JP2002542813A

JP2002542813A - 組換哺乳動物細胞におけるヘパリン結合性タンパク質の発現

Info

Publication number: JP2002542813A
Application number: JP2000615655A
Authority: JP
Inventors: ヤコブフロットガールト，ハンス; バートラスムッセン，ポウル; ビエルン，セーレン; スベントセン，イバン
Original assignee: レウコテクアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-12-17
Also published as: NO20015181L; HK1046005A1; NZ515762A; AU4286100A; IL146128A0; CN1357007A; KR20020034073A; CA2407714A1; NO20015181D0; WO2000066627A1; EA200101093A1; EP1179017A1; PL351499A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞において哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質を生産するための方法であって、当該哺乳動物細胞はそれに当該ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸が導入された後に嫌気性条件下で培養できるものであり、（ａ）前記哺乳動物細胞に前記ヘパリン結合性タンパク質（ＨＢＰ）をコードする核酸を導入し；（ｂ）工程（ａ）の細胞を前記ＨＢＰの発現を誘導する条件下で培養し；そして（ｃ）前記ＨＢＰを当該培養培地から回収することを含んで成る方法に関連する。本発明は更にこの方法に用いる組換哺乳動物細胞に関連する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は組換哺乳動物細胞においてヘパリン結合性タンパク質ＨＢＰを生産す
る方法に関連し、ここで当該細胞は当該ヘパリン結合性タンパク質をコードする
核酸で形質転換された後に嫌気性条件下で培養されることができるものである。
本発明は更に当該組換哺乳動物細胞に関連する。

【０００２】発明の背景ヒト及びブタ由来の末梢好中性白血球から単離された２種類の近縁タンパク質
の共有結合構造が最近決定されている（H.Flodgaard ら、1991, Eur.J.Biochem.
197: 535-547; J.Pohl ら、1990, FEBS Lett. 272: 200 以降を参照のこと）。
両方のタンパク質は好中球エラスターゼに対して高度な同一性を示すが、活性な
セリン１９５及びヒスチジン５７（キモトリプシン番号付け（B.S.Hartleg, 197
0, Phil.Trans.Roy.Soc.Series 257: 77以降））の選択的突然変異を理由に、こ
れらのタンパク質はプロテアーゼ活性を欠いている。これらのタンパク質はヘパ
リンに対するその高度な親和力を理由にそれぞれヒトヘパリン結合性タンパク質
（ｈＨＢＰ）又はブタヘパリン結合性タンパク質（ｐＨＢＰ）と呼ばれている。
Schafereら（W.M.Schafer ら、1986, Infect.Immun. 53: 651 以降）はその抗微
生物活性を理由にこのタンパク質をカチオン性抗微生物タンパク質（ＣＡＰ３７
）と命名している。このタンパク質は単球／マクロファージ機能、例えば化学走
性、生存率の向上及び分化を調節することが見い出されている（Pereira, 1995, J.Leuk.Biol. 57: 805-812 、更には米国特許第５，４５８，８７４及び５，４
８４，８８５号も参照のこと）。しかしながら、それが微生物による単球又はマ
クロファージの感染を阻害するかどうかについての開示はない。

【０００３】更に、ＨＢＰは単球培養物中で増殖している内皮細胞及び線維芽細胞に加えた
ときにかかる細胞の脱離及び収縮を媒介することが示されている。ＨＢＰは単球
の生存及びトロンボスポンジン分泌も刺激する（E.Ostergaard and H.Flodgaard
, 1992, J.Leuokocyte Biol.51: 316 以降）。

【０００４】ｈＨＢＰ及びＣＡＰ３７のものと同一の最初の２０個のＮ末端アミノ酸残基を
有するタンパク質、いわゆるアズロシジンもアズール好性顆粒から単離されてお
り（J.E.Gabay ら、1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 5610以降；C.G.Wilde
ら、1990, J.Biol.Chem. 265: 2038以降）、そしてその抗微生物特性が報告され
ている（D.Campanelliら、1990, J.Clin.Invest. 85: 904以降）。

【０００５】好中性白血球中のｈＨＢＰの存在及び白血球がスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）を食作用したときにＣＡＰ３７（これはｈＨＢ
Ｐと同じ）の８９％が放出されるという事実（H.A.Pereira ら、前掲）は、ｈＨ
ＢＰの機能が炎症過程に関与しうることを示唆し、なぜならこのタンパク質は活
性化好中球から放出されることが明らかであるからである。Pereira ら、前掲は
、ＣＡＰ３７の機能は、単球を特異的に引きつけることのできる炎症部位にあり
、従って炎症の第二波における単球の流入を司る因子の一つであることを示唆し
ている。Ostergaard and Flodgaard、前掲は、単球の補給のために重要であるこ
とに加えて、ＨＢＰは好中球及び単球の管外遊出のメカニズムにおいて重要な役
割を果たしていることがあると示唆している。

【０００６】ＨＢＰの構造は米国特許第５，８１４，６０２号及びH. Flodgaardら、前掲に
示されている。ＨＢＰは他にＣＡＰ３７（ＷＯ９１／００９０７、米国特許第５
，４５８，８７４号及び第５，４８４，８８５号参照）及びアズロシジン（C.G.
Wilde ら、J.Biol.Chem. 265, 1990, p.2038参照）とも呼ばれている。

【０００７】ＨＢＰは今まで好中性白血球から単離されている（Flodgaard ら、1991, Eur.
J.Biochem. 197: 535-547 ）。しかしながら、その収率は極めて低い。更に、Ｈ
ＢＰは昆虫細胞において組換ＤＮＡ法を介して生産されている（Rasmussen ら、
1996, FEBS Lett. 390: 109-112 ）。

【０００８】組換ＨＢＰ（参照文献の中ではＣＡＰ３７と称されている）はヒト腎２９３細
胞系においても産生されている（R.Alberdi ら、1997, FASEB J 11: 1915）。Ｒ
ＳＶ−Ｐ１４発現ベクターが使用されている。このベクターは分泌のためのトラ
ンスフェリンシグナルペプチド、免疫親和精製のためのＨＰＣ４エピトープ、Ｘ
ａ因子切断部位及びＧ４１８選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含む。機能
的なヘパリン結合性タンパク質はウシＸａ因子を用いてＸａ因子切断部位にて組
換タンパク質をｉｎｖｉｔｒｏで切断し、組換ヘパリン結合性タンパク質から
融合ペプチドを分離させることだけによって生産できる。

【０００９】また、組換ＨＢＰは網状赤血球血液白血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｂｌ
ｏｏｄｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：ＲＢＬｓ）において生産されている（ＰＣＴ／
ＤＫ９８／００２７５）。しかしながら、様々な度合いにグリコシル化されたＨ
ＢＰの不均質な集団が得られている。

【００１０】ヘパリン結合性タンパク質を高収率で、簡単に、しかも効率的な方法で生産す
ることは有利であろう。従って、本発明の目的は成熟ヘパリン結合性タンパク質
を高収率で、簡単に、しかも効率的な方法で得ることにある。

【００１１】発明の概要本発明は哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質を生産するための方法であって、
このヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸の導入された後に嫌気性条件下
で培養できる細胞において行われ、この方法は（ａ）哺乳動物宿主細胞であって
その中に前記ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸が導入された後に嫌気
性条件下で培養できるといった宿主細胞の中に当該核酸を導入し；（ｂ）工程（
ａ）の細胞を前記ＨＢＰの発現を誘導する条件下で培養し、そして（ｃ）その培
養培地から当該ＨＢＰを回収する；ことを含んで成る。特定の態様において、工
程（ｂ）の細胞はブラジキニンＢ−２レセプターアンタゴニストの存在下で培養
する。

【００１２】「ヘパリン結合性タンパク質」（ＨＢＰ）とは（ｉ）タンパク質分解活性が不
活性であり；（ii）多形核白血球のアズール好性顆粒の中で貯蔵され；そして（
iii ）単球に対して化学親和性物質であり、また任意的に約２７〜３１kDの分子
量を形成するようにグリコシル化されているタンパク質を意味する。

【００１３】別の態様において、本発明は前記哺乳動物ＨＢＰを生産するための方法に関連
し、この方法は（ａ）前記ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸を哺乳動
物宿主細胞に導入し、この宿主細胞は当該核酸をその中に導入された後に嫌気性
条件下で培養できるものであり；（ｂ）前記ヘパリン結合性タンパク質をコード
する核酸を含んで成る工程（ａ）の宿主細胞を選別し；（ｃ）無血清、且つ任意
的にタンパク質非含有培地の中で当該宿主細胞を培養し；そして（ｄ）当該ヘパ
リン結合性タンパク質を単離する；ことを含んで成る。この方法は前記ＨＢＰの
精製を更に含んで成りうる。

【００１４】本発明は更に哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸を導入した
後に嫌気性条件下で培養できる組換哺乳動物宿主細胞に関連し、ここでかかる細
胞はヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る。

【００１５】発明の詳細な説明ヘパリン結合性タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３（ＳＥＱＩＤＮＯ
：１に示す成熟ヒトＨＢＰをコードする）、ＳＥＱＩＤＮＯ：５（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：６に示すシグナル配列及び成熟タンパク質の配列を含むヒトＨＢＰ
をコードする）、ＳＥＱＩＤＮＯ：７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示すシグ
ナル配列、プロ配列及び成熟タンパク質の配列を含むヒトＨＢＰをコードする）
、又はＳＥＱＩＤＮＯ：４（ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すブタＨＢＰをコ
ードする）、ＳＥＱＩＤＮＯ：９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示すシグナ
ル配列及び成熟タンパク質の配列を含むブタＨＢＰをコードする）、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２を示すシグナル配列、プロ配列及び
成熟タンパク質の配列を含むＨＢＰをコードする）に記載の核酸配列と少なくと
も約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくと
も約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９７％の、アガロースゲル電気
泳動による決定に従う同一性を有する核酸配列によりコードされうる。この核酸
配列はゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合成起源、又は任意のそれらの組合
せであってよい。

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【００１６】二本の核酸配列間の同一性の度合いは当業界公知のコンピュータープログラム
、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Needleman and Wunsch, 1970, Journal
of Molecular Biology 48: 443-453）に供されているＧＡＰにより決定されうる
。本発明の２本の核酸配列間の同一性の度合いを決定する目的で、ＧＡＰは次の
設定値で利用する：５．０のＧＡＰ構築ペナルティー及び０．３のＧＡＰ伸長ペ
ナルティー。

【００１７】ＨＢＰをコードする核酸配列の修飾はＨＢＰと実質的に類似するポリペプチド
配列の合成のために必要でありうる。ＨＢＰに対して「実質的に類似する」とは
、ＨＢＰの非天然形態を言及している。このようなポリペプチド配列はその天然
起源から単離されたＨＢＰから多少操作された態様で相違しうる。例えば、部位
突然変異誘発を利用して比活性、熱安定性、至適pH等において相違するＨＢＰの
変異体を合成することが注目されうることがある。類似配列はＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１又は２のＨＢＰコード部、例えばそのサブ配列として示されている核酸配
列を基準に構築するか、及び／又は当該核酸配列によりコードされるＨＢＰの別
のアミノ酸配列を供することはないが、酵素の生産を目的とする宿主生物のコド
ン用法に対応するといったヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸
配列を供しうるヌクレオチド置換の導入により、構築してよい。ヌクレオチド置
換の一般的に説明については、例えばFordら、1991, Protein Expression and P
urification 2: 95-107 を参照のこと。

【００１８】かかる置換は分子の機能にとって本質的な領域の外にあり、そして活性ポリペ
プチド配列をもたらし続けるところで施されうることが当業者に明らかであろう
。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性にとって
本質的であり、それ故置換に委ねられないことが好ましいアミノ酸残基は当業界
において公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異
誘発により同定されうる（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244:
1081〜1085 参照のこと）。後者の技術においては、突然変異は分子の全ての残
基に導入され、そして得られる突然変異分子を分子の活性にとって本質的なアミ
ノ酸残基の同定のためにＨＢＰ活性について試験する。

【００１９】ヘパリン結合性タンパク質はＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，７，９又は１
１に記載の核酸配列に低乃至高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする
核酸配列によってもコードされうる。低乃至高ストリンジェンシー条件は、５×
のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／mlの剪断且つ変性させたサケ精子
ＤＮＡ、並びに低、中及び高ストリンジェンシーそれぞれについて２５，３５又
は５０％のホルムアルデヒド中で４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーションとして規定される。その担体材料は２×ＳＳＣ、０．２％
のＳＤＳを用い好ましくは少なくとも５０℃で（超低ストリンジェンシー）、よ
り好ましくは少なくとも５５℃で（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少
なくとも６０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６５℃（
中−高ストリンジェンシー）、更により好ましくは少なくとも７０℃（高ストリ
ンジェンシー）、そして最も好ましくは少なくとも７５℃（超高ストリンジェン
シー）を利用し、３回、３０分づつ洗浄する。

【００２０】ＨＢＰの調製ＨＢＰをコードする核酸配列は確立された標準的方法、例えばS.L.Beaucage a
nd M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.1859-1869により発表の
ホスホラミジット法、又はMatthes ら、EMBO Journal 3, 1984, pp 801-805によ
り発表の方法によって合成的に調製できうる。ホスホラミジット法に従えば、オ
リゴヌクレオチドは例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、精製され、ア
ニーリングされ、ライゲーションされ、そして適当なベクターにクローニングさ
れる。

【００２１】本発明の方法において利用されるヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸
配列を単離又はクローニングするために用いる技術は当業界において公知であり
、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組合せが
挙げられる。かかるゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例
えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造的特徴を有するクロ
ーニングされたＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体ス
クリーニングを利用して行うことができる。例えば、Innis ら、1990, A Guide
to Methods and Application, Academic Press, New York参照のこと。その他の
核酸増幅手順、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション化活性化転
写（ＬＡＴ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が利用されうる。

【００２２】次にこの核酸配列を組換発現ベクターに挿入する。このベクターは組換ＤＮＡ
手順に簡単にかけることのできうる任意のベクターであってよい。ベクターの選
定はそれを導入すべき宿主細胞に依存するであろう。従って、このベクターは自
己複製ベクター、即ち、染色体外質としての存在し、その複製が染色体の複製と
独立したベクター、例えばプラスミドであってよい。他方、このベクターは宿主
細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムの中に組込まれ、そしてその組込まれ
た染色体と一緒に複製するものであってよい。

【００２３】ベクターにおいて、ＨＢＰをコードする核酸配列は適当なプロモーター配列に
作用可能式に連結されているべきである。プロモーターは選定の宿主細胞の中で
転写活性を示す任意の核酸配列であって、そして宿主細胞にとって同種又は異種
のいずれでもよいタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。哺乳動物細胞に
おいてＨＢＰをコードする核酸配列の転写を指令するのに適当なプロモーターの
例はＳＶ４０プロモーター（Subramani ら、Mol.Cell Biol. 1, 1981, pp.854-8
64）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子プロモーター（Palmiterら、Science
222, 1983, pp.809-814 ））又はアデノウィルス２主要後期プロモーター、ラウ
ス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター
（Boshart ら、1981, Cell 41: 521-530）及びウシパピロマウィルスプロモータ
ー（ＢＰＶ）である。昆虫細胞において利用するのに適当なプロモーターはポリ
ヘドリンプロモーターである（Vasuvedan ら、FEBS Lett. 311, 1992, pp.7-11
）。

【００２４】ＨＢＰをコードする核酸配列は適当なターミネーター、例えばヒト成長ホルモ
ンターミネーター（Palmiterら、前掲）に作用可能式に連結されていてもよい。

【００２５】このベクターは更にポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０又はアデノウ
ィルス５Ｅｌｂ領域由来）、転写エンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハン
サー）及び翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウィルスＶＡＲＮＡをコー
ドするもの）の如き要素を更に含んで成ってよい。

【００２６】この組換発現ベクターは更に注目の宿主細胞内でのベクターの複製を可能にす
るＤＮＡ配列を含んで成ってよい。かかる配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞の
とき）はＳＶ４０又はポリオーマ複製起点である。

【００２７】このベクターは更に選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補う
遺伝子、例えばジヒドロホレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子
、又はネオマイシン、ジェネシチン、アンピシリンもしくはヒグロマイシン等の
薬剤に対する耐性を授けるものを含んで成ってよい。

【００２８】特定の態様において、本発明はＨＢＰを生産するための方法であって、ここで
Ｎ末端伸長部の先行する成熟ＨＢＰをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞をＨ
ＢＰの発現を可能にする条件下で適当な培養培地の中で培養し、そして得られる
ＨＢＰをＮ末端で伸長したＨＢＰとして培養培地から回収する方法に関連する。

【００２９】Ｎ末端伸長部は約５〜約２５個のアミノ酸残基、特に約８〜約１５個のアミノ
酸残基の配列であってよい。Ｎ末端配列内のアミノ酸残基の種類は本質ではない
ものと信じられる。Ｎ末端伸長部は適切にはアミノ酸配列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-
Asp （ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）を有するＨＢＰのプロペプチド又はプレプロ
ペプチドMet-Thr-Arg-Leu-Thr-Val-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ala-Ser-
Ser-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp （ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）であ
ってよい。

【００３０】成熟ＨＢＰの生産を助長するため、Ｎ末端で伸長したＨＢＰをコードするＤＮ
Ａ配列はＮ末端伸長部をコードするＤＮＡ配列と成熟ＨＢＰをコードするＤＮＡ
配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ配列を含むのが
一般に好ましい。適当なプロテアーゼ切断部位の例は当該アミノ酸配列を有する
エンテロキナーゼ切断部位又はＸａ因子切断部位である。

【００３１】他方、シグナル配列及び成熟ＨＢＰをコードする核酸配列を上記の手順を利用
してベクターに挿入してよい。その結果、ＨＢＰは培養培地から単離されうる。

【００３２】ＨＢＰ又はＮ末端で伸長したＨＢＰのそれぞれをコードする核酸配列をライゲ
ーションするのに利用する手順、及びそれらを複製のために必要な情報を含む適
当なベクターに挿入する手順は当業者に周知である（例えば、Sambrook前掲を参
照のこと）。

【００３３】哺乳動物細胞は哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸で形質転
換された後に嫌気性条件下で培養できる細胞である。より好適な態様では、哺乳
動物細胞はアデノウィルス形質転換細胞であるか、又は胎芽細胞に由来するもの
である。本明細書において規定する通り、胎芽細胞に由来する細胞は胎芽細胞の
一次培養物から獲得された細胞、又は胎芽細胞の一次培養物からもともと継代さ
れた細胞系に由来する細胞である。かかるアデノウィルス形質転換細胞又は胎芽
誘導細胞の例はヒト胎芽腎（ＨＥＫ）細胞、特にＨＥＫ２９３細胞である。

【００３４】哺乳動物細胞をトランスフェクションさせ、そしてその細胞に導入されたＤＮ
Ａ配列を発現させる方法は、例えばKaufman and Sharp, 1982, J.Mol.Biol. 159
: 601-621; Southern and Berg. 1982, J.Mol.Appl.Genet. 1: 327-341; Loyter
ら 1982, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79: 422-426; Wiglerら 1978, Cell 14: 72
5; Corsaro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7: 603, Graham and v
an der Eb, 1973, Virology 52: 456; Fraleyら 1980, JBC 225: 10431; Capecc
hi, 1980. Cell 22: 479; Wibergら 1983, NAR 11: 7287; 及びNeumannら 1982,
EMBO J. 1: 841-845 に記載されている。昆虫細胞は適切には米国特許第４，７
４５，０５１号に記載の通りバキュロウィルスベクターでトランスフェクション
されうる。

【００３５】細胞を培養するために用いる培地は哺乳動物細胞を増殖するために適当な任意
の慣用の培地、例えば血清含有又は無血清の、適当な補助剤を含む培地、又は昆
虫細胞を増殖するために適当な培地であってよい。適当な培地は商業的供給者か
ら入手するか、又は公開された処方に従って調製することができる（例えば、Am
erican Type Culture Collectionのカタログ）。次にこの細胞を抗生物質耐性に
ついてスクリーニングする。次に、選定したクローンを当業界公知のアッセイ、
例えば化学走性アッセイ及び単球からのサイトカイン放出を検定するアッセイを
利用してＨＢＰ活性についてアッセイする（例えば、米国特許第５，８１４，６
０２号参照のこと）。

【００３６】選定したクローンは無血清、且つ任意的にタンパク質非含有培地の中で更に培
養してよい。更に、それはブラジキニンＢ−２レセプターアンタゴニストの存在
下で培養してよい。その例には限定することなく、抗−ブラジキニンＢ−２レセ
プター抗体（例えば、Haasemanら、1991, J.Immunol. 147: 3882-3992 ）又はブ
ラジキニンレセプターの遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチド配列が挙
げられる。

【００３７】これらの細胞により産生されるＨＢＰは慣用の手順、例えば宿主細胞を遠心分
離もしくは濾過により培地から分離させ、上清液又は濾液のタンパク質性成分を
例えば硫酸アンモニウムの如き塩により沈殿させ、様々なクロマトグラフィー手
順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等により精製することにより、培養培地から回収してよい。特定の態様において
、このＮ末端で伸長したＨＢＰはアガロース結合型アプロチニンカラムでのクロ
マトグラフィーにより精製する。

【００３８】ＨＢＰがＮ末端で伸長したＨＢＰなら、培養培地からの回収後、このＮ末端で
伸長したＨＢＰを好都合には適当なプロテアーゼで切断して成熟（且つ活性）Ｈ
ＢＰを得る。適当な酵素の例には、限定することなく、エンテロキナーゼ及びＸ
ａ因子が挙げられる。

【００３９】実施例実施例１：昆虫細胞におけるプロ−ＨＢＰの発現ｐＳＸ５５６を構築するのに用いた手順はRasmussen ら、1996, FEBS Lett. 3
90: 109-112 に記載されている。以下のプライマーを作る：

【化１３】

【化１４】

【００４０】ＭＨＪ２０８７はＢａｍＨＩ部位、開始コドン及びヒトｃＤＮＡのプレプロ
部（Morgan, J.G.ら、1991, J.Immun., 147: 3210-3214）、それに続く当該遺伝
子の成熟部から始まる最初の２０ヌクレオチドをコードする。

【００４１】ＭＨＪ２０８９はＨＢＰ遺伝子のコード部由来の最後の８コドンと上記のｃ
ＤＮＡ配列に係る２つの追加のコドンに対して相補性である。それはＨｉｎｄII
I 部位で終結する。

【００４２】ＰＣＲを下記のスキームに従い、２つのプライマーを用いて実施する。３サイクル９５℃で６０秒、５０℃で１２０秒、７２℃で１２０秒１２サイクル９５℃で３０秒、６５℃で６０秒、７２℃で９０秒

【００４３】７６０bpフラグメントのＰＣＲ生成物を１％のアガロースゲル上での電気泳動
により単離し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、そしてこれら２種類の酵
素で切断したｐＳＸ２２１に挿入する（ｐＳＸ２２１はｐＵＣ１９（Yannisch-P
erron, C.ら、1985, Gene 33: 103-119）の誘導体である）。クローニングした
ＤＮＡを配列決定により確認し、そしてＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
を切り出し、単離し、そして昆虫細胞における発現のためにｐＢｌｕｅＢａｃII
I（Invitrogen Corporation ）に挿入する。このフラグメントは１９残基のシグ
ナルペプチド、７アミノ酸残基のプロ−ペプチド、２２２個のアミノ酸の成熟部
及び３個のアミノ酸のＣ未伸長部を含むＨＢＰ全コード領域を含む。得られるプ
ラスミドをｐＳＸ５５６と称する。

【００４４】ＨＢＰを発現する組換バキュロウィルスを構築するため、Invitrogen Corp. (
San Diego, CA ）由来のＭＡＸＢＡＣキットを使用し、そして全ての操作はその
中に含まれているバキュロウィルス発現システムマニュアル（Ｂｏｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＭａｎｕａｌ）（バージョン１
．５．５）に従って行う。簡単には、１μｇの線形ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ及び３
μｇのｐＳＸ５５６をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｒｕｇｉｐｅｄｒａ）（ＳＦ９）昆虫細胞に同時トランスフェクションさせる（
６０mmの皿で２×１０⁶ 細胞）。７日後に得られる培養上清液を集める。１００
mmのプレート中の新鮮なＳＦ９細胞単層をウィルス上清液で様々な希釈率で感染
させ、次いで１５０μｇ／mlのＸ−ｇａｌを有する完全ＴＮＭ−ＦＨ培地を含む
１．５％のアガロースをその上に重ねる。８日後、６つの推定組換プラークをそ
の青色の襟により同定し、そしてＳＦ９細胞を含む６ウェルプレートに感染させ
るのに用いる。５日後、対応のウィルスＤＮＡを精製し、そしてウィルスＤＮＡ
中の組換部位に隣接するフォワード及びリバースプライマーによるＰＣＲ反応に
かける。アガロースゲル上でのＰＣＲ生成物の評価の後、対応の最も純粋な組換
ウィルスを更なるプラーク精製ラウンドにかけ、最終組換ウィルスストックが野
生ウィルスを含まないことを確実にする。組換ＨＢＰの生産は無血清ＳＦ９００
−II培地（Gibco BRL／Life-Technologies）内での増殖に適合させた昆虫細胞（
ＳＦ９及びＳＦ２１）で実施する。典型的には、５ｌのスピンナー培養器又は１
０ｌの発酵槽（共に１×１０⁸ ／mlの細胞密度）を１のＭＯＩで感染させ、そし
てその培地を感染の３日後に回収する。ＨＢＰの精製は米国特許第５，８１４，
６０２号に記載の通りに実施する。

【００４５】組換バキュロウィルスで感染された昆虫細胞から得られるＨＢＰをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで試験する。このＨＢＰはヒト血液から精製した天然ＨＢＰより若干大き
い分子量を有していた。Ｎ末端配列を決定すると、生成された物質の１００％近
くが成熟部の前に７個のアミノ酸のプロペプチドを含むことが明らかとなり、昆
虫細胞が骨髄中のヒト骨髄性好中性前駆細胞と同じようにプロ型（プロ−ＨＢＰ
）をプロセシングできないことを示唆している。

【００４６】実施例２：昆虫細胞におけるΔｐｒｏ−ＨＢＰの発現オリゴヌクレオチドリンカー（下記参照）を作製する。それはＨＢＰ配列の最
初の９９bp（ＢａｍＨＩからＥａｇＩまで）をカバーし、この９９bpはシグナル
ペプチド及び成熟ＨＢＰの最初の４個のアミノ酸をカバーするが、プロ領域（７
３から８７まで）をカバーする部分は除かれ、そしてこれはｐＳＸ５５６中のも
とからあるＢａｍＨＩ−ＥａｇＩに代わり、ｐＳＸ５５９となる。

【００４７】そのリンカーは下記の二量体を供するようにアニーリング対合した４つのオリ
ゴヌクレオチドから成る：

【化１５】

【００４８】ＳＦ９細胞を組換バキュロウィルスでトランスフェクションし、そして発現し
たＨＢＰを実施例１に記載の通りにして精製する。Ｎ末端配列決定の後、９０％
がＩｌｅ¹ から適正にプロセシングされていることが確認された。残りの１０％
はＡｒｇ⁵ より更に下流でプロセシングされた。

【００４９】プロＨＢＰとＨＢＰとの発現を比較するため、経時的な実験を行う。最初の６
日間（５日目を除く）は毎日培養培地の後感染アリコートを取り出し、そしてＨ
ＢＰ特異的ＥＬＩＳＡで試験する。最大プロ−ＨＢＰ収率（４日目）の平均値（
ｎ＝３）を１００％に設定する。ＨＢＰはプロ型よりも２〜３分の１の量で発現
されることがわかる。プロ−ＨＢＰの最高収率は感染後４日目に得られ、一方Ｈ
ＢＰの収率は３〜４日目にてほぼそのままであり続けた。

【００５０】組換ＨＢＰのエレクトロスプレーマススペクトル（ＥＳＭＳ）分析は２７，２
３７±３の分子量を示した。２２５個のアミノ酸ＨＢＰ形態（成熟部と３個のア
ミノ酸のＣ末端伸長部）の計算値は２４，２６８．６である。ＨＢＰは３個の潜
在的なグリコシル化部位（Ａｓｎ¹⁰⁰，Ａｓｎ¹¹⁴及びＡｓｎ¹⁴⁵ ）を含む。これ
はグリカン部について２，９６８の質量に相当する。これは、２つのＭａｎ３［
Ｆｕｃ］ＧｌｃＮＡｃ２単位及び１つのＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２単位の理論値と
一致する。

【００５１】実施例３：ＨＥＫ２９３細胞におけるプロ−ＨＢＰの発現ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションさせる発現ベクターを構築するの
に以下の手順を利用する。まず、プラスミドｐＳＸ５５６を実施例１記載の手順
に従って構築する。

【００５２】ｐＳＸ５５６を以下のプライマー

【化１６】と、Ｐｆｕポリメラーゼとを利用する、製造者の仕様（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）に従うＰＣＲ反応の鋳型として用いる。ＰＣＲ反応生成物のＢａｍＨＩ切断の
後、フラグメントを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）に適正な配向でライゲーションし、ＢａｍＨＩで線形にし、ｐｃＤＮＡ３−Ｈ
ＢＰを得る。

【００５３】ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションに以下の手順を利用する。トラン
スフェクションの前日に５×１０⁵ のＨＥＫ２９３細胞を１０cmの皿の中で１
０mlのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン中に播種す
る。２０ｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＢＰを改良リン酸カルシウム法（Chen and Okaya
ma, 1987, Molecular and Cellular Biology 7: 2745-2752 ）によりＨＥＫ２
９３細胞にトランスフェクションする。トランスフェクション体を６００ｇ／ml
のジェネチシン（Life Technologies ）で選択する。集密となったら、一次トラ
ンスフェクションプールを特異的ＨＢＰサンドイッチＥＬＩＳＡを利用してＨＢ
Ｐの発現の陽性について試験する。トランスフェクションされた細胞の形態は非
トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞と似ている。トランスフェクションプ
ールを限界希釈手順によりサブクローニングし、そして最良のクローン（１／Ｅ
−１１）はＴ−２５フラスコスケールで１１．５ｇのＨＢＰ/ml/日を産生できる
。詳しくは、３００個の細胞を５枚の９６穴プレートに播種し、そして１個の細
胞に由来する細胞クローン（サブクローン）を発現について試験する。

【００５４】生成されたＨＢＰ物質を特性決定するため、クローン１／Ｅ−１１を無血清培
地の単層培養物の中で６日間、毎日培地を交換しながら増殖させる。ＨＢＰ上清
濃縮はＨＰＬＣ由来の積分面積による測定に従い８mg／ｌであった（バキュロウ
ィルスＨＢＰを標準品として用いて）。アガロース結合アプロニチンを精製のた
めに用い、そして１ＭのＮａＣｌで溶出させる。この単一段階精製はＨＰＬＣ分
析による判定に従い、９９％の純度のサンプルを供する。Ｎ末端配列を決定する
と、生成物質の１００％近くが成熟部の前の７個のアミノ酸のプロ−ペプチドを
含むことが明らかとなり、これはＨＥＫ２９３細胞が骨髄内のヒト骨髄性好中
球前駆細胞と同じようにしてプロ型（プロ−ＨＢＰ）をプロセシングできないこ
とを示唆している。実施例１に記載の通り、ＨＢＰをバキュロウィルス／昆虫細
胞系で発現させたときと同じ観察を行う。ＭｒはＭＡＬＤＩにより３１，６９３
と決定され、従ってグルカン部は６，７５５の質量を有する。この質量を占めて
いる３つのＮ結合グリコシル化部位全てがジ−シアル化、ガラクトシル化バイア
ンテンナリー構造に対応しうると仮定すると、莫大な数のその他の可能性も当然
に考えられるが、いずれにせよＨＥＫ２９３細胞ＨＢＰは複雑なタイプの天然
Ｎ結合オリゴ糖をプロセシングすると思われる。

【００５５】実施例４：ＨＥＫ２９３細胞における成熟ＨＢＰの発現以下の手順をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする発現ベクターの
構築に用いる。まず、プラスミドｐＳＸ５５９を実施例２記載の手順を利用して
構築する。

【００５６】ｐＳＸ５９９をプライマー

【化１７】とＰｆｕポリメラーゼとを用いるその製造者の仕様（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
に従うＰＣＲ反応の鋳型として用いる。ＰＣＲ反応生成物のＢａｍＨＩ切断の後
、それらのフラグメントを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）に適正な配向でライゲーションし、ＢａｍＨＩで線形にし、ｐｃＤＮＡ３
−ＨＢＰΔｐｒｏが得られる。

【００５７】ｐｃＤＮＡ３−ＨＢＰΔｐｒｏをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション
し、そして集密なトランスフェクション−プールをＨＢＰ−ＥＬＩＡＳによりＨ
ＢＰ発現の陽性について試験する。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
に以下の手順を利用する。トランスフェクションの前日に５×１０⁵ のＨＥＫ
２９３細胞を１０cmの皿の中で１０mlのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ＋ペニシリン
／ストレプトマイシン中に播種する。２０ｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＢＰΔｐｒｏを
改良リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, 1987, Molecular and Cellular B
iology 7: 2745-2752 ）によりＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする
。トランスフェクション体を６００ｇ／mlのジェネチシン（Life Technologies
）で選択する。集密となったら、一次トランスフェクションプールを特異的ＨＢ
ＰサンドイッチＥＬＩＳＡを利用してＨＢＰの発現の陽性について試験する。ト
ランスフェクションされた細胞の形態は非トランスフェクションＨＥＫ２９３
細胞と似ている。トランスフェクションプールを限界希釈手順によりサブクロー
ニングする。詳しくは、３００個の細胞を５枚の９６穴プレートに播種し、そし
て１個の細胞に由来する細胞クローン（サブクローン）を発現について試験する
。この限界希釈手順により、最良のクローン３／Ｅ−４（３．２５ｇのＨＢＰ／
ml／日）が単離される。

【００５８】生成されたＨＢＰを特性決定するため、クローン３／Ｅ−４を無血清培地の中
で単層培養において、毎日培地を交換しながら増殖させる。この培地をＳａｒｔ
ｏｒｉｕｓフィルターを用いて濾過し、そして前述の通りにしてＣＭ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅファストフローカラムで精製する。０．２mgの純粋なＨＢＰが単離さ
れる。１０μｇを更にＮ末端配列決定及び質量検査のために小スケール調製ＨＰ
ＬＣにより精製する。精製ＨＢＰの９５％が右Ｎ末端配列（ＩＶＧＧＲＫＡＲＰ
ＲＱＦＰＦＬ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）を有し、残り５％はアミノ酸Ｎｏ．
５で開始する切頭体（ＲＫＡＲＰＲＱＦＰＦＬＡＳＩＱＮ；ＳＥＱＩＤＮＯ
：２４）を示し、このＮ末端切頭体は実施例１記載のバキュロウィルス／昆虫細
胞ＨＢＰの発見と一致する。ＭＡＬＤＩ（マトリックス補助レーザー脱離イオン
化）及びＥＳＭＳ（エレクトロスプレーマススペクトル）質量検査は共に３０，
５５０の平均質量（Ｍｗ）をもつ広いピークを示す。これは約６３００の質量の
グリカン部を示す。

【００５９】実施例５：ＨＥＫ２９３産生成熟ＨＢＰの生物活性ＨＥＫ２９３産生成熟ＨＢＰと昆虫細胞誘導成熟ＨＢＰとの生物活性を比較
するため、両方の組換体を単球／ＩＬ６アッセイで試験する：ヒト単球を正常血
液のバッフィーコートから単離する。２４穴プレートの中で、ウェル当り２×１
０⁵ 個の細胞を２mMのＧｌｕｔａｍａｘ、１％の非必須アミノ酸及び１mg／mlの
ＢＳＡを含む１mlのＤＭＥＭ培地に播種する。ＬＰＳ（Ｅ．コリ、Ｓｉｇｍａ由
来）及び組換ＨＢＰを表１に示す通りに加える。３７℃で２４ｈのインキュベー
ション後（５％のＣＯ₂ ）、細胞上清液を集め、遠心分離により浄化し、そして
ＩＬ−６含有量のアッセイに利用するまで−２０℃で保存する。ＩＬ−６の測定
はＢｉｏｔｒｅｋＥＬＩＳＡシステム（Amersham Pharmacia Biotech）を用い
て実施する。

【００６０】表１に示す通り、ＬＰＳ誘導ＩＬ−６放出は昆虫ＨＢＰの量の増大に伴い増大
する。しかしながら、２ｇのＨＥＫ２９３−ＨＢＰの存在だけでは、ＬＰＳ誘
導ＩＬ−６放出は１０ｇの昆虫ＨＢＰの存在下で認められるものとほぼ同じであ
る。このことは、ＨＥＫ２９３成熟ＨＢＰの比活性が昆虫誘導成熟ＨＢＰの比
活性より約５倍高いことを示す。この比活性の増大は、哺乳動物ＨＥＫ２９３
細胞により行われるより複雑なタイプのＮ結合グリコシル化パターンに基づくも
ののようである。

【００６１】

【表１】

【００６２】実施例６：ＨＢＰ産生ＨＥＫ２９３細胞系におけるグルコース消費及び乳酸産
生ＨＢＰを産生する安定なＨＥＫ２９３トランスフェクション体の代謝がＨＢ
Ｐ生成物自体によりどのような影響を受けるかを調べるため、３種類のＨＥＫ
２９３細胞系：１）ＨＥＫ２９３細胞系（コントロール）；２）１／Ｃ−６（
クローン：実施例３の１／Ｅ−１１と全く同じようにして作られ、プロ−ＨＢＰ
を産生する）；３）３／Ｅ−４（クローン：実施例４に記載され、成熟ＨＢＰを
産生する）のグルコース消費及び乳酸産生をＫＯＤＡＫＥＫＴＡＣＨＥＭＤ
Ｔ６０II装置を用いて測定する。２種類の培地を使用する：４５００mg／ｌの
グルコース（Life Technologies ）と１０％のＦＣＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改
良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）及びタンパク質非含有合成培地。

【００６３】結果を表IIに示す。

【表２】

【００６４】表IIに示す通り、グルコース消費及び乳酸産生は双方の培地の中でＨＢＰ産生
ＨＥＫ２９３細胞系において増大する。成熟ＨＢＰを産生する３／Ｅ−４細胞
系もＤＭＥＭ培地及びタンパク質非含有培地の中で４時間の培養後に最大のグル
コース消費及び乳酸産生を有した。１８時間後では、３／Ｅ−４タンパク質非含
有培地の乳酸濃度は乳酸の分解のため最小のものとなる。

【００６５】表IIに示す結果はＨＢＰが、ＨＢＰ産生ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリア
の周囲に集まると、場合によっては酸素依存性ミトコンドリアＡＴＰ生成を閉鎖
してしまうことを示唆する。その結果、ＡＴＰの生成は、ＨＥＫ２９３細胞が
胎芽を起源とすることを理由にＨＥＫ２９３細胞で行われることのできる嫌気
性グリコリシスによってのみ行われるようにシストされる。

【００６６】実施例７：ｐＤＣ３１２−ＨＢＰΔｐｒｏの構築以下の手順をｐＤＣ３１２−ＨＢＰΔｐｒｏの構築に利用する。まず、プラス
ミドｐＳＸ５５９を実施例２記載の手順を利用して構築する。ｐＳＸ５５９をプ
ライマー

【化１８】とＰｆＸポリメラーゼをその製造者の仕様（Life Technologies ）に従うＰＣ
Ｒ反応の鋳型として用いる。作製したＰＣＲフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＮｏｔＩで消化する。消化したフラグメントをゲル精製し、そしてＢａｍＨ
Ｉ及びＮｏｔＩで消化しておいた哺乳動物発現ベクターｐＤＣ３１２（Ｉｍｍｕ
ｎｅｘ）に適正な配向でライゲーションし、ｐＤＣ３１２−ＨＢＰΔｐｒｏが得
られる。

【００６７】ｐＤＣ３１２−ＨＢＰΔｐｒｏをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション
し、そして集密なトランスフェクション−プールをＨＢＰ−ＥＬＩＡＳによりＨ
ＢＰ発現の陽性について試験する。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
に以下の手順を利用する。トランスフェクションの前日に５×１０⁵ のＨＥＫ
２９３細胞を１０cmの皿の中で１０mlのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ＋ペニシリン
／ストレプトマイシン中に播種する。２０ｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＢＰΔｐｒｏを
改良リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, 1987, Molecular and Cellular B
iology 7: 2745-2752 ）によりＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする
。トランスフェクション体を０．２５Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）(Life Te
chnologies）で選択する。集密となったら、一次トランスフェクションプールを
特異的ＨＢＰサンドイッチＥＬＩＳＡを利用してＨＢＰの発現の陽性について試
験する。トランスフェクションされた細胞の形態は非トランスフェクションＨＥ
Ｋ２９３細胞と似ている。トランスフェクションプールを限界希釈手順により
サブクローニングする。詳しくは、３００個の細胞を５枚の９６穴プレートに播
種し、そして１個の細胞に由来する細胞クローン（サブクローン）を発現につい
て試験する。この限界希釈手順により、最良のクローン３／Ｅ−４（９．４ｇの
ＨＢＰ／ml／日）が単離される。

【００６８】生成されたＨＢＰを特性決定するため、クローン３／Ｅ−４を無血清培地の中
で単層培養において、毎日培地を交換しながら増殖させる。この培地をＳａｒｔ
ｏｒｉｕｓフィルターを用いて濾過し、そして前述の通りにしてＣＭ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅファストフローカラムで精製する。０．２mgの純粋なＨＢＰが単離さ
れる。１０μｇを更にＮ末端配列決定及び質量検査のために小スケール調製ＨＰ
ＬＣにより精製する。精製ＨＢＰの９５％が右Ｎ末端配列（ＩＶＧＧＲＫＡＲＰ
ＲＱＦＰＦＬ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）を有し、残り５％はアミノ酸Ｎｏ．
５で開始する切頭体（ＲＫＡＲＰＲＱＦＰＦＬＡＳＩＱＮ；ＳＥＱＩＤＮＯ
：２８）を示し、このＮ末端切頭体は実施例１記載のバキュロウィルス／昆虫細
胞ＨＢＰの発見と一致する。ＭＡＬＤＩ（マトリックス補助レーザー脱離イオン
化）及びＥＳＭＳ（エレクトロスプレーマススペクトル）質量検査は共に３０，
５５０の平均質量（Ｍｗ）をもつ広いピークを示す。これは約６３００の質量の
グリカン部を示す。

【００６９】実施例８：中空ファイバー細胞培養システム２９３細胞（４．０３７×１０² ）、ＨＢＰ２９３３／Ｂ−５＃／０を
スピンナーボトル（Techne, Cambridge, UK）で培養してから、自動細胞培養シ
ステム（AcuSyst Maximaizer, CELLEX Biosciences, Inc., Minneapolis, USA
）で中空ファイバーカートリッジ（２個のバイオリアクター、１０Kd mol wtカ
ットオフ、１．５ｍ² ）のエキストラ・キャピラリー（ＥＳ）空間の中に播種す
る。この細胞系は試験され、マイコプラズマを含まないことが認められた（GEN-
PROBE, Gen-Probe Incorporated, San Diego, USA ）。出発コントロールパラメ
ーターは次の通りである：温度＝３６．５℃；pH７．１０；ｐＯ₂ ＝１２０Hg／
mm。溶解された気体を含む３．５mMのグルタミン（Life Technologies, Paisley
, UK）の添加された２９３ＳＦＭ II培地（Life Technologies, Paisley, UK
）をファイバーの内部に２５０ml／min でポンピングし（循環ポンプ）、そして
膜を通ってＥＣ空間へと流す。媒質流速（媒質ポンプ）は５０ml／hrとし、そし
て１日培養後に１００ml／hrに上げ、２−２０：０８日（２日と２０時間８分）
後に２００ml／hrに上げ、３−１９：４０日（３日と１９時間４０分）後に２５
０ml／hrに上げ、４−２０：３９日後に３００ml／hr、８−２３：１５日後に４
００ml／hr、１９−１８：４１日後に４５０ml／hr、２２−０１：１６日後に５
００ml／hr、２４−１８：４６日後に５５０ml／hr、２４−１９：０６日後に６
００ml／hr、３０−２０：４３日後に６５０ml／hr、そして３３−０１：０３日
後に７００ml／hrに上げる。ＥＣチャンバーの連続回収及び供給を８−２２：５
９日後に２ml／hrで開始する。この実験は３４−２３：０１日後に終え、そして
全部で１５２９mlの回収物が集められる。

【００７０】ＨＥＫ２９３懸濁物からＨＢＰを精製するのに下記の手順を利用する。この
懸濁物を１ＭのＮａＯＨでpH８．５に調整し、そしてＧＦ／Ａフィルターで濾過
する。このカラム（ＳＰ１６／１０）は３０mMのＴｒｉｓ、pH８．５で平衡に
し、そして流速は４ml／min とする。適用物を載せ、そして平衡バッファーで洗
浄する。ＨＢＰをＮａＣｌ勾配で溶出させる。ＨＢＰは約０．９ＭのＮａＣｌで
溶出する。プールを集め、そしてＣ４分析カラムで定量する。その結果を表III
に示す。

【表３】

【００７１】全部で約４００mgが集まる。ＨＢＰの濃度は０．３〜０．４ｇ／ｌであった。
全てのバッチは調製精製及び分析ＨＰＬＣに基づくものと似ている。最初のバッ
チはＭＳ及び配列で更に分析する。その質量は３０．５kDとわかり、そして多少
のダイマーも見つかった。配列は期待のＨＢＰと相関した（１５回の実験）。Ｓ
ＤＳでは、３６kDで強いバンドがあり、１０〜２０kDで２本の弱いバンドも認め
られた。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ビエルン，セーレンデンマーク国，デーコー−2800 リングビー，マリエグベスアレー 47 (72)発明者スベントセン，イバンデンマーク国，デーコー−2765 スメールム，トゥリパンハーベン 76 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA03 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 CA10 CA12 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93X AA93Y AA95X AB01 BA02 BC50 CA24 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物細胞において哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質を
生産するための方法であって、ここで当該哺乳動物細胞はそれに当該ヘパリン結
合性タンパク質をコードする核酸が導入された後に嫌気性条件下で培養できるも
のであり、（ａ）前記哺乳動物細胞に前記ヘパリン結合性タンパク質（ＨＢＰ）をコード
する核酸を導入し；（ｂ）工程（ａ）の細胞を前記ＨＢＰの発現を誘導する条件下で培養し；そし
て（ｃ）前記ＨＢＰを当該培養培地から回収すること；を含んで成る方法。
【請求項２】前記哺乳動物ヘパリン結合性タンパク質がヒト又はブタＨＢ
Ｐである、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記培養培地から回収されたＨＢＰがＳＥＱＩＤＮＯ：
１もしくは２に記載のアミノ酸配列又はそのアレルもしくは天然変異体と少なく
とも８０％の同一性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，７，９もしくは１１に記
載の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列；（ii）その相補鎖；又は（iii)（
ａ）もしくは（ｂ）のサブ配列を前記哺乳動物細胞に導入する、請求項１記載の
方法。
【請求項５】前記培養培地から回収されたＨＢＰがＳＥＱＩＤＮＯ：
１又は２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，７，９又は１１に記載の
核酸配列を前記哺乳動物細胞に導入する、請求項１記載の方法。
【請求項７】前記核酸配列がシグナル配列の先行した成熟ＨＢＰをコード
する、請求項１記載の方法。
【請求項８】工程（ａ）の細胞がヘパリン結合性タンパク質プロ配列及び
成熟ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸配列を含んで成り、ここでこの
Ｎ末端で伸長したヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸配列はＮ末端伸長
部をコードする核酸配列と成熟ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸配列
との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列を含む、請求項１
記載の方法。
【請求項９】成熟ＨＢＰを獲得するために前記Ｎ末端で伸長したＨＢＰを
切断することを更に含んで成る、請求項７記載の方法。
【請求項１０】工程（ａ）の細胞がヘパリン結合性タンパク質シグナル配
列、ヘパリン結合性プロ配列、成熟ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸
配列、及びヘパリン結合性プロ配列をコードする核酸配列と成熟ヘパリン結合性
タンパク質をコードする核酸配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコー
ドする核酸配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項１１】成熟ＨＢＰを得るためにＮ末端で伸長したＨＢＰを切断す
ることを更に含んで成る、請求項９記載の方法。
【請求項１２】前記宿主細胞がアデノウィルス形質転換細胞である、請求
項１１記載の方法。
【請求項１３】前記宿主細胞が胎芽誘導細胞である、請求項１記載の方法
。
【請求項１４】前記宿主細胞がヒト胎芽腎細胞である、請求項１記載の方
法。
【請求項１５】前記宿主細胞がヒト胎芽腎２９３細胞である、請求項１記
載の方法。
【請求項１６】前記ヘパリン結合性タンパク質を精製することを更に含ん
で成る、請求項１記載の方法。
【請求項１７】哺乳動物ＨＢＰを生産するための方法であって、（ａ）哺
乳動物宿主細胞にヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸を導入し、ここで
当該宿主細胞はそれに前記核酸が導入された後に嫌気性条件下で培養できるもの
であり；（ｂ）前記ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸を含んで成る工
程（ａ）の哺乳動物宿主細胞を選別し；（ｃ）無血清、且つ任意的タンパク質非
含有培地の中で前記宿主細胞を培養し；そして（ｄ）前記ヘパリン結合性タンパ
ク質を単離する；ことを含んで成る方法。
【請求項１８】前記ヘパリン結合性タンパク質を精製することを更に含ん
で成る、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】組換哺乳動物宿主細胞であって、それに哺乳動物ヘパリン
結合性タンパク質をコードする核酸が導入された後に嫌気性条件下で培養でき、
当該ヘパリン結合性タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、宿主細胞。
【請求項２０】前記核酸配列がヒトヘパリン結合性タンパク質をコードす
る、請求項１８記載の組換哺乳動物宿主細胞。
【請求項２１】前記核酸配列がシグナル配列の先行する成熟ＨＢＰをコー
ドする、請求項１８記載の組換哺乳動物宿主細胞。
【請求項２２】前記組換宿主細胞がヒト胎芽腎２９３細胞である、請求項
１８記載の組換哺乳動物宿主細胞。