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JP2002531053A - 核酸のヌクレオチド配列を解析するための方法および試薬 - Google Patents

核酸のヌクレオチド配列を解析するための方法および試薬

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JP2002531053A
JP2002531053A JP2000559258A JP2000559258A JP2002531053A JP 2002531053 A JP2002531053 A JP 2002531053A JP 2000559258 A JP2000559258 A JP 2000559258A JP 2000559258 A JP2000559258 A JP 2000559258A JP 2002531053 A JP2002531053 A JP 2002531053A
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Abstract

(57)【要約】 より感度が高く、より正確であり、標的核酸配列のより高い処理解析力の必要性を満足する方法と試薬が開示されている。本方法と試薬は、概して任意の標的核酸配列に対して一般的に適用してもよく、標的配列中の突然変異の存在、位置、正体について予め情報を要求することはない。本発明の試薬は、高いレベルのカバレージ及び質量数複雑度を有する天然の、及び、質量の変更されたオリゴヌクレオチド前駆体の混合物である。天然の及び質量の変更されたオリゴヌクレオチド前駆体の混合物と、化学的または酵素的分析を用いて質量スペクトル解析、一般的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる解析の前にオリゴヌクレオチド前駆体の質量を変える標的核酸配列を分析するための方法が開示されている。酵素的分析は、ポリメラーゼ伸長分析またはリガーゼ分析でもよい。本発明の方法を実施するための方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、質量分析法によって核酸のヌクレオチド配列を解析するための方法
および試薬に関係しており、特に、高いレベルでの質量数複雑度、及び配列カバ
レージ複雑度(sequence coverage complexity)を有するオリゴヌクレオチド前駆
体の混合物である試薬を用いた、ヌクレオチド配列を解析するための方法に関係
している。
【０００２】
【発明の背景】
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のヌクレオチド配列を決定するということは、遺
伝子の機能や制御、および、たとえば疾患の発見や疾患の管理と遺伝子との関係
を理解する上で極めて重要である。遺伝情報の解析は、生物学実験において決定
的な役割を果している。このことは、疾患に関連した基本的な遺伝的および環境
的要因、および細胞における治療薬の可能性の効果を理解するような研究に関し
て特に真実になっている。このパラダイムシフトによって生命科学産業の中で、
様々な生物資源から得られた遺伝素材を解析するために、さらに感度の優れた、
さらに正確な、さらに高い処理能力を持つ技術に対する必要性が高まってきてい
る。
【０００３】 ヒトの細胞それぞれにおける大量の核酸の配列を決定することは時間のかかる
過程なので、感度と精度を犠牲にしないような、迅速で高い処理能力を持つ解析
が常に差し迫って必要となっている。 核酸の配列を決めるために、とりわけ、
電気泳動、酵素および化学分析、アレイ技術および質量分析法を含む数多くの技
術が開発されている。
【０００４】 （電気泳動技術） 自動ＤＮＡシークエンサーに用いられるようなスラブあるいはキャピラリーポ
リアクリルアミド電気泳動技術は、相対的に長い（５００〜７００残基あるいは
塩基対）のＤＮＡ断片に関する新規の配列情報を高度な精度で提供する。電気泳
動に基づいた技術は、試料当たり大量の情報を提供するが、試料の調製と泳動の
準備に時間がかかり、そのために処理能力が限られている。
【０００５】 （酵素的および化学的解析） 核酸の新規ヌクレオチド配列を決めるために数多くの酵素的および化学的技術
が存在する。しかしながら、各技術はそれぞれ固有の限界性を持っている。たと
えば、Maxam and Gilbert[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5460(1977)]は、化
学的分解法を明らかにし、Sanger et al.[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463
(1977)]は相補鎖のプライマー伸長を利用した鎖終結法を明らかにした。この
ような技術はそれぞれ、４つの別々の反応混合物を用いて、長さについて１つの
ヌクレオチドが異なっているネストされた断片セットを作成し、完全なヌクレオ
チド配列を表す。そのサイズと末端ヌクレオチドに基づいて断片を分解すること
により、断片の順を決め、それによってヌクレオチド配列を決定する。
【０００６】 １本鎖構造多型（single stranded conformation polymorphism; ＳＳＣＰ）
解析は、類似した配列間で相対的に小さな差異を検出するのに役に立つ。その技
術は単純であり、複数の色素による検出あるいは質量タグ方式と組合せれば多様
化できる可能性があり、それによって処理能力が改善される。しかしながら、変
性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、化学切断（ＣＣＭ）、ミスマッチの酵素切断
（cleavaseを利用する）、および変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）
などのような、ヘテロ２本鎖を検出するための技術のように、技術は突然変異が
標的核酸の中にあるのかどうかを示すだけで、突然変異を同定し位置を突きとめ
るには最低の情報しか得られない。
【０００７】 リガーゼおよびポリメラーゼ伸長アッセイを用いるようなその他の技術は、別
に知られている標的核酸配列における限られた位置に突然変異があるのかどうか
を決めるのに役立つ。たとえば、米国特許第４，９８８，６１７号は、標的配列
に従って隣接したもの同志がハイブリッド形成するように設計した２つの天然オ
リゴヌクレオチドの連結を測定することによって別に知られている核酸配列にお
ける限られた位置に突然変異があるかどうかを決定するという方法を開示してい
る。米国特許第５，４９４，８１０号は、天然核酸だけを用い、別に知られてい
る核酸配列の中で、熱安定性リガーゼおよびリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）を用いて
、特定のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および転位を検出する方法を開示して
いる。米国特許第５，４０３，７０９号は、伸長としてのもうひとつのオリゴヌ
クレオチドと、最初の２つを一緒に連結のために支える第三の架橋オリゴヌクレ
オチドとを使用してヌクレオチド配列を決定する方法を開示し、ＷＯ９７／３５
０３３は、ポリメラーゼ伸長アッセイを用いてヌクレオチド３’の定められたプ
ライマーの同一性を決める方法を開示している。アッセイは相対的に高い処理能
力で行われてもよいが、それらは配列特異的なために、解析すべき標的毎に別々
の試薬セットが必要になる。
【０００８】 米国特許第５，５２１，０６５号、第４，８８３，７５０号、および第５，２
４２，７９４号（Whiteley et al.)は、１本鎖核酸断片の混合物における標的配
列の存在あるいは非存在を調べる方法を開示している。この方法には、標的配列
の１番目の領域に相補的な１番目のプローブ、および標的配列の２番目の領域に
相補的な２番目のプローブと１本鎖核酸断片との混合物の反応が関与する。１番
目と２番目の標的領域は互いに隣接している。２つのプローブが関連する標的領
域と安定的にハイブリッド形成できるようなハイブリッド形成条件を用いる。ハ
イブリッド形成に続いて、隣接した１番目および２番目の標的領域とハイブリッ
ド形成した１番目および２番目のうち任意のプローブが連結した後で、予想され
るプローブ連結産物の存在について試料を調べる。
【０００９】 （アレイ技術） 表面に結合したＤＮＡプローブアレイ（array; 配列）に対するハイブリッド
形成を利用する技術は、標的核酸のヌクレオチド配列を解析するのに役立つ。こ
のような技術は、ワトソン−クリックの塩基対法則に従って水素結合を介して２
本鎖を形成するという核酸に固有の能力に頼っている。理論的に、およびある程
度実践的に、表面に結合したＤＮＡプローブアレイに対するハイブリッド形成は
、１回の実験で相対的に大量の情報を提供することができる。たとえば、アレイ
技術によって相対的に長い（１，０００残基あるいは塩基）配列において単一の
ヌクレオチド多型を同定した（Kozal, M., et al., Nature Med. 7:753-759, Ju
ly 1996)。さらにアレイ技術は、ｍＲＮＡ標的配列の複雑な混合物を比較分析す
ることによって、ある種の遺伝子発現の解析にも有用である(Lockart, D., et a
l., (1995) Nat. Biotech 14:1675-1680)。アレイ技術は、標的配列の特異的な
応用や特異的なセットに対して行われた場合、理に適った感度と精度を提供する
けれども、多数の、および／または異なった標的を同時に適用できるという包括
的な実施はできない。これは大部分で、プローブ／標的２本鎖を形成し、次いで
検出することが求められる相対的に長いプローブ配列が要求されるためである。
さらに、プローブ／標的２本鎖における完全に相補的なものと１つのミスマッチ
との間の熱力学的な差異が本質的に小さいために、この相対的に長いプローブを
利用により１つのヌクレオチドの差異を見つけることは困難となる。さらに検出
は、相補的な標的とプローブ配列との間の溶液拡散特性および水素結合に依存し
ている。
【００１０】 （質量分析技術） 質量分析法（ＭＳ）は核酸を含む化合物の複雑な混合物を解析するための強力
なツールである。無処理の質量を正確に決定することに加えて、いくつかの別の
ＭＳ戦略によって１次構造の情報を得ることができる。ＤＮＡ解析にＭＳを用い
ることは、ＤＮＡの修飾の検出、ＤＮＡ断片の質量決定、およびＤＮＡの配列決
定（たとえばFields, G.B., Clinical Chemistry 43:1108(1997)を参照）に対し
て応用できる可能性を持っている。高速原子衝撃質量分析法（Fast atom bombar
dment; ＦＡＢ）およびエレクトロスプレーイオン化（eclectrospray ionizatio
n; ＥＳＩ）衝突−誘導解離／直列ＭＳの両方が、ＤＮＡ修飾部位の同定に応用
されてきた。
【００１１】 ＭＳは核酸を含む関連した化合物の複雑な混合物を解析するのに強力なツール
であるけれども、核酸の配列を解析するためにそれを利用することは、利用でき
るイオン化法と検出方法によって限られたものとなっている。たとえば、ＥＳＩ
分析計は、市販の４極質量分析計の範囲内での電荷に対する質量比を持つような
高く荷電したイオンの分布を作り出す。ＥＳＩは感度が良く、フェムトモル量の
試料で事足りるが、それは、充分なイオン化を達成するような複合電荷に頼り、
単純な核酸に対してさえ、複雑で解釈に苦しむような複合荷電したスペクトルを
生じる。
【００１２】 飛行時間（time of flight; ＴＯＦ）質量分析器に関連して用いられるマトリ
ックス補助レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionizat
ion; ＭＡＬＤＩ）は、相対的に広い質量幅で、高い解像度（質量５，０００で
ｍ／Δｍ≦１．０）および 試料採取速度（１秒当たり１試料まで）を持つために、核酸の配列決定に大きな
可能性を持っている。１つの態様では、ＭＡＬＤＩは大きな質量の生体分子をイ
オン化し、容易に解析するという、ＥＳＩおよびＦＡＢを越えた利点を提供する
。さらに、ＥＳＩに比べて、ＭＡＬＤＩは大部分単独で荷電する種である。
【００１３】 しかしながら一般にＭＡＬＤＩによるＤＮＡ解析では、高い分子量のＤＮＡ断
片の解像不足、ＤＮＡの不安定性、および試料調製試薬による干渉に悩まされる
可能性がある。ＭＡＬＤＩは高い分子量のイオンに対しては大きな動態エネルギ
ーを与えるために、オリゴヌクレオチドが長ければ長いほど、広がった、強度の
弱いシグナルになってしまう。高い分子量の核酸を解析するために用いられる可
能性はあるけれども、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは核酸のバックボーンを切断し、その
結果スペクトルはさらに複雑になってしまう。結果的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
によって現在解析できる核酸配列の長さは、約１００塩基あるいは１００残基に
限られている。Wang et al.（ＷＯ９８／０３６８４）は、「原料の断片化」を
うまく利用しており、核酸検体の配列を決定するために遅延パルスイオン抽出法
とそれを結び付けている。
【００１４】 質量分析法による解析のために、標準配列決定法をうまく利用して標的の断片
を作成する数多くの方法が開示されている。たとえば、米国特許第５，２８８，
６４４号(Beavis ら）、米国特許第５，５４７，８３５号(Koster）、および米
国特許第５，６２２，８２４号(Koster）は、エキソヌクレアーゼ分解あるいはS
angerの標準的な配列決定法のどちらかによって作成されたラダー状の標的のＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて標的核酸の配列を決める方法を開示している。Beavis
は未知の配列を持ったＤＮＡ片を作るためにＤＮＡ断片のいろいろなセットを用
いる異なった塩基特異的反応を利用するＤＮＡ配列決定法を議論している。ＤＮ
Ａ断片のいろいろなセットはそれぞれ、共通の素性を持ち、未知の配列によって
特別の塩基で終結している。いろいろなセットのＤＮＡ断片の分子量をそれぞれ
ＭＡＬＤＩ質量分析計で測定し、次いで、それを用いてＤＮＡ配列を推定する。
【００１５】 Kosterは Sangerの配列決定戦略を利用し、ＭＡＬＤＩあるいはＥＳＩ質量分
析法のような質量分析法を用いていろいろな分子量を介した塩基特異的鎖終結に
よって得られたネストされた断片を分析することによって配列情報を組み立てて
いる。この方法は、鋳型をビオチンで標識し、ストレプトアビジンを塗した磁
気ビーズに結合するという固相配列決定法に結び付けられている。この方法によ
って、２１個のプライマーを用いてｐ５３遺伝子のエクソン５および８の配列を
決定することができた（Fu et al., Nat, Biotechnol 16:381 (1998)。オリゴヌ
クレオチドプライマー、鎖終結ヌクレオチド三リン酸および／または鎖伸長ヌク
レオチド三リン酸において質量変更を導入すること、およびタグ特異的プローブ
と差別化した質量のものをハイブリッド形成することによって多様化できる統合
タグ配列を用いることによって、処理能力を高めることができる（米国特許第５
，５４７，８３５号）。しかしながら、このような方法はすべて、標的配列に関
するある程度の事前知識あるいはプライマー結合部位として作用するための既知
配列の導入が必要であることに気付くのは重要なことである。
【００１６】 少なくとも突然変異の存在、位置、および／あるいは正体に関して先験的に何
らかの情報が判っているような、別に知られている配列において突然変異の存在
、位置および正体を決めるような酵素アッセイと共に質量分析法を利用する試み
が行われてきた。たとえば、米国特許第５，６０５，７９８号は、関心のある既
知領域に隣接した既知の標的分子に相補的なＤＮＡプライマーが質量タグの付い
たジデオキシヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼにより伸長されるよう
な方法を開示している。次いでジデオキシ伸長ＤＮＡの質量を分析することによ
って突然変異の正体を決定してる。多様化法は、ジデオキシヌクレオチドにより
伸長することによって定められた部位において可能性のある突然変異／変異を検
出し、同時にどの特異的ジデオキシヌクレオチドが取り込まれたのかを決定する
ために有用であることが明らかにされている。
【００１７】 核酸の質量分析的解析において前述したような不足している点に取り組む試み
が行われてきた。たとえば、Gut（ＷＯ９６／２８６９１）は、ＭＳ分析にさら
に適しているように核酸のリン酸ジエステルの交換特性を変える方法を開示して
いる。断片化に対して核酸を安定化するような修飾ヌクレオチドを導入する方法
も説明されている(Schneider and Chait, Nucleic Acids Res, 23, 1570(1995),
Tang et al., J Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 218-224, 1997)。
【００１８】 前述した不充分な点のいくつかに取り組むために、切断できない質量タグも利
用されている。たとえば、日本特許第５９−１３１９０９号は、電気泳動、液体
クロマトグラフィおよび高速ゲル濾過によって分画された核酸断片を検出するよ
うな質量分析法の設計を開示し、そこでは、原子が核酸に取り込まれる。通常は
、核酸には存在しないような原子は、イオウ、臭素、ヨウ素、銀、金、プラチナ
および水銀である。
【００１９】 核酸のＭＳ分析と関連した問題をいくつか回避するために、切断できる質量タ
グが利用されてきた。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４１６０(Southern, e
t al.)は、質量分析技術を用いてレポーター基を含んでいる、切断できる質量タ
グの付いたオリゴヌクレオチドと表面にＤＮＡを結合したプロ−プとの間の標的
が介在する連結を用いて標的核酸の配列を解析する間接的方法を開示している。
決定すべき配列をまず、固相支持体に取り付けたオリゴヌクレオチドとハイブリ
ッド形成させる。上述のハイブリッドが付いている固相支持体を、任意の長さの
あらゆる配列を含むライブラリーを形成するコードされたオリゴヌクレオチド試
薬の溶液でインキュベートする。リガーゼを入れて支持体上のオリゴヌクレオチ
ドがオリゴヌクレオチドに隣接する標的とハイブリッドを形成するライブラリー
のメンバーと連結できるようにする。連結しなかった試薬は洗浄によって除く。
オリゴヌクレオチドに連結されたライブラリーのメンバーの一部であるリンカー
が壊れてタグを外す。それを回収して質量分析法によって解析する。
【００２０】 上述の技術に共通している焦点は、標的配列のある部分が判っている単一の決
定法で済ますことができるように標的部位（標的間あるいは標的内のいずれか）
の数を増やす方法を提供することである。この多重化するというテーマは、上述
の特許出願の教示においては直接述べられている、あるいは含蓄されていること
である。ハイブリッド形成のプローブ、あるいは伸長あるいは連結のためのプラ
イマーとして１以上のオリゴヌクレオチドの使用は、関心のある部位を囲んでい
る配列によって定められ、従って特異的な適用である。このように、Southern
によって開示された質量タグ技術の例外と共に、上述したオリゴヌクレオチド試
薬は、標的配列という点で一般的ではなく、それぞれ定められた適用について作
成しなければならない。そういうものとして、多重化して調べるということにお
いて用いられる異なったオリゴヌクレオチドの数は一般に、理論的に配列が完全
なセットの小さなサブセットにすぎない。配列が完全なセットによって提供され
る理論的カバレージ(coverage)に対する特定のオリゴヌクレオチド混合物によっ
て提供される現実の配列カバレージの比率は、混合物カバレージ複雑度(the mix
ture coverage complexity)として定義される（以下の議論参照）。たとえば、
説明されている多くの方法において（すなわち米国特許第５，６０５，７９８、
ＷＯ９２／１５７１２およびＷＯ９７／３５０３３）、プローブの長さは、特異
的な適用および検出方法に依存して８個から２０個のヌクレオチドに変化する。
配列が完全なセットにおけるプローブの数は、式４Lで説明することができ、Ｌ
はプローブの長さに等しい。従って８量体のヌクレオチドプローブは、配列が完
全なセットでは４8あるいは６５，５３６のメンバーを持つことになる。多重化
決定法において調べる部位の数が約５００の場合、それは、上述した型の技術に
関する単一決定法におけるオリゴヌクレオチドプローブ数について理に適った上
限であるが、調べている８量体のヌクレオチドプローブ混合物の混合物カバレー
ジ複雑度(the mixture coverage complexity)（下記の議論参照）は、５００／
６５，５３６あるいは約１／１３０に等しいものとなる。しかしながらほとんど
の場合、プローブは１５〜２０個のヌクレオチドの長さである。この長さが増す
ことは、特定の標的配列に対するプローブの特異性を保証するが、プローブ混合
物の混合物カバレージ複雑度を有意に小さくしてしまう。従って、上述した多重
化した方法や応用の型にとって、調べているオリゴヌクレオチド混合物は標的配
列カバレージに関して配列を完成するようには設計されていないし、従って一般
的な試薬であると考えることはできなかった。
【００２１】 アレイに基づいた多くの配列決定法の目的は、標的核酸配列の中の「短い単語
」の内容、すなわち、存在するすべてのオリゴヌクレオチド配列を決定すること
である。たとえば、表面に結合したＤＮＡプローブアレイに対するハイブリッド
形成を用いた技術では、特定の長さのオリゴヌクレオチドのセットを基質上の空
間的に異なった位置に並べてアレイを形成し、標的配列は、アレイとハイブリッ
ドを形成することができる。（たとえば米国特許第５，２０２，２３１号、米国
特許第５，４９２，８０６号、および米国特許第５，６９５，９４０号を参照）
。配列における短い単語の１つに相補的な短い単語を含む部位に標的配列が結合
する。オリゴヌクレオチドプローブの連続したセットで表面に結合した標的をプ
ローブするための方法はほかにも開示されている（たとえば米国特許第５，２０
２，２３１号、米国特許第５，４９２，８０６号、および米国特許第５，６９５
，９４０号を参照）。蛍光測定などを介してハイブリッド形成の位置を同定する
こと、あるいはプローブであるオリゴヌクレオチドとの同一性を知ることによっ
て、標的核酸配列の正確な短い単語の内容を理論的に決定することができる。こ
の情報は次に標的核酸の配列を再構築するのに用いることができる（たとえば、
Pevzner, P. A., J. Biomolecular Structure Dynamics 7, 63(1989), Pevzner,
P.A., et al., J. Biomolecular Structure Dynamics 9, 399(1991), Ukkonen,
E., Theoretical Computer Science 92, 191(1992)を参照）。しかしながら、
未知の標的における短い単語の内容を一般的に決定するためには、オリゴヌクレ
オチドプローブの配列を相対的に完全にしたセットが必要になることを強調する
のは重要なことである。
【００２２】 標的核酸配列における短い単語の内容を同定するような技術は、新規配列決定
、再配列決定、突然変異の検出および突然変異による変化の検出などのような応
用に有用である。標的配列の長さが増すにつれて、成功率、あるいはそれを用い
て分析を行う可能性のある成功率は減少する。突然変異の検出のようなある種の
応用は、質的な情報のみを必要としているので、その成功率は、新規配列決定の
ように量的な情報を必要とする応用に関する成功率に比べて概して高い。たとえ
ば、２、３の単語の反復の存在は、新規配列決定の成功率を大きく減らすが、突
然変異の検出に関する成功率にはさほど影響しないだろう。その他の応用では、
実質的な事前情報が短い単語の内容を解釈する手助けとして利用でき、従って結
果の成功率が高まる。
【００２３】 本発明の目的は、質量分析法を用いて標的核酸における短い単語の内容を決定
することである。しかしながら、質量スペクトルの中の特定の質量の存在は、可
能性のある多くの核酸の１つが存在することを示すにすぎないので、そのような
解析の成功率は相対的に低いものと予測されている。たとえば、天然のヌクレオ
チドだけを用いて、ＧＧＣＴＴＴＡという配列をＧＣＴＴＴＡＧという配列から
質量によって区別し、２，１４２原子質量単位における質量ピークの存在は、少
なくとも、混合物の中にＴが３つ、Ｇが２つ、Ａが１つおよびＣが１つでできた
核酸配列が１つ存在することを単に示すにすぎない。曖昧さは質量の偶然の一致
によってさらに混乱させられる。たとえば、２，１９３における質量ピークは、
Ａが６個とＴが１個、あるいはＡが１個、Ｃが２個、Ｇが３個とＴが１個を含む
核酸配列からの情報を含んでいる可能性がある。本発明の目的は、標的核酸配列
における短い単語の内容の中でこのような型の曖昧さを減らすことである。
【００２４】 （発明の概要） 本発明は、高解像度質量分析技術によって解析できる短い単語の形状において
標的核酸を再現する試薬と方法に関する。試薬と方法は、一般的なオリゴヌクレ
オチド前駆体混合物（Ｘ量体の前駆体混合物）と酵素過程を利用して、定められ
た混合物の中で標的核酸に相補的なこのようなＸ量体ヌクレオチドの前駆体のみ
の長さを変え、付随的に質量を変えるものである。
【００２５】 本発明の１つの態様は、核酸の質量スペクトルを直接分析するための混合物で
ある。混合物は、天然のもの、および最低３個のヌクレオチドを持つ、質量を変
更したＸ量体ヌクレオチドの前駆体を含む。最小の混合物カバレージ複雑度（Ｃ
ＣM）は、混合物中の異なったＸ量体ヌクレオチドの数で５６を割って得られる
ものである。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体
について個々独立に選択することができる。混合物の質量数複雑度（ＭＮＣ）は
、混合物の任意の天然同等物における質量数複雑度よりも大きい。混合物中のＸ
量体ヌクレオチド前駆体はそれぞれ１つの化学種で表される。
【００２６】 発明のもう１つの態様は、標的核酸配列を解析する方法である。Ｘ量体ヌクレ
オチド前駆体の混合物は、標的核酸配列とハイブリッド形成される。混合物は、
最低３個のヌクレオチドを持つ天然の、および、質量を変更したＸ量体のヌクレ
オチド前駆体を含み、混合物における異なったＸ量体の数で５６を割って得られ
る最小の混合物カバレージ複雑度を有する。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは
、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体について独立に選択することができる。混合物中
のＸ量体ヌクレオチド前駆体は、それぞれ１つの化学種で表される。ハイブリッ
ドは、標的配列が介在する反応においてハイブリッドのＸ量体ヌクレオチド前駆
体の質量を変えるように処理される。質量分析法によって前段階の産物を解析す
る。
【００２７】 本発明のもう１つの態様は、３’末端および５’末端を持つ標的核酸配列を解
析する方法に関する。標的核酸配列は、アレイにおいて多様な核酸プローブとハ
イブリッドを形成する。アレイは表面と、多様な核酸配列プローブを含む。プロ
ーブはそれぞれ、表面に付着した切断できるリンカーおよび３’末端と末端５’
リン酸を持つ核酸配列を含み、核酸の３’末端は、切断できるリンカーに付着し
ている。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の混合物は、標的核酸配列とハイブリッドを
形成される。混合物は、最低３個のヌクレオチドを持つ天然の、および、質量を
変更したＸ量体のヌクレオチド前駆体を持ち、混合物における異なったＸ量体ヌ
クレオチドの数で５６を割って得られる最小の混合物カバレージ複雑度を有する
。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体について独
立に選択することができる。混合物中のＸ量体ヌクレオチド前駆体はそれぞれ１
つの化学種で表される。末端５’リン酸に隣接した位置でハイブリッド形成した
Ｘ量体ヌクレオチド前駆体は、表面に結合したプローブと連結して、それに付着
した標的核酸配列によりハイブリッド形成した前駆体／プローブ複合体を形成す
る。複合体は切断できるリンカーで切断し、質量分析法で解析する。
【００２８】 発明のもう１つの態様は、上述の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述したような混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、および天然の
鎖終結三リン酸からなるグループから選択された多様なヌクレオチドを含んでな
る。
【００２９】 本発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キッ
トは、上述の混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、および質量を変更し
た、鎖終結三リン酸からなるグループから選択された多様なヌクレオチドを含ん
でなる。
【００３０】 本発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キッ
トは、上述の混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、天然鎖終結三リン酸
からなるグループから選択された多様なヌクレオチド、および多様な伸長ヌクレ
オチド三リン酸を含んでなる。
【００３１】 本発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キッ
トは、上述の混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、質量を変更した、鎖
終結三リン酸からなるグループから選択された多様なヌクレオチド、および多様
な伸長ヌクレオチド三リン酸を含んでなる。
【００３２】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、質量を変更した
、鎖終結三リン酸からなるグループから選択された多様なヌクレオチド、多様な
伸長ヌクレオチド三リン酸、およびヌクレアーゼを含んでなる。
【００３３】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、天然の、および
チオリン酸伸長ヌクレオチド三リン酸からなるグループから選択された多様なヌ
クレオチド、および質量を変更した鎖終結三リン酸を含んでなる。
【００３４】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物、ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つ酵素、天然の、および
チオリン酸伸長ヌクレオチド三リン酸からなるグループから選択された多様なヌ
クレオチド、質量を変更した鎖終結三リン酸、および５’エクソヌクレアーゼを
含んでなる。
【００３５】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物およびＤＮＡリガーゼを含んでなる。
【００３６】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物および縮合剤を含んでなる。
【００３７】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物、ＤＮＡリガーゼ、およびアレイとを含んでなり、アレ
イは、表面と、その表面に付着した切断できるリンカーと３’末端と末端５’リ
ン酸を有する多様な核酸配列プローブとを含んでなり、核酸配列の３’末端が切
断できるリンカーに付着されている。
【００３８】 発明のもう１つの実施例は、上の方法を実行するためのキットである。キット
は、上述のような混合物、濃縮剤、およびアレイとを含んでなり、アレイは、表
面とその表面に付着した切断できるリンカーと３’末端と末端５’リン酸を持つ
核酸配列とを有する核酸配列プローブを含み、核酸配列の３’末端が切断できる
リンカーに付着している。
【００３９】 （発明の詳細な説明） （定義） 本明細書および後に続く請求項において、以下の意味を持つよう定義すべき数
多くの用語に参考を添える。
【００４０】 「ポリヌクレオチド」あるいは「核酸」という用語は、ヌクレオチド重合体あ
るいは核酸ポリマーである化合物あるいは組成物のことをいう。ポリヌクレオチ
ドは天然の化合物あるいは合成の化合物でよい。ポリヌクレオチドは、約２０か
ら５，０００，０００以上のヌクレオチドを持つことができる。さらに大きなポ
リヌクレオチドは一般に天然に見られる。単離した状態では、ポリヌクレオチド
は、約３０から５０、０００のヌクレオチドを持ち、通例は約１００から２０，
０００のヌクレオチドを持ち、さらに頻繁には５００から１０，０００のヌクレ
オチドを持つことができる。従って、天然状態からのポリヌクレオチドの単離で
は、断片化が起きることが多いのは明らかなことである。長い標的核酸配列、特
にＲＮＡをハイブリッド形成に先だって断片化することは、競合的な分子内構造
を減らすために有用である。
【００４１】 ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ
とＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、あるいはその
混合物を含むＲＮＡ、遺伝子、染色体、プラスミド、コスミド、および微生物、
たとえば、細菌、酵母、ファージ、染色体、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌
、植物、動物ヒトなどのような生物素材のゲノムを含むＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよ
びｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡを含む精製されたあるいは精製されていない形状の
いかなる素材からの核酸およびその断片も含んでいる。ポリヌクレオチドは、生
物試料のような複合混合物の小さな分画にすぎない。また、鎌形赤血球貧血のヘ
モグロビン遺伝子、のう胞性線維症遺伝子、癌遺伝子、ｃＤＮＡなどのような遺
伝子も含まれる。
【００４２】 ポリヌクレオチドは技術上周知の方法によって様々な生物素材から得ることが
できる。ポリヌクレオチドを、適当な部位で切断して、たとえば、制限エンドヌ
クレアーゼあるいは部位特異的な化学切断法で処理することによって切断して、
標的ヌクレオチド配列を含む断片を得てもよい。
【００４３】 発明の目的のために、ポリヌクレオチドから得たポリヌクレオチドあるいは切
断した断片は、通例少なくとも部分的に変性させるか、１本鎖にするか、あるい
は変性または1本鎖になるように処理をする。そのような処理は技術上周知であ
り、たとえば、熱あるいはアルカリ処理、あるいは1本鎖の酵素的分解が含まれ
る。たとえば、ｄｓＤＮＡを９０℃から１００℃で約１分から１０分の間加熱す
ることにより、変性素材を作成することができる。
【００４４】 核酸は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、非対称ＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（Ｌ
ＣＲ）等のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ複製および／あるいは増幅法によって作成し
てもよい。核酸は1本鎖でも２本鎖でもよい。発明の方法におけるハイブリッド
形成段階においては、オリゴヌクレオチド前駆体に対して競合するような相補鎖
を欠くので、1本鎖核酸が好ましい。
【００４５】 「標的核酸配列」という語句は、通例ポリヌクレオチドの一部あるいは全部の
中に含まれる同定すべき、検出すべき、あるいは解析すべき核酸の配列のことを
いう。本発明においては、標的ヌクレオチド配列の正体は判っていても判ってい
なくてもよい。標的ヌクレオチド配列とハイブリッド形成できるような様々な配
列、およびプローブやプライマーのようなオリゴヌクレオチドの様々な配列、お
よび本発明などによる方法を実施するために必要なそのほかの分子を充分準備で
きるように、標的ヌクレオチド配列の正体はある程度知られている可能性がある
。
【００４６】 標的配列は通例、約３０から５，０００以上のヌクレオチドを含んでおり、好
ましくは５０から１、０００のヌクレオチドを含んでいる。標的ヌクレオチド配
列は一般に大きな分子の分画であり、あるいは実質的には上述したようなポリヌ
クレオチド全体の分子であってもよい。標的ヌクレオチド配列におけるヌクレオ
チドの最低数は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在が、試料中にポリヌクレ
オチドが存在していることの特異的な指標となるように選択する。標的ヌクレオ
チド配列におけるヌクレオチドの最大数は、通例いくつかの要因によって左右さ
れる。すなわち、それが由来するポリヌクレオチドの長さ、切断あるいは単離中
のその他の過程におけるそのようなポリヌクレオチドの壊れ易さ、解析のための
試料調製に必要な処理効率（たとえば、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡへの転写）、およ
び適当なところでの標的ヌクレオチド配列の同定、検出、増幅、および／あるい
はそのほかの解析における効率などである。
【００４７】 「オリゴヌクレオチド」という用語はポリヌクレオチドのことを言い、通例は
１本鎖で合成ポリヌクレオチドであるが、天然に存在するポリヌクレオチドでも
よい。オリゴヌクレオチドの長さは一般に、たとえば、プローブ、プライマー、
Ｘ量体ヌクレオチドなどのような、その特別な役割によって左右される。オリゴ
ヌクレオチドの調製には様々な技術を用いることができる。そのようなオリゴヌ
クレオチドは生物合成あるいは化学合成によって得ることができる。短いオリゴ
ヌクレオチド（約１００個のヌクレオチドまで）については、化学合成の方が生
物合成よりも経済的なことが多い。経済性に加えて化学合成によって、特別な合
成段階において低分子量化合物および／または修飾した塩基を取りこむような都
合の良い方法が提供される。さらに、化学合成は、標的ポリヌクレオチド結合配
列の長さや領域の選択において極めて柔軟性が高い。オリゴヌクレオチドは、市
販の自動核酸シンセサイザーにおいて用いられるような標準的な方法によって合
成することができる。適当に修飾したガラスや樹脂上でＤＮＡを化学的に合成す
ると表面に共有結合したＤＮＡを得ることができる。このことは洗浄や試料の煮
沸に利点を与えている。オリゴヌクレオチド合成の方法には、ホスホルアミデー
ト技術(Caruthers, M. H., et al., "Methods in Enzymology" Vol. 154, pp287
-314(1988))と同様に リン酸三エステルおよびリン酸ジエステル法(Narang, et
al.,(1979) Meth. Enzymol. 68:90)、および支持体上での合成（Beaucage, et a
l., (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1862)、および "Synthesis and Appl
ication of DAN and RNA" S. A. Narang, editor, Academic Press, New York,
1987に記載されているその他に含まれ、これらの文献は、参照することにより本
明細書野市部とする。ガラス表面に結合したオリゴヌクレオチドの、空間的に取
り扱い可能なアレイを光触刻法を介して化学的に合成する方法はA. C. Pease et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5022-5026に記載されている。
【００４８】 「Ｘ量体ヌクレオチド」という用語は、定められた長さ、通例は少なくとも３
個のヌクレオチド、好ましくは４から１４個のヌクレオチドおよび通例は５から
７個のヌクレオチドの長さを持つオリゴヌクレオチドのことをいう。
【００４９】 「Ｘ量体ヌクレオチド前駆体」という語句は、標的核酸配列の一部に相補的な
核酸配列についていう「オリゴヌクレオチド前駆体」のことである。オリゴヌク
レオチド前駆体は、リン架橋（たとえば、リン酸ジエステル、アルキルおよびア
リルリン酸、ホスホロチオネート、リン酸三エステル）あるいは非リン架橋（た
とえばペプチド、スルファミン酸その他）により結合したヌクレオシドモノマー
の配列である。それらは、環状、鎖状、あるいは直鎖状の１本鎖ＤＮＡおよび１
本鎖ＲＮＡの天然あるいは合成分子で、任意選択的に、２次構造を安定化するよ
うなドメイン（たとえば幹とループ、およびループ−幹−ループ構造）を含めて
もよい。オリゴヌクレオチド前駆体は３’末端と５’末端を含んでいる。この語
句はωによって表される。
【００５０】 「混合物」という用語は、２つ以上の物質の物理的な混合物のことをいう。こ
の用語はΩによって表される。
【００５１】 「オリゴヌクレオチドプローブ」という語句は、別のオリゴヌクレオチドある
いは標的ヌクレオチド配列のようなポリヌクレオチドの一部に結合するために用
いられるオリゴヌクレオチドのことをいう。オリゴヌクレオチドプローブの設計
と作成は一般に、それらが結合する配列に依存している。
【００５２】 「オリゴヌクレオチドプライマー」という語句は、通例たとえば核酸の増幅に
おけるような、ポリヌクレオチド鋳型の鎖伸長に用いられるオリゴヌクレオチド
のことをいう。オリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端に標的ポリヌクレオ
チドの定められた配列とハイブリッド形成できるような配列を含んだ、通例は１
本鎖の合成ヌクレオチドである。通例、オリゴヌクレオチドプライマーは、定め
られた配列あるいはプライマー結合部位に対して、少なくとも８０％、好ましく
は９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相補性を持って
いる。オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリッド形成できる配列のヌクレオ
チド数については、オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリッド形成させる厳
密性の条件が、過度のランダムな非特異的ハイブリッド形成を防ぐようにすべき
である。通例、オリゴヌクレオチドプライマーにおけるヌクレオチドの数は、少
なくとも標的ポリヌクレオチドの定められたヌクレオチドと同数で、すなわち少
なくとも１０個のヌクレオチドであり、好ましくは１５個のヌクレオチド、一般
的には、１０から２００個、好ましくは２０から５０個のヌクレオチドである。
【００５３】 「ヌクレオシド三リン酸」という語句は、５’−三リン酸置換基を持っている
ヌクレオシドのことをいう。ヌクレオシドは、通例デオキシリボースあるいはリ
ボースである五炭糖の１’炭素原子にプリンあるいはピリミジン誘導体の窒素を
含む塩基が共有結合した、五炭糖誘導体である。プリン塩基には、アデニン（Ａ
）、グアニン（Ｇ）、イノシン（Ｉ）およびその誘導体と類縁体が含まれる。ピ
リミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびその
誘導体と類縁体が含まれる。ヌクレオシド三リン酸には、４つの一般的なデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの
ようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および４つの一般的な三リン酸、ｒ
ＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびｒＴＴＰのようなリボヌクレオシド三リン酸
が含まれる。「ヌクレオシド三リン酸」という用語にはまた、それらの誘導体お
よび類縁体も含まれ、誘導体にはなっていないヌクレオシド三リン酸と同様の様
式で認識され、重合化される誘導体がその例となる。
【００５４】 「ヌクレオチド」あるいは「ヌクレオチド塩基」あるいは「塩基」という用語
は、核酸ポリマー、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡの単量体である、塩基−糖−リ
ン酸の組合せのことをいう。ここで用いられる用語は、以下に定義されるような
修飾されたヌクレオチドを含んでいる。一般に、その用語は、５’位でリン酸化
され、β−グリコシルＣ１’−Ｎ結合を介して糖のＣ−１’位でプリン塩基ある
いはピリミジン塩基のどちらかを持っている環状フラノース配糖体型の糖（ＲＮ
Ａにおけるβ−Ｄ−リボースおよびＤＮＡにおけるβ−Ｄ−２’デオキシリボー
ス）を含む化合物のいかなるものも指している。このような用語は、交換可能で
あり、ｂによって表される。ヌクレオチドは、とりわけ、修飾された塩基（たと
えばメチルシトシン）および修飾された糖（たとえば、２’−Ｏ−メチルリボシ
ル、２’−Ｏ−メチルエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノ
リボシルなど）で修飾したヌクレオシドを持つヌクレオチドを含む質量を変更し
たヌクレオチドを含み、天然のものでも合成されたものでもよい。
【００５５】 「ＤＮＡ」という用語はデオキシリボ核酸のことをいう。
【００５６】 「ＲＮＡ」という用語はリボ核酸のことをいう。
【００５７】 「天然のヌクレオチド」という用語は、デオキシシチジル酸（ｐｄＣ）、デオ
キシアデニル酸（ｐｄＡ）、デオキシグアニル酸（ｐｄＧ）、およびデオキシチ
ミジル酸（ｐｄＴ）を含むように定められている細胞性ＤＮＡの基本構造を形成
するような、およびデオキシシチジル酸（ｐｄＣ）、デオキシアデニル酸（ｐｄ
Ａ）、デオキシグアニル酸（ｐｄＧ）、およびデオキシウリジル酸（ｐｄＵ）を
含むように定められている細胞性ＲＮＡの基本構造を形成するような、ヌクレオ
チドのことをいう。ｐｄＵはｐｄＴの天然の同等物であると見なされている。
【００５８】 「天然のヌクレオチド塩基」という用語は、細胞性ＤＮＡおよびＲＮＡの中に
見られるプリンおよびピリミジン型塩基のことをいい、細胞性ＤＮＡにはシトシ
ン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）が含まれ、細胞
性ＲＮＡには（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）が
含まれる。ＵはＴの天然の同等物であると見なされている。
【００５９】 「修飾されたヌクレオチド」という語句は、修飾された塩基、糖、あるいはリ
ン酸を含む核酸ポリマーにおける単位のことをいう。修飾されたヌクレオチドは
、核酸ポリマーの一部として、あるいは核酸ポリマーに修飾されたヌクレオチド
を取り込む前にヌクレオチドを化学修飾することによって作ることができる。た
とえば、オリゴヌクレオチドの合成について上述した方法を用いてもよい。別の
方法では、修飾したヌクレオシド三リン酸を増幅反応の最中にポリマー鎖に取り
込むことによって修飾したヌクレオチドを作成することができる。修飾したヌク
レオチドの例としては、例示のするためのものであって、限定することを意図す
るものではないが、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化した誘導体や類縁体、
アミン修飾、アルキル化、蛍光標識等が含まれ、またホスホロチオエート、亜リ
ン酸塩、環原子で修飾された誘導体などが含まれる。
【００６０】 「ワトソン−クリック塩基対」という用語は、“Principles of Nucleic Acid
Structure"; Wolfran Saenger, Springer-Verlag, Berlin(1984)で定義されて
いる基準法則を持っている水素結合のドナーとアクセプターの特別なパターンの
水素結合によって２つの塩基が水素結合していることをいう。
【００６１】 ヌクレオチド塩基ｂの「塩基対特異性」という語句は、塩基がワトソン−クリ
ック塩基対を形成するような数多くの天然のヌクレオチド塩基のことをいう。こ
の用語は、Ｓbp（ｂ）で示される。たとえば、４つの天然のヌクレオチドについ
てのＳbp（ｂ）は、以下の通りである；Ｓbp（Ａ）＝１、Ｓbp（Ｇ）＝１、Ｓbp （Ｃ）＝１、およびＳbp（Ｔ）＝１である。
【００６２】 「ヌクレオチドの天然相補物」という語句は、ワトソン−クリック塩基対法則
に従ってヌクレオチドが最も好ましく塩基対を形成できるような天然の塩基のこ
とをいう。ヌクレオチドが複数の天然塩基と同等の親和性で塩基対を組め、ある
いは、別の環境で別の天然塩基対と最良の塩基対を組める場合、ヌクレオチドは
、複数の天然塩基対相補物を持つと考えられる。
【００６３】 「ヌクレオチドの天然同等物」という語句は、ヌクレオチドの天然相補物の天
然相補物のことをいう。ヌクレオチドが複数の天然相補物を持つ場合、それは、
複数の天然同等物を持つと考えられる。
【００６４】 「オリゴヌクレオチド前駆体の天然同等物」という語句は、各ヌクレオチドが
天然のヌクレオチド同等物で置き変えられているオリゴヌクレオチド前駆体のこ
とをいう。１つか複数の元々のヌクレオチドが複数の天然同等物を持つ場合、オ
リゴヌクレオチド前駆体は複数の天然同等物を持つと考えられ、同等物は置換し
うるあらゆる組合せから選択される。語句はＮＥ（ω）で示される。
【００６５】 「ヌクレオシド」という用語は、塩基−糖の組合せ、あるいはリン酸部分を欠
くヌクレオチドである。
【００６６】 「鎖終結ヌクレオシド三リン酸」は、鎖伸長反応においてオリゴヌクレオチド
プライマーに付加することはできるが、鎖伸長を受けることはできないヌクレオ
シド三リン酸のことをいう。例示であって限定を意図するものではないが、４つ
の標準ジデオキシヌクレオチド三リン酸、質量を変更したジデオキシヌクレオチ
ド三リン酸の類縁体、天然のおよび質量を変更したジデオキシヌクレオチド三リ
ン酸のチオ類縁体、アラビノース、３’−アミノ、３’−アジド、３’−フルオ
ロ誘導体などがある。
【００６７】 「ジデオキシヌクレオチド三リン酸」という語句は、４つの基本的な天然ジデ
オキシヌクレオチド三リン酸（ＤＮＡについてはｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄ
ＣＴＰおよびｄｄＴＴＰ、およびＲＮＡについてはｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄ
ｄＣＴＰおよびｄｄＵＴＰ）および質量を変更したジデオキシヌクレオチド三リ
ン酸のことをいい、それらを含んでいる。この用語はｄｄＮＴＰで表される。
【００６８】 「伸長ヌクレオシド三リン酸」という語句は、天然のデオキシヌクレオシド三
リン酸、修飾したデオキシヌクレオチド三リン酸、質量を変更したデオキシヌク
レオシド三リン酸、５’（α）ホスホチオエート、および関係ある部分がここで
参考として取り入れられる米国特許第５，１７１，５３４号および米国特許第５
，５４７，８３５号に開示されているような天然および質量を変更したデオキシ
およびリボヌクレオシド三リン酸などの５’−Ｎ（α−ホスホルアミデート）類
縁体のことをいい、それらを含んでいる。
【００６９】 「ヌクレオチドポリメラーゼ」という語句は、伸長がそれらに相補的であるＤＮ
ＡあるいはＲＮＡの鋳型に沿ってポリヌクレオチドの伸長を形成するための触媒
のことで、通例は酵素である。ヌクレオチドポリメラーゼは鋳型依存性のポリヌ
クレオチドポリメラーゼであり、基本骨格としてヌクレオシド三リン酸を利用し
、ポリヌクレオチドの３’末端を伸長してポリヌクレオチドの鋳型に相補的な配
列を提供する。通例、触媒はＤＮＡポリメラーゼのような酵素であり、たとえば
、原核細胞ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ、ＩＩ、あるいはＩＩＩ）、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow断片
３’−５’エクソ）、逆転写酵素、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、など、
あるいはＴ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼである
。ポリメラーゼ酵素は、細胞、大腸菌のような細菌、植物、動物、ウイルス、高
温細菌などのいかなる素材から得てもよい。
【００７０】 核酸およびポリヌクレオチドの「増幅」は、核酸あるいはポリヌクレオチド分
子の１つか複数のコピーを形成する（指数的増幅）、あるいは核酸あるいはポリ
ヌクレオチドの相補物だけを１つか複数コピーする（線形的増幅）ような方法で
ある。増幅の方法には、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が含まれ、それは、変性
、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングおよびプライマーの伸長という
サイクルの反復に基づいて、好熱性鋳型依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼに
より、プライマーに隣接したポリヌクレオチド検体における望ましい配列のコピ
ーの指数的増加を得るものである。ＤＮＡ鎖で向かい合ってアニーリングする２
つの異なったプライマーを置き、ポリメラーゼが触媒して伸長した一方のプライ
マー産物が他方の鋳型鎖として作用するようにして、オリゴヌクレオチドプライ
マーの５’末端間の距離で限定される長さの別々の２本鎖断片を蓄積させる。そ
のような増幅を実行するための試薬には、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌク
レオチドポリメラーゼ、 たとえばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、
デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴ
Ｐ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のようなヌクレオシド三リン
酸が含まれる。そのほかの増幅方法には、１つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いた１本鎖ポリヌクレオチドの増幅、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、増幅に基
づいた核酸配列法（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ−ベータ−レプリカーゼ法および３ＳＲが
含まれる。
【００７１】 ヌクレオチド配列という文脈のもとで、「ハイブリッド形成（ハイブリッド形
成する）」および「結合する」という用語は、本明細書では互いに交換できるよ
うに用いられる。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリッド形成できる能力
は２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づいており、言い換えるならば、
一致した相補的ヌクレオチド対の分画に基づいている。任意の配列におけるヌク
レオチドがほかの配列に対して相補的であればあるほど、厳密な条件でハイブリ
ッド形成ができ、２つの配列の結合は特異性の高いものになる。厳密性は、温度
を高くし、共溶媒の比率を増し、塩濃度を低くすることなどによって高くするこ
とができる。
【００７２】 「相補的」、「相補物」あるいは「相補的な核酸配列」という用語は、ワトソ
ン−クリック塩基対法則によってもう一方の核酸鎖における塩基配列に関係する
ような核酸鎖のことをいう。一般に、１つの配列がもう一方の配列に逆平行とい
う意味で結合できる場合に２つの配列は相補的であり、そこでは、３’末端はそ
れぞれもう一方の配列の５’末端と結合し、一方の配列のＡ、Ｔ（Ｕ）、Ｇおよ
びＣはもう一方の配列ではそれぞれＴ（Ｕ）、Ａ、ＣおよびＧとして並んでいる
。ＲＮＡ配列では相補的なＧ／ＵあるいはＵ／Ｇ塩基対も含めることができる。
【００７３】 「ハイブリッド」という用語は、相補的なヌクレオチド間で水素結合によて形
成された２本鎖核酸分子のことをいう。「ハイブリッド形成する」という用語は
、相補的なヌクレオチド間で水素結合を介して１本鎖核酸配列が二重らせんセグ
メントを形成する過程のことをいう。
【００７４】 「質量を変更した」という用語は、その化学構造に対する内部的な変化、すな
わち化学的部分の付加、欠失、あるいは置換によって、あるいはその化学構造に
対する外部的な変化、すなわち共有結合による化学的部分（原子あるいは分子）
の付加によってのいずれかで、その質量を変更した核酸配列のことをいう。
【００７５】 「原子の質量数」という語句は、関心のある要素に最も共通な同位元素の核子
数のことをいう。
【００７６】 あらゆる核酸（すなわちヌクレオチド、ヌクレオチド前駆体、オリゴヌクレオ
チド、Ｘ量体ヌクレオチドおよびＸ量体ヌクレオチド産物）に関する報告されて
いる質量は、構成原子で最も豊富な同位元素（すなわちＣ１２、Ｎ１４、Ｏ１６
、Ｐ３１、Ｉ１２７）に対する質量数およびｐＨ７における水溶液中で安定なプ
ロトン化状態を用いて計算する。
【００７７】 「オリゴヌクレオチド前駆体の質量数」という語句は、オリゴヌクレオチド前
駆体を構成する原子の質量数の合計のことをいう。この語句はｚ（ω）で表され
る。
【００７８】 「オリゴヌクレオチド前駆体混合物の質量数ヒストグラム」Ωという語句は、
ｈ（ｚ）で定義される自然数から自然数までの関数ｈのことをいい、そこでは、
ｈ（ｚ）は、ｚ（ω）＝ｚとなるような混合物Ωにおけるオリゴヌクレオチド前
駆体の数である。
【００７９】 「オリゴヌクレオチド混合物の平均曖昧さ」（Ａ（Ω））という語句は、オリ
ゴヌクレオチド前駆体混合物の質量数ヒストグラムの値を二乗したものの合計を
、混合物中のオリゴヌクレオチド前駆体の数で割ったものをいい、数学的には以
下のように表現してもよい。
【００８０】
【数１】
【００８１】 「質量数複雑度」（ＭＮＣ）という語句は、混合物中のオリゴヌクレオチド前
駆体の数を、オリゴヌクレオチド前駆体混合物の平均曖昧さで割ったものをいい
、数学的には以下のように表現してもよい。
【００８２】
【数２】
【００８３】 「オリゴヌクレオチドカバレージ複雑度(oligonucleotide coverage complexi
ty)」ＣＣ0（ω）という語句は、数学的に以下のように表現してもよい。
【００８４】
【数３】
【００８５】 ここで、Ｌは、オリゴヌクレオチド前駆体におけるヌクレオチド塩基の数であ
り、ｂiはオリゴヌクレオチド前駆体のｉ番目のユニットを表している。
【００８６】 「混合物カバレージ複雑度(mixture coverage complexity)」（ＣＣMΩ）とい
う語句は、混合物における各オリゴヌクレオチド前駆体のカバレージ複雑度の合
計をいい、数学的には以下のように表してもよい。
【００８７】
【数４】
【００８８】 「ビニング(binning)」という用語は、混合物を限られたサブセットに分割す
ることをいい、そこでは、混合物中の個々のオリゴヌクレオチドは少なくとも１
つのサブセット混合物に入っている。
【００８９】 「複合体混合物カバレージ複雑度(composite mixture coverage complexity)
」という用語は、ビニングによってできた混合物のセットにおけるカバレージ複
雑度のことをいい、ビニングしていない元々の混合物の混合物カバレージ複雑度
に等しい。
【００９０】 「複合体質量数複雑度」という用語は、ビニングでできた混合物のセットにお
ける質量数複雑度のことをいい、サブセットの混合物における質量数複雑度の合
計に等しい。
【００９１】 「質量スペクトル直接解析」という語句は、標的核酸配列それ自体あるいは標
的核酸配列の相補物のどちらかを解析するような質量スペクトル解析法のことを
いう。標的核酸配列それ自体あるいその相補物は、質量を変更 されて、余分なヌクレオチド塩基を含んでいてもよく、さもなければ、標的核酸
配列それ自体あるいその相補物が実際に質量解析されるという条件で、修飾され
ている。しかしながら、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４１６０で説明されている間接
法のように、標的核酸配列の存在を示す質量タグ部分を解析するような質量スペ
クトル解析は、この語句には含まれていない。
【００９２】 「一般性」あるいは「一般的な」という用語は、方法に適用した場合、特定の
情報を参考にしないで適用される質量スペクトル解析法のことをいう。「位置的
な一般性」という語句は、標的核酸配列における突然変異の存在、位置あるいは
同定に関する事前の情報を必要としないような質量スペクトル解析法のことをい
う。「標的の一般性」という語句は、標的核酸に関する事前の情報を必要としな
い質量スペクトル解析法のことをいう。
【００９３】 「支持体」あるいは「表面」という用語は、多孔性あるいは非多孔性の不溶性
物質のことをいう。表面は、細片、平板、円板、棒状、ビーズを含む粒子などの
数多くの形状のいずれか１つを持つことができる。支持体は、親水性、あるいは
親水性になることができるもので、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナの
ような無機粉末；天然ポリマー素材、特にセルロースでできた素材、および、た
とえば、ろ紙やクロマトグラフィ紙などのような線維を含んだ紙のようなセルロ
ースに由来する素材；ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビ
ニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレー
ト、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン
、ポリメタアクリレート、 ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ
（ブチル酸ビニル）などのような合成ポリマーあるいは天然ポリマーを改変した
もの；それら自体あるいは他のものと組合せたもの；バイオグラス、セラミック
ス、金属などとして利用できるガラスを含んでいる。リポソーム、リン脂質小胞
および細胞などのような天然部品および合成部品も用いることができる。支持体
や表面へのオリゴヌクレオチドの結合は、一般に利用できる文献中で周知の技術
によって行ってもよい。たとえば、A. C. Pease, et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 91:5022-5026(1994)を参照されたい。
【００９４】 「突然変異」という用語は、単一のヌクレオチド多型のような２つのポリヌク
レオチド間でのヌクレオチドにおける変異のことをいう。一般に、変異は個体か
ら個体へと起きる。突然変異は、正常に保たれていた核酸配列のヌクレオチド配
列における１つの変化であり、正常（変化していない）あるいは野生型配列から
分化したものとして突然変異を形成することになる。突然変異は一般に、２つに
、すなわち塩基対の置換およびフレームシフト変異に分けることができる。後者
は１つから数個の塩基対の挿入あるいは欠失という結果になる。１つのヌクレオ
チドの差異は、たとえば鎌形赤血球のように、正常から異常へと表現型を変化さ
せるのに充分である。
【００９５】 （一般的見解） 本発明は、標的核酸配列の解析においてさらに感度の良い、精度の優れた、高
い処理能力への要求を満たすための方法および試薬を提供する。方法および試薬
は、一般的にいかなる標的核酸配列に適用してもよく、標的核酸配列における突
然変異の存在、位置あるいは同定に関する事前の情報を必要としない。
【００９６】 発明の試薬は、核酸の質量スペクトルの直接解析に有用であり、最低長さ３個
のヌクレオチドを持つ天然の、および質量を変更した、Ｘ量体ヌクレオチドの前
駆体を備える混合物である。混合物カバレージ複雑度の最小値（ＣＣM）は、混
合物における異なったＸ量体ヌクレオチドの数で５６を割ったものである。Ｘ量
体ヌクレオチド前駆体の長さは、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体について個々に選
択することができる。混合物中のＸ量体ヌクレオチド前駆体はそれぞれ１つの化
学種によって表される。
【００９７】 本発明の方法と試薬は、標的核酸配列の質量スペクトル分析に存在する曖昧さ
を減らし、標的核酸の配列を解析するために質量分析法を用いるあらゆる適用に
おいて検出力を高める。高いレベルの質量およびカバレージ複雑度を持つ天然の
、および質量を変更したオリゴヌクレオチド前駆体の混合物を用いることによっ
て、この曖昧さの減少を達成する。「ビニング」すなわち、少なくとも２つの反
応混合物中におけるサブセットの反応混合物を用いることによってこの減少をさ
らに改善してもよい。サブセットの混合物において別々に調べた結果を組み合わ
せることもできる。このようにして、標的の全体的なカバレージ複雑度を高いレ
ベルに保ちながら、任意の質量解析においては、Ｘ量体ヌクレオチド産物間で重
なり合う質量の程度を減少させる。
【００９８】 発明の混合物は、その目標が標的核酸の配列情報を決定するという適用のいか
なるものにおいても利用できるという意味で一般的であり、普遍的である。さら
に、標的核酸配列について、たとえば突然変異の存在、位置あるいは正体などの
事前情報を参考にすることなく、混合物を設計してもよい。しかしながら、この
ことは、配列について事前に情報が判っているような標的核酸配列の解析に、本
混合物が有用ではないということを意味しているのではない。さらに標的に関す
る事前情報が、生じてくる質量スペクトルの解析に有用に使えないということを
示すものでもない。
【００９９】 （発明の試薬）オリゴヌクレオチド（Ｘ量体ヌクレオチド）前駆体 発明のオリゴヌクレオチド前駆体（Ｘ量体ヌクレオチド前駆体）試薬は、最低
長さ３個のヌクレオチドを持つ天然の、および質量を変更した、Ｘ量体ヌクレオ
チドの前駆体の混合物であり、前記混合物が少なくとも５６の異なったＸ量体ヌ
クレオチド前駆体を含む場合、混合物カバレージ複雑度は約７／８である。Ｘ量
体ヌクレオチド前駆体の平均長が増すにつれて、本発明の混合物における異なっ
たＸ量体ヌクレオチドの数も増え、混合物カバレージ複雑度は減少する可能性が
ある。混合物カバレージ複雑度の最低限度は、混合物におけるＸ量体ヌクレオチ
ドの数で５６を割ったものに等しい。Ｘ量体ヌクレオチドの長さは、各Ｘ量体ヌ
クレオチドについて個々に選択することができる。
【０１００】 混合物の特別な組成は事例毎に定め、任意の適用において要求されるものに依
存している。混合物の組成は、本明細書で述べられている数式によって定義され
る。混合物カバレージ複雑度は以下のように定義される。
【０１０１】
【数５】
【０１０２】 ここでＣＣoは各オリゴヌクレオチド前駆体のオリゴヌクレオチドカバレージ複
雑度であり、それは以下のように定義される。
【０１０３】
【数６】
【０１０４】 ここで、Ｌは、オリゴヌクレオチド前駆体におけるヌクレオチド塩基の数であり
、Ｓbpは、塩基対の特異性、およびｂiはオリゴヌクレオチド前駆体のｉ番目の
ユニットを表している。
【０１０５】 上述のような仕様を持っている混合物の例としては、限定するものではないが
、例としては、（１）可能な６４種の３量体ヌクレオチドのうち５６種を含む混
合物Ω1（ＣＣM（Ω1）＝７／８）、（２）可能な２５６種の４量体ヌクレオチ
ドのうち１２８種を含む混合物Ω2（ＣＣM（Ω2）＝１／２）、（３）可能な１
，０２４種の５量体ヌクレオチドのうち２５６種を含む混合物Ω3（ＣＣM（Ω3
）＝１／４）、（４）可能な４，０９６種の６量体ヌクレオチドのうち５１２種
を含む混合物Ω4（ＣＣM（Ω4）＝１／８）、（５）可能な４，０９６種の６量
体ヌクレオチドのうち１，０２４種を含む混合物Ω5（ＣＣM（Ω5）＝１／４）
、（６）４８種の５量体ヌクレオチドと５１２種の６量体ヌクレオチドを含む混
合物Ω6（ＣＣM（Ω6）＝１１／６４）、（７）１２８種の５量体ヌクレオチド
と５１２種の６量体ヌクレオチドと１２８種の７量体ヌクレオチドを含む混合物
Ω7（ＣＣM（Ω7）＝３３／１２８）、（８）２５６種の５量体ヌクレオチドと
１，０００種の６量体ヌクレオチドと９６種の７量体ヌクレオチドを含む混合物
Ω8（ＣＣM（Ω8）＝１／２）、がある。
【０１０６】 上の仕様に一致しない混合物の例としては、限定するものではないが、例とし
ては、（１）可能な２５６種の４量体ヌクレオチドのうち６４種を含む混合物Ω 9 （ＣＣM（Ω9）＝１／４＜５６／６４）、（２）可能な１，０２４種の５量体
ヌクレオチドのうち１２８種を含む混合物Ω10（ＣＣM（Ω10）＝１／８＜５６
／１２８）、（３）３８４種の６量体ヌクレオチドと１２８種の７量体ヌクレオ
チドを含む混合物Ω11（ＣＣM（Ω11）＝１３／１２８＜５６／５１２）、（４
）６４種の５量体ヌクレオチドと２５６種の６量体ヌクレオチドと６４種の７量
体ヌクレオチドを含む混合物Ω12（ＣＣM（Ω12）＝３３／２５６＜５６／３８
４）がある。
【０１０７】 さらに、発明の試薬は、混合物の質量数複雑度（ＭＮＣ）が混合物のどのよう
な天然同等物おける質量数複雑度よりも大きいような、天然のおよび質量を変更
したＸ量体ヌクレオチド前駆体の混合物である。質量数複雑度は、混合物中のＸ
量体ヌクレオチド前駆体の数を、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体混合物の平均曖昧さ
で割ったものをいい、数学的には以下のように定義される。
【０１０８】
【数７】
【０１０９】 Ｘ量体ヌクレオチド前駆体混合物の平均曖昧さ（Ａ（Ω））は、Ｘ量体ヌクレ
オチド前駆体混合物の質量数ヒストグラムの値を二乗したものの合計を、混合物
中のＸ量体ヌクレオチド前駆体の数で割ったものをいい、数学的には以下のよう
に表してもよい。
【０１１０】
【数８】
【０１１１】 Ｘ量体ヌクレオチド前駆体混合物の質量数ヒストグラム（ｈ（ｚ））は、ｈ（
ｚ）で定義される自然数から自然数までの関数ｈのことをいい、ここではｈ（ｚ
）は、ｚ（ω）＝ｚについて混合物中のＸ量体ヌクレオチド前駆体の数である。
【０１１２】 混合物のＭＮＣは、混合物に対する天然同等物の質量数複雑度よりも、通例少
なくとも約２倍大きく、さらに通例少なくとも約１０倍大きく、最も好ましくは
少なくとも約５０倍大きい。たとえば、天然の６量体ヌクレオチド、４，０９６
種すべての混合物は５３というＭＮＣを持っている（以下の議論および表１参照
）。順列組合せにより合成された４，０９６種の６量体ヌクレオチドすべてを含
む混合物は３４８というＭＮＣを持つことができ、それは天然同等物の約６．５
倍である。各Ｘ量体ヌクレオチドが個々に合成されたもう１つの混合物は、５５
９というＭＮＣを持つことができ、それは天然同等物の約１０倍である。４，０
９６種の６量体ヌクレオチドがそれぞれ独自の質量を持っているような混合物は
４，０９６というＭＮＣを持ち、天然同等物の約７７倍となる。
【０１１３】 発明の方法において有用なＸ量体ヌクレオチド前駆体は、少なくとも３個のヌ
クレオチド単位の長さを持っている。好ましくは、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体は
少なくとも４個のヌクレオチド単位の長さを持ち、より好ましくは、少なくとも
５個のヌクレオチド単位、最も好ましくは、少なくとも６個のヌクレオチド単位
の長さを持つ。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは混合物中の各Ｘ量体ヌクレオ
チド前駆体について個々に選択される。従って、５、６および７個のヌクレオチ
ドを持つＸ量体ヌクレオチド前駆体の混合物を１つ持つことはありうることであ
る。上の議論から判るように、混合物カバレージ複雑度についての値、および必
要条件は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の数が増えるにつれて減って行く。１つの
混合物の中に１つ以上の長さがある場合、混合物カバレージ複雑度は、個々のオ
リゴヌクレオチドのカバレージ指数の合計によって得られる。従ってこの場合、
混合物カバレージ複雑度に対する各オリゴヌクレオチドの貢献度はその長さに依
存しており、短いオリゴヌクレオチドほど大きく貢献する。長いオリゴヌクレオ
チドを用いると一般性において損失を招き得ることに気付くべきである。一般性
における損失が容認される場合にのみ、混合物カバレージ複雑度は低い値でもよ
い。さらに、試薬はオリゴヌクレオチド前駆体の混合物をセットで備えてもよい
。この場合、混合物の全体としての複雑度が上述に一致している限り、セットに
おけるどのメンバーの混合物カバレージ複雑度も上述よりは低い。
【０１１４】 ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４１６０(Southern)に説明されているオリゴヌクレオ
チドにおけるヌクレオチド配列を表すのに用いられた、はしご状のリポーター産
物のように、多数の似たような化学種によって表されるのとは対照的に、発明の
方法において有用なＸ量体ヌクレオチド前駆体は、それぞれ１つの化学種によっ
て表される可能性がある。従って、ＷＯ９５／０４１６０の混合物におけるオリ
ゴヌクレオチドは、上述のような関心のあるヌクレオチド配列を表す質量のスペ
クトルと関連しているけれども、発明の混合物におけるＸ量体ヌクレオチド前駆
体はそれぞれ、１つの質量を持つことになる。Southern によって開示された質
量タグ法は切断できる質量タグを利用し、そこではタグの付いたオリゴヌクレオ
チドのタグの付いた部分だけ質量分析法で解析されるということを認識するのは
重要である。本明細書における開示で見られるように、これは、標的が介在した
酵素的過程からできたオリゴヌクレオチド産物自体から生じている質量スペクト
ルを頼る本発明とは対照的な立場にいる。さらに、本発明の質量を変更したＸ量
体ヌクレオチドは、どの任意のオリゴヌクレオチド配列も１つの質量を持つよう
に、すなわち１つの化学種を表すように設計されている。これは、Southernによ
って開示された質量タグ法の場合とは異なっている。Southern法における「はし
ご状タグ」の設計のために、混合物中の別個のオリゴヌクレオチド配列はそれぞ
れ質量全体としての「スペクトル」に関係している。
【０１１５】 本発明の方法で役立つために、混合物の中にどのＸ量体ヌクレオチド前駆体が
存在するのかを知っていることが望ましく、それが必要なことが多い。しかしな
がら、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体のレベルを知っていることは必ずしも必要で
はない。前記でこう言いながら、２本鎖の熱安定性の差異を補正するために、混
合物におけるＸ量体ヌクレオチドそれぞれの濃度を制御できるのは有利である。
【０１１６】 １つの好ましい実施例において、前駆体Ｘ量体ヌクレオチドの混合物が天然の
ヌクレオチドおよび質量を変更したヌクレオチドの両方で構成されている。Ｘ量
体ヌクレオチド前駆体の中の質量を変更したヌクレオチドの正体および位置は、
要因の数に依存することになる。これらには、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体混合物
における全体としての望ましい質量複雑度、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の望まし
い熱力学的特性、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の中に質量を変更したヌクレオチド
を融和させる酵素あるいは酵素のセット（すなわちポリメラーゼとリガーゼ）の
能力、およびＸ量体ヌクレオチド前駆体混合物の特別な合成法により負わされた
制約が含まれている。
【０１１７】 内部的変化、すなわち、その化学構造に対する化学的部分の付加、欠失あるい
は置換によって、あるいは外部変化すなわち、その化学構造に対する、共有結合
している化学的部分（原子あるいは分子）の付加によって、Ｘ量体ヌクレオチド
前駆体を質量変化させてもよい。１つのＸ量体ヌクレオチド前駆体は、内部的変
化および化学的部分の両方、１つより多い内部的変化、１つより多い外部変化、
あるいはそれらの組合せのいくつかを持ってもよい。
【０１１８】 適切に内部的な質量の変更を行うには、ヌクレオシド間結合、糖のバックボー
ンあるいはＸ量体ヌクレオチド前駆体の塩基対に少なくとも１つの化学修飾を含
める。内部的に適切な質量変更をされたＸ量体ヌクレオチド前駆体の例には、以
下に限定するものではないが、例としては、２’−デオキシ−５−メチルシチジ
ン、２’−デオキシ−５−フルオロシチジン、２’−デオキシ−５−ヨードシチ
ジン、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、２’−デオキシ−５−ヨードウ
リジン、２’−Ｏ−メチル−５−フルオロウリジン、２’−デオキシ−５−ヨー
ドウリジン、２’−デオキシ−５（１−プロピニル）ウリジン、２’−Ｏ−メチ
ル−５(１−プロピニル）ウリジン、２−チオチミジン、４−チオチミジン、２
’−デオキシ−５（１−プロピニル）シチジン、２’−Ｏ−メチル−５(１−プ
ロピニル）シチジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−デオキシ２，６−ジ
アミノプリン、２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリン、２’−デオキシ−
７−デアザデノシン、２’−デオキシ−６−メチルアデノシン、２’−デオキシ
−８−オキソアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−デオキシ−７−
デアザグアノシン、２’−デオキシ−８−オキソグアノシン、２’−デオキシイ
ノシンなどがある。
【０１１９】 適切に外部的に質量を変更するには、質量タグをしたＸ量体ヌクレオチド前駆
体あるいはジデオキシターミネーターが含まれる。外部的に質量を変更する部分
は、Ｘ量体ヌクレオチドの３’末端、ヌクレオチド塩基（塩基）、リン酸バック
ボーン、ヌクレオシドの２’位（ヌクレオシド）、末端３’位などに付着させて
もよい。外部的にに質量を変更する適切な部分は、たとえば、ハロゲン、アジド
、ニトロ、アルキル、アリル、イオウ、銀、金、プラチナ、水銀、質量成分型、
Ｗ−ＲでＷｈａ連鎖基およびＲは質量変更部分などがある。
【０１２０】 連鎖基Ｗは、ヌクレオチドあるいはヌクレオシドとＲとの間の共有結合に含ま
れ、分子の性質によって変化する。分子に通例存在する、あるいは導入される官
能基は連結(linkage)に用いられる。連結基は、１個から１００個までの原子で
結合から鎖まで変化し、通例は約１から６０個までの原子、好ましくは１から４
０個までの原子、さらに好ましくは１から２０個までの原子であり、通例炭素、
水素、酸素、イオウ、窒素、ハロゲンおよびリンからなるグループからそれぞれ
個々別々に選択される。鎖中の原子は水素以外の原子と置き換えてもよい。一般
則として、特定の連結基の長さは、望ましい基の合成や取りこみに都合の良いよ
うに任意で選択することができる。ジアゾ基とともに芳香基は通例含まれるけれ
ども、連結基は脂肪族でも芳香族でもよい。質量を変更するＲ基は、連結基自体
で構成することができ、あるいは技術上周知の方法によって、別の質量を変更す
る部分を取り付けることもできる。結合されるべき分子と質量を変更する部分と
の間に共有結合を形成する連結基に存在する共通の機能性には、アルキルアミン
、アミジン、チオアミド、エーテル、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、グアニ
ジン、アゾ、チオエーテル、およびカルボン酸塩、スルホン酸塩、およびリン酸
エステル、アミドおよびチオエステルが含まれる。たとえば、アミンとカルボン
酸、あるいはその窒素誘導体あるいはリン酸が連結している場合、アミジンおよ
びリン酸アミドが形成される。メルカプタンと活性化オレフィンが連結している
場合、チオエーテルが形成される。メルカプタンとアルキル化剤が連結している
場合、チオエーテルが形成される。アルデヒドとアミンが還元条件で連結してい
る場合、アルキルアミンが形成される。カルボン酸とリン酸とアルコールが連結
している場合、エーテルが形成される。
【０１２１】 そのほかの適切な質量変更法については、Oligonuleotides and Analogues, A
Practical Approach, F. Eckstein(editor), IRL Press, Oxford(1991)；米国
特許第５，６０５，７９８号および日本特許第５９−１３１９０９に開示されて
いるものを含めて当業者には明らかにされており、参照することによって本明細
書に組み込むものとする。
【０１２２】 発明の主要な目標は、質量分析法の利用できる質量範囲で用いる完全な混合物
あるいは混合物のセットのどちらかを作成することであり、付随する目標は、異
なった塩基対パターンを持つ（配列）オリゴヌクレオチドの間での質量の重なり
合いを減らすことである。本明細書での議論から明らかなように、任意の解析に
おいて求められる情報の量と型は、必要とされるＸ量体ヌクレオチドの型を示し
ている。
【０１２３】 次にＸ量体ヌクレオチド前駆体の混合物を合成する３つの方法を説明する。こ
れは制限することを意図する者でなく、例として挙げるものである。ここで説明
する方法はそれぞれ、必要とされる個々のオリゴヌクレオチドに対する合成制御
の程度によって利点を持っている。３つの方法はすべて技術上周知の標準ホスホ
ラミダイト化学あるいは酵素反応を利用している。質量を変更したヌクレオチド
前駆体混合物の異なった型のものは、定められた型の適用のために合成される可
能性を熟慮している。たとえば、製造するのに容易で、安価な定義された混合物
が、極めて高い処理能力の、低い解像型のアッセイに用いられ得る。製造するの
にさらに高価なさらに複雑な混合物がさらに高い解像型の適用に用意されうる。
【０１２４】 Ｘ量体ヌクレオチド前駆体は、５’から３’および３’から５’の両方の合成
経路を含む、ホスホラミダイト化学を用いる方法を含めた従来の技術によって合
成してもよい。たとえば、６量体のヌクレオチドのすべてを合成するためには４
，０９６回の合成が必要である。自動ロボット運転装置を利用することによって
この過程が円滑となる。この方法によって組成と長さに関しては個々のＸ量体ヌ
クレオチド前駆体の合成を完全に制御することができる。これは、可能な最大Ｍ
ＮＣを持つＸ量体ヌクレオチド混合物を創るためには必要である。個々の合成に
よってＸ量体ヌクレオチドそれぞれのＱＣ分析ができ、最終産物を作る助けとな
る。各Ｘ量体ヌクレオチドの個々の試料を作ることによって組成の解像度を高め
るために作るサブセットの混合物を定めることができる。さらに、そのことによ
って各Ｘ量体ヌクレオチドを混合物の中で特定の濃度にすることができる。この
ことは、各Ｘ量体ヌクレオチド／標的２本鎖で予想される熱安定性の差異を補正
するのに役立つ可能性がある。
【０１２５】 Ｘ量体ヌクレオチド前駆体は、固相支持体ホスホラミダイト化学およびＡ、Ｃ
、ＧおよびＴホスホラミダイトの各型の２５％混合物シリーズを用いて、平行し
て、あるいは単独で合成してもよい。たとえば、合成は、３’−ＣＰＧ−連結５
’−ＤＭＴ−で保護されたＡ、Ｇ、ＣおよびＴのヌクレオシドそれぞれの２５％
混合物から出発して段階的に行われる。全部で４、０９６種の６量体ヌクレオチ
ドの合成については、ホスホラミダイトのＡ、Ｇ、ＣおよびＴ型それぞれの２５
％混合物を含むボトルを５本用意し、５回の縮合反応でそれぞれ用いる。たとえ
ば、最初の縮合反応段階に対するボトルには、２’−Ｏ−メチル−２，６−ジア
ミノプリン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−デオキシ−５−ヨードシチジ
ンおよびチミジンに対応するホスホラミダイトが２５％のモル当量で含まれてい
る。２回目の縮合反応に対するボトルには、２’−デオキシアデノシン、２’−
デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチル−５（１−プロピニル）シ
チジンおよび２’−デオキシ−５−フルオロウリジンに対応するホスホラミダイ
トが２５％のモル当量で含まれている。ほかの型の修飾されたＡ、Ｇ、Ｃおよび
Ｔホスホラミダイトの２５％混合物が残りの３つの縮合段階のために作られてい
る。
【０１２６】 これは、合成という見地からは相対的に単純な方法であるけれども、でき上が
った最終Ｘ量体ヌクレオチド混合物に質量相互依存を強いている。上の例では、
２番目にＡ型ヌクレオチドがある６量体ヌクレオチドでは１，０２４種全部がそ
の位置で２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンを持っている。３番目がＧ
である配列はすべて７−デアザグアノシンを持っていて、以下同様である。従っ
て、この合成計画では、天然の塩基を利用する場合に比べて相対的に全体的な曖
昧さは減少しているけれども、混合物の中でのでき上がった位置的相互依存性は
、最終的なアッセイにおける解像検出力に限界を与えている。これは、表１で示
されているＰＥＡに対して計算したＭＮＣ値から明らかである。順列組合せの６
量体ヌクレオチド混合物のＭＮＣは、天然の６量体ヌクレオチド混合物のそれよ
りも有意に大きい。しかしながら、当然個々に合成しなければならない、個々に
最適化されたセットよりもそれは約２倍低い。しかしながら、Ｘ量体ヌクレオチ
ドの定められたサブセットが別々の合成でそれぞれ作られるように、何回も順列
組合せの合成を行う可能性があることに気付くのは重要なことである。別々の合
成でできた産物を一緒に混合し、完全な混合物を作る。任意の合成混合物の中に
は依然として位置的相互依存性はあるものの、上述の１回だけの順列組合せ混合
物に比べて、全体を合わせた混合物は大きな質量複雑度を持つ可能性がある。
【０１２７】 もう１つの方法では、質量を変更したオリゴヌクレオチドは，最初の方法で説
明したように個々に合成し、次いである種の質量タグ部分で５’末端の化学修飾
を行うことができる。でき上がった天然オリゴヌクレオチド混合物を質量分析法
の利用できる質量範囲に分散させるために、わずかな数の別々の質量タグが必要
なだけである。この方法は、米国特許第５，６０５，７９８号で開示されたもの
に似ており、関連した開示は参照することにより本明細書の一部とする。前述の
特許が似たような合成を説明しているけれども、本発明に述べられているような
質量を特性的な型の分析で質量タグ付したオリゴヌクレオチドの利用については
述べてもいないし、示唆もしていないことに気付くべきである。
【０１２８】 （質量分析的、熱力学的および酵素的特性におけるＸ量体ヌクレオチド修飾
の効果） Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の組成は、アッセイの全体的な特異性および感度に
直接影響を与える。さらに、その設計や合成様式を制御することによって、発明
の方法における利用の助けとなる修飾を取り入れることができる。たとえば、Ｘ
量体ヌクレオチドのリン酸ジエステルバックボーンにおいてヌクレオシド間結合
を修飾してもよい。１つの実施例では、そのような化学修飾によってリン酸ジエ
ステル結合がヌクレアーゼ分解に対して抵抗性になるのが好ましい。適している
修飾には、取り込んでいる非架橋チオリン酸バックボーン、５’−Ｎ−ホスホア
ミダイトヌクレオチド間結合などが含まれる。
【０１２９】 質量の変更は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体と標的核酸検体との間に形成される
ハイブリッドの熱力学的安定性を高め、混合物の中でのハイブリッドの熱力学的
安定性を正常化する可能性がある。たとえば、２，６−ジアミノプリンはアデノ
シンよりもチミジンと安定な塩基対を形成する。さらに、２’−フルオロ−チミ
ジンの取り込みは、Ａ−Ｔ塩基対の安定性を高め、一方５−ブロモシチジンおよ
び５−メチルシチジンの取り込みはＧ−Ｃ塩基対の安定性を高める。
【０１３０】 質量の変更は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体と標的核酸検体との間に形成される
ハイブリッドの熱力学的安定性を低下させ、混合物の中でのハイブリッドの熱力
学的安定性を正常化する可能性がある。Ａ−Ｔ塩基対は、２’−アミノ−ヌクレ
オシドを取り込むことによって不安定化することができる。イノシンは不安定化
したＧ−Ｃ塩基対に対してグアノシンの代わりに用いることができる。Ｎ−４−
エチル−２’−デオキシシチジンの取り込みはＧ−Ｃ塩基対の安定性を低下させ
ることが判っている。後者の取り込みは、その安定性がＡ−ＴおよびＧ−Ｃの量
とは無関係に成り立っているような場合、任意の２本鎖の安定性を正常化するこ
とができる(Nguyen et al., Nucleic Acids Res. 25, 3095(1997))。
【０１３１】 質量分析におけるイオン化過程によるオリゴヌクレオチドの断片化を減らすよ
うな修飾も導入される。たとえば、１つの方法は、Ｎ−グリコシド結合を安定化
し、それでイオン化過程におけるオリゴヌクレオチドの断片化を減らすプリンの
７−デアザ修飾である（たとえば、Schneider and Chait, Nucleic Acids Res.
23, 1570(1995)を参照）。Ｎ−グリコシド結合を安定化することにより断片化を
減らすために、水酸基やフルオロ基のような電子吸引性の官能基によるリボース
環の２’位の修飾が用いられる（たとえば、Tang et al., J. Am. Soc. Mass Sp
ectrom, 8, 218-224,1997を参照）。
【０１３２】 （質量タグ付した鎖終結ヌクレオチド） ＰＥＡの方法のために本発明においてジデオキシヌクレオシド三リン酸のよう
な鎖終結ヌクレオシド三リン酸を用いることは、技術上周知のこととは根本的に
異なっている。質量を変更したＸ量体ヌクレオチド前駆体のうちで生じた伸長産
物の質量をシフトすることによって、標的核酸と多数の質量を変更したＸ量体ヌ
クレオチドとの間のハイブリッド形成を「スコア化」する方法として、本ＰＥＡ
法は鎖終結ヌクレオチドを利用する。この特別な機能によって、混合物中の最軽
量および最重量の質量を変更したＸ量体ヌクレオチド前駆体で定められる質量範
囲よりも鎖終結するヌクレオチドの絶対重量が大きくなるようにする。たとえば
、４つの天然デオキシヌクレオチドで作られたすべて６量体ヌクレオチドで構成
されるＸ量体ヌクレオチド前駆体の質量範囲は、（Ｃ6）について１，６６７原
子質量単位（ａｍｕ）から（Ｃ6）について１，９０７ａｍｕである。これで質
量範囲の差は２４０ａｍｕとなる。天然のジデオキシヌクレオチドの質量は（一
リン酸型から水分子を差し引いたもの）、ｐｄｄＡ、ｐｄｄＧ、ｐｄｄＣおよび
ｐｄｄＴについてそれぞれ、２９６、３１２、２７２および２８７ａｍｕである
。従って、各ジデオキシヌクレオチドの絶対質量は、天然の６量体ヌクレオチド
混合物の質量範囲より大きいので、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体とＸ＋１個ヌクレ
オチド伸長産物の質量を区分するのに充分なのである。しかしながら、たとえば
、質量の変更やいろいろな長さを混合したＸ量体ヌクレオチドの利用によって、
Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の質量範囲が増加した場合、鎖終結ヌクレオチドに質
量タグを付けて、あらゆる伸長産物の質量があらゆるＸ量体ヌクレオチド前駆体
よりも大きくなるようにするのが望ましい。
【０１３３】 本発明における１つの実施例では、質量タグ付したジデオキシヌクレオシド三
リン酸は追加の化学成分を持ってもよい。それによって試料混合物の中に存在す
る伸長されていないＸ量体ヌクレオチド前駆体あるいは望ましくない成分に比べ
て望ましいＸ量体ヌクレオチドのイオン化効率を高める。通例、少なくとも２の
要因によってイオン化効率は高められるが、さらに通例は４の要因、好ましくは
、１０の要因である。従って、たとえば、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体について６
量体ヌクレオチドが用いられた場合、上述の追加成分は、６量体ヌクレオチド前
駆体および７量体ヌクレオチド伸長産物の解析を促進するように作用する。その
ような追加の化学成分の例は、主としてアミンであり、プロトン化部位として作
用し、ＭＡＬＤＩ解析について１つの陽イオン種を支える（Tang et al., 1997
、上記）。固定した陽電荷を持つ第四級アミンを取り入れることも可能である。
Gut et al.によりＷＯ９６／２７６８１で開示されているように、ＮＨＳエステ
ル化学を用いて、この種の化学基を切断できない質量タグに取り込んでもよい。
手短に言えば、トリメチルアンモニウム ヘキシリル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルエステルのような荷電した第四級アンモニウムのコハク酸イミドエステ
ルは、第一級脂肪酸アミノ基を持つヌクレオシド誘導体と反応する。適している
ヌクレオシドは、たとえば、２’−デオキシヌクレオシドの３’−アミノ誘導体
のような知られているターミネーターである。適しているそのほかのヌクレオシ
ドには、Prober et al.,(Science 238, 336(1987))によって記載された蛍光標識
したｄｄＮＴＰを作成するのに用いられたような、5−［３−アミノ−１−プロ
ピニル］−ピリミジンおよび７−デアザ［３−アミノ−１−プロピニル］プリン
誘導体がある。
【０１３４】 （発明の方法） （標的核酸における短い単語による内容説明の作成） 発明は、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｘ量体ヌクレオチド）のセ
ットという形で標的配列を把握し、質量分析法でセットを解析するための方法お
よび試薬に向けられている。オリゴヌクレオチドのセットは、標的の内容を「短
い単語」で表し、標的に関する定められた配列情報を示す。標的を表すオリゴヌ
クレオチドのセットは３つの一般型で示される（図１）。重なり合ったＸ量体ヌ
クレオチドのネストされたセット（図１ａ）は、セットの中においてＸ量体ヌク
レオチドが長い重なり合いを持つことが特徴である。部分的に重なり合ったＸ量
体ヌクレオチドのネストされたセット（図１ｂ）は、Ｘ量体ヌクレオチドの重な
り合いが少なく、重なり合っていないＸ量体ヌクレオチドのセット（図１ｃ）は
重なり合いがない。３つの型のセットでは、任意のセットにおけるＸ量体ヌクレ
オチドの長さは一定である必要はない。一般に、重なり合ったＸ量体ヌクレオチ
ドのネストされたセットにおけるＸ量体ヌクレオチドは、約３から約１８個の長
さで、通例、約５から約１４個のヌクレオチドである。このセットでは標的核酸
配列の全長において１個のヌクレオチドを除くすべてが重なり合っている。一般
に、部分的に重なり合ったＸ量体ヌクレオチドのネストされたセットにおけるＸ
量体ヌクレオチドは、約３から約１８個の長さで、通例、約５から約１４個のヌ
クレオチドである。一般に、重なり合っていないＸ量体ヌクレオチドのネストさ
れたセットにおけるＸ量体ヌクレオチドは、約３から約１８個の長さで、通例、
約４から約１４個のヌクレオチドである。３つの方法すべてについて、Ｘ量体ヌ
クレオチドは、標的ヌクレオチド配列の全長を試料としている。実際に作成され
るＸ量体ヌクレオチドの数は、一般に標的ヌクレオチドの長さおよび望ましい結
果によって決められる。Ｘ量体ヌクレオチドの数は、定められた適用の目標を達
成するのに充分でなければならない。たとえば、目標が突然変異の検出を行うこ
とである場合、Ｘ量体ヌクレオチドあるいは突然変異を含んだＸ量体ヌクレオチ
ドのセットを区別するために充分な数のＸ量体ヌクレオチドが必要である。
【０１３５】 （方法の一般的な説明） 本発明の１つの態様は、標的核酸の配列を解析する方法である。Ｘ量体ヌクレ
オチド前駆体の混合物と標的核酸配列とのハイブリッドを形成させる。混合物は
、最低長さ３個のヌクレオチドを持つ、天然の、および質量を変更されたＸ量体
ヌクレオチド前駆体を含んでなる。前記混合物が少なくとも５６個の異なったＸ
量体ヌクレオチド前駆体を含んでいる場合、混合物は、約７／８という混合物カ
バレージ複雑度を有する。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の平均長が増すにつれて、
本発明の混合物における異なったＸ量体ヌクレオチド前駆体の数も増し、混合物
カバレージ複雑度は低下する可能性がある。混合物カバレージ複雑度の最低限度
は、５６を混合物におけるＸ量体ヌクレオチド前駆体の数で割ったものに等しい
。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは、各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体について独
立に選択することができる。混合物における質量数複雑度（ＭＮＣ）は、天然の
任意の同等混合物よりも大きい。ハイブリッドは、標的配列が介在する反応にお
いてハイブリッドのＸ量体ヌクレオチド前駆体部分の質量を変えるように処理さ
れ、産物は質量分析法によって解析される。最初の２段階は、溶液中で行っても
よく、あるいはアレイのように表面に結合した核酸で行ってもよい。それらは、
標準溶液の質量作用および拡散過程に左右されるために、溶液を基にしたシステ
ムが好ましい。
【０１３６】 （Ｘ量体ヌクレオチド混合物の調製） 発明の方法における最初の段階は、任意の適用に対して適切な質量数およびカ
バレージ複雑度を持っている天然の、および質量を変更したＸ量体ヌクレオチド
前駆体の混合物を調製することである。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の混合物は、
イオン化および熱力学特性に関してここで説明されている性質も持っている。Ｘ
量体ヌクレオチド前駆体の混合物の設計および調製はここで説明されているよう
に行ってもよい。
【０１３７】 （処理段階） 発明の方法における２番目の段階は、ここで説明されているようにハイブリッ
ドのＸ量体ヌクレオチド前駆体部分の質量を変更するようにハイブリッドを処理
することである。この変更は酵素的あるいは化学的反応によって行ってもよい。
適している酵素的技術には、ポリメラーゼ伸長アッセイ、リガーゼアッセイなど
が含まれる。適している化学的技術には、カルボジイミドおよび臭化シアン誘導
体を用いた活性化Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の縮合などが含まれる。以下の議論
は様々な過程の手短な説明である。さらに詳細な議論は下で述べられている。
【０１３８】 （ポリメラーゼ伸長アッセイ） ポリメラーゼ伸長アッセイ（ＰＥＡ）については、ヌクレオチドポリメラーゼ
を用いてハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体の３’末端でヌクレオ
チドを１つ重合することによって、ハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前
駆体を伸長する（図２参照）。ＰＥＡの１つの形式である、ポリメラーゼ伸長お
よび切断アッセイ（ＰＥＡＣＡ）については、ヌクレオチドポリメラーゼを用い
てハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体の３’末端でヌクレオチドを
１つか複数重合することによって、ハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前
駆体をまず伸長し、次いで、５’から３’へのエクソヌクレアーゼ、エンドヌク
レアーゼあるいは行った方法の特異性に依存した化学試薬により産物を分解する
ことによって再び短くする（図３および４参照）。
【０１３９】 （リガーゼ反応） Ｘ量体ヌクレオチド連結アッセイ（ＸＬＡ）については、隣接するハイブリッ
ド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体を解析に先だってリガーゼにより共に連結
する（図５参照）。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体は、リガーゼによる連結に良い基
質として作用するために充分な長さであり、けれども、反応混合物中で相補的な
Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の連結の鋳型として長すぎないのが好ましい。隣接す
るＸ量体ヌクレオチド前駆体をすべて連結することが好ましいが、必要条件では
ないことに気付くべきである。
【０１４０】 連結アッセイは表面に結合したアレイで行ってもよい（図６参照）。アレイは
、表面とそれに取り付けられた多様なオリゴヌクレオチドプローブとを有する。
プローブは、 （ａ）表面に取り付けられた切断リンカーと、 （ｂ）３’末端と末端５’リン酸をもつ核酸配列であって、前記核酸配列の３’
末端は切断リンカーに付着している核酸配列と を含んでなる。 本方法は、 （１）標的核酸配列とプローブとのハイブリッドを形成させるステップと、 （２）Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の混合物を標的核酸配列に加えるステップと、 （３）そこに付着する標的核酸配列と共にハイブリッド形成した前駆体／プロー
ブ複合体を形成するように、５’末端リン酸に隣接しているハイブリッド形成し
たＸ量体ヌクレオチド前駆体と表面に結合したプローブとを連結するステップと
、 （４）切断リンカー部位で複合体を切断するステップと、 （５）質量分析法によって各プローブの特徴あるいはセットの特徴において複合
体を解析するステップと を含む。
【０１４１】 （方法の詳細な説明） 以下の説明は、標的の内容を短い単語で示すオリゴヌクレオチドのセットを作
成するために３つの一般的な方法に向けられている。各方法は、用いる試薬によ
って１つか複数の型のオリゴヌクレオチドセットを作ることができる。この説明
は例示であり、限定を意図するものではない。上述したように、最初の方法を「
ポリメラーゼ伸長アッセイ」（ＰＥＡ）と呼び、２つ目の方法をポリメラーゼ伸
長および切断アッセイ（ＰＥＡＣＡ）と呼び、３つ目の方法を「Ｘ量体ヌクレオ
チド連結アッセイ」（ＸＬＡ）と呼ぶ。
【０１４２】 すべての方法の基本は、天然の、および／または質量を変更したヌクレオチド
で構成されるオリゴヌクレオチド（Ｘ量体ヌクレオチド）混合物である。 様々
な型のセットを作成するために様々なセットの混合物を設計することができ、従
っていろいろな量の標的配列情報を提供できることを理解すべきである。上の方
法で生じた質量スペクトルに存在する質量ピークを解析することによって、各質
量スペクトルに関係のある混合物中のＸ量体ヌクレオチド前駆体に関する情報と
これらのピークを相関させることによって、および標的配列に関する可能性のあ
る事前情報によって、標的から求められていた情報を決定する。
【０１４３】 ＰＥＡは重なり合った、あるいは部分的に重なり合ったＸ量体ヌクレオチドの
ネストされたセットを作成するための一般的な方法である。この方法には３つの
基本段階がある（図２）。第一段階では、可能性のある、あらゆるＸ量体ヌクレ
オチド配列あるいはそのサブセットを表しているＸ量体ヌクレオチドの混合物が
、ワトソン−クリック塩基対法則に従って、標的核酸配列の無作為な部位でハイ
ブリッド形成できるようにする。第二段階では、ＤＮＡ−あるいはＲＮＡ−依存
性ＤＮＡポリメラーゼのようなヌクレオチドポリメラーゼおよびジデオキシヌク
レオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）のような鎖終結ヌクレオシド三リン酸の１つか
複数の混合物を用いて、ハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチドをヌクレオチ
ド１個で伸長する。第三段階では、でき上がった伸長されたＸ量体ヌクレオチド
、すなわちＸ＋１個ヌクレオチドを質量分析法で解析する。
【０１４４】 Ｘ＋１ヌクレオチド産物間の重なり合いの程度は、取り調べているＸ量体ヌク
レオチド混合物の配列の完全性に依存している。たとえば、４，０９６種の６量
体ヌクレオチドすべて、および４種のｄｄＮＴＰすべてが混合物に存在する場合
、でき上がった７量体ヌクレオチド間の最大限の重なり合いが可能である。６量
体ヌクレオチドで可能性のある４，０９６種のサブセットおよび／または４種の
ｄｄＮＴＰのサブセットしかない場合、７量体ヌクレオチド間の重なり合いは少
なくなり、配列カバレージに隙間ができる可能性がある。
【０１４５】 鎖終結ヌクレオチドはＸ量体ヌクレオチド前駆体混合物とＸ＋１個ヌクレオチ
ド伸長産物を効果的に区分できるように充分な質量を持つことが重要である。ハ
イブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体がすべて伸長されるのが好ましい
が、それが必要条件ではないことに気付くべきである。本発明では、ハイブリッ
ド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体で伸長されたものの数が多ければ多いほど
、測定の精度は高くなる。
【０１４６】 Ｘ量体ヌクレオチドが標的核酸とハイブリッドを形成し、ハイブリッド形成し
たＸ量体ヌクレオチドに隣接する標的のヌクレオチドに相補的な１個のヌクレオ
チドによって鎖終結ヌクレオシド三リン酸の存在下で伸長されるという条件に、
試薬の組合せは制約される。一般に、水性媒体が用いられる。そのほかのイオン
化できる共溶媒を用いてもよい。通例、１〜６個の、さらに通例では１〜４個の
炭素原子の、アルコール、エーテルなどを含む酸化された有機溶媒を用いてもよ
い。通例このような共溶媒は、用いる場合、約７０重量パーセントよりも少なく
し、さらに通例では約３０重量パーセントより少なくする。
【０１４７】 媒体のｐＨは通例約４．５から９．５の範囲であり、さらに通例では約５．５
から８．５の範囲にあり、好ましくは約６から８の範囲である。望ましいｐＨを
達成するために、また測定中ｐＨを維持するために様々な緩衝液を用いてもよい
。例として挙げることのできる緩衝液には、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バ
ルビタール等が含まれる。特別の緩衝液を用いるのは、本発明にとって重要では
ない、しかし個々の方法においては、他のものよりも１つの緩衝液を好んでもよ
い。
【０１４８】 鎖終結ヌクレオシド三リン酸を含んでいる反応は、伸長されたＸ＋１個ヌクレ
オチドが生じるのに充分な時間をかけて行う。一般に、方法全体を実行する時間
は、約１０から２００分である。通例、時間は最小限にすることが望ましい。
【０１４９】 ヌクレオチドポリメラーゼの濃度は通例、経験的妥当性によって決める。好ま
しくは、特異的に標的核酸とハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチド前駆体の
すべてでないにしても、ほとんどを伸長するのに充分な濃度で用いる（以下参照
）。主な制限要因は一般に反応時間および試薬の費用である。
【０１５０】 標的核酸分子の数は、試料中で１０5程度低くすることができるが、一般に約
１０6から１０13まで変化してもよく、さらに通例では試料中に１０8から１０12 分子、好ましくは試料中で少なくとも１０-13Ｍで、１０-13から１０-6Ｍの間で
よく、さらに通例では１０-11から１０Ｍ-7である。一般に、反応のための試薬
は、ハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチドの伸長を達成する量で提供される
。各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の分子数は約１０マイクロリットルの試料サイズ
に対して、一般に１０10であり、通例は約１０10から約１０13、好ましくは約１
０11から約１０12である。各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の濃度は、上で議論した
ようにその熱安定性に従って調整する。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体に対する標的
の絶対比率は経験によって決めるべきである。媒体中における鎖終結ヌクレオシ
ド三リン酸の濃度は、ポリメラーゼに対するヌクレオシド三リン酸の親和性に依
存して変化することができる。好ましくは、試薬は過剰量存在する。ヌクレオシ
ド三リン酸は通例、約１０-7から約１０-4Ｍ存在し、好ましくは、約１０-6から
約１０Ｍ-5である。
【０１５１】 反応温度は、用いるポリメラーゼの型、標的とＸ量体ヌクレオチドの濃度、お
よび混合物中のＸ量体ヌクレオチドの熱力学特性によって、約０℃から約９５℃
にすることができる。たとえば、４０ｎＭの標的核酸配列、４０ｎＭの６量体ヌ
クレオチドおよび７ｎＭのＢｓｔポリメラーゼという条件では、６量体ヌクレオ
チドの配列によって、５℃、２時間にて２０％から５０％の６量体ヌクレオチド
が伸長される。同様の伸長効率が２０℃でも得られるということは、伸長効率は
、Ｘ量体ヌクレオチド／標的の相互作用における熱力学だけによっているのでは
ないことを示している。重要なことに、インキュベートする温度にサイクルを持
たせることが有利なのかも知れない。サイクルを持たせることによって、標的の
構造化された領域をＸ量体ヌクレオチドの結合部分に曝し、その後の伸長を助け
、伸長産物の生産を促進する可能性がある。従って、任意の標的分子が複数のＸ
量体ヌクレオチドの結合およびその後の伸長反応における鋳型として作用するこ
とができ、ＰＥＡの全体的な感度は著しく高められうる。発明のこの態様に従っ
て、１つのサイクルは約７５℃から９５℃の温度で約０．１から５分間、さらに
通例では約０．５から２分間行ってもよく、他のサイクルは約５℃から４５℃で
約１から２０分間、さらに通例では約５から１５分間行ってもよい。サイクルの
回数は約２回から２０回以上でもよい。一般に、サイクルの温度や時間は、任意
の長さのハイブリッド形成したＸ量体ヌクレオチドにおける伸長を最適化するよ
うに選択される。
【０１５２】 組合せを形成する様々な試薬の混合順序は変化してもよい。通例、標的ヌクレ
オチドを含む試料を、事前に調製した鎖終結ヌクレオシド三リン酸およびヌクレ
オチドポリメラーゼと混合する。Ｘ量体ヌクレオチドは事前調製混合物に含めて
もよいし、続いて別に加えてもよい。しかしながら、上のすべてを同時に加える
ことおよびステップ毎あるいは順を追って加えることは、上述の試薬がすべて反
応開始前に混ぜ合わせられているという条件で行ってもよい。
【０１５３】 ＰＥＡＣＡは、重なり合ったおよび部分的に重なり合ったＸ量体ヌクレオチド
のネストされたセットを作成するもう１つの一般的な方法である。この方法には
４つの基本的段階がある（図３）。ステップ１では、可能性のある、あらゆるＸ
量体ヌクレオチド配列あるいはそのサブセットを表しているＸ量体ヌクレオチド
の混合物が、ワトソン−クリック塩基対法則に従って、標的核酸配列のランダム
な部位でハイブリッド形成できるようにする。ステップ２では、ヌクレオチドポ
リメラーゼ、および１以上の天然ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と天然の、
あるいは質量を変更されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いて、ハ
イブリッド形成したＸ量体ヌクレオチドを伸長する。ステップ３では、Ｘ量体ヌ
クレオチドの伸長産物の５’末端部分を酵素切断あるいは化学切断によって切断
する。ステップ４では、でき上がったＸ量体ヌクレオチド産物を質量分析法で解
析する。
【０１５４】 ＰＥＡＣＡは、Ｘ量体ヌクレオチドの伸長産物を作成するように設計され、産
物の長さは、反応混合物中の標的の長さおよびｄＮＰＴの種類および鎖終結ヌク
レオチド（すなわちｄｄＮＴＰ）によって定められる。Ｘ量体ヌクレオチド産物
の間における重なり合う可能性のある部分は、長さのみではなく、Ｘ量体ヌクレ
オチド前駆体混合物のカバレージ複雑度にも依存している。より大きなカバレー
ジ複雑度を持っているＸ量体ヌクレオチド前駆体を用いることは、伸長産物の間
で大きな重なり合いを生じることになる。４つのｄＮＴＰすべてと１つの鎖終結
ヌクレオチド（すなわちｄｄＮＴＰ）が反応混合物中にある場合、ｄＮＴＰ／ｄ
ｄＮＴＰの分子比を高めることは、伸長産物の長さを増すだけでななく、伸長産
物間の重なり合いの可能性を大きくする。逆にｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰのが小さけ
れば、伸長産物は短くなり、可能性のある重なり合い部分も少なくなる。
【０１５５】 ＰＥＡＣＡでは（図３）、５’末端のある部位における切断は、Ｘ量体ヌクレ
オチド前駆体の中の指定されたヌクレオチドによって定められる。ＰＥＡＣＡは
酵素的あるいは化学的処理を用いてＸ量体ヌクレオチド前駆体における５’末端
のある部分を除くという別の利点を持っている。そのような特性は、いろいろな
長さのＸ量体ヌクレオチド混合物から開始する場合、同じ長さのＰＥＡＣＡ産物
を作るのに利用される。これによって、Ｃ／Ｇが豊富なものよりも長いＡ／Ｔが
豊富なＸ量体ヌクレオチドを作ることができ（熱安定性の差異を補正するために
）、さらに切断によって同じあるいは似たような長さのＰＥＡＣＡ産物を作成す
ることができる。さらに、Ｘ量体ヌクレオチドの５’末端は標的と間違ったハイ
ブリッド形成を起こす傾向があり、ポリメラーゼに対する感度も良くない。従っ
てＰＥＡＣＡ反応は質量分析に先だって間違った情報を除くために用いるとよい
。
【０１５６】 ＰＥＡＣＡの第二の型では（ＰＥＡＣＡ ＩＩ、図４）、伸長過程の間に取り
込まれ、指定されたヌクレオチドによって切断が定められる。この型では、Ｘ量
体ヌクレオチド前駆体のどの部分もＸ量体ヌクレオチド最終産物には残らない。
反応混合物にどのｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰが存在するかに依存することに加え
て、任意のヌクレオチドの両方が反応混合物にある場合、ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ
のモル比の変化によっても産物の長さを定めることができる。たとえば、ｄＮＴ
Ｐ／ｄｄＮＴＰ比が大きくなれば、伸長産物も平均して長くなる。逆に、ｄＮＴ
Ｐ／ｄｄＮＴＰ比が小さくなれば、伸長産物も短くなる。
【０１５７】 ＰＥＡＣＡ伸長反応を行う条件はＰＥＡについて上述したものに似ている。
緩衝液のｐＨ、イオン強度、界面活性剤の添加、温度（およびそのサイクル）、
ポリメラーゼの濃度、Ｘ量体ヌクレオチドの濃度、標的の濃度、およびｄＮＴＰ
／ｄｄＮＴＰの濃度と比率はすべて、最大限の特異性、伸長効率および情報量が
得られるように最適化する。
【０１５８】 ５’末端のある部分を切断する以下の例示は、実例のようなものであって制限
するものではなく、次に説明する。１つの方法では、切断により定まるヌクレオ
チドを用いてもよい。切断により定まるヌクレオチドは、たとえばリボヌクレア
ーゼＡのようなエンドヌクレアーゼによる切断、あるいはアンモニアや水酸化物
などのような化学塩基による切断に感受性の高い、リボヌクレオチドでありうる
。切断が決めるヌクレオチドは、たとえばトリクロロ酢酸や希塩酸のような酸に
よって切断できる５’−Ｎ−ホスホアミダイドヌクレオチド間結合を形成するよ
うなヌクレオチドでありうる。Ｘ量体ヌクレオチドがリボヌクレオチドのみで形
成されている場合、たとえばＤＮａｓｅＩのようなデオキシリボヌクレアーゼを
用いることができる。
【０１５９】 定められた試薬や酵素による切断を阻止するヌクレオチドやヌクレオチドのセ
ットによって切断点を決めることもできる。たとえば、Ｘ量体ヌクレオチドは３
’末端における三リン酸結合および５’末端における天然リン酸ジエステル結合
で構成することができる。Ｔ７遺伝子６プロテインのような三リン酸に感受性の
高い５’から３’エンドヌクレアーゼによるＸ量体ヌクレオチドの切断は、Ｘ量
体ヌクレオチドを三リン酸結合の点まで分解する。
【０１６０】 切断を行う条件は、上の酵素について技術上一般的に知られているものである
。手短に言えば、このような条件は２価の金属イオン（必要であれば）を含む適
当な緩衝液中で酵素をインキュベートすることである。５’から３’エンドヌク
レアーゼで適しているものは、すなわち、５’から３’までのポリヌクレオチド
の末端から１つずつヌクレオチドを切断するような酵素は、たとえば、ＤＮＡポ
リメラーゼおよびＴ１７遺伝子６である。適しているエンドヌクレアーゼ、すな
わち、核酸内の結合を切断するような酵素は、たとえば、デオキシリボヌクレア
ーゼＩ、リボヌクレアーゼＡなどである。化学分解にとって適している化学反応
は、たとえば、酸あるいは塩基が触媒となってリン酸エステルを加水分解するよ
うな試薬および、たとえば、塩酸、トリクロロ酢酸などのようなものである。上
の酵素的あるいは化学的反応を行う条件は、当業者には周知のことであり、ここ
では繰り返さない。
【０１６１】 ＸＬＡは、重なり合った、および半分重なり合ったＸ量体ヌクレオチドの一揃
いのセットを作成するもう１つの一般的な方法である。この方法には３つの基本
的なステップがある（図５）。ステップ１では、可能性のあるあらゆるＸ量体ヌ
クレオチドの配列あるいはそのサブセットを表しているＸ量体ヌクレオチドの混
合物が、ワトソン−クリック塩基対法則に従って標的核酸配列のランダムな部位
でハイブリッドを形成できるようにする。ステップ２では、別々のオリゴヌクレ
オチドにおける２つの隣接した塩基を結合するためのリン酸ジエステル結合の形
成を助けるような、ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを用いて、互いに隣接して
ハイブリッドを形成しているＸ量体ヌクレオチドを酵素的に連結する。そのよう
なリガーゼにはたとえば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、大腸菌リガ
ーゼなどが含まれる。別の方法としては、縮合剤を用いて隣接するＸ量体ヌクレ
オチド前駆体を化学的に連結してもよい。適している縮合剤には、たとえば、カ
ルボジイミド、臭化シアン誘導体などがある。ステップ３は、連結できたＸ量体
ヌクレオチド産物を質量分析法で解析する。
【０１６２】 ｎ種のＸ量体ヌクレオチド間における重なり合いの程度は、調べているＸ量体
ヌクレオチド混合物の配列の完全さに依存している。たとえば、４，０９６種の
６量体ヌクレオチドすべてが調べている混合物に存在する場合、でき上がったｎ
種のＸ量体ヌクレオチド間の最大限の重なり合いが可能である。６量体ヌクレオ
チドで可能性のある４，０９６種のサブセットしかない場合、ｎ種のＸ量体ヌク
レオチド間の重なり合いは少なくなる。
【０１６３】 この方法において反応を行う条件は、上述した条件に似ている。媒体のｐＨは
通例約４．５から９．５の範囲であり、さらに通例では約５．５から８．５の範
囲にあり、好ましくは約６から８の範囲である。
【０１６４】 反応は、望ましい連結産物を作成するのに充分な時間で行う。一般に全方法を
実行するのにかかる時間は約１０分間から２００分間である。通例、時間は最小
限にすることが望ましい。
【０１６５】 反応温度は、用いるポリメラーゼの型、標的とＸ量体ヌクレオチドの濃度、お
よび混合物中のＸ量体ヌクレオチドの熱力学特性によって、約０℃から約９５℃
にすることができる。ＰＥＡやＰＥＡＣＡの場合と同様に、インキュベートする
温度にサイクルを持たせることが有利なのかも知れない。サイクルを持たせるこ
とによって、標的の構造化された領域をＸ量体ヌクレオチドの結合部分に曝し、
その後の伸長を助け、伸長産物の生産を促進する可能性がある。
【０１６６】 リガーゼの濃度は通例、経験的妥当性によって決める。好ましくは、標的核酸
と特異的にハイブリッドを形成しているＸ量体ヌクレオチドのすべてとはいかな
くても、そのほとんどを結合するのに充分な濃度で用いる。主な制限要因は一般
に反応時間と試薬の費用である。
【０１６７】 各Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の濃度は、一般にＰＥＡに関して上述した通りで
あり、上で議論したように熱安定性に従って調整してもよい。Ｘ量体ヌクレオチ
ド前駆体に対する標的の絶対的な比率は経験的に定める。
【０１６８】 Ｘ量体ヌクレオチド混合物の５’末端におけるリン酸化のレベルは、連結の程
度（連結産物の全体数）および連結産物の長さ（ｎ値）に影響しうる。連結の程
度と長さは、Ｘ量体ヌクレオチドの３’末端で連結を阻止するような修飾を導入
することによっても制御できる。１つの方法では、２セットのＸ量体ヌクレオチ
ド混合物を１つの反応混合物に一緒に入れる。最初のＸ量体ヌクレオチド混合物
におけるＸ量体ヌクレオチドは、５’リン酸化末端と３’をブロックした末端を
持ち（ｐ−ｙ）、二番目のＸ量体ヌクレオチド混合物のＸ量体ヌクレオチドは、
５’も３’もヒドロキシ末端（ｏ−ｏ）を持っている。これによってｏ−ｏ／ｐ
−ｙを形成する２つのＸ量体ヌクレオチド連結産物しか生じない。３’末端のブ
ロックは、たとえば、３’−リン酸基、３’−ターミナルジデオキシ基のような
非天然の基のような縮合を受けない基、ポリマーあるいは表面、あるいは結合を
阻止するその他の手段を用いて行うことができる。２つのセットを共に最適化で
きるので、この方法は情報上大きな利点を持っている。
【０１６９】 連結の程度や長さを制御するために修飾されたＸ量体ヌクレオチドの利用は、
イオン化効率を高めるためにイオン化標識を取りこむことと組合せることができ
る。最初のＸ量体ヌクレオチド混合物のＸ量体ヌクレオチドは、５’リン酸化末
端およびブロックし、標識した３’末端を持つ（ｐ−ｚ）。二番目のＸ量体ヌク
レオチド混合物におけるＸ量体ヌクレオチドは、５’および３’の両方がヒドロ
キシル末端である（ｏ−ｏ）。これによって２つのＸ量体ヌクレオチドはｏ−ｏ
／ｐ−ｚを形成する連結産物しか生じない。ｚで表される基は、３’ヒドロキシ
ル基を介して結合した第四級アンモニウム基のような、ブロックとイオン化タグ
の両方という２つの目的を果す１つの官能基でありうるし、ヌクレオシド塩基に
取り付けられた別のイオン化タグ付を伴った、ブロックのための３’ジデオキシ
基のように別々の機能性で表すこともできる。
【０１７０】 ＰＥＡ、ＰＥＡＣＡおよびＸＬＡは数多くの望ましい特性を持っている。第一
に、すべて溶液に基づいたシステムであり、標準溶液の質量作用および拡散過程
によって左右される。このことは、表面を基にしたアレイ上におけるハイブリッ
ド形成システムとは対照的であり、アレイ上では、プローブは物理的に表面に取
り付けられており、拡散することができず、ハイブリッド形成の動態が遅くなる
。表面に結合したアレイに対して、本発明では、標的配列に結合する非常に多様
なオリゴヌクレオチドを特徴としている。このことによってＸ量体ヌクレオチド
結合およびその後の酵素反応の全体的効率が高くなる可能性がある。さらに、Ｘ
量体ヌクレオチド前駆体は短いので、分子内構造を形成する可能性は低くなる。
【０１７１】 第二に、ＰＥＡ、ＰＥＡＣＡおよびＸＬＡは特異性の高い酵素反応に有利であ
る。ＰＥＡおよびＰＥＡＣＡの場合、完全な２本鎖に対する特異性の高さは本質
的に、正しい標的配列とハイブリッド形成しているプライマーだけを伸長するこ
とによって（およびそれ故検出に寄与する）ハイブリッド形成過程を「校正(pro
of reading)」するように作用する。この「校正」によって単独で行われたハイ
ブリッド形成法により得られたものをアッセイする際に全体としての特異性が高
められる可能性がある。ハイブリッド形成の効率と特異性はＸＬＡにおけるリガ
ーゼ酵素によっても高められる可能性がある。
【０１７２】 第三に、ハイブリッド形成それ自体の検出に頼る表面に基づいたアレイハイブ
リッド形成システムとは異なって、ＰＥＡ、ＰＥＡＣＡおよびＸＬＡは一時的に
安定なプライマー標的相互作用さえも検出することができる。Ｘ量体ヌクレオチ
ド前駆体と標的との相互作用の時間は、ポリメラーゼあるいはリガーゼが認識し
、作用するのに充分な長さあればよい。このことによって任意の標的配列が複数
の前駆体の結合とそれに続く伸長あるいは連結反応に対する鋳型として作用する
ことができる。このサイクリングと一時的事象の検出能力によって表面に基づい
たハイブリッド形成のアッセイで得られたものに対する方法の検出感度を全体と
して高めることができる。上で議論したように、反応サイクリングのこの型は、
伸長あるいは連結反応の間、温度にサイクルを持たせることによって著しく促進
することができる。
【０１７３】 最後に、方法により生じた伸長産物あるいは連結産物は、Ｘ量体ヌクレオチド
前駆体よりも大きな質量範囲を持っている。従って、反応しなかった前駆体から
生じるスペクトルのピークは、望ましい伸長産物あるいは連結産物の質量スペク
トルの特徴を妨害しないはずである。ＰＥＡおよびＰＥＡＣＡの場合、質量タグ
付したｄｄＮＴＰを利用する可能性があることも熟慮されている。このことによ
って、アッセイの柔軟性を大きくし、質量解析段階を多重化することができる。
５’あるいは３’リンカーを介してＸ量体ヌクレオチド前駆体に、塩基あるいは
糖あるいは鎖終結ヌクレオチドに直接、イオン化タグを取り入れることも熟慮さ
れている。このような特性は、アッセイの全体的な感度を高め、分離ステップを
単純化し、可能であればそのステップを除くのに役立ち、アッセイの自動化と試
料の処理能力を促進する。
【０１７４】 ここで説明した最初３つの方法は溶液中で調べている標的を遊離な状態にする
ことに向けられている。しかしながら、ＸＬＡ方法論は、アレイシステムにおけ
る全体的な解像検出力を高めるために、オリゴヌクレオチドのアレイとして、表
面に結合したオリゴヌクレオチドと結び付けて用いることができる。アレイは一
般に、いろいろなオリゴヌクレオチドのモザイクからなる表面を含み、オリゴヌ
クレオチドは表面上で不連続に、判っている領域に個々に並んでいる。大量のオ
リゴヌクレオチドを含む、そのような順に並んだアレイは、遺伝子型や遺伝子発
現の解析を高い処理能力で行うツールとして開発されてきた。固相支持体上で合
成されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成により、独自に相補的な核酸
を認識し、特異的な標的配列を定め、遺伝子発現パターンを解析し、あるいは特
異的な遺伝子変異を同定するようにアレイを設計することができる。
【０１７５】 本発明は、支持体に取り付けたオリゴヌクレオチドを用いて実践してもよい。
図６を参考にすれば、本発明では、ＤＮＡアレイのようなオリゴヌクレオチドの
アレイは、ある種の光切断あるいは化学的切断できるリンカーを介してＤＮＡプ
ローブを３’末端で表面に取り付けるように作成することができる。リンカーは
光、化学物質、酸化、還元、酸不安定性、塩基不安定性および酵素的方法によっ
て切断することができる。このような表面に結合したプローブはまた、５’末端
にリン酸をもっている。光切断リンカーの見本は、ＷＯ９５／０４１６０などで
説明されているようなｏ−ニトロベンジル基に基づくようなものである。還元に
よって切断できるリンカーの見本は、ジチオスレイトールあるいはβ−メルカプ
トエタノールのような穏やかな還元剤によって切断するジチオエート機能性を持
つものがある。不安定で切断できるリンカーの見本は、リンカーの成分としての
５’−Ｎ−ホスホアミダイトヌクレオチド間結合あるいはヌクレオチドを含むも
のなどである。塩基不安定性で切断できるリンカーは、リンカーの成分としてリ
ボヌクレオチドを含むようなものなどである。
【０１７６】 図６を参考にすれば、アレイに基づいたＸ量体ヌクレオチド連結アッセイ（Ａ
ＸＬＡ）には４つのステップが含まれている。ステップ１では、上述の連結反応
に適合した条件下で、標的試料がアレイの表面に結合したプローブとハイブリッ
ドを形成する。標的核酸は標識されていないか、あるいは蛍光標識などで標識さ
れている。ステップ２では、Ｘ量体ヌクレオチド（リン酸化されていない）の混
合物をアレイに加え、ワトソン−クリックの塩基対法則に従って、標的と無作為
にハイブリッドを形成させる。ステップ３では、表面に結合したオリゴヌクレオ
チドに隣接してハイブリッドを形成したＸ量体ヌクレオチドを上述のようにＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結する。表面に結合しているオリゴヌクレオチドだけが末
端５’リン酸を持っているので、ＤＮＡプローブに隣接してハイブリッドを形成
している６量体ヌクレオチドＸ量体ヌクレオチド間にだけ連結は起き、互いに隣
接し合って、あるいは標的のほかの部分とハイブリッドを形成している６量体ヌ
クレオチドＸ量体ヌクレオチド間では連結は起きない。ステップ４では、連結し
たＸ量体ヌクレオチドを表面から切断し、特徴ごとに（あるいは特徴のセットで
）質量分析法を用いて解析する。この方法において連結反応を行う条件は、上述
した条件に似たものである。
【０１７７】 オリゴヌクレオチドの切断段階およびマトリックスの助けを借りたイオン化は
同時に行ってもよい。これには、ハイブリッド形成、オリゴヌクレオチドの光切
断、およびマトリックス形成とイオン化に必要な条件の間に適合性のあるシステ
ムが求められるが、微量力価ディシュのような反応容器から他のものに切断され
た産物を移す必要性はなくなる。さらに、解析の前の光切断段階の後で、連結産
物が１つの特徴からほかの特徴へ拡散する可能性を最小限にできる。
【０１７８】 上の様式において、質量数複雑度（ＭＮＣ、以下の議論を参照）は、アレイの
実際の特徴数を掛け合わせた、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体のＭＮＣ（以下の議論
を参照）となる。この状況で、６量体ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（４，
０９６の特徴）すべてのアレイを作り、Ｘ量体ヌクレオチド混合物でＸＬＡを行
うと、１ｋＢのＤＮＡ断片よりも大きな新規配列に充分な程度の合計有効特徴数
ができる。この方法は、アレイの情報内容をさらに増やすために非均一アレイ構
造と組合せることもできる。そのような非均一アレイ構造には、限定するもので
はなく、例示のようなものとして、Ｘ量体ヌクレオチドの中の定められた部位で
、４つの天然塩基すべてと対になれる普遍的な塩基あるいは天然塩基の限られた
一部と対になる変性塩基のどちらかを取り込むことが含まれる。このような型の
構造の特徴は、表面に基づいたハイブリッド形成アレイシステムに関して記載さ
れている(Pevzner P.A., et al., J. Biomolecular Structure Dynamics 9, 399
(1991))。
【０１７９】 （前駆体Ｘ量体ヌクレオチド混合物の設計） 上述した各型のアッセイにおける検出力は、標的核酸を調べるために用いられ
るＸ量体ヌクレオチド混合物の特性に依存している。上で議論したように、異な
った配列を持つＸ量体ヌクレオチド間における質量の重なり合いの程度が高いの
は、たった４つの組み立て単位で構成されるＸ量体ヌクレオチドの避け難い結論
である（図７ａのヒストグラム参照）。本発明の試薬は、曖昧さを減らすように
、従って標的核酸の配列を解析するために質量分析法を利用する適用のすべてに
おいて検出力を高めるように設計されている。高い質量数複雑度（ＭＮＣ（Ω）
）とカバレージ複雑度（ＣＣ（Ω））を持った天然の、および質量を変更したＸ
量体ヌクレオチド前駆体の混合物（Ω）を用いることによって、この減少は達成
できる。さらに、発明の混合物は、標的核酸の配列情報を決めるという目標をも
つようなどのような適用において利用してもよいという意味で一般的であり、普
遍的である。さらに、たとえば、突然変異の存在、位置あるいは正体を含むよう
な、標的核酸配列に関する事前情報を参考にしないで混合物を設計してもよい。
しかしながら、このことは、事前に何らかの情報が判っているような標的核酸配
列を解析するのに混合物が役立たないということを意味するものでもなければ、
事前情報が質量スペクトルの解釈に役立たないということを意味するものでもな
い。
【０１８０】 特別な適用（たとえば、突然変異の検出）については、アッセイの検出力は、
任意の成功率、たとえば９５％で問題が解決するような（この特別な例における
突然変異の検出）長さの標的核酸で測定する。アッセイの検出力が増すにつれて
、任意の成功率で解析できる長さも増える。任意の長さが解析できる成功率につ
いても同様である。使い易さの良い基準は、自動ＤＮＡゲル電気泳動シークエン
サーで分析できるＤＮＡの長さ、大体５００塩基くらいである。理に適った目標
は、５００塩基の標的を＞９５％成功率で解析することである。
【０１８１】 アッセイの理論的な検出力を決めるためには、ランダムに引いてきたＤＮＡ配
列あるいはゲノムデータベースから引いてきたゲノムＤＮＡ中で典型的な標的に
対するＸ量体ヌクレオチドの質量スペクトルをシミュレーションし、結果から望
ましい情報を抽出できるかどうかを調べれば十分である。しかしながら、多くの
代替アッセイの設計が考慮されている場合特に、これは時間のかかる処理である
。従って、以下に説明するように、アッセイ検出力の測定の代わりになるプロキ
シが設定されている。アッセイはこのプロキシを用いて最適化する。 最終的な
解析はアッセイのシミュレーションを介して行われる。
【０１８２】 最適化に用いられる測定は、上で定義した平均の曖昧さ（Ａ（Ω））である。 （Ａ（Ω））は、各反応混合物におけるＸ量体ヌクレオチドの可能性ある産物
の質量ヒストグラムを計算し、次いで個々の産物それぞれと混同できる産物の平
均数を計算することによって与えられる。産物の長さがＮ、混合物ｉに対するヒ
ストグラムが、質量ｍでｈｉ（ｍ）個持っている場合（すなわち、この混合物に
おいて可能性のあるｈｉ（ｍ）個の産物の質量はｍである）、平均の曖昧さは合
計ｉ（合計ｍ（ｈｉ（ｍ）2／（４N）））である。最適化過程は、ヒストグラム
をできるだけ平坦に広くする試みと考えることができる(図７ｂおよび７ｃ）。
【０１８３】 短い単語による内容の完全な決定が望ましい場合、ヒストグラムは１つよりも
大きいピークを持ってはならないことにここで気付くべきである。この場合、最
適化プロトコールは（Ａ（Ω））を減らすよりもむしろ、ヒストグラムの最大ピ
ークの高さを減らすようにすべきである。各質量から１つのオリゴヌクレオチド
を選択し、それを別々の混合物に入れることによって、短い単語による完全な解
析に必要な混合物を作成する。このことによって、選択したＸ量体ヌクレオチド
と明瞭に関係している混合物の解析において特別な質量を検出することができる
。従って最終的なヒストグラムの最大ピークの高さによって混合物の数が決まる
。
【０１８４】 アッセイの検出力の指標である、質量数複雑度（ＭＮＣ）は、（Ａ（Ω））を
可能性のある産物の総数に分けることによって決められる。産物の数が異なって
いるようなアッセイを比較する場合、これは役に立つ測定法である。我々のシミ
ュレーションによれば、この方法で計算したＭＮＣは、突然変異を検出するため
の、突然変異の型および位置を同定するための、および１つの核酸多型の遺伝子
型を決めるための、理論的検出力に単調に関係していることが判った。従って、
このプロキシで最適化するのは適当なことである。参考までに、ｎ量体ヌクレオ
チドのオリゴヌクレオチドすべてについて表面に結合したプローブを持つアレイ
では曖昧さは常に１であり、有効な特徴数はオリゴヌクレオチドプローブの数に
等しい。
【０１８５】 上で述べたように、設計過程の主な目標は、上で定義した平均の曖昧さ（Ａ（
Ω））を減らすことである。６量体ヌクレオチドの１つの反応混合物で天然の塩
基のみが用いられる場合、上で与えられた式を用いて曖昧さとＭＮＣは固定し（
ＭＮＣ＝５３）、標的の均一な断片によって得られた情報と同等である。５−ヨ
ードシチジン、５−フルオロウリジンおよび２’−Ｏ−メチルグアノシンのよう
な修飾した塩基は、修飾によってある種の塩基を選択的に置き換えることによっ
てオリゴヌクレオチドの曖昧さをなくすために用いることができる。たとえば、
ＡＣＧＴによって天然塩基を示し、Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊によって修飾したセットを
示した場合、オリゴヌクレオチドＡ＊ＴＡＴＡＴＴはＴＡＴＡＴＡＴというオリ
ゴヌクレオチドからの質量によって区別することができる。従って、最適化とは
、適切な置換を選択し、利用できるホスホラミダイト塩基に制約を加え、合成戦
略、連結あるいは伸長の長さの程度、前駆体オリゴヌクレオチドの長さ、および
反応混合物の数を選択する過程である。
【０１８６】 図８は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体Ｘ量体ヌクレオチドが個々に６量体ヌクレ
オチドに合成される場合のＰＥＡに関する最適化過程を図解したものである。過
程では，１つの反応混合物を用いて、標的を７量体ヌクレオチドの短い単語で繰
り返すために、天然ジデオキシヌクレオチドである鎖終結ヌクレオシド三リン酸
を用いて、１つのヌクレオチドでＸ量体ヌクレオチドを伸長する。最適化過程は
、できてくる７量体ヌクレオチド産物のヒストグラムが広く、平らになるように
、６量体ヌクレオチド前駆体の完全なセットを創ることに向けられている。
【０１８７】 図解するために、図８のアルゴリズムには、２つのアデニル酸誘導体（Ａ）、
すなわち、それぞれ３３０および３７５の質量を持つ、２’−デオキシアデノシ
ンおよび２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリン、２つのシチジル酸誘導体
（Ｃ）、すなわち、それぞれ３０６および４３４の質量を持つ２’−デオキシシ
チジンおよび２−デオキシ−５−ヨードシチジン、２つのグアニル酸誘導体（Ｇ
）、すなわち、それぞれ３４６および３７６の質量を持つ２’−デオキシグアノ
シンおよび２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２つのチミジル酸誘導体（Ｔ）
、すなわち、それぞれ３２１および４３３の質量を持つ２’−デオキシチミジン
および２’−デオキシ−５−ヨードウリジンを用いている。
【０１８８】 すべて天然の６量体ヌクレオチドの混合物を考えることから開始する。次いで
、混合物の質量ヒストグラムを計算し、ピークの大きさによって質量を区分けす
る（頻度）。最も高い頻度を持つピーク（任意の質量で６量体ヌクレオチドの最
大数）からＸ量体ヌクレオチドを選択し、そのようなＸ量体ヌクレオチドについ
て上述の試薬を用いて代替質量を計算する。次いで、この再振り分けによって平
らなヒストグラムができるという条件で、質量ヒストグラムで最も低い頻度を持
つ代替質量にＸ量体ヌクレオチドを再振り分けする。再振り分けできるようなピ
ークの高いＸ量体ヌクレオチドがなかった場合、続いて小さなピークからＸ量体
ヌクレオチドを選択し、調べる。一旦Ｘ量体ヌクレオチドをうまく位置決めし、
再振り分けしたら、完全な質量ヒストグラムを再び算出し、説明した基準に従っ
て、再振り分けできるＸ量体ヌクレオチドが無くなるまで過程を繰り返す。
【０１８９】 上の最適化過程の結果として、３０より少ない平均の曖昧さが用いた分子につ
いて観察される。図７ｂおよびｃにおける最終質量ヒストグラムに上述した平均
の曖昧さに関する式を適用することによって、これは計算される。この場合、質
量ヒストグラムの各ピークは、７量体ヌクレオチドについて可能性のある全部で
１６，３８４種のうち約３０種を含んでいる（図７ｂおよびｃ）。これによって
先に示し、上述した式によって計算したＭＮＣはおよそ５５９となる（表Ｉ参照
）。
【０１９０】 シミュレーションによれば、ＭＮＣに関するその値は、９５％の成功率で約０
．９ｋＢの１本鎖ＤＮＡにおける１つの点突然変異を検出する能力に相当してい
る(表Ｉ）。この意味で、そのような混合物は、５５９の特徴を持つ表面に結合
したハイブリッド形成アレイと同等の情報を提供すると言われうる。本発明の利
点は、実践的な用途においてアレイはそうでないけれども、ＰＥＡアッセイは一
般的であるということである。このことは、上述のＰＥＡと６量体ヌクレオチド
を用いて、平均９５％の成功率で、０．９ｋＢのいかなる標的配列でも点突然変
異を調べることができるというべきである。
【０１９１】 ＰＥＡについては、別の反応混合物に産物を分割するということは、用いた混
合物のおよその数によって曖昧さの減少を招くことになる。特に単純な１つの方
法は以下の通りである。４つの異なった反応混合物を作成する。それぞれの混合
物にはＸ量体ヌクレオチド前駆体すべてと４つの天然ジデオキシヌクレオチドタ
ーミネーターのうち１つだけが含まれている。４つの質量スペクトルのピークは
、特別な伸長物における７量体ヌクレオチドの末端に絶対的に割り振られる。こ
の方法では、ＭＮＣは４から２，０７５という値のうちの１つの要因によって増
加する。この値のＭＮＣで１．６ｋＢの２本鎖ヘテロ接合体のＰＣＲ産物におけ
る突然変異を検出することができる（表Ｉ参照）。同じ効果は、１つの反応で質
量タグ付した４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いることによっ
て得ることができる（図９参照）。この場合、３’末端のジデオキシヌクレオチ
ドの種類に従って、伸長された７量体ヌクレオチド産物の質量スペクトルが別々
に取り込まれるように質量タグを設計する。
【０１９２】 質量の曖昧さはさらに「ビニング」、すなわち、混合物の個々のサブセットに
よって標的を調べ、解析の間に調べたそれぞれの結果を組合せることによっても
減る可能性がある。混合物は、区分けすることによって、個々のＸ量体ヌクレオ
チドがそれぞれ、区分けした混合物の１つに入るように、ビニングしてもよい。
別の方法としては、任意のＸ量体ヌクレオチドが１つより多くの区分けした混合
物に入るように、混合物をビニングしてもよい。
【０１９３】 発明の混合物あるいは区分けした混合物は、標的核酸配列の質量スペクトルに
おける曖昧さを望ましいどのようなレベルまででも減らすように設計してもよい
。標的核酸配列の短い単語の完全な内容が決められるように、曖昧さのレベルは
最低レベルまで減らしてもよい。
【０１９４】 質量数複雑度に加えて、ＰＥＡの解像検出力と一般性は、Ｘ量体ヌクレオチド
混合物のカバレージ複雑度（ＣＣ（Ω））に依存している。シミュレーションに
よれば、理論的な最大ＣＣ（Ω）よりかなり小さいものを持つＸ量体ヌクレオチ
ド混合物は充分な解像検出力と一般性を持っていることが判っている。図１０に
示されるように、６量体ヌクレオチドにおける総数４，０９６種のうち５０％が
、標的の長さに大きな影響を与えない、任意の成功率で１つの突然変異を検出で
きるような最適化された６量体ヌクレオチド混合物から除かれうる。Ｘ量体ヌク
レオチドは混合物からさらに除かれるので、アッセイの検出力は急速に低下する
。この効果は、カバレージの一般性を保つためにはＸ量体ヌクレオチドの総数を
大量にすることと、しかし質量の重なり合いを減らすためにはＸ量体ヌクレオチ
ドの総数を少なくすることの間で成り立つ平衡によるものである。予測されるよ
うに、高い成功率のためにはＸ量体ヌクレオチド総数の比率を大きくする必要が
ある。直交する情報を持つために共通して最適化した２つの別々の混合物によっ
て標的を調べることにより、極めて高い成功率（＞９９％）が得られると予想さ
れる。
【０１９５】 ＸＬＡについても、アッセイの検出力は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体混合物の
ＭＮＣおよびＣＣ（Ω）に依存している。表Ｉに示すように、天然ヌクレオチド
で構成される配列の完全な６量体ヌクレオチド混合物を用いたＸＬＡでは、約２
００というＭＮＣが得られる。しかしながら、ＰＥＡについて最適化され、修飾
した６量体ヌクレオチド混合物を用いてＸＬＡを行う場合、ＭＮＣは２倍に増加
し、約４００となる。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体における最適化されたヒストグ
ラムの特徴はＰＥＡとＸＬＡでは異なっていることに気付くべきである。一般に
、ＰＥＡについて最適化されたＸ量体ヌクレオチドのヒストグラムは平坦である
けれども、ＸＬＡについて最適化されたＸ量体ヌクレオチドのヒストグラムは質
量範囲の端に偏りを持ったニ峰性である。これは、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の
連結効果が、質量範囲の真ん中に集中するような、産物のヒストグラムを作り、
ＭＮＣを低くするからである。この傾向に抗してＭＮＣを上げるためには、低い
質量と高い質量の境界に偏りを持った、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体のヒストグラ
ムを作ることが役に立つ。
【０１９６】 ＰＥＡの場合のように、多様なＸ量体ヌクレオチド混合物の決められたサブセ
ット標的を調べることによってＸＬＡに関する複合体ＭＮＣを高めることができ
る。しかしながら、アッセイの一般性を保つために各前駆体はあらゆる他の前駆
体と連結する機会を持たなければならないので、ＸＬＡについては、Ｘ量体ヌク
レオチド前駆体の最適化したビニングは問題が多い。従って、ＳセットのＸ量体
ヌクレオチド前駆体を作り、アッセイ反応がＸ量体ヌクレオチド対を連結した場
合、Ｓ（Ｓ−１）／２個の反応混合物が創られることになる。
【０１９７】 上の議論から明らかなように、精密な最適化過程は、アッセイの型および求め
る情報の詳細によって変化する。ある例では、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体すべて
の徹底的なリストを作り、最良のものを選択することができる。たとえば、以下
の６量体ヌクレオチド前駆体について説明している順列組合せ合成作戦を用いる
場合、この作戦は、現実的である。すなわち、可能性のある前駆体セットの数は
、２24／６！であり、これは理に適った時間内に徹底的に解析できる数だからで
ある。さらに込み入った場合では、ＰＥＡについて説明したもののような最適化
アルゴリズムを用いる。
【０１９８】 生じる可能性のある難しさは、分子の同位元素組成から生じるスペクトルにお
ける同位体ピークの存在である。それは、分子における個々の原子について特定
の同位元素の量を意味している。たとえば、天然の炭素は９９％の炭素１２と１
％の炭素１３から成っている。代表的な７量体ヌクレオチドから成るオリゴヌク
レオチドは、約７０個の炭素原子を持っており、別々の原子質量単位で２つのほ
とんど同じくらい強いピークを生じる。この問題に取り組むための１つの方法は
、同位体ピークをノイズ処理した高性能なデータ解析法を信頼することである。
これは、天然の同位体発生量を用いて、可能性のあるＸ量体ヌクレオチド伸長産
物の本当の質量分布を計算し、および／あるいは経験的に決めるものである。こ
の情報は、その後様々なＸ量体ヌクレオチドの同位体ピークの間における重なり
合いをノイズ処理するのに用いられる。この問題に取り組むためのもう１つの方
法は、Ｘ量体ヌクレオチド前駆体をサブセット混合物に区分けして、１つのサブ
セットには偶数の純粋な伸長あるいは連結主要質量だけが入り、もう１つのサブ
セットには奇数の主要質量だけが入るようにする。従って、主要質量が任意のサ
ブセット混合物では作られないために、Ｎ＋１が優勢な同位体のピークは（主と
して炭素１３による）は、もう１つの主要ピークを妨害することはできない。別
の方法では、精製した炭素１２を用いてＸ量体ヌクレオチド前駆体を作成しても
よい。この方法では、基本的なヌクレオシド構成成分は、精製した、あるいは濃
縮した炭素１２を含むヌクレオシド前駆体あるいは炭素源を含む培養液で培養し
た細菌あるいは酵母から単離することができる（たとえば、Crain, P. F., Meth
ods Enzymol.193, 782(1990), Nikonowica, D. P. et al., Nucleic Acids Res.
20, 4501(1992), Hall, K. B., Methods Enzymol. 261, 542(1995), Macallan
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 708(1998)を参照）。次いで標準プロ
トコールを用いて、自動合成のためにヌクレオシドを適当なホスホラミダイトに
変換する（たとえば、オリゴヌクレオチドと類縁体、実践的方法F. Eckstein(ed
itor) IRL Press, Oxford(1991)を参照）。同様の方法は、質量を変更した、あ
るいはイオン化タグ付したヌクレオチドを用いることによって導入された同位体
ピークで用いてもよい。質量タグあるいはイオン化タグは同位元素を濃縮した前
駆体から調製することができるし、別の方法では、フッ素、リンあるいはヨウ素
のような１つの同位体として天然に広く存在する要素で一部をあるいは全部を構
成することもできる。
【０１９９】 （分析段階） 反応混合物，あるいは精製したＸ量体ヌクレオチド産物は続いて、質量分析法
によって解析する。解析の詳細は技術上周知にことであり、ここでは繰り返さな
い。適している質量分析法は、酵素学における方法B. Karger & W. Hancock (ed
itor), Academic Press, San Diego, V270 (1996)および酵素学における方法J.
McCloskey (editor), Academic Press, San Diego, V193 (1990)に記載されてい
る。これらには、マトリックス支援型レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、
エレクトロスプレー（「ＥＳＩ」）イオンサイクロトロン共鳴（「ＩＣＲ」）、
フーリエ変換型および遅延型イオン抽出および上の組合せや変異型が含まれる。
適した質量解析機には、単一４極、３元４極（ＭＳ／ＭＳ）、フーリエ変換およ
び飛行時間（「ＴＯＦ」）配置における磁気、セクター／磁気偏向機器が含まれ
る。
【０２００】 たとえば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動
など（図５参照）のような技術を用いて、質量スペクトル解析の前に反応産物を
精製することも熟慮されている。伸長されたあるいは連結されたＸ量体ヌクレオ
チド産物を疎水性に基づいて分離するために、逆相ＨＰＬＣを用いてもよい。で
き上がったＨＰＬＣ分画を質量分析法にて解析する。そのような技術は、請求し
ている方法における解像検出力を充分に高める可能性がある。
【０２０１】 ＭＡＬＤＩなどによる解析では、望ましい特徴を解析に伝えるためにＸ量体ヌ
クレオチド前駆体あるいはＸ量体ヌクレオチドを修飾することが望ましいことが
ある。そのような修飾の例では、レーザーエネルギーを減らすために行うような
ものが含まれ、Ｘ量体ヌクレオチドを揮発させる、断片化を最小限にする、単一
に電荷したイオンを優位にする、組成や配列にかかわらず望ましいオリゴヌクレ
オチドの反応を基準化し、ピーク幅を減らす、および望ましい解析産物の感度お
よび／あるいは選択性を高める、ことである。たとえば、陽イオン交換によるリ
ン酸ジエステルバックボーンの修飾は、ヌクレオチド単位当たりに結合している
陽イオンの不均一性によるピークの広がりを除くのに役に立つ。別の方法では、
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を導入し、ヨードアルキル、ヨードアセ
トアミド、β−ヨードエタノールあるいは２，３−エポキシ−１−プロパノール
でホスホロチオエートをアルキル化し、中性のアルキル化ホスホロチオエートバ
ックボーンを形成することによって、Ｘ量体ヌクレオチドの荷電したリン酸ジエ
ステルバックボーンを中性化することができる。ＷＯ９６／２７６８１に詳細が
説明されているように、そのようなアルキル化は、イオン化タグと組合せて用い
ることができる。
【０２０２】 たとえば、Ｎ７−あるいはＮ９−デアザプリンヌクレオチド、ＲＮＡ構成成分
、オリゴヌクレオチド三エステル、および上述などのようなアルキル化されたホ
スホロチオエート機能をもつヌクレオチド塩基などのような、脱プリン（質量分
析の間における断片化）への感受性を減らすようなヌクレオチド塩基の取り込み
も役立つ可能性がある。
【０２０３】 （データ解析） 質量スペクトルが得られた後、特定の適用で定められた情報を回収するために
解析を行う。たとえば、突然変異の検出では、このような型の適用は一般に、参
考配列とその未知の変異との間で質量スペクトルの比較を行うために、データの
質的な解析のみを必要とする。質量ピークに差異があれば、未知の変異の中にあ
る種の突然変異（あるいは配列の差異）が存在することになる。
【０２０４】 突然変異の同定は、さらに高度な解析を必要としている。突然変異の検出の場
合のように、突然変異の同定には一般に、参考配列と未知の変異との比較が含ま
れている。しかしながら、正確な位置を同定するためには、およびヘテロ接合体
の突然変異を同定するためには、以下の過程が適用される。最初に、野生型スペ
クトルに見られない、試料の質量スペクトルに見られるピークを同定する。次い
でＸ量体ヌクレオチドの可能性のあるあらゆる産物のリストから、新しいピーク
に一致する質量を同定する。そして、存在が確認されたＸ量体ヌクレオチド産物
混合物のそれぞれを導くような可能性のある突然変異部位を同定する。突然変異
の型（たとえば置換）が判っている場合は、可能性のある多くの部位が拒絶され
、従って多くのＸ量体ヌクレオチドも拒絶される。最終的に、観察されたスペク
トルとの一貫性について各突然変異の理論的スペクトルを調べる。
【０２０５】 伸長あるいは連結効率、イオン化効率および同位体効果による曖昧さを解決す
るためにさらに高度な過程を用いることができる。さらに、Ｘ量体ヌクレオチド
前駆体混合物のＣＣMやＭＮＣに依存して、オリゴヌクレオチドアレイを用いた
配列決定で開発されたようなアルゴリズムを用いて、新規の配列情報を得ること
もできる（たとえば、Pevzner P.A., J. Biomolecular Structure Dynamics 7,
63(1989), Pevzner, PA., at al., J. Biomolecular Structure Dynamics 9, 39
9(1991), Ukkonen, E., Theoretical Computer Science 92, 191(1992)を参照）
。
【０２０６】 （発明のキット） 本発明のもう１つの態様は、発明に従った方法を都合良く行うのに役立つキッ
トに関係している。発明の主題の多面性を高めるために、試薬の比率によって方
法の実質的な最適化がもたらされるように、試薬は混合するものを同一のあるい
は別々の容器に包装して提供する。試薬は別々の容器に入れてもよいし、試薬の
交叉反応性および安定性によって様々な試薬を１つか複数の容器に組み合わせて
入れることができる。
【０２０７】 １つの実施例では、キットは、最低３個の長さのヌクレオチド、および混合物
中の異なったＸ量体ヌクレオチドの数で５６を割って得られる値である混合物に
おける最小のカバレージ複雑度を持った天然の、および質量を変更したＸ量体ヌ
クレオチド前駆体を備えている。Ｘ量体ヌクレオチド前駆体の長さは各Ｘ量体ヌ
クレオチド前駆体ごとに個々に選択することができる。混合物中のＸ量体ヌクレ
オチド前駆体はそれぞれ１つの化学種によって表される。混合物は、いかなる天
然同等物よりも大きな質量数複雑度（ＭＮＣ）を持っている。
【０２０８】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素および天然の鎖終結三リン酸から成るグループから選択し
た多様なヌクレオチドを含む。
【０２０９】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素および質量を変更した鎖終結三リン酸から成るグループか
ら選択した多様なヌクレオチドを含む。
【０２１０】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素および天然の鎖終結三リン酸および伸長ヌクレオチド三リ
ン酸から成るグループから選択した多様なヌクレオチドを含む。
【０２１１】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素および質量を変更した鎖終結三リン酸および伸長ヌクレオ
チド三リン酸から成るグループから選択した多様なヌクレオチドを含む。
【０２１２】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素、天然の鎖終結三リン酸と伸長ヌクレオチド三リン酸から
成るグループから選択した多様なヌクレオチド、およびヌクレアーゼを含む。
【０２１３】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素、質量を変更した鎖終結三リン酸と伸長ヌクレオチド三リ
ン酸から成るグループから選択した多様なヌクレオチド、およびヌクレアーゼを
含む。
【０２１４】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素、天然の鎖終結三リン酸とアルファ−三リン酸ヌクレオチ
ド三リン酸およびから成るグループから選択した多様なヌクレオチド、および５
’−エクソヌクレアーゼを含む。
【０２１５】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物、ヌクレオチドポリメ
ラーゼ活性を持つ酵素、質量を変更した鎖終結三リン酸とアルファ−三リン酸ヌ
クレオチド三リン酸から成るグループから選択した多様なヌクレオチド、および
５’−エクソヌクレアーゼを含む。
【０２１６】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物およびＤＮＡリガーゼ
を備えている。
【０２１７】 もう１つの実施例では、キットは、上述のような混合物および縮合剤を備えて
いる。
【０２１８】 本発明のもう１つの実施例は、上述の方法を実行するためのキットである。キ
ットは、上述のような混合物、ＤＮＡリガーゼを含み、さらに、表面に取り付け
られた切断できるリンカー、および３’末端と５’末端リン酸を持ち、３’の末
端は切断できるリンカーと結合している核酸配列を有する、核酸配列プローブの
表面と多様なアレイとを含む。
【０２１９】 １つの態様では、キットは縮合剤を含み、さらに表面に取り付けられた切断で
きるリンカー、および３’末端と５’末端リン酸を持ち、３’の末端は切断でき
るリンカーと結合している核酸配列を備えた、核酸配列プローブの表面と多様な
アレイとを含む。
【０２２０】 キットはさらに補助的な試薬などと同様に方法を実行するために分けて包装し
たそのほかの試薬を含むことができる。キットの中の様々な試薬の相対的な量は
、本方法の間で起きる必要のある反応を実質的に最適化するような、試薬の濃度
を提供するために、広く変えることができる。適当な環境下で、キットの中の１
つか複数の試薬は、補形剤を含み、通例凍結乾燥された、乾燥粉末として提供さ
れ、溶解すれば、本発明に従って方法を実行する際の適切な濃度を持つ試薬溶液
となる。キットは上述したような、本発明に従った方法の文書による説明も含め
ることができる。
【０２２１】 発明の試薬、方法およびキットは、そのほか、突然変異の検出、突然変異の同
定、多型解析、遺伝子型の決定、新規の配列決定、配列の再決定、遺伝子発現パ
ターン、ｃＤＮＡのクラスター形成などで有用である。
【０２２２】 上記の説明は、例示することを意図するものであり、発明の範囲を制限するも
のではないことを理解すべきである。発明の範囲にあるその他の態様、利点およ
び修飾は、発明に関係のある当業者にとっては明らかなことである。以下の例示
は、発明の方法と産物の作り方と使い方の例を当業者に提供できるように提出す
るものであり、発明者が発明と見なしているものの範囲に制限を加えようとする
ものではない。
【０２２３】
【実施例】
以下の三つの実施例は、目的核酸としてヒトp５３遺伝子配列領域を用いた上
記の方法に関するものである。図１１は、p５３遺伝子の６２および３７８ヌク
レオチド領域を、肉太で示した既知の突然変異とともに示している。すべての分
析には、図１１に示した配列の相補体が用いられる。実施例はすべてシミュレー
ションである。したがって、反応条件（すなわち緩衝液、Ｘ量体および目的物の
濃度、ポリメラーゼまたはリガーゼの種類等）についての詳細は、ここでは有意
味ではない。これらの実施例の解釈は、Ｘ量体前駆物質の質量複雑度とカバレー
ジ複雑度、目的物の長さと配列、および用いる分析のタイプに依存する。すべて
の実施例は、反応が、本文をとおして記述されまた図に示されているように進行
するものと仮定している。重要なであるのは、目的配列の正確な相補体であるＸ
量体のみが実際に伸長される（ＰＥＡおよびＰＥＡＣＡの場合）か、または連結
される（ＸＬＡの場合）と仮定していることである。すべての実施例の主な目的
は、各分析により生じることになる質量スペクトルのタイプおよび情報量の見地
から、各分析の理論的能力を説明することである。
【０２２４】 実施例１（ＰＥＡ） ＰＥＡは、目的物としてp５３フラグメントの６２ヌクレオチド、４つの天然
のｄｄＮＴＰのすべて、および４つの天然のヌクレオチドからなる６量体の配列
の完全なセット（4,096）を用いて行なった。図１２は、野性型のp５３標的配列
として期待される、５６個の重複する７量体の伸長産物のセットを示す。野性型
ならびに単一のＧ２４１８Ｃ突然変異体に対応する７量体産物の質量スペクトル
を図１３に示す。図１３の積分されたスペクトルは、野性型と突然変異体との間
でどの質量が異なるかを示している。ポジティブな差のピークは、野性型には存
在するが突然変異体には存在しない質量に対応し、ネガティブな差のピークは、
突然変異体にはあるが野性型にはない質量に対応する。次にこのスペクトルのデ
ータを前文に記したように解釈した。
【０２２５】 しかしながら重要であることは、積分された差スペクトルに示された情報がハ
イブリッド形成、伸長、イオン化、および検出のステップがすべてのＸ量体につ
て等しい効率で起きると仮定していることを強調することである。この定量のレ
ベルは良好な最適化をもってしても事実となる見込みはなく、個々のスペクトル
のデータはバイナリー形式に縮小される（図１４）。このタイプの変換は、今度
は上記のステップが、定義された域値レベルに合致することのみを必要とする。
このようなデータの量的性質の削除は総括的な分析能力を減じるが、結果的に得
られるバイナリー差スペクトルはなお、野性型と突然変異体との間の差異を示し
ている（図１４）。図１５は、 p５３フラグメントの６２ヌクレオチド内の位置
２４８１および２４８２における三つの可能な突然変異体すべてについての、Ｐ
ＥＡから得られる質量スペクトルを示す。図１６に示すように、バイナリー差ス
ペクトルは六つの突然変異体すべてを現わすためには十分有効である。
【０２２６】 C２４８１A突然変異をp５３フラグメントの３７８ヌクレオチド内でＰＥＡを
用いて調べる場合には、結果として得られるバイナリー差スペクトルはただ一つ
の質量差のみを示す（図１７）。しかしながら、上述の個々に最適化された質量
変更された６量体の混合物を用いて同様に調べると、結果として得られる差スペ
クトルは六つの質量の差を示す（図１８）。このことは、物質に質量変更が行な
われた場合、この分析法に利用できる能力が亢進されることを説明している。
【０２２７】 強調されるべきであるのは、上記の結果が一般的なものであって、分析される
べき特定の目的物については、いかなる情報も用いずにＸ量体前駆物質の選択が
行なわれたことである。表１に示したように、個々に最適化した６量体混合物を
用いたＰＥＡ分析は、８９０ヌクレオチド長の目的物内の単一の突然変異につい
て、少なくとも一つのバイナリーな質量差を９５％の成功率をもって示す。もし
さらに高い成功率が所望であれば、調べ得る目的物はより短い長さのものを用い
る（図１０参照）。より長い目的物またはより高い成功率は、Ｘ量体混合物の直
交するセットを用いるかまたは各ｄｄＮＴＰを別々の反応に用いて目的物を調べ
れば取得することができる（表１参照）。
【０２２８】 実施例２（ＰＥＡＣＡ） p５３フラグメントの６２ヌクレオチドを、Ｘ量体、ｄＮＴＰ、およびｄｄＮ
ＴＰの定義されたセットを各々が含む、４つの別々のＰＥＡＣＡ分析を行なうこ
とにより調べた。反応（Ａ）は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3ｒＡ4Ｘ5Ｘ6（ｒＸはリボヌクレオチ
ド）の形を有するすべての６量体、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄｄ
ＡＴＰを含む。同様に、反応（G）は、Ｘ1Ｘ2Ｘ3ｒＧ4Ｘ5Ｘ6（ｒＧはリボヌク
レオチド）の形を有するすべての６量体、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およ
びｄｄＧＴＰを含み、以下同様である。このようなステップから期待される結果
は、可変の長さを有するＸ量体産物の半重複したセットである（図１９）。野性
型ならびに単一のC2481A突然変異体の両者について、結果として得られる複合体
質量スペクトル（四つの反応すべてを混ぜ合わせたもの）を図２０に示す。バイ
ナリー差スペクトルは７つの質量ピークの差を示しており、それらは所与の突然
変異を表す。
【０２２９】 重要であるのは、ＰＥＡＣＡ法は結果として４量体切断産物（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ａ4，
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｇ4、Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｃ4、およびＸ1Ｘ2Ｘ3Ｔ4）をもたらすが、それらは目
的配列を表すものではないことに注目することである。したがって、バイナリー
差スペクトルにおける有益な情報はすべて強制的に５量体以上（＞1,550 amu.）
に相当する質量のものにする。このような注意をもってすれば、突然変異を同定
するべく十分な質量差を生じる。
【０２３０】 p５３フラグメントの３７８ヌクレオチド内の位置２４８１における３つのす
べての突然変異もまた、この特別の分析変法を用いて示される（図２１）。これ
らの結果は一般的なものである；ＰＥＡＣＡは天然のＸ量体を用いて３８０ヌク
レオチド長の目的物における一つの突然変異を、９５％の成功率をもって検出す
ることができる（表１）。ＰＥＡＣＡの解像力は、Ｘ5およびＸ6の位置に特別の
質量変更を取り入れることにより増大させることができる。定義されたｒＸをさ
らに５’末端方向、たとえばＸ3に設置することにより、また定義された質量変
更をＸ4Ｘ5、およびＸ6に取り込むことにより、さらなる能力を取得することが
できる。
【０２３１】 実施例３（ＸＬＡ） P５３フラグメントの６２ヌクレオチドを天然のヌクレオチドからなる６量体
混合物を用いたＸＬＡを行なうことにより調べた。図２２は、野性型配列および
Ｃ２４８１Ａ突然変異体についての個々の質量スペクトルを示す。バイナリー差
スペクトルは５つの質量ピークの差を示しており、それは所与の突然変異を表し
ている。同様の突然変異が３７８ヌクレオチドフラグメントにおけるＸＬＡによ
っても検出可能であるが、結果として得られるバイナリー差スペクトルは３つの
質量差を示すにすぎない（図２３）。前文に議論しかつ表１に示したように、Ｘ
ＬＡの能力は質量変更されたＸ量体混合物を使用することにより亢進することが
できる。
【０２３２】 本文においては、本明細書に引用したすべての出版物ならびに特許出願は、個
々の出版物または特許出願を参照することによって特別にまた個々に組み込まれ
る。
【０２３３】 前述の発明は、理解の明確さの目的のための説明および例としていくぶん詳し
く記述されているが、ある種の変更と変形とを、この発明にしたがって添付した
請求項の精神または範囲から逸脱することなく行なうことができることは、この
技術の通常の技術者には当然とするところであろう。
【０２３４】
【表１】
【０２３５】 報告された値は本文中に記述した計算またはシミュレーションから得られたも
のである。最後の３つの欄の数値は、９５％の成功率をもって問題を解決するこ
とができるヌクレオチド長をさす。ＭＮＣは本文中に定義されている。突然変異
同定は、他の方法で判明している配列における突然変異の正体ならびに位置の両
方を決定する能力をさす。＊これらの分析条件について報告された値は、完全な
シミュレーションがまだ行なわれていないため概算にすぎない。†質量変更され
たヌクレオチドを含む前駆体のセットは、天然の４つのヌクレオチドと以下の誘
導体とを含む；２´-O-メチル-２,６-ジアミノプリン、５-ヨードシチジン、２
´-O-メチルグアノシン、および５-ヨードウリジン。突然変異検出は、野性型と
その単一の突然変異体との間の質量特性における差を検出する能力をさす。‡も
し質量タグｄｄＮＴＰが、すべての７量体伸長産物を、前文ならびに図９に述べ
たように、添加された末端ｄｄＮＴＰに依存して質量スペクトルの４つの別々の
領域に分離するべく設計されるなら、４つの別個の実験（各ｄｄＮＴＰにつき１
回）を繰り返す代りに、単一の反応をおこなうことができることに注目されたい
。
【図面の簡単な説明】
図１は、異なった型の短いＸ量体ヌクレオチドのセットによって標的配列を繰
り返している図である。 図２は、ポリメラーゼによる伸長アッセイ（ＰＥＡ）の段階を概略した図であ
る。 図３は、ポリメラーゼによる伸長および切断アッセイ（ＰＥＡＣＡ）の段階を
概略した図である。 図４は、ポリメラーゼによる伸長および切断アッセイＩＩ（ＰＥＡＣＡＩＩ）
の段階を概略した図である。 図５は、Ｘ量体ヌクレオチド連結アッセイ（ＸＬＡ）の段階を概略した図であ
る。 図６は、アレイに基づいたＸ量体ヌクレオチド連結アッセイ（ＡＸＬＡ）の段
階を概略した図である。 図７は、すべて天然の、個々に最適化し、質量を変更した６量体ヌクレオチド
前駆体から作成した７量体ヌクレオチドＰＥＡ産物のすべて、１６、３８４種の
ヒストグラムを示す図である。 図８は、質量を変更したＸ量体ヌクレオチド前駆体の最適化に関するフローチ
ャートである。 図９は、質量タグしたｄｄＮＴＰから作成した７量体ヌクレオチドＰＥＡ産物
のすべて、１６、３８４種のヒストグラムを示す図である。 図１０は、定められた成功率におけるＰＥＡの解像検出力に対する６量体ヌク
レオチド前駆体混合物の配列カバレージパーセントの効果を示す図である。 図１１は、ヒトｐ５３遺伝子の突然変異部位が判っている領域の配列を示す。 図１２は、野生型ｐ５３配列における６２個のヌクレオチド断片に相当する７
量体ヌクレオチドのＰＥＡ産物で、重なり合ったネストされたセットを表してい
る。 図１３は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、６２個ヌクレオチド断
片内における野生型およびＧ２４５１Ｃｐ５３突然変異のＰＥＡ解析に関する質
量スペクトルを表す。 図１４は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、野生型およびＧ２４５
１Ｃｐ５３突然変異のＰＥＡ解析について、ニ峰性に変換し、差のあるスペクト
ルを表す。 図１５は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、６つのｐ５３突然変異
のＰＥＡ解析に関する質量スペクトルを表す。 図１６は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、６つのｐ５３突然変異
のＰＥＡ解析について、ニ峰性で差のあるスペクトルを表す。 図１７は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、３７８個ヌクレオチド
断片内における野生型およびＧ２４５１Ｃｐ５３突然変異のＰＥＡ解析について
、質量スペクトルを表す。 図１８は、質量を変更し、最適化した６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、３
７８個ヌクレオチド断片内における野生型およびＧ２４５１Ｃｐ５３突然変異の
ＰＥＡ解析について、質量スペクトルを表す。 図１９は、野生型ｐ５３配列における６２個のヌクレオチド断片に相当する７
量体ヌクレオチドのＰＥＡ産物で、部分的に重なり合ったセットを表している。 図２０は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、６２個ヌクレオチド断
片内における野生型およびＣ２４８１Ａｐ５３突然変異のＰＥＡＣＡ解析に関す
る質量スペクトルを表す。 図２１は、３７８ヌクレオチド断片における３つのｐ５３突然変異のＰＥＡＣ
Ａ解析についての質量スペクトルを表す。 図２２は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、６２個ヌクレオチド断
片内における野生型およびＣ２４８１Ａｐ５３突然変異のＸＬＡ解析に関する質
量スペクトルを表す。 図２３は、天然の６量体ヌクレオチド前駆体を用いた、３７８個ヌクレオチド
断片内における野生型およびＣ２４８１Ａｐ５３突然変異のＸＬＡ解析に関する
質量スペクトルを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 395 Ｐａｇｅ Ｍｉｌｌ Ｒｏａｄ Ｐ ａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 サンパス，ニコラス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95125， サンノゼ，チェリー・アヴェニュー 1418 (72)発明者 ツァレンコ，アンナ・エム アメリカ合衆国イリノイ州60637，シカゴ， イースト・フィフティーシックス・ストリ ート 1642，アパートメント 811 (72)発明者 マイヤーソン，ジョエル アメリカ合衆国カリフォルニア州94702， バークリー，ホプキンズ・ストリート 1320 (72)発明者 ウェッブ，ピーター・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州94025， メンロ・パーク，ウィロウ・ロード 345 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 CA10 HA14 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR56 QR84 QS28 QS34 QS39

Claims (68)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 天然または質量を変更されたＸ量体前駆体を含む混合物また
    は部分混合物のセットであって、 前記Ｘ量体前駆体の最小の長さが、３ヌクレオチドであり、 前記混合物が、前記混合物中の別個のＸ量体前駆体の数で５６を割って得られ
    る最小の混合物カバレージ複雑度または複合体混合物カバレージ複雑度を有して
    おり、 前記混合物の質量数複雑度が、前記混合物の任意の天然の同等物の質量数複雑
    度よりも大きく、 前記Ｘ量体前駆体の長さが、各Ｘ量体前駆体について独立に選択され、 前記混合物中の前記Ｘ量体前駆体の各々が、単一の化学種によって表される ことを特徴とする混合物または部分混合物のセット。
  2. 【請求項２】 天然または質量を変更されたＸ量体前駆体を含む混合物また
    は部分混合物のセットであって、 前記Ｘ量体前駆体の最小の長さが、３ヌクレオチドであり、 前記混合物が、前記混合物中の別個のＸ量体前駆体の数で５６を割って得られ
    る最小の混合物カバレージ複雑度または複合体混合物カバレージ複雑度を有して
    おり、 前記混合物の質量数複雑度が、前記混合物の任意の天然の同等物の質量数複雑
    度よりも大きく、 前記Ｘ量体前駆体の長さが、各Ｘ量体前駆体について無関係に選択され、 前記混合物中の前記Ｘ量体前駆体の各々が、単一の化学種によって表され、 前記Ｘ量体前駆体が定義された同位体組成を有する ことを特徴とする混合物または部分混合物のセット。
  3. 【請求項３】 前記混合物が、少なくとも１２８個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／２の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項１または２に記載の混合物。
  4. 【請求項４】 前記混合物が少なくとも２５６個の別個のＸ量体を含むとき
    、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／４の混合物カバレー
    ジ複雑度を有する請求項１または２に記載の混合物。
  5. 【請求項５】 前記混合物が少なくとも５１２個の別個のＸ量体を含むとき
    、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／８の混合物カバレー
    ジ複雑度を有する請求項１または２に記載の混合物。
  6. 【請求項６】 前記Ｘ量体前駆体が、イオン化タグを有する請求項１または
    ２に記載の混合物。
  7. 【請求項７】 前記混合物の組成が、既知である請求項１または２に記載の
    混合物。
  8. 【請求項８】 前記質量を変更されたＸ量体前駆体の少なくともいくつかが
    、少なくとも一つの質量タグか、またはヌクレオシド間結合、糖バックボーン、
    またはヌクレオシド塩基の少なくとも一つの化学的修飾を含んでなる請求項１ま
    たは２に記載の混合物。
  9. 【請求項９】 （１）天然および質量を変更されたＸ量体前駆体を含む混合
    物、または部分混合物のセットをハイブリッド形成するステップであって、 前記混合物が、前記混合物中の別個のＸ量体前駆体の数で５６を割って得られ
    る最小の混合物カバレージ複雑度または複合体混合物カバレージ複雑度を有し、 前記長さが、各Ｘ量体前駆体について独立に選択され、 前記混合物中の前記Ｘ量体前駆体の各々が、単一の化学種によって表わされ、 Ｘ量体前駆体が、３’末端と５’末端とを含む ことを特徴とするステップと、 （２）標的配列に媒介される反応における前記ハイブリッドの前記Ｘ量体前駆
    体部分の質量を変えるために、前記ハイブリッドをプロセシングするステップと
    、 （３）ステップ（２）の産物を質量スペクトルにより分析するステップと を含む標的核酸配列を分析する方法。
  10. 【請求項１０】 前記Ｘ量体前駆体が、定義された同位体組成を有する請求
    項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記混合物の前記質量数複雑度（MNC）が、前記混合物の
    任意の天然の同等物の質量数複雑度よりも大きい請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記混合物が少なくとも１２８個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／２の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記混合物が少なくとも２５６個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／４の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記混合物が少なくとも５１２個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／８の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項９に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記混合物が、少なくとも二つの反応混合物において提供
    される請求項９に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記質量を変更されたＸ量体前駆体の少なくともいくつか
    が、少なくとも一つの質量タグか、またはヌクレオシド間結合、糖バックボーン
    、またはヌクレオシド塩基の少なくとも一つの化学的修飾を含んでなる請求項９
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記プロセシングのステップが、前記混合物中の最も軽い
    Ｘ量体と最も重いＸ量体との質量差によって定義されるものより大きい量により
    、前記ハイブリッドの前記Ｘ量体前駆体部分の質量を変えることを含む請求項９
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 質量分析法による分析の前に、ステップ（２）の産物を精
    製するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 質量分析法による分析の前に、ステップ（２）の産物を分
    離するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ステップ（１）〜（２）が、溶液中で行われる請求項９に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ステップ（１）〜（２）が、表面に結合された混合物を用
    いて行われる請求項９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記産物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析さ
    れる請求項９に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記プロセシングのステップが、標的配列に媒介される酵
    素的分析を含む請求項９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記酵素的分析が、ポリメラーゼ伸長分析およびリガーゼ
    分析から選択される請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記プロセシングのステップが、前記ハイブリッド形成さ
    れたＸ量体前駆体の３’末端に少なくとも一つのヌクレオチドを重合させること
    により、前記ハイブリッド形成されたＸ量体前駆体を伸長することを含む請求項
    ９に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記プロセシングのステップが、前記ハイブリッド形成さ
    れたＸ量体前駆体の３’末端に一つのヌクレオチドを重合させることにより、前
    記ハイブリッド形成されたＸ量体前駆体を伸長することを含む請求項９に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 ハイブリッド形成されたＸ量体前駆体が、ヌクレオチドポ
    リメラーゼ活性を有する酵素を用いて伸長される請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ヌクレオチドが、鎖終結ヌクレオチド三リン酸である
    請求項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記鎖終結ヌクレオチド三リン酸が、天然のジデオキシヌ
    クレオチド三リン酸および質量を変更されたジデオキシヌクレオチド三リン酸か
    らなる群より選択されるヌクレオチドである請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記質量を変更したジデオキシヌクレオチド三リン酸の質
    量が、前記混合物において最も軽いＸ量体と最も重いＸ量体との質量差によって
    定義されるものよりも大きい請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 質量スペクトルによる分析に先立ち、ステップ（２）の産
    物を消化するステップをさらに含む請求項２５に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記ヌクレオチドが、伸長ヌクレオチド三リン酸、天然の
    ジデオキシヌクレオチド三リン酸、および質量を変更されたジデオキシヌクレオ
    チド三リン酸から選択されるヌクレオチドである請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記伸長ヌクレオチド三リン酸が、デオキシヌクレオチド
    、５’-(α)−フォスフォチオエート類似体、５’-Ｎ-α-ホスホロアミデート類
    似体、およびリボヌクレオチド類から選択されるヌクレオチドである請求項３2
    に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記消化のステップが、ヌクレアーゼを用いて行なわれる
    請求項３１に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ヌクレアーゼが、５’エキソヌクレアーゼである請求
    項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記５’エキソヌクレアーゼが、ＤＮＡポリメラーゼおよ
    びＴ７遺伝子６からなる群より選択される酵素である請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記消化のステップが、化学反応によって行なわれる請求
    項３１に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記プロセッシングのステップが、ＤＮＡリガーゼを用い
    て隣接するＸ量体前駆体を連結することを含む請求項９に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記プロセッシングのステップが、縮合剤を用いて隣接す
    るＸ量体前駆体を連結することを含む請求項９に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記縮合剤が、カルボジイミドおよび臭化シアン誘導体か
    らなる群より選択される請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記プロセッシングのステップが、化学分析を含む請求項
    ９に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 （１）標的核酸配列をアレイ（配列）における多様な核酸
    プローブにハイブリッド形成させるステップと、 ここで、前記アレイが、 （ａ）表面と、 （ｂ）（ｉ）前記表面に結合した切断可能なリンカーと、 （ｉｉ）３’末端および末端５’リン酸を有する核酸配列であって、前
    記核酸配列の前記３’末端が前記切断可能なリンカーに結合している核酸配列と
    を含む前記多様な核酸配列プローブと を含んでなり、 （２）天然および質量を変更されたＸ量体前駆体を含む混合物または部分混合
    物をハイブリッド形成させるステップと、 ここで、前記混合物が、前記混合物中の別個のＸ量体前駆体の数で５６を割っ
    て得られる最小の混合物カバレージ複雑度または複合体混合物カバレージ複雑度
    を有しており、 前記長さが各々のＸ量体前駆体について独立に選択され、 前記混合物中の前記Ｘ量体前駆体の各々が単一の化学種によって表わされ、 Ｘ量体前駆体が３’末端および５’末端を含み、 （３）ハイブリッド形成した前駆体／プローブ複合体を、それに結合した前記
    標的核酸配列とともに形成するべく、末端５’リン酸に隣接して局在する前記ハ
    イブリッド形成したＸ量体前駆体を、前記表面に結合プローブと連結するステッ
    プと、 （４）前記複合体を前記切断可能なリンカーにおいて切断するステップと、 （５）質量分析により前記複合体を分析するステップと を含む、３’末端と５’末端とを含む標的核酸配列を分析する方法。
  43. 【請求項４３】 前記混合物の前記質量数複雑度（MNC）が、前記混合物の
    任意の天然の同等物の質量数複雑度よりも大きい請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記混合物が少なくとも１２８個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／２の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記混合物が少なくとも２５６個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／４の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項４２に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記混合物が少なくとも５１２個の別個のＸ量体を含むと
    き、前記混合物または部分混合物のセットが少なくとも約１／８の混合物カバレ
    ージ複雑度を有する請求項４２に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記混合物の組成が、既知である請求項４２に記載の方法
    。
  48. 【請求項４８】 前記混合物が、少なくとも二つの反応混合物において提供
    される請求項４２に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記質量を変更されたＸ量体前駆体の少なくともいくつか
    が、少なくとも一つの質量タグか、またはヌクレオシド間結合、糖バックボーン
    、またはヌクレオシド塩基の少なくとも一つの化学的修飾を含む請求項４２に記
    載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記ハイブリッド形成したＸ量体前駆体が、ＤＮＡリガー
    ゼを用いて前記プローブと連結される請求項４２に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記ハイブリッド形成したＸ量体前駆体が、縮合剤を用い
    て前記プローブと連結される請求項４２に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記縮合剤が、カルボジイミドおよび臭化シアン誘導体か
    らなる群より選択される請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーである
    請求項４２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記切断可能なリンカーが、化学的切断が可能なリンカー
    である請求項４２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記複合体が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析
    される請求項４２に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ヌクレオチドポリメラーゼ活性を有する酵素と、 ｃ．天然の鎖終結三リン酸塩と質量を変更された鎖終結三リン酸塩とからなる
    群より選択される多様なヌクレオチドと を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  57. 【請求項５７】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、 ｃ．天然の鎖終結三リン酸塩と質量を変更された鎖終結三リン酸塩とからなる
    群より選択される多様なヌクレオチドと、 ｄ．多様な伸長ヌクレオチド三リン酸と を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  58. 【請求項５８】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、 ｃ．天然の鎖終結三リン酸塩と質量を変更された鎖終結三リン酸塩とからなる
    群より選択される多様なヌクレオチドと、 ｄ．ヌクレアーゼと を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  59. 【請求項５９】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、 ｃ．天然の鎖終結三リン酸塩と質量を変更された鎖終結三リン酸塩とからなる
    群より選択される多様なヌクレオチドと、 ｄ．ヌクレアーゼと、 ｅ．多様な伸長ヌクレオチド三リン酸と を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  60. 【請求項６０】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、 ｃ．天然の鎖終結三リン酸塩と質量を変更された鎖終結三リン酸塩とからなる
    群より選択される多様なヌクレオチドと、 ｄ．５’エキソヌクレアーゼと、 ｅ．多様な伸長ヌクレオチド三リン酸および５’-(α)-ホスフォチオエート類
    似体と を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  61. 【請求項６１】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡリガーゼと を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  62. 【請求項６２】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡリガーゼと、 ｃ．ヌクレアーゼと を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  63. 【請求項６３】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．縮合剤と を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  64. 【請求項６４】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．ＤＮＡリガーゼと、 ｃ．（ａ）表面と、 （ｂ）（ｉ）前記表面に結合した切断可能なリンカーと、 （ｉｉ）３’末端および末端５’リン酸を有しており、前記核酸配列の前
    記３’末端が切断可能なリンカーに結合している核酸配列と を含む多様な核酸配列プローブと を含むアレイと を含んでなる、３’末端および５’末端を有する標的核酸配列の分析法を行なう
    ためのキット。
  65. 【請求項６５】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．縮合剤と、 を含んでなる標的核酸配列の分析法を行なうためのキット。
  66. 【請求項６６】 ａ．請求項１の混合物と、 ｂ．縮合剤と、 ｃ．（ａ）表面と、 （ｂ）（ｉ）前記表面に付着した切断可能なリンカーと、 （ｉｉ）３’末端および末端５’リン酸を有しており、前記核酸配列の
    前記３’末端が切断可能なリンカーに結合している核酸配列と を含む多様な核酸配列プローブと を含むアレイと を含んでなる３’末端および５’末端を有する目的核酸配列の分析法を行なうた
    めのキット。
  67. 【請求項６７】 前記Ｘ量体前駆体が、イオン化タグを有する請求項９、１
    ０、または１１に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記鎖終結ヌクレオチドが、イオン化タグを有する請求項
    ２８に記載の方法。
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