JP2003125783A - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
アルカリプロテアーゼInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 特定アミノ酸配列の（ａ）２５１位、
（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基
が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：アスパラギ
ン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニ
ン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残
基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニ
ルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシ
ン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイ
ン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれた
アルカリプロテアーゼ。 【効果】 本発明によれば、反応効率が高く（高比活
性）、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテア
ーゼを提供できる。
（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基
が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：アスパラギ
ン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニ
ン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残
基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニ
ルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシ
ン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイ
ン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれた
アルカリプロテアーゼ。 【効果】 本発明によれば、反応効率が高く（高比活
性）、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテア
ーゼを提供できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高い比活性及び酸化
剤耐性を有し、洗浄剤配合酵素として有用な変異アルカ
リプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
剤耐性を有し、洗浄剤配合酵素として有用な変異アルカ
リプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロテ
アーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧
料、浴用剤等のトイレタリー分野、食品改質剤をはじめ
とする食品分野、消化助剤や消炎剤といった医薬品等の
多分野で利用されている。その中でも最も大量に工業生
産され市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアー
ゼである。
アーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧
料、浴用剤等のトイレタリー分野、食品改質剤をはじめ
とする食品分野、消化助剤や消炎剤といった医薬品等の
多分野で利用されている。その中でも最も大量に工業生
産され市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアー
ゼである。
【０００３】衣料等の汚れはタンパク質だけでなく、脂
質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほと
んどであり、実質的な複合汚れに対して洗浄力の高い洗
浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者らは、
高濃度の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、
タンパク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対
しても優れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分
子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、
先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。
質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほと
んどであり、実質的な複合汚れに対して洗浄力の高い洗
浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者らは、
高濃度の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、
タンパク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対
しても優れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分
子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、
先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。
【０００４】また、分子量約４３，０００のアルカリプ
ロテアーゼは他のバチルス属細菌からもいくつか見出さ
れているが、これらは従来からのズブチリシンタイプの
セリンプロテアーゼよりも非常に高い酸化剤耐性を有し
ており、酸化耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズ
ブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されて
いる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ. ２７９、３１３−３１９、２０００）。
ロテアーゼは他のバチルス属細菌からもいくつか見出さ
れているが、これらは従来からのズブチリシンタイプの
セリンプロテアーゼよりも非常に高い酸化剤耐性を有し
ており、酸化耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズ
ブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されて
いる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ. ２７９、３１３−３１９、２０００）。
【０００５】しかし、反応効率を向上させる為に比活性
が高く、高濃度の酸化剤に対しても安定なより強い酸化
剤耐性を示すアルカリプロテアーゼが求められていた。
が高く、高濃度の酸化剤に対しても安定なより強い酸化
剤耐性を示すアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記アルカ
リプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行って
きたが、ズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼ
と前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質に差異
が認められ、さらに検討を加えた結果、前記アルカリプ
ロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させる或いは
更に高い酸化剤耐性を付加するには、ある種のアルカリ
プロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に
特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
リプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行って
きたが、ズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼ
と前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質に差異
が認められ、さらに検討を加えた結果、前記アルカリプ
ロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させる或いは
更に高い酸化剤耐性を付加するには、ある種のアルカリ
プロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に
特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１の（ａ）
２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のア
ミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、 （ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたアルカ
リプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供す
るものである。
２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のア
ミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、 （ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたアルカ
リプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供す
るものである。
【０００８】また本発明は該アルカリプロテアーゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、
及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。
ードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、
及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明のアルカリプロテアーゼ
は、上記のように、配列番号１の（ａ）２５１位、
（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基
が欠失又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、
グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、
チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチ
オニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン
残基、から選ばれたものである。
は、上記のように、配列番号１の（ａ）２５１位、
（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基
が欠失又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、
グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、
チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチ
オニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン
残基、から選ばれたものである。
【００１０】すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼ
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼにおける前記（ａ）及び（ｂ）から選ば
れる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼ
のアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残
基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを
意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的
に変異を施した変異体であってもよい。
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカ
リプロテアーゼにおける前記（ａ）及び（ｂ）から選ば
れる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼ
のアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残
基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを
意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的
に変異を施した変異体であってもよい。
【００１１】ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」と
しては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸
化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法による分子量が
４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列
番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８
０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものが挙
げられる。特に好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配
列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有し、ｐ
Ｈ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有
する、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％
以上の残存活性を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
が４３，０００±２，０００である酵素が挙げられる。
ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテ
アーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを
含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）
中で、２０℃２０分間の放置後の残存活性が少なくとも
５０％以上を保持していることをいう。
しては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸
化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法による分子量が
４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列
番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８
０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものが挙
げられる。特に好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配
列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有し、ｐ
Ｈ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有
する、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％
以上の残存活性を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
が４３，０００±２，０００である酵素が挙げられる。
ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテ
アーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを
含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）
中で、２０℃２０分間の放置後の残存活性が少なくとも
５０％以上を保持していることをいう。
【００１２】ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４
３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げ
られ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の
相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアー
ゼ」としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配
列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エス
ピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３
４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示さ
れるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチル
ス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、Ｊ
Ｐ７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列
を有するプロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼＳＤ５２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ
−１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６
で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１
（ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配
列番号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ
Ａ−２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９
３）、又は配列番号１〜７と８０％以上、好ましくは８
７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは
９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙
げられる。なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン
−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,
1985）によって計算される。
配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４
３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げ
られ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の
相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアー
ゼ」としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配
列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エス
ピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３
４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示さ
れるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチル
ス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、Ｊ
Ｐ７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列
を有するプロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼＳＤ５２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ
−１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６
で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１
（ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配
列番号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ
Ａ−２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９
３）、又は配列番号１〜７と８０％以上、好ましくは８
７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは
９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙
げられる。なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン
−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,
1985）によって計算される。
【００１３】また、「相当する位置のアミノ酸残基」を
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較す
ることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ
酸配列をこのような方法で整列させることにより、相同
アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を
決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で
同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特
異的機能に関して類似した効果を有することが推定でき
る。
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較す
ることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ
酸配列をこのような方法で整列させることにより、相同
アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を
決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で
同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特
異的機能に関して類似した効果を有することが推定でき
る。
【００１４】すなわち、（ａ）配列番号１の２５１位の
アミノ酸残基はメチオニン残基であるが、その位置に相
当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いること
により、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５０位
のメチオニン酸基というように特定することができる。
当該アミノ酸残基は、アスパラギン、グリシン、アラニ
ン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリ
ン、ロイシン、グルタミン残基であるのが好ましく、ア
スパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミンであるのが特に好ましい。
アミノ酸残基はメチオニン残基であるが、その位置に相
当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いること
により、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５０位
のメチオニン酸基というように特定することができる。
当該アミノ酸残基は、アスパラギン、グリシン、アラニ
ン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリ
ン、ロイシン、グルタミン残基であるのが好ましく、ア
スパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミンであるのが特に好ましい。
【００１５】（ｂ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残
基はメチオニン残基であるが、ここで、その位置に相当
する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることに
より、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５５位の
メチオニン残基というように特定することができる。当
該アミノ酸残基は、グルタミン、アラニン、バリン、セ
リン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸残基であるのが好ましく、グルタミン、アラニ
ン、バリン、セリン、アスパラギン残基であるのが特に
好ましい。
基はメチオニン残基であるが、ここで、その位置に相当
する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることに
より、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５５位の
メチオニン残基というように特定することができる。当
該アミノ酸残基は、グルタミン、アラニン、バリン、セ
リン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸残基であるのが好ましく、グルタミン、アラニ
ン、バリン、セリン、アスパラギン残基であるのが特に
好ましい。
【００１６】プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配
列番号１）の２５１位（ａ）、２５６位（ｂ）に相当す
る位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカ
リプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す
（表１）。
列番号１）の２５１位（ａ）、２５６位（ｂ）に相当す
る位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカ
リプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す
（表１）。
【００１７】
【表１】
【００１８】また、本発明アルカリプロテアーゼにおけ
るアミノ酸残基の欠失、（ａ）又は（ｂ）の選択は、２
個所以上が同時になされていていもよい。
るアミノ酸残基の欠失、（ａ）又は（ｂ）の選択は、２
個所以上が同時になされていていもよい。
【００１９】本発明のアルカリプロテアーゼが変異体で
ある場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親ア
ルカリプロテアーゼということがある）としては、「配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として
示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すこと
により本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例え
ばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ
酸配列の前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる位置のアミ
ノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配
列、具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列
の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他
のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
ある場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親ア
ルカリプロテアーゼということがある）としては、「配
列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアー
ゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として
示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すこと
により本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例え
ばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ
酸配列の前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる位置のアミ
ノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配
列、具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列
の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他
のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００２０】本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以
下の方法により得ることができる。すなわち、クローニ
ングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子
に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当
な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することに
より得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺
伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用
いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１
１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行え
ばよい。
下の方法により得ることができる。すなわち、クローニ
ングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子
に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当
な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することに
より得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺
伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用
いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１
１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行え
ばよい。
【００２１】親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子の変異手段としては、一般的に行われているランダム
変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。よ
り具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutage
nesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用い
て行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（po
lymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academ
ic press, New York, 1990）を用いることによって、遺
伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当す
る配列と置換することが可能である。
子の変異手段としては、一般的に行われているランダム
変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。よ
り具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutage
nesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用い
て行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（po
lymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academ
ic press, New York, 1990）を用いることによって、遺
伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当す
る配列と置換することが可能である。
【００２２】得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテ
アーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増
幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該変異
遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる
などの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤ
ＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率
よく発現させることが可能である宿主に導入し、変異プ
ロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を
満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カ
ビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
アーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増
幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該変異
遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる
などの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤ
ＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率
よく発現させることが可能である宿主に導入し、変異プ
ロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を
満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カ
ビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
【００２３】かくして得られる本発明のアルカリプロテ
アーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有
し、強い酸化剤耐性を有し、各種洗浄剤組成物配合用酵
素として有用である。例えば、配列番号１のアミノ酸配
列を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼ
は、下記の理化学的性質を有する。 （ｉ）作用ｐＨ範囲：ｐＨ４〜１３の広い範囲で作用
し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ活性値の８０％以上を示
す。 （ii）安定ｐＨ範囲：４０℃、３０分の処理条件でｐＨ
６〜１１の範囲で安定である。 （iii）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分
解活性の阻害を受けない。
アーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有
し、強い酸化剤耐性を有し、各種洗浄剤組成物配合用酵
素として有用である。例えば、配列番号１のアミノ酸配
列を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼ
は、下記の理化学的性質を有する。 （ｉ）作用ｐＨ範囲：ｐＨ４〜１３の広い範囲で作用
し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ活性値の８０％以上を示
す。 （ii）安定ｐＨ範囲：４０℃、３０分の処理条件でｐＨ
６〜１１の範囲で安定である。 （iii）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分
解活性の阻害を受けない。
【００２４】
【実施例】［プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法］カ
ゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．
１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停
止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナト
リウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０mL加え、室温で３０
分間放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶タンパ
ク質をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅ
ｍ．、１９３、２６５−２７５、１９８１）によって定
量した。すなわち、濾液にアルカリ性銅溶液［１％酒石
酸ナトリウムカリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウ
ム＝１：１：１００］を２．５ｍＬ添加して室温で１０
分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東
化学）を脱イオン水で２倍希釈）０．２５ｍＬを添加し
て３０分間３０℃で保温したのち、６６０ｎｍにおける
吸光度を測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間
に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質
分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
ゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．
１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停
止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナト
リウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０mL加え、室温で３０
分間放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶タンパ
ク質をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅ
ｍ．、１９３、２６５−２７５、１９８１）によって定
量した。すなわち、濾液にアルカリ性銅溶液［１％酒石
酸ナトリウムカリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウ
ム＝１：１：１００］を２．５ｍＬ添加して室温で１０
分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東
化学）を脱イオン水で２倍希釈）０．２５ｍＬを添加し
て３０分間３０℃で保温したのち、６６０ｎｍにおける
吸光度を測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間
に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質
分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００２５】［プロテアーゼ活性測定法−合成基質法］
合成基質（Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｒｇ-ｐ-ｎｉｔｒ
ｏａｎｉｌｉｄｅ、ペプチド研究所）６μＭを含む１０
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）５０μＬに５０μ
Ｌの酵素溶液を加え、３０℃中で１５分間反応を行う。
反応液の吸光度４１４nmを経過時間ごとに測定し、単位
時間あたりの吸光度４１４nmの変化値からプロテアーゼ
活性を求めた。
合成基質（Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｒｇ-ｐ-ｎｉｔｒ
ｏａｎｉｌｉｄｅ、ペプチド研究所）６μＭを含む１０
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）５０μＬに５０μ
Ｌの酵素溶液を加え、３０℃中で１５分間反応を行う。
反応液の吸光度４１４nmを経過時間ごとに測定し、単位
時間あたりの吸光度４１４nmの変化値からプロテアーゼ
活性を求めた。
【００２６】実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約１．
５ｋｂの範囲に対しランダムに変異を与えることとし
た。先ず、本１．５ｋｂを増幅できるプライマー（5'−
GCGATGTTAAGTCAGCAACAAGC-3'（配列番号８）, 5'-CTATT
AATTCACAATTGCCAACGAG（配列番号９））を用いＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液（１００μＬ）中には鋳型ＤＮＡ
を５ｎｇ、リン酸化プライマーを２０ｐｍｏｌ、各ｄＮ
ＴＰを２０ｎｍｏｌ、１μｍｏｌのトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ８．３）、５μｍｏｌの塩化カリウム、０．１５
μｍｏｌの塩化マグネシウム、２．５ｕｎｉｔｓのＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲの反応条件
は、９４℃において５分間放置し鋳型を変性させた後、
９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間
を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ
product purificaton Kit（ベーリンガーマンハイム
社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で
溶出させた。引き続き、１μＬの溶出液を使用して２回
目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型ＤＮＡ以外は
全て１回目のＰＣＲ条件と同じとした。２回目のＰＣＲ
後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅
菌水で溶出させた。
５ｋｂの範囲に対しランダムに変異を与えることとし
た。先ず、本１．５ｋｂを増幅できるプライマー（5'−
GCGATGTTAAGTCAGCAACAAGC-3'（配列番号８）, 5'-CTATT
AATTCACAATTGCCAACGAG（配列番号９））を用いＰＣＲを
行った。ＰＣＲ反応液（１００μＬ）中には鋳型ＤＮＡ
を５ｎｇ、リン酸化プライマーを２０ｐｍｏｌ、各ｄＮ
ＴＰを２０ｎｍｏｌ、１μｍｏｌのトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ８．３）、５μｍｏｌの塩化カリウム、０．１５
μｍｏｌの塩化マグネシウム、２．５ｕｎｉｔｓのＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲの反応条件
は、９４℃において５分間放置し鋳型を変性させた後、
９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間
を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ
product purificaton Kit（ベーリンガーマンハイム
社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で
溶出させた。引き続き、１μＬの溶出液を使用して２回
目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型ＤＮＡ以外は
全て１回目のＰＣＲ条件と同じとした。２回目のＰＣＲ
後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅
菌水で溶出させた。
【００２７】増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みは
Ｔａｋａｒａ社のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応
による方法によって行った。即ち、２回目の精製溶出液
３５μＬにＬＡＴａｑ用の緩衝液（１０倍濃縮液）を５
μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨ
Ａ６４ＴＳ（発現ベクターにプロテアーゼ構造遺伝子を
連結したもの）を２０ｎｇ添加後、最終液量を５０μＬ
にし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３
０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノ
ール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産
物はプライマー位置の５'末端側にニックを有するプラ
スミドの形状を成しており、このニック部分を連結させ
るために、さらにＴ４リガーゼ（Ｔaｋaｒa社）による
結合反応処理を行った。
Ｔａｋａｒａ社のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応
による方法によって行った。即ち、２回目の精製溶出液
３５μＬにＬＡＴａｑ用の緩衝液（１０倍濃縮液）を５
μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨ
Ａ６４ＴＳ（発現ベクターにプロテアーゼ構造遺伝子を
連結したもの）を２０ｎｇ添加後、最終液量を５０μＬ
にし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３
０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノ
ール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産
物はプライマー位置の５'末端側にニックを有するプラ
スミドの形状を成しており、このニック部分を連結させ
るために、さらにＴ４リガーゼ（Ｔaｋaｒa社）による
結合反応処理を行った。
【００２８】次に、上記のリガーゼ反応液１０μＬを用
いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を
行ったところ約４×１０5個の形質転換体が取得され
た。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミル
ク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１
％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天
１．５％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬ）上に生
育させ、プロテアーゼ分泌量を反映しているスキムミル
ク溶解斑の形成状態を観察した。その結果、野生型プラ
スミドによる形質転換体よりも明らかに大きな溶解斑を
形成する形質転換体を検出した。
いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を
行ったところ約４×１０5個の形質転換体が取得され
た。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミル
ク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１
％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天
１．５％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬ）上に生
育させ、プロテアーゼ分泌量を反映しているスキムミル
ク溶解斑の形成状態を観察した。その結果、野生型プラ
スミドによる形質転換体よりも明らかに大きな溶解斑を
形成する形質転換体を検出した。
【００２９】これらの形質転換体を培養し、培養上清よ
りプロテアーゼを精製したところ、比活性が向上してい
ることことが判った。そこで、これらの変異酵素をコー
ドする遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列番号１
に示すプロテアーゼの２５１位或いは２５６位のメチオ
ニンがグルタミン或いはロイシンに置換している変異酵
素であることが明らかになった。これらの変異はランダ
ム変異の導入によって行われたので、次に２５１位或い
は２５６位を上記のアミノ酸以外のアミノ酸に置換する
ことを目的に部位特異的変異導入法による変異酵素の造
成を試みた。
りプロテアーゼを精製したところ、比活性が向上してい
ることことが判った。そこで、これらの変異酵素をコー
ドする遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列番号１
に示すプロテアーゼの２５１位或いは２５６位のメチオ
ニンがグルタミン或いはロイシンに置換している変異酵
素であることが明らかになった。これらの変異はランダ
ム変異の導入によって行われたので、次に２５１位或い
は２５６位を上記のアミノ酸以外のアミノ酸に置換する
ことを目的に部位特異的変異導入法による変異酵素の造
成を試みた。
【００３０】部位特異的変異の導入の方法はＯＤＡ法
（Hashimoto-Gotoh et al.、Gene、152、271-276、199
5）を基にしてＴａｋａｒａ社のSite-directed Mutagen
esisSystem Mutan-Super Express Km Kitのプロトコー
ルに準じて行った。２５１位を代えるために5'-AAATATG
CATACXXXGGTGGAACGTC-3'（配列番号１０）からなるプラ
イマーを256位を代えるために5'-GGAACGTCCXXXGCTACACC
GATC-3'（配列番号１１）からなるプライマーを使用し
た(ＸはATGCの混合)。
（Hashimoto-Gotoh et al.、Gene、152、271-276、199
5）を基にしてＴａｋａｒａ社のSite-directed Mutagen
esisSystem Mutan-Super Express Km Kitのプロトコー
ルに準じて行った。２５１位を代えるために5'-AAATATG
CATACXXXGGTGGAACGTC-3'（配列番号１０）からなるプラ
イマーを256位を代えるために5'-GGAACGTCCXXXGCTACACC
GATC-3'（配列番号１１）からなるプライマーを使用し
た(ＸはATGCの混合)。
【００３１】実施例２
プロテアーゼ活性画分の調製は、実施例１で得られた形
質転換体をＡ培地（ ３％ ポリペプトンS（日本製
薬）、０．５％ 酵母エキス、１％魚肉エキス（和光純
薬）、０．１５％ リン酸二カリウム、0.02％ 硫酸マグ
ネシウム７水和物、マルトース ４％、テトラサイクリ
ン 7.5μｇ/ｍＬ）にて３０℃、６０時間培養し、得ら
れた培養上清に９０％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、タンパク質を塩析した。塩析で得られたサ
ンプルを２ｍＭの塩化カルシウムを含有する１０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝
液にて一晩透析を行なった。透析膜中の画分を２ｍＭの
塩化カルシウムを含有する１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添着させ、非吸着のプロテアー
ゼ活性画分を回収した。さらに活性画分を同緩衝液で平
衡化したＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｗ（Ｔｏｓ
ｏｈ）に添着させ、０−５０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、プロテ
アーゼ活性画分を得た。この画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動し、ほぼ均一なタンパク質としてプロテアーゼが
得られていることを確認した。タンパク質濃度の測定は
牛血清アルブミン(バイオラッド社製)を標準タンパク質
として用いてＬｏｗｒｙらの方法に準じて行った。
質転換体をＡ培地（ ３％ ポリペプトンS（日本製
薬）、０．５％ 酵母エキス、１％魚肉エキス（和光純
薬）、０．１５％ リン酸二カリウム、0.02％ 硫酸マグ
ネシウム７水和物、マルトース ４％、テトラサイクリ
ン 7.5μｇ/ｍＬ）にて３０℃、６０時間培養し、得ら
れた培養上清に９０％飽和となるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、タンパク質を塩析した。塩析で得られたサ
ンプルを２ｍＭの塩化カルシウムを含有する１０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝
液にて一晩透析を行なった。透析膜中の画分を２ｍＭの
塩化カルシウムを含有する１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添着させ、非吸着のプロテアー
ゼ活性画分を回収した。さらに活性画分を同緩衝液で平
衡化したＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｗ（Ｔｏｓ
ｏｈ）に添着させ、０−５０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、プロテ
アーゼ活性画分を得た。この画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動し、ほぼ均一なタンパク質としてプロテアーゼが
得られていることを確認した。タンパク質濃度の測定は
牛血清アルブミン(バイオラッド社製)を標準タンパク質
として用いてＬｏｗｒｙらの方法に準じて行った。
【００３２】実施例３
実施例２で得られた精製した各変異プロテアーゼの活性
をカゼイン法によって測定した。各変異プロテアーゼの
単位タンパク質量あたりの活性（比活性）の測定結果を
図１に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親
アルカリプロテアーゼに比べ高い比活性を有していた。
をカゼイン法によって測定した。各変異プロテアーゼの
単位タンパク質量あたりの活性（比活性）の測定結果を
図１に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親
アルカリプロテアーゼに比べ高い比活性を有していた。
【００３３】実施例４
実施例２で得られた精製した各変異プロテアーゼを３％
の過酸化水素水を含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５）２ｍＬ中に５０μＬずつ添加し、３０℃で
３０分間放置した。余剰の過酸化水素を除くため充分量
のカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を加えた
後、残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した。
各変異プロテアーゼの過酸化水素水処理後の残存活性を
処理前の活性を１００％として相対値で図２に示した。
本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテ
アーゼに比較しより高い酸化剤耐性を有していた。
の過酸化水素水を含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５）２ｍＬ中に５０μＬずつ添加し、３０℃で
３０分間放置した。余剰の過酸化水素を除くため充分量
のカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を加えた
後、残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した。
各変異プロテアーゼの過酸化水素水処理後の残存活性を
処理前の活性を１００％として相対値で図２に示した。
本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテ
アーゼに比較しより高い酸化剤耐性を有していた。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、反応効率が高く（高比
活性）、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテ
アーゼを提供できる。
活性）、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテ
アーゼを提供できる。
【００３５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KAO CORPORATION
<120> Alkaline protease
<130> P04691310
<160> 11
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 434
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 1
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly
65 70 75 80
Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
85 90 95
Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
115 120 125
Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130 135 140
Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala
145 150 155 160
Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
165 170 175
Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
180 185 190
Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
195 200 205
Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210 215 220
Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe
225 230 235 240
Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
245 250 255
Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
260 265 270
Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
275 280 285
Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290 295 300
Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr
305 310 315 320
Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
325 330 335
Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
340 345 350
Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
355 360 365
Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
370 375 380
Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu
385 390 395 400
Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
405 410 415
Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
420 425 430
Val Asn
<210> 2
<211> 434
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 2
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly
65 70 75 80
Ala Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
85 90 95
Ile Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
115 120 125
Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130 135 140
Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala
145 150 155 160
Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
165 170 175
Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
180 185 190
Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
195 200 205
Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210 215 220
Thr Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe
225 230 235 240
Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
245 250 255
Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
260 265 270
Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
275 280 285
Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290 295 300
Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr
305 310 315 320
Val Asn Glu Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr
325 330 335
Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
340 345 350
Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
355 360 365
Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp
370 375 380
Phe Ser Ala Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu
385 390 395 400
Asn Val Phe Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
405 410 415
Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile
420 425 430
Val Asn
<210> 3
<211> 433
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 3
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile
85 90 95
Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr
100 105 110
Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser
115 120 125
Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val
130 135 140
Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly
145 150 155 160
Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys
165 170 175
Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly
180 185 190
Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly
195 200 205
Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr
210 215 220
Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp
225 230 235 240
Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala
245 250 255
Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile
260 265 270
Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu
275 280 285
Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln
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Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val
305 310 315 320
Asn Glu Ala Thr Ala Leu Thr Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe
325 330 335
Gln Thr Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp
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355 360 365
Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe
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Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn
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His
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<211> 433
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<213> Bacillus sp.
<400> 4
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala
245 250 255
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275 280 285
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Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asn Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val
305 310 315 320
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Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln
405 410 415
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420 425 430
His
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<211> 433
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 5
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115 120 125
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275 280 285
Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln
290 295 300
Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val
305 310 315 320
Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe
325 330 335
Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp
340 345 350
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355 360 365
Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe
370 375 380
Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn
385 390 395 400
Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln
405 410 415
Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val
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His
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<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 6
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Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Val Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
165 170 175
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180 185 190
Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ile Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
275 280 285
Leu Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asn
290 295 300
Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe
305 310 315 320
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325 330 335
Phe Thr Ala Gln Ser Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
340 345 350
Asp Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
355 360 365
Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Gln Ala Tyr Asn Val Pro Gln Gly Pro Gln Ala Phe Ser Leu Ala Ile
420 425 430
Val Asn
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<211> 433
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 7
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val
130 135 140
Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly
145 150 155 160
Asn Glu Gly Pro Gly Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys
165 170 175
Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly
180 185 190
Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly
195 200 205
Pro Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr
210 215 220
Tyr Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp
225 230 235 240
Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala
245 250 255
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260 265 270
Lys Asn Arg Gly Val Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu
275 280 285
Ile Ala Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Phe Pro Asn Gly Asn Gln
290 295 300
Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Phe Val
305 310 315 320
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Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe
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405 410 415
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ctattaattc acaattgcca acgag 25
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<212> DNA
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aaatatgcat acxxxggtgg aacgtc 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggaacgtccx xxgctacacc gatc 24
【図１】各変異アルカリプロテアーゼの相対比活性を示
す図である。
す図である。
【図２】各変異アルカリプロテアーゼの酸化剤処理後の
相対残存活性を示す図である。
相対残存活性を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 佐藤 剛
栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会
社研究所内
(72)発明者 瀧村 靖
栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会
社研究所内
(72)発明者 佐伯 勝久
栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会
社研究所内
(72)発明者 小林 徹
栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会
社研究所内
(72)発明者 川合 修次
栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会
社研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA02 DA07 HA01
4B050 CC03 DD02 FF04 FF11 FF12
LL04
4B065 AA15Y AA19X AB01 BA01
CA33 CA57
4H003 DA01 EC02 FA15 FA47
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２
５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又
は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、 （ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたアルカ
リプロテアーゼ。 - 【請求項２】 配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれ
と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアル
カリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）２５１
位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸
残基が欠失又は下記アミノ酸残基； （ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アス
パラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイ
シン、グルタミン残基、 （ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルア
ラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イ
ソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、ト
リプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチ
ジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたアルカ
リプロテアーゼ。 - 【請求項３】 配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％
以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロ
テアーゼが、配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列
を有する請求項２記載のアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項４】 請求項１〜３記載のアルカリプロテアー
ゼをコードする遺伝子。 - 【請求項５】 請求項４記載の遺伝子を含有する組換え
ベクター。 - 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターを含有す
る形質転換体。 - 【請求項７】 宿主が微生物である請求項６記載の形質
転換体。
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