JP2002516615A - 変性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、５〜１００kDaの分子量の親ポリペプチドに共有結合された、１００〜７５０Daの分子量のカップリングされたポリマー分子を有する、呼吸アレルゲン性が減少した変性ポリペプチド、呼吸アレルゲン性が減少した変性ポリペプチドを含んでなる工業用組成物、スキンケア製品、工業用組成物および製品のアレルゲン性を減少するための変性ポリペプチドの使用、および最後にポリペプチドのアレルゲン性を減少する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 変性ポリペプチド発明の分野 本発明は、呼吸アレルゲン性が減少した変性ポリペプチド、呼吸アレルゲン性 が減少した変性ポリペプチドを含んでなる工業用組成物、スキンケア製品、工業 用組成物および製品のアレルゲン性を減少するための変性ポリペプチドの使用、 および最後にポリペプチドのアレルゲン性を減少する方法に関する。発明の背景 医学的用途および工業的用途の双方のために、酵素を包含するポリペプチドの 使用はこの分野においてよく知られている。ポリペプチドは抗原投与の方法、典 型的にはＩｇＧおよび／またはＩｇＥの応答に依存して、望ましくない応答を潜 在的に引き起こすので、それを減少する技術は最近の３０年間開発されてきてい る。 １つの技術は、多数のポリマー分子を問題のポリペプチドにカップリングさせ る、「ＰＥＧ化（PEGIyation）」技術である。この技術を使用するとき、免疫系 は抗体の生成に必要なポリペプチドの表面上のエピトープを認識し、これにより 免疫応答を減少することが困難となる。 ポリペプチドをヒトの体の循環系の中に直接的に導入して特定の生理学的効果 を得る（すなわち、薬剤学）ために、典型的な潜在的免疫応答はＩｇＧおよび／ またはＩｇＭの応答であるが、呼吸器系を通して吸入されるポリペプチド（すな わち、工業用ポリペプチド）はＩｇＥ応答（すなわち、アレルギー性応答）を潜 在的に引き起 こすことができる。 免疫応答の減少を説明する理論の１つは、抗体の生成に導く免疫応答に必要な ポリペプチドの表面上の１または２以上のエピトープを１または２以上のポリマ ー分子が遮断することである。他の理論または少なくとも部分的因子は、複合体 が重くなるほど、免疫応答がより減少されることである。 米国特許第4,179,337号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはプロピ レングリコール（ＰＰＧ）にカップリングされた非免疫原性ポリペプチド、例え ば、酵素およびペプチドホルモンに関する。ポリペプチドの生理学的活性の少な くとも１５％が維持される。この特許において、７５０Da〜6,000Daの範囲の分 子量のＰＥＧの使用が例示されている。ポリペプチドは工業的用途に使用されな い。 WO96/17929号（Novo Nordisk A/S）は、ポリマー分子にカップリングされた変 性ポリペプチド複合体に関する。変性酵素は多数の工業的用途に使用することが できる。実施例におけるポリペプチドにカップリングされたポリマー分子の分子 量は、それぞれ、5,000、15,000Daおよび35,000Daである。発明の要約 本発明は、アレルゲン性が減少した変性ポリペプチド、および変性ポリペプチ ドを含んでなる工業的使用のための組成物および製品に関する。 一般に、短く／軽質のポリマー分子はポリペプチドの表面を十分に遮断するこ とができないので、ポリマー分子の分子量および長さは短く／軽質であってはな らないと考えられる。 この偏見は、今回、ポリペプチドが循環系の中に入ることを意図 しない、工業的用途に使用されるポリペプチド、例えば、酵素について、誤りで あることが、本発明者らにより証明された。 潜在的危険がポリペプチドの吸入により引き起こされるアレルゲン性応答であ る工業的用途に、問題のポリペプチドを使用するとき、呼吸アレルゲン性応答を 減少させる能力を有意に減少させないで、親ポリペプチドを１００Da〜5,000Da 、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Daの分子量のポリマー分子に カップリングさせることができることを本発明者ら見出した。 第１の面において、本発明は、１００Da〜７５０Da、特に１００〜５００Da、 例えば、約３００Daの範囲の分子量のポリマー分子にカップリングされたポリペ プチドに関する。 第２の面において、本発明は、１００Da〜5,000Daの分子量のポリマー分子に カップリングされた変性ポリペプチドを含んでなる、工業製品に使用するための 組成物に関する。工業用ポリペプチド 工業的用途に使用されるポリペプチドは、しばしば、酵素活性および／または 抗菌活性を有する。工業用ポリペプチドは、薬学上のポリペプチドと対照的に、 体の循環系の中に導入することを意図しない。 したがって、工業用組成物および／または製品（下記において定義される）、 例えば、洗濯および皿洗い洗剤を包含する洗剤、食物および飼料の添加剤、例え ば、パン製造用添加剤、繊維材料処理用組成物、および個人用ケア製品、例えば 、化粧品において活性成分として使用されるポリペプチド、例えば、酵素はヒト または動物の体の循環系と直接接触するようになる可能性は非常に低い。なぜな ら、このようなポリペプチド（またはこのようなポリペプチドを含んでなる製品 ）は血流の中に注射されないからである。 したがって、工業用ポリペプチドの場合において、潜在的危険は、気道を通し てポリペプチドを吸入した結果としての、呼吸アレルギー（すなわち、ＩｇＥ応 答）である。 本発明の関係において、「工業用ポリペプチド」は、ヒトおよび／または動物 の循環系の中に導入することを意図しないポリペプチド、例えば、ペプチド、タ ンパク質および／または酵素として定義される。 このような「工業用ポリペプチド」の例は、下記におい定義する酵素活性をも つポリペプチドを包含する。 本発明はまた、アレルゲン性が減少したスキンケア製品に関する。 さらに、本発明はまた、工業製品のアレルゲン性を減少するための、１００Da 〜5,000Da、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Daの分子量の変性 ポリペプチドの使用に関する。 最後に、本発明は、ポリペプチドを１００Da〜5,000Daの分子量のポリマー分 子とカップリングさせることによって、ポリペプチドのアレルゲン性を減少させ る方法に関する。発明の詳細な説明 本発明の目的は、アレルゲン性が減少した変性ポリペプチド、およびアレルゲ ン性が減少した変性ポリペプチドを含んでなる、工業的に使用するための組成物 および製品を提供することである。 用語「アレルゲン性が減少した」は、本発明の関係において、アレルギー状態 に導きうる産生されるＩｇＥ（ヒトにおいて、および特定の動物において匹敵す る作用をもつ分子）の量が、本発明のポリペプチドを吸入したとき、対応する親 ポリペプチドと比較して、減少することを意味する。その代わりに、用語「呼吸 アレルゲン性 」を使用することができる。 潜在的な主要な危険がポリペプチドの吸入により引き起こされるアレルゲン性 応答である工業的用途のために、ポリペプチドを使用するとき、呼吸アレルゲン 性応答を減少させる能力を有意に減少させないで、親ポリペプチドを１００Da〜 5,000Da、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Daの分子量のポリマ ー分子にカップリングさせることができることを本発明者らは見出した。 本発明の態様において、ポリペプチド、特に酵素にカップリングさせるポリマ ー分子は１００〜７５０Da、例えば、１００〜５００Da、例えば、約３００Daの 分子量を有する。 ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子はこの程度に小さくあること ができ、そして現存する偏見、すなわち、短く／軽質のポリマー分子はポリペプ チドの表面を十分に遮断することができないので、ポリペプチドにカップリング される分子量および長さは短く／軽質であってはならないこと、が誤りであるこ とを証明することは驚くべきことである。 第１の面において、本発明は、５〜１００kDa、例えば、１５〜６０kDaの分子 量を有する親ポリペプチドに共有結合された、１００〜７５０Da、特に１００〜 ５００Da、例えば、約３００Daの分子量のカップリングされたポリマー分子を有 する変性ポリペプチドに関する。 短く／軽質のポリマー分子はポリペプチドの機能的活性を阻害する傾向がより 少ないので、短く／軽質のポリマー分子を問題のポリペプチドにカップリングす ることが好都合である。例えば、ポリマー分子の立体障害性がそれほど顕著でな いので、より大きい／より重質のポリマー分子にカップリングされた対応する酵 素と比較して、本発明に従い規定された分子量を有するポリマー分子にカップリ ングされた酵素の活性部位は基質により容易にアクセス可能である。さらに、よ り小さい／より軽質のポリマー分子と結合したポリペプチド−ポリマーの複合体 は、ポリペプチドにカップリングされたより大きい／より重質のポリマー分子と の複合体に比較して、改良された安定性を有する。なぜなら、異なる方向におけ るポリペプチド構造を重さが少ないという事実のために、ポリペプチド構造の変 形が最小であるからである。 小さいポリマー分子を使用する他の利点は、それらがkg当たりで販売されてい るポリマーの価格が低いということである。これにより、本発明の複合体の製造 コストが減少する。アレルゲン性の評価 吸入試験において、気管内に投与された親ポリペプチドの作用を本発明による 対応する変性ポリペプチドと比較することによって、アレルゲン性を評価するこ とができる。 ポリペプチドのアレルゲン性の評価のために、多数のin vivo動物モデルが存 在する。これらのモデルのあるものは、人間における危険の評価の適当な基準を 提供する。適当なモデルはモルモットのモデルおよびマウスのモデルを包含する 。これらのモデルは、前に感作された動物において誘導された誘発反応の関数と して、呼吸アレルゲンを同定することを目的とする。これらのモデルによれば、 疑わしいアレルゲンを動物の腹腔内に導入する。 モルモットの適当な系統であるダンキン・ハートレイ（Dunkin Hartley）系統 は、ヒトのように、アレルギー応答に関してＩｇＥ抗体を産生しない。しかしな がら、モルモットは他の型の抗体、IgG1AおよびIgG1B（例えば、Prentφ，ATLA ，19，p.8-14，1991参照）を産生し、これらは吸入されたポリペプチド、酵素に 対するモルモットのアレルゲン性応答の原因となる。したがって、ダンキン・ ハートレイの動物モデルを使用するとき、IgG1AおよびIgG1Bの相対量はアレルゲ ン性レベルの測度結果となる。 ポリペプチド、例えば、酵素に対する気管内暴露に適当なラットの系統は、ブ ラウン・ノールウェイ（Brown Norway）系統である。ブラウン・ノールウェイラ ットは、アレルギー応答として、ＩｇＥを産生する。ブラウン・ノールウェイラ ットは、本発明を例示する実施例４および５に記載されている試験において使用 される。 モルモットおよびマウスにおける呼吸アレルゲン性の評価は、Kimber et al． (1996)、Fundamental and Applied Toxicology、33、p.1-10に詳細に説明されて いる。 他の動物、例えば、ウサギを匹敵する研究に使用することもできる。ポリマー分子 ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、本発明に従い規定された 分子量を有する、任意の適当なポリマー分子であり、下記のものを包含する：天 然および合成のホモポリマー、例えば、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、 ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ₂）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ −COOH）、並びに他のヘテロポリマー、すなわち、１または複数の異なるカップ リング基、例えば、ヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマー。 適当なポリマー分子の例は下記のものから成る群より選択されるポリマー分子 を包含する：ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えばポリアルキレングリコ ール（ＰＡＧ）例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレ ングリコール（mPEG）およびポリプロピレングリコール、ＰＥＧ−グリシジルエ ーテル（Epox−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−Ｐ ＥＧ）、分枝鎖状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレ ート、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コーマ レイン酸無水物、ポリスチレン−コーマレイン酸無水物、デキストラン、例えば カルボキシメチル−デキストラン、ヘパリン、相同性アルブミン、セルロース、 例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、 ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプ ロピルセルロース、キトサンの加水分解物、澱粉、例えばヒドロキシエチル澱粉 およびヒドロキシプロピル澱粉、グリコーゲン、アガロースおよびそれらの誘導 体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲーナン、ペクチ ン、アルギン酸加水分解物およびバイオポリマー。 好ましいポリマー分子は、無毒のポリマー分子、例えば、（メトキシ）ポリエ チレングリコール（mPEG）であり、これらは酵素表面上の結合基への共有結合の カップリングのために比較的簡単な化学反応をさらに必要とする。 簡単に述べると、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、ポリエチレン オキシド、例えばＰＥＧおよび特にmPEGは、多糖、例えばデキストラン、プルラ ンおよびその他に比較して、望ましくない架橋可能な反応性基の数が少ないので 、好ましいポリマー分子である。 前述のポリマー分子のすべては本発明に従い使用できるので、メトキシポリエ チレングリコール（mPEG）およびビス−ＯＨポリエチレングリコールが好ましい 。ポリマーの活性化 問題のポリペプチドと複合体化すべきポリマー分子が活性でない場合、それを 適当な技術により活性化しなくてはならない。また、 本発明によれば、ポリマー分子をリンカーを通してポリペプチドにカップリング することが考えられる。適当なリンカーは当業者によく知られている。 ポリマー分子の活性化およびポリペプチドの結合の方法および化学反応は文献 に集中的に記載されている。不溶性ポリマーの活性化に普通に使用されている方 法は、官能基を臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド 、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カーボジイミド、ハロゲン化スルホ ニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化を包含する（R.F．Taylo r、(1991)、”Protein immobilisation．Fundamental and applications”、Mar cel Dekker、N.Y.；S.S．Wong、(1992)、”Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”、CRC Press、Boca Raton；G.T．Hermanson et al.、(1993) 、”Immobilized Affinity Ligand Techniques”、Academic Press、N.Y.参照） 。方法のいくつかは不溶性ポリマーの活性化に関するが、また、可溶性ポリマー の活性化のために、例えば、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化 スルホニル、ジビニルスルホン、カーボジイミドなどが適用可能である。官能基 はポリマー上のアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒドま たはスルフヒドリルおよびタンパク質上の選択された結合基であり、これらの官 能基を活性化および結合の化学の選択において考慮しなくてはならない。このよ うな化学は、通常、ｉ）ポリマーの活性化、ｉｉ）結合、およびｉｉｉ）残りの 活性基のブロックから成る。 下記において、多数の適当なポリマーの活性化方法を簡単に述べる。しかしな がら、他の方法もまた使用できることを理解すべきである。 ポリペプチドの遊離酸基へのポリマー分子のカップリングは、ジ イミドおよび、例えば、アミノ−ＰＥＧまたはヒドラジン−ＰＥＧ(Pollak、et al.、(1976)、J．Amr．Chem．Soc.、98、289-291)またはジアゾアセテート／ア ミド(Wong,．et al.、(1992)、”Chemistry of Protein Conjugation and Cross linking”、CRC Press)の助けにより実施することができる。 ヒドロキシへのポリマー分子のカップリングは、水中で実施しなくてはならな いので、一般に非常に困難である。通常、ヒドロキシル基との反応より加水分解 が優勢を占める。 遊離スルフヒドリル基へのポリマー分子のカップリングは、マレイミドまたは オルト−ピリジルジサルファイドのような特別の基を使用して達成することがで きる。また、ビニルスルホン（米国特許第5,414,135号、(1995)、Snow、et al. ）はスルフヒドリル基のために好ましいが、述べた他の基のように選択的ではな い。 ２っのビシナルカルボニル基で、ポリペプチド鎖中のアクセス可能なアルギニ ン残基をターゲッティングすることができる。 また、求電子的に活性化したＰＥＧをリジンのアミノ基にカップリングするこ とを含む技術は有効であることがある。アルコールの通常の離脱基の多数はアミ ノ結合を形成する。例えば、アルキルスルホネート、例えば、トレシレート（tr esylate）（Nilsson et al.，(1984)，Methods in Enzymology，Vol.104，Jacob y，W.B.編，Academic Press，Orland，pp.56-66；Nilsson et al.，(1987)，Met hods in Enzymology，Vol.135；Mosbach，K.,編；Academic Press，Orland，pp. 65-79；Scouten et al.，(1987)，Methods in Enzymology，Vol.135，Mosbach， K.編；Academic Press，Orland，1987，pp.79-84；Crossland et al.，(1971)， J．Amr．Chem．Soc．1971，93，pp.4217-4219)、メシレート(Harris，(1985)，s upra ；Harris et al.，J．Polym．Sci．Polym．Chem．Ed．22，pp.341- 352)、アリールスルホネート、例えば、トシレート、およびパラ−ニトロベンゼ ンスルホネートを使用することができる。 有機塩化スルホニル（スルホニルクロライド）、例えば、塩化トレシル(Tresy l chloride)は、多数のポリマー、例えば、ＰＥＧ中のヒドロキシ基をすぐれた （good）離脱基（スルホネート）に効果的に有効に変換し、離脱基はポリペプチ ド中の求核基、例えば、アミノ基と反応するとき、ポリマーとポリペプチドとの 間で安定な結合を形成することができる。高い結合収率に加えて、反応条件は一 般に温和であり（変性を回避するために、中性またはわずかにアルカリ性のpH、 そして活性の破壊はわずかであるか、あるいはまったくない）、そしてポリペプ チドに対する非破壊的要件を満足する。 トシレートはメシレートよりも反応性であるが、また、いっそう不安定であり 、ＰＥＧ、ジオキサン、およびスルホン酸に分解する（Zalipsky，(1995)，Bioc onjugate Chem.，6，150-165）。また、エポキシドをアミン結合の形成に使用で きるが、前述の基よりも反応性に劣る。 ＰＥＧをホスゲンでクロロホルメートに変換すると、リジンに対するカルバメ ート結合が形成する。この主題は塩素をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（米国特 許第5,122,614号、(1992)；Zalipskyet al.、(1992)、Biotechnol．Applied Bio chem.、15、p.100-114；Monfardini et al．、(1995)；Bioconjugate Chem．、6 、62-69)、イミダゾール（Allen et al.、(1991)、Carbohydr．Res．、213、pp. 309-319）、ｐ−ニトロフェノール、DMAP（EP632、082A1、(1993)、Looze,，Y. ）およびその他で置換する多数の変法において使用することができる。誘導体は 通常クロロホルメートを所望の離脱基で反応させることによって製造される。す べてのこれらの基はペプチドに対するカルバメート結合を発生させる。 さらに、イソシアネートおよびイソチオシアネートを、それぞれ、尿素および チオ尿素の生成に使用することができる。 前述と同一の離脱基および環状イミドスロンを使用して、ＰＥＧ酸からアミド を製造することができる（米国特許第5,349,001号，(1994)，Greenwald et al. ）。これらの化合物の反応性は非常に高いが、加水分解を速くさせ過ぎることが ある。 また、コハク酸無水物との反応から製造したＰＥＧスクシネートを使用するこ とができる。これにより構成されたエステル基は、複合体を加水分解に対して非 常に感受性とする（米国特許第5,122,614号、(1992)、Zalipsky）。この基をＨ −ヒドロキシスクシンイミドで活性化することができる。 さらに、特別のリンカーを導入することができる。最も古いリンカーは塩化シ アヌル酸である(Abuchowski et al.，(19771)，J．Biol．Chem.，252，3578-358 1；米国特許第4,179,337号，(1979)，Davis et al.；Shafer et al.，(1986)，J ．Polym．Sci．Polym．Chem．Ed．24，375-378)。 ＰＥＧを芳香族アミンにカップリングし、次いでジアゾ化すると、非常に反応 性のジアゾニウム塩が生成し、これを現場でペプチドと反応させることができる 。ＰＥＧのアズラクトン誘導体を反応させ(米国特許第5,321,095号，(1994)，Gr eenwald，R.B.)こうして追加のアミド結合を導入することによって、アミド結合 を形成することができる。 いくつかのペプチドは多数のリジンを含まないので、２以上のＰＥＧを同一リ ジンに結合させることは好都合であることがある。これは、例えば、１，３−ジ アミノ−２−プロパノールを使用して実施することができる。 また、ＰＥＧを酵素のアミノ基にカルバメート結合で取付けるこ とができる（WO95/11924号，Greenwald et al.）。また、リジン残基を主鎖とし て使用することができる。カップリングされたポリマー分子の位置 事実上すべてのイオン化基、例えば、リジン残基のアミノ基は、ポリペプチド 分子の表面上に存在する（例えば、Thomas E．Creighton，(1993),”Proteins” ，W.H．Freeman and Company，New York、参照）。したがって、ポリペプチド表 面上の容易にアクセス可能な結合基（すなわち、アミノ基）の数は、ポリペプチ ドの一次構造中のリジン残基＋Ｎ末端のアミノ基の数に等しい。 本発明によれば、１〜１００のポリマー分子、好ましくは４〜５０のポリマー 分子、３〜３５のポリマー分子を親ポリペプチドにカップリングさせる。親ポリペプチド この分野において知られている任意の適当な技術を使用して、５〜１００kDa 、好ましくは１５〜６０kDaの範囲の分子量を典型的には有する、親ポリペプチ ドをベースとする、本発明の変性ポリペプチドを製造することができる。 用語「親」ポリペプチドは、任意のカップリングされていないポリペプチド（ すなわち、変性すべきポリペプチド）を示すことを意図する。ポリペプチドは好 ましくは微生物由来、例えば、細菌、糸状菌類または酵母由来であることができ る。親ポリペプチドは天然に存在する（または野生型）ポリペプチドであるか、 あるいはその変異型であることができる。 好ましいポリペプチドは抗菌活性を有するポリペプチドおよび酵素である。好 ましい態様において、酵素はスキンケア製品において使用されるpH範囲において 実質的に酵素活性を有するスキンケア組成物および製品に適当な酵素である。 親ポリペプチドを選択するとき、大きい数の結合基を有するポリペプチドを使 用することが好都合である。 さらに、本発明の好ましい態様において、ポリマー分子はポリペプチドの表面 にわたって分布される。酵素について、ポリマー分子は活性部位に密接した区域 においてカップリングされないことが好ましい。 本発明の関係において、「広く分布される」は、ポリペプチドの結合基にカッ プリングされたポリマー分子がポリペプチド表面の異なる部分、好ましくは全表 区域またはほとんど全表区域遮断して、認識可能な１または２以上の関係するエ ピトープが遮断され、これにより免疫系の抗体により認識されないことを保証す るように配置されることを意味する。ポリペプチドと抗体との間の相互作用の表 面区域は約５００Ų（２６×１９Å）の範囲に横たわると考えられる（Sheriff et al．(1987)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．84，p.8075、参照）。 ポリペプチド上の２またはそれより多くの結合基は、互いに密接して横たわら ないことが好ましい。それは、ただ１つのポリマー分子がカップリングされるこ とをもたらすからである。 酵素について、酵素活性の喪失を最小とし、ポリマー分子が活性部位に密接し た距離でポリマー分子をカップリングしないことが好ましい。簡単に述べると、 ポリマー分子は活性部位から５Ų範囲内で、好ましくは１０Ų範囲内で結合さ れないことが好ましい。 さらに、免疫系により認識可能な既知のエピトープにおいて、あるいは前記エ ピトープに密接して、カップリングされたポリマー分子を有するポリペプチドは 、また、本発明によれば好都合であると考えられる。１またはそれ以上のエピト ープの位置が未知である場合、ポリペプチドの表面上で利用可能な結合基に、で きるだけ多く のポリマー分子をカップリングさせることが好都合である。前記結合基は、活性 部位から適当な距離において、ポリペプチドの表面にわたって広く分布されるこ とが好ましい。 本発明によれば、ポリペプチドの表面上のカップリングされたポリマー分子の 分布に対する上記の要件を満足する変性ポリペプチドは好ましい。 酵素、特に活性部位から０〜５Ų、好ましくは０〜１０Ųの距離の範囲内で カップリングされたポリマー分子をもたないか、あるいはわずか（すなわち、０ 〜２つ）をもつ酵素は好ましい。酵素活性 親酵素はスキンケアのために使用すべき活性を有することができる。下記の酵 素が考えられる：オキシドレダクターゼ(Ｅ．Ｃ．１，”Enzyme Nomenclature， (1992)，Academic Press，Inc.)、例えば、ラッカーゼおよびスーパーオキシド ジスムターゼ（ＳＯＤ）；ヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３）、例えばプロテアーゼ、 特にセリンプロテアーゼ、例えば、スブチリシン、およびタンパク質分解酵素； トランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２）、例えばトランスグルタミナーゼ（ＴＧアー ゼ）；イソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５）、例えばタンパク質ジサルファイドイソメラ ーゼ（ＰＤＩ）。ヒドロラーゼ タンパク質分解酵素 考えられるタンパク質分解酵素は、上に示した性質（すなわち、結合基の数、 結合基の位置、およびその他）を有する、酸性アスパラギン酸プロテアーゼ、シ ステインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えばスブチリシン、またはメタ ロプロテアーゼを包含する。 下記表１に、適当な数の結合基を有する適当な親プロテアーゼの 特定の例を示す： スブチリシンPD498は２９kDaの分子量を有し、そして配列番号：２から理解で きるように、酵素の表面上のポリマーの結合のための１２リジン基＋１つのＮ末 端のアミノ基を有する。前述のように 、好ましい酵素は表面にわたって広く分布したリジンを有する。PD498は活性部 位から０〜１０Åの距離においてリジン残基を有さず、これによりPD498は変性 された形態において特に適当である。さらに、リジン残基は酵素の表面上に広く （すなわち、活性部位から離れる方向に）分散されている。 酵素のスブチリシンＤＹは２７kDaの分子量を有し、そして酵素の表面上の１ ２アミノ基（すなわち、リジン残基）および１つのＮ末端のアミノ基を有する（ 配列番号：３参照）。 親リオン（Lion）Ｙは４６kDaの分子量を有し、そして酵素の表面上の１４ア ミノ基（すなわち、リジン残基）および１つのＮ末端のアミノ基を有する（配列 番号：４参照）。 中性のメタロプロテアーゼ サーモリシン(Thermolysin)は３４kDaの分子量を 有し、そして酵素の表面上の１１アミノ基（すなわち、リジン残基）および１つ のＮ末端のアミノ基を有する（配列番号：５参照）。 脂肪分解酵素 考えられる脂肪分解酵素は下記のものを包含する：フミコラ・ラヌギノサ(Hum icola lanuginosa)リパーゼ、例えば、EP258,068号およびEP305,216号に記載さ れているリパーゼ、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、リゾムコル ・ミエヘイ（Rhizomucor miehei)リパーゼ、例えば、EP238,023号に記載されて いるリパーゼ、アブシディア(Absidia)の種の脂肪分解酵素（WO96/13578号）、 カンジダ(Candida)リパーゼ、例えば、カンジダ・アンタルクチカ(C．antarctic a)リパーゼ、例えば、EP214,761号に記載されているカンジダ・アンタルクチカ( C．antarctica)リパーゼＡまたはＢ、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ、 例えば、シュードモナス・アルカリゲネス（P．alcaligenes）およびシュードモ ナス・ シュードアルカリゲネス（P．pseudoalcaligenes）リパーゼ、例えば、EP218,27 2号に記載されているリパーゼ、シュードモナス・セパキア（P．cepacia）リパ ーゼ、例えば、EP331,376号に記載されているリパーゼ、WO95/14783号に記載さ れているシュードモナス(Pseudomonas)の種のリパーゼ、バシラス（Bacillus） リパーゼ、例えば、バシラス・サチリス(B．subtilis)リパーゼ（Dartois et al .，(1993),Biochemica et Biophysicaacta 1131,253-260）、バシラス・ステア ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）リパーゼ（日本国特許（JP ）64/744992号）およびバシラス・プミラス（Bacillus pumilus）リパーゼ（WO9 1/16422号）。脂肪分解酵素の他の型は、クチナーゼ、例えば、フミコラ・イン ソレンス(Humicola insolens)またはシュードモナス・メンドナ（Pseudomonas m endocina）(WO88/09367号)に由来するクチナーゼ、またはフザリウム・ソラニ・ ピシ（Fusarium solani pisi）(WO90/09446号)を包含する。オキシドレダクターゼ ラッカーゼ 考えられるラッカーゼは、ノボ・ノルディスク（Novo Nordisk）からのWO96/0 0290号およびWO95/33836号に開示されているラッカーゼを包含する。 他のオキシドレダクターゼは、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオ キシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびリポキシゲナーゼを包含する 。トランスフェラーゼ トランスグルタミナーゼ 適当なトランスフェラーゼは、WO96/06931号（Novo Nordisk A/S）およびWO96 /22366号（Novo Nordisk A/S）に開示されている、任 意のトランスグルタミナーゼを包含する。イソメラーゼ タンパク質ジサルファイドイソメラーゼ それに限定されないで、適当なタンパク質ジサルファイドイソメラーゼは、WO 95/01425号（Novo Nordisk A/S）に開示されているタンパク質ジサルファイドイ ソメラーゼを包含する。工業用組成物 それ以上の面において、本発明は、アレルゲン性が減少した変性ポリペプチド を含んでなる「工業用組成物」に関する。 本発明の関係において、「工業用組成物」は、循環系の中に導入することを意 図しない組成物を意味する。換言すると、それは皮内、静脈内または皮下の投与 を意図しない組成物を意味する。 前述のように、工業的用途についてポリペプチド、例えば、酵素についての主 要な問題は、呼吸器系を通す吸入、すなわち、気管内または鼻内の暴露により引 き起こされる呼吸アレルギーの潜在的危険である。 「工業用組成物」の例は、組成物または製品、例えば、洗濯および皿洗い洗剤 を包含する洗剤、家庭用製品、農薬、個人用ケア製品、例えば、スキンケア製品 、例えば、化粧品およびトイレ用品、口および皮膚の薬品、繊維材料の処理／加 工に使用される組成物、硬質表面のクリーニング用組成物、および食物および飼 料に使用される組成物、例えば、食物または飼料の添加剤、例えば、パン製造用 添加剤またはその他である。本発明によれば、スキンケア製品および洗剤が特に 考えられる。スキンケア製品 本発明の関係において、「スキンケア製品」は、使用の間に皮膚または呼吸器 系と接触するようになることがある、体の皮膚のクレ ンジング、ケアおよび／または美化に使用される、すべての個人用ケア製品、お よびさらに他の製品、例えば、ヘヤケア製品を包含する。また、本発明によれば 、動物のための対応する製品が考えられる。 本発明に従い考えられるスキンケア製品の特定の例は、セッケン、化粧品、皮 膚クリーム、皮膚ミルク、皮膚ローション、クレンジングクリーム、クレンジン グローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリームセッケン、メ ーキャップベース、ミルキイローション、カラミンローション、Ｔゾーンエッセ ンス、ハンドクリーム、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダー、粉末セ ッケン、ケークセッケン、透明セッケン、リップクリーム、リップスティック、 ナリッシングエッセンス、クリーミイファンデーション、おしろい、アイシャド ーパウダー、ファンデーションパウダー、爪磨きリムーバー、ヘアトニック、ヘ アリキッド、ヘアクリーム、ヘアゲル、ヘアトリートメント、ヘアセット剤、毛 染め剤、毛着色剤、禿げトリートメント、シャンプー、バルサム、ヘアリンス、 ヘアスプレー、サンオイル、サンスクリーン、シェービングフォームおよびゲル 、シェービングクリーム、ベイビーオイル、アクネケア製品、発汗防止剤、昆虫 忌避剤、防臭剤およびその他である。スキンケアに適当な酵素活性成分 本発明のスキンケア組成物は、アレルゲン性が減少した変性酵素と、スキンケ ア組成物において使用されることが知られている成分とを含んでなる。 多数の酵素活性成分がスキンケア組成物において使用されることが知られてい る。 プロテアーゼ プロテアーゼは皮膚クリーニングプロセスにおいて有効な成分で ある。プロテアーゼは死亡したケラチン皮膚細胞の上層を除去し、これにより皮 膚をより輝かせ、いっそう新鮮にする。さらに、プロテアーゼを皮膚の平滑さを また改善する。 プロテアーゼはトイレ製品、浴およびシャワーの製品、例えば、シャンプー、 コンディショナー、ローション、クリーム、棒セッケン、トイレ用セッケン、お よび液状セッケンにおいて使用される。 リパーゼ リパーゼは、過剰の皮膚脂質を除去するための皮膚クリーニング製品および抗 アクネ製品における活性成分として、および浴およびシャワー製品、例えば、ク リームおよびローションにおけるスキンケアの活性成分として化粧品の用途に適 用される。 リパーゼは、また、皮脂および頭髪の表面からの他の脂肪物質を効果的に除去 についてヘアクローニング製品（例えば、シャンプー）において使用することが できる。 オキシドレダクターゼ 個人用ケア製品のために最も普通のオキシドレダクターゼは、基質（例えば、 グルコース）とともにオキシダーゼ（通常グルコースオキシダーゼ）であり、こ れはH₂O₂を生成し、次いでこれはペルオキシダーゼ（通常ラクトペルオキシダー ゼ）により、例えば、ＳＣＮ^-またはＩ^-の抗菌試薬（SCNO^-またはＩ₂）の抗菌試 薬への酸化を開始する。この酵素複合体は、天然において、例えば、乳および唾 液に由来することが知られている。 オキシドレダクターゼは商業的に口のケア製品（口のリンス、歯みがき、チュ ーインガム）において抗菌系として利用されており、ここでそれをアミログルコ シダーゼと組合わせてグルコースを生成することができる。これらの系は、また 、化粧品の保存剤として知られている。 オキシドレダクターゼの他の用途は、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび ラッカーゼを使用する頭髪の酸化的染色である（例えば、Novo Nordisk、WO96/0 0290号またはWO95/33836号参照）。 皮膚（および頭髪）の表面上に形成したフリーラジカルは、皮膚の老化プロセ ス（頭髪の損傷）に関連することが知られている。 フリーラジカルは、脂肪膜、コラーゲン、および細胞の破壊に導く連鎖反応を 活性化する。 フリーラジカルの掃去剤、例えば、スーパーオキシドジスムターゼの化粧品へ の添加はよく知られている(R.L．Goldemberg，DCI，Nov.93，p.48-52)。 タンパク質ジサルファイドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、また、オキシドレダク ターゼである。それは頭髪のウェービング（頭髪中のジサルファイド結合の還元 および再酸化）および損傷した頭髪（ここで損傷は主として存在するジサルファ イド結合の還元である）の修復のために利用することができる。 トランスグルタミナーゼ ヒトの皮膚、頭髪または爪に適用されるスキンケア組成物は、（ａ）アミノ官 能活性成分、（ｂ）皮膚、頭髪または爪への活性成分の架橋を触媒するトランス グルタミナーゼ、および（ｃ）担体を含んでなる。このような組成物は、米国特 許第5,490,980号から知られている。 哺乳動物の皮膚、頭髪または爪への適用に適当な化粧品組成物は、（ａ）前記 皮膚、頭髪または爪上の保護層を提供するために十分な量の少なくとも１種の角 質細胞のエンベロープタンパク質、（ｂ）前記皮膚、頭髪または爪の角質層中に 存在する角質細胞のエンベロープタンパク質と外部に暴露された角質細胞のタン パク質との間で共有結合を形成するために十分な量のトランスグルタミナーゼ、 （ｃ）トランスグルタミナーゼを活性化するために十分な量のカルシウムイオン 、および（ｄ）化粧品上許容されるベヒクルを含んでなり、ここで組成物は２相 を有する乳濁液からなり、そして角質細胞のエンベロープタンパク質は相の一方 の中に含有され、そしてトランスグルタミナーゼは他方の相内に含有される（米 国特許第5,525,336号参照）。 日本国特許（JP）3083908には、水溶性物質で変性されたトランスグルタミナ ーゼを含有する皮膚化粧物質が記載されている。変性物質は、例えば、１または ２以上のポリエチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール 、グリセリン、ポリビニルアルコール、グルコース、スクロース、アルギン酸、 カルボキシメチルセルロース、澱粉、およびヒドロキシプロピルセルロースであ る。変性は、例えば、反応性基を導入し、そして酵素に結合させることによって 実施される。皮膚に対して刺激が少なく、経時的変色引き起こす程度が少なく、 粗い皮膚の治癒のすぐれた効果を有し、湿分を保持し、そして皮膚を美しくコン ディショニングする材料が提供される。本発明のスキンケア製品 第３の面において、本発明は、本発明のスキンケア組成物を含んでなるスキン ケア製品に関する。用語「スキンケア製品」は上記において定義した通りである 。 本発明のスキンケア製品は、有効量の本発明の変性酵素を含むことができる。 このようなこの分野において知られている有効量は、しばしば最終のスキンケア 製品の０〜５％以上の範囲である。 本発明の考えられるスキンケア製品は下記の製品を包含するが、これらに限定 されない：セッケン、化粧品、皮膚クリーム、皮膚ミルク、皮膚ローション、皮 膚ゲル、クレンジングクリーム、クレン ジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリームセッケン 、メーキャップベース、ミルキーローション、パック、カラミンローション、Ｔ ゾーンエッセンス、ハンドクリーム、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウ ダー、粉末セッケン、ケークセッケン、透明セッケン、リップクリーム、リップ スティック、ナリッシングエッセンス、クリーミイファンデーション、おしろい 、アイシャドーパウダー、ファンデーションパウダー、爪磨きリムーバー、ヘア トニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、ヘアゲル、ヘアトリー，メント、ヘア セット剤、毛染め剤、毛着色剤、禿げトリートメント、シャンプー、バルサム、 ヘアリンス、ヘアスプレー、サンオイル、サンスクリーン、シェービングフォー ム、シェービングクリーム、ベイビーオイル、アクネケア製品、発汗防止剤、昆 虫忌避剤、防臭剤、およびその他。一般的スキンケア製品の配合物 用語「スキンケア製品において使用される成分」は、スキンケア製品の配合物 において使用されることが知られている、すべての成分を包含することを意味す る。このような成分の例は下記の文献の中に見出すすることができる：”Cosmet ics and Toiletries”，WilferiedおよびUmbach編，Ellis Horwood，Limited発 行，英国、および”Surfactants in Consumer Products”、J．Falbe編、Spring er-Verlag発行、(1987)。 下記において、指針となる配合物の非限定的リストを記載する。これらは本発 明に従い考えられる重要なスキンケア製品の配合物の外観を提供する。トイレ用セッケン 合成洗剤（合成洗浄剤） 泡浴およびシャワー浴 皮膚クリーム（油中水型および水中油型） 体ローション（水中油型）および湿った皮膚上の皮膚ローション 顔ローション ヘアシャンプー ヘアリンスおよびヘアコンディショナー 毛染め剤 シェービングクリーム シェービングローション ヘアポマード セットローション それ以上の面において、本発明は、前述した工業用組成物および製品のアレル ゲン性を減少するための本発明の変性ポリペプチドの使用に関する。 最後の面において、本発明は、カップリング工程を含んでなるポリペプチドの 呼吸アレルゲン性を減少する方法に関する。洗剤の開示 本発明の洗剤組成物は、例えば、洗濯添加剤組成物および汚れた布帛の前処理 において使用するために適当な組成物を包含する、手および機械の洗濯洗剤組成 物、リンス添加布帛柔軟剤組成物、および一般的硬質表面のクリーニング操作お よび皿洗浄操作において使用するための組成物として配合することができる。 本発明の洗剤組成物は、本発明の複合体および界面活性剤を含んでなる。さら に、それは必要に応じてビルダー、他の酵素、泡抑制剤、柔軟剤、染料移動阻止 剤および洗剤において普通に使用されている他の成分、例えば、汚れ懸濁剤、汚 れ解放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、および／または カプセル封入された香料または非カプセル封入された香料を含むことができる。 本発明による洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状製品または粒子の形 態であることができる。pH（使用濃度における水溶液中で測定する）は通常中性 またはアルカリ性、例えば、７〜１１の範囲であろう。本発明による粒状組成物 は、また、「圧縮された形態」であることができる、すなわち、粒状組成物は慣 用の粒状組成物よりも比較的より高い密度、すなわち、５５０〜９５０ｇ／ｌを 有することができる。 本発明の酵素複合体、または必要に応じて洗剤組成物の中に混入された他の酵 素は、通常、組成物の重量に基づいて、0.00001％〜２％、好ましくは0.0001％ 〜１％、より好ましくは0.001％〜０．５％、なおより好ましくは0.01％〜０． ２％の酵素タンパク質のレベルで洗剤組成物の中に混入される。 界面活性剤系 界面活性剤系は、非イオン、アニオン、カチオン、両性、および／または双性 イオンの界面活性剤であることができる。界面活性剤系は好ましくはアニオン界 面活性剤またはアニオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との組合わせ、例えば 、５０〜１００％のアニオン界面活性剤と０〜５０％の非イオン界面活性剤との 組合わせから成る。液状洗剤組成物は、また、カチオン、両性、双性イオン、お よび半極性界面活性剤、ならびに既に本明細書において記載する界面活性剤以外 の非イオン界面活性剤および／またはアニオン界面活性剤を含有することができ る。界面活性剤は典型的には０．１〜６０重量％のレベルで存在する。 非イオン界面活性剤 界面活性剤は、アルキルフェノールのポリアルキレンオキシド（例えば、ポリ エチレンオキシド）縮合物からなることができる。アルキル基は直鎖状または分 枝鎖状の約６〜約１４個の炭素原子を含有することができる。エチレンオキシド は約２〜約２５モル／モルのアルキルフェノールに等しい量で存在することがで きる。 界面活性剤は、また、第一級および第二級の脂肪族アルコールと約１〜約２５ モルのエチレンオキシドとの縮合生成物からなることができる。脂肪族アルコー ルのアルキル鎖は直鎖状または分枝鎖状であり、そして一般に約８〜約２２個の 炭素原子を含有する。 さらに、非イオン界面活性剤は、アルキルフェノールのポリエチレンオキシド 縮合物、第一級および第二級の脂肪族アルコールと約１〜約２５モルのエチレン オキシドとの縮合生成物、アルキル多糖、およびそれらの混合物からなることが できる。３〜１５エトキシ基を有するＣ８〜Ｃ１４アルキルフェノールエトキシ レートおよび２〜１０エトキシ基を有するＣ８〜Ｃ１８アルコールエトキシレー ト（好ましくは平均Ｃ１０）、およびそれらの混合物は最も好まし い。 アニオン界面活性剤 適当なアニオン界面活性剤は、式RO(A)mSO3Mの水溶性塩または酸であるアルキ ルアルコキシル化硫酸塩を包含し、式中、Ｒは非置換Ｃ１０〜Ｃ２４アルキル成 分を有するＣ１０〜Ｃ２４アルキルまたはヒドロキシアルキル、好ましくはＣ１ ２〜Ｃ２０アルキルまたはヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ１２〜Ｃ１８ アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシまたはプロポキシ単位 であり、ｍは０より大きく、典型的には約０．５〜約６、より好ましくは約０． ５〜約３であり、そしてＭはＨまたはカチオンであり、カチオンは、例えば、金 属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシ ウム、およびその他）、アンモニウムまたは置換アンモニウムのカチオンである ことができる。アルキルエトキシル化硫酸塩ならびにアルキルプロポキシル化硫 酸塩が本発明において考えられる。置換アンモニウムカチオンの特定の例は、メ チル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオンおよび第四級アンモニ ウムカチオン、例えば、テトラメチル−アンモニウムおよびジメチルピペリジニ ウムカチオン、およびアルキルアミン、例えば、ジエチルアミン、トリエチルア ミン、それらの混合物、およびその他を包含する。 他の適当なアニオン界面活性剤は、式ROSO3Mの水溶性塩または酸であるアルキ ル硫酸塩を包含し、式中、ＲはＣ１０〜Ｃ２４ヒドロカルビル、好ましくはＣ１ ０〜Ｃ２０アルキル成分を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル、より好ま しくはＣ１２〜Ｃ１８アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨ またはカチオン、例えば、金属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチ ウム）、アンモニウムまたは置換アンモニウムである。 他のアニオン界面活性剤は、セッケンの塩（例えば、ナトリウム、カリウム、 アンモニウム、および置換アンモニウムの塩、例えば、モノ−、ジ−およびトリ −エタノールアミンの塩）、Ｃ８−Ｃ２２第一級または第二級アルカンスルホン 酸塩、Ｃ８−Ｃ２４オレフィンスルホン酸塩、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱 分解生成物のスルホン化により製造されたスルホン化ポリカルボン酸を包含する 。 アルキルベンゼンスルホン酸塩、特に線状（直鎖状）アルキルベンゼンスルホ ン酸塩（ＬＡＳ）（ここでアルキル基は好ましくは１０〜１８個の炭素原子を含 有する）は適当である。 液状洗剤組成物は典型的には約１〜約４０重量％、好ましくは約３〜約２０重 量％のこのような界面活性剤からなる。 ビルダー系 本発明による組成物はビルダー系をさらに含むことができる。任意の慣用のビ ルダー系は、本発明において使用するために適当であり、アルミノケイ酸塩物質 、ケイ酸塩、ポリカルボン酸塩および脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA ）のような物質、金属イオン金属イオン封鎖剤、例えば、アミノポリホスホン酸 塩を包含する。リン酸塩ビルダーを本発明において使用することもできる。 適当なビルダーは、無機イオン交換物質、通常無機水和アルミノケイ酸塩物質 、より特に水和合成ゼオライト、例えば、水和ゼオライトＡ、Ｘ、Ｂ、ＨＳまた はＭＡＰであることができる。 洗浄性ビルダー塩は、通常、組成物の５〜８０重量％の量で添加される。液状 洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは５〜３０重量％である。 他の洗剤酵素活性物質 洗剤組成物は、特別の活性を有する本発明の複合体に加えて、さ らに酵素活性物質、例えば、また、本発明に従い記載した酵素複合体の形態の、 他の酵素活性物質を含み、クリーニング性能および／または布帛のケアの利益を 提供することができる。このような酵素活性物質は、例えば、プロテアーゼ、リ パーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダー ゼ（例えば、ラッカーゼ）である。 考えられる酵素の特定の例は、節「酵素活性物質」において前述した通りであ る。 漂白剤 洗剤組成物（特に粒状洗剤の場合において）は、また、漂白剤、例えば、酸素 の漂白剤またはハロゲンの漂白剤を含むことができる。酸素の漂白剤は過酸化水 素解放剤、例えば、過ホウ酸塩（例えば、ＰＢ１またはＰＢ４）または過炭酸塩 であることができるか、あるいは、例えば、過カルボン酸であることができる。 粒度は４００〜８００ミクロンであることができる。存在するとき、酸素漂白化 合物は典型的には約１％〜約２５％のレベルで存在するであろう。 過酸化水素解放剤を漂白活性化剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン （TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）、３，５−トリメチ ル−ヘキサノイルベンゼンスルホン酸塩(ISONOBS)またはペンタアセチルグルコ ース（ＰＡＧ）と組合わせて使用することができる。 ハロゲン漂白剤は、例えば、次亜ハロゲン酸塩の漂白剤、例えば、トリクロロ イソシアヌル酸およびナトリウムまたはカリウムのジクロロイソシアヌレートお よびＮ−クロロおよびＮ−ブロモアルカンスルホンアミドであることができる。 このような物質は通常最終製品の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％ で添加される。繊維材料への適用 プロテアーゼ プロテアーゼは絹の脱ガムおよび砂の洗濯に使用される。 リパーゼ リパーゼは、繊維材料の仕上げの間に疎水性エステル（例えば、トリグリセリ ド）を含有する脂肪質物質の除去に使用される（例えば、Novo Nordisk A/S、 WO93/13256号、参照）。 オキシドレダクターゼ 繊維材料の漂白クリーニングにおいて、カタラーゼは過剰の過酸化水素を除去 する働きをする。 カルボヒドラーゼ セルロース分解酵素は、デニム被服の仕上げにおいて、布帛の色密度の局存化 した変動を提供するために広く使用される（酵素促進「ストーンウォッシュ」） 。 また、セルロース分解酵素は、バイオポリッシング法において使用される。バ イオポリッシングは、糸表面の特別の処理であり、布帛の湿潤性を減少させずに 、風合いおよび外観に関する布帛の品質を改良する。バイオポリッシングは、例 えば、WO93/20278号に記載されている方法を適用することによって、得ることが できる。 繊維材料の製織の間に、糸はかなりの機械的歪に暴露される。破断を防止する ために、糸は通常ゼラチン物質（糊剤）でコーティング（サイジング）すること によって強化される。最も普通の糊剤は天然または変性された形態の澱粉である 。こうして、均一かつ耐久性の仕上げは、糊剤を布帛から除去した後にのみ、得 ることができ、したがって、糊抜きと呼ばれる。デンプン分解酵素の使用により 、澱粉または変性澱粉を含有する糊剤でサイジングした布帛の糊抜きを促進する ことが好ましい。食物および飼料への適用 本発明の複合化酵素またはポリペプチドは、食物および飼料の製造において好 都合に使用することができる。 プロテアーゼ コムギ粉中のグルテンは、焼いた食物において使用すべき穀粉の能力に必要な 必須成分である。タンパク質分解酵素は、練り粉のグルテン相を変性するために 要求されることがある、すなわち、固いコムギ粉はプロテアーゼで柔らかくする ことができる。 ニュートラーゼ（Neutrase^R）は、均一な練り粉品質およびパンのきめを保証 するために、かつ香味を改良するために使用できる、商業的に入手可能中性のメ タロプロテアーゼである。グルテンタンパク質は適度にまたはより広範にペプチ ドに分解し、これにより練り粉の過度の柔軟化を回避するために厳密なコントロ ールが必要である。 プロテアーゼは、また、乳のタンパク質を変性するために使用される。 チーズを製造するとき、乳中のカゼインを凝固するために、プロテアーゼ、例 えば、レニンまたはキモシンを使用することができる。 醸造産業において、未モルト処理穀物を使用する醸造および窒素含量のコント ロールにプロテアーゼは使用される。 動物の飼料製品において、プロテアーゼは動物の消化系を拡張するために使用 される。 リパーゼ パン焼き産業におけるリパーゼの適用はむしろ新しい。リパーゼを添加すると 、練り粉の性質は改良されかつより大きい体積によりパン製造の品質は改良され 、パン粉の構造は改良されかつパン粉の 色は白くなる。練り粉の混合の間のゼラチンとある脂質断片との間の相互作用を リパーゼが変化させるメカニズムにより、観測される効果を説明することができ る。これにより、ゼラチンの網状構造が改良される。 ブルー・ローン（blue roan）チーズ（例えば、Danablue）、ある種のイタリ アンチーズの型およびバターの脂肪を含有する他の酪農製品のフレーバーの発生 は、乳脂肪が遊離脂肪酸に分解することに依存する。このような製品において、 フレーバーを発生させるためにリパーゼを使用することができる。 油および脂肪製造産業において、リパーゼは、例えば、望ましくない副生物の 量を最小するために、エステル交換により脂肪を変性するために、そしてエステ ルを合成するために使用される。 オキシドレダクターゼ 本発明によるアレルゲン性が減少した他のオキシドレダクターゼを、食物およ び飼料の製造するために好都合に使用することができる。 パン焼きについて、いくつかのオキシドレダクターゼ、例えば、グルコースオ キシダーゼ、リポオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびそれらの 組合わせが使用される。伝統的には、パン・菓子類製造業者はアスコルビン酸お よび臭素酸カリウムの添加によりグルテンを強化する。いくつかのオキシドレダ クターゼは、グルテンタンパク質中の遊離スルフヒドリル単位の酸化により、練 り粉系中の臭素酸塩を置換するために使用することができる。これによって、ジ サルファイド結合が形成され、抵抗性がより大きい、いっそう弾性の練り粉が生 ずる。 グルザイム(Gluzyme^R)（Novo Nordisk A/S）は、臭素酸塩を置換するために 使用できる、カタラーゼ活性を有するグルコースオ キシダーゼ調製物である。機械的衝撃に対する抵抗がより大きく、オーブンの弾 性（spring）がよりよいこと、およびパンの一塊の体積がより大きいこととして 、練り粉の強化は測定される。 カルボヒドラーゼ 粉のアミラーゼ含量が変化し、パン焼き品質の差に導く。粉を標準化するため に、アミラーゼの添加が必要であることがある。一般に、アミラーゼおよびペン トサナーゼは、糖を発酵させ、パン体積を改良し、戻り（凝集）を遅延させ、そ してペントサンガムから生ずるステーリング(staling)速度および粘着性を減少 させる。 生成物においてゴム性を引き起こさないで、パンの貯蔵寿命を延長するために 、ある種の麦芽発生アミラーゼを使用することができる。澱粉分子、低分子量の 糖およびデキストリンから非還元性末端を切り離すことによって、ゲル化した澱 粉を選択的に変性する。戻り（凝集）が起こる可能性が少ない方法において、澱 粉は変性される。生成した低分子量の糖は、仕上げられた生成物においてゴム性 を生ずる中間長さのデキストリンを発生させないで、焼かれた製品の水保持性を 改良する。酵素はパン焼きの間に不活性化されるので、ラベル上に明記しなくて よい加工助剤と考えることができる。ノバミル(Novamyl)の過量投与をほとんど 排除することができる。 パン粉のすぐれた、均一な構造をさらに提供する、菌類のα−アミラーゼによ り、パンの体積を改良することができる。前記α−アミラーゼは、マルトース、 デキストリンおよびグルコースを生成する細胞内酵素である。穀物およびある細 菌のα−アミラーゼは、澱粉のゲル化温度より高い温度において不活性化されの で、コムギの練り粉に添加するとき、それは小さいパン体積および粘着性のパン 内部を生ずる。フンガミル（Fungamyl）は熱不安定性であるという利点を有し、 そしてゲル化温度よりちょうど低い温度において不活 性化される。 多数のペントサナーゼおよびヘミセルラーゼの活性物質を含有する酵素調製物 は、練り粉の取扱いおよび安定性を改良し、そしてパンの新鮮さ、パン粉の構造 、および体積を改良することができる。 粉中のペントサン画分を加水分解することによって、粉はその結合容量の大部 分を喪失し、次いで水は澱粉およびグルテンのために利用可能となるであろう。 グルテンはいっそうしなやかにかつ伸長性となり、そして澱粉はいっそう容易に ゲル化する。ペントサナーゼは乳化剤と組合わせて使用するか、あるいは乳化剤 の代替物として使用することができる。 さらに、カルボヒドラーゼは、ソフトドリンク、甘味剤、肉製品、酪農製品、 パン製品、アイスクリーム、赤ん坊の食物、ジャムおよびその他において広く使 用される、澱粉からシロップを製造するために使用される。 澱粉の変換は通常３工程において実施される。 第１に、澱粉はα−アミラーゼの使用により液化される。主としてオリゴサッ カリドおよびデキストリンから成る、マルトデキストリンが得られる。 次いで混合物をアミログルコシダーゼで処理して、オリゴサッカリドおよびデ キストリンをグルコースに加水分解する。この方法により、より甘い製品が得ら れる。マルトース含量が高いシロップは所望のβ−アミラーゼ単独であるか、あ るいはそれとプルラナーゼ（脱分枝鎖酵素）と組合わせて使用することができる 。 フルクトースへの異性体化により、グルコース混合物をなおいっそう甘くする ことができる。このために、固定化されたグルコースイソメラーゼを使用するこ とができる。 糖産業において、サトウキビのジュースの中に存在する澱粉の破 壊を加速することが一般に実施されている。これにより、原料糖中の澱粉含量は 減少し、精製時における濾過が促進される。 さらに、デキストラナーゼを使用して、原料糖ジュースおよびシロップ中のデ キストランを破壊する。 アルコール産業において、α−アミラーゼはマッシュの蒸留において澱粉を薄 めるために好都合に使用されている。 醸造産業において、α−アミラーゼは補助的液化のために使用される。 酪農産業において、ラクトース吸収不良を患う人のためにラクトース含量が低 い乳を生産するとき、β−ガラクトシダーゼ（ラクトース）を使用する。 ラクトース処理した乳からフレーバー化乳飲料を製造するとき、製品の甘味を 減少させないで、糖の添加量を減少することができる。 練乳の製造において、ラクトース処理によりラクトースの結晶化を回避するこ とができ、こうしてラクトース結晶中のカゼインの凝固により引き起こされる増 粘の危険が減少する。 ラクトース処理した乳（またはホエー）からアイスクリームを製造するとき、 ラクトース結晶が形成し、欠陥のある乳結晶を含んだアイスクリームが生じない 。 さらに、WO94/21758号（Novo Nordisk A/S）に記載されているように、キシ ラナーゼを多数の食物／飼料産業の用途において使用することが知られている。 動物飼料においてα−アミラーゼを穀物含有飼料に添加して、澱粉の消化を改 良する。 抗菌性ポリペプチド ある種の溶菌酵素を使用して、例えば、食用獣肉包装産業におい てカーカスを洗浄することができる（Novo Nordisk A/S、米国特許第5,354,68 1号参照）。 トランスフェラーゼ 本発明によるアレルゲン性が減少したトランスグルタミナーゼを食物および飼 料の製造において使用することができる。 トランスグルタミナーゼはタンパク質を架橋する能力を有する。 タンパク質を含有する水性相をゲル化に、この性質を使用することができる。 スプレッドを製造するとき、トランスグルタミナーゼを使用することができる（ Novo Nordisk A/S、WO96/08156号）。 トランスグルタミナーゼは、例えば、改良された性質、例えば、改良された味 覚、くぼみ、口の触感およびより大きい体積を有するケーキの製造において使用 すべきコムギ粉を変性することによって、コムギ粉の焼かれる品質を改良するた めに使用される（日本国特許出願（JP）1-110147号参照）。 さらに、ペースト型の食物を製造するために、材料を、例えば、アイスクリー ム、上飾り、凍結デザート、マヨネーズおよび低脂肪のスプレッドとして食物に おいて脂肪代替物として使用することができる（Novo Nordisk A/S、WO93/229 30号参照）。 さらに、乳および乳様製品からヨーグルト、ムース、チーズ、プディング、オ レンジジュースのための、細断された肉製品を結合し、そして食物タンパク質の 味覚およひきめを改良するためのゲルを製造するため（Novo Nordisk A/S、WO 94/21120号およびWO94/21129号参照）。 フィターゼ 本発明のフィターゼは、食物、例えば、朝食のセリアル食品、ケーキ、甘い物 、飲料、パンまたはスープなど、および動物飼料の製造において好都合に使用す ることができる。 フィターゼは、野菜タンパク質源の中に存在するフィチン酸塩／フィチン酸中 の結合したリンを利用するか、あるいはフィチン酸複合体中の結合した栄養的に 重要なミネラルを利用のために使用することができる。 微生物のフィターゼは、単胃動物の飼料に添加して、飼料への無機リンの補充 を回避することができる（米国特許第3,297,548号参照）。 さらに、フィターゼを大豆の加工において使用することができる。大豆粉末は 抗栄養因子のフィチン酸塩を高いレベルで含有することができる。フィチン酸塩 は、大豆タンパク質の中に存在する必須ミネラルをキレート化するので、赤ん坊 の食物および魚類、仔ウシおよび他の非反芻動物のための飼料における使用のた めに、大豆タンパク質を不適当とする（EP0,420,358号参照）。 また、パン焼きのために、フィチン酸塩を使用することができる。コムギ粉な どおよびフィチン酸塩を含有する練り粉の分割片を焼くことによって、よりすぐ れた品質を有するパンを製造することができる（日本国特許出願（JP）0-307652 9-A号参照）。 高いフィターゼ活性のコウジカビは精製された酒の製造に使用されることが知 られている（日本国特許出願（JP）0-6070749-A号参照）。材料および方法 材料 酵素： PD498：WO93/24623号に示されているスブチリシン型のプロテアーゼ。PD498の 配列は配列番号：１および２に示されている。 スブチリシンＤＹ：バシラス（Bacillus）種変異型から単離された配列番号： ３に示すスブチリシン型のプロテアーゼ（Betzel et al．(1993)，Archives of Biophysics，Vol.302，No.2，p.499-502）。 ELISA 試薬： セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ブタ抗ウサギ−Ｉｇ（Dako，DK，P217 ，希釈１：1000）。 ラット抗マウスＩｇＥ（Serotec MCA419；希釈１：１００）。マウス抗ラッ トＩｇＥ（Serotec MCA193；希釈１：２００）。 ビオチン標識化マウス抗ラットIgG1モノクローナル抗体（Zymed03-9140；希釈 １：1000）。 ビオチン標識化ラット抗マウスIgG1モノクローナル抗体（Serotec MCA336B； 希釈１：2000）。 ストレプチアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Kirkegrd & Perry 14-30-00；希釈１：1000）。 緩衝液および溶液： − ＰＢＳ（pH７．２（１リットル）） NaCl 8.00ｇ KCl 0.20ｇ K₂HPO₄ 1.04ｇ KH₂PO₄ 0.32ｇ − 洗浄緩衝液 ＰＢＳ、0.05％（ｖ／ｖ）Tween ２０ − ブロッキング緩衝液 ＰＢＳ、２％（ｖ／ｖ）スキムミルク粉末 − 希釈緩衝液 ＰＢＳ、0.05％（ｖ／ｖ）Tween ２０、０．５％（ｖ／ｖ） スキムミルク粉末 − クエン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、pH５．０〜５．２（１リットル）） クエン酸ナトリウム 20.60ｇ クエン酸 6.30ｇ − 停止溶液（ＤＭＧ−緩衝液） − ホウ酸ナトリウム、ホウ砂（Sigma） − ３，３−ジメチルグルタル酸（Sigma） − CaCl₂（Sigma） − Tween ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Merckカタ ログNo.822184） − Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Fluka art．56480） − ホスゲン（Fluka art．79380） − ラクトース（Merck 7656） − PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）（Sigma） − スクシニル−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリ ド（Ｓｕｃ−AAPF−ｐＮＰ）Sigma No.S-7388、分子量624.6ｇ／モル。 − mPEG（Fluka） 着色基質： ＯＰＤ：ｏ−フェニレン−ジアミン、（Kementec カタログNo．4260） 被験動物： ブラウン・ノールウェイ(Brown Norway)ラット（Charles River、DE） 装置： XCEL II（Novex） ELISAリーダー（UVmax、Molecular Devices） HPLC（Waters） PFLC（Pharmacia） スパーデックス（Superdex）−７５カラム、Mono Q、Mono S （Pharmacia、SW） ＳＬＴ：フォトメーター（SLT Lab．Instruments） サイズ排除クロマトグラフィー（Spherogel TSK-G2000、SW） サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 Pharmacia、SW） アミコン・セル（Amicon Cell） 方法： ブラウン・ノールウェイラットの気管内（ＩＴ）刺激 分子のＩＴ投与のために、２．５インチの長さの金属プローブを有する、使い 捨て注射器を使用する。このプローブをラットの気管の中の喉頭蓋よりほぼ１cm 下に設置し、そして０．１mlの分子の溶液を沈着させる。 被験動物は１０のグループのブラウン・ノールウェイラット（ＢＮ）である。 体重は開始時において２００ｇより大きく、そして停止時においてほぼ４５０ｇ である。 ブラウン・ノールウェイラットにおけるＩｇＥ抗体の相対濃度を測定するELIS A手順 ３層のサンドイッチELISAを使用して、特定のＩｇＥ血清抗生物質の相対濃度 を測定する。 １）１０mgのマウス抗ラットＩｇＥ緩衝液１でELISAプレートを被覆する（５ ０μｌ／ウェル）。４℃において一夜インキュベートする。 ２）プレートを空にし、室温において少なくとも３０分間ブロッキング緩衝液 でブロックする（２００μｌ／ウェル）。おだやかに震盪する。プレートを洗浄 緩衝液で３回洗浄する。 ３）ラット血清（５０μｌ／ウェル）とインキュベートし、未希釈から開始し 、２倍の希釈で続ける。いくつかの溶離を緩衝液４の ためにのみ自由にしておく（ブランク）。おだやかに震盪する。プレートを洗浄 緩衝液で３回洗浄する。 ４）酵素を希釈緩衝液中で適当なタンパク質濃度に希釈する。５０μｌ／ウェ ルを室温において３０分間インキュベートする。おだやかに震盪する。プレート を洗浄緩衝液で３回洗浄する。 ５）希釈緩衝液中の結合した抗体を検出するために、特定のポリクローナル抗 酵素抗血清（ｐＩｇ）を希釈する。５０μｌ／ウェルを室温において３０分間イ ンキュベートする。おだやかに震盪する。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する 。 ６）希釈緩衝液中でセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ｐＩｇ抗体を希釈 する。５０μｌ／ウェルを室温において３０分間インキュベートする。おだやか に震盪する。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。 ７）基質緩衝液中の０．６mgのODP／ml＋０．４μｌのH₂O₂／mlを混合する。 ５０μｌ／ウェルを１０分間インキュベートする。 ８）反応を停止するために、５０μｌの停止溶液／ウェルを添加する。 ９）参照として６２０nmを使用して、プレートを４９２nmにおいて読む。デー タを計算し、ロータス(Lotus)で提示する。 分子量の測定 ４〜４０％の勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル(Novex)を使用して、標準 的方法により、タンパク質を電気泳動により分離した。銀染色により、タンパク 質を検出した。Mark−１２^Rの広い分子量標準(Novex)の移動度に関して、分子量 を測定した。 プロテアーゼ活性 Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａを使用する分析 プロテアーゼはペプチドとｐ−ニトロアニリンとの間で切断して、４０５nmに おいて吸収する可視の色の吸収を与える。 緩衝液：例えば、BrittonおよびRobinsonの緩衝液pH８．３ 基質：１００mgのｓｕｃ−AAPF−ｐＮａを１mlのジメチルスルホキシド（DMSO ）中に溶解する。この溶液の１００mlをBrittonおよびRobinsonの緩衝液で１０m lに希釈する。 分析 基質およびプロテアーゼの溶液を混合し、時間およびＡＢＳ_405nm／分の関数 として、吸収を４０５nmにおいて測定する。温度をコントロールする（プロテア ーゼに依存して２０〜５０℃）。これは試料中のプロテアーゼ活性の測度である 。 実施例 実施例１．Ｎ−スクシニミジルカーボネートを使用するmPEG350の活性化 mPEG350をトルエン中に溶解した（４ml／ｇのmPEG）。約２０％を常圧におい て共沸蒸留的して、反応成分を乾燥した。溶液を２０℃に冷却し、トルエン中の ホスゲン（1.92Ｍ、１．５モル／モルのmPEG）を添加した。次いでこの混合物を 室温において一夜撹拌した。この混合物を減圧下に蒸発させ、中間体のクロロホ ルメートを油として得た。 蒸発後、ジクロロメタンおよびトルエン（１：２、乾燥４ml／ｇのmPEG）を添 加して、無色の油を再溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１ ．５モル／モルのmPEG）を固体として添加し、次いで０℃においてトリエチルア ミン（１．１モル／モルのmPEG）を添加した。トリエチルアミン塩酸塩（Et₃N・ ＨＣｌ）の直ちの沈降を観察することができた。この混合物を室温において一 夜撹拌した。フリットガラス（Ｇ５）を使用して、この混合物を濾過してEt₃N・ ＨＣｌを除去した。濾液を減圧下に蒸発乾固して、９８％（モル／モル）の油が 得られた。ＮＭＲは８５〜９５％の活性および＜１０％（モル／モル）のHNEt₃C lを示す。mPEG350スクシニミジルカーボネートについての 実施例２．活性化mPEG350とのPD498プロテアーゼの複合体化 ６２mgのPD498を、５０ミリモルのホウ酸ナトリウム、pH中で、Ｎ−スクシニ ミジルカーボネートで活性化されたmPEG３５０（実施例１に従い製造された）の ２０mg（約２００μｌ）と、６mlの最終体積でインキュベートした。周囲温度に おいて磁気的に撹拌しながら反応を実施した。反応時間は２時間であった。０． ５Ｍのコハク酸を６．０の最終pHに添加することによって、反応を停止した。 得られた誘導体の分子量はほぼ３３kDaであり、約１１モルの結合mPEG／モル のPD498に対応した。 親酵素に比較して、残留活性はペプチド基質（スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド）に対して１００％であった。実施例３．活性化mPEG350とのスブチリシンＤＹプロテアーゼの複合体化 実施例２に記載されているのと同一の手順を使用して、スブチリシンＤＹをmP EG350とＮ−スクシニミジルカーボネートにより複合化した。 前述の開示に照らして、当業者にとって明らかとなるように、本 発明の精神または範囲から逸脱しないで、本発明の実施において、多数の種々の 変化および変更が可能である。したがって、本発明の範囲は下記の請求の範囲に より規定された物質に従い解釈すべきである。 実施例４．小さいmPEGポリマーのPD498複合体のブラウン・ノールウェイラッ トの気管内（ＩＴ）試験 既知のタンパク質濃度のPD498試料（誘導体についての光学密度およびアミノ 酸配列により測定した）を0.75μｇのタンパク質／mlに希釈した。 個体の免疫化のために、１．５mlの画分で希釈した試料のアリコートを取った 。使用するまで、これらの画分を−２０℃において貯蔵条件下に貯蔵した。研究 の開示および終わりにおいて、分析を実施した。各免疫化および各分析のために 、新しい画分を採った。 上の実施例に記載したように、酵素複合体をＮ−スクシニミジルカーボネート 活性化mPEG350、５５０、７５０と複合体化した。対応する親酵素を対照として 使用した。 下記の酵素を試験した： グループ１：PD498（親非カップリング酵素−対照） グループ２：PD498-SPEG750 グループ３：PD498-SPEG550 グループ４：PD498-SPEG350 ラットを１００μｌの０．９％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液（対照グループ）または １００μｌの前述のPD498タンパク質希釈物で毎週１５回免疫化した。 各グループは１０匹のブラウン・ノールウェイラットからなっていた。各第２ 免疫化後１週であるが、引き続く免疫化の前に、眼から血液試料（１２ml）を収 集した。血液の凝固および遠心により、 血清を得た。 前述のラットＩｇＥに対して特異的なELISAアッセイにより、特異的ＩｇＥレ ベルを測定した。未希釈から出発して、血清を１／２希釈で滴定した。光学密度 を４９２／６２０nmにおいて測定した。 ＩＴ試験の結果を下記表に示す。この表は、それぞれのPD498誘導体を使用し てブラウン・ノールウェイラットにおいて観測された、研究の終わりにおける合 計の光学密度／１００μｌの試料を示す。 PD498複合体の試験の結果を下記表１に示す： 括弧内の値：測定された平均値の標準誤差 表１から理解できるように、親未変性酵素で気管内暴露したラットに比較して 、小さいポリマーをカップリングして有するPD498複合体で気管内暴露したラッ トの特異的ＩｇＥ応答レベルは減少する。したがって、アレルゲン性は減少され る。 実施例５．スブチリシンＤＹ複合体のブラウン・ノールウェイラットの気管内 （ＩＴ）試験 実施例４に記載するブラウン・ノールウェイラットＩＴを反復して、スブチリ シンＤＹ−SPEG750複合体を対応する親スブチリシンＤＹ酵素と比較した（配列 番号：３参照）。 スブチリシンＤＹ−SPEG750複合体の試験の結果を下記表２に示 す： 括弧内の値：測定された平均値の標準誤差 表２から理解できるように、親未変性酵素で気管内暴露したラットに比較して 、７５０Daのポリマーと複合化されたスブチリシンＤＹ複合体で気管内暴露した ラットの特異的ＩｇＥ応答レベルは減少する。 したがって、アレルゲン性は減少される。 実施例６．PD498-SPEG 複合体を含んでなるスキンケア処方物 下記の本発明の複合体を含んでなるスキンケア処方物を調製した： ローション（１００ｇとする） 油相： 液状パラフィン ３５ｇ セチルアルコール ５ｇ Tween ８０ ７ｇ 水相： モノプロピレングリコール（ＭＰＧ） １０ｇ ０．４％クエン酸緩衝液＊pH５．８ ４２．９ｇ メチルパラベン ０．１ｇ PD498-SPEG550 ＊＊ １０mg （酵素タンパク質として） 油相および水相を別々に混合し、８０℃に加熱した。油相を撹拌しながら水相 の中にゆっくり注いだ。この混合物をほぼ３５℃に冷却し、PD498-SPEG550複合 体を添加した。このローションを急速に冷却した。 ＊ ０．４％クエン酸一水和物、pHを５．９に調節した。 ＊＊ 通常、ＭＰＧとの処方物として供給されるであろう。水相中のＭＰＧは 酵素処方物中のＭＰＧの量に従い調節すべきである。 ゲル（１００ｇにする） ＭＰＧ ２０ｇ＊ Ｈ₂Ｏ １００ｇに添加する クエン酸 ０．４ｇ＊＊ Cabapol 940 １ｇ PD498-SPEG550 １０mg （酵素タンパク質として） 成分を上記順序で混合した。pHを５．６に調節した後、Cabapolを添加した。C arbapolの添加後、pHを再び調節した。 ＊ 酵素の処方に従い調節する。 ＊＊ pH５．６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/96 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デュッセン，ハインツ−ヨセフ デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ローゲン，エルウィン ルード デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．５〜１００kDaの分子量の親ポリペプチドに共有結合により連結された１ ００〜７５０Daの分子量のポリマー分子を有することにより特徴づけられる変性 ポリペプチド。 ２．親ポリペプチド、特に酵素が、１５〜６０kDaの分子量を有する、請求項 １に記載の変性ポリペプチド。 ３．１〜１００のポリマー分子、好ましくは４〜５０、特に５〜３５のポリマ ー分子が親酵素に共有結合されている、請求項１および２のいずれか一項に記載 の変性ポリペプチド。 ４．前記ポリマー分子が天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマー から成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変性ポリペプ チド。 ５．前記ポリマー分子が、分枝鎖状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ） 、ポリカルボン酸、ポリビニルピロリドンおよびポリ−Ｄ，Ｌ−アミノ酸を包含 する合成ポリマー分子から成る群より選択される、請求項４に記載の変性ポリペ プチド。 ６．前記ポリマー分子が、天然に見出されるポリマー分子、例えば、カルボキ シメチル−デキストランなどのデキストラン、およびセルロース、例えば、メチ ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエ チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびキトサンの加水分解物 、澱粉、例えば、ヒドロキシエチル澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、グリコーゲ ン、アガロース、グアーゴム、イヌリン、プルラン、キサンタンガム、カラゲー ン、ペクチンおよびアルギン酸から成る群より選択される、請求項４に記載の変 性ポリペプチド。 ７．前記ポリペプチドが微生物由来、例えば、細菌、糸状菌類ま たは酵母由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変性ポリペプチド。 ８．前記ポリペプチドが、ヒドラーゼ、例えばプロテアーゼ、例えばセリンプ ロテアーゼ、例えばスブチリシンおよびメタロプロテアーゼ、またはリパーゼ、 またはオキシドリダクターゼ、例えばラッカーゼ、またはスーパーオキシドジス ムターゼから成る群より選択される酵素である、請求項１〜７のいずれか一項に 記載の変性ポリペプチド。 ９．前記親プロテアーゼが、PD498、サビナーゼ（Savinase^R）、プロデイナー ゼＫ、プロデイナーゼＲ、サーミターゼ(Thermitase)、スブチリシンＤＹ、リオ ン（Lion）Ｙ、アルカラーゼ（Alcalase^R）、プロデイナーゼＴ、およびJA16か ら成る群より選択される、請求項８に記載の変性ポリペプチド。 １０．前記酵素が配列番号：１に示すPD498もしくは配列番号：３に示すスブ チリシン型プロテアーゼスブチリシンＤＹ、または配列番号：４に示すリオンＹ である、請求項９に記載の変性ポリペプチド。 １１．前記メタロプロテアーゼが配列番号：５に示すサーモリシンである、請 求項８に記載の変性ポリペプチド。 １２．１００〜5,000Da、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Da の分子量のポリマー分子と連結された変性ポリペプチドを含んでなる工業用組成 物。 １３．前記ポリマー分子が１００〜７５０Da、例えば１００〜５００Da、例え ば約３００Daのステアリン酸マグネシウムを有する、請求項１２に記載の工業用 組成物。 １４．前記組成物が個人用ケア組成物、特にスキンケア組成物において使用さ れることが知られている、請求項１２または１３に記 載の工業用組成物。 １５．請求項１４に記載の組成物を含んでなり、セッケン、化粧品、皮膚クリ ーム、皮膚ミルク、皮膚ローション、皮膚ゲル、クレンジングクリーム、クレン ジングローション、クレンジングミルク、コールドクリーム、クリームセッケン 、メーキャップベース、ルキーローション、パック、カラミンローション、Ｔゾ ーンエッセンス、ハンドクリーム、エッセンスパウダー、ホワイトニングパウダ ー、粉末セッケン、ケークセッケン、透明セッケン、リップクリーム、リップス ティック、ナリッシングエッセンス、クリーミイファンデーション、おしろい、 アイシャドーパウダー、ファンデーションパウダー、爪磨きリムーバー、ヘアト ニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、ヘアゲル、ヘアトリートメント、ヘアセ ット剤、毛染め剤、毛着色剤、禿げトリートメント、シャンプー、バルサム、ヘ アリンス、ヘアスプレー、サンオイル、サンスクリーン、シェービングフォーム 、シェービングクリーム、ベイビーオイル、アクネケア製品、発汗防止剤、昆虫 忌避剤、防臭剤から成る群より選択されるスキンケア製品。 １６．洗剤、例えば、洗濯洗剤組成物、皿洗い組成物、または硬質表面クリー ニング組成物である、請求項１２または１３に記載の工業用組成物。 １７．組成物、例えば、食物または飼料の添加剤、特にパンまたはその他を製 造のための添加剤である、請求項１２または１３に記載の工業用組成物。 １８．繊維材料を処理するための組成物である、請求項１２または１３に記載 の工業用組成物。 １９．請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の工業用組成物および請求項１ ５に記載の製品の呼吸アレルゲン性を減少するための 、１００〜5,000Da、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Da、例え ば１００〜７５０Da、または１００〜５００Da、または約３００Daの範囲の分子 量のポリマー分子がカップリングされた変性ポリペプチドの使用。 ２０．１００〜5,000Da、好ましくは１００〜2,000Da、特に１００〜1,000Da 、例えば１００〜７５０Da、または１００〜５００Da、または約３００Daの範囲 の分子量のポリマー分子をポリペプチドにカップリングさせることを含んでなる 、タンパク質分解酵素のアレルゲン性を減少する方法。 ２１．前記ポリペプチドが請求項８〜１１のいずれか一項に記載の活性を有す る酵素またはそれらの混合物である、請求項２０に記載の方法。