸抽出用溶液と、シリカを含む核酸結合用固相担体と、
   カオトロピック物質ならびにアルカリ金属イオンおよび
   ／またはアルカリ土類金属イオンを洗い流し得る洗浄液
   と、核酸を溶解し得る遊離液とを少なくとも有する、核
   酸精製用試薬キット。