JP2002525123A

JP2002525123A - Ａｔｐを検出する方法

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Publication number: JP2002525123A
Application number: JP2000572400A
Authority: JP
Inventors: ファンルネハリー; テルウィエルヤン
Original assignee: パッカードバイオサイエンスベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2002-08-13
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: US6503723B1; EP1117825B1; WO2000018953A1; NL1010224C2; DE69924127T2; AU6231999A; AU754602B2; IL142003A0; ATE290604T1; CA2345721A1; JP4637357B2; EP1117825B2; CA2345721C; EP1117825A1; IL142003A; DE69924127D1; DE69924127T3

Abstract

(57)【要約】【課題】サンプル中のＡＴＰを検出する方法を提供する。【解決手段】サンプルを、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つまたはそれ以上の水溶性塩類を含み、全塩濃度が少なくとも０．０５モル／リットルである反応混合物と接触させて光信号を生じせしめ、この光信号を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明はＡＴＰを検出する方法およびこの方法に使用するキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】

ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を検出する公知の方法は生物ルミネセンスを利
用するものである。ルシフェラーゼ／ルシフェリン有機物の生物ルミネセンスは
公知であり、ここでルシフェリンはオキシルシフェリンに変換される。この変換
では酵素ルシフェラーゼが触媒的に作用する。

【０００３】公知のルシフェラーゼは蛍、ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒ
ａｌｉｓ）から生成する。このルシフェラーゼは約６０，０００ダルトンの分子
量を有し、約５５０のアミノ酸を含む酵素である。この酵素の基質はルシフェリ
ンであり、これもまた蛍から生成する。これはポリヘテロ環有機酸、Ｄ−（−）
−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ²−チアゾリン−４
−カルボン酸である。

【０００４】ルシフェラーゼが触媒的に作用する生物ルミネセンス反応は次のように進行す
るものと推定される。

【０００５】

【化１】

【０００６】ここで、ＰＰはピロホスフェートであり、ＡＭＰはアデノシン一リン酸である
。オキシルシフェリンは最初励起された状態で製造され、基底状態に戻るときに
、光が放出される。

【０００７】ＡＴＰが培地に存在するとき、ＡＴＰの量はルシフェリン・ルシフェラーゼ反
応によって決定することができる。ＡＴＰまたはＡＴＰ含有培地をルシフェリン
、ルシフェラーゼ、マグネシウムイオンおよび酸素を含む組成物に添加すると、
試薬の選択された組成に応じて、短くて、強い光信号が得られる。２、３秒間は
、比較的安定した光ということができる。反応速度の低下は生成物の阻害による
ものと推定される。

【０００８】注入システムによって、ＡＴＰ含有サンプルをルシフェリン・ルシフェラーゼ
反応用の試薬を含む組成物に添加すると、サンプル中のＡＴＰの濃度を決定する
ことができる。この測定システムの欠点は、ミクロ滴定プレートを用いると、各
ウェル（ｗｅｌｌ）を別々に、すなわちウェル毎に測定しなければならないこと
である。これは時間のかかる仕事である。ＡＴＰ含有サンプルを多くの反応容器
、あるいはミクロ滴定プレートのウェルに添加して測定すると、測定される最後
の容器あるいはウェルの光信号は既に全くあるいは大幅に消えてしまっているで
あろう。

【０００９】したがって、比較的安定した光信号がルシフェリン・ルシフェラーゼ反応にお
いて得られることが好ましい。光信号がより長い間安定であると、注入システム
を必要としないプレート・ルミノメータを使用することができる。さらに、ほん
の僅かな時間の後で光信号を測定するために、多数の反応容器あるいはミクロ滴
定プレートを用意することができる。光信号は種々のサンプル中のＡＴＰの量の
基準となる。

【００１０】本発明の目的は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを決定する
方法であって、反応中の光放出の持続時間が著しく延長された方法を提供するこ
とにある。

【００１１】文献には、ルシフェラーゼ反応における光信号の持続時間に影響を及ぼし、ま
た延長させるための多くの試みが記載されている。

【００１２】ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に影響を及ぼ
し、光放出の時間を延長する一つの方法は、ルシフェラーゼ酵素の阻害剤を利用
する。大いに注目されている阻害剤の例はヒ酸塩である。ヒ酸塩はフラッシュの
強度を低下させ、またその長さを延長する。しかし、ＡＴＰを検出する反応の感
度もまた低下する。また、ヒ酸塩の使用は環境の面から望ましいものではない。
さらに、光信号の強度の低下は、特にミクロ滴定プレート、あるいはストリップ
（ｓｔｒｉｐ）を読み出すことのできる装置を用いるときに、望ましくないと考
えられる。

【００１３】ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の速度はデルカ（ＤｅＬｕｃａ）などによ
り、分析化学（ＡｎａｌｉｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９５巻，１９４
〜１９８頁，１９７９年で研究されている。ヒ酸塩およびその他のイオンの添加
効果が著者により示されている。しかし、提案された方法の欠点は、光強度の減
少が、ＡＴＰの決定の広範囲の濃度にわたり非線形関係にあることである。

【００１４】米国特許第５，６１８，６８２号明細書には、ルシフェラーゼを検出する方法
が開示されているが、ここではＡＴＰを含む反応混合物が用いられている。この
反応混合物は、ＡＴＰに加えて、アデノシン一リン酸、ラジカル捕捉剤（ＤＴＴ
）、ジチオトレイトール、およびキレート化剤（ＥＤＴＡ）を含有している。プ
ロテアーゼ阻害剤、例えば、フェニル酢酸もまた用いられる。

【００１５】もう一つの方法は、共酵素Ａ（ＣｏＡ）の使用を選択するものである。「ビオチミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ」（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ
ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ）、２７巻（１９５８年）、５１９〜５３２頁
では、エールス（Ａｉｒｔｈ）等が、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応混合物
へのＣｏＡの添加は光フラッシュへの効果はないが、フラッシュ後の光信号の強
度はより長時間より高いレベルにとどまると述べている。

【００１６】この方法は米国特許第５，６５０，２８９号明細書にも記載されており、ここ
ではルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の速度に影響を及ぼす技術および反応混
合物の組成が提案されている。ここに述べられた技術はＣｏＡおよびＤＴＴの使
用に基づくものである。光信号の半減期、すなわち元の光信号が５０％となる時
間が３００〜５００秒に決められている。

【００１７】米国特許第４，２４６，３４０号明細書もまた２、３分の、ルシフェリン−ル
シフェラーゼ反応における光信号の半減期を得る方法を提案している。ここに述
べられた方法は、阻害剤、例えば、Ｄ−ルシフェリン類似体の使用に基づくもの
である。その一例はＬ−ルシフェリンである。

【００１８】

【発明の課題および課題を解決するための手段】

既に述べたように、本発明の目的は、従来技術で述べられているよりも著しく
長く続く光信号が得られる、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によりＡＴＰを
検出する改良された方法を提供することにある。さらに、簡単で、ミクロ滴定プ
レートのウェルで行うことのできる方法を提供することが本発明の目的の一つで
ある。

【００１９】驚くべきことに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を、添加した塩から生成
する比較的多量のアニオン類およびカチオン類の存在下に、行うことにより上記
目的が達成できることがわかった。アニオン類およびカチオン類はルシフェラー
ゼ酵素の非競合的阻害を行い、これにより光信号の持続時間が少なくとも３０分
、８時間を超えるまでに延長される。

【００２０】かくして、本発明は、サンプルを、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ
またはそれ以上の水溶性塩類を含み、全塩濃度が少なくとも０．０５モル／リッ
トルである反応混合物と接触させて光信号を生じせしめ、この光信号を測定する
、サンプル中のＡＴＰを検出する方法に関する。

【００２１】

【発明の実施の形態】

本発明によるＡＴＰの検出においては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で
生成する光信号は、ＡＴＰが存在するとき、３０分から８時間以上の半減期を有
することがわかった。本発明の方法によれば、ＡＴＰをいかなる適当なタイプの
容器のなかでも正確かつ簡単に測定することができるが、この方法は、ミクロ滴
定プレートのウェル、あるいは液体シンチレーション計測器において特に適当に
用いられる。

【００２２】ルシフェラーゼとは、ルシフェリンの酸化を触媒的に進める酵素を意味し、こ
の酸化は光信号の生成をもたらす。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼを生産す
る生物から単離することができる。ルシフェラーゼはまたルシフェラーゼをコー
ド化するポリヌクレオチドで形質転換もしくは形質変換された細胞から回収する
ことができる。好ましくは、蛍、ホチヌス・ピラリスのルシフェラーゼが用いら
れる。

【００２３】ルシフェリンとは、物質、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベン
ゾチアゾリル）−△²−チアゾリン−４−カルボン酸を意味する。ルシフェリン
もまた自然から単離することができる。しかし、化学的に合成したルシフェリン
を使用するのが、入手の容易さおよび高純度のために、好ましい。

【００２４】既に述べたように、本発明によれば、ＡＴＰの存在を評価すべきサンプルをル
シフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ以上の水溶性塩類を含む反応混合物と接
触させる。

【００２５】この反応混合物においては、ルシフェリンは通常０．０１〜１ｍＭ、好ましく
は０．０５〜０．５ｍＭの量で存在する。酵素ルシフェラーゼは通常反応混合物
のリットル当たり、０．０００３〜０．０５、好ましくは０．００１〜０．０３
ｇの量で存在する。

【００２６】好ましくは、反応混合物はマグネシウムイオンを含むとよい。マグネシウムイ
オンはリットル当たり少なくとも０．０００５モルの量で存在する。通常、マグ
ネシウムイオンの量はリットル当たり０．２モルより多くはない。

【００２７】反応混合物中の塩類の合計量は少なくとも０．０５モル／リットル、好ましく
はリットル当たり少なくとも０．１０モルである。多量の塩類が存在すると、ル
シフェリン・ルシフェラーゼ反応で生成する光信号が半時間あるいはそれ以上ま
で延長されることがわかった。

【００２８】反応混合物中の塩類の量は、もちろん、塩類のイオンがルシフェラーゼの阻害
を引き起こすことのできる程度に依存する。さらに、塩類が反応混合物中に全部
溶解することが重要である。したがって、用いられる塩類の最大量は、特に、選
択した塩類の溶解度によって決定される。

【００２９】原則として、全ての水溶性塩類を選べる。適当な塩類の例は、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、
ＳＯ₄ ^2-、ＨＳＯ₄ ^-、ＨＰＯ₄ ^2-、Ｈ₂ＰＯ₄ ^-、ＮＯ₃ ^-およびＨＣＯ₃ ^-のアルカリ
金属塩またはアルカリ土類塩金属である。Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ＮａＨ₂ＰＯ₄およびＮ
ａＣｌの塩溶液を用いるとよい結果が得られる。好ましくは、反応混合物中のＮ
ａＣｌの濃度は約１００ｍＭである。

【００３０】既に述べた物質とは別に、反応混合物はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に
用いられる全ての通常の物質を含んでいてもよい。反応混合物は、適当な緩衝剤、例えば、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、
ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＨＡＰＳ、あるいはリン酸塩を含むのが好ましい。好ま
しくは、ＨＥＰＥＳ、またはこれら緩衝剤の混合物が用いられる。このような緩
衝剤はｐＨを適当な値に維持することができる。好ましくは、ｐＨを６．５と８
．２の間に維持する。緩衝剤の量は当業者によって適宜選択することができ、通
常、２５ｍＭないし１Ｍの範囲にある。

【００３１】さらに、反応混合物はルシフェラーゼの安定剤を含むのが好ましい。安定剤の
適当な例としては、ほ乳動物の血清アルブミン、ラクトアルブミンおよびオバル
ブミンがある。好ましくは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が用いられる。安定剤
の量は、反応混合物の質量に基づいて、１質量％以下である。

【００３２】さらに、反応混合物は、ＥＤＴＡあるいはＣＤＴＡなどの金属イオン封鎖剤を
含むのが好ましい。このような物質は０．１〜１０ｍＭの量で存在するのが好ま
しい。

【００３３】上述の反応混合物と接触させるサンプルは、原則として、ＡＴＰの存在を評価
すべきサンプルであればいずれでもよい。ＡＴＰは、例えば、緩衝溶液に溶解し
た状態で存在する。

【００３４】特殊なケースにおいては、サンプルは、例えば、細胞培養から生成する、生物
学的性質のものである。生きた細胞は、知られているように、ＡＴＰを含んでい
る。もしサンプルが細胞を含んでいるならば、予め細胞中に存在するＡＴＰを放
出し、検出できるように、サンプルを細胞溶解に供さなければならない。

【００３５】細胞を含むサンプル中のＡＴＰを検出する際の問題は、細胞は、通常、検出す
べきＡＴＰを分解し、そのため測定に支障を来すＡＴＰ消費酵素、例えば、ＡＴ
Ｐアーゼを含むことである。本発明によれば、ＡＴＰアーゼのかく乱効果は、細
胞溶解をアルカリ性培地で、好ましくは非イオン洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）
を利用して、行うことにより取り除くことができることがわかった。特に好適な
溶解洗浄剤はノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＮ１０
１−米国登録商標））およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００であった。

【００３６】本発明が完成される前では、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰ
の決定の間の光信号の減少は、分当たりかなりのパーセントから１分以内に元の
光信号の半分までの減少まで変動した。ＡＴＰを検出するための生物ルミネセン
ス反応の光放出の急速な減少の結果として、例えば、細胞数を測るためにＡＴＰ
の検出を用いるのは限定的であった。その理由は、光信号が急速に減少するだけ
ではなく、ＡＴＰ消費酵素がまた光放出パターンに影響を及ぼし、光放出の一層
急速な減少を引き起こすからである。この細胞溶解によって、本発明はこの問題
に対しても同様に回答を出すものである。

【００３７】細胞溶解を行うためには、サンプルを溶解溶液と接触させる。この溶液は、好
ましくは、リットル当たり０．１〜１０グラムの量の溶解洗浄剤を含有する。溶
液のｐＨは好ましくは９．５を超え、特に好ましくは１０を超えるものであり、
水酸化ナトリウムなどの塩基で適宜調整することができる。細胞溶解を行うに必
要なインキュベーション期間は当業者によりその職業的知識に基づいて適宜決定
することができる。

【００３８】細胞溶解の後、サンプルを上記の反応混合物と接触させる。この工程は酸素の
存在下に、例えば、空気中で行う。細胞溶解、もしあれば、およびルシフェリン
−ルシフェラーゼ反応の両方をミクロ滴定プレートのウェルで行うのが好ましい
。このためには、好ましくは、１００μｌの溶解されたサンプルおよび５０μｌ
の細胞溶解混合物、それに続いて５０μｌの反応混合物を一緒にする。

【００３９】サンプルが反応混合物と接触させられると直ちに、ＡＴＰがサンプルに存在す
る場合には、光信号が放出される。この光信号がサンプル中のＡＴＰ量の尺度と
なる。もし、サンプルが細胞を含んでいると、ＡＴＰの量は、サンプル中に存在
した、生きた細胞の量の尺度と考えることができる。

【００４０】光信号を測定すること、およびそれに基づいて、ＡＴＰの量を測ることは、公
知の方法によって行うことができる。このためには、パッカード社（Ｐａｃｋａ
ｒｄ）製のトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）、あるいはパッカード社製のル
ミカウント（Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔ）、あるいはミクロ滴定プレートを測定するに
用いる他のプレートルミノメータなどの装置を用いることができる。また、いわ
ゆるストリップルミノメータ、あるいは注入システムを備えたルミノメータを用
いてもよい。また、液体シンチレータや生成する光信号のレベルを測定すること
のできる他の装置を用いてもよい。

【００４１】ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応の反応速度を安定化するためには、サンプ
ルと反応混合物を一緒にした後、測定を開始する前にしばらく待機するのが好ま
しい。この時間は当業者により適宜決定することができ、通常、５〜１５分であ
る。

【００４２】本発明はまたＡＴＰを検出する上記の方法に用いるキットに関する。それらの安定性の低さにより、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは、凍結さ
れた（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態でキットに存在するのが好ましい。この状
態を作るには、次のようにすればよい。所望量のルシフェラーゼおよびルシフェ
リンの混合物を緩衝剤、例えば、ＰＢＳ緩衝剤に溶解する。好ましくは、少量の
安定剤、例えば、ＢＳＡをこれに同様に加える。得られる組成物は通常の助剤、
例えば、トレハロースの存在下に凍結させることができる。

【００４３】上記の、好ましくは凍結状態の、ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物
に加えて、本発明のキットは、上記反応混合物の他の構成成分を含有する緩衝剤
を含む。好ましい実施例においては、キットはまた上記の溶解溶液を含むとよい
。

【００４４】

【実施例】

本発明を以下の実施例の基づいて説明する。実施例１ＡＴＰＬｉｔｅ−Ｍキットのテスト感度および直線性。希釈シリーズＵ９３７ヒト前骨髄球、ＨｅＬａ（ヒト頸かん種）、および
ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣）細胞。Ｕ９３７細胞は、ＦＣＳ（致死性血清）を１０％最終濃度まで加えたＲＰＭ
Ｉ培地で培養した。ＨｅＬａ細胞は、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥ
Ｍ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｍ）
即ち、デュルベコ変性ワシ培地で培養した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭとＦＣＳを
５％最終濃度まで加えたＨａｍ’ｓＦ１２培地との１：１混合物において３７
℃の培養器中で５％ＣＯ₂雰囲気で培養した。

【００４５】着生したＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞を、カルシウム塩およびマグネシウム塩を
含まないＰＢＳで洗浄した。細胞は、１：１０希釈の商業的に入手可能なトリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液の薄層で培養して、培養基体から放出させ、次いで培地＋Ｆ
ＣＳ中に集めた。Ｕ９３７懸濁細胞は５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管中
５００ × ｇで５分間遠心分離に供した。細胞ペレットはフレッシュな培地に含
ませた。細胞力価は、コールター・カウンタ（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ
）を用い、集めた細胞懸濁液の等張溶液による１：２０希釈液をカウントして決
定した。

【００４６】細胞懸濁液の一連の希釈物を培地＋ＦＣＳで準備した。ミリリットル当たり７
８１２５０細胞の力価を有する細胞懸濁液から始まって、１：５希釈物を調製し
て、それぞれ、ミリリットル当たり、７８１２５０、１５６２５０、３１２５０
、６２５０、１２５０、２５０および５０細胞の希釈物シリーズを得た。１００
マイクロリットルの細胞懸濁液を９６−ウェル・マイクロ滴定プレートのウェル
の中にピペットで入れた。培養器で２時間培養した後、各ウェルに５０マイクロ
リットルの哺乳類細胞溶解溶液（実施例４の溶液Ｄ）を添加して細胞を溶解し、
溶解物を２分間振とう台の上で振った。その後、５０マイクロリットルのＡＴＰ
−Ｍ緩衝液（実施例４の溶液Ｅ）を各ウェルに添加し、ＡＴＰ−依存ルシフェリ
ン・ルシフェラーゼ反応を開始した。１時間の培養の後、各ウェル中の放出光の
強度をパッカード・トップコートにより決定した。結果を図１、２および３に示
す。

【００４７】図１、図２および図３は、測定した細胞ラインにかかわらず、各ウェル中の細
胞の数と測定した関連光強度（秒当たりのカウントで表す。）との間には直線的
関係があることを示している。これらの結果は、サンプルとすべきウェル中の細
胞の数は、測定した光強度を標準線に関連づけることにより正確に決定できるこ
とを示している。さらに、測定した光強度は、細胞数の広い範囲にわたり、細胞
の数に正比例していることがわかる。

【００４８】図面の説明種々の細胞ラインを使用する間の直線性ＡＴＰ−Ｍ検定。細胞の希釈物シリー
ズを細胞懸濁液から調製した。細胞（０；５；２５；１２５；６２５；３１２５
；１５６２５；７８１２５）を９６−ウェル・プレートのウェルに添加した。２
時間の培養の後、５０μｌ溶解溶液を添加した。溶解後、５０μｌ検定基体緩衝
液を加えた。光強度をパッカード・トップコートで測定した。図面は、ダブル対
数スケールで、細胞数（Ｘ軸）と測定した光強度（秒当たりのカウント、（ＣＰ
Ｓ，Ｙ軸））との間の関係を示す。各グラフの点線は検定のバックグランドレベ
ルを示す。

【００４９】以下の実施例は、簡単な調合により、時間とともにゆっくりと減少する光信号
を得ることができることを示している。信号は、測定する混合物中のＡＴＰ濃度
に比例する。

【００５０】実施例２この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈物シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０
６Ｍから１Ｅ−１１ＭのＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００
μｌに、１００μｌの溶液Ａを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で
添加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で４時間にわたり繰
り返して測定した。

【００５１】調合溶液ＡＨＥＰＥＳ５０ｍＭＥＤＴＡ４ｍＭＭｇＣｌ₂ １０ｍＭＮａＣｌ２６０ｍＭＢＳＡ１．５グラム／リットルトレハロース５．０グラム／リットルＤ−ルシフェリン０．２ｍＭルシフェラーゼ６ｍｇ／リットルｐＨはＮａＯＨで7.8に調整。溶液ＡとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ａ中の成分およびＡＴＰの最終
濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を
表１に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともに
ゆっくりと減少し、信号が最初の測定時の信号の半分まで減少するまでに４時間
以上かかる、ということになる（図４参照）。

【００５４】実施例３この目的のために、水中へのＡＴＰの希釈シリーズ（１：１０）を１Ｅ−０６
Ｍから１Ｅ−１１ＭＡＴＰまで作成した。これらＡＴＰ溶液の各溶液１００μ
ｌに、１００μｌの溶液Ｂを白色９６−ウェル・ミクロプレートのウェル中で添
加し、光信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返し
て測定した。

【００５５】調合溶液ＢＨＥＰＥＳ１７５ｍＭＥＤＴＡ２ｍＭＭｇＣｌ₂ ２ｍＭＮａＣｌ１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ７５ｍＭＢＳＡ１．５グラム／リットルトレハロース５．０グラム／リットルＤ−ルシフェリン０．２ｍＭルシフェラーゼ６ｍｇ／リットルトリトンＮ−１０１２．０グラム／リットルｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。溶液ＢとＡＴＰ溶液との１：１混合物中の溶液Ｂ中の成分およびＡＴＰの最終
濃度は、これら２つの溶液の混合により、ウェルの中で２倍少なくなる。結果を
表２に示す。

【００５６】

【表２】

【００５７】上記結果から、信号はＡＴＰの濃度に直線的であり、また信号は時間とともに
ゆっくりと減少し、この例における半減期は約７時間である、ということになる
（図５参照）。

【００５８】実施例４この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中
への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ
当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。
各細胞希釈物１００μｌに、１００μｌの溶液Ｃを添加し、ＡＴＰ依存光信号を
時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定した。

【００５９】調合溶液ＣＨＥＰＥＳ１７５ｍＭＥＤＴＡ２ｍＭＭｇＣｌ₂ ２ｍＭＮａＣｌ６５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ７５ｍＭＢＳＡ１．５グラム／リットルトレハロース５．０グラム／リットルＤ−ルシフェリン０．２ｍＭルシフェラーゼ６ｍｇ／リットルトリトンＮ−１０１２．０グラム／リットルｐＨはＮａＯＨで7.4に調合。結果を表３に示す。

【００６０】

【表３】

【００６１】これら結果は、光信号は細胞の数に関連するが、光信号の減少速度は細胞の数
に依存することを示している。高細胞数における半減期はおおよそ１時間である
。この時間は、細胞数が少なくなると増加する（図６参照）。

【００６２】溶液Ｃを２つの部分、即ち溶液Ｃと溶液Ｅとに分割し、それぞれを連続的に細
胞懸濁液に添加することにより、光信号の減少速度が細胞数から独立したシステ
ムを作成することができる。

【００６３】調合溶液ＤＴｒｉｔｏｎＮ−１０１４グラム／リットルＮａＯＨ１００ｍＭ

【００６４】調合溶液ＥＨＥＰＥＳ３５０ｍＭＥＤＴＡ４ｍＭＭｇＣｌ₂ ４ｍＭＮａＣｌ１３０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ １５０ｍＭＢＳＡ３．０グラム／リットルトレハロース１０．０グラム／リットルＤ−ルシフェリン０．４ｍＭルシフェラーゼ１２ｍｇ／リットルｐＨはＮａＯＨで7.4に調整。

【００６５】この目的のために、ＣＨＯの、ＦＣＳを１０％最終濃度まで加えたＤＭＥＭ中
への希釈シリーズ（１：２）を１００μｌ当たり３７０００細胞から１００μｌ
当たり３６細胞まで白色の「組織培養処理」したミクロプレート中で作成した。
各細胞希釈物１００μｌに、５０μｌの溶液Ｄを添加し、ミクロプレートを約２
分間振った。次に、５０μｌの溶液Ｅを加えて、もう一度振った。ＡＴＰ依存光
信号を時間とともにパッカード・トップコート上で９．５時間繰り返して測定し
た。結果を表４に示す。

【００６６】

【表４】

【００６７】これら結果から、光信号は細胞数に直線的に関連する、ということになる。今
や、また、光信号の減少速度は、細胞数から独立したものとなった。この実施例
において、半減期はおおよそ５時間である（図７参照）。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の実験結果（Ｕ９３７細胞）のグラフ

【図２】実施例１の実験結果（ＣＨＯ細胞）のグラフ

【図３】実施例１の実験結果（Ｈｅｌａ細胞）のグラフ

【図４】実施例２の実験結果（表１）のグラフ

【図５】実施例３の実験結果（表２）のグラフ

【図６】実施例４の実験結果（表３）のグラフ

【図７】実施例４の実験結果（表４）のグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA24 AA28 BB02 BB20 BB29 BB46 CB01 CB21 DA15 FA11 FB01 FB13 GC15 2G054 AA08 AB07 BB01 CA22 CE02 EA02 FB07 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ63 QR02 QR58 QR66 QS28 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプルを、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび一つ以上
の水溶性塩を含み、全塩濃度が少なくとも０．０５モル／リットルである反応混
合物と接触させて光信号を生じせしめ、この光信号を測定する、サンプル中のＡ
ＴＰを検出する方法。
【請求項２】全塩濃度が少なくとも０．１０モル／リットルである請求項
１記載の方法。
【請求項３】水溶性塩類が、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、ＳＯ₄ ^2-、ＨＳＯ₄ ^-、ＨＰＯ₄ ^2- 、Ｈ₂ＰＯ₄ ^-、ＮＯ₃ ^-およびＨＣＯ₃ ^-のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金
属塩から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】反応混合物が、この反応混合物を６．５〜８．２のｐＨに維
持する緩衝剤を含有する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】サンプルが細胞を含有し、この細胞が予めアルカリ培地で細
胞溶解を受けたものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】細胞溶解が溶解洗浄剤を利用して起こる請求項５記載の方法
。
【請求項７】溶解洗浄剤が非イオン洗浄剤である請求項６記載の方法。
【請求項８】細胞溶解を９．５を超えるｐＨで行う請求項５〜７のいずれ
かに記載の方法。
【請求項９】ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物と、塩類を含有
する緩衝溶液とを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法に用いるキット。
【請求項１０】ルシフェリンおよびルシフェラーゼの混合物が凍結された
状態で存在する請求項９記載のキット。
【請求項１１】溶解洗浄剤を含み、９．５を超えるｐＨを有する細胞溶解
溶液を含む請求項１０記載のキット。
【請求項１２】ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応で発生する光信号を延
長させるための高塩濃度の使用方法。