JP2002521681A - 内因性の構成的に活性化されるｇタンパク質−共役オーファン受容体 - Google Patents
内因性の構成的に活性化されるｇタンパク質−共役オーファン受容体Info
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Abstract
(57)【要約】
本明細書に開示するのは、内因性の構成的に活性化されるオーファンＧタンパク質−共役受容体に対するアゴニスト、部分アゴニストおよび／または最も好ましくはインバースアゴニストとして候補化合物を直接同定するための技法である。そのような直接的に同定される化合物は、最も好ましくは医薬組成物に利用することができる。
Description
【０００１】
共有する利益：(１)1998年6月31日に出願された米国仮出願番号第60/094879号
；（２）1998年10月30日に出願された米国仮出願番号第60/106300号；（３）199
8年12月４日に出願された米国仮出願番号第60/110,906号および(４)1999年２月2
6日に出願された米国仮出願番号第60/121,851号をこれにより請求する。この特
許明細書は1998年４月14日に出願された米国特許出願第09/060,188号に関連する
。前述の特許出願の全開示は引用により本明細書に編入する。
；（２）1998年10月30日に出願された米国仮出願番号第60/106300号；（３）199
8年12月４日に出願された米国仮出願番号第60/110,906号および(４)1999年２月2
6日に出願された米国仮出願番号第60/121,851号をこれにより請求する。この特
許明細書は1998年４月14日に出願された米国特許出願第09/060,188号に関連する
。前述の特許出願の全開示は引用により本明細書に編入する。
【０００２】 発明の分野 本明細書に開示される発明は膜貫通受容体、より詳細には内因性リガンドが未
知である内因性の構成的に活性なＧタンパク質−共役受容体に関し、そして最も
詳細にはスクリーニングを介してそのような受容体に対するアゴニスト、部分ア
ゴニストまたはインバースアゴニストとして候補化合物を直接同定するためのそ
のような受容体の使用に関する。
知である内因性の構成的に活性なＧタンパク質−共役受容体に関し、そして最も
詳細にはスクリーニングを介してそのような受容体に対するアゴニスト、部分ア
ゴニストまたはインバースアゴニストとして候補化合物を直接同定するためのそ
のような受容体の使用に関する。
【０００３】 発明の背景 Ａ．Ｇタンパク質-共役受容体 Ｇタンパク質-共役受容体は共通する構造モティーフを共有する。すべてのこ
れらの受容体は、各々が膜に広がる７つのアルファヘリックスを形成する22から
24個の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する。膜貫通ヘリックスは、膜の細
胞外側上の第４および第５膜貫通ヘリックスの間により大きなループを有するア
ミノ酸鎖により連結されている。親水性アミノ酸から主に成る別のより大きなル
ープは、膜の細胞内側上で膜貫通ヘリックス５および６を連結する。受容体のカ
ルボキシ末端は細胞内に存在し、アミノ末端は細胞外空間にある。ヘリックス５
および６を連結するループならびにカルボキシ末端は、Ｇタンパク質と相互作用
すると考えられている。現在Gq、Gs、GiおよびGoが同定されたＧタンパク質であ
る。Ｇタンパク質共役受容体の一般構造は、図１に示す。
れらの受容体は、各々が膜に広がる７つのアルファヘリックスを形成する22から
24個の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する。膜貫通ヘリックスは、膜の細
胞外側上の第４および第５膜貫通ヘリックスの間により大きなループを有するア
ミノ酸鎖により連結されている。親水性アミノ酸から主に成る別のより大きなル
ープは、膜の細胞内側上で膜貫通ヘリックス５および６を連結する。受容体のカ
ルボキシ末端は細胞内に存在し、アミノ末端は細胞外空間にある。ヘリックス５
および６を連結するループならびにカルボキシ末端は、Ｇタンパク質と相互作用
すると考えられている。現在Gq、Gs、GiおよびGoが同定されたＧタンパク質であ
る。Ｇタンパク質共役受容体の一般構造は、図１に示す。
【０００４】 生理学的条件下で、Ｇタンパク質共役受容体は細胞膜中で２つの異なる状態ま
たは立体配座：「不活性」状態および「活性」状態の間の平衡状態で存在する。
図２に概略的に示すように、不活性状態の受容体は、細胞内伝達経路につながり
生物応答を生じることはできない。受容体の立体配座を活性状態に変えることに
より伝達経路につながり、そして生物応答を生じることが可能になる。
たは立体配座：「不活性」状態および「活性」状態の間の平衡状態で存在する。
図２に概略的に示すように、不活性状態の受容体は、細胞内伝達経路につながり
生物応答を生じることはできない。受容体の立体配座を活性状態に変えることに
より伝達経路につながり、そして生物応答を生じることが可能になる。
【０００５】 受容体は、内因性リガンドまたは外因性のアゴニストリガンドにより活性状態
で安定化され得る。限定するわけではないが受容体のアミノ酸配列に対する改変
を含め最近の知見では、活性状態の立体配座を安定化させるためにリガンド以外
の手段が提供されている。これらの手段は受容体へのリガンド結合の効果を刺激
する(smulating)ことにより受容体を活性状態に効果的に安定化する。そのよう
なリガンド−非依存的手段による安定化は、「構成的な受容体の活性化」と称す
る。内因性リガンドが未知であるか、または同定されていない受容体を「オーフ
ァン受容体」と称する。 Ｂ．従来の化合物スクリーニング 一般にそのような受容体に関連する生物応答をモジュレートする化合物を同定
するためのスクリーニング目的に、オーファン受容体を使用することは可能では
なかった。これは、化合物のスクリーニングに関する従来からの「定説」では受
容体に対するリガンドは既知であることが必要であるので、この定説によると、
すなわち受容体と自然なリガンドとの結合を妨害または遮断することにより、受
容体と競合的に結合する化合物が選択される。定義上、この方法はオーファン受
容体に関して応用することはできない。すなわち治療物質の発見にこの定説の方
法に執着するあまり、当該技術分野では本質的に、受容体に関する自然なリガン
ドが見いだされなければ、そして見いだされるまで、オーファン受容体の使用は
見捨てるように教示され、そして教示されてきた。オーファン受容体の内因性リ
ガンドの探索には数年を費やし、そして数百満ドルの経費がかかる。
で安定化され得る。限定するわけではないが受容体のアミノ酸配列に対する改変
を含め最近の知見では、活性状態の立体配座を安定化させるためにリガンド以外
の手段が提供されている。これらの手段は受容体へのリガンド結合の効果を刺激
する(smulating)ことにより受容体を活性状態に効果的に安定化する。そのよう
なリガンド−非依存的手段による安定化は、「構成的な受容体の活性化」と称す
る。内因性リガンドが未知であるか、または同定されていない受容体を「オーフ
ァン受容体」と称する。 Ｂ．従来の化合物スクリーニング 一般にそのような受容体に関連する生物応答をモジュレートする化合物を同定
するためのスクリーニング目的に、オーファン受容体を使用することは可能では
なかった。これは、化合物のスクリーニングに関する従来からの「定説」では受
容体に対するリガンドは既知であることが必要であるので、この定説によると、
すなわち受容体と自然なリガンドとの結合を妨害または遮断することにより、受
容体と競合的に結合する化合物が選択される。定義上、この方法はオーファン受
容体に関して応用することはできない。すなわち治療物質の発見にこの定説の方
法に執着するあまり、当該技術分野では本質的に、受容体に関する自然なリガン
ドが見いだされなければ、そして見いだされるまで、オーファン受容体の使用は
見捨てるように教示され、そして教示されてきた。オーファン受容体の内因性リ
ガンドの探索には数年を費やし、そして数百満ドルの経費がかかる。
【０００６】 さらに、ヒトのゲノムには推定2,000種のＧタンパク質共役受容体があり、そ
のほとんどがオーファン受容体であると仮定すると、従来の定説はこれらの受容
体に対する治療物質の発見に関する創造的な取り組みを制止する。 Ｃ．オーファン受容体例：GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1および
ALO22171 GPR3は330アミノ酸のＧタンパク質共役受容体であり、その内因性リガンドは
未知である（Marchese,A.et al.(1994) Genomics 23:609；Iismaa,T.P.et al.(1
994) Genomics 24:391も参照にされたい；報告されている核酸およびアミノ酸配
列については図１を参照されたい）。GPR3は内因性の状態で構成的に活性である
（Eggerick,D.et al.(1995) Biochem,J.389:837）。GPR12はGPR3の334アミノ酸
相同体であり：GRP12の内因性リガンドは未知である（Song,Z.-H.,et al.(1995)
Genomics 28:347；報告されているアミノ酸配列については図１を参照されたい
）。GPR6はGPR3の362アミノ酸相同体であり：GRP6の内因性リガンドは未知であ
る（Song,Z.-H.,et al.supra,；報告されているアミノ酸配列については図１を
参照されたい）。GPR6転写物はヒトの被殻では豊富であり、そして前頭皮質、海
馬および視床下部ではその程度が少ないと報告されている（Heiber,M.et al.DNA
and Cell Biology(1995)14(1):25；GPR6について報告されている核酸およびア
ミノ酸配列については図１を参照されたい）。GPR4もオーファンGPCRであると同
定された（Heiber,M.et al.DNA and Cell Biol.(1995))。オーファンGPCRである
OGR1は、GPR4と高レベルの相同性を有すると報告されている（Xu,Y.and Casey,G
.,35 Genomics 397(1996)）。GPR21は349アミノ酸のＧタンパク質共役受容体で
あり、その内因性リガンドは未知である（核酸および推定アミノ酸配列について
はGeneBank アソシエーション#U66580を参照にされたい）。GPR21は染色体9q33
に位置していると報告された。O'Dowd B.et al.,187 Gene 75(1997)。AL022171
は染色体1q24上のクローン384F21に由来するヒトDNA配列である。AL022171は、3
61アミノ酸タンパク質をコードする1,086bpの読み取り枠を含むと同定された（G
eneBank アソシエーション番号ALO22171を参照にされたい）。ALO22171はGPR21
に対して68％相同である（図５Ｂを参照にされたい）。GHSRもオーファンGPCRと
同定された（Howard,A.D.et al.,273 Science 974(1996)）。
のほとんどがオーファン受容体であると仮定すると、従来の定説はこれらの受容
体に対する治療物質の発見に関する創造的な取り組みを制止する。 Ｃ．オーファン受容体例：GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1および
ALO22171 GPR3は330アミノ酸のＧタンパク質共役受容体であり、その内因性リガンドは
未知である（Marchese,A.et al.(1994) Genomics 23:609；Iismaa,T.P.et al.(1
994) Genomics 24:391も参照にされたい；報告されている核酸およびアミノ酸配
列については図１を参照されたい）。GPR3は内因性の状態で構成的に活性である
（Eggerick,D.et al.(1995) Biochem,J.389:837）。GPR12はGPR3の334アミノ酸
相同体であり：GRP12の内因性リガンドは未知である（Song,Z.-H.,et al.(1995)
Genomics 28:347；報告されているアミノ酸配列については図１を参照されたい
）。GPR6はGPR3の362アミノ酸相同体であり：GRP6の内因性リガンドは未知であ
る（Song,Z.-H.,et al.supra,；報告されているアミノ酸配列については図１を
参照されたい）。GPR6転写物はヒトの被殻では豊富であり、そして前頭皮質、海
馬および視床下部ではその程度が少ないと報告されている（Heiber,M.et al.DNA
and Cell Biology(1995)14(1):25；GPR6について報告されている核酸およびア
ミノ酸配列については図１を参照されたい）。GPR4もオーファンGPCRであると同
定された（Heiber,M.et al.DNA and Cell Biol.(1995))。オーファンGPCRである
OGR1は、GPR4と高レベルの相同性を有すると報告されている（Xu,Y.and Casey,G
.,35 Genomics 397(1996)）。GPR21は349アミノ酸のＧタンパク質共役受容体で
あり、その内因性リガンドは未知である（核酸および推定アミノ酸配列について
はGeneBank アソシエーション#U66580を参照にされたい）。GPR21は染色体9q33
に位置していると報告された。O'Dowd B.et al.,187 Gene 75(1997)。AL022171
は染色体1q24上のクローン384F21に由来するヒトDNA配列である。AL022171は、3
61アミノ酸タンパク質をコードする1,086bpの読み取り枠を含むと同定された（G
eneBank アソシエーション番号ALO22171を参照にされたい）。ALO22171はGPR21
に対して68％相同である（図５Ｂを参照にされたい）。GHSRもオーファンGPCRと
同定された（Howard,A.D.et al.,273 Science 974(1996)）。
【０００７】 発明の要約 本明細書に開示するのは、内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質−共役
オーファン受容体（GPCR）に対するアゴニスト、インバースアゴニストまたは部
分アゴニストとしての候補化合物を直接同定するための、そのような受容体に対
する候補化合物をスクリーニングする方法である。 そのようなスクリーニング
目的には、内因性の構成的に活性化されるオーファンGPCR:Gタンパク質−融合タ
ンパク質を利用することが好ましい。
オーファン受容体（GPCR）に対するアゴニスト、インバースアゴニストまたは部
分アゴニストとしての候補化合物を直接同定するための、そのような受容体に対
する候補化合物をスクリーニングする方法である。 そのようなスクリーニング
目的には、内因性の構成的に活性化されるオーファンGPCR:Gタンパク質−融合タ
ンパク質を利用することが好ましい。
【０００８】 詳細な記述 受容体を中心に展開する技術文献では、受容体に様々な効果を有するリガンド
について多数の用語をあてはめた。明瞭性および一貫性を目的として、以下の定
義を本特許明細書を通じて使用する。ある程度、このような定義はこのような用
語に関する他の定義と矛盾するが、以下の定義に統制する： アゴニストとは、それらが受容体に結合した時に細胞内の応答を活性化するか
、またはGTPが膜に結合することを強化する物質（例えばリガンド、候補化合物
）を意味する。
について多数の用語をあてはめた。明瞭性および一貫性を目的として、以下の定
義を本特許明細書を通じて使用する。ある程度、このような定義はこのような用
語に関する他の定義と矛盾するが、以下の定義に統制する： アゴニストとは、それらが受容体に結合した時に細胞内の応答を活性化するか
、またはGTPが膜に結合することを強化する物質（例えばリガンド、候補化合物
）を意味する。
【０００９】 本明細書で使用するアミノ酸の略号は表１に説明する：
【００１０】
【表１】
【００１１】 部分アゴニストとは、それらが受容体に結合した時にアゴニストよりも少ない
程度／広がり（degree/extent)で細胞内の応答を活性化するか、またはアゴニス
トよりも少ない程度／広がりでGTPが膜に結合することを強化する物質（例えば
リガンド、候補化合物）を意味する。
程度／広がり（degree/extent)で細胞内の応答を活性化するか、またはアゴニス
トよりも少ない程度／広がりでGTPが膜に結合することを強化する物質（例えば
リガンド、候補化合物）を意味する。
【００１２】 アンタゴニストとは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するが、
受容体の活性形態により開始される細胞内応答を活性化せず、そしてこれにより
アゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる物質
（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストはアゴニストまた
は部分アゴニストの不存在下でベースラインの細胞内応答を消すことはない。
受容体の活性形態により開始される細胞内応答を活性化せず、そしてこれにより
アゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる物質
（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストはアゴニストまた
は部分アゴニストの不存在下でベースラインの細胞内応答を消すことはない。
【００１３】 候補化合物とは、スクリーニング技法で検査することができる分子（例えば限
定するわけではないが、化学化合物）を意味する。好ましくは「候補化合物」と
いう句は、間接的な同定法によりこれまでに決定されたような、受容体に対する
インバースアゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストから成る群から選択さ
れる化合物であると公に知られていた化合物を含まず（間接的に同定された化合
物）；より好ましくはこれまでに少なくとも１つの哺乳動物に治療効果を有する
とこれまでに決定されている間接的に同定された化合物を含まず；そして最も好
ましくは、ヒトに治療的利用性を有するとこれまでに間接的に同定された化合物
を含まない。
定するわけではないが、化学化合物）を意味する。好ましくは「候補化合物」と
いう句は、間接的な同定法によりこれまでに決定されたような、受容体に対する
インバースアゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストから成る群から選択さ
れる化合物であると公に知られていた化合物を含まず（間接的に同定された化合
物）；より好ましくはこれまでに少なくとも１つの哺乳動物に治療効果を有する
とこれまでに決定されている間接的に同定された化合物を含まず；そして最も好
ましくは、ヒトに治療的利用性を有するとこれまでに間接的に同定された化合物
を含まない。
【００１４】 組成物とは、少なくとも１種の成分を含んで成る物質を意味し；「医薬的組成
物」とは組成物の１例である。
物」とは組成物の１例である。
【００１５】 化合物の効能とは、受容体結合親和性に反して化合物が受容体の機能を阻害ま
たは刺激する能力の尺度を意味する。化合物の効能を検出するための最も好適な
手段は、本明細書の実施例でさらに開示するようにGTP（[35S]GTPγSを介して）
またはcAMPの測定を介する。
たは刺激する能力の尺度を意味する。化合物の効能を検出するための最も好適な
手段は、本明細書の実施例でさらに開示するようにGTP（[35S]GTPγSを介して）
またはcAMPの測定を介する。
【００１６】 構成的に活性化される受容体（構成的に活性な受容体）とは、構成的な受容体
の活性化に供される受容体を意味する。構成的に活性化される受容体は内因性ま
たは非内因性でよい。
の活性化に供される受容体を意味する。構成的に活性化される受容体は内因性ま
たは非内因性でよい。
【００１７】 構成的な受容体の活性化とは、受容体とその内因性リガンドまたはそれらの化
学的均等物との結合以外の手段による受容体の活性状態の安定化を意味する。
学的均等物との結合以外の手段による受容体の活性状態の安定化を意味する。
【００１８】 接触または接触するとは、インビトロ系またはインビボ系のいずれかにおいて
少なくとも２つの成分を一緒にすることを意味する。
少なくとも２つの成分を一緒にすることを意味する。
【００１９】 直接的に同定するまたは直接的に同定したとは、「候補化合物」という句と関
連して、構成的に活性化される受容体に対する、好ましくは構成的に活性化され
るオーファン受容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質
共役細胞表面オーファン受容体に対する候補化合物をスクリーニングし、そして
そのような化合物の化合物の効能を評価することを意味する。この句はどのよう
なことがあっても「間接的に同定する」または「間接的に同定した」という句に
包含されるか、または包含するとは解釈されないか、または理解されない。
連して、構成的に活性化される受容体に対する、好ましくは構成的に活性化され
るオーファン受容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質
共役細胞表面オーファン受容体に対する候補化合物をスクリーニングし、そして
そのような化合物の化合物の効能を評価することを意味する。この句はどのよう
なことがあっても「間接的に同定する」または「間接的に同定した」という句に
包含されるか、または包含するとは解釈されないか、または理解されない。
【００２０】 内因性とは、哺乳動物が自然に生産する物質を意味する。用語「受容体」と関
連して内因性とは、例えば限定するわけではないが哺乳動物（例えば限定するわ
けではないがヒト）またはウイルスにより自然に生産されることを意味する。対
照的にこれに関連して非−内因性という用語は、哺乳動物（例えば限定するわけ
ではないがヒト）またはウイルスにより自然には生産されないことを意味する。
例えば、そして限定するわけではないが、その内因性の形態で構成的に活性では
ない受容体は、操作して構成的に活性になった時、最も好ましくは「非−内因性
の構成的に活性化される受容体」と本明細書で称する。両方の用語は「インビボ
」および「インビトロ」系の両方を説明するために使用することができる。例え
ば、そして限定するわけではないがスクリーニング法において、内因性または非
内因性受容体はインビトロスクリーニング系に関するものでよい。更なる例とし
て、そして限定するわけではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活
性化される受容体を含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化
合物のスクリーニングを実現できる。
連して内因性とは、例えば限定するわけではないが哺乳動物（例えば限定するわ
けではないがヒト）またはウイルスにより自然に生産されることを意味する。対
照的にこれに関連して非−内因性という用語は、哺乳動物（例えば限定するわけ
ではないがヒト）またはウイルスにより自然には生産されないことを意味する。
例えば、そして限定するわけではないが、その内因性の形態で構成的に活性では
ない受容体は、操作して構成的に活性になった時、最も好ましくは「非−内因性
の構成的に活性化される受容体」と本明細書で称する。両方の用語は「インビボ
」および「インビトロ」系の両方を説明するために使用することができる。例え
ば、そして限定するわけではないがスクリーニング法において、内因性または非
内因性受容体はインビトロスクリーニング系に関するものでよい。更なる例とし
て、そして限定するわけではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活
性化される受容体を含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化
合物のスクリーニングを実現できる。
【００２１】 Ｇタンパク質共役受容体融合タンパク質およびGPCR融合タンパク質とは、本明
細書に開示する発明の内容において、それぞれ、少なくとも１つのＧタンパク質
、最も好ましくはそのようなＧタンパク質のアルファ(α)サブユニット（これは
GTPに結合するサブユニット）に融合した内因性の構成的に活性化されるオーフ
ァンGPCRを含んで成る非内因性タンパク質を意味し、Ｇタンパク質は好ましくは
内因性のオーファンGPCRと自然に共役するＧタンパク質と同じ種類である。例え
ば、そして限定するわけではないが内因性の状態で、Ｇタンパク質“Gsα”は、
GPCR6に基づくGPCR融合タンパク質がGsαに融合したGPCR6を含んで成る非-内因
性タンパク質となるように、GPCR6と共役する主要なＧタンパク質である。この
Ｇタンパク質は内因性の構成的に活性なオーファンGPCRのｃ-末端に直接融合す
ることができるか、あるいは２つの間にスペーサーがあってもよい。
細書に開示する発明の内容において、それぞれ、少なくとも１つのＧタンパク質
、最も好ましくはそのようなＧタンパク質のアルファ(α)サブユニット（これは
GTPに結合するサブユニット）に融合した内因性の構成的に活性化されるオーフ
ァンGPCRを含んで成る非内因性タンパク質を意味し、Ｇタンパク質は好ましくは
内因性のオーファンGPCRと自然に共役するＧタンパク質と同じ種類である。例え
ば、そして限定するわけではないが内因性の状態で、Ｇタンパク質“Gsα”は、
GPCR6に基づくGPCR融合タンパク質がGsαに融合したGPCR6を含んで成る非-内因
性タンパク質となるように、GPCR6と共役する主要なＧタンパク質である。この
Ｇタンパク質は内因性の構成的に活性なオーファンGPCRのｃ-末端に直接融合す
ることができるか、あるいは２つの間にスペーサーがあってもよい。
【００２２】 間接的に同定する、または間接的に同定されるとは、内因性受容体に特異的な
内因性リガンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／または競合す
るものを決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活
性化受容体に関連する少なくとも１つの第２メッセンジャー経路で影響を及ぼす
化合物の効能を評価することが関与する薬剤発見法に対する従来の取り組みを意
味する。
内因性リガンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／または競合す
るものを決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活
性化受容体に関連する少なくとも１つの第２メッセンジャー経路で影響を及ぼす
化合物の効能を評価することが関与する薬剤発見法に対する従来の取り組みを意
味する。
【００２３】 用語「応答」に関連して阻害または阻害するとは、化合物の不存在下とは反対
に、化合物の存在下で応答が下がる、または防止されることを意味する。
に、化合物の存在下で応答が下がる、または防止されることを意味する。
【００２４】 インバースアゴニストとは、受容体の内因性形態または受容体の構成的に活性
化された形態のいずれかに結合し、そして受容体の活性化形態により開始される
ベースラインの細胞内応答をアゴニストまたは部分アゴニストの不存在下で観察
される活性の正常ベースレベル未満に阻害するか、あるいは膜に対するGTPの結
合を下げる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。好ましくはベース
ラインの細胞内応答は、インバースアゴニストの不存在下でのベースライン応答
と比較して、インバースアゴニストの存在下で少なくとも30％まで、より好まし
くは少なくとも50％まで、そして最も好ましくは少なくとも75％まで阻害される
。
化された形態のいずれかに結合し、そして受容体の活性化形態により開始される
ベースラインの細胞内応答をアゴニストまたは部分アゴニストの不存在下で観察
される活性の正常ベースレベル未満に阻害するか、あるいは膜に対するGTPの結
合を下げる物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。好ましくはベース
ラインの細胞内応答は、インバースアゴニストの不存在下でのベースライン応答
と比較して、インバースアゴニストの存在下で少なくとも30％まで、より好まし
くは少なくとも50％まで、そして最も好ましくは少なくとも75％まで阻害される
。
【００２５】 リガンドは、内因性の、天然に存在する受容体に特異的な内因性の天然に存在
する分子を意味する。
する分子を意味する。
【００２６】 オーファン受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されていな
いか、または未知である内因性の受容体を意味する。
いか、または未知である内因性の受容体を意味する。
【００２７】 医薬組成物は、少なくとも１つの有効成分を含んで成る組成物を意味し、これ
により組成物は哺乳動物（例えば、そして限定するわけではないがヒト）中で特
別な、有効な成果について調査することが可能である。当業者は有効成分が望ま
しい効能のある成果を有するかどうかを決定するための適切な技法は技術者の必
要性に基づくと理解し、そして考えるだろう。
により組成物は哺乳動物（例えば、そして限定するわけではないがヒト）中で特
別な、有効な成果について調査することが可能である。当業者は有効成分が望ま
しい効能のある成果を有するかどうかを決定するための適切な技法は技術者の必
要性に基づくと理解し、そして考えるだろう。
【００２８】 非オーファン受容体とは、内因性の天然に存在するリガンドに特異的な内因性
の天然に存在する分子を意味し、ここでリガンドの受容体への結合が細胞内のシ
グナル発信経路を活性化する。
の天然に存在する分子を意味し、ここでリガンドの受容体への結合が細胞内のシ
グナル発信経路を活性化する。
【００２９】 刺激または刺激するとは、用語「応答」と関連では、応答が化合物の不在に反
して、化合物の存在で上昇することを意味する。
して、化合物の存在で上昇することを意味する。
【００３０】 以下の章のまとめは表象的な有効性について説明しており、そして本開示また
は前記の特許請求の範囲を限定することを意図せず、そして解釈されるべきでは
ない。 Ａ．はじめに 受容体の従来の研究は、発見が進んで受容体に影響を及ぼし得るアンタゴニス
トおよび他の分子を見いだすことができる前に、内因性のリガンドを最初に同定
しなければならないという前提から（歴史的に基づく）常に進められてきた。た
とえアンタゴニストが最初に知られても、研究は直ちに内因性のリガンドを探す
ことに広がった。受容体の研究において、この思考様式は構成的に活性化される
受容体が見いだされた後でも繰り返された。これまでに認識されていなかったこ
とは、受容体のアゴニスト、部分アゴニストおよびインバースアゴニストを見い
だすために最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度
に活性な受容体から生じる疾患の治療薬において望まれるのは、受容体の活性状
態を下げるように作用する化合物であり、内因性リガンドに対するアンタゴニス
トである薬剤である必要はない。これは活性受容体状態の活性を低下させる化合
物（薬剤）が、内因性リガンドと同じ部位に結合する必要はないからである。す
なわち本発明の方法により教示するように、治療用化合物の調査はリガンドに非
依存的な活性状態に対する化合物をスクリーニングすることから始めるべきであ
る。この調査は次に活性状態の受容体のインバースアゴニストに関する。
は前記の特許請求の範囲を限定することを意図せず、そして解釈されるべきでは
ない。 Ａ．はじめに 受容体の従来の研究は、発見が進んで受容体に影響を及ぼし得るアンタゴニス
トおよび他の分子を見いだすことができる前に、内因性のリガンドを最初に同定
しなければならないという前提から（歴史的に基づく）常に進められてきた。た
とえアンタゴニストが最初に知られても、研究は直ちに内因性のリガンドを探す
ことに広がった。受容体の研究において、この思考様式は構成的に活性化される
受容体が見いだされた後でも繰り返された。これまでに認識されていなかったこ
とは、受容体のアゴニスト、部分アゴニストおよびインバースアゴニストを見い
だすために最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度
に活性な受容体から生じる疾患の治療薬において望まれるのは、受容体の活性状
態を下げるように作用する化合物であり、内因性リガンドに対するアンタゴニス
トである薬剤である必要はない。これは活性受容体状態の活性を低下させる化合
物（薬剤）が、内因性リガンドと同じ部位に結合する必要はないからである。す
なわち本発明の方法により教示するように、治療用化合物の調査はリガンドに非
依存的な活性状態に対する化合物をスクリーニングすることから始めるべきであ
る。この調査は次に活性状態の受容体のインバースアゴニストに関する。
【００３１】 内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体（例えば、そして限定するわ
けではないが、本明細書に記載する内因性の構成的に活性なGPCRであるGPR3、GP
R4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171）に対する候補化合
物をスクリーニングすることは、従来の知識を必要とせずに、または受容体の内
因性リガンドを使用する事なく、これらのオーファン細胞表面受容体で作用する
候補化合物の直接的な同定を可能とする。そのような受容体が発現され、そして
／または過剰発現される身体内の領域を決定することにより、このような受容体
の発現および／または過剰発現が伴う関連する疾患／障害状態を決定することが
可能であり；そのような取り組みを本特許明細書に開示する。 Ｂ．疾患／障害の同定および／または選択 以下により詳細に記載するように、最も好ましくは例えば本明細書で説明する
ような内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体（GPR3、GPR4、GPR6、GP
R12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171のような）に対するインバースア
ゴニストを、本発明の方法により同定することができる。そのようなインバース
アゴニストは、このような受容体に関連する疾患を処置するための薬剤発見プロ
グラムにおいて、先導化合物として理想的であろう。実際にそのような受容体に
対するアンタゴニストは（たとえリガンドが既知でも）、リガンド−受容体結合
の不存在下でも受容体が活性化されると仮定すると効果的ではないかもしれない
。このような受容体に対するインバースアゴニストを直接的に同定する能力から
（これにより医薬組成物の開発が可能となる）、このような受容体に関連する疾
患および障害に関する調査が可能となる。例えば、このようなオーファン受容体
の存在に関して病んだ、および正常な組織サンプルの両方をスキャンニングする
ことは、今では単に学術的な過程ではなく、すなわち内因性リガンドを同定する
様式に沿って追求することになるだろう。組織スキャンは、広い範囲の健康な、
または病んだ組織にわたり行うことができる。そのような組織スキャンは具体的
な受容体を疾患および／または障害と関連させる好適な第１段階を提供する。
けではないが、本明細書に記載する内因性の構成的に活性なGPCRであるGPR3、GP
R4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171）に対する候補化合
物をスクリーニングすることは、従来の知識を必要とせずに、または受容体の内
因性リガンドを使用する事なく、これらのオーファン細胞表面受容体で作用する
候補化合物の直接的な同定を可能とする。そのような受容体が発現され、そして
／または過剰発現される身体内の領域を決定することにより、このような受容体
の発現および／または過剰発現が伴う関連する疾患／障害状態を決定することが
可能であり；そのような取り組みを本特許明細書に開示する。 Ｂ．疾患／障害の同定および／または選択 以下により詳細に記載するように、最も好ましくは例えば本明細書で説明する
ような内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体（GPR3、GPR4、GPR6、GP
R12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171のような）に対するインバースア
ゴニストを、本発明の方法により同定することができる。そのようなインバース
アゴニストは、このような受容体に関連する疾患を処置するための薬剤発見プロ
グラムにおいて、先導化合物として理想的であろう。実際にそのような受容体に
対するアンタゴニストは（たとえリガンドが既知でも）、リガンド−受容体結合
の不存在下でも受容体が活性化されると仮定すると効果的ではないかもしれない
。このような受容体に対するインバースアゴニストを直接的に同定する能力から
（これにより医薬組成物の開発が可能となる）、このような受容体に関連する疾
患および障害に関する調査が可能となる。例えば、このようなオーファン受容体
の存在に関して病んだ、および正常な組織サンプルの両方をスキャンニングする
ことは、今では単に学術的な過程ではなく、すなわち内因性リガンドを同定する
様式に沿って追求することになるだろう。組織スキャンは、広い範囲の健康な、
または病んだ組織にわたり行うことができる。そのような組織スキャンは具体的
な受容体を疾患および／または障害と関連させる好適な第１段階を提供する。
【００３２】 好ましくは内因性の構成的に活性化されるGPCRのDNA配列を使用して、組織サ
ンプル中の受容体の発現をRT-PCR同定するためのプローブを作成する。病んだ組
織中の受容体の存在、または正常な組織に比べて病んだ組織中の高濃度の受容体
の存在は、疾患との相関を同定するために利用することができる。受容体はこの
技法により器官の領域に均等に局在化され得る。受容体が局在する具体的な組織
の既知の機能に基づき、受容体の推定上の機能的役割を予測することができる。
Ｃ．相同性の確認 オーファン受容体を疾患および／または障害と同定し、そして関連づけること
は、元のオーファン受容体と相同性を有するさらなる受容体の同定を介して有利
に強化され得る。この方法はGPR3とのそれらの配列相同性に基づき両GPR6および
GPR12の同定に、そしてGPR21に対する配列相同性を有するAL022171の同定に利用
された。GPR3は以前に構成的に活性化されるオーファン受容体であると同定され
た（Eggerick,supraを参照にされたい）。本発明以前に知られていなかったこと
は、GPR6、GPR12、GPR21およびAL022171もそれらの内因性の状態で構成的に活性
であることであった。既知のコンピーター化されたデータベース（例えばdbEST
）を使用して、GPR6、GPR12、GPR21およびAL022171を同定した。
ンプル中の受容体の発現をRT-PCR同定するためのプローブを作成する。病んだ組
織中の受容体の存在、または正常な組織に比べて病んだ組織中の高濃度の受容体
の存在は、疾患との相関を同定するために利用することができる。受容体はこの
技法により器官の領域に均等に局在化され得る。受容体が局在する具体的な組織
の既知の機能に基づき、受容体の推定上の機能的役割を予測することができる。
Ｃ．相同性の確認 オーファン受容体を疾患および／または障害と同定し、そして関連づけること
は、元のオーファン受容体と相同性を有するさらなる受容体の同定を介して有利
に強化され得る。この方法はGPR3とのそれらの配列相同性に基づき両GPR6および
GPR12の同定に、そしてGPR21に対する配列相同性を有するAL022171の同定に利用
された。GPR3は以前に構成的に活性化されるオーファン受容体であると同定され
た（Eggerick,supraを参照にされたい）。本発明以前に知られていなかったこと
は、GPR6、GPR12、GPR21およびAL022171もそれらの内因性の状態で構成的に活性
であることであった。既知のコンピーター化されたデータベース（例えばdbEST
）を使用して、GPR6、GPR12、GPR21およびAL022171を同定した。
【００３３】 これにより本明細書に開示する発明のある種の独自な利点を強調している：薬
剤スクリーニングにおける定説は受容体の内因性リガンドの知識および同定にあ
るので、当該技術ではGPR3相同体がそれらの内因性形態で構成的に活性であるか
どうかを調査する動機付はなかった（せいぜい学術的興味以外には）。しかしそ
のような受容体に対するインバースアゴニストを直接同定するための本発明の威
力を用いると、そのような受容体の組織サンプル中の分布を局在化する能力と組
み合わせて、本発明はそのような無駄な好奇心を劇的に超越し、そしてヒトの状
態に影響を及ぼす疾患および障害を緩和するための手段を提供する。 Ｄ．候補化合物のスクリーニング １．包括的なGPCRスクリーニングアッセイ法 Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になる時、これはＧタンパク質（例えばGq
、Gs、Gi、Go）に結合し、そしてGTPのＧタンパク質への結合を刺激する。次に
Ｇタンパク質はGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへゆっくりと加水分解し、
これにより受容体は正常な条件下で失活型（deactivated）となる。しかし構成
的に活性化される受容体はGDPをGTPに変換し続ける。GTPの非−加水分解性同族
体である[35S]GTPγSは、構成的に活性化される受容体を発現する膜への強化さ
れた結合を監視するために使用することができる。[35S]GTPγSはリガンドの不
存在下または存在下でＧタンパク質の膜への共役を監視するために使用すること
ができる。当該技術分野で周知かつ利用されている他の例の中でこの監視の例は
、1995年にTraynor and Nahorskiにより報告された。このアッセイ系の使用は、
受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらず、系は
包括的にすべてのＧタンパク質共役受容体に応用できるので、候補化合物の最初
のスクリーニングに好適である。この内容は、GPCR融合タンパク質が好ましく使
用されるGTPアッセイ系の使用である。 Ｂ．２．特異的なGPCRスクリーニングアッセイ技法 いったん候補化合物が「包括的」なＧタンパク質共役受容体アッセイ（すなわ
ち、アゴニスト、部分アゴニストまたはインバースアゴニストである化合物を選
択するためのアッセイ）を使用して同定されれば、さらなるスクリーニングによ
りこの化合物が受容体部位で相互作用したことを確認することが好ましい。例え
ば「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないが、代わり
に細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「離す（uncouple)」かもしれない。G
PR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびAL022171の場合、この
ような受容体はＧタンパク質であるGsと共役すると決定された。Gsは酵素である
アデニリル シクラーゼを刺激する（一方Giはこの酵素を阻害する）。アデニリ
ル シクラーゼはATPのcAMPへの転換を触媒し；すなわちこのような受容体はそれ
らの内因性形態に活性化されるので、それらにはcAMPレべルの上昇が伴う（一方
、Giタンパク質と共役する内因的に活性化される受容体は、cAMPレべルの減少が
伴う）。一般に、「シナプス伝達の間接的メカニズム（Indirect Mechanism of
Synaptic Transmission)」、第８章、神経から脳へ（From Neuron To Brain）（
第３版）、Nichols,J.G.et al 編集、シナウアー アソシエイツ（Sinauer Assoc
iates）社（1992）を参照のこと。このようにcAMPを検出するアッセイを、候補
化合物が受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定するために
利用することができる（すなわち、受容体と接触するそのような化合物は、非接
触受容体と比べてcAMPのレベルを減少させるだろう）。cAMPを測定するために当
該技術分野で知られている種々の方法を利用することができる：最も好適な方法
は抗−cAMP抗体の使用に依存する。使用することができる別の種類のアッセイは
、全細胞第２メッセンジャーレポーター系アッセイ（whole cell second messen
ger reporter system assay）である。遺伝子上のプロモーターは特定の遺伝子
がコードするタンパク質の発現を支配する。サイクリックAMPはcAMP−応答性（c
AMP-responsive）のDNA結合タンパク質の結合を、または次にcAMP応答配列と呼
ばれる特別な部位でプロモーターに結合し、そして遺伝子の発現を駆動する転写
因子（CREB）の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター系
はレポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に
、多cAMP応答配列を含むプロモーターを有するように構成することができる。す
なわちGPR3のような活性化GsレポーターはcAMPの蓄積を引き起こし、これが次に
遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。β-ガラクトシダーゼ
またはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、次に標準的な生化学ア
ッセイを使用して検出することができる（例えばChen et al.1995を参照にされ
たい）。cAMPアッセイが特に好適である。
剤スクリーニングにおける定説は受容体の内因性リガンドの知識および同定にあ
るので、当該技術ではGPR3相同体がそれらの内因性形態で構成的に活性であるか
どうかを調査する動機付はなかった（せいぜい学術的興味以外には）。しかしそ
のような受容体に対するインバースアゴニストを直接同定するための本発明の威
力を用いると、そのような受容体の組織サンプル中の分布を局在化する能力と組
み合わせて、本発明はそのような無駄な好奇心を劇的に超越し、そしてヒトの状
態に影響を及ぼす疾患および障害を緩和するための手段を提供する。 Ｄ．候補化合物のスクリーニング １．包括的なGPCRスクリーニングアッセイ法 Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になる時、これはＧタンパク質（例えばGq
、Gs、Gi、Go）に結合し、そしてGTPのＧタンパク質への結合を刺激する。次に
Ｇタンパク質はGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへゆっくりと加水分解し、
これにより受容体は正常な条件下で失活型（deactivated）となる。しかし構成
的に活性化される受容体はGDPをGTPに変換し続ける。GTPの非−加水分解性同族
体である[35S]GTPγSは、構成的に活性化される受容体を発現する膜への強化さ
れた結合を監視するために使用することができる。[35S]GTPγSはリガンドの不
存在下または存在下でＧタンパク質の膜への共役を監視するために使用すること
ができる。当該技術分野で周知かつ利用されている他の例の中でこの監視の例は
、1995年にTraynor and Nahorskiにより報告された。このアッセイ系の使用は、
受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらず、系は
包括的にすべてのＧタンパク質共役受容体に応用できるので、候補化合物の最初
のスクリーニングに好適である。この内容は、GPCR融合タンパク質が好ましく使
用されるGTPアッセイ系の使用である。 Ｂ．２．特異的なGPCRスクリーニングアッセイ技法 いったん候補化合物が「包括的」なＧタンパク質共役受容体アッセイ（すなわ
ち、アゴニスト、部分アゴニストまたはインバースアゴニストである化合物を選
択するためのアッセイ）を使用して同定されれば、さらなるスクリーニングによ
りこの化合物が受容体部位で相互作用したことを確認することが好ましい。例え
ば「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないが、代わり
に細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「離す（uncouple)」かもしれない。G
PR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびAL022171の場合、この
ような受容体はＧタンパク質であるGsと共役すると決定された。Gsは酵素である
アデニリル シクラーゼを刺激する（一方Giはこの酵素を阻害する）。アデニリ
ル シクラーゼはATPのcAMPへの転換を触媒し；すなわちこのような受容体はそれ
らの内因性形態に活性化されるので、それらにはcAMPレべルの上昇が伴う（一方
、Giタンパク質と共役する内因的に活性化される受容体は、cAMPレべルの減少が
伴う）。一般に、「シナプス伝達の間接的メカニズム（Indirect Mechanism of
Synaptic Transmission)」、第８章、神経から脳へ（From Neuron To Brain）（
第３版）、Nichols,J.G.et al 編集、シナウアー アソシエイツ（Sinauer Assoc
iates）社（1992）を参照のこと。このようにcAMPを検出するアッセイを、候補
化合物が受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定するために
利用することができる（すなわち、受容体と接触するそのような化合物は、非接
触受容体と比べてcAMPのレベルを減少させるだろう）。cAMPを測定するために当
該技術分野で知られている種々の方法を利用することができる：最も好適な方法
は抗−cAMP抗体の使用に依存する。使用することができる別の種類のアッセイは
、全細胞第２メッセンジャーレポーター系アッセイ（whole cell second messen
ger reporter system assay）である。遺伝子上のプロモーターは特定の遺伝子
がコードするタンパク質の発現を支配する。サイクリックAMPはcAMP−応答性（c
AMP-responsive）のDNA結合タンパク質の結合を、または次にcAMP応答配列と呼
ばれる特別な部位でプロモーターに結合し、そして遺伝子の発現を駆動する転写
因子（CREB）の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター系
はレポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に
、多cAMP応答配列を含むプロモーターを有するように構成することができる。す
なわちGPR3のような活性化GsレポーターはcAMPの蓄積を引き起こし、これが次に
遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。β-ガラクトシダーゼ
またはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、次に標準的な生化学ア
ッセイを使用して検出することができる（例えばChen et al.1995を参照にされ
たい）。cAMPアッセイが特に好適である。
【００３４】 前述の特異的アッセイ法はもちろん、包括的アッセイ法を使用することよりは
むしろ候補化合物を最初に直接的に同定するために使用することができる。その
ような選択は主に技術者の選択の問題である。GPR6に関しては修飾された市販さ
れているcAMPアッセイを使用することが、インバースアゴニストの直接的同定に
最初に利用された。 Ｃ ３．GPCR融合タンパク質 インバースアゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストを直接的に同定する
ために、候補化合物のスクリーニングに使用する内因性の構成的に活性化される
オーファンGPCRの使用は、定義によれば内因性の受容体はそれに結合する内因性
のリガンドの不存在下でも活性であるという点で、独自な挑戦を提供する。すな
わち例えば候補化合物の存在下での内因性受容体とその化合物の不存在下での内
因性受容体との間を識別するために、そのような化合物がインバースアゴニスト
、アゴニストおよび部分アゴニストであるかどうか、またはそのような受容体に
影響をもたないのかどうかを理解することができるような識別を目的として、そ
のような識別を強化できる方法を利用することが好ましい。好適な方法は、GPCR
融合タンパク質の使用である。
むしろ候補化合物を最初に直接的に同定するために使用することができる。その
ような選択は主に技術者の選択の問題である。GPR6に関しては修飾された市販さ
れているcAMPアッセイを使用することが、インバースアゴニストの直接的同定に
最初に利用された。 Ｃ ３．GPCR融合タンパク質 インバースアゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストを直接的に同定する
ために、候補化合物のスクリーニングに使用する内因性の構成的に活性化される
オーファンGPCRの使用は、定義によれば内因性の受容体はそれに結合する内因性
のリガンドの不存在下でも活性であるという点で、独自な挑戦を提供する。すな
わち例えば候補化合物の存在下での内因性受容体とその化合物の不存在下での内
因性受容体との間を識別するために、そのような化合物がインバースアゴニスト
、アゴニストおよび部分アゴニストであるかどうか、またはそのような受容体に
影響をもたないのかどうかを理解することができるような識別を目的として、そ
のような識別を強化できる方法を利用することが好ましい。好適な方法は、GPCR
融合タンパク質の使用である。
【００３５】 一般にいったん内因性のオーファンGPCRが構成的に活性であると決定されれば
、上記に説明した（ならびに他の）アッセイ技法を使用して内因性GPCRと共役す
る主要なＧタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質のGPCRへの共
役は、評価することができるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニングは哺
乳動物発現系を使用することにより行うことが最も好適であるので、そのような
系には内因性Ｇタンパク質を中に有することが期待されるだろう。すなわち定義
によりこのような系では、内因性の構成的に活性なオーファンGPCRが持続的にシ
グナルを発信する。これに関して、このシグナルは例えば受容体に対するインバ
ースアゴニストの存在下で、特にスクリーニングの内容において受容体がインバ
ースアゴニストと接触した時と接触しない時との間をより容易に識別できるよう
に強化されることが好ましい。
、上記に説明した（ならびに他の）アッセイ技法を使用して内因性GPCRと共役す
る主要なＧタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質のGPCRへの共
役は、評価することができるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニングは哺
乳動物発現系を使用することにより行うことが最も好適であるので、そのような
系には内因性Ｇタンパク質を中に有することが期待されるだろう。すなわち定義
によりこのような系では、内因性の構成的に活性なオーファンGPCRが持続的にシ
グナルを発信する。これに関して、このシグナルは例えば受容体に対するインバ
ースアゴニストの存在下で、特にスクリーニングの内容において受容体がインバ
ースアゴニストと接触した時と接触しない時との間をより容易に識別できるよう
に強化されることが好ましい。
【００３６】 GPCR融合タンパク質は、内因性GPCRと共役するＧタンパク質の効能を強化する
ことを意図する。GPCR融合タンパク質は、そのような方法がそのようなスクリー
ニング技法において最も好ましく使用されるシグナルを増加させるので、内因性
の構成的に活性化されるGPCRを用いたスクリーニングに重要となると考えられる
。有意な「シグナル対ノイズ」比を容易にすることが、本明細書に開示するよう
に候補化合物のスクリーニングに重要である。
ことを意図する。GPCR融合タンパク質は、そのような方法がそのようなスクリー
ニング技法において最も好ましく使用されるシグナルを増加させるので、内因性
の構成的に活性化されるGPCRを用いたスクリーニングに重要となると考えられる
。有意な「シグナル対ノイズ」比を容易にすることが、本明細書に開示するよう
に候補化合物のスクリーニングに重要である。
【００３７】 GPCR融合タンパク質の発現に有用な構築物の構造は、当業者の視野内にある。
市販されている発現ベクターおよび系は、研究者の特定の必要性に合わせること
ができる種々の方法を提供する。そのようなGPCR融合タンパク質構築物に関する
１つの重要な基準は、内因性GPCR配列およびＧタンパク質配列が両方とも枠内に
あり（好ましくは、内因性GPCRの配列がＧタンパク質配列の上流にある）、そし
てGPCRの「終止」コドンはGPCRの発現に際してＧタンパク質も発現できるように
欠失しているか、または置き換えられなければならないことである。GPCRはＧタ
ンパク質に直接連結することができ、またはこの２つの間にスペーサー残基があ
ることができる（好ましくは約12以下であるが、この数は当業者により容易に確
認することができる）。我々は両方の方法をすでに評価し、そしてGPCRの活性の
測定に関して結果は実質的に同じである；しかし使用しない幾つかの制限部位が
発現に際して効果的にスペーサーとなりうるスペーサーの使用が（便利さに基づ
き）好ましい。最も好ましくは、内因性のGPCRと共役するＧタンパク質は、GPCR
融合タンパク質構築物の作成前に同定されているだろう。同定されたＧタンパク
質はわずかしかないので、Ｇタンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち、
ユニバーサルＧタンパク質構築物）を、内因性のGPCR配列をその中に挿入するた
めに利用することができる；これは異なる配列を有する種々の内因性GPCRの大規
模スクリーニングに関して有効性を提供する。 Ｅ．薬化学 一般にしかし常にではないが、候補化合物の直接的同定は好ましくはコンビナ
トリアルケミストリーの技術を介して生成される化合物と一緒に行われ、これに
より数千の化合物がそのような目的に無作為に調製される。一般にそのようなス
クリーニングの結果は、独自の中心となる構造を有する化合物となるだろう；そ
の後にこのような化合物は好ましくは好適な中心構造（１つまたは複数）のまわ
りにさらなる化学修飾を施され、それらの薬学的特性がさらに強化される。この
ように、直接的に同定されるインバースアゴニスト、アゴニストおよび／または
部分アゴニストは、そのような化合物を含んで成る医薬組成物の開発に先立ち、
有利に改善することができる。一般に、医薬組成物にさらに仕上げるために選択
される直接的に同定された化合物の結合親和性は、100nM未満のレセプターに対
する結合親和性を有することが好ましいが、一般にはこれは技術者の特定の必要
性に基づく好適な選択である。そのような技法は当業者には周知であり、そして
本明細書で詳細には取り扱わない。 Ｆ．医薬組成物 さらなる開発のために選択される候補化合物は、当業者に周知な技法を使用し
て医薬組成物に製剤することができる。適当な医薬的に許容できるキャリアーを
当該技術分野で利用することができる；例えばレミングトンの薬科学（Remingto
n's Pharmaceutical Science)、第16版、マック出版社（Mack Publishing Co.）
（Oslo et al.編集）を参照にされたい。
市販されている発現ベクターおよび系は、研究者の特定の必要性に合わせること
ができる種々の方法を提供する。そのようなGPCR融合タンパク質構築物に関する
１つの重要な基準は、内因性GPCR配列およびＧタンパク質配列が両方とも枠内に
あり（好ましくは、内因性GPCRの配列がＧタンパク質配列の上流にある）、そし
てGPCRの「終止」コドンはGPCRの発現に際してＧタンパク質も発現できるように
欠失しているか、または置き換えられなければならないことである。GPCRはＧタ
ンパク質に直接連結することができ、またはこの２つの間にスペーサー残基があ
ることができる（好ましくは約12以下であるが、この数は当業者により容易に確
認することができる）。我々は両方の方法をすでに評価し、そしてGPCRの活性の
測定に関して結果は実質的に同じである；しかし使用しない幾つかの制限部位が
発現に際して効果的にスペーサーとなりうるスペーサーの使用が（便利さに基づ
き）好ましい。最も好ましくは、内因性のGPCRと共役するＧタンパク質は、GPCR
融合タンパク質構築物の作成前に同定されているだろう。同定されたＧタンパク
質はわずかしかないので、Ｇタンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち、
ユニバーサルＧタンパク質構築物）を、内因性のGPCR配列をその中に挿入するた
めに利用することができる；これは異なる配列を有する種々の内因性GPCRの大規
模スクリーニングに関して有効性を提供する。 Ｅ．薬化学 一般にしかし常にではないが、候補化合物の直接的同定は好ましくはコンビナ
トリアルケミストリーの技術を介して生成される化合物と一緒に行われ、これに
より数千の化合物がそのような目的に無作為に調製される。一般にそのようなス
クリーニングの結果は、独自の中心となる構造を有する化合物となるだろう；そ
の後にこのような化合物は好ましくは好適な中心構造（１つまたは複数）のまわ
りにさらなる化学修飾を施され、それらの薬学的特性がさらに強化される。この
ように、直接的に同定されるインバースアゴニスト、アゴニストおよび／または
部分アゴニストは、そのような化合物を含んで成る医薬組成物の開発に先立ち、
有利に改善することができる。一般に、医薬組成物にさらに仕上げるために選択
される直接的に同定された化合物の結合親和性は、100nM未満のレセプターに対
する結合親和性を有することが好ましいが、一般にはこれは技術者の特定の必要
性に基づく好適な選択である。そのような技法は当業者には周知であり、そして
本明細書で詳細には取り扱わない。 Ｆ．医薬組成物 さらなる開発のために選択される候補化合物は、当業者に周知な技法を使用し
て医薬組成物に製剤することができる。適当な医薬的に許容できるキャリアーを
当該技術分野で利用することができる；例えばレミングトンの薬科学（Remingto
n's Pharmaceutical Science)、第16版、マック出版社（Mack Publishing Co.）
（Oslo et al.編集）を参照にされたい。
【００３８】
実施例 以下の実施例は、本発明を説明するために提供するが限定するものではない。
具体的な核酸およびアミノ酸配列を本明細書で開示するが、当業者は以下に報告
するものと同じか、または実質的に同じ結果を達成しながらこのような配列にわ
ずかな改変を施す能力を持つと考える。GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR
、OGR1、RE2およびALO22171に対して85パーセント(85％）の相同性、より好まし
くは90パーセント（90％）の相同性、そして最も好ましくは95パーセント（95％
）より高い相同性を有する均等な内因性の構成的に活性化されるヒトのオーファ
ン受容体配列は、前記特許請求の範囲内にあることを意図している。 実施例１ イン・シトウ(In Situ)プローブの調製 GPR3、GPR6およびGPR12用のイン・シトウプローブを調製した。以下のPCRプロ
トコールをすべての３種のプローブに使用した：使用した反応条件は、50μlの
反応容量中に、１×rTth DNAポリメラーゼバッファーII、1.5mM Mg(OAc)2、0.2m
Mの各４種のヌクレオチド、0.228μgのラットのゲノム DNA、0.25μMの各プライ
マー（以下を参照のこと）および１単位のrTth DNAポリメラーゼ（パーキンエル
マー：Perkin Elmer）であった。サイクル条件は、94℃で１分、55℃で１分およ
び72℃で45秒をパーキンエルマーシータス2400温度循環器中で30サイクルであっ
た。 １．ラットGPR3 イン・シトウプローブ ラットGPR3に関する完全長のcDNA配列はデータベースから入手できないので、
イン・シトウプローブ用のDNAフラグメントは、公開されているヒトおよびマウ
スのGPR3配列の膜貫通ドメイン3の中央部に基づく3'縮重オリゴヌクレオチド、
および5'細胞外ドメインの始まり付近の5'縮重オリゴヌクレオチドを使用してPC
Rにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：
具体的な核酸およびアミノ酸配列を本明細書で開示するが、当業者は以下に報告
するものと同じか、または実質的に同じ結果を達成しながらこのような配列にわ
ずかな改変を施す能力を持つと考える。GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR
、OGR1、RE2およびALO22171に対して85パーセント(85％）の相同性、より好まし
くは90パーセント（90％）の相同性、そして最も好ましくは95パーセント（95％
）より高い相同性を有する均等な内因性の構成的に活性化されるヒトのオーファ
ン受容体配列は、前記特許請求の範囲内にあることを意図している。 実施例１ イン・シトウ(In Situ)プローブの調製 GPR3、GPR6およびGPR12用のイン・シトウプローブを調製した。以下のPCRプロ
トコールをすべての３種のプローブに使用した：使用した反応条件は、50μlの
反応容量中に、１×rTth DNAポリメラーゼバッファーII、1.5mM Mg(OAc)2、0.2m
Mの各４種のヌクレオチド、0.228μgのラットのゲノム DNA、0.25μMの各プライ
マー（以下を参照のこと）および１単位のrTth DNAポリメラーゼ（パーキンエル
マー：Perkin Elmer）であった。サイクル条件は、94℃で１分、55℃で１分およ
び72℃で45秒をパーキンエルマーシータス2400温度循環器中で30サイクルであっ
た。 １．ラットGPR3 イン・シトウプローブ ラットGPR3に関する完全長のcDNA配列はデータベースから入手できないので、
イン・シトウプローブ用のDNAフラグメントは、公開されているヒトおよびマウ
スのGPR3配列の膜貫通ドメイン3の中央部に基づく3'縮重オリゴヌクレオチド、
および5'細胞外ドメインの始まり付近の5'縮重オリゴヌクレオチドを使用してPC
Rにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりであった：
【００３９】
【表２】
【００４０】 ヌクレオチド24から膜貫通ドメイン３の中央までを含む537bpのPCRフラグメン
トを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部位
にサブクローン化した。 ２．ラットGPR6 イン・シトウプローブ ラットGPR6のイン・シトウプローブDNAフラグメントは、公開されているラッ
トGPR6 cDNA配列に基づきPCRにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列は
以下のとおりであった：
トを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部位
にサブクローン化した。 ２．ラットGPR6 イン・シトウプローブ ラットGPR6のイン・シトウプローブDNAフラグメントは、公開されているラッ
トGPR6 cDNA配列に基づきPCRにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列は
以下のとおりであった：
【００４１】
【表３】
【００４２】 ヌクレオチド-10から膜貫通ドメイン４の中央までを含む608bpのPCRフラグメ
ントを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部
位にサブクローン化した。 ３．ラットGPR12 イン・シトウプローブ ラットGPR12のイン・シトウプローブDNAフラグメントは、公開されているラッ
トGPR12 cDNA配列に基づきPCRにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列
は以下のとおりであった：
ントを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部
位にサブクローン化した。 ３．ラットGPR12 イン・シトウプローブ ラットGPR12のイン・シトウプローブDNAフラグメントは、公開されているラッ
トGPR12 cDNA配列に基づきPCRにより得た。使用したオリゴヌクレオチドの配列
は以下のとおりであった：
【００４３】
【表４】
【００４４】 ヌクレオチド-5から膜貫通ドメイン４の中央までを含む516bpのPCRフラグメン
トを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部位
にサブクローン化した。
トを、BamHIおよびHindIIIで消化し、そしてpBluescriptのBamHI−HindIII部位
にサブクローン化した。
【００４５】 作成されたイン・シトウプローブ配列は、以下の通りであった： ラットGPR3プローブ：
【００４６】
【表５】
【００４７】 ラットGPR6プローブ：
【００４８】
【表６】
【００４９】 ラットGPR12プローブ：
【００５０】
【表７】
【００５１】 実施例２ 受容体の発現 １．cDNAおよびベクター GPR3およびGPR6に関して、cDNAを含んで成る発現ベクターはBrian O'Dowd（ト
ロント大学）の好意により提供された。GPR3 cDNAのベクターはpcDNA3であった
；GPR6のベクターはpRcCMVであった（GPR6のコード領域はHindIII-Xba1部位でpC
MVベクターにサブクローン化された）。GPR12 cDNAは以下のプロトコールを使用
して調製した：ヒトGPR12 cDNAは、ヒトのゲノムDNAおよびHindIII制限部位を持
つ5'非翻訳領域からの5'プライマー、およびBamHI部位を含む3'非翻訳領域から
の3'プライマーを使用してPCRにより得た。プライマーは以下の配列を有した：
ロント大学）の好意により提供された。GPR3 cDNAのベクターはpcDNA3であった
；GPR6のベクターはpRcCMVであった（GPR6のコード領域はHindIII-Xba1部位でpC
MVベクターにサブクローン化された）。GPR12 cDNAは以下のプロトコールを使用
して調製した：ヒトGPR12 cDNAは、ヒトのゲノムDNAおよびHindIII制限部位を持
つ5'非翻訳領域からの5'プライマー、およびBamHI部位を含む3'非翻訳領域から
の3'プライマーを使用してPCRにより得た。プライマーは以下の配列を有した：
【００５２】
【表８】
【００５３】 PCRは、製造元により提供されたバッファー系を含むrTthポリメラーゼ（パー
キンエルマー)、0.25μMの各プライマー、0.2μMの４種の各ヌクレオチドおよび
鋳型として0.2μgのゲノムDNAを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、5
7℃で１分および72℃で1.5分を30サイクルであった。1.2kbのPCRフラグメントを
HindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII−BamHI部位に
サブクローン化した。生成したcDNAクローンは完全に配列決定し、そして公開さ
れている配列と一致した。
キンエルマー)、0.25μMの各プライマー、0.2μMの４種の各ヌクレオチドおよび
鋳型として0.2μgのゲノムDNAを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、5
7℃で１分および72℃で1.5分を30サイクルであった。1.2kbのPCRフラグメントを
HindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのHindIII−BamHI部位に
サブクローン化した。生成したcDNAクローンは完全に配列決定し、そして公開さ
れている配列と一致した。
【００５４】 GPR21に関して、PCRは鋳型としてゲノムDNAおよび製造元により提供されたバ
ッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４
種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、62℃で１分お
よび72℃で１分20秒を30サイクルであった。5'PCRプライマーはキナーゼ処理し
、配列
ッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４
種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、62℃で１分お
よび72℃で１分20秒を30サイクルであった。5'PCRプライマーはキナーゼ処理し
、配列
【００５５】
【表９】
【００５６】 を得、そして3'プライマーは以下の配列でBamHIを含んだ。
【００５７】
【表１０】
【００５８】 生成した1.1kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、そしてpCMV発現ベクターのE
coRV-BamHI部位にクローン化した。ヒトGPR21について核酸（配列番号14）およ
びアミノ酸（配列番号15）配列をその後に決定した。
coRV-BamHI部位にクローン化した。ヒトGPR21について核酸（配列番号14）およ
びアミノ酸（配列番号15）配列をその後に決定した。
【００５９】 AL022171に関して、PCRは鋳型としてゲノムDNAおよび製造元により提供された
バッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各
４種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、54℃で１分
および72℃で１分20秒を30サイクルであった。5'PCRプライマーは以下の配列でH
indIIIを含み：
バッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各
４種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、54℃で１分
および72℃で１分20秒を30サイクルであった。5'PCRプライマーは以下の配列でH
indIIIを含み：
【００６０】
【表１１】
【００６１】 そして3'プライマーは以下の配列でEcoRI部位を含んだ：
【００６２】
【表１２】
【００６３】 生成した1.15kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびEcoRIで消化し、そしてpCMV
発現ベクターのHindIII−EcoRI部位にクローン化した。ヒトAL022171について核
酸（配列番号18）およびアミノ酸（配列番号19）配列をその後に決定し、そして
確認した。
発現ベクターのHindIII−EcoRI部位にクローン化した。ヒトAL022171について核
酸（配列番号18）およびアミノ酸（配列番号19）配列をその後に決定し、そして
確認した。
【００６４】 GPR4（GeneBank 寄託番号L36148）に関して、cDNAを含んで成る発現ベクター
は、Brian O'Dowd（トロント大学）の好意により提供された。GPR4 cDNAのベク
ターはpcDNA3であり、そしてこれはHindIII-Xba1部位でpCMVベクターにサブクロ
ーン化された（HindIIIとApaI部位との間の5'非翻訳領域を、消化／自己連結を
行い整えた）。
は、Brian O'Dowd（トロント大学）の好意により提供された。GPR4 cDNAのベク
ターはpcDNA3であり、そしてこれはHindIII-Xba1部位でpCMVベクターにサブクロ
ーン化された（HindIIIとApaI部位との間の5'非翻訳領域を、消化／自己連結を
行い整えた）。
【００６５】 RE12（GeneBank 寄託番号AF091890）に関して、PCRは鋳型としてヒト脳のcDNA
および製造元により提供されたバッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μM
の各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル
条件は、94℃で１分、62℃で１分および72℃で１分30秒を30サイクルであった。
この5'-PCRプライマーはEcoRI部位を含み、配列
および製造元により提供されたバッファー系を含むrTthポリメラーゼ、0.25μM
の各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用いて行った。サイクル
条件は、94℃で１分、62℃で１分および72℃で１分30秒を30サイクルであった。
この5'-PCRプライマーはEcoRI部位を含み、配列
【００６６】
【表１３】
【００６７】 であり、そして3'プライマーはBamHI部位を含み、配列
【００６８】
【表１４】
【００６９】 であった。２回のPCR後に生成した1.36kbのPCRフラグメントは、次にEcoRIおよ
びBamHIで消化し、そしてpCMVのEcoRV-BamHI部位にクローン化した。核酸（配列
番号22）およびアミノ酸配列（配列番号23）をその後に決定した。
びBamHIで消化し、そしてpCMVのEcoRV-BamHI部位にクローン化した。核酸（配列
番号22）およびアミノ酸配列（配列番号23）をその後に決定した。
【００７０】 OGR1（GeneBank 寄託番号U48405）に関して、PCRは鋳型としてヒトのゲノムDN
Aおよび製造元により提供されたバッファー系を含むrTthポリメラーゼ（パーキ
ンエルマー）、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用
いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、62℃で１分および72℃で１分20秒を
30サイクルであった。この5'PCR-プライマーはHindIII部位を含み、配列
Aおよび製造元により提供されたバッファー系を含むrTthポリメラーゼ（パーキ
ンエルマー）、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用
いて行った。サイクル条件は、94℃で１分、62℃で１分および72℃で１分20秒を
30サイクルであった。この5'PCR-プライマーはHindIII部位を含み、配列
【００７１】
【表１５】
【００７２】 であり、そして3'プライマーはBamHI部位を含み、配列
【００７３】
【表１６】
【００７４】 であった。生成した1.14kbのPCRフラグメントをHindIIIおよびBamHIで消化し、
そしてpCMVのHindIII-BamHI部位にクローン化した。核酸（配列番号26）および
アミノ酸配列（配列番号27）をその後に決定した。
そしてpCMVのHindIII-BamHI部位にクローン化した。核酸（配列番号26）および
アミノ酸配列（配列番号27）をその後に決定した。
【００７５】 GHSRに関して、PCRは鋳型として海馬のcDNAおよび製造元により提供されたバ
ッファー系を含むTaqPlus Precisionポリメラーゼ(ストラタジーン：Stratagene
）、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用いて行った
。サイクル条件は、94℃で１分、68℃で１分および72℃で１分10秒を30サイクル
であった。第１回目のPCRについて5'PCR-プライマー配列は：
ッファー系を含むTaqPlus Precisionポリメラーゼ(ストラタジーン：Stratagene
）、0.25μMの各プライマーおよび0.2mMの各４種のヌクレオチドを用いて行った
。サイクル条件は、94℃で１分、68℃で１分および72℃で１分10秒を30サイクル
であった。第１回目のPCRについて5'PCR-プライマー配列は：
【００７６】
【表１７】
【００７７】 であり、そして3'-プライマー配列は：
【００７８】
【表１８】
【００７９】 であった。２マイクロリットルの第１回目のPCRを第２回目のPCRの鋳型として使
用し、ここで5'プライマーはキナーゼ処理した配列：
用し、ここで5'プライマーはキナーゼ処理した配列：
【００８０】
【表１９】
【００８１】 であり、そして3'プライマーはEcoRI部位を含み、配列：
【００８２】
【表２０】
【００８３】 であった。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、そしてpCMV発現ベクター
の平滑-EcoRI部位にクローン化した。ヒトGHSRに関する核酸（配列番号44）およ
びアミノ酸（配列番号45）配列をその後に決定した。 ２．トランスフェクションの手順 １日目に、150mmプレートあたり１×107の293または293Ｔ細胞をプレートにま
いた。２日目に、２つの反応試験管を準備した（各試験管を追跡するための比率
は、プレートあたりである）：試験管Ａは８〜20μgの間のDNA（例えばpCMVベク
ター；レポーターcDNAを含むpCMVベクター；GPCR融合タンパク質を含むpCMV、同
上）を、１〜２mlの無血清DMEM（イルバイン サイエンティフィック(Irvine Sci
entific）、イルバイン、カリフォルニア州）中で混合することにより準備した
：試験管Ｂは、50〜120μlのリポフェクタミン（ギブコ：Gibco BRL）を１〜２m
lの無血清DMEM中で混合することにより準備した。次に試験管ＡおよびＢを上下
にすることにより混合し（数回）、続いて室温で30〜45分間インキューベートし
た。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートにまいた細
胞は、１×PBSで洗浄し、続いて10〜12mlの無血清DMEMを加えた。次に2.4mlのト
ランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて37℃／５％CO2で４時間インキ
ューベートした。次にトランスフェクション混合物を吸引により除去し、続いて
25mlのDMEM／10％ウシ胎児血清を加えた。次に細胞を37℃／５％CO2でインキュ
ーベートした。
の平滑-EcoRI部位にクローン化した。ヒトGHSRに関する核酸（配列番号44）およ
びアミノ酸（配列番号45）配列をその後に決定した。 ２．トランスフェクションの手順 １日目に、150mmプレートあたり１×107の293または293Ｔ細胞をプレートにま
いた。２日目に、２つの反応試験管を準備した（各試験管を追跡するための比率
は、プレートあたりである）：試験管Ａは８〜20μgの間のDNA（例えばpCMVベク
ター；レポーターcDNAを含むpCMVベクター；GPCR融合タンパク質を含むpCMV、同
上）を、１〜２mlの無血清DMEM（イルバイン サイエンティフィック(Irvine Sci
entific）、イルバイン、カリフォルニア州）中で混合することにより準備した
：試験管Ｂは、50〜120μlのリポフェクタミン（ギブコ：Gibco BRL）を１〜２m
lの無血清DMEM中で混合することにより準備した。次に試験管ＡおよびＢを上下
にすることにより混合し（数回）、続いて室温で30〜45分間インキューベートし
た。この混合物を「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレートにまいた細
胞は、１×PBSで洗浄し、続いて10〜12mlの無血清DMEMを加えた。次に2.4mlのト
ランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて37℃／５％CO2で４時間インキ
ューベートした。次にトランスフェクション混合物を吸引により除去し、続いて
25mlのDMEM／10％ウシ胎児血清を加えた。次に細胞を37℃／５％CO2でインキュ
ーベートした。
【００８４】 GPCR融合タンパク質には、上記に対して好適な量は次の通りである：12μg DN
A；２ml無血清DMEM；60μlリポフェクタミン；293細胞９および12mlの無血清DME
M）。 実施例３ GPCRの組織分布 幾つかのオーファン受容体に関して、当業者はそのような受容体の例えばヒト
内での分布、あるいは疾患状態との関連に対して理解はあるようである。しかし
多くのオーファン受容体に関しては、そのような情報は知られていないか、ある
いは知られないだろう。したがってそのような受容体がどこに分布し得るのかの
解明が好ましいと考えられる：これにより特定の受容体と、受容体が優先的に発
現する特定の組織に関連する疾患状態または障害とを関連づける予測的機会を得
る能力が与えられる。市販されているmRNAドット-ブロット形式を使用して、内
因性の構成的に活性なGPCRの種々の組織型中での分布を評価した。
A；２ml無血清DMEM；60μlリポフェクタミン；293細胞９および12mlの無血清DME
M）。 実施例３ GPCRの組織分布 幾つかのオーファン受容体に関して、当業者はそのような受容体の例えばヒト
内での分布、あるいは疾患状態との関連に対して理解はあるようである。しかし
多くのオーファン受容体に関しては、そのような情報は知られていないか、ある
いは知られないだろう。したがってそのような受容体がどこに分布し得るのかの
解明が好ましいと考えられる：これにより特定の受容体と、受容体が優先的に発
現する特定の組織に関連する疾患状態または障害とを関連づける予測的機会を得
る能力が与えられる。市販されているmRNAドット-ブロット形式を使用して、内
因性の構成的に活性なGPCRの種々の組織型中での分布を評価した。
【００８５】 好ましくは受容体の全コード領域を使用して、Prime-ItII（商標）ランダム
プライマー ラベリング キット(Random Primer Labeling Kit：ストラタジーン
（Stratagene）#300385）を用いて製造元の指示に従い放射標識プローブを作成
する。例としてこの方法をGPR4に利用した。
プライマー ラベリング キット(Random Primer Labeling Kit：ストラタジーン
（Stratagene）#300385）を用いて製造元の指示に従い放射標識プローブを作成
する。例としてこの方法をGPR4に利用した。
【００８６】 ヒトRNA Master Blot(商標)キット（クローンテック（Clontech)、#7770-1）
をこのプローブとハイブリダイズさせ、そして緊縮条件下で製造元の指示に従い
洗浄した。このブロットをKodak BioMax(商標)オートラジオグラフィーフィルム
に-80℃で一晩暴露した。結果を図３に示す。このような結果に基づき、GPR4は
種々の胎児組織型全体（Ｇ列）、ならびに非-胎児心臓（Ｃ１）および非-胎児肺
（Ｆ１）に発現することに注目されたい。この方法は他の受容体にも容易に利用
することができる。 実施例４ GTPの膜結合シンチレーション近接アッセイ Ｇタンパク質−共役受容体がリガンドの結合または構成的な活性化の結果のい
ずれかとしてその活性状態である時、受容体はＧタンパク質に結合し（GPR3、GP
R4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171、Gsの場合）、そし
てGTPのＧタンパク質への結合を刺激する。三量体のＧ-タンパク質−受容体複合
体はGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへゆっくりと加水分解し、この時点で
受容体は通常不活性型（deactivated）である。構成的に活性化された受容体はG
DPをGTPに変換し続ける。非−加水分解性のGTP同族体である[35S]GTPγSは、[35 S]GTPγSの構成的に活性化された受容体を発現する膜への強化された結合を示す
ために使用することができる。構成的な活性化を測定するために[35S]GTPγS結
合を使用することの利点は：（ａ）すべてのＧ−タンパク質共役受容体に包括的
に応用することができる：（ｂ）これは膜表面に近接しているので、細胞内カス
ケードに影響を及ぼす分子を拾う（pick-up）可能性が低いということである。
をこのプローブとハイブリダイズさせ、そして緊縮条件下で製造元の指示に従い
洗浄した。このブロットをKodak BioMax(商標)オートラジオグラフィーフィルム
に-80℃で一晩暴露した。結果を図３に示す。このような結果に基づき、GPR4は
種々の胎児組織型全体（Ｇ列）、ならびに非-胎児心臓（Ｃ１）および非-胎児肺
（Ｆ１）に発現することに注目されたい。この方法は他の受容体にも容易に利用
することができる。 実施例４ GTPの膜結合シンチレーション近接アッセイ Ｇタンパク質−共役受容体がリガンドの結合または構成的な活性化の結果のい
ずれかとしてその活性状態である時、受容体はＧタンパク質に結合し（GPR3、GP
R4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2およびALO22171、Gsの場合）、そし
てGTPのＧタンパク質への結合を刺激する。三量体のＧ-タンパク質−受容体複合
体はGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへゆっくりと加水分解し、この時点で
受容体は通常不活性型（deactivated）である。構成的に活性化された受容体はG
DPをGTPに変換し続ける。非−加水分解性のGTP同族体である[35S]GTPγSは、[35 S]GTPγSの構成的に活性化された受容体を発現する膜への強化された結合を示す
ために使用することができる。構成的な活性化を測定するために[35S]GTPγS結
合を使用することの利点は：（ａ）すべてのＧ−タンパク質共役受容体に包括的
に応用することができる：（ｂ）これは膜表面に近接しているので、細胞内カス
ケードに影響を及ぼす分子を拾う（pick-up）可能性が低いということである。
【００８７】 このアッセイは、Ｇタンパク質共役受容体が[35S]GTPγSの関連する受容体を
発現している膜への結合を刺激する能力を利用している。したがってこのアッセ
イは、既知の、オーファンおよび構成的に活性化されるＧタンパク質共役受容体
に対する候補化合物をスクリーニングするための直接的な同定法に使用すること
ができる。このアッセイは包括的であり、そしてすべてのＧタンパク質共役受容
体での薬剤探索に応用を有する。
発現している膜への結合を刺激する能力を利用している。したがってこのアッセ
イは、既知の、オーファンおよび構成的に活性化されるＧタンパク質共役受容体
に対する候補化合物をスクリーニングするための直接的な同定法に使用すること
ができる。このアッセイは包括的であり、そしてすべてのＧタンパク質共役受容
体での薬剤探索に応用を有する。
【００８８】 [35S]GTPγSアッセイは20mM HEPES、pH7.4、12nM [35S]GTPγSおよび75μg膜
タンパク質［例えばGPCR3を発現する293T細胞］および１μM GDPを含む結合バッ
ファー中で１時間インキューベーションした。小麦胚芽アグルチニンビーズ（25
μl;アマーシャム(Amersham)）を次に加え、そして混合物をさらに室温で30分間
インキューベーションした。次に試験管を室温にて1500×gで５分間遠心し、そ
してシンチレーションカウンターで計数した。
タンパク質［例えばGPCR3を発現する293T細胞］および１μM GDPを含む結合バッ
ファー中で１時間インキューベーションした。小麦胚芽アグルチニンビーズ（25
μl;アマーシャム(Amersham)）を次に加え、そして混合物をさらに室温で30分間
インキューベーションした。次に試験管を室温にて1500×gで５分間遠心し、そ
してシンチレーションカウンターで計数した。
【００８９】 図４を参照にすると、GPR3受容体は対照に比べて活性が上昇していると決定さ
れ；この強調される活性は、そのデータが全細胞調製物とは反対に膜の調製物か
ら得られており、オートクリン刺激による結果ではない。 実施例５ 受容体の相同性の決定 GPR3が構成的に活性化される受容体であることを確認し、市販されているプロ
グラムであるDNA Starを使用して利用できるＧタンパク質-共役体のデータバン
ク（GeneBank）の相同性調査をした後、２つの高度に相同的な受容体、GPR6およ
びGPR12（図５Ａを参照にされたい）を同定し、これらの受容体の両方がオーフ
ァン受容体である。このような受容体の配列はすでに「知られていた」（すなわ
ち、それらはデーターベース上で利用できた）が、このような２つの受容体がそ
れらの内因性形態で構成的に活性化されることは知られていなかった（実施例６
、図７を参照にされたい）。さらにこれまではそれらのリガンドが知られていな
いか、または同定されなかったので、薬剤発見プログラムにおいて使用するため
にそのような受容体を調査する理由がなかっただろう。それだけでは薬剤発見に
対する定説的な方法により、せいぜいわずかな興味しかなく、または恐らくはち
ぐはぐなGPR3、GPR6およびGPR12間の相同性が見いだされたことであろう。 実施例６ 構成的な活性化についての相同受容体の分析 タンパク質の発現には当該技術分野で種々の細胞を利用することができるが、
哺乳動物細胞を利用できることが最も好適である。この主要な理由は、実用性す
なわちGPCRの発現のための利用性(例えば酵母細胞)に基づくが、可能ではあるも
ののプロトコールに哺乳動物系に進化した受容体の共役、遺伝的メカニズムおよ
び分泌経路を含まないかもしれない(実際に酵母細胞の場合は含まない)非-哺乳
動物細胞を導入することにより、非哺乳動物細胞でこのように得られる結果は潜
在的な利用性はあるものの、哺乳動物細胞から得られる結果ほど好ましくない。
哺乳動物細胞の中でも、COS-7、293および293Ｔ細胞が特に好ましいが、使用す
る具体的な哺乳動物細胞は、技術者の特定の必要性に基づくことができる。 １．GPR3、GPR6およびGPR12の分析 多Gal4結合部位を含有するβ-ガラクトシダーゼレポーターを作成するために
、BalII／HindIIIフラグメントをソマトスタチンプロモーター−含有プラスミド
1.4(5×Gal)CATから取り出し（Leonard,J.et al(1992) PNAS USA 89:6247-6251
）、そしてpβgal−Basic（プロメガ：Promega）にクローン化した。BalII／Hin
dIIIフラグメントは最小ソマトスタチンプロモーターの変異体を含み（転写開始
部位に対して-71bpから+50bp）、ここでcAMP応答配列のコアの４bp（-46から-43
）を、酵母転写因子Gal4に関する認識配列の５コピーと置き換えた。このレポー
ターがGal4-CREB融合タンパク質をコードする発現プラスミドと共にコートラン
スフェクト（co-transfect）されると、cAMPシグナル発信経路を増す作用物質に
対して高度に反応性である。
れ；この強調される活性は、そのデータが全細胞調製物とは反対に膜の調製物か
ら得られており、オートクリン刺激による結果ではない。 実施例５ 受容体の相同性の決定 GPR3が構成的に活性化される受容体であることを確認し、市販されているプロ
グラムであるDNA Starを使用して利用できるＧタンパク質-共役体のデータバン
ク（GeneBank）の相同性調査をした後、２つの高度に相同的な受容体、GPR6およ
びGPR12（図５Ａを参照にされたい）を同定し、これらの受容体の両方がオーフ
ァン受容体である。このような受容体の配列はすでに「知られていた」（すなわ
ち、それらはデーターベース上で利用できた）が、このような２つの受容体がそ
れらの内因性形態で構成的に活性化されることは知られていなかった（実施例６
、図７を参照にされたい）。さらにこれまではそれらのリガンドが知られていな
いか、または同定されなかったので、薬剤発見プログラムにおいて使用するため
にそのような受容体を調査する理由がなかっただろう。それだけでは薬剤発見に
対する定説的な方法により、せいぜいわずかな興味しかなく、または恐らくはち
ぐはぐなGPR3、GPR6およびGPR12間の相同性が見いだされたことであろう。 実施例６ 構成的な活性化についての相同受容体の分析 タンパク質の発現には当該技術分野で種々の細胞を利用することができるが、
哺乳動物細胞を利用できることが最も好適である。この主要な理由は、実用性す
なわちGPCRの発現のための利用性(例えば酵母細胞)に基づくが、可能ではあるも
ののプロトコールに哺乳動物系に進化した受容体の共役、遺伝的メカニズムおよ
び分泌経路を含まないかもしれない(実際に酵母細胞の場合は含まない)非-哺乳
動物細胞を導入することにより、非哺乳動物細胞でこのように得られる結果は潜
在的な利用性はあるものの、哺乳動物細胞から得られる結果ほど好ましくない。
哺乳動物細胞の中でも、COS-7、293および293Ｔ細胞が特に好ましいが、使用す
る具体的な哺乳動物細胞は、技術者の特定の必要性に基づくことができる。 １．GPR3、GPR6およびGPR12の分析 多Gal4結合部位を含有するβ-ガラクトシダーゼレポーターを作成するために
、BalII／HindIIIフラグメントをソマトスタチンプロモーター−含有プラスミド
1.4(5×Gal)CATから取り出し（Leonard,J.et al(1992) PNAS USA 89:6247-6251
）、そしてpβgal−Basic（プロメガ：Promega）にクローン化した。BalII／Hin
dIIIフラグメントは最小ソマトスタチンプロモーターの変異体を含み（転写開始
部位に対して-71bpから+50bp）、ここでcAMP応答配列のコアの４bp（-46から-43
）を、酵母転写因子Gal4に関する認識配列の５コピーと置き換えた。このレポー
ターがGal4-CREB融合タンパク質をコードする発現プラスミドと共にコートラン
スフェクト（co-transfect）されると、cAMPシグナル発信経路を増す作用物質に
対して高度に反応性である。
【００９０】 VIP2.0Zcは、cAMP応答性VIPプロモーターの制御下でレポーター遺伝子β-ガラ
クトシダーゼを安定にトランスフェクトされた細胞系である（Konig et al.Mol.
Cell.Neuro.1991,2,331-337）。この細胞系はここで細胞内cAMPの蓄積を間接的
に測定するために使用された。約２百万細胞をトランスフェクションの前日に６
cmのプレートにまいた。各受容体に関してDNA（５μg）を200μg/mlのDEAEデキ
ストランおよび100μMのクロロキンを含有する2.5mlの無血清DMEMと混合し、そ
してすすいだ細胞の単層に加えた。CO2インキューベーター中で90分間インキュ
ーベーションした後、トランスフェクション培地を除去した。細胞を無血清培地
で洗浄し、そして新たな完全培地を補充した。トランスフェクションから24時間
後、細胞を96-ウェルプレートにウェルあたり50〜100Kの密度でまき、そしてβ-
ガラクトシダーゼ活性をトランスフェクションから48〜72時間後にアッセイした
。
クトシダーゼを安定にトランスフェクトされた細胞系である（Konig et al.Mol.
Cell.Neuro.1991,2,331-337）。この細胞系はここで細胞内cAMPの蓄積を間接的
に測定するために使用された。約２百万細胞をトランスフェクションの前日に６
cmのプレートにまいた。各受容体に関してDNA（５μg）を200μg/mlのDEAEデキ
ストランおよび100μMのクロロキンを含有する2.5mlの無血清DMEMと混合し、そ
してすすいだ細胞の単層に加えた。CO2インキューベーター中で90分間インキュ
ーベーションした後、トランスフェクション培地を除去した。細胞を無血清培地
で洗浄し、そして新たな完全培地を補充した。トランスフェクションから24時間
後、細胞を96-ウェルプレートにウェルあたり50〜100Kの密度でまき、そしてβ-
ガラクトシダーゼ活性をトランスフェクションから48〜72時間後にアッセイした
。
【００９１】 アッセイバッファーは、100mM リン酸ナトリウム、２mM MgSO4、0.1mM MnCl2
、pH8.0を含んだ。細胞をPBSで洗浄し、そして25μl/ウェルの0.1Ｘアッセイバ
ッファーからなる低張溶解バッファーを加えた。10分後、0.5％ Triton X-100お
よび40mM β-メルカプトエタノールを含有する100μlのアッセイバッファーを各
ウェルに加え、そして室温で10分間のインキューベーションを続けた。５mg/ml
のクロロフェノール レッド-β-D-ガラクトピラノシド（GPRG）をアッセイバッ
ファー中に含有する基質溶液を25μl/ウェルで加え、そしてプレートを37℃で30
分間インキューベーションした後、595nmでの吸収をプレートリーダーで測定し
た。
、pH8.0を含んだ。細胞をPBSで洗浄し、そして25μl/ウェルの0.1Ｘアッセイバ
ッファーからなる低張溶解バッファーを加えた。10分後、0.5％ Triton X-100お
よび40mM β-メルカプトエタノールを含有する100μlのアッセイバッファーを各
ウェルに加え、そして室温で10分間のインキューベーションを続けた。５mg/ml
のクロロフェノール レッド-β-D-ガラクトピラノシド（GPRG）をアッセイバッ
ファー中に含有する基質溶液を25μl/ウェルで加え、そしてプレートを37℃で30
分間インキューベーションした後、595nmでの吸収をプレートリーダーで測定し
た。
【００９２】 GPR3、GPR6およびGPR12を前述の系を使用してアッセイし、そしてGPR6およびG
PR12の両方が構成的に活性であると決定した。図６Ａを参照にされたい。 ２．GPR21およびAL022171の分析 293および293Ｔ細胞を、ウェルあたり２×104細胞の密度で96ウェルプレート
にまき、そして製造元の指示に従い翌日にリポフェクタミン試薬（BRL）を使用
してトランスフェクトさせた。DNA／脂質混合物を以下のように各６−ウェルト
ランスフェクション用に調製した：100μlのDEME中の260ngのプラスミドDNAを、
100μlのDEME中２μlの脂質と（260ngのプラスミドDNAは200ngの８×CRE-Lucレ
ポータープラスミド、内因性の受容体または非内因性の受容体またはpCMV単独を
含んで成る50ngのpCMV、および10ngのGPRS発現プラスミド（pcDNA3中のGPRS（イ
ンビトロゲン）から成った）でゆるやかに混合した。８×CRE-Lucレポータープ
ラスミドは以下のように調製した：ベクターSRIF-β-galは、ラットのソマトス
タチンプロモーター（-71/+51)を、pβgal-Basic Vector（クローンテック）中
のBalIV−HindIII部位にクローニングすることにより得た。cAMP応答配列の８コ
ピーを、アデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE8からPCRにより得（７つのヒト 遺伝
子治療（7 Human Gene Therapy）(1996)を参照にされたい）、そしてSRIF-β-ga
l ベクターにKpn-BglV部位でクローン化し、８×CRE-β-galレポーターベクター
を得た。８×CRE-Lucレポータープラスミドは、８×CRE-β-galレポーターベク
ターのベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、HindIII−BamHIII部位でpGL3-basic
ベクター（プロメガ）から得たルシフェラーゼ遺伝子と置き換えることにより
作成した。室温で30分間インキューベーションした後、DNA/脂質混合物を400μl
のDEMEで希釈し、そして100μlの希釈した混合物を各ウェルに加えた。10％FCS
を含有する100μlのDEMEを、細胞培養インキューベーターで４時間インキューベ
ーションした後に各ウェルに加えた。翌日、トランスフェクトした細胞は10％FC
Sを含有する200μl/ウェルのDEMEと交換した。８時間後、PBSで１回洗浄した後
に、ウェルにフェノールレッドを含まない100μl/ウェルのDEMEを加えた。ルシ
フェラーゼ活性は、製造元の指示に従いLucLite(商標)レポーター遺伝子アッセ
イキット（パッカード:Packard）を使用して翌日測定し、そして1450MicroBeta(
商標)シンチレーションおよび蛍光カウンター(ワァラック：Wallac)で読んだ。
結果を図６Ｂおよび６Ｃにまとめる。
PR12の両方が構成的に活性であると決定した。図６Ａを参照にされたい。 ２．GPR21およびAL022171の分析 293および293Ｔ細胞を、ウェルあたり２×104細胞の密度で96ウェルプレート
にまき、そして製造元の指示に従い翌日にリポフェクタミン試薬（BRL）を使用
してトランスフェクトさせた。DNA／脂質混合物を以下のように各６−ウェルト
ランスフェクション用に調製した：100μlのDEME中の260ngのプラスミドDNAを、
100μlのDEME中２μlの脂質と（260ngのプラスミドDNAは200ngの８×CRE-Lucレ
ポータープラスミド、内因性の受容体または非内因性の受容体またはpCMV単独を
含んで成る50ngのpCMV、および10ngのGPRS発現プラスミド（pcDNA3中のGPRS（イ
ンビトロゲン）から成った）でゆるやかに混合した。８×CRE-Lucレポータープ
ラスミドは以下のように調製した：ベクターSRIF-β-galは、ラットのソマトス
タチンプロモーター（-71/+51)を、pβgal-Basic Vector（クローンテック）中
のBalIV−HindIII部位にクローニングすることにより得た。cAMP応答配列の８コ
ピーを、アデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE8からPCRにより得（７つのヒト 遺伝
子治療（7 Human Gene Therapy）(1996)を参照にされたい）、そしてSRIF-β-ga
l ベクターにKpn-BglV部位でクローン化し、８×CRE-β-galレポーターベクター
を得た。８×CRE-Lucレポータープラスミドは、８×CRE-β-galレポーターベク
ターのベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、HindIII−BamHIII部位でpGL3-basic
ベクター（プロメガ）から得たルシフェラーゼ遺伝子と置き換えることにより
作成した。室温で30分間インキューベーションした後、DNA/脂質混合物を400μl
のDEMEで希釈し、そして100μlの希釈した混合物を各ウェルに加えた。10％FCS
を含有する100μlのDEMEを、細胞培養インキューベーターで４時間インキューベ
ーションした後に各ウェルに加えた。翌日、トランスフェクトした細胞は10％FC
Sを含有する200μl/ウェルのDEMEと交換した。８時間後、PBSで１回洗浄した後
に、ウェルにフェノールレッドを含まない100μl/ウェルのDEMEを加えた。ルシ
フェラーゼ活性は、製造元の指示に従いLucLite(商標)レポーター遺伝子アッセ
イキット（パッカード:Packard）を使用して翌日測定し、そして1450MicroBeta(
商標)シンチレーションおよび蛍光カウンター(ワァラック：Wallac)で読んだ。
結果を図６Ｂおよび６Ｃにまとめる。
【００９３】 GPR21およびAL022171は前述の系を使用してアッセイし、そしてこのような結
果に基づき、GPR21およびAL022171の両方がそれらの内因性形態で構成的に活性
であると決定した。図６Ｂおよび６Ｃを参照にされたい。 ３．GPR4、RE2、OGR1およびGHSRの分析 本明細書に定めたプロトコールを使用して、GPR4、RE2、OGR1およびGHSRを分
析し、そしてそれらの内因性形態で構成的に活性であることを決定した（データ
は示さず）。 実施例７ GPR3、GPR6およびGPR12の組織分布 組織サンプルは、以下のプライマーを使用して比較RT-PCRによりこのようなオ
ーファン受容体の発現について調査した： ＧＰＲ３：
果に基づき、GPR21およびAL022171の両方がそれらの内因性形態で構成的に活性
であると決定した。図６Ｂおよび６Ｃを参照にされたい。 ３．GPR4、RE2、OGR1およびGHSRの分析 本明細書に定めたプロトコールを使用して、GPR4、RE2、OGR1およびGHSRを分
析し、そしてそれらの内因性形態で構成的に活性であることを決定した（データ
は示さず）。 実施例７ GPR3、GPR6およびGPR12の組織分布 組織サンプルは、以下のプライマーを使用して比較RT-PCRによりこのようなオ
ーファン受容体の発現について調査した： ＧＰＲ３：
【００９４】
【表２１】
【００９５】 このようなプライマーは194bpフラグメントを増幅する。 ＧＰＲ６：
【００９６】
【表２２】
【００９７】 このようなプライマーは249bpフラグメントを増幅する。 ＧＰＲ１２：
【００９８】
【表２３】
【００９９】 このようなプライマーは220bpフラグメントを増幅する。
【０１００】 このようなアンプリコンは、各プライマー対がその各々の標的を同じ至適なア
ニーリング温度で増幅するように、重複しないように、すなわちそれらの間に配
列の類似性が無く、そして類似のT'mをもつように設計した。これにより多反応
で１つのプライマー対からのアンプリコンが別のプライマーのアニーリング標的
として作用する機会が減少し、それゆえに他のプライマー対を妨害する機会が減
少する。
ニーリング温度で増幅するように、重複しないように、すなわちそれらの間に配
列の類似性が無く、そして類似のT'mをもつように設計した。これにより多反応
で１つのプライマー対からのアンプリコンが別のプライマーのアニーリング標的
として作用する機会が減少し、それゆえに他のプライマー対を妨害する機会が減
少する。
【０１０１】 全RNAは、製造元の指示に従い組織サンプル（ヒト）からTRIzol（商標）試薬
（ギブコ／BRL）を使用して抽出した。cDNAは２mgの全RNAおよびFirst-Strand（
商標）cDNA合成キット（ファルマシア：Pharmacia）を使用して作成した。次にc
DNAサンプルをH2Oで１：３に希釈し、そして比較PCRを記載されているように（J
ensen,J.et al.(1996)、J.Biol.Chem.271:187490）、[32P]dCTPの存在下で行っ
た。すべての反応にSP-1特異的プライマーを含み、これは300bpフラグメントを
増幅して内部対照として役立った。上記に概略したプライマーを定めたPCR条件
下（１サイクル：95℃、５分；23サイクル：95℃、30秒、58℃、30秒、72℃、１
分；１サイクル：72℃、10分）で使用して、一貫して信頼性のある、しかも定量
的に正確な結果を与えた。さらに選択したプライマー対は倍増した時に互いに妨
害しなかったことがさらに測定された。PCR生成物は変性ゲル電気泳動（７M 尿
素、５％ポリアクリルアミド（Long Ranger(商標)溶液、ATバイオケミカルズ（B
iochemicals）、0.6XTBE）、そして続いてオートラジオグラフィーにより視覚化
した。
（ギブコ／BRL）を使用して抽出した。cDNAは２mgの全RNAおよびFirst-Strand（
商標）cDNA合成キット（ファルマシア：Pharmacia）を使用して作成した。次にc
DNAサンプルをH2Oで１：３に希釈し、そして比較PCRを記載されているように（J
ensen,J.et al.(1996)、J.Biol.Chem.271:187490）、[32P]dCTPの存在下で行っ
た。すべての反応にSP-1特異的プライマーを含み、これは300bpフラグメントを
増幅して内部対照として役立った。上記に概略したプライマーを定めたPCR条件
下（１サイクル：95℃、５分；23サイクル：95℃、30秒、58℃、30秒、72℃、１
分；１サイクル：72℃、10分）で使用して、一貫して信頼性のある、しかも定量
的に正確な結果を与えた。さらに選択したプライマー対は倍増した時に互いに妨
害しなかったことがさらに測定された。PCR生成物は変性ゲル電気泳動（７M 尿
素、５％ポリアクリルアミド（Long Ranger(商標)溶液、ATバイオケミカルズ（B
iochemicals）、0.6XTBE）、そして続いてオートラジオグラフィーにより視覚化
した。
【０１０２】 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、GPR3、GPR6およびGPR12の分布をヒトの組織全体
で表している。この情報はそのような組織に関連する疾患状態を評価すること、
ならびにそのような発現が優勢であるそのような組織中の特異的領域を決定する
ことを可能とし、これによりそのような受容体の発現と特定の疾患状態との相関
を可能とする。これは次に、そのような受容体に影響を及ぼす化合物の直接的な
同定を、そのような受容体の内因性リガンドを解明または知る必要なく可能とす
る。さらなるスクリーニングでは、RT-PCR分析により証明されるように対照と比
較してGPR3が大変高レベルでヒトの癲癇組織（組織源：側頭皮質)で発現するこ
とが明らかである（図８）。 実施例８Ａ 機能的分析−GPR6（イン・シトウ分析） GPR6の視床下部における分布は、摂食行動における関与の可能性を示唆した。
したがってこの受容体の機能的分析を行った。イン・シトウ分析は以下のように
行った： １．プローブの設計 GPR6プローブは、pBluescriptSK+のHindIII−SmaI部位にクローン化したGPR6
受容体の450bpのHindIII−ScaIフラグメントから調製した。リボプローブは：１
μgの直線化プラスミド、２μlの５×転写バッファー、125μCiの35S-UTP、150
μMのGTP、CTPおよびATP、12.5mMのジチオスレイトール、20UのRNaseインヒビタ
ーおよび６Uの適切なポリメラーゼから成る標準標識反応でＴ７転写系を使用し
て作成した。反応は37℃で90分間インキューベーションし、標識したプローブは
遊離ヌクレオチドからSephadex G-50スピン カラム上で分離した。 ２．組織プレパレーション 切開した組織は-42℃に冷却したイソペンテンで凍結し、そして続いて-20℃に
維持したクリオスタットで切開する前に-80℃に保存した。スライドにのせた組
織切片は、次に-80℃に保存した。 ３．イン・シトウハイブリダイゼーションのプロトコール 組織切片は-80℃の冷凍庫から取り出し、そして１μg/mlのプロテインキナー
ゼＫ溶液を用いてインキューベーションして組織を透過し、そして内因性のRNas
eを不活性化した。この処理後、切片を連続的に水（１分）、0.1M トリエタノー
ルアミン（pH8.0；１分）、そして0.25％無水酢酸（0.1M のトリエタノールアミ
ン中)(10分)にインキューベーションした。次に組織を２×SSC（0.3mM NaCl、0.
03nM クエン酸Na、pH7.2；５分）で洗浄し、そしてエタノールの濃度を段階的に
上げることにより脱水した。次に切片を1.5×106dpmの[35S]UTP-標識cRNAプロー
ブ（75％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、３×SSC、50mM リン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.4）、１×デンハーツ溶液、0.1mg/ml酵母tRNAおよび0.1mg/ml
の剪断サケ精子DNAを含有する20μlのハイブリダイゼーションバッファー中）と
ハイブリダイズさせた。組織切片は、ゴムセメントで密閉したカバースリップで
覆った。このスライドを50℃で一晩インキューベーションした。翌日、ゴムセメ
ントを取り除き、カバースリップを２×SSCに浸し、そして組織切片を10分間、
新しい２×SSC溶液で洗浄した。内因性のmRNAとはハイブリダイズしない一本鎖
のプローブは、切片を30分間、200μg/mlのRNase-A溶液中で37℃にてインキュー
ベーションすることにより除去した。次に組織を次第に緊縮性を増加させたSSC
溶液（２、１そして0.5×SSC；各10分）で洗浄し、続いて60℃の0.5×SSCで１時
間洗浄した。この最後の洗浄後、組織切片はエタノール濃度を段階的に上げて脱
水し、風乾させ、そしてKodak XAR-5フィルム上でのｘ−線オートラジオグラフ
ィーにより検出するために調製した。 ４．分析 正常なオスのラット（Sprague-Dawley、チャールズ リバー（Charles River
））について上記のプロトコールを使用して、GPR6が脳の以下の領域で発現する
ことが測定された：視床下部、海馬、坐核、尾状核および大脳皮質。代表的な組
織切片については図９Ａを参照にされたい（GPR6受容体は暗い領域で表し；図９
Ｂはラット脳の参照マップを提供する）。
で表している。この情報はそのような組織に関連する疾患状態を評価すること、
ならびにそのような発現が優勢であるそのような組織中の特異的領域を決定する
ことを可能とし、これによりそのような受容体の発現と特定の疾患状態との相関
を可能とする。これは次に、そのような受容体に影響を及ぼす化合物の直接的な
同定を、そのような受容体の内因性リガンドを解明または知る必要なく可能とす
る。さらなるスクリーニングでは、RT-PCR分析により証明されるように対照と比
較してGPR3が大変高レベルでヒトの癲癇組織（組織源：側頭皮質)で発現するこ
とが明らかである（図８）。 実施例８Ａ 機能的分析−GPR6（イン・シトウ分析） GPR6の視床下部における分布は、摂食行動における関与の可能性を示唆した。
したがってこの受容体の機能的分析を行った。イン・シトウ分析は以下のように
行った： １．プローブの設計 GPR6プローブは、pBluescriptSK+のHindIII−SmaI部位にクローン化したGPR6
受容体の450bpのHindIII−ScaIフラグメントから調製した。リボプローブは：１
μgの直線化プラスミド、２μlの５×転写バッファー、125μCiの35S-UTP、150
μMのGTP、CTPおよびATP、12.5mMのジチオスレイトール、20UのRNaseインヒビタ
ーおよび６Uの適切なポリメラーゼから成る標準標識反応でＴ７転写系を使用し
て作成した。反応は37℃で90分間インキューベーションし、標識したプローブは
遊離ヌクレオチドからSephadex G-50スピン カラム上で分離した。 ２．組織プレパレーション 切開した組織は-42℃に冷却したイソペンテンで凍結し、そして続いて-20℃に
維持したクリオスタットで切開する前に-80℃に保存した。スライドにのせた組
織切片は、次に-80℃に保存した。 ３．イン・シトウハイブリダイゼーションのプロトコール 組織切片は-80℃の冷凍庫から取り出し、そして１μg/mlのプロテインキナー
ゼＫ溶液を用いてインキューベーションして組織を透過し、そして内因性のRNas
eを不活性化した。この処理後、切片を連続的に水（１分）、0.1M トリエタノー
ルアミン（pH8.0；１分）、そして0.25％無水酢酸（0.1M のトリエタノールアミ
ン中)(10分)にインキューベーションした。次に組織を２×SSC（0.3mM NaCl、0.
03nM クエン酸Na、pH7.2；５分）で洗浄し、そしてエタノールの濃度を段階的に
上げることにより脱水した。次に切片を1.5×106dpmの[35S]UTP-標識cRNAプロー
ブ（75％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、３×SSC、50mM リン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.4）、１×デンハーツ溶液、0.1mg/ml酵母tRNAおよび0.1mg/ml
の剪断サケ精子DNAを含有する20μlのハイブリダイゼーションバッファー中）と
ハイブリダイズさせた。組織切片は、ゴムセメントで密閉したカバースリップで
覆った。このスライドを50℃で一晩インキューベーションした。翌日、ゴムセメ
ントを取り除き、カバースリップを２×SSCに浸し、そして組織切片を10分間、
新しい２×SSC溶液で洗浄した。内因性のmRNAとはハイブリダイズしない一本鎖
のプローブは、切片を30分間、200μg/mlのRNase-A溶液中で37℃にてインキュー
ベーションすることにより除去した。次に組織を次第に緊縮性を増加させたSSC
溶液（２、１そして0.5×SSC；各10分）で洗浄し、続いて60℃の0.5×SSCで１時
間洗浄した。この最後の洗浄後、組織切片はエタノール濃度を段階的に上げて脱
水し、風乾させ、そしてKodak XAR-5フィルム上でのｘ−線オートラジオグラフ
ィーにより検出するために調製した。 ４．分析 正常なオスのラット（Sprague-Dawley、チャールズ リバー（Charles River
））について上記のプロトコールを使用して、GPR6が脳の以下の領域で発現する
ことが測定された：視床下部、海馬、坐核、尾状核および大脳皮質。代表的な組
織切片については図９Ａを参照にされたい（GPR6受容体は暗い領域で表し；図９
Ｂはラット脳の参照マップを提供する）。
【０１０３】 摂食と関連する脳の領域でのGPR6の高レベルの発現を仮定して、痩せたおよび
肥満のオスのZuckerラット（チャールズ リバー）の両方について、上記プロト
コールを使用してin situ分析を行った。当業者には認識されているように、Zuc
ker動物は遺伝的に飼育されて痩せた、または肥満の表現型を表す動物を生じる
。図１０Ａは痩せたZucker動物におけるGPR6受容体発現の代表的な組織切片を提
供する：図１０Ｂは肥満したZucker動物におけるGPR6受容体発現の代表的な組織
切片を提供する：図１０Ｃは、ラットの脳のこの切片の参照マップである。この
ような結果は、内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体GPR6が肥満モデ
ルで比較的過剰に発現されることを支持している。 実施例８Ｂ 機能的分析−GPR12（イン・シトウ分析） GPR12受容体に関するイン・シトウ分析を以下のように行った： １．プローブの設計 GPR12プローブは、pBluescriptSK+のHindIII−BamHI部位にクローン化したラ
ットGPR12受容体の515bp(NT5-NT520)のHindIII−BamHIフラグメントから調製し
た。リボプローブは：１μgの直線化プラスミド、２μlの５×転写バッファー、
125μCiの35S-UTP、150μMのGTP、CTPおよびATP、12.5mMのジチオスレイトール
、20UのRnaseインヒビターおよび６Uの適切なポリメラーゼから成る標準標識反
応でT3/T7転写系を使用して作成した。反応は37℃で90分間インキューベーショ
ンし、標識したプローブは遊離ヌクレオチドからSephadex G-50スピン カラム上
で分離した。 ２．組織プレパレーション 切開した組織は-42℃に冷却したイソペンテン中で凍結し、そして続いて-20℃
に維持したクリオスタットで切開する前に-80℃に保存した。スライドにのせた
組織切片は、次に-80℃に保存した。 ３．イン・シトウハイブリダイゼーションのプロトコール 組織切片は-80℃の冷凍庫から取り出し、そして１μg/mlのプロテインキナー
ゼＫ溶液を用いてインキューベーションして組織を透過し、そして内因性のRNas
eを不活性化した。この処理後、切片を連続的に水（１分）、0.1M トリエタノー
ルアミン（pH8.0；１分）、そして0.25％無水酢酸（0.1M のトリエタノールアミ
ン中)(10分)にインキューベーションした。次に組織を２×SSC（0.3mM NaCl、0.
03nM クエン酸Na、pH7.2；５分）で洗浄し、そしてエタノールの濃度を段階的に
上げることにより脱水した。次に切片を1.5×106dpmの[35S]UTP-標識cRNAプロー
ブ（75％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、３×SSC、50mM リン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.4）、１×デンハーツ溶液、0.1mg/ml酵母tRNAおよび0.1mg/ml
の剪断サケ精子DNAを含有する20μlのハイブリダイゼーションバッファー中）と
ハイブリダイズさせた。組織切片は、ゴムセメントで密閉したカバースリップで
覆った。このスライドを50℃で一晩インキューベーションした。翌日、ゴムセメ
ントを取り除き、カバースリップを２×SSCで洗浄し、そして組織切片を10分間
、新しい２×SSC溶液で洗浄した。内因性のmRNAとはハイブリダイズしなかった
一本鎖のプローブは、切片を30分間、200μg/mlのRNase-A溶液中で37℃にてイン
キューベーションすることにより除去した。次に組織を次第に緊縮性を増加させ
たSSC溶液（２、１および0.5×SSC；各10分）で洗浄し、続いて60℃の0.5×SSC
で１時間洗浄した。この最後の洗浄後、組織切片はエタノール濃度を段階的に上
げて脱水し、風乾させ、そしてKodak XAR-5フィルム上でのｘ−線オートラジオ
グラフィーにより検出するために調製した。 ４．分析 正常なオスのラット（Sprague-Dawley、チャールズ リバー）について上記の
プロトコールを使用して、GPR12が脳の以下の領域で発現することが測定された
：海馬（特にCA3、CA4および歯状回：大脳皮質の外層；および扁桃−これらすべ
ての領域が学習および記憶に重要な領域と関係すると当該技術分野では周知であ
る）；ならびに外側膝状核、内側膝状核および外側視床核（thelamic nucleus)(
外側にある機能、例えば視覚および聴覚に関連する領域）を含む視床にある核(t
halamic relay nuclei)。代表的な組織切片については図１１Ａ〜Ｆを参照にさ
れたい（GPR12受容体は暗い領域で表している。 実施例８Ｃ 機能分析−摂食−行動受容体を用いたGPR6の同時局在化（co-localization） （イン・シトウ分析） これまではオーファンGPCRであった(a.k.a.“HFGAN72”）ヒトのオレキシン受
容体OX1Rは、脳の外側視床下部領域に局在し、そして摂食行動の制御に関与する
と仮定されてきた。Sakurai.T.et al 92(4) Cell 573(1988)。Sakuraiにより言
及されるように、「オレキシン受容体に向けられる薬理学的介入は、肥満症およ
び糖尿病のようなエネルギーホメオスタシスのディスレギュレーションが関与す
る疾患の新規治療物質を見いだすために魅力的な手段であると示すことができる
」Id 582．メラノコルチン-3受容体（MC-3）も同定され、Gantz,I.Et al 268(11
)J.Biol.Chem.8246(1993)、そして同様にエネルギーホメオスタシスと関連して
いる。
肥満のオスのZuckerラット（チャールズ リバー）の両方について、上記プロト
コールを使用してin situ分析を行った。当業者には認識されているように、Zuc
ker動物は遺伝的に飼育されて痩せた、または肥満の表現型を表す動物を生じる
。図１０Ａは痩せたZucker動物におけるGPR6受容体発現の代表的な組織切片を提
供する：図１０Ｂは肥満したZucker動物におけるGPR6受容体発現の代表的な組織
切片を提供する：図１０Ｃは、ラットの脳のこの切片の参照マップである。この
ような結果は、内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体GPR6が肥満モデ
ルで比較的過剰に発現されることを支持している。 実施例８Ｂ 機能的分析−GPR12（イン・シトウ分析） GPR12受容体に関するイン・シトウ分析を以下のように行った： １．プローブの設計 GPR12プローブは、pBluescriptSK+のHindIII−BamHI部位にクローン化したラ
ットGPR12受容体の515bp(NT5-NT520)のHindIII−BamHIフラグメントから調製し
た。リボプローブは：１μgの直線化プラスミド、２μlの５×転写バッファー、
125μCiの35S-UTP、150μMのGTP、CTPおよびATP、12.5mMのジチオスレイトール
、20UのRnaseインヒビターおよび６Uの適切なポリメラーゼから成る標準標識反
応でT3/T7転写系を使用して作成した。反応は37℃で90分間インキューベーショ
ンし、標識したプローブは遊離ヌクレオチドからSephadex G-50スピン カラム上
で分離した。 ２．組織プレパレーション 切開した組織は-42℃に冷却したイソペンテン中で凍結し、そして続いて-20℃
に維持したクリオスタットで切開する前に-80℃に保存した。スライドにのせた
組織切片は、次に-80℃に保存した。 ３．イン・シトウハイブリダイゼーションのプロトコール 組織切片は-80℃の冷凍庫から取り出し、そして１μg/mlのプロテインキナー
ゼＫ溶液を用いてインキューベーションして組織を透過し、そして内因性のRNas
eを不活性化した。この処理後、切片を連続的に水（１分）、0.1M トリエタノー
ルアミン（pH8.0；１分）、そして0.25％無水酢酸（0.1M のトリエタノールアミ
ン中)(10分)にインキューベーションした。次に組織を２×SSC（0.3mM NaCl、0.
03nM クエン酸Na、pH7.2；５分）で洗浄し、そしてエタノールの濃度を段階的に
上げることにより脱水した。次に切片を1.5×106dpmの[35S]UTP-標識cRNAプロー
ブ（75％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、３×SSC、50mM リン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.4）、１×デンハーツ溶液、0.1mg/ml酵母tRNAおよび0.1mg/ml
の剪断サケ精子DNAを含有する20μlのハイブリダイゼーションバッファー中）と
ハイブリダイズさせた。組織切片は、ゴムセメントで密閉したカバースリップで
覆った。このスライドを50℃で一晩インキューベーションした。翌日、ゴムセメ
ントを取り除き、カバースリップを２×SSCで洗浄し、そして組織切片を10分間
、新しい２×SSC溶液で洗浄した。内因性のmRNAとはハイブリダイズしなかった
一本鎖のプローブは、切片を30分間、200μg/mlのRNase-A溶液中で37℃にてイン
キューベーションすることにより除去した。次に組織を次第に緊縮性を増加させ
たSSC溶液（２、１および0.5×SSC；各10分）で洗浄し、続いて60℃の0.5×SSC
で１時間洗浄した。この最後の洗浄後、組織切片はエタノール濃度を段階的に上
げて脱水し、風乾させ、そしてKodak XAR-5フィルム上でのｘ−線オートラジオ
グラフィーにより検出するために調製した。 ４．分析 正常なオスのラット（Sprague-Dawley、チャールズ リバー）について上記の
プロトコールを使用して、GPR12が脳の以下の領域で発現することが測定された
：海馬（特にCA3、CA4および歯状回：大脳皮質の外層；および扁桃−これらすべ
ての領域が学習および記憶に重要な領域と関係すると当該技術分野では周知であ
る）；ならびに外側膝状核、内側膝状核および外側視床核（thelamic nucleus)(
外側にある機能、例えば視覚および聴覚に関連する領域）を含む視床にある核(t
halamic relay nuclei)。代表的な組織切片については図１１Ａ〜Ｆを参照にさ
れたい（GPR12受容体は暗い領域で表している。 実施例８Ｃ 機能分析−摂食−行動受容体を用いたGPR6の同時局在化（co-localization） （イン・シトウ分析） これまではオーファンGPCRであった(a.k.a.“HFGAN72”）ヒトのオレキシン受
容体OX1Rは、脳の外側視床下部領域に局在し、そして摂食行動の制御に関与する
と仮定されてきた。Sakurai.T.et al 92(4) Cell 573(1988)。Sakuraiにより言
及されるように、「オレキシン受容体に向けられる薬理学的介入は、肥満症およ
び糖尿病のようなエネルギーホメオスタシスのディスレギュレーションが関与す
る疾患の新規治療物質を見いだすために魅力的な手段であると示すことができる
」Id 582．メラノコルチン-3受容体（MC-3）も同定され、Gantz,I.Et al 268(11
)J.Biol.Chem.8246(1993)、そして同様にエネルギーホメオスタシスと関連して
いる。
【０１０４】 エネルギーホメオスタシスのレギュレーションおよびディスレギュレーション
に関与する神経経路の解明は、合理的なドラッグデザインに関する重要な階層的
意味合い（hierarchical nuance）の認識に重要である。１つの受容体、特によ
り関連性のある受容体−経路の「下流」にある受容体に影響を及ぼすだけでは、
時間と人的資源の実質的な浪費を導き、これは最終的には特定の疾患状態にたと
えあったにしても実質的にわずかな影響しか及ぼさない医薬化合物の開発をもた
らすあろう。例えばレプチンはエネルギーホメオスタシスに幾らかの様式で明ら
かに関与はしているが、今日まで肥満症の分野で医薬生成物の開発に好機を示し
たことはない。そしてOX1およびMC-3受容体の両方（ならびに他のメラノコルチ
ン受容体）も、幾らかの様式でエネルギーホメオスタシスに関与しているが、も
し例えばこのような受容体がそれらの内因性形態で構成的に活性ではなく、そし
てエネルギーホメオスタシス経路内に内因性の状態で構成的に活性な受容体があ
るならば、従来からの受容体「アンタゴニスト」による取り組みに基づく医薬品
の開発は実を結ぶというよりは挫折することを示すかもしれない。実際に内因性
の構成的に活性な受容体は定義により連続してシグナルを発信するが、内因性の
非構成的に活性な受容体はそのようなシグナル発信にリガンド−結合が必要であ
る。このように内因性の形態で構成的に活性であるだけでなく、肥満の動物モデ
ルにおいて有意にアップレギュレートされるGPR6の場合、たとえこのような受容
体に対する受容体アンタゴニストを介して完全遮断してもGPR6はシグナルを発信
し続けるので、GPR6は本質的に他のエネルギーホメオスタシス関連受容体に「勝
つ(trump）」だろう。このように、このような受容体（およびエネルギーホメオ
スタシス経路の他の受容体）が離れた神経領域に同時局在しているかどうかを決
定することは、薬剤開発により精巧な受容体標的を提供する点で有利である。
に関与する神経経路の解明は、合理的なドラッグデザインに関する重要な階層的
意味合い（hierarchical nuance）の認識に重要である。１つの受容体、特によ
り関連性のある受容体−経路の「下流」にある受容体に影響を及ぼすだけでは、
時間と人的資源の実質的な浪費を導き、これは最終的には特定の疾患状態にたと
えあったにしても実質的にわずかな影響しか及ぼさない医薬化合物の開発をもた
らすあろう。例えばレプチンはエネルギーホメオスタシスに幾らかの様式で明ら
かに関与はしているが、今日まで肥満症の分野で医薬生成物の開発に好機を示し
たことはない。そしてOX1およびMC-3受容体の両方（ならびに他のメラノコルチ
ン受容体）も、幾らかの様式でエネルギーホメオスタシスに関与しているが、も
し例えばこのような受容体がそれらの内因性形態で構成的に活性ではなく、そし
てエネルギーホメオスタシス経路内に内因性の状態で構成的に活性な受容体があ
るならば、従来からの受容体「アンタゴニスト」による取り組みに基づく医薬品
の開発は実を結ぶというよりは挫折することを示すかもしれない。実際に内因性
の構成的に活性な受容体は定義により連続してシグナルを発信するが、内因性の
非構成的に活性な受容体はそのようなシグナル発信にリガンド−結合が必要であ
る。このように内因性の形態で構成的に活性であるだけでなく、肥満の動物モデ
ルにおいて有意にアップレギュレートされるGPR6の場合、たとえこのような受容
体に対する受容体アンタゴニストを介して完全遮断してもGPR6はシグナルを発信
し続けるので、GPR6は本質的に他のエネルギーホメオスタシス関連受容体に「勝
つ(trump）」だろう。このように、このような受容体（およびエネルギーホメオ
スタシス経路の他の受容体）が離れた神経領域に同時局在しているかどうかを決
定することは、薬剤開発により精巧な受容体標的を提供する点で有利である。
【０１０５】 イン・シトウハイブリダイゼーション実験はGPR6、OX1RおよびMC-3受容体につ
いて上記のように行った。GPR6については、使用したイン・シトウプローブは実
施例７Ａに説明した。OX1RおよびMC-3受容体については、プローブは公開されて
いるラットの配列に基づき、そしてそれぞれ950bpおよび441bpであった。組織プ
レパレーション（正常ラット）およびイン・シトウハイブリダイゼーションは、
実施例８Ａに説明したものと実質的に同じであった。
いて上記のように行った。GPR6については、使用したイン・シトウプローブは実
施例７Ａに説明した。OX1RおよびMC-3受容体については、プローブは公開されて
いるラットの配列に基づき、そしてそれぞれ950bpおよび441bpであった。組織プ
レパレーション（正常ラット）およびイン・シトウハイブリダイゼーションは、
実施例８Ａに説明したものと実質的に同じであった。
【０１０６】 結果を図１２（GPR6およびOX1R)、ならびに図１３（GPR6およびMC-3)に与え、
ここで赤いフィルターをGPR6ハイブリダイゼーションに、そして緑のフィルター
をOX1R(図１２Ｂ）およびMC-3（図１３Ｂ）に使用した。図１２Ｃおよび１２Ｄ
（１２Ａを拡大したバージョン)は、図１２Ａおよび１２Ｂを重ねて作成する；
同時−局在化はオレンジ色を有する領域で表されている（赤と緑の組み合わせか
ら）。すなわち図１２Ｃにおいて、GPR6およびOX1Rは外側弓(lateral arcuate)
および腹側正中の視床下部核中の細胞のサブ-セットに同時-局在化することがわ
かり、このような領域の両方がエネルギーホメオスタシス経路に関与している。
図１３Ａ（GPR6)および(MC-3)について同様の重複手法により、これらの受容体
が主に外側弓に同時-局在化する証拠を提供する。
ここで赤いフィルターをGPR6ハイブリダイゼーションに、そして緑のフィルター
をOX1R(図１２Ｂ）およびMC-3（図１３Ｂ）に使用した。図１２Ｃおよび１２Ｄ
（１２Ａを拡大したバージョン)は、図１２Ａおよび１２Ｂを重ねて作成する；
同時−局在化はオレンジ色を有する領域で表されている（赤と緑の組み合わせか
ら）。すなわち図１２Ｃにおいて、GPR6およびOX1Rは外側弓(lateral arcuate)
および腹側正中の視床下部核中の細胞のサブ-セットに同時-局在化することがわ
かり、このような領域の両方がエネルギーホメオスタシス経路に関与している。
図１３Ａ（GPR6)および(MC-3)について同様の重複手法により、これらの受容体
が主に外側弓に同時-局在化する証拠を提供する。
【０１０７】 摂食行動に関連する神経経路に関する分野での情報は進歩しつづけている。こ
の経路の重要な成分は、神経ペプチドであるアグーチ関連ペプチド（AGRP）であ
り、アグーチ-関連転写産物（ART）と呼ばれることもある。AGRPの発現は、主に
弓状核に限定されている（Flier,J.S.およびMaratos-Flier,E.,およびその図１
を参照にされたい）。AGRPを生産する細胞は、神経ペプチドＹ（NPY）も生産す
る。動物実験では、AGRPの投与およびNPYの投与が摂食行動および肥満症の増加
を導くことを示した。AGRPはまたメラノコルチン4（MC-4)受容体のアンタゴニス
トであることも示され、そしてMC-4受容体の拮抗作用も摂食行動および肥満を増
加することが知られている。このようにAGRPは摂食行動に関連する少なくとも２
つの経路に関与すると思われる。以下に説明するように、GPR6受容体はAGRPを生
産する細胞内に同時局在することが見いだされ、そして以下の実施例８に説明す
る結果に基づき、GPR6が内因性の構成的に活性化されるGPCRであるという事実と
組み合わせると、GPR6はいくつかの様式で系の有力な「レギュレーター」である
ことは明らかであり、GPR6受容体の発現がアンチセンスプロトコール（実施例９
）の使用を介して減少した時に、試験した動物の体重に過度に迅速な損失があり
、これはGPR6がAGRPの発現を調節していることを示唆している。
の経路の重要な成分は、神経ペプチドであるアグーチ関連ペプチド（AGRP）であ
り、アグーチ-関連転写産物（ART）と呼ばれることもある。AGRPの発現は、主に
弓状核に限定されている（Flier,J.S.およびMaratos-Flier,E.,およびその図１
を参照にされたい）。AGRPを生産する細胞は、神経ペプチドＹ（NPY）も生産す
る。動物実験では、AGRPの投与およびNPYの投与が摂食行動および肥満症の増加
を導くことを示した。AGRPはまたメラノコルチン4（MC-4)受容体のアンタゴニス
トであることも示され、そしてMC-4受容体の拮抗作用も摂食行動および肥満を増
加することが知られている。このようにAGRPは摂食行動に関連する少なくとも２
つの経路に関与すると思われる。以下に説明するように、GPR6受容体はAGRPを生
産する細胞内に同時局在することが見いだされ、そして以下の実施例８に説明す
る結果に基づき、GPR6が内因性の構成的に活性化されるGPCRであるという事実と
組み合わせると、GPR6はいくつかの様式で系の有力な「レギュレーター」である
ことは明らかであり、GPR6受容体の発現がアンチセンスプロトコール（実施例９
）の使用を介して減少した時に、試験した動物の体重に過度に迅速な損失があり
、これはGPR6がAGRPの発現を調節していることを示唆している。
【０１０８】 上記の「重複」法とは異なり、Marls,D.L.et al.3 Mol.& Cell Neuro.395(199
2)に説明するプロトコールを同時-局在化の評価に利用した。AGRP（AGRP cRNAプ
ローブはBluescriptSKベクターにクローン化したAGRP cDNAの382bpフラグメント
から合成した）を放射標識したGPR6と一緒に分析し、そして両方とも弓に同時局
在化することが分かった（図１４を参照にされたい）。ホメオスタシスに関する
AGRPの役割を仮定し、そしてさらにhatGPR6がその内因性の状態で構成的に活性
であると仮定すると、以下の実施例９から得られる結果は、ほぼ即座の体重の有
意な損失がAGRPに影響するGPR6との関連で理解され得る点でこのようなデータと
一致する。 実施例９ 機能分析−GPR6（インビボ分析：GPR6アンチセンス） 実施例７で見いだした結果に基づき、そして特定の理論に拘束されることを望
まないが、GPR6受容体の発現の減少はとりわけ摂食行動、代謝、体重等の減少を
導くと仮定され；すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を介してこの
受容体の発現を減少させることにより、そのような動物は機能的な摂食行動およ
び／または摂食に関連する代謝に於いて変化を表すと仮定した。この仮定の調査
は、受容体自体の発現の減少に類似してインバースアゴニストがGPR6受容体の構
成的な活性を下げる点で、受容体に対するインバースアゴニストの利用と類似す
ると考えられた。そのような方法は受容体の「ノックアウト」に反して「ノック
ダウン」をもたらし、すなわち一般にアンチセンス法は標的タンパク質の発現を
約30％まで減少させると解釈される。
2)に説明するプロトコールを同時-局在化の評価に利用した。AGRP（AGRP cRNAプ
ローブはBluescriptSKベクターにクローン化したAGRP cDNAの382bpフラグメント
から合成した）を放射標識したGPR6と一緒に分析し、そして両方とも弓に同時局
在化することが分かった（図１４を参照にされたい）。ホメオスタシスに関する
AGRPの役割を仮定し、そしてさらにhatGPR6がその内因性の状態で構成的に活性
であると仮定すると、以下の実施例９から得られる結果は、ほぼ即座の体重の有
意な損失がAGRPに影響するGPR6との関連で理解され得る点でこのようなデータと
一致する。 実施例９ 機能分析−GPR6（インビボ分析：GPR6アンチセンス） 実施例７で見いだした結果に基づき、そして特定の理論に拘束されることを望
まないが、GPR6受容体の発現の減少はとりわけ摂食行動、代謝、体重等の減少を
導くと仮定され；すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を介してこの
受容体の発現を減少させることにより、そのような動物は機能的な摂食行動およ
び／または摂食に関連する代謝に於いて変化を表すと仮定した。この仮定の調査
は、受容体自体の発現の減少に類似してインバースアゴニストがGPR6受容体の構
成的な活性を下げる点で、受容体に対するインバースアゴニストの利用と類似す
ると考えられた。そのような方法は受容体の「ノックアウト」に反して「ノック
ダウン」をもたらし、すなわち一般にアンチセンス法は標的タンパク質の発現を
約30％まで減少させると解釈される。
【０１０９】 16匹の成体のオスSprange-Dawleyラット（Harlan、サンディエゴ）をこの実験
に使用した。動物は使用前に少なくとも１週間、動物飼育場で順化した。動物は
掛けるプラスチックケージに収容し（１群２匹）、食料と水を自由に与えた。動
物は手術前に少なくとも１日（ベースライン体重を確立するため）、そして実験
中（処置の効果を評価するため）、体重を計り、そして慣らした（handled)。ケ
ージの中の１対の動物について毎日の食糧の摂取は、毎朝補充する前および後に
、餌桶中の食糧の重量を測定することにより評価した。群はアンチセンス（ｎ＝
５）、ミスセンス（ｎ＝４）および滅菌水（ｎ＝５）を含んだ。
に使用した。動物は使用前に少なくとも１週間、動物飼育場で順化した。動物は
掛けるプラスチックケージに収容し（１群２匹）、食料と水を自由に与えた。動
物は手術前に少なくとも１日（ベースライン体重を確立するため）、そして実験
中（処置の効果を評価するため）、体重を計り、そして慣らした（handled)。ケ
ージの中の１対の動物について毎日の食糧の摂取は、毎朝補充する前および後に
、餌桶中の食糧の重量を測定することにより評価した。群はアンチセンス（ｎ＝
５）、ミスセンス（ｎ＝４）および滅菌水（ｎ＝５）を含んだ。
【０１１０】 手術は、必要ならばハロタンを補充したペントバルビタールナトリウム麻酔（
60mg/kg）下で行った。動物には、側脳室（ブレグマ、脳表面からAP-1.0、Lat-1
.5，DV-3.8）をねらう１つのカニューレ（脳輸液キット、アルザ ファルマシュ
ーティカルズ:Alza Pharmaceuticals）を定位に埋めた。カニューレの入口は柔
軟なチューブを介して浸透圧ミニポンプ（Model 2001、アルザ ファルマシュー
ティカルズ）につなぎ、このポンプは製造元により提供される使用書に従い肩甲
骨の間の皮下に埋め込んだ。
60mg/kg）下で行った。動物には、側脳室（ブレグマ、脳表面からAP-1.0、Lat-1
.5，DV-3.8）をねらう１つのカニューレ（脳輸液キット、アルザ ファルマシュ
ーティカルズ:Alza Pharmaceuticals）を定位に埋めた。カニューレの入口は柔
軟なチューブを介して浸透圧ミニポンプ（Model 2001、アルザ ファルマシュー
ティカルズ）につなぎ、このポンプは製造元により提供される使用書に従い肩甲
骨の間の皮下に埋め込んだ。
【０１１１】 ポンプにはアンチセンスオリゴヌクレオチド5'-GsCTAGCGTTCATCGCCGsC-3'（配
列番号：34；アンチセンス）（ここで小文字のｓはホスホロチオエート結合を表
す）またはミスセンスオリゴヌクレオチド5'-CsTGGACTGTATCGCCCCsG-3'（配列番
号：35；ミスセンス）、または滅菌水賦形剤を含んだ。オリゴヌクレオチドはジ
ェンセット社（Genset Corp）により合成し、そして２μg/μlに滅菌水で希釈し
た。ポンプは１μl/時間で送液するように使用したので、動物は48μg/日のアン
チセンスまたはミスセンスオリゴヌクレオチドを、または24μl/日の滅菌水を受
容した。ポンプにはインプラントに先立ち37℃で少なくとも４時間、滅菌水にイ
ンキューベーションすることによりインプラントに先立ち呼び水を差した。 手
術から５日後、動物をd-アンフェタミンサルフェートで処置し；手術から６日後
にベースラインおよびアンフェタミンで刺激した運動の行動を調査し；手術から
７日後、動物を安楽死させ、そして脳を迅速に摘出し、そして組織分析のために
凍結した。
列番号：34；アンチセンス）（ここで小文字のｓはホスホロチオエート結合を表
す）またはミスセンスオリゴヌクレオチド5'-CsTGGACTGTATCGCCCCsG-3'（配列番
号：35；ミスセンス）、または滅菌水賦形剤を含んだ。オリゴヌクレオチドはジ
ェンセット社（Genset Corp）により合成し、そして２μg/μlに滅菌水で希釈し
た。ポンプは１μl/時間で送液するように使用したので、動物は48μg/日のアン
チセンスまたはミスセンスオリゴヌクレオチドを、または24μl/日の滅菌水を受
容した。ポンプにはインプラントに先立ち37℃で少なくとも４時間、滅菌水にイ
ンキューベーションすることによりインプラントに先立ち呼び水を差した。 手
術から５日後、動物をd-アンフェタミンサルフェートで処置し；手術から６日後
にベースラインおよびアンフェタミンで刺激した運動の行動を調査し；手術から
７日後、動物を安楽死させ、そして脳を迅速に摘出し、そして組織分析のために
凍結した。
【０１１２】 動物は飼育器から試験室に移し、開放場の囲いに置いた（以下を参照にされた
たい）、そして30分間、ベースライン活動を評価した。30分の最後に、動物は囲
いから簡単に取り出し、d-アンフェタミンサルフェートを注射し（1.0mg/kg s.c
.、滅菌水で希釈；薬物濫用に関する国立研究所の薬物供給プログラム（Nationa
l Institute on Drug Abuse Drug Supply Program)）、そして直ちに150分間、
囲いに戻した。運動の行動は、ベースラインのタイムコースおよびアンフェタミ
ンで刺激した活性を追跡するために10分間隔で定量した。
たい）、そして30分間、ベースライン活動を評価した。30分の最後に、動物は囲
いから簡単に取り出し、d-アンフェタミンサルフェートを注射し（1.0mg/kg s.c
.、滅菌水で希釈；薬物濫用に関する国立研究所の薬物供給プログラム（Nationa
l Institute on Drug Abuse Drug Supply Program)）、そして直ちに150分間、
囲いに戻した。運動の行動は、ベースラインのタイムコースおよびアンフェタミ
ンで刺激した活性を追跡するために10分間隔で定量した。
【０１１３】 ベースラインおよびアンフェタミンで刺激した運動の行動は、16"×16"×15"
の透明プレキシグラスの開放場囲いから成るサンディエゴ インスツルメンツ フ
レックス フィールドシステム（San Diego Instruments Flex Field System）で
評価した。開放場の回にあるフォトセルアレイ（各直径は16）は、データを収集
するためにパーソナルコンピューターと連結していた。囲いの床から２"上の１
つのアレイが運動の活動を検出し、そして２つ目の５"は後ろ脚立ち行動（reari
ng behavior）を検出した。コンピューターは運動の活動の種々の測定を提供し
、それには全フォトセルビームの中断、活動時間、休止時間、移動距離、後ろ脚
立ちの総数および後ろ脚立ちで過ごした時間（データは示さず）を含む。試験中
、試験室は頭頂の白熱ランプで薄暗く明かりをつけ、白色ノイズが外の音を遮蔽
した。
の透明プレキシグラスの開放場囲いから成るサンディエゴ インスツルメンツ フ
レックス フィールドシステム（San Diego Instruments Flex Field System）で
評価した。開放場の回にあるフォトセルアレイ（各直径は16）は、データを収集
するためにパーソナルコンピューターと連結していた。囲いの床から２"上の１
つのアレイが運動の活動を検出し、そして２つ目の５"は後ろ脚立ち行動（reari
ng behavior）を検出した。コンピューターは運動の活動の種々の測定を提供し
、それには全フォトセルビームの中断、活動時間、休止時間、移動距離、後ろ脚
立ちの総数および後ろ脚立ちで過ごした時間（データは示さず）を含む。試験中
、試験室は頭頂の白熱ランプで薄暗く明かりをつけ、白色ノイズが外の音を遮蔽
した。
【０１１４】 結果を図１５および１６に与える。図１５ではアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを受容した動物（GPR6「ノックダウン」動物）は、ミスセンス−処置動物また
は対照処置動物のそれぞれと比較して体重の損失が有意に大きかった。運動活動
に関して図１６の結果は、ベースラインおよびアンフェタミン処置した運動の活
動が実質的に３群すべてにわたり同じ位置にあることを支持している。 実施例１０ GPCR融合タンパク質の調製 内因性の構成的に活性化されるGPCR-Ｇタンパク質融合構築物は、以下のよう
に完成された：ラットGタンパク質Gsα（長い形態：Itoh,H.et al.,83 PNAS 377
6(1986)）の５'および３'末端の両方は、HindIII（5'-AAGCTT-3'）配列をそれに
含むように工作した。正しい配列の確認後（フランキングHindIII配列を含む）
、全配列はベクターのHindIII制限部位を使用したサブクローニングによりpcDNA
3.1(-)（インビトロゲン、カタログ番号V795-20）にシャトル化した(shuttled)
。Gsα配列に関する正しい方向は、pcDNA3.1(-)にサブクローニングした後に決
定した。ラットGsα遺伝子をHindIII配列に含む修飾したpcDNA3.1(-)を次に確認
し；このベクターはここで、「ユニバーサル」Gsαタンパク質ベクターとして利
用することができた。pcDNA3.1(-)ベクターはHindIIIの上流に種々の周知な制限
部位を含み、これによりGsタンパク質の上流に内因性の構成的に活性なGPCRのコ
ード配列を挿入するための能力が有利に提供される。同じ方法は他の「ユニバー
サル」Ｇタンパク質ベクターを作成するために利用することができ、そしてもち
ろん他の市販されている、または当業者に周知な所有ベクターも利用することが
でき、重要な基準はGPCRに関する配列がＧタンパク質の上流であり、しかも枠内
にあることである。
ドを受容した動物（GPR6「ノックダウン」動物）は、ミスセンス−処置動物また
は対照処置動物のそれぞれと比較して体重の損失が有意に大きかった。運動活動
に関して図１６の結果は、ベースラインおよびアンフェタミン処置した運動の活
動が実質的に３群すべてにわたり同じ位置にあることを支持している。 実施例１０ GPCR融合タンパク質の調製 内因性の構成的に活性化されるGPCR-Ｇタンパク質融合構築物は、以下のよう
に完成された：ラットGタンパク質Gsα（長い形態：Itoh,H.et al.,83 PNAS 377
6(1986)）の５'および３'末端の両方は、HindIII（5'-AAGCTT-3'）配列をそれに
含むように工作した。正しい配列の確認後（フランキングHindIII配列を含む）
、全配列はベクターのHindIII制限部位を使用したサブクローニングによりpcDNA
3.1(-)（インビトロゲン、カタログ番号V795-20）にシャトル化した(shuttled)
。Gsα配列に関する正しい方向は、pcDNA3.1(-)にサブクローニングした後に決
定した。ラットGsα遺伝子をHindIII配列に含む修飾したpcDNA3.1(-)を次に確認
し；このベクターはここで、「ユニバーサル」Gsαタンパク質ベクターとして利
用することができた。pcDNA3.1(-)ベクターはHindIIIの上流に種々の周知な制限
部位を含み、これによりGsタンパク質の上流に内因性の構成的に活性なGPCRのコ
ード配列を挿入するための能力が有利に提供される。同じ方法は他の「ユニバー
サル」Ｇタンパク質ベクターを作成するために利用することができ、そしてもち
ろん他の市販されている、または当業者に周知な所有ベクターも利用することが
でき、重要な基準はGPCRに関する配列がＧタンパク質の上流であり、しかも枠内
にあることである。
【０１１５】 次にGPR3-Gsα融合タンパク質構築物およびGPR6-Gsα融合タンパク質構築物の
両方を以下のように作成した：GPR3およびGPR6の両方のためにプライマーを設計
した。GPR3についてはプライマーは以下の通りである：
両方を以下のように作成した：GPR3およびGPR6の両方のためにプライマーを設計
した。GPR3についてはプライマーは以下の通りである：
【０１１６】
【表２４】
【０１１７】 センスおよびアンチセンスプライマーは、XbaIおよびKpnIの制限部位をそれぞれ
含んだ。GPR6についてはプライマーは以下の通りである：
含んだ。GPR6についてはプライマーは以下の通りである：
【０１１８】
【表２５】
【０１１９】 センスおよびアンチセンスプライマーも、XbaIおよびKpnIの制限部位をそれぞれ
含んだ。このような制限部位はpcDNA3.1(-)ベクター中のHindIII部位の上流で利
用可能である。
含んだ。このような制限部位はpcDNA3.1(-)ベクター中のHindIII部位の上流で利
用可能である。
【０１２０】 次にPCRを使用して融合用の各受容体配列を、上に開示したGsαユニバーサル
ベクター内に、それぞれについて以下のプロトコールを使用して固定した：GPR3
およびGPR6に関する100ngのcDNAを、２μlの各プライマー（センスおよびアンチ
-センス）、３μLの10mM dNTPs、10μLの10×TaqPlus(商標)Precisionバッファ
ー、１μLのTaqPlus(商標)Precisionポリメラーゼ（ストラタジーン：#600211）
および80μLの水を含有する別個の試験管に加えた。GPR3に関する反応温度およ
びサイクル時間は以下の通りであった：最初の変性工程は94℃で５分間行い、そ
して94℃で30秒間；55℃で30秒間；72℃で２分間のサイクル（GPR3については30
回繰り返した）。最終的な延長時間は、72℃で10分間行った。GPR6に関して、最
初の変性工程は96℃で７分間行い、そして96℃で30秒間、55℃で30秒間そして72
℃で２分間のサイクルを30回繰り返した。最終的な延長時間はGPR6に関しては、
72℃で10分間行った。GPR3およびGPR6について両PCR生成物を１％アガロースゲ
ルで泳動し、そして次に精製した（データは示さず）。各精製した生成物をXbaI
およびKpnI（ニューイングランド バイオ ラボズ：New England Biolabs）で消
化し、そして所望の挿入物を単離し、精製し、そしてGsユニバーサルベクターに
各制限部位で連結した。トランスフェクション後に陽性のクローンを単離し、そ
して制限酵素消化により決定した；293細胞を使用した発現は以下に説明するプ
ロトコールで行った。GPR3:Gs−融合タンパク質およびGPR6:Gs−融合タンパク質
に関して各陽性クローンを配列決定し、そして候補化合物の直接同定に利用でき
るようにした。
ベクター内に、それぞれについて以下のプロトコールを使用して固定した：GPR3
およびGPR6に関する100ngのcDNAを、２μlの各プライマー（センスおよびアンチ
-センス）、３μLの10mM dNTPs、10μLの10×TaqPlus(商標)Precisionバッファ
ー、１μLのTaqPlus(商標)Precisionポリメラーゼ（ストラタジーン：#600211）
および80μLの水を含有する別個の試験管に加えた。GPR3に関する反応温度およ
びサイクル時間は以下の通りであった：最初の変性工程は94℃で５分間行い、そ
して94℃で30秒間；55℃で30秒間；72℃で２分間のサイクル（GPR3については30
回繰り返した）。最終的な延長時間は、72℃で10分間行った。GPR6に関して、最
初の変性工程は96℃で７分間行い、そして96℃で30秒間、55℃で30秒間そして72
℃で２分間のサイクルを30回繰り返した。最終的な延長時間はGPR6に関しては、
72℃で10分間行った。GPR3およびGPR6について両PCR生成物を１％アガロースゲ
ルで泳動し、そして次に精製した（データは示さず）。各精製した生成物をXbaI
およびKpnI（ニューイングランド バイオ ラボズ：New England Biolabs）で消
化し、そして所望の挿入物を単離し、精製し、そしてGsユニバーサルベクターに
各制限部位で連結した。トランスフェクション後に陽性のクローンを単離し、そ
して制限酵素消化により決定した；293細胞を使用した発現は以下に説明するプ
ロトコールで行った。GPR3:Gs−融合タンパク質およびGPR6:Gs−融合タンパク質
に関して各陽性クローンを配列決定し、そして候補化合物の直接同定に利用でき
るようにした。
【０１２１】 GPCR融合タンパク質を上記のように分析し、 そして構成的に活性であると確
認した（データは示さず）。 実施例１１ プロトコール：[35S]GTPγSを使用したインバースアゴニストおよびアゴニスト
の直接同定 例えばインバースアゴニストとして候補化合物を直接的同定するた
めに、我々は内因性の構成的に活性なGPCRを利用したが、全体が解明されていな
いという理由から、アッセイ間の変動は悪くなり得る。なので好ましくは上に開
示したGPCR融合タンパク質を利用する。我々はそのようなタンパク質を使用する
時、アッセイ間の変動が実質的に安定化され、これにより効果的なシグナル−対
−ノイズ比が得られると決定した。これは候補化合物のより確固とした同定を可
能とするために有利な結果を有する。
認した（データは示さず）。 実施例１１ プロトコール：[35S]GTPγSを使用したインバースアゴニストおよびアゴニスト
の直接同定 例えばインバースアゴニストとして候補化合物を直接的同定するた
めに、我々は内因性の構成的に活性なGPCRを利用したが、全体が解明されていな
いという理由から、アッセイ間の変動は悪くなり得る。なので好ましくは上に開
示したGPCR融合タンパク質を利用する。我々はそのようなタンパク質を使用する
時、アッセイ間の変動が実質的に安定化され、これにより効果的なシグナル−対
−ノイズ比が得られると決定した。これは候補化合物のより確固とした同定を可
能とするために有利な結果を有する。
【０１２２】 以下の結果がオーファン受容体を使用して得られたことに注目することは重要
である；データが支持するように、本明細書に開示した技法を使用してインバー
スアゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストとしてオーファン受容体をモジ
ュレートする候補化合物を直接一次調査から直接同定することが可能であり；実
際に本明細書に開示する方法は、インバースアゴニストおよびアゴニストモジュ
レーターの両方を同じアッセイプレート上で直接同定するためことを可能にする
十分な感度をもつ。 １．膜の調製 目的とする内因性の構成的に活性なオーファンGPCR融合タンパク質を含んで成
り（実施例２および１０を参照にされたい）、そしてインバースアゴニスト、ア
ゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用するための
膜を以下のように調製した： （ａ）材料 膜回収（membrane scrape）バッファーは、20mM HEPESおよび10mM EDTA、pH7.
4から成り；膜洗浄バッファーは、20mM HEPESおよび0.1mM EDTA、pH7.4から成り
；結合バッファーは20mM HEPES、100mM NaClおよび10mM MgCl2、pH7.4から成っ
た。
である；データが支持するように、本明細書に開示した技法を使用してインバー
スアゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストとしてオーファン受容体をモジ
ュレートする候補化合物を直接一次調査から直接同定することが可能であり；実
際に本明細書に開示する方法は、インバースアゴニストおよびアゴニストモジュ
レーターの両方を同じアッセイプレート上で直接同定するためことを可能にする
十分な感度をもつ。 １．膜の調製 目的とする内因性の構成的に活性なオーファンGPCR融合タンパク質を含んで成
り（実施例２および１０を参照にされたい）、そしてインバースアゴニスト、ア
ゴニストまたは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用するための
膜を以下のように調製した： （ａ）材料 膜回収（membrane scrape）バッファーは、20mM HEPESおよび10mM EDTA、pH7.
4から成り；膜洗浄バッファーは、20mM HEPESおよび0.1mM EDTA、pH7.4から成り
；結合バッファーは20mM HEPES、100mM NaClおよび10mM MgCl2、pH7.4から成っ
た。
【０１２３】 （ｂ）手順 すべての材料は作業中、氷上に維持した。最初に媒質をコンフルエント細胞の
単層から吸引し、続いて10mlの冷PBSですすぎ、続いて吸引した。その後に５ml
の膜回収バッファーを細胞をはぎとるために加えた；これに続き細胞抽出物を50
mlの遠心管に移した（４℃で17分間、20,000rpmで遠心）。その後に上清を吸引
し、そしてペレットを30mMの膜洗浄バッファーに再懸濁し、続いて４℃で17分間
、20,000rpmで遠心した。次に上清を吸引し、そしてペレットを結合バッファー
に再懸濁した。これを次いでBrinkman polytron(商標)ホモゲナイザーを使用し
て均質化した（すべての材料が懸濁されるまで15〜20秒間、壊した)。これを本
明細書では「膜タンパク質」と呼ぶ。 ２．ブラッドフォードタンパク質アッセイ 均質化の後、膜のタンパク質濃度はブラッドフォードタンパク質アッセイを使
用して決定した（タンパク質は約1.5mg/mlに希釈することができ、後の使用のた
めにアリコートとし、そして凍結(-80℃)した；凍結した時の使用のためのプロ
トコールは以下の通りである：アッセイの日に、凍結した膜タンパク質を室温で
解凍し、続いてボッテックスにかけ、そして次にポリトロンを用いて約12×1,00
0rpmで約５〜10秒間均質化する：多数の調製物にはホモジナイザーは異なる調製
物の均質化の間で徹底的に洗浄するべきである）。
単層から吸引し、続いて10mlの冷PBSですすぎ、続いて吸引した。その後に５ml
の膜回収バッファーを細胞をはぎとるために加えた；これに続き細胞抽出物を50
mlの遠心管に移した（４℃で17分間、20,000rpmで遠心）。その後に上清を吸引
し、そしてペレットを30mMの膜洗浄バッファーに再懸濁し、続いて４℃で17分間
、20,000rpmで遠心した。次に上清を吸引し、そしてペレットを結合バッファー
に再懸濁した。これを次いでBrinkman polytron(商標)ホモゲナイザーを使用し
て均質化した（すべての材料が懸濁されるまで15〜20秒間、壊した)。これを本
明細書では「膜タンパク質」と呼ぶ。 ２．ブラッドフォードタンパク質アッセイ 均質化の後、膜のタンパク質濃度はブラッドフォードタンパク質アッセイを使
用して決定した（タンパク質は約1.5mg/mlに希釈することができ、後の使用のた
めにアリコートとし、そして凍結(-80℃)した；凍結した時の使用のためのプロ
トコールは以下の通りである：アッセイの日に、凍結した膜タンパク質を室温で
解凍し、続いてボッテックスにかけ、そして次にポリトロンを用いて約12×1,00
0rpmで約５〜10秒間均質化する：多数の調製物にはホモジナイザーは異なる調製
物の均質化の間で徹底的に洗浄するべきである）。
【０１２４】 （ａ）材料 結合バッファー（上記のような）：ブラッドフォード染色試薬；ブラッドフォ
ードタンパク質標準を、製造元の指示に従い使用した（バイオラッド（Biorad)
、カタログ番号500−0006）。
ードタンパク質標準を、製造元の指示に従い使用した（バイオラッド（Biorad)
、カタログ番号500−0006）。
【０１２５】 （ｂ）手順 二連の試験管を準備し、１つには膜を、そして１つは対照「ブランク」として
含んだ。各々が800μlの結合バッファーを含有した。その後に、10μlのブラッ
ドフォードタンパク質標準（１mg/ml）を各試験管に加え、そして次に10μlの膜
タンパク質を１つの試験管のみに加えた（ブランクではない）。その後に200μl
のブラッドフォード染色試薬を各試験管に加え、続いてそれぞれをボルテックス
処理した。５分後、試験管を再度ボルテックス処理し、そしてその中の材料をキ
ュベットに移した。キュベットは次にCECIL 3041分光光度計を使用して波長595
で読んだ。 ３．直接同定アッセイ （ａ）材料 GDPバッファーは、37.5mlの結合バッファーおよび２mgGDP（シグマ、カタログ
番号G-7127)から成り、そして結合バッファー中で一連の希釈を行うことにより0
.2μM GDP（各ウェル中のGDPの終濃度は、0.1μM GDPであった）を得た；候補化
合物を含有する各ウェルは、100μl GDPバッファー（終濃度、0.1μM GDP）、結
合バッファー中の50μl膜タンパク質、および結合バッファー中50μlの[35S]GTP γ S（0.6nM)(10mlの結合バッファーあたり2.5μl[35S]GTPγS)から成る200μlの
終容積を有した。
含んだ。各々が800μlの結合バッファーを含有した。その後に、10μlのブラッ
ドフォードタンパク質標準（１mg/ml）を各試験管に加え、そして次に10μlの膜
タンパク質を１つの試験管のみに加えた（ブランクではない）。その後に200μl
のブラッドフォード染色試薬を各試験管に加え、続いてそれぞれをボルテックス
処理した。５分後、試験管を再度ボルテックス処理し、そしてその中の材料をキ
ュベットに移した。キュベットは次にCECIL 3041分光光度計を使用して波長595
で読んだ。 ３．直接同定アッセイ （ａ）材料 GDPバッファーは、37.5mlの結合バッファーおよび２mgGDP（シグマ、カタログ
番号G-7127)から成り、そして結合バッファー中で一連の希釈を行うことにより0
.2μM GDP（各ウェル中のGDPの終濃度は、0.1μM GDPであった）を得た；候補化
合物を含有する各ウェルは、100μl GDPバッファー（終濃度、0.1μM GDP）、結
合バッファー中の50μl膜タンパク質、および結合バッファー中50μlの[35S]GTP γ S（0.6nM)(10mlの結合バッファーあたり2.5μl[35S]GTPγS)から成る200μlの
終容積を有した。
【０１２６】 （ｂ）手順 候補化合物（トリポス社（Tripos,Inc.）、セントルイス、モンタナ州）を、9
6ウェルプレート(これらは-80℃に凍結することができる）に入れた。膜タンパ
ク質（または対照としてGPCR融合タンパク質を含まない発現ベクターを含む膜）
を懸濁するまで簡単に均質化した。次にタンパク質濃度は上記に説明したブラッ
ドフォードタンパク質アッセイキットを使用して測定した。膜タンパク質（およ
び対照）を、結合バッファー中で0.25mg/mlに希釈した（最終アッセイ濃度、12.
5μg/ウェル)。その後に100μlのGDPバッファーをワラック（Wallac）のScintis
trip(商標)(ワラック）各ウェルに加えた。次に５μlのピン-ツールを使用して
５μlの候補化合物をそのようなウェルに移した（すなわち200μl全アッセイ容
積中の５μlは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が10μMになるように1:40
比である）。再度、混入を防ぐために、それぞれの移し工程の後に、ピンツール
は水（１×）、エタノール（１×）および水（２×）を含んで成る３種のリザー
バー中ですすぎ、過剰な液体は各すすぎ工程後に振って除き、紙およびキムワイ
プで乾燥させた。その後に、50μlの膜タンパク質を各ウェルに加え(GPCR融合タ
ンパク質無しの膜を含んで成る対照ウェルも使用した）、そして室温で５〜10分
間プレ-インキュ ーベーションし（トリポスから得た候補化合物が光感受性なの
で、プレートはホイルで覆った）。その後に、結合バッファー中50μlの[35S]GT
PγS（0.6nM)を各ウェルに加え、続いて室温で60分間、振盪機上でインキューベ
ーションした（この例においてもプレートはホイルで覆った）。次にアッセイは
プレートを22℃で15分間、4000RPMで遠心させることにより止めた。次にプレー
トを８チャンネルマニホールドで吸引し、そしてプレートカバーで密閉した。次
にプレートをワラック1450で“Prot.#37"の設定（製造元の指示により）を使用
して読んだ。
6ウェルプレート(これらは-80℃に凍結することができる）に入れた。膜タンパ
ク質（または対照としてGPCR融合タンパク質を含まない発現ベクターを含む膜）
を懸濁するまで簡単に均質化した。次にタンパク質濃度は上記に説明したブラッ
ドフォードタンパク質アッセイキットを使用して測定した。膜タンパク質（およ
び対照）を、結合バッファー中で0.25mg/mlに希釈した（最終アッセイ濃度、12.
5μg/ウェル)。その後に100μlのGDPバッファーをワラック（Wallac）のScintis
trip(商標)(ワラック）各ウェルに加えた。次に５μlのピン-ツールを使用して
５μlの候補化合物をそのようなウェルに移した（すなわち200μl全アッセイ容
積中の５μlは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が10μMになるように1:40
比である）。再度、混入を防ぐために、それぞれの移し工程の後に、ピンツール
は水（１×）、エタノール（１×）および水（２×）を含んで成る３種のリザー
バー中ですすぎ、過剰な液体は各すすぎ工程後に振って除き、紙およびキムワイ
プで乾燥させた。その後に、50μlの膜タンパク質を各ウェルに加え(GPCR融合タ
ンパク質無しの膜を含んで成る対照ウェルも使用した）、そして室温で５〜10分
間プレ-インキュ ーベーションし（トリポスから得た候補化合物が光感受性なの
で、プレートはホイルで覆った）。その後に、結合バッファー中50μlの[35S]GT
PγS（0.6nM)を各ウェルに加え、続いて室温で60分間、振盪機上でインキューベ
ーションした（この例においてもプレートはホイルで覆った）。次にアッセイは
プレートを22℃で15分間、4000RPMで遠心させることにより止めた。次にプレー
トを８チャンネルマニホールドで吸引し、そしてプレートカバーで密閉した。次
にプレートをワラック1450で“Prot.#37"の設定（製造元の指示により）を使用
して読んだ。
【０１２７】 例示的な結果を図１７Ａ（GPR3:Gs融合タンパク質）および図１７Ｂ（GPR6:Gs
融合タンパク質）に与え、ここで各表示は異なる候補化合物を含むウェルであり
、各プレートの平均結果に基づく標準偏差は仕切線であり、そして垂直の線は応
答パーセントである。図１７ＡはC4と指定するウェルに注目されたい（この化合
物はGPR3受容体に対するインバースアゴニストとして直接同定された）。図１７
ＢはG7およびH9と指定されたウェルに注目されたい（これらの化合物はGPR6受容
体に対してそれぞれインバースアゴニストおよびアゴニストとして直接同定され
た）。両方の場合で、これらはオーファン受容体である。
融合タンパク質）に与え、ここで各表示は異なる候補化合物を含むウェルであり
、各プレートの平均結果に基づく標準偏差は仕切線であり、そして垂直の線は応
答パーセントである。図１７ＡはC4と指定するウェルに注目されたい（この化合
物はGPR3受容体に対するインバースアゴニストとして直接同定された）。図１７
ＢはG7およびH9と指定されたウェルに注目されたい（これらの化合物はGPR6受容
体に対してそれぞれインバースアゴニストおよびアゴニストとして直接同定され
た）。両方の場合で、これらはオーファン受容体である。
【０１２８】 そのような直接的同定に続いて、IC50（インバースアゴニスト）またはEC50（
アゴニスト）値を決定することが好適であり；当業者は選択したIC50およびEC50 アッセイプロトールの利用を確信している。 実施例１２ プロトール：確認アッセイ 上記に説明したように直接的に同定した候補化合物を提供するために独立した
アッセイ法使用した後、次に確認アッセイを使用することが好適である。この場
合、好適な確認アッセイは、シクラーゼに基づくアッセイである。
アゴニスト）値を決定することが好適であり；当業者は選択したIC50およびEC50 アッセイプロトールの利用を確信している。 実施例１２ プロトール：確認アッセイ 上記に説明したように直接的に同定した候補化合物を提供するために独立した
アッセイ法使用した後、次に確認アッセイを使用することが好適である。この場
合、好適な確認アッセイは、シクラーゼに基づくアッセイである。
【０１２９】 内因性の構成的に活性化されたオーファンGPCRに対するインバースアゴニスト
およびアゴニストとして直接的に同定された候補化合物を確認するために、以下
のプロトールに従い修飾したFlash Plate(商標)アデニリル シクラーゼキット(
ニューイングランドバイオラボズ）を使用した。
およびアゴニストとして直接的に同定された候補化合物を確認するために、以下
のプロトールに従い修飾したFlash Plate(商標)アデニリル シクラーゼキット(
ニューイングランドバイオラボズ）を使用した。
【０１３０】 トランスフェクトした細胞は、トランスフェクションから約３日後に回収した
。膜は20mM HEPES、pH7.4および10mM MgCl2を含有するバッファー中の懸濁細胞
の均質化により調製した。均質化はBrinkman polytron(商標)を使用して氷上で
約10秒間行った。生成したホモジネートを４℃で15分間、49,000×ｇで遠心した
。生成したペレットは、20mM HEPES、pH7.4および0.1mMのEDTAを含有するバッフ
ァーに再懸濁し、10秒間均質化し、続いて４℃で15分間、49,000×ｇで遠心した
。生成したペレットを-80℃で使用するまで保存した。直接同定スクリーニング
の日に、膜のペレットを室温でゆっくりと解凍し、20mM HEPES、pH7.4および10m
M MgCL2を含有するバッファーに再懸濁して、0.60mg/mlの終濃度のタンパク質を
得た（再懸濁した膜は使用するまで氷上に置いた）。
。膜は20mM HEPES、pH7.4および10mM MgCl2を含有するバッファー中の懸濁細胞
の均質化により調製した。均質化はBrinkman polytron(商標)を使用して氷上で
約10秒間行った。生成したホモジネートを４℃で15分間、49,000×ｇで遠心した
。生成したペレットは、20mM HEPES、pH7.4および0.1mMのEDTAを含有するバッフ
ァーに再懸濁し、10秒間均質化し、続いて４℃で15分間、49,000×ｇで遠心した
。生成したペレットを-80℃で使用するまで保存した。直接同定スクリーニング
の日に、膜のペレットを室温でゆっくりと解凍し、20mM HEPES、pH7.4および10m
M MgCL2を含有するバッファーに再懸濁して、0.60mg/mlの終濃度のタンパク質を
得た（再懸濁した膜は使用するまで氷上に置いた）。
【０１３１】 cAMP標準および検出バッファー（２μCiのトレーサー[125ＩcAMP(100μl]を11
mlの検出バッファーに含む）を調製し、そして製造元の指示に従い維持した。ア
ッセイバッファーはスクリーニング用に新たに調製し、そして20mM HEPES、pH7.
4、10mM MgCl2、20mM ホスホクレアチン(シグマ)、0.1単位／mlのクレアチンホ
スホキナーゼ(シグマ)、50μM GTP（シグマ)および0.2mM ATP(シグマ)を含んだ
；アッセイバッファーは使用するまで氷上に保存した。
mlの検出バッファーに含む）を調製し、そして製造元の指示に従い維持した。ア
ッセイバッファーはスクリーニング用に新たに調製し、そして20mM HEPES、pH7.
4、10mM MgCl2、20mM ホスホクレアチン(シグマ)、0.1単位／mlのクレアチンホ
スホキナーゼ(シグマ)、50μM GTP（シグマ)および0.2mM ATP(シグマ)を含んだ
；アッセイバッファーは使用するまで氷上に保存した。
【０１３２】 上記のように同定された候補化合物（凍結されているならば、室温で解凍する
）は、プレートウェル（３μl/ウェル；12μMの最終アッセイ濃度）に40μlの膜
タンパク質（30μg/ウェル)および50μlのアッセイバッファーと一緒に加えた。
この混合物を室温で30分間、ゆるやかに震盪しながらインキューベーションした
。
）は、プレートウェル（３μl/ウェル；12μMの最終アッセイ濃度）に40μlの膜
タンパク質（30μg/ウェル)および50μlのアッセイバッファーと一緒に加えた。
この混合物を室温で30分間、ゆるやかに震盪しながらインキューベーションした
。
【０１３３】 インキューベーション後、100μlの検出バッファーを各ウェルに加え、続いて
２〜24時間インキューベーションした。プレートをワラックMicroBeta(商標)リ
ーダーで“Prot.#31"を使用してカウントした（製造元の指示に従う）。
２〜24時間インキューベーションした。プレートをワラックMicroBeta(商標)リ
ーダーで“Prot.#31"を使用してカウントした（製造元の指示に従う）。
【０１３４】 当該技術分野では種々の発現ベクターを利用することができるが、使用するベ
クターで最も好ましいのはpCMVである。このベクターは1998年10月13日にアメリ
カン タイプ カルチャー コレクション(ATCC）（米国20110-2209、バージニア州
、マナッサス、10801 ブルヴァール大学）に、特許手続きのための微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約の条項に基づき寄託された。このベクター
はATCCにより試験され、そして利用可能であると定められた。ATCCはpCMVに以下
の寄託番号を割り当てた：ATCC#203351。pCMVの該略図（制限部位を含む）は図
１８に説明する。
クターで最も好ましいのはpCMVである。このベクターは1998年10月13日にアメリ
カン タイプ カルチャー コレクション(ATCC）（米国20110-2209、バージニア州
、マナッサス、10801 ブルヴァール大学）に、特許手続きのための微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約の条項に基づき寄託された。このベクター
はATCCにより試験され、そして利用可能であると定められた。ATCCはpCMVに以下
の寄託番号を割り当てた：ATCC#203351。pCMVの該略図（制限部位を含む）は図
１８に説明する。
【０１３５】 本明細書中で言及した各特許、特許出願および公開公報は全部、引用により本
明細書に編入する。当業者は本発明の精神から逸脱することなく多くの変更およ
び修飾を施すことができると考えるだろう。そのようなすべての変更も本発明の
範囲内にあることを意図する。
明細書に編入する。当業者は本発明の精神から逸脱することなく多くの変更およ
び修飾を施すことができると考えるだろう。そのようなすべての変更も本発明の
範囲内にあることを意図する。
【０１３６】 補遺Ａ 図３の格子コード Ａ２−扁桃；Ａ３−尾状核；Ａ４−小脳；Ａ５−大脳皮質；Ａ６−前脳皮質；Ａ
７−海馬；Ａ８−延髄 Ｂ１−後頭皮質；Ｂ２−被殻；Ｂ３−黒質；Ｂ４−側頭皮質；Ｂ５−視床； Ｂ６−視床下核；Ｂ７−脊髄 Ｃ１−心臓；Ｃ２−大動脈；Ｃ３−骨格筋；Ｃ４−結腸；Ｃ５−膀胱；Ｃ６−子
宮；Ｃ７−前立腺；Ｃ８−胃 Ｄ１−精巣；Ｄ２−卵巣；Ｄ３−膵臓；Ｄ４−下垂体；Ｄ５−副腎；Ｄ６−甲状
腺；Ｄ７−唾液腺；Ｄ８−乳腺 Ｅ１−腎臓；Ｅ２−肝臓；Ｅ３−小腸；Ｅ４−脾臓；Ｅ５−胸腺；Ｅ６−末梢白
血球；Ｅ７−リンパ節；Ｅ９−骨髄 Ｆ１−扁桃；Ｆ２−肺；Ｆ３−気管；Ｆ４−胎盤 Ｇ１−胎児脳；Ｇ２−胎児心臓；Ｇ３−胎児腎臓；Ｇ４−胎児肝臓；Ｇ５−胎児
脾臓；Ｇ６−胎児胸腺；Ｇ８−胎児肺
７−海馬；Ａ８−延髄 Ｂ１−後頭皮質；Ｂ２−被殻；Ｂ３−黒質；Ｂ４−側頭皮質；Ｂ５−視床； Ｂ６−視床下核；Ｂ７−脊髄 Ｃ１−心臓；Ｃ２−大動脈；Ｃ３−骨格筋；Ｃ４−結腸；Ｃ５−膀胱；Ｃ６−子
宮；Ｃ７−前立腺；Ｃ８−胃 Ｄ１−精巣；Ｄ２−卵巣；Ｄ３−膵臓；Ｄ４−下垂体；Ｄ５−副腎；Ｄ６−甲状
腺；Ｄ７−唾液腺；Ｄ８−乳腺 Ｅ１−腎臓；Ｅ２−肝臓；Ｅ３−小腸；Ｅ４−脾臓；Ｅ５−胸腺；Ｅ６−末梢白
血球；Ｅ７−リンパ節；Ｅ９−骨髄 Ｆ１−扁桃；Ｆ２−肺；Ｆ３−気管；Ｆ４−胎盤 Ｇ１−胎児脳；Ｇ２−胎児心臓；Ｇ３−胎児腎臓；Ｇ４−胎児肝臓；Ｇ５−胎児
脾臓；Ｇ６−胎児胸腺；Ｇ８−胎児肺
【配列表】
【図１】 膜貫通ヘリックス、細胞内ループおよび細胞外ループに割り当てた数字を含む
、Ｇタンパク質共役受容体の一般構造を表す。
、Ｇタンパク質共役受容体の一般構造を表す。
【図２】 典型的なＧタンパク質共役受容体に関する活性および不活性な２つの状態、な
らびに活性状態の第２メッセンジャー伝達経路とのつながりを概略的に表す。
らびに活性状態の第２メッセンジャー伝達経路とのつながりを概略的に表す。
【図３】 種々のヒトの組織にわたりオーファン受容体GPR4の分布を表す「ドット−ブロ
ット」のコンピーター表示である（格子−コードについては補遺Ａを参照にされ
たい）。
ット」のコンピーター表示である（格子−コードについては補遺Ａを参照にされ
たい）。
【図４】 75μg/ウェル膜タンパク質で、対照ベクター単独でトランスフェクトしたもの
と比較してオーファン受容体GPR3を用いてトランスフェクトした293T細胞から調
製された膜に対する[35S]GTPγSの強化された結合を表す図表である。 [35S]GTPγS放射線標識の濃度は１.２ｎＭの一定に保持され、ＧＤＰ濃度は１ｎ
Ｍの一定に保持された。
と比較してオーファン受容体GPR3を用いてトランスフェクトした293T細胞から調
製された膜に対する[35S]GTPγSの強化された結合を表す図表である。 [35S]GTPγS放射線標識の濃度は１.２ｎＭの一定に保持され、ＧＤＰ濃度は１ｎ
Ｍの一定に保持された。
【図５】 図５Ａは、オーファン受容体GPR3、GPR6およびGPR12のアミノ酸配列を表し、
そして図５Ｂはオーファン受容体GPR21およびAl022171のアミノ酸配列を表す（
コンセンサス#１は合った残基を示す）。
そして図５Ｂはオーファン受容体GPR21およびAl022171のアミノ酸配列を表す（
コンセンサス#１は合った残基を示す）。
【図６】 図６Ａは、オーファン受容体GPR3、GPR6およびGPR12が、VIP細胞中のCRE駆動
レポーター系からβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するそれらの強化された能
力により構成的に活性であると確認されることを示す図表であり、そして図６Ｂ
および６Ｃは、オーファン受容体GPR21およびAl022171が293および293Ｔ両細胞
中のCRE駆動レポーター系からルシフェラーゼ遺伝子の発現を誘導するそれらの
強化された能力により構成的に活性であると確認されたそれぞれの図表である。
レポーター系からβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するそれらの強化された能
力により構成的に活性であると確認されることを示す図表であり、そして図６Ｂ
および６Ｃは、オーファン受容体GPR21およびAl022171が293および293Ｔ両細胞
中のCRE駆動レポーター系からルシフェラーゼ遺伝子の発現を誘導するそれらの
強化された能力により構成的に活性であると確認されたそれぞれの図表である。
【図７】 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、RT-PCRにより決定された正常なヒトの組織にわた
りGPR3(A)、GPR6(B)およびGPR12(C)オーファン受容体の発現の相対的分布を表す
。略号：Ocx＝後頭皮質；Hypoth＝視床下部；Tex＝側頭皮質；Fcx＝前頭皮質。
りGPR3(A)、GPR6(B)およびGPR12(C)オーファン受容体の発現の相対的分布を表す
。略号：Ocx＝後頭皮質；Hypoth＝視床下部；Tex＝側頭皮質；Fcx＝前頭皮質。
【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、RT-PCRにより調査した時の正常（Ａ）および癲癇（Ｂ）
のヒトの脳組織でのGPR3受容体の発現を表す。
のヒトの脳組織でのGPR3受容体の発現を表す。
【図９】 図９Ａは、GPR6プローブを使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（正
常ラット）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであり；図９Ｂは、ラ
ット脳の対応する領域の参照地図である。
常ラット）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであり；図９Ｂは、ラ
ット脳の対応する領域の参照地図である。
【図１０】 図１０Ａは、GPR6プローブを使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（
Zuckerラット−痩せている）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであ
り；図１０Ｂは、GPR6プローブを使用したイン・シトウハイブリダイゼーション
（Zuckerラット−肥満）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであり；
図１０Ｃはラット脳の対応する領域の参照地図である。
Zuckerラット−痩せている）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであ
り；図１０Ｂは、GPR6プローブを使用したイン・シトウハイブリダイゼーション
（Zuckerラット−肥満）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーであり；
図１０Ｃはラット脳の対応する領域の参照地図である。
【図１１】 図１１Ａ−Ｆは、GPR12プローブを使用したイン・シトウハイブリダイゼーシ
ョン（正常ラット）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーである。
ョン（正常ラット）からの結果を表すオートラジオグラフのコピーである。
【図１２】 図１２は、GPR6プローブ（１２Ａ）およびオレキシン１受容体プローブ（１２
Ｂ）を使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（正常ラット）からの結果
を表すオートラジオグラフのコピーであり、２つの受容体の同時局在を決定する
ための重複を含む（１２Ｃおよび１２Ｄ）。
Ｂ）を使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（正常ラット）からの結果
を表すオートラジオグラフのコピーであり、２つの受容体の同時局在を決定する
ための重複を含む（１２Ｃおよび１２Ｄ）。
【図１３】 図１３は、GPR6プローブ（１３Ａ）およびメラノコルチン-３受容体プローブ
（１３Ｂ）を使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（正常ラット）から
の結果を表すオートラジオグラフのコピーであり、２つの受容体の同時局在を決
定するための重複を含む（１３Ｃおよび１３Ｄ）。
（１３Ｂ）を使用したイン・シトウハイブリダイゼーション（正常ラット）から
の結果を表すオートラジオグラフのコピーであり、２つの受容体の同時局在を決
定するための重複を含む（１３Ｃおよび１３Ｄ）。
【図１４】 図１４は、同時局在実験からの結果を提供し、GPR6およびAGPRが弓内に同時局
在することを表している。矢印は弓内の特異的な細胞に注目を向け、細胞の回り
に丸印を付し；「ドット」は放射標識したGPR6であり、そしてそれらの下の暗い
ところがAGPRである。
在することを表している。矢印は弓内の特異的な細胞に注目を向け、細胞の回り
に丸印を付し；「ドット」は放射標識したGPR6であり、そしてそれらの下の暗い
ところがAGPRである。
【図１５】 図１５はGPR6に対するアンチオリゴヌクレオチドを受けた動物（ｎ＝５）から
の継時的な体重のグラフによる結果を提供する（５日の星印は、動物がd-アンフ
ェタミンサルフェート注射を受けた日を示す；図１６を参照にされたい）。
の継時的な体重のグラフによる結果を提供する（５日の星印は、動物がd-アンフ
ェタミンサルフェート注射を受けた日を示す；図１６を参照にされたい）。
【図１６】 図１６は図１５の動物を対象としたベースラインの運動活動およびアンフェタ
ミンで誘導された運動の行動からの結果を棒グラフで提供する。
ミンで誘導された運動の行動からの結果を棒グラフで提供する。
【図１７】 GPR3融合タンパク質（図１７Ａ）およびGPR6融合タンパク質（図１７Ｂ）に対
してスクリーニングした候補化合物の直接的同定からの結果を棒グラフで提供す
る。
してスクリーニングした候補化合物の直接的同定からの結果を棒グラフで提供す
る。
【図１８】 図８Ａ−Ｌは好適なベクターpCMVの配列図であり、制限酵素部位の位置を含む
。
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１１０，９０６ (32)優先日 平成10年12月４日(1998．12．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１２１，８５１ (32)優先日 平成11年２月26日(1999．2．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 リアウ，チエン アメリカ合衆国カリフオルニア州92129サ ンデイエゴ・サリツクスプレイス7668 (72)発明者 リン，アイ−リン アメリカ合衆国カリフオルニア州92126サ ンデイエゴ・ゴールドコーストドライブ 8291−７ (72)発明者 ロウイツツ・ケビン アメリカ合衆国カリフオルニア州92108サ ンデイエゴ・カミニトデピツザ8031・アパ ートメントシー (72)発明者 チエン，ルオピング アメリカ合衆国カリフオルニア州92130サ ンデイエゴ・テインバーブランチウエイ 5296 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB17 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FB02 FB09 JA04 4B024 AA01 AA20 BA63 CA04 CA09 CA12 HA13 HA14 4C084 AA16 BA44 CA59 NA14 ZB012 ZC412
Claims (19)
- 【請求項１】 内因性の構成的に活性なＧタンパク質共役オーファン受容体
に対するインバースアゴニスト、部分アゴニストおよびアゴニストから成る群か
ら選択される化合物として候補化合物を直接同定するための方法において： （ａ）候補化合物を、GPCR融合タンパク質であって、内因性の構成的に活性なＧ
タンパク質共役オーファン受容体およびＧタンパク質を含んで成るGPCR融合タン
パク質と接触させ；そして （ｂ）該接触した受容体における化合物の効能を測定することにより、該化合物
が該受容体のインバースアゴニスト、部分アゴニストまたはアゴニストであるか
どうかを決定する： 工程を含んで成る方法。 - 【請求項２】 化合物が上記オーファン受容体に対してインバースアゴニス
トであると直接同定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 化合物が上記オーファン受容体に対してアゴニストであると
直接同定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 化合物が上記オーファン受容体に対して部分アゴニストであ
ると直接同定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 請求項２の方法により同定される化合物を含んで成る組成物
。 - 【請求項６】 請求項３の方法により同定される化合物を含んで成る組成物
。 - 【請求項７】 請求項４の方法により同定される化合物を含んで成る組成物
。 - 【請求項８】 上記オーファン受容体が、GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21
、OGR1、GHSR、RE2およびALO22171から成る群から選択される請求項１に記載の
方法。 - 【請求項９】 上記オーファン受容体がGPR6である請求項１に記載の方法。
- 【請求項１０】 上記Ｇタンパク質がGs、Gi、GqおよびGoから成る群から選
択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｇタンパク質がGsαである請求項１に記載の方法。
- 【請求項１２】 内因性の構成的に活性なＧタンパク質共役オーファン受容
体に対するインバースアゴニスト、部分アゴニストおよびアゴニストから成る群
から選択される化合物として候補化合物を直接同定するための方法において： （ａ）候補化合物を、GPCR融合タンパク質であって、内因性の構成的に活性なＧ
タンパク質共役オーファン受容体およびGsαタンパク質を含んで成るGPCR融合タ
ンパク質と接触させ；そして （ｂ）該接触した受容体における化合物の効能を測定することにより、該化合物
が該受容体のインバースアゴニスト、部分アゴニストまたはアゴニストであるか
どうかを決定する： 工程を含んで成る方法。 - 【請求項１３】 上記オーファン受容体が、GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR
21、OGR1、GHSR、RE2およびALO22171から成る群から選択される請求項１２に記
載の方法。 - 【請求項１４】 上記オーファン受容体がGPR6である請求項１２に記載の方
法。 - 【請求項１５】 上記化合物がインバースアゴニストおよびアゴニストから
成る群から選択される化合物として直接同定される、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 上記化合物がインバースアゴニストである請求項１５に記
載の方法。 - 【請求項１７】 請求項１６の化合物を含んで成る組成物。
- 【請求項１８】 受容体を請求項１に記載の方法により同定された化合物と
接触させることを含んで成る、Ｇタンパク質共役オーファン受容体のモジュレー
ト法。 - 【請求項１９】 受容体を請求項１２に記載の方法により同定された化合物
と接触させる工程を含んで成る、Ｇタンパク質共役オーファン受容体のモジュレ
ート法。
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