JP2002541796A - 酵素組成物及びその触媒としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 その内部で反応が起こり得るマトリックスを形成する材料を添加する酵素仲介反応方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は酵素組成物及びその触媒としての使用に関するものである。

【０００２】 (発明の背景) キラルな化学品の所望の鏡像異性体は、ほとんどの場合、酵素などのバイオ触
媒を用いて最も簡便に合成される。酵素触媒反応は、多くの場合、スケールアッ
プが困難であることが判明しているため、製薬あるいは化学工業では一般に採用
されていない。

【０００３】 これは、有機溶剤中で反応を行わねばならない触媒工程を含む反応において特
に言えることである。有機溶剤中にて行われる工程は、化学反応、後工程及びし
ばしば触媒作用そのものにとって多くの利点を有する。しかし、溶剤中の酵素触
媒は、酵素の活性をかなり低下させ、工程の速度を使用不能あるいは非経済的レ
ベルにまで下げることがある。

【０００４】 溶剤中の酵素による触媒反応は、加水分解反応の基質として水が添加される必
要のある場合に、特に、物理的に不安定になる傾向もある。そのような反応は、
酵素の凝集、沈殿及び触媒工程の不可逆停止に至ることがある。

【０００５】 水性液中での酵素反応は、種々の化学薬品を添加することにより可能となる。
これらのものとしては、界面活性剤、塩、リン脂質及び脂質ミセルがある(例え
ばHebb et al, Biochem. Pharma. (1975)24: 1007-12、 Mann et al, Biochem.
Pharmac. (1975)24; 1013-17及びMann, J. Newrochem. (1978) 31; 747-9参照)
。

【０００６】 同様に、阻害物質を種々の材料を存在させて反応媒体から除去してもよい。よ
く知られた例として、簡単な緩衝剤を使用した酸性反応生成物の除去がある。こ
の方法における塩や他の材料の使用は、有機溶剤中、未精製触媒を用いては可能
でないと思われる。しかしながら、これは触媒の活性化及びどのような阻害工程
も特に除去する必要がある場合の一つである。

【０００７】 酵素触媒反応は、しばしば基質依存性であり、生成物により阻害されることが
ある。このように、高い転化率は望ましいこともあるが、基質及び／又は生成物
の濃度を低く維持しなければならないため不可能である。

【０００８】 酵素の活性を下げたりあるいは分散したりするために希釈剤を使用することは
よく知られている。例えば、酵素をふすま又は他の類似の材料上に噴霧乾燥して
もよい。同様に、脱水した酵素を、凍結乾燥によって溶剤中における有機合成に
使用するよう調製してもよい。この工程は、コスト高となり得る。

【０００９】 (発明の概要) 本発明は、例えば、酵素反応に水の存在が必要であって有機溶剤中で行われ、
酵素に結合した水が触媒反応を進行させるに充分必要である場合には、加水分解
反応に必要な水を収容するためにだけ余分の酵素を使用しなければならないとい
う知見に基づくものである。本発明は、マトリックスを形成する能力を有し、そ
れによって酵素の近くに余分な水を保持する材料を添加することによりこのよう
な問題を解決するものである。さらに、一般的に言えば、この材料は内部で反応
を生ずるマトリックスを形成することができ、反応のための基質(一以上の基質
の可能性がある)を保持することができる。

【００１０】 このように、本発明は、有機溶剤中での酵素触媒反応にて生ずる多くの問題を
解決する酵素の配合方法について述べるものである。溶剤中のバイオ触媒作用の
問題にかかる本願の解決法は柔軟性があり、界面活性剤および塩などの他の材料
を適宜に該配合物に添加して触媒工程における所望の改善を実現することもでき
る。

【００１１】 したがって、この配合物は、溶剤中の酵素触媒作用を大きくする効果があり、
また酵素の活性を保持あるいは増進したり、安定性を高め、さらに、酵素の隣接
環境の操作を容易にする効果がある。特に、加水分解反応の場合、マトリックス
形成材料は、水の容器となって反応における基質の役割をする。また、本発明は
、酵素が保護され長期に用いられるため経済的にも有利である。

【００１２】 (発明の記述) この明細書において、用語「酵素」は、従来の酵素、例えば、タンパク質およ
び／又はアミノ酸をベースとするものおよびその類似物をベースとするものを含
めて使用され、「酵素」は、一次基質を生成物(二次基質、例えば、水も通常含
まれる)への転化の触媒作用の能力のあるものである。例として、工程は加水分
解であってもよく、この場合、酵素は例えば、リパーゼあるいはプロテアーゼで
あってよい。また、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを酵素として使用した
非加水分解でもよい。他に使用できる酵素には、オキシドリダクターゼ、トラン
スフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメアラーゼおよびリガーゼがある
。

【００１３】 本発明は、酵素触媒の周囲の自然又は人工的環境を維持することのできる材料
又は「希釈剤」を用いる。その例を示すと、特に、デキストリン、シクロデキス
トリンおよびポリガラクツロナンなどの炭水化物含有多糖類の使用がある。

【００１４】 タンパク質、界面活性剤、脂質および／又はリン脂質などの他の材料も使用で
きるが、いずれの場合も、その効果は、反応において触媒作用を増強させ、操作
が可能で、その結果最大の活性が得られる触媒周囲の環境を作ることである。

【００１５】 さらに、詳しく説明すると、有機溶剤中における反応効率および酵素活性は、
特定の材料の使用により高くすることができる。それらの材料は、酵素の活性が
配合物中にて低下しているので、希釈剤と考えられる。しかし、有機溶剤中、当
該酵素は、効率および経済的な有効性がかなり高くなるとともに全体的な活性の
増加を示すことがある。このような希釈剤としては、酵素が機能するフレームワ
ーク即ちマトリックスを作るに充分な長さの多糖類が代表的である。このマトリ
ックスは、酵素を溶剤の脱水作用及び変性作用から効果的に保護し、また、操作
し得る環境を提供して、酵素の効果を最大にする。加水分解反応においては、基
質として用いられる水をマトリックス自体が保持し、加水分解反応にあたり水が
酵素に導かれる経路となる。これにより、酵素タンパク質内に存在し、酵素の安
定化および配座(コンホーメーション)に必要な自然な水の集まりから水が取り除
かれるのを防止する。このようにして、酵素の効率が向上し寿命が延びる。この
ため、そのような配合物を使用して設計した工程の経済的実行可能性はいずれも
高くなる。

【００１６】 マトリックスを形成する材料は、典型的には重合体で、例えば、重合度(ＤＰ)
が１０から４００である。タンパク質は必要な特性を有している。しかし、タン
パク質の含水量は、非常に限定されていることがあり、一般に望ましくない。シ
ョ糖、トレハロースおよびラクトースなどの短鎖の多糖類を使用してもよいが、
ほとんどの場合、１０炭水化物単位より大きいＤＰを有する多糖類を用いるとよ
りよい結果が得られる。適当な例として、充分に重合したデキストリン又はデキ
トランが上げられる。説明のために、水にほとんど溶解しない原料を含む簡単な
デキストリンを使用する。

【００１７】 配合物は、いくつかの方法で調製できるが、均質なブレンドが得られるまでデ
キストリンを酵素と混合することにより好ましい結果が得られる。加水分解工程
を行うには、希釈した酵素を、基質を含む有機媒体は又は溶剤に加えて、ついで
注意深く水を添加して水和する。非加水分解工程を行うには、極く少量の水（用
いる場合）を添加する必要があり得る。酵素タンパク質は、デキストリンと共に
マトリックスあるいは格子体(latticework)を形成する。少量の水は、反応中、
この酵素−デキストリンマトリックスを一体に保持する。このマトリックスは、
酵素の物理的支持体であるばかりでなく、加水分解工程の場合（例えば、リパー
ゼあるいはプロテアーゼを使用）には、マトリックスが反応の基質として水を供
給するので炭水化物自体が補助基質(co-substrate)となる。

【００１８】 このように、触媒工程において水を保持できる系内の二成分があり、これらは
酵素タンパク質およびデキストリンである。加水分解反応では、二つの水の集ま
り(pool)の間に、連続した動的関係があると考えられる。水は加水分解反応が進
行するに従い、一方から他方に通過することができる。このような加水分解反応
は、酵素の活性中心から水を除去し、それだけ他方のプールから補給される。

【００１９】 しかし、水の供給が、マトリックスの唯一の利点あるいは機能ではない。この
ように、マトリックスは、第一基質(すなわち、水以外の基質)が溶解している有
機相中に酵素を効果的に担持することができる。このように、基質はマトリック
スを通って移動し、そうでない場合もしばしばあるが、充分な水が触媒反応のた
めに存在する環境で酵素に供給される。したがって、マトリックスの維持は、い
ずれの反応を完遂するためにも非常に重要である。触媒工程に物理的な強さを与
え、触媒反応を可能にする他の材料の添加が可能な「フレームワーク」を与える
のは、酵素と例えばデキストリンとの間のこの物理的関係である。

【００２０】 加水分解でない反応は、つぎのように考えてもよい。場合によって、凍結乾燥
の酵素中でもマトリックスを支持するための充分な水の存在することがある。ま
た、場合によっては、少量の水を添加する必要のあることもある。

【００２１】 多糖類を用いて最も好ましいマトリックスあるいは格子体を作るには、多糖類
あるいはデキストリンの重合度は１０を超えるのが望ましい。最も効果的なデキ
ストリン類では、デキストリンの６０％を超えるものの重合度が１０から３５０
でほとんど溶解性のない材料であることが判明している。成功しているマトリッ
クスの構造では、水の量が理論上、実験的に決定できる。しかし、実際には、酵
素自体、水吸収能がばらついているかもしれないから、安定したマトリックスを
実現するに必要なデキストリンおよび水の量は、どのような場合でも多分実験に
より最も良好に決められる。これは、熟練者であれば容易になし得る。

【００２２】 疎水性の反応には、非水和性マトリックス形成体を使用しなければならないで
あろう。この場合、酵素内に残っている極く小量の水が添加されて、酵素の機能
性を保持する。多くの水を添加する必要はなく、害にさえなることがある。

【００２３】 好適な配合物でも、反応中全体にわたりマトリックスが安定性を保持しない可
能性のあることがわかる。この理由は、どんな成功した加水分解反応でももう一
つのパラメータ、すなわち、基質の濃度が存在することを考慮すれば明かになる
。どのような加水分解反応においても、マトリックスより取得される水の量を決
定するのは基質の濃度であるため、水の必要量が大きすぎることがある。そのよ
うな場合、反応が進行するにつれて、マトリックスからかなり大量の水が取られ
、そのためマトリックスは不安定になり崩壊する。これは反応完結の妨げとなり
、基質の転化が非効率となりそうである。同様に、水が余り多く添加されて、配
合物により吸収されない場合は、酵素配合物の凝析を防止するためにより多量の
デキストリンが必要である。したがって、どのような予備ブレンド酵素でも、デ
キストリンおよび水の一方又は両方を余分に添加して、目的とする反応に適した
配合物要件を満足するよう配合物処方を変更する必要がある。

【００２４】 したがって、調整した製品の使用により、反応計画を最適化する一方、有機溶
剤中の基質(化学品)濃度を最大にする機会が得られる。これは、化学薬品および
薬の合成で重要なコスト要因である。多くの場合、基質濃度の単独の上昇は、生
ずる工程を経済的にかつ望ましくするに充分である。

【００２５】 マトリックス内にて、酵素は基本的に、溶剤の望ましくない影響からマトリッ
クスにより保護された形態にて存在する。触媒反応を促進させる水に加えて、又
はその代わりに他の原料を導入することも、ここでは可能である。より一般的に
言えば、酵素分解反応を可能とする成分を添加することができ、この成分は、酵
素および／又は材料と比較的相容性があり、反応媒体と比較的非相容性である。

【００２６】 例えば、有機媒体中では、塩、特に、水溶性塩、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、アンモニウム又はリン酸塩イオンを含む塩を添加することがで
きる。界面活性剤も適当な添加剤の一例である。水性環境おける酵素タンパク質
に加えるそのような添加剤を、マトリックスを前記のように考えて、酵素活性と
その効率の両者のために添加することができるとする充分な証拠がある。さらに
、活性を確保する為に添加できる他の適当な添加材料として、阻害物質又は望ま
しくない生成物を除去するものがある。

【００２７】 このように、マトリックスを形成する多糖類、タンパク質、又は他の類似の材
料を使用することにより提供される本発明の特徴は、酵素の配合を行い、これに
よって触媒効率を増進し、酵素を保護し、かつ強度と操作の柔軟性を工程に導入
し、他方、支持体を提供して加水分解反応のための水を提供することにより補助
基質の働きをすること、酵素を安定化することにより非加水分解反応の効率を高
め、最大基質濃度を高めること、および酵素を物理的に支持し、これにより効率
を最大にするために酵素の環境の操作をさらに、良くすることにある。

【００２８】 つぎに、実施例により本発明を説明する。

【００２９】 ［実施例１］(バイオ分割)

【００３０】

【化１】 酢酸エノールより出発しエノールエステルおよびケトンを生ずるラセミ分割を
、Candida rugosa由来のリパーゼ酵素を使用してブタノールの存在下に行った。
水中にて分割はなく、収率１００％のケトンが得られた。

【００３１】 本発明を説明するために、酢酸エノール(０.６４ｍｍｏｌ)を９.０ｍｌのトル
エンに溶解し、さらに酵素、又は酵素とデキストリン(６：１)を添加し充分に混
合した。つぎに第２の基質(ｎ−ブタノール)を添加し、さらに約３〜４時間にわ
たり反応を進行させ観察した。５２％のケトンおよび４８％の酢酸エノールを回
収した。酢酸エノールのｅｅは、(Ｓ)形が優勢で６８％であった。デキストリン
を添加しない場合では、収率８８％のケトンが得られ、同じｅｅで(Ｓ)−酢酸エ
ステルが優勢であった。

【００３２】 結局、この実施例から、所望の(Ｓ)−酢酸エステルは、収率が、水中で０％、
デキストリンなしのトルエン中で８.２％、 デキストリンを用いたトルエン中に
て３２.６％であった。

【００３３】 ［実施例２］ 製薬前駆物質のラセミ混合物を分割した。その時、実施例１と同じリパーゼを
用いキラル中心にハロゲンを含む一対の鏡像異性体の一つを加水分解して、ハロ
ゲン酸を放出した。もとの反応は、化学的、物理的および効率的にかなりスケー
ルアップに問題があった。酵素をデキストリンで希釈すると回収およびｅｅの点
ですぐれた結果が得られ、他方、安定した再現性のある工程が得られスケールア
ップ可能であった。

【００３４】 この発明の有用性の更なる証拠が、Griebenow et al. J. Am. Chem. Soc. (19
99) 121; 8157-63により提供されている。この論文は、酵素がシクロデキストリ
ンの存在下に凍結乾燥されたとき、活性および鏡像選択性が改良されることを示
している。いくつかの利点が、有機溶剤の中におけるズブチリシン カールスベ
ルグとのエステル交換にて指摘されている。改善されたｅｅは、酵素の構造の保
持および不変性(intactness)に関連し、他方、活性の向上は酵素の構造の移動度
の向上により達成されたとこの著者は主張している。なお、本発明の目的の為に
凍結乾燥は不要である。

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Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有機媒体中にて行われ、その内部で反応が起こり得るマトリッ
   クスを形成する多糖類を加え、反応中に水が加えられる酵素仲介加水分解反応方
   法。
2. 【請求項２】有機媒体中にて行われ、その内部で反応が起こり得るマトリッ
   クスを形成する多糖類を加える酵素仲介非加水分解方法。
3. 【請求項３】酵素がリパーゼ又はプロテアーゼである請求項１に記載の方法
   。
4. 【請求項４】酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである請求項２に記載の方
   法。
5. 【請求項５】酵素がオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラ
   ーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼから選択されたものである前記い
   ずれかの請求項に記載の方法。
6. 【請求項６】通常、水で水和されたとき、前記多糖類の粘度が７５ｃｐｓよ
   り大きい前記いずれかの請求項に記載の方法。
7. 【請求項７】前記多糖類の重合度が１０〜４００である前記いずれかの請求
   項に記載の方法。
8. 【請求項８】前記多糖類がデキストリンである前記いずれかの請求項に記載
   の方法。
9. 【請求項９】さらに、酵素仲介反応を可能にする成分を添加することからな
   る方法であって、前記成分が酵素および／又は多糖類と比較的相容性であり、有
   機媒体と比較的非相容性である前記いずれかの請求項に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記成分が塩である請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】反応が鏡像選択性である前記いずれかの請求項に記載の方法
    。