JP2003172736A

JP2003172736A - 化学反応用マイクロチップ

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Publication number: JP2003172736A
Application number: JP2001374763A
Authority: JP
Inventors: Michifumi Nika; 通文丹花; Hiroshi Okamura; 浩岡村; Keigo Ebara; 啓吾江原; Kaoru Yamakawa; 薫山川; Mitsuyoshi Oba; 光芳大場
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2003-06-20

Abstract

(57)【要約】【課題】実験に供される化学物質の種類を問わず、か
つ、あらゆる実験条件下においても、迅速に実験を行う
ことができる化学反応用マイクロチップを提供する。【解決手段】化学反応用マイクロチップＡの基板を形
成する微小サイズのセル１０の表面に、電極層と炭素化
合物の電極とを備えた化学反応プール部１１、１２を形
成させる。これらの複数の化学反応プール部１１、１２
同士を連通連結する溝からなる水平連通路１３を形成す
ることができる。さらに、化学反応プール部１１、１２
と対応する個所にペルチェ素子等の加熱・冷却手段２
３、２４を取り付けている。従って、化学物質の種類に
よって制約されることなく、かつ、実験条件を変えて微
小空間で多様な実験を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、各種化学反応を微
小空間で行うことができる化学反応用マイクロチップに
関するもので、特にＤＮＡ等を電気泳動することにより
ＤＮＡを特定することが可能な化学反応用マイクロチッ
プに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種研究開発の迅速化、省力化、
省資源化、省エネルギー化、省スペース化、さらには、
実験廃液、廃棄物の削減、繰り返し実験の合理化等を目
的として、マイクロメートル単位の微小空間において化
学実験を行うことができる、いわゆる集積化化学実験室
が提唱されている。このような集積化化学実験室は、数
ｃｍ角のガラス基板上にサブμｍから１００μｍのプロ
セスチャンネルを形成することによって構成されるもの
であり、ミクロンレベルの化学反応を起こし、反応生成
物の分離、さらに検出まで一貫して行うことを目的とし
たものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記した集積
化化学実験室は、未だ、以下の解決すべき課題を有して
いた。（１）即ち、基板としてガラス単体からなる基板を用い
ることから、化学物質によっては、十分な耐腐食性を確
保することができないため、それらの化学物質について
の実験を行うことができないおそれがある。（２）ガラス基板は電気伝導性が低いので、電気泳動の
実験ができないおそれがある。本発明は、上記した課題を解決することができ、実験に
供される化学物質の種類を問わず、かつ、あらゆる実験
条件下においても、迅速に実験を行うことができ、特に
広範囲の化学物質に対して優れた耐腐食性を示し、しか
も電気伝導性及び熱伝導性に優れた電極を備えた化学反
応用マイクロチップを提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明に係る化学反応用マイクロチップは、固体支
持体表面に下層として電極層と、上層として炭素化合物
を有する電極と、該電極層と逆の極性を有する対極とか
らなる化学反応プール部を備えていることを特徴として
いる。このチップにおいては、化学反応プール部は複数
個存在し、該化学反応プール部同士を連通連結する溝か
らなる水平連通路を形成していることが好ましい。この
場合、前記化学反応プール部の周囲又は底面に沿って、
加熱・冷却手段を取り付けることが好ましい。前記固体
支持体はガラスあるいはプラスチックであることが好ま
しい。プラスチックを基板とする場合、ポリエチレン樹
脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アク
リル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウ
レタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メ
ラミン樹脂、エポキシ樹脂、あるいは塩化ビニル樹脂が
適用できる。また、前記炭素化合物がダイヤモンド、ダ
イヤモンドライクカーボン（Diamond like Carbon、Ｄ
ＬＣ）、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、
炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、
炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭
化モリブデン、炭化クロムあるいは炭化バナジウムであ
ることが好ましい。この炭素化合物の表面に、化学修飾
を施し、オリゴヌクレオチド断片、蛋白質又はペプチド
を担持させることが好ましい。更に、前記電極層が錫を
ドープした酸化インジウム（Indium Tin oxide、ＩＴ
Ｏ）、金、白金あるいは銀であることが好ましい。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、添付図に示す一実施形態を
参照して、本発明を具体的に説明する。まず、図１〜図
３を参照して、本発明の一実施形態に係る化学反応用マ
イクロチップＡの全体構成について説明する。図示する
ように、化学反応用マイクロチップＡの本体を形成する
セル１０は、幅と長さがそれぞれ数ｃｍで、厚みがサブ
μｍ〜数百μｍの矩形板からなる。そして、セル１０の
一側表面には、複数の化学反応プール部１１、１２と、
これらの化学反応プール部１１、１２を連通連結する溝
からなる水平連通路１３が形成されている。また、セル
１０の一側表面には、水平面上で隣接される他の化学反
応用マイクロチップＡ１、Ａ２のセル１４、１５に同様
に設けられた化学反応プール部１６，１７を、化学反応
用マイクロチップＡの化学反応プール部１１、１２に連
通連結するための溝からなる水平連通路１８、１９、３
１、３２も設けられている。

【０００６】さらに、図３に示すように、化学反応用マ
イクロチップＡのセル１０の下面で、化学反応プール部
１１、１２と対応する個所にペルチェ素子等の加熱・冷
却手段２４を取り付けることも考えられる。この場合、
化学反応プール部１１、１２内の化学物質の反応を促進
することができる。

【０００７】次に、上記した構成を有する化学反応用マ
イクロチップＡを用いた化学実験について説明する。ま
ず、化学反応プール部１１内において被実験対象物であ
る複数の液状、ガス状、または固形状の化学物質を流入
又は導入して所定の化学反応を起こさせ、反応後生成物
質を水平連通路１３を通して化学反応プール部１２に送
り、次の化学反応や成分分析等を行う。この際、化学反
応用マイクロチップＡ（Ａ１、Ａ２も同じ。）の基板
は、固体支持体表面に下層として電極層、上層として炭
素化合物を有する電極とからなり、化学反応マイクロチ
ップＡ３の基板は該電極層と逆の極性を有する対極から
なる。対極は１つの化学反応容器に、少なくとも１つの
マイクロチップの基板としてあれば良い。また、図３に
示すように、各化学反応プール部１１において、間に試
験液を挟んで、電極と向かい合うように対峙させても良
い。対極の材料として、電気伝導性を有する化学的に安
定な金、白金、銀などが使える。その他の大部分のマイ
クロチップは、固体支持体表面に下層として電極層、上
層として炭素化合物を有する電極とからなることが好ま
しい。前記炭素化合物は特に限定されるものではない
が、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラ
ファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭
化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、
炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデ
ン、炭化クロムあるいは炭化バナジウムが適用できる。
特に、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グ
ラファイトはあらゆる化学物質に対して、高耐食性を有
し、化学物質の種類によって、制約されることなく微小
空間で多様な化学実験を行うことができる。上記のダイ
ヤモンドの素材としては、合成ダイヤモンド、高圧形成
ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも
使用できる。また、上記のダイヤモンドライクカーボン
（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物
質と他の物質との混合体、例えば金属やセラミックス等
との混合体も表面処理層として用いることができる。さ
らに、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、
ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の物質
との積層体も表面処理層として用いることができる。ダ
イヤモンド、ＤＬＣあるいはグラファイトなどの炭素化
合物の被覆は、高周波プラズマＣＶＤ法、イオン化蒸着
法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法等により形成でき
る。炭素化合物の厚みは特に限定するものではないが、
１ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みであれば良い。１ｎｍ未満
では、薄すぎて、炭素化合物の被膜が均一にはならな
く、下地の基板が露出してしまう部分が存在するので好
ましくない。一方、１０００ｎｍを越える被膜は、被膜
内に応力が生じ、剥離が生じやすくなるので好ましくな
い。工業上の生産性からすると、炭素化合物の厚みは１
ｎｍ〜５００ｎｍである。更に好ましくは２ｎｍ〜２０
０ｎｍである。、ＤＬＣあるいはグラファイトなどの炭
素化合物の被覆は、高周波プラズマＣＶＤ法、イオン化
蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法等により形成で
きる。ダイヤモンドの形成割合は上記プラズマＣＶＤ法
で形成する場合には、反応槽内の圧力、バイアス電圧や
基板温度等の条件により適宜設定することができる。高
周波プラズマＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波
によって電極間に生じるグロー放電によりメタンを分解
し、基板上にＤＬＣ膜を合成する。イオン化蒸着法で
は、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利
用して、ベンゼンを分解・イオン化し、バイアス電圧に
よって基体上に製膜する。また、水素ガス０〜９９体積
％と残りメタンガス１００〜１体積％からなる混合ガス
中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣを形成しても良い。

【０００８】上記のイオン化蒸着法とは、Weissmantel
らによって提案された方法で、炭化水素ガスソースＤＬ
Ｃ製膜法の１種であり、イオン源は陰極である熱フィラ
メントと対向する陽極グリットとそれらを取り囲む金属
円筒からなる。アーク式蒸着法では、固体のグラファイ
ト原料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電
圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして
陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりも更
に負のバイアス電圧を基体に印加することにより基体に
向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し製膜する。

【０００９】また、レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：Ｙ
ＡＧレーザ（パルス発信）光をグラファイトのターゲッ
ト板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆
積させることにより形成することができる。炭素化合物
からなる電極は、熱伝導性に優れるため、温度を変化さ
せながら反応を起こす場合には、特に有利である。この
炭素化合物の表面に、化学修飾を施し、いろんな種類の
配列の判明したＤＮＡを固定して、配列の不明なＤＮＡ
を含んだ試験液中でＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）を行い、ハイブリタイズしたＤＮＡを蛍光標識する
ことにより、配列が判らなかったＤＮＡの配列が判明す
る。ＰＣＲは電極層と、対極の間に一定電圧をかけて行
った。このように、配列の不明なＤＮＡの配列を調べる
ための実験装置としても用いることができる。また、Ｐ
ＣＲを行っている時、ハイブリタイズする際の電流の変
化により、配列が不明なＤＮＡの配列が判明する。この
ため、前記電極層は優れた導電性を有する錫をドープし
た酸化インジウム（ＩＴＯ）、金、白金あるいは銀であ
ることが好ましい。ＩＴＯは公知の方法で被覆すれば良
く、例えば、イオンビームスパッタリング法、ＤＣマグ
ネトロンスパッタリング法、真空蒸着法などが適用でき
る。金あるいは白金は真空蒸着による法など公知の方法
で被覆することができる。この電極の厚みは１０nm〜５
０００ｎｍの範囲が良い。１０ｎｍ未満では、薄すぎ
て、十分な導電性が得られない。５０００ｎｍを越える
と、導電性は飽和状態に達し、コストの点で好ましくな
い。

【００１０】以上のように、炭素化合物を形成した後、
ＤＮＡあるいはプロテインが容易に固定するように、炭
素化合物の表面をそれ自体公知の手段で化学修飾する。
化学修飾の一例としては、炭化水素基の末端に活性化エ
ステル基を、支持体表面にアミド結合を介して固定化す
ることが挙げられる。このような化学修飾によって、Ｄ
ＮＡあるいはプロテインが容易に固定する。その他の化
学修飾は、末端に極性基、例えば、水酸基、カルボキシ
ル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基、アルデヒド
基、イソシアネート基等を有する炭化水素基で基板表面
を置換することによる。

【００１１】前記炭化水素基として、炭素数が１〜１２
のもの、中でも１〜６のものが好ましい。例えば、蟻
酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸、シュウ
酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などの
ジカルボン酸、トリメリト酸等の多価カルボン酸が挙げ
られる。中でも、ポリアクリル酸、シュウ酸、コハク酸
が好ましい。化学修飾する方法として、例えば、塩素ガ
ス中で基板に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでア
ンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当
な酸クロリドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化
する。また、ほかの方法として、塩素化しないで、アン
モニアガス中でプラズマ法でアミノ化し、次いで同様に
カルボキシル化してもよい。

【００１２】また、ダイヤモンド、ダイヤモンドライク
カーボンあるいはグラファイトなどの炭化物は熱伝導性
が良好なので、例えば、化学反応プール部１１、１２と
対応する個所にペルチェ素子等の加熱・冷却手段２４を
取り付けることによって反応速度を高め、或いは抑制す
るなど、反応速度を制御することができ、実験を効率的
に行うことができる。上記した化学反応用マイクロチッ
プＡ〜Ａ２のセル１０、１４、１５において、化学反応
プール部１１、１２、１６、１７は、ダイヤモンドレー
ザー等を用いて溶融除去によって形成加工することも可
能である。

【００１３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
る。

【００１４】（実施例１）以下のようにして、固体支持
体を用意した。まず、固体支持体として、２５ｍｍ
（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライド
ガラスを用いた。このスライドガラスの表面に、リソグ
ラフィにより図に示すようなプールと流路を形成し、プ
ール部にはDCマグネトロンスパッタ法により金を１００
０ｎｍ付着させた。更に、プールと流路に、イオン化蒸
着法により、メタンガス９５体積％、水素ガスを５体積
％を混合したガスを原料として、ＤＬＣ膜を２５ｎｍ厚
みに形成した固体支持体を作成した。

【００１５】次に、このプールに形成したDLC表面を化
学修飾し、活性化させた。すなわち、ＤＬＣ表面をアン
モニアガス中でプラズマ法により３０秒間アミノ化し、
更にN−メチル−２−ピロリドン中で無水コハク酸を２
０分間反応させた。次に、超純水で洗浄後、活性化液へ
浸漬して直接活性化を行った。活性化液の組成は、１，
４−ジオキサン１ｍＬ、ハイドロゲンシアナミド２５ｍ
ｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１５０ｍｇであ
り、これらを溶解したものである。さらに超純水で洗浄
後、６５℃で乾燥して活性化した。

【００１６】0.5μｇ／μｌのオリゴヌクレオチドdA_３d
T_１７水溶液を化学反応プール部１１，１２に入れて２
分間反応させることにより、上層に炭素化合物、下層に
金層を有する化学反応プール部の１１、１２部に固定し
た。また化学反応プール部１３には、予めラットcDNAか
らcyp４５０（チトクロムｐ４５０）部位をPCRにより増
幅した後、精製したDNAを固定した（プライマーの塩基
配列は配列表の配列番号１および２参照）。化学反応プ
ール部１１、１２にそれぞれ異なるラットＡ、ＢのmRNA
と逆転写に必要な組成液を入れて逆転写することによ
り、化学反応プール部１１、１２にcDNAを固定した。次
に、化学反応プール部１１、１２にcyp４５０部位を対
象とするそれぞれ異なる蛍光標識プライマー（Ｃｙ３、
Ｃｙ５）及びDNAの増幅に必要な組成液を入れた。そし
て、固体支持体の下部に設置したペルチェ素子により、
固体支持体全体を７２℃に保持して、金層と対極の白金
電極間で電場を制御することによりDNAを増幅した。こ
の時DLCは、１Ｖの電圧に対して、0.02A/cm^２の電流を
通すことができた。その後、固体支持体を６０℃に維持
して、この増幅液を化学反応プール部１１、１２から化
学反応プール部１４に輸送して、化学反応プール部１４
のDNAにハイブリダイズさせた。

【００１７】その結果、化学反応プール部１４におい
て、黄緑色の蛍光シグナルが観測された。即ちこの結果
は、Ｃｙ３蛍光シグナルが強く、Ｃｙ５蛍光シグナルは
弱いことを表し、これにより、ラットＡの方が解毒のた
めに、ラットＢより沢山のcyp４５０遺伝情報を含むmRN
Aを発現していることが推定できる。

【００１８】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明では、
固体支持体の下層として金等からなる電極層、上層とし
て、炭素化合物からなる電極を備えた化学反応マイクロ
チップは、広範囲の化学物質に対して優れた耐腐食性を
示し、しかも電気伝導性及び熱伝導性に優れているとい
う利点を与える。このマイクロチップは、作用の判明し
たDNAを固定することにより、mRNAの発現量を調べるこ
とができ、センサーとして使える。また、一つのチップ
上に、ＤＮＡが電気を通し且つＤＮＡを固定できること
を活かして、反応のための化学反応プール部、流路及び
検出のための化学反応プール部等を集積化することによ
り、化学反応マイクロチップとして広範な応用展開が期
待できる。

【００１９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 配列番号１ primer-Forward:5'-GAA CTG AGG AAA ACA AAA GGA TCA CC-3' 配列番号２ primer-Reverse:5'-GCC AAT CAC ACG GTC AAT CTC TTC-3' <110> Toyo Kohan Co., Ltd. <120>化学反応用マイクロチップ <130>P 3023 <160>2 <210>1 <211>26 <212>DNA <213>artificial sequence <400>1 gaa ctg agg aaa aca aaa ggc tca cc 26 <210>2 <211>24 <212>DNA <213>artificial sequence <400>2 gcc aat cac acg gtc aat ctc ttc 24

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施の形態に係る化学反応用マイク
ロチップの斜視図である。

【図２】同平面図である。

【図３】図２のＩ−Ｉ線による断面図である。

【符号の説明】

Ａ：化学反応用マイクロチップＡ１、Ａ２：化学反応用マイクロチップ１０：セル１１、１２：化学反応プール部１３：水平連通路１４、１５：セル１６、１７：化学反応プール部１８、１９：水平連通路２４：加熱・冷却手段２９、３０、３１、３２：水平連通路３６：基板３７：炭素化合物３８：白金３９：電極層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｂ０１Ｊ 19/00 ３２１Ｂ０１Ｊ 19/00 ３２１Ｂ０３Ｃ 5/00 Ｂ０３Ｃ 5/00 ＺＣ１２Ｍ 1/00 ＺＮＡＣ１２Ｍ 1/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１１０２１０２Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者江原啓吾山口県下松市東豊井1296番地の１東洋鋼鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者山川薫山口県下松市東豊井1296番地の１東洋鋼鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者大場光芳山口県下松市東豊井1296番地の１東洋鋼鈑株式会社技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 CA09 CA12 HA19 4B029 AA23 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR55 QR84 QS34 4D054 FA06 FA10 FB01 FB09 FB11 4G075 AA32 AA39 AA62 AA63 AA65 BD05 BD17 BD26 CA02 CA20 EA06 EC21 EE07 EE12 FA12 FB03 FB06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固体支持体表面に下層として電極層、上
層として炭素化合物を有する電極と、該電極層と逆の極
性を有する対極とからなる化学反応プール部を備えてい
ることを特徴とする化学反応用マイクロチップ。
【請求項２】化学反応プール部が複数個存在し、該化
学反応プール部同士を連通連結する溝からなる水平連通
路を形成したことを特徴とする請求項１に記載の化学反
応用マイクロチップ。
【請求項３】前記化学反応プール部の周囲又は底面に
沿って、加熱・冷却手段を取り付けたことを特徴とする
請求項１または２に記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項４】前記固体支持体がガラスあるいはプラス
チックであることを特徴とする請求項１乃至３の何れか
に記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項５】前記炭素化合物がダイヤモンド、ダイヤ
モンドライクカーボン、グラファイト、炭化ハフニウ
ム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウ
ム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化
ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムあるいは炭
化バナジウムであることを特徴とする請求項１乃至４の
何れかに記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項６】前記電極層が錫をドープした酸化インジ
ウム（ＩＴＯ）、金、白金あるいは銀であることを特徴
とする請求項１乃至５の何れかに記載の化学反応用マイ
クロチップ。
【請求項７】前記炭素化合物の表面に、化学修飾を施
し、オリゴヌクレオチド断片を担持させた請求項１乃至
６の何れかに記載の化学反応用マイクロチップ。
【請求項８】前記炭素化合物の表面に、化学修飾を施
し、蛋白質又はペプチドを担持させた請求項１乃至６の
何れかに記載の化学反応用マイクロチップ。