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JP2002536981A - 核酸標的配列の存在を測定する方法およびその応用 - Google Patents

核酸標的配列の存在を測定する方法およびその応用

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JP2002536981A
JP2002536981A JP2000599902A JP2000599902A JP2002536981A JP 2002536981 A JP2002536981 A JP 2002536981A JP 2000599902 A JP2000599902 A JP 2000599902A JP 2000599902 A JP2000599902 A JP 2000599902A JP 2002536981 A JP2002536981 A JP 2002536981A
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nucleic acid
probe
seq
sample
nucleotides
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JP2000599902A
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シュルツ，ジョン・ダブリュー
ルイス，マーティン・ケイ
ライペ，ドナ
マンドレカー，ミッシェル
ケパート，ダニエル
ローズ，リチャード・ビー
アンドリュース，クリスティーン・アン
ハートネット，ジェームズ・アール
グ，トレント
オルソン，ライアン・ジェイ
ウッド，キース・ヴイ
ウェルチ，ロイ
Original Assignee
プロメガ・コーポレーション
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 予め決定された核酸の存在を定性および定量分析するために核酸ハイブリッドの脱重合を使用するプロセスが開示される。それらのプロセスの応用は、単一ヌクレオチドの多形性の検出、単一塩基変化の同定、ウイルス荷重の測定、医学マーカー診断等を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、核酸の検出に関する。特定すれば、本発明は、核酸標的／プローブ
ハイブリッド中の予め決定された核酸標的配列の検出、およびそのような検出の
様々な応用に関する。
【０００２】 発明の背景 核酸を検出する方法は、分子生物学の大きくしかも早く成長する分野が築かれ
る基礎を提供する。特定の外因性核酸の検出に対してそのような一般的な方法の
幅広い応用が存在する。別の方法および生成物に関する絶え間無い要求が存在す
る。他の方法に勝る一つの方法を選択する理由は多様であり、放射性物質を避け
る必要性、技術を使用するライセンスのないこと、試薬または装置の費用または
利用可能性、要する時間または工程の数を最小にする欲求、特定の応用に必要と
される正確性または感度、分析の容易さ、またはプロセスを自動化する可能性を
含む。
【０００３】 特定の外因性核酸を含む核酸の検出は、しばしば、本質的に結果というよりむ
しろプロセスの一部である。当業界においては核酸の検出の多くの応用が存在し
、そして新たな応用がいつも発見されつつある。外因性核酸を検出および定量す
る可能性は、生物学サンプル中の微生物およびウイルスおよび生物学上の分子（
例えば、非天然プロモーターまたはターミネーター配列または外来遺伝子）検出
するのに有用であり、即ち多くの分野に影響し、ヒトおよび獣医の医学、食品加
工および環境試験を含む。さらに、生物学サンプル（例えば、組織、痰、尿、血
液、精液、唾液）からの特定の生物学上の分子の検出および／または定量は医学
および法科学における応用を有する。
【０００４】 核酸を検出するためのハイブリダイゼーション方法は、核酸配列の情報に依存
する。多くの公知の核酸検出技術は、オリゴヌクレオチドプローブをサンプル中
またはブロット上の核酸にハイブリダイズさせるかまたはアニールさせる、特異
的核酸ハイブリダイゼーションに依存し、そしてハイブリダイズしたプローブを
検出する。
【０００５】 ハイブリダイズした核酸の検出のための伝統的な種類のプロセスは、標識した
核酸プローブを使用することにより、核酸サンプルにハイブリダイズさせる。例
えば、サザンブロット技術においては、核酸サンプルをサイズに基づいてアガロ
ースゲル中で分離して、膜に固定化し、変性し、そしてハイブリダイズする条件
下で標識した核酸プローブに露出する。標識した核酸プローブがブロット上の核
酸とハイブリッドを形成するならば、標識は膜に結合する。サザンブロットに使
用されるプローブは、放射活性、蛍光染料、ジゴキシゲニン、ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアクリジニウムエステル等
で標識された。
【０００６】 ハイブリダイズした核酸の検出のための別の種類のプロセスはポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲプロセスは当業界においてよく知られている
（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８
００，１５９号）。簡単にＰＣＲを要約するため、核酸増幅標的配列に相補な核
酸プライマーを変性させたサンプルにアニールさせる。ＤＮＡポリメラーゼ（典
型的には熱安定性）がＤＮＡ二本鎖をハイブリダイズしたプライマーから伸長す
る。核酸標的を増幅するために上記プロセスを繰り返す。核酸プライマーがサン
プルにハイブリダイズしなかったならば、相当する増幅ＰＣＲ産物は存在しない
。この場合、ＰＣＲプライマーはハイブリダイゼーションプローブとして作用す
る。ＰＣＲに基づく方法は、未知の配列の核酸の検出に関しての限定使用である
。
【０００７】 ＰＣＲ方法においては、増幅された核酸産物は多くの様式、例えば標識された
プライマーを用いることにより標識されたヌクレオチドを増幅鎖へ取り込むこと
により検出してよい。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、放射活性、蛍光
染料、ジゴキシゲニン、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、アクリジニウムエステル、ビオチンおよびジャックビーンウレアーゼ
で標識された。非標識プライマーを用いて作成されたＰＣＲ産物は、別の様式、
例えば電気泳動ゲル分離、続く染料に基づく可視化により検出してよい。
【０００８】 いくらかの３’→５’脱重合活性が報告された鋳型特異的ポリメラーゼ活性を
有する酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｋｏ
ｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４（１１）：３０１９−２８（
１９６９））、Ｔ７のＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：５２６−３７（１９９１））、大腸菌ＲＮＡポリメラ
ーゼ（Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２４：６
４５−５０（１９９４））、ＡＭＶおよびＲＬＶの逆転写酵素（Ｓｒｉｖａｓｔ
ａｖａ ａｎｄ Ｍｏｄａｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０００−４
（１９８０））、およびＨＩＶの逆転写酵素（Ｚｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４１９５−２０２（１９９４））を含む。Ｄ
ＮＡハイブリッドのミスマッチ末端における３’→５’エキソヌクレオチド活性
が報告された鋳型依存性ポリメラーゼはファージ２９のＤＮＡポリメラーゼであ
る（ｄｅ Ｖｅｇａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：１１８２−１１
９２，１９９６）。
【０００９】 体内に存在するウイルス分子の数（「ウイルス荷重（load）」）を測定するこ
とができる、高い感度の診断の実用に関する要求が存在する。例えば、循環系ま
たは特定の組織中のウイルス粒子の存在は、ウイルス感染の重度を監視する手段
である。いくつかの方法が、ウイルス荷重を測定するために、当業界において現
在使用されている。米国特許第５，６６７，９６４号は、反応性酸素中間体生成
機を使用したＨＩＶ−１感染患者の細胞の数の測定方法を開示する。米国特許第
５，３８９，５１２号は、ＰＣＲを使用してサンプル中のウイルス性核酸の相対
量を測定する方法を開示する。
【００１０】 Ｃ．Ｇａｒｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１３
：１２２−５（１９９９）は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ
）、組換え体イムノブロットアッセイ（ＲＩＢＡ）、および逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、血液透析患者のＣ型肝炎ウイルス（
ＨＣＶ）感染の検出においてウイルス荷重の結果を比較する。定量性ＨＣＶ Ｒ
Ｔ−ＰＣＲアッセイは、約２，０００ウイルスコピー／ｍＬ血清の検出レベルを
有する。Ｈｏｌｇｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８：２５６−９（１９９９）は、いくつかの
市販のアッセイ、即ち第２世代のＨＩＶ−１ブランチＤＮＡアッセイ、Ｎｕｃｌ
ｉｓｅｎｓアッセイ、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（商標名）モニター逆転写酵素ポリメラ
ーゼ鎖反応アッセイ、およびＵｌｔｒａｄｉｒｅｃｔモニターを使用して血漿の
ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルを比較する。これらの様々なアッセイの間の結果を比
較することにおいて、異なる値が記された。Ｂｏｒｉｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，
Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．８０：１３２−６（１９９９）は、ＨＩＶ−１
感染した子供の末梢血白血球中のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡおよびＣＭＶゲ
ノミックＤＮＡを測定するためにネステッドポリメラーゼ鎖反応を使用した。ウ
イルスの荷重を検出および定量するための信頼できる手段に関する要求が残され
る。ウイルス粒子の定量が極めて小さい場合にウイルスの荷重を測定する方法に
関する要求が存在する。
【００１１】 核酸ハイブリッドの検出のための別の方法に関する要求が存在する。天然では
ないかまたは生物体の核酸にとって「外因性の（exogenous）」特定の核酸配列
の存否を測定するために有用な高感度の方法に関する要求が存在する。例えば、
非天然核酸が天然核酸に取り込まれた場合および取り込まれない場合の両方にお
いて、細胞中に存在する非天然核酸の存在を測定する要求が存在する。例えば、
体内、組織内、体液内、または他の生物学上のサンプル中に存在するわずか１０
コピーのウイルスを確実に検出することができるウイルス荷重測定方法にする要
求が存在する。ウイルス集団を含む生物学上のサンプル中の変異ウイルス、例え
ば薬剤耐性ウイルスの存在を測定する方法に関する大きな要求が存在する。サン
プル中の特定の種に唯一の非天然配列の存否、例えば主として非細菌性生物学サ
ンプル中に存在する細菌の汚染の同定を測定する方法に関する大きな要求が存在
する。再現性が高くしかも自動化できて、公知の方法よりも感度が高い方法に関
する大きな要求も存在する。
【００１２】 需要の多い、予め決定された外因性標的ヌクレオチド配列の存在を検出するの
に別の方法が利用可能であったなら、有益なはずである。また、マイクログラム
からピコグラムのスケールのサンプルサイズを使用してそのような方法が操作可
能であったなら、有益なはずである。さらに、そのような検出方法が単一アッセ
イにおいて複数の分析を提供したなら、有益なはずである（複数アッセイ）。以
下の開示はそのような方法の一つを提供する。 発明の簡単な概要 この発明の方法は、核酸サンプル中の予め決定された外因性核酸標的配列の存
否を決定するために使用される。そのような方法は、核酸標的配列にハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドプローブの３’末端領域を脱重合する酵素が、その
存在を次に検出できる一つまたは複数の同定用ヌクレオチドを放出するのに利用
される。
【００１３】 本発明の一つの態様は、核酸サンプル中の予め決定された外因性核酸標的配列
の存否を決定する方法を包含する。一つより多いそのような予め決定された標的
配列も、アッセイされるサンプル中に存在させることができ、そして一つより多
い予め決定された核酸標的配列の存否も決定することができる。該態様は以下の
工程を含む。
【００１４】 ３’末端領域に同定用ヌクレオチドを含む核酸プローブとハイブリダイズした
、予め決定された核酸標的配列を含むかもしれない、処理サンプルを用意する。
処理サンプルを、その活性が、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から
一つまたは複数のヌクレオチドを放出する、脱重合量の酵素と混合することによ
り、処理反応混合物を形成する。ヌクレオチドの放出のために使用される酵素の
種類は、本明細書において以下においてさらに明らかにされて記載される。処理
反応混合物は、脱重合条件下で、上記酵素がハイブリダイズした核酸を脱重合し
てそれから同定用ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、保持する。放出され
た同定用ヌクレオチドの存在を分析することにより分析用出力を得て、該分析用
出力が核酸標的配列の存在または不在を示す。分析用出力は本明細書において論
じられる様々な技術により得られる。
【００１５】 本発明の方法の分析用出力は様々な様式において得られ得ることを意図する。
分析用出力は発光分光測定により確認することができる。いくつかの好ましい態
様において、放出された３’末端領域のインディケーターヌクレオチドに関する
分析は、ＡＴＰの検出を含み、ルシフェラーゼ検出系（発光分光）またはＮＡＤ
Ｈ検出系（吸光または蛍光分光）の何れかによる。特に好ましい態様において、
ＡＴＰ分子は、リン酸転移工程により、例えば脱重合工程により生成されるヌク
レオチド３リン酸から生じるリン酸基を用いて、ＡＤＰ存在下においてＮＤＰＫ
のような酵素を使用することにより形成される。別の態様において生成されたＡ
ＴＰは増幅されて多数のＡＴＰ分子を形成する。ＡＴＰ検出の態様において、酵
素ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（ＮＤＰＫ）は典型的には脱重合反応に存在し
、そして機能することにより、放出されたヌクレオチドと加えたＡＤＰをＡＴＰ
に変換し、即ち、上記２つの酵素が共に存在する反応を「ワンポット」法と記す
。
【００１６】 別の態様において、分析用出力は、蛍光分光測定により得られる。蛍光は当業
界において公知の多数の様式においてプローブに取り込まれるかまたは付加され
得る。例えば、同定用ヌクレオチドが蛍光標識を含むことは意図される。同定用
ヌクレオチドは、同定用ヌクレオチドの放出前または後に蛍光標識することがで
きる。放出された同定用ヌクレオチド以外のものが蛍光タグを含むことも意図さ
れる。そのような態様において、本発明のプロセスにおけるヌクレオチドの放出
は、ポリヌクレオチドプローブの長さの違いの測定により、例えばプローブの５
’末端かまたは３’末端領域以外の別の領域中の蛍光タグによりイメージされた
キャピラリー電気泳動により、確認される。
【００１７】 別の態様において、分析用出力は、質量分光測定により得られる。ここでは、
同定用ヌクレオチドがヌクレオチド類似体または標識されたヌクレオチドであり
、そしてそのヌクレオチドの通常の形態の質量とは異なる分子質量を有すること
が好ましいが、質量の差は要求されない。蛍光標識された同定用ヌクレオチドを
用いて分析用出力を質量分光測定により得ることが可能なことも注目に値する。
放出されたヌクレオチドの分析は、本発明のプロセスの脱重合工程の後にプロー
ブの質量の差を確認することにより実施されることも意図される。
【００１８】 また別の態様においては、分析用出力は吸光分光測定により得られる。そのよ
うな分析は紫外線の光の吸光および分光の可視領域を監視することにより、吸収
する種の存在を測定する。そのようなプロセスの一つの側面においては、放出さ
れたヌクレオチドをハイブリダイズした核酸および他のポリヌクレオチドからク
ロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣまたはＧＣ）または電気泳動（例えば、Ｐ
ＡＧＥまたはキャピラリー電気泳動）により分離する。放出された同定用ヌクレ
オチドまたはプローブの残りの何れかを分析することにより、本発明のプロセス
において同定用ヌクレオチドの放出を確認することができる。そのようなプロセ
スの別の側面において、標識は分析された核酸内に取り込まれてよい。
【００１９】 意図される態様において、外因性核酸標的配列の存在または不在に関してアッ
セイされるサンプルは、ハイブリダイゼーション組成物を形成するハイブリダイ
ズ条件下で一つまたは複数の核酸プローブと混合する。該核酸プローブの３’末
端領域は、その配列がサンプル中に存在する場合に一部または全体の相補性をも
って外因性核酸標的配列にハイブリダイズする。核酸プローブの３’末端領域は
同定用ヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション組成物は、核酸プローブと
ハイブリダイズした上記の予め決定された核酸標的配列を含むかもしれない処理
サンプルを形成するのに十分な時間、ハイブリダイズ条件下で保持する。処理サ
ンプルは、その活性が、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から一つま
たは複数のヌクレオチドを放出することである、脱重合量の酵素と混合すること
により、処理反応混合物を形成させる。処理反応混合物は、上記酵素がハイブリ
ダイズした核酸を脱重合してそこから同定用ヌクレオチドを放出するのに十分な
時間、脱重合条件下で保持される。放出された同定用ヌクレオチドの存在を分析
することにより分析用出力を得て、該分析用出力が核酸標的配列の存在または不
在を示す。分析用出力は上記の様々な技術により得てよい。
【００２０】 本発明の一つの方法は、アッセイされるサンプル中の外因性核酸標的配列中の
特定の塩基の存否を質問することを意図し、以下の工程を含む。 ハイブリダイゼーション組成物は、アッセイされるサンプルを、ハイブリダイ
ズ条件下で一つまたは複数の核酸プローブと混合することにより形成される。ア
ッセイされるサンプルは、取り込まれる外因性核酸標的配列を含むかもしれない
。核酸標的は、その存在が明らかにされる少なくとも一つの塩基を含む。ハイブ
リダイズ組成物は、核酸標的配列に実質上相補な少なくとも一つの核酸プローブ
を含み、そして質問位置において少なくとも一つの予め決定されたヌクレオチド
を、および３’末端領域において同定用ヌクレオチドを含む。
【００２１】 処理サンプルは、質問位置においてプローブヌクレオチドを、標的配列中で明
らかにされる塩基と並べた場合に塩基対が生じる時間、ハイブリダイズ条件下で
ハイブリダイゼーション組成物を保持することにより形成される。処理反応混合
物は、その活性が、ハイブリダイゼーションした核酸プローブの３’末端から一
つまたは複数の同定用ヌクレオチドを放出してハイブリッドを脱重合することで
ある酵素と、処理サンプルを混合することにより形成される。処理反応混合物は
、上記酵素が、ハイブリダイズした核酸を脱重合して同定用ヌクレオチドを放出
するのに十分な時間、脱重合条件下で保持する。
【００２２】 分析用出力は、放出された同定用ヌクレオチドの存否を分析することにより得
られる。分析用出力は、同定される特定の一つまたは複数の塩基の存否を示す。
分析用出力は本明細書において論じられる様々な技術により得られる。好ましく
は、同定用ヌクレオチドは質問位置にある。
【００２３】 本発明の方法の一つの側面において、核酸標的配列は、デオキシリボ核酸およ
びリボ核酸からなるグループから選択される。 本発明の別の側面においては、複数の標的核酸配列を含むサンプルを、複数の
核酸プローブと混合する。いくつかの分析用出力がそのような複合アッセイから
得られ得る。
【００２４】 第１の態様において、少なくとも一つの核酸プローブが部分相補性をもって一
つの標的核酸配列とハイブリダイズする場合に得られる分析用出力は、それら各
々の核酸標的配列に全体の相補性をもって全ての核酸プローブがハイブリダイズ
した場合に得られた分析用出力よりも大きい。第２の態様において、少なくとも
一つの核酸プローブが部分相補性をもって一つの標的核酸配列とハイブリダイズ
する場合に得られる分析用出力は、それら各々の核酸標的配列に全体の相補性を
もって全ての核酸プローブがハイブリダイズした場合に得られた分析用出力より
も小さい。第３の態様において、少なくとも一つの核酸プローブが全体の相補性
をもって一つの標的核酸配列とハイブリダイズする場合に得られる分析用出力は
、それら各々の核酸標的配列に部分相補性をもって全ての核酸プローブがハイブ
リダイズした場合に得られた分析用出力よりも大きい。第４の態様において、少
なくとも一つの核酸プローブが全体の相補性をもって一つの標的核酸配列とハイ
ブリダイズする場合に得られる分析用出力は、それら各々の核酸標的配列に部分
相補性をもって全ての核酸プローブがハイブリダイズした場合に得られた分析用
出力よりも小さい。脱重合酵素は本明細書において記載されるとおりである。
【００２５】 本発明のさらに別の態様は、その標的を含むかまた実質上同一の第２標的を含
むかもしれない核酸サンプル中の第１外因性核酸標的の存否を決定する方法を意
図する。例えば、第２標的は第１核酸標的に対して塩基の置換、欠失または付加
を有してよい。この態様は以下の工程を含む。
【００２６】 アッセイされるサンプルを、ハイブリダイズ条件下にて一つまたは複数の核酸
プローブと混合することにより、ハイブリダイゼーション組成物を形成する。第
１および第２核酸標的は、それぞれ、標的間で異なる予め決定された位置におけ
る少なくとも一つのヌクレオチドを除いて配列同一の領域を含む。核酸プローブ
は、配列同一の核酸標的領域に実質相補であって、質問位置に少なくとも一つの
ヌクレオチドを含む。プローブの質問位置は、標的とプローブがハイブリダイズ
したときに、標的の予め決定された位置と並ぶ（aligned with）。プローブは、
３’末端領域に同定用ヌクレオチドも含む。
【００２７】 ハイブリダイゼーション組成物は、処理サンプルを形成するのに十分な時間ハ
イブリダイズ条件下で保持されるが、その際、プローブの質問位置のヌクレオチ
ドを、標的の同一性領域中の予め決定された位置のヌクレオチドと並べる。
【００２８】 処理反応混合物は、その活性が、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端
から一つまたは複数のヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合量と、処
理サンプルを混合することにより形成される。反応混合物は、上記酵素が、ハイ
ブリダイズした核酸を脱重合して同定用ヌクレオチドを放出するのに十分な時間
、脱重合条件下で保持する。
【００２９】 分析用出力は、放出された同定用ヌクレオチドの存否に関して分析することに
より得られる。分析用出力は、予め決定された領域におけるヌクレオチドの存否
を示し、そして；それにより、第１核酸標的の存否を示す。
【００３０】 上記の方法の一つの側面は、第１プローブおよび第２プローブからなる。第１
プローブは、予め決定された位置において第１核酸プローブと相補な質問位置に
ヌクレオチドを含む。第２プローブは、予め決定された位置において第２核酸プ
ローブと相補な質問位置にヌクレオチドを含む。
【００３１】 本発明のプロセスの別の態様においては、その活性がヌクレオチドを放出する
ことである脱重合酵素が、その３’末端のヌクレオチドがマッチしているハイブ
リダイズした核酸をピロリン酸イオン存在下で３’→５’方向に脱重合すること
により一つまたは複数のヌクレオチドを放出することである活性を有する鋳型依
存性ポリメラーゼである。即ち、該酵素の活性は、ハイブリダイズした核酸を脱
重合することにより脱重合条件下でヌクレオチドを放出することである。この態
様においては、酵素処理前に遊離のプローブからハイブリッドを分離することが
できる。いくつかの態様において、過剰の標的を使用することにより、酵素反応
中の遊離プローブの濃度を極めて低くしてよい。
【００３２】 本発明のプロセスのまたさらに別の側面において、脱重合酵素は、ハイブリッ
ドの３’末端に一つまたは複数のマッチした塩基を有する二本鎖ＤＮＡ基質上で
３’から５’へのエキソヌクレオチド活性を呈する。該酵素の活性は、ハイブリ
ダイズした核酸を脱重合することにより、脱重合条件下で５’リン酸を含むヌク
レオチドを放出することである。
【００３３】 特に好ましい態様において、ＡＴＰ分子はリン酸転移工程により（例えば、Ａ
ＤＰ存在下において酵素ＮＤＰＫを使用して）、脱重合工程により生成されたデ
オキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）から形成される。いくつかの態様に
おいて、ＡＴＰが増幅されることにより多数のＡＴＰ分子を形成することができ
る。耐熱性ヌクレオシド２リン酸キナーゼはＮＤＰＫ酵素を用いる場合に特に好
ましい。
【００３４】 本発明の一つの側面において、アッセイされる核酸サンプルは、固体または液
体の生物学上のサンプルから得られる。 上記方法の一つの側面において、予め決定された核酸標的配列は、遺伝子治療
のためにサンプル中に存在する。
【００３５】 上記方法の一つの側面において、予め決定された核酸標的配列は、微生物また
はウイルスの核酸である。 本発明のいくつかの好ましい態様において、予め決定された核酸標的配列はウ
イルスの核酸である。ウイルスの荷重、存在するウイルスの量は、予め決定され
た量の生物学上のサンプル、例えば動物の体液または組織からの分析用出力の大
きさから決定することができる。
【００３６】 いくつかの好ましい態様において、ウイルスゲノム中の変異の存否を測定する
ことができる。 上記方法の別の側面において、核酸サンプルは食品源から得られる。該方法の
一つのプロセスにおいて、食品源は植物であるか、または植物の物質に由来し、
そして予め決定された核酸標的配列はその植物にとって本来存在しない（non-na
tive）配列である。該方法の一つの側面において、主題の植物に本来存在しない
核酸配列は転写制御配列である。本発明の一つの好ましい態様において、転写制
御配列は３５ＳプロモーターまたはＮＯＳターミネーター、あるいは両方である
。
【００３７】 本発明のさらに別の態様は、標的にハイブリダイズして次にヘアピン構造を取
ることが可能なように修飾されたプローブを用いて、核酸サンプル中の外因性核
酸標的配列の存否を決定することを意図する。この態様は、以下の工程を含む。
【００３８】 核酸プローブとハイブリダイズした質問位置を有する外因性核酸標的配列を含
むかもしれない核酸サンプルを含む処理サンプルを用意する。該プローブは少な
くとも２つのセクションからなる。第１のセクションは、プローブの３’末端の
の約１０から約３０のヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチドは、質問位置
下流の約１０から約３０ヌクレオチドで始まる位置において標的鎖配列に相補で
ある。プローブの第２セクションは、プローブの５’末端領域に位置しており、
標的配列の約１０から約２０のヌクレオチドを含む。この配列は、質問位置にお
いてかまたはそのちょうど上流のヌクレオチドから、プローブの末端のヌクレオ
チドが標的にアニールする位置のちょうど上流のヌクレオチドへの、標的中の領
域にわたる。ゼロから約５０ヌクレオチド、好ましくはゼロから約２０ヌクレオ
チドの長さの、第１または第２セクションの何れかとハイブリダイズしない配列
を含む、上記プローブの任意の第３セクションは、プローブの第１セクションと
第２セクションの間に位置する。
【００３９】 処理サンプルのプローブは、鋳型依存性様式において伸長するが、ｄＮＴＰｓ
と鋳型依存性ポリメラーゼと混合して、少なくとも質問位置を通るようにし、そ
れにより伸長したプローブ／標的ハイブリッドを形成する。好ましい態様におい
て、プローブの伸長の長さは、質問位置の上流に存在して質問位置の３’末端に
相補なヌクレオチド間に存在しない標的配列のヌクレオチドに相補なｄＮＴＰの
伸長反応からの脱落により、限定される。
【００４０】 伸長したプローブ／標的ハイブリッドをあらゆる未反応のｄＮＴＰｓから分離
する。伸長したプローブ／標的ハイブリッドを変性することにより、鎖を分ける
。伸長したプローブ鎖はヘアピン構造をとる。
【００４１】 処理反応混合物は、その活性が伸長したプローブのヘアピン構造の３’末端か
ら一つまたは複数のヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合量と、上記
ヘアピン酵素含有組成物を混合することにより形成される。反応混合物は、脱重
合酵素が３’末端ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下で保持
し、そして次に、放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析する。分析
用出力は、外因性核酸標的配列の存否を示す。
【００４２】 本発明のまたさらなる態様において、ＲＥＡＰＥＲ（商標名）と呼ぶものもヘ
アピン構造を利用する。この方法は、核酸サンプル中の、外因性核酸標的配列の
存否、または標的配列の中の特定の塩基の存否を決定することを意図し、以下の
工程を含む。第１核酸プローブ鎖とハイブリダイズした外因性核酸標的配列を含
むかもしれない処理サンプルを用意する。
【００４３】 上記ハイブリッドは第１ハイブリッドと呼ぶ。第１プローブは少なくとも２つ
のセクションからなる。第１セクションは、質問位置下流の約５から約３０ヌク
レオチドで始まる位置において標的核酸配列に相補である、プローブの３’末端
の約１０から約３０ヌクレオチドを含む。第１プローブの第２セクションは、質
問位置から、質問位置下流の約１０から約３０ヌクレオチドまでの標的配列の繰
り返しである約５から約３０ヌクレオチドを含み、そしてプローブの第１セクシ
ョンにはハイブリダイズしない。プローブの第１セクションと第２セクションの
間に位置する任意の第３セクションは、ゼロから約５０ヌクレオチド、好ましく
は約２０までのヌクレオチドの長さであり、第１または第２セクションの何れか
とハイブリダイズしない配列を含む。
【００４４】 処理サンプル中の第１ハイブリッドは第１プローブの３’エンドにおいて伸長
されて、それにより、第１プローブは質問位置を越えて伸長し、その配列が質問
位置を含む、伸長された第１ハイブリッドを形成する。伸長した第１ハイブリッ
ドは、元の標的核酸と伸長した第１プローブからなる。伸長した第１ハイブリッ
ドは、次に、水性組成物中で変性されて、ハイブリダイズした二本鎖の２つの核
酸鎖を分離して、分離された標的核酸と分離された伸長第１プローブを含む水溶
液を形成する。
【００４５】 約１０から約２０００ヌクレオチド、好ましくは約１０から約２００ヌクレオ
チド、もっとも好ましくは約１０から約３０ヌクレオチドの長さであって、伸長
した第１プローブの質問位置下流の約５から約２０００、好ましくは約５から約
２００ヌクレオチドで始まる位置にて伸長した第１プローブに相補な第２プロー
ブを、伸長した第１プローブにアニールさせて、それにより第２ハイブリッドを
形成する。第２ハイブリッドは、その伸長が伸長した第１プローブの５’エンド
に到達するまで、第２プローブの３’エンドにおいて伸長し、それにより、その
３’領域が同定用ヌクレオチドを含む第２の伸長ハイブリッドを形成する。好ま
しい態様において、両伸長に関して伸長するポリメラーゼは、鋳型中に対応する
相補ヌクレオチドを含まない３’エンドにヌクレオチドを付加しない。
【００４６】 伸長した第２ハイブリッドの水性組成物を変性することにより、２つの核酸鎖
を分離する。そうして形成された水性組成物を冷やすことにより、標的配列が元
の核酸サンプル中に存在する場合には、分離した伸長第２プローブから「ヘアピ
ン構造」を形成する。
【００４７】 処理反応混合物は、その活性が核酸ハイブリッドの３’末端から一つまたは複
数のヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合量と、上記ヘアピン構造含
有組成物を混合することにより、形成される。反応混合物を、３’末端領域の同
定用ヌクレオチドを放出するのに十分な時間脱重合条件下で保持し、そして次に
、放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析する。分析用出力は、外因
性核酸標的配列の存在または不在を示す。
【００４８】 本発明は、多くの利益および利点を有するかもしれず、そのいくつかを以下に
掲載する。 本発明の一つの利益は、いくつかの態様において、放射性化学物質または電気
泳動の要求無しに極めて高いレベルの感度をもって核酸ハイブリッドが検出でき
ることである。
【００４９】 本発明の利点は、一つまたは複数の外因性標的核酸の存在または不在が、信頼
性をもって、再現性よく、そして高い感度で検出できることである。 本発明のさらなる利益は、定量に関する情報をサンプル中の外因性標的核酸配
列の量について得ることができ、そして大いに様々なサンプルの種類を使用する
ことができることである。
【００５０】 本発明のさらなる利点は、外因性核酸配列中の極めて小さな差異、例えば単一
ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）が検出可能なことである。 本発明のさらに別の利益は、多数の外因性標的配列の存否を同じアッセイにお
いて検出可能なことである。
【００５１】 本発明のさらに別の利点は、外因性標的配列の存否を少ない数の試薬および操
作により決定できることである。 本発明の別の利益は、上記プロセスが自動化に役立つことである。
【００５２】 本発明のさらに別の利益は、多くの異なる種類の応用およびアッセイにおける
その使用の柔軟性であり、限定ではないが、ウイルス荷重の測定、ウイルスの種
類の測定、種の同定、サンプルの汚染、および法廷のサンプルの分析を含む。
【００５３】 本発明のさらに別の利益および利点は、当業者にとっては以下の開示から明ら
かになる。 定義 発明の理解を促進するため、多くの用語を以下に定義する。
【００５４】 本明細書にて使用される「ヌクレオシド」は、ペントースに共有結合したプリ
ン［グアニン（Ｇ）またはアデニン（Ａ）］またはピリミジン［チミン（Ｔ）、
ウリジン（Ｕ）またはシチジン（Ｃ）］塩基からなる化合物を意味し、「ヌクレ
オチド」はそのペントースのヒドロキシル基の一つにおいてリン酸化されたヌク
レオシドを意味する。「ＸＴＰ」、「ＸＤＰ」および「ＸＭＰ」は、リボヌクレ
オチドおよびデオキシリボヌクレオチドの一般名称であり、「ＴＰ」は３リン酸
を、「ＤＰ」は２リン酸を、そして「ＭＰ」は１リン酸を意味し、当業界におい
ける標準の使用と一致する。リボヌクレオチドのやや一般的な名称は「ＮＭＰ」
、「ＮＤＰ」または「ＮＴＰ」であり、そしてデオキシリボヌクレオチドのやや
一般的な名称は「ｄＮＭＰ」または「ｄＮＴＰ」である。本明細書にて使用され
る「ヌクレオシド」は、上記のヌクレオシドの代替物として一般に使用される物
質、例えばこれらの塩基の修飾された形態（例えば、メチルグアニン）または当
業界においてそのような用途についてよく知られた合成物質、例えばイノシンで
ある。
【００５５】 本明細書において使用される「核酸」は、一つのヌクレオチドのペントースの
３’位が隣のペントースの５’位にホスホジエステル基により連結しており、そ
してヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列で連結している；即ちヌクレオチド
の直線順序にて連結する、ヌクレオチドの共有結合配列である。本明細書におい
て使用される「ポリヌクレオチド」は、約１００ヌクレオチドの長さより大きい
配列を含む核酸である。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」は
、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部である。オリゴヌクレオ
チドは、典型的には、約２から約１００塩基の配列を含む。用語「オリゴ」は、
ときどき「オリゴヌクレオチド」に代って使用される。
【００５６】 本明細書にて使用される塩基「位置」は、核酸内の所定の塩基またはヌクレオ
チド残基の位置を意味する。 本明細書にて使用される「目的の核酸」は、サンプル中で研究することを望む
あらゆる特定の核酸である。
【００５７】 核酸または蛋白質に関して使用される場合の用語「単離された」は、少なくと
も一つの混在物（それぞれ、核酸または蛋白質）から同定および単離された核酸
配列または蛋白質を意味し、通常は天然源に関連する。単離された核酸または蛋
白質は自然界に見いだされる形態とは異なる形態またはセッティングにおいて存
在する。対照的に、非単離核酸または蛋白質は自然界において存在する状態にお
いて見いだされる。
【００５８】 本明細書において使用されるとおり、用語「精製された」または「精製するた
め」は、目的の成分、例えば蛋白質または核酸からいくらかの汚染物を除去する
あらゆるプロセスの結果を意味する。精製された成分のパーセントは、それによ
り、サンプル中で増加する。本明細書において使用される用語「野生型」は、集
団中においてもっとも頻繁に見いだされるその遺伝子または遺伝子産物の特徴を
有する遺伝子または遺伝子産物を意味し、即ち、「正常な」または「野生型」の
形態の遺伝子と任意に呼ぶ。対照的に、本明細書において使用される用語「修飾
された」または「変異体」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に
、配列および／または機能上の特性において修飾を示す遺伝子または遺伝子産物
を意味する。
【００５９】 核酸は、異なる種類の変異を含むことが知られている。本明細書において使用
されるとおり、「点」変異は１カ所の塩基の位置におけるヌクレオチドの配列の
変更（alteration）を意味する。
【００６０】 本明細書において使用される「単一ヌクレオチド多形性」またはＳＮＰは、特
定の核酸位置においてもっとも頻繁に生じる塩基の変更（variation）である。 本明細書において核酸に関して使用される用語「外因性（exogenous）」は、
サンプル中の天然ではない核酸である。例えば、細胞に挿入された遺伝子は外因
性であり、または宿主細胞中に存在するウイルスは外因性である。宿主細胞のＤ
ＮＡに取り込まれているか否かに拘わらず外因性であってよい。
【００６１】 ＤＮＡ分子は、置換体モノヌクレオチドのペントースの５’炭素および３’炭
素に核酸ホスホジエステル結合が生じるため、「５’末端（terminus）（５’エ
ンド（end））」および「３’末端（３’エンド）」を有すると言う。新たな結
合が５’炭素に対してであるはずの位置のポリヌクレオチドの末端は、その５’
末端ヌクレオチドである。新たな結合が３’炭素に対してであるはずの位置のポ
リヌクレオチドのエンドは、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書におい
て使用される末端ヌクレオチドは、３’または５’の末端のエンドの位置におけ
るヌクレオチドである。本明細書において使用されるとおり、核酸配列は、大き
なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部であっても、５’および３
’エンドを有すると言うこともできる。例えば、大きな染色体の配列内に位置す
る遺伝子配列は、依然として５’および３’エンドを有すると言うことができる
。
【００６２】 本明細書において使用されるとおり、核酸プローブの３’末端領域は、３’末
端領域から約１０残基以内のヌクレオチドを含むプローブの領域を意味する。 直鎖状または環状のＤＮＡ分子の何れかにおいて、もしも別々の要素が結合す
るかまたはその要素の５’エンドに結合するなら、要素に関して「上流」または
「５’」であると呼ぶ。同様に、直鎖状または環状のＤＮＡ分子の何れかにおい
て、もしも別々の要素が結合するかまたはその要素の３’エンドに結合するなら
、要素に関して「下流」または「３’」であると呼ぶ。転写は、ＤＮＡ鎖に沿っ
て５’から３’への様式にて進行する。これは、伸長する鎖の３’末端に、リボ
ヌクレオチドの５’の３リン酸を連続して付加することによりＲＮＡが作成され
ることを意味する（ピロリン酸の除去を伴い）。
【００６３】 本明細書において使用される用語「標的核酸」または「核酸標的」は、目的の
特定の核酸配列を意味する。即ち、「標的」は、他の核酸分子の存在下において
かまたは大きな核酸分子内に存在し得る。
【００６４】 本明細書において使用される、用語「核酸プローブ」は、目的の別の核酸にハ
イブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。核
酸プローブは、精製された制限消化におけるように生じさせるか、または合成、
組換えあるいはＰＣＲ増幅により生成してよい。本明細書において使用されると
おり、用語「核酸プローブ」は、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチドを意味する。その同じオリゴヌクレオチドを使用
することもでき、例えば、重合のためのプライマーとしてＰＣＲ法においてであ
るが、本明細書において使用されるとおり、そのオリゴヌクレオチドはその時に
は「プライマー」と呼ぶ。本明細書において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドは修飾された結合、例えばホスホロチオエート結合を含んでよい。
【００６５】 本明細書において使用されるとおり、用語「相補」または「相補性」は、Ａが
Ｔと対合してＣがＧと対合する、よく知られた塩基対の規則により関係した核酸
（即ち、核酸配列）に関して使用される。例えば、配列５’Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は
配列３’Ｔ−Ｃ−Ａ−５’に相補である。相補性は、ほんのいくつかの核酸塩基
が塩基対合規則に従いマッチしているような「部分的」であり得る。一方、全て
の塩基が塩基対合規則に従いマッチしている場合の、核酸鎖間で「完全」または
「全体に」相補であってよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、当業界において知
られるとおり、ハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な効果を有する
。本発明の方法ような核酸間の結合に依存する検出方法において、これは特に重
要である。用語「実質相補」は、以下に記載される低いストリンジェンシーな条
件下または、好ましくは９５℃に加熱して後に室温まで冷やしたポリメラーゼ反
応バッファー（プロメガ、Ｍ１９５Ａ）中で標的核酸配列の一方または両方の鎖
にハイブリダイズすることができるあらゆるプローブを意味する。本明細書にお
いて使用されるとおり、核酸プローブを、標的核酸に対して一部または全部相補
であると呼ぶ場合、それは、プローブの３’末端領域を意味する（即ち、３’末
端ヌクレオチド位置の約１０ヌクレオチド以内）。
【００６６】 本明細書において使用されるとおり、用語「ハイブリダイゼーション」は、相
補な核酸鎖の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションとハイブリダイ
ゼーションの強度（即ち、核酸鎖の間の会合の強度）は、当業界においてよく知
られた多くの因子により影響され、核酸間の相補性の程度、塩濃度のような条件
により影響される関与条件の厳重さ、形成されたハイブリッドのＴｍ（熔融温度
）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの存否）、ハイブリダイ
ズする鎖のモル濃度および核酸鎖のＧ：Ｃ含有量を含む。
【００６７】 本明細書において使用されるとおり、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハ
イブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および他の成分の存在
の条件に関して使用される。「高いストリンジェンシー」の条件を用いると、核
酸塩基の対合は高い頻度の相補塩基配列を有する核酸断片間でのみ起こることに
なる。即ち、「弱い」かまたは「低い」ストリンジェンシーの条件は、互いに完
全に相補ではない核酸が共にハイブリダイズするかまたはアニールすることを望
む場合にしばしば必要とされる。低いストリンジェンシーの条件を含むように多
くの均等な条件が用いられ得ることは当業界がよく知っている。
【００６８】 本明細書において使用されるとおり、用語「Ｔｍ」は、「熔融温度」に関して
使用される。熔融温度は、二本鎖核酸分子の５０％の集団が一本鎖に解離するよ
うになる温度である。核酸のＴｍを計算する方程式は、当業界において知られて
いる。ハイブリッド核酸のＴｍは、１Ｍ塩におけるハイブリダイゼーションアッ
セイから採用された式を使用してしばしば見積もられ、そしてＰＣＲプライマー
に関するＴｍを計算するために一般に使用される：Ｔｍ＝［（Ａ＋Ｔの数）Ｘ２
℃＋（Ｇ＋Ｃの数）Ｘ４℃］。Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ，
第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク：１９９７）、ｐ．２
４。この式は、２０ヌクレオチドより長いプライマーに関しては不正確であるこ
とがわかった。Ｔｍの計算に関して構造上の特徴並びに配列の特徴を参酌する、
他のより洗練された計算が当業界に存在する。計算されたＴｍは単なる見積り値
であり；最適の温度は一般には経験上決定される。
【００６９】 本明細書において使用される用語「相同（homology）」は、相補の程度を意味
する。部分的相同も完全相同（即ち、同一性）もありうる。完全に相補な配列が
標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも一部阻害する部分的な相補配列
は、機能性用語「実質相同」を使用して呼ばれる。
【００７０】 二本鎖核酸配列、例えばｃＤＮＡまたはゲノミッククローンに関して使用され
た場合に、本明細書において使用される用語「実質相同」は、低いストリンジェ
ンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方の鎖にハイブリダイズすることができる
プローブを意味する。
【００７１】 一本鎖核酸配列、例えばｃＤＮＡまたはゲノミッククローンに関して使用され
た場合に、本明細書において使用される用語「実質相同」は、低いストリンジェ
ンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型配列にハイブリダイズすることができる（即ち
、相補な）プローブを意味する。
【００７２】 本明細書において使用される用語「質問位置（interrogation position）」は
、核酸プローブ内の興味のある所定の（given）塩基の位置を意味する。例えば
、ＳＮＰｓの分析においては、プローブ内の「質問位置」は、野生型から変更さ
れたかもしれない標的の一つのヌクレオチドに相補であるはずの位置にある。本
発明の方法からの分析用出力は、プローブの質問位置に相補な標的核酸の核酸残
基に関しての情報を提供する。質問位置は、核酸プローブの実際の３’末端ヌク
レオチドの約１０塩基以内にあり、３’末端のヌクレオチド位置にある必要はな
い。標的核酸とプローブ核酸をハイブリダイズさせる場合、標的核酸配列の質問
位置はプローブの質問位置の反対である。
【００７３】 本明細書において使用される、用語「同定用ヌクレオチド」は、脱重合反応が
生じたか否かを同定するために本発明にプロセスにおいて検出される。本発明の
方法の特定の応用は、どの残基が同定用ヌクレオチドであると考えられるかに影
響する。分析の間に脱重合により放出されたすべてのヌクレオチドがＮＤＰＫの
ような酵素によりＡＴＰに変換される、ＡＴＰ検出を使用する方法（例えば、ル
シフェラーゼ／ルシフェリンまたはＮＡＤＨ）に関しては、放出された全てのヌ
クレオチドが同定用ヌクレオチドである。同様に、ヌクレオチド間を識別しない
吸光検出を用いる方法に関しては、全ての放出されたヌクレオチドが同定用ヌク
レオチドである。全ての放出されたヌクレオチドを分析する質量分光分析検出に
関しては、全ての放出されたヌクレオチドが同定用ヌクレオチドであることがで
き；あるいは、特定のヌクレオチド（例えば、異なる質量のヌクレオチド類似体
）が検出できる。蛍光検出に関しては、蛍光標識されたヌクレオチドが同定用ヌ
クレオチドである。該ヌクレオチドは、核酸からの放出前または後に、標識する
ことができるかまたは蛍光レベルを修飾することができる。放射線写真の検出に
関しては、放射線標識されたヌクレオチドが同定用ヌクレオチドである。いくつ
かの場合、同定用ヌクレオチドの同定は、本発明の脱重合工程の後にプローブの
痕跡を分析することにより演繹される。そのような分析は、残ったプローブのサ
イズまたは質量の測定によるのが一般的であり、記載された分析方法の何れかに
よることができる（例えば、キャピラリー電気泳動後のその分子量を監視するた
めのプローブの５’末端上の蛍光タグ）。
【００７４】 用語「サンプル」はその広い意味において使用される。核酸を含む疑いのある
サンプルは、細胞から単離された染色体（例えば、中期染色体の展開）、ゲノミ
ックＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含み得る。
【００７５】 本明細書において使用される用語「検出」は、サンプル中のヌクレオチドまた
は核酸を定量によるかまたは定性により同定することを意味する。 本明細書において使用される用語「脱重合」は、核酸の３’エンドからのヌク
レオチドの除去を意味する。
【００７６】 本明細書において使用される用語「対立遺伝子」は、遺伝子の別の形態を意味
し、そして本明細書において使用される用語「座（locus）」は、核酸分子上の
特定の位置を意味する。 発明の詳細な説明 意図された方法は、サンプルの源にとって外因性である核酸の存否に関してア
ッセイすることに利用される。例えば、意図された方法を使用することにより、
ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の存在に関してアッセイすること、並びに
疾患を有する生物、例えばヒトまたは植物のウイルス荷重を測定することができ
る。意図された方法は、植物、例えばトウモロコシ、ダイズまたはライスの中の
外因性核酸配列の存在を同定するためにも使用することができる。意図された方
法は、食品、例えば肉、乳製品、およびフルーツジュース中の、Listeria monoc
ytogenes，Campylobacter種，Salmonella種，Shigella種またはEscherichia col
i（大腸菌Ｅ０１５７を含む）の存在に関してアッセイすることもできる。
【００７７】 本発明の方法における使用のための核酸プローブをデザインするのに有用な適
切な外因性核酸標的配列の測定は、当業者の範囲内である。遺伝子配列のデータ
ベース、例えばＧｅｎｂａｎｋを使用することにより、選択された核酸標的の唯
一性を確認することができる。ＰＣＲプライマーをデザインするための市販のソ
フトウエアを使用して、本発明における使用のためのプライマーのデザインを補
助することができる。
【００７８】 この発明の方法は、核酸サンプル中の少なくとも一つの予め決定された（公知
の）外因性核酸標的の存否を決定するために使用される。核酸標的は、標的にハ
イブリダイズするプライマーをデザインするためにその配列が公知でなければな
らないということにおいて「予め決定された」である。しかしながら、この発明
のプロセスに関して使用されるとおり、核酸標的配列は、その存在を決定される
ことが望まれる別の核酸の存在をシグナル化するためのリポーターとして単に作
用してよい。その目的の他の核酸は予め決定された配列を有する必要がない。さ
らに、本発明のプロセスは、プローブの３’末端領域における一部相補性を伴っ
て外因性標的にハイブリダイズするプローブをデザインするためのかろうじて十
分な配列が公知である場合に、標的内の塩基の同定を測定するのに有用である。
【００７９】 そのような方法は、核酸標的配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプ
ローブの３’末端を脱重合することができる酵素を利用することにより、標的配
列の存否を示す分析用出力としてその存否が次に決定され得る一つまたは複数の
同定用ヌクレオチドを脱重合条件下で放出する。
【００８０】 核酸標的配列は、その核酸標的配列に一部または全部相補なように核酸プロー
ブが提供されるように、予め決定される（あるいは公知である）。核酸標的配列
は核酸サンプルの一部であり、その標的がサンプル中に存在するならばプローブ
がハイブリダイズする。
【００８１】 上記方法の第１工程は、アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プロ
ーブと混合することである。第１工程の混合は、典型的には、ハイブリダイゼー
ション組成物を形成する低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件下で実施
する。そのようなハイブリダイゼーション組成物においては、核酸プローブの３
’末端領域が（ｉ）サンプル中に存在するかもしれない外因性核酸標的配列に一
部または全体の相補性をもってハイブリダイズし；そして（ｉｉ）３’末端領域
において同定用ヌクレオチドを含む。
【００８２】 好ましくは、核酸プローブは、プローブの３’末端領域の標的核酸へのハイブ
リダイゼーションを干渉するような様式において自身がヘアピン構造を形成する
ようにハイブリダイズしないようにデザインする。プローブデザインを導くパラ
メーターは当業界において知られている。
【００８３】 ハイブリダイゼーション組成物は、核酸プローブとハイブリダイズした少なく
とも一つの予め決定された核酸標的を含むかもしれない処理サンプルを形成する
のに十分な時間、ハイブリダイズ条件下で保持される。
【００８４】 アッセイされるサンプルがプローブのハイブリダイズする標的配列を含まない
事象においては、ハイブリダイゼーションが起こらない。本発明の方法を使用し
て特定の標的配列がアッセイされるサンプル中に存在するか不在であるか否かを
測定する場合、その結果の処理サンプルは本発明の酵素のための基質を含まなく
てよい。結果として、３’末端領域の同定用ヌクレオチドは放出されず、そして
分析用出力はバックグラウンドレベル付近である。
【００８５】 処理サンプルは、その活性が、核酸標的にハイブリダイズしたプローブの３’
末端領域から一つまたは複数の同定用ヌクレオチドを放出させることである酵素
の脱重合量と混合して、脱重合反応混合物を形成させる。上記のプロセスにおい
て使用される酵素の選択は、３’末端ヌクレオチドにおけるマッチまたはミスマ
ッチがその３’末端ヌクレオチドの放出をもたらすか否かを決定する。特定の酵
素反応条件に関するさらなる情報は本明細書において以後詳細に論じられる。
【００８６】 脱重合反応混合物は、上記酵素が、ハイブリダイズした核酸を脱重合してそこ
から同定用ヌクレオチドを放出させるのに十分な時間、脱重合条件したで保持さ
れて、処理反応混合物を形成する。
【００８７】 放出された同定用ヌクレオチドの存在または不在を次に測定することにより、
分析用出力を得る。分析用出力は、一つの核酸標的配列少なくとも一つの存否を
示す。
【００８８】 ハイブリダイゼーション条件は、様々な時間、ｐＨ値、温度、核酸プローブ／
標的の組み合わせ等についての対照サンプルについて経験的に確認することがで
きる。例示の持続時間および条件は、以後の特定の実施例において提供され、そ
して典型的には低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を反映す
る。実際上、適切なセットのハイブリダイゼーション条件と持続時間は与えられ
たセットのプローブに関して知られており、それらの条件を使用するアッセイは
核酸標的配列が存在するか否かについての正しい結果を提供する。典型的な持続
時間は約５から約６０分である。
【００８９】 ＰＣＲにおいてのＰＣＲプライマーの鋳型核酸へのハイブリダイゼーションに
関する条件および考察は、本発明のプロセスにおける核酸プライマーの標的配列
へのハイブリダイゼーションに適用可能である。そのようなハイブリダイゼーシ
ョン条件は、当業界においてよく知られており、そして核酸プローブおよび標的
核酸の配列［配列同一性（相同性）、長さおよびＧ＋Ｃ含有量］存在する核酸の
質量、塩含有量および他の可変物間の二本鎖Ｔｍを含む因子に依存する日常的実
験の問題である。
【００９０】 本発明のプロセスは感度がよく、そして低いストリンジェンシーのハイブリダ
イゼーション条件（例えば、０−４℃の温度）は十分であるが、中位のストリン
ジェンシー条件（４０−６０℃の温度）もハイブリダイゼーションを可能にして
受容可能な結果を提供する。これは、本発明のプロセスに関して真実である。
【００９１】 本発明の一つの意図された態様においては、その活性が、ハイブリダイズした
核酸を脱重合することによりプローブ３’末端エンドからヌクレオチドを放出す
ることである酵素は、鋳型依存性のポリメラーゼである。そのような態様におい
て、ポリメラーゼ反応の逆を使用することにより、核酸プローブを脱重合し、そ
して核酸プローブの３’末端のヌクレオチドがその核酸標的配列に完全に相補で
ある場合に、同定用ヌクレオチドが放出される。シグナルは、本発明のプロセス
により検出される核酸プローブに十分相補な配列を有する核酸標的配列の存在を
確認する。
【００９２】 ポリメラーゼ、例えばクレノーまたはＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（しかしこれ
ら２つの酵素に限定されない）の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する
態様においては、核酸プローブを脱重合するためには、核酸プローブの３’末端
残基がマッチせず、よって核酸プローブの３’末端がその核酸標的配列にほんの
一部相補である場合に、同定用ヌクレオチドが放出される。この態様においては
、バックグラウンドを最小にするために、脱重合酵素反応の前に、同定用ヌクレ
オチドを放出するかもしれない、アニールしなかった核酸からハイブリッドを精
製するのが典型的である。シグナルは、核酸プローブに完全に相補ではない核酸
標的配列の存在を確認する。
【００９３】 エキソヌクレアーゼＩＩＩの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して核
酸プローブを脱重合する態様においては、核酸プローブの３’末端残基が標的核
酸にマッチした場合に同定用ヌクレオチドを放出する。シグナルは、放出された
同定用ヌクレオチドにおいて相補な核酸標的の存在を確認する。
【００９４】 即ち、ハイブリダイゼーションおよび脱重合が同定用ヌクレオチドの放出を導
き得るかあるいはほとんどまたは全くそのようなヌクレオチドの放出を導き得な
いことも観察され、プローブ：標的が３’末端領域においてマッチするかまたは
ミスマッチするかに依存する。これは、使用する酵素の種類、エンドの種類、マ
ッチするかミスマッチするか、酵素が脱重合活性を必要とするかにも依存する。
【００９５】 規定された条件下での意図された分析用出力の規模は、放出された同定用ヌク
レオチドの量に依存する。同定用ヌクレオチドが放出される場合、バックグラウ
ンドより大きい値を有する分析用出力が提供され得る。標的配列が元のサンプル
中に存在しなかったためかまたは標的が存在する場合にプローブと選択された脱
重合酵素が３’末端ヌクレオチドの放出を提供しないために同定用ヌクレオチド
が放出されない場合、あるいは３’末端ヌクレオチドのマッチ／ミスマッチ状態
が、３’末端ヌクレオチドを放出するために使用された酵素のために要求される
状態にマッチしなかったならば、分析用出力は実質上バックグラウンドレベルに
ある。
【００９６】 本発明の意図された方法およびキットは、上で論じられたとおりに多くの応用
のために有用である。例えば、サンプル、しばしば生物学上のサンプルまたは医
学サンプルのみならず食品サンプル中の汚染（またはウイルス荷重）の存在また
は量を検出したい場合に、外因性核酸配列を検出することが望まれる。業界は、
広い種類のウイルス標的に関して有用な多くの配列を提供し、そしてより多くの
配列が発見されるにつれ、それらは同様にして本発明のプロセスにおいて有用で
ある。即ち、植物ウイルス、例えばタバコモザイクウイルスも意図される。例示
のウイルスプローブは以下のとおりである： サイトメガロウイルス配列プローブ： 配列番号８２ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCATGGGTGTAATATCAAAGTGGCA
TACACGAGCT 3’ 配列番号３５ 5’CACTTTGATATTACACCCATG 3’ ＪＨ６７ 5’TCACACAGGAAACAGCTATGACCATG 3’配列番号４１
Ｃ型肝炎ウイルスプローブ。 ＨＣＶ−１：5’CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGG 3’配列番号４３
ヒト免疫不全ウイルスプローブ。 １１８０８ 5’CCATTTAGTACTGTCT 3’配列番号５２ １１８１０ 5’CTAGTTTTCTCCATTT 3’配列番号５４ １１８１２ 5’TTCTCTGAAATCTACT 3’配列番号５６ １１８１４ 5’AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配
列番号５８ 以下は、様々な変異ウイルスに対して提供されるプローブの配列である。その
ようなプローブは、他の存在する病原体の間から特定の変異病原体の存在を識別
するのに有用である。 変異サイトメガロウイルス配列に対するプローブ。 ＣＶ２ 5’CACTTTGATATTACACCCGTG 3’配列番号３６ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCGTGAACGTGCTCATCGACGTGAACCCGCACAACGAGCT 3’
配列番号８３ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCACGGGTGTTAATATCAAAGTGGCATACACGAGCT 3
’配列番号８４ ガンシクロビル耐性サイトメガロウイルスプローブ： ＣＶ１１ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGACCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGA
GCGTCTGTTGGAGCT 3’配列番号１ ＣＶ１２ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGGTCTGCGAGCATTCG
TGGTAGAAGCGAGCT 3’配列番号２ ＣＶ１３ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGATCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGA
GCGTCTGTTGGAGCT 3’配列番号３ ＣＶ１４ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGATCTGCGAGCATTCG
TGGTAGAAGCGAGCT 3’配列番号４ 薬剤耐性ＨＩＶ乳製品対するプローブ。 １１８１５ 5’AAAAAAAACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配
列番号５９ １１８１６ 5’AAAAAAGACAGTACTAGATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配
列番号６０ １１８１７ 5’AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAATAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配
列番号６１ １１８１３ 5’TTCTCTGAAATCTATT 3’配列番号５７ １１８１１ 5’CTAGTTTTCTCCATCT 3’配列番号５５ １１８０９ 5’CCATTTAGTACTGTTT 3’配列番号５３ 他の外因性核酸、例えば汚染細菌から生ずる外因性核酸の存在は、本発明のプ
ロセスにおいて有用である。例は以下の細菌プローブである。 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉａｐに対するプローブ。 ＬＭ１ 5’GAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAA
CTCCAGTAG 3’配列番号９ ＬＭ２ 5’CTACTGGAGTTTCTTTCGTTTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTGCTTGTGTAGTTTG
TTTTACTTC 3’配列番号１０ ＬＭ３ 5’GCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAA 3’配列番号１１ ＬＭ４ 5’TTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTCG 3’配列番号１２ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｈｙｌのためのプローブ。 ＬＭ５ 5’CATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGA
GAAACACCA 3’配列番号１３ ＬＭ６ 5’TGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCGCCTTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAGGTTG
CCGTCGATG 3’配列番号１４ ＬＭ７ 5’CTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAA 3’配列番号１５ ＬＭ８ 5’TTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAG 3’配列番号１６ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのためのプローブ。 ＳＴ３ 5’TGTGTAATGAAAGAAATCACCGTCACTGAA 3’配列番号１９ ＳＴ４ 5’TTCAGTGACGGTGATTTCTTTCATTACACA 3’配列番号２０ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに対するプローブ。 １１４５３ 5’CTTGAAGCATAGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTGAGCCGCTTGAGTTGCCT
TAGTTTTAATAGT 3’配列番号３１ １１４５４ 5’ACTATTAAAACTAAGGCAACTCAAGCGGCTCAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGA
ACTATGCTTCAAG 3’配列番号３３ １１４５１ 5’AGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTG 3’配列番号３２ １１４５０ 5’CAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGAACT 3’配列番号３４ 典型的には挿入された遺伝子のための単なるマーカーとして取り込まれた外因
性遺伝子の存在を検出することは、しばしば望まれる。古典的な生物学の技術は
、所望の挿入された外因性核酸配列を有するクローンを選択するための抗生物質
耐性の取り込みを含む。抗生物質耐性遺伝子も外因性遺伝子である。外因性「マ
ーカー」遺伝子の配列は、当業界においてよく知られており、当業界の研究者に
は容易に利用される。本発明の方法およびキットにおけるプローブとして有用な
そのような配列の例示される配列は、以下のとおりである。 カナマイシン耐性を細菌に付与する遺伝子に関するプローブ。 5’GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTC 3’配列番号２１ 5’GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTG 3’配列番号２２ 5’GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTA 3’配列番号２３ 5’GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTT 3’配列番号２４ 5’GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTC 3’配列番号８５ 生化学の分野において外因性遺伝子に関する生物学マーカーとして一般に使用さ
れるβガラクトシダーゼ遺伝子に対するプローブ。 5’CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 3’配列番号２９ 5’ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTG 3’配列番号３０ マーカーとして使用されることが必然ではないが、外因性外来マーカーは、本
発明の方法およびキットに有用である。これは以下の実施例においてさらに論じ
られるが、特に遺伝学上修飾された生物体に関して論じられる。いくつかの例示
的な共通の外因性配列は、以下の生物体の遺伝子操作の間にしばしば導入される
。
【００９７】 外因性植物遺伝子を挿入する際に、生物工学において一般に使用される植物３
５Ｓプロモーターのためのプローブ。 １１２１１ 5’GCAAGTGGATTGATG 3’配列番号４８ １１２１０ 5’CCAACCACGTCTTCAAA 3’配列番号４９ 外因性植物遺伝子を挿入する際に、生物工学において一般に使用される植物ＮＯ
Ｓターミネーターのためのプローブ。 １１２１２ 5’TTTATGAGATGGGTTT 3’配列番号５０ １１２１３ 5’ATGATTAGAGTCCCG 3’配列番号５１ 本発明の一つの態様において、ウイルス荷重、存在するウイルスの量は、予め
決定された量の生物学上のサンプル、例えば動物体液または組織からの分析出力
の規模から測定される。本発明のプロセスは定量性であり感度が極めてよい。予
め決定された外因性核酸標的配列からのシグナルを増幅された予め決定されたリ
ポーター配列に変換することによるかまたは放出された同定用ヌクレオチドから
のシグナルの増幅により、予め決定された外因性核酸標的配列中のサンプルを増
強する工程を含む本発明のプロセスの使用を通して、感度はさらに増強される。
以下のウイルス荷重の例において、標的配列はＲＴ−ＰＣＲを通してサンプル中
で富裕化される。
【００９８】 上記方法の一つの側面において、予め決定された核酸標的配列は、遺伝子治療
の目的のためにサンプル中に存在する。例示の遺伝子治療の態様は、動物、好ま
しくはヒトまたは一般に飼育される動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はチキンに対しての外因性遺伝子の供給においてであり、フェニルケトン尿症ま
たはアデニンデアミナーゼを欠く患者における場合のように、紛失した遺伝子を
作成する。
【００９９】 当業界の研究者は、本発明のプロセスおよびキットがアッセイのために特別に
意図されるあらゆる予め決定された配列と共に有用であることを認識する。その
ような研究者は、予め決定された配列に相補な核酸プローブを構築することのみ
を必要とする。即ち、本発明は、導入された遺伝子を検索することにより植物、
典型的には農作物への遺伝子操作の成功を測定するのに有用である。同様に、交
雑種の盛大に導入されることを目的とする遺伝子が核酸標的の場合、植物の育種
の成功は本発明のプロセスを使用して監視される。
【０１００】 当業者は、１９９９年７月２１日に出願された親出願、米国連続番号第０９／
３５８，９７２号に開示された発明を使用して特定の方法のためのあらゆる所望
のプローブを構築することが可能なことを認識する。（この出願は米国特許出願
連続番号０９／３５８，９７２の一部継続出願であり、その開示は引用により編
入され、そしてhttp://www.promega.com/pt/pend/093538972.pdfにてインターネ
ット上で公表される。） 一つの態様において、核酸標的配列中の質問の位置の特定の塩基の正体が決定
される。これは、遺伝しないの特定の変異の存否の決定のために有用である。そ
のような変異遺伝子の例は上記に掲載されており、例えば耐性ＨＩＶ、またはガ
ンシクロビル耐性ＣＭＶである。 脱重合 脱重合反応およびそのような反応に有用な酵素は以下に論じられる。核酸ポリ
メラーゼは通常核酸鎖の伸長を触媒する。該反応は各ヌクレオチドが加えられる
と共にピロリン酸を分解することにより進む。各ヌクレオシド−５’の３リン酸
はリボースまたはデオキシリボースの糖の５位の炭素に連結した３つのリン酸基
を有する。ヌクレオチドの伸長する核酸への付加はヌクレオシド間のホスホジエ
ステル結合の形成をもたらす。この結合は、リボースまたはデオキシリボースの
３位の炭素への３’結合およびリボースまたはデオキシリボースの５位の炭素へ
の５’結合を有することを特徴とする。各ヌクレオチドは新たな３’または５’
の結合の形成を通して加えられ、そして核酸鎖は５’から３’の方向に向かって
伸長する。
【０１０１】 そのもっとも厳格な意味での脱重合は、本コンテクストにおいて、ピロリン酸
とポリメラーゼ酵素の存在下で２つの３’末端塩基間でヌクレオチド間のホスホ
ジエステル結合が破壊される事により、一つのより短いヌクレオチドとヌクレオ
シド３リン酸である核酸を形成する、重合の逆を意味する。いくらかより包囲的
な定義が本明細書においては意図される。その定義によると、３’末端のヌクレ
オチドは酵素により触媒される反応において核酸から除去されるが、形成された
ヌクレオチドは１リン酸であることができ、そしてピロリン酸は必ずしも要求さ
れない。
【０１０２】 前者の反応（即ち、重合の逆）は本明細書においてはピロリン酸分解反応と呼
ばれ、そして後者のより包囲的な定義の反応はエキソヌクレアーゼ反応と呼ばれ
る。本発明における目的の脱重合反応は、核酸プローブの３’末端領域において
生じるその脱重合である。この脱重合反応は、本明細書において論じられるとお
り、適切な脱重合条件下で同定用ヌクレオチドを放出する。
【０１０３】 脱重合反応およびそのような反応において有用な酵素は、１９９９年７月２１
日に出願された親出願、米国連続番号第０９／３５８，９７２号において論じら
れており、開示を引用により編入する。
【０１０４】 Ａ．ピロリン酸分解 本発明のいくつかの態様においては、ピロリン酸またはその類似体中の末端の
ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を酵素により分割することにより３’末
端ヌクレオチドにおいて核酸（ＮＡ）を脱重合することによりＸＴＰ（例えば、
ＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓ）を形成することからなる方法は、５’突出を有する
二本鎖ＤＮＡ上における以下の反応により例示される： ５’．．．ＴｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴ−３’ＯＨ ３’．．．ＡｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ↓酵素＋ＰＰｉ ５’．．．ＴｐＡｐＣｐＧｐ−３’ＯＨ ３’．．．ＡｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ＋ｄＧＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｄＴＴＰ。
【０１０５】 ピロリン酸分解可能な鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、限定されないが、ＤＮ
Ａポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｎｅ３重変異ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリ
メラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ，クレノー断片、クレノーｅｘｏマイナス（ｅｘｏ−
）、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびＭＭＬＶ逆転写酵素、および
ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む。
【０１０６】 もっとも好ましくは、クレノーｅｘｏマイナス（クレノーｅｘｏ−）またはＴ
ｎｅ３重変異ポリメラーゼを、５’突出ＤＮＡエンドのそれらの有効な利用のた
めに、ＤＮＡピロリン酸分解反応に利用する。
【０１０７】 ポリメラーゼ活性の逆の場合の好ましい態様において（ピロリン酸分解）、好
ましい基質は、その３’末端において完全な相補性を有する外因性核酸標的配列
にハイブリダイズしたＤＮＡプローブであり、３’末端領域中の同定用ヌクレオ
チドを含む。この好ましい態様において、核酸プローブを、核酸プローブの３’
末端ヌクレオチドにおいて１塩基のミスマッチを有するような外因性核酸標的配
列にハイブリダイズさせる場合、核酸プローブは逆重合反応を通して非効率的に
脱重合される。即ち、そのような基質は脱重合のための理想的な基質ではない。
【０１０８】 重合反応の逆を通しての脱重合のための基質の理想的でないことは、核酸プロ
ーブの３’末端から約１０残基の範囲での単一の塩基ミスマッチにより認識され
る。プローブの３’末端から１２残基目の単一の塩基ミスマッチを用いると、ミ
スマッチがなくて、且つ核酸プローブが核酸標的配列に完全に相補な場合とほぼ
同じ程度で脱重合反応がおこり得る。
【０１０９】 即ち、脱重合反応の反応性は基質の効率に関係のある連続性であることが意図
される。一部相補なハイブリッドは、重合反応の逆のために完全に相補なハイブ
リッドよりも低い効率の脱重合基質である。この異なる反応性は、特定の位置（
例えば、質問位置）においてマッチまたはミスマッチの間の差異を高めるのに使
用されることが意図される。基質ハイブリッドが完全に相補である場合、見事に
高い分析出力をあたえることになる。ミスマッチは、基質ハイブリッドを不安定
化するのに意図的に導入することができる。そのような不安定化は、塩基位置を
不安定化することとは異なる、質問位置において置換された塩基間の分析出力に
おける差異を増加させることができる。
【０１１０】 いくつかの化学化合物がピロリン酸分解反応においてピロリン酸を代用できる
ことが当業界において知られている。Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：６４５−６５０（１９８４）。
【０１１１】 分析される各核酸ポリメラーゼのバッファーを含めて、ピロリン酸分解により
脱重合するための好ましい反応混合物および時間（脱重合条件）は、実施例にお
いて極めて詳細に説明される。典型的には、これらの条件下では、極めて低量の
核酸（例えば、約５−１０００ピコグラム）を正確に検出またはアッセイするた
めに、十分なＮＴＰまたはｄＮＴＰが放出される。分析前に（ＡＤＰの存在下で
）ＮＤＰＫのような酵素によりＸＴＰから変換されることによりＡＴＰが生成で
きるか、または分析前にＡＴＰはさらに精製できる。
【０１１２】 高い効率のピロリン酸分解反応は予測されず、そしてはるかに高い量のＤＮＡ
を用いて実施される以前のＤＮＡピロリン酸分解の研究とは対照的に、極めて低
いレベルのＤＮＡ基質に連合するらしい。
【０１１３】 別々の核酸ポリメラーゼのピロリン酸分解活性も多様である。例えば、Ｔ４ポ
リメラーゼとＴｎｅのＤＮＡポリメラーゼは、ピロリン酸分解により生成される
ＡＴＰに関するルシフェラーゼアッセイにより測定したところ、極めて高いピロ
リン酸分解活性を有する。Ｔ４ポリメラーゼを使用したピロリン酸分解は、ＭＭ
ＬＶ−ＲＴに比して約１０倍の光生産の増加をもたらし、そしてＴａｑポリメラ
ーゼに比して約４倍の光生産をもたらした。
【０１１４】 制限酵素消化によりもたらされるＤＮＡエンドの種類も、別々の核酸ポリメラ
ーゼのピロリン酸分解活性に影響する。例えば、クレノーｅｘｏ−、ＭＭＬＶ−
ＲＴおよびＴａｑポリメラーゼは、５’突出および平滑エンドのＤＮＡ断片のピ
ロリン酸分解を触媒するが、３’突出にはほとんどあるいは全くピロリン酸活性
を有さない。対照的に、Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼは３’突出のハイブリッドの
ピロリン酸分解の好ましい酵素である。他の核酸ポリメラーゼを制限酵素処理さ
れたＤＮＡ断片のピロリン酸分解に利用する場合、ポリメラーゼの末端特異性に
、制限エンドヌクレアーゼにより創製されたエンドの種類をマッチさせることに
注意を払うことを熟慮する。そのような注意は当業者には容易である。
【０１１５】 さらに、ピロリン酸分解反応に使用されるポリメラーゼの種類を正確な核酸基
質に適合させることにより、最良の結果を生じさせることも熟慮される。通常、
ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素はＤＮＡを脱重合するのに好ましいが、Ｒ
ＮＡポリメラーゼはＲＮＡを脱重合するのに好ましい。逆転写酵素または逆転写
活性を有するＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを脱重合するの
に好ましい。
【０１１６】 祖父出願においては、驚くことに、そのような反応が以前に報告されていない
にも拘わらず、ポリ（Ａ）ポリメラーゼがピロリン酸分解を触媒できることが証
明された。事実、ポリ（Ａ）ポリメラーゼはピロリン酸分解を触媒しない事が広
く報告されていた。（例えば、Ｓｉｐｐｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３７：３１−４０（１９７３）およびＳａｎｏ ａｎｄ Ｆｅｉｘ，Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１：５７７−８３（１９７６）を参照）。しかしながら
、祖父出願に用いられた開示と上記文献に用いられた条件の間には多くの違いが
ある。祖父出願において開示された発明の好ましい態様においては、以前に報告
されたバッファー中に存在した塩化マンガンが除かれており、塩化ナトリウムの
濃度が減少しており、そしてｐＨ値が約８．０から約７．５に低くなっている。
さらに、ポリ（Ａ）ポリメラーゼのピロリン酸分解反応のバッファーは約５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，および２ｍＭ Ｎａｐｐｉ（ピロリン酸ナトリウム）を含む。
【０１１７】 脱重合反応は重合反応の逆反応であることに注目することは重要である。よっ
て、増加量の遊離のヌクレオシド３リン酸が脱重合により報告されるとおり、重
合反応と脱重合反応のバランスがとれた平衡状態が理論上達成できる。あるいは
、少量の核酸を検出する場合、平衡に到達することなく反応が本質的に完了し得
る（即ち、核酸標的が５０％より多くその構成的サブユニットヌクレオチドに脱
重合される）。この因子が定量アッセイにおいて重要なのは、放出されたヌクレ
オチド全量が検出アッセイにおいて生じるシグナルの量に比例するからである。
【０１１８】 核酸の定性検出に使用される場合、ヌクレオチドの閾値レベルが生じる限り、
反応が平衡に到達することあるいは本質的に完了することは必要でない。好まし
い態様において、脱重合により生成されるヌクレオシド３リン酸分子の混合物は
以下に記載されるとおりＡＴＰに変換されることが好ましい。定量性または定性
性検出の何れかのたねには、１００μｌのサンプル中約１Ｘ１０-12モルの検出
可能な閾値ＡＴＰ濃度が典型的なルシフェラーゼアッセイの光検出に関して提供
されることが好ましい。
【０１１９】 いくつかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブは典型的には
２０μＬ脱重合反応あたり約１００ｎｇから約１μｇにて提供される。その量は
、約２００：１から約１，０００：１のプローブ対標的質量比を提供する。
【０１２０】 本発明の好ましい態様においては、核酸ポリメラーゼおよびピロリン酸（ＰＰ
ｉ）またはそれらの類似体を、約１００μｇ未満の標的核酸から約１０ｐｇ未満
の核酸を含むハイブリダイズサンプルに加える。典型的な標的核酸は、アッセイ
されるサンプル中約１から約５ｎｇにて存在し、約３０から約１０００ｂｐの長
さの標的核酸が好ましい。
【０１２１】 ５’突出基質を利用する酵素を使用する場合、標的核酸の３’エンドは核酸プ
ローブの５’エンドを超えて伸長することが好ましい。この様式においては、５
’突出基質のみが、標的核酸の５’が核酸プローブの３’末端領域の上に突出す
る基質である。脱重合を核酸プローブに限定する別の方法は、サンプル中の他の
核酸のエンドの化学修飾、例えば標的核酸の３’末端のホスホロチオエート結合
の作成である。
【０１２２】 脱重合酵素は、ハイブリダイズした標的：プローブを脱重合するのに十分な量
にて存在することが好ましい。その量は、使用される酵素、脱重合温度、バッフ
ァー等により変更可能であり、当業界においてよく知られている。２０μＬの容
量にて実施される典型的な反応に関しては、約０．２５から約１ユニット（Ｕ）
の酵素、例えばクレノーｅｘｏ−を使用する。約１から約５Ｕの耐熱性酵素は、
上昇させた温度において脱重合するのに使用される。
【０１２３】 ルシフェラーゼは好ましいＡＴＰ検出系の一部であり、ＰＰｉにより阻害され
る。好ましい態様においては、高い阻害量のＰＰｉをＡＴＰ検出系に移すことを
回避するように注意が払われる。好ましくは、ＡＴＰ検出系に持ち越されるＰＰ
ｉの量は、約１００μＭ未満のルシフェラーゼ検出反応中のＰＰｉ濃度をもたら
すが、１０μＭ未満が望ましい。よって、ピロリン酸分解反応において利用され
るＰＰｉの量は、ルシフェラーゼ検出系における使用のために採られるアリコー
トのサイズにより決定される。アリコートのサイズは使用される試験系に依存し
て変更可能であるが、ルシフェラーゼ検出系に移されるかまたは持ち越されるＰ
Ｐｉの量は上記のＰＰｉ濃度パラメーターに相当し、それによりＰＰｉ濃度は少
なくとも約１００μＭ未満、そして好ましくは約１０μＭ未満であることが意図
される。
【０１２４】 発明の一つの好ましい態様において、その活性が脱重合することである酵素は
鋳型依存性ポリメラーゼである。脱重合反応は、重合反応の逆である。意図され
た態様において、重合反応は、ピロリン酸分解と呼ぶ反応においてピロリン酸の
存在下で逆転する。
【０１２５】 いくつかの好ましい態様において、反応条件は、その標的核酸配列よりも高い
濃度の核酸プローブを用意することにより、その標的核酸配列にハイブリダイズ
した核酸プローブのさらに好都合の脱重合に適合させることが好ましい。
【０１２６】 プローブ：標的ハイブリッドの脱重合を好都合にする一つの戦略は、二本鎖標
的核酸を変性した後のハイブリダイゼーション工程においてプローブが核酸標的
よりもモル過剰で存在することである。
【０１２７】 プローブ：標的ハイブリッドの脱重合を好都合にするための別の戦略は、プロ
ーブが相補な核酸標的の鎖のみを単離することである。この目的を達成するため
に使用できるいくつかの技術が存在する。
【０１２８】 そのような技術の一つにおいて、ホスホロチオエート結合は、プライマー配列
を増幅する標的核酸の５’末端、例えば１から約１０の５’のほとんどの残基に
おいて利用される。標的のＰＣＲ増幅において、プライマーのホスホロチオエー
ト結合は相補鎖の一対の一つの一部として増幅した標的核酸に取り込まれること
になる。Ｔ７ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ６による二本鎖の結果分子の処理
は、非ホスホロチオエート含有鎖を除去する。
【０１２９】 別の技術において、鎖の単離は、標識されていない伸長核酸鎖（本明細書にお
いて有用な核酸プローブはハイブリダイズするようにデザインされる）に取り込
まれたＰＣＲプライマーを使用して標的核酸を増幅することにより実施すること
ができ、一方、相補鎖のためのプライマーは例えばビオチンにより標識される。
次に、増幅された核酸は変性されて、支持体に結合したストレプトアビジンに加
えられる。有用な材料はストレプトアビジンＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標
）両磁性体粒子（プロメガ、Ｚ５４８Ａ）であり、磁石を使用することによりそ
のビオチン化相補鎖から望む標的核酸鎖を分離することができる。ピロリン酸分
解に関するさらなる議論は、上記引用の親出願に見いだされ、引用により編入さ
れる。 Ｂ．エキソヌクレアーゼ消化 本発明の他の態様において、末端のヌクレオシド間ホスホジエステル結合を酵
素により分断して３’末端ヌクレオチドにおいて核酸を脱重合することにより、
ＸＭＰを形成する方法は、５’突出を有する二本鎖ＤＮＡ上の以下の反応により
例示されるとおりである。
【０１３０】 ５’．．．ＧｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＴ−３’ＯＨ ３’．．．ＣｐＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ↓酵素 ５’．．．ＧｐＣｐＴｐＡ−３’ＯＨ ３’．．．ＣｐＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ＋ｄＡＭＰ＋ｄＧＭＰ＋ｄＴＭＰ。
【０１３１】 例えば、そのような加水分解反応はクレノーまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ
により触媒され得る。 いくつかの態様において（例えば、核酸の定量アッセイ）、本質的には完了ま
で、あるいは検出感度を増加させるために最少３つのヌクレオチドの鎖から少な
くとも２つのヌクレオチド分子を得るために平衡まで、脱重合工程を繰り返す。
別の態様において、（例えば、ＤＮＡの定性検出）、シグナルを生じるために存
在する核酸分子が十分存在するならば、脱重合工程を繰り返す必要はない。
【０１３２】 本発明の別の態様において、以下の反応： 反応１：ＮＡn＋Ｈ2Ｏ→ＮＡn-1＋ＸＭＰ に従うエキソヌクレアーゼ消化により、末端ミスマッチのハイブリダイズ核酸プ
ローブを最初にＮＭＰまたはｄＮＭＰに脱重合するが、式中、ＮＡnは核酸、Ｘ
ＭＰはｄＮＭＰまたはＮＭＰ、そしてｎは上記核酸中のヌクレオチドの数である
。
【０１３３】 この脱重合反応は、５’突出およびその３’末端のミスマッチ塩基を有する二
本鎖ＤＮＡ上の以下の反応において下により特定して示す。 ５’．．．ＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＣ−３’ＯＨ ３’．．．ＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ↓酵素 ５’．．．ＣｐＴｐＡｐＡｐＧ−３’ＯＨ ３’．．．ＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ−５’ ＋ｄＣＭＰ。
【０１３４】 例えば、そのような脱重合反応はバクテリオファージＴ４のポリメラーゼによ
りＮＴＰｓ不在下で触媒され得る。好ましい態様において、放出されたヌクレオ
チド、ＸＭＰｓはヌクレアーゼ消化により生成される。
【０１３５】 ヌクレアーゼ消化は、５’リン酸を有するヌクレオチドを放出する様々なヌク
レアーゼにより達成することができ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢａｌ３
１，マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびリボヌクレア
ーゼＨを含む。ヌクレアーゼ消化の条件およびバッファーは当業界において知ら
れている。それらの使用のためのヌクレアーゼおよびバッファーは市販されてい
る。
【０１３６】 プリンおよびピリミジン１ヌクレオチドの生合成において、ホスホリボシル−
１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）が必須のリボース−５’リン酸ドナーである。ＰＲ
ＰＰ自体は、ＡＴＰからリボース−５’リン酸へのピロリン酸の転移を通してＰ
ＲＰＰシンセターゼにより触媒される反応において形成される。この反応はＳａ
ｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１１９３−９５（１９８４
）において記載されるとおりに可逆性であることが知られている。
【０１３７】 本発明のいくつかの態様において、ヌクレアーゼ消化により生成されたＮＭＰ
またはｄＮＭＰは以下の反応により酵素ＰＲＰＰシンセターゼによりＮＴＰまた
はｄＮＴＰに直接変換されることが好ましい。
【０１３８】 反応２：ＸＭＰ＋ＰＲＰＰ→ＸＴＰ＋リボース−５’ＰＯ4 （式中、ＸＭＰはＡＭＰまたはｄＡＭＰの何れか、そしてＸＴＰはＡＴＰまたは
ｄＡＴＰの何れかである。）。好ましくは、この反応は１００μｌサンプル中約
１Ｘ１０-12Ｍの閾値ＡＴＰ濃度を生じる。
【０１３９】 この反応において、ＰＲＰＰのピロリン酸基は酵素によりＸＭＰ分子に転移さ
れてＸＴＰ分子を形成する。適切な反応条件およびバッファーの例は、本明細書
において以前にどこかで記載された。
【０１４０】 本発明の核酸検出系におけるＰＲＰＰ反応の利用は、以前に報告された方法を
超える利点を有する。例えば、ＡＭＰまたはｄＡＭＰをＡＴＰまたはｄＡＴＰに
変換するためにほんの１工程しか必要とせず、それにより検出系が単純化される
。さらに、本発明の方法を用いると、外因性のＡＴＰ，ＡＤＰまたはＡＭＰによ
る検出系の汚染が以前に報告された方法に比べて起こりにくい。
【０１４１】 脱重合酵素が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を呈する態様においては、基
質は３’ヒドロキシル末端を有する二本鎖または一本鎖核酸である。本発明のプ
ロセスにおいて有用な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩ，クレノー断片およびバクテリオファージＴ４のＤＮＡ
ポリメラーゼを含む。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩホロ酵素は本発明のプロセス
において好ましくないが、３’末端におけるハイブリダイゼーションの程度に拘
わらずプローブ：標的ハイブリッドを分解する５’→３’エキソヌクレアーゼ活
性を回避することが好ましいからである。バクテリオファージλのエキソヌクレ
アーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のみを有するから、意図された酵素
ではない。同様に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは極めて低いレベルの３’→５
’エキソヌクレアーゼ活性しか有さない。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩ
ＩＩ）は平滑末端基質または５’突出あるいは３’ヒドロキシル基におけるニッ
クを有する基質に対して３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、そして即ちマッチ
した３’末端ヌクレオチドとのハイブリッドを脱重合するための本発明のプロセ
スにおいて有用である。しかしながら、ＥｘｏＩＩＩはごく部分的な相補性３’
末端しか有さないハイブリッドには限定されず、二本鎖エンドを必要とし、即ち
マッチした末端ヌクレオチドを必要とする。
【０１４２】 酵素活性が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性である場合の本発明の態様にお
いて、ハイブリダイズした核酸プローブはその３’末端ヌクレオチドから脱重合
される。ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の場合の好ましい態
様において、好ましい基質は、好ましくは、その３’末端領域において部分相補
性をもって外因性核酸標的配列にハイブリダイズした核酸プローブであり、もっ
とも好ましくは、同定用ヌクレオチドである３’末端領域においてミスマッチを
有するものである。
【０１４３】 意図された方法は、多数のプローブを利用することにより、多数の予め決定さ
れた外因性核酸配列がサンプル中に存在するかまたは不在であるかを決定する、
複合アッセイ環境において特に有用である。そのような複合アッセイのための特
に有用なエリアは、通常の分析用出力が必要とされている外因性遺伝子は不在で
あることを示すスクリーニングアッセイにおいてである。
【０１４４】 一つの例示の態様において、核酸サンプルは予め決定された複数の外因性遺伝
子、例えば生物学上のサンプル中のウイルスの存在に関してスクリーンする。こ
の態様において、ウイルスは通常は存在し得ず、そして分析用出力は、例えばそ
の外因性核酸を有するウイルスが存在する場合を除いてほぼバックグラウンドレ
ベルである。
【０１４５】 別の態様において、複数のサンプルを微生物特異的遺伝子の存否に関して試験
する。ここでは、再び、健康な個体、動物、またはおそらくは無菌の食品の集団
をサンプルする場合に、必要とされる外因性遺伝子の不在がほぼバックグラウン
ドレベルの分析用出力を提供し、そして微生物の汚染の稀な例でしかバックグラ
ウンドより大きな出力が出現しない。
【０１４６】 上記のプロセスの複合化された態様において、サンプルは複数の異なる外因性
核酸プローブと混合し、そしていくつかの態様においては複数の核酸標的の増幅
の後であることが要求される。本発明のこの態様において、プローブの一つを用
いた特定の結果に関する分析用出力は、プローブ全てを用いた反対の結果からの
分析用出力と識別可能である。
【０１４７】 好ましい態様において、ＡＤＰ存在下における放出ヌクレオチドからのＮＤＰ
Ｋ変換を通して生成されたＡＴＰは、ルシフェラーゼ検出系またはＮＡＤＨ検出
系により検出される。本発明のさらに別の態様においては、ピロリン酸転移工程
およびリン酸転移工程を単一のポット反応において実施する。別の好ましい態様
において、感度の増加を必要とするならば、ＡＴＰ分子を増幅することができる
。 分析用出力 分析用出力は、放出された同定用生成物、放出されたヌクレオチドまたはプロ
ーブの残りの何れかの検出により得られる。例示の検出系は、光放射ルシフェラ
ーゼ検出系、ＮＡＤＨ光吸収検出系（ＮＡＤＨ検出系）、蛍光放射および質量分
光分析を含む。これらの検出系は本明細書中にて以下に論じられる。
【０１４８】 ヌクレオチドを放出した事実（定性測定）、または放出されたヌクレオチドの
数でさえ（定量測定）、脱重合後にプローブの試験を通して推定することができ
る。オリゴヌクレオチドのサイズの測定は当業界において知られている。例えば
ゲル分離およびクロマトグラフィー分離はよく知られている。ゲルイメージング
技術は、蛍光および吸光分光測定並びにラジオグラフ法が有利である。オリゴヌ
クレオチドの質量分光測定もより一般的になりつつある。
【０１４９】 Ａ．発光分光測定 ルシフェラーゼ検出系はＡＴＰを検出するために特に有用である。ＡＴＰおよ
び酸素の存在下では、ルシフェラーゼがルシフェリンの酸化を触媒して、ルミノ
メーターを用いて後で定量可能な光を生じる。上記反応の追加の生成物はＡＭＰ
、ピロリン酸およびオキシルシフェリンである。
【０１５０】 特に好ましい態様においては、Ｌ／Ｌ試薬と呼ぶＡＴＰ検出バッファーを利用
する。好ましくは、約５から１０ｎｇのルミノメーターを反応に用いる。本発明
は特定の濃度のルミノメーターに限定することを意図しないが、大量のルミノメ
ーターは非得意的バックグラウンドを増加させる傾向を有する。
【０１５１】 いくつかの態様においては、ピロリン酸分解またはヌクレアーゼ消化により生
成されるｄＮＴＰｓまたはＮＴＰｓは次に直接ルシフェラーゼの基質として使用
可能であり、核酸を検出を可能にすることが意図される。しかしながら、ルシフ
ェラーゼの好ましい基質はＡＴＰであり、Ｍｏｙｅｒ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓ
ｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１：１８７−８９（１９８３）により
証明されるとおりである。ＤＮＡが最初の物質である場合、ｄＮＴＰｓのＡＴＰ
への変換を触媒するためにはＮＤＰＫが都合よく利用され、以下の一般式による
。 反応３：ｄＮＴＰ*＋ＡＤＰ→ｄＮＴＰ＋ＡＴＰ* （式中、ｄＮＴＰはデオキシリボヌクレオシド３リン酸の混合物であり、そして
ｄＮＴＰは対応するデオキシリボヌクレオシド２リン酸である。）。反応３にお
いては、ｄＮＴＰの末端の５’の３リン酸（Ｐ＊）をＡＤＰに転移して、ＡＴＰ
を形成させる。
【０１５２】 この反応を触媒する酵素はヌクレオシド２リン酸キナーゼ（ＮＤＰＫｓ）とし
て一般には知られる。ＮＤＰＫｓは偏在し、比較的に非特異性の酵素である。Ｎ
ＤＰＫの総説に関しては、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ｐ．Ｂｏ
ｙｅｒ Ｅｄ．（１９７３）中のＰａｒｋｓ ａｎｄ Ａｇａｒｗａｌを参照さ
れたい。
【０１５３】 ＮＤＰＫによるＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓのＡＴＰへの変換は、ＮＤＰＫおよ
び、ピロリン酸分解またはヌクレアーゼ消化により生成されることが予測される
ＮＴＰｓまたはｄＮＴＰｓの量を超えるモル過剰なＡＤＰを加え、次にＰＲＰＰ
シンセターゼによるピロリン酸分解により達成することが好ましい。ＡＤＰの利
用は加えたＡＤＰの量の最適化を必要とする。過剰なＡＤＰは高いバックグラウ
ンドレベルをもたらす。
【０１５４】 いくつかの生物源からのＮＤＰＫ（ＥＣ ２，７，４，６）調製物はいくつか
の供給者から市販されている。例えば、酵母のＮＤＰＫはシグマケミカル社、セ
ントルイス、ＭＯから市販されており、ウシのＮＤＰＫはＩＣＮバイオケミカル
ズ社、コスタメサ、ＣＡから市販されている。本明細書において記載されたほと
んどの用途のために選択される特定のＮＤＰＫは典型的には選択の問題である。
【０１５５】 Ｔｎｅ３重変異ＤＮＡポリメラーゼは詳細にＷＯ ９６／４１０１４に記載さ
れており、その開示は引用により編入され、そしてその６１０残基のアミノ酸配
列はその書類の配列番号３５として提供される。その酵素はＷＯ ９６／４１０
１４においてＴｎｅ Ｍ２８４（Ｄ３２３Ａ，Ｄ３８９Ａ）と呼ばれる。
【０１５６】 簡単に言えば、その酵素は耐熱性ユーバクテリアのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎ
ｅａｐｏｌｉｔａｎａ（ＡＴＣＣ ４９０４９）によりコードされるポリメラー
ゼの３重変異体である。天然配列のアミノ末端の２８３残基を欠失しており、天
然配列の３２３および３８９位のアスパラギン酸が、この組換え酵素においては
アラニンに置換されている。この組換え酵素は即ち天然酵素の欠失並びに置換変
異体である。
【０１５７】 アミノ末端配列の欠失は天然酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を取り除き、
２つのアスパラギン酸残基の置換はその存在がエンドヌクレアーゼヌクレアーゼ
活性を促進するマグネシウム結合部位を取り除き、そしてこの３重変異体も組換
え天然酵素に比して３’エキソヌクレアーゼ活性を呈さなかった。この３重変異
体酵素は、その温度においてたった５分間の半減期しか呈さない完全長の組換え
酵素に比して９７．５℃において６６分の半減期を呈した。
【０１５８】 ＮＤＰＫを含む反応は約０．０１から０．５０μＭ、好ましくは約０．０５μ
ＭのＡＤＰを含む。様々な有用なバッファーおよび他の反応成分がどこかに記載
される。ＮＤＰＫはそれ自体ＡＤＰからＡＴＰへの所望の変換を触媒するのに十
分な量にて存在する。２０μＬの脱重合反応から開始する典型的なアッセイにお
いて、約０．１ＵのＮＤＰＫを使用する。
【０１５９】 大きな容量の反応物を使用する場合、標的とプローブの濃度はほぼ比例して大
きくなり、そしてＮＤＰＫまたは本明細書にて論じられた他の酵素の量は、２０
μＬ反応に関して論じられた量に比例して同様に大きくして使用することができ
る。事実、２０μＬ反応は約２倍スケールダウンすること、および約２０の係数
によりスケールを上げることに成功した。
【０１６０】 Ｂ．質量分光分析 発明の一つの方法において、放出されたヌクレオチドの存在は質量分光分析を
用いて分析される。質量分光分析を使用する方法の態様において、処理された反
応混合物は、放出された同定用ヌクレオチドの分子量範囲において処理反応混合
物の全ての成分が測定されるような様式にてイオン化される。分子量のきわめて
小さい差も質量分光による方法を用いれば検出できる（同じ原子の異なる同位体
を検出できる）ため、同定用ヌクレオチド中の１原子置換（例えば水素原子の代
わりにフッ素、または、重水素原子による水素原子の置き換え）を含む天然核酸
からの如何なる変異も、検出可能な差を与える。本発明の方法で用いる核酸類似
体は核酸プローブのハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズされたプロー
ブの脱重合の何れも妨害してはならない。
【０１６１】 更にまた、質量分光測定はここのヌクレオチドまたはヌクレオシドの間を識別
できる。例えば、本発明で用いる３’同定用ヌクレオチドがＧヌクレオチドであ
った場合、質量分光測定を用いて、本発明の方法においてそのＧヌクレオチドの
放出を検出することができる。同様に、質量分光分析は、Ａ，ＴまたはＣヌクレ
オチドの放出を、これらの化合物の原子量の差に基づいて検出することができる
。即ち、本発明の多重態様において、質量分光測定を用いてこれらの３’同定用
ヌクレオチド１つ以上の存在を解析することができる。
【０１６２】 本態様の特に有用な特徴において、ＤＩＯＳ（ケイ素上脱着／イオン化）と称
される質量分光法が最近Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：２４３
（１９９９）において報告されており、これは特殊な多孔質のケイ素試料ウェル
を使用した市販の質量分光分析測定を用いてピコグラムまたはアタグラムの量で
単一または複数の試験を正確に行うことができる。それ以前のよく知られたＭＡ
ＬＤＩ質量分光分析法も利用することができる。
【０１６３】 質量分光測定を用いる多重方法の１つの態様において、複数の異なる同定用ヌ
クレオチドを種々の核酸プローブにおいて用いることができる。このような技法
を用いることにより、異なる同定用ヌクレオチドの存在は核酸標的配列の存在の
直接の証拠となる。 Ｃ．蛍光分光分析 いくつかの意図される態様において、同定用ヌクレオチドは蛍光標識を含む。
例えば、ヌクレオチドが蛍光標識される１つの態様において、分析出力は蛍光分
光測定により得られる。ヌクレオチドを蛍光標識する別の態様においては、分析
出力は質量分光測定により得られる。
【０１６４】 本発明の好ましい態様において、蛍光標識はヌクレオチドの蛍光類似体の部分
である。蛍光ヌクレオチド類似体は広範に知られており、幾つかの入手元より購
入できる。入手元の例は、ＮＥＮ（商標名）ライフサイエンスプロダクツ（ボス
トン、マサチューセッツ）であり、ここからはフルオレセイン、クマリン、テト
ラメチルローダミン、ナフトフルオレセイン、ピレン、テキサスレッド（商標名
）およびＬｉｓｓａｍｉｎｅ（商標名）で標識されたジデオキシ、デオキシおよ
びリボヌクレオチド類似体が得られる。他の入手元はアマシャムファルマシアバ
イオテック（アップサラ、スウエーデン；ピスカタウエイ、ニュージャージー）
およびＭＢＩファーメンタス社（アムハースト、ニューヨーク）である。
【０１６５】 蛍光標識および蛍光分光分析を用いることの好都合な点は、複数の異なる標識
が存在する点である。このような異なる標識は本発明の多重態様において特に有
用である。放出された同定用ヌクレオチドとして特定の蛍光標識ヌクレオチド類
似体を検出することにより核酸標的が存在するかを推定できるように、異なる蛍
光標識を異なるプローブにおいて使用する。
【０１６６】 例えば、フルオレセインは４８８ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長
を有するが、ローダミン（テトラメチルローダミンの形態）は５５０ｎｍの励起
波長および５７５ｎｍの発光波長を有する。蛍光検出器は励起光源と発光検出器
を与える。５２０ｎｍと５７５ｎｍの発光波長は蛍光分光測定により容易に識別
できる。
【０１６７】 １分子に基づくと、蛍光分光測定は吸光度分光測定より約１０倍感度が高い。
単一のチューブ、フローセルおよびマルチウェルプレート用など、蛍光値を読み
取るための極めて多くの種類の蛍光分光測定による検出器が市販されている。例
えば、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎモデルのマイクロプレートリ
ーダーは広範に入手でき、分光範囲４００〜７５０ｎｍ、フィルターは３４０，
４０５，４１４，４５０，４９２，５４０，６２０および６９０ｎｍを用いるこ
とができる（例えば、フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペン
シルバニア）。
【０１６８】 放出された同定用ヌクレオチドは市販の試薬を用いて当該分野でよく知られた
交差結合化学を用いて脱重合の前または後に標識することができると予期される
。例えばフルオレセインイソチオシアネートおよびローダミンＢイソチオシアネ
ートは共にアルドリッチケミカルカンパニア（ミルウオーキー、ウイスコンシン
）から入手できる。生物学的分子を標識する際のフルオレセインイソチオシアネ
ートの使用についての文献はＮａｔｕｒｅ，１９３：１６７（１９６２），Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６：２８（１９７２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，５７：２２７（１９７４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，Ｕ．Ｓ．，７２：４５９（１９７５）を含む。
【０１６９】 本発明の多くの態様について、放出された蛍光同定用ヌクレオチドをプローブ
のようなオリゴヌクレオチドに結合したものと分離することが有用であると予期
される。即ち、このような態様では当該分野でよく知られ上記した分離技法、例
えば蛍光検出器付きＨＰＬＣ等が有用である。他の分光測定法と比較して蛍光の
感度が高いことにより本発明の検出または定量のプロセスの感度を高めることが
できる。
【０１７０】 分析出力が蛍光分光分析を使用して測定される別の態様においては、ＮＡＤＨ
検出系を使用する。ＮＡＤＨ検出系においては、２つの酵素、ホスホグリセレー
トキナーゼとグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを使用して、ＡＴＰ存
在下においてＮＡＤＨからＮＡＤの形成を触媒する。即ち、これは事実上ＡＴＰ
検出系であり、ルシフェラーゼ／ルシフェリン系に関してＡＴＰ検出に関係する
本明細書の議論の多くがここであてはまる。ＮＡＤＨは蛍光性であるがＮＡＤは
そうではないので、ＡＴＰは蛍光強度の損失として測定される。ＮＡＤＨに基づ
くＡＴＰアッセイの例は、米国特許第４，７３５，８９７号、第４，５９５，６
５５号、第４，４４６，２３１号および第４，７４３，５６１号、および英国特
許出願ＧＢ第２，０５５，２００号に開示されており、全ては引用により編入さ
れる。 Ｄ．吸光度分光分析 吸光度分光分析工程は分析出力を得るものとして意図されており、これにより
放出された同定用ヌクレオチドの存在または非存在を測定でき、そして、上記核
酸標的配列の存在または非存在を示すことができる。本態様は、ハイブリダイズ
された核酸の３’末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の
脱重合量で処理された反応混合物のクロマトグラフィーの分離を意図する。
【０１７１】 例示される態様において、試料中の幾つかの異なる核酸標的配列の存在を調べ
る多重アッセイを吸光度分光測定により行う。種々の核酸標的配列に対する幾つ
かの標識されたプローブを核酸試料に添加する。プローブ上の標識は各プローブ
ごとに異なる種々のヌクレオチド類似体であることができる。クレノーｅｘｏ−
のような脱重合酵素を添加し、３’末端ヌクレオチドがマッチする場合に標的配
列にハイブリダイズされたプローブの３’末端から標識されたヌクレオチドおよ
び他のヌクレオチドを遊離させる。
【０１７２】 反応溶液は予め平衡させておいた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カ
ラムに付し、天然のヌクレオチドからヌクレオチド類似体を分離する条件下に溶
離する。ヌクレオチド、塩基およびヌクレオシドのクロマトグラフィー分離に有
用な媒体は逆相Ｃ１８カラムまたはＯＤＳ−８０ＴMまたはＯＤＳ−１２０Ｔ
ＴＳＫ−ＧＥＬ （ＴｏｓｏＨａａｓ，モンゴメリービル、ペンシルバニア）、
アニオン交換媒体、例えばＤＥＡＥ−２５ＳＷまたはＳＰ−２５Ｗ ＴＳＫ−Ｇ
ＥＬ （ＴｏｓｏＨａａｓ，モンゴメリービル、ペンシルバニア）またはアフィ
ニティー媒体、例えばＢｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ ＴＳＫ−ＧＥＬ （Ｔｏｓｏ
Ｈａａｓ，モンゴメリービル、ペンシルバニア）である。実施例６５はＨＰＬＣ
を用いた本発明の態様を説明する。
【０１７３】 ＨＰＬＣカラムには吸光度検出器を取りつけてカラムの溶出物を監視する。し
たがって、この種の分析用の「吸光度分光測定」となる。ヌクレオチドのＨＰＬ
Ｃ検出を監視するための典型的な波長は２５０ｎｍ，２６０ｎｍおよび２８０ｎ
ｍである。このようなヌクレオシドおよびヌクレオチドの類似体の分離は当該分
野でよく知られている。Ｒｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ，３１７：２８３−３００（１９８４）、および、Ｐｅｒｒｏｎｅ
＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３１７：３０１−３１０
（１９８４）はｄＮＴＰのＨＰＬＣ分離の例を示す。
【０１７４】 分離されたヌクレオチド類似体の識別は同じ条件下、同じＨＰＬＣカラム上で
分離されたヌクレオチド類似体の標品の保持時間（種々の時間における溶出物の
吸光度により監視されるとおり）を比較することにより行なうことができる。あ
るいは、異なる画分中に採取されたヌクレオチド類似体の同一性（カラム溶出液
の吸光度を連続的に監視することにより測定されるとおり）は核磁気共鳴または
元素分析（Ｈ，Ｃ，Ｎ）のような他の標準的な分析方法により測定できる。
【０１７５】 クレノーｅｘｏ−により脱重合する本例においては、特定のプローブから放出
された同定用ヌクレオチドの存在はそのプローブとハイブリダイズする標的配列
の存在を示す。
【０１７６】 別の態様において、脱重合反応混合物から放出されたヌクレオチドはカラム溶
出液の監視のための吸光度検出器の取りつけられたガスクロマトグラフィーによ
り分離される。 プローブ−媒介特異的核酸検出 さらに別の好ましい態様において、本発明のプローブ媒介特異的核酸検出法を
用いることにより、目的の核酸を単純に同定または検出することができる。この
方法のため、核酸プローブ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を利用するが、標的
核酸に対して実質的に相補であって、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。特に好ま
しい態様において、核酸プローブは、外因性標的核酸に完全に相補である。核酸
プローブは、一本鎖核酸からなる（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）。プローブは
長さを変更することができ、好ましくは約１０から約１０００塩基であり、最も
好ましくは約１０から１００塩基である。検出は上記のとおりに実施することが
できる。核酸プローブ−核酸標的／プローブハイブリッド（複合体）は、プロー
ブの脱重合を許容する条件に暴露されて、ＸＴＰｓの生成をもたらす。目的の核
酸の検出は、生成されるＸＴＰｓにより生じるシグナル内の差異により特徴付け
される。好ましくは、上記のとおりにＸＴＰｓがＡＴＰに変換されて、ＡＴＰは
ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系により検出される。
【０１７７】 脱重合のための好ましい条件（脱重合条件）は本明細書のどこかに記載された
。ヌクレオチドを次に検出する。いくつかの好ましい態様において、核酸は前お
よび実施例に記載されたとおり、ＡＴＰ均等物に変換される。好ましい態様にお
いて、ＡＴＰはルシフェラーゼ（発光分光測定）またはＮＡＤＨ（蛍光分光測定
）検出系により検出される。
【０１７８】 前に記載したとおり、本発明の方法における使用のために核酸プローブをデザ
インするのに有用な適切な核酸標的配列の測定は、当業者の範囲内である。 脱重合反応は核酸中の特定の塩基の同定を質問するためにも使用することがで
きる。例えば、核酸中の一つの塩基の点変異、欠失または挿入は以下のとおりに
検出することができる。
【０１７９】 １つの態様においては、点突然変異を含むか、または含むことが疑われる標的
核酸に実質相補な核酸プローブを合成する。ハイブリダイゼーションが起こる際
のストリンジェンシーを変えるために種々のハイブリダイゼーション条件を用い
ることができる。すなわち、使用する系に応じて、プローブの相補性を変化させ
ることができる。プローブの長さ、ＧＣ含量、および、ハイブリダイゼーション
条件のストリンジェンシーに応じて、プローブは標的核酸と１０個まで、好まし
くは５個未満の塩基のミスマッチを有することができる。最も好ましくは、プロ
ーブは標的核酸と１個のみの塩基のミスマッチを有するか、または、標的核酸に
対して完全に相補性である。
【０１８０】 核酸プローブは一本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有する。プロー
ブは様々な長さのものであることができ、好ましくは約１０〜１００塩基、最も
好ましくは約１０〜３０塩基であることができる。特に好ましい態様においては
、プローブは核酸プローブの質問位置と３’エンドの間の全ての塩基において標
的と相補性である。
【０１８１】 好ましい態様において、プローブは質問位置に所定のヌクレオチドを有するよ
うにデザインされる。相補なプローブの塩基が標的核酸に対形成するか、ハイブ
リダイズする場合、質問位置の塩基は、塩基対形成が起こるような条件下にその
同一性を調べる核酸標的における塩基と並ぶ。質問位置はプローブ内で変化する
ことができることを意図している。例えば、一部の好ましい態様においては、質
問位置は好ましくは核酸プローブの３’エンドの１０塩基内にある。更に別の好
ましい態様においては、質問位置は核酸プローブの３’エンドの６塩基内にある
。特に好ましい態様においては、質問位置は、核酸プローブの３’エンドの最後
から２番目、または、最後の塩基にある。
【０１８２】 いくつかの好ましい態様においては、各々が質問位置において異なるヌクレオ
チドを有するような、同じ長さの４種の異なるプローブを合成する。従って、一
部の態様においては、１セットのＤＮＡプローブには、質問位置にデオキシアデ
ノシン残基を有する第１のプローブ、質問位置にデオキシチミジン残基を有する
第２のプローブ、質問位置にデオキシグアノシン残基を有する第３のプローブ、
および、質問位置にデオキシシトシン残基を有する第４のプローブが含まれるこ
とを意図する。同様に、１セットのＲＮＡプローブには、質問位置にアデノシン
残基を有する第１のプローブ、質問位置にウリジン残基を有する第２のプローブ
、質問位置にグアノシン残基を有する第３のプローブ、および、質問位置にシト
シン残基を有する第４のプローブが含まれることも意図する。
【０１８３】 いくつかの態様の次の工程では、プローブを別々の反応において外因性標的核
酸にハイブリダイズすることにより、プローブ核酸−標的核酸複合体を形成する
。ハイブリダイゼーション条件はプローブの長さおよび塩基組成に応じて変化す
ることができることが意図される。
【０１８４】 プローブ−標的核酸複合体において、質問位置のヌクレオチドは核酸中の識別
されるべき特定の塩基と並ぶ。１セットのプローブを用いる態様においては、異
なる反応を各々のプローブを用いて実施する。多重態様においては、そのセット
のプローブを同時に用いることができる。プローブは質問位置において相違があ
るため、プローブのうち１つのみが、質問位置に並ぶ標的核酸の特定の塩基に対
して相補的である。
【０１８５】 いくつかの態様の次の工程においては、核酸プローブ−標的核酸複合体は、プ
ローブの脱重合が可能な条件下、個別に反応させる。脱重合のための好ましい反
応条件は上記および後の実施例に記載する通りである。その後ヌクレオチドを検
出する。
【０１８６】 好ましい態様において、反応混合物は、上記反応３および以下の実施例におい
て記載されるとおり、ＸＴＰのＡＴＰへの変換を触媒するのに必要な試薬も含む
。いくつかの好ましい態様において、脱重合反応により生成されたヌクレオチド
および／またはＡＴＰは、次に、ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系のいずれ
かにより検出する。上記核酸プローブの質問位置の塩基の、核酸標的中の対応す
る塩基に対しての相補性は、脱重合後のＡＴＰから生じるシグナルの検出により
特徴付けされる。
【０１８７】 特に好ましい態様において、各反応において生成されるＡＴＰの量を比較する
ことにより、特定の塩基の正体を決定する。プローブの脱重合はその３’エンド
から進行する。質問位置の塩基が核酸中の特定の塩基に相補でない場合、ほとん
どまたは全くＡＴＰが生成されず、よって即ちシグナルがもたらされない。別の
態様において、この方法は１つから４つのプローブを用いて実施することができ
る。複数のプローブの利用（例えば、質問位置において異なる塩基を有する各々
）が陽性のシグナルを生成するか否かについての不必要性を証明してよいことが
意図される（例えば、試験された第１のプローブを用いて）。 ヘアピン構造を用いたアッセイ プローブはヘアピン構造を有さないように構築することが好ましいが、ヘアピ
ン構造を構築するアッセイも有用である。本発明の１つの態様は、実施例２０に
記載するとおり、標的にハイブリダイズされ、その後ヘアピン構造を形成するこ
とができるように修飾されるプローブを用いて核酸試料中の核酸標的配列の存在
または非存在を測定するためのヘアピン構造の使用を意図する。本態様は以下の
工程を包含する。
【０１８８】 質問位置を有する核酸標的配列を含むと思われる核酸試料を含有する処理され
た試料を準備する。標的配列は、核酸試料中に存在する場合は、核酸プローブと
ハイブリダイズする。プローブは少なくとも２つのセクションよりなる。第１の
セクションはプローブの３’末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含む。これら
のヌクレオチドは質問位置の約１〜約３０ヌクレオチド下流から始まる位置の標
的鎖配列と相補的である。プローブの第２のセクションはプローブの５’末端領
域に位置し、そして、標的配列の約１０〜約２０ヌクレオチドを含む。従ってこ
の同じ配列は同じく５’から３’の方向に標的とプローブの両方に存在する。こ
の配列は、質問位置上またはその直ぐ上流（５’側）のヌクレオチドから、プロ
ーブの３’末端ヌクレオチドが標的にアニールする個所の直ぐ上流のヌクレオチ
ドまでの、標的中領域に渡っている。０〜約５０、好ましくは、０〜約２０個の
ヌクレオチド長で第１のセクションとも第２のセクションともハイブリダイズし
ない配列を有するプローブの任意の第３のセクションがプローブの第１および第
２のセクションの間に位置する。
【０１８９】 処理されたサンプルのプローブは、ｄＮＴＰおよび鋳型依存性のポリメラーゼ
と混合することにより、質問位置を少なくとも経由して、鋳型依存的な方法で伸
長され、これにより伸長されたプローブ／標的ハイブリッドを形成する。好まし
い態様においては、プローブ伸長の長さは、質問位置の上流に存在し、質問位置
の３’末端に相補的なヌクレオチドの間には存在しない、標的配列のヌクレオチ
ドに相補的なｄＮＴＰの伸長反応からの離脱により限定される。
【０１９０】 伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは未反応のｄＮＴＰから分離され、即
ち、試料中の質問位置の存在または非存在または質問位置の塩基の同一性を測定
するための伸長されたプローブ鎖の使用のために少なくとも必要な水準まで、精
製される。伸長されたプローブ／標的のハイブリッドを変性して鎖を分離する。
伸長されたプローブ鎖はヘアピン構造を取ることができるようになる。
【０１９１】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を、伸長されたプローブヘ
アピン構造の３’末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の
脱重合量と混合することにより形成される。反応混合物は、脱重合酵素が３’末
端ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、その後、
放出された同定用ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸標的
配列の存在または非存在を示す。その分析出力は本明細書に記載する通り測定す
ることができる。
【０１９２】 ＲＥＡＰＥＲ（商標名）と称され実施例２１および図２に示されるような、更
に別の本発明の態様は、核酸試料中の核酸標的配列または標的配列内の特定の塩
基の存在または非存在を測定する際のヘアピン構造の使用を意図し、以下の工程
を包含する。第１の核酸プローブ鎖にハイブリダイズされた核酸標的配列を含む
と思われる核酸試料を含有する処理された試料を準備する（図２Ａ）。
【０１９３】 ハイブリッドは第１のハイブリッドと称する。第１のプローブは少なくとも２
つのセクションよりなる。第１のセクションは標的質問位置の下流約５〜約３０
ヌクレオチドから始まる位置の標的核酸配列に相補的なプローブ３’末端約１０
〜約３０ヌクレオチドを含んでいる。第１のプローブの第２のセクションは、質
問位置から質問位置の約１０〜約３０ヌクレオチド下流まで標的配列の反復であ
る約５〜約３０ヌクレオチドを含み、そして、プローブの第１のセクションには
ハイブリダイズしない。即ち、第２の配列は、質問位置から下流に向かって第１
のプローブの３’末端ヌクレオチドが標的と並置される位置まで標的配列の領域
の反復である。プローブの第１および第２のセクションの間に位置するプローブ
の任意の第３のセクションは、０〜約５０、好ましくは約２０までのヌクレオチ
ド長であり、第１および第２の何れかのセクションとハイブリダイズしない配列
を有する。
【０１９４】 処理された試料の第１のハイブリッドを第１のプローブの３’末端において伸
長することにより第１のプローブを質問位置を超えて伸長し、その配列が質問位
置を含む伸長された第１のハイブリッド（図２Ｂ）を形成する。伸長された第１
のハイブリッドは元の標的核酸および伸長された第１のプローブよりなる。次に
伸長された第１のハイブリッドを水性組成物中で変性することにより、ハイブリ
ダイズされた二本鎖の２本の核酸鎖を分離し、分離された標的核酸および分離さ
れた伸長された第１のプローブを含有する水溶液を形成する。
【０１９５】 約１０〜約２０００、より好ましくは約１０〜約２００、最も好ましくは約１
０〜約３０ヌクレオチド長であり、伸長された第１のプローブの質問位置の約５
〜約２０００、好ましくは約５〜約２００ヌクレオチド下流から始まる位置の伸
長された第１のプローブに相補的な第２のプローブを伸長された第１のプローブ
にアニールさせ、これにより第２のハイブリッドを形成する（図２Ｃ）。第２の
ハイブリッドは、伸長された第１のプローブの５’末端にその伸長が達するまで
、第２のプローブの３’末端において伸長され、これにより、その３’領域が同
定用ヌクレオチドを含む第２の伸長されたハイブリッド（図２Ｄ）を形成する。
【０１９６】 伸長反応に用いられるポリメラーゼ酵素は、鋳型非特異的様式にて３’末端デ
オキシアデノシンを付加する活性の無い鋳型依存性のポリメラーゼであることが
好ましい。即ち、意図する伸長のためにはＴａｑのようなポリメラーゼ以外を用
いることが好ましい。
【０１９７】 伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して２本の核酸鎖、すなわ
ち、伸長された第２のプローブおよび伸長された第１のプローブを分離する。こ
のようにして形成された水生組成物を冷却することにより、元の核酸試料中に標
的配列が存在する場合は、分離された伸長された第２のプローブ（図２Ｅ）から
「ヘアピン構造」が形成される。即ち、標的配列が元の核酸試料中に存在する場
合は、第２の伸長されたハイブリッドの第２の伸長されたプローブの３’末端配
列は、質問位置および第２の伸長されたプローブの質問位置から下流の配列を有
する領域から、元の（最初に命名された）プローブの３’末端ヌクレオチドが元
の標的にアニールされたヌクレオチドの位置まで、第２の伸長されたプローブの
配列とハイブリダイズする。
【０１９８】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を、核酸ハイブリッドの３
’末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合
することにより形成される。反応混合物は、３’末端領域の同定用ヌクレオチド
を放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、その後、放出された同定
用ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸標的配列の存在また
は非存在を示す。ここでもまた、分析出力は本明細書に記載するいくつかの方法
の１つにより測定することができる。
【０１９９】 前述した態様の場合と同様、ｄＮＴＰを伸長反応に用いる。同定用ヌクレオチ
ドの分析を容易にするためには脱重合よりも前にｄＮＴＰからヘアピン構造を分
離することが好ましい。 キット 本発明の他の態様は核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または非存
在を測定するためのキットを意図する。このようなキットはハイブリダイズされ
た核酸プローブの３’末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵
素および核酸プローブ少なくとも１つを含んでおり、その核酸プローブは核酸標
的配列に相補的である。キットは場合により更にヌクレオシド２リン酸キナーゼ
を包含する。好ましくは、ヌクレオシド２リン酸キナーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるものとする。キットは場合により更に
脱重合により上記核酸を検出するための取り扱い説明書を包含する。好ましくは
、キットに含まれるヌクレオチド放出活性を有する酵素は、ピロリン酸イオンの
存在下、その３’末端領域の塩基が全体的な相補性でマッチするハイブリダイズ
された核酸を脱重合する鋳型依存性のポリメラーゼである。或いは、キットに含
まれるヌクレオチド放出活性を有する酵素は、３’から５’へのエキソヌクレア
ーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３’末端においてミスマッチ
塩基１つ以上を有するハイブリダイズされた核酸を脱重合する。
【０２００】 このようなキットは本発明の方法の何れに対しても有用であるものと認識され
るべきである。特定の成分の選択は、実施するためにキットをデザインする特定
の方法により異なる。同定用ヌクレオチドの放出により測定されるか、または、
脱重合後に残存するプローブの検出により測定される、分析出力の検出のための
別の要素も準備することができる。例えば、３’末端領域から同定用ヌクレオチ
ドを放出させたプローブを検出するためにルシフェラーゼ試薬を本発明のキット
に設けることができる。
【０２０１】 このようなキット中に存在させる取り扱い説明書はユーザーに対し、本発明の
種々の方法を実施するためにどのようにしてキットの要素を使用するかを指示す
る。これらの取り扱い説明書は、発行分光測定、質量分光測定、蛍光分光測定お
よび吸光度分光測定による検出を包含する本発明の検出方法の説明を含むことが
できる。
【０２０２】 別の態様においては、本発明は、以下の要素：ハイブリダイズされた核酸プロ
ーブからヌクレオシド３リン酸として同定用ヌクレオチドを放出するピロリン酸
存在下の活性を有する酵素；アデノシン５’２リン酸；ピロリン酸；ヌクレオシ
ド２リン酸キナーゼ；および少なくとも１つの核酸プローブを包含する核酸試料
中の所定の核酸標的配列少なくとも１つの存在または非存在を測定するためのキ
ットを意図し、ここで核酸プローブは所定の核酸標的配列に相補である。
【０２０３】 好ましくは、ピロリン酸の存在下に同定用ヌクレオチドを放出する活性を有す
る酵素は、Ｔｎｅ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーｅｘｏ−，クレノ
ー、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼおよびＴｖｕ ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される。好
ましくは、ヌクレオシド２リン酸キナーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏ
ｓｉｓによりコードされるものである。キットは任意に取り扱い説明書を包含す
る。
【０２０４】 別の態様においては、本発明は、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’末
端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素および取り扱い説明書
を包含する、核酸試料中の所定の核酸標的配列の存在または非存在を測定するた
めのキットを意図する。このようなキットは任意にヌクレオシド２リン酸キナー
ゼを包含する。好ましくは、ヌクレオシド２リン酸キナーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるものである。キットは更に所定の核
酸標的配列に相補的な核酸プローブを任意に包含する。
【０２０５】 本発明の別の態様において、核酸検出試験キットは、本発明により意図される
脱重合法、特に脱重合検出法を実施するために提供される。 １つの態様においては、キットは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ
、Ｔｎｅ３重突然変異ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ
、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片、クレノーエ
キソマイナス、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転
写酵素またはポリ（Ａ）ポリメラーゼを包含する、ピロリン酸分解を触媒するこ
とのできる酵素の入った容器を包含する。別の態様においては、キットはＳ１ヌ
クレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ ３１、マングビーンヌクレアーゼ、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＨのようなエキソヌクレアーゼを含有
する容器を包含する。
【０２０６】 上記した酵素の種類の何れも、脱重合有効量で意図する方法に用いられる。即
ち、酵素は、ハイブリダイズされたプローブを脱重合して同定用ヌクレオチドを
放出するような量で用いる。この量は使用する酵素により、そして脱重合を行な
う温度により変動する。キットの酵素は典型的には約０．１〜１００Ｕ／反応の
量で存在し、特に好ましい態様においては、濃度は約０．５Ｕ／反応である。対
照試料と共に少なくとも一回の試験を行うために十分な量の酵素を準備する。
【０２０７】 本明細書に記載する通り、同定用ヌクレオチドの存在または非存在を測定する
ための好ましい分析出力はルシフェラーゼの存在下ルシフェリンとのＡＴＰの反
応により生じる発光である。発光を用いたＤＮＡの検出に使用するためのピロリ
ン酸化酵素を含むキットは、好ましくは、ＮＤＰＫの入った容器およびＡＤＰの
入った容器を包含する。同様に、発光を用いたＤＮＡの検出に使用するためのエ
キソヌクレアーゼ酵素を含むキットは、ＰＲＰＰ合成酵素の入った容器およびＡ
ＤＰの入った容器を包含する。ＮＤＰＫまたはＰＲＰＰの合成酵素は、約０．０
１〜１００Ｕ／反応、好ましくは約０．１〜約１．０Ｕ／反応の濃度で提供され
る。
【０２０８】 好ましくは、上記試薬およびここで記載するキットに用いられる全ての試薬は
夾雑ＡＴＰやアデニレートキナーゼを含まない。夾雑物の一部は透析により酵素
から除去することができる。
【０２０９】 任意に、キットはｄＮＴＰまたはＮＴＰからＡＴＰへの増幅のための試薬の入
った容器を含む。増幅試薬には、例えば、ピルベートキナーゼ、アデニレートキ
ナーゼ、ＮＭＰＫ、ＮＤＰＫ、ＡＭＰ（例えば増幅酵素および基質として）およ
びｄＣＴＰまたはＡＭＰ−ＣＰＰ（例えば高エネルギーリン酸供与体として）が
包含される。特に好ましい態様においては、キットは試験方法を実施するための
取り扱い説明書を含む１つの同封物として包装することができる。いくつかの態
様においては、試薬は容器内に準備され、直接の使用または希釈後の使用に適す
る強度のものとする。別の好ましい態様においては、結果の定量を可能とするた
めに、標品のセットも提供する。更に別の好ましい態様においては、最適酵素活
性のための試験バッファーも含める。
【０２１０】 更に別の態様において、意図するキットはヌクレアーゼ、ＰＲＰＰ合成酵素、
ＰＲＰＰ、ＮＤＰＫ、およびＡＤＰをルシフェラーゼおよびルシフェリンと共に
包含する。好ましい態様においては、ヌクレアーゼは約１〜５００Ｕ／反応の濃
度で提供し、特に好ましい態様においては、約２０Ｕ／反応の濃度とする。特に
好ましい態様においては、ＰＲＰＰ合成酵素は約０．０１Ｕ／反応〜１０Ｕ／反
応、好ましくは約０．１Ｕ／反応の濃度で提供する。一部の好ましい態様におい
ては、キットは、単一の試薬溶液として提供される全ての上記試薬およびルシフ
ェラーゼおよびルシフェリンを包含する。
【０２１１】 別の好ましい態様において、上記試薬は、例えば、ルシフェラーゼにより利用
されない高エネルギーリン酸供与体、好ましくはｄＣＴＰ、およびＡＭＰをルシ
フェラーゼおよびルシフェリンと共に包含する。別の好ましい態様においては、
キットは同じ溶液中に提供された上記全ての試薬およびルシフェラーゼおよびル
シフェリンを包含する。
【０２１２】 本発明の更に別の態様において、上記キットはプローブ媒介特異的核酸検出の
ためのプローブを包含することができる。いくつかの態様において、キットは目
的の核酸標的に対する核酸プローブ少なくとも１つを含む。別の態様において、
キットは複数のプローブを有し、その各々は、質問位置において異なる塩基を含
むか、または、異なる標的ＤＮＡ配列を質問するようにデザインされる。
【０２１３】 キットに含まれることのできる核酸プローブの種類およびその使用は以下によ
り詳細に記載する。 実施例 実施例１：ウイルス配列を質問するためにデザインされたプローブに関してのプ
ローブのみのバックグラウンド値の減少 この実施例においては、プローブのみの反応からのバックグラウンド光の値が
反応条件の変化により減少する。より特定すれば、反応物中におけるクレノーｅ
ｘｏ−レベルを低下させることにより、そのようなバックグラウンド反応からの
値を減少させる。さらに、プローブを用いて、同じＤＮＡ鎖にハイブリダイズす
るプローブ対、異なる鎖にハイブリダイズするが同じヌクレオチドの多形性部位
に質問するプローブの相対的プローブシグナル強度の値をアッセイする。
【０２１４】 オリゴヌクレオチドＣＶ１１（配列番号１）とＣＶ１２（配列番号２）は、薬
剤ガンシクロビアに対して感受性の形態のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のゲ
ノムのセグメントを生成するように、共にハイブリダイズすることができる一本
鎖ＤＮＡｓの対である。オリゴヌクレオチドＣＶ１３（配列番号３）とオリゴヌ
クレオチド（配列番号４）は、ＣＭＶゲノムのセグメントを生成するが薬剤ガン
シクロビアに耐性のウイルスの形態を表すＳＮＰを含むためにＣＶ１１およびＣ
Ｖ１２とは異なるように、共にハイブリダイズすることができる一本鎖ＤＮＡｓ
の対である。
【０２１５】 プローブオリゴヌクレオチドＣＶ１５（配列番号５）は、ＣＶ１２のセグメン
トに厳密な相同性をもってハイブリダイズすることができる。プローブオリゴヌ
クレオチドＣＶ１６（配列番号６）は、ウイルスに薬剤耐性を付与するＳＮＰの
部位においてＣＶ１５配列とは異なる１塩基を含むこと以外は、ＣＶ１５と同一
である。プローブオリゴヌクレオチドＣＶ１７（配列番号７）は、ＣＶ１１にハ
イブリダイズすることができる。プローブオリゴヌクレオチドＣＶ１８（配列番
号８）は、ウイルスに薬剤耐性を付与するＳＮＰの部位においてＣＶ１７配列と
は異なる１塩基を含むこと以外は、ＣＶ１７と同一である。
【０２１６】 上記のオリゴヌクレオチドは１ｍｇ／ｍＬの濃度にて水に溶解して、以下の溶
液をアッセンブルした。 溶液 オリゴヌクレオチド 水 ＃１ ― ― ２０μＬ ＃２ ＣＶ１５，１μＬ １９μＬ ＃３ ＣＶ１６，１μＬ １９μＬ ＃４ ＣＶ１７，１μＬ １９μＬ ＃５ ＣＶ１８，１μＬ １９μＬ これらの溶液を９５℃において５分間加熱して、次に室温において１０分間冷
やした。以下のマスターミックスをアッセンブルして混合した。 成分 量 １０Ｘ ＤＮＡ Ｐｏｌ バッファー（プロメガ、Ｍ１９５Ａ） ２００μＬ クレノーｅｘｏ−（１Ｕ／μＬ）（プロメガ、Ｍ１９５Ａ） １２．５μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（プロメガ、Ｍ１９５Ａ） ２５μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） １０μＬ １０ｕＭ ＡＤＰ（シグマ Ａ５２５８） ２０μＬ 水 ７３２．５μＬ ２０マイクロリットルのこの溶液を冷やした上記の溶液１−５に加え、次にそ
の結果の混合物を３７℃において１５分間加熱した。このインキュベーションの
後に、各溶液４μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ Ｆ２０２Ａ）に加え
て、その結果の溶液の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノ
メーターを用いてすぐに測定した。以下の結果が得られた。 サンプルされた溶液 相対光ユニット ＃１ １３．０７ ＃２ １４．９８ ＃３ １４．２７ ＃４ ２８．２５ ＃５ ５８３．７０ これらの結果は、プローブＣＶ１５−１７が、反応あたり０．２５Ｕのクレノ
ーｅｘｏ−において相対的に低いプローブ単独の光シグナルを供給することを示
すが、プローブＣＶ１８単独は極めて高い相対的光シグナルを供給することを示
す。ＣＶ１８プローブの配列は、末端の３’塩基がセグメントのさらに５’エン
ドの方にある配列５’ＴＣＧＴＧＣ３’にハイブリダイズするようなヘアピン構
造を形成することができる。プローブＣＶ１７は同じ構造を形成することができ
るが、その結果生じる構造の末端の３’の塩基が対合しない塩基を有する。
【０２１７】 これらのデータは、この系のための適切なプローブデザインの規準の原理の一
つを例示する：プローブは安定なヘアピン構造を形成するように予測されるべき
ではなく、そして特に、脱重合酵素のための基質として作用するかもしれないよ
うに、断片中で平滑末端または５’突出を形成する構造を生じるプローブの３’
エンドを有するそのような構造を提供するように予測されるべきではない。さら
に、使用されるプローブは平滑末端または５’突出の何れかを有するプローブダ
イマー構造を形成するように予測されるべきではないが、何故ならば、そのよう
なプローブは系において高いプローブ単独シグナルを生じることができ、そして
使用するために利用不可能にさせるかもしれないからである。
【０２１８】 それらの低いバックグラウンドのため、プローブＣＶ１５−ＣＶ１７は次にさ
らなる研究のために選択された。等容量のオリゴヌクレオチドＣＶ１１とＣＶ１
２をアニールさせたが、この実施例において以前に記載されたとおりであり、Ｃ
Ｖ１３とＣＶ１４もアニールさせた。ＣＶ１１とＣＶ１２、そしてＣＶ１３とＣ
Ｖ１４のアニールした溶液を、それぞれＣＶ１１＋ＣＶ１２およびＣＶ１３＋Ｃ
Ｖ１４と記した。以下の溶液をアッセンブルした。 溶液 CV15 CV16 CV17 CV11+12 CV13+14 CV(11+12)+(13+14) 水 ヘテロ接合体鋳型 ＃１ −− −− −− −− −− −− ２０μｌ ＃２ １μｌ −− −− −− −− −− １９μｌ ＃３ −− １μｌ −− −− −− −− １９μｌ ＃４ −− −− １μｌ −− −− −− １９μｌ ＃５ −− −− −− １μｌ −− −− １９μｌ ＃６ −− −− −− −− −− １μｌ １９μｌ ＃７ −− −− −− −− １μｌ −− １９μｌ ＃８ １μｌ −− −− １μｌ −− −− １８μｌ ＃９ −− １μｌ −− １μｌ −− −− １８μｌ ＃10 １μｌ −− −− −− −− １μｌ １８μｌ ＃11 −− １μｌ −− −− −− １μｌ １８μｌ ＃12 １μｌ −− −− −− １μｌ −− １８μｌ ＃13 −− １μｌ −− −− １μｌ −− １８μｌ ＃14 １μｌ −− −− １μｌ −− −− １８μｌ ＃15 −− −− １μｌ １μｌ −− −− １８μｌ ＃16 １μｌ −− −− −− −− １μｌ １８μｌ ＃17 −− −− １μｌ −− −− １μｌ １８μｌ ＃18 １μｌ −− −− −− １μｌ −− １８μｌ ＃19 −− −− １μｌ −− １μｌ −− １８μｌ これらの溶液を９５℃において５分間加熱して、次に室温において１０分間冷
やした。マスター混合溶液をこの実施例において記載されたとおりに、０．２５
Ｕ／２０μＬの最終濃度のクレノーｅｘｏ−を含むようにアッセンブルした。溶
液１−１９を冷やした後に、２０μＬのマスター混合溶液を加えて、その結果の
溶液を３７℃において１５分間加温した。このインキュベーションの後に、溶液
２−１９の２通りの４μＬサンプルおよび溶液１の１サンプルを取り、１００μ
ＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加えて、混合物の光生産をＴｕｒｎ
ｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して測定した。以下の結
果が得られた。
【０２１９】 相対光ユニット 溶液 読み１ 読み２ ＃１ １０．５３ ― ― ＃２ １１．３５ １２．１６ ＃３ １０．７９ １２．７５ ＃４ １７．７０ １６．７６ ＃５ １２．７８ １１．１２ ＃６ １１．３６ １１．４８ ＃７ １２．３８ １２．１６ ＃８ ３４８．３ ３６９．３ ＃９ ７３．１１ ７４．４８ ＃１０ ２８９．５ ２８３．６ ＃１１ ５０９．８ ３６４．０ ＃１２ １２０．２ １０８．６ ＃１３ ７８５．４ ５９５．７ ＃１４ ７６４．３ ７６３．３ ＃１５ ７７．２５ ７３．２２ ＃１６ ５３０．９ ５４１．２ ＃１７ ４７６．１ ４１９．６ ＃１８ ３３９．４ ２６２．７ ＃１９ ９４３．２ ９６４．０ 上記のデータの正味の相対光の値は以下のとおりに計算した。この実施例にお
いて報告した比は、マッチしたサンプルの結果を最初に平均化し、次にマッチし
たサンプルとミスマッチのサンプルから正味の光生産を測定し、そしてマッチし
た反応からの正味の光生産を、ミスマッチの反応において観察された光生産で割
ることにより測定した。正味の光生産は、生産された全光生産から、上記反応に
存在するプローブおよび鋳型からの概算の光の寄与（estimated light contribu
tion）を差し引くことにより測定した。鋳型反応からの光の生産は、鋳型から特
異的に寄与される光生産と、様々な成分からの混在するＡＴＰにより起因する光
生産の全部であると考えられた。プローブ単独からの正味の増加は、プローブ値
から、平均の「ＤＮＡなし」の値を差し引くことにより計算したが、これはプロ
ーブ値から混在するＡＴＰに起因する値を差し引くことためである。即ち、上記
反応からの正味の光生産を測定するために使用される式は： 正味の光＝全光−［（標的単独）＋（プローブ単独−ＤＮＡなし）］ これらの値を使用して、「Ｔ」対立遺伝子プローブからのシグナルで、「Ｃ」
対立遺伝子プローブからのシグナルを割ることによりシグナル比を測定した。こ
れらの計算の結果を以下の表に提示するが、「ＷＴ」は野生型の遺伝子型を示す
。 プローブが同じDNA鎖を質問する プローブが異なるDNA鎖を質問する 鋳型遺伝子型 鋳型遺伝子型 プローブ Ｃ／Ｃ Ｃ／Ｔ Ｔ／Ｔ プローブ Ｃ／Ｃ Ｃ／Ｔ Ｔ／Ｔ WTプローブ 345.5 274.0 100.8 WTプローブ 745.1 518.0 282.1 （CV15） （CV15） 変異プローブ 60.5 424.3 677 変異プローブ 61.9 435.0 940 （CV16） （CV17） 比 5.7 1.5 0.15 比 12 1.2 0.33 これらのデータは、この特別なＳＮＰに関して、異なる鎖に結合する多形性を
検出するプローブは、療法の核酸標的が反応中に存在する場合に（特定の対立遺
伝子に関してヘテロ接合のサンプルについて生じるような）、１．０に近いシグ
ナル比を与えることを証明する。しかしながら、何れかのセットのプローブは、
サンプルＤＮＡの遺伝子型に依存して明らかに異なるシグナルを与える。 ＣＶ１１ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGACCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGAGCGTCTGTTG
GAGCT 3’配列番号１ ＣＶ１２ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGGTCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAGC
GAGCT 3’配列番号２ ＣＶ１３ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGATCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGAGCGTCTGTTG
GAGCT 3’配列番号３ ＣＶ１４ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGATCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAGC
GAGCT 3’配列番号４ ＣＶ１５ 5’CTACCACGAATGCTCGCAGAC 3’配列番号５ ＣＶ１６ 5’CTACCACGAATGCTCGCAGAT 3’配列番号６ ＣＶ１７ 5’TGACGTATTCGTGCAGCATGG 3’配列番号７ ＣＶ１８ 5’TGACGTATTCGTGCAGCATGA 3’配列番号８ 実施例２：Ｌｉｓｔｅｒｉａ種のゲノム中のＤＮＡ配列の検出 この実施例は、ｉａｐ遺伝子として公知の遺伝子中のＬｉｓｔｅｒｉａゲノム
中に存在するＤＮＡ配列の存在に関するアッセイを提供する。オリゴヌクレオチ
ドＬＭ１（配列番号９）およびＬＭ２（配列番号１０）は、ｉａｐ遺伝子のセグ
メントをコードし、そして互いにぴったり相補である。オリゴヌクレオチドＬＭ
３（配列番号１１）は標的ＬＭ２の領域にぴったりハイブリダイズし、そしてプ
ローブＬＭ４（配列番号１２）は標的ＬＭ１にぴったりとハイブリダイズするよ
うにデザインした。
【０２２０】 オリゴヌクレオチドＬＭ１−ＬＭ４はＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に５００μｇ／ｍＬの濃度にて溶解し、次にＴ
Ｅバッファーで２５倍希釈することにより、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度の溶液
を得た。以下の溶液をアッセンブルした。 溶液 オリゴヌクレオチド １ＸＴＥバッファー ＃１ ＬＭ１，１０μＬ １０μＬ ＃２ ＬＭ２，１０μＬ １０μＬ ＃３ ＬＭ３，１０μＬ １０μＬ ＃４ ＬＭ４，１０μＬ １０μＬ ＃５ ＬＭ１，１０μＬ；ＬＭ３，１０μＬ ―― ＃６ ＬＭ１，１０μＬ；ＬＭ４，１０μＬ ―― ＃７ ＬＭ２，１０μＬ；ＬＭ３，１０μＬ ―― ＃８ ＬＭ２，１０μＬ；ＬＭ４，１０μＬ ―― ＃９ − − ２０μＬ これらの溶液を９５℃において３分間加熱し、次に１５分間室温において冷や
した。
【０２２１】 以下のマスター混合物をアッセンブルした。 成分 容量／反応 ナノピュア水（プロメガ ＡＡ３９９） １２．７５μＬ １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ Ｍ１９５Ａ） ２μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（プロメガ Ｃ１１３） ０．２５μＬ ＡＤＰ，２μＭ＊ １μＬ ＮＤＰＫ、０．１Ｕ／μＬ＊＊ １μＬ クレノーＥｘｏ− １０Ｕ／μＬ（プロメガ Ｍ２１８） １μＬ ＊シグマＡ５２５８を水に溶解することにより作成した。＊＊シグマＮ０３７
９を水に溶解することにより作成した。
【０２２２】 溶液１−９を冷やした後に、溶液の２」μＬサンプルを１８μＬのマスター混
合物に３通りに加え、その結果の溶液を混合して３７℃において１５分間インキ
ュベートした。このインキュベーションの後に、チューブを氷の上に置いた。全
てのインキュベーションを氷の上で行ったら、チューブ中の２０μＬの内容物を
１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてその結果の反
応の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用し
て直ぐに測定した。以下のデータが得られた。
【０２２３】 相対光ユニット 溶液 標 的 プローブ 読み１ 読み２ 読み３ 平均 ＃１ ＬＭ１ − − ７０．３ ６９．７ ６９．０ ６９．７ ＃２ ＬＭ２ − − ３９．６ ４０．８ ４５．３ ４１．９ ＃３ − − ＬＭ３ １２．２ １２．４ １３．２ １２．６ ＃４ − − ＬＭ４ １６．９ １７．３ １７．４ １７．２ ＃５ ＬＭ１ ＬＭ３ ５７．７ ７６．５ ７２．７ ６９．０ ＃６ ＬＭ１ ＬＭ４ １８１４ １８１５ １７６１ １７９７ ＃７ ＬＭ２ ＬＭ３ ５６．７２ ６１．１ ５７．５９ ５８．５ ＃８ ＬＭ２ ＬＭ４ ６７．５ ７２．４ ７９．３ ７３．１ これらのデータは、ＬＭ４がＬＭ１との反応において強いシグナルを生じ、即
ちこのＤＮＡ配列を検出するのに使用可能であることを示す。
【０２２４】 オリゴヌクレオチドＬＭ１とＬＭ２をＴＥバッファー中において２ｎｇ／μＬ
に希釈した。これらの物質は３通りの以下の溶液を創製するのにも使用した。 溶液 ＬＭ１ ＬＭ２ ＬＭ３ ＬＭ４ １ＸＴＥ ＃１ ５μＬ ５μＬ ―― ―― １０μＬ ＃２ ５μＬ ５μＬ １０μＬ ―― ―― ＃３ ５μＬ ５μＬ ―― １０μＬ ―― これらの溶液を９５℃にて１０分間加熱して、次に１５分間室温において冷や
した。
【０２２５】 マスター混合物はこの実施例の前に記載されたとおりに作成した。室温におい
て冷やした後に、各溶液２μＬをこのマスター混合物の１８μＬのサンプルに加
え、そしてその結果の溶液を３７℃において１５分間インキュベートした。この
インキュベーション後に、２μＬの上記溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメ
ガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてその結果の反応の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録
商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して直ぐに測定した。以下のデータ
が得られた。
【０２２６】 相対光ユニット 溶液 読み１ 読み２ 読み３ 平 均 ＮＬＵ＊ ＃１ ７５４．４ ７２７．８ ７５２．７ ７４５．０ ―― ＃２ ８５７．４ ８０１．０ ８５２．３ ８３６．９ ９１．９ ＃３ １１８５ １２１１ １１９２ １１９６ ４５１ ＊正味の光ユニット（ＮＬＵ）は特定のプローブ反応値からプローブなしの反
応の平均（＃１）を差し引くことにより計算した。
【０２２７】 存在する両方のＤＮＡ鋳型鎖を用いると、両プローブはバックグラウンドより
高いシグナルを与える。 使用した配列は以下のとおりであった： ＬＭ１ 5’GAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTA
G 3’配列番号９ ＬＭ２ 5’CTACTGGAGTTTCTTTCGTTTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTGCTTGTGTAGTTTGTTTTACTT
C 3’配列番号１０ ＬＭ３ 5’GCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAA 3’配列番号１１ ＬＭ４ 5’TTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTCG 3’配列番号１２ 実施例３：Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｙｌ遺伝子のセグメントの検出 この実施例においては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓから
のｈｙｌ遺伝子のセグメントの検出のための方法を記載する。
【０２２８】 オリゴヌクレオチドＬＭ５（配列番号１３）とＬＭ６（配列番号１４）は、ｈ
ｙｌ遺伝子の領域を創製するようにぴったりとアニールする。ＬＭ７（配列番号
１５）とＬＭ８（配列番号１６）オリゴヌクレオチドは質問プローブとして使用
したが、ＬＭ７は完全にＬＭ６に相補であり、そしてＬＭ８はＬＭ５に完全に相
補である。オリゴヌクレオチド５−８は１Ｘ ＴＥバッファーに５００μｇ／ｍ
Ｌの濃度にて溶解して、次にＴＥバッファーで２５倍に希釈することにより、２
０ｎｇ／μＬの濃度を得た。以下の溶液をアッセンブルした。 溶液 オリゴヌクレオチド １Ｘ ＴＥバッファー ＃１ ＬＭ５，１０μＬ １０μＬ ＃２ ＬＭ６，１０μＬ １０μＬ ＃３ ＬＭ７，１０μＬ １０μＬ ＃４ ＬＭ８，１０μＬ １０μＬ ＃５ ＬＭ５，１０μＬ；ＬＭ７，１０μＬ ― ― ＃６ ＬＭ５，１０μＬ；ＬＭ８，１０μＬ ― ― ＃７ ＬＭ６，１０μＬ；ＬＭ７，１０μＬ ― ― ＃８ ＬＭ６，１０μＬ；ＬＭ８，１０μＬ ― ― ＃９ ― ― ２０μＬ これらの溶液を９５℃にて３分間加熱して、次に室温において１５分間冷やし
た。
【０２２９】 以下のマスター混合物をアッセンブルした。 容量／反応 ナノピュア水（プロメガ ＡＡ３９９） １２．７５μＬ １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ Ｍ１９５） ２μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（プロメガ Ｃ１１３） ０．２５μＬ ＡＤＰ，２μＭ＊ １μＬ ＮＤＰＫ、０．１Ｕ／μＬ＊＊ １μＬ クレノーＥｘｏ− １０Ｕ／μＬ（プロメガ Ｍ２１８） １μＬ ＊シグマＡ５２５８を水に溶解することにより作成した。＊＊シグマＮ０３７
９を水に溶解することにより作成した。
【０２３０】 溶液１−９を冷やした後に、溶液の２μＬサンプルを１８μＬのマスター混合
物に３通りに加え、その結果の溶液を混合して３７℃において１５分間インキュ
ベートした。このインキュベーションの後に、チューブを氷の上に置いた。全て
のインキュベーションを氷の上で行ったら、チューブ中の２０μＬの内容物を１
００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてその結果の反応
の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して
直ぐに測定した。以下のデータが得られた。
【０２３１】 相対光ユニット 溶液 読み１ 読み２ 読み３ 平均 正味の平均 ＃１ ２８．５３ ２９．６２ ３０．０ ２９．４１ − − ＃２ ８１．３０ ７５．１２ ７４．６８ ７７．０３ − − ＃３ １９．８８ １３．１２ １２．８０ １５．２６ − − ＃４ １３２６ １２７３ １２１６ １２７１ − − ＃５ ３７．２４ ３６．４０ ３６．７７ ３６．８０ ３．７８ ＃６ ２５８２ ２３３６ ２１６９ ２３６２ １０８９ ＃７ ９０．８４ ９０．８３ ９０．６４ ９０．６４ ９．９７ ＃８ １５９６ １６７１ １７８７ １６８４ ３４７．６ ＃９ １２．３３ １１．１６ １１．４８ １１．６６ − − 上記のデータは、少なくともオリゴヌクレオチドＬＭ８を使用することにより
ＬＭ６中に示される標的遺伝子配列を検出することができることを示す。
【０２３２】 オリゴヌクレオチドＬＭ５とＬＭ６を１Ｘ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中にて２ｎｇ／μＬに希釈した。これら
の物質は３通りの以下の溶液を創製するためにも使用した。 溶液 ＬＭ５ ＬＭ６ ＬＭ７ ＬＭ８ １ＸＴＥ ＃１ ５μＬ ５μＬ ―― ―― １０μＬ ＃２ ５μＬ ５μＬ １０μＬ ―― ―― ＃３ ５μＬ ５μＬ ―― １０μＬ ―― これらの溶液を９５℃にて１０分間加熱して、次に１５分間室温において冷や
した。
【０２３３】 次に、溶液２μＬをこのマスター混合物の１８μＬのサンプルに加え、そして
その結果の溶液を３７℃において１５分間インキュベートした。このインキュベ
ーション後に、２μＬの上記溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０
２Ａ）に加え、そしてその結果の反応の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ
２０／２０ルミノメーターを使用して直ぐに測定した。以下のデータが得られた
。
【０２３４】 相対光ユニット 溶液 読み１ 読み２ 読み３ 平 均 ＮＬＵ＊ ＃１ ４４２．５ ４３１．８ ４３２．２ ４３５．５ ― ― ＃２ ５７６．１ ５４４．６ ５８０．１ ５６６．９ １１５．７ ＃３ １７７９ １８３７ １９０８ １８４１ １４０５ ＊正味の光ユニット（ＮＬＵ）は特定のプローブ反応値からプローブなしの反
応の平均（＃１）を差し引くことにより計算した。
【０２３５】 これらの結果は、上記の成分を使用してＬｉｓｔｅｒｉａのｈｙｌ遺伝子の配
列のセグメントの特異的検出が実施できること証明する。この遺伝子配列がＬｉ
ｓｔｅｒｉａに特定的であるため、これは上記成分をＬｉｓｔｅｒｉａのＤＮＡ
の特異的検出に使用する可能なことを示す。 ＬＭ５ 5’CATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACC
A 3’配列番号１３ ＬＭ６ 5’TGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCGCCTTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAGGTTGCCGTCGAT
G 3’配列番号１４ ＬＭ７ 5’CTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAA 3’配列番号１５ ＬＭ８ 5’TTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAG 3’配列番号１６ 実施例４：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＤＮＡ配列の検出 この実施例においては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの遺伝子配列の検出のための方
法を提供する。
【０２３６】 オリゴヌクレオチドＳＴ１（配列番号１７），ＳＴ２（配列番号１８），ＳＴ
３（配列番号１９），およびＳＴ４（配列番号２０）を１Ｘ ＴＥバッファーに
溶解して、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度の溶液を得た。以下の溶液を調製した。
溶液 オリゴヌクレオチド １Ｘ ＴＥバッファー ＃１ ＳＴ１，１０μＬ １０μＬ ＃２ ＳＴ２，１０μＬ １０μＬ ＃３ ＳＴ３，１０μＬ １０μＬ ＃４ ＳＴ４，１０μＬ １０μＬ ＃５ ＳＴ１，１０μＬ；ＳＴ３，１０μＬ ― ― ＃６ ＳＴ１，１０μＬ；ＳＴ４，１０μＬ ― ― ＃７ ＳＴ２，１０μＬ；ＳＴ３，１０μＬ ― ― ＃８ ＳＴ２，１０μＬ；ＳＴ４，１０μＬ ― ― ＃９ ― ― ２０μＬ これらの溶液を９５℃にて３分間加熱して、次に室温において１５分間冷やし
た。
【０２３７】 以下のマスター混合物をアッセンブルした。 成分 容量／反応 ナノピュア水（プロメガ ＡＡ３９９） １２．７５μＬ １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ Ｍ１９５） ２μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（プロメガ Ｃ１１３） ０．２５μＬ ＡＤＰ，２μＭ＊ １μＬ ＮＤＰＫ、０．１Ｕ／μＬ＊＊ １μＬ クレノーＥｘｏ− １０Ｕ／μＬ（プロメガ Ｍ２１８） １μＬ ＊シグマＡ５２５８を水に溶解することにより作成した。＊＊シグマＮ０３７
９を水に溶解することにより作成した。
【０２３８】 溶液１−９を冷やした後に、溶液の２μＬサンプル３つを１８μＬのマスター
混合物に３通りに加え、その結果の溶液を混合して３７℃において１５分間イン
キュベートした。このインキュベーションの後に、チューブを氷の上に置いた。
全てのインキュベーションを氷の上で行ったら、チューブ中の２０μＬの内容物
を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてその結果の
反応の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用
して直ぐに測定した。以下のデータが得られた。 溶液 読み１ 読み２ 読み３ 平均 正味の平均 ＃１ １８．２８ １８．２７ １７．９７ １８．１７ − − ＃２ ２３１．９ ２１１．４ ２２６．３ ２２３．２ − − ＃３ １１．５８ １２．５６ １１．３４ １１．８３ − − ＃４ １４．００ １４．４８ １４．８８ １４．４５ − − ＃５ ２１．３１ ２１．２０ １９．４４ ２０．６５ ２．１８ ＃６ ３００３ ２９４３ ２９１８ ２９５５ ２９３３ ＃７ ２７８０ ２７８２ ２６４１ ２７３４ ２５１０ ＃８ ２５６．４ ２６９．９ ２７１．１ ２６５．８ ３９．６７ ＃９ １１．６３ １１．３９ １１．５６ １１．５２ − − これらのデータは、両オリゴヌクレオチドプローブＳＴ３とＳＴ４がＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａからの一本鎖標的ＤＮＡ配列により極めて強い特異的光シグナルを
与えることが可能なことを示す。
【０２３９】 オリゴヌクレオチドＳＴ１とＳＴ２を１Ｘ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中にて２ｎｇ／μＬに希釈した。これら
の物質は３通りの以下の溶液を創製するためにも使用した。 溶液 ＳＴ１ ＳＴ２ ＳＴ３ ＳＴ４ １ＸＴＥ ＃１ ５μＬ ５μＬ ― ― ― ― １０μＬ ＃２ ５μＬ ５μＬ １０μＬ ― ― ― ― ＃３ ５μＬ ５μＬ ― ― １０μＬ ― ― これらの溶液を９５℃にて１０分間加熱して、次に１５分間室温において冷や
した。
【０２４０】 マスター混合物はこの実施例において前に記載されたとおりに作成した。室温
にて冷やした後に、各溶液２μＬをこのマスター混合物の１８μＬのサンプルに
加え、そしてその結果の溶液を３７℃において１５分間インキュベートした。こ
のインキュベーション後に、２μＬの上記溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロ
メガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてその結果の反応の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登
録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して直ぐに測定した。以下のデー
タが得られた。
【０２４１】 相対光ユニット 溶液 読み１ 読み２ 読み３ 平 均 ＮＬＵ＊ ＃１ ６９２．５ ７２８．９ ６７８．３ ６９９．９ ― ― ＃２ ２４４８ ２３８９ ２３１１ ２３８２ １６８３ ＃３ １７４２ １７７８ １７３８ １７５２ １０５３ ＊正味の光ユニット（ＮＬＵ）は測定された平均光ユニットからプローブ単独
の値（上記表参照）と溶液＃１の値を差し引くことにより計算した。
【０２４２】 これらの結果は、両ＤＮＡが存在する場合でさえ、オリゴヌクレオチドＳＴ３
とＳＴ４はＳａｌｍｏｎｅｌｌａからのＤＮＡ標的配列の特異的検出を提供する
ことを証明する。 使用した配列は以下のとおりであった： ＳＴ１ 5’TTTAATTCCGGAGCCTGTGTAATGAAAGAAATCACCGTCACTGAACCTGCCTTTGTCACC 3’配列
番号１７ ＳＴ２ 5’GGTGACAAAGGCAGGTTCAGTGACGGTGATTTCTTTCATTACACAGGCTCCGGAATTAAA 3’配列
番号１８ ＳＴ３ 5’TGTGTAATGAAAGAAATCACCGTCACTGAA 3’配列番号１９ ＳＴ４ 5’TTCAGTGACGGTGATTTCTTTCATTACACA 3’配列番号２０ 実施例５：メッセージ配列にぴったりとマッチするＤＮＡプローブの使用および
シグナルの不使用による上記ＤＮＡプローブがその３’末端においてミスマッチ
する場合の特定のメッセージの検出 この実施例においては、標的ＲＮＡ種の配列に相補なＤＮＡプローブのピロリ
ン酸化によりルシフェラーゼ光シグナルを生じさせる。さらに、上記プローブの
３’末端塩基が標的配列中のＲＮＡ塩基に相補でないならばこのシグナルは生じ
ないことを示す証拠を提示する。これらのデータは、プローブのピロリン酸化を
使用して特定の標的ＲＮＡ配列の存在を検出できること、および上記塩基にマッ
チしないべきであるがメッセージによりによりシグナルを与えないプローブを使
用することにより標的配列中の特定の塩基における変異が検出可能であることを
示す。
【０２４３】 マスター混合物は、 キャップしたカナマイシンＲＮＡ（０．６２ｍｇ／ｍＬ） １．２５μＬ ５Ｘ ＭＭＬＶ反応バッファー ５０μＬ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ２．５μＬ １０μＭ ＡＤＰ ２．５μＬ ＮＤＰＫ（１ Ｕ／μＬ） ５μＬ ＭＭＬＶ−ＲＴ（２００Ｕ／μＬ）（プロメガ、Ｍ１７０１） １２．５μＬ ナノピュア水 １６３．７５μＬ を含むようにアッセンブルした。
【０２４４】 プローブ１から４を１ｍｇ／ｍＬの濃度にて１Ｘ ＴＥバッファーに溶解した
。 プローブ１（配列番号２１）は、カナマイシンＲＮＡのコーディング領域のセ
グメントにぴったりと相補なようにデザインした。プローブ２（配列番号２２）
、プローブ３（配列番号２３）およびプローブ４（配列番号２４）はプローブ１
の配列にマッチさせるようにデザインしたが、但し、プローブの３’末端の塩基
をこの位置において他の３つのＤＮＡ塩基の各々の一つに変更した。
【０２４５】 １９マイクロリットルのマスター反応混合物を１０のラベルされた０．５ｍＬ
のマイクロ遠心分離チューブに入れて、以下の追加をチューブに行った：チュー
ブ１と２、１μＬの１Ｘ ＴＥバッファー；チューブ３と４、１μＬのプローブ
１；チューブ５と６、１μＬのプローブ２；チューブ７と８、１μＬのプローブ
３；そしてチューブ９と１０、１μＬのプローブ４。上記の１０の０．５ｍＬの
マイクロ遠心分離チューブは３７℃において２０分間インキュベートすることに
よりハイブリダイズさせて処理サンプルにした。その後、チューブの含有物のう
ち２μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そしてそ
の結果の反応の光出力をルミノメーターを使用して測定した。以下のデータが回
収された。 溶液 相対光ユニット １ ３．９８９ ２ ３．４５８ ３ ４９．９５ ４ ５２．２４ ５ ３．７７９ ６ ３．７２７ ７ ４．３９４ ８ ４．１６３ ９ ７．８７９ １０ ７．８１１ これらのデータは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズしたＤＮＡプローブをＭＭ
ＬＶ−ＲＴがピロリン酸化できること、そして形成された遊離のヌクレオシド３
リン酸がルシフェラーゼを使用して測定可能なＡＴＰに変換されることを示す。
さらに、データは、予測された塩基に対して３’ミスマッチのプローブを反応に
おいて使用した場合に、このシグナルが存在しないかまたは極めて弱いことを示
す（チューブ３と４に比較して）。 プローブ１ 配列番号２１ 5' GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTC 3' プローブ２ 配列番号２２ 5' GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTG 3' プローブ３ 配列番号２３ 5' GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTA 3' プローブ４ 配列番号２４ 5' GCAACGCTACCTTTGCCATGTTTT 3' 実施例６：特定のＲＮＡの検出：グロビンｍＲＮＡ この実施例においては、グロビンｍＲＮＡの２つの領域に相補なＤＮＡプロー
ブのピロリン酸化により生じた光シグナルを、同じ領域の正確な配列である２つ
のＤＮＡプローブからのシグナルと比較する。再び、標的ＲＮＡと全体で相補な
プローブがバックグラウンドより高いシグナルを与えることを示すが、一方標的
ＲＮＡと相補ではないプローブはほとんどあるいは全くシグナルを発しない。
【０２４６】 プローブ５（配列番号２５）、プローブ６（配列番号２６）、プローブ７（配
列番号２７）、およびプローブ８（配列番号２８）を１Ｘ ＴＥバッファー（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した
。精製されたグロビンのｍＲＮＡ（ギブコＢＲＬ，１８１０３−０２８）が標的
であり、１Ｘ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解して２０ｎｇ／μＬの濃度にした。
【０２４７】 ハイブリダイゼーション溶液は以下のとおりにアッセンブルした： 溶液１：１０μＬのプローブ５と１０μＬのグロビンｍＲＮＡ 溶液２：１０μＬのプローブ６と１０μＬのグロビンｍＲＮＡ 溶液３：１０μＬのプローブ７と１０μＬのグロビンｍＲＮＡ 溶液４：１０μＬのプローブ８と１０μＬのグロビンｍＲＮＡ 溶液５：１０μＬのプローブ５と１０μＬの１Ｘ ＴＥバッファー 溶液６：１０μＬのプローブ６と１０μＬの１Ｘ ＴＥバッファー 溶液７：１０μＬのプローブ７と１０μＬの１Ｘ ＴＥバッファー 溶液８：１０μＬのプローブ８と１０μＬの１Ｘ ＴＥバッファー 溶液９：１０μＬの１Ｘ ＴＥバッファーと１０μＬのグロビンｍＲＮＡ これらの溶液を０．５ｍＬに入れて、５０℃において１５分間加熱し、そして
室温に１５分間冷やした。
【０２４８】 以下のマスター反応混合物をアッセンブルした： ナノピュア水（プロメガ ＡＡ３９９） ３４６．５μＬ ＭＭＬＶ−ＲＴ ５Ｘ反応バッファー（プロメガ Ｍ１９５Ａ） １３２μＬ ピロリン酸ナトリウム（プロメガ Ｍ５３１） １６．５μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） ３３μＬ ＡＤＰ（２μＭ） ３３μＬ ＭＭＬＶ−ＲＴ（１００Ｕ／μＬに調整）（プロメガ Ｍ１７０１） ３３μＬ 上記溶液を混合して、１８μＬを２７のチューブに入れた。上記ハイブリダイ
ゼーション溶液各々の３つの２マイクロリットルサンプルを、マスター反応混合
物を含むチューブ２つに加え、そして上記チューブを次に３７℃において１５分
間インキュベートして室温において冷やすことによりハイブリダイズさせて処理
サンプルとした。上記チューブの内容物を次に１００μＬのＬ／Ｌ試薬に加え、
そしてその結果の反応の光生産をルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ（登録商標）Ｔ
Ｄ２０／２０）を使用して測定した。以下のデータを得た： ハイブリダイゼーション溶液 光値 平均 プローブ５＋ＲＮＡ 6.555 6.303 6.187 6.348 プローブ５＋ＴＥバッファー 6.335 5.923 6.046 6.101 プローブ６＋ＲＮＡ 137.8 128.5 169.2 145.2 プローブ６＋ＴＥバッファー 10.24 9.429 9.858 9.842 プローブ７＋ＲＮＡ 6.235 6.763 6.375 6.458 プローブ７＋ＴＥバッファー 6.436 6.545 6.138 6.388 プローブ８＋ＲＮＡ 90.34 95.42 54.7 80.15 プローブ８＋ＴＥバッファー 10.21 12.55 9.372 10.71 ＴＥバッファー＋ＲＮＡ 5.579 6.509 6.388 6.159 これらのデータは、プローブ６または８および標的ＲＮＡを含む反応混合物を
Ｌ／Ｌ試薬に加えた場合に強い光シグナルが観察されたが、標的ＲＮＡなしでプ
ローブをインキュベートしたか、あるいは標的ＲＮＡをこれらのプローブなしで
インキュベートした場合には、ほとんどシグナルが観察されなかった。さらに、
プローブ５と７は添加した標的ＲＮＡの存否に拘わらず極めて低いシグナルしか
提供しなかった。プローブ６と８は、グロビンのｍＲＮＡのコーディング領域中
の異なる２つの領域に相補なようにデザインした。プローブ５と７は、これらの
同じ標的ＲＮＡ領域の配列を正確にまねるように作成した。即ち、これらのデー
タは、如何にしてプローブのピロリン酸化を用いて特定のＲＮＡを検出すること
ができるかについての第２の例を提供する。 プローブ５ 配列番号２５ 5' ATGGTGCATCTGTCCAGTGAGGAGAA GTCT 3' プローブ６ 配列番号２６ 5' AGACTTCTCCTCACTGGACAGATGCA CCAT 3' プローブ７ 配列番号２７ 5' GCTGCTGGTTGTCTACCCATGGACCC 3' プローブ８ 配列番号２８ 5' GGGTCCATGGGTAGACAACCAGCAGC 3' 実施例７：ＲＮＡの特異的検出：外来の（extraneous）標的ＲＮＡの添加および
無添加の反応におけるプローブ配列にマッチするＲＮＡ種由来のシグナルの比較 実施例８に記載されたピロリン酸化反応を特定の標的配列の検出のために用い
るために、系に求められる他の条件は、プローブが外来ＲＮＡの存在下および非
存在下に極めて類似のシグナルを生じるべきことである。本実施例においては、
大量の酵母ＲＮＡの存在下にて標的グロビンｍＲＮＡを検出するようにデザイン
されたプローブのシグナルの強度を、添加した酵母ＲＮＡ不在下にて観察される
シグナルと比較する。
【０２４９】 種々の濃度の酵母ＲＮＡ、プローブ６（配列番号２６）またはプローブ８（配
列番号２８）および標的グロビンｍＲＮＡ（ギブコＢＲＬ，１８１０３−０２８
）を含有するハイブリダイゼーション溶液は、５μｌの５００ｎｇ／μＬのプロ
ーブ６またはプローブ８何れかを、１ＸＴＥバッファー（１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の５μＬの４０ｎｇ／μＬ標的グロビンｍＲＮＡおよび１
０μＬの酵母ＲＮＡ（シグマケミカル社、Ｒ３６２９）に添加して酵母ＲＮＡ総
量０，２，２０，２００，４００および８００ｎｇを含有する溶液とすることに
よりアッセンブルした。溶液を１５分間５０℃に加熱し、次に１５分間室温まで
冷やした。
【０２５０】 反応マスター混合物は上記実施例２のとおりにアッセンブルし、該混合物１８
μＬを１８本のチューブに入れた。１５分間冷却した後、プローブ６を含有する
様々なハイブリダイゼーション溶液２μＬをチューブに添加し、該チューブを３
７℃の加熱ブロックにいれた。
【０２５１】 反応マスター混合物と共にハイブリダイゼーション混合物を１５分間インキュ
ベートした後に、溶液２０μＬをＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）１００μ
Ｌに添加し、そしてその結果の反応物の光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ
−２０／２０ルミノメーターを用いて測定した。
【０２５２】 プローブ６のデータを回収した後、同一のセットの反応をプローブ８を含有す
るハイブリダイゼーション溶液を用いて実施した。以下のデータが得られた。 プローブ６反応 酵母ＲＮＡ 相対光ユニット 平均 なし ９６ １０９ １１１ １０５．３ ２ｎｇ ９８．４ ８５．０ １１８．５ １００．７ ２０ｎｇ １１７．９ １１０．９ ８２．７ １０３．６５ ２００ｎｇ ５６．４ １１０．１ ９３．２ ８６．６ ４００ｎｇ １１５．７ １１０．７ １２４．６ １１７ ８００ｎｇ １２７．６ １２８．７ １４３．１ １３３．１ プローブ８反応 酵母ＲＮＡ 相対光ユニット 平均 なし １０５．８ ９７．０ ８２．３ ９５．０ ２ｎｇ ８４．５ ８４．６ ９３．７ ８７．６ ２０ｎｇ ９９．６ １１１．７ １０４．９ １０５．４ ２００ｎｇ ８３．６ ７５．９ ９５．６ ８５．１ ４００ｎｇ ９４．７ ９７．２ ８１．９ ９１．２ ８００ｎｇ ５０．７ ８９．０ ８２．１ ７３．９ これらのデータは、極めて大量の酵母ＲＮＡのハイブリダイゼーション反応へ
の添加が、特定の標的ＲＮＡ種に関してハイブリダイズされたプローブからのシ
グナルを大きく低下させないことを示す。 プローブ６ 配列番号２６ 5' AGACTTCTCCTCACTGGACAGATGCACC AT 3' プローブ８ 配列番号２８ 5' GGGTCCATGGGTAGACAACCAGCAGC 3' 実施例８：プローブのピロリン酸化の使用によるプラスミド標的ＤＮＡに関する
初期の検出限界 前の２つの実施例においては、プラスミド標的ＤＮＡは、ＤＮＡ中の標的配列
にハイブリダイズしたプローブを用いて特異的に検出した。この実施例において
は、標的ＤＮＡのタイトレーションをピロリン酸化反応において実施することに
より、この反応からのシグナルを得るために必要なＤＮＡのレベルを測定した。
【０２５３】 ＳｐｈＩにより切断した標的ｐＫＡＮのＤＮＡ（４０，０００ｐｇ／μＬ）を
ヌクレアーゼ不含水を用いて連続希釈することにより、１０，０００，２，５０
０，６２５，１５６および３９ｐｇ／μＬの濃度を得た。これらのＤＮＡ標的溶
液各々を１μＬ、１μＬのプローブ１（配列番号２１）および１８μＬのヌクレ
アーゼ不含水を含む２通りの溶液を、１μＬのプローブ１と１９μＬのヌクレア
ーゼ不含水を含む溶液の対であるようにアッセンブルした。これらの溶液全てを
９５℃において３分間加熱して、次に１０分間室温まで冷やすことにより、ハイ
ブリダイゼーションを可能にして処理サンプルとした。２Ｘマスター混合物は以
下のとおりにアッセンブルした： ４０μＬ １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ、Ｍ１９５Ａ） １０μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １０μＬ（１０Ｕ／μＬ）クレノーｅｘｏマイナスＤＮＡポリメラーゼ（プロメ
ガ、Ｍ１２８Ｂ） ２μＬ １Ｕ／μＬのＮＤＰＫ ４μＬ １０μＭ ＡＤＰ １３４μＬ ヌクレアーゼ不含水。
【０２５４】 マスター混合物成分を混合して２０マスターＬの２Ｘマスター混合物を溶液の
各々に加えて、３７℃において２０分間インキュベートした。４μＬの溶液を含
むサンプルを次に１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そ
して反応により生じた光をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）２０／２０ルミノメーター
を使用して直ぐに測定した。以下のデータを得た： データ表 反応 アッセイしたＤＮＡ＊ 光ユニット ＃１ ４０００ｐｇ １６８．４ ＃２ ４０００ｐｇ １６９．４ ＃３ １０００ｐｇ ５７．７ ＃４ １０００ｐｇ ７７．９ ＃５ ２５０ｐｇ １９．３ ＃６ ２５０ｐｇ ２１．１ ＃７ ６２．５ｐｇ ６．３ ＃８ ６２．５ｐｇ ６．４ ＃９ １５．６ｐｇ ２．４ ＃１０ １５．６ｐｇ ２．３ ＃１１ ３．９ｐｇ １．４ ＃１２ ３．９ｐｇ １．４ ＃１３ ０ｐｇ １．１ ＃１４ ０ｐｇ １．４ ＊この数字はＬ／Ｌ溶液に移されたＤＮＡの相対量の数を反映する。
【０２５５】 これらのデータは、これらの条件下でのこの反応によるＤＮＡの検出限界が少
なくとも約６２．５ｐｇのＤＮＡであり、約１５．６ｐｇのＤＮＡまたはそれ以
下であるらしいことを示す。 プローブ１：配列番号２１：5'GCAACGTACCTTTGCCATGTTTC3' 実施例９：プラスミド中のβ−ガラクトシダーゼ標的遺伝子の検出 この実施例においては、互いに正確に相補な２つのプローブを使用する。プロ
ーブの一方はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列に厳密にマッチしており（セン
ス配向）、他方のプローブはその遺伝子の相補鎖（アンチセンス配向）に厳密に
マッチしている。この実施例は、両プローブを使用してプラスミドＤＮＡ中の標
的β−ガラクトシダーゼ遺伝子の存在を検出できるが、プローブＤＮＡのみを含
む反応により提供されるバックグラウンドシグナルのレベルが極めて異なり得る
ことを証明する。
【０２５６】 プローブ２３（配列番号２９）およびプローブ２４（配列番号３０）を上記の
ように溶解して、５００ｎｇ／μＬの濃度にして、次に、ヌクレアーゼを含まな
い水により１００および２００ｎｇ／μＬに希釈した。プラスミドｐＧＥＭ７ｚ
ｆ＋（プロメガ）をＳａｃＩ（プロメガ）により消化して標的とし、そして希釈
することにより、２０ｎｇのプラスミド標的ＤＮＡ／μＬ溶液を含む溶液を与え
た。
【０２５７】 以下の溶液をアッセンブルした： 溶液 プラスミドＤＮＡ プローブ、濃度 Ｈ2Ｏ（μＬ） （μＬ） ＃１ １ （なし、１Ｘ ＴＥバッファー １８ １μＬ加えた） ＃２ ０ １μＬプローブ２３、５００ｎｇ／μＬ １９ ＃３ ０ １μＬプローブ２３、１００ｎｇ／μＬ １９ ＃４ ０ １μＬプローブ２３、２０ｎｇ／μＬ １９ ＃５ １ １μＬプローブ２３、５００ｎｇ／μＬ １８ ＃６ １ １μＬプローブ２３、１００ｎｇ／μＬ １８ ＃７ １ １μＬプローブ２３、２０ｎｇ／μＬ １８ ＃８ ０ １μＬプローブ２４、５００ｎｇ／μＬ １９ ＃９ ０ １μＬプローブ２４、１００ｎｇ／μＬ １９ ＃１０ ０ １μＬプローブ２４、２０ｎｇ／μＬ １９ ＃１１ １ １μＬプローブ２４、５００ｎｇ／μＬ １８ ＃１２ １ １μＬプローブ２４、１００ｎｇ／μＬ １８ ＃１３ １ １μＬプローブ２４、２０ｎｇ／μＬ １８ これらの溶液を９５℃において３分間加熱し、そして室温まで冷やすことによ
り、ハイブリッドを形成して処理サンプルとした。次に、実施例８において記載
された通りに作成した２０μＬの２Ｘマスター混合物を加えて、該溶液をさらに
２０分間３７℃においてインキュベートした。各溶液４マイクロリットルを次に
１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）に加え、そして反応により生
じた光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用し
て直ぐに測定した。以下のデータを得た： 反応 光出力 正味の光出力＊ ＃１ ２．８ ＃２ ４．０ ＃３ １．９ ＃４ １．３ ＃５ ５２．４ ４５．６ ＃６ １３．６ ８．９ ＃７ ４．１ ０ ＃８ ３４．３ ＃９ ６．６ ＃１０ １．７ ＃１１ ５９．８ ２２．７ ＃１２ １９．３ ９．９ ＃１３ ６．０ １．５ ＊正味の光出力はプローブ単独の値とＤＮＡ単独の値を存在する両成分を用い
て得られた値から差し引くことにより計算する。
【０２５８】 これらのデータは、両プローブを使用することにより、これらプローブにマッ
チするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする標的領域がプラスミド中に存在
することを示すシグナルを生じることが可能なことを示す。それらは、標的ＤＮ
Ａ不在下でプラスミドにより生じるシグナルのレベルが変更可能であること、お
よびプローブおよびそのプローブの相補体からのシグナルが必ずしも等しくない
ことも証明する。 プローブ２３ 配列番号２９ 5' CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT 3' プローブ２４ 配列番号３０ 5' ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA CTG 3' 実施例１０：ラムダＤＮＡ上の特定の標的ＤＮＡ配列の検出 この実施例においては、組換えラムダファージのＤＮＡ中の標的β−ガラクト
シダーゼ遺伝子の検出を示す。
【０２５９】 ２通りの溶液を作成し、以下を含んだ：溶液１および２、１μＬの３００ｎｇ
／μＬのラムダｇｔ１１のＤＮＡおよび１９μＬのヌクレアーゼ不含水；溶液３
および３、１μＬの５００ｎｇ／μＬのプローブ２３（配列番号２９）および１
９μＬのヌクレアーゼ不含水；溶液５および６、１μＬの３００ｎｇ／μＬのラ
ムダｇｔ１１のＤＮＡ、１μＬの５００ｎｇ／μＬのプローブ２３および１８μ
Ｌのヌクレアーゼ不含水。これらの溶液全てを９５℃において３分間加熱して、
次に１０分間室温まで冷やすことにより、相補鎖間ハイブリダイゼーションを起
こさせ、そして処理サンプルとした。この点において、この実施例において上に
記載した通りに作成した２０μＬの２Ｘマスター混合物を加えて、溶液をさらに
２０分間３７℃においてインキュベートした。各ピロリン酸分解反応の４μＬの
サンプルを次にとり、そして１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）
に加え、そして溶液の光生産をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノ
メーターを使用して直ぐに測定した。以下のデータを得た。 反応 ＤＮＡ成分 光ユニット ＃１ 標的ラムダＤＮＡ １６．５ ＃２ 標的ラムダＤＮＡ ７．４ ＃３ プローブ２３ ２．９ ＃４ プローブ２３ ２．９ ＃５ 標的ラムダＤＮＡとプローブ２３ ８８．１ ＃６ 標的ラムダＤＮＡとプローブ２３ ７０．４ これらのデータは、ピロリン酸化系を使用することにより、ラムダｇｔ１１の
ＤＮＡ上の特定の標的配列にハイブリダイズしたプローブを検出できることを示
す。 プローブ２３ 配列番号２９ 5' CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT 3' 実施例１１：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのゲノム中のＤＮＡ配
列の検出 オリゴヌクレオチド１１４５３（配列番号３１）および１１４５４（配列番号
３３）はぴったり相補であり、アニールさせることができ、それによりＣａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの７０ｂｐのセグメントを表す合成標的を形
成する。これらの２つのオリゴヌクレオチドをナノピュア水で希釈して最終濃度
１０μｇ／ｍｌとした。次に各々４μＬを２３２μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ７．３と混合し、ＤＮＡ０．３μｇ／ｍＬの標的溶液を生じさせた。オリゴヌ
クレオチド１１４５１（配列番号３２）および１１４５０（配列番号３４）は合
成標的に表される細菌ゲノムの反対の鎖に結合するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉの質問プローブである。オリゴヌクレオチド１１４５１はオリゴ
ヌクレオチド１１４５４にアニールする。オリゴヌクレオチド１１４５０はオリ
ゴ１１４５３にアニールする。
【０２６０】 以下の溶液を３通りアッセンブルして、しナノピュア水を最終容量２０μＬと
なるまで添加した。 溶液 ０．３ｎｇ標的 １μｇプローブ ｒｌｕ １． ＋ １１４５１ ３９１ ２． ＋ １１４５０ ２４１ ３． ＋ なし ２８ ４． − １１４５１ ２４８ ５． − １１４５０ ３０ ６． − なし ２４ アッセンブルした溶液を５分間９２℃でインキュベートし、次に１０分間室温
にて冷却した。マスター混合物を１０ユニットのクレノーｅｘｏ−ポリメラーゼ
および４ユニットのＮＤＰＫを用いて実施例１に記載されたとおりに調製した。
マスター混合物２０マイクロリットルを各チューブに添加し、１５分間３７℃で
インキュベートした。次に各溶液５マイクロリットルを１００μＬのＬ／Ｌ試薬
（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）と合わせ、光出力を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）
ＴＤ２０／２０ルミノメーターで測定した。平均の相対光ユニット（ｒｌｕ）を
上記表中に記録する。
【０２６１】 標的と共に各質問プローブを用いることは強力な正味のシグナルを与えるらし
い。しかしながら、一番上のプローブ（１１４５１）は、おそらくヘアピンの形
成により、る極めて強力なシグナルのみを与え、質問にはあまり適さない。一番
下の質問プローブ（１１４５０）が質問にはより適する。 １１４５３ 5’CTTGAAGCATAGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTGAGCCGCTTGAGTTGCCTTAGTTTTAATAG
T 3’配列番号３１ １１４５４ 5’ACTATTAAAACTAAGGCAACTCAAGCGGCTCAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGAACTATGCTTCAA
G 3’配列番号３３ １１４５１ 5’AGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTG 3’配列番号３２ １１４５０ 5’CAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGAACT 3’配列番号３４ 実施例１２：ヘテロ接合性の損失に関する質問−ＣＭＶ 合成サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）標的を用いてヘテロ接合性の損失を測定
するための質問アッセイの使用をこの実施例において示す。
【０２６２】 ＣＭＶ標的を選んだのは、質問プローブオリゴヌクレオチド９２１１（配列番
号３５）および９２１２（配列番号３６）を以前に使用してよく特徴付けされて
いるからである。オリゴヌクレオチド１０８００（配列番号３７）および１０８
０１（配列番号３８）をアニールさせることにより、ＣＭＶゲノムの断片を表す
合成標的「Ａ」を生じさせた。同様に、オリゴヌクレオチド１０８０３（配列番
号３９）および１０８０５（配列番号４０）をアニールさせることにより、ＣＭ
Ｖゲノムの断片を表す合成標的「Ｇ」を生じさせた。標的Ａおよび標的Ｇは、そ
れらの名称をもたらす結果となったヌクレオチドを有する場所である１カ所のヌ
クレオチド位以外は同一である。
【０２６３】 標的をｐＺＥＲＯ−２プラスミド（インビトロジェン）のＳａｃＩ制限部位に
クローン化して、ＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）を形質転換した。
ＡクローンとＧクローンの正確なヌクレオチド配列の存在は、配列決定により確
認した。しかしながら、Ｇクローンは、質問プラスミドにアニールする領域の５
’末端から３塩基のヌクレオチド位置において意図しない変異を含むことがわか
った。このミスマッチは質問プラスミドのアニーリング配列の５’末端に近いた
め、質問結果に影響しないであろう。
【０２６４】 クローンＡおよびクローンＧを用いて以下の５つの標的溶液を作成した： １．Ｈｅｔｅｒｏ：１２５ｐｇのＡおよび１２５ｐｇのＧ／マイクロリットル ２．ＬＯＨ Ａ：１２５ｐｇのＡ／マイクロリットルでＧはなし ３．ＬＯＨ Ｇ：Ａなしで１２５ｐｇのＧ／マイクロリットル ４．Ｍｉｘ Ａｇ：１２５ｐｇのＡおよび６２ｐｇのＧ／マイクロリットル ５．Ｍｉｘ Ｇａ：６２ｐｇのＡおよび１２５ｐｇのＧ／マイクロリットル これらの標的溶液は、ＪＨ６７（配列番号４１）および１１０７７（配列番号
４２）プローブを用いて以下の反応中でＰＣＲ増幅した： ２μＬ 標的溶液 １μＬ プローブＪＨ６７および１１０７７（各５０ｐｍｏｌ） １μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ １０Ｘ Ｔａｑバッファー １μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ４０μＬ 水 ＰＣＲ循環のパラメーターは、９６℃、１分間；（９４℃、１５秒間；６０℃
、３０秒間；７２℃、４５秒間）Ｘ１５；７２℃、４５秒間であった。次に、５
００μＬのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＲＰＰ精製樹脂（プロメガ、Ａ７１７０
）を用いて、製造者の指示書に従い、全ＰＣＲ反応物を精製した。３０μＬのＴ
Ｅバッファーを用いてＤＮＡを溶出した。６μＬの標的および１μＬの質問プロ
ーブを用いた標準質問反応を実施したが、反応あたり２ユニットのクレノーｅｘ
ｏ−を用いたのが例外であった。４マイクロリットルの最終反応物を１００μＬ
のＬ／Ｌ試薬と混合して相対光ユニットを測定した。
【０２６５】 ヘテロ接合体 LOH A LOH G 混合Ax 混合Ga オリゴのみ オリゴなし 30 40 65 29 34 51 19 59 26 41 − Ａオリゴ 279 340 74 329 27 27 258 309 50 164 5.2 308 372 76 339 20 26 351 330 83 167 5.2 Ｇオリゴ 302 324 37 91 285 272 127 106 245 302 6.3 278 325 30 87 256 187 113 124 215 357 6.3 Ａ：Ｇ比 1.01 1.10 2.26 3.76 0.09 0.11 2.54 2.78 0.29 0.50 これらのデータは、適切な質問プローブを用いたこの方法を使用してＬＯＨが
測定できることを例示する。 １０８００ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCATGAACGTGCTCATCGACGTGAACCCGCAC
AACGAGCT 3’配列番号３７ １０８０１ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCATGGGTGTAATATCAAAGTGGCATA
CACGAGCT 3’配列番号３８ １０８０３ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCGTGAACGTGCTCATCGACGTGAACCCGCAC
AACGAGCT 3’配列番号３９ １０８０５ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCACGGGTGTAATATCAAAGTGGCATA
CACGAGCT 3’配列番号３９ ＪＨ６７ 5’TCACACAGGAAACAGCTATGACCATG 3’配列番号４１ １１０７７ 5’GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG 3’（Ｍ１３フォワードプライマー
）配列番号４２ ９２１１ 5’CACTTTGATATTACACCCATG 3’配列番号３５ ９２１２ 5’CACTTTGATATTACACCCGTG 3’配列番号３６ 実施例１３：ウイルス荷重の測定 この実施例は、血清サンプル中のウイルス核酸の存在を、サンプルあたり１０
コピーウイルス核酸の検出レベルで測定できることを例示する。
【０２６６】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を感染したかまたは感染していないヒト血清サン
プルから単離した。ＨＣＶ−特異的プローブおよび約１０００のウイルスに等し
いＲＮＡを用いて２段階のＲＴ−ＰＮＰを実施し、そしてサンプルを質問プロー
ブＨＣＶ１（配列番号４３）を用いて質問した。
【０２６７】 ２つのＨＣＶ陽性サンプル、一つのＨＣＶ陰性サンプル、および水の対照を２
通り分析した。質問反応物を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２Ａ）
に加え、そして光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメータ
ーを使用して直ぐに測定した。平均相対光ユニット値は以下のとおりであった：
水対照 ３８．６ ＨＣＶマイナス ２３９．０ ＨＣＶ陽性（１） １２６１．０ ＨＣＶ陽性（２） １３９０．０ この技術を使用してウイルス検出の感度を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲを、
ＨＣＶ陽性およびＨＣＶ陰性対照並びに１０００、１００および１０ウイルスＲ
ＮＡコピーと見積もられたサンプルに対して実施した。２５マイクロリットルの
各増幅反応物を磁気シリカを用いて以下のとおりに精製し、そして１００μＬの
水に溶出した。
【０２６８】 １．０．４Ｍグアニジンチオシアネートおよび０．０８Ｍ酢酸カリウムを含む
溶液中の１５μＬのＭａｇｎｅＳｉｌ（商標名）常磁性体粒子（プロメガ）を含
むスラリー２００μＬを各サンプルに加えた。
【０２６９】 ２．ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標名）常磁性体粒子を溶液中で混合し、磁石を用い
てチューブの側面に捕まえた。 ３．２００μＬの７０％エタノールを用いて２回、該溶液をチューブに加える
ことにより粒子を洗浄し、溶液中に粒子を懸濁し、磁石を用いてチューブの壁に
粒子を再度捕獲し、そして粒子不含溶液を除去した。
【０２７０】 ４．粒子を再度５０マイクロリットルの水に懸濁した。 ５．２００μＬの０．４Ｍ ＧＴＣおよび０．０８Ｍの酢酸カリウムをそれぞ
れに加えた。
【０２７１】 ６．工程２を上記のとおりに繰り返したが、但し、７０％エタノールを用いて
３回洗浄を実施した。 ７．粒子を１００μＬの水に懸濁して、粒子をチューブの側面に捕まえて、そ
して精製されたＤＮＡを含む溶液を新しいチューブに移した。
【０２７２】 水で２０マイクロリットルの全量に希釈した質問プローブを使用して、４マイ
クロリットルの溶出ＤＮＡを質問した。核酸溶液を９５℃にて３分間加熱して、
次に、３７℃のインキュベーター中に１０分間置いた。以下のマスター混合物を
アッセンブルした： １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ Ｍ１９５） ２０μＬ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ５μＬ １０Ｕ／μｌ クレノーＥｘｏマイナス（プロメガ Ｍ２１８） ５μＬ ＮＤＰＫ（シグマ、ＮＯ３７９，水中１０Ｕ／μＬ） １μＬ ＡＤＰ（シグマＡ５２５８，水中１０μＭ） ２μＬ 水 ６７μＬ １００μＬ ３７℃において１０分間インキュベーションした後の加熱ヌクレオチド混合物
各々に、２０マイクロリットルのマスター混合物を加えた。その結果の反応物を
、１５分間３７℃においてインキュベートして、次に１００μＬのＬ／Ｌ試薬）
に加え、そして光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメータ
ーを使用して測定した。平均相対光ユニット（ｒｌｕ）値は以下のとおりであっ
た： サンプル ｒｌｕ 水 ４９．０ 水 ５４．２ ＨＣＶ陰性対照 ５９．４ ＨＣＶ陰性対照 ６２．１ ＨＣＶ陽性対照 ６５３．７ ＨＣＶ陽性対照 ７４３．１ ＨＣＶ１０００コピー ４６０．７ ＨＣＶ１０００コピー ４２９．５ ＨＣＶ１００コピー ４０５．１ ＨＣＶ１００コピー ４０４．３ ＨＣＶ１０コピー １８４．９ ＨＣＶ１０コピー １７９．５ ＨＣＶ１： 5' CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGG 3' 配列番号４３ 実施例１４：遺伝学上修飾された生物のＤＮＡ配列の質問 １９９７年に採択された新規食品および新規食品添加物に関する欧州ユニオン
（ＥＵ）の規則に従うと、遺伝学上修飾された食品は、それらがそれらの在来の
同等物とは「もはや等しくない」か否かのように表示しなければならない。これ
は、食品が在来の食品と異なる組成、用途または栄養価を有する場合を含む。Ｅ
Ｕは次に、遺伝学上修飾された蛋白質またはＤＮＡのほんの断片の存在が、ダイ
ズおよびトウモロコシの在来産物とは「もはや等しくない」産物を作るのに十分
であり、よって、そのような産物は表示を必要とすることを決定した。
【０２７３】 遺伝学上修飾された生物（ＧＭＯ）、特に植物は、しばしば遺伝学上修飾され
ることにより、外因性転写因子、例えば３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミ
ネーターと共に目的の外因性の特定のＤＮＡを含む。この実施例においては、ダ
イズおよびトウモロコシのＤＮＡを、３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネ
ーターの存否に関して分析した。ＰＣＲプライマー３５Ｓ−１（配列番号４４）
および３５Ｓ−２（配列番号４５）を使用することにより、２３５ｂｐのＰＣＲ
産物を生成した。プライマーＮＯＳ−１（配列番号４６）およびＮＯＳ−２（配
列番号４７）を使用することにより２２０ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。
【０２７４】 ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターＰＣＲプライマー対５０ｐｍ
ｏｌを使用して、ＧＭＯ陽性および陰性対照ＤＮＡ（２０ｎｇ）をＰＣＲ増幅し
た。ＰＣＲ循環プロフィールは、９４℃、３分間；（９４℃、３０秒間；５４℃
、４０秒間；７２℃、１分間）Ｘ４０；７２℃、３分間であった。その結果のＰ
ＣＲ産物（２５μＬ）は、実施例１３に記載されたとおりに磁気シリカを使用し
て精製して、１００μＬの水に溶出した。溶出されたＰＣＲ産物４マイクロリッ
トルを実施例１３に記載されたとおりに標準質問アッセイにおいて使用して、相
対光ユニット（ｒｌｕ）の結果を以下の表に詳細に記載する。使用した３５Ｓ質
問プローブは、１１２１１（配列番号４８）および１１２１０（配列番号４９）
であった。使用したＮＯＳ質問プローブは、１１２１２（配列番号５０）および
１１２１３（配列番号５１）であった。 ＤＮＡ ＰＣＲオリゴ 質問オリゴ ｒｌｕ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１０ １６６．６ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１０ １７２．０ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ ２０６．８ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ ２０５．８ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ なし ９５．７ ＧＭＯマイナス、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１０ ２４５．０ ＧＭＯマイナス、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１０ ２５４．３ ＧＭＯマイナス、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１１ ２７１．３ ＧＭＯマイナス、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１１ ２７５．７ ＧＭＯマイナス、トウモロコシ ３５Ｓ なし １１６．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１０ １４５６．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１０ １４４２．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ １５４６．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ １５２９．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ なし ８６５．０ ＧＭＯ陽性、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１０ １２５２．０ ＧＭＯ陽性、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１０ １２９９．０ ＧＭＯ陽性、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１１ １３５８．０ ＧＭＯ陽性、トウモロコシ ３５Ｓ １１２１１ １３６１．０ ＧＭＯ陽性、トウモロコシ ３５Ｓ なし ７０５．６ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ １１２１２ ７３．９ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ １１２１３ ７５．８ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ なし ７６．１ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ １１２１２ ６１５．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ １１２１３ ６１６．６ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ １１２１０ ９８．０ 上記のデータは、質問反応がダイズおよびトウモロコシの産物から単離された
ＤＮＡサンプル中のＧＭＯのＤＮＡの存否の同定のために役に立つことを証明す
る。３５ＳＰＣＲ産物は単独で高いバックグラウンドレベルを与え、実施例１３
および以下に記載されるとおりにＰＣＲ反応のために５’末端近傍にホスホロチ
オエート結合を有するプライマーを使用して、次にｅｘｏ６処理してＰＣＲ産物
の一方の鎖を除去することにより、低下させることができる。ＰＣＲプライマー
３５Ｓ１およびＮＯＳ１を、５’末端の初めの５塩基の間にホスホロチオエート
結合を有するように再合成した。
【０２７５】 ＮＯＳプライマー１１２１２および３５Ｓプライマー１１２１１を５ユニット
のクレノーｅｘｏ−と共に使用して、４マイクロリットルの精製ＤＮＡを標準質
問アッセイに使用した。得られたｒｌｕデータは以下の表にある。 ＤＮＡ ＰＣＲオリゴ 質問オリゴ ｒｌｕ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ １１２１２ ５２．３ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ １１２１１ ６０．２ ＧＭＯマイナス、ダイズ ＮＯＳ なし ５３．３ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ １１２１２ ２７７．１ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ １１２１１ ８４．４ ＧＭＯ陽性、ダイズ ＮＯＳ なし ７５．７ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１２ ５７．８ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ ６６．９ ＧＭＯマイナス、ダイズ ３５Ｓ なし ５４．６ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１２ ９９．７ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ １１２１１ ３９７．６ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ なし ８６．０ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ＋ＮＯＳ １１２１２ ２４９．４ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ＋ＮＯＳ １１２１１ ２９０．１ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ＋ＮＯＳ 11211＋11212 ４８２．５ ＧＭＯ陽性、ダイズ ３５Ｓ＋ＮＯＳ なし ７０．５ この方法は、３５ＳＰＣＲ産物からのバックグラウンドを大きく減少させて、
ＧＭＯ陽性とＧＭＯマイナスのＤＮＡサンプルの間の良好な識別を可能にした。
また、この方法は再びＰＣＲ反応と質問反応両者の複合化のための技術の利用性
を証明する。上記の最後の４つの反応において観察されるとおり、複数のＰＣＲ
プローブおよび／または複数の質問プローブの使用はＧＭＯ生物の同定を導くこ
とをデータが示す。 ３５ＳプロモーターＰＣＲプライマー： ３５Ｓ−１ 5' GATAGTGGGATTGTGCGTCA 3' 配列番号４４ ３５Ｓ−２ 5' GCTCCTACAAATGCCATCA 3' 配列番号４５ ＮＯＳターミネーターＰＣＲプライマー： ＮＯＳ−１ 5' TTATCCTAGTTTGCGCGCTA 3' 配列番号４６ ＮＯＳ−２ 5' GAATCCTGCTGCCGGTCTTG 3' 配列番号４７ ３５Ｓ質問オリゴヌクレオチドプローブ： １１２１１ 5' GCAAGTGGATTGATG 3' 配列番号４８ １１２１０ 5' CCAACCACGTCTTCAAA 3' 配列番号４９ ＮＯＳ質問オリゴヌクレオチドプローブ： １１２１２ 5' TTTATGAGATGGGTTT 3' 配列番号５０ １１２１３ 5' ATGATTAGAGTCCCG 3' 配列番号５１ 実施例１５：質問アッセイ後であるがリン酸転移および光生産前のｄＮＴＰｓの
ＨＰＬＣ分離 マッチしたプローブ／標的ハイブリッドおよびミスマッチのプローブ／標的ハ
イブリッドについて、大量のピロリン酸分解アッセイを実施した。放出されたヌ
クレオチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および回収されたそれら
の画分により分離した。ＮＤＰＫ末端リン酸転移反応をこれらの濃縮画分に実施
して、ルシフェラーゼアッセイを実施することによりオリジナルのマッチおよび
ミスマッチのハイブリッド処理サンプルの間の識別を例示した。
【０２７６】 標的／プローブハイブリッドは、合成野生型ＣＭＶ標的オリゴヌクレオチド３
１５ｎｇを、マッチハイブリッド用の野生型ＣＭＶプローブ１０．５μｇまたは
ミスマッチハイブリッド用の変異ＣＭＶプローブ１０．５μｇの何れかと混合し
て、最終容量２００μＬまで水を加えることにより形成した。オリゴヌクレオチ
ドは、前の実施例１において記載されたとおり、ＣＶ１２（配列番号２），ＣＶ
１５（配列番号５），およびＣＶ１６（配列番号６）であった。これらの溶液を
少なくとも５分間９５℃まで加熱して、次に少なくとも１０分間室温まで冷やし
た。
【０２７７】 以下のマスター混合物を調製した。 ３３７．５μＬ ナノピュア水（プロメガ、ＡＡ３９９） ９０．０μＬ １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ、 Ｍ１９５Ａ） １１．２５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ（プロメガ、Ｃ１１３） マスター混合物（２１０μＬ）を、上記ハイブリッド溶液各々に加え、そして
５．８ユニットのクレノーｅｘｏ−（プロメガ、Ｍ２１８Ａ）を各々に加えた。
溶液は次に３７℃において１５分間インキュベートして氷の上に置いた。ｄＮＴ
ＰｓのＨＰＬＣ分離を実施した。
【０２７８】 ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰのＨＰＬＣ分離をＰｈｅｎｏｍｅ
ｎｅｘの１００Ｘ４．６ｍｍ、３μＬｕｎａ Ｃ１８カラム［Ｐｅｒｒｏｎｅ
ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３１７：３０１−３
１０（１９８４）］上で実施した。９７パーセントバッファーＡ（１００ｍＭト
リエチル酢酸アンモニウム、ｐＨ７）から９２パーセントバッファーＡの直線勾
配により１２分の時間をかけてカラムを溶出した。バッファーＢの組成は８０：
２０アセトニトリル：３５ｍＭトリエチル酢酸アンモニウムである。２５０、２
６０および２８０ｎｍにおける吸光により検出を監視した。この条件下で、ｄＣ
ＴＰが４分と４．５分の間に溶出され、ＴＴＰとｄＧＴＰが２つのピークとして
７分と７．５分の間に溶出され、そしてｄＡＴＰが９分と９．５分の間に溶出さ
たことがわかった。
【０２７９】 遊離のｄＮＴＰｓを含む画分を回収して凍結乾燥した。画分１はｄＣＴＰを含
み、画分２はｄＧＴＰとＴＴＰを含み、そして画分３はｄＡＴＰを含んだ。 各画分はナノピュア水１００μＬ中で元に戻した。１０マイクロリットルの各
画分、または１０μＬの対照としての水を、水、１０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバ
ッファー、およびＡＤＰの１０μＬ混合物に加えて、最終濃度を１Ｘ ＤＮＡ
ｐｏｌバッファーおよび０．１μＭ ＡＤＰにした。ＮＤＰＫ（０．００５ユニ
ット）を１セットのチューブの各チューブに加え、そして等量の水を別のセット
のチューブの各チューブに加えた。サンプルと対照は３７℃において１５分間イ
ンキュベートして、１０μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬に加えて、光出力をＴｕ
ｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して測定した。得ら
れた相対光ユニット（ｒｌｕ）の結果を以下に示す： サンプル トライアル１ トライアル２ トライアル３ 平均ｒｌｕ ＮＤＰＫありのマッチハイブリッド 画分１ ２０６．６ ２００．６ ２０５．９ ２０４．４ 画分２ ８３９．４ ８５１．６ ８３３．９ ８４１．６ 画分３ １１４９．０ １１５０．０ １１６９．０ １１５６ ＮＤＰＫありのミスマッチハイブリッド 画分１ １０１．８ ９７．０ ９８．９ ９９．９ 画分２ ３８６．１ ３８７．３ ３８２．２ ３８５．２ 画分３ ４１２．４ ４０９．９ ４１６．５ ４１２．９ ＮＤＰＫなしのマッチハイブリッド 画分１ ６．８ ６．５ − − ６．６ 画分２ １０．９ １１．５ − − １１．２ 画分３ ３３．０ ３７．８ − − ３５．４ ＮＤＰＫなしのミスマッチハイブリッド 画分１ ６．２ ６．７ − − ６．４ 画分２ ８．３ ８．４ − − ８．４ 画分３ １３．４ １３．５ − − １３．４ ｄＮＴＰ ７．９ ７．５ − − ７．７ 上記の表から観察されるとおり、画分のマッチ：ミスマッチの比率は２．１、
画分２のマッチ：ミスマッチの比率は２．２そして画分３のマッチ：ミスマッチ
の比率は２．８である。データは、従って、ここのヌクレオチドのＨＰＬＣ分離
、続く、ルシフェラーゼの好ましい基質であるＡＴＰへのＮＤＰＫ変換を用いる
利用性を証明する。画分３はヌクレオチドＨＰＬＣ画分中のｄＡＴＰの存在によ
るわずかに高いマッチ：ミスマッチ比を提供する。にもかかわらず、同定用ヌク
レオチドのＨＰＬＣ分離は本発明の質問アッセイにおいて有用である。 ＣＶ１２ 5' CCAACAGACGCTTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGGTCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAG
CGAGCT 3' 配列番号２ ＣＶ１５ 5' CTACCACGAATGCTCGCAGAC 3' 配列番号５ ＣＶ１６ 5' CTACCACGAATGCTCGCAGAT 3' 配列番号６ 実施例１６：ヌクレオチド検出のための質量分光測定 質量分光測定計は様々な分子の電荷に対する分子質量の比を使用することによ
りそれらを同定する。核酸は４つの異なる塩基分子により構成され、各々は異な
る電荷比率を有する。この実施例においては、ＤＮＡを構成するヌクレオチドの
分離のための質量分光測定の使用の可能性を証明する。
【０２８０】 １μＭおよび０．１マイクロＭのｄＮＴＰ分子のＥＳＩＭＳ（エレクトロスプ
レーイオン質量分光測定）の分光を測定した（Ｆｉｓｏｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，ＶＧプラットフォーム）。アセトニトリル／水／１％ＮＨ4ＯＨを用い
て１：１希釈することによりサンプルを調製した。２０μＬの注入を各サンプル
に行った。よって、１０ピコモルの各ｄＮＴＰｓが１μＭサンプル注入物中にあ
り、そして１ピコモルの各ｄＮＴＰが０．１μＭサンプル注入物中にあった。
【０２８１】 ｄＮＴＰｓ各々はｄＮＴＰ＋Ｎａ+ピークを伴って１μＭサンプル中に観察さ
れる。４８５ピークも存在し、系またはサンプル中の不純物である。ｄＮＴＰｓ
各々のピークは０．１μＭサンプル中においては顕著に減少する；ｄＡＴＰのピ
ークのみがノイズレベルを超える。よって、１μＭサンプルと０．１μＭサンプ
ルの間の差異は定量測定でき、プローブと標的がプローブの３’領域においてマ
ッチの場合とミスマッチの場合の質問サンプル間の違いを測定する能力を示唆す
る。 実施例１７：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の薬剤耐性変異体の検出 インビボにおける化学治療性選択の圧力は、薬剤を破壊することを意図する感
染病原体のゲノム内の変異をもたらす。進化上の適合のこの証明は、プロテア−
ゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤の選択圧の下でのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）に関して広く報告される（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｉｃａｄｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，７３：３７４４−３７５２，１９９９；Ｂａｃｋ，ＥＭＢＯ Ｊ．，
１５）。
【０２８２】 治療の間に選択される最初のウイルス変異体は、典型的には、単一のアミノ酸
置換を有する変異体である。ＨＩＶの逆転写酵素（ＲＴ）およびプロテアーゼの
遺伝子のヌクレオチドのいくつかは、そのような点変異を起こす「ホットスポッ
ト」として当業界では知られる。追加の変異が進行中の治療と共に蓄積する。Ａ
ＺＴを用いて約６カ月から１年間の治療の後、ＨＩＶは典型的にＲＴ遺伝子を変
異させ、治療に耐性となる。
【０２８３】 信頼できて感度の良いアッセイにおいてそのようなウイルス変異ゲノムを検出
して同定する可能性は、感染の進行を理解することおよび感染した個体のための
最良の治療療法の開発を伴ってアシストする。耐性変異ウイルスを捕まえる前か
直後に別の治療にスイッチすることは患者の生命を引き伸ばすのに重要である。
【０２８４】 この実施例は、逆転写酵素阻害剤、例えばＡＺＴやｄｄＩのようなヌクレオチ
ド類似体の選択圧の下で、ＨＩＶ−１の逆転写酵素遺伝子内に起こる薬剤耐性変
異が、本発明のプロセスを使用して検出できることを証明する。ＲＴ変異の３つ
の特定の「ホットスポット」部位を研究のために選択した。これら３つの変異の
全てはＲＴ遺伝子の短い領域内に存在し、該蛋白質のコドン６５から７５の約１
０アミノ酸に及ぶ。
【０２８５】 ＲＴのコドン６７（部位１）は薬剤ＡＺＴ存在下でＧＡＣからＡＡＣへ変え、
コドン７０（部位２）はＡＺＴ存在下でＡＡＡからＡＧＡに変え、そしてコドン
７５（部位３）は薬剤ＡＺＴとｄｄＩの組み合わせの存在下でＧＴＡからＡＴＡ
に変える。標的オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ２野生型ゲノムのＲ
Ｔゲノムのコドン６５から８１に及ぶように合成し、並びに部位１、部位２およ
び部位３の点変異に関して上で定義されたとおりに１カ所においてのみ変更した
オリゴヌクレオチドを合成した。野生型標的およびこれら３つの部位における変
異体標的に関して完全に相補なプローブオリゴヌクレオチドも合成した。これら
のオリゴヌクレオチドの配列および名称を以下に掲載する。
【０２８６】 プローブオリゴヌクレオチドをＴＥバッファーに溶解して、最終濃度を０．５
μｇ／μＬにした。標的オリゴヌクレオチドはＴＥバッファーに溶解して、最終
濃度を５μｇ／ｍＬにした。１マイクロリットルの標的を１μＬのプローブと１
８μＬの水と混合し；そして対照に関しては、１μＬの各オリゴヌクレオチドを
１９μＬの水と混合した。これらの溶液を次に９５℃において３分間加熱して、
室温において３分間冷却した。２０マイクロリットルのマスター混合物を次に各
チューブに加えた。マスター混合物を以下に記載する。 マスター混合物 １０Ｘ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ、Ｍ１９５Ａ）１２０μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １５μＬ クレノーｅｘｏ−酵素（１Ｕ／μＬ；プロメガ、Ｍ２１８Ａ） １５μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） ６μＬ ＡＤＰ（１０μＭ） １２μＬ ナノピュア水 ４３２μＬ マスター混合物を加えたチューブは、次に、３７℃において１５分間インキュ
ベートした。５マイクロリットルの溶液を次にＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２０２
Ａ）に加え、そして光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメ
ーターを使用して測定した。得られた相対光ユニット（ｒｌｕ）のデータを以下
に示す： 溶液 標的 プローブ 読み１ 読み２ 読み３ １） １１８１４ −− ２．５５ ３．８２ １０．７８ （野生型） ２） １１８１５ −− ２．５４ ２．５７ ２．９９ （変異体１） ３） −− １１８０８ １６２．８ ２０７．２ １６５．５ （野生型１） ４） −− １１８０９ ２．８１ ２．１７ ２．２０ （変異体１） ５） １１８１６ −− ３．８４ ３．９８ ３．８１ （変異体２） ６） −− １１８１０ ４．５７ ４．７７ ５．２９ （野生型１） ７） −− １１８１１ ３．８４ ３．９８ ３．８１ （変異体２） ８） １１８１７ −− ２．０４ １．６４ １．４４ （変異体３） ９） −− １１８１２ ２．３６ ２．５７ ２．４１ （野生型３） １０） −− １１８１３ ４．０５ ２．０６ １．７７ （変異体３） １１）１１８１４ １１８０８ ４１８．７ ７１１．６ ６８２．１ （野生型） （野生型１） １２）１１８１４ １１８０９ ２０．６９ ２９．０５ ２１．２５ （野生型） （変異体１） １３）１１８１５ １１８０８ ２１８．４ １８５．６ １１８．１ （変異体１） （野生型１） １４）１１８１５ １１８０９ ６８２．６ ７３７．８ ５９９．７ （変異体１） （変異体１） １５）１１８１４ １１８１０ １０５５．０ ９２０．２ ７４４．７ （野生型） （野生型２） １６）１１８１４ １１８１１ １７５．３ １８８．１ １７１．１ （野生型） （変異体２） １７）１１８１５ １１８１０ １３６．９ １２１．０ １１４．４ （変異体２） （野生型２） １８）１１８１５ １１８１１ ８２２．３ ８６５．９ ７２９．０ （変異体２） （変異体２） １９）１１８１４ １１８１２ ３１．４９ ３３．２２ ４３．８３ （野生型） （野生型３） ２０）１１８１４ １１８１３ ２．５５ ３．７９ ２．４９ （野生型） （変異体３） ２１）１１８１５ １１８１２ ５．２６ ６．００ ６．３３ （変異体２） （野生型３） ２２）１１８１５ １１８１３ ７７．５８ ７８．４６ ８２．８５ （変異体２） （変異体３） ２３）ＤＮＡなし ２．１８ ２．４８ １．３７
野生型および変異体ａ，２，および３は下で定義する。
【０２８７】 ３つ全てのＨＩＶのＲＴ薬剤耐性変異が約３から７の範囲の変異体：野生型ｒ
ｌｕ比で検出できる。プローブ１１８０８は部位１に対するものであって野生型
標的に完全に相補であり、これのみで試験した場合には高いバックグラウンド値
を有した。他のオリゴヌクレオチド全ては受容可能な低レベルのバックグラウン
ドを有した。 標的およびプローブの配列 １１８０８ 5' CCATTTAGTACTGTCT 3' 配列番号５２ ＨＩＶ野生型プローブ部位１ １１８０８ 5' CCATTTAGTACTGTTT 3' 配列番号５３ ＨＩＶ変異体プローブ部位１ １１８１０ 5' CTAGTTTTCTCCATTT 3' 配列番号５４ ＨＩＶ野生型プローブ部位２ １１８１１ 5' CTAGTTTTCTCCATCT 3' 配列番号５５ ＨＩＶ変異体プローブ部位２ １１８１２ 5' TTCTCTGAAATCTACT 3' 配列番号５６ ＨＩＶ野生型プローブ部位３ １１８１３ 5' TTCTCTGAAATCTATT 3' 配列番号５７ ＨＩＶ変異体プローブ部位３ １１８１４ 5' AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3' 配
列番号５８ ＨＩＶ野生型標的 １１８１５ 5' AAAAAAAACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3' 配
列番号５９ ＨＩＶ変異体標的部位１ １１８１６ AAAAAAGACAGTACTAGATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3' 配列
番号６０ ＨＩＶ変異体標的部位２５’ １１８１７ 5'AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAATAGATTTCAGAGAACTTAA 3' 配
列番号６１ ＨＩＶ変異体標的部位３ 実施例１８：核酸増幅を行なわない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）反復配列の検出 この実施例においては、大腸菌中の反復配列をピロリン酸化前の標的配列の増
幅を必要とすることなく検出する。この標的配列は「ｃｏｌｉｒｅｐ」と命名す
る。
【０２８８】 オリゴヌクレオチド１１７０７（配列番号６２）はｃｏｌｉｒｅｐ ＤＮＡの
配列のセグメントと全体に相補である。オリゴヌクレオチド１１７０７溶液（１
ｍｇ／ｍＬ）１２マイクロリットルを水２０４μＬと混合して溶液Ａを作成した
。１１７０７（１ｍｇ／ｍＬ）４μＬを２０４μＬの水および８μＬの１０ｍＭ
トリスｐＨ８．０と混合することにより別の溶液を調製し、溶液Ｂを作成した。
大腸菌はシグマカタログ＃Ｄ４８８９、大腸菌株Ｂ超純粋である。
【０２８９】 ４ナノグラム（２μＬ）の大腸菌ＤＮＡを１８μＬの溶液Ａおよび１８μＬの
溶液Ｂと個別のチューブ中で混合した。同様にして、４０ｎｇの大腸菌ＤＮＡを
１８μＬの溶液Ａおよび１８μＬの溶液Ｂと個別のチューブ中で混合した。次に
これらの溶液を３分間９２℃でインキュベートし、１５分間室温にて冷却した。
以下のマスター混合物をアッセンブルした。 １０ｘＤＮＡポリメラーゼバッファー ２４０μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ３０μＬ クレノーｅｘｏ−（１０Ｕ／μＬ） ３０μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） １２μＬ １０μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ） ２４μＬ 水 ８６４μＬ マスター混合物２０マイクロリットルを各反応に添加し、次にそれらを１５分
間３７℃でインキュベートした。次にＬ／Ｌ試薬１００μＬを添加し、相対光出
力（ｒｌｕ）を直ちにＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーター
で測定した。ｒｌｕは、 溶 液 ｒｌｕ−１ ｒｌｕ−２ ｒｌｕ−３ 平 均 Ｔｒｉｓ ２．８５ ３．５６２ ３．０５９ ３．１５７ 11707(A) １３．６９ １２．１３ １３．６７ １３．１６ 11707(B) ７．４７３ ７．２３４ ６．９８１ ７．２５９ 40ng DNA+Tris ７５．６２ ７５．５２ ７３．２４ ７４．７９ 40ng DNA+ 11707(A) ９７．７１ １３４．２ １０５．１ １１２．３ 40ng DNA+ 11707(B) ８１．４６ ８７．５６ ７６．２８ ８１．７７ 4ng DNA+Tris ６．７１９ ８．０８４ ５．８８２ ６．８９５ 4ng DNA+ 11707(A) ２４．５０ ２５．９７ ２５．１７ ２５．１２ 4ng DNA+ 11707(B) １５．６９ １７．２２ １６．９９ １６．６３ データは、オリゴヌクレオチドプローブ１１７０７が本発明のプロセスにより
増幅することなく大腸菌のＤＮＡを検出できることを示す。 質問オリゴヌクレオチド： １１７０７ 5'AGTGACTGGGG 3' 配列番号６２ 実施例１９：ＰｈｉＸ１７４のＨｉｎＦ１断片の検出 天然に遭遇するポリヌクレオチドはしばしば二本鎖である。エンドヌクレアー
ゼＨｉｎＦ１を使用したＰｈｉＸ１７４の消化により生じるＤＮＡ断片は、様々
なサイズの二本鎖ＤＮＡである。二本鎖ＤＮＡが検出できるか否かを測定するた
めに、ＰｈｉＸ１７４のＤＮＡを直接標的核酸基質として使用するかまたはヌク
レアーゼで消化することにより、前の実施例におけるように、ヌクレオシド３リ
ン酸に変換できるヌクレオチドを生じた。
【０２９０】 以下の条件を使用することにより、バクテリオファージＰｈｉＸ１７４のＤＮ
Ａ断片を消化した。以下の物質を３つの１．５ｍＬポリプロピレンチューブに入
れた：５０μＬのＰｈｉＸ１７４のＨｉｎＦ１断片（プロメガＧ１７５Ａ，ロッ
ト＃７７３６０３）；４０μＬの５ｍＭ ＭｇＳＯ4；５μＬのＥｘｏＩＩＩバ
ッファー（１０Ｘ）（プロメガＥ５７７Ｂ，４８５３２１６）、および５μＬの
ナノピュア水。５０マイクロリットルのＴＥバッファーと４０マイクロＬの５ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ4；５μＬのＥｘｏＩＩＩバッファー（１０Ｘ）およびナノピュア
水を一つのサンプルに加えた。ＰｈｉＸ１７４のＤＮＡを含むサンプル２つをさ
らに２μＬのＥｘｏＩＩＩ（プロメガＭ１８１Ａ，５５１２７０８）で処理して
、チューブを３７℃水浴に６０分間入れた。ＥｘｏＩＩＩはＤＮＡを含まないサ
ンプルにも加えて、該サンプルは３７℃において６０分間インキュベートした。
【０２９１】 この時点で、８００μＬのナノピュア水と１００μＬの（１０Ｘ）Ｓ１ヌクレ
アーゼバッファー（プロメガ、Ｍ５７７Ａ，ロット＃６７４８６０５）を全ての
サンプルに加えた。３マイクロリットルのＳ１ヌクレアーゼ（プロメガ、Ｅ５７
６Ｂ，ロット＃７８９８８１）を次に全てのサンプルに加えた。全てのサンプル
を３７℃において３０分間インキュベートした。
【０２９２】 ＤＮＡを含む３つのチューブ各々からの２００マイクロリットルを３００μＬ
の１Ｘ ＴＥバッファーで希釈して、２６０ｎｍにおける吸光をベックマンＤＵ
６５０分光光度計を用いて読んだ。記録された読みは、チューブ１（ヌクレアー
ゼ添加なし）、０．３０７３；チューブ２（ＥｘｏＩＩＩ処理）、０．５４９５
；チューブ３（ＥｘｏＩＩＩとＳ１で処理）、０．５１９０。ヌクレアーゼで処
理したチューブの吸光値の増加は、ポリマーが消化されたことを示す。これらの
消化は、次に別の研究において使用した（以下の実施例２２を参照）。 実施例２０：自己アニーリング質問プローブ この実施例は、本方法の質問技術においてヘアピン構造を形成するために用い
る異なる種類のオリゴヌクレオチドプローブの使用を例示する。本研究は、質問
反応に質問部位特異的なプローブを加える必要性をなくすための方法を示す。
【０２９３】 ここでは、オリゴヌクレオチドプローブは標的配列の質問位置の下流（３’側
）の標的鎖にアニールする。オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの未アニーリン
グ領域をその５’エンドに有し、続いて、標的鎖の質問領域と同一の約５〜約２
０ヌクレオチドを有する。次にオリゴヌクレオチドのアニールされた３’エンド
を標的鎖の質問位置を通過して伸長し、伸長プローブと称されるものを創製する
。ハイブリッドを変性し、そして伸長されたプローブ鎖とオリゴヌクレオチドプ
ローブの５’エンドとの間にヘアピン構造を形成する。次にこの領域のミスマッ
チの有無について標準的な質問反応によりアッセイする。
【０２９４】 伸長されたプローブ鎖がとると思われる異なる種類のヘアピン構造を示すよう
に４つのプローブをデザインした。これらのプローブは、１０２０７（配列番号
６３）、１０２０８（配列番号６４）、１０２０９（配列番号６５）および１０
２１２（配列番号６６）である。
【０２９５】 これらのプローブは、自己アニールさせた場合に、以下の自己ハイブリダイズ
二次構造を形成すると推定される。
【０２９６】
【表１】 ４種のプローブの各々５μＬ（５μｇ）をナノピュア水で１００μＬに希釈し
た。次にこれらを１：１０で連続希釈して最終希釈ファクター１：１００，００
０とした。希釈されたプローブ２０μＬを３分間９５℃で個別のチューブ中で加
熱し、１０分間室温に冷却して自己アニーリングさせた。次に実施例１に記載し
たマスター混合物２０マイクロリットルを各チューブに添加し、試験管を１５分
間３７℃でインキュベートした。溶液１０μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロ
メガ、Ｆ２０２Ａ）に添加し、相対光単位をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０
／２０ルミノメーターで直ちに測定した。プローブなしの対照群は相対光ユニッ
ト５７．２４であり、残存プローブの結果は以下の表に相対光単位（ｒｌｕ）と
して報告する。 ｌｏｇ プローブ 希釈 １０２０７ １０２０８ １０２０９ １０２１２ −５ ４４．８９ ５６．２２ ５７．５７ ５７．８０ −４ ８５．２１ ６４．５６ ５８．２６ ６３．１５ −３ ２９７．７ ７０．５３ ７９．１２ ８２．６５ −２ ９７０．５ １０８．４ ８０．０６ １０６．７ プローブ１０２０７は期待された通り質問のための効率的な標的として機能し
、プローブ１０２０８は予測された陰性の結果を示した。プローブ１０２１２は
塩基のマッチが僅か３箇所であり、このため伸長できず、低い値をもたらした。
プローブ１０２０９は３’エンドから内側の３番目のヌクレオチドにあるミスマ
ッチのため、ヘアピンが形成してもアニールされない３’末端ヌクレオチドを有
しているらしい。このような未アニーリングの３’末端ヌクレオチドが低いｒｌ
ｕの原因であると考えられる。 １０２０７ 5'ATGAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号６３ １０２０８ 5'GTGAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号６４ １０２０９ 5'ATAAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号６５ １０２１０ 5'ATAAACGTACGTCGGATGAGCACG 3' 配列番号６６ 実施例２１：自己アニーリングプライマーを用いた質問 この実施例および図２は、異なる種類のオリゴヌクレオチドプローブである「
ＲＥＡＰＥＲ（商標名）」プローブの本発明のプロセスにおける使用を例示する
。この実施例は、質問反応に質問部位特異的なプローブを加える必要性をなくす
ための方法を示す。
【０２９７】 本明細書において、オリゴヌクレオチドの第１プローブ（配列番号６８）はそ
の３’エンドにおいて、標的鎖の質問位置の下流（３’）の標的鎖（配列番号６
７）にアニールさせる（図２Ａ）。プローブはその５’エンドに、質問位置を含
む標的鎖上の領域に同一の約５〜約２０ヌクレオチドを含むヌクレオチドの未ア
ニール領域を有する。この同一領域は標的とプローブの鎖の双方で同じ方向に存
在する。
【０２９８】 次にアニールされたプローブの３’エンドを標的鎖の質問位置を通過して伸長
し、図２Ｂに示されるとおり、第１の伸長されたプローブおよび伸長された第１
のハイブリッドと称されるものを形成する（配列番号６９）。伸長された第１の
ハイブリッドを変性し、第２のプローブ（配列番号７０）を第１の伸張されたプ
ローブにアニールして第２のハイブリッドを形成する。この第２のプローブは第
１の伸長されたプローブ鎖上の質問位置の下流の領域の第１の伸張されたプロー
ブ鎖と相補的である（図２Ｃ）。
【０２９９】 次に図２Ｄに示すとおり、第２のプローブを伸長し、第２の伸長されたハイブ
リッドを形成する。第２の伸長されたハイブリッドは第１の伸長されたプローブ
および第２の伸長されたプローブよりなる（配列番号７１）。
【０３００】 第２の伸長されたハイブリッドの鎖を変性し、再生させてヘアピン構造を形成
させる。ヘアピンの形成により、第１の伸長されたプローブは３’突出を有する
ヘアピン構造を形成するのに対し、第２の伸長されたプローブは脱重合の基質と
なる５’突出を含むヘアピン構造を形成する。次に第２の伸長されたプローブ鎖
を脱重合し、分析出力を本明細書のどこかに記載されたとおりに得る。分析出力
は、これも本明細書のどこかで論じたとおりに、元の標的鎖、または元の標的鎖
中の特定の塩基の存在または非存在を測定する。
【０３０１】 配列番号６７のオリゴヌクレオチドを水で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。配列番号
７０のオリゴヌクレオチドを水で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。各溶液１μＬを水１
８μＬと混合する。溶液を５分間９５℃に加熱し、その後、１０分間室温にて冷
却して、配列番号６７と７０のオリゴヌクレオチドをアニールさせる。
【０３０２】 この溶液に、ｄＮＴＰ混合物を各ｄＮＴＰに付き０．２５ｍＭの最終濃度とな
るまで、１０ｘクレノーバッファーを最終濃度１ｘとなるまで、そして、５Ｕの
クレノー酵素を添加する。これらの成分の入ったチューブを３０分間３７℃でイ
ンキュベートする。このようにして形成された伸長された第１のハイブリッドＤ
ＮＡ（配列番号６９を含む）を精製（キアゲン、マーメイドシステム）し、水５
０μＬ中に溶離する。
【０３０３】 この精製伸長第１ハイブリッド溶液に、第２のプローブとして配列番号７０の
オリゴヌクレオチド１μＬ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加する。次に溶液を５分間９５
℃に加熱し、室温に冷却して６９および７０を図２Ｃに示すとおりアニールさせ
、第２のハイブリッドを形成する。この溶液にｄＮＴＰ混合物を各ｄＮＴＰに付
き０．２５ｍＭの最終濃度となるまで、１０ｘクレノーバッファーを最終濃度１
ｘとなるまで、そして、５Ｕのクレノー酵素を添加する。これらの成分の入った
チューブを３０分間３７℃でインキュベートして、第２の伸長されたプローブを
含有する第２の伸長されたハイブリッドを形成する（オリゴヌクレオチド配列番
号７１）。
【０３０４】 形成された配列番号７１／６９の第２の伸長されたハイブリッドＤＮＡ（図２
Ｄ）を精製（キアゲン、マーメイドシステム）して、未反応のｄＮＴＰから伸長
されたハイブリッドを分離し、水５０μＬ中に溶離させる。（或いは、元の６８
オリゴヌクレオチドをその５’末端でビオチン化し、このビオチンはその後配列
番号６９の鎖中にも存在する。このビオチン化鎖６９を次に鎖７１から変性し、
製造元の取り扱い説明書（プロメガ、Ｚ５４８１）に従ってストレプトアビジン
コーティング常磁性体粒子を用いて溶液から除去し、７１のヘアピン構造を以下
の通り形成させる。） このハイブリッド溶液を次に５分間９５℃に加熱し、水で１００μＬに希釈し
、１０分間氷上で冷却してヘアピン構造を形成させる。
【０３０５】 以下のマスター混合物をアッセンブルして混合する。 成分 量 １０Ｘ ＤＮＡ Ｐｏｌバッファー（プロメガ、Ｍ１９５Ａ） ２００μＬ クレノーｅｘｏ−（１Ｕ／μＬ）（プロメガ、Ｍ２１８Ｂ） １２．５μＬ ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム（プロメガ、Ｃ３５０Ｂ） ２５μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） １０μＬ １０ｕＭ ＡＤＰ（シグマＡ５２５８） ２０μＬ 水 ７３２．５μＬ このマスター混合物２０μＬを冷却後上記ヘアピン含有溶液２０μＬに添加し
、得られた混合物を１５分間３７℃に加熱する。このインキュベーションの後、
溶液の４μＬ試料を２通りに採取し、１００μＬのＬ／Ｌ試薬（プロメガ、Ｆ２
０２Ａ）に添加し、反応により生成した光をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０
／２０ルミノメーターを用いて直ちに測定する。バックグラウンド値（酵素無添
加）を超える水準の正の分析出力はマッチした塩基がヘアピン構造の３’末端に
存在することを示しており、このことは標的鎖の存在を示し、標的の質問位置に
Ｇ塩基が存在することも示す。 5'CCCGGAGAGACCTCCTTAAGGGGCCATATTATTTCGTCGATTCCAGTGTTGGCCAAACGGAT 3' 配
列番号６７ 5'GGGGCCATATTATTTCGCCGTTTGGCCAACACTGGAATCGA 3' 配列番号６８ 5'GGGGCCATATTATTTCGCCGTTTGGCCAACACTGGAATCGACGAAATAATATGGCCCCTTAAGGAGGTCT
CTCCGGG 3' 配列番号６９ 5'CCCGGAGAGACCTCCT 3' 配列番号７０ 5'CCCGGAGAGACCTCCTTAAGGGGCCATATTATTTCGTCGATTCCAGTGTTGGCCAAACGGCGAAATAATA
TGGCCCC 3' 配列番号７１ 実施例２２：ヌクレアーゼＰＲＰＰ合成酵素、ＮＤＰＫを使用したＰｈｉＸ１７
４のＨｉｎＦ１断片の検出 この実施例は、ヌクレアーゼを使用したポリマーからヌクレオシド１リン酸へ
の消化、ＰＲＰＰ合成酵素を用いたヌクレオシド１リン酸からヌクレオシド３リ
ン酸への形質転換並びにＰＲＰＰ合成酵素の作用により生じたヌクレオシド３リ
ン酸を用いたＡＤＰからＡＴＰへの形質転換、およびルシフェラーゼを用いたＡ
ＴＰの検出、によるＤＮＡの検出を示す。デオキシヌクレオチドのサンプル（ポ
リ（Ａ））を実施例１９に記載されたとおりに調製した。異なる量のデオキシオ
リゴを表３０に提示した反応において使用した。
【０３０６】 以下の添加を各反応に行った：２μＬのＰＲＰＰ、２μＬのＰＲＰＰ合成酵素
、および２０μＬのＰＲＰＰ合成酵素バッファー。反応は３７℃２８分間進行さ
せ、反応物を２μＬのＡＤＰと２μＬのＮＤＰＫを含む１００μＬのＬＡＲバッ
ファーに移した。この第２反応は室温において２０分間進行させた。生成したＡ
ＴＰの量は、１０ｎｇのルシフェラーゼを添加して、ルミノメーターを用いて光
出力を測定うことにより測定した。データを以下の表に提示する。これらのデー
タは、酵素のこの組み合わせがＤＮＡの検出を可能にしたことを示す。 反応 ヌクレオチド 反応における量 光ユニット １ ｄＡＭＰ ２００ｎｇ，６００ｐｍｏｌｅｓ １０１８ ２ ｄＡＭＰ ２０ｎｇ，６０ｐｍｏｌｅｓ ６３６ ３ ｄＡＭＰ ２ｎｇ，６ｐｍｏｌｅｓ １７８ ４ ｄＡＭＰ ２００ｐｇ，６００ｆｍｏｌｅｓ ８３ ５ なし ゼロｎｇ ６９ ６ ＰｈｉＸ１７４ １００ｎｇ（＝３００ｐｍｏｌｅｓ ４６ のみ ｄＮＭＰ；約７５ｐｍｏｌｅｓ ｄＡＭＰ） ７ ＰｈｉＸ１７４＋ １００ｎｇ ４７２ ＥｘｏＩＩＩ ８ ＰｈｉＸ１７４＋ １００ｎｇ ４４８ ＥｘｏＩＩＩ＋Ｓ１ ９ ＤＮＡなし＋Ｅｘｏ ゼロｎｇ ５５ ＋Ｓ１ 実施例２３：１段階７０℃質問反応における好熱性ＤＮＡポリメラーゼの比較 この実施例においては、４つの異なる好熱性ＤＮＡポリメラーゼを、Ｐｆｕか
らの好熱性ＮＤＰＫと共に質問反応において使用した。使用したポリメラーゼは
、Ｔａｑ（プロメガ、Ｍ１６６Ｆ）、Ｐｆｕ（Pyrococcus Furiosus株Ｖｃ−１
ＤＳＭ３６３８，プロメガ、Ｍ７７４Ａ）、Ｔｖｕ（Thermoactinomyces vulg
aris，プロメガにおいて精製した）、およびＡｔｈ（Anaeocellum thermophilum
，プロメガにおいて精製した）であった。
【０３０７】 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の合成標的は、野生型オリゴヌクレオチドプ
ライマー９１６２（配列番号７２）と９１６５（配列番号７３）または変異体オ
リゴヌクレオチドプライマー９１６３（配列番号７４）と９１６６（配列番号７
５）を組み合わせることにより生じさせた。使用した質問用オリゴヌクレオチド
は、野生型配列９２１１（配列番号３５）と変異体配列９２１２（配列番号３６
）であった。
【０３０８】 ５ナノグラムの野生型または変異体の何れかの標的（野生型の９１６２および
９１６５又は変異体の９１６３および９１６６に関してそれぞれ２．５ｎｇ）を
１μｇの野生型プローブ、変異体プローブの何れかと混合するかまたはプローブ
なしにして、水を加えて最終量を２０μＬにした。上記の溶液を５分間９５℃に
おいて加熱して、次に１０分間室温において冷やした。２０マイクロリットルの
２Ｘマスター混合物を次に各溶液に加え、そして各々をさらに７０℃において１
０分間インキュベートした。４マイクロリットルの各溶液を１００μＬのＬ／Ｌ
試薬（プロメガＦ２０２Ａ）に加えて、相対光ユニット（ｒｌｕ）をＴｕｒｎｅ
ｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターにて測定した。アッセイした標的
およびプローブの様々な組み合わせおよびバックグラウンド値に関して補正され
たそれらのもたらされたｒｌｕ値の平均が以下の表である。 ２Ｘマスター混合物 １００μＬ １０Ｘ好熱性ＤＮＡポリメラーゼバッファー（プロメガ、 Ｍ１９０Ａ） １００μＬ １５ｍＭ ＭｇＣｌ2（プロメガ、Ａ３５１Ｂ） ２５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ（プロメガ、Ｅ３５０Ｂ） １０μＬ １０μＭ ＡＤＰ（シグマ、Ａ−５２５８） ５μＬ 好熱性ポリメラーゼ（１Ｕ酵素／反応） ５μＬ Ｐｆｕ ＮＤＰＫ（０．５Ｕ／μＬ）（酵素の精製に関しては 実施例２５参照；０．１Ｕ／ｒｘｎ） ２７５μＬ 水 マッチ：ミスマッチ ポリメラーゼ 標的 プローブ ｒｌｕ 比 Ｔａｑ 野生型 野生型 １２９ １２８：１ 野生型 変異体 −２ 変異体 変異体 ６２ ９５：１ 変異体 野生型 ０．６５ Ｐｆｕ 野生型 野生型 １２１ ２０：１ 野生型 変異体 ６ 変異体 変異体 ３４ １：２ 変異体 野生型 ５４ Ｔｖｕ 野生型 野生型 ８９８ ８９：１ 野生型 変異体 １０ 変異体 変異体 １０７５ ６６：１ 変異体 野生型 １６ Ａｔｈ 野生型 野生型 ３２７ ３２７：１ 野生型 変異体 ０ 変異体 変異体 ２４４ １３６：１ 変異体 野生型 １．８ ９１６２ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCATGAACGTGCTCATCGACGTCAACCCGCACAA
CGAGCT 3’配列番号７２ ９１６５ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCATGGGTGTAATATCAAAGTGGCATACA
CGAGCT 3’配列番号７３ ９１６３ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCGTGAACGTGCTCATCGACGTCAACCCGCACAA
CGAGCT 3’配列番号７４ ９１６６ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCACGGGTGTAATATCAAAGTGGCATACA
CGAGCT 3’配列番号７５ ９２１１ 5’CACTTTGATATTACACCCATG 3’（野生型プライマー）配列番号３５ ９２１２ 5’CACTTTGATATTACACCCGTG 3’（変異体プライマー）配列番号３６ 上記から、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく多くの修飾およ
び変更がなされ得ることが観察されることになる。提示した特定の実施例に関し
て何ら限定されずあるいは推論されべきでないことは理解されるべきである。本
開示は特許請求の範囲に含まれるような修飾によりカバーすることを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、１０８６５オリゴヌクレオチド（配列番号７６）の、それぞれ図１Ａ
および図１Ｂに示したとおりの回転循環増幅において利用された１０８７０野生
型（配列番号７７）および１０９９４変異体（配列番号７８）オリゴヌクレオチ
ドへのアニーリングを示す。また、オリゴヌクレオチド１０８６６（配列番号８
１）のオリゴヌクレオチド１０８６５へのアニーリング（ハイブリッド）並びに
オリゴヌクレオチドプローブ１０８６９（配列番号７９）のオリゴヌクレオチド
１０８７０へのアニーリングおよびオリゴヌクレオチドプローブ１０９８９（配
列番号８０）のオリゴヌクレオチド１０９９４へのアニーリングも示され、それ
らのプローブの、各増幅配列への結合を表す。オリゴヌクレオチド１０８６５の
弓形の線は、オリゴヌクレオチド１０８７０または１０９９４の何れかとハイブ
リダイズしたときにオリゴヌクレオチド１０８６５が予測できる形状を示す補助
となるように使用される。
【図２】 図２は、実施例２１に記載したＲｅａｐｅｒ（商標名）アッセイである。図２
Ａは、核酸標的配列番号６７（２８６）の第１プローブ配列番号６８（２８７）
へのアニーリング荷より形成された第１ハイブリッドを示す。矢印は２８６中の
質問位置を示す。 図２Ｂは、２８６の、伸長した２８７へのアニーリングにより形成された第１
伸長ハイブリッドを示す。伸長した２８７は第１の伸長したプローブ配列番号６
９（２８８）である。 図２Ｃは、図２Ｂに示した変性核酸分子からの２８８の、第２プローブと表示
された配列番号７０（２８９）へのアニーリングにより形成された第２ハイブリ
ッドを示す。矢印は、２８８中の質問位置を示す。 図２Ｄは、２８８と、伸長した２８９鎖の表示された配列番号７１（２９０）
のアニーリングにより形成された伸長第２ハイブリッドを示す。 図２Ｅは、図２Ｄからの変性した２９０鎖を、そしてヘアピン構造を形成する
ことを示す。矢印は、ハイブリッドの３’末端の質問位置を指す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/53 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／４０６，１４７ (32)優先日 平成11年９月27日(1999．9．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ライペ，ドナ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53562， ミドルトン，プレザント・ビュー・ロード 1110，ナンバー103 (72)発明者 マンドレカー，ミッシェル アメリカ合衆国ウィスコンシン州53575， オレゴン，アシュ・ストリート 525 (72)発明者 ケパート，ダニエル アメリカ合衆国ウィスコンシン州53527， カティッジ・グローヴ，ヴィスタ・ドライ ブ 112 (72)発明者 ローズ，リチャード・ビー アメリカ合衆国ウィスコンシン州53703， マディソン，ウエスト・ウィルソン・スト リート 444，ナンバー207 (72)発明者 アンドリュース，クリスティーン・アン アメリカ合衆国ウィスコンシン州53527， カティッジ・グローヴ，ウィスパリング・ ウェイ 800 (72)発明者 ハートネット，ジェームズ・アール アメリカ合衆国ウィスコンシン州53719， マディソン，チェサピーク・ドライブ 2590 (72)発明者 グ，トレント アメリカ合衆国ウィスコンシン州53715， マディソン，ノース・ウィングラ・ドライ ブ 1329 (72)発明者 オルソン，ライアン・ジェイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53705， マディソン，ノース・アレン・ストリート 340，ナンバー ８ (72)発明者 ウッド，キース・ヴイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53711― 5399，マディソン，コットケ・ドライブ 902，ナンバー ５ (72)発明者 ウェルチ，ロイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306， パロ・アルト，マグノリア・ドライブ 3868 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA35 CA25 CB01 CB03 CB07 CB14 CB30 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 FB13 GC10 JA20 2G054 AA06 AA10 AB05 CA22 EA01 EA02 EA03 EA04 GB02 JA10 4B024 AA11 CA02 CA09 HA08 HA13 HA14 4B063 QA01 QA11 QA18 QQ43 QQ48 QR07 QR08 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (71)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸サンプル中の予め決定された外因性核酸標的配列の存否を
    決定する方法であって、工程： （Ａ）３’末端領域に同定用ヌクレオチドを含む核酸プローブとハイブリダイ
    ズした上記の予め決定された外因性核酸標的配列を含むかもしれない処理サンプ
    ルを用意し； （Ｂ）上記処理サンプルを、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から
    一つまたは複数のヌクレオチドを放出する活性を有する酵素を脱重合量で処理す
    ることにより処理反応混合物を形成させ； （Ｃ）上記酵素が、ハイブリダイズした核酸を脱重合してそれから同定用ヌク
    レオチドを放出するのに十分な時間、上記処理反応混合物を保持し；そして （Ｄ）放出された同定用ヌクレオチドの存在を分析することにより分析用出力
    を得て、該分析用出力が上記外因性核酸標的の存在または不在の指標を示す ことからなる。
  2. 【請求項２】 同定用ヌクレオチドがヌクレオシド３リン酸である、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 分析用出力が発光分光測定により得られる、請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 分析用出力が蛍光分光測定により得られる、請求項１記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 分析用出力が質量分光測定により得られる、請求項１記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 分析用出力が吸光分光測定により得られる、請求項１記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 上記処理サンプルを形成するさらなる工程： （Ａ）アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プローブと混合するこ
    とによりハイブリダイゼーション組成物を形成するが、但し、上記核酸プローブ
    の３’末端は（ｉ）サンプル中にその配列が存在する場合に、上記外因性配列に
    一部または全部の相補性を伴ってハイブリダイズし、そして（ｉｉ）同定用ヌク
    レオチドを含み； （Ｂ）核酸プローブにハイブリダイズした上記一つの予め決定された外因性核
    酸標的配列を含むかもしれない処理サンプルを形成するのに十分な時間上記ハイ
    ブリダイゼーション組成物を保持すること を含む、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 核酸サンプルを生物学上のサンプルから得る、請求項１記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 予め決定された外因性核酸標的配列が微生物またはウイルスの
    核酸である、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 上記予め決定された外因性核酸標的配列がウイルスの核酸で
    あり、そして予め決定された量の上記生物学上の液体からの分析用出力が生物学
    上のサンプル中のウイルスの荷重の一定量を提供する、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 核酸サンプルを食品源から得る、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 食品源が植物である、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 上記予め決定された外因性核酸標的配列が植物のゲノムの非
    天然配列である、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 植物のゲノムの非天然配列が転写制御配列である、請求項１
    ３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 転写制御配列がＮＯＳターミネーターの３５Ｓプロモーター
    の配列である、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 粗核酸サンプルからの外因性核酸配列を増幅することにより
    、アッセイされる核酸サンプルを調製するさらなる工程を含む、請求項７記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 核酸サンプル中の少なくとも一つの予め決定された外因性核
    酸標的配列の存否を決定する方法であって、工程： （Ａ）アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プローブと混合するこ
    とによりハイブリダイゼーション組成物を形成するが、但し、上記核酸プローブ
    の３’末端は（ｉ）サンプル中にその配列が存在する場合に、少なくとも一つの
    上記外因性核酸標的配列に一部または全部の相補性を伴ってハイブリダイズし、
    そして（ｉｉ）同定用ヌクレオチドを含み； （Ｂ）核酸プローブにハイブリダイズした上記一つの予め決定された外因性核
    酸標的配列を含むかもしれない処理サンプルを形成するのに十分な時間上記ハイ
    ブリダイゼーション組成物を保持し； （Ｃ）ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から少なくとも一つのヌク
    レオチドを放出する活性を有する酵素の脱重合量と、上記処理サンプルを混合す
    ることにより処理反応混合物を形成し； （Ｄ）ハイブリダイズした核酸を上記酵素が脱重合してそれから同定用ヌクレ
    オチドを放出するのに十分な時間上記処理サンプルを保持し；そして （Ｅ）放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析することにより分析
    出力を得るが、分析出力は少なくとも一つの上記外因性核酸標的配列の存在また
    は不在を示すこと からなる。
  18. 【請求項１８】 同定用ヌクレオチドがヌクレオシド３リン酸である、請求項
    １７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 分析用出力が発光分光測定より得られる、請求項１７記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 分析用出力が蛍光分光測定により得られる、請求項１７記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 分析用出力が質量分光測定により得られる、請求項１７記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 分析用出力が吸光分光測定により得られる、請求項１７記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 その活性がヌクレオチドを放出することである上記酵素が、
    ３’末端領域においてその塩基が全体の相補性を伴ってマッチするハイブリダイ
    ズした核酸をピロリン酸イオン存在下で脱重合する鋳型依存性ポリメラーゼであ
    る、請求項１７記載の方法。
  24. 【請求項２４】 その活性がヌクレオチドを放出することである上記酵素が、
    ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を呈し、ハイブリダイズしたプローブの３’
    末端領域において一つまたは複数のミスマッチ塩基を有するハイブリダイズした
    核酸を脱重合する、請求項１７記載の方法。
  25. 【請求項２５】 核酸サンプル中に質問市を含む外因性核酸標的配列の存否を
    決定する方法であって、工程： （Ａ）３つのセクションから構成される核酸プローブとハイブリダイズした上
    記外因性核酸標的配列を含むかもしれない核酸サンプルを含む処理サンプルを用
    意するが、上記の３つのセクションは（ｉ）標的配列の質問位置の下流約１から
    約３０核酸から始まる位置において外因性核酸標的配列と相補な約１０から約３
    ０ヌクレオチドのプローブ３’末端、（ｉｉ）約１０から約２００核酸の長さで
    あって、上記外因性核酸標的配列との同一配列を有する、５’末端領域、および
    （ｉｉｉ）上記核酸サンプルに相補でないゼロから約５０の核酸を含む任意の第
    ３セクション、そして； （Ｂ）上記核酸プローブを３’方向に伸長することにより、核酸サンプルにハ
    イブリダイズした第２プローブを第２ハイブリッドとして形成し； （Ｄ）上記第２ハイブリッドを変性して、上記外因性核酸標的配列から上記第
    ２プローブを分離し； （Ｅ）上記水性組成物を再生することにより、上記第２プローブからヘアピン
    構造を形成させ； （Ｆ）上記ヘアピン構造含有組成物を、その活性が核酸ハイブリッドの３’末
    端から一つまたは複数のヌクレオチドを放出させることである酵素の脱重合量と
    混合することにより、処理反応混合物を形成し； （Ｇ）上記酵素がハイブリダイズした核酸を脱重合して、そこから３’末端か
    ら一つまたは複数のヌクレオチドを放出させるのに十分な時間、処理反応混合物
    を保持し；そして （Ｈ）放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析することにより分析
    出力を得て、該分析出力が上記外因性核酸標的配列の存在または不在を示すこと
    からなる。
  26. 【請求項２６】 外因性核酸標的配列の存否または上記標的配列内の特定の塩
    基の存否を決定する方法であって、工程： （Ａ）第１核酸プローブとハイブリダイズした外因性核酸標的配列を第１ハイ
    ブリッドとして含むかもしれない核酸サンプルを含む処理サンプルを用意するが
    、上記第１プローブは少なくとも２つのセクションから構成され、第１のセクシ
    ョンは標的質問位置の下流約５から約３０ヌクレオチドで始まる位置において標
    的核酸配列に相補な、プローブ３’末端の約１０から約３０ヌクレオチドを含み
    、第１プローブの第２セクションは、質問位置から、プローブの上記第１セクシ
    ョンにはハイブリダイズしない質問位置下流の約１０から約３０ヌクレオチドの
    、標的配列の繰り返しである約５から約３０のヌクレオチドを含み、そしてプロ
    ーブの第１セクションと第２セクションの間に位置するプローブの任意の第３セ
    クションはゼロから約５０ヌクレオチドの長さであり、プローブの第１セクショ
    ンまたは第２セクションの何れかにハイブリダイズしない配列を含み； （Ｂ）処理サンプル中の第１ハイブリッドを第１プローブの３’末端において
    伸長し、それにより上記質問位置を越えて第１プローブを伸長して、質問位置を
    含む伸長された第１ハイブリッドを形成し； （Ｃ）伸長した第１ハイブリッドの水性組成物を編成することにより、２つの
    核酸鎖を分離して、分離された標的核酸と分離された伸長第１プローブを含む水
    性組成物を形成し； （Ｄ）約１０から約３０ヌクレオチドの長さであって、伸長した第１プローブ
    の質問位置下流約５から約２０００ヌクレオチドで始まる位置において伸長した
    第１プローブに相補な第２プローブに伸長した第１プローブをアニールさせ、そ
    れにより第２ハイブリッドを形成し； （Ｅ）その伸長が伸長した第１プローブの５’末端に到達するまで第２プロー
    ブの３’末端にて第二ハイブリッドを伸長し、それにより、その３’領域が同定
    用ヌクレオチドを含む第２の伸長したプローブを含む第２の伸長したハイブリッ
    ドを形成し； （Ｆ）伸長した第２のハイブリッドの水性組成物を変性することにより２つの
    核酸鎖を分離して、分離した伸長した第１プローブと伸長した第２プローブを含
    む水性組成物を形成し； （Ｇ）水性組成物を冷やしてヘアピン構造を上記分離した伸長第２プローブか
    ら形成して、ヘアピン構造含有組成物を形成し； （Ｈ）その活性が核酸ハイブリッドの３’末端から一つまたは複数のヌクレオ
    チドを放出させることである酵素の脱重合量と上記ヘアピン構造含有組成物を混
    合することにより、処理反応混合物を形成し； （Ｉ）３’末端領域の同定用ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、処理反
    応混合物を保持し；そして （Ｊ）放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析することにより分析
    出力を得て、該分析出力が上記外因性核酸標的配列の存在または不在あるいは標
    的配列中の特定の塩基の存在または不在を示すこと からなる。
  27. 【請求項２７】 分析用出力が発光分光測定により得られる、請求項２６記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 分析用出力が蛍光分光測定により得られる、請求項２６記載
    の方法。
  29. 【請求項２９】 分析用出力が質量分光測定により得られる、請求項２６記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 分析用出力が吸光分光測定により得られる、請求項２６記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 アッセイされるサンプル中の外因性核酸標的配列中の特定の
    塩基の存否を決定する方法であって、工程： （Ａ）アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プローブと混合するこ
    とによりハイブリダイゼーション組成物を形成するが、上記核酸プローブの少な
    くとも一つの３’末端領域は（ｉ）上記核酸標的配列に実質相補であり、そして
    質問位置において少なくとも一つの予め決定されたヌクレオチドを含み、そして
    （ｉｉ）同定用ヌクレオチドを含むが、但し上記核酸標的配列はその存在または
    不在を決定される少なくとも一つの特定の塩基を含み； （Ｂ）処理サンプルを形成するのに十分な時間上記ハイブリダイゼーション組
    成物を保持するが、但し、プローブの質問位置は、存在する場合、上記標的配列
    中の同定される上記特定の塩基と並列するヌクレオチドであり、その結果塩基対
    合が生じることができ； （Ｃ）処理サンプルを、その活性がハイブリダイズした核酸プローブのの３’
    末端から一つまたは複数のヌクレオチドを放出させることである酵素の脱重合量
    と混合することにより、ハイブリッドを脱重合して処理反応混合物を形成し； （Ｄ）それから同定用ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、処理反応混合
    物を保持し；そして （Ｅ）放出された同定用ヌクレオチドの存在または不在に関して分析すること
    により、同定されるべき上記特定の塩基の存在または不在を示す分析出力を得る
    こと からなる。
  32. 【請求項３２】 同定用ヌクレオチドが質問位置にある、請求項３１記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 分析用出力が蛍光分光測定により得られる、請求項３１記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】 分析用出力が質量分光測定により得られる、請求項３１記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 核酸標的配列がデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなるグ
    ループから選択される、請求項３１記載の方法。
  36. 【請求項３６】 さらに第１プローブ、第２プローブ、第３プローブおよび第
    ４プローブを含む、請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 核酸サンプル中の少なくとも一つの予め決定された外因性核
    酸標的配列の存否を決定する方法であって、工程： （Ａ）その３’末端領域が上記の予め決定された核酸標的配列に完全に相補で
    あって且つ同定用ヌクレオチドを含む核酸プローブにハイブリダイズした上記の
    予め決定された核酸標的配列を含むかもしれない処理サンプルを、（ｉ）ピロリ
    ン酸存在下におけるその活性が、同定用ヌクレオチドを、ハイブリダイズした核
    酸プローブからヌクレオシド３リン酸として放出することである、脱重合量の酵
    素、（ｉｉ）アデノシン５’リン酸、（ｉｉｉ）ピロリン酸および（ｉｖ）ＮＤ
    ＰＫと混合することにより、処理反応混合物を形成し； （Ｂ）上記酵素が、ハイブリダイズした核酸プローブを脱重合し、３’末端領
    域中の同定用ヌクレオチドをヌクレオシド３リン酸として放出させ、そして該ヌ
    クレオシド３リン酸および上記アデノシン５’２リン酸をアデノシン５’３リン
    酸に変換するするのに十分な時間、約２５℃から約８０℃の温度において処理反
    応混合物を保持し；そして （Ｃ）アデノシン５’３リン酸の存在に関して分析することにより分析出力を
    得て、該分析出力が上記少なくとも一つの核酸標的配列の存在または不在を示す
    こと からなる。
  38. 【請求項３８】 分析用出力が発光分光測定により得られる、請求項３７記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 処理サンプルを形成するさらなる工程： （Ａ）アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プローブと混合するこ
    とによりハイブリダイゼーション組成物を形成するが、但し、核酸プローブの３
    ’末端領域は（ｉ）その配列がサンプル中に存在する場合に核酸標的配列に一部
    または全部の相補性をもってハイブリダイズし、そして（ｉｉ）同定用ヌクレオ
    チドを含み； （Ｂ）核酸プローブにハイブリダイズした上記予め決定された核酸標的配列を
    含むかもしれない処理サンプルを形成するのに十分な時間、上記ハイブリダイゼ
    ーション組成物を保持すること を含む、請求項３７記載の方法。
  40. 【請求項４０】 脱重合酵素が６０−９０℃において活性を保持する、請求項
    ３７記載の方法。
  41. 【請求項４１】 脱重合酵素が好熱性ポリメラーゼである、請求項４０記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 ＮＤＰＫがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓにより
    コードされるポリメラーゼである、請求項３７記載の方法。
  43. 【請求項４３】 核酸サンプル中の予め決定された外因性核酸標的配列の存否
    を決定するためのキットであって、 （Ａ）その活性が、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から一つまた
    は複数のヌクレオチドを放出することである、精製されて単離された酵素；およ
    び （Ｂ）予め決定された外因性核酸標的配列に相補な核酸プローブ を含む。
  44. 【請求項４４】 予め決定された外因性核酸プローブ配列が種特異的である、
    請求項４３記載のキット。
  45. 【請求項４５】 核酸プローブが以下の核酸配列： 5’CCAGACGCCTCA 3’配列番号８６； 5’ACCTTCACGCCA 3’配列番号８７； 5’TGCCGAGACGT 3’配列番号８８； 5’GCAGACACATCC 3’配列番号８９； 5’GGAATCTCCACG 3’配列番号９０； 5’ACATACACGCAA 3’配列番号９１；および 5’ATATGCACGCAA 3’配列番号９２ またはそれらの相補配列の一つを含む、請求項４４記載のキット。
  46. 【請求項４６】 予め決定された核酸標的配列が病原体に関連する、請求項４
    ３記載のキット。
  47. 【請求項４７】 核酸プローブが以下の核酸配列： 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCATGGGTGTAATATCAAAGTGGCATACACGAGCT 3’
    配列番号８２ 5’CACTTTGATATTACACCCATG 3’配列番号３５ 5’TCACACAGGAAACAGCTATGACCATG 3’配列番号４１ 5’CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGG 3’配列番号４３ 5’CCATTTAGTACTGTCT 3’配列番号５２ 5’CTAGTTTTCTCCATTT 3’配列番号５４ 5’TTCTCTGAAATCTACT 3’配列番号５６ 5’AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配列番号５８ 5’CACTTTGATATTACACCCGTG 3’配列番号３６ 5’CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCGTGAACGTGCTCATCGACGTGAACCCGCACAACGAGCT 3’
    配列番号８３ 5’CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCACGGGTGTTAATATCAAAGTGGCATACACGAGCT 3
    ’配列番号８４ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGACCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGAGCGTCTGTTG
    GAGCT 3’配列番号１ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGGTCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAGC
    GAGCT 3’配列番号２ 5’CGCTTCTACCACGAATGCTCGCAGATCATGCTGCACGAATACGTCAGAAAGAACGTGGAGCGTCTGTTG
    GAGCT 3’配列番号３ 5’CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGATCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAGC
    GAGCT 3’配列番号４ 5’AAAAAAAACAGTACTAAATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配列番号５９ 5’AAAAAAGACAGTACTAGATGGAGAAAACTAGTAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配列番号６０ 5’AAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAACTAATAGATTTCAGAGAACTTAA 3’配列番号６１ 5’TTCTCTGAAATCTATT 3’配列番号５７ 5’CTAGTTTTCTCCATCT 3’配列番号５５ 5’CCATTTAGTACTGTTT 3’配列番号５３ 5’GAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTA
    G 3’配列番号９ 5’CTACTGGAGTTTCTTTCGTTTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTGCTTGTGTAGTTTGTTTTACTT
    C 3’配列番号１０ 5’GCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAA 3’配列番号１１ 5’TTCTGCTACTTTAGGCGCAGGTGTAGTTCG 3’配列番号１２ 5’CATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACC
    A 3’配列番号１３ 5’TGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCGCCTTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAGGTTGCCGTCGAT
    G 3’配列番号１４ 5’CTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAA 3’配列番号１５ 5’TTTTTTCAAAATATCTCGTAAGTCTCCGAG 3’配列番号１６ 5’TGTGTAATGAAAGAAATCACCGTCACTGAA 3’配列番号１９ 5’TTCAGTGACGGTGATTTCTTTCATTACACA 3’配列番号２０ 5’CTTGAAGCATAGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTGAGCCGCTTGAGTTGCCTTAGTTTTAATAG
    T 3’配列番号３１ 5’ACTATTAAAACTAAGGCAACTCAAGCGGCTCAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGAACTATGCTTCAA
    G 3’配列番号３３ 5’AGTTCTTGTTTTTAAACTTTGTCCATCTTG 3’配列番号３２ 5’CAAGATGGACAAAGTTTAAAAACAAGAACT 3’配列番号３４ またはそれらの相補配列の一つを含む、請求項４６記載のキット。
  48. 【請求項４８】 核酸プローブが蛍光標識を含む、請求項４３記載のキット。
  49. 【請求項４９】 核酸プローブが非天然ヌクレオチド類似体を含む、請求項４
    ３記載のキット。
  50. 【請求項５０】 ピロリン酸をさらに含む、請求項４３記載のキット。
  51. 【請求項５１】 ヌクレオチド２リン酸キナーゼをさらに含む、請求項４３記
    載のキット。
  52. 【請求項５２】 ヌクレオチド２リン酸キナーゼがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆ
    ｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるキナーゼである、請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 核酸サンプル中の複数の予め決定された外因性核酸標的配列
    の存否を決定するための組成物であって、 （Ａ）その活性が、ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から一つまた
    は複数のヌクレオチドを放出することである、精製されて単離された酵素；およ
    び （Ｂ）各々が予め決定された外因性核酸標的配列に相補な、複数の核酸プロー
    ブ を含む水溶液を含む。
  54. 【請求項５４】 核酸サンプル中の複数の予め決定された核酸標的配列の存否
    を決定するための組成物であって、 （Ａ）その活性が、ピロリン酸存在下で、同定用ヌクレオチドを、ハイブリダ
    イズした核酸プローブからヌクレオシド３リン酸として放出することである、精
    製されて単離された酵素； （Ｂ）アデノシン５’２リン酸； （Ｃ）ピロリン酸； （Ｄ）精製されて単離されたヌクレオシド２リン酸キナーゼ；および （Ｅ）各々がそのそれらの予め決定された核酸標的配列に相補な、複数の核酸
    プローブ を含む。
  55. 【請求項５５】 その活性がピロリン酸存在下で同定用ヌクレオチドを放出す
    ることである精製されて単離された酵素が好熱性ポリメラーゼである、請求項１
    ８１記載の組成物。
  56. 【請求項５６】 精製されて単離されたヌクレオシド２リン酸キナーゼがＰｙ
    ｒｐｃｐｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるキナーゼである、請求
    項５３記載の組成物。
  57. 【請求項５７】 第１の外因性核酸標的を含む核酸サンプル中の上記第１外因
    性核酸標的または実質上同一の第２の外因性標的の存否を決定するための方法で
    あって、工程： （Ａ）アッセイされるサンプルを一つまたは複数の核酸プローブと混合するこ
    とによりハイブリダイゼーション組成物を形成するが、但し、上記第１および第
    ２の外因性核酸標的は標的間で異なる予め決定された位置において少なくとも一
    つのヌクレオチドを除いて配列同一性である領域を含み、そして核酸プローブが
    、（ｉ）配列同一の上記核酸標的領域に実質相補であって、標的とプローブがハ
    イブリダイズしたときに標的の上記予め決定された位置において並べられたプロ
    ーブの質問位置において少なくとも一つのヌクレオチドを含み、そして（ｉｉ）
    ３’末端領域に同定用ヌクレオチドを含み； （Ｂ）処理サンプルを形成するのに十分な時間上記ハイブリダイゼーション組
    成物を保持するが、上記プローブの質問位置におけるヌクレオチドが上記の同一
    の領域中の標的の予め決定された位置のヌクレオチドと並べられており； （Ｃ）ハイブリダイズした核酸プローブの３’末端から一つまたは複数のヌク
    レオチドを放出する活性を有する酵素の脱重合量と、上記処理サンプルを混合す
    ることにより処理反応混合物を形成し； （Ｄ）同定用ヌクレオチドを放出し、そしてハイブリダイズした核酸プローブ
    を上記酵素が脱重合するのに十分な時間上記処理サンプルを保持し；そして （Ｅ）放出された同定用ヌクレオチドの存在に関して分析することにより分析
    出力を得るが、分析出力は上記の予め決定された領域における上記ヌクレオチド
    の存否を示し、それにより第１または第２の上記外因性核酸標的の存在または不
    在を示すこと からなる。
  58. 【請求項５８】 分析用出力が蛍光分光測定により得られる、請求項５７記載
    の方法。
  59. 【請求項５９】 分析用出力が質量分光測定により得られる、請求項５７記載
    の方法。
  60. 【請求項６０】 分析用出力が発光分光測定により得られる、請求項５７記載
    の方法。
  61. 【請求項６１】 分析用出力が吸光分光測定により得られる、請求項５７記載
    の方法。
  62. 【請求項６２】 核酸標的配列がデオキシリボ核酸およびリボ核酸からなるグ
    ループより選択される、請求項５７記載の方法。
  63. 【請求項６３】 第１プローブおよび第２プローブをさらに含む、請求項５７
    記載の方法。
  64. 【請求項６４】 アッセイされるサンプルが複数の第１核酸標的および第２の
    実質上同一の核酸標的を含む、請求項６３記載の方法。
  65. 【請求項６５】 第１プローブが上記の予め決定された位置の第１の標的核酸
    に相補な質問位置においてヌクレオチドを含み、そして第２プローブが上記の予
    め決定された位置の第２の標的核酸に相補な質問位置においてヌクレオチドを含
    む、請求項６４記載の方法。
  66. 【請求項６６】 核酸プローブの一つが部分相補性をもって一つの標的核酸配
    列にハイブリダイズするときに得られる分析出力が、全ての核酸プローブが全体
    の相補性をもってそれら各々の核酸標的配列にハイブリダイズする場合の分析出
    力よりも大きい、請求項６４記載の方法。
  67. 【請求項６７】 核酸プローブの一つが部分相補性をもって一つの標的核酸配
    列にハイブリダイズするときに得られる分析出力が、全ての核酸プローブが全体
    の相補性をもってそれら各々の核酸標的配列にハイブリダイズする場合の分析出
    力よりも低い、請求項６４記載の方法。
  68. 【請求項６８】 核酸プローブの一つが全体の相補性をもって一つの標的核酸
    配列にハイブリダイズするときに得られる分析出力が、全ての核酸プローブが部
    分相補性をもってそれら各々の核酸標的配列にハイブリダイズする場合の分析出
    力よりも大きい、請求項６４記載の方法。
  69. 【請求項６９】 核酸プローブの一つが全体の相補性をもって一つの標的核酸
    配列にハイブリダイズするときに得られる分析出力が、全ての核酸プローブが部
    分相補性をもってそれら各々の核酸標的配列にハイブリダイズする場合の分析出
    力よりも低い、請求項６４記載の方法。
  70. 【請求項７０】 その活性がヌクレオチドを放出することである上記酵素が、
    ３’末端領域においてその塩基が全体の相補性を伴ってマッチするハイブリダイ
    ズした核酸をピロリン酸イオン存在下で脱重合する鋳型依存性ポリメラーゼであ
    る、請求項５７記載の方法。
  71. 【請求項７１】 その活性がヌクレオチドを放出することである上記酵素が、
    ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を呈し、ハイブリダイズしたプローブの３’
    末端領域において一つまたは複数のミスマッチ塩基を有するハイブリダイズした
    核酸を脱重合する、請求項５７記載の方法。
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