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JP2002526057A - エンドフカナーゼ、並びにフカンからフコ−オリゴサッカリドを調製するためのエンドフカナーゼを使用する方法、エンドフカナーゼを生産する細菌並びに植物保護のためのフコ−オリゴサッカリドの使用 - Google Patents

エンドフカナーゼ、並びにフカンからフコ−オリゴサッカリドを調製するためのエンドフカナーゼを使用する方法、エンドフカナーゼを生産する細菌並びに植物保護のためのフコ−オリゴサッカリドの使用

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Publication number
JP2002526057A
JP2002526057A JP2000574124A JP2000574124A JP2002526057A JP 2002526057 A JP2002526057 A JP 2002526057A JP 2000574124 A JP2000574124 A JP 2000574124A JP 2000574124 A JP2000574124 A JP 2000574124A JP 2002526057 A JP2002526057 A JP 2002526057A
Authority
JP
Japan
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fuco
oligosaccharides
endofucanase
fucan
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000574124A
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English (en)
Inventor
ヴァレリー・デカン
オリヴィエ・クラルズィンスキ
トリスタン・バルベイロン
ベルナール・クローレック
ベルナール・フリティグ
ジャン−マリー・ジュベール
ベルトラン・プルッス
ジャン−クロード・イヴァン
Original Assignee
ラボラトワール・ゴエマー・ソシエテ・アノニム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ラボラトワール・ゴエマー・ソシエテ・アノニム filed Critical ラボラトワール・ゴエマー・ソシエテ・アノニム
Publication of JP2002526057A publication Critical patent/JP2002526057A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】 フカンの酵素的加水分解による、フコ−オリゴサッカリドの調製に適したエンドフカナーゼ、エンドフカナーゼを生産する細菌、並びに該細菌から開始する上記酵素の調製、エンドフカナーゼの遺伝子、並びに植物の保護のための上記フコ−オリゴサッカリドの使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フカンの酵素的加水分解による、フコ−オリゴサッカリドの調製に
適したエンドフカナーゼに関する。
【０００２】 本発明はまた、エンドフカナーゼを生産する細菌、並びに該細菌から開始する
上記酵素の調製に関する。
【０００３】 本発明はさらに、エンドフカナーゼの遺伝子に関する。
【０００４】 最後に本発明は、植物の保護のための上記フコ−オリゴサッカリドの使用に関
する。
【０００５】
【従来の技術】
フカンは、L-フコースに基づくポリサッカリドである。
【０００６】 褐藻類の細胞壁からフカンを抽出することが可能である。棘皮動物からフカン
を抽出することも可能である。
【０００７】 オリゴサッカリド分画は、フカンから開始する酸性若しくはラジカル加水分解
によって、すでに調製されている。
【０００８】 特定の低分子量の分画と並んで、フカンに関する各種の生物学的活性が研究さ
れている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明は、特定のフコ−オリゴサッカリド、その調製のための酵素、並びに植
物保護の分野におけるその使用に関する。
【００１０】 問題となるフコ−オリゴサッカリドは硫酸化されており、４から１００、好ま
しくは４から２０のα-Lフコース単位の重合度を有する；これらのフコ−オリゴ
サッカリドの二つは、図１に示される構造式Ｉ及びＩＩによって特徴付けされる
。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に従って、それらはエンドフカナーゼ、即ち本出願人会社が単離の利点
を有している酵素の機能の下で、フカンから開始する酵素的加水分解によって調
製される。
【００１２】 これらの酵素は、アルギネートの抽出のため植物の、有効に豊富な硫酸化フカ
ンの処理のために使用される産業上のマッドから開始される、本出願人会社によ
って得られたフカン溶解活性を提示する細菌株によって分泌される。
【００１３】 この点に関して、本出願人会社は、以下のように研究した。
【００１４】 下水の酸化及び沈殿若しくは傾瀉水から得られたマッド、若しくはアルギネー
トの抽出のための植物の下部に位置する精製植物を、２ｇ／ｌのフカンを含む濾
過海水に基づくプール媒体のための接種物として使用する。
【００１５】 かくして構成された培養培地の等量の部分に働きかけて、酸性媒体中に「血清
ウシアルブミン（若しくはＢＳＡ）を使用する」と称される試験を毎日実施する
。
【００１６】 この試験の原理は、正に荷電したアルブミンと酸性媒体中のアニオン性ポリサ
ッカリドが、完全な形成複合体の沈降を生ずるという事実に基づく。
【００１７】 これに対して、オリゴサッカリド及びオリゴサッカリドースは、不溶性複合体
の形成を引き起こすためにはその分子量があまりに小さいため、沈降も凝集もし
ない。
【００１８】 ＢＳＡ試験に関しては、６００μｌの培養上清を、１ｍｌの容量を有するミク
ロチューブに導入し、該ミクロチューブを遠心分離にかける。
【００１９】 上清、即ち５００μｌを別のチューブに移し、３．７２から３．７８のｐＨを
有する、３．２６ｇの酢酸ナトリウム、４．５６ｍｌの酢酸（「氷冷」）及び１
ｌの滅菌水中に１ｇのＢＳＡより成る酸性ＢＳＡの２ｍｌの溶液と混合する。
【００２０】 平行してコントロールを試験し、このコントロールは、接種物を含まない５０
０μｌの培養上清より成る。
【００２１】 上述の説明を考慮して、コントロールで生じるのと同等な濁りの形成は、ポリ
マーの分解が生じていないことを示す；これに対して、濁りが少ない若しくは存
在しない場合は、フコースの特異的な酵素活性が細菌培養物中に存在することが
結論付けられる。
【００２２】 該試験は、上述の接種物の存在下で、フコースのインキュベーションの７日後
に陽性であると気が付いた。
【００２３】 対応する培養培地の等量の部分を、２ｇ／ｌのフコースを補い、１５ｇ／ｌの
アガーで固化されたZobell培地(1941)より成る、Zobell-Fucaneという名称で周
知の培地を含むペトリ皿上に広げる。
【００２４】 Zobell培地[Zobell CE (1941) "Studies on marine bacteria, 1. The cultur
al requirements of heterotrophic aerobes" J. Mar. Res., 4: 41-75に印刷]
の組成は、以下の通りである： Bactoprptone Difco ５．０ｇ Difco yeast extract １．０ｇ 濾過海水 ８００ｍｌ 滅菌水 ｑ．ｓ．ｐ．１ｌ
【００２５】 ペトリ皿中で、特定数のコロニーの形成が検出され、これらのコロニーは互い
に異なり、多くの株に対応する。
【００２６】 これらのコロニーのそれぞれ、言い換えるとこれらの株のそれぞれを、当該培
地から初めに単離し、１／２容量のZobell及び１／２容量の濾過海水中に４ｇ／
ｌを含むフコースの溶液より成る、液体Zobell-Fucane培地に導入する。
【００２７】 Zobell-Fucane培地に導入されたかくして単離された株のそれぞれに対して、
ＢＳＡ試験を実施し、フカン溶解性の株を検出する。
【００２８】 試験が陽性である場合、株をZobell-Fucane培地に蒔き、それが新鮮な培地の
フカンを加水分解し続けるかどうかに付きチェックする；もしそうであるならば
、そのことは、フカナーゼの生産に必要とされる全ての遺伝的装置が存在するこ
とを意味する；その場合、株が基質によって誘導されることが考慮される；言い
換えると、培地中のフカンの存在は、株による酵素の生産を誘導する。このため
、ＢＳＡ試験を新鮮な培養物に対して再び実施する。
【００２９】 これに先行して、ＳＷ５と称され、Zobell-Fucane培地で培養した場合に３か
ら４日後で陽性のＢＳＡ試験結果を与える株を単離しておく。
【００３０】 記載された方法に従って選択された上述のＳＷ５株は、コレクションＤＳＭＺ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuituren GmbH、住所Masche
roder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany)において登録番号１２１７１の
下に寄託された。
【００３１】 該株は、グラム陰性桿菌であり、強力に好気性で、有機栄養体で、従属栄養菌
である。培養の３日後、Zobell-Fucane培地上のコロニーは小さく（直径１ｍｍ
）、オレンジ色を呈する。ＳＷ５株は生育のため海水を必要とし、その最適な生
育温度は約１８−２０℃である。１５℃以下の温度及び２５℃以上の温度では、
生育は全くみられない。ＳＷ５株の他の表現型的特徴は、以下の表１に示される
。
【００３２】 表１． ＳＷ５株の生理学的及び生物学的特徴
【表１】
【００３３】 ＳＷ５株の系統発生的関係は、ＡＲＮ１６Ｓをコードする遺伝子の配列番号１
のヌクレオチドによって確立されている。
【００３４】 この遺伝子の配列と、ＣＦＢ群(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides)の細
菌から得たホモローグ遺伝子の比較は、系統発生的ツリーの確立を可能にし、そ
れにより、該株がFlavobacteriaceae (Bernardet等, 1996 International Jouna
l of Systematic Bacteriology, Jan: 128-148)のファミリーに属することを表
し、南極の氷から単離された株であるGelidibacter algens (Bowman等, 1997, I
nternational Jounal of Systematic Bacteriology, July: 670-677)に近いこと
を表す。
【００３５】 上記フコ−オリゴサッカリドの調製のための本発明に従った方法は、フカンに
基づく原材料より成る基質が、DSMZコレクションに登録番号１２１７１で寄託さ
れた細菌株から入手可能なフカン溶解性酵素若しくはエンドフカナーゼを使用す
る、酵素的加水分解を受けるということによって特徴付けされる。
【００３６】 細菌ＳＷ５は、ｐＨ７．５に緩衝された培地若しくは水中で室温で使用できる
、十分量のフカナーゼ活性を培養培地中に分泌している。
【００３７】 基質、言い換えると酵素活性の作用を受けることが企図されるフカンの調製は
、以下のように実施される。
【００３８】 １５０ｋｇの量の褐藻Pelvetia canaliculataを、Urschel社により販売されCo
mitrol 2100と表される装置を使用して、２．５から３ｍｍの断片を得るために
すりつぶす。
【００３９】 これらの断片を、７０℃で３時間攪拌しながら４重量％のＣａＣｌ2を含む０
．０１Ｎの塩酸８００ｌを使用して抽出にかける。
【００４０】 かくして処理される藻類の断片の上清を、２時間３０分でデカントし、かくし
て得られた残余物を遠心分離にかける；遠心分離の後に得られた上清を、５０ｋ
Ｄａの膜で勾配限外濾過にかける。Minor Production社により販売されているMi
roと表される装置を使用した自動的な勾配限界濾過の最後で、残余物が得られる
。
【００４１】 上記自動化の結果として、特にフカンより成る粉体が得られる。
【００４２】 この粉体を、再溶解、遠心分離、エタノールでの上清の沈降、水中への沈降物
の再溶解、並びに３００００Ｄａの膜での水溶液の勾配限界濾過にかける。
【００４３】 上記限外濾過の最後に得られた残余物を、凍結乾燥にかけ、求めていた基質が
得られる；それはＦＳ２８ＥｔＯＨと表される。
【００４４】 その基質、言い換えるとフカン粉体を、細菌ＳＷ５から開始されて得られた酵
素活性にかける。
【００４５】 この点で、Ｔｒｉｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）緩衝液中に基質ＦＳ２８ＥｔＯ
Ｈの１ｇ／ｌを含む溶液を調製する；該溶液の５０μｌの量を取り、１０μｌの
タンパク分画と混合し、細菌ＳＷ５から開始して得られた酵素活性を含むかどう
かか試験する。
【００４６】 該混合物を室温で１時間維持する。
【００４７】 最終加水分解物は、問題となるフコ−オリゴサッカリドの混合物を含む。
【００４８】 加水分解物を、オリゴサッカリド分画の存在を示す定量的な態様で電気泳動に
かける；該電気泳動は、"Bot. Mar. "33:273-276に印刷された"A partially pyr
uvated carrageena from Hawaiian Grateloupia filicina (Cryptonemiales, Rh
odophyta)の文献においてZablackis E.とPerez J. (1990)によって開示されたＣ
−ＰＡＧＥと称される方法を使用して、ポリアクリルアミドゲル上で実施される
。
【００４９】 細菌ＳＷ５によって生産された酵素を使用する、得られたフカンの分解プロフ
ィールは、問題となる株の酵素活性が内溶解性型であることを示す；試験の間、
フカンが抽出された褐藻が何であれ、フカンは互いに類似した構造要素を含むこ
とに注意すべきである。
【００５０】 ＳＷ５株のエンド−フカナーゼ活性を、電気泳動により均質に精製した；問題
となるタンパク質は、約１０５ｋＤａの分子量を有すると測定された。
【００５１】 ３種の内部ペプチドが、ミクロシークエンスされた。
【００５２】 かくして配列番号２，３及び４のミクロシークエンスが得られた。
【００５３】 本発明はまた、配列番号２，３，４及び／または６のペプチドに対する類似す
る配列を含むことによって特徴付けされるエンドフカナーゼ、並びに配列番号５
のヌクレオチド配列に類似する配列を含むことによって特徴付けされるエンドフ
カナーゼ遺伝子に関する。
【００５４】 上記記載のエンド−フカナーゼ活性の精製は、Pharmacia社によりＦＰＬＣRの
名称で販売されている装置を使用して実施された；この装置は、４℃に配置され
た。
【００５５】 ５日間の６ｌのZobell-Fucane培地中のＳＷ５株の培養の後、０．４５μｍ(Mi
llipore)カートリッジでのMillipore社のPelliconタイプの装置でミクロ濾過を
実施し、次いで３００００ＤａのＰＴＧＣカートリッジを使用して勾配限外濾過
を実施した。
【００５６】 タンパク質の分画のため、以下の方法を実施する。
【００５７】 ゆっくりと４℃で緩く攪拌する０から４０％の第一の分画について、２４２ｇ
／ｌの濃度を有する（ＮＨ4）2ＳＯ4をタンパク質溶液に加える。全ての硫酸ア
ンモニウムが溶解した後、該溶液を遠心分離する；０から４０％の間の分画を表
す残余物は取得せず、さらに上清を４０から６０％の分画にかける。その分画は
、ゆっくりと４℃で穏やかに攪拌しながら、１３０ｇ／ｌの濃度で（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4の添加によって実施する。結晶が溶解したら直ぐに、溶液を遠心分離する；
飽和硫酸アンモニウムの４０から６０％の間のタンパク質分画を表す残余物を取
得し、Tris緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＣａＣｌ2５ｍＭ
、ＭｇＣｌ2５ｍＭ中に再溶解する。
【００５８】 飽和硫酸アンモニウムの４０から６０％の間の分画を、Tris緩衝液２０ｍＭ、
ｐＨ７．５で２０回希釈し、４０％の（ＮＨ4）2ＳＯ4で再飽和する。
【００５９】 かくして得られたサンプルを、１ｍｌ／分の速度でPhenyl Sepharose Cl4B Ph
armacisに基づく疎水性相互作用のクロマトグラフィーカラムに導入する。
【００６０】 カラムを事前にTris緩衝液ｐＨ７．５；４０％の（ＮＨ4）2ＳＯ4で平衡化す
る。カラムの３容量のTris緩衝液中で１．８Ｍ（４０％）から０Ｍで（ＮＨ4）2 ＳＯ4の濃度を減少することによって勾配を生じさせ、ついで（ＮＨ4）2ＳＯ4を
含まない２容量の緩衝液を使用する。
【００６１】 各タンパク分画を、フカンＦＳ２８ＥｔＯＨの加水分解のために使用する。加
水分解産物を、塩を含むTris緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ７．５中に１ｇ／ｌの濃度で
のフカンの溶液に上記分画の添加によって、上述のように調製する。ついで加水
分解を、Ｃ−ＰＡＧＥ法を使用して試験する。「Ｃ−ＰＡＧＥで陽性」と称され
る分画は、オリゴ−フコサッカリドの分画を含む電気泳動プロフィールを生ずる
ものである。
【００６２】 ポリアクリルアミドゲルにおいて陽性分解プロフィールを提供する分画を集め
、Tris緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ７．５；ＮａＣｌ５ｍＭで５回希釈子、その後、Ph
armacia社によって販売されているDEAE Sepharose CL6Bを搭載したアニオン交換
のためのクロマトグラフィーカラムに注入する。
【００６３】 タンパク質を、１ｍｌ／分でカラムの３容量において５ｍＭから１ＭのＮａＣ
ｌ勾配によって溶出する。
【００６４】 次いでこれらの分画を、Pharmacis社によって販売されるSuperdex 200ゲルを
搭載し、事前にリン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．０；ＮａＣｉ１５０
ｍＭで０．５ｍｌ／分で平衡化された濾過カラムに１００μlの量で導入する。
【００６５】 Ｃ−ＰＡＧＥ法によって同定された活性分画を集め、タンパク質の純度をPhar
macia社のPhasr-SystemR装置を使用して１２．５％のＳＤＳゲルで測定する。使
用された分子マーカーは、Biorad社により"broad-range"の名称で販売されてい
る１４．５から２００ｋＤａのスタンダードである。
【００６６】 配列番号３及び配列番号４のタンパクミクロ配列から開始して、オリゴヌクレ
オチドを合成した；これらのオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖
反応）によるフカナーゼをコードする遺伝子の断片の合成のための開始材料とし
て使用し、ＳＷ５株の精製ＤＮＡは、反応のためのマトリックスの機能を果たし
た。
【００６７】 これらの開始材料ペアの特異的ＰＣＲ産物を配列決定した。
【００６８】 それらの一つが、配列番号５のヌクレオチド配列を表す。
【００６９】 ６７アミノ酸の長さを有する由来するタンパク質配列は、配列番号３及び配列
番号４のミクロ配列を含み、そのことはＳＷ５株のフカナーゼの断片であること
を意味する。
【００７０】 従って、配列番号５のヌクレオチド配列は、２０３ヌクレオチドの長さを有す
る遺伝子の一部であり、ＳＷ５株のフカナーゼをコードする。
【００７１】 フコ−オリゴサッカリドの調製のために、いくつかの方法を使用することが可
能であり、その中の二つが以下に記載される。
【００７２】 第一の方法に従って、酵素は２４時間で基質の完全な消費を達成するまで作用
する；Pelvetia canliculateのフコシダーゼを、部分的に精製した酵素の存在下
でインキュベーションし、ついで加水分解産物を、５００Ｄａの膜で限外濾過す
る。Ｉ２７と称される分画を、かくして得る。
【００７３】 実際的な立場からみると、Pelvetia canaliculataから抽出されたフカン（Ｆ
２８ＥｔＯＨ分画）を、Tris緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ７．５；ＮａＣｌ５０ｍＭ；
ＭｇＣｌ2５ｍＭ中に５ｇ／ｌの濃度を有する基質の１リットルに対して、４０
−６０％の硫酸アンモニウムと酵素の沈降物の３０ｍｌ（３．０２ｍｇのタンパ
ク質）の量の添加によって、２４時間で室温で加水分解する。
【００７４】 かくして得られた加水分解産物を、２０ｌまで蒸留水で補い、６．５バールの
浸入圧と５．５バールの排出圧で、Millipore社の０．４６ｍ2ＰＴＧＣカートリ
ッジを使用して、１００００Ｄａの勾配限外濾過システムで限外濾過にかける。
【００７５】 かくして得られた限外濾過物を回収し、回路の侵入で１バール、出口でゼロに
等しい圧力を有するPall Filtron社による商標名Omega Centraset OM500DC05の
下で販売されている装置を使用して、５００Ｄａで再び限外濾過する。
【００７６】 オリゴマーの分画のために、残余物を再び５００Ｄａで限外濾過し、しかし圧
力は浸入時で２．５バール、排出時で２バールである。
【００７７】 ５００Ｄａ（約２０ｌ）の膜を通過した濾過物を、次いで回転蒸発器で濃縮し
、炭酸アンモニウムで中和し、次いでSecfroid社により商標名Lyolab A LSLで販
売されている装置を使用して凍結乾燥する。かくして得られた凍結乾燥物は、Ｉ
２７と称されるオリゴフカンを含む。
【００７８】 かくして得られたＩ２７の分画のオリゴフカンを、イオン交換クロマトグラフ
ィー及び排除クロマトグラフィーによって補足的な分画にかける。
【００７９】 商標名BIOGEL P6のゲルで得られた排除クロマトグラフィー物を、図２の図面
に再提供し、該図は、ｘ軸がｍｌ単位で表される溶出容量（Ｖｅ）、ｙ軸が屈曲
指数（ＲＩ）オージー溶出物を示す。
【００８０】 かくして得られたオリゴサッカリドの構造（クロマトグラムの１Ａから４Ａ）
を、二次元ＲＭＮによって分析した。
【００８１】 ４Ａ及び３Ａのそれぞれは、α（１−＞３）及びα（１−４）結合で結合し、
炭素原子２で硫酸化されたそれぞれフコース残基によって形成されたテトラサッ
カリド及びヘキササッカリドに対応する（図１）。
【００８２】 ２Ａ及び１Ａは、考慮される範囲で、同じホモローグシリーズのオリゴサッカ
リドの可変的ＤＰの混合物を構成するが、側鎖を有する可能性がある。
【００８３】 この結果により、開始材料のポリサッカリドが、今日まで開示されていないα
-L-Fuc-2-硫酸-1->3-α-L-Fuc-2-硫酸-1->4の繰り返しによって少なくとも部分
的に構成されていることが示唆される。
【００８４】 第二の方法は、連続的な加水分解を含む；その方法は、３０ｋＤａの限外濾過
膜を使用し、オリゴフカンが形成される場合、オリゴフカンを酵素の作用から引
き離すことより成る。かくして得られた分画は、「Ｉ２５分画」と称され、Ｉ２
７分画を構成するものより高い分子量のオリゴフカンを含む。
【００８５】 実際的な観点から、基質（５０ｇのＦＳ２８ＥｔＯＨ）を１０リットルの滅菌
水に溶解する。
【００８６】 加水分解を実施するために、２リットルの基質中に４０から６０％の飽和の硫
酸アンモニウムによって沈降された分画の形態で２５ｍｌの酵素を使用する；連
続的な限外濾過を３０分後に開始する。
【００８７】 勾配限外濾過のため、３００００Ｄａのカートリッジを含む商標名Pelliconの
装置を使用し、上記装置を加水分解の全継続時間を通じて１バールの浸入圧、０
バールの排出圧に調節する。
【００８８】 濾過物の排出を、２ｌ／ｈで濾過物は移出を維持するために部分的に停止する
。
【００８９】 反応容器の特徴的特性を、１０リットルの消耗と、２リットルの固定加水分解
容量の維持まで、基質と酵素を供給させるように選択する。
【００９０】 濾過物がもはやオリゴマーを含まなくなるまで継続的に蒸留水（８リットル）
の添加によって、加水分解を継続する。
【００９１】 限外濾過物の１８リットルの量をかくして得、２バールの浸入圧と０の排出圧
で、５００Ｄａのカートリッジを備えたPellicon装置を使用して、約１リットル
に濃縮する；２００ｍｌまでの補足的濃縮を、回転蒸発器で実施し、次いで濃縮
物を中和して凍結乾燥する。
【００９２】 低分子量分画（即ち５００Ｄａの膜を通過するにに適した）を含む濾過物は取
得しない。
【００９３】 Ｉ２５分画は、５００Ｄａと３００００Ｄａの間の通過を維持するオリゴフカ
ンを表す。
【００９４】 植物に対するＩ２７及びＩ２５分画の生物学的活性を調べた。
【００９５】 これらの分画の直接的誘因効果を、タバコＢＹ細胞の培養物に対して分析した
。
【００９６】 防御反応の５個の特徴点が、以下に独立して試験された： − 培養培地のアルカリ化（植物をオリゴサッカリド誘因子の存在下でインキュ
ベーションした際に直ぐに観察される応答）； − 植物においてフィトアレキシンの合成のためのキーとなる酵素である「フェ
ニルアンモニアリアーゼ」（ＰＡＬ）の活性レベル； − リグニンの合成において上昇する酵素であるO-メチルトランスフェラーゼ（
ＯＭＴ）の活性レベル； − 防御遺伝子の活性化を引き起こすシグナル伝達の構成要素の一つである、ジ
ャスミン酸メチルの生産において上昇する酵素であるリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ
）の活性レベル；並びに − 防御反応において上昇する他の第二のメッセンジャーであるサリチル酸（Ｓ
Ａ）の含有量。
【００９７】 ２００ｍｇ／ｌの投与量で投与されたＩ２７分画は、１から１．５ｐＨ単位で
タバコ細胞の培養培地のアルカリ化を誘導する。非処理細胞については、ＰＡＬ
とＯＭＴの活性はそれぞれ、培養培地へのＩ２７の添加の４時間から８時間の間
で５０から６００倍及び２．０から２．８倍まで刺激される。
【００９８】 ２００ｍｇ／ｌの投与量でＩ２７の添加の１８時間後に測定したＬＯＸ活性は
、コントロール細胞のものより７倍大きい。同様に、処理の開始の３時間後、サ
リチル酸の含有量は、非処理細胞のものより７０倍大きい。
【００９９】 流自体の結果は、Ｉ２５分画を使用して観察された。ＬＯＸ活性のより強い刺
激が観察されたが、コントロールに対して５５倍の増加割合であった。
【０１００】 図３は、タバコＢＹ細胞におけるＰＡＬ活性の刺激に対するＩ２５分画の影響
を示す；図３は、３種の濃度、即ち２００ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ及び１０ｍｇ
／ｌと、コントロールについて時間で表された時間の関数における、細胞上性の
新鮮な体積のｇ辺りのピコカタール（ｐＫａｔ／ｇ）で表される活性の変数を示
す。
【０１０１】 図３を精査することにより、１０ｍｇ／ｌの濃度は、誘導されないコントロー
ルに対して顕著な刺激を同定するのに十分であることが示され、応答の飽和が５
０ｍｇ／ｌより高い濃度で観察される。
【０１０２】 これらの実験の結果は、本発明に従ったオリゴフカンが、タバコ細胞によって
誘因子として認識されることを示す。
【０１０３】 非処理細胞について、それらは非常に強い態様で、ＰＡＬ、ＬＯＸ及びＯＭＴ
活性、並びにＳＡの含有量を刺激する（即ち、オリゴペクチン及びオリゴα１−
３グルカンのような他の誘因子のものと匹敵する割合で）。
【０１０４】 Ｉ２５分画の誘因効果はまた、コムギ細胞上清で分析された。
【０１０５】 この分画はＰＡＬ活性を誘導することを示した。
【０１０６】 この点で、２００ｍｇ／ｌの濃度で、Ｉ２５は処理の２から６時間の間でＰＡ
Ｌ活性を１５から２０倍まで刺激した。
【０１０７】 ５０ｍｇ／ｌの投与量でさえ、処理の４時間で４倍までＰＡＬ活性を刺激する
。
【０１０８】 Ｉ２５はまた、パセリ細胞上清のＰＡＬ活性を誘導する。
【０１０９】 ２００ｍｇ／ｌの濃度で、Ｉ２５は処理の４から６時間の間でＰＡＬ活性を１
５から３０倍刺激した。
【０１１０】 ２０ｍｇ／ｌの投与量でさえ、処理の４時間後で、５倍までＰＡＬ活性を刺激
する。
【０１１１】 別の一連の実験によって、タバコの葉に浸透したフコ−オリゴサッカリドが、
ＶＭＴ（タバコモザイクウイルス）に対して保護することが示されている。この
実験は、以下のように実施した。
【０１１２】 Ｉ２５で表されるフコ−オリゴサッカリドの分画（２００ｍｇ／ｌ）を、２週
齢の３種のタバコの葉（下から数えて第４葉、５葉及び６葉）にシリンジを使用
して浸透させる。
【０１１３】 浸透の５日後、ＶＭＴとのインキュベーションを、第５葉、６葉及び７葉で実
施し、第４葉をコントロールとする。
【０１１４】 インキュベーションの一週間後、試験された植物と水でのみ処理された植物の
葉の傷の数（ＮＬ）とこれらの傷のサイズ（ＴＬ）を測定した。
【０１１５】 以下の表２は、上述の二つの指標に従った保護のパーセンテージを示す。
【０１１６】 表２． フコ−オリゴサッカリドによるＶＭＴに対するタバコの保護
【表２】
【０１１７】 第４葉は、傷を示さない。
【０１１８】 表に示された結果から、Ｉ２５で浸透された葉（第５葉及び６葉）において保
護が誘導され、フコ−オリゴサッカリドを受けなかった第７葉では誘導されなか
ったと結論付けることができる。
【０１１９】 かくして、全身性の保護を証明することが可能である。
【０１２０】 コムギ、パセリ及びタバコでの二つの一連の実験から、フコ−オリゴサッカリ
ドは、タバコの場合だけでなく、コムギとパセリの場合においても天然の防御マ
ーカーである酵素活性を刺激することが明らかである。
【０１２１】 この刺激は、ＶＭＴに対して、及びおそらく他の病原性試薬に対して、全身性
の保護を引き起こす。
【０１２２】 説明のために、以下に二つの実施例を記載する。
【０１２３】
【実施例】
実施例１ オリゴフカンに基づく農業のための液体濃縮物： オリゴフカンＩ２５ ０．２００ｋｇ Ｔｗｅｅｎ８０１ ０．００５ｋｇ 固体メチルパラベン ０．００５ｋｇ 水 ０．７９０ｋｇ 合計 １．０００ｋｇ
【０１２４】 この濃縮物は、１０ｇから１０ｋｇの間、好ましくは２０ｇから５ｋｇの間、
さらに好ましくは１００ｇから１ｋｇの間を含む量に対して、水の１０００リッ
トルで希釈の後使用される；この希釈物は、１０００ミリリットルの水に対して
、２から２０００ｇ、好ましくは２０から２００ｇの間で含まれるオリゴフカン
Ｉ２５の含有量に相当する。
【０１２５】 実施例２ 活性基質としてＩ２７加水分解物並びにアジュバントを含む可溶性濃縮粉体
【０１２６】 １ｋｇ重量／重量に対して、この粉体の構成成分は以下のように定義される： オリゴフカンＩ２７ ０．２００ｋｇ カオリン ０．４９５ｋｇ マンノース ０．０５０ｋｇ 固体メチルパラベン ０．００５ｋｇ 精製デンプン ０．２５０ｋｇ 合計 １．０００ｋｇ
【０１２７】 この粉体は、１０００リットルの水に対して２から５０００ｇ、好ましくは２
０ｇから１００ｇの間のオリゴフカンＩ２７を含む組成物を得るのに十分量の水
で希釈の後使用される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、α（１−＞３）及びα（１−４）結合で結合し、炭素
原子２で硫酸化されたそれぞれフコース残基によって形成されたテトラサッカリ
ド及びヘキササッカリドを表す図である。
【図２】 図２は、ｘ軸がｍｌ単位で表される溶出容量（Ｖｅ）、ｙ軸が
屈曲指数（ＲＩ）オージー溶出物を示す、商標名BIOGEL P6のゲルで得られた排
除クロマトグラフィー物を表す。
【図３】 図３は、タバコＢＹ細胞におけるＰＡＬ活性の刺激に対するＩ
２５分画の影響を示す；３種の濃度、即ち２００ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ及び１
０ｍｇ／ｌと、コントロールについて時間で表された時間の関数における、細胞
上性の新鮮な体積のｇ辺りのピコカタール（ｐＫａｔ／ｇ）で表される活性の変
数を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トリスタン・バルベイロン フランス・Ｆ−29233・クレデル・リュ・ ドゥ・ラ・ギャレン・30 (72)発明者 ベルナール・クローレック フランス・Ｆ−29420・プルエナン・ペ ン・アル・フウントゥウン（番地なし) (72)発明者 ベルナール・フリティグ フランス・Ｆ−67460・スッフェルウェイ エルスハイム・リュ・オワルド・６ (72)発明者 ジャン−マリー・ジュベール フランス・Ｆ−35400・サン・マロ・リ ュ・ゲリル・デュ・パプー・13 (72)発明者 ベルトラン・プルッス フランス・Ｆ−67000・ストラスブール・ リュ・サン・テルハルド・23 (72)発明者 ジャン−クロード・イヴァン フランス・Ｆ−35400・サン・マロ・リ ュ・ガブリエル・デグレ・３ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA11 CA04 GA30 HA12 4B050 CC01 DD02 EE02 KK15 LL05 4B064 AF04 AF11 CA02 CA21 CC03 CD19 CE15 CE16 DA11 4B065 AA01X AC12 AC14 BA22 BB18 CA21 CA31 CA47 CA53 (54)【発明の名称】 エンドフカナーゼ、並びにフカンからフコ−オリゴサッカリドを調製するためのエンドフカナー ゼを使用する方法、エンドフカナーゼを生産する細菌並びに植物保護のためのフコ−オリゴサッ カリドの使用

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コレクションＤＳＭＺに登録番号１２１７１で寄託されたグ
    ラム陰性桿菌株。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の細菌株から開始して入手可能なエンドフカナ
    ーゼ。
  3. 【請求項３】 配列番号２，配列番号３，配列番号４及び／または配列番号
    ６のペプチドに類似する配列を含むことによって特徴付けされるエンドフカナー
    ゼ。
  4. 【請求項４】 配列番号５のヌクレオチド配列と類似する配列を含むことに
    よって特徴付けされるエンドフカナーゼ遺伝子。
  5. 【請求項５】 請求項２または３記載の少なくとも一つのエンドフカナーゼ
    を使用する酵素的加水分解工程を含むことによって特徴付けされる、α-Lフコー
    ス単位、特に図１に表される式（Ｉ）及び（ＩＩ）に相当するフコ−オリゴサッ
    カリドの４から１００，好ましくは４から２０より成る重合度を有する、硫酸化
    フコ−オリゴサッカリドの調製方法。
  6. 【請求項６】 α-Lフコース単位、特に図１に表される式（Ｉ）及び（ＩＩ
    ）に相当するフコ−オリゴサッカリドの４から１００，好ましくは４から２０よ
    り成る重合度を有する、または請求項５記載の方法によって得られる、十分量の
    硫酸化フコ−オリゴサッカリドを含む植物保護のための植物製薬組成物。
  7. 【請求項７】 α-Lフコース単位、特に図１に表される式（Ｉ）及び（ＩＩ
    ）に相当するフコ−オリゴサッカリドの４から１００，好ましくは４から２０よ
    り成る重合度を有する、または請求項５記載の方法によって得られる、硫酸化フ
    コ−オリゴサッカリドの植物の保護の処理のための使用。
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