JP2002531121A

JP2002531121A - Ｎ末端伸長を有するグルコアミラーゼ

Info

Publication number: JP2002531121A
Application number: JP2000586886A
Authority: JP
Inventors: レンフェルトニールセン，ビャルネ; スベンセン，アラン; ボイセン，キルステン; ビン，イェスペル; ペデルセン，ヘンリク
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2002-09-24
Also published as: CN1329665A; WO2000034452A1; CA2352046A1; AU1648700A; EP1137763A1; KR20010089885A

Abstract

(57)【要約】本発明は、改良された熱安定性を示す親真菌グルコアミラーゼの変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、親グルコアミラーゼのグルコアミラーゼ変異体、その変異体グルコ
アミラーゼをコードするＤＮＡ配列及びデンプンを加水分解するためのその変異
体酵素を用いる方法に関する。

【０００２】より詳しくは、本発明は、改良された熱安定性を有するグルコアミラーゼ変異
体に関する。

【０００３】発明の背景グルコアミラーゼ（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３
．２．１．３）は、デンプン又は関連するオリゴ−及びポリサッカライド分子の
非還元端からのＤ−グルコースの遊離を触媒する酵素である。グルコアミラーゼ
は、商業的に最も重要であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からの
ものと共に、いくつかの糸状菌及びイーストにより生産される。

【０００４】商業的に、グルコアミラーゼ酵素はα−アミラーゼにより既に部分的に加水分
解されているコーンデンプンをグルコースに変換するのに用いられる。グルコー
スは更に、グルコースイソメラーゼにより、グルコース及びフルクトースからほ
ぼ等しく構成される混合物に変換される。この混合物、又はフルクトースが更に
豊富な混合物は、世界を通じて商業化されている一般に用いられる高フルクトー
スコーンシロップである。このシロップは、酵素的過程により生産される世界で
最も大きなトン数の製品である。デンプンのフルクトースへの変換に関連する３
つの酵素は、生産される最も重要な工業用酵素の１つである。

【０００５】高フルクトースコーンシロップの生産におけるグルコアミラーゼの商業的使用
に関して存在する主要な問題の１つは、グルコアミラーゼの比較的低い熱安定性
である。グルコアミラーゼはα−アミラーゼ又はグルコースイソメラーゼほど熱
的に安定でなく、それは、α−アミラーゼ又はグルコースイソメラーゼより低い
pHで最も活性で安定である。従って、それは、より低い温度及びpHで別個の容器
で用いなければならない。

【０００６】発明の概要これにより、本発明の目的は、グルコアミラーゼ活性を有する酵素の特性を改
良すること、特にその酵素の熱安定性を改良することである。驚くことに、酵素のＮ末端にペプチド伸長部を連結させることにより、グルコ
アミラーゼ活性を有する酵素の熱安定性を有意に増加させることができることが
見い出された。

【０００７】結果として、第１の態様において、本発明は、Ｎ末端にペプチド伸長部を有す
る親グルコアミラーゼの変異体に関する。本文脈において、用語“ペプチド伸長部”は、１又は複数の連続的なアミノ酸
残基のストレッチが、親（成熟）グルコアミラーゼのＮ末端に加えられているこ
とを示すことを意図する。

【０００８】用語“成熟グルコアミラーゼ”は、その慣用的な意味で、即ち、問題の生産体
生物により（グリコシル化を行い、Ｎ及び／又はＣ末端配列、例えばプレ−及び
プロペプチド配列を除去するための）翻訳後及び分泌後プロセッシング後に生じ
るグルコアミラーゼの活性型を示すのに用いる。より詳しくは、これは、アミノ
酸配列、例えばプレ−及びプロ−ペプチド配列が、存在するなら、最初に翻訳さ
れたグルコアミラーゼ、即ち非プロセッシンググルコアミラーゼから除去されて
いることを意味する。本発明の定義に含まれる成熟グルコアミラーゼは、Ａ．ニ
ゲルグルコアミラーゼ（配列番号：１を参照）を、位置３、即ちＬｅｕとＡｓｐ
の間で切断するトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）により切断（プ
ロセッシング）されたグルコアミラーゼである。

【０００９】用語“親グルコアミラーゼ”は、本発明により改変すべきグルコアミラーゼを
示すことを意図する。親グルコアミラーゼは、天然（又は野生型）グルコアミラ
ーゼであっても、いずれかの好適な手段により調製されたその変異体であっても
よい。例えば、親グルコアミラーゼは、１もしくは複数のアミノ酸残基の置換、
欠失もしくはトランケーションにより、又は１もしくは複数のアミノ酸残基の、
天然のグルコアミラーゼのアミノ酸配列への付加もしくは挿入により、典型的に
はグルコアミラーゼの構造的部分において改変されている天然のグルコアミラー
ゼの変異体であり得る。

【００１０】他の態様において、本発明は、先に定義されるグルコアミラーゼをコードする
ＤＮＡ配列、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物及び組換え発現ベクター、
並びに本発明のＤＮＡ配列又は本発明のベクターを有する宿主細胞に関する。本発明のグルコアミラーゼ変異体は、便利には、デンプンを変換するための方
法に用いることができ、従って、更に別の態様において、本発明は、デンプン又
は部分的に加水分解されたデンプンをデキストロースを含むシロップに変換する
ための方法であって、デンプン加水分解物を、本発明のグルコアミラーゼ変異体
の存在下で糖化することを含む方法に関する。

【００１１】最後の態様において本発明は、Ｎ末端に伸長部を作ることにより親グルコアミ
ラーゼの熱安定性を改良するための方法を供する。本発明の発明者らは、改良された熱安定性を有する親グルコアミラーゼの改良
されたいくつかの変異体を供する。その改良された熱安定性は、ペプチド伸長部
を親グルコアミラーゼに連結させることにより得られる。これは、以下に詳細に
記載されよう。

【００１２】発明の詳細な記載ペプチド伸長部上述の通り、驚くことに、グルコアミラーゼ変異体、特に改良された熱安定性
を有するものは、好適なペプチド伸長が親グルコアミラーゼのＮ末端で見い出す
ことができる場合に達成することができることが見い出された。本発明はこの発
見に基づく。

【００１３】本発明の文脈において、“Ｎ末端で見い出すことができる”とは、成熟グルコ
アミラーゼがＮ末端にペプチド伸長を有することを意味する。一実施形態におい
て、ペプチド伸長部は親グルコアミラーゼに対してネイティブ、即ちプロ−及び
／又はプレ−配列を除去するための翻訳後プロセッシング前のものである。これ
により、ペプチド伸長部は、発現及び翻訳後プロセッシング後に通常、除去され
又は切断される非プロセッシング化親グルコアミラーゼのプレ−及び／又はプロ
−配列であり得る。

【００１４】別の実施形態において伸長部は、プロセッシングの間にドナー細胞により通常
、切り落とされるペプチド配列、例えばプレ−及び／又はプロ−配列と同一のＮ
末端のペプチドである。ほとんどの場合、ペプチド伸長部は、プレ−及び／又は
プロ−配列と異なる。これは以下に更に記載されよう。伸長部がＮ末端に連結させる場合、それは、当業界で公知のいずれかのタンパ
ク質工学法により行うことができる。

【００１５】用語“改良された熱安定性を有するグルコアミラーゼ変異体”とは、本発明の
文脈において、対応する親グルコアミラーゼより、より高いＴ_1/2 （半減期）又
は固定されたインキュベーション時間の後の残存酵素活性を有するグルコアミラ
ーゼ変異体を意味する。熱安定性、例えばＴ_1/2 及び残存活性の測定は、以下の
材料及び方法セクションに記載される。

【００１６】用語“好適なペプチド伸長部”は、用いるべきペプチド伸長部が、先に定義さ
れるような改良された熱安定性を示すことができるものであることを示すのに用
いる。ペプチド伸長部の“妥当性”は、ペプチド伸長部が連結している改変され
たグルコアミラーゼ、及び対応する親グルコアミラーゼの各々の熱安定性の比較
分析により検査することができる。熱安定性は、いずれかの好適な技術、例えば
本願に記載される熱安定性アッセイにより決定することができる。

【００１７】要求される効果、例えば改良された熱安定性を供することができるペプチド伸
長部の能力は、例えば改変すべき親グルコアミラーゼの同一性、ペプチド伸長部
の（長さを含む）構造、全体のグルコアミラーゼ変異体酵素の構造へのペプチド
伸長部の影響、ペプチド伸長部のアミノ酸残基の性質又は官能性等に依存すると
現在、考えられている。ペプチド伸長部が要求される効果を供することができる
ための必要条件は、もちろん、ペプチド伸長部を含むグルコアミラーゼ変異体が
好適な宿主生物内で発現可能であることである。以下の一般的な考察は、好適な
ペプチド伸長部のデザインに関連し得る。

【００１８】ペプチド伸長部の長さ：様々の数のアミノ酸残基を含むペプチド伸長部が要求
される効果を供することができ、これにより本発明により用いるべきペプチド伸
長部に存在すべきアミノ酸残基の正確な数を特定することは可能でないことが見
い出されている。アミノ酸残基の数の上限は、とりわけ得られた改変されたグル
コアミラーゼ変異体の発現、構造及び／又は活性へのペプチド伸長部の影響に基
づき決定される。

【００１９】ペプチド伸長部は、これにより、１〜１００アミノ酸残基、好ましくは１〜５
０アミノ酸残基、より好ましくは１〜２０、そして更により好ましくは１〜１０
アミノ酸残基を含み得る。安定性：ペプチド伸長部は、好ましくは、許容できる安定性（例えば構造的安
定性及び／又は発現安定性）を有するグルコアミラーゼ変異体を供するように、
又はグルコアミラーゼ変異体の構造的安定性を有意に減少させないように選択さ
れるべきである。多くのペプチド伸長部が得られるグルコアミラーゼ変異体にい
ずれかの実質的な構造的不安定性を与えるとは考えられないが、それは、特定の
例において及び特定の親グルコアミラーゼで、構造的安定性を改変されたグルコ
アミラーゼ酵素にそれ自体で与えることができるペプチド伸長部を選択すること
に関連し得る。例えば、ペプチド伸長部は、以下で議論するように、Ｎ末端残基
にＮ末端伸長部からのシステイン架橋を加えることにより相互作用の数を増加さ
せ、及び／又は共有結合させることができる。

【００２０】ペプチド伸長部のアミノ酸残基の性質Ｎ末端残基とＮ末端伸長部との間の改良された相互作用を得るために、それら
残基は、好ましくは、α−ヘリックスを形成するための優先度の低い残基からの
ものであるべきであり、これにより本発明の文脈に用いられるべきである。これ
は、Ｎ末端のα−ヘリックスがＮ末端に長くなると、それはＮ末端残基との接触
がない構造から突き出るという事実により理論的に説明される。本発明によるペ
プチド伸長部は、Ｎ末端残基のＮ末端伸長部への接触を改良することにより改良
された安定性を含む。与えるＮ末端伸長部内で、残基の主要部分は非ヘリックス
メーカーの群からのものでなければならない。より低い又は等しい、ヘリックス
のＮ末端、及び／又はヘリックスの中央、及び／又はヘリックスのＣ末端部分に
おけるα−ヘリックス傾向を有する残基を用いることにより、Ｎ末端残基とＮ末
端伸長部との間の接触の改良が最適になるであろう。α−ヘリックスのＮ末端部
分におけるより低い傾向を有する残基は、その伸長部がグルコアミラーゼ中天然
のα−ヘリックスのＮ末端部分におかれるので、特別の関心がある。Ｍ（メチオ
ニン）、Ｋ（リシン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｖ（バリン）、Ｉ（イソロイシン）
、Ｙ（チロシン）、Ｃ（システイン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｔ（トレオニ
ン）、Ｇ（グリシン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）及
びＤ（アスパラギン酸）を含む残基を非α−ヘリックスメーカーとして本発明に
用いることができる。

【００２１】本発明の文脈において、“Ｎ末端残基”は、Ｎ末端残基の周辺の残基、即ちＮ
末端残基の中心から１８，１２及び／又は８Åの球の中にあり、Ｎ末端伸長部の
部分でない残基を意味する。より好ましくは、伸長部は１０Å以内にあるが、Ｃ
ｏｎｎｅｌｌｙ水アクセス可能表面プログラム（（バージョン１９８８年１０月
）、引用W.Kabsch and C.Sander, Biopolymers 22 (1983) pp.2577〜2637）を用
いてアクセシビリティーにおいて正の数を有する残基として定義される酵素の表
面上にある。

【００２２】 “非ヘリックスメーカー”は、本明細書において、（Proteins: Creighton T.
E.(1993)）のｔａｂｌｅ６．５から得られるデータにより定義される。ここで
は、異なるアミノ酸残基について異なる傾向が記載されている。あるいは、改良された構造安定性は、本発明のグルコアミラーゼ内のシステイ
ン架橋の導入により供することができる。例えは、ペプチド伸長部とグルコアミ
ラーゼの成熟部分との間のシステイン架橋は、そのペプチド伸長部のアミノ酸残
基の少くとも１つがグルコアミラーゼ変異体の成熟部分内のシステイン残基と共
有結合を形成することができるように位置したシステイン残基であるなら、確立
することができる。システイン架橋を導入することのポジティブな効果を実施例
３に示す。成熟グルコアミラーゼ内に好適なシステインが存在しないなら、便利
には、活性のために重要でないと考えられる親グルコアミラーゼのアミノ酸を置
換することにより、親グルコアミラーゼの好適な位置にシステインを挿入するこ
とができる。

【００２３】一般に、本発明におけるシステイン残基を含むペプチド伸長部のアミノ酸配列
は、Ｘ−Ｃ−（Ｘ）_n （式中、Ｘは独立して、１つのアミノ酸、好ましくは上述の非α−ヘリックスメ
ーカーのもの、更により好ましくは短い側鎖を有するものである）で示すことができる。

【００２４】そのＣｙｓのカルボキシ末端側とプロセッシングされた天然のＮ末端との間に
は、５より大きい又は等しい、好ましくは５〜１００の、更により好ましくは５
〜１０の、更により好ましくは５の、いずれかの数（ｎ）のＸ残基が存在する。例としては次のものがある：ＡＣＧＰＳＴＳ（配列番号：２５）ＡＣＰＧＴＳＴ（配列番号：２６）ＡＣＧＴＧＴＳ（配列番号：２７）ＡＣＴＧＳＴＧ（配列番号：２８）ＡＣＧＰＳＴＳＧ（配列番号：２９）ＡＣＰＧＴＳＴＧ（配列番号：３０）ＡＣＧＴＧＴＳＳ（配列番号：３１）ＡＣＴＧＳＴＧＴ（配列番号：３２）グルコアミラーゼのネイティブプロペプチド（例えばＡ．ニゲルＧ１又はＧ２
ＡＭＧ）は、ｋｅｘ２様プロテアーゼ（二塩基性プロテアーゼ）により開裂さ
れる。これにより、ｋｅｘ２プロテアーゼは、ｋｅｘ２又はｋｅｘ２様部位を開
裂することができるプロテアーゼである。ｋｅｘ２部位（例えばMethods in Enz
ymology Vol 185, ed. D.Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, C
A,“Gene Expression Technology”）及びｋｅｘ２様部位は、特定のタンパク質
のプロペプチドコーディング領域と成熟領域との間に見い出される二塩基性認識
部位（即ち開裂部位）である。

【００２５】この開裂部位を変異させることで、Ｎ末端プロペプチドを完全に残すことがで
きる。例：ＮＶＩＰＰＲ（配列番号：３３）ＮＰＰＩＲＰ（配列番号：３４）ＮＶＩＰＲＰ（配列番号：３５）別の可能性は、グルコアミラーゼ遺伝子を発現するように選択された宿主にお
いてｋｅｘ２様プロテアーゼコーディング遺伝子を削除し又は不活性化すること
である。これも、Ｎ末端ペプチド伸長部を完全に残し得る。

【００２６】Ｎ末端プロセッシングに関連するプロテアーゼをコードする他の遺伝子、例え
ばトリペプチジルアミノペプチダーゼコーディング遺伝子も、発現のための問題
の宿主において削除し又は不活性化することができよう。システイン変異体のためのＮ末端残基は、Ｎ末端残基周辺の残基、即ちＮ末端
残基の中心から１８，１２及び／又は８Åの球の内にあり、Ｎ末端伸長部の部分
でない残基として定義される。一般に、本発明におけるシステイン残基を含む伸
長部のためのアミノ酸配列は、ｘ−Ｃ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ（式中、ｘは独立して、上述の非−αヘリックスメーカーのうちの１つである）
と示すことができる。

【００２７】特定の実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼの
成熟部分と共有結合を形成することができるペプチド伸長部を含む。別の特定の
実施形態において、グルコアミラーゼ変異体は、システイン残基が一緒にシステ
イン架橋を形成するように、ペプチド伸長部の１又は複数のシステイン残基及び
親グルコアミラーゼの成熟部分のシステイン残基を含む。更に別の特定の実施形
態において、親グルコアミラーゼの成熟部分内のシステイン残基は親グルコアミ
ラーゼのアミノ酸残基に挿入され又は置換されている。最も好ましい特定の実施
形態において、位置３７５に相当する位置のアスパラギン酸残基、位置２９９に
相当する位置のグルタミン酸残基、位置４３１に相当する位置のセリン残基位置
４７１に相当する位置のアラニン残基、位置４７９に相当する位置のアラニン残
基、位置４８０に相当する位置のトレオニン残基、位置４８１に相当する位置の
プロリン残基、又は位置８に相当する位置のセリン残基は、アスペルギルス・ニ
ゲルＧ１グルコアミラーゼのアミノ酸配列においてシステイン残基で置換されて
いる。

【００２８】特に、親グルコアミラーゼに連結したペプチド伸長部は、有利には、以下の伸
長部のうちの１つであり得る： Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR), Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR), Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS), Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS), Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE), Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD), Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE), Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE), Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD), Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR), Ile-Ser-Asn (ISN) 、又は Met-Asn (MN)。

【００２９】本文脈において、トリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）は、ペプチ
ド又はタンパク質配列、例えばプロホルモン又はプロ酵素内に見い出される延長
したアミノ酸配列からトリペプチドを開裂するアミノペプチダーゼを示すことを
意図する。トリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）は、特定の場合、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、又はタンパク質の非置換化Ｎ末端からトリペプチ
ドフラグメントを開裂する時に減少した安定性を導くことが見い出されている。
より詳しくは、Ｎ末端のトリペプチジルアミノペプチダーゼはグルコアミラーゼ
酵素の安定性を減少させる。従って、本発明は、ペプチド伸長部がグルコアミラ
ーゼ酵素のトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）開裂を防ぐことがで
きる親グルコアミラーゼの変異体にも関する。

【００３０】ペプチド伸長部を親グルコアミラーゼに連結する方法本発明の変異体は、合成により生産されたペプチド伸長部を問題の親グルコア
ミラーゼ酵素に加える（融合又は挿入する）ことによって得ることができるが、
本発明のグルコアミラーゼ変異体は、ｉ）親グルコアミラーゼのＮ末端に適用さ
れる要求されるペプチド伸長部をコードするように、親グルコアミラーゼをコー
ドするヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ配列を改変（例えば親グルコアミラーゼ
をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）配列中の関連する位置にペプチド伸長部
をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）配列を挿入することによる）、ii）好適
な発現系において得られた改変された核酸（好ましくはＤＮＡ）配列を発現させ
、そして iii）得られたグルコアミラーゼ変異体を回収することにより調製され
るのが好ましい。

【００３１】本文脈において、用語“連結”は、伸長部が成熟グルコアミラーゼのＮ末端（
例えば最後のアミノ酸残基）に配合していることを示すことを意図する。多くのグルコアミラーゼが、“プレプログルコアミラーゼ”として即ち成熟グ
ルコアミラーゼ、分泌シグナルペプチド（即ちプレペプチド）及びプロペプチド
からなるグルコアミラーゼとして発現される。そのプレプロ−グルコアミラーゼ
は細胞内でプロセッシングされて発酵媒体に分泌される。そこから、成熟グルコ
アミラーゼを単離及び／又は精製することができる。ペプチド伸長部の親グルコ
アミラーゼへの添加は、要求されるペプチドをコードする核酸配列を、親グルコ
アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に（Ｎ末端ペプチド伸長部について）上流に
連結させることによって行うことができる。

【００３２】要求されるグルコアミラーゼ変異体（即ち要求されるペプチド伸長部を有する
もの）が、グルコアミラーゼ変異体の転写、翻訳、及びプロセッシングの後に宿
主細胞により発現及び分泌されるように、挿入を行うべきである。用語“プロセ
ッシング”は、この文脈において、プレ−及びプロ−ペプチドの除去を意味する
（もちろん、プロペプチドが要求されるペプチド伸長部と同一である場合を除く
。これは更に以下で扱われる。

【００３３】ほとんどの場合、プロ−ペプチド又はプレペプチド（プロ配列が存在しないな
ら）をコードするＤＮＡ配列と成熟グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列と
の間にペプチド伸長部をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより親グルコア
ミラーゼを伸長させることが可能である。ペプチド伸長部をコードするＤＮＡ配列の挿入／付加は、分子生物学の分野の
いずれの当業者にも知られているいずれかの標準的技術により行うことができる
（例えばSambrookら、1989）。これは、例えば、米国特許４，６８３，２０２又
はR.K.Saiki ら（1988), Science, 239, 487〜491 に記載される特定のプライマ
ーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む。隣接ＤＮＡ配列の発現及び分
泌を供する方法は以下に記載されよう。（特に改変されたＤＮＡ配列を生産のた
めに用いる場合）本発明のグルコアミラーゼ変異体を生産するための正確な発現
系を選択することに注意を払わなければならないが、（改良された熱安定性を有
する）本発明によるグルコアミラーゼ変異体は、通常の様式で翻訳されたポリペ
プチドをプロセッシングすることができない発現系において親グルコアミラーゼ
酵素をコードするＤＮＡ配列を発現させることにより得ることができ、それによ
りプロペプチドの一部もしくは全部又はそのプロセッシング前に成熟タンパク質
と会合している類似したペプチド配列を含むグルコアミラーゼを生産する。この
場合、プロペプチド又は類似ペプチド配列はペプチド伸長部を構成する。プロペ
プチド又は類似ペプチド配列は親グルコアミラーゼに対して異種であっても同種
であってもよく、親グルコアミラーゼのＮ末端に存在し得る。この後者の技術を
用いる本発明によるグルコアミラーゼ変異体の生産は更に以下に記載される。

【００３４】従って、アミノ酸の好適なストレッチが親グルコアミラーゼのプレプロ形態に
既にコードされており、このアミノ酸のストレッチが所定の発現系によりグルコ
アミラーゼのプロセッシングにおいて切断されるなら、ペプチド伸長部は、その
発現宿主系をそのアミノ酸のストレッチのプロセッシングがおきない系に変える
ことにより適用することができる。このような場合、分泌シグナルプレ−ペプチ
ドは、分泌の間又は後に切り落とされ、プロ−ペプチドもしくはその部分又は対
応するＤＮＡ配列によりコードされる類似ペプチド配列を含む親グルコアミラー
ゼからなる改変されたグルコアミラーゼ、即ちＮ末端が伸長したグルコアミラー
ゼを生ずる。

【００３５】イースト細胞は、（プロペプチド又はその一部の形態の）ペプチド伸長部を親
真菌グルコアミラーゼ酵素、特にアスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ酵素
に適用するための特定の使用が見い出されている。極めて好ましい実施形態において、ペプチド伸長部は、以下の原理に従うラン
ダム変異誘発法によりデザインされ、適用される：ａ）ペプチド伸長部を有する親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列を、
ペプチド伸長部における、又は親グルコアミラーゼのＮ末端における局在化ラン
ダム変異誘発にかけ、ｂ）ステップａ）で得られた変異ＤＮＡ配列を宿主細胞内で発現させ、そしてｃ）親グルコアミラーゼ酵素と比べて改良された能力を有する変異グルコアミ
ラーゼ酵素を発現する宿主細胞についてスクリーニングする。

【００３６】このアプローチにより、いくつかの極めて有利なペプチド付加物を形成した。局所化ランダム変異誘発は、ＷＯ９５／２２６１５に本質的に記載される通
り行うことができる。より詳しくは、変異誘発は、上述の領域の１又は複数のみ
を変異誘発にかける条件下で行われる。特に、大きなペプチド伸長部を変異誘発
するために、それは、（例えばDeshler 1992又はLeung ら、1989に記載されるよ
うな）ＰＣＲ生成変異誘発法を用いることに関連し得る。ここでは、変異誘発す
べき領域に隣接した１又は複数の好適なオリゴヌクレオチドプローブが用いられ
る。より短いペプチド伸長部のために、ドープ化（ｄｏｐｅｄ）又はスパイク化
（ｓｐｉｋｅｄ）オリゴヌクレオチドの使用により局所化ランダム変異誘発を行
うことがより好ましい。ドーピング又はスパイキングは、例えば、不要なアミノ
酸残基についてのコドンを避けるため又は特定の型のアミノ酸残基、例えば正に
荷電した又は疎水性のアミノ酸残基を要求される位置に導入する可能性を増加さ
せるために用いられる。

【００３７】変異誘発の後、その変異したＤＮＡは、発現がおこる条件下でＤＮＡ配列を有
する好適な宿主細胞を培養することによって発現される。この目的のために用い
られる宿主細胞は、任意にベクター上に存在する、変異したＤＮＡ配列で形質転
換されているもの、又は変異誘発処理の間に親酵素をコードするＤＮＡ配列を有
するものであり得る。好適な宿主細胞の例は以下に供され、それは、好ましくは
、（容易なスクリーニングを可能にする）変異した酵素を分泌することができる
宿主細胞である。イースト細胞、例えばＳ．セレビシアエの細胞が好適な宿主細
胞であることが見い出されている。

【００３８】親グルコアミラーゼ本発明により考慮される親グルコアミラーゼには、真菌グルコアミラーゼ、特
にアスペルギルス株から得ることができる真菌グルコアミラーゼ、例えばアスペ
ルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ及びその変異体又は突然変異体、相同なグルコ
アミラーゼ、並びに配列番号：１と構造的及び／又は機能的に類似した更なるグ
ルコアミラーゼがある。特に考慮されるのは、Boelら（1984),“Glucoamylases
G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but
closely related mRNAs”, EMBO J. 3 (5), p.1097〜1102に開示されるアスペル
ギルス・ニゲルグルコアミラーゼＧ１及びＧ２である。Ｇ２グルコアミラーゼは
配列番号：１に開示される。

【００３９】商用親グルコアミラーゼ市販の親グルコアミラーゼには、Novo NordiskからのＡＭＧ、及びGenencor,
Inc USA 及びGist-Brocades, Delft, The Netherlands 社からのグルコアミラー
ゼもある。親相同グルコアミラーゼ親グルコアミラーゼの相同性は、第１の配列の第２の配列からの派生を示す２
つのタンパク質配列間の類似性の程度として決定される。相同性は、好適には、
当業界で知られたコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケー
ジ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Ge
netics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology,
48, p.443-453) に供されるＧＡＰを用いて決定することができる。ポリペプチ
ド配列比較のための次のセッティング：３．０のＧＡＰクリエーションペナルテ
ィー及び０．１のＧＡＰエクステンションペナルティーでＧＡＰを用いて、本発
明の類似ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの成熟部分は、好ましくは
少くとも８０％、少くとも９０％、より好ましくは少くとも９５％、より好まし
くは少くとも９７％、そして最も好ましくは少くとも９９％の、配列番号：１に
示すアミノ酸配列の成熟部分との同一性の程度を示す。

【００４０】好ましい実施形態において、本発明の変異体は、例えば基質としてマルトデキ
ストリンを用いて、約６０〜８０℃、好ましくは６３〜７５℃の温度範囲で、４
〜５、特に４．２〜４．７のpHで、改良された熱安定性を有する。別の好ましい実施形態において、親相同グルコアミラーゼは微生物からのグル
コアミラーゼを含む。より好ましい実施形態において、微生物は、ユーバクテリ
ア、古細菌、真菌、藻類及び原生動物を含み、更により好ましい実施形態におい
て、親相同グルコアミラーゼは糸状菌から得られる。

【００４１】極めて好ましい実施形態において、親グルコアミラーゼはアスペルギルス・ニ
ゲルＧ１グルコアミラーゼである（Boelら（1984), EMBO, J. 3 (5), p.1097 〜
1102）。親グルコアミラーゼはトランケートされたグルコアミラーゼであってよ
い。グルコアミラーゼ変異体を調製するための方法遺伝子に突然変異を導入するためのいくつかの方法が当業界で知られている。
グルコアミラーゼコーディングＤＮＡ配列のクローニングの短い議論の後、グル
コアミラーゼコーディング配列内の特定部位に突然変異を作り出すための方法が
議論されよう。

【００４２】グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング、α-アミラーゼを
コードするＤＮＡ配列のクローニング親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は当業界で公知の種々の方法を用
いて、問題のグルコアミラーゼを生産するいずれかの細胞又は微生物から単離す
ることができる。第１に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、研
究すべきグルコアミラーゼを生産する生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡを用いて作製すべきである。次に、グルコアミラーゼのアミノ酸配列が
知られているなら、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、問題の
生物から調製されたゲノムライブラリーからグルコアミラーゼコーディングクロ
ーンを同定するのに用いることができる。あるいは、別の知られたグルコアミラ
ーゼ遺伝子と相同な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、低ス
トリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、グルコアミ
ラーゼコーディングクローンを同定するためにプローブとして用いることができ
よう。

【００４３】グルコアミラーゼコーディングクローンを同定するための更に別の方法は、ゲ
ノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られ
たゲノムＤＮＡライブラリーでグルコアミラーゼ陰性細菌を形質転換し、そして
次にその形質転換された細菌をグルコアミラーゼのための基質（即ちマルトース
）を含む寒天にプレートし、それによりグルコアミラーゼを発現するクローンを
同定することに関する。

【００４４】あるいは、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、確立されている標準
的方法、例えばS.L.Beaucage及びM.H.Caruthers (1981), Tetrahedron Letters
22, p.1859〜1869に記載されるホスホロアミジト法、又はMatthes ら、(1984),
EMBO J. 3, p.801〜805 に記載される方法により合成により調製することができ
る。ホスホロアミジト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシ
ンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、連結し、そして好適なベクタ
ーにクローニングされる。最後にそのＤＮＡ配列は、ゲノム及び合成起源の混合
物、合成及びｃＤＮＡ起源の混合物又はゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合物であっ
てよく、それは、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラ
グメント（好適なら、全体のＤＮＡ配列の種々の部分に対応するフラグメント）
を連結することにより調製される。そのＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４，６８３
，２０２又はR.K.Saiki ら（1988), Science 239, 1988, pp.487〜491 に記載さ
れるように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により調製すること
もできる。

【００４５】変異誘発剤とのインキュベーション又はそれへの露出の後、その変異されたＤ
ＮＡは、そのＤＮＡ配列を有する好適な宿主細胞を、発現がおこる条件下で培養
することにより発現される。この目的のために用いる宿主細胞は、任意にベクタ
ー上に存在する、変異したＤＮＡ配列で形質転換されているもの、又は変異誘発
処理の間に親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列も保有するものであり得
る。好適な宿主細胞の例は次のものである：グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，
Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋ
ａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａ
ｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ；及び
グラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。変異したＤＮＡ配列は、その変異
したＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を更に含み得る。

【００４６】部位特異的変異誘発グルコアミラーゼコーディングＤＮＡ配列を単離し、そして変異のための要求
される部位を同定した後、合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を導入すること
ができる。これらのオリゴヌクレオチドは、要求される変異部位に隣接するヌク
レオチド配列を含む。特定の方法において、グルコアミラーゼコーディング配列
のＤＮＡの一本鎖ギャップがグルコアミラーゼ遺伝子を有するベクター内に形成
される。次に、要求される突然変異を有する合成ヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ
の相同部分とアニーリングされる。次に残りのギャップにＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）で充填され、その構造物はＴ４リガーゼを用いて連結
される。この方法の一例は、Morinagaら（1984), Biotechnology 2, p 646 〜63
9 に記載される。ＵＳ４，７６０，０２５は、そのカセットの小さな変化を行
うことにより多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しか
しながら、更により多くの種類の変異をMorinagaの方法により、いずれかの一回
で導入することができる。なぜなら種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導
入することができるからである。

【００４７】グルコアミラーゼコーディングＤＮＡ配列に突然変異を導入するための別の方
法がNelson and Long (1989), Analytical Biochemistry 180, p.147〜151 に記
載される。それは、ＰＣＲ反応においてプライマーの１つとして化学的に合成さ
れたＤＮＡ鎖を用いることにより導入された要求される変異を含むＰＣＲフラグ
メントの３−ステップ生成に関する。ＰＣＲ生成フラグメントから、変異を有す
るＤＮＡフラグメントは制限エンドヌクレアーゼでの開裂により単離し、発現プ
ラスミドに再挿入することができる。

【００４８】更に、Sierks. et al., (1989)“Site-directed mutagenesis at the active
site Trp120 of Aspergillus awamori glucoamylase."Protein Eng., 2, 621-62
5; Sierks et al., (1990),"Determination of Aspergillus awamori glucoamyl
ase catalytic mechanism by site-directed mutagenesis at active site Asp1
76, Glu179, and Glu180". Protein Eng. vol.3, 193-198もアスペルギルスグル
コアミラーゼにおける部位特異的変異誘発を記載する。

【００４９】ランダム変異誘発ランダム変異誘発は、好適には、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳される遺
伝子の少くとも３つの部分、又は全体の遺伝子内で局在化又は領域特異的ランダ
ム変異誘発のいずれかとして行われる。親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ
配列のランダム変異誘発は、便利には、当業者に知られたいずれかの方法の使用
により行うことができる。これに関して、本発明の更なる態様は、親グルコアミ
ラーゼの変異体を形成するための方法であって、その変異体はその親に対して増
加した熱安定性を示し、（ａ）親グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列をランダム変異誘発にかけ
、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた変異したＤＮＡ配列を宿主細胞において発現
させ、そして（ｃ）親グルコアミラーゼに対して変化した特性（即ち熱安定性）を有するグ
ルコアミラーゼ変異体を発現する宿主細胞についてスクリーニングすることを含む方法に関する。

【００５０】上述の本発明の方法のステップ（ａ）は、好ましくは、本明細書の研究例（後
述）に記載されるようなドープ化（ｄｏｐｅｄ）プライマーを用いて行われる。
例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤の使用により
、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はそのＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変
異誘発にかけることにより行うことができる。更に、ランダム変異誘発はこれら
の変異誘発剤のいずれかの組合せの使用により行うことができる。変異誘発剤は
、例えば、トランジション、トランスバージョン、インバージョン、スクランブ
リング、デリーション、及び／又はインサーションを誘導するものである。本目
的に適した物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロ
キシアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＭＭＧ）
、Ｄ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ
）、亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。これらの剤を
用いる場合、変異誘発は典型的には、変異誘発すべき親酵素をコードするＤＮＡ
配列を、選択された変異誘発の存在下で、変異誘発がおこるための好適な条件下
でインキュベートし、そしてその要求される特性を有する変異ＤＮＡについて選
択することにより行われる。変異誘発をオリゴヌクレオチドの使用により行う場
合、そのオリゴヌクレオチドは、変化すべきでない位置でオリゴヌクレオチドの
合成の間、３つの非親ヌクレオチドでドープ又はスパイクされ得る。ドーピング
又はスパイキングは、不要なアミノ酸のためのコドンが回避されるように行うこ
とができる。ドープ化又はスパイク化オリゴヌクレオチドは例えばＰＣＲ，ＬＣ
Ｒ又は好適と思われるいずれかのＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、い
ずれかの公開された技術によりグルコアミラーゼ酵素をコードするＤＮＡに組み
込むことができる。好ましくはドーピングは、“コンスタントランダムドーピン
グ”を用いて行われ、そこでは各々の位置での野生型及び変異体の割合が予め規
定される。更に、ドーピングは、特定のヌクレオチドの導入についての選択性、
それにより１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入についての選択性に対して行
われる。ドーピングは、例えば各々の位置において９０％の野生型及び１０％の
変異の導入を許容するように行うことができる。ドーピングスキームの選択にお
ける更なる考慮は遺伝子及びタンパク質構造の束縛に基づく。ドーピングスキー
ムは、とりわけ、終止コドンの導入を避けるのを確実にするＤＯＰＥプログラム
を用いて行うことができる。ＰＣＲ生成変異誘発を用いる場合、親グルコアミラ
ーゼをコードする化学的に処理した又は未処理の遺伝子はヌクレオチドのミス・
インコーポレーションを増加させる条件下でＰＣＲにかけられる（Peshler 1992
; Leung ら、Technique, Vol.1, 1989, pp.11 〜15）。大腸菌のミューテーター
株（Fowlerら、Molec.Gen.Genet., 133, 1947, pp.179 〜191 ）、Ｓ．セレビア
エ又はいずれかの他の微生物を、例えば親グルコシレートを含むプラスミドをそ
のミューテーター株に形質転換し、そのプラスミドを有するミューテーター株を
生長させ、そしてそのミューテーター株から変異プラスミドを単離することによ
りグルコアミラーゼをコードするＤＮＡのランダム変異誘発のために用いること
ができる。その変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換することがで
きる。その変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換することができる
。変異誘発すべきＤＮＡ配列は、便利には、親グルコアミラーゼを発現する生物
から調製されたゲノム又はｃＤＮＡライブラリー中に存在し得る。あるいは、そ
のＤＮＡ配列は、それ自体、変異誘発剤と共にインキュベートされ、又はそれに
露出され得るプラスミド又はバクテリオファージのような好適なベクター上に存
在し得る。変異誘発すべきＤＮＡは、その細胞のゲノム内に組み込まれることに
より、又は細胞が有するベクター上に存在することにより宿主細胞中にも存在し
得る。最後に、変異誘発すべきＤＮＡは、単離された形態であり得る。ランダム
変異誘発にかけるべきＤＮＡ配列は、好ましくはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列
であることが理解されよう。特定の場合、発現ステップｂ）又はスクリーニング
ステップｃ）の前に、変異ＤＮＡ配列を増幅するのが便利であり得る。このよう
な増幅は、当業界で知られた方法に従って行うことができる。好ましい方法は、
親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるＰＣＲ生成増幅である。変異誘発剤とのインキュベーション又は
それへの露出の後、その変異したＤＮＡは、ＤＮＡ配列を有する好適な宿主細胞
を発現がおこる条件で培養することにより発現される。この目的のために用いる
宿主細胞は、任意にベクター上に存在する、変異ＤＮＡ配列で形質転換されてい
るもの、又は変異誘発処理の間に親酵素をコードするＤＮＡ配列を有するもので
あり得る。好適な宿主細胞の例は、次のもの：グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌ
ｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ；及
びグラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。その変異したＤＮＡ配列は、そ
の変異したＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を更に含む
。

【００５１】局所化ランダム変異誘発ランダム変異誘発は、有利には、問題の親グルコアミラーゼの一部分に局所化
することができる。これは、例えば、酵素の特定の領域がその酵素の所定の特性
のために特に重要である場合、及び改変が改良された特性を有する変異体を生ず
ると予想される場合に有利であり得る。このような領域は、通常、親酵素の３次
構造が解明されて、酵素の機能に関連づけられている場合に同定することができ
る。

【００５２】局所化又は領域特異的ランダム変異誘発は、便利には、上述のＰＣＲ生成変異
誘発技術又は当業界で知られたいずれかの他の好適な技術の使用により行われる
。あるいは、改変すべきＤＮＡ配列の部分をコードするＤＮＡ配列は、例えば好
適なベクターへの挿入により単離することができ、その部分は、後に、先に議論
した変異誘発法のいずれかの使用により変異誘発にかけることができる。

【００５３】グルコアミラーゼ変異体の発現本発明によれば、上述の方法により、又は当業界で知られたいずれかの別の方
法により生産された変異体をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、プロモータ
ー、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意にレプレ
ッサー遺伝子又は種々のアクティベーター遺伝子をコードする調節配列を含む発
現ベクターを用いて、酵素形態で発現させることができる。

【００５４】発現ベクター本発明のグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現
ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順にかけることができるいずれのベクターで
あってもよく、ベクターの選択は、しばしば、導入すべき宿主細胞に依存するで
あろう。そのベクターは、宿主細胞に導入した時に宿主細胞ゲノムに組み込まれ
、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。好適な発現ベ
クターの例にはｐＭＴ８３８がある。

【００５５】プロモーターベクター内で、ＤＮＡ配列は好適なプロモーター配列に作用可能に連結される
べきである。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれの
ＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種のタンパク質をコー
ドする遺伝子から得ることができる。

【００５６】特に細菌宿主において、本発明のグルコアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ
配列の転写を指示するための好適なプロモーターの例は、大腸菌のｌａｃオペロ
ンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガロース遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチル
ス・リケニホルミス（Ｂａｔｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−ア
ミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｔｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニ
ックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリクエフ
ァシエンス（Ｂａｔｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−ア
ミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブチリス（Ｂａｔｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。
真菌宿主における転写のため、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、Ｓ．セレビ
シアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラ
ーゼ）プロモーター（Alber ら（1982), J.Mol.Appl Genet 1, p 419〜434 ）、
リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）アスパラチック
プロティナーゼ、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニゲ
ル酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニゲルグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘ
イ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリザエアルカリプ
ロテアーゼ、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニジェランス
アセトアミダーゼから得られるものである。

【００５７】発現ベクター本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物において
、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に結合した
ポリアデニル化配列も含み得る。ターミネーション及びポリアデニル化配列は、
プロモーターと同じソースから得ることができる。

【００５８】ベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞内で複製するのを可能にするＤＮ
Ａ配列を更に含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣ
ＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製の
起点である。ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞内の欠損を補う遺伝子
、例えばＢ．サブチリスもしくはＢ．リケニホルミスからのｄａｌ遺伝子、又は
抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロランフェニコール又は
テトラサイクリン耐性を与えるものも含み得る。更に、ベクターは、アスペルギ
ルス選択マーカー、例えばａｍｄＳ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ヒグロマイ
シン耐性を生じるマーカーを含み得、又は選択は、例えばＷＯ９１／１７２４
３に記載されるように、同時形質転換により行うことができる。

【００５９】グルコアミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の因子を各々
コードする本発明のＤＮＡ構成物を連結するため、及びそれらを複製のために必
要な情報を含む好適なベクターに挿入するために用いる手順は当業者に公知であ
る（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
Cold Spring Harbor, 1989)。

【００６０】宿主細胞先に定義した本発明のＤＮＡ構成物又は発現ベクターのいずれかを含む本発明
の細胞は、有利には、本発明のグルコアミラーゼ変異体の組換え生産において宿
主細胞として用いられる。その細胞は、便利には（１又は複数のコピーにおける
）ＤＮＡ構成物を宿主染色体に組み込むことにより、その変異体をコードする本
発明のＤＮＡ構成物で形質転換することができる。この組込みは、一般に、その
ＤＮＡ配列が細胞内に安定に維持される傾向が強いので、有利であると考えられ
る。ＤＮＡ構成物の宿主染色体への組込みは、例えば相同的又は非相同的組換え
により、慣用的な方法に従って行うことができる。あるいは、細胞は、異なる型
の宿主細胞と関連して、上述のように発現ベクターで形質転換することができる
。

【００６１】本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であってよいが、
好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は（イーストを含む）真菌細胞である。好適な細菌の例は、グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｌ
ｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，
Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖ
ｉｄａｎｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ、又はグラム陰
性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラス
ト形質転換により、又はそれ自体、知られた様式でコンピテント細胞を用いるこ
とにより行うことができる。

【００６２】イースト生物は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。宿主細胞は、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種に属する株、最も好
ましくは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ、又はＦｕｓａｒｉｕｍの株、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏ
ｘｙｓｐｏｒｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（その完全状
態でＧｒｉｂｂｅｒｅｌｌａｚｅａｅ、以前には、Ｓｐｈａｅｒｉａｚｅａ
ｅ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｒｏｓｅｕｍ及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｒｏｓｅ
ｕｍｆ．ｓｐ．ｃｅｒｅａｌｉｓと同義）、もしくはＦｕｓａｒｉｕｍｓｕ
ｌｐｈｕｒｅｕｍ（その完全状態でＧｉｂｂｅｒｅｌｌａｐｕｒｉｃａｒｉｓ
，Ｆｕｓａｒｉｕｍｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍｓａｍｂｕｃｉｕｍ，Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍｖａｒ．ｇ
ｒａｍｉｎｅａｒｕｍと同義）、Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｅｒｅａｌｉｓ（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍｃｒｏｋｋｗｅｌｌｎｓｅと同義）、もしくはＦｕｓａｒｉｕｍ
ｖｅｎｅｎａｔｕｍの株であってもよい。

【００６３】本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼマイナス株のプ
ロテアーゼ欠損体である。これは、例えば、“ａｌｐ”と呼ぶアルカリプロテアーゼ遺伝子が削除されて
いるプロテアーゼ欠損株アスペルギルス・オリザエＪａＬ１２５であり得る。
この株は、ＷＯ９７／３５９５６（Novo Nordisk）に記載される。

【００６４】糸状菌細胞は、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換、次の
それ自体、知られた様式での細胞壁の再生に関する方法によって形質転換するこ
とができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用はＥＰ２３８０２３
（Novo Nordisk A/S）に記載され、その内容は、引用により本明細書に組み込ま
れる。

【００６５】本発明のグルコアミラーゼ変異体を生産する方法なお更なる態様において、本発明は、本発明のグルコアミラーゼ変異体を生産
する方法であって宿主細胞を変異体の生産に資する条件下で培養しそしてその細
胞及び／又は培養培地から変異体を回収することを含む方法に関する。細胞を培養するのに用いる媒体は、問題の宿主細胞を増殖させ及び本発明のグ
ルコアミラーゼ変異体の発現を得るために適したいずれの慣用的な培地であって
もよい。好適な培地は、商業的供給元から利用でき、又は（例えばＡｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載され
るような）公開された方法に従って調製することができる。

【００６６】宿主細胞から分泌されるグルコアミラーゼ変異体は、便利には、遠心又はろ過
により培地から細胞を分離し、そして硫酸アンモニウムのような塩によりその培
地からタンパク質成分を分離させ、次にイオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー法を用いることを含
む公知の方法により培養培地から回収することができる。

【００６７】デンプン変換本発明は、デンプンからグルコース等を生産するための本発明のグルコース変
異体を用いる方法を供する。一般に、その方法は、α−アミラーゼの存在下で前
駆体デンプンを部分的に加水分解し、そしてα−（１→４）及びα−（１→６）
グルコシド結合を開裂することによりグルコアミラーゼの存在下でデンプン又は
関連するオリゴ−及びポリサッカライド分子の非還元端からＤ−グルコースの遊
離を更に加水分解するステップを含む。

【００６８】 α−アミラーゼを利用する前駆体デンプンの部分的加水分解は、内部α−（１
→４）結合を加水分解することによりデンプン分子の最初の分解を供する。商用
的適用において、α−アミラーゼを用いる最初の加水分解は、約１０５℃の温度
で行われる。極めて高いデンプン濃度、通常、３０％〜４０％の固体が処理され
る。最初の加水分解は、通常、この上昇温度で５分、行われる。部分的に加水分
解したデンプンは、次に、第２のタンクに移し、約１時間、８５°〜９０℃の温
度でインキュベートし、１０〜１５のデキストロース等量（Ｄ．Ｅ．）を得るこ
とができる。

【００６９】グルコアミラーゼの存在下でデンプン又は関連するオリゴ−又はポリサッカラ
イド分子の非還元端からのＤ−グルコースの遊離を更に加水分解するステップは
、通常、３０°〜６０℃で低い温度で別個のタンクで行われる。好ましくは、基
質液の温度は５５°〜６０℃に落とされる。その溶液のpHは６〜６．５から３〜
５．５の範囲に落とされる。好ましくは、その溶液のpHは４〜４．５である。グ
ルコアミラーゼは溶液に添加され、その反応は２４〜７２時間、好ましくは３６
〜４８時間、行われる。

【００７０】本発明の熱安定性グルコアミラーゼ変異体を用いることにより、糖化過程は、
伝統的なバッチ糖化過程より高い温度で行うことができる。本発明によれば、糖
化は６０〜８０℃超、好ましくは６３〜７５℃の範囲の温度で行うことができる
。これは、伝統的なバッチ過程（上述）のため及び連続的糖化過程のための両方
に適用される。

【００７１】実際に、１又は複数の膜分離ステップ、即ちろ過ステップを含む連続的糖化は
、膜上の適度に高い流れを維持し、又は微生物のコンタミネーションを最小にす
ることができるように６０℃超の温度で行わなければならない。それゆえ、本発
明の熱安定性変異体は、適正な値段で及び／又は工業的糖化過程のための少い酵
素タンパク質投与量及び／又は許容できる時間内での大規膜連続糖化過程を行う
可能性を供する。本発明によれば、糖化時間は更に短くすることができる。

【００７２】本発明のグルコアミラーゼ変異体（例えばＡＭＧ変異体）の活性は、一般に、
３０〜６０℃の伝統的に用いられる温度より実質的に高い６０℃〜８０℃の温度
である。それゆえ、グルコアミラーゼが機能する温度を上げることにより、その
糖化過程は、より短い時間で行うことができる。更に、熱安定性を改善することにより、Ｔ_1/2 （“材料及び方法”セクション
に定義される半分時間（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ））が改善される。本発明のグルコ
アミラーゼ変異体の熱安定性は改善されるので、糖化過程の間に不活性化される
グルコアミラーゼを置換するために少量のグルコアミラーゼを加える必要がある
。本発明によれば、より多くのグルコアミラーゼが糖化過程の間、活性に維持さ
れる。更に、微生物コンタミネーションの危険性は、６３℃超の温度で糖化過程
を行う場合にも削減される。

【００７３】本発明のグルコアミラーゼ変異体を用いることができる糖化の例には、ＪＰ
３−２２４４９３；ＪＰ１−１９１６９３；ＪＰ６２−２７２９８７；及び
ＥＰ４５２，２３８に記載される方法がある。本発明のグルコアミラーゼ変異体は、少くとも４つのグルコシル残基を伴う分
子内のα−（１→６）グルコシド結合のみを加水分解する酵素と組み合わせて本
発明の方法に用いることができる。有利には、本発明のグルコアミラーゼは、プ
ルラナーゼ又はイソアミラーゼと組み合わせて用いることができる。枝切りのた
めのイソアミラーゼ及びプルラナーゼの使用、その酵素の分子特性、並びにグル
コアミラーゼを伴うその酵素の潜在的使用は、G.M.A. van Beynum ら、Starch C
onversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101〜142 に記載され
る。

【００７４】更なる態様において、本発明は、デンプン変換過程における本発明のグルコア
ミラーゼ変異体の使用に関する。更に、本発明のグルコアミラーゼ変異体は、連続的糖化ステップを含む連続的
デンプン変換過程に用いることができる。本発明のグルコアミラーゼ変異体は、固定化された形態でも用いることができ
る。これは、特殊シロップ、例えばマルトースシロップを生産するため、及び更
に、フルクトースシロップの生産と合わさったオリゴサッカライドのラフィネー
ト流のために好適にしばしば用いられる。

【００７５】本発明のグルコアミラーゼは、燃料又は飲料のためのエタノールを生産するた
めの方法に用いることもでき、又は有機化合物、例えばクエン酸、アスコルビン
酸、リシン、グルタミン酸を生産するための発酵法に用いることができる。最後に、本発明は、Ｎ末端に伸長部を形成することにより親グルコアミラーゼ
の熱安定性を改良するための方法にも関する。重要な実施形態において、その伸
長部はペプチド伸長部を含む。

【００７６】材料及び方法材料：酵素：ＡＭＧＧ１：Novo Nordiskから利用できるBoelら（1984), EMBO J. 3
(5), 1097〜1102に開示されるアスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼ。ＡＭ
ＧＧ２：Novo Nordiskから利用できる配列番号：１に示すトランケートされた
アスペルギルス・ニゲルグルコアミラーゼＧ１宿主細胞：Ａ．オリザエＪａＬ１２５：マーカーとしてＡ．オリザエｐｙｒＧ遺伝子を
用いる、（G.May,“Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi”(1992
), p.1〜25. Eds.J.R.Kinghorn and G.Turner; Blackie Academic and Professi
onalに記載される）１ステップ遺伝子置換法により削除された（Murakami Kら（
1991), Agric.Biol.Chem. 55, p.2807〜2811に記載される）“ａｌｐ”と呼ぶア
ルカリプロテアーゼ遺伝子を有する、Institute for Fermention, Osaka; 17-25
Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japanから利用できるアスペルギ
ルス・オリザエＩＦＯ４１７７。株ＪａＬ１２５は、ＷＯ９７／３５９５
６（Novo Nordisk）に更に開示される。

【００７７】微生物：株：サッカロマイセス・セレビシアエＹＮＧ３１８：ＭＡＴαＬｅｕ２−Δ２ｕｒａ３−５２ｈｉｓ４−５３９ｐｅｐ４−Δ１［ｃｉｒ＋］プラスミド：ｐＬａＣ１０３：トランケートされたアスペルギルス・ニゲルグルコアミラー
ゼをコードするプラスミド。Ｇ２．ｐＪＳＯ０２６：（Ｓ．セレビシアエ発現プ
ラスミド）（J.S.Okkels, (1996)“A URA3-promoter deletion in a pYES vecto
r increases the expression level of a fungal lipase in Saccharomyces cer
evisiae. Recombinant DNA Biotechnology III”, The Integration of Biologi
cal and Engineering Sciences, vol.782, the Annals of the New York Academ
y of Sciences）。より詳しくは、発現プラスミドｐＪＳＯ２６は、ｐＹＥＳ２
．０の誘導性ＧＡＬ１−プロモーターを、構成的に発現されたＴＰＩ（トリオー
スホスフェートイソメラーゼ）−サッカロマイセス・セレビシアエからのプロモ
ーター（Albert and Karwasaki, (1982), J.Mol.Appl.Genet., 1, 419 〜434 ）
で置換し、そしてＵＲＡ３プロモーターの部分を削除することによりｐＹＥＳ２
．０から得られる。

【００７８】方法：サッカロマイセス・セレビシアエＹＮＧ３１８の形質転換ＤＮＡフラグメント及び開いたベクターを混合し、標準的方法によりイースト
サッカロマイセス・セレビシアエＹＮＧ３１８に形質転換した。ＡＧＵ活性の測定１Ｎｏｖｏアミログルコシダーゼ単位（ＡＧＵ）を、以下の標準条件下で分
当りに１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義した：基質…マルトース温度…２５℃ pH……４．３（酢酸緩衝液）反応時間…３０分分析法（ＡＦ２２）の詳細な記載は要求に応じて利用できる。

【００７９】アスペルギルス・オリザエの形質転換（一般的手順）１００mLのＹＰＤ（Sherman ら、 (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory ）にＡ．オリザエの胞子を接種し、そして２４時間
、振とうしながらインキュベートした。その菌糸体をミラクロスを介してのろ過
により収集し、２００mLの０．６ＭのＭｇＳＯ₄ で洗浄した。その菌糸体を１５
mLの１．２ＭＭｇＳＯ₄ 、１０mM ＮａＨ₂ ＰＯ₄ 、pH５．８中に懸濁した。
その懸濁液を氷上で冷却し、１２０mgのＮｏｖｏｚｙｍ^TM ２３４を含む１mLの
緩衝液を加えた。５分後、１mLの１２mg／mL ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａｔｙｐｅ
Ｈ２５）を加え、顕微鏡下で見たサンプル中に多数のプロトプラストが見えるま
で、静かに撹拌しながらのインキュベーションを３７℃で１．５〜２．５時間、
続けた。

【００８０】その懸濁液をミラクロスを介してろ過し、そのろ液を滅菌チューブに移し５mL
の０．６Ｍソルビトール、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０を重層した。
遠心を１５分、１０００ｇで行い、ＭｇＳＯ₄ クッションの頂上部からプロトプ
ラストを収集した。２容量のＳＴＣ（１．２Ｍソルビトール、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、pH７．５、１０mM ＣａＣｌ₂ ）をそのプロトプラスト懸濁液に加え
、その混合物を５分、１０００ｇで遠心した。そのプロトプラストペレットを３
mLのＳＴＣに再度懸濁し、再びペレット化した。これをくり返した。最後に、プ
ロトプラストを０．２〜１mLのＳＴＣに再度懸濁した。

【００８１】１００μＬのプロトプラスト懸濁液を５〜２５μｇのｐ３ＳＲ２（Hynes ら、
Mol. and Cel.Biol., Vol.3, No.8, 1430 〜1439, Aug. 1983 に記載のＡ．ニジ
ュランスａｍｄＳ遺伝子を有するプラスミド）と、１０μＬのＳＴＣ中で混合し
た。その混合物を２５分、室温に放置した。０．２mLの６０％ＰＥＧ４００
０（ＢＤＨ２９５７６）、１０mM ＣａＣｌ₂ 及び１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、pH７．５を加え、注意深く混合し（２回）、そして最後に０．８５mLの同溶液
を加え、注意深く混合した。その混合物を室温に２５分、放置し、２，５００ｇ
で、１５分、回転させ、そしてそのペレットを２mLの１．２Ｍソルビトールに再
度懸濁した。更に１回の沈降の後、そのプロトプラストを、１．０Ｍスクロース
、pH７．０、窒素源として１０mMアセトアミド及びバックグラウンド増殖を阻害
するための２０mM ＣｓＣｌを含む最小プレート（Cove, (1966), Biochem.Biop
hys.Acta 113, 51〜56）に広げた。３７℃で４〜７日のインキュベーションの後
、胞子を取り、滅菌水に懸濁し、そして単一コロニーについて広げた。この手順
をくり返し、２回目の再単離の後の単一コロニーの胞子を所定の形質転換体とし
て保存した。

【００８２】フェド・バッチ発酵フェド・バッチ発酵を、炭素源としてマルトデキストリン、窒素源として尿素
、及びイーストエキスを含む媒体中で行う。フェド・バッチ発酵は、問題のＡ．
オリザエ宿主細胞の振とうフラスコ培養物を、３．５％の炭素源及び０．５％の
窒素源を含む媒体に接種することにより行う。pH５．０で３４℃での２４時間の
培養の後、更なる炭素及び窒素源の連続的供給を開始する。炭素源は制限因子と
して維持し酸素が過剰に存在することを確実にする。フェド・バッチ培養を４日
間、続け、その後、遠心、限外ろ過、クリアーフィルトレーション及びジャーム
フィルトレーションにより回収することができる。更なる精製は、当業界で知ら
れたアニオン交換クロマトグラフィー法により行うことができる。

【００８３】精製その培養ブロスをろ過し、アンモニウムスルフェート（ＡＭＳ）を１．７Ｍ
ＡＭＳの濃度まで加え、pHをpH５に調節する。沈殿した材料を遠心により除去し
、グルコアミラーゼ活性を含む溶液を、１．７ＭＡＭＳ、２０mM酢酸ナトリウ
ム、pH５で先に平衡化したＴｏｙｏＰｅａｒｌＢｕｔｙｌカラムに適用した
。未結合の材料を平衡化緩衝液で洗い落とした。結合したタンパク質を、１０カ
ラム容量にわたり１．７〜０ＭＡＭＳの直線勾配を用いて１０mM酢酸ナトリウ
ム、pH４．５で溶出した。グルコアミラーゼ含有画分を収集し、２０mM酢酸ナト
リウム、pH４．５に対して透析した。

【００８４】本発明の変異体の熱安定性測定本発明の変異体の熱安定性を次の方法を用いてテストする：９５０マイクロリ
ッターの５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．３）（ＮａＯＡｃ）を５分間、７
０℃でインキュベートする。５０マイクロリッターの緩衝液中の酵素（４AGU ／
mL）を加える。２×４０マイクロリッターのサンプルを０，５，２０及び／又は
４０分の各々で採取し、氷上で冷却する。インキュベーション前に測定した活性
（AGU ／mL）（０分）を標準（１００％）として用いる。その割合（％）の減少
を、インキュベーション時間の関数として計算する。

【００８５】グルコアミラーゼのＴ_1/2 （半減期）Ｔ_1/2 を、問題のグルコアミラーゼ（０．１８〜０．３６AG／g DS）を、問題
の温度（例えば７０℃）でpH４．５で３０％の１０ＤＥマルトデキストリン中で
インキュベートすることにより測定する。サンプルを、設定時間の間隔で回収し
、２４時間、５０℃で更にインキュベートして全ての基質が加水分解されるのを
確実にした。なぜならマルトデキストリンは活性アッセイに影響を与え得るから
である。２４時間の５０℃でのインキュベーションは、酵素活性を有意に減少さ
せないであろう。インキュベーションの後、サンプルを冷却し、残存酵素活性を
（後述の）ｐＮＰＧ法により測定した。

【００８６】残存グルコアミラーゼ活性（％）を異なる時間で測定した。Ｔ_1/2 は、相対活
性が５０％に減少するまでの時間であった。残存酵素活性（ｐＮＰＧ法）ｐＮＰＧ試薬：０．２ｇのｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニルグルコピラノシド）を０．１Ｍ酢酸
緩衝液に溶かし、１００mLにした。

【００８７】ホウ酸溶液：３．８ｇのＮａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ ・１０Ｈ₂ ＯをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、１００
mLにした。ＡＭＧ標準：０．０４AGU ／mLと等価の既知の量の酵素を含む水溶液。

【００８８】サンプルは、分析前に希釈することができた（水で１：１〜１：２）。以下の
溶液を調製した：ＨＳ：０．５mLのサンプル＋１mL ＡＭＧ標準＋３mL ｐＮＰＧ試薬Ｈ：０．５mLサンプル＋１mL水＋３mL ｐＮＰＧ試薬Ｂ：０．５mLサンプル＋１mL ＡＭＧ標準＋３mLホウ酸溶液ＨＳ及びＨを５０℃の水浴に入れる。２時間後３mLのホウ酸溶液を各々のバイ
アルに加えた。Ｂを室温におき、２時間後に３mLのｐＮＰＧ試薬を加えた。全て
の３つの溶液の光学密度を４００nmで測定し、その活性を計算した：活性＝２＊ＡＧＵ_st＊（Ｈ−Ｂ）／（ＨＳ−Ｈ）式中、ＨＳ，Ｈ、及びＢは分析した溶液のＯＤであり、ＡＧＵ_stは用いたＡＭ
Ｇ標準の活性である。

【００８９】ｐＡＭＧＹの濃度ｐＡＭＧＹベクターを以下の通り作製した：ｐＪＳＯ０２６中のリパーゼ遺伝
子をＡＭＧ遺伝子で置きかえ、それをＡＭＧ遺伝子を含むテンプレートプラスミ
ドｐＬＡＣ１０３を用いて正プライマー；ＦＧ２：5′-CAT CCC CAG GAT CCT TA
C TCA GCA ATG-3 ′及び逆プライマー：ＲＧ２：5′-CTC AAA CGA CTC ACC AGC
CTC TAG AGT-3 ′で増幅した。ｐＪＳＯ０２６プラスミドを３７℃で２時間、Ｘ
ｂａＩ及びＳｍａＩで消化し、そのＰＣＲアンプリコンをクレノウフラグメント
を用いて平滑断端にし、次にＸｂａＩで消化した。そのベクターフラグメント及
びＰＣＲアンプリコンを連続し、エレクトロトランスホーメーションにより大腸
菌に形質転換した。得られたベクターをｐＡＭＧＹで示す。

【００９０】発現プラスミドｐＪＳＯ３７はＷＯ９７／０４０７９及びＷＯ９７／０７
２０５に記載される。それは、ｐＹＥＳ２．０の誘導性ＧＡＬ１−プロモーター
を、サッカロマイセス・セレビシアエから構成的に発現されるＴＰＩ（トリオー
スホスフェートイソメラーゼ）−プロモーター（Albert and Karwasaki, (1982)
, J.Mol.Appl Genet., 1, 419 〜434 ）で置換し、そしてＵＲＡ３プロモーター
の部分を削除することにより、ｐＹＥＳ２．０から得られる。

【００９１】ｐＬａＣ１０３の作製Ａ．ニゲルＡＭＧII ｃＤＮＡクローン（Boelら（1984）、前掲）をＡＭＧの
ＧII型のＳ．セレビシアエ発現を目的としたｐＬａＣ１０３の作製のためのソー
スとして用いる。作製は、以下に概説するいくつかのステップで行う。

【００９２】ｐＴ７−２１２（ＥＰ３７８５６／米国特許第５１６２４９８号）をＸｂａ
Ｉで開裂し、クレノウＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰで平滑断端にする。Ｅｃ
ｏＲＩでの開裂の後、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動
から精製し、ｐＢｏｅ１５３の２．０５kb ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメン
トに連結し、それにより得られたプラスミドｐＧ２ｘ内のＡＭＧコーディングフ
ラグメントのＥｃｏＲＶ端にＸｂａＩ部位を再形成する。

【００９３】ＡＭＧｃｄｓの上流のＤＮＡを除去し、そのＡＭＧコーディングＤＮＡに好
適な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を与えるため、以下の構成物を作った：ｐ
５３の９３０bp ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、ＡｌｕＩ開裂に
かけ、得られた７７１bp Ａｌｕ−ＰｓｔＩフラグメントを平滑断端化ＥｃｏＲ
Ｉ部位（上述）と共にｐＢＲ３２２に連結し、そしてＰｓｔＩで開裂した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ−ＡＭＧ′において、ＥｃｏＲＩ部位を、ＡＭＧｃｄｓ
の開始コドンからちょうど３４bpに再形成した。

【００９４】ｐＢＲ−ＡＭＧ′から、７７５bp ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離
し、ｐＴ７−２１２のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩベクターフラグメントを含む連結反
応においてｐＧＺｘからの１１５１bp ＰｓｔＩ−ＸｂａＩフラグメントに連結
した。得られたプラスミドｐＴ７ＧIIを、アルカリホスファターゼの存在下でＢａｍ
ＨＩ開裂にかけ、次にそのホスファターゼの不活性化の後、部分的ＳｐｈＩ開裂
にかけた。この反応から、ＡＭＧII ｃｄｓに連結したＳ．Ｃ．ＴＰＩプロモー
ターを含む２４８９bp ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを得た。

【００９５】このフラグメントを、ｐＴ７ＧIIの１０５２bp ＢａｍＨＩフラグメントと一
緒に、ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ消化から得られるｐＭＴ７４３（ＥＰ３７８５６
／ＵＳ５１６２４９８）のアルカリホスファターゼ処理したベクターフラグメ
ントに連結した。熱安定性グルコアミラーゼ変異体についてのスクリーニングそのライブラリーを、後述の熱安定性フィルターアッセイでスクリーニングす
る。

【００９６】熱安定性についてのフィルターアッセイイーストライブラリーを少くとも７２時間、３０℃で１００μｇ／mLアンピシ
リンを含むＳＣｕｒａ寒天プレート上のセルロースアセテートフィルター（OE
67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）上にプレートする。そのコロニ
ーをニトロセルロースフィルター（Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Das
sel, Germany）にレプリカプレートし、室温で１時間、インキュベートする。コ
ロニーを水道水でＰｒｏｔｒａｎフィルターから洗う。各々のフィルターは、ス
クリーニングの後にフィルター上の陽性変異体を局在化することができるように
、インキュベーション前に針で特異的にマークする。結合した変異体を有するＰ
ｒｏｔｒａｎフィルターを０．１ＭＮａＡｃ、ｐＨ４．５を含む容器に移し、
１５分、５５〜７５℃でインキュベートする。ＳＣｕｒａ−寒天プレート上の
セルロースアセテートフィルターを使用まで室温で保存する。インキュベーショ
ンの後、その残存活性を、５％マルトース、１％アガロース、５０mM ＮａＡｃ
、pH４．５を含むプレート上で検出する。Ｐｒｏｔｒａｎフィルターを伴うアッ
セイプレートを、セルロースアセテートフィルターと同様にマークし、５０℃で
２時間、インキュベートする。Ｐｒｏｔｒａｎフィルターを除去した後、そのア
ッセイプレートをGlucose GOD perid (Boehringer Mannheim GmbH, Germany）で
染色する。残存活性を有する変異体を白色バックグラウンド上の暗緑スポットと
してアッセイプレート上で検出する。改変された変異体は貯蔵プレート上に局在
化する。改変された変異体は、第１のスクリーンと同じ条件下で再スクリーニン
グする。

【００９７】ＤＯＰＥプログラムの使用によるランダム変異誘発のための一般的な方法ランダム変異誘発は、以下のステップを用いて行うことができる：１．親酵素における改変について問題の領域を選択し、２．その選択された領域内の変異部位及び非変異部位を決定し、３．例えば、作製すべき変異体の要求される安定性及び／又は能力に関して、行
うべき変異の種類を決定し、４．構造的に合理的な突然変異を選択し、５．ステップ４に関してステップ３により選択した残基を調節し、６．好適なドープアルゴリズムを利用してヌクレオチド分布を分析し、７．必要に応じて、例えば終止コドンの導入を避けるため、例えば遺伝コードか
ら生ずる束縛を考慮し、要求される残基を遺伝子コード実現性に調節し；ここで
当業者は、いくつかのコドンの組合せは実際には用いることができず、適合させ
る必要があろうことに気づくであろう。８．プライマーを作製し、９．そのプライマーの使用によりランダム変異誘発を行い、１０．要求される改変された特性についてスクリーニングすることにより生じた
グルコアミラーゼ変異体を選択する。

【００９８】ドープアルゴリズムステップ６に用いるための好適なドープアルゴリズムは当業界で公知である。
１つのこのようなアルゴリズムはTomandl, Dら、1997, Journal of Computer-Ai
ded Molecular Design 11: 29 〜38に記載される。別のアルゴリズムはＤＯＰＥ
（Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucle
ic Acids Research 26: 697 〜702 ）である。

【００９９】実施例実施例１Ｎ末端伸長部を有するグルコアミラーゼの作製ランダム変異誘発（ＫｅｘII部位の後で成熟タンパク質の前に１〜７の余分なアミノ酸を挿入し
ている可能性がある）オリゴヌクレオチドＡＭ１１−１８及びプライマーＡＭ１
８を、５′（４２４４：5′-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3 ′）及び３′
端（ＫＢ１４：5′-CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3′）の両方におけるコーディ
ング領域の外側約７５bpの配列に対応する２つのプライマーと一緒に用いて、オ
ーバーラップエクステンション法（Hortonら、Gene, 77 (1989), pp.61〜68）に
よりＰＣＲライブラリーフラグメントを作る。

【０１００】以下のＰＣＲ反応を行った：ＰＣＲ反応１：５′プライマーとして４２４４及び３′プライマーとしてＡＭ１
８。ＰＣＲ反応２：５′プライマーとしてＡＭ１１及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（７の余分なａａ）。ＰＣＲ反応３：５′プライマーとしてＡＭ１２及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（６の余分なａａ）。ＰＣＲ反応４：５′プライマーとしてＡＭ１３及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（５の余分なａａ）。ＰＣＲ反応５：５′プライマーとしてＡＭ１４及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（４の余分なａａ）。ＰＣＲ反応６：５′プライマーとしてＡＭ１５及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（３の余分なａａ）。ＰＣＲ反応７：５′プライマーとしてＡＭ１６及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（２の余分なａａ）。ＰＣＲ反応８：５′プライマーとしてＡＭ１７及び３′プライマーとしてＫＢ１
４（１の余分なａａ）。

【０１０１】第１の反応におけるテンプレート：ｐＡＭＧＹ。反応２〜８におけるテンプレ
ート：ｐＡＭＧＹ又は同ベクター内にクローン化した改変した変異体。ＰＣＲ反
応９〜１５：ＰＣＲ反応２〜８からのいずれかのＤＮＡと一緒にＰＣＲ反応１か
らのＤＮＡを、５′プライマーとして４２４４及び３′プライマーとしてＫＢ１
４を用いるＰＣＲ反応に用いた。これらの最終的なＰＣＲフラグメントは、（コ
ーディング領域を除去し、同時に、各々の端に約７５bpのオーバーラップを作り
出して、組換えを可能にするため）制限酵素ＳｍａＩ（又はＢａｍＨＩ）及びＸ
ｂａＩで切断したｐＪＳＯ０２６と一緒に、イーストにおけるイン・ビボ組換え
に用いた。

【０１０２】ＡＭ１１：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS
GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′（配列番号：２）ＡＭ１２：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS GCG
ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′（配列番号：３）ＡＭ１３：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS GCG ACC
TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′（配列番号：４）ＡＭ１４：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS GCG ACC TTG
GAT TCA TGG TTG AGC-3′（配列番号：５）ＡＭ１５：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS GCG ACC TTG GAT
TCA TGG TTG AGC-3′（配列番号：６）ＡＭ１６：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS GCG ACC TTG GAT TCA
TGG TTG AGC-3′（配列番号：７）ＡＭ１７：5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS GCG ACC TTG GAT TCA TGG
TTG AGC-3′（配列番号：８）ＡＭ１８：5′-GCG CTT GGA AAT CAC ATT TGC-3′（配列番号：９）４２４４：5′-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3′（配列番号：１０）ＫＢ１４：5′-CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3′（配列番号：１１）実施例２ＫｅｘII認識部位を変化させることによるＮ末端伸長部の導入Ｎ末端伸長部は、成熟タンパク質の前のＫｅｘII認識部位を除去又は変化させ
ることにより導入することができる。次に、６アミノ酸の伸長部を６アミノ酸か
らなるプロ配列として導入することができる。イーストにおいて、ＫＲはＫｅｘ
IIのための至適認識部位である。ＲＲへの変化は、開裂した分子の割合（％）を
減少させるであろう（Bevan, A, Brenner, C及びFuller, R.S, 1998, PNAS 95 (
18): 10384〜10389 ）。あるいは、ＫＲの前へのＰの導入は、開裂した分子の割
合（％）を減少させるであろう。

【０１０３】プロ配列をＮＶＩＳＫＲからＮＶＩＳＲＲ又はＮＶＩＰＫＲに変化させ、約５
０％の伸長部ＮＶＩＳＲＲ又はＮＶＩＰＫＲを伴うＡＭＧ分子及び５０％の通常
のプロセッシングされた成熟ＡＭＧ分子を供した。実施例３システイン架橋を含むグルコアミラーゼ（ＡＭＧ２）変異体の作製本発明のグルコアミラーゼ変異体は、次の変異を含む：Ａ４７９Ｃ，Ｔ４８０
Ｃ，Ｐ４８１Ｃ，Ａ４７１Ｃ，Ｓ４３１Ｃ，Ｓ８Ｃ，Ｅ２９９Ｃ又はＤ３７５Ｃ
並びにペプチド伸長部ＡＣＰＰＳＴＳ及びＡＳＰＰＳＴＳ。親グルコアミラーゼ
（ＡＭＧ２）は以下の変異を含む：Ａ４７９Ｃ，Ｔ４８０Ｃ，Ｐ４８１Ｃ，Ａ４
７１Ｃ，Ｓ４３１Ｃ，Ｓ８Ｃ，Ｅ２９９Ｃ又はＤ３７５Ｃを含む。

【０１０４】システイン架橋は以下の通り作製した。部位特異的変異誘発ＡＭＧＧ２酵素の変異体（配列番号：１１）の作製のため、商用キット、Ｃ
ｈａｍｅｌｅｏｎ二本鎖部位特異的変異誘発キットを製造元の説明に従って用い
た。

【０１０５】問題のＡＭＧＧ２酵素をコードする遺伝子は、プラスミドｐＩＶＩ９を、Ｂ
ａｍＨＩ／ＸｈｏＩ（コプリヌスペルオキシダーゼ遺伝子を切り出す）で切断し
、そして、テンプレートとして（Ｇ２ｃＤＮＡを含む）ｐＬａＣ１０３並びに
プライマー１３９１２３（CGCACGAGATCTGCAATGTCGTTCCGATCTCTA ）（配列番号：
１２）及び１３９１２４（CAGCCGGTCGACTCACAGTGACATACCAGAGCG ）（配列番号：
１３）を用いて作ったＰＣＲフラグメント（ＢｇｌII／ＳａｌＩで切断）を含む
ＡＭＧＧ２にクローニングすることにより調製したｐＥＮＩ１５４２上に位置
する。これは、変異体であることをＤＮＡ配列決定により確認した。製造元の説
明に従って、ｐＮＥＩ１５４２のアンピシリン遺伝子のＳｃａＩ部位を以下のプ
ライマーを用いることによりＭｌｕＩ部位に変化させた：７２５８：5′p gaa t
ga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3′（配列番号：１４）（これにより、ア
ンピシリン耐性遺伝子に見い出され、ＭｌｕＩ部位に切断するために用いるＳｃ
ａＩ部位を変化させる）。次に問題のＡＭＧ遺伝子を含むｐＥＮＩ１５４２ベク
ターをＤＮＡポリメラーゼ並びにオリゴ７２８５（配列番号：１４）及び２１４
０１（配列番号：１５）のためのテンプレートとして用いた。プライマーno. ２
１４０１（配列番号：１５）を選択プライマーとして用いた。２１４０１： 5′
p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg
acc tgc gtt ata gcc 3′（配列番号：１５）システイン残基の導入は、以下の通り要求される変異を含む好適なオリゴの付
加により問題のＡＭＧ遺伝子に導入される。

【０１０６】変異誘発オリゴ：ＡＣＰＰＳＴＳ１３７７６７（配列番号：１６）（5′P-GTGATTTCCAGCGGTGCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG 3′）ＡＳＰＰＳＴＳ１３７７６６（配列番号：１７）（5′P-GTGATTTCCAGCGGTCCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG 3′）Ｄ３７５Ｃ１３７７６５（配列番号：１８）（5′P-GTAGCATTGTATGTGCCGTGAAGAC 3′）Ｓ４３１Ｃ１４６８２６（配列番号：１９）（5′P-ACCGTCGTAACTGCGTCGTGCCTGC 3′）Ｅ２９９Ｃ１４６８２８（配列番号：２０）（5′P-GTCTCAGTGACAGCTGCGCTGTTGCGGTG 3′）Ａ４７９Ｃ１４６８２９（配列番号：２１）（5′P-CCACTACGACGTGCACCCCCACTGG 3′）Ｔ４８０Ｃ１４６８３０（配列番号：２２）（5′P-CTACGACGGCTTGCCCCACTGGATCC 3′）Ｐ４８１Ｃ１４６８３１（配列番号：２３）（5′P-CGACGGCTACCTGCACTGGATCCGGC 3′）Ｓ８Ｃ１４６８２７（配列番号：２４）（5′P-TGGATTCATGGTTGTGTAACGAAGCGACC 3′）作った変異体ＡＣＰＰＳＴＳ，Ｄ３７５ＣＡＣＰＰＳＴＳ，Ｓ４３１ＣＡＣＰＰＳＴＳ，Ｅ２９９ＣＡＣＰＰＳＴＳ，Ａ４７９ＣＡＣＰＰＳＴＳ，Ｔ４８０ＣＡＣＰＰＳＴＳ，Ｐ４８１ＣＡＳＰＰＳＴＳＳ８Ｃ＋Ａ４７９ＣＳ８Ｃ＋Ｔ４８０ＣＳ８Ｃ＋Ｐ４８１Ｃ変異体は、全体の遺伝子を配列決定することにより確認する。そのプラスミド
を、“材料及び方法”セクションに上述される方法を用いてＡ．オリザエに形質
転換した。その変異体を“材料及び方法”セクションに上述されるように発酵さ
せ、精製した。

【０１０７】スクリーニングライブラリーは、上述の“材料及び方法”セクションに記載される熱安定性フ
ィルターアッセイにおいてスクリーニングすることができる。実施例４熱安定性が増加したグルコアミラーゼ変異体熱安定性活性を、上述の方法セクションに記載されるように、pH４．５、７０
℃で測定した。

【０１０８】

【表１】

【０１０９】結果は、本発明により、グルコアミラーゼ酵素のＮ末端に伸長部を連結させる
ことにより熱安定性を増加させることができることを示す。実施例５熱安定性が増加したグルコアミラーゼ変異体イーストにおいて発現された改変された変異体の熱安定性活性を、上述の方法
セクションに記載されるように、pH４．５、６８℃で粗サンプル上で測定した。

【０１１０】

【表２】

【０１１１】実施例６熱安定性が増加したグルコアミラーゼ変異体Ａ．ニゲル内で発現された改変された変異体の熱安定性活性を、上述の方法セ
クションに記載されるようにpH４．５、７０℃で粗サンプル上で測定した。

【０１１２】

【表３】

【０１１３】変異体ＡＣＰＰＳＴＳ＋Ｅ２９９ＣのＮ末端分析は、この変異体のＮ末端に遊
離システイン又は酸化システインが存在しないことを示し、このことは、Ｎ末端
のシステインと位置２９９のシステインとの間に−ＳＳ−結合が形成されている
ことを示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 9/34 ４Ｈ０４５ 9/34 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１３Ｋ 1/00 Ｃ１３Ｋ 1/00 (Ｃ１２Ｎ 1/15 //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69）Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/34 (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:69）Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/34 (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ボイセン，キルステンデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ビン，イェスペルデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ペデルセン，ヘンリクデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブＦターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA13 CA06 DA11 EA04 FA20 GA11 GA19 HA01 HA14 4B041 LD08 LE10 LH04 LK44 LP25 4B050 CC04 DD03 FF09 LL02 LL05 4B064 AF02 AF04 AF14 CA22 CB07 CD19 DA10 4B065 AA62X AA62Y AA63Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA41 4H045 AA10 AA30 BA13 BA14 BA41 CA15 DA89 EA01 FA74 GA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｎ末端にペプチド伸長部を有する親グルコアミラーゼの変異
体。
【請求項２】前記ペプチド伸長部がＮ末端に結合している請求項１に記載
の変異体。
【請求項３】前記ペプチド伸長部がシステイン残基を含む請求項１又は２
に記載の変異体。
【請求項４】前記ペプチド伸長部が、一般式：Ｘ−Ｃ−（Ｘ）_n （式中、Ｘは独立して、１つのアミノ酸を示す）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の変異体。
【請求項５】Ｘが非α−ヘリックスメーカーである請求項４に記載の変異
体。
【請求項６】前記ペプチド伸長部が、Ｍ，Ｋ，Ｈ，Ｖ，Ｉ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，
Ｔ，Ｇ，Ｎ，Ｐ，Ｓ又はＤ残基からなる群から選択される非ヘリックスメーカー
を含む請求項５に記載の変異体。
【請求項７】前記ペプチド伸長部の長さが、１〜１００アミノ酸残基、好
ましくは１〜５０アミノ酸残基、より好ましくは１〜２０、更により好ましくは
１〜１０アミノ酸残基を含む請求項１〜５のいずれかに記載の変異体。
【請求項８】前記ペプチド伸長部が、前記親グルコアミラーゼの成熟部分
と共有結合を形成することができる請求項１〜７のいずれかに記載の変異体。
【請求項９】システイン残基が一緒にシステイン架橋を形成するように、
前記ペプチド伸長部に１又は複数のシステイン残基、及び前記親グルコアミラー
ゼの成熟部分にシステイン残基を含む請求項１〜８のいずれかに記載の変異体。
【請求項１０】前記ペプチド伸長部が、前記グルコアミラーゼ酵素のトリ
ペプチジルアミノペプチダーゼ開裂を防ぐことができる請求項１〜９のいずれか
に記載の変異体。
【請求項１１】前記親相同グルコアミラーゼが、微生物からのグルコアミ
ラーゼを含む請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体。
【請求項１２】前記微生物が、真性細菌、古細菌、真菌、藻類及び原生動
物を含む請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】前記親相同グルコアミラーゼが、糸状菌から得られる請求
項１２に記載の変異体。
【請求項１４】前記親相同グルコアミラーゼが、アスペルギルス・ニゲル
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼである
請求項１〜１３のいずれかに記載の変異体。
【請求項１５】前記ペプチド伸長部が、以下のペプチド伸長： Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR), Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR), Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS), Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS), Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE), Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD), Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE), Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE), Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD), Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR), Ile-Ser-Asn (ISN) 、又は Met-Asn (MN) のうちの１つを含む請求項１〜１４のいずれかに記載の変異体。
【請求項１６】前記親グルコアミラーゼの成熟部分内のシステイン残基が
、該親グルコアミラーゼのアミノ酸残基に挿入されているか又は置換されている
請求項３〜１５のいずれかに記載の変異体。
【請求項１７】位置３７５に対応する位置のアスパラギン酸残基、位置２
９９に対応する位置のグルタミン酸残基、位置４３１に対応する位置のセリン残
基、位置４７１に対応する位置のアラニン残基、位置４７９に対応する位置のア
ラニン残基、位置４８０に対応する位置のトレオニン残基、位置４８１に対応す
る位置のプロリン残基、又は位置８に対応する位置のセリン残基が、アスペルギ
ルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｇ１グルコアミラーゼの
アミノ酸配列内でシステイン残基で置換されている請求項１〜１６のいずれかに
記載の変異体。
【請求項１８】前記変異体が親グルコアミラーゼと比べて改良された熱安
定性を有する請求項１〜１７のいずれかに記載の変異体。
【請求項１９】請求項１〜１８のいずれか一に記載のグルコアミラーゼ変
異体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２０】請求項１〜１８のいずれか一に記載のグルコアミラーゼ変
異体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物。
【請求項２１】請求項２０に記載のＤＮＡ構成物を有する組換え発現ベク
ター。
【請求項２２】請求項１１に記載のＤＮＡ構成物又は請求項２１に記載の
ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２３】微生物、例えば細菌又は真菌である請求項２２に記載の細
胞。
【請求項２４】プロテアーゼ欠損アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）である請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】デンプン又は部分的に加水分解したデンプンを、デキスト
ロースを含むシロップに変換するための方法であって、デンプン加水分解物を、
請求項１〜１８のいずれかに記載のグルコアミラーゼ変異体の存在下で糖化する
ステップを含む方法。
【請求項２６】前記グルコアミラーゼ変異体を、燃料又は飲料のためにエ
タノールを生産するための方法に用いる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記グルコアミラーゼ変異体を、飲料を生産するための方
法に用いる請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】前記グルコアミラーゼ変異体を、有機化合物、例えばクエ
ン酸、アスコルビン酸、リシン、グルタミン酸を生産するための発酵法に用いる
請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】Ｎ末端に伸長部を作ることにより親グルコアミラーゼの熱
安定性を改良するための方法。
【請求項３０】前記伸長部がペプチド伸長部を含む請求項２９に記載の方
法。
【請求項３１】前記ペプチド伸長部が、非ヘリックスメーカー、例えばＭ
，Ｋ，Ｈ，Ｖ，Ｉ，Ｙ，Ｃ，Ｆ，Ｔ，Ｇ，Ｎ，Ｐ，Ｓ又はＤ残基を含む請求項３
０に記載の方法。
【請求項３２】前記ペプチド伸長部の長さが、１〜１００アミノ酸残基、
好ましくは１〜５０アミノ酸残基、より好ましくは１〜２０、更により好ましく
は１〜１０アミノ酸残基を含む請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】前記ペプチド伸長部が、前記親グルコアミラーゼの成熟部
分と共有結合を形成することができる請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法
。
【請求項３４】システイン残基が一緒にシステイン架橋を形成するように
、前記ペプチド伸長部にシステイン残基、及び前記親グルコアミラーゼの成熟部
分にシステイン残基を含む請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】前記ペプチド伸長部が、以下のペプチド伸長： Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg (NVISRR), Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg (NVIPKR), Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ASPPSTS), Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser (ACPPSTS), Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu (PCSAGE), Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp (PLALSD), Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu (LGVTGE), Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu (AGPLPSE), Leu-Gly-Pro-Asp (LGPD), Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg (IFELTPR), Ile-Ser-Asn (ISN) 、又は Met-Asn (MN) を含む請求項２９〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】前記親グルコアミラーゼの成熟部分内のシステイン残基が
、該親グルコアミラーゼのアミノ酸残基に挿入されているか又は置換されている
請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】位置３７５に対応する位置のアスパラギン酸残基、位置２
９９に対応する位置のグルタミン酸残基、位置４３１に対応する位置のセリン残
基、位置４７１に対応する位置のアラニン残基、位置４７９に対応する位置のア
ラニン残基、位置４８０に対応する位置のトレオニン残基、位置４８１に対応す
る位置のプロリン残基、又は位置８に対応する位置のセリン残基が、アスペルギ
ルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｇ１グルコアミラーゼの
アミノ酸配列内でシステイン残基で置換されている請求項２９〜３５のいずれか
に記載の方法。
【請求項３８】前記ペプチド伸長部が、前記グルコアミラーゼ酵素のトリ
ペプチジルアミノペプチダーゼ開裂を防ぐことができる請求項２９〜３６のいず
れかに記載の方法。